TWI615158B - 多肽之調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明是有關於穩定的醫藥組成物，其包含具有至少兩個抗原-結合域的多肽且尤其適於皮下投與。本發明提供液體組成物，其將非所欲多肽團聚體(二聚體及/或多聚體)的形成減至最低。本發明進一步提供一種用以在液體組成物中將具有抗原-結合域的多肽團聚降至最低的方法。

Description

多肽之調配物
本發明是有關於穩定的醫藥組成物，其包含具有至少兩個抗原-結合域的多肽且尤其適於皮下投與。本發明提供液體組成物，其將非所欲多肽團聚體(二聚體及/或多聚體)的形成減至最低。本發明進一步提供一種用以在液體組成物中將具有抗原-結合域的多肽團聚降至最低的方法。
在先前技藝中已知需要使溶液中的抗體穩定化(亦即防止形成二聚體與多聚體)(已知為高分子量或HMW團聚體)，以維持治療活性恆定。WO2011061712揭示經穩定的抗體調配物，除了25-250mg/ml抗體以外，其含有10-30mM緩衝劑(較佳為乙酸鹽、琥珀酸鹽、磷酸鹽、組胺酸或其組合)、1-15%多元醇以及0.001-0.05%濕潤劑。組成物的pH介於5-7.5。
WO2010148337(A1)(“用於小模塊免疫藥劑的經凍乾調配物”)揭示已知為小免疫藥劑蛋白(SMIP)的組成物。其為多重融合結構域(例如抗原-結合域、免疫球蛋白樞紐區與Ig分子的CH2或CH3區或自其衍生的區域)組成的構築體。SMIP的結構域由多肽組 成，多肽為基因序列的產物，其可為人類、非人類或人工(使用基因技術方法所產生)來源。儘管SMIP蛋白較佳為單特異性，該申請案亦揭示多特異性變體，例如蠍分子(Scorpion molecules)。它們含有SMIP蛋白，其具有又一個C端結合域。蠍分子的結合域較佳地結合至不同標的結構且因而適於作為免疫特異性治療劑。WO2010148337(A1)揭示經凍乾組成物的穩定調配物，其含有SMIP，其中少於7%的SMIP以團聚形式存在。該等調配物可進一步包含緩衝劑、穩定劑、增積劑、濕潤劑以及其他賦形劑。WO2009070642 A1揭示BiTE分子MT103的各種調配物，其第一結合域特異地結合至T細胞受體抗原CD3，而第二結合域則特異地結合至B細胞抗原CD19。該等BiTE分子於7.0的pH下在所揭示的組成物中是穩定的，至高達最大濃度300μg/ml。所用緩衝劑為檸檬酸鹽。該等調配物適於靜脈內以及皮下投與。在皮下投與之後的生物可利用性為10-50%。
IgG抗體具有大恆定區(CH1-3/CL區)，為其大部分物理化學特性的主因。具有不同特異性的IgG抗體在結構上主要於VL與VH區內之高度變異抗體結合位點的區域(CDR1-CDR3)中有所差別。因為恆定區大，個別IgG變體之間的結構與物理化學差異性相對地小。類似於IgG抗體，WO2010148337(A1)中所述的SMIP分子含有部分的恆定抗體結構域。
相對地，具有不同特異性的BiTE分子主要在其物理化學特性上有所差異。一般而言，作為由不同免疫球蛋白的兩個單鏈可變片段(scFv)組成的融合蛋白而言，它們缺乏恆定CH1-3/CL區，故因此這種在抗原-結合域中的差異性涉及BiTE分子的區段要比IgG或 SMIP抗體的區段還大。同樣地，BiTE分子MT103以及本發明中所用的BiTE分子主要在其分子結構上有所不同。其中MT103的結構域是以順序VL-VH-VH-VL排列，對於本發明中使用的BiTE分子排列而言較佳為VH-VL-VH-VL的形式。此外，分子的順序在數個位置處都有所不同。
BiTE分子的這些特性及其小尺寸在各種BiTE分子的物理化學行為上產生獨特差異性。這使得有需要針對個別應用發展出個別調配物(以增加物理化學穩定性)，因為無法使用個別BiTE或類似分子的調配物，或僅能有限制地使用於替代用途。
在一個具體例中，存在於組成物中的多肽係已知為雙特異性T細胞銜接體(BiTE)。在一個特定具體例中，BiTE具有特異地結合至T細胞受體-CD3複合體之ε鏈的第一結合域，以及特異地結合至前列腺-特異性膜抗原(PSMA)的第二結合域。PSMA是一種第II型膜本體蛋白，其以高度特異性表現在前列腺上皮細胞上，且在前列腺癌的情況下強度增加。此外，PSMA由實體腫瘤的新生成血管所表現。PSMA-BiTE因而媒介細胞毒性T細胞以及此等標的細胞直接接觸。
蛋白質(例如BiTE分子)的團聚體形成在醫藥應用來說是不樂見的，例如生物活性成分的效力或可利用性可能因為團聚體形成而改變。
因而目標為提供以抑制非所欲團聚體形成的方式容許BiTE分子穩定的調配物。
解決方案描述於在本申請案以及申請專利範圍中，且含括BiTE調配物，其包含TRIS以及磷酸鹽。在其較佳具體例中，調配物包含50mM磷酸鹽、100mM TRIS、0.04%聚山梨醇酯80以及pH 6.0的4%海藻糖二水合物，且能夠就形成團聚體方面穩定帶有PSMA-BiTE1分子的調配物。這同時適用於範圍低於μg/ml的低濃度以及>2mg/ml的高濃度。這個穩定效用對於習於技藝者來說是出乎意料的，因為(例如)在WO2009070642 A1中所用的檸檬酸鹽，即便組合50mM檸檬酸鹽以及pH 6.0的100mM TRIS也未表現出這個效用。舉例而言，在可相比擬的組成物(其僅含有檸檬酸鹽取代磷酸鹽)中所測量的二聚體部分為7%。相反地，本發明組成物將二聚體部分限制在0.8%(參見表6與7)。組合使用TRIS以及磷酸鹽是組成物穩定效用的主因。為了也在剪力方面穩定BiTE分子，需要濃度為至少0.04%的諸如聚山梨醇酯80的濕潤劑，因為二聚體部分在某個方面來說會過大(約7.5%，見表15)。為了防止PSMA-BiTE1分子吸附在注射器、注射袋等的容器壁上，含有僅0.002%聚山梨醇酯80就足夠了。
定義
如本文所用術語”抗體”意指免疫球蛋白分子，其各自含有經由雙硫鍵結而彼此連結之兩個重(H)多肽鏈以及兩個輕(L)多肽鏈。每一重鏈由可變區(VH)以及恆定區組成，恆定區又是由三個結構域(CH1、CH2及CH3)組成。每一輕鏈是由可變區(VL)以及恆定區(CL)組成。輕鏈與重鏈(VH與VL)的可變區在各情況下均進一步再分為三個超變抗體結合位點(CDR1-CDR3)，以及在CDR之間共有四個保守區(FR1-FR4)。
術語”單株抗體”描述源於一群相同抗體的抗體，它們除了相當少量的天然突變或轉譯後修飾以外是相同的。相對於多株抗體作為免疫反應的一部分，單株抗體定向對抗特定抗原決定基。
“雙特異性”或”雙功能性抗體”為一種人工、混合抗體，其具有兩對不同重鏈及輕鏈還有兩個不同的抗原-結合位點。
以木瓜蛋白酶處理抗體會產生兩個相同的抗原-結合Fab片段以及可結晶Fc片段。”Fab片段”由完整的VL鏈以及部分重鏈(亦即含有可變區之VH域及第一恆定域CH1)構成。每一Fab片段因而具有個別的抗原-結合位點。”Fc片段”含有重鏈的羧基-端部分，其係經由雙硫鍵結連結。部分Fc片段是被其他細胞的Fc受體所辨識並經由抗體的效應子功能所測定。
胃蛋白酶在雙硫鍵結下切割抗體，而這樣兩個Fab片段經由樞紐區仍保持連結並形成”F(ab’)2片段”。其具有抗原-結合位點且因此能夠像是完整抗體般交聯抗原。
術語”結構域”描述蛋白質的球形區域，其具有一個明確並獨立摺疊的結構。IgG抗體的輕鏈是由兩個結構域構成(在各情況下，一個恆定域以及一個可變域)；重鏈是由四個結構域構成(在各情況下，三個恆定域以及一個可變域)。兩個可變區各自由重鏈的一個結構域以及輕鏈的一個結構域組成。
術語”抗原決定基”或”抗原決定部位”描述抗體(或其抗原-結合片段)特異性結合的抗原區。抗原決定基可由連續胺基酸，或者因為三級蛋白質折疊而彼此緊鄰的不連續胺基酸組成。
”抗原”為具有抗體可結合之”抗原決定部位”的分子(例如蛋白質、多肽、肽與醣類)。
術語”構型”意指蛋白質或多肽(例如抗體、抗體鏈、結構域或其一部分)的三級結構。
”特異地結合”特定多肽或特定多肽上之抗原決定基，或對此結構”具有特異性”的抗體以較不那麼有效的方式結合至替代性結構。
術語”scFv抗體”在本申請案中意指人工製造的抗體片段，其由抗體之共價連結的VH以及VL域組成。兩個結構域皆存在於單多肽鏈中並經一個由多個胺基酸組成的多肽連接子彼此連結。除了Fc-媒介的效應子功能以外，scFv抗體維持抗體的所有功能，尤其是其選擇性與親和性。
”雙特異性T細胞銜接體”(BiTE)分子為重組型蛋白構築體，由兩個彈性連結的單鏈抗體(scFv)組成。該scFv抗體之一者特異地結合至選定之標的細胞表現的腫瘤抗原，第二者則特異地結合至CD3，T細胞上的T細胞受體複合體的一個次單位。BiTE抗體能夠暫時地使T細胞結合至標的細胞，同時活化T細胞的細胞溶解活性。T細胞的BiTE-媒介之活化既不需要T細胞上的特異性T細胞受體，也不需要標的細胞上的MHC I分子、肽抗原或共刺激分子。
術語”穩定性”及”穩定的”在含有BiTE分子的化合物中描述抗體或其片段在與其生產、製備、儲存、使用或運輸相關的特定條件下對團聚、分解或片段化的抗性。本發明的”穩定”調配物在特定生產、製備、運輸、使用及儲存條件下維持其生物活性。
存在於溶液中的蛋白質(例如BiTE分子)對於像是在生產、容器填充與運輸期間發生的機械運動是敏感的。超過某個強度的移動，分子會團聚及/或變性。含有蛋白質的液體組成物因此在機 械運動期間暴露於已知為攪動壓力下。在”攪動壓力測試”中，對含蛋白質的液體組成物使用經控制的機械(攪動)力來分析不同組成物中經溶解蛋白質的團聚以及變性行為。
蛋白質在攪動壓力測試中的行為是其對剪力(像是例如在溶液以套管抽吸和注射期間)之物理穩定性的指標。
”凍乾”描述一種乾燥方法，其是基於昇華的原理。要乾燥的物質首先冷卻低至約-45℃，接著施加真空而物質加熱至約-20℃。結果，冰晶直接昇華至氣態而未經過液體中間步驟。以這個方式乾燥的物質在第二乾燥步驟之後(仍在真空下)於約25℃下含有少於5%的其原有水分且意指為”凍乾物”。
在投與給患者之前，凍乾物經”重組(reconstituted)”，亦即溶解於醫藥學上可接受的稀釋劑。”經重組調配物”在本發明中是藉由將經凍乾調配物溶於這樣的一種稀釋劑中而形成。抗體接著呈溶解的形式並可被投與給患者。
”多元醇”描述一群有機化合物，其含有多個羥基(-OH)(多元醇、多羥基酒精)。諸如蔗糖或海藻糖的多元醇為能夠穩定抗體及/或影響組成物滲透性的糖。
為了防止蛋白質在凍乾期間非樂見的分解或團聚，添加所謂的”凍乾保護劑”。這些為(例如)糖或糖醇，諸如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。在本發明中，偏好使用海藻糖為凍乾保護劑。
術語”濕潤劑”在此意指任一種具有親水區以及疏水區的清潔劑且包括非離子性、陽離子性、陰離子性與兩性離子性清潔劑。可用清潔劑含括(例如)聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯(亦已知為聚 山梨醇酯80或TWEEN 80)、聚氧乙烯山梨糖醇單月桂酸酯(亦已知為聚山梨醇酯20或TWEEN 20)，或N-月桂基肌胺酸。就本文揭示的組成物而言，偏好提供非離子性濕潤劑。就本發明組成物而言，尤其偏好提供使用聚山梨醇酯80。以0.002%至0.1%的濃度使用濕潤劑。
術語”緩衝劑”在此描述一種經緩衝的溶液，在添加酸性或鹼性物質後其pH僅略微地改變。經緩衝的溶液含有弱酸與其對應鹼或弱鹼與其對應酸的混合物。
術語”患者”意指(人類或動物)接受預防性或治療性治療的個體。
術語”治療”在此意指使用或投與治療性物質至患者身上/給患者，或使用或投與治療性物質至經單離組織/給經單離組織，或使用或投與治療性物質至患者之細胞株/給患者之細胞株，該患者正受疾病所苦，顯示疾病的某個症狀或易罹患某種疾病，其中目標在於治癒、改善、影響、中止或減輕疾病、其症狀或對疾病的易罹患性。
”有效劑量”在文中描述活性成分量，以該量可至少部分地達到所要效用。因此”治療有效劑量”定義為足以至少部分地治癒疾病，或至少部分地在患者體內消除由疾病引起之不良反應的活性成分量。就此目的，實際所需的量端視疾病嚴重性以及患者的一般免疫狀態而定。
術語”生物可利用性”，如本文所用，描述活性成分或醫藥產品劑量在全身性循環中未被改變而可供利用的百分率。生物可利用性因此為一種表示活性成分多快被吸收以及吸收還有在作用處可供利用之程度的測量值。依據定義，靜脈內投與的醫藥產品具 有100%生物可利用性。
絕對生物可利用性描述所投與物質以任何所欲(非靜脈內)方式相比於靜脈內投與的生物可利用性，而相對生物可利用性是來自於特定劑型(例如經口對皮下)的生物可利用性的比較。
”等張化合物”具有與人類血液基本上相同的滲透壓。因此，等張化合物一般具有約250至350mOsm的滲透壓。術語”低張”描述具有低於人類血液之滲透壓的組成物，而”高張”組成物具有高於人類血液的滲透壓。
術語”高分子量團聚體”(同義字：”HMW”)描述由至少兩種蛋白質單體組成的團聚體。
文中所用術語”磷酸鹽”意指水溶性，藥理學上安全的正磷酸(H3PO4)的鹽類，其中偏好一級(氫-)與二級(二氫-)磷酸鹽。本發明組成物較佳地含有磷酸鈉，尤佳為磷酸氫二鈉(Na2HPO4)。
詳細說明
