KR100191487B1

KR100191487B1 - 돼지헤모필로시스에 대한 예방백신

Info

Publication number: KR100191487B1
Application number: KR1019900017617A
Authority: KR
Inventors: 데스메뜨리 삘리쁘; 밀와르 프랑시스; 쁘레보 삘리쁘; 롤랑 에릭
Original assignee: 기이 말레; 메리알
Priority date: 1990-10-31
Filing date: 1990-10-31
Publication date: 1999-06-15
Also published as: KR920007638A

Abstract

돼지 헤모필로시스에 대한 예방 백신

에이치·플류로뉴모니아의 세포독 및 용혈활성의 근거인, 혈청타입 1 헤로필루스(악티노 바실루스)플류로뉴모니아로부터 얻은 독소를 백신의 제조에 사용된 타입의 부형체내에 함유하는 돼지 헤로필로시스에 대한 예방백신.

Description

돼지 헤모필로시스에 대한 예방 백신

본 발명은 돼지 헤모필로시스(Heamophilosis)에 대한 예방 백신 및 상기 백신에 포함된 유효성분을 수득하는 방법에 관한 것이다.

돼지 흉막폐렴(pleuropneumonia) 또는 돼지 헤모필로시스(Heamophilosis)는 지리적으로 광범위하게 분포되고 심각한 경제적 결과를 갖는 질병이다. 상기 질병은 섬유성 늑막염 및 출혈성 폐렴을 뚜렷한 특징으로 한다.

상기 질병의 원인이 되는 병원균은 헤모필루스(악티노바실루스) 플류로뉴모니아 [Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae]이고, 이는 이후에, 에이치·플류로뉴모니아로 언급된다. 세계적으로 12개의 캡슐(capsules) 혈청 타입(serotype)이 기술되어 오고 있다.

에이치·플류로뉴모니아의 발병력의 인자는 본질적으로 세가지이다 : 내독소(LPS 리포플리사카라이드), 캡슐(캡슐 다당류) 및 에이치·플류로뉴모니아의 용혈활성뿐만 아니라 세포독 활성을 담당하는 1∼수개의 독소(들). 상기 독소들은 아직 명확하게 정의되지 않았고 상기 두가지 활성들이 1∼수개의 독소들에 기인한 것인지의 여부는 확실히 공지되어 있지 않다.

위생 프로그램을 이행하는데 어려움이 있어, 예방 접종이 종종 숙고되어 왔다. 불활성화된 균체로부터 제조된 백신의 실패(백신에 포함된 혈청타입의 약하고 특이적인 예방, 낮은 무독성)후에, '서브-유닛'형 백신이 연구되었다.

그렇지만, 리포폴리사카라이드, 캡슐 다당류 및 외막(outer membrane) 단백질로부터 서브-유닛 백신을 제조하기 위한 노력들은 결론에 이르지 못했다 : 예방 효과가 충분치 않고 특이적이다.

돼지 혈청을 회수하는데 있어서 항용혈성 항체의 존제 및 용혈 및 세포독 활성에 대한 것으로서, 과-면역 토끼 혈청의 중화 효과를 밝힌 벤딕순(Bendixen et al., Toxicity of Haemophilus Pleuropneumomiae for poecine lung macrophages, peripheral blood monocytes and testicular cells-Infect, Immun, 1981, 33, 673∼676) 및 로젠달(Rosendal et al., H. Pleuropneumomiae lung lesions induced by sonicated bacteria and sterile culture Supernatant - Proceeding IPVS Copenhagen, 1980, p. 221)에 의한 연구후에 용혈소 (용혈 독소)가 연구되었다.

반 린고에드(Van Leengoed et al., Vaccination of pigs with toxin containing supernatant of H. Pleuropneumomiae - 1988, Thesis 'Pathogenic Studies on H. Pleuropneumomiae'. State University of Utrecht)는 혈청타입 9 독소에 기초하여 오일상 보조약내에 제조된 백신이 돼지내의 동일원의 전염성 공격 동안에 예방을 제공함을 밝혔다. 예방 접종된 동물들은 용혈 및 세포독 활성을 중화시키는 항체를 제공한다.

반대로, 헤세(R. Hesse et al., H. Pleuropneumomiae Vaccination -Challenge studies 1984, IPVS de Ghent, Belgique p. 111)는 열에 의해 불활성화된 혈청 타입 1 세포독소에 기포하고 보조약이 없는 백신이 동일원의 전염성 공격 동안에 예방을 제공하지 않음과 혈청 타입 1 독소와 보조약으로서 유화액을 함유하는 백신이 혈청 타입 5에 의한 공격에 대하여 예방하지 않음을 밝혔다. 그들은 독소 및 불활성화된 균체를 모두 함유하는 백신의 예방을 설명한다.

