PT95396B - Processo para a preparacao duma vacina para a proteccao contra a hemofilose suina - Google Patents
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Description
Entretanto, as tentativas de preparação de vacinas submidade a partir de lipopolisacarídeo, do polissacarídeo capsular e de proteínas da membrana extensiva não chegaram a bom termo: o efeito de protecção é insuficiente e específico.
interesse focou-se na hemodisina (toxina bemolítica) a seguir aos trabalhos de Bendixen et al (Toxicity of Haemophilus pneuropneumoniae por porcine lung macrophages, peripheral blood monocytes and testiculae eells-Infect. Immunm. 1981, 33, 673-676) e de Rosendal et al. (H. pleuropenumoniae lung lesinos induced by sanicated bactéria and sterite culture supernatant-Proceedings LPVS Gopenhagen, 1980, P.221) que mostraram a presença de anticorpos antihemolisina nos soros dos porcos convalescentes e o efeito neutralizante de um soro de coelho hiper-imune para a actividades hemolíticas e citotóxicas.
Van Leengoed et al. (Vaccination of pigs with toxin containing supernatant of H. pleuropneumoniae - 1988, Thesis Pathogenis Studies on H.Pleur opneumoniae , State University of Utrenht) mostraram que uma vacina à base de toxina do sorotipo 9 preparada num agente adjuvante oleoso conferia uma protecção na altura de uma prova virulenta homóloga no porco. Os animais vacinados apresentam anticorpos que neutralizam as actividades homelíticas e citotóxicas.
Em compensação, R. Hesse et al. (H. ple uro pne umaiae vaccina-
tion - Ohallenge Studes, 1984, IPVS de Ghent, Bélgica, p. 111) mostraram que uma vacina à base de citotoxina do sorotipo 1 inaotivada pelo calor e sem agente adjuvante não conferia protecção na altura de uma prova virulenta homóloga e que uma vacina comporta por toxina do sorotipo 1 tendo oomo agente adjuvante uma emulsão não protegia contra uma prova pelo sorotipo 5. Demonstravam uma prorecção por uma vacina compreendendo no conjunto a toxina e corpos bacterianos inactivados.
Por fim, J. Prey et al. (Biochemical and genetic oharacterization of Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin, 1988, IPVS de Rio de Janeiro, p. 79) mostraram a importância da presença de Ca++ no meio de cultura para expressão da hemolisina em alguns sorotipos espeeialmente no sorotipo 1. 0 meio de cultura que utilizaram é o Columbia Broth, a que se adicionou IsoVatilex e HAD.
A invenção tem por objectivo proporcionar uma vacina contra a hemofilase siina que confere uma protecçâo eficaz contra o soro tipo 1 e, pelo menos parcial oontra os outros sorotipos de H. pleuropneumoniae e que apresenta uma grande inocuidade.
Um outro objectivo da invenção é fornecer uma vacina pouco one rosa e fácil de produzir.
A invenção tem por objecto uma vacina para a protecçâo contra a hemofilase suina, caracterizada por compreender a toxina inactivada sob a forma de anatoxina, do sorotipo 1 de Ξ. ropneumoniae, que é o suporte de uma actividade citotóxica e hemolítica de H. pleuropneumoniae, num agente veicular ou exhipiente do tipo dos utilizados na constituição de vacinas.
Ê preferível que a anatoxina seja obtida por inactivação da toxina pelo formol.
De preferência, a anatoxina está combinada com agente adjuvante, espeeialmente o hidróxido de alumínio.
De preferência, a anatoxina encontra-se a uma concentração final de 50 microgramas/ml.
Be preferência, a vacina é administrada à razão de 100 microgramas de anatoxina pôr dose.
Be preferência, a anatoxina que entra na constituição da vacina é obtida por purificação do líquido sobrenadante de uma cultura de uma estirpe de H. pleuropneumoniae de sorotipo 1 fortemente produtora de toxina, num meio s, que e adicionado Oa e :IAD (ííAD = dispersante não aquoso).
Duma forma de realização aperfeiçoada, a vacina, de acordo com. a presente invenção, pode compreender, além da anatoxina do sorotipo 1, assim definida, anatoxina purificada de um outro sorotipo, espeeialmente 2, 3, 4, 6, 8 e 12 a partir da toxina convenientemente inactivada, de preferência por formol.
A anatoxina deste outro sorotipo pode ser obtido por concentração e purificação a partir de um líquido sobrenadante de cultura do sorotipo, mas por também principalmente, se se tratar do sorotipo 2, obter-se por expressão de um vector recombinante genético, e entende-se igualmente por anatoxina de outro sorotipo, por exemplo 2, a anatoxina recombinante bem como as suas fracções variantes e péptidos que apresentem epitópos pertinentes, ou ainda por síntese peptidica.