本發明是有關於雙特異性T細胞銜接體(BiTE)分子的醫藥調配物，其特徵在於其含有參(羥甲基)胺基甲烷(TRIS)以及磷酸鹽。
BiTE分子在先前技藝中為已知的。BiTE分子是以它們暫時招募細胞毒性T細胞供溶解特定標的細胞用的方式來設計(見Bäuerle et al.Curr Opin Mol Ther.2009 Feb；11(1)：22-30)。它們特別適用於癌症療法。
BiTE分子為含有兩個scFv抗體結合域的多肽，其中第一scFv結合域能夠結合至人類CD3 ε而第二scFv結合域結合第二個其他的表面抗原。較佳為癌細胞的人類表面抗原。尤佳的表面抗原 為癌細胞的人類表面蛋白。scFv結合域可包含嵌合、人類化或人類抗體片段。較佳地，scFv結合域包含人類或人類化抗體片段。
本發明中所用的BiTE分子不同於例如WO2009070642 A1中所述的BiTE分子(例如MT103)，因為第一結合域可結合至人類與白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴CD3 ε鏈的抗原決定基，其中抗原決定基是選自由SEQ ID NO：1、2、3及4組成之群的胺基酸序列的部分，而該抗原決定基至少具有胺基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。這是有助於臨床前研究的優勢，因為(例如)藥物動力學或毒理學可以在前述測試動物中進行，測試動物的免疫系統類似於人類的免疫系統。具有此等特性的BiTE分子揭示於(例如)WO2008119566 A2或WO2008119567 A2中。
在一個具體例中，本發明組成物因而包含BiTE分子，其第一結合域可結合至人類與白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴CD3 ε鏈的抗原決定基，其中抗原決定基是選自由SEQ ID NO：1、2、3及4組成之群的胺基酸序列的部分，而該抗原決定基至少具有胺基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。
SEQ ID NO：5顯示符合以上要件之scFV結合域的胺基酸序列。
在一個較佳具體例中，該多肽的第一結合域包含於SEQ ID NO：5中再現之胺基酸序列。
scFV包含一可變輕抗體鏈(VL)以及一可變重抗體鏈(VH)的胺基酸。BITE分子可以各種位向來建構。舉例而言，BiTE分子MT103具有一(VL-VH)結合域2-(VH-VL)結合域1的scFV排列。
其他位向也是可行的，例如(VH-VL)結合域2-(VH-VL) 結合域1。
在一個較佳具體例中，該多肽具有排列(VH-VL)結合域2-(VH-VL)結合域1。
在一個尤佳的具體例中，該多肽具有排列(VH-VL)結合域2-(VH-VL)結合域1，其中(VH-VL)結合域1包含SEQ ID NO：5中再現之胺基酸序列。
本發明的一個具體例為液體醫藥組成物，其特徵在於第二結合域可結合至細胞表面抗原。細胞表面抗原為在不使細胞溶解的情況下可被結合蛋白(例如抗體，或scFv)結合的抗原。
本發明的一個具體例是液體醫藥組成物，其特徵在於多肽的第二結合域可結合至癌細胞的表面抗原。
在又一個具體例中，多肽之第二結合域結合至人類表面抗原前列腺特異性膜抗原(PSMA，SWISS-PROT：FOLH1_HUMAN，存取編號：Q0460)。此等BiTE分子描述於，例如WO201037836 A2中。
SEQ ID NO：6描述一種結合至PSMA的結合域。
在一個較佳具體例中，多肽的第二結合域包含SEQ ID NO：6中再現的胺基酸序列。
本發明的一個具體例為含有一多肽的液體醫藥組成物，該多肽含有第一scFv結合域以及第二scFv結合域，其中第一結合域包含SEQ ID NO：5中再現的胺基酸序列，其特徵在於該組成物進一步包含TRIS與磷酸鹽。
本發明的一個具體例為液體醫藥組成物，其特徵在於多肽的結合域包含人類或人類化scFv抗體片段。
本發明的一個具體例為液體醫藥組成物，其特徵在於第二PSMA-結合結合域包含SEQ ID NO：6中再現的胺基酸序列。
在一個具體例中，多肽含有由SEQ ID NO：5以及SEQ ID NO：6中再現之序列編碼的第一結合域與第二結合域的胺基酸序列。
包含SEQ ID NO：5以及SEQ ID NO：6中再現之序列的多肽再現於SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中。
一個較佳的多肽包含SEQ ID NO：7中再現的胺基酸序列。
尤佳的多肽為PSMA-BiTE1分子，其由SEQ ID NO：8中再現的胺基酸序列所編碼。
本發明的一個較佳具體例為液體醫藥組成物，其包含多肽、TRIS以及磷酸鹽，其中該多肽包含SEQ ID NO：7中再現的胺基酸序列。
本發明的一個尤佳具體例為液體醫藥組成物，其包含多肽、TRIS以及磷酸鹽，其中該多肽包含SEQ ID NO：8中再現的胺基酸序列。
在一個具體例中，本發明組成物包含約0.5μg/ml、約0.7μg/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約10μg/ml、約15μg/ml、約18μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約30μg/ml、約30μg/ml、約35μg/ml、約40μg/ml、約45μg/ml、約50μg/ml、約55μg/ml、約60μg/ml、約70μg/ml、約80μg/ml、約90μg/ml、約100μg/ml、約110μg/ml、約120μg/ml、約130μg/ml、約140μg/ml、約150μg/ml、約160μg/ml、約170μg/ml、約180μg/ml、約190μg/ml、 約200μg/ml、約225μg/ml、約275μg/ml、約300μg/ml、約325μg/ml、約350μg/ml、約375μg/ml、約400μg/ml、約500μg/ml、約700μg/ml、約900μg/ml，或約1000μg/ml之上述多肽。
在一個具體例中，本發明組成物包含0.5μg/ml、0.7μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、18μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml、225μg/ml、275μg/ml、300μg/ml、325μg/ml、350μg/ml、375μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、700μg/ml、900μg/ml，或1000μg/ml的BiTE分子。
在又一個具體例中，本發明組成物包含約1mg/ml、約1.3mg/ml、約1.5mg/ml、約1.8mg/ml、約2mg/ml、約2.3mg/ml、約2.5mg/ml、約2.8mg/ml、約3mg/ml、約3.5mg/ml、約4mg/ml、約5mg/ml、約6mg/ml、約7mg/ml、約8mg/ml、約9mg/ml或約10mg/ml的BiTE分子。
在又一個具體例中，本發明組成物包含1mg/ml、1.3mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml、2.3mg/ml、2.5mg/ml、2.8mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml或10mg/ml的BiTE分子。
在又一個具體例中，本發明組成物包含自約0.5μg/ml至約1μg/ml、自約1μg/ml至約5μg/ml、自約5μg/ml至約10μg/ml、自約10μg/ml至約20μg/ml、自約20μg/ml至約50μg/ml、自約50 μg/ml至約90μg/ml、自約90μg/ml至約120μg/ml、自約120μg/ml至約150μg/ml、自約150μg/ml至約180μg/ml、自約180μg/ml至約200μg/ml、自約200μg/ml至約250μg/ml、自約250μg/ml至約280μg/ml、自約280μg/ml至約300μg/ml，或自約300μg/ml至約350μg/ml的BiTE分子。
在又一個具體例中，本發明組成物包含自0.5μg/ml至1μg/ml、自1μg/ml至5μg/ml、自5μg/ml至10μg/ml、自10μg/ml至20μg/ml、自20μg/ml至50μg/ml、自50μg/ml至90μg/ml、自90μg/ml至120μg/ml、自120μg/ml至150μg/ml、自150μg/ml至180μg/ml、自180μg/ml至200μg/ml、自200μg/ml至250μg/ml、自250μg/ml至280μg/ml、自280μg/ml至300μg/ml，或自300μg/ml至350μg/ml的BiTE分子。
在又一個具體例中，本發明組成物包含自約350μg/ml至約1mg/ml、自約350μg/ml至約1.3mg/ml、自約350μg/ml至約1.5mg/ml、自約350μg/ml至約1.8mg/ml、自約350μg/ml至約2mg/ml、自約350μg/ml至約2.3mg/ml、自約350μg/ml至約2.5mg/ml、自約350μg/ml至約2.8mg/ml、自約350μg/ml至約3.0mg/ml、自約350μg/ml至約3.5mg/ml、自約350μg/ml至約5mg/ml，或自約350μg/ml至約10mg/ml的BiTE分子。
在又一個具體例中，本發明組成物包含自350μg/ml至1mg/ml、自350μg/ml至1.3mg/ml、自350μg/ml至1.5mg/ml、自350μg/ml至1.8mg/ml、自350μg/ml至2mg/ml、自350μg/ml至2.3mg/ml、自350μg/ml至2.5mg/ml、自350μg/ml至2.8mg/ml、自350μg/ml至3.0mg/ml、自350μg/ml至3.5mg/ml、自350μg/ml至5 mg/ml，或自350μg/ml至10mg/ml的BiTE分子。
在又一個具體例中，本發明組成物包含自0.5μg/ml至10mg/ml、自0.5μg/ml至5mg/ml、自0.5μg/ml至3.5mg/ml、自0.5μg/ml至3.0mg/ml、自0.5μg/ml至2.8mg/ml、自0.5μg/ml至2.5mg/ml、自0.5μg/ml至2.3mg/ml、自0.5μg/ml至2.0mg/ml、自0.5μg/ml至1.8mg/ml、自0.5μg/ml至1.5mg/ml、自0.5μg/ml至1.3mg/ml、自0.5μg/ml至1.0mg/ml、自0.5μg/ml至350μg/ml、自0.5μg/ml至300μg/ml、自0.5μg/ml至250μg/ml的BiTE分子。
在又一個具體例中，本發明組成物包含自約0.5μg/ml至約10mg/ml、自約0.5μg/ml至約5mg/ml、自約0.5μg/ml至約3.5mg/ml、自約0.5μg/ml至約3.0mg/ml、自約0.5μg/ml至約2.8mg/ml、自約0.5μg/ml至約2.5mg/ml、自約0.5μg/ml至約2.3mg/ml、自約0.5μg/ml至約2.0mg/ml、自約0.5μg/ml至約1.8mg/ml、自約0.5μg/ml至約1.5mg/ml、自約0.5μg/ml至約1.3mg/ml、自約0.5μg/ml至約1.0mg/ml、自約0.5μg/ml至約350μg/ml、自約0.5μg/ml至約300μg/ml、自約0.5μg/ml至約250μg/ml的BiTE分子。
在一個尤佳具體例中，本發明組成物包含約2mg/ml的本發明多肽。
