PT95396B - Processo para a preparacao duma vacina para a proteccao contra a hemofilose suina - Google Patents

Description

Entretanto, as tentativas de preparação de vacinas submidade a partir de lipopolisacarídeo, do polissacarídeo capsular e de proteínas da membrana extensiva não chegaram a bom termo: o efeito de protecção é insuficiente e específico.

interesse focou-se na hemodisina (toxina bemolítica) a seguir aos trabalhos de Bendixen et al (Toxicity of Haemophilus pneuropneumoniae por porcine lung macrophages, peripheral blood monocytes and testiculae eells-Infect. Immunm. 1981, 33, 673-676) e de Rosendal et al. (H. pleuropenumoniae lung lesinos induced by sanicated bactéria and sterite culture supernatant-Proceedings LPVS Gopenhagen, 1980, P.221) que mostraram a presença de anticorpos antihemolisina nos soros dos porcos convalescentes e o efeito neutralizante de um soro de coelho hiper-imune para a actividades hemolíticas e citotóxicas.

Van Leengoed et al. (Vaccination of pigs with toxin containing supernatant of H. pleuropneumoniae - 1988, Thesis Pathogenis Studies on H.Pleur opneumoniae , State University of Utrenht) mostraram que uma vacina à base de toxina do sorotipo 9 preparada num agente adjuvante oleoso conferia uma protecção na altura de uma prova virulenta homóloga no porco. Os animais vacinados apresentam anticorpos que neutralizam as actividades homelíticas e citotóxicas.

Em compensação, R. Hesse et al. (H. ple uro pne umaiae vaccina-

tion - Ohallenge Studes, 1984, IPVS de Ghent, Bélgica, p. 111) mostraram que uma vacina à base de citotoxina do sorotipo 1 inaotivada pelo calor e sem agente adjuvante não conferia protecção na altura de uma prova virulenta homóloga e que uma vacina comporta por toxina do sorotipo 1 tendo oomo agente adjuvante uma emulsão não protegia contra uma prova pelo sorotipo 5. Demonstravam uma prorecção por uma vacina compreendendo no conjunto a toxina e corpos bacterianos inactivados.

Por fim, J. Prey et al. (Biochemical and genetic oharacterization of Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin, 1988, IPVS de Rio de Janeiro, p. 79) mostraram a importância da presença de Ca⁺⁺ no meio de cultura para expressão da hemolisina em alguns sorotipos espeeialmente no sorotipo 1. 0 meio de cultura que utilizaram é o Columbia Broth, a que se adicionou IsoVatilex e HAD.

A invenção tem por objectivo proporcionar uma vacina contra a hemofilase siina que confere uma protecçâo eficaz contra o soro tipo 1 e, pelo menos parcial oontra os outros sorotipos de H. pleuropneumoniae e que apresenta uma grande inocuidade.

Um outro objectivo da invenção é fornecer uma vacina pouco one rosa e fácil de produzir.

A invenção tem por objecto uma vacina para a protecçâo contra a hemofilase suina, caracterizada por compreender a toxina inactivada sob a forma de anatoxina, do sorotipo 1 de Ξ. ropneumoniae, que é o suporte de uma actividade citotóxica e hemolítica de H. pleuropneumoniae, num agente veicular ou exhipiente do tipo dos utilizados na constituição de vacinas.

Ê preferível que a anatoxina seja obtida por inactivação da toxina pelo formol.

De preferência, a anatoxina está combinada com agente adjuvante, espeeialmente o hidróxido de alumínio.

De preferência, a anatoxina encontra-se a uma concentração final de 50 microgramas/ml.

Be preferência, a vacina é administrada à razão de 100 microgramas de anatoxina pôr dose.

Be preferência, a anatoxina que entra na constituição da vacina é obtida por purificação do líquido sobrenadante de uma cultura de uma estirpe de H. pleuropneumoniae de sorotipo 1 fortemente produtora de toxina, num meio s, que e adicionado Oa e :IAD (ííAD = dispersante não aquoso).

Duma forma de realização aperfeiçoada, a vacina, de acordo com. a presente invenção, pode compreender, além da anatoxina do sorotipo 1, assim definida, anatoxina purificada de um outro sorotipo, espeeialmente 2, 3, 4, 6, 8 e 12 a partir da toxina convenientemente inactivada, de preferência por formol.

A anatoxina deste outro sorotipo pode ser obtido por concentração e purificação a partir de um líquido sobrenadante de cultura do sorotipo, mas por também principalmente, se se tratar do sorotipo 2, obter-se por expressão de um vector recombinante genético, e entende-se igualmente por anatoxina de outro sorotipo, por exemplo 2, a anatoxina recombinante bem como as suas fracções variantes e péptidos que apresentem epitópos pertinentes, ou ainda por síntese peptidica.