A concentração da anatoxina do outro sorotipo na toxina é, de preferência, da ordem dos 50 microgramas/ml e a dose administrada compreende igualmente, de preferência, uma quantidade similar àquela da anatoxina do sorotipo 1.
Por anatoxina, de um sorotipo dado, no sentido atribuído pela
envenção, entende-se tanto um qualquer como a totalidade dos polipéptidos do líquido sobrenadante de cultura aos quais são atribuídos actividades citotóxica e/ou hemolíticas. No entanto, para o sqrotipo 1, a anatoxina compreende ou é constituída por, hemolisina e, para o sorotipo 2, se se encontra presente, ou para os outros sorotipos, é preferível que contenha, ou seja constituído por um polipéptido de cerca de 120 KDa, a que se atribui uma actividade citotóxica,
A vacina, de acordo com a invenção, é de preferência administrada por via entramuscular, subcutânea ou intradérmica, numa ou em duas injecções.
A invenção tem igualmente por objecto um processo de obtenção da toxina responsável pela actividade citotóxica e hemolítica na H, pleuropneumoniae de sorotipo 1, para a constituição de vacinas para a protecção de tipo descrito acima.
Neste process, selecciona-se uma estirpe de H. pleuropneumoniae de sorotipo 1 fortemente produtora da referida toxina, cultiva-se a estirpe seleccionada em condições óptimas de expressão da toxina, recupera-se o líquido sobrenadante de cultura e extrai-se e purifica-se a toxina, a seguir ao que se inactiva a toxina, podendo a inactívação ser efectuada de acordo com qualquer técnica conhecida apropriada, especialmente pelo formol.
De acordo com a invenção, pode cultivar-se a estirpe seleccionada nomeadamente num dos três meios de cultura seguintes, contendo Ca*+ e NADí
- meio de caldo de coração e cérebro,
- meio Bacto Columbia Broth,
- meio de Vilkins-Chalgran.
A invenção vai agora ser descrita mais em pormenor com a ajuda de um processo de obtenção da toxina do sorotipo 1 e com a ajuda de experiências de vacinação no rato e no porco.
I. Processo de obtenção de toxina
Escolheu-se a estirpe do sorotipo 1 descrita por Shope R. Ξ. (1964), -J. Exp. Med. 119, 357—368 em virtude da sua produção importante de toxina.
meio de cultura utilizado deve conter 0a++ e 1TAB. Os meios caldo de coração e cérebro (BioMérieux), Bacto Golumbia Broth (Bijco) e Wilkins-Ghalgren são especialmente convenientes.
Reste processo, utiliza-se 0 meio Bacto Golumbia Broth, a que se adicionam 10 mM de CaC2 e 5 mM de BAB.
Ooloca-se uma ampola liofilizada da estirpe em cultura em 5 ml de meio durante 18 horas a 37-C e sob agitação. Inoculam-se de seguida 100 ml de meio e cultiva-se 6 horas a 372C, sob agitação.
Besta fase a cultura pode ser inactivada através da adição de formaldeído a 1,6 mg/ml.
Centrifuga-se de seguida a cultura a 7000 g durante 20 minutos Concentra-se 0 líquido de amónio a 40 de saturação, durante 30 minutos a 42C e sob agitação. 0 precipitado obtido após centrifugação a 10000 g durante 10 mn é tomado num tampão ΤΙΤΟ (Tris HCl 10 ml, BaC2 9 Ca012 10 mM).
A toxina pode também ser concentrada através de ultrafiltração (limiar de separação: 10 000 Ba). 0 concentrado pode ser inactivado por calor, uma hora a 56 °G.
A toxina é depois purificada através de duas cromatografias sucessivas de filtração por gel S200 HR (Pharmacia-1KB). 0 domínio de fraccionamento deste gel situa-se entre 50 000 e 250 000 para as proteínas globulares. As características da coluna são as seguintes:
Volume Altura | de | gel | 190 95 | ml cm |
Secção | 2 | cm | ||
Volume | de | depósito | 10 | ml |
Débito | 20 | ml/h | ||
Tampão | de | elução | Tris H01 10 mM | |
NaCl 9 | % | |||
Ca012 | 10 mM. |
perfil em electroforese PAGB-SDS (de acordo com laemli, 1970 Gleavage of Strutural protein during the assembly of the head of hacteriophage T4, Nature 227» 680-685) mostra uma única banda, que corresponde a um peso molecular de 105 KDa (Pigura 1). Parece, pois, que não existe, para o sorotipo 1, mais que uma única toxina responsável pelas duas actividades, citotóxica e hemolítica. Em todo o caso, de acordo com a invenção, a vacina inclui a anatoxina de peso molecular 105 KDa, mesmo que outros componentes antigénicos possam, ou não, estar presentes
II. Preparação de uma vacina
A vaidna é preperada a partir da anatoxina purificada obtida como foi referido em cima. A formulação de anatoxina faz-se com base no título hemolítico antes de inactivação (título de 3, mais ou menos) e pode também fazer-se de acordo com outros testes (B1ISÁ, por exemplo). A anatoxina tem oomo agente coad9
juvante gel de alumina (0,7 mg/ml) e é formulada a 1,6 mg/ml.