在又一個具體例中，本發明組成物包含參(羥甲基)胺基甲烷(TRIS)以及磷酸鹽的組合物做為緩衝、影響pH的試劑。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含呈濃度約10mM、或約20mM、或約30mM、或約40mM、或約50mM、或約60mM、或約70mM、或約80mM、或約90mM、或約100mM、或約150mM、或約200mM、或約250mM、或約300mM的TRIS，以及 呈濃度約10mM、或約20mM、或約30mM、或約40mM、或約50mM、或約60mM、或約70mM、或約80mM、或約90mM、或約100mM、或約150mM、或約200mM的磷酸鹽。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含呈濃度10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM、或200mM、或250mM，或300mM的TRIS，以及呈濃度10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM，或200mM的磷酸鹽。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含呈濃度約10mM、或約20mM、或約30mM、或約40mM、或約50mM、或約60mM、或約70mM、或約80mM、或約90mM、或約100mM、或約110mM、或約120mM、或約130mM、或約140mM、或約150mM、或約160mM、或約170mM、或約180mM、或約190mM，或約200mM的磷酸鹽。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含呈濃度10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或110mM、或120mM、或130mM、或140mM、或150mM、或160mM、或170mM、或180mM、或190mM，或200mM的磷酸鹽。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含約2mg/ml的本發明多肽，以及呈濃度10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM、或200mM、或250mM，或300mM的TRIS，與呈濃度 10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM，或200mM的磷酸鹽。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含約2mg/ml的本發明多肽，以及呈濃度約10mM、或約20mM、或約30mM、或約40mM、或約50mM、或約60mM、或約70mM、或約80mM、或約90mM、或約100mM、或約110mM、或約120mM、或約130mM、或約140mM、或約150mM、或約160mM、或約170mM、或約180mM、或約190mM，或約200mM的磷酸鹽。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含約2mg/ml的本發明多肽，以及呈濃度10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或110mM、或120mM、或130mM、或140mM、或150mM、或160mM、或170mM、或180mM、或190mM，或200mM的磷酸鹽。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含約2mg/ml的本發明多肽，以及呈濃度約100mM的TRIS，與呈濃度約10mM、或約20mM、或約30mM、或約40mM、或約50mM、或約60mM、或約70mM、或約80mM、或約90mM、或約100mM、或約110mM、或約120mM、或約130mM、或約140mM、或約150mM、或約160mM、或約170mM、或約180mM、或約190mM，或約200mM的磷酸鹽。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含約2mg/ml的本發明多肽，以及呈濃度約100mM的TRIS，與呈濃度10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、 或80mM、或90mM、或100mM、或110mM、或120mM、或130mM、或140mM、或150mM、或160mM、或170mM、或180mM、或190mM、或200mM的磷酸鹽。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含約2mg/ml的本發明多肽，以及呈濃度約50mM的磷酸鹽，與呈濃度約10mM、或約20mM、或約30mM、或約40mM、或約50mM、或約60mM、或約70mM、或約80mM、或約90mM、或約100mM、或約150mM、或約200mM、或約250mM、或約300mM的TRIS，以及呈濃度約10mM、或約20mM、或約30mM、或約40mM、或約50mM、或約60mM、或約70mM、或約80mM、或約90mM、或約100mM、或約150mM，或約200mM的TRIS。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含約2mg/ml的本發明多肽，以及呈濃度約50mM的磷酸鹽，與呈濃度10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM、或200mM、或250mM、或300mM的TRIS，以及呈濃度10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM，或200mM的TRIS。
在一個較佳具體例中，本發明組成物的pH在約5.0至約7.0的範圍內，或在約5.0至約6.5的範圍內。尤佳地，本發明組成物的pH為6.0。較佳地，本發明組成物的pH是使用HCl來調整。
在又一個具體例中，本發明組成物另外包含濕潤劑。濕潤劑的實例為非離子性濕潤劑，諸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；帕洛沙姆(例如帕洛沙姆188)；Triton；辛基葡萄糖苷鈉； 月桂基、肉豆蔻基、亞麻基或硬脂醯基硫代甜菜鹼；月桂醯基肌胺酸、肉豆蔻醯基肌胺酸、亞麻醯基肌胺酸或硬脂醯基肌胺酸；亞麻基、肉豆蔻基或十六基甜菜鹼；月桂醯胺基丙基、椰油醯胺基丙基、亞麻醯胺基丙基、肉豆蔻醯胺基丙基、棕櫚醯胺基丙基或異硬脂醯胺基丙基甜菜鹼；聚乙二醇；聚丙二醇；以及乙二醇與丙二醇的共聚體(例如Pluronics、PF68)。在一個較佳具體例中，濕潤劑為聚山梨醇酯80。
在又一個具體例中，本發明化合物包含呈濃度從0.002%至0.1%，較佳從0.04%至0.1%的濕潤劑。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含呈濃度從0.002%至0.1%，較佳地從0.04%至0.1%的聚山梨醇酯80。尤佳地，本發明組成物包含呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80。
在又一個具體例中，本發明組成物另外包含凍乾保護劑。在又一個具體例中，本發明組成物另外包含糖或糖醇做為凍乾保護劑。凍乾保護劑較佳為海藻糖或海藻糖二水合物。在一個較佳具體例中，本發明組成物包含呈濃度從2%至10%，尤佳4%的凍乾保護劑。
在一個較佳具體例中，本發明組成物包含呈濃度從2%至10%，尤佳4%的海藻糖。
在一個尤佳的具體例中，本發明組成物包含呈濃度從2%至10%，尤佳4%的海藻糖二水合物。
尤佳地，本發明組成物包含自約0.5μg/ml至約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度自約50mM至約200mM的TRIS、呈濃度自約20mM至約100mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯 80以及呈濃度4%的海藻糖二水合物，且pH為6.0。
尤佳地，本發明組成物包含自約0.5μg/ml至約2mg/ml的PSMA-BiTEl分子以及呈濃度自約50mM至約200mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、濃呈度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖二水合物，且pH為6.0。
尤佳地，本發明組成物包含自約0.5μg/ml至約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約20mM至約100mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖二水合物，且pH為6.0。
尤佳地，本發明組成物包含自約50μg/ml至約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖二水合物，且pH為6.0。
尤佳地，本發明組成物包含自約50μg/ml至約1mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖二水合物，且pH為6.0。
尤佳地，本發明組成物包含約100μg/ml至約500μg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖二水合物，且pH為6.0。
尤佳地，本發明組成物包含約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖二水合物，且pH為 6.0。
尤佳地，本發明組成物包含約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的Na2HPO4、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖二水合物，且pH為6.0。
較佳地，本發明組成物包含約0.5μg/ml至約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約50mM至約200mM的TRIS、呈濃度約20mM至約100mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖，且pH為6.0。
較佳地，本發明組成物包含約0.5μg/ml至約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約50mM至約200mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖，且pH為6.0。
較佳地，本發明組成物包含約0.5μg/ml至約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約20mM至約100mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖，且pH為6.0。
較佳地，本發明組成物包含約50μg/ml至約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖，且pH為6.0。
較佳地，本發明組成物包含約50μg/ml至約1mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖， 且pH為6.0。
較佳地，本發明組成物包含約100μg/ml至約500μg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖，且pH為6.0。
較佳地，本發明組成物包含約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的磷酸鹽、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖，且pH為6.0。
較佳地，本發明組成物包含約2mg/ml的PSMA-BiTE1分子以及呈濃度約100mM的TRIS、呈濃度約50mM的Na2HPO4、呈濃度0.04%的聚山梨醇酯80以及呈濃度4%的海藻糖，且pH為6.0。
以每百分(%)計的指明單位表示以質量計的濃度(質量/體積)。
此外，本發明組成物可又另外含有醫藥上可接受的添加劑((Remington’s Pharmaceutical Sciences；18th edition,Mack Publishing Co.,Easton,PA,USA)。此等添加劑為(例如)防腐劑或抗氧化劑。可供使用的抗氧化劑為(例如)抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E或偏二亞硫酸鈉。防腐劑為(例如)抑制或減緩微生物生長的物質。此一物質為(例如)硫柳汞。
本發明的一個具體例為固體混合物，其是藉由凍乾本發明組成物而製成，或是可藉由凍乾該組成物而獲得。
本發明的一個較佳具體例為藉由冷凍乾燥本發明組成物而獲得的凍乾物。
本發明的一個較佳具體例為依據實例16中所述程序 藉由冷凍乾燥本發明組成物而生成的凍乾物。
在又一個具體例中，本發明組成物是透過溶解於適當的液體介質中而將經凍乾固體混合物重組而提供。
在一個較佳具體例中，本發明組成物是透過溶解於水(較佳為無菌水)中而將經凍乾固體重組而提供。
本發明進一步提供含有本發明組成物之一者以及較佳還含有使用說明的產品。在一個具體例中，該產品包含一含有上列組成物中之一者的容器。可用容器為(例如)瓶、小管、管或注射器。容器可以(例如)由玻璃或塑膠製成。注射器可包含注射針頭，其由(例如)金屬製成。
在一個具體例中，該容器為注射器。在又一個具體例中，該注射器是包含在一個注射裝置中。在一個較佳具體例中，該注射裝置為自動注射器。自動注射器可以描述為一種注射儀器，其在啟動後投與其內含物而不需要由患者或另一人額外操作。在本發明中，投與較佳為皮下。
