CN117244049A - 病原体疫苗及其生产和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了疫苗组合物和制备这种组合物的方法。本发明的其他实施方案包括治疗病原体感染的方法，针对病原体感染对受试者接种疫苗的方法，以及在需要的受试者中治疗抗生素抗性细菌感染的方法。在进一步的实施方案中，本发明包括降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法，增加具有病原体感染的受试者的存活率的方法，降低与病原体感染相关的疼痛水平的方法，以及在需要的受试者中降低与病原体感染相关的痛苦程度的方法。本文还提供了新型支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体组合物及其用途。
Description
本申请是申请日为2017年2月16日和发明名称为“病原体疫苗及其生产和使用方法”的201780010619.2号发明申请的分案申请。
相关申请
本申请要求于2016年5月31日提交的美国临时专利申请第62/343,448号和2016年2月16日提交的美国临时专利申请第62/295,711号的优先权，每个前述申请的全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在DARPA N66001-11-1-4180的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
传染病由进入并在活生物体内繁殖的病原微生物(如病毒、细菌、真菌等)引起。治疗传染病的常用策略包括给患有或易患此类感染的患者施用抗微生物药物，如抗病毒药物或抗生素，或使用免疫疗法如疫苗接种。
然而，在一些情况下，通过使用现有抗微生物药物不能容易地根除病原微生物，因为这些微生物可能获得对药物的抗性，或者药物可能对患者造成不同程度的不良反应。因此，已知的抗生素和抗病毒剂在其抗微生物活性、体内性能、安全性或抑制耐药性微生物的能力方面并不完全令人满意。疫苗通过与身体的天然防御系统一起工作来帮助其安全地产生针对病原体的免疫力而降低感染风险。虽然疫苗被认为是公共卫生可用的最有效的工具之一，但是存在着与用于治疗或预防传染病的疫苗相关的某些局限性。例如，开发针对病原体感染的疫苗通常需要鉴定或分离病原体。在其中特定病原体未知或病原体的分离存在很大困难的情况下，疫苗的制备将是巨大的挑战并且可能需要长得多的时间。此外，病原体的抗原性容易改变，并且对于具有携带不同表面抗原的多种菌株的病原体，疫苗株和感染株之间的抗原结构的不一致将是重要的问题。当与所施用的疫苗不同的菌株引起传染病时，疫苗接种变得无效。此外，在某些疫苗中已观察到病原体渗漏(pathogen leakage)，并在受试者体内引起不希望的副作用和重度炎症。
因此，传染病仍然是主要的公共卫生威胁，且也是全世界疾病、残疾和死亡的主要原因。因此，仍然存在对开发治疗传染病的新型治疗策略和疫苗的持续和未满足的需求。
发明内容
本发明至少部分地基于以下发现：使用调理素或凝集素(例如工程化的凝集素或其片段)分离的病原体或病原体相关分子模式(PAMP)可用于产生治疗传染病的功能性疫苗。特别地，本发明人惊奇地发现，当其与生物活性剂(例如佐剂)和/或支架组合时，使用工程化凝集素分离的病原体或病原体相关分子模式(PAMP)允许快速地产生高效力病原体疫苗(图1)。当其用于对动物接种疫苗时，单剂的这些疫苗导致被接种的动物中病原体滴度显著降低，并且在用致死剂量的细菌感染动物后显著延长存活时间。实际上，如实施例1中所示，单剂的本发明疫苗组合物可以在90天的时间内保护接种疫苗的小鼠免受细菌攻击。此外，调理素或凝集素，例如工程化的凝集素或其片段，不仅起到分离病原体以用于疫苗组合物并将病原体呈递给免疫细胞而引发免疫应答的作用，而且也用作锚结构以固定病原体，从而防止病原体从疫苗组合物泄漏，并防止目前随病原体渗漏发生的任何不希望的副作用。
本发明的疫苗组合物具有优于现有疫苗的额外改进。例如，本发明的疫苗组合物允许快速和直接分离来自患有传染病的患者的血液样品中循环的病原体(包括已知和未知的病原体)，存在于其他生物体液中的病原体，或存在于体外培养物中的病原体。要求保护的疫苗组合物还可针对难以分离和纯化的病原体使用。一旦病原体从受试者分离出来，疫苗组合物可以在世界上的任何地方以快速和方便的方式容易地制备，并且可以及时地，例如在一天内，供患者使用。此外，使用所要求保护的疫苗组合物的疫苗接种可以以更可控、局部和更安全的方式发生，而不损害疫苗组合物的功效。所要求保护的疫苗提高的稳定性使得它们是便携的并且可以用于在室温下长期储存而无需冷藏。此外，当组合物中包含超过一种类型的病原体时，疫苗组合物可以是多价疫苗，并且还可以用于针对给定病原体的不同种类或菌株接种疫苗。此外，如果植入的话，疫苗组合物可以在疫苗接种后容易地从受试者移除。例如，在疫苗接种后引发过多的免疫应答或不希望的副作用的情况下，可以容易地从受试者移除植入的疫苗组合物。相反，目前现有的疫苗一旦被引入受试者中就不能被除去。这些改进规避了当前病原体疫苗的主要局限性，并且对公众是非常有意义的，特别是在流行病时期，例如，对于发展中国家的人群，或者对于军事用途具有重要价值，其中在这些地方容易获得的疫苗是非常需要的。实际上，快速产生不仅易于储存和处理，而且可以以更安全和更可控的方式施用并赋予长期保护作用的功能性和高度稳定的疫苗的能力使得本发明的疫苗组合物比现有疫苗显著有利。
因此，在一个方面，本发明提供了疫苗组合物。该疫苗组合物包含调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，和能够在受试者中募集免疫细胞的生物制剂。
在一些实施方案中，该生物制剂选自于白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、Fms相关酪氨酸激酶配体(FTL)-3配体、CCL19、CCL21、M-SCF、MIF、CD40L、CD3、ICAM、转化生长因子(TGF)-β、胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
在一些实施方案中，该生物制剂包含佐剂。在其他的实施方案中，该佐剂选自于胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、卵清蛋白(OVA)、单磷酰脂质A(MPL)、聚(I:C)、MF59、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙、Quil A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、FIA、montanide、佐剂65、lipovant、聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球、石蜡油、角鲨烯、病毒体、AS03、AS04、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、STING、Toll样受体配体、CD40L、病原体相关分子模式(PAMP)、损伤相关分子模式分子(DAMPs)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、抗免疫抑制分子的抗体(例如，针对转化生长因子(TGF)-β的抗体或拮抗剂，A2aR拮抗剂)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
在一些实施方案中，该凝集素结合的病原体构建体包含凝集素、凝集素的一部分、工程化的凝集素或其部分。在一些实施方案中，凝集素是胶原凝集素。在其他实施方案中，凝集素是ficollin。在一些实施方案中，凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。在其他实施方案中，凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基81-228。在另一个实施方案中，凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基111-228。在一些实施方案中，甘露糖结合凝集素(MBL)能够结合病原体。在一些实施方案中，该凝集素包含表面活性蛋白D(Surfactant ProteinD)(SPD)。在其他实施方案中，该表面活性剂蛋白D(SPD)能够结合病原体。
在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含免疫球蛋白(IgG)Fc部分。
在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含固体基质。在其他实施方案中，固体基质选自于磁珠、微孔膜、中空纤维反应器、血液过滤膜和血流装置。在一些实施方案中，该固体基质是磁珠。在其他实施方案中，病原体以约1pg至约1000μg的量存在于所述固体基质上。
在一些实施方案中，所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
在一些实施方案中，所述细菌选自于鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、脆弱拟杆菌(Bacterioides fragilis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus infb)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)(MDR/CRE)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒杆菌(paratyphi)、鼠伤寒杆菌(typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、新型梭菌(Clostridium neoformans)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、棒状杆菌(Corynebacterium spp)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鸟分枝杆菌(Mycobactrium avium)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)、痤疮丙酸杆菌(P.acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus.epidermidis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A群链球菌(Strep)、B群链球菌(无乳链球菌)和C群链球菌。
在一些实施方案中，细菌是抗生素抗性细菌。在一些实施方案中，细菌是多重耐药细菌。在其他实施方案中，所述抗生素抗性细菌或多重耐药细菌选自于鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、铜绿假单胞菌、艰难梭菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
在一些实施方案中，所述真菌选自于曲霉菌(Aspergillus spp)、芽生菌属(Blastomyces)、白色念珠菌(Candida albicans)、glabrata、guilliermondii、krusei、parapsilosis、tropicalis、隐球菌属(Cryptococcus)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、毛霉菌(Mucor spp.)、酵母属(Saccharomyces)和耶氏(卡氏)肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii(carinii))。
在一些实施方案中，所述病毒选自于登革热病毒(Dengue virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、EBV、甲型肝炎病毒(Hepitis A virus)、乙型肝炎病毒(Hepitis Bvirus)、丙型肝炎病毒(Hepitis C virus)、丁型肝炎病毒(Hepitis D virus)、HIV、HSV1、HSV2、巨细胞病毒(CMV)、甲型流感病毒(Influenza A virus)、马尔堡病毒(Marburgvirus)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗河病毒(West Nilevirus)、人乳头瘤病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)和寨卡病毒。
在一些实施方案中，寄生虫选自于隐孢子虫属(Cryptosporidium)、利什曼原虫属(Leishmania)、疟原虫属(Malaria)、血吸虫属(Schistosoma)、毛滴虫属(Trichomonas)和锥虫属(Trypanosoma)。
在一些实施方案中，所述病原体包括传染性微生物的细胞壁组分。在其他实施方案中，病原体包含完整传染性微生物细胞。在一些实施方案中，传染性微生物的细胞壁组分是糖基化的。在其他实施方案中，细胞壁组分是甘露糖基化的。在一些实施方案中，细胞壁组分是甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)。在其他实施方案中，细胞壁组分是磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)。
在一些实施方案中，病原体是支原体。在其他实施方案中，支原体选自于肺炎支原体(M.pneumoniae)、人型支原体(M.hominis)和口腔支原体(M.orale)。
在一些实施方案中，病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。在其他实施方案中，PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从病原体释放的组分。
在一些实施方案中，从病原体释放的组分包含毒素。在其他实施方案中，所述毒素选自于内毒素、脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、壁磷壁酸(WTA)和蓖麻毒素。
在一些实施方案中，病原体存在于来源于受试者体内的样品中。在其他实施方案中，所述样品选自于血液样品、血浆样品、血清样品、血液培养样品、脑脊髓液样品、关节液样品、尿液样品、精液样品、唾液样品、痰液样品、支气管液样品和泪液样品。
在一些实施方案中，病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。在一些实施方案中，病原体是合成的病原体。
在一些实施方案中，病原体是中和的。在其他实施方案中，病原体通过用抗生素、紫外光、超声、微波、珠磨机、X射线、热压法、辐射或机械破碎处理来中和。在一些实施方案中，病原体在中和后是非传染性的。
在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞。在其他实施方案中，免疫细胞选自于树突细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。
在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少两种不同类型的病原体。在其他实施方案中，疫苗组合物包含至少三种不同类型的病原体。在一些实施方案中，疫苗组合物能够靶向于不同种类的病原体。
在一些实施方案中，疫苗组合物适于植入受试者体内。在其他实施方案中，疫苗组合物适合于皮下植入。在一些实施方案中，疫苗组合物适合注射于受试者。在其他实施方案中，疫苗组合物适合口服施用于受试者。在另一个实施方案中，疫苗组合物为丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
在一些实施方案中，疫苗组合物是冻干的。在其他实施方案中，疫苗组合物具有约30天至约1年的保质期。在一些实施方案中，疫苗组合物具有至少1年的保质期。在其他实施方案中，疫苗组合物能够在室温下储存。在一些实施方案中，疫苗组合物是便携的。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，该哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。在一些实施方案中，该哺乳动物是人类。
在一些实施方案中，疫苗组合物还包含支架，所述支架包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞。
在一些实施方案中，该生物材料选自于糖胺聚糖、丝、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乳酸)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚e-己内酯(PCL)、聚环氧乙烷、聚丙烯富马酸酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丁酸、水解聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、海藻酸酯；果胶酸；和藻酸盐、完全或部分氧化的藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、甲壳素、支链淀粉、结冷胶、黄原胶、胶原、明胶、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉及其组合。在其他实施方案中，该生物材料选自于聚(L-丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)、中孔二氧化硅、冷冻凝胶及其组合。
在一个方面，本发明提供了治疗需要的受试者的病原体感染的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而治疗受试者中的病原体感染。
另一方面，本发明提供了针对病原体感染对受试者接种疫苗的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而针对病原体感染对受试者接种疫苗。
在一个方面，本发明提供了在需要的受试者中治疗抗生素抗性细菌感染的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而治疗受试者中的抗生素抗性细菌感染。在一些实施方案中，疫苗组合物对受试者中的抗生素抗性细菌是特异性的。
另一方面，本发明提供了降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而降低受试者中的病原体水平。
在一些实施方案中，病原体的水平在受试者的器官中降低。在其他实施方案中，所述器官选自于肺、肝、肾和脾。
在一个方面，本发明提供了提高具有病原体感染的受试者的存活率的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而提高受试者的存活率。
在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。在一些实施方案中，该哺乳动物是人类。
在一些实施方案中，该感染是急性感染。在其他实施方案中，该感染是慢性感染。
