DD297560A5

DD297560A5 - Schutzimpfstoff gegen schweine-haemophilose

Info

Publication number: DD297560A5
Application number: DD90344141A
Authority: DD
Inventors: Philippe Desmettre; Francis Milward; Philippe Prevost; Eric Rolland
Original assignee: ��@��k��
Priority date: 1989-09-26
Filing date: 1990-09-21
Publication date: 1992-01-16
Also published as: WO1991004747A1; EP0420743A1; DK0420743T3; ATE189609T1; FR2652266A1; AU6523090A; DE10199019I1; PT95396A; FR2652266B1; DE69033454D1; ES2143456T3; JP3169379B2; JPH04502018A; CA2035474C; GR3033151T3; AU635349B2; EP0420743B1; PT95396B; DE69033454T2; CA2035474A1

Abstract

Der Schutzimpfstoff gegen Schweine-Haemophilose enthaelt das Toxin des Serotyps 1 von Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, das eine cytotoxische und haemolytische Aktivitaet von H. pleuropneumoniae traegt, in einem Traeger oder einem Hilfsstoff des Typs, wie er in der Zusammensetzung von Impfstoffen verwendet wird.

Description

Die Erfindung betrifft einen Schutzimpfstoff gegen Schweine-Hämophilose und ein Verfahren zum Erhalt des aktiven Wirkstoffs wie er in die Zusammensetzung dieses Impfstoffs eingeht.

Die Pleuropneumonie des Schweines oder die Schweine-Hämophilose ist eine geographisch weit vei breitete Krankheit mit schwerwiegenden wirtschaftlichen Folgen. Diese Krankheit äußert sich insbesondere in einer fibrinösen Pleuritis ⁿnd einer hämorrhagischen Pneumonie.

Der für diese Krankheit verantwortliche Keim ist Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, im folgenden H.

pleuropneumoniae genannt. Weltweit sind zwölf kapsuläre Serotypen beschrieben.

Für die Virulenz von H. pleuropnoumonlae gibt es drei Faktoren: das Endotoxin (Lipopolysaccharid LPS), die Kapsel (kapsuläres Polysaccharid) und ein oder mehrere Toxine, die für die cytotoxische und hämolytische Aktivität von H. pleuropneumoniae verantwortlich sind. Diese Toxine sind bislang schlecht definiert und man weiß nicht mit Sicherheit, ob diese zwei Aktivitäten die Erscheinung eines einzigen oder mehrerer Toxine sind.

Angesichts der Schwierigkeiten bei der Durchführung von Gesundungsprogrammen wurde des öfteren eine Impfung ins Auge gefaßt. Infolge des Versagens der Impfstoffe, die ausgehend von inaktivierten Bakterienzellen hergestellt wurden (schwacher und für die in den Impfstoff enthaltenen Serotypen spezifischer Schutz, mangelnde Unschädlichkeit), wurden Impfstoffe vom Typ „Sub-Einheit" („sous-unitö") untersucht.

Dennoch blieben die Versuche zur Herstellung von Sub-Einheit-Impfstoffen ausgehend von Lipopolysaccharid, kapsulärem Polysaccharid und Proteinen der äußeren Membran erfolglos: der Schutzaffekt ist ungenügend und spezifisch Für das Hämolysin (hämolytisches Toxin) interessierte man sich im Anschluß an die Arbeiten von Bendixen et al. (Toxicity of Haemophllus pleuropnoumoniae for porcine lung macrophages, peripheral blood monocytes and testicular cells Infect. Immun., 1981,33,673-676) und Rosendal et al. (H. pleuropneumoniae lung lesions induced by sonicated bacteria and sterile culture supernatant - Proceedings IPVS Copenhagen, 1980, S. 221), die die Anwesenheit von Antihärnolysin-Antikörpern

in Seren von gesundeten Schweinen und die neutralisierende Wirkung eines Serums eines hyperimmunen Kaninchensgegenüber hämolytischen und cytotoxischen Aktivitäten zeigten.