A concentração da anatoxina do outro sorotipo na toxina é, de preferência, da ordem dos 50 microgramas/ml e a dose administrada compreende igualmente, de preferência, uma quantidade similar àquela da anatoxina do sorotipo 1.

Por anatoxina, de um sorotipo dado, no sentido atribuído pela

envenção, entende-se tanto um qualquer como a totalidade dos polipéptidos do líquido sobrenadante de cultura aos quais são atribuídos actividades citotóxica e/ou hemolíticas. No entanto, para o sqrotipo 1, a anatoxina compreende ou é constituída por, hemolisina e, para o sorotipo 2, se se encontra presente, ou para os outros sorotipos, é preferível que contenha, ou seja constituído por um polipéptido de cerca de 120 KDa, a que se atribui uma actividade citotóxica,

A vacina, de acordo com a invenção, é de preferência administrada por via entramuscular, subcutânea ou intradérmica, numa ou em duas injecções.

A invenção tem igualmente por objecto um processo de obtenção da toxina responsável pela actividade citotóxica e hemolítica na H, pleuropneumoniae de sorotipo 1, para a constituição de vacinas para a protecção de tipo descrito acima.

Neste process, selecciona-se uma estirpe de H. pleuropneumoniae de sorotipo 1 fortemente produtora da referida toxina, cultiva-se a estirpe seleccionada em condições óptimas de expressão da toxina, recupera-se o líquido sobrenadante de cultura e extrai-se e purifica-se a toxina, a seguir ao que se inactiva a toxina, podendo a inactívação ser efectuada de acordo com qualquer técnica conhecida apropriada, especialmente pelo formol.

De acordo com a invenção, pode cultivar-se a estirpe seleccionada nomeadamente num dos três meios de cultura seguintes, contendo Ca*⁺ e NADí

- meio de caldo de coração e cérebro,

- meio Bacto Columbia Broth,

- meio de Vilkins-Chalgran.

A invenção vai agora ser descrita mais em pormenor com a ajuda de um processo de obtenção da toxina do sorotipo 1 e com a ajuda de experiências de vacinação no rato e no porco.

I. Processo de obtenção de toxina

Escolheu-se a estirpe do sorotipo 1 descrita por Shope R. Ξ. (1964), -J. Exp. Med. 119, 357—368 em virtude da sua produção importante de toxina.

meio de cultura utilizado deve conter 0a⁺⁺ e 1TAB. Os meios caldo de coração e cérebro (BioMérieux), Bacto Golumbia Broth (Bijco) e Wilkins-Ghalgren são especialmente convenientes.

Reste processo, utiliza-se 0 meio Bacto Golumbia Broth, a que se adicionam 10 mM de CaC₂ e 5 mM de BAB.

Ooloca-se uma ampola liofilizada da estirpe em cultura em 5 ml de meio durante 18 horas a 37-C e sob agitação. Inoculam-se de seguida 100 ml de meio e cultiva-se 6 horas a 37²C, sob agitação.

Besta fase a cultura pode ser inactivada através da adição de formaldeído a 1,6 mg/ml.

Centrifuga-se de seguida a cultura a 7000 g durante 20 minutos Concentra-se 0 líquido de amónio a 40 de saturação, durante 30 minutos a 4²C e sob agitação. 0 precipitado obtido após centrifugação a 10000 g durante 10 mn é tomado num tampão ΤΙΤΟ (Tris HCl 10 ml, BaC₂ 9 Ca01₂ 10 mM).

A toxina pode também ser concentrada através de ultrafiltração (limiar de separação: 10 000 Ba). 0 concentrado pode ser inactivado por calor, uma hora a 56 °G.

A toxina é depois purificada através de duas cromatografias sucessivas de filtração por gel S200 HR (Pharmacia-1KB). 0 domínio de fraccionamento deste gel situa-se entre 50 000 e 250 000 para as proteínas globulares. As características da coluna são as seguintes:

Volume Altura	de	gel	190 95	ml cm
Secção			2	cm
Volume	de	depósito	10	ml
Débito			20	ml/h
Tampão	de	elução	Tris H01 10 mM
			NaCl 9	%
			Ca012	10 mM.

perfil em electroforese PAGB-SDS (de acordo com laemli, 1970 Gleavage of Strutural protein during the assembly of the head of hacteriophage T4, Nature 227» 680-685) mostra uma única banda, que corresponde a um peso molecular de 105 KDa (Pigura 1). Parece, pois, que não existe, para o sorotipo 1, mais que uma única toxina responsável pelas duas actividades, citotóxica e hemolítica. Em todo o caso, de acordo com a invenção, a vacina inclui a anatoxina de peso molecular 105 KDa, mesmo que outros componentes antigénicos possam, ou não, estar presentes

II. Preparação de uma vacina

A vaidna é preperada a partir da anatoxina purificada obtida como foi referido em cima. A formulação de anatoxina faz-se com base no título hemolítico antes de inactivação (título de 3, mais ou menos) e pode também fazer-se de acordo com outros testes (B1ISÁ, por exemplo). A anatoxina tem oomo agente coad9

juvante gel de alumina (0,7 mg/ml) e é formulada a 1,6 mg/ml.

