CN104780940B - 用于双特异性t细胞衔接体(bites)的制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及稳定的药物组合物，其含有具有至少两个抗原‑结合结构域的多肽且尤其适于皮下施用。本发明提供液体组合物，其将不期望的多肽团聚体(二聚体和/或多聚体)的形成降至最低。本发明进一步提供用于在液体组合物中将具有抗原‑结合结构域的多肽的团聚降至最低的方法。

Description

用于双特异性T细胞衔接体(BITES)的制剂
本发明涉及稳定的药物组合物，其含有具有至少两个抗原-结合结构域的多肽且尤其适于皮下施用。本发明提供液体组合物，其将不期望的多肽团聚体(二聚体和/或多聚体)的形成减至最低。本发明进一步提供用于在液体组合物中将具有抗原-结合结构域的多肽团聚降至最低的方法。
在现有技术中已知需要使溶液中的抗体稳定化(即防止形成二聚体和多聚体)(已知为高分子量或HMW团聚体)，以维持治疗活性恒定。WO2011061712公开了稳定的抗体制剂，除了25-250mg/ml抗体以外，其含有10-30 mM缓冲剂(优选为乙酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸或其组合)、1-15%多元醇以及0.001-0.05%润湿剂。组合物的pH为5-7.5之间。
WO2010148337(A1) ("Lyophilized formulation for small modularimmunopharmaceuticals")公开了已知为小免疫药剂蛋白(SMIP)的组合物。这些是由多重融合结构域(例如抗原-结合结构域、免疫球蛋白铰链区和Ig分子的CH2或CH3区或自其衍生的区域)组成的构建体。SMIP的结构域由多肽组成，所述多肽是基因序列的产物，其可以是人、非人或人工(使用基因技术方法所产生)来源。尽管SMIP蛋白优选为单特异性的，但该申请还公开了多特异性变体，例如蝎分子(Scorpion molecules)。它们含有SMIP蛋白，其具有进一步C端结合结构域。蝎分子的结合结构域优选结合至不同的目标结构且因此适于作为免疫特异性治疗剂。WO2010148337(A1)公开了冻干组合物的稳定制剂，其含有SMIP，其中少于7%的SMIP以团聚形式存在。所述制剂可进一步包含缓冲剂、稳定剂、填充剂、润湿剂和其它赋形剂。WO2009070642 A1公开了BiTE分子MT103的各种制剂，其第一结合结构域特异性结合至T细胞受体抗原CD3，而第二结合结构域特异性结合至B细胞抗原CD19。所述BiTE分子在7.0的pH在公开的组合物中是稳定的，至高达300 µg/ml的最大浓度。所用缓冲剂是柠檬酸盐。所述制剂适于静脉内和皮下施用。在皮下施用之后的生物利用度为10-50%。
IgG抗体具有大恒定区(CH1-3/CL 区)，这是其大部分物理化学特性的原因。具有不同特异性的IgG抗体在结构上主要在VL和VH 区内的高变抗体结合位点的区域(CDR1-CDR3)中不同。由于恒定区大，所以个别IgG变体之间的结构和物理化学差异相对地小。如IgG抗体，WO2010148337(A1)中所述的SMIP分子含有恒定抗体结构域的部分。
相比之下，具有不同特异性的BiTE分子在其物理化学特性上显著不同。作为由不同免疫球蛋白的两个单链可变片段(scFv)idR.构成的融合蛋白，它们缺乏恒定CH1-3/CL 区，因此在抗原-结合结构域中的差异涉及BiTE分子的区段比IgG或SMIP抗体的区段大得多。同样地，BiTE分子MT103和本发明中使用的BiTE分子主要在其分子结构上不同。尽管MT103中的结构域以顺序VL-VH-VH-VL排列，但本发明中优选使用的BiTE分子排列是形式VH-VL-VH-VL。此外，两种分子的顺序在许多位置处不同。
BiTE分子的这些特性及其小尺寸在不同BiTE分子的物理化学行为上产生明显差异。这导致需要针对各个别应用开发个别制剂(以增加物理化学稳定性)，这是由于无法使用个别BiTE或类似分子的制剂，或仅可以有限制地使用，用于替代应用。
在一个实施方案中，存在于组合物中的多肽是已知为双特异性T细胞衔接体(BiTE)的多肽。在一个特定实施方案中，BiTE具有特异性结合至T细胞受体-CD3复合体的ε链的第一结合结构域，以及特异性结合至前列腺-特异性膜抗原(PSMA)的第二结合结构域。PSMA是一种整合II型膜蛋白，其以高度特异性表达在前列腺上皮细胞上，且在前列腺癌的情况下强度增加。此外，PSMA由实体肿瘤的新形成血管表达。PSMA-BiTE因此介导细胞毒性T细胞和这些目标细胞之间的直接接触。
蛋白(例如BiTE分子)的团聚体形成在药物应用中是不期望的，例如生物活性成分的效力或利用度可能由于团聚体形成而改变。
这导致提供以抑制不期望的团聚体形成的方式容许BiTE分子稳定的制剂的目标。
解决方案描述于本申请和权利要求中，且涵盖BiTE制剂，其包含TRIS和磷酸盐。在其优选的实施方案中，所述制剂包含pH 6.0的50mM磷酸盐、100mM TRIS、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖二水合物，且能够就形成团聚体而言稳定具有PSMA-BiTE1分子的制剂。这适用于范围低于µg/ml的低浓度和>2mg/ml的高浓度两者。稳定效果对于本领域技术人员而言是令人惊讶的，因为，例如，在WO2009070642 A1中使用的柠檬酸盐，甚至作为pH 6.0的50mM柠檬酸盐和100mM TRIS的组合，也没有表现出该效果。例如，在相当的组合物(其仅含有柠檬酸盐取代磷酸盐)中所测量的二聚体分数为7.0%。相比之下，根据本发明的组合物将二聚体分数限制在0.8%(参见表6和7)。组合使用TRIS和磷酸盐是组合物的稳定效果的原因。为了也在剪切力方面稳定BiTE分子，需要浓度为至少0.04%的润湿剂诸如聚山梨醇酯80，因为二聚体分数否则将太大(约7.5%，见表15)。为了防止PSMA-BiTE1分子吸附在注射器、输注袋等的容器壁上，具有仅0.002%聚山梨醇酯80是足够的。
定义
如本文所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其各自包含经由二硫键而彼此连接的两个重(H)多肽链以及两个轻(L)多肽链。每一重链由可变区(VH )和恒定区组成，恒定区又由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每一轻链是由可变区(VL)和恒定区(CL )构成。轻链和重链两者的的可变区(VH和VL)在各情况下均进一步再分为三个超变抗体结合位点(CDR1-CDR3)，以及在CDR之间总共四个保守区(FR1-FR4)。
术语“单克隆抗体”描述源自相同的抗体群体的抗体，其除了相对少量的天然存在的突变或翻译后修饰以外是相同的。与作为免疫反应的部分出现的多克隆抗体相比之下，单克隆抗体针对特异性表位。
“双特异性”或“双功能性抗体”是一种人工、杂合抗体，其具有两对不同的重链和轻链，且还有两个不同的抗原-结合位点。
以木瓜蛋白酶处理抗体产生两个相同的抗原-结合Fab片段和可结晶Fc片段。“Fab片段”由完整的VL 链和部分重链(即含有可变区的VH结构域和第一恒定结构域CH1)组成。每一Fab片段因此具有个别的抗原-结合位点。“Fc片段”包含两个重链的羧基-端部分，其经由二硫键连接。Fc片段的部分被其它细胞的Fc受体所识别并经由其决定抗体的效应子功能。
胃蛋白酶在二硫键下切割抗体，而这样两个Fab片段经由铰链区保持连接并形成单一“F(ab')2 片段”。其具有两者抗原-结合位点且因此如完整抗体能够交联抗原。
术语“结构域”描述蛋白的球形区域，其具有定义并独立折叠的结构。IgG抗体的轻链由两个结构域构成(在各情况下，一个恒定结构域和一个可变结构域)；重链由四个结构域构成(在各情况下，三个恒定结构域和一个可变结构域)。两个可变区各自由重链的一个结构域和轻链的一个结构域构成。
术语“表位”或“抗原决定簇”描述抗体(或其抗原-结合片段)特异性结合的抗原区域。表位可由连续氨基酸，或者因为三级蛋白折叠而彼此紧邻的不连续氨基酸组成。
“抗原”是具有抗体可结合的“抗原决定簇”的分子(例如蛋白、多肽、肽和碳水化合物)。
术语“构型”是指蛋白或多肽(例如抗体、抗体链、结构域或其部分)的三级结构。
“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位，或对该结构“特异性”的抗体相当不那么有效地结合至替代结构。
术语“scFv抗体”在本申请中是指人工产生的抗体片段，其由抗体的共价键合的VH和VL结构域组成。两个结构域均存在于单一多肽链中并经由由多个氨基酸构成的多肽接头彼此连接。除了Fc-介导的效应子功能以外，scFv抗体保留抗体的所有功能，更特别是其选择性和亲和力。
“双特异性T细胞衔接体”(BiTE)分子是重组蛋白构建体，其由两个弹性连接的单链抗体(scFv)构成。所述scFv抗体之一特异性结合至选择的目标细胞表达的肿瘤抗原，第二种特异性结合至CD3，T细胞上的T细胞受体复合体的一个亚单位。BiTE抗体能够暂时地使T细胞结合至目标细胞，同时活化T细胞的细胞溶解活性。T细胞的BiTE-介导的活化既不需要T细胞上的特异性T细胞受体，也不需要目标细胞上的MHC I分子、肽抗原或共刺激分子。
术语“稳定性”和“稳定的”在含有BiTE分子的化合物的背景下描述抗体或其片段在涉及其生产、制备、储存、使用或运输的给定条件下对团聚、降解或片段化的抗性。根据本发明的“稳定”制剂在给定生产、制备、运输、使用和储存条件下保留其生物活性。
存在于溶液中的蛋白(例如BiTE分子)对于如在生产、填充和运输期间发生的机械运动是敏感的。超过特定强度的移动，分子会团聚和/或变性。含有蛋白的液体组合物因此在机械运动期间暴露于已知为搅动应激下。在“搅动应激测试”中，对含有蛋白的液体组合物使用受控制的机械(搅动)力来分析不同组合物中溶解蛋白的团聚和变性行为。
蛋白在搅动应激测试中的行为是其对剪切力(如例如在溶液以套管抽吸和注射期间发生)的物理稳定性的指标。
“冻干”描述一种干燥方法，其基于升华的原理。待干燥的物质首先冷却低至约-45℃，随后施加真空而物质加热至约-20℃。结果，冰晶直接升华至气态而未经过液体中间步骤。以这种方式干燥的物质在第二干燥步骤之后(仍在真空下)在约25℃含有少于5%的其初始水分且被称为“冻干物”。
在施用于患者之前，冻干物进行“重构(rekonstituieren)”，即溶解于药学上可接受的稀释剂。“重构制剂”在本发明的背景下通过将冻干的抗体制剂溶于此类稀释剂中而形成。抗体随后呈溶解的形式并可被施用于患者。
“多元醇”描述一组有机化合物，其含有多个羟基(-OH)(多元醇、多羟基醇)。多元醇诸如蔗糖或海藻糖是能够稳定抗体和/或影响组合物的摩尔渗透压浓度的糖。
为了防止蛋白在冻干期间不期望的降解或团聚，添加所谓的“冻干保护剂”。这些是，例如，糖或糖醇，诸如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。在本发明的背景下，海藻糖是优选使用的冻干保护剂。
术语“润湿剂”在本文中是指任何具有亲水区和疏水区的去污剂且包括非离子型、阳离子型、阴离子型和两性离子型去污剂。可用去污剂涵盖，例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(也已知为聚山梨醇酯80或TWEEN 80)、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯(也已知为聚山梨醇酯20或TWEEN 20)或N-月桂基肌氨酸。对于本文公开的组合物，优选非离子型润湿剂。对于本发明的组合物，尤其优选使用聚山梨醇酯80。润湿剂可以0.002%至0.1%的浓度使用。
术语“缓冲剂”在本文中描述缓冲的溶液，在添加酸性或碱性物质后其pH仅略微改变。缓冲的溶液含有弱酸和其对应碱或弱碱和其对应酸的混合物。
术语“患者”是指接受预防性或治疗性治疗的(人或动物)个体。
术语“治疗”在本文中是指使用或施用治疗性物质至患者，或使用或施用治疗性物质至患者的分离组织，或至患者的细胞系，所述患者正患有疾病，显示疾病的症状，或具有疾病的易患性，其中目标在于治愈、改善、影响、中止或减轻疾病、其症状或疾病的易患性。
“有效剂量”在文中描述活性成分量，以该量可至少部分地实现所需效果。因此“治疗有效剂量”定义为足以至少部分地治愈疾病，或至少部分地在患者体内消除由疾病引起的副作用的活性成分量。对于该目的实际所需的量取决于疾病严重性和患者的总体免疫状态。
术语“生物利用度”，如本文所使用，描述活性成分或医药产品剂量在全身性循环中未被改变而可利用的百分比。生物利用度因此是表明活性成分多快以及在何种程度被吸收以及在作用部位可利用的测量值。通过定义，静脉内施用的医药产品具有100%的生物利用度。
绝对生物利用度描述以任何期望(非静脉内)方式施用的物质相比于静脉内施用的生物利用度，而相对生物利用度由特定剂型(例如口服相比于皮下)的生物利用度的比较产生。
“等张化合物”具有与人血液基本上相同的渗透压。因此，等张化合物因此具有通常约250至350mOsm的渗透压。术语“低张”描述具有低于人血液的渗透压的渗透压的组合物，而“高张”组合物具有高于人血液的渗透压的渗透压。
术语“高分子量团聚体”(同义字：“HMW”)描述由至少两种蛋白单体构成的团聚体。
本文所使用的术语“磷酸盐”是指水溶性、药理学上安全的三元正磷酸(H3PO4)的盐类，其中优选一级(氢-)和二级(二氢-)磷酸盐。根据本发明的组合物优选含有磷酸钠，特别优选磷酸氢二钠(Na2HPO4 )。
详述
本发明涉及双特异性T细胞衔接体(BiTE)分子的药物制剂，其特征在于其含有三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和磷酸盐。
BiTE分子在现有技术中是已知的。BiTE分子以它们暂时招募细胞毒性T细胞用于裂解特定目标细胞的方式来设计(参见Bäuerle et al. Curr Opin Mol Ther. 2009 Feb;11(1):22-30.)。它们特别适用于癌症疗法。
BiTE分子是包含两个scFv抗体结合结构域的多肽，其中第一scFv结合结构域能够结合至人CD3 ε，而第二scFv结合结构域结合第二个其它的表面抗原。优选癌细胞的人表面抗原。特别优选的表面抗原是癌细胞的人表面蛋白。scFv结合结构域可包含嵌合、人源化或人抗体片段。优选地，scFv结合结构域包含人类或人源化抗体片段。