Van Leengoed et al. (Vaccination of pigs with toxin containing supernatant of H. pleuropneumcnlae-1988, Thesis „Pathogenic

studies on H. pleuropnoumonlae", State University of Utrecht) zeigten, daß ein Impfstoff auf Basis von Toxin des Serotyps 9, derin öligem Adjuvans hergestellt wurde, bei einem homologen Virulenztest beim Schwein einen Schutz vermittelte. Die geimpften

Tiere weisen Antikörper auf, die die hämolytischen und cytotoxischen Aktivitäten neutralisieren. Im Gegensatz dazu zeigten R. Hesse et al. (H. pleuropneumonlae vaccination - Challenge studies, 1984, IPVS de Ghent, Belgien, S. 111) daß ein Impfstoff auf Basis von Cytotoxin des Serotyps 1, das durch Hitze inaktiviert und ohne Adjuvans war, keinen Schutz bei einem homologen Virulenztest vermittelte und daß ein Impfstoff aus einem Toxin des Serotyps 1 und einer Emulsion

als Adjuvans nicht gegen eine Probe mit Serotyp 5 schützte. Sie demonstrierten einen Schutz für einen Impfstoff, der gleichzeitigdas Toxln und inaktivierte Bakterienzellen enthielt.

Schließlich zeigten J. Frey et al. (Biochemical and genetic characterization of Actlnobaclllus pleuropneumonlae hemolysin, 1988, IPVS de Rio de Janeiro, S. 79) die Bedeutung der Anwesenheit von Ca⁺⁴' im Kulturmedium für die Expression von Hämolysin bei

bestimmten Serotypen, insbesondere Serotyp 1. Das von ihnen verwendete Kulturmedium ist Columbia Broth mit einem Zusatzvon IsoVitaleX und NAD.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Impfstoff gegen Schweine-Hämophilose zur Verfügung zu stellen, der einen wirksamen Schutz gegen Serotyp 1 und zumindest teilweise gegen die anderen Serotypen von H. pleuropneumonlae vermittelt und sich

durch große Unschädlichkeit auszeichnet.

Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen weniger kostspieligen und leicht herzustellenden Impfstoff zur Verfügung zu

stellen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Schutzimpfstoff gegen Schweine-Hämophilose, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er das Toxin des Serotyps 1 von H. pleuropneumonlae, das der Träger einer cytotoxischen und hämolytischen Aktivität von H.

pleuropneumonlae ist, inaktiviert in Form von Anatoxin in einem Träger oder Hilfsstoff enthält, wie er bei der Zusammensetzungvon Impfstoffen verwendet wird.

Bevorzugt wird das Anatoxin durch Inaktivierung des Toxins durch Formalin erhalten. Vorzugsweise wird das Anatoxin durch ein Adjuvans unterstützt, insbesondere durch Aluminiumhydroxyd. Vorzugsweise liegt das Anatoxin in einer Endkonzentration von 50 Mg/ml vor. Vorzugsweise wird der Impfstoff entsprechend einer Menge von ΙΟΟμρ Anatoxin pro Dosis verabreicht. Vorzugsweise wird das Anatoxin, wie es in die Zusammensetzung des Impfstoffes eingeht, durch Reinigung des Überstandes

einer Kultur eines H. pleuropneumoniae-Stammes das Serotyps 1, der ein starker Toxinproduzent ist, in einem Medium miteinem Zusatz von Ca⁺⁺ und NAD, erhalten.