III. Ensaio de vacinação do rato

A vacina supracitada foi estada por ocasião de uma vacinação em ratos:

os ratos recebem no dia O 0,5 ml de vacina por via sub-cutânea. A prova é realizada no dia 2 por injec· ção de 10 doses letais 50 % por rato por via intraperitonial sob 0,5 ml. Os resultados figuram no qua dro 1 que se segue:

os resultados encontram-se expressos em número de mortos por cada 10 ratos testados:

orotipo da prova

Testemunha

Vacina anatoxina”

0

0

3

3

0

0

2

1

0

2

3

3

Isto demonstra que a vacina confere uma protecção eficaz e heteróloga face a todos os sorotipos descritos no modelo rato, extrapolável à espécie suina.

IV. Experiência de vacina no porco

Dois grupos de leitões OPS (isentos de organismos patogénicos específicos) são criados nas mesmas condições. Um dos grupos é vacinado às 8 semanas e às 12 semanas. 0 outro grupo serve de testemunha.

Os dois grupos são testados às 14 semanas com o sorotipo 9 (prova heterõloga) por via intranasal (10^’ germes).

Os resultados encontram-se reagrupados no quadro 2 que se segue.

	Sintomas ! clínicos	Mortalidade	lesões pulmonares
Grupos de porcos vacinados (por 8 porcos)	0	0	1 (pequenos ahcessos)
Grupo testemunha (por 8 porcos)	8	8 (em 48 h)	8

Estes resultados demonstram hem a eficácia da vacina de acordo com a invenção.

Para se preparar uma vacina, que contenha igualmente a anatoxina do sorotipo 2, pode proceder-se a uma cultura da estirpe deste sorotipo em condições idênticas ou. similares às descritas.

líquido sobrenadante de cultura é centrifugado, depois concentrado por precipitação com sulfato de amónio, sendo o precipitado tomado de novo, de seguida purificado por cromatografia por permuta de iões, seguida de uma filtração por gel, ou por cromatografia sobre gel de hidroxi-apatite. A inactivação da toxina purificada é feita de preferência com formol.

Para os outros sorotipos, tais como os 3, 4, 6, 8, 12, pode proceder-se como para a anatoxina de sorotipo 1.

Claims (11)

1. RBIYIfíSIQAgÕBS

   1^. - Processo para a preparação duma vacina de protecção con tra a hemolifose suina, caracterizado pelo facto de se misturar a toxina, desactivada sob a forma de anatoxina, do sorotl po 1 de I-Iemophilus (Actinobacillus) pleuropne umoniae, que é o suporte duma actividade citotóxica e hemolítica de H. pleuropne umoniae, com um agente vciular ou um excipiente do tipo correntemente utilizado na constituição de vacinas.
2. 2&. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se desactivar a toxina por meio de formol.
3. 3^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracte rizado pelo facto de se adicionar hidróxido de alumínio como agente adjuvante da anatoxina.
4. 4^â. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de a proporção de anatoxina para excipiente ser de preferência igual a cerca de 50 microgramas por mililitro.
5. 5^Ê. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de cada dose de vacina conter 100 /Ug de anatoxina.
6. 6&. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se obter a toxina por purificação do líquido sobrenadante de uma cultura duma estirpe original de H. ple uropneumoniae de sorotipo 1, fortemente produtora de toxinas, num meio ao qual se adicionaram Oa e dispersante não aquoso (IWD).
7. 7-. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se obter uma vacina que contém igualmente uma anatoxina purificada desactivada dum outro soro tipo 2,3, 4,6, 8 e 12.
8. 8ã. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se obter a anatoxina do sorotipo 2, ou uma variante ou um péptido equivalente, por recombinação genética ou síntese peptídica.
9. 9^â. - Processo para a preparação da toxina responsável pela actividade citotóxica e hemolítica do Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae de sorotipo 1 apropriada para a preparação de vacinas de acordo com qualquer reivindicação 1 a 7, caracterizado pelo facto de uma estirpe de H, pleuropneumoniae de sorotipo 1, fortemente produtora da citada toxina, se cultivar a estirpe escolhida em condições óptimas de expressão da toxina, se recuperar o líquido sobrenadante da cultura, se extrair e purificar a toxina e, em seguida, se desactivar a toxina.

   103. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se cultivar a estirpe escolhida num meio de cultura de caldo (de coração e cérebro) contendo Ga⁺⁺ e £TaD.
10. 11&. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se cultivar a estirpe escolhida num meio de cul++ tura de caldo de Bacto Columbia contendo Oa e HaB.
11. 12^s. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se cultivar a estirpe escolhida num meio de cultura de Vilkins - Chalgren contendo Ca⁺⁺ e NaD.