在另一方面，本发明提供了产生疫苗的方法。该方法包括使包含病原体或其片段的样品与调理素或凝集素接触，其中该调理素或凝集素能够结合样品中的病原体或其片段，从而形成调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；从样品分离调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；和将调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体与能够在受试者中募集免疫细胞的生物制剂组合，从而产生疫苗。
在一些实施方案中，病原体源自受试者体内。在其他实施方案中，病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。在一些实施方案中，PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从病原体释放的组分。
在一些实施方案中，所述病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。在其他实施方案中，该病原体是合成的病原体。
在一些实施方案中，所述生物制剂包含佐剂。
本发明还提供了疫苗组合物，其包含支架，所述支架包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞；和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体。
在一些实施方案中，生物材料选自于糖胺聚糖、丝、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乳酸)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚e-己内酯(PCL)、聚环氧乙烷、聚丙烯富马酸酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丁酸、水解聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、海藻酸酯；果胶酸；和藻酸盐、完全或部分氧化的藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、甲壳素、支链淀粉、结冷胶、黄原胶、胶原、明胶、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉及其组合。在其他实施方案中，生物材料选自聚(L-丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)、中孔二氧化硅、冷冻凝胶及其组合。
在一些实施方案中，支架还包含生物制剂。在其他实施方案中，生物制剂能够在受试者中募集免疫细胞。
在一些实施方案中，该生物制剂选自于白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、Fms相关酪氨酸激酶配体(FTL)-3配体、CCL19、CCL21、M-SCF、MIF、CD40L、CD3、ICAM、转化生长因子(TGF)-β、胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
在一些实施方案中，该生物制剂包含佐剂。在其他实施方案中，该佐剂选自于胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、卵清蛋白(OVA)、单磷酰脂质A(MPL)、聚(I:C)、MF59、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙、Quil A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、FIA、montanide、佐剂65、lipovant、聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球、石蜡油、角鲨烯、病毒体、AS03、AS04、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、STING、Toll样受体配体、CD40L、病原体相关分子模式(PAMP)、损伤相关分子模式分子(DAMP)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、抗免疫抑制分子的抗体(例如，针对转化生长因子(TGF)-β的抗体或拮抗剂，A2aR拮抗剂)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
在一些实施方案中，凝集素结合的病原体构建体包含凝集素、凝集素的一部分、工程化的凝集素或其部分。在一些实施方案中，所述凝集素是胶原凝集素。在其他实施方案中，凝集素是ficollin。在一些实施方案中，凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。在其他实施方案中，凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基81-228。在再另一个实施方案中，凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基111-228。在一些实施方案中，所述甘露糖结合凝集素(MBL)能够结合病原体。在一些实施方案中，所述凝集素是表面活性蛋白D(SPD)。在其他实施方案中，所述表面活性蛋白D(SPD)能够结合病原体。
在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含免疫球蛋白(IgG)Fc部分。
在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含固体基质。在其他实施方案中，所述固体基质选自于磁珠、微孔膜、中空纤维反应器、血液过滤膜和血流装置。在一些实施方案中，固体基质是磁珠。在其他实施方案中，所述病原体以约1pg至约1000μg的量存在于所述固体基质上。
在一些实施方案中，所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
在一些实施方案中，所述细菌选自于鲍曼不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、脆弱拟杆菌、沙眼衣原体、弗氏柠檬酸杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、乙型流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、粘质沙雷氏菌、福氏志贺菌、嗜麦芽寡养单胞菌、假结核耶尔森菌、枯草芽孢杆菌、新型梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)、单核细胞增生李斯特菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风杆菌、皮疽诺卡菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、A群链球菌、B群链球菌(无乳链球菌)和C群链球菌。
在一些实施方案中，细菌是抗生素抗性细菌。在一些实施方案中，细菌是多重耐药细菌。在其他实施方案中，该抗生素抗性细菌或多重耐药细菌选自于鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、铜绿假单胞菌、艰难梭菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
在一些实施方案中，所述真菌选自于曲霉菌、芽生菌属、白色念珠菌、glabrata、guilliermondii、krusei、parapsilosis、tropicalis、隐球菌属、镰刀菌、毛霉菌、酵母属和耶氏(卡氏)肺孢子虫。
在一些实施方案中，所述病毒选自于登革热病毒、埃博拉病毒、EBV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、HIV、HSV 1、HSV 2、巨细胞病毒(CMV)、甲型流感病毒、马尔堡病毒、人呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS冠状病毒、西尼罗河病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)和寨卡病毒。
在一些实施方案中，寄生虫选自于隐孢子虫属、利什曼原虫属、疟原虫属、血吸虫属、毛滴虫属和锥虫属。
在一些实施方案中，病原体包含传染性微生物的细胞壁组分。在其他实施方案中，病原体包含完整的传染性微生物细胞。在一些实施方案中，传染性微生物的细胞壁组分是糖基化的。在其他实施方案中，细胞壁组分是甘露糖基化的。在一些实施方案中，细胞壁组分是甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)。在其他实施方案中，细胞壁组分是磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)。
在一些实施方案中，病原体包含传染性微生物的细胞壁组分。在其他实施方案中，病原体包含完整的传染性微生物细胞。在一些实施方案中，传染性微生物的细胞壁组分是糖基化的。在其他实施方案中，细胞壁组分是甘露糖基化的。在一些实施方案中，细胞壁组分是甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)。在其他实施方案中，细胞壁组分是磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)。
在一些实施方案中，病原体是支原体。在其他实施方案中，支原体选自于肺炎支原体、人型支原体和口腔支原体。
在一些实施方案中，病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。在其他实施方案中，PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从病原体释放的组分。
在一些实施方案中，从病原体释放的组分包含毒素。在其他实施方案中，该毒素选自于内毒素、脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、壁磷壁酸(WTA)和蓖麻毒素。
在一些实施方案中，病原体存在于源自受试者体内的样品中。在其他实施方案中，该样品选自于血液样品、血浆样品、血清样品、血液培养样品、脑脊髓液样品、关节液样品、尿液样品、精液样品、唾液样品、痰液样品、支气管液样品和泪液样品。
在一些实施方案中，所述病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。在一些实施方案中，该病原体是合成的病原体。
在一些实施方案中，病原体是中和的。在其他实施方案中，病原体通过用抗生素、紫外光、超声、微波、珠磨机、X射线、热压法、辐射或机械破碎处理来中和。在一些实施方案中，病原体在中和后是非传染性的。
在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞。在其他实施方案中，免疫细胞选自于树突细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。
在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少两种不同类型的病原体。在其他实施方案中，疫苗组合物包含至少三种不同类型的病原体。在一些实施方案中，疫苗组合物能够靶向不同种类的病原体。
在一些实施方案中，疫苗组合物适于植入受试者体内。在其他实施方案中，疫苗组合物适合于皮下植入。在一些实施方案中，疫苗组合物适合注射于受试者。在其他实施方案中，疫苗组合物适合口服施用于受试者。在另一个实施方案中，疫苗组合物为丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
在一些实施方案中，疫苗组合物是冻干的。在其他实施方案中，疫苗组合物具有约30天至约1年的保质期。在一些实施方案中，疫苗组合物具有至少1年的保质期。在其他实施方案中，疫苗组合物能够在室温下储存。在一些实施方案中，疫苗组合物是便携的。
在一些实施方案中，该疫苗组合物能够固定调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体并防止调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体从支架泄漏。
在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人类。
在一个方面，本发明提供了稳定的支架组合物。该稳定的支架组合物包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞，其中所述支架是冻干的，并且其中所述支架具有约30天至约1年的保质期。
在一些实施方案中，所述生物材料选自于糖胺聚糖、丝、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乳酸)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚e-己内酯(PCL)、聚环氧乙烷、聚丙烯富马酸酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丁酸、水解聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、海藻酸酯；果胶酸；和藻酸盐、完全或部分氧化的藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、甲壳素、支链淀粉、结冷胶、黄原胶、胶原、明胶、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉及其组合。在其他实施方案中，所述生物材料选自于聚(L-丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)、中孔二氧化硅、冷冻凝胶及其组合。
在一些实施方案中，该支架还包含生物制剂。在一些实施例中，该生物制剂能够在受试者中募集免疫细胞。
在一些实施方案中，该生物制剂选自于白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、Fms相关酪氨酸激酶配体(FTL)-3配体、CCL19、CCL21、M-SCF、MIF、CD40L、CD3、ICAM、转化生长因子(TGF)-β、胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
在一些实施方案中，该生物制剂包含佐剂。在其他实施方案中，该佐剂选自于胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、卵清蛋白(OVA)、单磷酰脂质A(MPL)、聚(I:C)、MF59、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙、Quil A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、FIA、montanide、佐剂65、lipovant、聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球、石蜡油、角鲨烯、病毒体、AS03、AS04、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、STING、Toll样受体配体、CD40L、病原体相关分子模式(PAMP)、损伤相关分子模式分子(DAMP)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、抗免疫抑制分子的抗体(例如，针对转化生长因子(TGF)-β的抗体或拮抗剂，A2aR拮抗剂)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。在某些实施方案中，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在某些实施方案中，该佐剂包含聚乙烯亚胺(PEI)-CpG-ODN序列。
在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞。在其他实施方案中，该免疫细胞选自于树突细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。
在一些实施方案中，该支架组合物适于植入受试者体内。在其他实施方案中，该支架组合物适合于皮下植入。在一些实施方案中，该支架组合物适合注射于受试者。在其他实施方案中，支架组合物适合口服施用于受试者。在一些实施方案中，支架组合物为丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，该哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。在一些实施方案中，该哺乳动物是人类。
在一些实施方案中，该支架组合物能够在室温下储存。在一些实施方案中，该支架组合物是便携的。
在另一个方面，本发明提供了包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞的支架组合物，其中所述支架包含固体基质，并且其中所述固体基质适合于病原体附着。
在一些实施方案中，该固体基质选自于磁珠、微孔膜、中空纤维反应器、血液过滤膜和血流装置。在一些实施方案中，该固体基质是磁珠。在其他实施方案中，病原体以约1pg至约1000μg的量存在于所述固体基质上。
在一些实施方案中，该生物材料选自于糖胺聚糖、丝、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乳酸)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚e-己内酯(PCL)、聚环氧乙烷、聚丙烯富马酸酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丁酸、水解聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、海藻酸酯；果胶酸；和藻酸盐、完全或部分氧化的藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、甲壳素、支链淀粉、结冷胶、黄原胶、胶原、明胶、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉及其组合。在其他实施方案中，所述生物材料选自于聚(L-丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)、中孔二氧化硅、冷冻凝胶及其组合。
在一些实施方案中，所述支架还包含生物制剂。在一些实施方案中，该生物制剂能够在受试者中募集免疫细胞。
在一些实施方案中，该生物制剂选自于白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、Fms相关酪氨酸激酶配体(FTL)-3配体、CCL19、CCL21、M-SCF、MIF、CD40L、CD3、ICAM、转化生长因子(TGF)-β、胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