In einer vervollkommneten Ausführungsform kann der erfindungsgemäße Impfstoff zusätzlich zum Anatoxin des Serotyps 1,

wie definiert, ausgehend von einem passend, vorzugsweise mit Formalin inaktivierten Toxin, gereinigtes Anatoxin eines anderen

Serotyps, insbesondere der Typen 2,3,4,6,8 und 12, enthalten. Das Anatoxin dieses anderen Serotyps kann durch Konzentration und Reinigung eines Kulturüberstandes dieses Serotyps

erhalten werden, es kann aber auch, insbesondere wenn es sich um den Serotyp 2 handelt, durch Expression einesrekombinanten genetischen Vektors oder auch durch Peptidsynthese erhalten werden, wobei unter dem Anatoxin eines anderen

Serotyps, beispielsweise 2, auch das rekombinante Anatoxin sowie seine Bruchstücke, Varianten und Peptide verstanden

werden, die die passenden Epitope aufweisen.

Die Konzentration des Anatoxins des anderen Serotyps im Impfstoff ist vorzugsweise in der Größenordnung von 50pg/ml und

die verabreichte Dosis umfaßt gleichermaßen vorzugsweise eine Menge ähnlich derjenigen des Anatoxins von Serotyp 1.

Unter dem Anatoxin eines gegebenen Serotyps im Sinne der Erfindung versteht man entweder irgendein beliebiges oder die Gesamtheit der Polypeptide des Kulturüberstandes, denen die cytotoxischen und/oder hämolytischen Aktivitäten zugeschrieben

werden. Gleichwohl umfaßt oder besteht das Anatoxin für Serotyp 1 aus dem Hämolysin, und für den Serotyp 2, sofernanwesend, oder die anderen Serotypen bevorzugt man, daß es ein Polypeptid um 120KDa enthält oder aus diesem besteht, demeine cytotoxische Aktivität zugeschrieben wird.

Der erfindungsgemäße Impfsto.r wird bevorzugt intramuskulär, subcutan oder intracutan in einer oder zwei Injektionen

verabreicht.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Erhalt des für die cytotoxische und hämolytische Aktivität bei H.

pleuropneumoniae vom Serotyp 1 verantwortlichen Toxins für die Zusammensetzung von Schutzimpfstoffen des obenbeschriebenen Typs.

In diesem Verfahren selektioniert man einen Stamm von H. pleuropneumonlae vom Serotyp 1, der ein starker Produzent dieses Toxins ist, züchtet den selektionierten Stamm unter für die Expression des Toxins optimalen Bedingungen, gewinnt den Kulturüberstand zurück und extrahiert und reinigt das Toxin, dann inaktiviert man das Toxin, wobei die Inaktivierung nach jeder

geeigneten bekannten Technik, insbesondere durch Formalin, erfolgen kann.

Erfindungsgemäß kann man den selektionieien Stamm insbesondere in einem der folgenden drei Kulturmedien, die Ca⁺* und NAD enthalten, züchten:

Boillon Coeur-Cervelle-Medium, Bacto Columbia Broth-Medium, Wilkins-Chalgren-Medium.

Die Erfindung wird nunmehr mit Hilfe eines Verfahrens zum Erhalt des Toxins des Serotyps 1 und von Impftests bei der Maus und beim Schwein näher beschrieben.

I. Verfahren zum Erhalt des Toxins Als Stamm für Serotyp 1 wurde der von Shope, R. E. (1964), J. Exp. Mod. 119,357-368, beschriebene Stamm aufgrund seiner

beträchtlichen Toxinproduktion ausgewählt.

Das verwendete Kulturmedium muß Ca⁺* und NAD enthalten. Bouillon Coeur-Cervelle-Medium (BioMerieux), Bacto Columbia Broth-Medium (Difco) und Wilkins-Chalgren-Medium sind besonders geeignet. In diesem Verfahren wird Bacto Columbia Broth-Medium mit einem Zusatz von 10mM CaCI₂ und 15 mM NAD verwendet. Eine lyophilisierte Ampulle des Kulturstammes wird für 18h bei 37⁰C unter Umschütteln in 5ml Medium gegeben. Anschließend

beimpft man 100ml Medium und kultiviert 6h bei 37⁰C unter Schütteln.

