MX2015005700A - Formulacion para dominios de union biespecificos de celulas-t (bites). - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas estables que contienen polipéptidos con por lo menos dos dominios de unión a antígeno y que son especialmente adecuadas para su administración subcutánea. La invención pone a disposición composiciones líquidas que minimizan la formación de agregados indeseados de polipéptidos (dímeros y/o multímeros). La presente invención pone además a disposición un método para minimizar la agregación de polipéptidos con dominios de unión a péptidos en composiciones líquidas.

Description

FORMULACIÓN PARA DOMINIOS DE UNION BIESPECÍFICOS DE CELULAS-T (BITES) CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones farmaceuticas estables que contienen polipéptidos con por lo menos dos dominios de unión a antígeno y que son especialmente adecuadas para la administración subcutánea. La invención pone a disposición composiciones líquidas que minimizan la formación de agregados indeseados de polipéptidos (dímeros y/o multímeros). La presente invención pone además a disposición un método para minimizar la agregación de polipéptidos con dominios de unión a péptidos en composiciones líquidas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La necesidad de estabilizar anticuerpos en solución, es decir, de impedir la formación de dímeros y multímeros (los denominados agregados de elevado peso molecular o agregados de HMW (High Molecular Weight)), a efectos de mantener constante su eficacia terapéutica, es conocida en el estado de la téenica. El documento WO 2011061712 divulga formulaciones estabilizadas de anticuerpos, que además de 25 - 250 mg/ml de anticuerpo contienen 10 - 30 mM de un tampón (preferentemente acetato, succinato, fosfato, histidina o sus combinaciones), de 1 a 15% de un poliol además de 0,001 a 0,05% de un agente humectante. El valor de pH de las composiciones es de 5 a 7,5.

En el documento WO 2010148337(A1) (“Lyophilized formulation for small modular immunopharmaceuticals”) se revelan composiciones denominadas SMIP (Small Immunopharmaceutical Proteins, Pequeñas proteínas inmunofarmacéuticas). Se trata de constructos de varios dominios fusionados, como por ejemplo de un dominio de unión a antígenos, una región bisagra de inmunoglobulina y una región CH2 O CH3 de una molécula de Ig o de una región derivada de ellos. Los dominios de los SMIP consisten en polipéptidos que son productos de secuencias de genes que pueden ser de procedencia humana, no humana o artificial (generados con ayuda de métodos de ingeniería genética). Si bien las proteínas SMIP son preferentemente monoespecíficas, en la solicitud tambien se revelan variantes multiespecíficas, como por ejemplo moléculas de escorpión. Estas contienen proteínas SMIP con otro dominio de unión, C-terminal. Los dominios de unión de las moléculas de escorpión se unen preferentemente a diversas estructuras objetivo por lo que son adecuados como agentes terapéuticos inmunoespecíficos. El documento WO 2010148337(A1) divulga formulaciones estables de composiciones liofilizadas que contienen un SMIP, en donde menos del 7% del SMIP se halla presente en forma agregada. Estas formulaciones pueden además contener agentes tamponantes, agentes estabilizantes, agentes de masa, agentes humectantes y otros materiales adyuvantes. El documento WO 2009070642 A1 divulga diversas formulaciones de la molécula de BiTE MT103, cuyo primer dominio unión se une específicamente al antígeno del receptor de las células T CD3, mientras que el segundo se liga específicamente al antígeno de células B CD19. Las moléculas de BiTE son estables en las composiciones reveladas hasta una concentración de a lo sumo 300 mg/ml, con un valor de pH = 7,0. Como agente tamponante se emplea citrato. Las formulaciones son adecuadas para administración intravenosa y subcutánea. La biodisponibilidad después de la administración subcutánea es del 10 al 50%.

Los anticuerpos IgG tienen regiones constantes grandes (regiones CHI-3/CL), que son responsables de una gran parte de sus propiedades fisicoquímicas. Los anticuerpos IgG con distintas especificidades se diferencian en su estructura principalmente en la región de los puntos de ligación hipervariables a los anticuerpos (CDR1-CDR3) dentro de las regiones VL y VH. Las diferencias estructurales y fisicoquímicas entre las variantes individuales de IgG son relativamente reducidas, debido a las grandes regiones constantes. Lo mismo que los anticuerpos IgG las moléculas de SMIP descritas en el documento WO 2010148337 (A1) contienen partes de los dominios constantes de anticuerpos.

En cambio, las moléculas de BiTE de diferente especificidad se diferencian manifiestamente en sus propiedades fisicoquímicas. Como proteínas de fusión consistentes en dos fragmentos de variables de cadena simple (scFv) idR de diferentes inmunoglobulinas les faltan las regiones constantes CHI-3/CL, por lo que las diferencias en los dominios de unión se refieren por lo demás a regiones parciales más grandes de la molecula de BiTE, de lo que sería el caso para los anticuerpos IgG o SMIP. De la misma manera se diferencian la molécula de BiTE MT103 y las moléculas de BiTE que se utilizan en la presente invención, fundamentalmente en cuanto a su estructura molecular. Mientras que los dominios para MT103 están dispuestos en la secuencia VL-VH-VH-VL, la disposición de las moléculas de BiTE, que se emplean preferentemente en la presente invención, se encuentran predominantemente en la forma VH-VL-VH-VL. Además de ello, las secuencias de ambas moléculas se diferencian en numerosas posiciones.

Estas propiedades de las moléculas de BiTE así como también su reducido tamaño imponen diferencias manifiestas en el comportamiento fisicoquímico de diversas moléculas de BiTE. Además de ello, resulta la necesidad de desarrollar formulaciones individuales (para aumentar las estabilidades fisicoquímicas) para cada aplicación individual, dado que las formulaciones de BiTE individuales o de moléculas similares no pueden emplearse para aplicaciones alternativas, o solamente puede serlo de manera limitada.

En una forma de realización los péptidos contenidos en las composiciones son los denominados BiTE ( Bispecifíc T-cell-engangers). En una forma de realización específica, los BiTE poseen un primer dominio de unión, que se liga específicamente a la cadena e del complejo receptor de las células T-CD3 y un segundo dominio de unión, que se une específicamente al PSMA (Prostata-spezifische Membranantigen). El PSMA es una proteína de membrana de tipo II integral, que se expresa muy específicamente y en el caso de cáncer de próstata de manera reforzada sobre las células epiteliales de próstata. Además, el PSMA es expresado por vasos sanguíneos recién formados de los tumores sólidos. Por lo tanto, los PSMA-BiTE mediante un contacto directo entre las células T citotóxicas y estas células objetivo.

La formación de agregados de proteínas, como p.ej. de las moléculas de BiTE, es indeseable en las composiciones farmacéuticas; por ejemplo, la efectividad o disponibilidad de una sustancia biológica puede ser modificada por la formación de agregados.

Por lo tanto, resulta el objetivo de poner a disposición una formulación que permita estabilizar la molécula de BiTE de manera tal que se reprima una formación indeseada de agregados.

La solución ha sido expuesta en el presente solicitud y en las reivindicaciones y comprende una formulación de BiTE que comprende TRIS y fosfato. En su forma de realización preferida, la formulación comprende la formulación de fosfato 50 mM, TRIS 100 mM, Polisorbato 80 al 0,04% y trehalosa dihidratada al 4% con un pH de 6,0, y está en condiciones de estabilizar formulaciones con moleculas de PSMA-BÍTE1 contra la formación de agregados. Esto rige para concentraciones bajas en el intervalo de unos pocos mg/ml como también para concentraciones más elevadas, de > 2 mg/ml. El efecto estabilizante es sorprendente para la persona experta, ya que por ejemplo el citrato empleado en el documento WO 2009070642 A1 , también en una combinación consistente en citrato 50 mM y Tris 100 mM, con pH 6,0, no muestra este efecto. Así, la proporción medida de dímero para una composición comparable que solamente contenía citrato en lugar de fosfato, era de 7,0%. En cambio, la composición de acuerdo con la invención limitaba la proporción de dímero al 0,8% (comp. las Tablas 6 y 7). La utilización combinada de TRIS y fosfato es la causante del efecto estabilizante de las composiciones. A efectos de estabilizar la molécula de BiTE también contra las fuerzas de cizallamiento, se requiere un agente como el Polisorbato e 80 en una concentración de por lo menos 0,04 %, ya que en caso contrario la proporción de dímero sería excesiva (aproximadamente 7,5%, véase la Tabla 15). A efectos de impedir la adsorción de las moléculas de PSMA-BÍTE1 en la pared de los vasos sanguíneos debido a la utilización de jeringas de inyecciones, bolsas de infusión, ya es suficiente Polisorbato e 80 al 0,002%.

Definiciones La noción “anticuerpo” utilizada en la presente se refiere a moléculas de inmunoglobulina cada una de las cuales comprende dos cadenas polipeptídicas pesadas (H) y dos cadenas polipeptídicas ligeras (L) que están unidas entre sí mediante puentes disulfuro. Cada una de las cadenas pesadas está constituida por una región variable (VH) y por una cadena constante, que a su vez está constituida por tres dominios (CH1 , CH2 y CH3). Cada una de las cadenas ligeras está constituida por una región variable (VL) y una cadena constante (CL). Las cadenas variables de tanto las cadenas ligeras como tambien de las cadenas pesadas (VH y VL) están subdivididas, cada una de ellas, en tres lugares de unión a anticuerpos hipervariables (CDR1-CDR3) y en total cuatro regiones conservadas entre los CDRs (FR1-FR4).

El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que procede de una población de anticuerpos que son idénticos entre sí con la salvedad de mutaciones o modificaciones postraducción naturales menores. A diferencia de los anticuerpos policlonales, que se presentan dentro del campo de la inmunorrespuesta, los anticuerpos están orientados contra un epítopo específico.

Un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” es un anticuerpo artificial, híbrido con dos pares diferentes de cadenas pesadas y ligeras así como también con dos lugares diferentes de ligación a antígeno.

Un tratamiento con anticuerpos con papaína conduce a dos fragmentos Fab de unión a antígeno, así como al fragmento Fe cristalizable. Un “fragmento Fab” está constituido por una cadena VL completa y por una parte de la cadena pesada, a saber el dominio VH con la región variable y el primer dominio constante CH1. Por lo tanto cada fragmento Fab posee un único lugar de unión a antígeno. El “fragmento Fe” comprende las partes carboxi terminales de ambas cadenas pesadas, anudadas entre sí mediante puentes disulfuro. Partes del fragmento Fe son reconocidas por los receptores Fe de otras células y de esta manera determinan las funciones efectoras de los anticuerpos.

La pepsina escinde los anticuerpos por debajo de los puentes disulfuro, por lo que ambos fragmentos Fab permanecen unidos por la región de bisagra y se origina un único “fragmento F(abV· El mismo dispone de ambos lugares de unión a antígeno y por ello está en condiciones de reticular antígenos, lo mismo que el anticuerpo completo.

El término “dominio” designa una región globular de una proteína con una estructura definida e independientemente plegada. Las cadenas ligeras de un anticuerpo de IgG están compuestas de 2 dominios juntos (en cada caso uno constante y uno variable), las cadenas pesadas están compuestas de cuatro dominios (en cada caso tres constantes y uno variable). Ambas regiones variables están compuestas, cada una de ellas, de un dominio de la cadena pesada y de un dominio de la cadena ligera.

Los terminos “epítopo” o “determinante antígeno” designa la región de un antígeno al que se une un anticuerpo (o el fragmento de unión a antígeno del mismo) de manera específica. Los epítopos pueden consistir en aminoácidos consecutivos, o en aminoácidos no consecutivos, cuya proximidad espacial mutua se debe al plegado terciario de proteínas.

Un “antígeno” es una molécula (por ejemplo, una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato) con un “determinante antigénico”, al que puede ligarse un anticuerpo.

El término “conformación” se refiere a la temperatura de una proteína o polipéptido, por ejemplo, de un anticuerpo, de una cadena de anticuerpo, de un dominio o de una parte del mismo.

Un anticuerpo, que “se une específicamente” a un determinado polipéptido o un epítopo sobre un polipéptido determinado, o que es “específico de” dicha estructura, se une de una manera considerablemente menos efectiva a estructuras alternativas.

En la presente solicitud, el término “anticuerpo scFv” se refiere a fragmentos de anticuerpos preparados artificialmente, consistentes en dominios VH y VL covalentemente ligados de un anticuerpo. Ambos dominios se encuentran en una única cadena de polipéptido y están unidos entre sí por intermedio de un ligador consistente en varios aminoácidos. Hasta las funciones efectoras mediadas por Fe, en el caso de los anticuerpos scFv se mantienen todas las funciones de un anticuerpo, en especial su selectividad y afinidad.

Las moléculas de BiTE ("Bispecific T-cell-enganger”) son constructos de proteína recombinantes consistentes en dos anticuerpos de cadenas individuales flexiblemente ligados (scFv). Uno de estos anticuerpos scFv se liga específicamente a un antígeno tumoral expresado por las células apuntadas, el segundo se liga específicamente a CD3, una subunidad del complejo receptor de las células T sobre células T. Los anticuerpos BiTE están en condiciones de ligar de manera transitoria las células T a las células objetivo y al mismo tiempo activar la actividad citotóxica de las células T. Para la activación mediada por BiTE de las células T no son necesarios receptores de células T específicos ni moléculas de MHC I, antígenos péptido ni moléculas coestimuladoras sobre las células objetivo.

Los terminos "estabilidad" y "estable" en el contexto de los compuestos que contienen moléculas de BiTE se refieren a la resistencia de los anticuerpos o bien de su fragmentos contra su agregación, degradación o fragmentación en las condiciones dadas para su producción, preparación, almacenamiento, utilización o transporte. Las formulaciones “estables" de acuerdo con la presente invención conservan su actividad biológica en las condiciones dadas de producción, preparación, transporte, utilización y almacenamiento.

Las proteínas que se hallan en solución (por ejemplo, las moléculas de BiTE) son sensibles al movimiento mecánico, como el que se presenta durante su preparación, introducción en envases, y transporte. A partir de una determinada intensidad del movimiento se agregan y/o desnaturalizan las moléculas. Las composiciones líquidas que contienen proteínas quedan por lo tanto expuestas durante su movimiento mecánico a un denominador “estrés por agitación”. En el ensayo de estrés por agitación, mediante la utilización controlada de fuerzas mecánicas (de agitación) sobre las composiciones líquidas que contienen proteínas se analiza el comportamiento de agregación y de desnaturalización de las proteínas disueltas en diversas composiciones.

El comportamiento de una proteína en el ensayo de estrés por agitación es una indicación de su estabilidad física frente a fuerzas de cizallamiento que se presentan, por ejemplo, durante la aspiración e inyección de soluciones mediante cánulas.

El término "liofilización" se refiere a un procedimiento de secado que se basa en el principio de la sublimación. La sustancia a ser secada se enfría primero a una temperatura de aproximadamente -45 °C, antes de aplicarse subsiguientemente un vacío y la sustancia se calienta a una temperatura de aproximadamente -20 °C. De esta manera, se subliman los cristales de hielo directamente pasando a un estado gaseoso, sin que se pase por una etapa intermedia líquida. La sustancia secada de esta manera contiene después de una etapa de secado posterior (siempre bajo vacío) a una temperatura de 25°, menos del 5% de su humedad original, y se lo designa como "liofilizado".

Antes de su administración al paciente se procede a "reconstituir" el liofilizado, es decir, se lo disuelve en un agente de dilución farmacéuticamente aceptable. En el sentido de la presente invención, una "formulación reconstituida" se origina disolviendo una formulación liofilizada de anticuerpo en un agente diluyente de este tipo. Subsiguientemente el anticuerpo se encuentra disuelto y puede ser administrado al paciente.