마침내, 프레이(J. Frey et al., Biochmical and genetic characterization of Actinobacillus pleuropneumomiae hemolysin, 1988, IPVS de Rio Janerio, p. 79)는 몇몇 혈청타입, 그중에서도 특히 혈청타입 1에 있어서 용혈소의 발현을 위해서 배양 배지내에 Ca⁺⁺의 존재의 중요성을 밝혔다. 이 저자들이 사용한 배양 배지는 IsoVitaleX 및 NAD가 첨가된 콜럼비아 브로쓰(Columbia Broth)이다.

본 발명의 목적은 혈청타입 1에 대한 효과적인 예방 및 에이치·플류로뉴모니아의 다른 혈청타입들에 대한 최소한 부분적인 예방을 주고 고도로 무해한 돼지 헤모필로시스에 대한 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 저렴하고 만들기 쉬운 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 에이치·플류로뉴모니아의 세포독 및 용혈 활성의 근거인 에이치·플류로뉴모니아의 혈청 타입 1의 불활성된 독소를 변성 독소(anatoxin)의 형태로 백신의 제조에 사용되는 타입의 부형제 또는 보조제 중에 함유량을 특징으로 하는, 돼지 헤모필로시스에 대한 예방 백신이다. 변성 독소는 포르말린에 의한 독소의 불활성화로써 바람직하게 수득할 수 있다.

변성 독소에는 바람직하게, 보조약, 그중에서도 특히 수산화 알루미늄이 부가된다.

변성 독소는 바람직하게는 50㎍/㎖의 최종 농도를 갖는다.

백신은 바람직하게는 1 회 투약량당 100㎍ 변성 독소의 비율로 투여된다.

백신에 포함된 변성 독소는 바람직하게는 Ca⁺⁺및 NAD가 부가된 배지에서 다량의 독소를 생성하는 혈청타입 1 에이치·플류로뉴모니아의 배양 상층액을 정제함으로써 수득할 수 있다.

개선된 구현예에서, 발명의 백신은 이렇게 정의된 혈청타입 1 변성독소와 별도로, 바람직하게는 포르말린으로 충분히 불활성화된 독소로부터 얻은, 다른 혈청타입, 그 중에서도 특히 2,3,4,6,8 및 12의 정제된 변성 독소를 함유할 수도 있다.

이들 다른 혈청타입의 변성 독소는 혈청 타입의 배양 상층액을 고도로 농축 및 정제함으로써 수득할 수 있지만, 특히 혈청타입 2의 경우에는, 유전자 재조합 백터를 발현시킴으로써 또는 펩타이드 합성을 통해 역시 수득될 수 있고, 다른 혈청타입, 예를들면, 2의 변성 독소하에 재조합 변성 독소뿐만 아니라, 그의 단편들, 변형체들, 및 개별적인 항원 결정기들(epitoes)을 가진 펩타이드 등을 역시 포함한다.

백신내의 다른 혈청타입 변성 독소 농도는 바람직하게는 약 50㎍/㎖이고 그것이 투여되는 1회 투약량은 또한 바람직하게는 혈청타입 1변성독소의 양과 비슷한 양을 포함한다.

발명의 의미에서, 주어진 혈청타입의 변성 독소는 세포독 및/또는 용혈활성이 기인하는 것으로 추정되는 배양 상층액중의 어떤 플리텝티드 또는 모든 폴리텝티디들을 포함한다. 그렇지만 혈청타입 1에 대해서는, 변성 독소는 용혈소를 함유하거나 그로부터 구성되고, 만약 존재한다면 혈청타입 2 또는 다른 혈청타입들에 대해서는 이들은 바람직하게는 세포독 활성이 기인하는 것으로 추정되는 약 120KDa의 폴리텝티드를 함유하거나 그로부터 구성된다.

본 발명의 백신은 바람직하게는 근육내로, 피하로, 또는 피내로 1∼2회 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 목적은 또한 상기에서 기술된 타입의 예방백신을 제조하기 위해서, 혈청타입 1 에이치·플류로뉴모니아 내에 있는 세포독 및 용혈 활성을 담당하는 독소를 수득하기 위한 방법이다.