III. Ensaio de vacinação do rato
A vacina supracitada foi estada por ocasião de uma vacinação em ratos:
os ratos recebem no dia O 0,5 ml de vacina por via sub-cutânea. A prova é realizada no dia 2 por injec· ção de 10 doses letais 50 % por rato por via intraperitonial sob 0,5 ml. Os resultados figuram no qua dro 1 que se segue:
os resultados encontram-se expressos em número de mortos por cada 10 ratos testados:
orotipo da prova
Testemunha
Vacina anatoxina”
0
0
3
3
0
0
2
1
0
2
3
3
Isto demonstra que a vacina confere uma protecção eficaz e heteróloga face a todos os sorotipos descritos no modelo rato, extrapolável à espécie suina.
IV. Experiência de vacina no porco
Dois grupos de leitões OPS (isentos de organismos patogénicos específicos) são criados nas mesmas condições. Um dos grupos é vacinado às 8 semanas e às 12 semanas. 0 outro grupo serve de testemunha.
Os dois grupos são testados às 14 semanas com o sorotipo 9 (prova heterõloga) por via intranasal (10^’ germes).
Os resultados encontram-se reagrupados no quadro 2 que se segue.
Sintomas ! clínicos | Mortalidade | lesões pulmonares | |
Grupos de porcos vacinados (por 8 porcos) | 0 | 0 | 1 (pequenos ahcessos) |
Grupo testemunha (por 8 porcos) | 8 | 8 (em 48 h) | 8 |
Estes resultados demonstram hem a eficácia da vacina de acordo com a invenção.
Para se preparar uma vacina, que contenha igualmente a anatoxina do sorotipo 2, pode proceder-se a uma cultura da estirpe deste sorotipo em condições idênticas ou. similares às descritas.
líquido sobrenadante de cultura é centrifugado, depois concentrado por precipitação com sulfato de amónio, sendo o precipitado tomado de novo, de seguida purificado por cromatografia por permuta de iões, seguida de uma filtração por gel, ou por cromatografia sobre gel de hidroxi-apatite. A inactivação da toxina purificada é feita de preferência com formol.
Para os outros sorotipos, tais como os 3, 4, 6, 8, 12, pode proceder-se como para a anatoxina de sorotipo 1.
Claims (11)
- RBIYIfíSIQAgÕBS1^. - Processo para a preparação duma vacina de protecção con tra a hemolifose suina, caracterizado pelo facto de se misturar a toxina, desactivada sob a forma de anatoxina, do sorotl po 1 de I-Iemophilus (Actinobacillus) pleuropne umoniae, que é o suporte duma actividade citotóxica e hemolítica de H. pleuropne umoniae, com um agente vciular ou um excipiente do tipo correntemente utilizado na constituição de vacinas.
- 2&. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se desactivar a toxina por meio de formol.
- 3a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracte rizado pelo facto de se adicionar hidróxido de alumínio como agente adjuvante da anatoxina.
- 4â. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de a proporção de anatoxina para excipiente ser de preferência igual a cerca de 50 microgramas por mililitro.
- 5Ê. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de cada dose de vacina conter 100 /Ug de anatoxina.
- 6&. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se obter a toxina por purificação do líquido sobrenadante de uma cultura duma estirpe original de H. ple uropneumoniae de sorotipo 1, fortemente produtora de toxinas, num meio ao qual se adicionaram Oa e dispersante não aquoso (IWD).
- 7-. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se obter uma vacina que contém igualmente uma anatoxina purificada desactivada dum outro soro tipo 2,3, 4,6, 8 e 12.
- 8ã. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se obter a anatoxina do sorotipo 2, ou uma variante ou um péptido equivalente, por recombinação genética ou síntese peptídica.
- 9â. - Processo para a preparação da toxina responsável pela actividade citotóxica e hemolítica do Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae de sorotipo 1 apropriada para a preparação de vacinas de acordo com qualquer reivindicação 1 a 7, caracterizado pelo facto de uma estirpe de H, pleuropneumoniae de sorotipo 1, fortemente produtora da citada toxina, se cultivar a estirpe escolhida em condições óptimas de expressão da toxina, se recuperar o líquido sobrenadante da cultura, se extrair e purificar a toxina e, em seguida, se desactivar a toxina.103. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se cultivar a estirpe escolhida num meio de cultura de caldo (de coração e cérebro) contendo Ga++ e £TaD.
- 11&. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se cultivar a estirpe escolhida num meio de cul++ tura de caldo de Bacto Columbia contendo Oa e HaB.
- 12s. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se cultivar a estirpe escolhida num meio de cultura de Vilkins - Chalgren contendo Ca++ e NaD.
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