Mediante el termino “polioles" se designa un grupo de compuestos orgánicos que contienen varios grupos hidroxilo (-OH) (polialcohol, alcoholes polihídricos). Los polioles como sacarosa o trehalosa son azúcares que están en condiciones de estabilizar anticuerpos y/o influir sobre la osmolaridad de una composición.

A efectos de evitar una indeseada degradación o agregación de proteínas durante la liofilización, se añaden los denominados “agentes lioprotectores”. Al respecto se trata por ejemplo de azúcares o de alcoholes de azúcar tales como sacarosa, mañosa, trehalosa, glucosa, sorbitol, manitol. En el contexto de la presente invención, la trehalosa es el agente lioprotector preferiblemente utilizado.

En la presente, el término "agente humectante" se refiere a cualquier agente detergente con una región hidrófila y una región hidrófoba e incluye agentes detergentes no iónicos, catiónicos, aniónicos y zwitteriónicos. Los agentes detergentes utilizables comprenden por ejemplo monoleato de polioxietilensorbitano (también conocido como Polisorbato 20 o TWEEN 20), monolaurato de polioxietilensorbitano (también conocido como Polisorbato 20 o TWEEN 20), o N-laurilsarcosina. Para las composiciones divulgadas en la presente, cabe preferir un agente humectante no iónico. Para las composiciones de la presente invención se prefiere especialmente la utilización de Polisorbato e 80. El agente humectante puede ser utilizado en una concentración del 0,002% al 0,1%.

El término “tampón” se refiere a una solución tamponada cuyo pH cambia sólo muy poco después de la adición de materiales ácidos o alcalinos. Las soluciones tamponadas contienen una mezcla de un ácido débil con su base correspondiente o una base débil y su ácido correspondiente.

El término "paciente" se refiere a individuos (humanos o animales), que reciben un tratamiento preventivo o terapéutico.

El término "tratamiento" utilizado en la presente se refiere a la aplicación o administración de una sustancia terapéutica un paciente, o a la aplicación o administración de una sustancia terapeutica en un tejido aislado o en una línea de células de un paciente, que sufre de una enfermedad, muestra un síntoma de una enfermedad, o tiene una predisposición para una enfermedad, con el objetivo de ocasionar una mejoría o de influir en la enfermedad, en sus síntomas o en una predisposición a la enfermedad o de desactivar o atenuar dicha enfermedad, síntomas o predisposición.

En la presente, la expresión "dosis efectiva" se refiere a la cantidad de sustancia activa con el que puede lograrse el efecto deseado, por lo menos parcialmente. Por lo tanto, por definición una "dosis terapéuticamente efectiva" es la cantidad de sustancia activa que es suficiente para curar una enfermedad por lo menos parcialmente, o para contrarrestar por lo menos parcialmente los efectos ocasionados en el paciente. Las cantidades efectivamente requeridas para ello depende del grado de seriedad de la enfermedad como también de la condición inmunológica general del paciente.

El término "biodisponibilidad", tal como se lo utiliza en la presente, se refiere a la proporción porcentual de una sustancia activa o de la dosis de un medicamento, que se encuentra disponible sin modificar en el sistema circulatorio sistémico. Por lo tanto, la biodisponibilidad es una medida de con qué rapidez y en qué amplitud la sustancia activa es resorbida y en qué lugar de acción se encuentra disponible. Por definición, los medicamentos aplicados por vía intravenosa tienen una biodisponibilidad del 100%.

La biodisponibilidad absoluta es la biodisponibilidad de una sustancia administrada de manera arbitraria (no intravenosa) en comparación con su administración intravenosa, mientras que la biodisponibilidad relativa resulta de la comparación entre las biodisponibilidades obtenidas mediante formas de administración individuales (por ejemplo, oral vs. subcutánea).

Un “compuesto isotónico" posee esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Por ello las composiciones isotónicas tienen por lo general una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. El término “hipotónico” describe composiciones con una presión osmótica inferior a la de la sangre humana, mientras que las composiciones “hipertónicas” presentan una presión osmótica superior a la de la sangre humana.

La expresión "agregados de elevado peso molecular" (sinónimo HMW = “High Molecular Weight Aggregates”) se refiere a agregados que están compuestos por lo menos de dos monómeros proteína.

El término “fosfatos” utilizado se refiere a sales solubles en agua, farmacéuticamente aceptables, de ácido ortofosfórico tribásico (H3PO4), prefiriéndose fosfatos primarios (hidrogeno-fosfatos) y secundarios (dihidrogeno-fosfatos). Es preferible que las composiciones de acuerdo con la invención contengan fosfato de sodio, preferentemente hidrogeno-fosfato disódico (Na2HP04).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la formulación farmacéutica de una molécula de BiTE (Bispecific T-cell-engager), caracterizada porque comprende TRIS (Tris (hidroximetil)-aminometano) y fosfato.

Las moléculas de BiTE son conocidas en el estado de la téenica. Las moléculas de BiTE están configuradas de manera tal que hacen intervenir células T transitoriamente citotóxicas para la lisis de determinadas células objetivo. (Véase Báuerle et al. Curr. Opin. Mol. Ther. 2009 Feb; 11 (1 ):22-30). Son adecuadas para la terapia de cáncer.

Una molécula de BiTE es un polipéptido que comprende dos dominios de unión a anticuerpo scFv, en donde el primer dominio de unión scFv puede unirse al CD3 épsilon humano y el segundo dominio de unión scFv se une un segundo antígeno de superficie. Es preferible que se trate de antígenos de superficie humanos de células cancerosas. Los dominios de unión scFv pueden abarcar fragmentos de anticuerpo quiméricos, humanizados o humanos. Es preferible que los dominios de unión scFv comprendan fragmentos de anticuerpos humanos o humanizados.

Las moléculas de BiTE utilizadas en la presente invención se diferencian de las moléculas de BiTE (por ejemplo, MT103) descritas en por ejemplo el documento WO 2009070642 A1 por el hecho de que el primer dominio de unión puede unirse a un epítopo de la cadena épsilon humana y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en donde el epítopo es parte de una secuencia de aminoácidos que ha sido elegida del grupo constituido por SEC ID N°: 1, 2, 3 y 4 y en donde el epítopo comprende por lo menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Esto tiene la ventaja de que se facilitan las investigaciones preclínicas, ya que es posible llevar a cabo por ejemplo estudios farmacocineticos o toxicológicos en los animales de laboratorio mencionados cuyo sistema inmunológico es similar a la del ser humano. Moléculas de BiTE con estas características se han divulgado por ejemplo en los documentos WO 2008119566 A2 o WO 2008119567 A2.

En una forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende por lo tanto también aquellas moléculas de BiTE cuyo primer dominio de unión puede unirse a un epítopo de la cadena épsilon de CD3 humano o de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en donde el epítopo es parte de una secuencia de aminoácidos que ha sido seleccionada del grupo constituido por SEC ID N°: 1, 2, 3 y 4 y en donde el epítopo comprende por lo menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu.

En la SEC ID N°: 5 se reproduce la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión scFV, que satisface los criterios arriba mencionados.

En una forma de realización preferida el primer dominio de unión del polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 5.

Los scFV comprenden los aminoácidos de una cadena de anticuerpo ligera variable (VL) y de una cadena pesada variable (VH). Las moléculas de BiTE pueden estar estructuradas en distintas orientaciones. La molécula de BiTE tiene por ejemplo una disposición (VL-VH) dominio de unión 2 -(VH-VL) dominio de unión 1 de scFVs.

También son posibles otras orientaciones, por ejemplo (VH-VL) dominio de unión 2-(VH-VL) dominio de unión 1.

En una forma de realización preferida, el polipéptido tiene la disposición (VH-VL) dominio de unión 2 - (VH-VL) dominio de unión 1.

En una forma de realización especialmente preferida, el polipéptido tiene la disposición (VH-VL) dominio de unión 2 - (VH-VL) dominio de unión 1, en donde (VH-VL) dominio de unión 1 comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 5.

Una forma de realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica líquida caracterizada porque el segundo dominio de unión puede ligarse a un antígeno de la superficie de las celulas. Un antígeno de la superficie celular es un antígeno al que puede unirse por ejemplo una proteína de unión, por ejemplo un anticuerpo o un scFv, sin que sea necesario lisar la célula.

Una forma de realización de la presente invención es una composición farmacéutica líquida caracterizada porque el segundo dominio de unión del polipéptido puede unirse a un antígeno de superficie de una célula cancerosa.

En otra forma de realización, el segundo dominio de unión del polipéptido se liga al antígeno de superficie humano PSMA (Prostate-Specific Membrane Antigen, SWISS-PROT: FOLH1_HUMAN, n° de referencia: Q04609). Las moléculas de BiTE de este tipo han sido descritas en, por ejemplo, el documento WO 2010037836 A2.

En la SEC ID N°: 6 se describe un dominio de unión que se une a PSMA.

En una forma de realización preferida, el segundo dominio de unión del polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 6.

Una forma de realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica líquida que comprende un polipéptido que comprende un primer y un segundo dominio de unión scFv, en donde el primer dominio de unión comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 5, caracterizada porque la composición contiene además TRIS y fosfato.

Una forma de realización de la presente invención comprende una composición farmacéutica líquida caracterizada porque los dominios de unión del polipéptido comprenden fragmentos de anticuerpo scFv humanos u humanizados.

Una forma de realización de la presente invención comprende una composición farmacéutica líquida caracterizada porque el segundo dominio de unión que se une a PSMA comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la -SEC ID N°: 6.

En una forma de realización, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de un primer y de un segundo dominio de unión codificados por las secuencias reproducidas en la SEC ID N°: 5 y en la SEC ID N°: 6.

Un polipéptido que comprende las secuencias reproducidas en la SEC ID N°: 5 y en la SEC ID N°: 6 se reproduce en las SEC ID N°: 7 o SEC ID N°:8.

Un polipéptido preferido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 7.

Un polipeptido especialmente preferido es la molécula de PSMA-BiTE 1 que es codificada por la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 8.

Una forma de realización preferida de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica líquida que comprende un polipéptido, TRIS y fosfato, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 7.

Una forma de realización especialmente preferida de la presente invención es una composición farmacéutica líquida que comprende un polipéptido, TRIS Y fosfato, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 8.

En una forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,7 pg/ml, aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 2 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 6 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 15 pg/ml, aproximadamente 18 pg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 25 pg/ml, aproximadamente 30 pg/ml, aproximadamente 30 pg/ml, aproximadamente 35 pg/ml, aproximadamente 40 pg/ml, aproximadamente 45 pg/ml, aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 55 pg/ml, aproximadamente 60 pg/ml, aproximadamente 70 pg/ml, aproximadamente 80 pg/ml, aproximadamente 90 pg/ml, aproximadamente 100 pg/ml, aproximadamente 110 pg/ml, aproximadamente 120 pg/ml, aproximadamente 130 pg/ml, aproximadamente 140 pg/ml, aproximadamente 150 pg/ml, aproximadamente 160 pg/ml, aproximadamente 170 pg/ml, aproximadamente 180 pg/ml, aproximadamente 190 pg/ml, aproximadamente 200 pg/ml, aproximadamente 225 pg/ml, aproximadamente 275 pg/ml, aproximadamente 300 pg/ml, aproximadamente 325 pg/ml, aproximadamente 350 pg/ml, aproximadamente 375 pg/ml, aproximadamente 400 pg/ml, aproximadamente 500 pg/ml, aproximadamente 700 pg/ml, aproximadamente 900 pg/ml, o aproximadamente 1000 pg/ml, del polipéptido anteriormente mencionado.

En una forma de realización la composición de acuerdo con la invención comprende 0,5 pg/ml, 0,7 pg/ml, 1 pg/ml, 2 pg/ml, 5 pg/ml, 6 pg/ml, 10 pg/ml, 15 pg/ml, 18 pg/ml, 20 pg/ml, 25 pg/ml, 30 pg/ml, 30 pg/ml, 35 pg/ml, 40 pg/ml, 45 pg/ml, 50 pg/ml, 55 mg/ml, 60 pg/ml, 70 pg/ml, 80 pg/ml, 90 pg/ml, 100 pg/ml, 110 pg/ml, 120 pg/ml, 130 pg/ml, 140 pg/ml, 150 pg/ml, 160 pg/ml, 170 pg/ml, 180 pg/ml, 190 pg/ml, 200 pg/ml, 225 pg/ml, 275 pg/ml, 300 pg/ml, 325 pg/ml, 350 pg/rnl, 375 pg/ml, 400 pg/ml, 500 pg/ml, 700 pg/ml, 900 pg/ml, o 1000 pg/ml de las moleculas de BiTE.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente 1 ,5 mg/ml, aproximadamente 1 ,8 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 2,3 mg/ml, aproximadamente 2,5 mg/ml, aproximadamente 2,8 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 3,5 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 7 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml aproximadamente 9 mg/ml o aproximadamente 10 mg/ml de las moléculas de BiTE.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 1 mg/ml, 1,3 mg/ml, 1 ,5 mg/ml, 1,8 mg/ml, 2 mg/ml, 2,3 mg/ml, 2,5 mg/ml, 2,8 mg/ml, 3 mg/ml, 3,5 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml 9 mg/ml o 10 mg/ml de las moléculas de BiTE.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 20 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 90 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 120 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 180 pg/ml, de aproximadamente 180 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, de aproximadamente 200 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, de aproximadamente 250 pg/ml a aproximadamente 280 pg/ml, de aproximadamente 280 pg/ml a aproximadamente 300 pg/ml o de aproximadamente 300 pg/ml a aproximadamente 350 pg/ml de las moléculas de BiTE.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende de 0,5 pg/ml a 1 pg/ml, de 1 pg/ml a 5 pg/ml, de 5 pg/ml a 10 pg/ml, de 10 pg/ml a 20 mg/ml, de 20 pg/ml a 50 pg/ml, de 50 pg/ml a 90 pg/ml, de 90 pg/ml a 120 pg/ml, de 120 pg/ml a 150 pg/ml, de 150 pg/ml a 180 pg/ml, de 180 pg/ml a 200 pg/ml, de 200 Mg/ml a 250 Mg/ml, de 250 Mg/ml a 280 Mg/ml, de 280 Mg/ml a 300 Mg/ml o de 300 Mg/ml a 350 Mg/ml de las moleculas de BiTE.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 1 ,3 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 1,8 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 2,3 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 2,8 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 3,0 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o de aproximadamente 350 pg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de las moléculas de BiTE.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende de 350 pg/ml a 1 mg/ml, de 350 pg/ml a 1,3 mg/ml, de 350 pg/ml a 1,5 mg/ml, de 350 pg/ml a 1,8 mg/ml, de 350 pg/ml a 2 mg/ml, de 350 pg/ml a 2,3 mg/ml, de 350 pg/ml a 2,5 mg/ml, de 350 pg/ml a 2,8 mg/ml, de 350 pg/ml a 3,0 mg/ml, de 350 pg/ml a 3,5 mg/ml, de 350 pg/ml a 5 mg/ml o de 350 pg/ml a 10 mg/ml de las moléculas de BiTE.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende de 0,5 pg/ml a 10 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 5 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 3,5 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 3,0 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 2,8 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 2,5 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 2,3 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 2,0 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 1,8 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 1,5 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 1,3 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 1,0 mg/ml, de 0,5 pg/ml a 350 pg/ml, de 0,5 pg/ml a 300 pg/ml, de 0,5 pg/ml a 250 pg/ml de las moléculas de BiTE.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 3,0 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2,8 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 2,3 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 2,0 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 1,8 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 1,3 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 350 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 300 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml de las moleculas de BiTE.