在一些实施方案中，该生物制剂包含佐剂。在其他实施方案中，该佐剂选自于胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、卵清蛋白(OVA)、单磷酰脂质A(MPL)、聚(I:C)、MF59、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙、Quil A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、FIA、montanide、佐剂65、lipovant、聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球、石蜡油、角鲨烯、病毒体、AS03、AS04、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、STING、Toll样受体配体、CD40L、病原体相关分子模式(PAMP)、损伤相关分子模式分子(DAMP)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、抗免疫抑制分子的抗体(例如，针对转化生长因子(TGF)-β的抗体或拮抗剂，A2aR拮抗剂)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。在某些实施方案中，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在某些实施方案中，该佐剂包含聚乙烯亚胺(PEI)-CpG-ODN序列。
在一些实施方案中，该免疫细胞是抗原呈递细胞。在其他实施方案中，所述免疫细胞选自于树突细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。
在一些实施方案中，该支架组合物适于植入受试者体内。在其他实施方案中，支架组合物适合于皮下植入。在一些实施方案中，支架组合物适合注射于受试者。在其他实施方案中，支架组合物适合口服施用于受试者。在一些实施方案中，所述支架组合物为丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，该哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。在一些实施方案中，该哺乳动物是人类。
在一些实施方案中，支架组合物是冻干的。在其他实施方案中，支架组合物具有约30天至约1年的保质期。在一些实施方案中，支架组合物具有至少1年的保质期。在其他实施方案中，支架组合物能够在室温下储存。在一些实施方案中，支架组合物是便携的。
在一些实施方案中，所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
在一些实施方案中，病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。在其他实施方案中，所述PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从病原体释放的组分。
在一些实施方案中，从病原体释放的组分包含毒素。在其他实施方案中，所述毒素选自于内毒素、脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、壁磷壁酸(WTA)和蓖麻毒素。
在一些实施方案中，病原体存在于源自受试者体内的样品中。在其他实施方案中，所述样品选自于血液样品、血浆样品、血清样品、血液培养样品、脑脊髓液样品、关节液样品、尿液样品、精液样品、唾液样品、痰液样品、支气管液样品和泪液样品。
在一些实施方案中，所述病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。在一些实施方案中，病原体是合成的病原体。
在一个方面，本发明提供了适合于结合源自受试者的病原体或其片段的重组调理素或凝集素，其中该调理素或凝集素包含肺表面活性物质。在一些实施方案中，该肺表面活性物质是表面活性剂蛋白D(SPD)。
另一方面，本发明提供了调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体。该调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体包含与调理素或凝集素结合的源自受试者的病原体或其片段，其中该调理素或凝集素包含肺表面活性物质。在一些实施方案中，该肺表面活性物质是表面活性剂蛋白D(SPD)。
另一方面，本发明提供稳定的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体。该稳定的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体包含与调理素结合的源自受试者的病原体或其片段，其中该调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体是冻干的，并且其中该调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体具有约30天至约1年的保质期。
在一些实施方案中，该凝集素结合的病原体构建体包含凝集素或凝集素的一部分、工程化的凝集素或其部分。在一些实施方案中，凝集素是胶原凝集素。在其他实施方案中，凝集素是ficollin。在一些实施方案中，凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。在其他实施方案中，凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基81-228。在再另一个实施方案中，凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基111-228。在一些实施方案中，甘露糖结合凝集素(MBL)能够结合病原体。在一些实施方案中，凝集素是表面蛋白D(SPD)。在其他实施方案中，表面蛋白D(SPD)能够结合病原体。
在一些实施方案中，该调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含免疫球蛋白(IgG)Fc部分。
在一些实施方案中，该调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含固体基质。在其他实施方案中，该固体基质选自于磁珠、微孔膜、中空纤维反应器、血液过滤膜和血流装置。在一些实施方案中，该固体基质是磁珠。在其他实施方案中，所述病原体以约1pg至约1000μg的量存在于所述固体基质上。
在一些实施方案中，病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
在一些实施方案中，该细菌选自于鲍曼不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、脆弱拟杆菌、沙眼衣原体、弗氏柠檬酸杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、乙型流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、粘质沙雷氏菌、福氏志贺菌、嗜麦芽寡养单胞菌、假结核耶尔森菌、枯草芽孢杆菌、新型梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)、单核细胞增生李斯特菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风杆菌、皮疽诺卡菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、A群链球菌、B群链球菌(无乳链球菌)和C群链球菌。
在一些实施方案中，细菌是抗生素抗性细菌。在一些实施方案中，细菌是多重耐药细菌。在其他实施方案中，该抗生素抗性细菌或多重耐药细菌选自于鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、铜绿假单胞菌、艰难梭菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
在一些实施方案中，所述真菌选自于曲霉菌、芽生菌属、白色念珠菌、glabrata、guilliermondii、krusei、parapsilosis、tropicalis、隐球菌属、镰刀菌、毛霉菌、酵母属和耶氏(卡氏)肺孢子虫。
在一些实施方案中，所述病毒选自于登革热病毒、埃博拉病毒、EBV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、HIV、HSV 1、HSV 2、巨细胞病毒(CMV)、甲型流感病毒、马尔堡病毒、人呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS冠状病毒、西尼罗河病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)和寨卡病毒。
在一些实施方案中，该寄生虫选自于隐孢子虫属、利什曼原虫属、疟原虫属、血吸虫属、毛滴虫属和锥虫属。
在一些实施方案中，该病原体是支原体。在其他实施方案中，该支原体选自于肺炎支原体、人型支原体和口腔支原体。
在一些实施方案中，该病原体包含传染性微生物的细胞壁组分。在其他实施方案中，病原体包含完整的传染性微生物细胞。在一些实施方案中，传染性微生物的细胞壁组分是糖基化的。在其他实施方案中，细胞壁组分是甘露糖基化的。在一些实施方案中，细胞壁组分是甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)。在其他实施方案中，细胞壁组分是磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)。
在一些实施方案中，病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。在其他实施方案中，PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从病原体释放的组分。
在一些实施方案中，从病原体释放的组分包含毒素。在其他实施方案中，所述毒素选自于内毒素、脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、壁磷壁酸(WTA)和蓖麻毒素。
在一些实施方案中，病原体存在于源自受试者体内的样品中。在其他实施方案中，所述样品选自于血液样品、血浆样品、血清样品、血液培养样品、脑脊髓液样品、关节液样品、尿液样品、精液样品、唾液样品、痰液样品、支气管液样品和泪液样品。
在一些实施方案中，病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。在一些实施方案中，病原体是合成的病原体。
在一些实施方案中，病原体是中和的。在其他实施方案中，病原体通过用抗生素、紫外光、超声、微波、珠磨机、X射线、热压法、辐射或机械破碎处理来中和。在一些实施方案中，病原体在中和后是非传染性的。
在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞。在其他实施方案中，免疫细胞选自于树突细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。
在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体包含至少两种不同类型的病原体。在其他实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体包含至少三种不同类型的病原体。在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体能够靶向于不同种类的病原体。
在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体适于植入受试者体内。在其他实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体适合于皮下植入。在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体适合注射于受试者。在其他实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体适合口服施用于受试者。在另一个实施方案中，疫苗组合物为丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体是冻干的。在其他实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体具有约30天至约1年的保质期。在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体具有至少1年的保质期。在其他实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体能够在室温下储存。在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体是便携的。
在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。在一些实施方案中，该哺乳动物是人类。
本发明还提供了治疗需要的受试者中的病原体感染的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而治疗受试者中的病原体感染。
在一个方面，本发明提供了针对病原体感染对受试者接种疫苗的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而会对病原体感染对受试者接种疫苗。
另一方面，本发明提供了在需要的受试者中治疗抗生素抗性细菌感染的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而治疗受试者中的抗生素抗性细菌感染。在一些实施方案中，疫苗组合物对受试者中的抗生素抗性细菌是特异性的。
在一个方面，本发明提供了降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而降低受试者中的病原体水平。
在一些实施方案中，病原体的水平在受试者的器官中降低。在一些实施方案中，器官选自于肺、肝、肾和脾。
在一个方面，本发明提供了提高具有病原体感染的受试者的存活率的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而提高受试者的存活率。
另一方面，本发明提供了降低需要的受试者中与病原体感染相关的疼痛水平的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而降低受试者中与病原体感染相关的疼痛水平。
在再另一方面，本发明提供了降低需要的受试者中与病原体感染相关的痛苦程度的方法。该方法包括向受试者施用本发明的疫苗组合物，从而降低受试者中与病原体感染相关的痛苦程度。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。在一些实施方案中，该哺乳动物是人类。
在一些实施方案中，感染是急性感染。在其他实施方案中，感染是慢性感染。
在一个方面，本发明提供了治疗需要的受试者中的病原体感染的方法。该方法包括向受试者施用本发明的支架组合物和本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而治疗受试者的病原体感染。
另一方面，本发明提供了针对病原体感染对受试者接种疫苗的方法。该方法包括向受试者施用本发明的支架组合物和本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而针对病原体感染对受试者接种疫苗。
在一个方面，本发明提供了在需要的受试者中治疗抗生素抗性细菌感染的方法。该方法包括向受试者施用本发明的支架组合物和本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而治疗受试者中的抗生素抗性细菌感染。在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体对受试者中的抗生素抗性细菌是特异性的。
另一方面，本发明提供了降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法。该方法包括向受试者施用本发明的支架组合物和本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而降低受试者中的病原体水平。
在一些实施方案中，病原体的水平在受试者的器官中降低。在一些实施方案中，该器官选自于肺、肝、肾和脾。
在一个方面，本发明提供了提高具有病原体感染的受试者的存活率的方法。该方法包括向受试者施用本发明的支架组合物和本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而提高受试者的存活率。
在另一方面，本发明提供了降低需要的受试者中与病原体感染相关的疼痛水平的方法。该方法包括向受试者施用本发明的支架组合物和本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而降低受试者中与病原体感染相关的疼痛水平。
而在另一方面，本发明提供了降低需要的受试者中与病原体感染相关的痛苦程度的方法。该方法包括向受试者施用本发明的支架组合物和本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而降低受试者中与病原体感染相关的痛苦程度。
在一些实施方案中，本发明的支架组合物和本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体同时施用于受试者。在其他实施方案中，本发明的支架组合物在本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体之前施用于受试者。在再另一个实施方案中，本发明的支架组合物在本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体之后施用于受试者。
在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，该哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。在一些实施方案中，该哺乳动物是人类。
在一些实施方案中，该感染是急性感染。在其他实施方案中，该感染是慢性感染。
在一个方面，本发明提供了产生疫苗的方法。该方法包括使包含病原体或其片段的样品与调理素或凝集素接触，其中调理素或凝集素能够结合样品中的病原体或其片段，从而形成调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；从样品分离调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；和将分离的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体与支架组合，从而产生疫苗。
在一些实施方案中，病原体源自受试者体内。在一些实施方案中，病原体源自于体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。在一些实施方案中，该病原体是合成的病原体。
在一些实施方案中，病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。在一些实施方案中，所述PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从病原体释放的组分。
在一些实施方案中，病原体包含传染性微生物的细胞壁组分。在其他实施方案中，病原体包含完整的传染性微生物细胞。在一些实施方案中，传染性微生物的细胞壁组分是糖基化的。在其他实施方案中，细胞壁组分是甘露糖基化的。在一些实施方案中，细胞壁组分是甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)。在其他实施方案中，细胞壁组分是磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)。
