JP3169379B2 - ブタのヘモフィロシス予防ワクチン - Google Patents
ブタのヘモフィロシス予防ワクチンInfo
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ブタのヘモフィロシィス（Haemophilosis
porcine）に対する予防ワクチンと、このワクチン中に
含まれる有効成分を得るための方法に関するものであ
る。
porcine）に対する予防ワクチンと、このワクチン中に
含まれる有効成分を得るための方法に関するものであ
る。
ブタ胸膜肺炎（pleuropneumonie du porc）すなわち
ヘモフィロシスは深刻な経済的影響を及ぼす地理的に広
く分布した病気である。この病気の顕著な特徴は線維素
性胸膜炎（pleuresie fibrineuse）と出血性肺炎（pneu
monie hemorragique）である。
ヘモフィロシスは深刻な経済的影響を及ぼす地理的に広
く分布した病気である。この病気の顕著な特徴は線維素
性胸膜炎（pleuresie fibrineuse）と出血性肺炎（pneu
monie hemorragique）である。
この病気の原因となる細菌はヘモフィルス〔Haemophi
lus（アクチノバシラス,Actinobacillus）〕プルロニュ
ーモニア（pleuropneumoniae）である（以下、この細菌
をH.プルロニューモニアと呼ぶことにする。世界で12の
莢膜血清型が知られている。
lus（アクチノバシラス,Actinobacillus）〕プルロニュ
ーモニア（pleuropneumoniae）である（以下、この細菌
をH.プルロニューモニアと呼ぶことにする。世界で12の
莢膜血清型が知られている。
H.プルロニューモニアの毒性因子は内毒素（リポ多
糖、LPS）と、莢膜（莢膜多糖）と、H.プルロニューモ
ニアの細胞毒性作用および溶血作用の原因となる一つま
たは数個の毒素の３つである。この毒素は正確には定義
されておらず、これら２つの作用が１つの毒素によるも
のか、複数の毒素によるものかも不明である。
糖、LPS）と、莢膜（莢膜多糖）と、H.プルロニューモ
ニアの細胞毒性作用および溶血作用の原因となる一つま
たは数個の毒素の３つである。この毒素は正確には定義
されておらず、これら２つの作用が１つの毒素によるも
のか、複数の毒素によるものかも不明である。
この病気の予防のためにブタの飼育環境を衛生的に保
つのは困難であるため、ワクチン接種が考えられてきた
が、不活化細菌から製造したワクチンは失敗（予防効果
が低く、ワクチン中に含まれる血清型に特異性があり、
無害でない）であったため、「サブ−ユニット」型のワ
クチンが研究されてきた。
つのは困難であるため、ワクチン接種が考えられてきた
が、不活化細菌から製造したワクチンは失敗（予防効果
が低く、ワクチン中に含まれる血清型に特異性があり、
無害でない）であったため、「サブ−ユニット」型のワ
クチンが研究されてきた。
しかし、リポ多糖、莢膜多糖および外部膜蛋白からサ
ブユニット型のワクチンを製造する試みは予防効果が不
十分且つ特異的であったため成功しなかった。
ブユニット型のワクチンを製造する試みは予防効果が不
十分且つ特異的であったため成功しなかった。
回復期のブタの血清中に抗溶血素抗体が存在するとい
うこと、そして、高度免疫ウサギの血清が溶血作用と細
胞毒性作用に対して中和作用をするということを示した
ベンディクセン（Bendixen）達の研究（ブタの肺マクロ
ファージ、周辺血液単球および精巣細胞に対するヘモフ
ィルス プルロニューモニアのの毒性、Infect.Immum.1
981、33、673〜676）やローゼンダール（Rosendal）達
の研究（音波処理細菌と無菌培養上澄みによって誘発さ
れるH.プルロニューモニア肺障害−IPVS予縞集、コペン
ハーゲン、1980、221）から、溶血素（溶血毒素）に興
味がもたれてきた。
うこと、そして、高度免疫ウサギの血清が溶血作用と細
胞毒性作用に対して中和作用をするということを示した
ベンディクセン（Bendixen）達の研究（ブタの肺マクロ
ファージ、周辺血液単球および精巣細胞に対するヘモフ
ィルス プルロニューモニアのの毒性、Infect.Immum.1