En una forma de realización especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml del polipéptido de acuerdo con la invención.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende una combinación de Tris(hidroximetil)-aminometano (TRIS) y fosfato en calidad de agentes tamponantes, que influyen sobre el valor del pH.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende TRIS en una concentración de aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 20 mM o de aproximadamente 30 mM o de aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 60 mM o de aproximadamente 70 mM o de aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 90 mM o de aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 200 mM o de aproximadamente 250 mM o de aproximadamente 300 mM como también fosfato en una concentración de aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 20 mM o de aproximadamente 30 mM o de aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 60 mM o de aproximadamente 70 mM o de aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 90 mM o de aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende TRIS en una concentración de 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 150 mM o de 200 mM o de 250 mM o de 300 mM así como tambien fosfato en una concentración de aproximadamente 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 150 mM o de 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende fosfato en una concentración de aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 20 mM o de aproximadamente 30 mM o de aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 60 mM o de aproximadamente 70 mM o de aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 90 mM o de aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 110 mM o de aproximadamente 120 mM o de aproximadamente 130 mM o de aproximadamente 140 mM o de aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 160 mM o de aproximadamente 170 mM o de aproximadamente 180 mM o de aproximadamente 190 mM o de aproximadamente 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende fosfato en una concentración de 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 110 mM o de 120 mM o de 130 mM o de 140 mM o de 150 mM o de 160 mM o de 170 mM o de 180 mM o de 190 mM o de 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml del polipéptido de acuerdo con la invención como también TRIS en una concentración de 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 150 mM o de 200 mM o de 250 mM o de 300 mM así como también fosfato en una concentración de aproximadamente 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 150 mM o de 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml del polipéptido de acuerdo con la invención así como también TRIS en una concentración de 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 150 mM o de 200 mM o de 250 mM o de 300 mM así como tambien fosfato en una concentración de aproximadamente 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 150 mM o de 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml del polipéptido de acuerdo con la invención así como también fosfato en una concentración de aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 20 mM o de aproximadamente 30 mM o de aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 60 mM o de aproximadamente 70 mM o de aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 90 mM o de aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 110 mM o de aproximadamente 120 mM o de aproximadamente 130 mM o de aproximadamente 140 mM o de aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 160 mM o de aproximadamente 170 mM o de aproximadamente 180 mM o de aproximadamente 190 mM o de aproximadamente 200 mM.

En una forma de realización preferida de la invención, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml del polipéptido de acuerdo con la invención así como también fosfato en una concentración de 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 110 mM o de 120 mM o de 130 mM o de 140 mM o de 150 mM o de 160 mM o de 170 mM o de 180 mM o de 190 mM o de 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml del polipéptido de acuerdo con la invención así como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM y fosfato en una concentración de aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 20 mM o de aproximadamente 30 mM o de aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 60 mM o de aproximadamente 70 mM o de aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 90 mM o de aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 110 mM o de aproximadamente 120 mM o de aproximadamente 130 mM o de aproximadamente 140 mM o de aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 160 mM o de aproximadamente 170 mM o de aproximadamente 180 mM o de aproximadamente 190 mM o de aproximadamente 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml del polipéptido de acuerdo con la invención como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM y fosfato en una concentración de 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 110 mM o de 120 mM o de 130 mM o de 140 mM o de 150 mM o de 160 mM o de 170 mM o de 180 mM o de 190 mM o de 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml del polipéptido de acuerdo con la invención como también fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM como también TRIS en una concentración de aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 20 mM o de aproximadamente 30 mM o de aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 60 mM o de aproximadamente 70 mM o de aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 90 mM o de aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 200 mM o de aproximadamente 250 mM o de aproximadamente 300 mM como también fosfato en una concentración de aproximadamente 10 mM o de aproximadamente 20 mM o de aproximadamente 30 mM o de aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 60 mM o de aproximadamente 70 mM o de aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 90 mM o de aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 200 mM.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml del polipéptido de acuerdo con la invención como también fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM como también TRIS en una concentración de 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 150 mM o de 200 mM o de 250 mM o de 300 mM como también fosfato en una concentración de aproximadamente 10 mM o de 20 mM o de 30 mM o de 40 mM o de 50 mM o de 60 mM o de 70 mM o de 80 mM o de 90 mM o de 100 mM o de 150 mM o de 200 mM.

En una forma de realización preferida, el valor del pH de la composición de acuerdo con la invención se halla en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, o en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5. De manera especialmente preferida, el valor del pH de la composición de acuerdo con la invención es de 6,0. Es preferible que el valor del pH de la composición de acuerdo con la invención sea regulado mediante HCI.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende adicionalmente una agente humectante. Los ejemplos de agentes humectantes comprenden los agentes humectante no iónicos tales como polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 u 80); polioxámeros (por ejemplo, Poloxamer 188); Tritón; octilglicósido de sodio; lauril-, miristil-, lonoleil-, o estearilsulfobetaina; lauril-, miristil-, lonoleil-, o estearilsarcosina; lineolil-, miristil-, o cetilbetaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, lineoamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropilbetaína; polietilglicol; polipropilglicol; y copolímeros de etileno y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68). En una forma de realización preferida, el agente humectante es Polisorbato 80.

En otra forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende un agente humectante en una concentración del 0,002% al 0,1%, preferentemente del 0,004% al 0,1%.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende Polisorbato e 80 en una concentración del 0,002% al 0,1%, preferentemente del 0,04% al 0,1%. De manera especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende Polisorbato 80 en una concentración del 0,04%.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende adicionalmente un agente lioprotector. En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende adicionalmente un azúcar o un alcohol de azúcar como agente lioprotector. En cuanto al agente lioprotector, se trata preferentemente de trehalosa o de trehalosa dihidratada. En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende el agente lioprotector en una concentración del 2% al 10%, de manera especialmente preferida en una concentración del 4%.

En una forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende trehalosa en una concentración del 2% al 10%, de manera especialmente preferida del 4%.

En una forma de realización especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende trehalosa dihidratada en una concentración del 2% al 10%, de manera especialmente preferida, del 4%.

De manera especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de las moleculas de PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa dihidratada en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

De manera especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de las moléculas de PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración del 0,04% y trehalosa dihidratada en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

De manera especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de las moléculas de PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, Polisorbato 80 en una concentración del 0,04% y trehalosa dihidratada en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

De manera especialmente preferida la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de las moléculas de PSMA-BÍTE1 como tambien TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración del 0,04% y trehalosa dihidratada en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

De manera especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml de las moléculas de PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración del 0,04% y trehalosa dihidratada en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

De manera especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml de las moléculas de PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración del 0,04% y trehalosa dihidratada en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

De manera especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml de las moléculas de PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa dihidratada en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

De manera especialmente preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 2 mg/ml de las moléculas de PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, Na2HP04 en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa dihidratada en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

De manera preferible la composición de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de las moléculas de PSMA-BiTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

Es preferible que la composición de acuerdo con la invención comprenda aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de las moleculas de PSMA-BiTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

Es preferible que la composición de acuerdo con la invención comprenda aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de las moléculas de PSMA-BiTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

Es preferible que la composición de acuerdo con la invención comprenda aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de las moléculas de PSMA-BiTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

Es preferible que la composición de acuerdo con la invención comprenda aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 1 mg/ml de las moléculas de PSMA-BiTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

Es preferible que la composición de acuerdo con la invención comprenda aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml de las moléculas de PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

Es preferible que la composición de acuerdo con la invención comprenda aproximadamente 2 mg/ml de las moleculas de PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, fosfato en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

Es preferible que la composición de acuerdo con la invención comprenda 2 mg/ml de las moléculas PSMA-BÍTE1 como también TRIS en una concentración de aproximadamente 100 mM, Na2HP04 en una concentración de aproximadamente 50 mM, Polisorbato 80 en una concentración de 0,04% y trehalosa en una concentración del 4%, en donde el pH es de 6,0.

Las concentraciones indicadas en porcentaje (%) se refieren a la concentración de masa (masa/volumen).

A título adicional, las composiciones de acuerdo con la invención pueden también contener otros aditivos farmacéuticamente aceptables (Remington’s Pharmaceutical Sciences; 18. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA, Estados Unidos). Tales aditivos comprenden por ejemplo agentes de conservación o agentes antioxidantes. Como agentes antioxidantes pueden emplearse por ejemplo ascorbato, metionina, vitamina E, o metasulfito de sodio. Los agentes de conservación son por ejemplo sustancias que inhiben o ralentizan el desarrollo de microorganismos. Un sustancial de este tipo es por ejemplo el tiomersal.

Una forma de realización de la presente invención es una mezcla de sustancias sólidas, que se prepara mediante liofilización de la composición de acuerdo con la invención, o por lo menos puede prepararse mediante liofilización de esta composición.

Una forma de realización preferida de la presente invención es un liofilizado, que puede prepararse mediante secado por liofilización de una composición de acuerdo con la invención.

Una forma de realización preferida de la presente invención es un liofilizado, preparado mediante liofilización de una composición de acuerdo con la invención de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 16.

En otra forma de realización, se prepara la composición de acuerdo con la invención reconstituyendo la mezcla de sustancias sólidas liofilizada mediante su disolución en un medio líquido adecuado.

En una forma de realización preferida se prepara la composición de acuerdo con la invención reconstituyendo la mezcla de sustancias sólidas liofilizada mediante disolución en agua, preferiblemente agua esteril.

Otro objeto de la invención es un producto que contiene una de las composiciones de acuerdo con la invención y preferiblemente también instrucciones para su utilización. En una forma de realización, el producto comprende un recipiente que contiene una de las composiciones señaladas con anterioridad. Los recipientes utilizables son, por ejemplo, botellas, ampollas, tubitos o jeringas para inyectar. Los recipientes o contenedores pueden ser, por ejemplo, de vidrio o de plástico. Las jeringas para inyectar pueden comprender, por ejemplo, una aguja de inyección, por ejemplo de metal.

En una forma de realización, el recipiente forma parte de un dispositivo para inyectar. En otra forma de realización, la aguja forma parte de un dispositivo para inyectar. En una forma de realización preferida, el dispositivo para inyectar es un dispositivo inyector automático. Un dispositivo inyector automático puede describirse como un aparato para inyecciones que después de su activación administre su contenido sin manipulación adicional por el paciente ni por otra persona. En la presente invención, la administración preferida es por vía subcutánea.

En comparación con las formulaciones disponibles en el estado de la téenica para las moléculas de BiTE, las composiciones de acuerdo con la invención presentan una mayor estabilidad y una biodisponibilidad significativamente superior. Gracias a este perfil de propiedades, las composiciones de acuerdo con la invención son especialmente adecuadas para su administración parenteral. Las administraciones parenterales comprenden, entre otras, la inyección o infusión intravenosa, la inyección o infusión intraarterial (en una arteria), la inyección intramuscular, la inyección intratecal, la inyección subcutánea, la inyección infusión intraperitoneal, la aplicación intraósea o la inyección en un tejido. En especial, las composiciones de acuerdo con la invención son adecuadas para su administración subcutánea. Una forma de realización de la composición de acuerdo con la invención se caracteriza porque despues de la administración subcutánea de la composición la biodisponibilidad del polipéptido es superior al 60%; es preferible que se trate de la biodisponibilidad en un macaco.

Las composiciones de acuerdo con la invención poseen propiedades farmacológicas útiles y pueden ser utilizadas para prevenir y tratar enfermedades en seres humanos y animales.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención son adecuadas en general para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas en los seres humanos y en los mamíferos. Entre las enfermedades hiperproliferativas para cuyo tratamiento pueden emplearse las composiciones de acuerdo con la invención, se encuentra en especial el grupo de las enfermedades cancerosas y tumorales. Entre dichas enfermedades, dentro de los alcances de la presente invención se incluyen las siguientes enfermedades, pero sin limitación: carcinomas y tumores de mama (formas ductales y lobulares, también in situ), tumores de las vías respiratorias (carcinoma de células pequeñas y de células no pequeñas, carcinoma bronquial), tumores cerebrales (por ejemplo, del cerebro y del hipotálamo, astrocitoma, meduloblastoma, ependinoma como también tumores euroectodérmicos y pineales), tumores de los órganos digestivos (esófago, estómago, vesícula, intestino grueso y delgado, recto), tumores hepáticos (entre otros carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma y colangioma hepatocelular mixto), tumores de la región de cabeza y cuello (laringe, hipolaringe, nasofaringe, orofaringe, labios y cavidad bucal), tumores de la piel (carcinoma epitelial de placas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, cáncer de piel de células de Merkel, y cáncer de piel de tipo no melanoma), tumores de las partes blandas(entre otros, sarcoma de las partes blandas, osteosarcoma, histiocitoma fibrosa maligna, linfosarcoma y rhabdomiosarcomna), tumores de los ojos (entre otros, melanoma intraocular y retinoblastoma), tumores de las glándulas endocrinas y exocrinas (por ejemplo, de la glándulas tiroides y paratiroides, páncreas, glándulas salivares), tumores del tracto urinario (tumores de vejiga, pene, riñones, tumores de la pelvis y de uréter), como también tumores de los órganos reproductores (carcinoma de endometrio, cerviz, ovario, vagina, vulva y útero de la mujer como también carcinoma de próstata y de testículos en el hombre). Entre las mismas figuran tambien las enfermedades proliferativa de la sangre en forma sólida y en forma de células sanguíneas circulantes, tales como linfomas, leucemias y enfermedades mieloproliferativas, por ejemplo, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia de las células de los pelos, como también los linfomas asociadas con el sida, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de las células T cutáneas, linfoma de Burkitt y linfomas en el sistema nervioso central.

Las enfermedades preferidas para cuyo tratamiento pueden emplearse las composiciones de acuerdo con la invención son los carcinomas y/o las metástasis que expresan el antígeno PSMA.

Una enfermedad especialmente preferida para cuyo tratamiento pueden emplearse las composiciones de acuerdo con la invención se selecciona del grupo constituido por carcinoma de próstata, metástasis ósea por carcinoma de próstata, y metástasis del tejido blando por carcinoma de próstata.

Otra enfermedad especialmente preferida, para cuyo tratamiento pueden emplearse las composiciones de acuerdo con la invención, es el carcinoma de próstata.

Estas enfermedades, bien descritas en el ser humano, también pueden presentarse con una etiología comparable en otros mamíferos, y pueden ser tratadas en ellos con las composiciones de la presente invención.

Dentro del contexto de la invención, los términos “tratamiento” o “tratar” se utilizan de manera convencional y se refieren al cuidado atención, seguimiento y cuidado de un paciente con el objeto de combatir, reducir, debilitar una enfermedad o una desviación del estado de salud o de producir una mejoría en dicha enfermedad o desviación, y para mejorar las condiciones de vida que han sido afectadas por esta enfermedad como, por ejemplo, en el caso de un cáncer.

Por lo tanto, otro objeto de la presente invención es el uso de las composiciones de acuerdo con la invención para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, en especial de las enfermedades anteriormente mencionadas.

Otro objeto de la presente invención es el uso de las composiciones de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y/o prevención de enfermedades, en especial de las enfermedades mencionadas con anterioridad.

Otro objeto de la presente invención es el uso de las composiciones de acuerdo con la invención en un procedimiento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades, en especial de las enfermedades mencionadas con anterioridad.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades, en especial de las enfermedades anteriormente mencionadas, mediante el uso de una cantidad efectiva de una de las composiciones de acuerdo con la invención.

En una forma de realización preferida, el tratamiento y/o prevención consiste en una administración parenteral de la composición de acuerdo con la invención. Se prefiere especialmente la administración subcutánea.

Las composiciones de acuerdo con la invención pueden emplearse solas, o en caso de necesidad, con una o varias otras sustancias farmacológicamente efectivas, siempre y cuando esta combinación no conduzca a efectos secundarios indeseables e inaceptables. Por ello, otro objeto de la presente invención son medicamentos que contienen por lo menos una de las composiciones de acuerdo con la invención y una o más sustancias activas adicionales, en especial para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades anteriormente mencionados. A título de ejemplo, los compuestos de la presente invención pueden ser combinados con agentes antihiperproliferativos, citostáticos o citotóxicos para el tratamiento de enfermedades de cáncer.