另一方面，本发明提供了产生疫苗的方法。该方法包括将调理素或凝集素施用于受试者，其中所述调理素或凝集素能够结合来自受试者的病原体或其片段，从而形成调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；从受试者分离调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；将分离的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体与支架组合，从而产生疫苗。
在一个方面，本发明提供了用于针对病原体感染对受试者接种疫苗的试剂盒。该试剂盒包含本发明的疫苗组合物；和向受试者施用疫苗的说明书。在一些实施方案中，疫苗组合物预先包装在无菌容器中。
另一方面，本发明提供了试剂盒。该试剂盒包含本发明的支架组合物；本发明的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；以及将支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体施用于受试者的说明书。
在一些实施方案中，支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体预先包装在无菌容器中。在其他实施方案中，支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体预先包装在不同的无菌容器中。在某些实施方案中，支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体预先包装在相同的无菌容器中。
具体地，本申请涉及以下各项：
1.一种疫苗组合物，其包含
调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，和能够在受试者中募集免疫细胞的生物制剂。
2.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述生物制剂选自于白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、Fms相关酪氨酸激酶配体(FTL)-3配体、CCL19、CCL21、M-SCF、MIF、CD40L、CD3、ICAM、转化生长因子(TGF)-β、胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
3.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述生物制剂包含佐剂。
4.如第3项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自于胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、卵清蛋白(OVA)、单磷酰脂质A(MPL)、聚(I:C)、MF59、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙、Quil A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、FIA、montanide、佐剂65、lipovant、聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球、石蜡油、角鲨烯、病毒体、AS03、AS04、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、STING、Toll样受体配体、CD40L、病原体相关分子模式(PAMP)、损伤相关分子模式分子(DAMPs)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、转化生长因子(TGF)-β抗体或拮抗剂、A2aR拮抗剂、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
5.如第1项所述的疫苗组合物，其中该凝集素结合的病原体构建体包含凝集素、凝集素的一部分、工程化的凝集素或其部分。
6.如第5项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素是胶原凝集素。
7.如第5项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素是ficollin。
8.如第5项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。
9.如第8项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基81-228。
10.如第8项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基111-228。
11.如第8项所述的疫苗组合物，其中所述甘露糖结合凝集素(MBL)能够结合所述病原体。
12.如第5项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素包含表面活性蛋白D(SPD)。
13.如第12项所述的疫苗组合物，其中所述表面活性蛋白D(SPD)能够结合所述病原体。
14.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含免疫球蛋白(IgG)Fc部分。
15.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含固体基质。
16.如第15项所述的疫苗组合物，其中所述固体基质选自于磁珠、微孔膜、中空纤维反应器、血液过滤膜和血流装置。
17.如第16项所述的疫苗组合物，其中所述固体基质是磁珠。
18.如第15项所述的疫苗组合物，其中所述病原体以约1pg至约1000μg的量存在于所述固体基质上。
19.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
20.如第19项所述的疫苗组合物，其中所述细菌选自于鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、脆弱拟杆菌(Bacterioides fragilis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus inf b)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)(MDR/CRE)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒杆菌(paratyphi)、鼠伤寒杆菌(typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、新型梭菌(Clostridium neoformans)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、棒状杆菌(Corynebacterium spp)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、耐万古霉素肠球菌(VRE)(vancomycin-resistant Enterococci)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鸟分枝杆菌(Mycobactrium avium)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)、痤疮丙酸杆菌(P.acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A群链球菌(Strep)、B群链球菌(无乳链球菌)和C群链球菌。
21.如第19项所述的疫苗组合物，其中所述细菌是抗生素抗性细菌或多重耐药细菌。
22.如第21项所述的疫苗组合物，其中所述抗生素抗性细菌或所述多重耐药细菌选自于鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、铜绿假单胞菌、艰难梭菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
23.如第19项所述的疫苗组合物，其中所述真菌选自于曲霉菌(Aspergillusspp)、芽生菌属(Blastomyces)、白色念珠菌(Candida albicans)、glabrata、guilliermondii、krusei、parapsilosis、tropicalis、隐球菌属(Cryptococcus)、镰刀菌(Fusarium spp.)、毛霉菌(Mucor spp.)、酵母属(Saccharomyces)和耶氏(卡氏)肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii(carinii))。
24.如第19项所述的疫苗组合物，其中所述病毒选自于登革热病毒(Denguevirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、EBV、甲型肝炎病毒(Hepitis A virus)、乙型肝炎病毒(Hepitis B virus)、丙型肝炎病毒(Hepitis C virus)、丁型肝炎病毒(Hepitis Dvirus)、HSV 1、HSV 2、HIV、巨细胞病毒(CMV)、甲型流感病毒(Influenza A virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗河病毒(West Nile virus)、人乳头瘤病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)和寨卡病毒(Zica virus)。
25.如第19项所述的疫苗组合物，其中所述寄生虫选自于隐孢子虫属(Cryptosporidium)、利什曼原虫原(Leishmania)、疟原虫(Malaria)、血吸虫属(Schistosoma)、毛滴虫属(Trichomonas)和锥虫属(Trypanosoma)。
26.如第19项所述的疫苗组合物，其中所述病原体包括所述传染性微生物的细胞壁组分。
27.如第19项所述的疫苗组合物，其中所述病原体包含整个传染性微生物细胞。
28.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述病原体是支原体。
29.如第28项所述的疫苗组合物，其中所述支原体选自于肺炎支原体(M.pneumoniae)、人型支原体(M.hominis)和口腔支原体(M.orale)。
30.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。
31.如第30项所述的疫苗组合物，其中所述PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从该病原体释放的组分。
32.如第31项所述的疫苗组合物，其中所述从病原体释放的组分包含毒素。
33.如第32项所述的疫苗组合物，其中所述毒素选自于内毒素、脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、壁磷壁酸(WTA)和蓖麻毒素。
34.如第1项的疫苗组合物，其中所述病原体处于源自受试者的样品中。
35.如第34项所述的疫苗组合物，其中所述样品选自于血液样品、血浆样品、血清样品、血液培养样品、脑脊髓液样品、关节液样品、尿液样品、精液样品、唾液样品、痰液样品、支气管液样品和泪液样品。
36.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。
37.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述病原体是合成的病原体。
38.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述病原体是被中和的。
39.如第38项所述的疫苗组合物，其中所述病原体通过用抗生素、紫外光、超声、微波、珠磨机、X射线、热压法、辐射或机械破碎处理来中和。
40.如第39项所述的疫苗组合物，其中所述病原体在中和后是非传染性的。
41.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述免疫细胞是抗原呈递细胞。
42.如第41项所述的疫苗组合物，其中所述免疫细胞选自于树突细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。
43.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含至少两种不同类型的病原体。
44.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够靶向不同种类的病原体。
45.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适于植入受试者体内。
46.如第45项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适合于皮下植入。
47.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适合注射于受试者。
48.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适合口服施用于受试者。
49.如第48项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物为丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
50.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是冻干的。
51.如第50项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物具有约30天至约1年的保质期。
52.如第50项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在室温下储存。
53.如第1项所述的疫苗组合物，其中所述受试者是哺乳动物。
54.如第53项所述的疫苗组合物，其中所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。
55.如第54项所述的疫苗组合物，其中所述哺乳动物是人类。
56.如第1项所述的疫苗组合物，其还包含支架，该支架包含生物材料并且能够在所述受试者中募集和激活免疫细胞。
57.如第56项所述的疫苗组合物，其中所述生物材料选自于糖胺聚糖、丝、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乳酸)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚e-己内酯(PCL)、聚环氧乙烷、聚丙烯富马酸酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丁酸、水解聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、海藻酸酯；果胶酸；和藻酸盐、完全或部分氧化的藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、甲壳素、支链淀粉、结冷胶、黄原胶、胶原、明胶、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉及其组合。
58.如第57项所述的疫苗组合物，其中所述生物材料选自于聚(L-丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)、中孔二氧化硅、冷冻凝胶及其组合。
59.一种治疗需要的受试者的病原体感染的方法，包括向所述受试者施用如第1-58项中任一项所述的疫苗组合物，从而治疗所述受试者中的病原体感染。
60.一种针对病原体感染对受试者接种疫苗的方法，包括向所述受试者施用如第1-58项中任一项所述的疫苗组合物，从而针对所述病原体感染对所述受试者接种疫苗。
61.一种在需要的受试者中治疗抗生素抗性的细菌感染的方法，包括向所述受试者施用如第1-58项中任一项所述的疫苗组合物，从而治疗所述受试者中的抗生素抗性的细菌感染。
62.如第61项所述的方法，其中该疫苗组合物对所述受试者中的抗生素抗性细菌是特异性的。
63.一种降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法，包括向所述受试者施用如第1-58项中任一项所述的疫苗组合物，从而降低所述受试者中的病原体水平。
64.如第63项所述的方法，其中所述病原体水平在所述受试者的器官中降低。
65.如第64项所述的方法，其中所述器官选自于肺、肝、肾和脾。
66.一种提高具有病原体感染的受试者的存活率的方法，包括向所述受试者施用如第1-58项中任一项所述的疫苗组合物，从而提高所述受试者的存活率。
67.如第59-66项中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
68.如第67项所述的方法，其中所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。
69.如第68项所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
70.如第59-69项中任一项所述的方法，其中所述感染是急性感染。
71.如第59-69项中任一项所述的方法，其中所述感染是慢性感染。
72.一种生产疫苗的方法，包括：
使包含病原体或其片段的样品与调理素或凝集素接触，其中该调理素或凝集素能够结合所述样品中的病原体或其片段，从而形成调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；
从所述样品分离所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；和
将所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体与能够在受试者中募集免疫细胞的生物制剂组合，从而产生所述疫苗。
73.如第72项所述的方法，其中所述病原体源自受试者。
74.如第72项所述的方法，其中所述病原体包括病原体相关分子模式(PAMP)。
75.如第74项所述的方法，其中所述PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从该病原体释放的组分。
76.如第72项所述的方法，其中所述病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。
77.如第72项所述的方法，其中所述病原体是合成的病原体。
78.如第72项所述的方法，其中所述生物制剂包含佐剂。
79.一种疫苗组合物，包含
支架，其包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞；和
调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体。