981、33、673〜676）やローゼンダール（Rosendal）達
の研究（音波処理細菌と無菌培養上澄みによって誘発さ
れるH.プルロニューモニア肺障害−IPVS予縞集、コペン
ハーゲン、1980、221）から、溶血素（溶血毒素）に興
味がもたれてきた。
リーゴード（Van Leegoed）達は、油状補助中で製造
された血清型９の毒素をベースとしたワクチンがブタに
対する相同毒素の攻撃時に保護をするということを示し
た（H.プルロニューモニアの上澄みを含む毒素を用いた
ブタのワクチン接種−1988年、H.プルロニューモニアに
関する病理学研究論文、ユトレヒト州立大学）。このワ
クチン接種した動物は溶血作用と細胞毒作用とを中和す
る抗体を有している。
された血清型９の毒素をベースとしたワクチンがブタに
対する相同毒素の攻撃時に保護をするということを示し
た（H.プルロニューモニアの上澄みを含む毒素を用いた
ブタのワクチン接種−1988年、H.プルロニューモニアに
関する病理学研究論文、ユトレヒト州立大学）。このワ
クチン接種した動物は溶血作用と細胞毒作用とを中和す
る抗体を有している。
これに対して、ヘッセ（R.Hesse）達は、補剤なしに
加熱によって不活化した血清型１の細胞毒素をベースと
したワクチンは相同毒素の攻撃時に保護をしないという
こと、また、補剤として乳濁液を用いた血清型１の毒素
で構成されるワクチンは血清型５による攻撃に対して予
防作用がないということを示し、毒素および不活化細菌
を同時に含むワクチンが予防効果があるとしている（H.
プルロニューモニアワクチン接種−攻撃研究、1984年、
Proc.Int.Pig.Vet.Soc.Congress、ゲント、ベルギー、1
11頁）。
加熱によって不活化した血清型１の細胞毒素をベースと
したワクチンは相同毒素の攻撃時に保護をしないという
こと、また、補剤として乳濁液を用いた血清型１の毒素
で構成されるワクチンは血清型５による攻撃に対して予
防作用がないということを示し、毒素および不活化細菌
を同時に含むワクチンが予防効果があるとしている（H.
プルロニューモニアワクチン接種−攻撃研究、1984年、
Proc.Int.Pig.Vet.Soc.Congress、ゲント、ベルギー、1
11頁）。
フレィ（J.Frey）達は、ある種の血清型、特に血清型
１で溶血素を発現させるためには培地中にCa++が存在す
ることが重要であるということを示した〔アクチノバシ
ラス プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropn
eumoniae）溶血素の生化学的特徴と遺伝子学的特徴、19
88年、Proc.Int.Pig.Vet.Soc.Congress、リオデジェネ
イロ、79頁）。彼達の使用した培地はインビタレックス
（Iso VitaleX）とNADとを添加したコロンビア培養液
（Columbia Broth）であった。
１で溶血素を発現させるためには培地中にCa++が存在す
ることが重要であるということを示した〔アクチノバシ
ラス プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropn
eumoniae）溶血素の生化学的特徴と遺伝子学的特徴、19
88年、Proc.Int.Pig.Vet.Soc.Congress、リオデジェネ
イロ、79頁）。彼達の使用した培地はインビタレックス
（Iso VitaleX）とNADとを添加したコロンビア培養液
（Columbia Broth）であった。
本発明の目的は、血清型１に対しては効果的な予防が
でき、その他のH.プルロニューモニアの血清型に対して
は少なくとも部分的な予防ができ、しかも、極めて無害
性が高いブタのヘモフィロシスに対するワクチンを提供
することにある。本発明の他の目的は製造が簡単で、コ
ストが安いワクチンを提供することにある。
でき、その他のH.プルロニューモニアの血清型に対して
は少なくとも部分的な予防ができ、しかも、極めて無害
性が高いブタのヘモフィロシスに対するワクチンを提供
することにある。本発明の他の目的は製造が簡単で、コ
ストが安いワクチンを提供することにある。
本発明の提供するブタのヘモフィロシスに対する予防
ワクチンは、H.プルロニューモニアの細胞毒作用および
溶血作用の担体であるH.プルロニューモニアの血清型１