本发明中使用的BiTE分子不同于例如WO2009070642 A1中所述的BiTE分子(例如MT103)，因为第一结合结构域可结合至人和白鬓狨(Callithrix jacchus)、棉冠獠狨(Saguinus oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3 ε链的表位，其中表位是选自SEQID NO: 1、2、3和4的氨基酸序列的部分，且该表位包含至少氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。这具有有助于临床前研究的优点，因为，例如，药代动力学或毒理学研究可以在前述测试动物中实施，测试动物的免疫系统类似于人的免疫系统。具有这些特征的BiTE分子公开于，例如，WO2008119566 A2或WO2008119567 A2。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物因此包含BiTE分子，其第一结合结构域可结合至人和白鬓狨、棉冠獠狨或松鼠猴CD3 ε链的表位，其中表位是选自SEQ ID NO: 1、2、3和4的氨基酸序列的部分，而该表位包含至少氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。
SEQ ID NO: 5显示符合上述标准的scFV结合结构域的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，该多肽的第一结合结构域包含SEQ ID NO: 5中再现的氨基酸序列。
scFV包含可变轻抗体链(VL)和可变重抗体链(VH)的氨基酸。BITE分子可以各种定向来构建。例如，BiTE分子MT103具有scFV的(VL-VH)结合结构域2-(VH-VL)结合结构域1排列。
其它定向也是可能的，例如(VH-VL)结合结构域2-(VH-VL)结合结构域1。
在一个优选的实施方案中，该多肽具有排列(VH-VL)结合结构域2-(VH-VL)结合结构域1。
在一个特别优选的实施方案中，该多肽具有排列(VH-VL)结合结构域2-(VH-VL)结合结构域1，其中(VH-VL)结合结构域1包含SEQ ID NO: 5中再现的氨基酸序列。
本发明的一个实施方案是液体药物组合物，其特征在于第二结合结构域可结合至细胞表面抗原。细胞表面抗原是在不使细胞裂解的情况下可被结合蛋白(例如抗体，或scFv)结合的抗原。
本发明的一个实施方案是液体药物组合物，其特征在于多肽的第二结合结构域可结合至癌细胞的表面抗原。
在一个进一步实施方案中，该多肽的第二结合结构域结合至人表面抗原前列腺特异性膜抗原(PSMA，SWISS-PROT：FOLH1_HUMAN，登录号：Q04609)。此类BiTE分子描述于，例如WO201037836 A2中。
SEQ ID NO: 6描述一种结合至PSMA的结合结构域。
在一个优选的实施方案中，多肽的第二结合结构域包含SEQ ID NO: 6中再现的氨基酸序列。
本发明的一个实施方案是包含多肽的液体药物组合物，该多肽包含第一scFv结合结构域和第二scFv结合结构域，其中第一结合结构域包含SEQ ID NO: 5中再现的氨基酸序列，其特征在于该组合物进一步包含TRIS和磷酸盐。
本发明的一个实施方案是液体药物组合物，其特征在于多肽的结合结构域包含人或人源化scFv抗体片段。
本发明的一个实施方案是液体药物组合物，其特征在于第二PSMA-结合结合结构域包含SEQ ID NO: 6中再现的氨基酸序列。
在一个实施方案中，多肽包含由SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6中再现的序列编码的第一结合结构域和第二结合结构域的氨基酸序列。
包含SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6中再现的序列的多肽再现于SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8中。
一种优选的多肽包含SEQ ID NO: 7中再现的氨基酸序列。
特别优选的多肽是PSMA-BiTE1分子，其由SEQ ID NO: 8中再现的氨基酸序列所编码。
本发明的一个优选的实施方案是液体药物组合物，其包含多肽、TRIS和磷酸盐，其中该多肽包含SEQ ID NO: 7中再现的氨基酸序列。
本发明的一个特别优选的实施方案是液体药物组合物，其包含多肽、TRIS和磷酸盐，其中该多肽包含SEQ ID NO: 8中再现的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含约0.5μg/ml、约0.7μg/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约10μg/ml、约15μg/ml、约18μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约30μg/ml、约30μg/ml、约35μg/ml、约40μg/ml、约45μg/ml、约50μg/ml、约55μg/ml、约60μg/ml、约70μg/ml、约80μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml、约110μg/ml、约120μg/ml、约130μg/ml、约140μg/ml、约150μg/ml、约160μg/ml、约170μg/ml、约180μg/ml、约190μg/ml、约200μg/ml、约225μg/ml、约275μg/ml、约300μg/ml、约325μg/ml、约350μg/ml、约375μg/ml、约400μg/ml、约500μg/ml、约700μg/ml、约900μg/ml或约1000μg/ml的上述多肽。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含0.5μg/ml、0.7μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、18μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml、225μg/ml、275μg/ml、300μg/ml、325μg/ml、350μg/ml、375μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、700μg/ml、900μg/ml或1000μg/ml的BiTE分子。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物包含约1mg/ml、约1.3mg/ml、约1.5mg/ml、约1.8mg/ml、约2mg/ml、约2.3mg/ml、约2.5mg/ml、约2.8mg/ml、约3mg/ml、约3.5mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml或约10mg/ml的BiTE分子。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物包含1mg/ml、1.3mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml、2.3mg/ml、2.5mg/ml、2.8mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml或10mg/ml的BiTE分子。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物包含约0.5μg/ml至约1μg/ml、约1μg/ml至约5μg/ml、约5μg/ml至约10μg/ml、约10μg/ml至约20μg/ml、约20μg/ml至约50μg/ml、约50μg/ml至约90μg/ml、约90μg/ml至约120μg/ml、约120μg/ml至约150μg/ml、约150μg/ml至约180μg/ml、约180μg/ml至约200μg/ml、约200μg/ml至约250μg/ml、约250μg/ml至约280μg/ml、约280μg/ml至约300μg/ml或约300μg/ml至约350μg/ml的BiTE分子。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物包含0.5μg/ml至1μg/ml、1μg/ml至5μg/ml、5μg/ml至10μg/ml、10μg/ml至20μg/ml、20μg/ml至50μg/ml、50μg/ml至90μg/ml、90μg/ml至120μg/ml、120μg/ml至150μg/ml、150μg/ml至180μg/ml、180μg/ml至200μg/ml、200μg/ml至250μg/ml、250μg/ml至280μg/ml、280μg/ml至300μg/ml或300μg/ml至350μg/ml的BiTE分子。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物包含约350μg/ml至约1mg/ml、约350μg/ml至约1.3mg/ml、约350μg/ml至约1.5mg/ml、约350μg/ml至约1.8mg/ml、约350μg/ml至约2mg/ml、约350μg/ml至约2.3mg/ml、约350μg/ml至约2.5mg/ml、约350μg/ml至约2.8mg/ml、约350μg/ml至约3.0mg/ml、约350μg/ml至约3.5mg/ml、约350μg/ml至约5mg/ml或约350μg/ml至约10mg/ml的BiTE分子。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物包含350μg/ml至1mg/ml、350μg/ml至1.3mg/ml、350μg/ml至1.5mg/ml、350μg/ml至1.8mg/ml、350μg/ml至2mg/ml、350μg/ml至2.3mg/ml、350μg/ml至2.5mg/ml、350μg/ml至2.8mg/ml、350μg/ml至3.0mg/ml、350μg/ml至3.5mg/ml、350μg/ml至5mg/ml或350μg/ml至10mg/ml的BiTE分子。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物包含0.5μg/ml至10mg/ml、0.5μg/ml至5mg/ml、0.5μg/ml至3.5mg/ml、0.5μg/ml至3.0mg/ml、0.5μg/ml至2.8mg/ml、0.5μg/ml至2.5mg/ml、0.5μg/ml至2.3mg/ml、0.5μg/ml至2.0mg/ml、0.5μg/ml至1.8mg/ml、0.5μg/ml至1.5mg/ml、0.5μg/ml至1.3mg/ml、0.5μg/ml至1.0mg/ml、0.5μg/ml至350μg/ml、0.5μg/ml至300μg/ml、0.5μg/ml至250μg/ml的BiTE分子。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物包含约0.5μg/ml至约10mg/ml、约0.5μg/ml至约5mg/ml、约0.5μg/ml至约3.5mg/ml、约0.5μg/ml至约3.0mg/ml、约0.5μg/ml至约2.8mg/ml、约0.5μg/ml至约2.5mg/ml、约0.5μg/ml至约2.3mg/ml、约0.5μg/ml至约2.0mg/ml、约0.5μg/ml至约1.8mg/ml、约0.5μg/ml至约1.5mg/ml、约0.5μg/ml至约1.3mg/ml、约0.5μg/ml至约1.0mg/ml、约0.5μg/ml至约350μg/ml、约0.5μg/ml至约300μg/ml、约0.5μg/ml至约250μg/ml的BiTE分子。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的根据本发明的多肽。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物包含三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和磷酸盐的组合物作为缓冲、影响pH的试剂。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含浓度为约10mM、或约20mM、或约30mM、或约40mM、或约50mM、或约60mM、或约70mM、或约80mM、或约90mM、或约100mM、或约150mM、或约200mM、或约250mM、或约300mM的TRIS，以及浓度为约10mM、或约20mM、或约30mM、或约40mM、或约50mM、或约60mM、或约70mM、或约80mM、或约90mM、或约100mM、或约150mM或约200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM、或200mM、或250mM，或300mM的TRIS，以及浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM或200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含浓度为约10mM、或约20mM、或约30mM、或约40mM、或约50mM、或约60mM、或约70mM、或约80mM、或约90mM、或约100mM、或约110mM、或约120mM、或约130mM、或约140mM、或约150mM、或约160mM、或约170mM、或约180mM、或约190mM或约200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或110mM、或120mM、或130mM、或140mM、或150mM、或160mM、或170mM、或180mM、或190mM或200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的根据本发明的多肽，以及浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM、或200mM、或250mM，或300mM的TRIS，与浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM或200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的根据本发明的多肽，以及浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM、或200mM、或250mM，或300mM的TRIS，与浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM或200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的根据本发明的多肽，以及浓度为约10mM、或约20mM、或约30mM、或约40mM、或约50mM、或约60mM、或约70mM、或约80mM、或约90mM、或约100mM、或约110mM、或约120mM、或约130mM、或约140mM、或约150mM、或约160mM、或约170mM、或约180mM、或约190mM或约200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的根据本发明的多肽，以及浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或110mM、或120mM、或130mM、或140mM、或150mM、或160mM、或170mM、或180mM、或190mM或200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的根据本发明的多肽，和浓度为约100mM的TRIS，以及浓度为约10mM、或约20mM、或约30mM、或约40mM、或约50mM、或约60mM、或约70mM、或约80mM、或约90mM、或约100mM、或约110mM、或约120mM、或约130mM、或约140mM、或约150mM、或约160mM、或约170mM、或约180mM、或约190mM或约200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的根据本发明的多肽，和浓度为约100mM的TRIS，以及浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或110mM、或120mM、或130mM、或140mM、或150mM、或160mM、或170mM、或180mM、或190mM或200mM的磷酸盐。