Otro objeto de la invención es el uso de las composiciones anteriormente mencionadas en un procedimiento terapeutico, en donde la composición es adecuada para formas de administración parenteral, tales como la inyección o infusión intravenosa, inyección o infusión intraarterial (en una arteria), inyección intramuscular, inyección intratecal, inyección subcutánea, inyección o infusión intraperitoneal, administración intraósea o inyección en un tejido.

Otro objeto de la invención es el uso de las composiciones anteriormente mencionadas en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de enfermedades proliferativas de las células de la próstata.

Otro objeto de la invención es el uso de las composiciones anteriormente mencionadas en un procedimiento para el tratamiento terapeutico de enfermedades debidas a la proliferación de células de próstata, siendo la composición adecuada para su administración subcutánea.

Otro objeto de la invención es uso de las composiciones anteriormente mencionadas en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de enfermedades debidas a la proliferación de células de la próstata, en donde la composición se administra mediante administración subcutánea.

Otro objeto de la invención es un método para estabilizar polipéptidos, que comprende la preparación de una de las composiciones anteriormente mencionadas que además del péptido contiene por lo menos TRIS y fosfato, y cuyo pH tiene un valor de 6,0.

Otro objeto de la invención es un kit que comprende las composiciones anteriormente mencionadas.

En el sentido de la presente invención, los compuestos preferidos son compuestos farmacéuticos.

Formas de realización Una forma de realización de la presente invención comprende una composición farmacéutica líquida que comprende un polipéptido, TRIS y fosfato, en donde el polipéptido comprende dos dominios de unión de anticuerpos scFv, en donde el primer dominio de unión scFv puede ligarse al CD3 épsilon humano.

En otra forma de realización de la composición, el segundo dominio de unión del polipéptido puede unirse a un antígeno de la superficie celular.

En otra forma de realización de la invención, el polipéptido comprende un segundo dominio de unión que puede unirse a un antígeno de superficie de una célula cancerosa.

En otra forma de realización el antígeno de superficie al que puede unirse el segundo dominio de unión del polipéptido es el PSMA (Prostata-Spezifische Membran-Antigen, antígeno de membrana específico de próstata).

En otra forma de realización de la invención, el polipéptido tiene la disposición (VH-VL) dominio de unión 2-(VH-VL) dominio de unión 1.

En otra forma de realización de la composición, el primer dominio de unión del polipeptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 5.

En otra forma de realización de la composición, el segundo dominio de unión del polipéptido que se une a PSMA comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 6.

En otra forma de realización, la composición contiene un polipéptido, TRIS y fosfato, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 7.

En otra forma de realización, la composición contiene un polipéptido, TRIS y fosfato, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 8.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 mg/ml a 5 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 3,5 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 3,0 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 2,5 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 2,0 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 1,8 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 1 ,5 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 0,35 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 0,3 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 0,25 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipeptido en una concentración de 0,5 mg/ml a 0,2 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición comprende el PSMA-BÍTE1 en una concentración de 50 pg/ml a 1 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición comprende el PSMA-BÍTE1 en una concentración de 50 pg/ml a 500 pg/ml.

En otra forma de realización, la composición comprende el PSMA-BÍTE1 en una concentración de 100 pg/ml a 500 pg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene el polipéptido en una concentración de aproximadamente 2 mg/ml.

En otra forma de realización, la composición contiene TRIS en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM como también fosfato en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM.

En otra forma de realización, la composición contiene TRIS 100 mM y fosfato 50 mM.

En otra forma de realización, el valor del pH de la composición se halla en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0.

En otra forma de realización, el valor del pH de la composición se halla en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5.

En otra forma de realización, el valor del pH de la composición se halla en un intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5.

En otra forma de realización, el valor del pH de la composición desde aproximadamente 6,0.

En otra forma de realización, el valor del pH de la composición se ajusta con ácido clorhídrico.

En otra forma de realización, la composición contiene adicionalmente un agente humectante.

En otra forma de realización, el agente humectante es Polisorbato 80.

En otra forma de realización, la composición contiene adicionalmente del 0,002% al 0,1% de Polisorbato 80.

En otra forma de realización, la composición contiene adicionalmente del 0,04% al 0,1% de Polisorbato 80.

En otra forma de realización, la composición contiene adicionalmente el 0,04% de Polisorbato 80.

En otra forma de realización, la composición contiene adicionalmente un agente lioprotector.

En otra forma de realización, la composición contiene como agente lioprotector trehalosa o preferentemente trehalosa dihidratada.

En otra forma de realización, la composición contiene adicionalmente del 4% al 10% de trehalosa o preferentemente del 4% al 10% de trehalosa dihidratada.

En otra forma de realización, la composición contiene de manera adicional aproximadamente el 4% de trehalosa o preferentemente de manera adicional el 4% de trehalosa dihidratada.

En una forma de realización preferida, el pH de la composición tiene un valor de 6 y comprende de 50 mg/ml a 1 mg/ml de PSMA-BÍTE1 , 100 mM de TRIS, 50 mM de fosfato, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa dihidratada.

En una forma de realización preferida, la composición tiene un pH con un valor de 6 y comprende de 50 pg/ml a 500 pg/ml de PSMA-BÍTE1 , 100 mM de TRIS, 50 mM de fosfato, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa dihidratada.

En una forma de realización preferida, la composición tiene un pH con un valor de 6 y comprende de 50 pg/ml a 500 pg/ml de PSMA-BÍTE1 , 100 mM de TRIS, 50 mM de Na2HPC>4, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa dihidratada.

En otra forma de realización, la composición tiene un precio con un valor de 6 y comprende de 50 pg/ml a 1 mg/ml de PSMA-BÍTE1, 100 mM de TRIS, 50 mM de fosfato, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa.

En otra forma de realización, la composición tiene un pH con un valor de 6 y comprende 50 pg/ml a 500 pg/ml de PSMA-BÍTE1 , 100 mM de TRIS, 50 mM de fosfato, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa.

En otra forma de realización, la composición tiene un pH con un valor de 6 y comprende de 50 pg/ml a 500 pg/ml DE PSMA-BÍTE1, 100 mM de TRIS, 50 mM de Na2HP04, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa.

En una forma de realización preferida de la composición, el polipéptido, después de liofilización y subsiguiente reconstitución y almacenamiento (durante 7 días a 2-8 °C y seguidamente durante 16 horas a una temperatura de 20 °C-+5 °C, como se describe en el Ejemplo 21), tiene una bioactividad de por lo menos el 90%, preferentemente de por lo menos el 96% (preferentemente determinada mediante ensayos de actividad basados en células como se describe en el Ejemplo 21).

En una forma de realización preferida de la composición, el polipéptido, después de liofilización y almacenamiento durante tres meses o 12 meses tiene una bioactividad de por lo menos el 90%, preferentemente de por lo menos en 96% (preferentemente determinada mediante ensayos de actividad basados en células como se describe en el Ejemplo 21 ).

En una forma de realización preferida de la composición, el polipéptido, después de liofilización y almacenamiento durante tres meses a una temperatura de 6 °C o durante 12 meses a una temperatura de 6 °C, presenta una bioactividad de por lo menos el 97% (preferentemente determinada mediante ensayos de actividad basados en células como se describe en el Ejemplo 21).

En una forma de realización preferida de la composición, el polipéptido, después de haber experimentado estrés por cizallamiento por inyección, presenta un contenido de monómeros superior al 96% (SEC), (preferentemente determinado de acuerdo con el Ejemplo 18a).

En una forma de realización preferida de la composición, el polipéptido, después de haber experimentado un estrés por cizallamiento por inyección lenta o rápida mediante una jeringa presenta un contenido no mayor del 4% de dímeros y multímeros (SEC), (preferentemente determinado de acuerdo con el Ejemplo 18a).

En una forma de realización preferida de la composición, el polipéptido, después de haber experimentado estrés por cizallamiento por inyección lenta o rápida mediante una aguja (calibre: 30 G, longitud de la aguja: 13 mm), tiene un contenido de dímeros y multímeros no superior al 4% (SEC), (preferentemente determinado de acuerdo con el Ejemplo 18a).

Una forma de realización de la presente tensión comprende una mezcla de sustancias sólidas, preparables mediante liofilización de la composición líquida.

En otra forma de realización, se reconstituye la composición disolviendo la mezcla de sustancias sólidas de acuerdo con la invención, liofilizada, en un medio líquido adecuado.

En otra forma de realización la biodisponibilidad el polipeptido después de la administración subcutánea de la composición, es de más del 60%.

En otra forma de realización, la composición se usa en un procedimiento terapéutico.

En otra forma de realización la composición se usa en un procedimiento terapéutico, comprendiendo dicho procedimiento la administración parenteral de la composición.

En otra forma de realización, la composición se usa en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de enfermedades hiperproliferativas.

En otra forma de realización, la composición es usa en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de enfermedades hiperproliferativas de la próstata.

En otra forma de realización, la composición se usa en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de enfermedades hiperproliferativas de la próstata, que comprende la administración subcutánea de la composición.

En otra forma de realización la presente invención comprende un procedimiento para estabilizar polipéptidos que comprende la preparación de una composición que además de los polipéptidos contiene por lo menos TRIS y fosfato y en donde la composición tiene un pH de 6.

En otra forma de realización, la presente invención comprende un kit que comprende la composición descrita con anterioridad.

Son formas de realización preferidas: 1. Una composición farmacéutica líquida que comprende un polipéptido, TRIS y fosfato, en donde el polipéptido comprende dos dominios de unión de anticuerpos scFv, en donde el primer dominio de unión scFv puede unirse al CD3 épsilon humano. 2. Una composición de acuerdo con la forma de realización 1, caracterizada porque el segundo dominio de unión del polipéptido puede ligarse a un antígeno de la superficie celular.

. Una composición de acuerdo con la forma de realización 2, caracterizada porque el polipeptido comprende un segundo dominio de unión, que puede unirse a un antígeno de la superficie de una célula de cáncer.

. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización 2 ó 3, caracterizado porque el antígeno de superficie es el PSMA.

. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización anteriores, caracterizada porque el polipéptido tiene la disposición (VH-VL)dominio de unión 2- (VH-VL)dominio de unión 1.

. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque el primer dominio de unión del polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 5.

. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque el segundo dominio de unión del polipéptido que se liga a PSMA, comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 6.

. Una composición farmacéutica líquida, que comprende un polipéptido, TRIS y fosfato, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 7. 9. Una composición farmacéutica líquida, que comprende un polipéptido, TRIS y fosfato, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 8. 10. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 mg/ml a 5 mg/ml. 11. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 3,5 mg/ml. 12. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 3 mg/ml. 13. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipeptido en una concentración de 0,5 mg/ml a 2,5 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 2 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 1 ,8 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 1 ,5 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 0,35 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 0,3 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 0,25 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 0,5 pg/ml a 0,2 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición comprende PSMA-BÍTE1 en una concentración de 50 pg/ml a 1 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición comprende PSMA-BÍTE1 en una concentración de 50 pg/ml a 500 pg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición comprende PSMA-BÍTE1 en una concentración de 100 mg/ml a 500 pg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de aproximadamente 2 mg/ml.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene TRIS en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM como también fosfato en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene 100 mM de TRIS y 50 mM de fosfato.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque el valor del pH de la composición se halla en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque el valor del pH de la composición en un intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque el valor del pH de la composición se halla en un intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque el valor del pH de la composición es de aproximadamente 6,0.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque el pH de la composición se ajusta con ácido clorhídrico. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene adicionalmente un agente humectante.

Una composición de acuerdo con la forma de realización 32, caracterizada porque el agente humectante es Polisorbato 80. 34. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene adicionalmente de 0,002% a 0,1% de Polisorbato 80. 35. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene adicionalmente de 0,04% a 0,1% de Polisorbato 80. 36. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene adicionalmente 0,04% de Polisorbato 80. 37. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene adicionalmente un agente lioprotector. Es preferible que la composición contenga de 2 a 10% de un agente lioprotector, de manera especialmente preferida 4%. 38. Una composición de acuerdo con la forma de realización 37, caracterizada porque el agente lioprotector es trehalosa. Es preferible que el agente lioprotector sea trehalosa dihidratada. 39. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición contiene adicionalmente de 4 a 10% de adicionalmente 4% de trehalosa dihidratada. 40. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición además contiene aproximadamente 4% de trehalosa dihidratada. 41. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición tiene un pH con un 6 y comprende de 50 mg/ml a 1 mg/ml de PSMA-BÍTE1 , 100 mM de TRIS, 50 mM de fosfato, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa dihidratada. 42. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición tiene un pH de 6 y comprende de 50 pg/ml a 500 pg/ml de PSMA-BÍTE1, 100 mM de TRIS, 50 mM de fosfato, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa dihidratada. 43. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque la composición tiene un pH con un valor de 6 y comprende 2 mg/ml de PSMA-BÍTE1 , 100 mM de TRIS, 50 mM de Na2HP04, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa dihidratada.

Una mezcla de sustancias sólidas preparable por liofilización de una composición líquida de acuerdo con una de las formas de realización precedentes.

Una composición farmaceutica líquida, caracterizada porque la composición se reconstituye mediante disolución de una mezcla de sustancias sólidas liofilizada de acuerdo con la forma de realización 44 en un medio líquido adecuado.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, en donde después de liofilización y subsiguiente reconstitución y almacenamiento (7 días a una temperatura de 2-8 °C y a continuación 16 horas a 20 °C+- 5 °C; como se describe en el Ejemplo 21), el polipéptido presenta una bioactividad de por lo menos el 90% (preferiblemente determinada mediante ensayo de actividad a base de células como se describe en el Ejemplo 21).

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, en donde después de liofilización y almacenamiento de tres meses o de doce meses el polipéptido presenta una bioactividad de por lo menos 90%, preferentemente de por lo menos 96% (preferiblemente determinada mediante ensayo de actividad a base de células como se describe en el Ejemplo 21).

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, en donde después de liofilización y almacenamiento durante tres meses a una temperatura de 6 °C o 12 meses a una temperatura de 6 °C el polipéptido presenta una bioactividad de por lo menos 97% (preferiblemente determinada mediante ensayo de actividad a base de células como se describe en el Ejemplo 21).

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, en donde después de experimentar un estrés por cizallamiento por inyección, el polipéptido presenta un contenido de monómeros superior al 96% (SEC) (preferiblemente determinado de acuerdo con el Ejemplo 18a).

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, en donde despues de experimentar un estrés por cizallamiento por inyección lenta o rápida mediante una jeringa, el polipéptido presenta un contenido de dímeros y multímeros no superiores al 4% (SEC), (preferiblemente determinado de acuerdo con el Ejemplo 18a).

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, en donde después de experimentar un estrés por cizallamiento por inyección lenta o rápida mediante una aguja (calibre: 30 G, longitud de la aguja: 13 mm) presenta un contenido de dímeros y multímeros no superior al 4% (SEC), (preferiblemente determinado de acuerdo con el Ejemplo 18a).

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, caracterizada porque después de administración subcutánea de la composición, la biodisponibilidad del polipéptido es de más del 60%.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes para su uso en un procedimiento terapéutico.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes para su uso en un procedimiento terapéutico, en donde este procedimiento comprende la aplicación parenteral de la composición.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes para su uso en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de enfermedades hiperproliferativas.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes para su uso en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de enfermedades hiperproliferativas de la próstata.

Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes para su uso en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de enfermedades hiperproliferativas de la próstata, en donde el procedimiento comprende la aplicación subcutánea de la composición.