の不活化毒素をアナトキシン（anatoxine）の形で、ワ
クチン製造に用いられる賦形剤または付形剤中に含むこ
とを特徴としている。
ワクチンは、H.プルロニューモニアの細胞毒作用および
溶血作用の担体であるH.プルロニューモニアの血清型１
の不活化毒素をアナトキシン（anatoxine）の形で、ワ
クチン製造に用いられる賦形剤または付形剤中に含むこ
とを特徴としている。
上記アナトキシンはホルリンで毒素を不活化して得る
のが好ましい。
のが好ましい。
上記アナトキシンには補助、特に水酸化アルミニウム
を添加するのが好ましい。
を添加するのが好ましい。
上記アナトキシンの最終濃度は50μg/mlであるのが好
ましい。
ましい。
本発明のワクチンは１投与当たり100μg/mlの割合で
投与するのが好ましい。
投与するのが好ましい。
ワクチンに含まれるアナトキシンは、Ca++とNADとを
添加した培地中で、多量の毒素を作る血清型１のH.プル
ロニューモニア株の培養液の上澄液を精製して得るのが
好ましい。
添加した培地中で、多量の毒素を作る血清型１のH.プル
ロニューモニア株の培養液の上澄液を精製して得るのが
好ましい。
本発明の改良型の実施例では、本発明のワクチンが上
記定義した血清１のアナトキシン以外に、別に血清型、
特に血清型２、３、４、６、８および12の精製アナトキ
シン、好ましくはホルマリンで十分に不活化した毒素か
らの精製アナトキシンを含むことができる。
記定義した血清１のアナトキシン以外に、別に血清型、
特に血清型２、３、４、６、８および12の精製アナトキ
シン、好ましくはホルマリンで十分に不活化した毒素か
らの精製アナトキシンを含むことができる。
これらの他の血清型のアナトキシンは、これら血清型
の培養液の上澄液を高度に濃縮・精製して得ることがで
きるが、その他の方法で得ることもでき、特に血清型２
の場合には遺伝子組換えベクターの発現で得ることがで
きる。これらの他の血清型、例えば血清型２のアナオキ
シンとは、組換えアナトキシンと、その断片、変異体お
よび関連するエピトープを有するペプチドの他に、ペプ
チド合成したものも含むということは理解できよう。
の培養液の上澄液を高度に濃縮・精製して得ることがで
きるが、その他の方法で得ることもでき、特に血清型２
の場合には遺伝子組換えベクターの発現で得ることがで
きる。これらの他の血清型、例えば血清型２のアナオキ
シンとは、組換えアナトキシンと、その断片、変異体お
よび関連するエピトープを有するペプチドの他に、ペプ
チド合成したものも含むということは理解できよう。
本発明のワクチン中でのこれら他の血清型のアナトキ
シンの濃度は約50μg/mlであり、投与量は血清型１のア
ナトキシンの量と同じ量であるのが好ましい。
シンの濃度は約50μg/mlであり、投与量は血清型１のア
ナトキシンの量と同じ量であるのが好ましい。
本発明では、所定の血清型のアナトキシンとは、細胞
毒性作用および／または溶血作用に寄与する培養液の上
澄液中の任意のポリペプチドまたは全てのポリペプチド
を意味している。しかし、血清型１の場合には、アナト
キシンは溶血素を含むか、溶血素で構成され、血清型２
またはその他の血清型が存在する場合には、血清型２ま
たはその他の血清型は、細胞毒性作用に関与する約120K
Daのポリペプチドを含むか、このポリペプチドで構成さ
れているのが好ましい。
毒性作用および／または溶血作用に寄与する培養液の上
澄液中の任意のポリペプチドまたは全てのポリペプチド
を意味している。しかし、血清型１の場合には、アナト
キシンは溶血素を含むか、溶血素で構成され、血清型２
またはその他の血清型が存在する場合には、血清型２ま
たはその他の血清型は、細胞毒性作用に関与する約120K
Daのポリペプチドを含むか、このポリペプチドで構成さ
れているのが好ましい。
本発明のワクチンは１回または２回の注射で筋肉内、
皮下または皮内に投与するのが好ましい。
皮下または皮内に投与するのが好ましい。
本発明のさらに他の目的は、上記タイプの予防ワクチ
ンを製造するための、血清型１のH.プルロニューモニア
に対する細胞毒性作用と溶血作用に関与する毒素を得る
方法にある。
ンを製造するための、血清型１のH.プルロニューモニア
に対する細胞毒性作用と溶血作用に関与する毒素を得る