就BiTE分子而言，本發明組成物相較於先前技藝中可用的調配物表現穩定性增加以及生物可利用性明顯增加。因為這個特性，本發明組成物尤其適用於非經口投與。非經口投與尤其包括靜脈內注射或輸注、動脈內注射或輸注(至動脈中)、肌肉內注射、鞘內注射、皮下注射、腹膜內注射或輸注、骨內投與或注射至組織中。本發明組成物尤其適用於皮下投與。本發明組成物的一個具體例特徵為在皮下投與組成物後，多肽的生物可利用性>60%；較佳地，這個是在石蟹獼猴中的生物可利用性。
本發明組成物具有富價值的藥理學特性且可用於預 防與治療人類和動物疾病。
本發明組成物一般適於在人類中和在哺乳動物中治療過度增生性疾病。可使用本發明組成物治療之過度增生性疾病尤其屬於癌症與腫瘤疾病之群。在本發明中，應理解尤其表示但不限於下列疾病：乳癌與乳腺腫瘤(腺管與小葉形式，還有原位)、呼吸道的腫瘤(小細胞性與非小細胞性癌、支氣管炎)、腦腫瘤(例如腦幹的腫瘤或下視丘的腫瘤、星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤以及神經外胚層與松果腺腫瘤)、消化器官的腫瘤(食道、胃、膽囊、小腸、大腸、直腸)、肝臟腫瘤(尤其是肝細胞癌、膽管癌以及混合型肝細胞膽管癌)、頭部與頸部區域的腫瘤(喉、下咽、鼻咽、口咽、唇與口腔)、皮膚腫瘤(鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤、惡性黑色素瘤、梅克爾細胞皮膚癌與非黑色素瘤皮膚癌)、軟組織腫瘤(尤其是軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤與橫紋肌肉瘤)、眼部腫瘤(尤其是眼內黑色素瘤與視網膜母細胞瘤)、內分泌腺與外分泌腺(例如甲狀腺與副甲狀腺、胰腺與唾腺)的腫瘤、泌尿道腫瘤(膀胱、陰莖、腎臟、腎盂與輸尿管的腫瘤)以及生殖器官的腫瘤(女性子宮內膜、子宮頸、卵巢、陰道、陰唇和子宮癌與男性前列腺和睪丸癌)。這些亦包括呈實體形式或如循環血液細胞的增生性血液疾病，諸如淋巴瘤、白血病與骨髓增生性疾病，例如急性骨髓性、急性淋巴母細胞性、慢性淋巴細胞性、慢性骨髓性與髮樣細胞白血病，以及AIDS相關淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤與中樞神經系統內的淋巴瘤。
可使用本發明組成物治療之較佳疾病為表現PSMA抗原的癌症及/或轉移。
可使用本發明組成物治療之尤佳疾病為選自由以下組成之群：前列腺癌、前列腺癌的骨轉移以及前列腺癌的軟組織轉移。
可使用本發明組成物治療之其他尤佳疾病為前列腺癌。
這些已充分說明之疾病在其他哺乳動物中也可能出現相當的病因學且可使用本發明組成物治療。
在本發明中，術語”治療(treatment)”或”治療(treat)”是以習用意思來使用並表示旨在對抗、降低、減弱或減輕疾病或健康異常，以及改善因為此疾病(例如在癌症的情況下)而有所損害之生活品質來照料、照護以及調治患者。
因此，本發明進一步提供本發明組成物於治療及/或預防疾病，更具體而言為上述疾病的用途。
本發明進一步提供本發明組成物於製造用以治療及/或預防疾病，更具體而言上述疾病之藥品的用途。
本發明進一步提供本發明組成物於治療及/或預防疾病，更具體而言上述疾病之方法中的用途。
本發明進一步提供一種使用有效量之本發明化合物之一者治療及/或預防疾病，更具體而言上述疾病的方法。
在一個較佳具體例中，治療及/或預防是非經口投與本發明組成物。更佳是以皮下投與來提供。
本發明組成物可單獨使用，或者是若需要的話與一或多種其他藥理活性物質組合使用，前提是這個組合不會產生不樂見以及無法接受的副作用。因此，本發明進一步提供含有本發明組成 物之至少一者以及一或多種其他活性成分的藥品，特別適用於治療及/或預防上述疾病。舉例而言，本發明組成物可與已知的抗過度增生物質、細胞抑制物質或細胞毒性物質組合以供治療癌症疾病。
本發明進一步提供上述組成物於治療性方法中的用途，該組成物適於非經口投與形式，諸如靜脈內注射或輸注、動脈內注射或輸注(至動脈內)、肌肉內注射、鞘內注射、皮下注射、腹膜內注射或輸注、骨內投與或注射至組織中。
本發明進一步提供上述組成物在用以治療性治療前列腺細胞增生性疾病的方法中的用途。
本發明進一步提供上述組成物在用以治療性治療前列腺細胞增生性疾病的方法中的用途，該組成物適用於皮下投與。
本發明進一步提供上述組成物在用以治療性治療前列腺細胞增生性疾病的方法中的用途，該組成物是藉由皮下投與而被投與。
本發明進一步提供一種穩定多肽的方法，其包含生產上述組成物之一者，除了該多肽以外，該組成物之一者至少含有TRIS以及磷酸鹽且具有pH為6.0。
本發明進一步提供一種包含上述組成物的套組。
在本發明中的較佳化合物為醫藥化合物。
具體例
本發明的一個具體例包含液體醫藥組成物，其含有多肽、TRIS以及磷酸鹽，該多肽含有兩個scFv抗體結合域，第一scFv結合域能夠結合至人類CD3 ε。
在又一個具體例中，該多肽的第二結合域可結合至細胞表面抗原。
在組成物的又一個具體例中，該多肽含有能夠結合至癌細胞之表面抗原的第二結合域。
在又一個具體例中，該多肽之第二結合域可結合的表面抗原為前列腺特異性膜抗原(PSMA)。
在組成物的又一個具體例中，該多肽具有排列(VH-VL)結合域2-(VH-VL)結合域1。
在該組成物的又一個具體例中，該多肽之第一結合域含有SEQ ID NO：5中再現的胺基酸序列。
在組成物的又一個具體例中，該多肽之第二、PSMA-結合結合域含有SEQ ID NO：6中再現的胺基酸序列。
在又一個具體例中，該組成物含有多肽、TRIS以及磷酸鹽，該多肽含有SEQ ID NO：7中再現的胺基酸序列。
在又一個具體例中，該組成物含有多肽、TRIS以及磷酸鹽，該多肽含有SEQ ID NO：8中再現的胺基酸序列。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至5mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至3.5mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至3.0mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至2.5mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至2.0mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至1.8mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至1.5mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至0.35mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至0.3mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至0.25mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自0.5μg/ml至0.2mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自50μg/ml至1mg/ml的PSMA-BiTE1。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自50μg/ml至500μg/ml的PSMA-BiTE1。
在又一個具體例中，該組成物包含呈濃度自100μg/ml至500μg/ml的PSMA-BiTE1。
在又一個具體例中，該組成物含有呈濃度約2mg/ml的多肽。
在又一個具體例中，該組成物含有呈濃度自約50mM至約200mM的TRIS以及呈濃度自約20mM至約100mM的磷酸鹽。
在又一個具體例中，該組成物含有100mM TRIS以及50mM磷酸鹽。
在又一個具體例中，該組成物的pH落在自約5.0至約7.0的範圍內。
在又一個具體例中，該組成物的pH落在自約5.0至約6.5的範圍內。
在又一個具體例中，該組成物的pH落在自約5.5至約6.5的範圍內。
在又一個具體例中，該組成物的pH為約6.0。
在又一個具體例中，使用鹽酸調整該組成物的pH。
在又一個具體例中，該組成物另外含有濕潤劑。
在又一個具體例中，該濕潤劑為聚山梨醇酯80。
在又一個具體例中，該組成物另外含有自0.002%至0.1%聚山梨醇酯80。
在又一個具體例中，該組成物另外含有自0.04%至0.1%聚山梨醇酯80。
在又一個具體例中，該組成物另外含有0.04%聚山梨醇酯80。
在又一個具體例中，該組成物另外含有凍乾保護劑。
在又一個具體例中，該組成物含有海藻糖或較佳海藻糖二水合物作為凍乾保護劑。
在又一個具體例中，該組成物另外含有自4%至10%海藻糖或較佳自4%至10%海藻糖二水合物。
在又一個具體例中，該組成物另外含有約4%海藻糖或 較佳另外含有約4%海藻糖二水合物。
在一個較佳具體例中，該組成物具有pH為6且含有自50μg/ml至1mg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸鹽、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖二水合物。
在一個較佳具體例中，該組成物具有pH為6且含有自50μg/ml至500μg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸鹽、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖二水合物。
在一個較佳具體例中，該組成物具有pH為6且含有自50μg/ml至500μg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM Na2HPO4、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖二水合物。
在又一個具體例中，該組成物具有pH為6且含有自50μg/ml至1mg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸鹽、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖。
在又一個具體例中，該組成物具有pH為6且含有自50μg/ml至500μg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸鹽、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖。
在又一個具體例中，該組成物具有pH為6且含有自50μg/ml至500μg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM Na2HPO4、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖。
在組成物的一個較佳具體例中，該多肽在凍乾，接著重組並儲存(在2-8℃下7天且接著在20℃ +- 5℃下16小時，如實例21中所述)之後具有至少90%的生物活性以及較佳至少96%的生物活性(較佳是藉由實例21中所述以細胞為主之活性分析而確定)。
在組成物的一個較佳具體例中，該多肽在凍乾並儲存 3個月或12個月之後具有至少90%的生物活性，且較佳至少96%的生物活性(較佳是藉由實例21中所述以細胞為主之活性分析而確定)。
在組成物的一個較佳具體例中，該多肽在凍乾並在6℃下儲存3個月或在6℃下儲存12個月之後具有至少97%的生物活性(較佳是藉由實例21中所述的以細胞為主之活性分析而確定)。
在組成物的一個較佳具體例中，該多肽在來自注射的剪力作用之後具有超過96%的單體含量(SEC)(較佳是依照實例18a而確定)。
在組成物的一個較佳具體例中，該多肽在來自使用針頭緩慢或快速注射的剪力作用之後具有不超過4%的二聚體與多聚體含量(SEC)(較佳是依照實例18a而確定)。
在組成物的一個較佳具體例中，該多肽在來自使用針頭(規格：30G；針頭長度：13mm)緩慢或快速注射的剪力作用之後具有不超過4%的二聚體與多聚體含量(SEC)(較佳是依照實例18a而確定)。
本發明的一個具體例包含可藉由凍乾液體組成物而獲得的固體混合物。
在又一個具體例中，該組成物是藉由將本發明經凍乾固體混合物溶解於適當液體介質中而重組。
在又一個具體例中，該多肽在皮下投與組成物之後的生物可利用性為>60%。
在又一個具體例中，該組成物用於治療性方法中。
在又一個具體例中，該組成物用於治療性方法中，該方法包含非經口投與該組成物。
在又一個具體例中，該組成物用於治療性治療過度增生性疾病的方法中。
在又一個具體例中，該組成物用於治療性治療前列腺過度增生性疾病的方法中。
在又一個具體例中，該組成物用於治療性治療前列腺過度增生性疾病的方法中，該方法包含皮下投與該組成物。