80.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述生物材料选自于糖胺聚糖、丝、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乳酸)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚e-己内酯(PCL)、聚环氧乙烷、聚丙烯富马酸酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丁酸、水解聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、海藻酸酯；果胶酸；和藻酸盐、完全或部分氧化的藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、甲壳素、支链淀粉、结冷胶、黄原胶、胶原、明胶、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉及其组合。
81.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述生物材料选自于聚(L-丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)、中孔二氧化硅、冷冻凝胶及其组合。
82.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述支架还包含生物制剂。
83.如第82项所述的疫苗组合物，其中所述生物制剂能够在所述受试者中募集所述免疫细胞。
84.如第83项所述的疫苗组合物，其中所述生物制剂选自于白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、Fms相关酪氨酸激酶配体(FTL)-3配体、CCL19、CCL21、M-SCF、MIF、CD40L、CD3、ICAM、转化生长因子(TGF)-β、胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
85.如第83项所述的疫苗组合物，其中所述生物制剂包含佐剂。
86.如第85项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自于胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、卵清蛋白(OVA)、单磷酰脂质A(MPL)、聚(I:C)、MF59、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙、Quil A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、FIA、montanide、佐剂65、lipovant、聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球、石蜡油、角鲨烯、病毒体、AS03、AS04、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、STING、Toll样受体配体、CD40L、病原体相关分子模式(PAMP)、损伤相关分子模式分子(DAMP)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、转化生长因子(TGF)-β抗体或拮抗剂、A2aR拮抗剂、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
87.如第86项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
88.如第86项所述的疫苗组合物，其中所述佐剂包含聚乙烯亚胺(PEI)-CpG-ODN序列。
89.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素结合的病原体构建体包含凝集素、凝集素的一部分、工程化的凝集素或其部分。
90.如第89项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素是胶原凝集素。
91.如第89项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素是ficollin。
92.如第89项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。
93.如第92项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基81-228。
94.如第92项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基111-228。
95.如第92项所述的疫苗组合物，其中所述甘露糖结合凝集素(MBL)能够结合所述病原体。
96.如第89项所述的疫苗组合物，其中所述凝集素包括表面活性蛋白D(SPD)。
97.如第96项所述的疫苗组合物，其中所述表面活性蛋白D(SPD)能够结合所述病原体。
98.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含免疫球蛋白(IgG)Fc部分。
99.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含固体基质。
100.如第99项所述的疫苗组合物，其中所述固体基质选自于磁珠、微孔膜、中空纤维反应器、血液过滤膜和血流装置。
101.如第100项所述的疫苗组合物，其中所述固体基质是磁珠。
102.如权利要求99所述的疫苗组合物，其中所述病原体以约1pg至约1000μg的量存在于所述固体基质上。
103.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
104.如第103项所述的疫苗组合物，其中所述细菌选自于鲍曼不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、脆弱拟杆菌、沙眼衣原体、弗氏柠檬酸杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、乙型流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、粘质沙雷氏菌、福氏志贺菌、嗜麦芽寡养单胞菌、假结核耶尔森菌、枯草芽孢杆菌、新型梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)、单核细胞增生李斯特菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风杆菌、皮疽诺卡菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、A群链球菌、B群链球菌(无乳链球菌)和C群链球菌。
105.如第103项所述的疫苗组合物，其中所述细菌是抗生素抗性细菌或多重耐药细菌。
106.如第105项所述的疫苗组合物，其中所述抗生素抗性细菌或所述多重耐药性细菌选自于鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、铜绿假单胞菌、艰难梭菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
107.如第103项所述的疫苗组合物，其中所述真菌选自于曲霉菌、芽生菌属、白色念珠菌、glabrata、guilliermondii、krusei、parapsilosis、tropicalis、隐球菌属、镰刀菌、毛霉菌、酵母属和耶氏(卡氏)肺孢子虫。
108.如第103项所述的疫苗组合物，其中所述病毒选自于登革热病毒、埃博拉病毒、EBV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、HSV 1、HSV 2、HIV、巨细胞病毒(CMV)、甲型流感病毒、马尔堡病毒、人呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS冠状病毒、西尼罗河病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)和寨卡病毒。
109.如第103项所述的疫苗组合物，其中所述寄生虫选自于隐孢子虫属、利什曼原虫属、疟原虫属、血吸虫属、毛滴虫属和锥虫属。
110.如第103项所述的疫苗组合物，其中所述病原体包含所述传染性微生物的细胞膜组分。
111.如第103项所述的疫苗组合物，其中所述病原体包括从所述传染性微生物分离的全细胞。
112.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述病原体是支原体。
113.如第112项所述的疫苗组合物，其中所述支原体选自于肺炎支原体、人型支原体和口腔支原体。
114.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。
115.如第114项所述的疫苗组合物，其中所述PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从该病原体释放的组分。
116.如第115项所述的疫苗组合物，其中所述从病原体释放的组分包含毒素。
117.如第116项所述的疫苗组合物，其中所述毒素选自于内毒素、脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、壁磷壁酸(WTA)和蓖麻毒素。
118.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述病原体在源自受试者的样品中。
119.如第118项所述的疫苗组合物，其中所述样品选自于血液样品、血浆样品、血清样品、血液培养样品、脑脊髓液样品、关节液样品、尿液样品、精液样品、唾液样品、痰液样品、支气管液样品和泪液样品。
120.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。
121.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述病原体是合成的病原体。
122.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述病原体是被中和的。
123.如第122项所述的疫苗组合物，其中所述病原体通过用抗生素、紫外光、超声、微波、珠磨机、X射线、热压法、辐射或机械破碎处理来中和。
124.如第123项所述的疫苗组合物，其中所述病原体在中和后是非传染性的。
125.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述免疫细胞是抗原呈递细胞。
126.如第125项所述的疫苗组合物，其中所述免疫细胞选自于树突细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。
127.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含至少两种不同类型的病原体。
128.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够靶向不同种类的病原体。
129.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适于植入受试者体内。
130.如第129项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适合于皮下植入。
131.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适合注射于受试者。
132.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适于口服施用于受试者。
133.如第132项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物为丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
134.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是冻干的。
135.如第134项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物具有约30天至约1年的保质期。
136.如第134项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在室温下储存。
137.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够固定所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体并防止所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体从所述支架泄漏。
138.如第79项所述的疫苗组合物，其中所述受试者是哺乳动物。
139.如第138项所述的疫苗组合物，其中所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。
140.如第139项所述的疫苗组合物，其中所述哺乳动物是人类。
141.一种稳定的支架组合物，其包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞，其中所述支架是冻干的，并且其中所述支架具有约30天至约1年的保质期。
142.如第141项所述的支架组合物，其中所述生物材料选自于糖胺聚糖、丝、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乳酸)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚e-己内酯(PCL)、聚环氧乙烷、聚丙烯富马酸酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丁酸、水解聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、海藻酸酯；果胶酸；和藻酸盐、完全或部分氧化的藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、甲壳素、支链淀粉、结冷胶、黄原胶、胶原、明胶、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉及其组合。
143.如第142项所述的支架组合物，其中所述生物材料选自于聚(L-丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)、中孔二氧化硅，冷冻凝胶及其组合。
144.如第143项所述的支架组合物，其中所述支架还包含生物制剂。
145.如第144项所述的支架组合物，其中所述生物制剂能够在所述受试者中募集所述免疫细胞。
146.如第145项所述的支架组合物，其中所述生物制剂选自于白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、Fms相关酪氨酸激酶配体(FTL)-3配体、CCL19、CCL21、M-SCF、MIF、CD40L、CD3、ICAM、转化生长因子(TGF)-β、胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
147.如第145项所述的支架组合物，其中所述生物制剂包含佐剂。
148.如第147项所述的支架组合物，其中所述佐剂选自于胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、卵清蛋白(OVA)、单磷酰脂质A(MPL)、聚(I:C)、MF59、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙、Quil A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、FIA、montanide、佐剂65、lipovant、聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球、石蜡油、角鲨烯、病毒体、AS03、AS04、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、STING、Toll样受体配体、CD40L、病原体相关分子模式(PAMP)、损伤相关分子模式分子(DAMP)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、转化生长因子(TGF)-β抗体或拮抗剂、A2aR拮抗剂、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
149.如第148项所述的支架组合物，其中所述佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
150.如第148项所述的支架组合物，其中所述佐剂包含聚乙烯亚胺(PEI)-CpG-ODN序列。
151.如第141项所述的支架组合物，其中所述免疫细胞是抗原呈递细胞。
152.如第151项所述的支架组合物，其中所述免疫细胞选自于树突细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。
153.如第141项所述的支架组合物，其中所述支架组合物适于植入受试者体内。
154.如第153项所述的支架组合物，其中所述支架组合物适合于皮下植入。
155.如第141项所述的支架组合物，其中所述支架组合物适合注射于受试者。
156.如第141项所述的支架组合物，其中所述支架组合物适合口服施用于受试者。
157.如第156项所述的支架组合物，其中所述支架组合物为丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
158.如第141项所述的支架组合物，其中所述受试者是哺乳动物。
159.如第158项所述的支架组合物，其中所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。
160.如第159项所述的支架组合物，其中所述哺乳动物是人类。
161.如第141项所述的支架组合物，其中所述支架组合物能够在室温下储存。
162.一种稳定的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其包含与调理素结合的源自受试者的病原体或其片段，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体是冻干的，并且其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体具有约30天至约1年的保质期。
163.如第162项所述的凝集素结合的病原体构建体，其中所述凝集素结合的病原体构建体包含凝集素或凝集素的一部分、工程化的凝集素或其部分。
164.如第163项所述的凝集素结合的病原体构建体，其中所述凝集素是胶原凝集素。
165.如第163项所述的凝集素结合的病原体构建体，其中所述凝集素是ficollin。
166.如第163项所述的凝集素结合的病原体构建体，其中所述凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。
167.如第166项所述的凝集素结合的病原体构建体，其中所述凝集素包含MBL(SEQID NO：1)的氨基酸残基81-228。