方法にある。
本発明の方法では、上記毒素を多量に産成する血清型
１のH.プルロニューモニア株を選択し、選択した株を毒
素の発現に最適な条件で培養し、培養液の上澄液を回収
し、毒素を抽出・精製し、次いで毒素を不活化する。こ
の不活化は適当な公知の方法、特にホルマリンを用いて
行うことができる。
１のH.プルロニューモニア株を選択し、選択した株を毒
素の発現に最適な条件で培養し、培養液の上澄液を回収
し、毒素を抽出・精製し、次いで毒素を不活化する。こ
の不活化は適当な公知の方法、特にホルマリンを用いて
行うことができる。
本発明方法では、選択した株をCa++とNADとを含む下
記の３つの培地の１つで培養することができる： （１） クール−セベーユ（Coeur−Cervelle）肉汁培
地、 （２） バクトコロンビア（Bacto Columbia）肉汁培
地、 （３） ウィルキンズ−チャルグレン（Wilkins−Chalg
ren）培地。
記の３つの培地の１つで培養することができる： （１） クール−セベーユ（Coeur−Cervelle）肉汁培
地、 （２） バクトコロンビア（Bacto Columbia）肉汁培
地、 （３） ウィルキンズ−チャルグレン（Wilkins−Chalg
ren）培地。
以下、血清型１の毒素を得る方法と、マウスおよびブ
タでのワクチン接種試験とを用いて本発明をさらに詳細
に説明する。
タでのワクチン接種試験とを用いて本発明をさらに詳細
に説明する。
I.毒素を得るための方法 血清型１の株として、多量の毒素を生成するという理
由で、ショープ（Shop.R.E.）のJ.Exp.Med.119,1964,35
7〜368頁に記載の株を選択した。
由で、ショープ（Shop.R.E.）のJ.Exp.Med.119,1964,35
7〜368頁に記載の株を選択した。
使用する培地はCa++とNADとを含んでいなければなら
ない。特に、ブイヨン クール−セルベーユ培地〔ビオ
メリウ（Bio Merieux）製〕と、バクト コロンビア
ブロス〔ディフコ（Difco）製〕培地と、ウィルキンズ
−チャルグレン培地を使用するのが好ましい。
ない。特に、ブイヨン クール−セルベーユ培地〔ビオ
メリウ（Bio Merieux）製〕と、バクト コロンビア
ブロス〔ディフコ（Difco）製〕培地と、ウィルキンズ
−チャルグレン培地を使用するのが好ましい。
本実施例では、10mMのCaCl2と15mMのNADとを添加した
バクト コロンビア ブロス培地を使用した。
バクト コロンビア ブロス培地を使用した。
培養株の凍結乾燥したサンプルを5mlの培地に導入
し、37℃で18時間撹拌する。次いで、100mlの培地に接
種し、撹拌下に37℃で６時間培養する。
し、37℃で18時間撹拌する。次いで、100mlの培地に接
種し、撹拌下に37℃で６時間培養する。
この段階で、1.6mg/mlのホルムアルデヒドを添加し
て、培養液を不活化する。
て、培養液を不活化する。
次いで、培養液を7000gで20分間遠心分離する。40％
の飽和硫酸アンモニウムを用いて撹拌下に４℃で30分間
沈澱させて、上澄液を濃縮する。10000gで10分間遠心分
離した後に得られた沈澱物をTNC緩衝剤（10mMトリスHC
l、９％NaCl、10mM CaCl2）中に再溶解する。
の飽和硫酸アンモニウムを用いて撹拌下に４℃で30分間
沈澱させて、上澄液を濃縮する。10000gで10分間遠心分
離した後に得られた沈澱物をTNC緩衝剤（10mMトリスHC
l、９％NaCl、10mM CaCl2）中に再溶解する。
毒素を限外濾過（カット限界:10,000Da）で濃縮する
こともできる。濃縮物は56℃で１時間半加熱して不活化
することができる。
こともできる。濃縮物は56℃で１時間半加熱して不活化
することができる。
次に、毒素をゲル濾過S200HR（ファルマシア−LKB）
で２回の連続的にクロマトグラフにかけて精製する。こ
のゲルの分画範囲は球状蛋白に対して50,000から250,00
0の間にある。カラムの特徴は以下の通り： ゲル容量 190ml 高さ 95cm 断面 2cm 付着容積 10ml 流量 20ml/時 溶離緩衝剤 10mMトリスHCl 9％NaCl 10mM CaCl2 SDS−PAGE電気泳動プロフィル〔ラエムリ（Laeml