Un método para la estabilización de polipéptidos de acuerdo con por lo menos una de las formas de realización 1 a 9, que comprende la preparación de una composición que además de los polipéptidos contiene por lo menos TRIS y fosfato y cuya composición tiene un pH de 6. 59. Un kit, que comprende la composición de acuerdo con una de las formas de realización 1-57. 60. Una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes, siendo la composición farmaceutica líquida una composición farmacéutica acuosa, preferentemente una composición farmacéutica acuosa estéril. 61. Jeringa, que contiene una composición de acuerdo con una de las formas de realización precedentes.

Eiemplos Ejemplo 1: Selección sistemática de tampón para mejorar la termoestabilidad de las moléculas de PSMA-BÍTE1 Con ayuda de DSF (Differential-Scanning-Fluorimetry) se midió el punto de fusión medio (Tmi) del dominio de proteínas PSMA-BÍTE1 con el peso molecular más bajo en diferentes sistemas tamponantes. Se trata de una medida de la estabilidad de la proteína investigada en los diversos sistemas tamponantes. Cuanto más elevado sea el valor Tm, tanto mayor será también la termoestabilidad de la proteína. Cuanto más termoestable sea una proteína, tanto más adecuada será para la preparación de formulaciones farmacéuticas estables.

Para la selección sistemática de tampones, se emplearon tampones estándar con un pH en el intervalo de 5,0 a 8,0. La concentración de PSMA-BiTEI en las formulaciones preparadas era de aproximadamente 0,2 mg/ml. El punto de fusión medio se determinó mediante el método DSF.

Tabla 1: PSMA-BiTEI (0,2 mg/ml) en diversos sistemas tamponantes (50 mM) Los sistemas de tampones a base de citrato y Na2HP04 mostraron un efecto positivo en cuanto a la elevación del punto de fusión de los dominios de proteínas PSMA-BiTEI. Los efectos positivos de citrato y de Na2HP04 fueron objeto de seguimiento en estudios posteriores.

Los tampones basados en tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) de por sí solos no condujeron a una elevación manifiesta del punto de fusión de la proteína (Tabla 2). Tabla 2: PSMA-BÍTE1 (0,2 mg/ mi) en diferentes sistemas tamponantes (50 mM) (continuación de la Tabla D Lo mismo que la Tabla 1 , en la Tabla 2 se muestra también el punto de fusión medio (Tm) obtenido mediante fluorimetría de escaneo diferencial, de los dominios de proteína PSMA-BÍTE1 con el peso molecular más bajo en diferentes sistemas tamponantes. Los valores de Tm estaban entre 57,7 °C y 64,6 °C. Por medio de la combinación de diferentes sistemas tamponantes no pudieron lograrse valores superiores para Tm.

Las formulaciones de PSMA-BÍTE1 en tampón fosfato con pH = 5, 5-6, 5 y en tampón citrato con pH = 5,0 - 6,5, mostraron los puntos de fusión más elevados (Tm > 63,0 °C según el método DSF).

Ejemplo 2: La influencia de los tensioactivos no iónicos sobre la formación de agregados de PSAMA— B?TE1 Las moléculas de PSMA-BÍTE1 se formaron después del ensayo de estrés por agitación en todos los agregados de sistemas de tampón ensayados. La eficiencia con la cual las moléculas de PSMA-BÍTE1 implementan una activación de las células T no puede preverse ni controlarse, como no sea de una manera limitada. Por ello era absolutamente necesario un estabilizador que impidiera la formación de agregados por estrés por agitación o por la acción de las fuerzas de cizallamiento. En el ensayo de estrés por agitación se comprobó que diversos tensioactivos no iónicos (por ejemplo el Polisorbato 80 ó 20) estabilizan las moléculas de PSMA-BÍTE1 y pueden impedir una agregación. Las concentraciones de tensioactivos entre el 0,01 y el 0,04% (m/V) fueron suficientes para la estabilización (veanse las Tablas 3 a 7).

Ejemplo 3: Formación del dímero PSMA-BiTE en presencia de cationes multivalentes.

Un aumento de la proporción de agregados PSMA-BÍTE1 durante la reconcentración de las formulaciones de PSMA-BiTE 1 no pudo evitarse mediante la adición de tensioactivos no iónicos.

Por ello, se investigó la estabilización electrostática de las moléculas de PSMA-BÍTE1 en presencia de cationes multivalentes (por ejemplo, Mg2+ y Ca2+). Los iones multivalentes tienen una influencia directa sobre el potencial superficial de las proteínas disueltas, por lo que pueden tener un efecto estabilizante o incluso desestabilizante.

Las moléculas pudieron estabilizarse con ayuda de cloruro de magnesio. La proporción de dímeros PSMA-BÍTE1 aumentó sólo de forma despreciable después de la reconcentración y permaneció por debajo de 3% (Tabla 3). La medición de la proporción de monómeros y dímeros tuvo lugar mediante SEC (Size Exclusión Chromatography, Cromatografía por Exclusión de Tamaño).

Tabla. 3: Moléculas de PSMA-BÍTE1 después de reconcentración (en 50 mM de Na2HP04 y 50 mM de Usina, pH 7,3) SEC = cromatografía por exclusión de tamaño Sin embargo, la adición de sales inorgánicas en elevadas concentraciones es objetable desde el punto de vista farmacéutico, o bien estas adiciones representan una complicación para la liofilización. Por esas razones se buscan excipientes alternativos que estabilicen las moléculas de PSMA-BÍTE1 y que al mismo tiempo sean farmacéuticamente seguras.

Ejemplo 4: Identificación de sustancias adyuvantes alternativas para estabilizar los monómeros PSMA-BiTEI De una manera más bien casual, se incluyeron entre otros diversos aminoácidos y sus derivados en los ensayos para estabilizar los monómeros PSA-BÍTE1 en elevadas concentraciones. Los aminoácidos y sus derivados no son sales inorgánicas, por lo que se los clasifica como seguros desde el punto de vista farmaceutico. Algunas de estas sustancias (por ejemplo, la lisina) muestran de manera sorprendente una influencia positiva sobre las moléculas de PSMA-BiTEI durante y después de la concentración (Tabla 4).

Tabla 4: Molécula de PSMA-BiTEI después de la concentración a pH 7,3 SEC = Cromatografía por exclusión de tamaño; DLS = dispersión dinámica de la luz; una solución turbia después del estrés por agitación muestra una elevada proporción de agregados de BiTE; una solución clara o poco turbia (estado “OK”) indica un reducido grado de agregación.

Mediante la adición de lisina e histidina en un tampón fosfato fue posible reconcentrar las moléculas PSAM-BÍTE1 , sin que se formen proporciones inaceptables de dímeros (iguales o superiores a 5%). Sin embargo, las formulaciones para las que la proporción de dímeros era reducida (< 5%), se desestabilizaron durante el ensayo de estres por agitación, lo que puede reconocerse entre otros por el enturbiamiento de la solución (volúmenes de ensayo 1 y 2, “turbio” muestra agregación; “ok” indica agregación nula o reducida).

Ejemplo 5: Influencia del pH sobre la estabilidad de las moléculas de PSMA-BiTEi A efectos de investigar la influencia del pH sobre la formación de los dímeros, se preparó una formulación con pH = 6,0. Ella mostró una proporción de dímeros que era comparable con la de las formulaciones con pH = 7,3. Además, la parte dímera era también estable en cuanto al estrés por agitación, lo que pudo comprobarse por lectura ante la ausencia de enturbiamiento (Tabla 5). La influencia positiva del pH = 6,0 se utilizó para la búsqueda ulterior de agentes estabilizantes y formulaciones adecuados.

Tabla. 5: Moléculas de PSMA- BiTE1 después de la concentración a pH 6,0 SEC = cromatografía por exclusión de tamaño; DLS dinámica de la luz.

Fue asombrosa la estabilidad del PSMA-BiTEi en tampón fosfato a pH = 6,0.

Las moléculas pudieron reconcentrarse en una formulación que abarcaba 50 mM de Na 2HPO4, 50 mM de lisina, 0,04% de Polisorbato 20 y 10% de trehalosa dihidratada con un pH = 6,0, repentinamente a 1 ,6 mg/ml, sin agregarse debido a la influencia del estrés por agitación.

Ejemplo 6: Investigación de combinaciones de tampones En otro ensayo se investigó un posible efecto sinérgico referido a una elevación de la estabilidad de las moléculas de PSMA-BiTEi mediante aditivos tales como arginina, TEA o TRIS en combinación con fosfato. La participación más baja de dímeros PSMA-BÍTE1 de 0,8% se presentó para la combinación de tampones 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS con pH = 6,0. La formulación tambien era estable suficientemente estable después del estrés por agitación, lo que cabía reconocer por la ausencia de enturbiamiento de la solución (Tabla 6). Fue sorprendente el efecto estabilizante de TRIS, ya que la adición de arginina o TEA, ambos conocidos en cuanto a su acción estabilizante (es decir, por su efecto reductor de las agregaciones) en las proteínas, en el caso de las moléculas de PSMA-BiTE no tenía ningún efecto estabilizante.

Tabla 6: Moléculas de PSMA- BÍTE1 después de la concentración con diversos aditivos a pH 6,0 SEC = cromatografía por exclusión de tamaño; DLS = dispersión dinámica de la luz.

Como se muestra en el Ejemplo 1 , la utilización de tampón citrato condujo a una elevación de la termoestabilidad de las moleculas. Sin embargo, después de la reconcentración de los preparado la parte de los dímeros se halla todavía en un nivel superior al de los preparados con tampón fosfato (comparar Tabla 7 con Tabla 6). Por lo tanto, el tampón fosfato es más adecuado que el tampón citrato para minimizar la formación de dímeros durante la reconcentración. Además, en una formulación el citrato puede conducir a la deslaminación del vidrio y ya no debería ser empleado.

Tabla 7: Moléculas de PSMA-b/TE? después de la concentración a pH b,0 SEC = cromatografía por exclusión de tamaño; DLS = dispersión dinámica de la luz.

Ejemplo 7: Termoestabilidad de las moléculas de PSMA-BÍTE1 en los sistemas de tampón TRIS-fosfato Se determinó el punto de fusión medio (Tmi) del dominio de proteínas PSMA-BiTE1-Proteína con el menor peso molecular de la siguiente formulación: 0,2 mg/ml PSMA BiTE en 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS, 0,04% de Polísorbato 80, 4% de trehalosa dihidratada, pH 6,0 (ajustado con HCI). Mediante DSC se midió un Tmi de 61 ,1 °C.

Ejemplo 8: Influencia del estrés por agitación sobre las moléculas de PSMA- BÍTE1 en formulaciones de fosfato/TRIS En términos generales las moléculas de BiTE se desestabilizan físicamente por el estrés por agitación, es decir forman agregados que pueden detectarse por medio de dispersión dinámica de la luz (DSL). La formación de los agregados tiene lugar ya bajo concentraciones reducidas de BiTE de aproximadamente 0,2 mg/ml. En cambio, para un contenido de proteínas inferior a 0,2 mg/mililitro, las moléculas de BiTE se adsorben en mayor grado en la pared de los vasos sanguíneos.

Mediante la adición de un tensioactivo (por ejemplo, Polisorbato 20 u 80), fue posible impedir la adsorción de las moléculas de PSMA-BÍTE1 a las paredes de los vasos sanguíneos (por ejemplo, causada por jeringas de inyección, bolsas de infusión, etc.) en algunos sistemas tamponantes (por ejemplo, en tampones basados en fosfato y lisina), como también la formación de agregados en estado de reposo. El Polisorbato 80 debe encontrarse presente en la composición en una concentración de por lo menos el 0,002%, a efectos de impedir la absorción de las moléculas de PSMA-BÍTE1.

Mediante la disolución de las moléculas de PSMA-BiTE en un tampón fosfato con adición de tensioactivo a pH 6,0, fue posible impedir la formación de agregados tanto en estado de reposo como también durante el efecto del estrés por agitación. En cuanto a la minimización de la formación de los agregados, la formulación mencionada (tampón fosfato con adición de tensioactivos a pH 6,0) era superior a las formulaciones con lisina.

Tabla. 8: Formación de agregados de PSMA-BÍTE1 después de estrés por agitación; todas las muestras contienen 0,2 mg/ mi de moléculas de PSMA-BÍTE1 y 0,02% (m/V) de Polisorbato 80 Na2HP04-TRIS** b,0 99,0 ‘Agregados ** Monómeros 99,6%; Dímeros 0,4% Ejemplo 9: La concentración como función de la agregación de PSMA-BÍTE1 En los sistemas tamponantes estándar, la proporción de dímeros y multímeros aumentó junto con la concentración de moleculas de PSMA-BÍTE1. Sin embargo, en las formulaciones destinadas a la utilización terapéutica, los dímeros y multímeros sólo son aceptables en una medida reducida por cuanto influyen sobre el grado de efectividad de la formulación y de la proteína terapéutica, y pueden provocar efectos inmunológicos indeseados. Típicamente se limitan los dímeros a un valor máximo del 5% y se procura no superar este valor. También deben minimizarse los multímeros y los fragmentos de elevado peso molecular (LMW) o bien ni siquiera debería haber vestigios de ellos. También se mide la relación entre monómero y dímeros, así como también la proporción de multímeros y fragmentos de bajo peso molecular mediante cromatografía por exclusión de tamaño (SEC).

Con el sistema tampón que comprende 50 mM de Na 2HPO4 y 100 mM de TRIS a pH 6,0 pudo reducirse en un grafo suficiente la formación de dímeros y multímeros entre las moléculas de PSMA-BÍTE1 durante la reconcentración.

Con ayuda de este sistema tampón fue posible preparar una formulación de BiTE estable con un contenido de >2 mg/ml (Tabla 9).

Tabla 9: Moléculas de PS/WA-BÍTE1 en 50 mM de Na2HPC>4 y 100 mM de TRIS a pH 6,0 LMW = Fragmentos de baio peso molecular Eiemplo 10: Influencia de trehalosa y Polisorbato sobre la estabilidad de PSMA-BÍTE1 La adición de trehalosa y polisorbato no conduce a una mayor formación de dímeros, multímeros o fragmentos de bajo peso molecular, lo que se comprueba mediante medición por SEC.

Ejemplo 10a: Influencia de trehalosa y Polisorbato sobre la estabilidad de PSMA-BiTE1 La adición de trehalosa dihidratada y polisorbato no condujo a una mayor formación de dímeros, multímeros o fragmentos de bajo peso molecular (Tabla 10).

Tabla 10: Moleculas de PSMA-BÍTE1 en 50 mM de Na2HP04 y 100 mM de TRIS a pH 6,0 con/sin trehalosa y polisorbato 80 Ejemplo 11: estabilidad de las moléculas de PSMA-BÍTE1 en condiciones de almacenamiento La estabilidad de las moléculas de PSMA-BÍTE1 en condiciones de almacenamiento puede determinarse en base al incremento de la proporción de dímeros y/o multímeros en función del tiempo de almacenamiento. Cuanto más rápidamente ascienda la proporción de estos agregados, tanto menor será la estabilidad en condiciones de almacenamiento.

Por vía experimental pudo determinarse que las moléculas de PSMA-BÍTE1 con una concentración de 90 mg/ml, 500 pg/ml y 2 mg/ml son estables a lo largo de un intervalo de tiempo de 9 días contra la formación de multímeros y dímeros. Las formulaciones se conservan en jeringas de inyecciones a una temperatura de aproximadamente 2-8 °C, despues de una fase inicial de 4 a 16 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). Las composiciones contienen además de PSMA-BiTE1, 50 mM de Na 2HPO4, 100 mM de TRIS, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa. La proporción de monómeros PSMA-BÍTE1 fue medida mediante SEC-HPLC y se comparó con la proporción de monómero PSMA-BÍTE1 al inicio de los ensayos (es decir, en el día 0).