In diesem Stadium kann die Kultur durch Zugabe von Formaldehyd in einer Menge von 1,6mg/ml inaktiviert werden. Anschließend zentrifugiert rv.an die Kultur bei 7000g 20 Minuten lang. Man konzentriert den Überstand durch Ammoniumsulfatfällung bei 40%iger Sättigung während 30 Minuten bei 4°C und unter Umschütteln. Der nach lOminütiger Zentrifugation bei 10000g erhaltene Niederschlag wird in TNC Puffer (Tris HCI 1OmM, NaCI 9%, CaCI₂1OmM) wieder

aufgenommen.

Das Toxin kann auch durch Ultrafiltration (Ausschlußschwelle: 10000Da) konzentriert werden. Das Konzentrat kann durch Hitze,

1 h bei 56⁰C, inaktiviert werden.

Das Toxin wird anschließend durch zwei aufeinander folgende Gelfiltrations-Chromatografien über S200 HR (Pharmacia-LKB)

gereinigt. Der Auftrennungsbereich dieses Gels liegt zwischen 50000 und 250000 für globuläre Proteine. Die Charkteristiken der

Säule sind wie folgt:

Gelvolumen	190ml
Höhe	95cm
Querschnitt	2 cm
Porenvolumen	10ml
Durchflußmenge	20 ml/h
Elutionspuffer	Tris HCI 1OmM
	NaC! 9%
	CaCI₂IOmM

Das Profil der PAGE-SDS Elektrophorese (nach Laemli, 1970, Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4, Natur 227,680-685) zeigt eine einzige Bande, nie einem Molekulargewicht von 105 KDa entspricht (Figur 1). Es scheint also, daß für den Serotyp 1 nur ein einziges Toxin existiert, das für die zwei Aktivitäten, cytotoxisch und hämolytisch, verantwortlich ist. In jedem Fall schließt der Impfstoff in Übereinstimmung mit der Erfindung das Anatoxin vom Molekulargewicht von 105KDa ein, selbst wenn andere antigene Komponenten anwesend oder nicht anwesend sein können.

II. Herstellung eines Impfstoffs

Der Impfstoff wird ausgehend von gereinigtem Anatoxin, das wie oben erhalten wurde, hergestellt. Die Formulierung an Anatoxin basiert auf dem hämolytischen Titer vor Inaktivierung (Titer von ungefähr 3) und läßt sich auch nach anderen Tests vornehmen (z. B. ELISA). Das Anatoxin wird durch ein Aluminiumoxid-Gel (0,7mg/ml) als Adjuvans unterstützt und wird zu 1,6mg/ml formuliert.

IM. Impftest bei Mausen Der oben beschriebene Impfstoff wurde bei einer Testimpfung an Mäusen getestet: Die Mäuse erhalten am Tag 0 0,5ml Impfstoff subcutan verabreicht. Der Versuch wird am Tag 21 durch intraperitoneale Injektion

von unter 0,5ml von 10 lethalen Dosen 50% bei Mäusen abgeschlossen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1

dargestellt:

Die Resultate sind ausgedrückt als Todesfälle pro 10 getesteter Mäuse: Tabelle I

Serotyp-Test	Konfrontiere	,Anatoxin"
		Impfstoff
1	9	0
2	4	0
3	9	3
4	8	3
5	5	0
6	5	0
7	9	2
8	7	1
9	5	0
10	10	2
11	10	3
12	10	3

Dies zeigt, daß der Impfstoff im Maus-Beispiel einen wirksamen und hetereologen Schutz gegenüber allen beschriebenen Serotypen, vermittelt, von dem man auf die Spezies Schwein schließen kann.

IV. Impftest beim Schwein Zwei Gruppen von Ferkeln EOPS (EOPS = frei von spezifischen pathogenen Organismen) werden unter denselben Bedingungen

gezüchtet. Die eine Gruppe wird im Alter von 8 Wochen und 12 Wochen geimpft. Die andere Gruppe dient als Kontrolle.