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的根据本发明的多肽，和浓度为约50mM的磷酸盐，和浓度为约10mM、或约20mM、或约30mM、或约40mM、或约50mM、或约60mM、或约70mM、或约80mM、或约90mM、或约100mM、或约150mM、或约200mM、或约250mM、或约300mM的TRIS，以及浓度为约10mM、或约20mM、或约30mM、或约40mM、或约50mM、或约60mM、或约70mM、或约80mM、或约90mM、或约100mM、或约150mM或约200mM的TRIS。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的根据本发明的多肽，和浓度为约50mM的磷酸盐，和浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM、或200mM、或250mM、或300mM的TRIS，以及浓度为10mM、或20mM、或30mM、或40mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM、或100mM、或150mM或200mM的TRIS。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物的pH在约5.0至约7.0的范围内，或在约5.0至约6.5的范围内。特别优选地，根据本发明的组合物的pH为6.0。优选地，根据本发明的组合物的pH使用HCl来调整。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物另外包含润湿剂。润湿剂的实例是非离子型润湿剂，诸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；辛基葡萄糖苷钠；月桂基、肉豆蔻基、亚麻基或硬脂基磺基甜菜碱；月桂基肌氨酸、肉豆蔻基肌氨酸、亚麻基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亚麻基、肉豆蔻基或十六烷基甜菜碱；月桂酰胺基丙基、椰油酰胺基丙基、亚麻酰胺基丙基、肉豆蔻酰胺基丙基、棕榈酰胺基丙基或异硬脂酰胺基丙基甜菜碱；聚乙二醇；聚丙二醇；和乙二醇和丙二醇的共聚体(例如Pluronics、PF68)。在一个优选的实施方案中，润湿剂是聚山梨醇酯80。
在又一个实施方案中，根据本发明的化合物包含浓度为0.002%至0.1%，优选0.04%至0.1%的润湿剂。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含浓度为0.002%至0.1%，优选0.04%至0.1%的聚山梨醇酯80。特别优选地，根据本发明的组合物包含浓度为0.04%的聚山梨醇酯80。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物另外包含冻干保护剂。在又一个实施方案中，根据本发明的组合物另外包含糖或糖醇作为冻干保护剂。冻干保护剂优选为海藻糖或海藻糖二水合物。在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含浓度为2%至10%，特别优选4%的冻干保护剂。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含浓度为2%至10%，特别优选4%的海藻糖。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含浓度为2%至10%，特别优选4%的海藻糖二水合物。
特别优选地，根据本发明的组合物包含约0.5μg/ml至约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约50mM至约200mM的TRIS、浓度为约20mM至约100mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖二水合物，且pH为6.0。
特别优选地，根据本发明的组合物包含约0.5μg/ml至约2mg/ml的PSMA-BiTEl分子和浓度为约50mM至约200mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖二水合物，且pH为6.0。
特别优选地，根据本发明的组合物包含约0.5μg/ml至约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约20mM至约100mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖二水合物，且pH为6.0。
特别优选地，根据本发明的组合物包含约50μg/ml至约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖二水合物，且pH为6.0。
特别优选地，根据本发明的组合物包含约50μg/ml至约1mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖二水合物，且pH为6.0。
特别优选地，根据本发明的组合物包含约100μg/ml至约500μg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖二水合物，且pH为6.0。
特别优选地，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖二水合物，且pH为6.0。
特别优选地，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的Na2HPO4、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖二水合物，且pH为6.0。
优选地，根据本发明的组合物包含约0.5μg/ml至约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约50mM至约200mM的TRIS、浓度为约20mM至约100mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖，且pH为6.0。
优选地，根据本发明的组合物包含约0.5μg/ml至约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约50mM至约200mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖，且pH为6.0。
优选地，根据本发明的组合物包含约0.5μg/ml至约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约20mM至约100mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖，且pH为6.0。
优选地，根据本发明的组合物包含约50μg/ml至约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖，且pH为6.0。
优选地，根据本发明的组合物包含约50μg/ml至约1mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖，且pH为6.0。
优选地，根据本发明的组合物包含约100μg/ml至约500μg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖，且pH为6.0。
优选地，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的磷酸盐、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖，且pH为6.0。
优选地，根据本发明的组合物包含约2mg/ml的PSMA-BiTE1分子和浓度为约100mM的TRIS、浓度为约50mM的Na2HPO4、浓度为0.04%的聚山梨醇酯80以及浓度为4%的海藻糖，且pH为6.0。
以百分比(%)计的指明浓度是指以质量计的浓度(质量/体积)。
此外，根据本发明的组合物可又进一步含有药学上可接受的添加剂(Remington’sPharmaceutical Sciences; 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA, USA)。此类添加剂是，例如，防腐剂或抗氧化剂。可使用的抗氧化剂是，例如，抗坏血酸盐、甲硫氨酸、维生素E或偏亚硫酸钠。防腐剂是，例如，抑制或减缓微生物生长的物质。此类物质是，例如，硫柳汞。
本发明的一个实施方案是固体混合物，其通过冻干根据本发明的组合物而产生，或至少可通过冻干所述组合物而获得。
本发明的一个优选的实施方案是通过冷冻干燥根据本发明的组合物而获得的冻干物。
本发明的一个优选的实施方案是根据实施例16中所述的方案通过冷冻干燥根据本发明的组合物而产生的冻干物。
在又一个实施方案中，根据本发明的组合物由通过溶解于合适的液体介质中而重构冻干固体混合物而提供。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物由通过溶解于水(优选为无菌水)中而重构冻干固体混合物而提供。
本发明进一步提供含有根据本发明的组合物之一和优选还含有使用说明的产品。在一个实施方案中，该产品包含含有上列组合物中之一的容器。可用容器是，例如，瓶、小瓶、管或注射器。容器可以，例如，由玻璃或塑料制成。注射器可包含注射针头，其由，例如，金属制成。
在一个实施方案中，该容器是注射器。在又一个实施方案中，该注射器包含在注射装置中。在一个优选的实施方案中，该注射装置是自动注射器。自动注射器可以描述为注射仪器，其在活化后施用其内含物而不需要由患者或另一人额外操作。在本发明中，施用优选为皮下。
对于BiTE分子，根据本发明的组合物相比于现有技术中可用的制剂表现出稳定性增加和生物利用度明显增加。由于该特性概况，根据本发明的组合物尤其适用于肠胃外施用。肠胃外施用尤其包括静脉内注射或输注、动脉内注射或输注(至动脉中)、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、腹膜内注射或输注、骨内施用或注射至组织中。根据本发明的组合物尤其适用于皮下施用。根据本发明的组合物的一个实施方案的特征在于在皮下施用组合物后，多肽的生物利用度为>60%；优选地，这是在食蟹猴中的生物利用度。
根据本发明的组合物具有有价值的药理学特性且可用于预防和治疗人和动物中的疾病。
根据本发明的组合物通常适于在人中和在哺乳动物中治疗过度增生性疾病。可使用根据本发明的组合物治疗的过度增生性疾病尤其包括癌症和肿瘤疾病的组群。在本发明的背景下，这些被理解为尤其意指以下疾病，但不限于此：乳腺癌和乳腺肿瘤(腺管和小叶形式，还有原位)、呼吸道的肿瘤(小细胞性和非小细胞性癌、支气管癌)、脑肿瘤(例如脑干的肿瘤或下丘脑的肿瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤和神经外胚层和松果腺肿瘤)、消化器官(食道、胃、胆囊、小肠、大肠、直肠)的肿瘤、肝脏肿瘤(尤其是肝细胞癌、胆管癌和混合型肝细胞胆管癌)、头部和颈部区域(喉、下咽、鼻咽、口咽、唇和口腔)的肿瘤、皮肤肿瘤(鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、恶性黑色素瘤、梅克尔细胞皮肤癌和非黑色素瘤皮肤癌)、软组织肿瘤(尤其是软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤)、眼部肿瘤(尤其是眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤)、内分泌腺和外分泌腺(例如甲状腺和副甲状腺、胰腺和唾腺)的肿瘤、泌尿道肿瘤(膀胱、阴茎、肾脏、肾盂和输尿管的肿瘤)以及生殖器官的肿瘤(女性中的子宫内膜、子宫颈、卵巢、阴道、阴唇和子宫的癌和男性中的前列腺和睾丸的癌)。这些也包括实体形式或如循环血液细胞的增生性血液疾病，诸如淋巴瘤、白血病和骨髓增生性疾病，例如急性骨髓性、急性淋巴母细胞性、慢性淋巴细胞性、慢性骨髓性和毛细胞白血病，和AIDS相关淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和中枢神经系统中的淋巴瘤。
可使用根据本发明的组合物治疗的优选疾病是表达PSMA抗原的癌症和/或转移。
可使用根据本发明的组合物治疗的特别优选疾病选自：前列腺癌、前列腺癌的骨转移和前列腺癌的软组织转移。
可使用根据本发明的组合物治疗的其它特别优选疾病是前列腺癌。
这些在人中充分说明的疾病在其它哺乳动物中也可出现相当的病因学且可使用本发明的组合物治疗。