i）、バクテリオファージT4のヘッドの集合時の構造蛋
白の分画、ネイチャー227、1970,680〜685〕は分子量10
5KDaに対応する単一バンドのみを示す（図１）。従っ
て、血清型１の場合には、細胞毒性作用と溶血作用の両
方に関与するのは単一の毒素であると思われる。いずれ
にせよ、本発明のワクチンは、他の抗原成分が存在して
も、しなくても、分子量105KDaのアナトキシンを含んで
いる。
で２回の連続的にクロマトグラフにかけて精製する。こ
のゲルの分画範囲は球状蛋白に対して50,000から250,00
0の間にある。カラムの特徴は以下の通り： ゲル容量 190ml 高さ 95cm 断面 2cm 付着容積 10ml 流量 20ml/時 溶離緩衝剤 10mMトリスHCl 9％NaCl 10mM CaCl2 SDS−PAGE電気泳動プロフィル〔ラエムリ（Laeml
i）、バクテリオファージT4のヘッドの集合時の構造蛋
白の分画、ネイチャー227、1970,680〜685〕は分子量10
5KDaに対応する単一バンドのみを示す（図１）。従っ
て、血清型１の場合には、細胞毒性作用と溶血作用の両
方に関与するのは単一の毒素であると思われる。いずれ
にせよ、本発明のワクチンは、他の抗原成分が存在して
も、しなくても、分子量105KDaのアナトキシンを含んで
いる。
II.ワクチンの製造 上記方法で得られた精製アナトキシンからワクチンを
製造する。アナトキシン配合は、不活化前の溶血価（約
３の溶血価）を基礎に製造するが、他の試験（例えば、
ELISA）によって製造することもできる。このアナトキ
シンに補剤としてアルミナゲル（0.7mg/ml）とホルマリ
ン（1.6mg/ml）を添加する。
製造する。アナトキシン配合は、不活化前の溶血価（約
３の溶血価）を基礎に製造するが、他の試験（例えば、
ELISA）によって製造することもできる。このアナトキ
シンに補剤としてアルミナゲル（0.7mg/ml）とホルマリ
ン（1.6mg/ml）を添加する。
III.マウスへのワクチン接種試験 上記のワクチンをマウスヘワクチン接種試験して評価
する。
する。
マウスに皮下注射で初日（JO）に0.5mlのワクチンを
投与した。12日（J21）には、0.5ml以下を腹膜組織内に
マウス１匹当たり50％致死量の10投与量を注射して評価
した。結果を下記の表１にまとめて示してある。
投与した。12日（J21）には、0.5ml以下を腹膜組織内に
マウス１匹当たり50％致死量の10投与量を注射して評価
した。結果を下記の表１にまとめて示してある。
この結果は10匹の被試験マウスの中で死んだマウスの
数で示した。 表１ 攻撃血清型 対照 “アナトキシン”ワクチン １ ９ ０ ２ ４ ０ ３ ９ ３ ４ ８ ３ ５ ５ ０ ６ ５ ０ ７ ９ ２ ８ ７ １ ９ ５ ０ 10 10 ２ 11 10 ３ 12 10 ３ この結果は、本発明ワクチンはマウスモデルに記載の
全ての血清型に対して異質組織（heterologue）の予防
効果を示すことを示し、このことはブタに外挿すること
ができる。
数で示した。 表１ 攻撃血清型 対照 “アナトキシン”ワクチン １ ９ ０ ２ ４ ０ ３ ９ ３ ４ ８ ３ ５ ５ ０ ６ ５ ０ ７ ９ ２ ８ ７ １ ９ ５ ０ 10 10 ２ 11 10 ３ 12 10 ３ この結果は、本発明ワクチンはマウスモデルに記載の
全ての血清型に対して異質組織（heterologue）の予防
効果を示すことを示し、このことはブタに外挿すること
ができる。
IV.ブタへのワクチン接種試験 ２つのグループのEOPS子豚（特別な病理的組織のない
子豚を同じ条件で飼育する。一方のグループには生後８
〜12週間でワクチン接種し、他方のグループは対照とし
た。
子豚を同じ条件で飼育する。一方のグループには生後８
〜12週間でワクチン接種し、他方のグループは対照とし
た。
生後14週間目に、２つのグループに血清型９を鼻腔内
に接種（104菌）して試験した（異質組織攻撃）。
に接種（104菌）して試験した（異質組織攻撃）。
結果は表２にまとめて示してある。
この結果は、明らかに本発明のワクチンの効果を示して
いる。
いる。
血清型２のアナトキシンを含むワクチンを製造する場
合には、この血清型の株を上記と同じ条件で培養すれば
よい。