본 발명에서, 상기 독소의 고생산자인 혈청타입 1 에이치·플류로뉴모니아의 한 균주가 선택되고, 독소의 발현을 위한 최적 조건에서 선택된 균주를 배양하고, 배양 상층액을 수거하고 독소를 추출하고 정제한다. 그리고나서 독소를 불활성화 하는데, 상기 불활성화는 어떠한 적절하게 공지된 기술, 그중에서도 특히 포르말린을 사용한 것에 따라 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 선택된 균주는 Ca⁺⁺및 NAD를 함유하는 하기의 세 배양 배지중 어느 하나에서 특히 배양될 수 있다 :

-뇌-심장 브로쓰 (Brain-Heart Broth) 배지,

-박토 클럼비아 브로쓰(Bacto Columbia Broth) 배지,

-윌킨스-찰그렌(Wilkins-Chalgren) 배지,

본 발명은 혈청타입 1 독소를 수득하는 방법 및 쥐 및 돼지에서의 예방 접종 분석의 도움으로 보다 상세하게 기술될 것이다.

I. 독소를 수득하는 방법

쇼프[Shope R.E. (1964), J. Exp. Med. 119, 357∼268]에 의해 기술된 혈청 타입 1균주를 그의 중요한 독소 생성 때문에 선택했다.

사용된 배양배지는 반드시 Ca⁺⁺및 NAD를 함유해야 한다. 뇌-심장 브로쓰 배지(BioMerieux)뿐만 아니라, 박토 콜롬비아 브로쓰(Difco) 및 월킨스-찰그렌 배지도 특히 사용될 수 있다.

본 발명에서는 10mM CaCl₂및 15mM NAD가 부가된 박토콜럼비아 브로쓰 배지가 사용된다.

동결-건조된 한병의 배양된 균주를 5㎖의 배지에 넣고 37℃에서 교반하여 18시간동안 방치한다. 상기 배지로부터 얻은 100㎖를 접종하고 37℃에서 교반하에 6시간동안 배양한다.

이 단계에서 1.6㎎/㎖의 포름알데히드를 가함으로써 배양물을 불활성화 한다.

그리고나서 배양물을 7000g에서 20분간 원심분리한다. 상층액을 4℃에서 교반하면서 30분 동안 40% 포화 암모늄 슐페이트로 침전시킴으로써 농축시킨다. 1000g에서 10분간 원심분리한 후 수득된 침전물을 TNC 완충액 (10mM 트리스 HCl, 9% NaCl, 10mM CaCl₂)에 다시 용해시킨다.

한외 여과(분자량 분리 : 10000Da)에 의해 독소를 역시 농축시킬 수도 있다. 농축액은 56℃에서 1시간동안 가열함으로써 불활성화 될 수 있다.

그리고나서 두 번의 연속적인 S200 HR(pharmacia-LKB) 겔 여과 크로마토그래피 실행에 의해 독소를 정제한다. 상기 겔의 분별 범위는 구형 단백질에 대해 50000과 250000사이이다. 컬럼의 특성은 하기와 같다 :

겔부피 190㎖

높이 95㎝

단면적 2㎝

적재부피 10㎖

유속 20㎖/h

용출 완충액 10mM Tris HCl

9% NaCl

10mM CaCl²

SDS-PAGE 전기영동 윤곽 [라엠리 (Larmi)에 의한 것, 1970, Clevage of strutural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, 680∼685]은 오직 하나의 밴드를 보이며, 이는 105KDa의 분자량에 해당한다. 그렇다면 혈청타입 1의 경우에는, 단지 하나의 독소만이 세포독 및 용혈 활성 모두를 담당하는 것처럼 보인다. 본 발명에 따른 어떠한 경우에도, 다른 항원성분이 존재하든 않든간에, 백신은 분자량 105 KDa을 가진 변성독소를 함유한다.

II. 백신의 제조

백신은 상기 방법에서 수득한 정제된 변성 독소로부터 제조된다. 변성 독소 조성물은 활성화전의 용혈 역가(역가 약 3)로부터 시작하여 만들어지고, 다른 분석법(예를 들면 ELISA)에 따라 역시 만들어질 수 있다. 변성 독소는 알루미나겔(0.7㎎/㎖) 및 포르말린(1.6㎎/㎖)을 보조약으로 가진다.

III. 쥐에 대한 예방접종 분석

상기에서 언급한 백신이 쥐에 대한 예방 접종 분석동안 시험된다 :

0일에 쥐에게 0.5㎖의 백신을 피하 투여한다. 21일에 10마리에게 쥐당 50% 치사량을 0.5㎖이하로 복강내 주사함으로써 분석을 실시한다. 결과를 하기 표 1에 나타낸다:

결과는 10마리의 공격된 쥐중에서 죽은 동물수로서 나타낸다.