在本发明的背景下，术语“治疗(Behandlung)”或“治疗(behandeln)”在常规意义上使用并意指目的在于对抗、降低、减弱或减轻疾病或健康异常，和改善由该疾病(如例如在癌症的事件中)而损害的生活质量来照料、照顾和护理患者。
因此，本发明进一步提供根据本发明的组合物用于治疗和/或预防疾病，更具体地上述疾病的用途。
本发明进一步提供根据本发明的组合物用于制造用于治疗和/或预防疾病，更具体地上述疾病的药品的用途。
本发明进一步提供根据本发明的组合物在用于治疗和/或预防疾病，更具体地上述疾病的方法中的用途。
本发明进一步提供用于使用有效量的根据本发明的化合物之一治疗和/或预防疾病，更具体地上述疾病的方法。
在一个优选的实施方案中，治疗和/或预防是肠胃外施用根据本发明的组合物。特别优选皮下施用。
根据本发明的组合物可单独使用，或者是如果需要，与一种或多种其它药理活性物质组合使用，条件是该组合不导致不期望和不可接受的副作用。因此，本发明进一步提供含有根据本发明的组合物的至少一种和一种或多种其它活性成分的药品，其特别用于治疗和/或预防上述疾病。例如，本发明的化合物可与已知的抗过度增生物质、细胞抑制物质或细胞毒性物质组合用于治疗癌症疾病。
本发明进一步提供上述组合物在治疗性方法中的用途，该组合物适于肠胃外施用形式，诸如静脉内注射或输注、动脉内注射或输注(至动脉内)、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、腹膜内注射或输注、骨内施用或注射至组织中。
本发明进一步提供上述组合物在用于治疗性治疗前列腺细胞增生性疾病的方法中的用途。
本发明进一步提供上述组合物在用于治疗性治疗前列腺细胞增生性疾病的方法中的用途，该组合物适用于皮下施用。
本发明进一步提供上述组合物在用于治疗性治疗前列腺细胞增生性疾病的方法中的用途，该组合物通过皮下施用而施用。
本发明进一步提供用于稳定多肽的方法，其包括产生上述组合物之一，除了该多肽以外，其含有至少TRIS和磷酸盐且具有6.0的pH。
本发明进一步提供包含上述组合物的药剂盒。
在本发明的背景下的优选化合物是药物化合物。
实施方案
本发明的一个实施方案包含液体药物组合物，其包含多肽、TRIS和磷酸盐，所述多肽包含两个scFv抗体结合结构域，第一scFv结合结构域能够结合至人CD3 ε。
在所述组合物的又一个实施方案中，所述多肽的第二结合结构域可结合至细胞表面抗原。
在所述组合物的又一个实施方案中，所述多肽包含可结合至癌细胞的表面抗原的第二结合结构域。
在又一个实施方案中，所述多肽的第二结合结构域可结合的表面抗原是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
在所述组合物的又一个实施方案中，所述多肽具有排列(VH-VL)结合结构域2-(VH-VL)结合结构域1。
在所述组合物的又一个实施方案中，所述多肽的第一结合结构域包含SEQ ID NO:5中再现的氨基酸序列。
在所述组合物的又一个实施方案中，所述多肽的第二、PSMA-结合结合结构域包含SEQ ID NO: 6中再现的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，所述组合物包含多肽、TRIS和磷酸盐，所述多肽包含SEQ IDNO: 7中再现的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，所述组合物包含多肽、TRIS和磷酸盐，所述多肽包含SEQ IDNO: 8中再现的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至5mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至3.5mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至3.0mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至2.5mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至2.0mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至1.8mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至1.5mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至0.35mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至0.3mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至0.25mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至0.2mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物包含浓度为50μg/ml至1mg/ml的PSMA-BiTE1。
在又一个实施方案中，所述组合物包含浓度为50μg/ml至500μg/ml的PSMA-BiTE1。
在又一个实施方案中，所述组合物包含浓度为100μg/ml至500μg/ml的PSMA-BiTE1。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为约2mg/ml的多肽。
在又一个实施方案中，所述组合物含有浓度为约50mM至约200mM的TRIS和浓度为约20mM至约100mM的磷酸盐。
在又一个实施方案中，所述组合物含有100mM TRIS和50mM磷酸盐。
在又一个实施方案中，所述组合物的pH在约5.0至约7.0的范围内。
在又一个实施方案中，所述组合物的pH在约5.0至约6.5的范围内。
在又一个实施方案中，所述组合物的pH在约5.5至约6.5的范围内。
在又一个实施方案中，所述组合物的pH为约6.0。
在又一个实施方案中，所述组合物的pH使用盐酸来调整。
在又一个实施方案中，所述组合物另外含有润湿剂。
在又一个实施方案中，所述润湿剂为聚山梨醇酯80。
在又一个实施方案中，所述组合物另外含有0.002%至0.1%聚山梨醇酯80。
在又一个实施方案中，所述组合物另外含有0.04%至0.1%聚山梨醇酯80。
在又一个实施方案中，所述组合物另外含有0.04%聚山梨醇酯80。
在又一个实施方案中，所述组合物另外含有冻干保护剂。
在又一个实施方案中，所述组合物含有海藻糖或优选海藻糖二水合物作为冻干保护剂。
在又一个实施方案中，所述组合物另外含有4%至10%海藻糖或优选4%至10%海藻糖二水合物。
在又一个实施方案中，所述组合物另外含有约4%海藻糖或优选另外含有约4%海藻糖二水合物。
在一个优选的实施方案中，所述组合物具有6的pH且包含50μg/ml至1mg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸盐、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖二水合物。
在一个优选的实施方案中，所述组合物具有6的pH且包含50μg/ml至500μg/mlPSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸盐、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖二水合物。
在一个优选的实施方案中，所述组合物具有6的pH且包含50μg/ml至500μg/mlPSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM Na2HPO4、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖二水合物。
在又一个实施方案中，所述组合物具有6的pH且包含50μg/ml至1mg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸盐、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖。
在又一个实施方案中，所述组合物具有6的pH且包含50μg/ml至500μg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸盐、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖。
在又一个实施方案中，所述组合物具有6的pH且包含50μg/ml至500μg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM Na2HPO4、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖。
在所述组合物的一个优选的实施方案中，所述多肽在冻干、随后重构并储存(在2-8℃7天且随后在20℃ +- 5℃16小时，如实施例21中所述)之后具有至少90%且优选至少96%的生物活性(优选通过如实施例21中所述的基于细胞的活性测定而确定)。
在所述组合物的一个优选的实施方案中，所述多肽在冻干并储存3个月或12个月之后具有至少90%且优选至少96%的生物活性(优选通过如实施例21中所述的基于细胞的活性测定而确定)。
在所述组合物的一个优选的实施方案中，所述多肽在冻干并在6℃储存3个月或在6℃储存12个月之后具有至少97%的生物活性(优选通过如实施例21中所述的基于细胞的活性测定而确定)。
在所述组合物的一个优选的实施方案中，所述多肽在由注射导致的剪切力作用之后具有超过96%的单体含量(SEC)(优选依照实施例18a而确定)。
在所述组合物的一个优选的实施方案中，所述多肽在由使用针头缓慢或快速注射导致的剪切力作用之后具有不超过4%的二聚体和多聚体含量(SEC)(优选依照实施例18a而确定)。
在所述组合物的一个优选的实施方案中，所述多肽在由使用针头(规格：30G；针头长度：13mm)缓慢或快速注射导致的剪切力作用之后具有不超过4%的二聚体和多聚体含量(SEC)(优选依照实施例18a而确定)。
本发明的一个实施方案包含可通过冻干液体组合物而获得的固体混合物。
在又一个实施方案中，所述组合物通过将根据本发明的冻干固体混合物溶解于合适液体介质中而重构。
在又一个实施方案中，所述多肽在皮下施用组合物之后的生物利用度为>60%。
在又一个实施方案中，所述组合物用于治疗性方法中。
在又一个实施方案中，所述组合物用于治疗性方法中，所述方法包括肠胃外施用所述组合物。
在又一个实施方案中，所述组合物用于治疗性治疗过度增生性疾病的方法中。
在又一个实施方案中，所述组合物用于治疗性治疗前列腺过度增生性疾病的方法中。
在又一个实施方案中，所述组合物用于治疗性治疗前列腺过度增生性疾病的方法中，所述方法包括皮下施用所述组合物。
在又一个实施方案中，本发明包含用于稳定多肽的方法，其包括产生除了多肽以外含有至少TRIS和磷酸盐并具有6.0的pH的组合物。
在又一个实施方案中，本发明包含含有上述组合物的药剂盒。
优选实施方案为
1. 液体药物组合物，其包含多肽、TRIS和磷酸盐，所述多肽包含两个scFv抗体结合结构域，所述第一scFv结合结构域能够结合至人CD3 ε。
2. 根据实施方案1的组合物，其特征在于所述多肽的第二结合结构域可结合至细胞表面抗原。
3. 根据实施方案2的组合物，其特征在于所述多肽包含可结合至癌细胞的表面抗原的第二结合结构域。
4. 根据实施方案2或3中任一项的组合物，其特征在于所述表面抗原是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
5. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述多肽具有排列(VH-VL)结合结构域2 -(VH-VL)结合结构域1 。
6. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述多肽的第一结合结构域包含SEQ ID NO: 5中再现的氨基酸序列。
7. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述多肽的第二、PSMA结合结合结构域包含SEQ ID NO: 6中再现的氨基酸序列。
8. 液体药物组合物，其含有多肽、TRIS和磷酸盐，所述多肽包含SEQ ID NO: 7中再现的氨基酸序列。
9. 液体药物组合物，其含有多肽、TRIS和磷酸盐，所述多肽包含SEQ ID NO: 8中再现的氨基酸序列。
10. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至5mg/ml的多肽。
11. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至3.5mg/ml的多肽。
12. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至3.0mg/ml的多肽。
13. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至2.5mg/ml的多肽。
14. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至2.0mg/ml的多肽。
15. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至1.8mg/ml的多肽。
16. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至1.5mg/ml的多肽。
17. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至0.35mg/ml的多肽。
18. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至0.3mg/ml的多肽。
19. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至0.25mg/ml的多肽。
20. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至0.2mg/ml的多肽。
21. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物包含浓度为50μg/ml至1mg/ml的PSMA-BiTE1。
22. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物包含浓度为50μg/ml至500μg/ml的PSMA-BiTE1。
23. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物包含浓度为100μg/ml至500μg/ml的PSMA-BiTE1。
24. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为约2mg/ml的多肽。
25. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为约50mM至约200mM的TRIS和浓度为约20mM至约100mM的磷酸盐。
26. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物含有100mMTRIS和50mM磷酸盐。
27. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物的pH在约5.0至约7.0的范围内。
28. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物的pH在约5.0至约6.5的范围内。
29. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物的pH在约5.5至约6.5的范围内。
30. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物的pH为约6.0。
31. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物的pH使用盐酸来调整。
32. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物另外含有润湿剂。
33. 根据实施方案32的组合物，其特征在于所述润湿剂是聚山梨醇酯80。
34. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物另外含有0.002%至0.1%聚山梨醇酯80。
35. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物另外含有0.04%至0.1%聚山梨醇酯80。
36. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物另外含有0.04%聚山梨醇酯80。
37. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物另外含有冻干保护剂。所述组合物优选含有2-10%冻干保护剂，优选为4%。
38. 根据实施方案37的组合物，其特征在于所述冻干保护剂是海藻糖。所述冻干保护剂优选为海藻糖二水合物。
39. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物另外含有4%至10%海藻糖二水合物。
40. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物另外含有约4%海藻糖二水合物。
41. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物具有6的pH且包含50μg/ml至1mg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸盐、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖二水合物。
42. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物具有6的pH且包含50μg/ml至500μg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM磷酸盐、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖二水合物。
43. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述组合物具有6的pH且包含2mg/ml PSMA-BiTE1、100mM TRIS、50mM Na2HPO4、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖二水合物。
44. 可通过冻干根据前述实施方案中任一项的液体组合物而获得的固体混合物。
45. 液体药物组合物，其特征在于所述组合物通过将根据实施方案44的冻干固体混合物溶解于合适液体介质中而重构。
46. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述多肽在冻干、随后重构并储存(在2-8℃7天且随后在20℃ +- 5℃16小时，如实施例21中所述)之后具有至少90%且优选至少96%的生物活性(优选通过如实施例21中所述的基于细胞的活性测定而确定)。
47. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其中所述多肽在冻干并储存3个月或12个月之后具有至少90%且优选至少96%的生物活性(优选通过如实施例21中所述的基于细胞的活性测定而确定)。
48. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其中所述多肽在冻干并在6℃储存3个月或在6℃储存12个月之后具有至少97%的生物活性(优选通过如实施例21中所述的基于细胞的活性测定而确定)。
49. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其中所述多肽在由注射导致的剪切力作用之后具有超过96%的单体含量(SEC)(优选依照实施例18a而确定)。
50. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其中所述多肽在由使用针头缓慢或快速注射导致的剪切力作用之后具有不超过4%的二聚体和多聚体含量(SEC)(优选依照实施例18a而确定)。
51. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其中所述多肽在由使用针头(规格：30G；针头长度：13mm)缓慢或快速注射导致的剪切力作用之后具有不超过4%的二聚体和多聚体含量(SEC)(优选依照实施例18a而确定)。
52. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其特征在于所述多肽在皮下施用组合物之后的生物利用度为>60%。
53. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其用于治疗性方法中。
54. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其用于治疗性方法中，所述方法包括肠胃外施用所述组合物。
55. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其用于治疗性治疗过度增生性疾病的方法中。
56. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其用于治疗性治疗前列腺过度增生性疾病的方法中。
57. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其用于治疗性治疗前列腺过度增生性疾病的方法中，所述方法包括皮下施用所述组合物。
58. 用于稳定根据实施方案1-9中至少一项的多肽的方法，其包括产生除了多肽以外含有至少TRIS和磷酸盐并具有6.0的pH的组合物。
59. 药剂盒，其包含实施方案1-57中任一项的组合物。
60. 根据前述实施方案中任一项的组合物，其中所述液体药物组合物是水性药物组合物，优选为无菌水性药物组合物。
61. 注射器，其含有根据前述实施方案中任一项的组合物。
实施例
实施例1：缓冲剂筛选以改善PSMA-BiTE1分子的热稳定性
使用差示扫描荧光测定法(DSF)来测量具有最低分子量的PSMA-BiTE1蛋白结构域在不同缓冲系统中的平均熔点(Tm1)。其是一种所检查蛋白在各种缓冲系统中的稳定性的量度：Tm值越大，蛋白的热稳定性也越大。蛋白的热稳定性越大，则其越适于产生稳定的药物制剂。
对于缓冲剂筛选，使用范围为pH 5.0至8.0的pH的标准缓冲剂。所产生的制剂的PSMA-BiTE1浓度为约0.2mg/ml。平均熔点通过DSF方法来确定。
表1：不同缓冲系统(50 mM)中的PSMA-BITE1 (0.2 mg/ml)
基于柠檬酸盐和Na 2 HPO 4 的缓冲系统关于增加PSMA-BiTE1蛋白结构域的熔点表现出积极效果。在进一步实验中追踪柠檬酸盐和Na 2 HPO 4 的积极效果。
单独的基于三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的缓冲剂没有导致蛋白熔点的明显增加(表2)。
表2：各种缓冲系统(50 mM)中的PSMA-BiTE1 (0.2 mg/ml)(续表1)
如表1，表2还显示具有最低分子量的PSMA-BiTE1蛋白结构域在不同缓冲系统中的平均熔点(Tm)，如通过差示扫描荧光测定法所确定。Tm值为57.7℃至64.6℃。通过组合各种缓冲系统，不能达到较高的Tm值。
在pH 5.5-6.5的磷酸盐缓冲剂中和在pH 5.0-6.5的柠檬酸盐缓冲剂中的PSMA-BiTE1制剂表现出最高熔点(根据DSF方法，Tm>63.0℃)。
实施例2：非离子型表面活性剂对PSMA-BiTE1团聚体形成的影响
PSMA-BiTE1分子在搅动应激测试之后在所有测试缓冲系统中都形成团聚体。团聚的PSMA-BiTE1分子引起T细胞活化的效率无法预测或控制，或仅可在有限程度上预测或控制。因此，必须找到防止由于搅动应激或剪切力作用所导致的团聚体形成的稳定剂。在搅动应激测试中，各种非离子型表面活性剂(例如聚山梨醇酯80或20)稳定PSMA-BiTE1分子且可防止团聚变得显而易见。0.01至0.04%(质量/体积)的表面活性剂浓度对于稳定是足够的(参见表3-7)。
实施例3：在多价阳离子存在的情况下的PSMA-BiTE1二聚体形成
在PSMA-BiTE1制剂浓缩期间，PSMA-BiTE1团聚体比例的增加无法通过添加非离子型表面活性剂而得到防止。
因此，检查在多价阳离子(例如Mg2+和Ca2+)存在的情况下PSMA-BiTE1分子的静电稳定。多价离子对于溶解蛋白的表面电位具有直接影响且因此可以稳定或甚至去稳定的方式来发挥作用。
可以使用氯化镁稳定PSMA-BiTE1分子。在浓缩之后，PSMA-BiTE1二聚体比例仅可被忽略地增加并维持低于<3%(表3)。单体和二聚体的比例经由大小排除层析(SEC)来测量。
表3：在浓缩之后(50 mM Na 2 HPO 4 和50 mM 赖氨酸, pH 7.3中)的PSMA-BiTE1分子
浓缩期间的添加剂 蛋白含量 [mg/ml] 单体 [%] 二聚体 [%]
- 2.04 95.7 4.3
0.04% (质量/体积)聚山梨醇酯 20 2.09 91.2 8.8
100 mM MgCl 2 2.13 98.1 1.9
SEC = 大小排除层析。
然而，添加较高浓度的无机盐在药学上不是安全的，和/或所述添加剂代表在冷冻-干燥中的一个挑战。由于该原因，寻找稳定PSMA-BiTE1分子且同时是药学上安全的替代赋形剂。
实施例4：鉴定用于稳定PSMA-BiTE1单体的替代赋形剂
随机地，将各种氨基酸及其衍生物尤其包括在以较高浓度稳定PSMA-BiTE1单体的测试中。氨基酸及其衍生物不是无机盐且因此被分类为药学上安全的。这些物质中的一些(例如赖氨酸)在浓缩期间和之后对PSMA-BiTE1分子的稳定性表现出令人惊讶的积极影响(表4)。
表4：浓缩之后在pH 7.3的PSMA-BiTE1分子
SEC=大小排除层析：DLS=动态光散射；在搅动应激之后的混浊溶液表明高比例的BiTE团聚体，澄清或最少混浊溶液(状态“OK”)表明低程度的团聚。
通过在磷酸盐缓冲剂中添加赖氨酸和组氨酸，PSMA-BiTE1分子可以在没有形成不可接受比例的二聚体(≥5%)的情况下浓缩。然而，二聚体比例低(<5%)的制剂在搅动应激测试期间是不稳定的，且这可以由溶液呈混浊来识别(测试体积1和2；“混浊”表明团聚，“OK”表明少或没有团聚)。
实施例5：pH对PSMA-BiTE1分子的稳定性的影响
为了检查pH对二聚体形成的影响，产生具有pH 6.0的制剂。其表现出与pH 7.3的制剂相当的二聚体比例。此外，在搅动应激期间的二聚体比例也是稳定的，且其明显缺乏呈混浊(表5)。为了额外寻找合适的稳定剂和制剂，使用pH 6.0的积极影响。
表5：浓缩之后在pH 6.0的PSMA-BiTE1分子
SEC=大小排除层析：DLS=动态光散射。
PSMA-BiTE1在pH 6.0的磷酸盐缓冲剂中的稳定性是令人惊讶的。在包含50mMNa 2 HPO 4 、50mM赖氨酸、0.04%聚山梨醇酯20和10%海藻糖二水合物(pH 6.0)的制剂中可以将分子突然浓缩至1.6mg/ml，而不会因为搅动应激作用而产生团聚。
实施例6：检查缓冲剂组合物
在又一个实验中，检查关于通过添加剂诸如精氨酸、TEA或TRIS组合磷酸盐来增加PSMA-BiTE1分子稳定性的可能协同效果。在缓冲剂组合50mM Na 2 HPO 4 、100mM TRIS(pH 6.0)的情况下，产生0.8%的最低比例的PSMA-BiTE1二聚体。制剂在搅动应激后也是足够稳定的，且这可以由溶液不呈混浊来识别(表6)。TRIS的稳定效果是令人惊讶的，因为在蛋白的情况下添加均由于其稳定(即降低团聚)效果而已知的精氨酸或TEA在PSMA-BiTE分子的情况下不具有稳定效果。
表 6：浓缩之后在各种pH 6.0 的添加剂存在的情况下的PSMA-BiTE1分子
SEC = 大小排除层析; DLS = 动态光散射。
如实施例1中所示，使用柠檬酸盐缓冲剂导致PSMA-BiTE1分子的热稳定性增加。然而，在浓缩测试体积之后，柠檬酸盐缓冲的测试体积中的二聚体比例基本上比使用磷酸盐缓冲剂的那些更高(表7相比于表6)。磷酸盐缓冲剂因此比柠檬酸盐缓冲剂更适合用于在浓缩期间将PSMA-BiTE1二聚体形成降至最低。此外，制剂中的柠檬酸盐可导致玻璃层离且不应该再使用。
表 7：浓缩之后在pH 6.0的PSMA-BiTE1 分子
SEC = 大小排除层析; DLS = 动态光散射。
实施例7：PSMA-BiTE1分子在TRIS-磷酸盐缓冲系统中的热稳定性