Ejemplo 11a: Estabilidad de las moléculas de PS A-BÍTE1 en condiciones de almacenamiento La estabilidad de las moléculas de PSMA-BÍTE1 en condiciones de almacenamiento puede determinarse en base al incremento de la proporción de dímeros y/o multímeros en función del tiempo de almacenamiento. Cuanto más rápidamente ascienda la proporción de estos agregados, tanto menor será la estabilidad en condiciones de almacenamiento.

Por vía experimental pudo determinarse que las moléculas de PSMA-BÍTE1 con una concentración de 90 mg/ml, 500 pg/ml y 2 mg/ml son estables a lo largo de un intervalo de tiempo de 9 días contra la formación de multímeros y dímeros (Tabla 11). Las formulaciones se conservaron en jeringas de inyecciones a una temperatura de aproximadamente 2-8 °C, después de una fase inicial de 4 a 16 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). Las composiciones contenían además de PSMA-BiTE1, 50 mM de Na2HPC>4, 100 mM de TRIS, 0,04% de Polisorbato 80 y 4% de trehalosa dihidratada. La proporción de monómeros PSMA-BÍTE1 fue medida mediante SEC-HPLC y comparada con la proporción de monómero PSMA-BÍTE1 al inicio de las investigaciones (es decir, al día 0). Esta pureza relativa, después de 9 días para composiciones con una concentración de partida de PSMA-BÍTE1 de 90 pg/ml y 500 pg/ml era del 100%, es decir, la proporción de los monómeros no había bajado a lo largo de este tiempo. La pureza relativa para las composiciones con 2 mg/ml de moléculas de PSMA-BÍTE1 después de 9 días era de 97%, lo que corresponde a una reducción de monómeros en aproximadamente 3% absoluto (de 97,58% en el día 0 a 94,81% en el día 9).

Tabla. 11: Determinación de la pureza (es decir, de la proporción de monómeros) de las moleculas de PSMA-BiTE mediante SEC-HPLC a lo largo de un intervalo de tiempo de 9 días En otros estudios, en la formulación líquida con una concentración de PSMA-BiTE1 de 2 mg/ml a 2-8 °C se observó en el transcurso de una semana un moderado incremento de la proporción de dímero en 2,5% (de 3% a 5,5%), junto con una proporción estable simultánea de multímeros (Tabla 12). Por lo tanto, con esta concentración las moléculas de PSMA-BÍTE1 son estables durante un tiempo suficiente de manera de asegurar un llenado aproximadamente libre de perdidas y un uso virtualmente sin pérdidas.

Sin embargo, para un almacenamiento a largo plazo (es decir, el almacenamiento durante un intervalo de tiempo considerablemente superior a una semana) es posible congelar las soluciones de PSMA-BÍTE1 para asegurar su estabilidad (-80 °C) o liofilizarlas. Una liofilización de las formulaciones que contienen PSMA-BITE1 con conservación de la biodisponibilidad era posible, como se muestra en el Ejemplo 17.

Tabla 12: Estabilidad de la formulación BiTE en condiciones de almacenamiento a 2-8 °C (Concentración de PSMA-BÍTE1: 2 mg/ml) Eiemplo 12: Influencia del valor del pH sobre la estabilidad de PSMA-BÍTE1 Fundamentalmente, las moléculas de PSMA-BÍTE1 en la formulación elegida TRIS, fosfato (aquí: Na2HP04), trehalosa y polisorbato son estables en un intervalo de pH de 5,0 a 7,5. Sin embargo, para un valor de pH superior a 6, aumenta la proporción de dímero después del estrés por cizallamiento.

Ejemplo 12a: Influencia del valor del pH sobre la estabilidad de PSMA-BÍTE1 Fundamentalmente, las moleculas de PSMA-BÍTE1 en la formulación elegida con TRIS, fosfato (aquí: Na2HP04), trehalosa hidratada y polisorbato son estables en un intervalo de pH de 5,0 a 7,5. Sin embargo, para un valor de pH superior a 6, aumenta la proporción de dímero (> 2%) después del estrés por cizallamiento (Tabla 13).

Tabla. 13: 2 mg de moléculas de PSMA-BiTE por mi en 50 mM de Na2HPC>4, 100 mM de TRIS pH [Variable]; 4% (mA/) de trehalosa dihidratada, 0,04% (% m/V) de Polisorbato 80 Ejemplo 13: Influencia de TRIS y fosfato sobre la estabilidad de PSMA-BÍTE1 En las investigaciones en cuanto a diversas intensidades de tampón en la formulación se ha comprobado que es posible variar las concentraciones de tampón en la formulación: para minimizar la formación de dímeros de PSMA-BÍTE1 pueden utilizarse de 20 a 100 mM de Na2HP04 y de 50 a 200 mM de TRIS con pH 6,0. Todas las combinaciones permiten una reconcentración y la acción del estres por cizallamiento.

Sin TRIS no fue posible reconcentrar las moléculas de PSMA-BÍTE1, y sin Na2HP04 aumentó la proporción de dímero a > 2% después de exposición a estrés por cizallamiento. Además, el tampón fosfato mostró un buen efecto tampón a pH 6,0 y refuerza la termoestabilidad de las moléculas de PSMA-BÍTE1.

Tabla 14: 2 mg/ml de moléculas de PSMA- BÍTE1 en [variable] de Na2HPC>4, [variable] de TRIS pH 6,0; 4% (m/V) de trehalosa dihidratada, 0,04% (mA/)de Polisorbato 80 Ejemplo 14: Influencia de diversos agentes humectantes sobre la estabilidad de PSMA-BÍTE1 Diversos polisorbatos pueden estabilizar las moleculas de PSMA-BÍTE1 en la formulación contra estrés por cizallamiento. Sin embargo, con Polisorbato 80 se lograron mejores resultados. Otros estabilizadores como, por ejemplo, Synperonic F68 tuvieron también efectos positivos.

De 0,04% a 0,10% (m/V) de Polisorbato 80 tuvo un buen efecto estabilizante sobre las moléculas de PSMA-BÍTE1 durante el estrés por cizallamiento.0,004% (mA/) de Polisorbato no fueron suficientes en este caso para impedir un incremento inaceptable de la formación de dímeros después de la exposición al estrés por cizallamiento.

Tabla 15: 2 mg/ml de moléculas de PSMA-BÍTE1 en 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS pH b,0; 4% (m/V)de trehalosa dihidratada, [variable] de agente humectante Ejemplo 15: Influencia de la concentración de PSMA-BiTEI sobre la estabilidad de la formulación Con la formulación: 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS pH 6,0; 4% (mA/) de trehalosa, 0,04% (m/V) de Polisorbato 80 es posible preparar concentraciones de PSMA-BiTE1 de 2 mg/ml. Sin embargo, para concentraciones de PSMA-BiTEI más elevadas aumenta manifiestamente la proporción de dímeros. Sin embargo, valores inadmisibles se miden recién a concentraciones de PSMA-BiTE de más de 4 mg/ml y después de la exposición a fuerzas de cizallamiento (9,25% de dímeros para una concentración de PSMA-BiTE de aproximadamente 11,2 mg/ml).

Ejemplo 15a: Influencia de la concentración de PSMA-BiTE sobre la estabilidad de la formulación Con la formulación 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS pH 6,0; 4% (m/V) trehalosa dihidratada, 0,04% (m/V) Polisorbato 80 fue posible preparar concentraciones de PSMA-BiTEI de 2 mg/ mi. Para mayores concentraciones de PSMA-BiTE aumentó la proporción de dímeros manifiestamente. Sin embargo, se midieron valores inaceptables recién para concentraciones de PSMA-BiTE de más de 4 mg/ml y después de haberse medido la influencia de fuerzas de cizallamiento (9,25% de dímeros para una concentración de PSMA-BiTE de aproximadamente 11,2 mg/ml).

Tabla 16: [Variable] mg/ml de moléculas de PSMA-BITEI en 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS pH 6,0; 4% (m/V) de trehalosa dihidratada, 0,04% (m/V) de Polisorbato 80 Ejemplo 16: Liofilización Después de la preparación de la composición PSMA-BiTE se la liofilizó. Para ello se dispone de numerosas instalaciones de secado por congelación, como por ejemplo el aparato Génesis Super XL de SP Scientific. La liofilización se efectuó mediante la congelación de una sustancia y la subsiguiente sublimación del hielo sin pasar por una fase líquida.

Tabla 17: Programa para el secado por congelación de formulaciones PSMA-BiTE (duración total: 42 h).

“Gradiente = elevación o disminución continua de la temperatura En una fase de congelación se enfrió el producto en un “gradiente”, es decir de manera continua, en un intervalo de 30 minutos, de temperatura ambiente a -45 °C. Para que la solución del producto se congele por completo, se mantuvo esta temperatura durante 240 minutos.

Esto fue seguido por una fase de secado principal. En una cámara con un vacío de 100 pbar se calentó la composición dentro de 60 minutos a 20 °C. Se mantuvo esta temperatura durante 1.000 minutos y seguidamente se interrumpió el secado principal. Para el subsiguiente secado secundario se calentó la composición bajo un Introdujo vacío a una temperatura de 25 °C. Estas condiciones fueron mantenidas durante 1.140 minutos, a efectos de eliminar el agua residual a £ 2% (detección mediante titulación según Karl-Fischer).

Al final del proceso de secado se venteó la instalación y se cerró el recipiente de liofilización.

Ejemplo 17a: Bioactividad de liofilizados de PSMA-BÍTE1 despues de almacenamiento prolongado y reconstitución Unas composiciones con moléculas de PSMA-BÍTE1 (Tabla 18a) fueron almacenadas como liofilizado durante 12 meses a una temperatura de 2-8 °C y bajo una humedad relativa del aire 25 °C/60%. Después de 3 y 12 meses se reconstituyó cada solución a partir del liofilizado y se la analizó en un ensayo de actividad de base celular. Las mediciones (mediante ensayo CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay de Promega) indicaron una bioactividad no modificada, tanto después de 6 como también de 12 meses de almacenamiento en las condiciones mencionadas.

Además de ello, se analizó la estabilidad de la solución de PSMA-BÍTE1 reconstituida en condiciones de almacenamiento. Después de su reconstitución, la solución fue almacenada en primer término durante 7 días en una refrigeradora (2-8 °C) y subsiguientemente durante 16 horas a temperatura ambiente (+20 ± 5 °C). A continuación se determinó también en este caso la bioactividad de la molécula de PSMA-BÍTE1 mediante ensayo de actividad de base celular. En el caso de la solución reconstituida, despues del almacenamiento adicional mencionado, era del 96%.

La bioactividad de las moléculas de PSMA-BÍTE1 en la formulación liofilizada era por lo tanto después de un almacenamiento de 6 a 12 meses estable en las condiciones de almacenamiento mencionadas. Rige lo mismo para esta solución reconstituida a partir de este liofilizado después de un almacenamiento durante 7 días a 2 de 8 °C y durante 16 horas a temperatura ambiente.

Ejemplo 17b: Estabilidad de dos cargas representativas para monómero (SEC y CGE), bioactividad (ensayo de actividad de base celular) y partículas (HIAC y MFI) de liofilizados de PSMA-BÍTE1 después de almacenamiento prolongado y reconstitución Unas composiciones con moléculas de PSMA-BÍTE1 (Tabla 18a) fueron almacenadas como liofilizado durante 12 meses a 2-8 °C y bajo una humedad relativa del aire del 60% a 25 °C. Después de 3 y 12 meses se analizó en cada caso una solución a partir de liofilizado y se analizó entre otros en un ensayo de actividad de base celular. Las mediciones (mediante ensayo CytoTox-GloCytotoxicity de Promega) demostraron actividades no modificadas, así como también solo reducidas variaciones en la proporción de monómeros en el SEC y CGE, después de un almacenamiento tanto de 3 como también de 12 meses en las condiciones de almacenamiento mencionadas (Tabla 18b).

Además, se midieron partículas de proteína en un orden de tamaño de >2 a > 25 mm mediante Mikro Flow Imaging (MFI) y FIIAC (Tabla c). Los valores se mantuvieron estables para ambas cargas durante el tiempo de almacenamiento durante los alcances de la exactitud de las mediciones.

Tabla 18 a: Composición del producto secado por congelación. Cada frasco de vidrio para inyecciones, incoloro, contiene un liofilizado con la siguiente composición: Composición Función Cantidad enCantidad en %, de la mg solución antes de la liofilización Sustancia activa PSMA-BITE1 Sustancia activa 2,60 0,2 Excipientes Na2HP04*2H2O Sustancia 11,57 0,89 tampón TRIS Sustancia 15,73 1,21 tampón Trehalosa- crioprotector 52,00 4 dihidratada Polisorbato 80 Tensioactivo 0,52 0,04 10% HCL Ajuste del pH es es a las cantidades incluyen 0,3 mi de sobrellenado El liofilizado ha de ser reconstituido con 1 ,2 mi de agua para fines de inyección. La solución aplicable así obtenida tiene una entonces concentración de 2 mg/ml. Una ampolla contiene por el sobrellenado 1 ,3 mi con 2,6 mg de PSMA-BITE1.

Tabla 18b Estabilidades de dos lotes de la formulación de acuerdo con la invención de PSMA-BITE1 Tabla 18c: Estabilidades de dos lotes de la formulación de acuerdo con la invención de PSMA- BITEl (partículas de proteína) Además, se investigó la estabilidad en almacenamiento de la solución de PSMA-BÍTE1 reconstituida. La solución fue almacenada durante de su reconstitución en primer lugar durante 7 días en refrigerador (2-8 °C) y seguidamente durante 16 horas a temperatura ambiente (+20 ± 5 °C). Seguidamente tambien aquí se determinó la bioactividad de las moléculas de PSMA-BÍTE1 mediante ensayo de actividad de base celular. En la solución reconstituida después del mencionado almacenamiento fue del 96%.

La bioactividad de las moléculas de PSMA-BÍTE1 en la formulación liofilizada fue seguidamente estable después de un almacenamiento de más 3 a 12 meses en las condiciones de almacenamiento mencionadas, dentro de los alcances de las correspondientes exactitudes de las mediciones. También los otros parámetros de medición (datos de SEC, Bioactividad, MFI y HIAC) muestran este resultado. Rige lo mismo para la solución reconstituida a partir de este liofilizado despues de un almacenamiento durante 7 días durante 7 días a 2-8 °C y durante 16 horas a temperatura ambiente.

Ejemplo 18: Influencia del estrés por cizallamiento en la administración mediante jeringa de inyecciones y cánula sobre la formación de dímeros de PSMA-BÍTE1 Composición: 2,17 mg/ml de moléculas de PSMA-BÍTE1, 50 mM de NQSHRO^ 100 mM de TRIS pH 6,0; 4% de trehalosa, 0,04% de Polisorbato 80 Material: Jeringas descartares (BD 2 mi), Cánulas (BD Microlance 30G1/2 (REF: 304000)) y ampollas de vidrio ámbar (6R) y CryoTubes.

Realización: se descongelaron 30 ampollas.6 ampollas fueron utilizadas como valores iniciales. Para cada ensayo se utilizaron 6 ampollas, es decir, se extrajeron con la jeringa/cánula y se inyectaron todas en un vidrio ámbar o bien en un CryoTube. Ensayos: 1. Inyección lenta de la composición de PSMA-BÍTE1 en un CryoTube (SpLCryo) 2. Inyección lenta de la composición de PSMA-BÍTE1 en un vidrio ámbar (SpL Glas) 3. Inyección rápida de la composición de PSMA-BÍTE1 en un CryoTube (SpLCryo) 4. Inyección rápida de la composición de PSMA-BÍTE1 en un vidrio ámbar (SpL Glas) Seguidamente se midió la formación de dímeros mediante DSF (Differential Scanning Fluorimetry).