在又一個具體例中，本發明包含穩定多肽的方法，其包含生產除了多肽以外含有至少TRIS以及磷酸鹽並具有pH為6.0的組成物。
在又一個具體例中，本發明包含含有上述組成物的套組。
較佳具體例為
1.一種液體醫藥組成物，其含有多肽、TRIS以及磷酸鹽，該多肽含有兩個scFv抗體結合域，該第一scFv結合域能夠結合至人類CD3 ε。
2.如具體例1之組成物，其特徵在於該多肽的第二結合域可結合至細胞表面抗原。
3.如具體例2之組成物，其特徵在於該多肽含有能夠結合至癌細胞之表面抗原的第二結合域。
4.如具體例2或3的組成物，其特徵在於該表面抗原為前列腺特異性膜抗原(PSMA)。
5.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該多肽具有排列(VH-VL)結合域2-(VH-VL)結合域1。
6.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該多肽之第一結合域含有SEQ ID NO：5中再現的胺基酸序列。
7.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該多肽之第二、PSMA結合結合域含有SEQ ID NO：6中再現的胺基酸序列。
8.一種液體醫藥組成物，其含有多肽、TRIS以及磷酸鹽，該多肽含有SEQ ID NO：7中再現的胺基酸序列。
9.一種液體醫藥組成物，其含有多肽、TRIS以及磷酸鹽，該多肽含有SEQ ID NO：8中再現的胺基酸序列。
10.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至5mg/ml的多肽。
11.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至3.5mg/ml的多肽。
12.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至3.0mg/ml的多肽。
13.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至2.5mg/ml的多肽。
14.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至2.0mg/ml的多肽。
15.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至1.8mg/ml的多肽。
16.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至1.5mg/ml的多肽。
17.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組 成物含有呈濃度自0.5μg/ml至0.35mg/ml的多肽。
18.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至0.3mg/ml的多肽。
19.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至0.25mg/ml的多肽。
20.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至0.2mg/ml的多肽。
21.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物包含呈濃度自50μg/ml至1mg/ml的PSMA-BiTE1。
22.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物包含呈濃度自50μg/ml至500μg/ml的PSMA-BiTE1。
23.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物包含呈濃度自100μg/ml至500μg/ml的PSMA-BiTE1。
24.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度約2mg/ml的多肽。
25.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度自約50mM至約200mM的TRIS以及呈濃度自約20mM至約100mM的磷酸鹽。
26.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物含有100mM TRIS以及50mM磷酸鹽。
27.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物的pH落在自約5.0至約7.0的範圍內。
28.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物的pH落在自約5.0至約6.5的範圍內。
29.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物的pH落在自約5.5至約6.5的範圍內。
30.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物的pH為約6.0。
31.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於使用鹽酸調整該組成物的pH。
32.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物另外含有濕潤劑。
33.如具體32之組成物，其特徵在於該濕潤劑為聚山梨醇酯80。
34.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物另外含有自0.002%至0.1%聚山梨醇酯80。
35.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物另外含有自0.04%至0.1%聚山梨醇酯80。
36.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物另外含有自0.04%聚山梨醇酯80。
37.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物另外含有凍乾保護劑。該組成物較佳含有2-10%凍乾保護劑，較佳為4%。
38.如具體例37之組成物，其特徵在於該凍乾保護劑為海藻糖。該凍乾保護劑較佳為海藻糖二水合物。
39.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物另外含有自4%至10%海藻糖二水合物。
40.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組 成物另外含有約4%海藻糖二水合物。
41.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物具有pH為6且含有自50μg/ml至1mg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸鹽、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖二水合物。
42.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物具有pH為6且含有自50μg/ml至500μg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸鹽、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖二水合物。
43.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該組成物具有pH為6且含有2mg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM Na2HPO4、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖二水合物。
44.一種可藉由凍乾前面具體例中任一者的液體組成物而獲得的固體混合物。
45.一種液體醫藥組成物，其特徵在於該組成物是藉由將具體例44之經凍乾固體混合物溶解於適當液體介質中而重組。
46.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該多肽在凍乾，接著重組並儲存(在2-8℃下7天且接著在20℃ +- 5℃下16小時，如實例21中所述)之後具有至少90%的生物活性以及較佳至少96%的生物活性(較佳是藉由實例21中所述以細胞為主之活性分析而確定)。
47.如前面具體例中任一者的組成物，其中該多肽在凍乾並儲存3個月或12個月之後具有至少90%的生物活性，且較佳至少96%的生物活性(較佳是藉由實例21中所述以細胞為主之活性分析而確定)。
48.如前面具體例中任一者的組成物，其中該多肽在凍乾以及在6℃下儲存3個月或在6℃下儲存12個月之後具有至少97%的生物活性(較佳是藉由實例21中所述以細胞為主之活性分析而確定)。
49.如前面具體例中任一者的組成物，其中該多肽在來自注射的剪力作用之後具有超過96%的單體含量(SEC)(較佳是依照實例18a而確定)。
50.如前面具體例中任一者的組成物，其中該多肽在來自使用針頭緩慢或快速注射的剪力作用之後具有不超過4%的二聚體與多聚體含量(SEC)(較佳是依照實例18a而確定)。
51.如前面具體例中任一者的組成物，其中該多肽在來自使用針頭(規格：30G；針頭長度：13mm)緩慢或快速注射的剪力作用之後具有不超過4%的二聚體與多聚體含量(SEC)(較佳是依照實例18a而確定)。
52.如前面具體例中任一者的組成物，其特徵在於該多肽在皮下投與組成物之後的生物可利用性為>60%。
53.如前面具體例中任一者的組成物，其用於治療性方法中。
54.如前面具體例中任一者的組成物，其用於治療性方法中，該方法包含非經口投與該組成物。
55.如前面具體例中任一者的組成物，其用於治療性治療過度增生性疾病的方法中。
56.如前面具體例中任一者的組成物，其用於治療性治療前列腺過度增生性疾病的方法中。
57.如前面具體例中任一者的組成物，其用於治療性治療前列腺過度增生性疾病的方法中，該方法包含皮下投與該組成物。
58.一種穩定如具體例1至9中至少一者的多肽的方法，其包含生產除了多肽以外至少含有TRIS以及磷酸鹽並具有pH為6.0的組成物。
59.一種套組，其包含具體例1-57中任一者的組成物。
60.如前面具體例中任一者的組成物，其中該液體醫藥組成物為水性醫藥組成物，較佳為無菌水性醫藥組成物。
61.一種注射器，其含有前面具體例中任一者的組成物。
實例 實例1：緩衝劑篩選以增進PSMA-BiTE1分子的熱穩定性
使用示差掃描螢光測定法(DSF)來測量具有最低分子量的PSMA-BiTE蛋白結構域在不同緩衝系統中的平均熔點(Tm1)。其為一種檢驗蛋白質在各種緩衝系統中之穩定性的測量法：Tm值越大，蛋白質的熱穩定性也越大。蛋白質的熱穩定性越大，則其越適於生產穩定的醫藥調配物。
關於緩衝劑篩選，使用標準緩衝劑為pH 5.0至8.0的pH範圍。所生產之調配物的PSMA-BiTE1濃度為約0.2mg/ml。平均熔 點是藉由DSF方法來確定。
Figure TWI615158BD00001
以檸檬酸鹽以及Na2HPO4為主的緩衝系統對增加PSMA-BiTE1蛋白結構域的熔點表現出正向效用。在其他實驗中進一步檢驗檸檬酸鹽以及Na2HPO4的正向效用。
以參(羥甲基)胺基甲烷(TRIS)為主的緩衝劑單獨無法使得蛋白質熔點有明顯增加(表2)。
Figure TWI615158BD00002
Figure TWI615158BD00003
如同表1，表2亦顯示具有最低分子量的PSMA-BiTE蛋白結構域在不同緩衝系統中的平均熔點(Tm)，如藉由示差掃描螢光測定法所確定。Tm值介於57.7℃與64.6℃間。透過組合各種緩衝系統，不能達到較高的Tm值。
在pH 5.5-6.5的磷酸鹽緩衝劑中以及在pH 5.0-6.5的檸檬酸鹽緩衝劑中的PSMA-BiTE1調配物表現出最高熔點(依據DSF方法Tm>63.0℃)。
實例2：非離子性界面活性劑對PSMA-BiTE1團聚體形成的影響
PSMA-BiTE1分子在攪動壓力測試之後在所有測試緩衝系統中形成團聚體。經團聚的PSMA-BiTE1分子引起T細胞活化的效率無法被預測或控制，或僅可有限度地預測或控制。因此，必須找到能防止因為攪動壓力或剪力作用所致的團聚體形成的穩定劑。在攪動壓力測試中，各種非離子性界面活性劑(例如聚山梨醇酯80或20)明顯穩定PSMA-BiTE1分子且可防止團聚。介於0.01與0.04%(質量/體積)的界面活性濃度對穩定作用來說是足夠的(見表3-7)。
實例3：在多價陽離子存在下的PSMA-BiTE1二聚體形成