测量以下制剂的具有最小分子量的PSMA-BiTE1蛋白结构域的平均熔点(Tm1)：
0.2mg/ml PSMA BiTE，在50mM Na2HPO4、100mM TRIS、0.04%聚山梨醇酯80、4%海藻糖二水合物、pH 6.0(以HCl调整)中。借助DSC测量61.1℃的Tm1。
实施例8：搅动应激对磷酸盐/TRIS制剂中的PSMA-BiTE1分子的影响
通常，BiTE分子通过搅动应激而在物理上不稳定，即它们形成团聚体，其可经由动态光散射(DLS)而检测到。团聚体的形成甚至发生在约0.2mg/ml的低BiTE浓度。相比之下，在蛋白含量低于0.2mg/ml的情况下，BiTE分子渐增地吸附至容器壁。
通过添加表面活性剂(例如聚山梨醇酯20或80)，在一些缓冲系统中(例如在基于磷酸盐和赖氨酸的缓冲剂中)可以防止PSMA-BiTE1分子吸附至容器壁(例如注射器、输注袋等的壁)，且同样在静止状态形成团聚体。聚山梨醇酯80必须以至少0.002%的浓度存在于组合物中，以防止PSMA-BiTE1分子的吸附。
通过将PSMA-BiTE1分子溶解于pH 6.0的具有表面活性剂添加剂的磷酸盐缓冲剂中，可以在静止状态和在搅动应激作用期间防止团聚体的形成。就将团聚体的形成降至最低而言，前述制剂(pH 6.0的具有表面活性剂添加剂的磷酸盐缓冲剂)优于具有赖氨酸的制剂。
表 8：在搅动应激之后PSMA-BiTE1团聚体的形成；所有样品都含有0.2 mg/mlPSMA-BiTE1 分子和0.02% (质量/体积) 聚山梨醇酯 80
*团聚体 ** 单体 99.6%；二聚体 0.4%。
实施例9：PSMA-BiTE1团聚对浓度的依赖性
在标准缓冲系统中，二聚体和多聚体的比例随着PSMA-BiTE1分子的浓度而增加。然而，在用于治疗用途的制剂中，二聚体和多聚体仅有限程度上是可接受的，因为它们可影响制剂和治疗性蛋白的有效性并且引起不期望的免疫作用。通常，二聚体被限制为最大5%的值并试图尽可能保持低于该值。多聚体和低分子量(LMW)片段同样应当降至最低，或者根本不存在。单体/二聚体比率，以及多聚体和低分子量片段的比率使用大小排除层析(SEC)来测量。
使用包含50mM Na 2 HPO 4 和100mM TRIS(pH 6.0)的缓冲系统，可以在浓缩期间足够有效地降低PSMA-BiTE1分子间的二聚体和多聚体的形成。
该缓冲系统使其可能产生具有>2mg/ml的含量的稳定BiTE制剂(表9)。
表 9：50 mM Na 2 HPO 4 以及100 mM TRIS(pH 6.0)中的PSMA-BiTE1分子
蛋白含量 [mg/ml] 0.321 0.333 0.530 0.883 1.308 1.330 2.138 3.228
单体 [%] 98.17 98.30 97.89 95.15 98.33 95.95 96.28 96.97
二聚体 [%] 0.58 0.42 1.18 1.71 1.14 1.92 2.26 2.03
多聚体 [%] < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05
LMW [%] 1.24 1.28 0.93 3.14 0.53 2.14 1.45 1.00
LMW = 低分子量片段。
实施例10：海藻糖和聚山梨醇酯对PSMA-BiTE1稳定性的影响
添加海藻糖和聚山梨醇酯没有导致增加的二聚体、多聚体或LMW片段的形成，其可借助SEC测量来测定。
实施例10a：海藻糖以及聚山梨醇酯对PSMA-BiTE1稳定性的影响
添加海藻糖二水合物和聚山梨醇酯没有导致增加的二聚体、多聚体或LMW片段的形成(表10)。
表10: 在有/没有海藻糖和聚山梨醇酯 80的情况下，50 mM Na 2 HPO 4 和100 mM TRIS(pH 6.0)中的PSMA-BiTE1分子
聚山梨醇酯 80 (% 质量/体积) - 0.04% - 0.04%
海藻糖二水合物 (% 质量/体积) - - 4% 4%
蛋白含量 [mg/ml] 1.209 1.235 1.191 1.217
SEC 单体 [%] 98.3 98.3 98.5 98.2
二聚体 [%] 1.6 1.7 1.5 1.7
多聚体 [%] 0.1 0.1 < 0.05 0.1
LMW [%] < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05
实施例11：PSMA-BiTE1分子的储存稳定性
PSMA-BiTE1分子的储存稳定性可基于二聚体和/或多聚体比例随着储存时间增加来测定。这些团聚体比例增加越快，则储存稳定性越低。
实验显示，浓度为90μg/ml、500μg/ml和2mg/ml的PSMA-BiTE1分子在形成二聚体和/或多聚体方面持续9天的期间是稳定的。制剂在约2-8℃保持在注射器中，随后在室温(约20℃)保持4至16小时的起始期。除了PSMA-BiTE1分子以外，组合物含有50mM Na 2 HPO 4 、100mM TRIS、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖。PSMA-BiTE1单体的比例使用SEC-HPLC测量并与在实验开始时(即在第0天)的PSMA-BiTE1单体的比例相比较。
实施例11a：PSMA-BiTE1分子的储存稳定性
PSMA-BiTE1分子的储存稳定性可基于二聚体和/或多聚体的比例随着储存时间增加来测定。这些团聚体比例增加地越快，则储存稳定性越低。
实验显示，浓度为90μg/ml、500μg/ml和2mg/ml的PSMA-BiTE1分子在形成二聚体和/或多聚体方面持续9天的期间是稳定的(表11)。制剂在约2-8℃保持在注射器中，随后在室温(约20℃)保持4至16小时的起始期。除了PSMA-BiTE1分子以外，组合物含有50mMNa 2 HPO 4 、100mM TRIS、0.04%聚山梨醇酯80和4%海藻糖二水合物。PSMA-BiTE1单体的比例使用SEC-HPLC测量并与在实验开始时(即在第0天)的PSMA-BiTE1单体的比例相比较。在具有90μg/ml和500μg/ml的PSMA-BiTE1起始浓度的组合物的情况下9天后，该相对纯度为100%，即单体的比例未随着该时间降低。在具有2mg/ml PSMA-BiTE1分子的组合物的情况下，9天后的相对纯度为97%，绝对对应于单体减少约3%(从第0天的97.58%至第9天的94.81%)。
表11：借助SEC-HPLC，PSMA-BiTE分子经9天期间的纯度(即单体的比例)的测定
在其它实验中，在具有2mg/ml的PSMA-BiTE1浓度的液体制剂中在2-8℃经一周期间，二聚体比例存在2.5%(3%至5.5%)的适度增加，伴随多聚体的稳定比例(表12)。在该浓度下，PSMA-BiTE1分子因此持续足够长的时间是稳定的，以确保填充几乎没有损失且使用几乎没有损失。
对于长期储存(即持续远长于一周的期间的储存)，PSMA-BiTE1溶液却可以冷冻(-80℃)或冻干以确保其稳定性。在保留生物活性的情况下冻干含有PSMA-BiTE1的制剂是可能的，如实施例17中所示。
表12: BiTE制剂在 2-8℃的储存稳定性 (PSMA-BiTE1浓度2 mg/ml)
实施例12：pH对PSMA-BiTE1稳定性的影响
原则上，在pH 5.0和7.5之间的pH范围内，PSMA-BiTE1分子在含有TRIS、磷酸盐(在这种情况下：Na2HPO4)、海藻糖和聚山梨醇酯的所选制剂中是稳定的。然而，在高于pH 6的pH，二聚体的比例在剪切应激之后增加。
实施例12a：pH对PSMA-BiTE1稳定性的影响
原则上，在pH 5.0和7.5之间的pH范围内，PSMA-BiTE1分子在含有TRIS、磷酸盐(在这种情况下：Na2HPO4)、海藻糖二水合物和聚山梨醇酯的所选制剂中是稳定的。然而，在高于pH 6的pH，二聚体的比例(>2%)在剪切应激之后增加(表13)。
表13：在50 mM Na 2 HPO 4 , 100 mM TRIS, pH [可变]; 4% (质量/体积)海藻糖二水 合物, 0.04% (% 质量/体积)聚山梨醇酯 80中每ml 的2 mg PSMA-BiTE1分子
实施例13：TRIS和磷酸盐对PSMA-BiTE1稳定性的影响
关于制剂中的不同缓冲剂强度的研究显示，制剂中的缓冲剂强度可变化：就将PSMA-BiTE1二聚体形成降至最低而言，在pH 6，从20至100mM Na2HPO4以及从50至200mMTRIS是有用的。所有组合均容许浓缩和剪切应激作用。
在剪切应激作用之后，在TRIS不存在的情况下，不能浓缩PSMA-BiTE1分子，而在Na2HPO4不存在的情况下，二聚体的比例增加至超过>2%。此外，磷酸盐缓冲剂在pH 6.0表现出良好的缓冲作用并支持PSMA-BiTE1分子的热稳定性。
表14：在[可变] Na 2 HPO 4 , [可变] TRIS, pH 6.0, 4% (质量/体积) 海藻糖二水 合物, 0.04% (质量/体积)聚山梨醇酯 80中的2 mg/ml PSMA-BiTE1 分子
实施例14：各种润湿剂对PSMA-BiTE1稳定性的影响
各种聚山梨醇酯可以针对剪切应激而稳定制剂中的PSMA-BiTE1分子。然而，使用聚山梨醇酯80达到最佳结果。其它稳定剂诸如，例如，Synperonic F68同样具有积极效果。
0.04%至0.10%(质量/体积)聚山梨醇酯80在剪切应激期间对PSMA-BiTE1分子具有良好的稳定效果。0.004%(质量/体积)聚山梨醇酯在此不足以防止在剪切应激作用之后二聚体形成的不可接受的增加。
表15：在50 mM Na 2 HPO 4 , 100 mM TRIS, pH 6.0, 4% (质量/体积) 海藻糖二水合 物, [可变] 润湿剂中的2 mg/ml PSMA-BiTE1分子
实施例15：PSMA-BiTE1浓度对制剂稳定性的影响
使用制剂50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%(质量/体积)海藻糖、0.04%(质量/体积)聚山梨醇酯80，可产生至多达2mg/ml的PSMA-BiTE1浓度。在较高的PSMA-BiTE1浓度，二聚体的比例显著增加。然而，仅在高于4mg/ml的PSMA-BiTE浓度且在剪切力作用之后测量到不可接受的值(在约11.2mg/ml的PSMA-BiTE浓度，9.25%二聚体)。
实施例15a：PSMA-BiTE1浓度对制剂稳定性的影响
使用制剂50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%(质量/体积)海藻糖二水合物、0.04%(质量/体积)聚山梨醇酯80，可产生至多达2mg/ml的PSMA-BiTE1浓度。在较高的PSMA-BiTE1浓度，二聚体的比例显著增加。然而，仅在高于4mg/ml的PSMA-BiTE浓度且在剪切力作用之后测量到不可接受的值(在约11.2mg/ml的PSMA-BiTE浓度，9.25%二聚体)。
表16：在50 mM Na 2 HPO 4 , 100 mM TRIS, pH 6.0, 4% (质量/体积)海藻糖二水合 物, 0.04% (质量/体积)聚山梨醇酯 80中的[可变] mg/ml PSMA-BiTE1 分子
实施例16：冻干
在完成PSMA-BiTE1组合物之后，将其冻干。许多冷冻干燥单元可用于该目的，例如来自SP Scientific的Genesis Super XL。冷冻干燥通过将物质冷冻且随后将冰升华而不经过液相来实现。
表17：用于冷冻干燥 PSMA-BiTE 制剂的程序 (总时间：42 h).
Ts [℃] t [min] 真空[µbar] 斜变(Rampe)/维持
冷冻期
1 室温 0 - 维持
2 -45 30 - 斜变
3 -45 240 - 维持
主要干燥
1 -20 60 100 斜变
2 -20 1000 100 维持
二次干燥
1 25 60 10 斜变
2 25 1140 10 维持
“斜变” = 连续温度增加或下降。
在冷冻期中，将产物以“斜变”冷却，即在30min内从室温连续至-45℃。为了完全冰冻产物溶液，将该温度维持240min。
其随后是主要干燥期。在100µbar的室真空，将组合物在60min内加热至-20℃。将该温度维持1000min；然后完成主要干燥。对于随后的二次干燥，将组合物在10µbar的真空中加热至25℃。将这些条件维持1140min以移除残余水分降至≤ 2% (借助Karl Fischer滴定检测)。
在干燥过程结束时，将该单元减压并密封冻干容器。
实施例17a：长期储存和重构之后PSMA-BiTE1冻干物的生物活性
将含有PSMA-BiTE1分子的组合物(表18a)作为冻干物储存在2-8℃和在25℃/60%相对空气湿度至多12个月。在3和12个月之后，从各情况的冻干物重构溶液并在基于细胞的活性测定中进行分析。测量(借助来自Promega的CytoTox-Glo细胞毒性测定)揭示在前述条件下6和12个月储存之后生物活性均未改变。
此外，分析重构的PSMA-BiTE1溶液的储存稳定性。在重构之后，首先将溶液储存在冰箱(2-8℃)中7天，然后在室温(+20±5℃)储存16小时。随后，在此还借助基于细胞的活性测定确定PSMA-BiTE1分子的生物活性。在前述进一步储存之后，其在重构溶液中为96%。
PSMA-BiTE1分子在冻干制剂中的生物活性因此在前述储存条件下经6-12个月储存之后是稳定的。同样适用于在2-8℃储存7天和在室温储存16小时之后由冻干物重构的溶液。
实施例17b：长期储存和重构之后PSMA-BiTE1冻干物的两种代表性批次的稳定性- 在单体(SEC和CGE)、生物活性(基于细胞的活性测定)和颗粒(HIAC和MFI)方面
将含有PSMA-BiTE1分子的组合物(表18a)作为冻干物储存在2-8℃和在25℃/60%相对空气湿度至多12个月。在3和12个月之后，从各情况的冻干物重构溶液并在尤其基于细胞的活性测定中进行分析。测量(借助来自Promega的CytoTox-Glo细胞毒性测定)揭示在前述条件下储存3和12个月之后未改变的活性，以及单体比例在SEC和CGE方面仅稍微改变。
此外，借助微流体成像(MFI)和HIAC(表18c)测量大小范围为>2至>25μm的蛋白颗粒。两个批次的值在储存期间在测量精确度限值内维持稳定。
表18a: 冷冻干燥产物的组成。各无色注射玻璃小瓶含有以下组成的冻干物:
a 该量包括0.3 ml 过量填充。
所述冻干物用1.2ml注射用水重构。然后获得的用于施用的溶液具有2mg/ml的浓度。因为过量填充，小瓶含有1.3ml，具有2.6mg PSMA-BITE1。
表18b 两个批次的根据本发明的PSMA-BITE1制剂的稳定性
批次1 SEC (单体) CGE (还原) CGE (未还原) 生物活性
起始 97.3% n.d. n.d. 101%
3个月, 6℃ n.d. n.d. n.d. n.d.