168.如第166项所述的凝集素结合的病原体构建体，其中所述凝集素包含MBL(SEQID NO：1)的氨基酸残基111-228。
169.如第166项所述的凝集素结合的病原体构建体，其中所述甘露糖结合凝集素(MBL)能够结合所述病原体。
170.如第163项所述的凝集素结合的病原体构建体，其中所述凝集素包含表面活性蛋白D(SPD)。
171.如第170项所述的凝集素结合的病原体构建体，其中所述表面活性蛋白D(SPD)能够结合所述病原体。
172.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体包含免疫球蛋白(IgG)Fc部分。
173.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含固体基质。
174.如第173项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述固体基质选自于磁珠、微孔膜、中空纤维反应器、血液过滤膜和血流装置。
175.如第174项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述固体基质是磁珠。
176.如第173项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体以约1pg至约1000μg的量存在于所述固体基质上。
177.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
178.如第177项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述细菌选自于鲍曼不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、脆弱拟杆菌、沙眼衣原体、弗氏柠檬酸杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、乙型流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、粘质沙雷氏菌、福氏志贺菌、嗜麦芽寡养单胞菌、假结核耶尔森菌、枯草芽孢杆菌、新型梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)、单核细胞增生李斯特菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风杆菌、皮疽诺卡菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、A群链球菌、B群链球菌(无乳链球菌)和C群链球菌。
179.如第178项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述细菌是抗生素抗性细菌或多重耐药细菌。
180.如第179项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中抗生素抗性细菌或所述多重耐药细菌选自于鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、铜绿假单胞菌、艰难梭菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
181.如第177项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述真菌选自于曲霉菌、芽生菌属、白色念珠菌、glabrata、guilliermondii、krusei、parapsilosis、tropicalis、隐球菌属、镰刀菌、毛霉菌、酵母属和耶氏(卡氏)肺孢子虫。
182.如第177项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病毒选自于登革热病毒、埃博拉病毒、EBV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、HSV 1、HSV 2、HIV、巨细胞病毒(CMV)、甲型流感病毒、马尔堡病毒、人呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS冠状病毒、西尼罗河病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)和寨卡病毒。
183.如第177项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述寄生虫选自于隐孢子虫属、利什曼原虫属、疟原虫属、血吸虫属、毛滴虫属和锥虫属。
184.如第177项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体，其中所述病原体包含传染性微生物的细胞膜组分。
185.如第177项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体包含从所述传染性微生物分离的全细胞。
186.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体是支原体。
187.如第186项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述支原体选自于肺炎支原体、人型支原体和口腔支原体。
188.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。
189.如第188项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从该病原体释放的组分。
190.如第189项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述从病原体释放的组分包含毒素。
191.如第190项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述毒素选自于内毒素、脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、壁磷壁酸(WTA)和蓖麻毒素。
192.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体在源自受试者的样品中。
193.如第192项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述样品选自于血液样品、血浆样品、血清样品、血液培养样品、脑脊髓液样品、关节液样品、尿液样品、精液样品、唾液样品、痰液样品、支气管液样品和泪液样品。
194.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。
195.如第162项所述的调理素结合的病原体构建体，其中所述病原体是合成的病原体。
196.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体是被中和的。
197.如第19项6所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体通过用抗生素、紫外光、超声处理、微波、珠磨机、X射线、热压法、辐射或机械破碎处理来中和。
198.如第197项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述病原体在中和后是非传染性的。
199.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中该调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体包含至少两种病原体。
200.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中该调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体包含至少三种病原体。
201.如第162项所述的调理素结合的病原体构建体，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体适于植入受试者体内。
202.如第162项所述的调理素结合的病原体构建体，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体适合注射于受试者。
203.如第162项所述的调理素结合的病原体构建体，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体适合口服施用于受试者。
204.如第203项所述的调理素结合的病原体构建体，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体为丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
205.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体能够在室温下储存。
206.如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述受试者是哺乳动物。
207.如第206项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。
208.如第207项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，其中所述哺乳动物是人类。
209.一种治疗需要的受试者中的病原体感染的方法，其包括向所述受试者施用第79-140项中任一项所述的疫苗组合物，从而治疗所述受试者中的病原体感染。
210.一种针对病原体感染对受试者接种疫苗的方法，其包括向所述受试者施用如第79-140项中任一项所述的疫苗组合物，从而针对病原体感染对受试者接种疫苗。
211.一种在需要的受试者中治疗抗生素抗性细菌感染的方法，其包括向所述受试者施用如第79-140项中任一项所述的疫苗组合物，从而治疗所述受试者中的抗生素抗性细菌感染。
212.如第211项所述的方法，其中所述疫苗组合物对所述受试者中的抗生素抗性细菌是特异性的。
213.一种降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法，其包括向所述受试者施用如第79-140项中任一项所述的疫苗组合物，从而降低所述受试者中的病原体水平。
214.如第213项所述的方法，其中所述病原体水平在所述受试者的器官中降低。
215.如第214项所述的方法，其中所述器官选自于肺、肝、肾和脾。
216.一种提高具有病原体感染的受试者的存活率的方法，其包括向所述受试者施用如第79-140项中任一项所述的疫苗组合物，从而提高所述受试者的存活率。
217.如第209-216项中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
218.如第217项所述的方法，其中所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。
219.如第218项所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
220.如第209-219项中任一项所述的方法，其中所述感染是急性感染。
221.如第209-219项中任一项所述的方法，其中所述感染是慢性感染。
222.一种治疗需要的受试者中的病原体感染的方法，其包括向所述受试者施用第141项所述的支架组合物和第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而治疗所述受试者中的病原体感染。
223.一种针对病原体感染对受试者接种疫苗的方法，其包括向所述受试者施用第141项所述的支架组合物和第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而针对病原体感染对受试者接种疫苗。
224.一种在需要的受试者中治疗抗生素抗性细菌感染的方法，其包括向所述受试者施用第141项所述的支架组合物和第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而治疗所述受试者中的抗生素抗性细菌感染。
225.如第224项所述的方法，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体对所述受试者中的抗生素抗性细菌是特异性的。
226.一种降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法，其包括向所述受试者施用第141项所述的支架组合物和第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而降低所述受试者中的病原体水平。
227.如第226项所述的方法，其中所述病原体水平在所述受试者的器官中降低。
228.如第227项所述的方法，其中所述器官选自于肺、肝、肾和脾。
229.一种提高具有病原体感染的受试者的存活率的方法，其包括向所述受试者施用第141项所述的支架组合物和第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而提高所述受试者的存活率。
230.如第222-229项中任一项所述的方法，其中将第141项所述的支架组合物和第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体同时施用于所述受试者。
231.如第222-229项中任一项所述的方法，其中将第141项所述的支架组合物在第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体之前施用于所述受试者。
232.如第222-229项中任一项所述的方法，其中第141项所述的支架组合物在第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体之后施用于所述受试者。
233.如第222-232项中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
234.如第233项所述的方法，其中所述哺乳动物选自于人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠、兔子和大鼠。
235.如第234项的方法，其中所述哺乳动物是人类。
236.如第222-235项中任一项所述的方法，其中所述感染是急性感染。
237.如第222-235项中任一项所述的方法，其中所述感染是慢性感染。
238.一种产生疫苗的方法，其包括：
使包含病原体或其片段的样品与调理素或凝集素接触，其中所述调理素或凝集素能够结合所述样品中的病原体或其片段，从而形成调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；
从所述样品分离所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；和
将所述分离的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体与支架组合，从而产生所述疫苗。
239.如第238项所述的方法，其中所述病原体源自受试者。
240.如第238项所述的方法，其中所述病原体源自于体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。
241.如第238项所述的方法，其中所述病原体是合成的病原体。
242.如第238项所述的方法，其中所述病原体包括病原体相关分子模式(PAMP)。
243.如第242项所述的方法，其中所述PAMP选自于病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从该病原体释放的组分。
244.一种产生疫苗的方法，其包括：
将调理素或凝集素施用于受试者，其中该调理素或凝集素能够与来自所述受试者的病原体或其片段结合，从而形成调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；
从所述受试者分离所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；和
将所述分离的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体与支架组合，从而产生所述疫苗。
245.一种用于针对病原体感染对受试者接种疫苗的试剂盒，其包含
如第1-58项中任一项所述的疫苗组合物；和
向所述受试者施用该疫苗的说明书。
246.一种用于针对病原体感染对受试者接种疫苗的试剂盒，其包含
如第79-140项中任一项所述的疫苗组合物；和
向所述受试者施用该疫苗的说明书。
247.如第245或246项所述的试剂盒，其中所述疫苗组合物预先包装在无菌容器中。
248.一种试剂盒，其包含
如第141项所述的支架组合物，
如第162项所述的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，和
用于将所述支架组合物和所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体施用于所述受试者的说明书。
249.如第248项所述的试剂盒，其中所述支架组合物和所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体预先包装在无菌容器中。
250.如第249项所述的试剂盒，其中所述支架组合物和所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体预先包装在不同的无菌容器中。
251.如第249项所述的试剂盒，其中所述支架组合物和所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体预先包装在相同的无菌容器中。
通过以下附图和详细描述来说明本发明，这些附图和详细描述并不限制权利要求中描述的本发明的范围。
附图说明
图1描述了本发明的总体病原体疫苗概念。
图2描述了使用真菌MBL靶标，甘露聚糖，产生的FcMBL ELISA标准曲线。具体地，使用1μM FcMBL包被的超顺磁颗粒来捕获缓冲液或完全供体血液中的甘露聚糖。将甘露聚糖的连续稀释液加入到指定的溶液中，与FcMBL珠混合，通过ELISA测定并用于生成用于定量来自测试样品的病原体相关分子模式(PAMP)的曲线。
图3描述了来自经过滴定的抗生素处理的RS218溶液的FcMBL珠上捕获的RS218片段的定量。使用通过FcMBL ELISA产生的标准曲线将捕获的RS218片段作为病原体相关分子模式(PAMP)定量。
图4描述了通过FcMBL珠捕获的RS218 PAMP的FcMBL ELISA定量，以及FcMBL和RS218 PAMP之间的特异性钙依赖性结合。
图5A-5C描述了本发明的病原体疫苗的图像。图5A描述了疫苗包括含有用捕获的抗生素处理的RS218致病性大肠杆菌包被的FcMBL珠的PLG支架。图5B是FcMBL珠的SEM图像，其中捕获的大肠杆菌PAMP掺入PLG支架中。可清楚地看到FcMBL珠(1微米)分散在PLG支架的整个孔和空腔中。图5C是没有FcMBL珠的对照支架的SEM图像。
图6描述了用致死剂量的RS218大肠杆菌细菌感染时接种疫苗的小鼠的存活曲线。小鼠皮下植入含有FcMBL捕获的RS218片段的PLG疫苗支架3周。小鼠在第21天用致死剂量的RS218腹膜内感染。监测小鼠的存活48小时，且如果临床状况需要，则提早人道地处死小鼠。接种疫苗的动物表现出显著延长的存活时间。具有涂覆了RS218的FcMBL珠的PLG-GMCFS/CpG的预防性疫苗保护10只小鼠中的9只，直到48小时研究结束，而单独的PLG支架或具有FcMBL珠/RS218裂解产物而没有募集和佐剂因子的PLG则不保护。处理组(n＝10)。