在PSMA-BiTE1調配物濃縮期間，PSMA-BiTE1團具體 比例的增加無法因為添加非離子性界面活性劑而被防止。
因此，在多價陽離子(例如Mg2+及Ca2+)存在下檢驗PSMA-BiTE1分子的靜電穩定作用。多價離子對於溶解蛋白質的表面電位有直接影響且因而可以穩定或甚至去穩定的方式來發揮作用。
可以使用氯化鎂穩定PSMA-BiTE1分子。在濃縮之後，PSMA-BiTE1二聚體比例僅可被忽略地增加並維持低於<3%(表3)。單體以及二聚體的比例是經由尺寸排除層析(SEC)來測量。
Figure TWI615158BD00004
但是，添加成高濃度的無機鹽在醫藥上不是安全的，及/或該等添加劑意味著在冷凍-乾燥時是一個挑戰。因此，針對能穩定PSMA-BiTE1分子且同時為醫藥上安全的替代性賦形劑進行研究。
實例4：鑑別用於穩定PSMA-BiTE1單體的替代性賦形劑
各種胺基酸及其衍生物被隨機納入以高濃度來穩定PSMA-BiTE1單體的測試中。胺基酸及其衍生物不是無機鹽且因此被歸納為醫藥學上安全的。這些物質中的一些(例如離胺酸)在濃縮期間及之後對PSMA-BiTE1分子的穩定性表現出乎意料的正面影響(表4)。
Figure TWI615158BD00005
SEC=尺寸排除層析：DLS=動態光散射；在攪動壓力之後的混濁溶液表示較高比例的BiTE團聚體，清澈或最少雲狀溶液(狀態”OK”)表示可忽略程度的團聚。
藉由添加離胺酸及組胺酸至磷酸鹽緩衝劑中，PSMA-BiTE1分子可以在沒有形成不可接受比例之二聚體(≧5%)的情況下濃縮。但是，低二聚體比例(<5%)的調配物在攪動壓力測試期間是不穩定的，且這可以由雲狀溶液來識別(測試體積1與2；”混濁”表示團聚，”OK”表示少或沒有團聚)。
實例5：pH對於PSMA-BiTE1分子穩定性的影響
為了檢驗pH對於二聚體形成的影響，生產具有pH 6.0的調配物。其展現可與pH 7.3之調配物相當的二聚體比例。此外，在攪動壓力期間的二聚體比例也是穩定的，且明顯沒有雲狀(表5)。在關於適當穩定劑與調配物的其他研究中使用pH 6.0的正向影響。
Figure TWI615158BD00006
PSMA-BiTE1在pH 6.0之磷酸鹽緩衝劑下的穩定性令人吃驚。於包含50mM Na2HPO4、50mM離胺酸、0.04%聚山梨醇酯20與pH 6.0的10%海藻糖二水合物的調配物中可以將分子快速濃縮至1.6mg/ml，而不會因為攪動壓力作用而產生團聚。
實例6：檢驗緩衝劑組合物
在又一個實驗中，檢驗關於藉由添加諸如精胺酸、TEA或TRIS組合磷酸鹽來增加PSMA-BiTE分子穩定性的可能協同效用。在pH 6.0的緩衝劑組合50mM Na2HPO4、100mM TRIS的情況下，產生最低比例的PSMA-BiTE二聚體為0.8%。調配物在攪動壓力後仍是充分地穩定，且這可以由雲狀溶液不存在來識別(表6)。TRIS的穩定效用出人意料，因為在蛋白質中添加穩定(亦即降低團聚)效用均屬已知的精胺酸或TEA在PSMA-BiTE分子中不具有穩定效用。
Figure TWI615158BD00007
Figure TWI615158BD00008
如實例1中所示，使用檸檬酸鹽緩衝劑使得PSMA-BiTE1分子的熱穩定性增加。但是，在濃縮測試體積之後，經檸檬酸鹽緩衝之測試體積中的二聚體比例基本上比使用磷酸鹽緩衝劑者還高(表7相較於表6)。磷酸鹽緩衝劑因此比檸檬酸鹽緩衝劑 更適合用於在濃縮期間將PSMA-BiTE1二聚體形成降至最低。此外，調配物中的檸檬酸鹽會使得玻璃剝落且不應該再使用。
Figure TWI615158BD00009
實例7：PSMA-BiTE分子在TRIS-磷酸鹽緩衝系統中的熱穩定性
測量下列調配物之具有最小分子量的PSMA-BiTE蛋白結構域的平均熔點(Tm1)：0.2mg/ml PSMA BiTE於50mM Na2HPO4、100mM TRIS、0.04%聚山梨醇酯80、4%海藻糖二水合物、pH 6.0(以HCl調整)。藉由DSC測量Tm1為61.1℃。
實例8：攪動壓力在磷酸鹽/TRIS調配物中對於PSMA-BiTE1的影響
一般來說，BiTE分子因為攪動壓力而在物理上是不穩定的，亦即它們會形成團聚體，其可經由動態光散射(DLS)而偵測到。團聚體形成甚至發生在約0.2mg/ml的低BiTE濃度下。相反地，在蛋白質含量少於0.2mg/ml的情況下，BiTE分子逐漸吸附至容器壁上。
藉由添加界面活性劑(例如聚山梨醇酯20或80)，於一些緩衝系統中(例如在以磷酸鹽與離胺酸為主的緩衝劑中)可以預防PSMA-BiTE1分子吸附在容器壁上(例如注射器、輸注袋等的壁上)，且同樣在靜止狀態形成團聚體。聚山梨醇酯80必須以至少0.002%的濃度存在於組成物中，以防止PSMA-BiTE1分子吸附。
藉由將PSMA-BiTE1分子溶解於pH 6.0之具有界面活性劑添加劑的磷酸鹽緩衝劑中，可以在靜止狀態以及在攪動壓力作用期間防止團聚體形成。就將團聚體形成降至最低來說，前述調配物(pH 6.0之具有界面活性劑添加劑的磷酸鹽緩衝劑)優於具有離胺酸的調配物。
Figure TWI615158BD00010
Figure TWI615158BD00011
實施例9：關於濃度的PSMA-BiTE1團聚依賴性
在標準緩衝系統中，二聚體以及多聚體的比例隨著PSMA-BiTE1分子濃縮而增加。但是，在治療用途時調配物中僅能接受某個有限程度的二聚體與多聚體，因為它們可能會影響調配物和治療性蛋白質的有效性並引起不樂見的免疫效用。典型地，二聚體限制為最大5%的數值並試圖盡可能維持在低於該數值。多聚體以及低分子量(LMW)片段也是要降至最低，或者是一點都不能存在。單體/二聚體比例，以及多聚體和低分子量片段的比例是使用尺寸排除層析(SEC)來測量。
使用含有pH 6.0之50mM Na2HPO4以及100mM TRIS的緩衝系統，可以在濃縮期間尤其有效率地降低PSMA-BiTE1分子的二聚體以及多聚體形成。
這個緩衝系統使其生成具有含量>2mg/ml的穩定BiTE調配物(表9)。
Figure TWI615158BD00012
實例10：海藻糖以及聚山梨醇酯對PSMA-BiTE1穩定性的影響
添加海藻糖以及聚山梨醇酯不會增加二聚體、多聚體或LMW片段形成，如同可藉由SEC測量法的方式所測定般。
實例10a：海藻糖以及聚山梨醇酯對PSMA-BiTE1穩定性的影響
添加海藻糖二水合物以及聚山梨醇酯不會增加二聚體、多聚體或LMW片段形成(表10)。
Figure TWI615158BD00013
Figure TWI615158BD00014
實例11：PSMA-BiTE1分子的儲存穩定性
PSMA-BiTE1分子的儲存穩定性可依據二聚體及/或多聚體比例增加作為儲存時間的函數來測定。此等團聚體比例增加地越快，則儲存穩定性越低。
由實驗可見，呈濃度90μg/ml、500μg/ml以及2mg/ml的PSMA-BiTE1分子在形成二聚體及/或多聚體方面於9天的期間為穩定的。調配物在約2-8℃下保留在注射器中，接著在室溫(約20℃)下4至16小時的起始期。除了PSMA-BiTE1分子，組成物含有50mM Na2HPO4、100mM TRIS、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖。使用SEC-HPLC測量PSMA-BiTE1單體比例並與在實驗開始時(亦即在第0天)的PSMA-BiTE1單體比例相比較。
實例11a：PSMA-BiTE1分子的儲存穩定性
PSMA-BiTE1分子的儲存穩定性可依據二聚體及/或多聚體比例增加作為儲存時間的函數來測定。此等團聚體比例增加地越快，則儲存穩定性越低。
由實驗可見，呈濃度90μg/ml、500μg/ml以及2mg/ml的PSMA-BiTE1分子在形成二聚體及/或多聚體方面於9天的期間為穩定的(表11)。調配物在約2-8℃下保留在注射器中，接著在室溫(約20℃)下4至16小時的起始期。除了PSMA-BiTE1分子，組成物含有50mM Na2HPO4、100mM TRIS、0.04%聚山梨醇酯80以及4%海藻糖二 水合物。使用SEC-HPLC測量PSMA-BiTE1單體比例並與在實驗開始時(亦即在第0天)的PSMA-BiTE1單體比例相比較。在具有PSMA-BiTE1起始濃度為90μg/ml以及500μg/ml的組成物的情況下，相對純度為100%，亦即單體比例未隨著時間降低。在具有2mg/ml PSMA-BiTE1分子的組成物的情況下，9天後的相對純度為97%，絕對相應於單體降低約3%(自第0天的97.58%至第9天的94.81%)。
Figure TWI615158BD00015
Figure TWI615158BD00016
在其他實驗中，於具有PSMA-BiTE1濃度為2mg/ml的液體調配物中在2-8℃下於一週期間，在二聚體比例方面有中等程度增加2.5%(自3%至5.5%)，與多聚體的穩定比例有關(表12)。在這個濃度下，PSMA-BiTE1分子因此歷時充分長的時間均為穩定的，以確保容器填充而實際上沒有損失且使用沒有實際上損失。
就長期儲存(亦即儲存一段長於一週的期間)，PSMA-BiTE1溶液卻可以被冷凍(-80℃)或凍乾以確保其穩定性。在保留生物活性的情況下凍乾含有PSMA-BiTE1的調配物是可行的，如實例17中所示。
Figure TWI615158BD00017
Figure TWI615158BD00018
實例12：pH對PSMA-BiTE1穩定性的影響
原則上在pH 5.0與7.5之間的pH範圍內，PSMA-BiTE1分子在含有TRIS、磷酸鹽(在此例中：Na2HPO4)、海藻糖以及聚山梨醇酯的選定調配物中是穩定的。但是，在超過pH 6的pH下，二聚體比例在剪力之後增加。
實例12a：pH對PSMA-BiTE1穩定性的影響
原則上在pH 5.0與7.5之間的pH範圍內，PSMA-BiTE1分子在含有TRIS、磷酸鹽(在此例中：Na2HPO4)、海藻糖二水合物以及聚山梨醇酯的選定調配物中是穩定的。但是，在超過pH 6的pH下，二聚體比例(>2%)在剪力之後增加(表13)。
表13：每ml的2mg PSMA-BiTE1分子在50mM Na 2 HPO 4 、100mM TRIS、pH[可變]；4%(質量/體積)海藻糖二水合物、0.04%(%質量/體積)聚山梨醇酯80中
Figure TWI615158BD00019
實例13：TRIS以及磷酸鹽對於PSMA-BiTE1穩定性的影響
關於調配物中不同緩衝強度的研究顯示，調配物中的緩衝劑強度可能有所改變：在pH 6從20至100mM Na2HPO4以及從50至200mM TRIS可供使用將PSMA-BiTE1二聚體形成降至最低。所有組合容許濃縮以及剪力作用。
於剪力作用之後，在TRIS不存在的情況下不能濃縮PSMA-BiTE1分子，而在Na2HPO4不存在的情況下二聚體比例增加至超過>2%。還有，磷酸鹽緩衝劑在pH 6.0下顯示良好的緩衝作用並支持PSMA-BiTE1分子的熱穩定性。
Figure TWI615158BD00020
實例14：各種濕潤劑對PSMA-BiTE1穩定性的影響
各種聚山梨醇酯可對抗剪力而穩定調配物中的PSMA-BiTE1分子。但是，使用聚山梨醇酯80達到最佳效果。其他諸如(例如)Synperonic F68的穩定劑同樣具有正向效用。
0.04%至0.10%(質量/體積)聚山梨醇酯80在剪力期間對於PSMA-BiTE1分子具有良好的穩定效用。0.004%(質量/體積)聚山梨醇酯於此不足以防止二聚體在剪力之後形成不樂見的增加。
Figure TWI615158BD00021
實例15：PSMA-BiTE1濃度對調配物穩定性的影響
使用50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%(質量/體積)海藻糖、0.04%(質量/體積)聚山梨醇酯80的調配物，可以生成PSMA-BiTE1濃度至多達2mg/ml。在較高的PSMA-BiTE1濃度下，二聚體比例顯著增加。但是，僅有在PSMA-BiTE濃度高於4mg/ml時且在剪力作用之後測量到無法接受的數值(在PSMA-BiTE濃度為約11.2mg/ml下有9.25%二聚體)。
實例15a：PSMA-BiTE1濃度對調配物穩定性的影響
使用50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%(質量/體積)海藻糖二水合物、0.04%(質量/體積)聚山梨醇酯80的調配物，可以生成PSMA-BiTE1濃度至多達2mg/ml。在較高的PSMA-BiTE1濃度下，二聚體比例顯著增加。但是，僅有在PSMA-BiTE濃度高於4mg/ml時且在剪力作用之後測量到無法接受的數值(在PSMA-BiTE濃度度為約11.2mg/ml下有9.25%二聚體)。
Figure TWI615158BD00022
實例16：凍乾
在PSMA-BiTE1組成物完成之後，其被凍乾。許多冷凍乾燥裝置可用於此，例如來自SP Scientific的Genesis Super XL。 冷凍乾燥是藉由將物質冷凍且之後將冰昇華而沒有經過液相。
Figure TWI615158BD00023