3个月, 25℃/60 n.d. n.d. n.d. n.d.
12个月, 6℃ 96.9% 99.54% 122.3%
12个月, 25℃/60 95.8% 99.51% 100% 100%
批次2 SEC (单体) CGE (还原) CGE (未还原) 生物活性
起始 98.0% 92.8%
3个月, 6℃ 97.8% 136%
3个月, 25℃/60 97.7% 131.2%
12个月, 6℃ 97% 100 100 123.5%
12个月, 25℃/60 96.71% 100 100 112.7%
表18c: 两个批次的根据本发明的PSMA-BITE1制剂的稳定性 (蛋白颗粒)
此外，分析重构的PSMA-BiTE1溶液的储存稳定性。在重构后，首先将溶液在冰箱(2-8℃)中储存7天并随后在室温(+20±5℃)储存16小时。随后，在此还借助基于细胞的活性测定确定PSMA-BiTE1分子的生物活性。在前述进一步储存之后，其在重构溶液中为96%。
在前述储存条件下储存经3至12个月之后，PSMA-BiTE1分子随后在冻干制剂中的生物活性在各情况下在测量精确度限值内是稳定的。其它测量参数(SEC、生物活性、MFI和HIAC数值)也显示该结果。这同样适用于在2-8℃储存7天和在室温储存16小时之后由该冻干物重构的溶液。
实施例18：在借助注射器和导管的施用中剪切应激对PSMA-BiTE1二聚体形成的影响
组成：2.17mg/ml PSMA-BiTE1分子、50mM Na 2 HPO 4 、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖、0.04%聚山梨醇酯80。
材料：一次性注射器(BD 2ml)、导管(BD Microlance 30G1/2(REF：304000))和棕色玻璃小瓶(6R)和冷冻管(CryoTubes)。
程序：
解冻30个小瓶。6个小瓶用作起始值。对于每个实验，使用6个小瓶，即使用注射器/导管吸取且全部注射至棕色玻璃管或冷冻管。
实验：
1.缓慢注射PSMA-BiTE1组合物至冷冻管(SpL Cryo)中
2.缓慢注射PSMA-BiTE1组合物至棕色玻璃管(SpL Glass)中
3.快速注射PSMA-BiTE1组合物至冷冻管(SpL Cryo)中
4.快速注射PSMA-BiTE1组合物至棕色玻璃管(SpL Glass)中
随后，借助差示扫描荧光测定法(DSF)测量二聚体的形成。
实施例18a：借助注射器和导管的施用中剪切应激对PSMA-BiTE1二聚体形成的影响
组成：2.17mg/ml PSMA-BiTE1分子、50mM Na 2 HPO 4 、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖二水合物、0.04%聚山梨醇酯80。
材料：一次性注射器(BD 2ml)、导管(BD Microlance 30G1/2(REF：304000))和棕色玻璃小瓶(6R)和冷冻管。
程序：解冻30个小瓶。6个小瓶用作起始值。对于每个实验，使用6个小瓶，即使用注射器/导管吸取且全部注射至棕色玻璃管或冷冻管。
实验：
1.缓慢注射PSMA-BiTE1组合物至冷冻管(SpL Cryo)中
2.缓慢注射PSMA-BiTE1组合物至棕色玻璃管(SpL Glass)中
3.快速注射PSMA-BiTE1组合物至冷冻管(SpL Cryo)中
4.快速注射PSMA-BiTE1组合物至棕色玻璃管(SpL Glass)中。
表19：在由于注射所导致的剪切应激作用之后的PSMA-BiTE1二聚体的形成
起始 SpL冷冻 SpL 玻璃 SpL冷冻 SpL玻璃
PSMA-BiTE1浓度 [mg/ml] 2.17 2.21 2.16 2.19 2.16
SEC单体 [%] 96.6 96.5 96.4 96.4 96.4
SEC二聚体 [%] 3.3 3.4 3.5 3.4 3.4
SEC多聚体 [%] 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
借助差示扫描荧光测定法(DSF)测量二聚体形成。在借助注射器和导管注射组合物之后，未报道二聚体比例的显著升高。该结果显示，根据本发明的制剂在所有情况下就所产生的剪切力作用而言都是稳定的。
实施例19：在重构之后(在2-8℃至多28小时)和在2个稀释度以及2个温度(25℃)在0.9%盐水溶液中至多8小时，PSMA-BiTE1溶液的稳定性
单体、二聚体以及多聚体的比例借助SEC层析来测量。
组成：2.0mg/ml PSMA-BiTE1分子、50mM Na 2 HPO 4 、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖二水合物、0.04%聚山梨醇酯80。
材料：0.9% NaCl和注射用水。
程序：通过添加1.1ml注射用水(WFI)重构16个冻干的PSMA-BiTE1小瓶。在这些小瓶中，8个小瓶储存在2-8℃，4个小瓶用0.9% NaCl溶液稀释至0.066mg/ml的浓度，而4个小瓶用0.9% NaCl溶液稀释至0.66mg/ml的浓度。将它们在25℃孵育并在0h、2h、4h和8h的时间时借助SEC进行检查。
表20：在重构溶液的情况下，在0.9% NaCl溶液中稀释并在25℃孵育至多8小时，还有在2-8℃孵育至多28小时的情况下的PSMA-BiTE1 稳定性
如预期，使用WFI重构的样品再次显示二聚体的增加，其在2-8℃的2mg/ml溶液可被预期。单体减少明显与二聚体的增加相关，但是没有形成多聚体。
在0.9% NaCl溶液中稀释显示与PBS中的结果相当的结果。在0.666mg/ml的情况下，单体/二聚体比率维持恒定，但在0.066mg/ml的情况下，单体进而增加。
实施例20：在皮下施用的情况下关于PSMA-BITE1溶液稳定性的模型实验
为此，重构的PSMA-BiTE1溶液在2个稀释度和2个温度(25℃ & 37℃)在PBS中进行检查。借助SEC层析测量单体、二聚体和多聚体以及片段(LMW)的比例，以及借助MFI测量亚可见颗粒(SVP)。
组成：2.0mg/ml PSMA-BiTE1分子、50mM Na 2 HPO 4 、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖二水合物、0.04%聚山梨醇酯80。
材料：PBS。
程序：为了测定稀释的PSMA-BITE1溶液在sc施用条件下的稳定性，将八个冻干PSMA-BiTE1小瓶各自通过添加1.1ml WFI进行重构。使用PBS，将4个小瓶稀释至0.066mg/ml的浓度且将4个小瓶稀释至0.66mg/ml的浓度。将它们在25℃(对照)和37℃孵育并且在0h、2h、4h和8h的时间时借助SEC和MFI进行测量。
表20.1：在PBS中稀释且在25℃(上方)和37℃(下方)孵育至多8小时的情况下的PSMA-BiTE1 稳定性
用PBS稀释且在37℃在PBS中孵育显示PSMA-BiTE1分子在这些皮下施用的模拟条件下是稳定的。在0.66mg/ml的情况下，我们对于两种孵育温度具有稳定的单体/二聚体比率。相比之下，在0.066mg/ml的情况下，我们看到二聚体比例降低而单体比例增加的结果。这是可逆二聚体形成的效果，其是浓度和时间依赖性的。在SVP的情况下，存在SVP的稍微浓度、温度和时间依赖性的形成的趋势，然而其不代表稳定性问题。这显示制剂用于皮下施用的适用性。
实施例21：0.9% NaCl溶液中的PSMA-BiTE1稀释液用于剂量-范围发现研究的稳定性
用1.2ml WFI重构PSMA-BiTE1冻干物并与0.9%的NaCl溶液混合，将其调整至0.004%聚山梨醇酯80含量。为了避免高度稀释溶液的生物活性的丧失，这是必需的。因此，产生在50mM磷酸钠缓冲剂(pH 6.5)中的1%的聚山梨醇酯80溶液。将该溶液添加至商售的0.9%的NaCl溶液(例如Baxter Viaflo 250ml)以达到0.004%的最终浓度。使用该溶液，在以下步骤中产生范围为0.05μg/ml至2000μg/ml的PSMA-BiTE1的稀释液：
- 0.05μg/ml
- 0.7μg/ml
- 2μg/ml
- 18μg/ml
- 90μg/ml
- 500mg/ml
- 2000μg/ml。
因此，使用无菌、空输注袋(例如来自Impromediform GmbH, REF MF 1661的150ml袋)，初始将调理的盐水溶剂装入该输注袋中。将对应量的重构PSMA-BiTE1溶液添加至此溶液中并通过旋转该袋而混合。将1ml等分试样填充至2ml注射器(例如Injekt 2ml/LuerLock Solo Braun(REF 46067001V))并用来自B. Braun的Combi塞子(REF 4495101)密封。
然后将这些注射器储存在2℃至8℃的冰箱中至多9天。该储存包括在RT(20℃ +/-5℃)储存4或20小时。对于测量，用于皮下施用的注射针头(BD Microlance 3 30G1/2"0.3*13 mm)附接至注射器(REF 304000)并且通过其将溶液压至2ml小瓶(1型玻璃)中。
稀释溶液的生物活性在细胞毒性测定中检查。在(电化学发光测定)ECL测定中确定回收率(蛋白含量)。
由于ECL测定的测量范围有限，在分析之前必需如下将测定溶液在调理的0.9%的盐水溶液中稀释：
- 0.05μg/ml：未稀释
- 0.7μg/ml：1:50
- 2μg/ml：1:200
- 18μg/ml：1:1000。
表21a和b显示范围为0.05至18µg/ml PSMA-BiTE1的最终注射溶液经9天的储存期间的储存研究结果。蛋白浓度在所有最终浓度都维持稳定。相对浓度(相比于T0值)在79%至117%的范围内。基于用该物质类别的先前经验，相对于T0值的±40%至±50%差异性的接受基准是确认的。测量的数据非常好地落在该接受范围内。
表21a：通过ECL测定在0.05 µg/ml至18 µg/ml范围内的蛋白含量的测定
表21b：通过ECL测定在0.05 µg/ml至18 µg/ml范围内的相对浓度的测定
表21a和b中使用的缩写：
BiTE：PSMA-BiTE1分子
A：测定
Ave：平均值
T0值：在时间0的数值
对于CytoTox-Glo细胞毒性测定中的使用，必需使用测定介质来稀释测定溶液，如下：
18µg/ml：1:36
90µg/ml 1:180
500µg/ml 1:1000
2000µg/ml 1:4000
测定材料的生物活性表示为“相对生物活性”。其如下测定：
相对生物活性 = EC50 (参考标准品)
EC50 (测定对照)
表22显示，含有18 µg /ml至2000 µg /ml PSMA-BiTE1的最终输注溶液的生物活性经9天的储存期间保持稳定。相对生物活性在9天的储存时间期间相比于T0值变化，在77%-132%的范围内。这些结果都非常好地落在先前测定的50%至200%生物活性的接受范围内。
表22a：在18至2000 µg/ml范围内通过基于细胞的细胞毒性测定的相对效力的测定
表 22b：在18 至 2000 µg/ml范围内通过基于细胞的细胞毒性测定的相比于T0值的相对生物活性的测定
表22中使用的缩写：
BiTE：PSMA-BiTE1分子
A：测定
Ave：平均值
T0值：在时间0的数值。
稀释且储存9天的溶液的生物活性的差异相比于T0值不大于±33%。没有明显趋势表明在储存时间期间生物活性的明显丧失。含有18μg/ml PSMA-BiTE1的测定溶液在储存时间期间表现出生物活性的稍微降低，但是当考虑较高浓度的测定溶液时不能确认该趋势。
此外，在ECL测定中，18μg/ml的浓度在整个储存时间内没有表现出蛋白浓度的降低。
总之，可说明与使用的稀释条件和储存和施用系统相容的18-2000μg/ml的浓度范围内的PSMA-BiTE1的最终注射溶液在+2-8℃的温度储存至多9天(包括在+20±5℃储存至多20小时的期间)是可能的。
实施例22：在皮下施用之后PSMA-BiTE1的生物利用度
使用50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖、0.04%聚山梨醇酯80的制剂，可在皮下施用之后达到高生物利用度。PSMA-BiTE1分子的s.c.生物利用度在4只雌性食蟹猴中进行检查。用于s.c.施用的剂量为45μg/kg且将其与5和15μg/kg体重(BW)的i.v.施用相比较。用生理盐水溶液稀释2mg/ml储存溶液。i.v.施用的输注时间为1小时而输注速率为1ml/kg BW。所选的注射部位为浅静脉(小隐静脉(V. saphena parva))。对于s.c.施用，以0.15ml/kg BW将测试溶液注射至侧胸区中。使用ELISA测定检查血液水平。为此，使用ECL技术。该方法的定量下限(LLOQ)为4μg/l。
实施例22a：在皮下施用之后PSMA-BiTE1的生物利用度
使用50mM Na2HPO4、100mM TRIS、pH 6.0、4%海藻糖二水合物、0.04%聚山梨醇酯80的制剂，可在皮下施用之后达到66%生物利用度。PSMA-BiTE1分子的s.c.生物利用度在4只雌性食蟹猴中进行检查。用于s.c.施用的剂量为45μg/kg且将其与5和15μg/kg体重(BW)的i.v.施用相比较。用生理盐水溶液稀释2mg/ml储存溶液。i.v.施用的输注时间为1小时而输注速率为1ml/kg BW。所选的注射部位为浅静脉(小隐静脉)。对于s.c.施用，以0.15ml/kgBW将测试溶液注射至侧胸区。使用ELISA测定检查血液水平。为此，使用ECL技术。该方法的定量下限(LLOQ)为4μg/l。
方法
PSMA-BiTE分子的产生
用于产生BiTE分子(更具体地PSMA-BiTE分子)的方法，例如，描述于WO2010037836A2中。
首先，将编码PSMA-BiTE1的重组BiTE DNA构建整合入合适的表达载体中并从而稳定地引入真核CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中。用合适培养基将转染的CHO细胞在生物反应器中培养并通过过滤细胞来分离分泌蛋白。BiTE分子的纯化包括借助大小排除层析(SEC)用TRIS和磷酸盐替代缓冲物质并且随后借助超滤和渗滤进行浓缩。此外，添加多元醇(优选海藻糖)和润湿剂(优选聚山梨醇酯80)。将组合物储存在-60℃以下。
差示扫描荧光测定法(DSF)
使用750 Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)实施对PSMA-BiTE1分子的稳定性的测量(例如在剪切应激之后)。在96孔板(微量滴定板)中将不同的PSMA-BiTE1浓度(0.15和0.005mg/ml之间)与荧光染料(例如“Sypro® Orange 5000”)混合并在PCR系统(750 Fast Real-Time PCR系统, Applied Biosystems)中进行测量。温度从20℃增加至90℃。经由荧光检测确定蛋白的熔点，当荧光染料与蛋白的疏水性区域反应时，荧光以温度依赖性的方式产生。