合には、この血清型の株を上記と同じ条件で培養すれば
よい。
この場合には、培養液の上澄液を遠心分離し、硫酸ア
ンモニウムで沈澱させて濃縮し、沈澱物を再溶解し、イ
オン交換クロマトグラフィ、次いでゲル濾過またはヒド
ロキシ−アパタイトゲルクロマトグラフィで精製する。
精製された毒素の不活化はホルマリンで行うのが好まし
い。
ンモニウムで沈澱させて濃縮し、沈澱物を再溶解し、イ
オン交換クロマトグラフィ、次いでゲル濾過またはヒド
ロキシ−アパタイトゲルクロマトグラフィで精製する。
精製された毒素の不活化はホルマリンで行うのが好まし
い。
血清型３、４、６、８、12等の他の血清型の場合に
は、血清型１のアナトキシンと同様に行うことができ
る。
は、血清型１のアナトキシンと同様に行うことができ
る。
フロントページの続き (72)発明者 ロラン，エリック フランス国 69007 リヨン リュ リ ュートナン コロネル ジラール 51 (56)参考文献 特開 平２−152930（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｐｉｇ Ｖｅｔ. Ｓｏｃ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，1984，ｐ. 111 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/102 C07K 14/285 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (13)
- 【請求項１】SDS−PAGE電気泳動で105Kdaのバンドに表
れる、ヘモフィルス（アクチノバシラス）プルロニュー
モニア［Haemophilus（Actionbacillus）pleuropneumon
iae］の細胞毒作用および溶血作用の担体であるヘモフ
ィルス プルロニューモニアの血清型１の毒素を不活性
化して得られるアナトキシンと、ワクチン製造に用いら
れる賦形剤または付形剤とからなることを特徴とするブ
タのヘモフィロシスに対する予防ワクチン。 - 【請求項２】毒素が血清型１のヘモフィルス プルロニ
ューモニア株の培養液の上澄液を精製して得られたもの
である請求項１に記載のワクチン。 - 【請求項３】毒素をホルマリンで不活化したものである
請求項１または２に記載のワクチン。 - 【請求項４】補剤をさらに含む請求項１〜３のいずれか
一項に記載のワクチン。 - 【請求項５】補剤が水酸化アルミニウムである請求項４
に記載のワクチン。 - 【請求項６】毒素が、Ca++とNADとを添加した培地中で
多量の毒素を産成する血清型１のヘモフィルス プルロ
ニューモニア株の培養液の上澄液を精製して得られたも
のである請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチ
ン。 - 【請求項７】他の血清型２、３、４、６、８および12か
ら得られる不活化された精製アナトキシンをさらに含む
請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。 - 【請求項８】ヘモフィルス プルロニューモニアの血清
型２の120kDaの毒素を不活化して得られる精製アナトキ
シンを含む請求項７に記載のワクチン。 - 【請求項９】血清型６から得られる精製アナトキシンを
含む請求項７に記載のワクチン。 - 【請求項１０】毒素をホルマリンで不活化したものであ
る請求項７〜９のいずれか一項に記載のワクチン。 - 【請求項１１】毒素を多量に産成する血清型１のヘモフ
ィルス プルロニューモニア（Haemophilus pleuropneu
moniae）株を選択し、選択した株を毒素の発現に最適条
件で培養し、培養液の上澄液を回収し、毒素を抽出・精
製し、次いで毒素を不活化することを特徴とする、請求
項１〜10のいずれか一項に記載の予防ワクチンの製造方
法。 - 【請求項１２】毒素をホルマリンで不活化する請求項11
に記載の方法。 - 【請求項１３】選択した株をCa++とNADとを含むバクト
コロンビア（Bacto Columbia）肉汁培地で培養する請求
項11または12に記載の方法。
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