在冷凍期中，產品以”斜移”被冰冷，亦即在30min內從室溫連續至-45℃。為了完全冰凍產品溶液，維持這個溫度240min。
接著是一次乾燥期。在室真空為100μbar下組成物在60min內加熱至-20℃。維持這個溫度1000min；一次乾燥於是完成。關於接著的二次乾燥，組成物在室真空為10μbar中加熱至25℃。維持這些條件1140min以移除殘餘水分降至≦2%(藉由卡爾費雪滴定的方式偵測)。
乾燥程序結束時，將該裝置減壓並密封凍乾容器。
實例17a：PSMA-BiTE1凍乾物在長期儲存與重組之後的生物活性
含有PSMA-BiTE1分子的組成物(表18a)如凍乾物般被儲存在2-8℃以及在25℃/60%相對溼度至多12個月。在3與12個月之 後，從各例的凍乾物使溶液重組並在以細胞為主的活性分析中進行分析。測量法(依據Promega之CytoTox-Glo細胞毒性分析的方式)揭示在前述條件下6與12個月儲存之後生物活性均未有所改變。
另外，分析經重組PSMA-BiTE1溶液的儲存穩定性。在重組之後，首先將溶液儲存在冰箱(2-8℃)中7天，接著在室溫(+20±5℃)下16小時。之後，在此亦藉由以細胞為主的活性分析確定PSMA-BiTE1分子的生物活性。在前述進一步儲存之後，其在經重組溶液中為96%。
PSMA-BiTE1分子在經凍乾調配物中的生物活性因此在前述儲存條件下儲存超過6-12個月之後是穩定的。同樣適用於在2-8℃下儲存7天之後以及在室溫下儲存16小時後，由凍乾物重組而來的溶液。
實例17b：兩種代表性批次的穩定性：關於PSMA-BiTE1凍乾物在長期儲存與重組之後的單體(SEC及CGE)、生物活性(以細胞為主的活性分析)以及顆粒(HIAC及MFI)
含有PSMA-BiTE1分子的組成物(表18a)如凍乾物般被儲存在2-8℃與在25℃/60%相對濕度下至多12個月。在3與12個月之後，從各例的凍乾物使溶液重組並在尤其以細胞為主的活性分析中進行分析。測量法(依據Promega之CytoTox-Glo細胞毒性分析的方式)揭示在前述條件下儲存3與12個月之後單體比例在SEC與CGE方面僅有些微改變。
此外，藉由微流體成像(MFI)與HIAC(表18c)的方法測量範圍自>2至>25μm的蛋白質顆粒。兩個批次的數值於儲存期間在 測量準確度限值內維持穩定。
Figure TWI615158BD00024
以1.2ml水使凍乾物重組以供注射之用。接著所得投與用溶液具有2mg/ml的濃度。因為裝填過量，一個小瓶含有1.3ml的2.6mg PSMA-BITE1。
Figure TWI615158BD00025
Figure TWI615158BD00026
此外，分析經重組PSMA-BiTE1溶液的儲存穩定性。在重組後，首先將溶液儲存在冰箱(2-8℃)中7天並接著在室溫(+20±5℃)下16小時。之後，在此亦藉由以細胞為主的活性分析確定PSMA-BiTE1分子的生物活性。在前述進一步儲存之後，其在經重組溶液中為96%。
在上述儲存條件下儲存超過3至12個月之後，PSMA-BiTE1分子在經凍乾調配物中的生物活性於各例中在測量準確度限值內維持穩定。其他測量參數(SEC、生物活性、MFI與HIAC數值)也顯示這個結果。這同樣適用於在2-8℃下儲存7天之後以及在室溫下儲存16小時後，由此凍乾物重組而來的溶液。
實例18：呈藉由注射器以及導管的方式投與的剪力對於 PSMA-BiTE1二聚體形成的影響
組成：2.17mg/ml PSMA-BiTE1分子、50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖、0.04%聚山梨醇酯80
材料：可拋棄式注射器(BD 2ml)、導管(BD Microlance 30G1/2(REF：304000))以及棕色玻璃小管(6R)與冷凍管。
程序：解凍30個小管。6個小管用作為起始數值。就每個實驗而言，使用6個小管，亦即使用注射器/導管吸取且全部注射至棕色玻璃管或冷凍管。
實驗：
1.緩慢注射PSMA-BiTE1組成物至冷凍管(SyS Cryo)中
2.緩慢注射PSMA-BiTE1組成物至棕色玻璃管(SyS Glass)中
3.快速注射PSMA-BiTE1組成物至冷凍管(SyR Cryo)中
4.快速注射PSMA-BiTE1組成物至棕色玻璃管(SyR Glass)中
接著，藉由示差掃描螢光測定法(DSF)的方式測量二聚體形成。
實例18a：呈藉由注射器以及導管的方式投與的剪力對於 PSMA-BiTE1二聚體形成的影響
組成：2.17mg/ml PSMA-BiTE1分子、50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖二水合物、0.04%聚山梨醇酯80
材料：可拋棄式注射器(BD 2ml)、導管(BD Microlance 30G1/2(REF：304000))以及棕色玻璃小管(6R)與冷凍管。
程序：解凍30個小管。6個小管用作為起始數值。就每個實驗而言，使用6個小管，亦即使用注射器/導管吸取且全部注射至棕色玻璃管或冷凍管。
實驗：
1.緩慢注射PSMA-BiTE1組成物至冷凍管(SyS Cryo)中
2.緩慢注射PSMA-BiTE1組成物至棕色玻璃管(SyS Glass)中
3.快速注射PSMA-BiTE1組成物至冷凍管(SyR Cryo)中
4.快速注射PSMA-BiTE1組成物至棕色玻璃管(SyR Glass)中
Figure TWI615158BD00027
由示差掃描螢光測定法(DSF)的方式測量二聚體形成。在藉由注射器與導管的方式注射組成物之後，未報導二聚體比例有顯著增加。這個結果顯示，本發明調配物在所有情況下就所產生的剪力作用來說皆為穩定的。
實例19：在重組之後(在2-8℃下至多28小時)以及在2個稀釋度以及1個溫度(25℃)下於0.9%食鹽水溶液中至多8小時，PSMA-BiTE1溶液的穩定性
單體、二聚體以及多聚體的比例是藉由SEC層析的方式來測量。
組成：2.0mg/ml PSMA-BiTE1分子、50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖二水合物、0.04%聚山梨醇酯80
材料：0.9% NaCl以及注射用水
程序：藉由添加1.1ml注射用水(WFI)來使16個經凍乾PSMA-BiTE1小管重組。在這些小管中，8個小管儲存在2-8℃下，4個小管以0.9% NaCl溶液稀釋到0.066mg/ml的濃度，而4個小管以0.9% NaCl溶液稀釋到0.66mg/ml的濃度。將它們培育在25℃下並在0h、2h、4h以及8h的時間之時藉由SEC的方式進行檢驗。
Figure TWI615158BD00028
一如預期，使用WFI重組的樣品再次顯示二聚體增加，其在2-8℃下的2mg/ml溶液可被預期。單體減少明顯與二聚體增加相關，但是沒有多聚體形成。
溶解於0.9% NaCl溶液中顯示可與在PBS中的結果相 當的結果。在0.666mg/ml的情況下，單體/二聚體比例維持固定，但在0.066mg/ml的情況下，單體有依次增加。
實例20：在皮下投與的情況下針對PSMA-BITE1溶液穩定性的模型實驗
為此，經重組的PSMA-BiTE1溶液係在2個稀釋度以及2個溫度(25℃&37℃)下於PBS中進行檢驗。藉由SEC層析的方式對單體、二聚體以及多聚體及片段(LMW)的比例進行測量，以及藉由MFI的方式對在顯微鏡下才看得見的顆粒(SVP)進行測量。
組成：2.0mg/ml PSMA-BiTE1分子、50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖二水合物、0.04%聚山梨醇酯80
材料：PBS
程序：為測定經稀釋PSMA-BITE1溶液在sc投與條件下的穩定性，將8個經凍乾PSMA-BiTE1小管個別藉由添加1.1ml WFI而重組。利用PBS，將4個小管稀釋成0.066mg/ml的濃度而4個小管稀釋成0.66mg/ml的濃度。在25℃(對照)以及37℃下培育它們並且在0h、2h、4h及8h的時間之時藉由SEC與MFI的方式測量。
Figure TWI615158BD00029
以PBS稀釋並在PBS中於37℃下培育顯示PSMA-BiTE1分子在這些皮下投與的模擬條件下是穩定的。在0.66mg/ml的情況下，兩個培育溫度有穩定的單體/二聚體比例。相對地，在0.066mg/ml的情況下，可見二聚體比例降低而單體比例增加的結果。這是可逆二聚體形成的結果，其為濃度依賴性以及時間依賴性。 在SVP的情況下，SVP有略為的濃度依賴性形成、溫度依賴性形成以及時間依賴性形成，但是其不代表有穩定性的問題。這顯示調配物用於皮下投與的穩定性。
實例21：稀釋於0.9% NaCl溶液中的PSMA-BiTE1的穩定性供用於找尋劑量範圍研究
以1.2ml WFI將PSMA-BiTE1凍乾物重組並與0.9%強度NaCl溶液混合，其將聚山梨醇酯80含量調整為0.004%。為了要避免高度稀釋溶液的生物活性喪失，這是必須的。因此，在50mM磷酸鈉緩衝劑(pH 6.5)中生成1%強度聚山梨醇酯80溶液。將這個溶液添加至商業上可購得的0.9%強度NaCl溶液(例如Baxter Viaflo 250ml)以達到最終濃度為0.004%。使用這個溶液，依據下列步驟生成稀釋度從0.05μg/ml至2000μg/ml的PSMA-BiTE1：
-0.05μg/ml
-0.7μg/ml
-2μg/ml
-18μg/ml
-90μg/ml
-500mg/ml
-2000μg/ml
因此，使用無菌、空輸注袋(例如Impromediform GmbH,REF MF 1661的150ml袋)，開始將經調理的食鹽水溶劑裝入輸注袋中。將對應量的經重組PSMA-BiTE1溶液加入此溶液中並藉由旋轉該袋而混合。將1ml等分試樣填充至2ml注射器(例如Injekt 2 ml/Luer Lock Solo Braun(REF 46067001V))並以B.Braun的Combi檔塞(REF 4495101)密封。
接著將這些注射器儲存在2℃至8℃的冰箱中至多9天。此儲存包括儲存在RT(20℃ +/- 5℃)下4或20小時。關於測量，皮下注射用注射針頭(BD Microlance 330G1/2" 0.3*13mm)被附接到注射器(REF 304000)並且透過其將溶液排至2ml小管(第1型玻璃)中。
經稀釋溶液的生物活性是在細胞毒性分析中進行檢驗。在(電化學發光分析)ECL分析中確定還原率(蛋白質含量)。
因為ECL分析的測量範圍有限，在分析之前需要如下將分析溶液稀釋於經調理的0.9%強度食鹽水溶液中：
-0.05μg/ml：未經稀釋
-0.7μg/ml：1：50
-2μg/ml：1：200
-18μg/ml：1：1000
表21a與b顯示最終注射溶液在0.05至18μg/ml PSMA-BiTE1範圍內在整個9天儲存期間的儲存研究結果。蛋白質濃度在所有最終濃度下維持穩定。相對濃度(相較於T0值)在79%至117%的範圍內。依據這個物質分類的先前經驗，相對於T0值有±40%至±50%差異性的接受準則是經確認的。所測量的數據均在這個接受範圍內。
Figure TWI615158BD00030
Figure TWI615158BD00031
表21a與b中所用縮寫：
BiTE：PSMA-BiTE1分子
A：分析
Ave：平均值
T0值：在時間0時的數值
關於使用於CytoTox-Glo細胞毒性分析中，需要使用分析介質來稀釋分析溶液，如下：
18μg/ml：1：36
90μg/ml 1：180
500μg/ml 1：1000
2000μg/ml 1：4000
分析材料的生物活性表示為”相對生物活性”。其係如下測定：
Figure TWI615158BD00032
表22顯示，含有18μg/ml至2000μg/ml PSMA-BiTE1的最終輸注溶液的生物活性在整個9天儲存期間保持穩定。相對生物活性在9天的儲存期間相較於T0值有變化，在77%-132%的範圍內。這些結果皆充分落在先前測定50%至200%生物活性之接受範圍內。
Figure TWI615158BD00033
Figure TWI615158BD00034
表22中所用縮寫：
BiTE：PSMA-BiTE1分子
A：分析
Ave：平均值
T0值：在時間0時的數值
經稀釋且經儲存9天的溶液之生物活性差異性相較於T0值不大於±33%。沒有明顯趨勢指出在儲存時間期間生物活性有明 顯喪失。含有18μg/ml PSMA-BiTE1的分析溶液在儲存時間期間於生物活性方面表現出些許降低，但是當考量較高濃度的分析溶液時不能確認有這個趨勢。
此外，在ECL分析中，18μg/ml的濃度在整個儲存時間內蛋白質沒有降低。
歸納來說，可說明PSMA-BiTE1的最終注射溶液可以18-2000μg/ml的濃度範圍，於+2-8℃的溫度下儲存至多9天(包括在+20±5℃下至多20小時的期間)，與所用稀釋條件以及儲存與投與系統相容。
實例22：PSMA-BiTE1在皮下投與之後的生物可利用性