图7A和7B分别描述了用致死剂量的RS218细菌处理时疫苗接种的小鼠的总器官病原体计数和单个器官病原体计数。小鼠皮下植入含有FcMBL捕获的RS218片段的PLG疫苗支架3周。小鼠在第21天用致死剂量的RS218腹膜内感染。以无菌方式收集器官培养物，通过机械破碎处理并铺板以确定器官中病原体的滴度。在接种疫苗的动物中观察到病原体滴度的显著降低。处理组(n＝10)。病原体负荷减少2.5-3.5个量级(p＝0.0021-0.0057)。
图8描述了用含有FcMBL捕获的RS218片段或全RS218裂解产物的PLG疫苗支架接种的小鼠的存活曲线。小鼠皮下植入PLG疫苗支架(具有GM-CSF和CpG)或含有FcMBL捕获的RS218片段或全RS218裂解产物的支架21天，然后用亚致死剂量的RS218细菌进行腹膜内攻击。监测接种疫苗的小鼠的存活率。接种疫苗的动物表现出显著延长的存活时间。
图9描述了用含有FcMBL捕获的RS218片段或全RS218裂解产物的PLG疫苗支架接种的小鼠的单个器官病原体计数。小鼠皮下植入PLG疫苗支架(具有GM-CSF和CpG)或含有FcMBL捕获的RS218片段或全RS218裂解产物的支架21天，然后用亚致死剂量的RS218细菌进行腹膜内攻击。以无菌方式收集器官培养物，通过机械破碎处理并铺板以确定每个单个器官中病原体的滴度。器官培养显示疫苗接种动物中病原体滴度的显著降低。
图10A-C描述了在含有FcMBL捕获的RS218片段或全RS218裂解产物的PLG疫苗支架在蔗糖浸出过程中CpG、GM-CSF和大肠杆菌RS218内毒素泄漏量的体外定量。当在没有珠(仅裂解产物)的假支架或具有裂解产物的珠之间进行比较时，未观察到CpG含量(图10A)和GM-CSF含量(图10B)的显著差异。然而，在含有全RS218裂解产物的PLG疫苗支架中观察到显著的内毒素渗漏，而含有FcMBL捕获的RS218片段的PLG疫苗支架显示出最小的内毒素泄漏(图10C)。
图11A-C是在疫苗植入部位拍摄的图像，其描述了疫苗接种小鼠的总体状况。小鼠皮下植入PLG疫苗支架(具有GM-CSF和CpG)或含有FcMBL捕获的RS218片段或全RS218裂解产物的支架21天，然后用亚致死剂量的RS218细菌进行腹膜内攻击。接受假支架的小鼠没有免疫反应的迹象(图11A)，和疫苗支架在接受含有FcMBL捕获的RS218片段的PLG疫苗支架的小鼠中大部分完整(图11B)。然而，接受含有全RS218裂解产物的PLG疫苗支架的小鼠发生了不希望的副作用，形成有大的脓肿(图11C)。
图12A-12B描述了感染疫苗技术的交叉反应性。图12A描述了用含有FcMBL捕获的阴沟肠杆菌裂解产物或FcMBL捕获的大肠杆菌RS218裂解产物的PLG疫苗支架接种的小鼠的存活曲线。小鼠皮下植入PLG疫苗支架(具有GM-CSF和CpG)或含有FcMBL捕获的阴沟肠杆菌裂解产物或FcMBL捕获的RS218裂解产物的支架21天，然后用致死剂量的RS218细菌进行腹膜内攻击。监测接种疫苗小鼠的存活。具有涂覆了RS218裂解产物的FcMBL珠的PLG-GMCSF/CpG预防性疫苗保护100％的小鼠直到RS218攻击后96小时研究结束时，和具有涂覆了阴沟肠杆菌裂解产物的FcMBL珠的PLG-GMCSF/CpG疫苗保护78％的小鼠免于RS218攻击直至96小时研究结束时(LD90在20小时)。仅具有GMCSF募集和CpG佐剂(不含FcMBL珠和RS218裂解产物)的PLG支架在96小时仅保护20％的动物。阴沟肠杆菌和大肠杆菌都是肠杆菌科的成员。图12B描述了具有PLG疫苗支架的小鼠的单个器官病原体计数，所述PLG疫苗支架含有FcMBL捕获的阴沟肠杆菌裂解产物或FcMBL捕获的RS218裂解产物。以无菌方式收集器官培养物，通过机械破碎处理并铺板以测定每个单个器官中病原体的滴度。器官培养物显示疫苗接种动物中病原体滴度的降低。
图13描述了具有不同支架的疫苗组合物的剂量反应研究。具体地，用不同剂量的大肠杆菌RS218裂解产物包被具有FcMBL珠的MPS支架和GMCSF/CpG的预防性疫苗。具有15个PAMP单位的疫苗保护90％的小鼠免于21天攻击，而具有3个PAMP单位的疫苗仅保护70％。所有接受含GMCSF/CpG和涂覆有15个PAMP的FcMBL珠的PLG疫苗支架的小鼠在攻击中存活。
图14描述了用含有FcMBL捕获的RS218裂解产物的MPS疫苗支架接种的小鼠的存活曲线。具有涂覆了大肠杆菌(RS218)裂解产物的FcMBL珠的MPS-GMCSF/CpG的预防性疫苗保护90％小鼠免于RS218攻击直到96小时研究结束时(n＝12)。接种假MPS-GMCSF/CpG的小鼠中只有50％在RS218攻击下存活(n＝6)。
图15A-15B描述了单一植入剂量的感染疫苗技术的长期效果。图15A描述了具有用大肠杆菌RS218裂解产物包被的FcMBL珠的PLG-GMCSF/CpG的预防性疫苗保护100％的小鼠超过96天，尽管在第21、60和90天具有(加强)RS218攻击。图15B描述了使用更高攻击剂量的RS218细菌，并显示具有涂覆有大肠杆菌RS218裂解产物的FcMBL珠的PLG-GMCSF/CpG的预防性疫苗保护75％的小鼠超过96天。
图16是描述PLG和MPS支架两者的密集细胞浸润的组织学图像。
图17描述了感染疫苗技术的长期抗体介导的保护作用。具体地，图17描述了在90天的时间内针对RS218细菌的长期IgG滴度。
图18描述了结核病中FcMBL与结核分枝杆菌(MTb)的结合以及感染疫苗技术用于治疗结核病的潜在用途。具体地，FcMBL可以与结核分枝杆菌(MTb)细胞壁的甘露糖基化组分结合，例如，甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)。
图19描述了针对甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)的感染疫苗技术的抗体介导的效果。当用单剂的含有涂覆了LAM裂解产物的FcAML珠的MPS-GMCSF/CpG接种小鼠时，LAM特异性IgG的滴度比疫苗接种前的天然动物提高2-3个量级。(p＝<0.001)。
图20描述了针对甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)的细胞介导的抗LAM反应。具体地，图20描述了含有FcMBL珠和MTb PAMP的PLG支架中浸润细胞的FACS分析。对照支架(假)显示很少的浸润细胞，而树突细胞、巨噬细胞和CD4+T细胞在测试支架(Vax)中显著增加。
图21A-21B描述了FcMBL捕获多种病原体属的能力。图21A描述了用FcMBL珠包被来自革兰氏阴性细菌(大肠杆菌RS218)、革兰氏阳性细菌(MRSA，LAM)、真菌(白色念珠菌)、病毒(HIV gp120)和寄生虫(阴道毛滴虫)的不同量的PAMP。图21B描述了接种疫苗时小鼠中增加的抗体滴度。小鼠用含有用来自革兰氏阴性细菌(大肠杆菌RS218)、革兰氏阳性细菌(MRSA，LAM)、真菌(白色念珠菌)、病毒(HIV gp120)和寄生虫(阴道毛滴虫)的样品涂覆的FcMBL珠的单剂MPS-GMCSF/CpG接种。在所有情况下，LAM特异性IgG的滴度比接种疫苗前的天然动物增加。
图22描述了针对掺入疫苗中的毛滴虫裂解产物的细胞介导的抗毛滴虫反应。具体地，图22描述了接种动物的脾脏中浸润细胞的FACS分析。对照脾脏(原始)与接种动物组中的脾脏相比显示出更少的浸润CD4+T细胞和CD11c细胞。
图23描述了在用包含替代的凝集素，表面活性蛋白D(SPD)的疫苗组合物接种的小鼠中产生的抗体滴度。表面活性蛋白D(SPD)是与MBL相关的另一种胶原凝集素(具有胶原区域的C型凝集素)。产生FcSPD，其与FcMBL具有77％的蛋白质序列同一性。FcSPD显示为能够结合RS218大肠杆菌。当FcSPD捕获的RS218掺入MPS支架中并用于接种小鼠时，引发抗体介导的免疫反应。与未接种疫苗的对照相比时，在接种疫苗的小鼠中观察到抗体滴度增加。
具体实施方式
本发明至少部分地基于以下发现：使用调理素或凝集素(例如工程化的凝集素或其片段)分离的病原体或病原体相关分子模式(PAMP)可用于产生用于治疗传染性疾病的功能性疫苗。特别地，本发明人惊奇地发现，当其与生物活性剂(例如佐剂)和/或支架组合时，使用工程化凝集素分离的病原体或病原体相关分子模式(PAMP)允许快速产生高效力病原体疫苗(图1)。当其用于接种免疫动物时，单剂量的这些疫苗导致接种的动物中显著降低的病原体滴度，并且在用致死剂量的细菌感染动物后显著延长的存活时间。实际上，如实施例1中所示，单剂量的本发明的疫苗组合物可以在90天的时间内保护接种疫苗的小鼠免受细菌攻击。此外，调理素或凝集素，例如工程化的凝集素或其片段，不仅起到分离病原体以用于疫苗组合物并将病原体呈递给免疫细胞以引发免疫应答的作用，而且可用作锚结构以固定病原体，从而防止病原体从疫苗组合物渗漏，并防止目前病原体渗漏引起的任何不希望的副作用。
本发明的疫苗组合物具有优于现有疫苗的额外改进。例如，本发明的疫苗组合物允许快速和直接分离来自患有传染病的患者的血液样品中的循环病原体，其中包括已知和未知的病原体、存在于其他生物体液中的病原体或存在于体外培养物中的病原体。要求保护的疫苗组合物还可用于针对难以分离和纯化的病原体。一旦病原体从受试者中分离，疫苗组合物可以在世界任何地方以快速和方便的方式容易地制备，并且可以及时地，例如在一天内为患者提供。此外，使用所要求保护的疫苗组合物的疫苗接种可以以更可控、局部和更安全的方式发生，而不损害疫苗组合物的功效。所要求保护的疫苗的稳定性的提高使得它们便于携带并且可以用于在室温下长期储存而无需冷藏。此外，当组合物中包含一种以上类型的病原体时，疫苗组合物可以是多价疫苗，并且还可以用于针对给定病原体的不同种或菌株接种疫苗。此外，如果植入疫苗组合物，其可以在疫苗接种后容易地从受试者中移除。例如，在其中疫苗接种后出现过多的免疫应答或不希望的副作用的情况下，可以容易地从受试者移除植入的疫苗组合物。相反，目前现有的疫苗一旦被注射至受试者中就不能被除去。这些改进规避了当前病原体疫苗的主要局限性，并且对于公众是非常有意义的，特别是在流行病时期中，例如，对于发展中国家的人群，或者对于军事用途具有重要价值，其中在这些地方容易获得的疫苗是非常需要的。实际上，快速产生不仅易于储存和处理，而且可以以更安全和更可控的方式施用并赋予长期保护作用的功能性和高度稳定的疫苗的能力使得本发明的疫苗组合物比现有疫苗显著有利。
因此，本发明提供了疫苗组合物和制备这种组合物的方法。本发明的其他实施方案包括治疗病原体感染的方法，针对病原体感染使受试者接种疫苗的方法，以及在需要的受试者中治疗抗生素抗性细菌感染的方法。在进一步的实施方案中，本发明包括降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法，增加具有病原体感染的受试者的存活率的方法，减少与病原体感染相关的疼痛的方法和减轻需要的受试者中与病原体感染相关的痛苦的方法。本文还提供了新型支架组合物和病原体组合物及其用途。
I.定义
为了更容易地理解本发明，首先定义某些术语。另外，应当注意，每当列举参数的值或值范围时，意图表示所列举的值中间的值和范围也是本发明的部分。
在以下描述中，出于解释的目的，阐述了具体的数字、材料和配置以便提供对本发明的透彻理解。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下实践本发明。在某些情况下，可以省略或简化公知的特征以免模糊本发明。此外，在说明书中对诸如“一个实施方案”或“一实施方案”的短语的引用意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。在说明书中各处出现的诸如“在一个实施方案中”的短语不一定都指的是同一实施方案。
这里使用的冠词“一”和“一个”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”表示一个元素或多于一个元素。
术语“包含”或“包括”在本文中用于指本发明必需的组合物、方法和其各自的组分，但仍然是开放的以包括未指明的元素，无论是否必需。
术语“由...组成”是指如本文所述的组合物、方法和其各个组分，其不包括在该实施方案的描述中未列举的任何要素。
如本文所用的术语“疫苗”包括含有免疫原性决定簇的任何组合物，所述免疫原性决定簇刺激免疫系统使得其可以更好地响应后续的感染。疫苗通常含有免疫原性决定簇(例如抗原)和佐剂，该佐剂用于非特异性地增强对该免疫原性决定簇的免疫应答。目前生产的疫苗主要激活体液免疫系统，即抗体依赖性免疫应答。其他疫苗集中于激活细胞介导的免疫系统，包括能够杀死靶定的病原体的细胞毒性T淋巴细胞。
如本文所用的术语“调理素”是指识别病原体细胞的表面分子的任何蛋白质或其片段，例如病原体相关分子模式(PAMP)，从而标记和靶向结合的病原体细胞以进行破坏，例如，通过补体攻击和吞噬作用。在一些实施方案中，调理素是天然调理素，例如由B细胞响应于抗原暴露而产生的抗体，作为先天免疫应答的部分的补体蛋白，或可溶性免疫模式识别蛋白，其能够识别非自身或改变的自身分子模式，包被外来微生物或改变/死亡的细胞，并通过吞噬作用或补体攻击增强嗜中性粒细胞对它们的反应性(Litvack等，2010，InnateImmunity16(3):191-200)。可溶性免疫模式识别蛋白的实例可包括但不限于胶原凝集素、ficolins、正五聚蛋白、sCD14、MFG-E8、天然IgM和C1q。
如本文所用的术语“凝集素”是指能够结合碳水化合物结构，例如病原体上的碳水化合物结构或与病原体相关分子模式(PAMP)相关的碳水化合物结构的任何蛋白质或其片段。凝集素包括天然存在的凝集素或工程化凝集素，例如工程化甘露糖结合凝集素(MBL)、表面活性蛋白D(SPD)或其片段。例如，工程化的甘露糖结合凝集素包括MBL的碳水化合物识别结构域，例如MBL的颈部和凝集素结构域，例如MBL的氨基酸残基81至228或MBL的氨基酸残基111至228，其融合至人IgG的Fc部分的下游。
如本文所用的术语“病原体”是指能够在受试者中诱导传染性疾病的任何病原体或病原体片段。在一些实施方案中，病原体是传染性微生物(其选自于细菌、真菌，病毒和寄生虫)或其片段。病原体可包括完整的传染性病原体细胞，或病原体细胞的一部分，例如传染性微生物的细胞壁组分。在一些实施方案中，病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)，例如病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分或从病原体释放的组分。术语“病原体”还包括从病原体释放的支原体或毒素。用于本发明的疫苗组合物的病原体引起被施用疫苗的受试者的物种(例如哺乳动物)或密切相关物种的疾病或感染。例如，病原体可以从接受包含病原体的疫苗的相同受试者中分离。或者，病原体可以从患有病原体感染的一个受试者中分离，并将包含病原体的疫苗组合物施用于具有相同病原体感染的不同受试者。适用于疫苗组合物的病原体也可以源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物，或者病原体可以是合成的病原体。
如本文所用的术语“病原体相关的分子模式”或“PAMP”是指指导靶向的宿主细胞区分“自身”与“非自身”(例如感染的病原体)并促进与先天免疫有关的信号的任何微生物组分。示例性的PAMP可包括但不限于病原体片段；病原体碎片；病原体核酸，包括DNA(例如，未甲基化的CpG基序)、双链RNA(dsRNA)、单链RNA(ssRNA)和5'-三磷酸RNA；病原体脂蛋白；病原体表面糖蛋白；病原体膜组分，例如肽聚糖、糖基磷脂酰肌醇；和从病原体释放的组分，例如从病原体释放的毒素。在一些实施方案中，所述毒素选自于内毒素、脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、壁磷壁酸(WTA)和蓖麻毒素。
如本文所用的术语“生物制剂”是指能够在受试者中募集免疫细胞的任何试剂。生物制剂可以是天然存在的、合成产生的或重组产生的化合物。适用于本发明要求保护的疫苗组合物的生物制剂包括佐剂；细胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、干扰素-γ(γ-IFN)、IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)；或生长因子，如转化生长因子-α(TGF-α)、TGF-β、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NFG)、神经营养因子、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、生长分化因子-9(GDF-9)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)。
如本文所用的术语“佐剂”是指可以添加到疫苗中以刺激针对抗原的免疫应答的化合物。佐剂可以增强高度纯化的或重组抗原的免疫原性。佐剂可以减少保护性免疫所需的抗原量或免疫次数。例如，佐剂可激活分泌抗体的B细胞以产生更高量的抗体。或者，佐剂可以作为抗原的贮库，在较长时间内呈递抗原，这可以帮助最大化免疫应答并提供更持久的保护。佐剂也可用于通过帮助改变对特定类型的免疫系统细胞的免疫应答来增强疫苗的功效，例如，通过根据疫苗的目的激活T细胞而不是分泌抗体的B细胞。
如本文所用的术语“支架”是指包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞的任何结构。支架提供了调理素或凝集素结合的病原体构建体或生物制剂可以结合或附着在其上或者其中的物理结构。调理素或凝集素结合的病原体构建体可以包封在支架内用于递送或施用于受试者，从而防止病原体从疫苗组合物的任何不希望的渗漏。支架包含无毒的或非免疫原性的生物相容性材料。如本文所用的术语“生物相容性材料”是指在其植入受试者的生物组织中或放置在其附近时不会随着时间而明显退化和不会引起显著的免疫反应或有害的组织反应，例如毒性反应或显著的刺激，或当其与血液接触时不会诱导血液凝固或凝结的任何材料。
如本文所用的术语“免疫细胞”是指免疫系统的任何细胞，其起到保护身体免受传染病和外来入侵者的作用。示例性的免疫细胞包括但不限于T细胞、B细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、巨噬细胞、粒细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞。
如本文所用的术语“抗原呈递细胞”是指能够在其表面上展示抗原的任何细胞。抗原呈递细胞将抗原加工成肽片段并将它们在细胞表面上呈递给免疫系统的T细胞。可以在多种组织类型中找到抗原呈递细胞。经典的抗原呈递细胞，包括巨噬细胞、B细胞和树突细胞，与MHC II类分子结合以将外源抗原呈递给辅助性T细胞。而可以表达MHC II类分子的其他细胞类型，例如肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和3型先天淋巴细胞(ILC3s)，也可以作为抗原呈递细胞(Kambayashi和Laufer，2014，Nature Reviews Immunology14,719-730)。抗原呈递细胞还可包括任何细胞，例如有核细胞，其能够在细胞表面上向细胞毒性T细胞展示内源性肽，通常使用MCH I类分子。除MHC蛋白家族外，抗原呈递还依赖于APC和T细胞两者表面上的其他特化信号传导分子。
如本文所用的术语“冻干”是指用于保存组合物(例如，本发明的疫苗组合物、支架组合物和/或调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体)或使得该组合物更便于储存和运输的脱水过程。冷冻干燥是通过冷冻组合物和然后降低周围压力以使组合物中的冷冻水直接从固相升华为气相而发挥作用。在一些实施方案中，冻干增加了所要保护的本发明的疫苗组合物的稳定性，从而使疫苗组合物便于携带并且在室温下储存而无需冷藏。