이는 백신이 쥐 모델에서 기술된 모든 혈청타입에 대한 효과적인 이종 예방을 제공함을 나타내고 이는 돼지에 대해서도 추정될 수 있다.

IV. 돼지에 대한 예방접종분석

두그룹의 EOPS(특정한 병원체가 없는 것) 돼지 새끼를 같은 조건하에서 기른다. 생후 8주 및 12주에 한 그룹을 예방 접종한다. 다른 그룹을 대조 표준으로서 사용한다.

생후 14주에 두 그룹을 혈청타입 9를 사용하여(이종 공격)비강내로 (10세균)시험한다.

결과를 하기 표 2에 나타낸다.

상기 결과는 본 발명의 백신의 효과를 명백히 보여준다.

혈청타입 2 변성독소를 또한 함유하는 백신을 제조하기 위해서, 상기에서 기술된 것과 동일하거나 비슷한 조건하에서 상기 혈청타입의 균주를 역시 배양할 수 있다.

배양 상층액을 원심분리하고, 황산 암모늄으로 침전시킴으로써 농축하고, 침전물을 제용해시키고, 이온 교환 크로마토그래피로 겔 여과 또는 히드록시-아파타이트겔 크로마토그래피에 의해 정제한다. 정제된 독소의 불활성화는 바람직하게는 포르말린으로 이루어진다.

3,4,6,8,12와 같은 다른 혈청타입에 대해서는, 혈청타입 1 변성독소와 같이 처리될 수 있다.

Claims

에이치·플류로뉴모니아 (H. Pleuropneumomiae)에 의한 세포독 및 용혈활성의 근거이고, SDS-PAGE 전기영동에서 105kDa의 밴드로서 나타나는 헤모필루스(악티노바실루스)플루로뉴모니아[Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae] 혈청타입 1의 독소를 불활성화된 변성독소의 형태로 백신의 제조에 사용되는 타입의 부형제 또는 보조제중에 함유함을 특징으로 하는 돼지 헤모필로시스에 대한 예방백신.
제1항에 있어서, 독소를 포르말린으로 불활성화함을 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 변성독소가 수산화알루미늄으로 보조됨을 특징로 하는 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 변성도고소가 50㎍/㎖의 최종농도를 가짐을 특징으로 하는 백신.
제1항 또는 2항에 있어서, 1회 투여량당 100㎍ 변성독소의 비율로 투여됨을 특징으로 하는 백신.
제1항 또는 2항에 있어서, Ca⁺⁺및 NAD가 부가된 배지내에서 고도의 독소 생산자인 혈청타입 1 에이치·플류로뉴모니아 균주의 배양 상층액을 정제함으로써 독소를 수득함을 특징으로 하는 백신.
제1항 또는 2항에 있어서, 다른 혈청타입 2,3,4,8 및 12로부터 얻은 불활성화된 정제 변성독소를 또한 함유함을 특징으로 하는 백신.
제7항에 있어서, 혈청타입 2 변성독소, 또는 그들의 변형체 또는 펩타이드 등가물이 유전적 재조합 또는 펩타이드 합성을 통해 수득됨을 특징으로 하는 백신.
독소의 고 생산자인 혈청타입 1 에이치·플류로뉴모니아 균주를 선택하고, 선택된 균주를 최적의 발현 조건하에 Ca⁺⁺및 NAD를 함유하는 배지에서 배양하고, 배양 상층액을 수거하고 독소를 추출 및 정제하고 나서 불활성화시킴을 특징으로 하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 다른 예방용 백신 제조를 위한 혈청타입 1 헤모필루스(악티노바실루스)플류로뉴모니아의 세포독성 및 용혈활성을 담당하는 독소의 수득방법.
제9항에 있어서, 선택된 균주가 Ca⁺⁺및 NAD를 함유하는 뇌-심장 브로쓰(Brain-Heart Broth)배지를 사용하여 배양됨을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 선택된 균주가 Ca⁺⁺및 NAD를 함유하는 박토 콜럼비아 브로쓰(Bacto Columbia Broth)배지를 사용하여 배양됨을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 선택된 균주가 Ca⁺⁺및 NAD를 함유하는 윌킨스-찰그렌(Wilkins-Chagreen)배지를 사용하여 배양됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 2항에 있어서, 다른 혈청타입 6으로부터 얻은 불활성화된 정제 변성독소를 또한 함유함을 특징으로 하는 백신.