Ejemplo 18a: Influencia del estrés por cizallamiento en la administración mediante jeringa de inyecciones y cánulas sobre la formación de dímeros Composición: 2,17 mg/ml de moléculas de PSMA-BÍTE1, 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS pH 6,0; 4% de trehalosa dihidratada, 0,04% de Polisorbato 80 Material: jeringas de un sólo uso (BD 2 mi), cánulas (BD Microlance 30G1/2 (REF: 304000)) y ampollas de vidrio ámbar (6R) y Cryo Tubes.

Realización: se descongelaron 30 ampollas.6 ampollas fueron utilizadas como valores iniciales. Para cada ensayo se utilizaron 6 ampollas, es decir, se extrajeron con la jeringa/cánula y se inyectaron todas en un vidrio ámbar o bien en un CryoTube.

Ensayos: 1. Inyección lenta de la composición de PSMA-BÍTE1 en un CryoTube (SpLCryo) 2. Inyección lenta de la composición de PSMA-BÍTE1 en un vidrio ámbar (SpL Glas) 3. Inyección rápida de la composición de PSMA-BÍTE1 en un CryoTube (SpLCryo) 4. Inyección rápida de la composición PSMA-BÍTE1 en un vidrio ámbar (SpL Glas) Tabla. 19: Formación de dímeros de PSMA-BÍTE1 despues de exposición a estrés por cizallamiento por inyección Se midió la formación de dímeros mediante DSF (Differential Scanning Fluorimetry). No pudo observarse un aumento significativo de la proporción de dímeros después de la inyección de la composición mediante jeringas de inyecciones y cánulas. Este resultado muestra que la formulación de acuerdo con la invención es en todos los casos estable frente a su exposición a las fuerzas de cizallamiento generadas.

Ejemplo 19: Estabilidad de la solución de PSMA-BÍTE1 después de reconstitución (hasta 28 horas a 2-8 °C) y para 2 diluciones y 2 temperaturas (25 °C) en solución de cloruro de sodio 0,9 durante hasta 8 horas.

Se midió la proporción de monómeros, dímeros y multímeros mediante cromatografía de SEC.

Composición: 2,0 mg/ml de moléculas de PSMA-BÍTE1 , 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS pH 6,0; 4% de trehalosa dihidratada, 0,04% de Polisorbato 80 Material: NaCI al 0,9 % y agua para fines de inyección Realización: 16 ampollas liofilizadas de PSMA-BÍTE1 fueron reconstituidas mediante la adición de 1 ,1 mi de agua para fines de inyección (WFI, Wasser für Injektionszwecke). De estas, 8 ampollas fueron guardadas a 2-8 °C y cada una de 4 frascos con solución de cloruro de sodio al 0,9% fue diluida hasta una concentración de 0,066 y 0,66 mg/ml. Las mismas fueron sometidas a incubación y se investigó para los instantes de tiempo O h, 2 h, 4 h y 8 h mediante SEC.

Tabla 20: estabilidad de PSMA-BÍTE1 en caso de dilución en solución de cloruro de sodio al 0,9% e incubación a 25 °C durante hasta 8 horas como tambien hasta 28 horas a 2-8 °C para la solución reconstituida.

Las muestras reconstituidas mediante WFI mostraron de acuerdo con lo previsto a su vez el incremento de dímeros que cabía prever para una solución de 2 mg/ml a 2-8 °C. La disminución de monómeros se correlaciona claramente con el incremento en dímeros y no se presentan multímeros.

Las diluciones en solución de cloruro de sodio al 0,9% muestran un resultado comparable con los resultados en PBS. Para 0,666 mg/ml la relación entre monómeros y dímeros se mantiene constante y a su vez se presenta un incremento en monómeros.

Ejemplo 20: Ensayo en modelo de la estabilidad de la solución de PSMA-BITE1 en aplicación subcutánea Para ello se investigó la solución de PSMA-BÍTE1 reconstituida para 2 diluciones y 2 temperaturas (25 °C y 37 °C) en PBS. Se midió la proporción de monómeros, dímeros y multímeros, como las partes de ruptura (LMW) mediante cromatografía SEC, como también de las partículas subvisibles (SVP, Subvisible Particles) mediante MFI.

Composición: 2,0 mg/ml de moléculas de PSMA-BÍTE1, 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS pH 6,0; 4% de trehalosa dihidratada, 0,04% de Polisorbato 80 Material: PBS Realización: A efectos de determinar la estabilidad de las soluciones de PSMA-BITE-1 diluidas en condiciones de la aplicación se, se reconstituyeron correspondientes ocho ampollas de PSMA-BÍTE1 liofilizadas mediante adición de 1 ,1 mi de WFI. Con PBS se diluyeron en cada caso 4 ampollas hasta una concentración de 0,066 y 0,66 mg/ml. Las mismas fueron incubadas a 25 °C (controles) y 37 °C, y se midieron en los instantes de tiempo O h, 2 h, 4 h y 8 h mediante SEC y MFI.

Tabla 20: estabilidad de PSMA-BÍTE1 en caso de dilución en PBS e incubación a 25 °C (arriba) y a 37 °C (abajo) durante hasta 8 horas.

Dilución con PBS a 25 °C Dilución con PBS a 37°C: La dilución con PBS y la incubación en PBS a 37 °C muestran que la molecula de PSMA-BiTE en estas condiciones simuladas de la utilización subcutánea, se mantiene estable. Con una concentración de 0,665 mg/ml, tenemos una relación estable entre monómeros y dímeros para ambas temperaturas de incubación. En cambio, en el caso de 0,66 mg/mL, vemos el efecto de que disminuye la proporción de dímeros y aumenta la proporción de monómeros. Esto es un efecto de la formación reversible de dímeros, que depende de la concentración y del tiempo. En el caso del SVP puede observarse una tendencia hacia una ligera formación de SVP función de la concentración, temperatura y del tiempo, que sin embargo no representa ningún problema en cuanto a la estabilidad. De esta manera se demuestra la aptitud de la formulación para una aplicación subcutánea.

Ejemplo 21: estabilidad de las diluciones de PSMA-BÍTE1 en soluciones de NaCI al 0,9% para estudios relacionados con las dosis.

Unos liofilizados de PSMA-BiTE fueron reconstituidos con 1,2 mi de WFI y mezclados con una solución de cloruro de sodio al 0,9%, que fue ajustada a un contenido de Polisorbato 80 al 0,004%. Esto era necesario para evitar pérdidas en la bioactividad de las soluciones fuertemente diluidas. A tal efecto se preparó una solución de Polisorbato 80 al 1% en un tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,5). Esta solución fue añadida a una solución de cloruro de sodio al 0,9% disponible en el comercio (por ejemplo, Baxter Viaflo 250 mi), de manera que se alcanzase una concentración final de 0,004%. Con esta solución se prepararon diluciones de PSMA-Bite en el intervalo de 0,05 mg/ml a 2000 pg/ml en las siguientes etapas: - 0,05pg/ml - 0,7pg/ml - 2pg/ml - 18pg/ml - 90pg/ml - 500 mg/ml - 2000 mg/ml A tal efecto se utilizaron bolsas de infusión esteriles vacías (por ejemplo, bolsas de 150 mide Impromediform GmbH, REF MF 1661)), en los que se introdujo la solución de cloruro de sodio acondicionada. A esta solución se le añadieron cantidades correspondientes de solución de PSMA-BÍTE1 reconstituido, y se mezcló mediante rotación de la bolsa. Se extrajeron alícuotas de 1 mi mediante jeringas de 2 mi (por ejemplo, Injekt 2 mi/ Luer Lock Solo Braun (REF 46067001V)), y se obturó mediante tapones Combi Stopfen von BBraun (REF 4495101).

Estas jeringas fueron seguidamente guardadas a una temperatura de 2 a 8 °C durante hasta 9 días en un refrigerador. Dicho almacenamiento contenía un almacenamiento a temperatura ambiente (20 °C +/- -5 °C) durante 4 ó 20 horas. Para la medición se colocó una aguja de inyecciones (BD Microlance 330G1/2” 0,3*13 mm) para utilización subcutánea sobre la jeringa (REF 304000), y con la misma se introdujo la solución en un vial de 2 mi (tipo de vidrio 1).

Se investigó la bioactividad de las soluciones diluidas en un ensayo de citotoxicidad. La recuperación (contenido de proteínas) fue determinada en un ensayo de ECL (Ensayo de Electroquimioluminiscencia).

Debido a un intervalo de medición restringido en el ensayo de ECL fue necesario diluir las soluciones de ensayo como sigue antes de los análisis en la solución acondicionada de cloruro de sodio al 0,9%: - 0,05 pg/ml: sin diluir - 0,7pg/ml: 1:50 - 2pg/ml: 1:200 - 18 pg/ml: 1:1000 Las Tablas 21a y b muestran los resultados de los estudios de almacenamiento de las soluciones impecables finales en el intervalo de 0,05 a 18 pg/ml de PSMA-BiTE a lo largo de un tiempo de almacenamiento de 9 días. La concentración de proteínas permanece constante para todas las concentraciones finales. Las concentraciones relativas (comparadas con los valores T0) se hallan en el intervalo del 79% al 117%. Sobre la base de experiencias anteriores con esta clase de sustancias, se determinó un criterio de aceptabilidad de una diferencia de +/- -40% a +/- 50% con respecto al valor T0. Los datos medidos se encuentran muy bien en ese intervalo de aceptabilidad Tabla 21a: Determinación del contenido de proteínas mediante ensayo ECL en el intervalo de 0,05 mg/ml a 18 pg/ml Tabla 21b: Determinación de la concentración relativa mediante el ensayo de ECL en el intervalo de 0,05 mg/ml a 18 pg/ml Abreviaturas utilizadas en las Tablas 21a y b: BiTE: Molecula de PSMA-BiTE 1 A: Ensayo Prom.: valor promedio Valor T0: valor en el instante 0 Para su utilización en el ensayo de CytoTox-Glo Citotoxicidad fue necesario diluir las soluciones de ensayo como sigue con medio de ensayo: 18 pg/ml: 1: 36 90 pg/ml 1 : 180 500 Mg/ml 1 : 1000 2000 Mg/ml 1 : 4000 La actividad biológica del material ensayado se expresa como “bioactividad relativa”. La misma se determina como sigue: Actividad biológica relativa = EC50 (estándar de referencia) EC50 (Control de ensayo) En la Tabla 22 se muestra que la bioactividad de las soluciones de infusión finales con 18 a 2.000 Mg/ml el PSMA-BiTE se mantiene estable a lo largo de un período de almacenamiento de nueve días. Durante el período de almacenamiento de 9 días las bioactívidades relativas se encuentran, en comparación con el valor TY0, en un intervalo de 77% y-132%.

Por lo tanto, estos resultados se encuentran muy bien en un intervalo de aceptabilidad, previamente determinada o de una bioactividad del 50 al 200%.

Tabla 22a: Determinación de la potencia relativa mediante ensayo de citotoxicidad a base de celulas, en el intervalo de 18 a 2000 mg/ml.

Tabla 22b: Determinación de la bloactividad relativa en comparación con el valor TO mediante ensayos de citotoxicidad a base de celulas en el intervalo de 18 a 2.000 pg/ml.

Abreviaturas utilizadas en la Tabla 22: BiTE: Molecula de PSMA-BiTE 1 A: Ensayo Prom : valor promedio Valor TO: valor en el instante 0 Las diferencias en la bioactividad de soluciones diluidas y almacenadas a lo largo de 9 días no era mayores de +/- 33% en comparación con los valores TO. No puede observarse ninguna tendencia que permita reconocer una manifiesta pérdida del bioactividad a lo largo del tiempo de almacenamiento. Las soluciones de ensayo con 18 mg/mililitro de PSMA-BÍTE1 muestran una ligera disminución de la bioactividad durante el tiempo de almacenamiento, no pudiéndose sin embargo confirmar esta tendencia cuando se observan las soluciones de ensayo con concentraciones más elevadas.

Por otra parte, la concentración de 18 pg/mililitro en el ensayo de ECL no mostró ninguna disminución de la concentración de proteínas a lo largo del tiempo de almacenamiento.

En resumen, puede afirmarse que el almacenamiento de las soluciones inyectables finales de PSMA-BiTE con un intervalo de concentraciones 18 a 2000 pg/mililitro es compatible con las condiciones de dilución aplicadas, y que es posible un sistema de almacenamiento y de aplicación de hasta 9 días a una temperatura de +2 - 8 °C, inclusive un intervalo de hasta 20 horas a una temperatura de 20 +/- 5 °C.

Ejemplo 22 Biodisponibilidad de PSMA-BÍTE1 después de aplicación subcutánea Con la formulación 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS pH 6,0; 4% de trehalosa, 0,04% de Polisorbato es posible lograr una elevada biodisponibilidad después de la aplicación subcutánea. Se investigó la biodisponibilidad subcutánea de la molécula de PSMA-BÍTE1 en monos Cynomolgus hembras. La dosificación es de 45 mg/kilo para la aplicación subcutánea y se compara con una administración intravenosa de 5 y 15 pg/kilo de peso corporal. La solución madre fue diluida con 2 pg/ml de solución salina fisiológica. La duración de la infusión de la aplicación intravenosa es de una hora, y la velocidad de la infusión es de 1 ml/kg en peso. Como lugar para la inyección se elige una vena superficial (V. saphena parva). Para la administración subcutánea se inyectó la solución experimental con 0,15 ml/kg en peso en la región lateral izquierda del pecho. Los niveles sanguíneos fueron investigados mediante un ensayo ELISA. Para ello se utilizó la teenología ECL. El límite de cuantificación inferior (LLOQ) del método era de 4 pg/litro.

Ejemplo 22a: Biodisponibilidad de PSMA-BÍTE1 después de aplicación subcutánea Con la formulación 50 mM de Na2HP04, 100 mM de TRIS pH 6,0; 4% de trehalosa dihidratada, 0,04% de Polisorbato 80 es posible lograr una biodisponibilidad del 66% después de la aplicación subcutánea. Se investigó la biodisponibilidad subcutánea de la molécula de PSMA-BÍTE1 en 4 macacos hembras. La dosificación era de 45 pg/kilo para la aplicación subcutánea y se comparó con una administración intravenosa de 5 y 15 pg/kilo de peso corporal. La solución madre fue diluida con 2 pg/ml de solución salina fisiológica. La duración de la infusión de la aplicación intravenosa era de una hora, y la velocidad de la infusión era de 1 ml/kg en peso. Como lugar para la inyección se eligió una vena superficial (V. saphena parva). Para la administración subcutánea se inyectó la solución experimental con 0,15 ml/kg en peso en la región lateral izquierda del pecho. Los niveles sanguíneos fueron investigados mediante un ensayo ELISA. Para ello se utilizó la teenología ECL. El límite de cuantificación inferior (LLOQ) del método era de 4 mg/litro.

Métodos Preparación de las moléculas de PSMA-BiTE En por ejemplo el documento WO 2010037836 A2 se describen procedimientos para la preparación de moléculas de BiTE, en especial para moléculas de PSMA-BiTE.

En primer lugar se integró el constructo BiTE-ADN recombinante codificador de PSMA-BÍTE1 en un vector de expresión adecuado, y se lo introduce con el mismo de manera estable en células eucariotas CHO (ovario de hámster chino). Las células CHO transfectadas se cultivaron en un biorreactor con un medio nutriente adecuado y la proteína seleccionada sistemáticamente se aisló por filtración de las células. La purificación de las moléculas de BiTE comprendió un intercambio de la sustancia tampón contra TRIS y fosfato mediante SEC y la subsiguiente concentración mediante ultrafiltración y diafiltración. Adicionalmente se añadió un poliol (preferentemente trehalosa) y un agente humectante (preferentemente Polisorbato 80). La composición fue almacenada a una temperatura de -60 °C.