使用50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖、0.04%聚山梨醇酯80的調配物，可以在皮下投與之後達到高生物可利用性。PSMA-BiTE1分子的s.c.生物可利用性是在4隻母石蟹獼猴中進行檢驗。用於s.c.投與的劑量為45μg/kg且相比i.v.投與為5與15μg/kg體重(BW)。以生理食鹽水溶液稀釋2mg/ml原液。i.v.投與的輸注時間為1小時而輸注速率為1ml/kg BW。選定的注射位點為表層靜脈(小隱靜脈)。關於s.c.投與，以0.15ml/kg BW將測試溶液注射至側胸區中。使用ELISA分析檢驗血液含量。因此，使用ECL技術。該方法的定量下限(LLOQ)為4μg/l。
實例22a：PSMA-BiTE1在皮下投與之後的生物可利用性
使用50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖二水合物、0.04%聚山梨醇酯80的調配物，可以在皮下投與之 後達到66%生物可利用性。PSMA-BiTE1分子的s.c.生物可利用性是在4隻母石蟹獼猴中進行檢驗。用於s.c.投與的劑量為45μg/kg且相較i.v.投與為5與15μg/kg體重(BW)。以生理食鹽水溶液稀釋2mg/ml原液。i.v.投與的輸注時間為1小時而輸注速率為1ml/kg BW。選定的注射位點為表層靜脈(小隱靜脈)。關於s.c.投與，以0.15ml/kg BW將測試溶液注射至側胸區。使用ELISA分析檢驗血液含量。因此，使用ECL技術。該方法的定量下限(LLOQ)為4μg/l。
方法 生產PSMA-BiTE分子
舉例而言，用於生產BiTE分子(更具體而言為PSMA-BiTE分子)的方法描述於WO2010037836 A2中。
首先，將編碼PSMA-BiTE1的重組型BiTE DNA構築體併入適當表現載體中並從而穩定地引入真核CHO(中國倉鼠卵巢)細胞中。以適當培養基將經轉染的CHO細胞培養在生物反應器中並藉由過濾細胞來分離分泌蛋白質。BiTE分子的純化包含藉由尺寸排除層析(SEC)以TRIS以及磷酸鹽置換緩衝物質並且接著藉由超過濾以及濾洗濃縮。此外，使用多元醇(較佳為海藻糖)以及濕潤劑(較佳為聚山梨醇酯80)。將組成物儲存在-60℃下。
示差掃描螢光測定法(DSF)
使用7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)對PSMA-BiTE1分子的穩定性進行測量(例如在剪力之後)。在96孔盤(微量盤)中將不同的PSMA-BiTE1濃度(介於0.15與 0.005mg/ml之間)與螢光染料(例如”Sypro® Orange 5000”)混合並在PCR系統(7500 Fast Real-Time PCR System,Applied Biosystems)中進行測量。溫度從20℃增加至90℃。經由螢光偵測確定蛋白質的熔點，當螢光染料與蛋白質的疏水性區域反應時，螢光是以溫度依賴性的方式產生。
示差掃描測熱法(DSC)
PSMA-BiTE1分子的熱展開溫度(Tm)是藉由DSC的方式來確定。為此，將樣品自20℃加熱至105℃，並使用量熱計來確定多肽的熔點。使用來自GE Healthcare的VP-DSC儀器。
攪動壓力
於控溫室(MMM,FrioCell 200)中藉由在實驗室振動器(IKA,HS 260)上攪動對樣品施予壓力。在300rpm與20℃下24小時後確認團聚的主要特性參數。
外觀檢查
在剪力之後藉由使溶液與黑色背景相對照並檢核可見顆粒或濁度來對PSMA-BITE溶液穩定性進行外觀檢查。在攪動壓力測試之後，澄清溶液表示少許或無二聚體及/或多聚體形成，而溶液的可見濁度與高比例的二聚體及/或多聚體有關。
動態光散射(DLS)
動態光散射是一種分析雷射在溶解或懸浮樣品上的 散射光的方法。測量的是流體動力半徑，復而能推論出PSMA-BiTE1分子的團聚狀態。流體動力半徑是使用Horiba LB 550(Retsch Technology)來測量。
蛋白質含量的測定
蛋白質含量是使用Nanodrop 2000(Thermo Scientific)在280nm下以分光光譜的方式來測量。所有的樣品是與對應安慰劑或緩衝溶液對照來進行測量。
將各樣品溶液(2μl)抽吸3x至Nanodrop儀器的測量區中並在每個情況下以二重複的方式測量；之後，平均這些測量值(n=6)。透過先前產生的蛋白質校正函數(與蛋白質含量相關的吸收依賴性)由平均測量值計算出蛋白質含量[mg/ml]。
電化學發光測量(ECL分析)
關於這個方法，使用SULFO-TAGTM標記，其在電化學刺激之後發光。在所謂的MULTI-ARRAY微量盤上的電極表面進行刺激。所發出的光是使用偵測器在約620nm下進行測量。
測量是基於“三明治“方法，其中溶液內的PSMA-BiTE1分子藉由多株山羊抗-PSMA-BiTE1抗體而被固定在微量盤上。五-His-生物素接而結合至固定的BiTE分子並藉由SULFO-TAGTM-接合的卵白素來偵測。在Sector Imager 2400中讀取樣品。
尺寸排除層析(SEC)
為了要測定單體以及二聚體還有低分子量(LMW)與高分子量(HMW)部分的比例，使用HPLC系統進行尺寸排除層析。使用螢光偵測器進行測量並藉由面積/百分率方法來進行計算。所用的管柱是蛋白質SEC用的標準管柱，例如Tosoh Biosep TSK gel G3000 SWXL 5μm，300mm長×7.8mm i.D.或相等的材料。
在i.v.與s.c.投與後，血清中的PSMA-BITE1濃度測定
PSMA-BITE1在石蟹獼猴血清中的濃度是藉由ELISA來測量。藉由電化學發光來進行偵測。偵測極限(LLOQ)為0.98μg/l，其中準確度為3至28%而正確度為70至100%。
以細胞為主的活性分析
以細胞為主的活性分析是用為確定PSMA-BiTE1樣品的相對活性的慣用分析。因為PSMA-BiTE1對人類/石蟹獼猴CD3-陽性以及人類/石蟹獼猴PSMA-陽性細胞具有雙特異性結合，在T細胞(效應子細胞)活化之後發生標的細胞的T細胞媒介溶解。
細胞毒性是藉由Promega的發光CytoTox-Glo細胞毒性分析的方式來偵測。所用的測量值是被釋放的光訊號量，其與死亡細胞數相關。其他活性分析描述於WO2010037836 A2中。
用於測定PSMA-BiTE1樣品之相對活性的以細胞為主的細胞毒性分析
Figure TWI615158BD00035
Figure TWI615158BD00036
Figure TWI615158BD00037
Figure TWI615158BD00038
Figure TWI615158BD00039
測試程序
樣品、分析對照品以將樣品、分析對照品以及參考材料的等
Figure TWI615158BD00040
測定細胞毒性以及相 對活性
Figure TWI615158BD00041
Figure TWI615158BD00042
測定PSMA-BiTE1多肽的濃度(UV/VIS分光學)
依據歐洲藥典(Ph.Eur.,2.2.25，在280nm下的UV-VIS分光學)進行該方法且亦適用於測定其他分子的濃度。
首先，依據實驗來測定PSMA-BiTE1分子的吸光係數。為此，測定已知PSMA-BiTE1濃度之溶液的吸光值，依據PSMA-BiTE1分子的莫耳質量(1.8673 x 105g/mol)建立濃度(以mol/l計)。根據吸光值、路徑長度以及濃度，可以依據下式計算出PSMA-BiTE1分子的吸光係數
e=A/c x d，其中
A=在適當波長(在本例中為280nm)下的吸光值(或吸光，忽略光散射)
c=濃度(mol/l)
d=路徑長度(mm)。
接著在y軸上將吸光值相對於x軸上的相關濃度作圖以獲得標準曲線。使用這些標準曲線，隨後能直接依據吸光值取得PSMA-BiTE1溶液的濃度。
為了產生前述標準曲線，必須將比爾-蘭博定律應用於所測量的溶液，亦即，尤其是吸光物質必須均質地分布在溶液中，必須忽略吸光係數在所測量光譜範圍內的變異，且必須將測量溶液濃縮至足夠低的程度以使得與交互作用有關的偏差不會發生。
使用分子的吸光係數，根據測得的吸光值(或在280nm下的吸光值)，可根據下列反算出蛋白質濃度(以mol/l計)蛋白質濃度[mol/l]=A x V/e x d，其中
A=在280nm下的吸光值
d=以cm計的槽長度(標準槽，1.00cm)
V=測試溶液的稀釋度
e=PSMA-BiTE1在280nm下的吸光係數=111 315M-1 x cm-1.。
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<120> 多肽之調配物
<130> BHC 11 1 057
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 1
Figure TWI615158BD00043
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 白鬢狨
<400> 2
Figure TWI615158BD00044
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> 棉冠獠狨
<400> 3
Figure TWI615158BD00045
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 松鼠猴
<400> 4
Figure TWI615158BD00046
<210> 5
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv Bindedom鄚e CD3
<400> 5
Figure TWI615158BD00047
<210> 6
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv Bindedom鄚e PSMA
<400> 6
Figure TWI615158BD00048
<210> 7
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PSMA-BiTE
<400> 7
Figure TWI615158BD00049
Figure TWI615158BD00050
<210> 8
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PSMA-BiTE1的序列
<400> 8
Figure TWI615158BD00051
Figure TWI615158BD00052
Figure TWI615158BD00053

Claims (13)

  1. 一種液體醫藥組成物，其包含多肽、TRIS以及磷酸鹽，該多肽包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，其特徵在於：該組成物含有呈濃度自0.5μg/ml至3.0mg/ml的多肽，該組成物含有100mM TRIS以及50mM磷酸鹽，該組成物的pH為6.0，且該組成物含有0.04%聚山梨醇酯80。
  2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其特徵在於該組成物另外包含凍乾保護劑。
  3. 如申請專利範圍第2項之組成物，其特徵在於該組成物含有2-10%的凍乾保護劑。
  4. 如申請專利範圍第2或3項之組成物，其特徵在於該凍乾保護劑為海藻糖或海藻糖二水合物。
  5. 如申請專利範圍第1項之組成物，其特徵在於該組成物另外包含約4%海藻糖二水合物。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物，其特徵在於該組成物含有呈濃度為2mg/ml的多肽。
  7. 一種固體混合物，其可藉由凍乾如前述申請專利範圍中任一項之液體組成物而獲得。
  8. 一種液體醫藥組成物，其特徵在於該組成物是藉由將申請專利範圍第7項之經凍乾固體混合物溶解於適當液體介質中而被重組(reconstituted)。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物，其特徵在於該多肽在皮下投與組成物之後的生物可利用性為>60%。
  10. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物，其是用於治療性方法中。
  11. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物，其是用於治療性方法中，該方法包含非經口投與該組成物。
  12. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物，其是用於治療性治療前列腺過度增生性疾病的方法中。
  13. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物，其是用於治療性治療前列腺過度增生性疾病的方法中，該方法包含皮下投與該組成物。
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