Die beiden Gruppen werden im Alter von 14 Wochen mit Serotyp 9 (heterologer Test) auf intranasalem Weg getestet (10* Keime). Die Ergebnisse sind in der folgonden Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2 Klinische Sterblichkeit Lungenschä- Symptome digungen

geimpfte

Schweinegruppe 0 0

(für 8 Schweine) (kleine

Abszesse) Kontrollgruppe

(für 8 Schweine) 8 8

(in48h)

Diese Ergebnisse zeigen gut die Wirksamkeit des erfindungsgen.'ßen Impfstoffs. Zur Herstellung eines Impfstoffes, der auch Anatoxin von Serotyp 2 enthält, kann man von einer Kultur des Stammes dieses Sorotyps unter identischen oder ähnlichen Bedingungen wie den oben beschriebenen ausgehen. Der Kulturüberstand wird zentrifugiert, danach durch Ammoniumsulfatfällung konzentriert, und der wieder aufgenommene Niederschlag anschließend durch lonenaustausch-Chromatographie gefolgt von einer Gelfiltration oder von einer Chromatografie über ein Hydroxyl-Apatit-Gel gereinigt. Die Inaktivierung des gereinigten Toxins wird bevorzugt mit Formalin

durchgeführt.

Für die anderen Serotypen wie 3,4,8,8,12, kann man wie für das Anatoxin von Serotyp 1 vorgehen.

Claims

1. Schutzimpfstoff gegen Schweine-Hämophilose, dadurch gekennzeichnet, daß er das Toxin des Serotyps 1 von Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, das der Träger einer cytotoxischen und hämolytischen Aktivität von H. pleuropneumoniae ist, inaktiviert in Form von Anatoxin in Einern Träger oder Hilfsstoff enthält, wie er bei der Zusammensetzung von Impfstoffen verwendet wird.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Toxin durch Formalin inaktiviert wird.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Anatoxin durch Aluminiumhydroxid als Adjuvans unterstützt wird.

4. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Anatoxin in einer Endkonzentration von 50^g/ml vorliegt.

5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er entsprechend einer Menge von 100pg Anatoxin pro Dosis verabreicht wird.

6. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Toxin durch Reinigung des Überstandes einer Kultur eines H. pleuropneumoniae-Stammes des Serotyps 1, der ein starker Toxinproduzent ist, in einem Medium mit einem Zusatz von Calcium⁺⁺ und NAD, erhalten wird.

7. Impfstoff nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ebenso ein inaktiviertes gereinigtes Anatoxin eines anderen Serotyps 2,3,4, 6,8 und 12 enthält.

8. Impfstoff nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Anatoxin von Serotyp 2 oder eine Variante oder ein Peptidäquivalent durch genetische Rekombination oder Peptidsynthese erhalten wird.

9. Verfahren zum Erhalt des Toxins, das für die cytotoxische und hämolytische Aktivität bei Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae des Serotyps 1 verantwortlich ist für die Zusammensetzung von Schutzimpfstoffen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von H. pleuropneumoniae des Serotyps 1, der ein starker Produzent dieses Toxins ist, selektioniert, den selektionierten Stamm unter für die Expression des Toxins optimalen Bedingungen kultiviert, den Kulturüberstand wiedergewinnt und das Toxin extrahiert und reinigt, und dann das Toxin inaktiviert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den selektionierten Stamm mit einem Bouillon Coeur-Cervelle-Medium, das Calcium⁺⁺ und NAD enthält, kultiviert.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den selektionierten Stamm mit einem Bacto Columbia Broth-Medium, das Calcium⁺⁺ und NAD enthält, kultiviert.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeicnnet, daß man den selektionierten Stamm mit einem Wilkins-Chalgren-Medium, das Calcium⁺⁺ und NAD enthält, kultiviert.