DSF (Differential Scanning Fluorimetry) Las mediciones relacionadas con la estabilidad de las moléculas de PSMA-BiTE1 (por ejemplo, después del estrés por cizallamiento) se llevaron a cabo con un aparato 750 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). Diferentes concentraciones de PSMA-BÍTE1 (entre 0,15 y 0,005 mg/mililitros) se mezclaron en placas de 96 cavidades (placas de microtitulación) con un colorante fluorescente (por ejemplo, “Sypro® Orange 5000”), y se midió en un sistema de PCR (750 Fast Real Time PCR System, Applied Biosystems). La temperatura se elevó de 20 a 90 °C. Se determinaron los puntos de fusión de las proteínas por medio de detección de fluorescencia, que resulta ser dependiente de la temperatura cuando el colorante fluorescente reacciona con las regiones hidrófobas de la proteína.

Calorimetría Diferencial de Barrido (Differential Scanning Calorimetry, DSC) Se determinó la temperatura termica de desplegado (Tm) de la molécula de PSMA-BiTEI mediante DSC. A tal efecto, se calentaron las muestras a una temperatura de 20 a 105 °C y se determinó el punto de fusión del polipéptido con un colorímetro. Se empleó un aparato un aparato VP-DSC de GE Healthcare.

Estrés por agitación Se sometieron las muestras a estrés en un aparato de agitación de laboratorio (IKA, HS 260) en una cámara templada (MMM, FrioCell 200). Se determinó la agregación de parámetro crítico después de 24 horas a 300 rpm y a una temperatura de 20 °C.

Control visual Se controló ópticamente la estabilidad de las soluciones de PSMA-BiTE después de haberlas sometido a estrés por cizallamiento, para lo cual se sostuvieron la solución contra un fondo oscuro y se las examinó en búsqueda de partículas o de turbiedades visibles. Una solución clara después del ensayo de estrés por agitación señala una formación escasa o ausente de dineros y/o multímeros, mientras que una turbiedad visible de la solución está correlacionada con una elevada proporción de dímeros y/o multímeros.

Dispersión dinámica de la luz (DLS) La dispersión dinámica de la luz es un método para analizar la luz dispersa de un láser en una muestra disuelta o bien suspendida. En este caso se mide el radio hidrodinámico que a su vez permite sacar conclusiones en cuanto al estado de agregación de las moléculas de PSMA-BiTE. El radio hidrodinámico se mide mediante un aparato. Horiba LB 550 (Retsch Technology).

Determinación del contenido de proteínas El contenido de proteínas fue determinado por espectrometría con un aparato Nanodrop 2000 (Thermo Scíentific) a 280 nm. Todas las muestras fueron objeto de una medición en comparación con una correspondiente solución placebo o tampón.

Cada solución de muestra fue pipeteado 3 X en el intervalo de medición del aparato Nanodrop (2 mI) y en cada caso se midió dos veces, después de lo cual se promediaron estos valor de medición (n = 6). El contenido proteínico (mg/ml) se calculó por intermedio de una función de calibración previamente establecida (absorción en función del contenido de proteínas) de la proteína a partir de los valores de medición determinados.

Medición por electroquimioluminiscencia (ensayo ECL) Para este método, se utilizaron marcaciones SULFO-TAG™, que después de una estimulación electroquímica emiten luz. La estimulación tuvo lugar en la superficie de electrodos de las denominadas microplacas MULTI-ARRAY. En este caso, la luz emitida fue medida a aproximadamente 620 manómetros mediante un detector.

La medición se basaba en el método “sándwich”, en el que las moléculas de PSMA-BiTE en solución son inmovilizadas mediante anticuerpos anti-PSMA-BiTE1 de cabra policlonales sobre una microplaca. A continuación, se ligó penta-His-biotina a la molécula de BiTE inmovilizada y se la detectó mediante estreptavidina conjugada con SULFO-TAG™. Las muestras fueron leídas en un Sektor Imager 2400.

Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) Para determinar las proporciones de monómeros y dímeros como también las proporciones de bajo peso molecular (LMW) y de elevado peso molecular (HMW) se llevó a cabo una cromatografía por exclusión de tamaño por medio de una instalación de HPLC. La medición tuvo lugar mediante un detector de fluorescencia y el cálculo tuvo lugar mediante el método porcentual de áreas. Como columnas se utilizó una columna estándar para el SEC de proteínas, por ejemplo, un TosohBiosep TSK gel G3000 SWXL 5 mm, longitud 300 mm x I.D.7,8 mm, o un material equivalente. Determinación de las concentraciones de PSMA-BITE1 en el suero después de administración i.v.y s.c.

Se midió la concentración de PSMA-BiTE en suero de monos Cynomolgus mediante ELISA. La detección tuvo lugar mediante electroquimioluminiscencia. El límite de detección (LLOQ) era de 0,98 mg/litro, con una precisión del 3 al 28% y una exactitud del 70 al 100%.

Ensayo de actividad a base de células El ensayo de citotoxicidad a base de células sirve como ensayo de rutina para determinar la actividad relativa de las muestras de PSMA-BiTE. Por medio de la unión biespecífica de células positivas a CD3 humano/macaco y PSMA humano/macaco tiene lugar, después de la activación de las células T (células efectoras), la lisis mediada por las células T de las células objetivo.

La determinación de la citotoxicidad se realiza mediante los ensayos luminiscentes de citotoxidad CytoTox-GloCyto de Promega. En este caso, como magnitud de medición sirve la cantidad de señales luminosas liberadas que se correlaciona con la cantidad de células moribundas. Otros ensayos de actividad se describen en el documento WO 2010037836 A2.

Ensayo de citotoxicidad a base de células para la determinación de la actividad relativa de las muestras de PSMA-BÍTE1 Aparatos y materiales 1. Banco de trabajo estéril 2. Incubadora de células 3. Microscopio 4. Aparato para contar células, por ejemplo, hemocitómetro 5. Placas con 96 cavidades en U, transparentes (por ejemplo, Greiner Bio-one) 6. Placas con 96 cavidades planas, blancas (por ejemplo, Nunc, 3058078) 7. Botella para cultivo de células 8. Aparato para medir múltiples placas Reactivos 1. Celulas efectoras, por ejemplo, MC15 2. Células objetivo, por ejemplo, C4-2 3. 0,4% de azul Tripano 4. Penicilina - estreptomicina 5. L-Glutamina (200 mM) 6. Interleucina 2 7. Medio- MC15: Advanced RPMI 1640 8. Suero fetal de ternero (FKS), por ejemplo, Gibco 10270106 9. PBS, por ejemplo, Gibco 20012 10. Medio - C4-2: RPMI 1640 con L-glutamina, por ejemplo, Gibco 11835063 11. Reactivo de detección, por ejemplo, CytoToxGlo, Promega G9291 Medio de cultivo Medio para células MC 15, por ejemplo, 900 mi de Advanced RPM1 1640 +100 mi de FKS +10 mi de penicilina - estreptomicina +10 mi L-glutamina (200 mM) +10 - 20 mI [100-200 U/ml] de Interleuquina 2 Medio para células C4 - 2, por ejemplo, 900 mi de RPMI 1640 con L-glutamina +100 mi de FKS +10 mi de penicilina- estreptomicina Medio de ensayo Medio de ensayo, por ejemplo, 900 mi de RPMI 1640 con L-glutamina +100 mi FKS Inicio del cultivo de Las celulas se conservaron en nitrógeno líquido. La células descongelación de las células se realizó rápidamente MC 15 a 37 °C, seguidamente se suspendieron las células en 15 mi de medio frío y se incubaron durante 10 minutos. A continuación las células fueron centrifugadas durante por ej. 7 minutos a 700 g, se desechó el sobrenadante y se resuspendieron las pellas en 10 mi de medio de crecimiento.

Las células se incubaron a 37 °C y C02 al 5% durante aproximadamente 3-4 días.

Subcultivo MC 15 Se cuentan alícuotas de células vivas del cultivo Centrifugar durante 7 min a 170 g Desechar el sobrenadante y ajustar el sedimento con medio de crecimiento a una concentración de 0,5 x106 a 1,5 x 106 células/ml. Las células deberían ser pasadas 2 ó 3 veces por semana Inicio del cultivo de Las células para el ensayo se conservan en nitrógeno células C4 -2 líquido. La descongelación de las células se realiza rápidamente a 37 °C. Seguidamente se resuspenden las células en 20 mi de medio. Seguidamente centrifugar durante por ejemplo 7 minutos a 700 g. Desechar el sobrenadante y suspender el sedimento en 10 mi de medio de crecimiento.

Las célula se Incuban a 37 °C y a 5% de CO2 durante aproximadamente 3 -4 días Subcultivo C4-2 Retirar el medio de la botella y desecharlo Enjuagar la capa de células cuidadosamente con 10 mi de PBS Añadir 2-3 mi de tripsina e incubar a 37 °C hasta que se desprenda la capa de celulas (aproximadamente 5- 15 min.)· Añadir 10 mi de medio y desprender las células Centrifugar durante por ejemplo 7 minutos a 170 g Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 10 mi de medio de crecimiento, contar las células y ajustar con medio a una densidad adecuada.

Las células se incuban a 37 C y 5 % CO2 durante aproximadamente 3- 5 y deberían ser tratadas una o dos veces por semana.

Preparación de las Liberar las células como arriba descrito células para el ensayo Ajustar células efectoras (MC 15) a una concentración de 2 x 10E6 células/ml en medio de ensayo Ajustar las células objeto (C4-2) a una concentración de 4 x 10E5 células/ml en medio de ensayo.

Mezclar volúmenes iguales de células objeto y efectoras 1:1 (mezcla de células) Preparación de las Mezclar bien una o varias muestras, controles de muestras, controles de ensayo y material de referencia (RF) a temperatura ensayo y material de ambiente, y ajustar todas a una misma primera referencia concentración (V1; por ejemplo, 500 mg/ml) con medio de ensayo. Seguidamente llevar a cabo una dilución en serie (por ejemplo, 1 :6, n = 7) con medio de ensayo a efectos de obtener curvas compensadas de dosis- efecto.

Realización del ensayo Adición de las muestras, Transferir alícuotas de muestras, controles de ensayo controles de ensayo y y material de referencia (por ejemplo, 25 pl) en las material de referencia cavidades correspondientes de una placa de 96 cavidades de fondo plano.

Transferir la mezcla de celulas (por ejemplo 50 pl) en cada una de las cavidades de una placa de 96 cavidades de fondo plano.

Sacudir placa, por ejemplo, durante 1 min a 400 rpm Incubar placa durante 16 - 24 h a 37 °C y 5% de CO2 Determinación de la citotoxicidad y de la actividad relativa Adición del reactivo de La dilución y adición del reactivo como también detección y medición la subsiguiente medición se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, por ejemplo CytoTox - Glo, Promega.

Añadir 15 mL de reactivo por cavidad Sacudir placa, por ejemplo, 1 min con 400 rpm Incubar durante aproximadamente 15 min a temperatura ambiente La luminiscencia se mide mediante un aparato medidor de múltiples placas adecuado.

Evaluación Curva de compensación Determinar los valores de medición promedio para cada concentración para las repeticiones de las muestras, controles de ensayo y material de referencia.

Dibujar una curva de dosis - efecto para cada serie de muestras, controles de ensayo y material de referencia. A tal efecto se registran los valores de medición medios correspondientes a las concentraciones finales de BAY2010112 (por ejemplo, de 500.000 mg/ml a 1,79 pg/ml).

Disponer una curva de compensación adecuada a traves de los valores medidos medios del nivel de concentración de muestras, controles de ensayo y material de referencia.

Actividad relativa Se determina y documenta la relación de las (Determinación) actividades entre muestra y material de referencia. Puede utilizarse un software estadístico.

Evaluación La activad relativa de las muestras en comparación con el material de referencia debe corresponder a la especificación Determinación de la concentración del polipéptido PSMA-BÍTE1 (espectroscopia UV/VIS) El método se lleva a cabo de acuerdo con la Farmacopea Europea (Ph. Eur., 2.2.25, espectroscopia de UV-VIS a 280 nm) y es adecuado para determinar la concentración de otras moléculas.

En primera instancia, se determina experimentalmente el coeficiente de extinción respondiendo a las moléculas de PSMA-BÍTE1. A tal efecto se determina la extinción de soluciones con una concentración conocida de PSMA-BÍTE1, en donde las concentraciones (expresadas en mol/l) se ajustan en base a las masas molares de las moléculas de PSMA-BiTE (1,8673 x 105 g/mol). En base a la extinción, del espesor de la capa y de la concentración de las moléculas de PSMA-BÍTE1 es posible calcular el coeficiente de extinción de las moléculas de PSMA-BiTE, de acuerdo con: e = A / c x d, en donde A = Extinción (o bien absorción, desdeñándose la dispersión de luz) bajo una longitud de onda adecuada (en este caso, 280 nm) c = concentración (mol/l) d = espesor de la capa (mm).

Seguidamente se consignan los coeficientes de extinción en el eje de las ordenadas referidos a las concentraciones correspondientes sobre el eje de las abscisas, de manera de obtener una recta de calibración. Mediante esta recta de calibración y con ayuda de la extinción, es posible leer directamente la concentración de la solución de PSMA-BÍTE1.

Para trazar la recta de calibración mencionada debe ser posible aplicar la lcy de Beer-Lambert sobre la solución medida, es decir entre otros, la sustancia absorbente ha de estar distribuida homogeneamente en la solución, la variación del coeficiente de absorción dentro del intervalo espectral medido debe ser despreciable, y la solución medida debe tener una concentración suficientemente baja para que no se presenten desviaciones impuestas por las interacciones.

Inversamente, con ayuda del coeficiente de extinción de una molécula, y en base de la extinción medida (o bien absorción a 250 nm), es también posible calcular la concentración de proteínas (en mol/l), como sigue: Concentración de la proteína [mol/l] = A x V/ e x d, en donde A = absorción a 280 nm d = longitud de celda en cm (celda estándar, 1 ,00 cm) V = dilución de la solución de ensayo e = coeficiente de extinción de PSMA-BÍTE1 a 280 nm = 111315 M 1 x cm 1.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica líquida, que comprende un polipéptido, TRIS y fosfato, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEC ID N°: 8, caracterizada porque comprende: el polipéptido en una concentración de 0,5 mg/ml a 3,0 mg/ml; 100 mM de TRIS y 50 mM de fosfato; el valor del pH de la composición es de aproximadamente 6,0; y la composición contiene 0,04% de Polisorbato 80.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición contiene adicionalmente un agente lioprotector.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la composición contiene del 2 al 10 % de un agente lioprotector.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 2 y 3, caracterizada porque el agente lioprotector es trehalosa o trehalosa dihidratada.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición adicionalmente contiene aproximadamente 4% de trehalosa dihidratada.

6. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la composición contiene el polipéptido en una concentración de 2 mg/ml.

7. Una mezcla de sustancias sólidas, que puede ser preparada mediante liofilización de una composición líquida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Una composición farmaceutica líquida, caracterizada porque la composición se reconstituye disolviendo en un medio líquido adecuado una mezcla de sustancias sólidas liofilizada de conformidad con la reivindicación 7.

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la biodisponibilidad del polipéptido después de administración subcutánea de la composición es superior al 60%.

10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para ser utilizada en un procedimiento terapéutico.

11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para ser utilizada en un procedimiento terapéutico, comprendiendo este procedimiento la administración parenteral de la composición.

12. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para ser utilizada en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de enfermedades hiperproliferativas de la próstata.

13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para ser utilizada en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de la próstata, comprendiendo el procedimiento la administración subcutánea de la composición.

14. Una jeringa, caracterizada porque comprende una composición como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.