差示扫描量热法(DSC)
PSMA-BiTE1分子的热去折叠温度(Tm)借助DSC来确定。为了该目的，将样品从20℃加热至105℃，并使用量热计来确定多肽的熔点。使用来自GE Healthcare的VP-DSC仪器。
搅动应激
在控温室(MMM, FrioCell 200)中通过在实验室振动器(IKA, HS 260)上搅动对样品进行应激。在300rpm和20℃ 24小时后确认团聚的关键质量参数。
目视检查
在剪切应激之后通过使溶液针对黑色背景放置并检查可见颗粒或浊度来目视检查PSMA-BITE溶液的稳定性。在搅动应激测试之后，澄清溶液表明较少或无二聚体和/或多聚体形成，而溶液的可见浊度与高比例的二聚体和/或多聚体有关。
动态光散射(DLS)
动态光散射是一种用于分析激光在溶解或悬浮样品上的散射光的方法。测量的是流体动力学半径，其进而使得可推断PSMA-BiTE1分子的团聚状态。流体动力学半径使用Horiba LB 550(Retsch Technology)来测量。
蛋白含量的测定
蛋白含量使用Nanodrop 2000(Thermo Scientific)在280nm分光光谱测量。所有样品都针对对应安慰剂或缓冲溶液对照来测量。
将各样品溶液(2µl)抽吸3x至Nanodrop仪器的测量区中并在每种情况下一式两份测量；其后，取这些测量值(n=6)的平均值。经由先前产生的蛋白校准函数(与蛋白含量相关的吸收依赖性)由平均测量值计算出蛋白含量[mg/ml]。
电化学发光测量(ECL测定)
关于该方法，使用SULFO-TAGTM标记，其在电化学刺激之后发光。在所谓的MULTI-ARRAY微量滴定板上的电极表面上实施刺激。发射的光是使用检测器在约620nm进行测量。
测量基于“夹心”方法，其中溶液中的PSMA-BiTE1分子已借助多克隆山羊抗-PSMA-BiTE1抗体而固定在微量滴定板上。五-His-生物素然后结合至固定的BiTE分子并借助SULFO-TAGTM-缀合的链霉抗生物素来检测。在Sector Imager 2400中读取样品。
大小排除层析(SEC)
为了测定单体和二聚体还有低分子量(LMW)和高分子量(HMW)级分的比例，使用HPLC系统实施大小排除层析。使用荧光检测器实施测量并借助面积百分比方法来实施计算。使用的柱是用于蛋白SEC的标准柱，例如Tosoh Biosep TSK凝胶G3000 SWXL 5μm，300mm长×7.8mm i.D.或等效材料。
在i.v.和s.c.施用后，血清中的PSMA-BITE1浓度的测定
PSMA-BITE1在食蟹猴血清中的浓度借助ELISA来测量。借助电化学发光来实施检测。检测限值(LLOQ)为0.98μg/l，其中精确度为3至28%而正确度为70至100%。
基于细胞的活性测定
基于细胞的细胞毒性测定用作关于测定PSMA-BiTE1样品的相对活性的常规测定。由于PSMA-BiTE1对人/食蟹猴CD3-阳性细胞和人/食蟹猴PSMA-阳性细胞的双特异性结合，在T细胞(效应子细胞)活化之后发生目标细胞的T细胞介导的裂解。
细胞毒性借助来自Promega的发光CytoTox-Glo细胞毒性测定来检测。此处使用的测量值是释放的光信号的量，其与死亡细胞数相关。其它活性测定描述于WO2010037836 A2中。
用于测定PSMA-BiTE1样品的相对活性的基于细胞的细胞毒性测定
PSMA-BiTE1多肽的浓度的测定(UV/VIS光谱学)
该方法根据欧洲药典(Ph. Eur., 2.2.25，在280nm的UV-VIS光谱学)实施且也适用于测定其它分子的浓度。
首先，实验测定PSMA-BiTE1分子的消光系数。为此，测定已知PSMA-BiTE1浓度的溶液的吸光度，基于PSMA-BiTE1分子的摩尔质量(1.8673 x 105 g/mol)建立浓度(以mol/l计)。基于吸光度、层厚度和浓度，可根据以下计算PSMA-BiTE1分子的消光系数e
e=A/c x d，其中
A=在合适波长(在这种情况下为280nm)的吸光度(或吸收，忽略光散射)
c=浓度(mol/l)
d=层厚度(mm)。
然后将吸光度在y轴上相对于x轴上的相关浓度作图以获得标准线。使用这些标准线，然后可基于吸光度直接读出PSMA-BiTE1溶液的浓度。
为了产生前述标准线，Beer-Lambert定律必须适用于所测量的溶液，即，尤其是吸收物质必须均质地分布在溶液中，吸光系数在所测量光谱范围内的变异必须是可忽略不计的，且必须将测量的溶液浓缩至足够低水平，使得相互作用相关的偏差不存在。
使用分子的消光系数，基于测量的吸光度(或在280nm的吸光度)，也可根据以下反算出蛋白浓度(以mol/l计)：
蛋白浓度[mol/l]=A x V/e x d，其中
A = 在280nm的吸光度
d = 以cm计的槽长度(标准槽，1.00cm)
V = 测试溶液的稀释度
e = PSMA-BiTE1在280nm的消光系数=111315 M-1 x cm-1。
序列表
<110> Bayer Pharma AG
<120> 用于多肽的制剂
<130> BHC 11 1 057
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
20 25
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 白鬓狨(Callithrix jacchus)
<400> 2
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Asp Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr
20 25
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> 棉冠獠狨(Saguinus oedipus)
<400> 3
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Asp Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr
20 25
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 松鼠猴(Saimiri sciureus)
<400> 4
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Ile Gly Asp Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr
20 25
<210> 5
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFV结合结构域CD3
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 6
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv结合结构域PSMA
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ile Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Pro Leu Leu Arg His Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
180 185 190
Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 7
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PSMA-BiTE
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ile Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Pro Leu Leu Arg His Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
180 185 190
Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
260 265 270
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
275 280 285
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
290 295 300
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn
325 330 335
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
340 345 350
Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
385 390 395 400
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly
405 410 415
Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly
420 425 430
Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly
435 440 445
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
450 455 460
Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val
465 470 475 480
Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
485 490 495
Val Leu
<210> 8
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PSMA-BiTE1的序列
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ile Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Pro Leu Leu Arg His Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
180 185 190
Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
260 265 270
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
275 280 285
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
290 295 300
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn
325 330 335
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
340 345 350
Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
385 390 395 400
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly
405 410 415
Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly
420 425 430
Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly
435 440 445
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
450 455 460
Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val
465 470 475 480
Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
485 490 495
Val Leu His His His His His His
500

Claims (13)

1.液体药物组合物，其包含多肽、TRIS和磷酸盐，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示，其特征在于：
所述组合物含有浓度为0.5μg/ml至3.0mg/ml的多肽，
所述组合物含有100mM TRIS和50mM磷酸盐，
所述组合物的pH值为6.0，且
所述组合物含有0.04％聚山梨醇酯80。
2.根据权利要求1的组合物，其特征在于所述组合物另外含有冻干保护剂。
3.根据权利要求2的组合物，其特征在于所述组合物含有2-10％的冻干保护剂。
4.根据权利要求2或3的组合物，其特征在于所述冻干保护剂是海藻糖或海藻糖二水合物。
5.根据权利要求1的组合物，其特征在于所述组合物另外包含4％海藻糖二水合物。
6.根据权利要求1的组合物，其特征在于所述组合物含有浓度为2mg/ml的多肽。
7.固体混合物，其可通过冻干根据权利要求2-5中任一项的液体组合物而获得。
8.液体药物组合物，其特征在于所述组合物通过将权利要求7的冻干的固体混合物溶解于液体介质中而重构。
9.根据权利要求1的组合物，其特征在于所述多肽在皮下施用组合物之后的生物利用度为＞60％。
10.根据权利要求1-6和8-9中任一项的组合物在制备用于治疗性治疗前列腺过度增生性疾病的药物中用途。
11.根据权利要求10的用途，所述药物用于肠胃外施用。
12.根据权利要求10或11的用途，所述药物用于皮下施用。
13.注射器，其含有根据权利要求1-6和8-9中任一项的组合物。
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