疾病或病症(例如由病原体引起的传染病)的“治疗”、“预防”或“改善”意指延迟或防止这种疾病或病症的发作，逆转、缓解、改善、抑制、减缓或停止进展、加重或恶化、与这种疾病或病症(例如病原体感染)相关的病症的进展或严重性。在一个实施方案中，疾病或病症(例如病原体感染)的症状，或与病原体感染相关的疼痛和痛苦，减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
如本文所用，“受试者”意指人或动物。动物可以是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括奶牛、绵羊、猪、山羊、鸟、马、猪、鹿、野牛、水牛、两栖动物、爬行动物、猫科物中如家猫、犬科物种如狗、狐狸、狼，鸟类如鸡、鸸鹋、鸵鸟及鱼如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在某些实施方案中，受试者是胚胎或胎儿，其中在用本发明接种疫苗后引发终身保护。
在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长动物，例如人类。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马、猪、绵羊、山羊、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼或奶牛。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表传染病或其他相关病理的动物模型学的受试者。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是成年人、青少年或儿童。受试者可以是先前已被诊断患有或被鉴定为患有或具有发展为传染病或与病原体感染相关的疾病和病症的风险的受试者。
II.本发明的疫苗组合物
本发明提供了适用于预防和治疗传染病的疫苗组合物。该疫苗组合物包含调理素或凝集素结合的病原体构建体和能够在受试者中募集免疫细胞的生物制剂。
本发明的疫苗组合物经调节以激活免疫细胞并用特定抗原(例如，以调理素结合的病原体构建体形式或以凝集素结合的病原体构建体形式呈现的病原体)激发细胞，从而增强免疫防御和对不希望的病原体的破坏。该疫苗组合物吸引适当的免疫细胞，例如巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和树突细胞。
能够在受试者中诱导传染病的任何病原体或病原体片段可用于本发明的疫苗组合物中。在一些实施方案中，病原体是传染性微生物，包括完整的传染性病原体细胞或传染性微生物的任何细胞片段，例如传染性微生物的细胞壁组分。在其他实施方案中，病原体包括病原体释放的材料、病原体碎片、病原体毒素或病原体相关的分子模式(PAMP)。在一些实施方案中，传染性微生物的细胞壁组分是糖基化的。在其他实施方案中，细胞壁组分是甘露糖基化的。在一些实施方案中，细胞壁组分是甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)。在其他实施方案中，细胞壁组分是磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)。
适用于疫苗组合物的病原体的实例包括但不限于细菌、病毒、类病毒、支原体、寄生虫、真菌或其片段。细菌可以是下列属的成员：奈瑟氏菌属(Neisseria)、气杆菌属(Aerobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、埃希氏菌属(Escherichia)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、志贺氏菌属(Shigella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、螺杆菌属(Helibacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、梭菌属(Clostridium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)；博代氏杆菌属(Bordetelia)、布鲁氏菌属(Brucelia)、弧菌属(Vibrio)、链球菌属(Streptococcus)、疟原虫属(Plasmodium)、血吸虫属(Schisostoma)或假丝酵母属(Candida)。示例性细菌还可以包括但不限于鲍曼不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、脆弱拟杆菌、沙眼衣原体、弗氏柠檬酸杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、乙型流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、粘质沙雷氏菌、福氏志贺菌、嗜麦芽寡养单胞菌、假结核耶尔森菌、枯草芽孢杆菌、新型梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)、单核细胞增生李斯特菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风杆菌、皮疽诺卡菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、A群链球菌、B群链球菌(无乳链球菌)和C群链球菌。
在一些实施方案中，细菌是抗生素抗性细菌。在一些实施方案中，细菌是多重耐药细菌。在其他实施方案中，抗生素抗性细菌或多重耐药细菌选自于鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(MDR/CRE)、铜绿假单胞菌、艰难梭菌、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
任何真菌都可用于本发明的疫苗组合物中。示例性真菌可包括但不限于曲霉菌、芽生菌属、白色念珠菌、glabrata、guilliermondii、krusei、parapsilosis、tropicalis、隐球菌属、镰刀菌、毛霉菌、酵母属和耶氏(卡氏)肺孢子虫。
用于本发明的疫苗组合物的示例性病毒可包括但不限于流感病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、EBV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、HSV 1、HSV2、巨细胞病毒(CMV)、甲型流感病毒、马尔堡病毒、人呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS冠状病毒、西尼罗河病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)和寨卡病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、人类T细胞白血病病毒(HTLV)、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、麻疹病毒、虫媒病毒(arbor virus)、柯萨奇病毒、疱疹病毒、汉坦病毒、杆状病毒、腮腺炎病毒、圆环病毒、vichaivirus、沙粒病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、禽白血病-肉瘤病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MLV)、猫白血病病毒(FeLV)、猿猴肉瘤病毒(SIS)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)、猿猴艾滋病病毒(SRVs)、猿猴T细胞白血病病毒(SUN)、牛白血病病毒(BLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FTV)、维斯纳/梅迪(Visna/maedi)病毒(VMV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)。
用于本发明的疫苗组合物的示例性寄生虫可包括但不限于隐孢子虫属、利什曼原虫属、疟原虫属、血吸虫属、毛滴虫属和锥虫属。用于本发明的疫苗组合物的示例性支原体可包括但不限于肺炎支原体、人型支原体和口腔支原体。
在一些实施方案中，病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。如本文所用的术语“病原体相关分子模式”是指宿主中先天免疫系统的细胞所识别的微生物的任何组分(Tang等，2012，Immunol Rev.，249(1)：158-175和Sangiuliano等，2014，Mediators ofInflammation,Article ID 821043)。具体地，由于PAMP存在于多种多样的生物体中，但在宿主中不存在，它们提供外源危险信号，该信号被宿主细胞中的特定受体识别并警告宿主免疫系统病原体的存在，从而促进免疫。
示例性PAMP可包括但不限于病原体片段；病原体碎片；病原体核酸，包括DNA(例如，未甲基化的CpG基序)、双链RNA(dsRNA)、单链RNA(ssRNA)和5'-三磷酸RNA；病原体脂蛋白；病原体表面糖蛋白；病原体膜组分如肽聚糖、糖基磷脂酰肌醇；和从病原体释放的组分，例如从病原体释放的毒素。在一些实施方案中，毒素选自内毒素、脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、壁磷壁酸(WTA)和蓖麻毒素。
PAMP可被模式识别受体(PPR)识别，如Toll样受体(TLR)和其他PRR，如维甲酸诱导基因I(RIG-I)样受体(RLR)、AIM2样受体(ALR)和核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLR)。在PAMP识别后，活化的TLR和定位于细胞表面、细胞质和/或细胞内囊泡的其他PRR向宿主提供信号，指示存在微生物感染并通过激活多种细胞内信号传导途径触发促炎性和抗微生物反应，所述途径包括衔接分子、激酶和转录因子如核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)和IFN调控因子(IRF)。PAMP诱导的信号转导途径最终导致基因表达的激活和广范分子的合成，包括细胞因子、趋化因子、细胞粘附分子和免疫受体，其通过探测微生物而指导对入侵病原体的适应性免疫反应。
疫苗组合物中应包含有效量的病原体或病原体片段。病原体或病原体片段的有效量是足以产生针对本发明的疫苗组合物的一种或多种病原体或病原体片段的免疫应答的量，例如，抗体分泌性B细胞或细胞毒性T细胞介导的免疫应答。本发明的疫苗组合物引发免疫应答的能力可以使用本领域技术人员可获得的任何常规方法来确定。在一些实施方案中，每种组合物的有效量是足以在受试者中产生细胞毒性T细胞应答的量，例如通过混合淋巴细胞T细胞测定法测量的。
在一些实施方案中，病原体或病原体片段以约1pg至约1000μg的量存在于疫苗组合物中。在一些实施方案中，病原体或病原体片段的量为1μg至100μg、1μg至200μg、1μg至300μg、1μg至400μg、1μg至500μg、1μg至600μg、1μg至700μg、1μg至800μg或1μg至900μg。在一些实施方案中，病原体或病原体片段的量为1μg至10μg、1μg至20μg、1μg至30μg、1μg至40μg、1μg至50μg、1μg至60μg、1μg至70μg、1μg至80μg或1μg至90μg。在一些实施方案中，病原体或病原体片段的量为1pg至100μg、1pg至90μg、1pg至80μg、1pg至70μg、1pg至60μg、1pg至50μg、1pg至40μg、1pg至30μg、1pg至20μg或1pg至10μg。在其他实施方案中，病原体或病原体片段的量为10pg至1μg、20pg至1μg、30pg至1μg、40pg至1μg、50pg至1μg、60pg至1μg、70pg至1μg、80pg至1μg、90pg至1μg、100pg至1μg或1000pg至1μg。
用于本发明疫苗组合物的病原体是中和的。例如，病原体通过用抗生素、紫外光、超声、微波、珠磨机、X射线、热压法、辐射或机械破碎处理来中和。中和后的病原体变成非传染性的。在疫苗组合物中使用非传染性病原体是有益的，并且可以减少病原体毒素所经历的潜在严重副作用。
本发明的疫苗组合物可包含一种或多种类型的病原体以产生单价或多价疫苗。在一些实施方案中，疫苗组合物包含一种类型的病原体。在其他实施方案中，疫苗组合物包含多种类型的病原体，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同类型的病原体，例如2、3、4、5，6、7、8、9、10、1-4、1-5、2-5、2-10、3-6、3-10或5-10种不同类型的病原体。
本发明的疫苗组合物还可用于跨物种接种给定病原体。例如，包含病原体的一种特定物种或菌株的要求保护的疫苗组合物可用于针对病原体的多种相关物种或菌株接种疫苗。对于给定的病原体跨物种接种的能力是特别有利的，特别是对于具有含有不同表面抗原的多种物种或菌株的病原体。对于那些病原体，疫苗株和感染株之间抗原结构的不一致通常是重要的问题。例如，当与疫苗株不同的病原体株引起传染病时，疫苗接种将变得无效。然而，这对于要求保护的疫苗组合物而言不是问题，因为它们具有靶向特定病原体的多种物种的优异能力。
适用于本发明疫苗组合物的病原体可以从任何来源获得。例如，病原体可以直接从源自受试者体内的样品中分离。在一些实施方案中，病原体从接受包含病原体的疫苗的相同受试者中分离。在其他实施方案中，病原体从具有病原体感染的一个受试者分离，并且将包含病原体的疫苗组合物施用于具有相同或相似病原体感染的不同受试者。例如，病原体可以从人类受试者中分离，并施用于感染了相同病原体或病原体的相关物种的不同人类受试者。或者，病原体可以从受试者(例如动物)中分离，并施用于感染相同病原体或病原体的相关物种的不同受试者，例如人。
适合于病原体分离的样品的实例包括但不限于血液样品、血浆样品、血清样品、血液培养样品、脑脊髓液样品、关节液样品、尿液样品、精液样品、唾液样品、痰液样品、支气管液样品和泪液样品。
或者，适用于疫苗组合物的病原体可源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。在另一个实施方案中，病原体可以是合成的病原体。
使用本领域已知的方法分离用于疫苗组合物的病原体。在一些实施方案中，使用调理素或凝集素从样品中分离病原体，并以疫苗组合物中调理素结合的病原体构建体或凝集素结合的病原体构建体的形式存在。
如实施例1中所证明的，使用凝集素分离的病原体片段与直接使用微生物裂解产物(例如细菌裂解产物)相比具有意想不到的优势。虽然细菌裂解产物和凝集素捕获的细菌片段都可以用于产生功能性疫苗组合物并保护小鼠免受细菌感染的致命攻击，但是在疫苗组合物中直接使用细菌裂解产物与不希望的副作用有关，如裂解产物的浸出和给药部位的脓肿的形成。因此，凝集素或调理素不仅起到分离用于疫苗组合物的病原体的作用，并且将病原体呈递给免疫细胞以引发长期免疫应答，而且还用作固定病原体的锚结构，从而防止病原体从疫苗组合物中泄漏。
使用凝集素或调理素直接分离病原体赋予额外的益处，例如，当特定病原体或病原体片段(例如LPS)难以纯化时，或当病原体未知或难以培养时，向微生物裂解产物中添加凝集素或调理素将促进所需病原体的分离，从而形成可用于疫苗组合物的调理素或凝集素结合的病原体构建体。
适用于本发明的疫苗组合物的调理素包括可以识别病原体细胞的表面分子(例如病原体相关分子模式)的任何蛋白质或其片段，从而靶向调理素结合的病原体细胞以通过补体攻击和吞噬作用进行破坏。
在一些实施方案中，调理素结合的病原体构建体中的调理素是天然调理素或其部分，例如由B细胞响应于抗原暴露而产生的抗体、作为先天免疫反应的部分的补体蛋白或可溶性免疫模式识别蛋白，其能够识别非自身的或改变的自身分子模式，包被外来微生物或改变的/死亡的细胞，并通过吞噬作用或补体攻击增强中性粒细胞对它们的反应性(Litvack等，2010,Innate Immunity 16(3):191-200)。通常，外源病原体在其表面上展示出改变的分子阵列。例如，外来微生物的细胞表面通常含有或允许接近与来自宿主细胞的那些不同的脂质、细胞内糖蛋白和核酸如DNA。这些细胞表面模式被认为是用于调理素分子的信号，其将标记并靶向识别的细胞用于杀死。类似地，程序性细胞死亡过程如细胞凋亡也产生含有细胞内组分的细胞表面泡。这些泡很容易释放以便有效清除或发出信号。在细胞死亡的晚期阶段，还释放作为调理素分子的信号发挥作用的可溶性组分如lysoPC和核苷酸。(Litvack等，2010，Innate Immunity 16(3)：191-200)。可溶性免疫模式识别蛋白的实例可包括但不限于胶原凝集素、ficolins、正五聚蛋白、sCD14、MFG-E8、天然IgM和C1q，其可有效地识别这些特定分子模式中的一些。
工程化的调理素或凝集素，例如工程化的甘露糖结合凝集素、表面活性蛋白D或其片段，也可用于本发明的疫苗组合物中。通过使用基因工程及直接进化和选择策略，可以工程设计天然调理素或凝集素的修饰形式。这种工程化的调理素或凝集素分子可用于结合病原体或鉴定用于疫苗组合物中的特定病原体种类以用于治疗和诊断患有传染病的患者。
在一些实施方案中，调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体包含凝集素、凝集素的一部分、工程化的凝集素或其部分。在一些实施方案中，凝集素是胶原凝集素。在其他实施方案中，凝集素是ficolin。
在一些实施方案中，凝集素包含肺表面活性蛋白D(SPD)。在其他实施方案中，表面活性剂蛋白D(SPD)能够结合病原体。肺表面活性物质(脂质和蛋白质的复杂混合物)对肺功能至关重要。肺表面活性蛋白D(SPD)在肺的免疫和炎症调节中具有重要作用，因为它调节肺中表面活性剂的水平并充当宿主防御蛋白。
在一些实施方案中，凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。MBL是与甘露糖、含有N-乙酰基葡萄糖胺(NAG)的碳水化合物以及存在于许多微生物病原体表面上的各种其他碳水化合物结合的血清凝集素。MBL(也称为甘露糖-或甘露聚糖-结合蛋白，MBP)是由三个或更多个32kDa单体组装的聚合蛋白。每个单体具有N-末端富含半胱氨酸的区域、胶原蛋白样的gly-X-Y区域、颈部区域和碳水化合物识别结构域。较高分子量聚合物的组装开始于形成32kDa单体的三聚体；然后这些三聚体自组装成三至六组三聚体的更高分子量的聚合物。
MBL是微生物病原体的调理素作用中和补体活化(通过凝集素途径)和凝血中的关键组分。调理素作用是蛋白质与靶细胞的结合，然后将这些细胞靶向以被吞噬细胞(例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)摄取和破坏。该调理素作用似乎由MBL的小的富含半胱氨酸的N-末端结构域以及通过MBL介导的凝集素补体途径激活沉积在靶细胞表面上的C3b介导。在通过凝集素途径的补体激活中，微生物和特化的蛋白质，即MASP-1(甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶)和MASP-2，与结合的MBL相互作用，并在没有抗体的情况下激活补体(Matsushita&Fujita，1992，J.Exp.Med.176(5)：1497-1502；Thiel等，1997，Nature 386：506-510)。较高分子量的MBL复合物(功能性MBL三聚体的5至6个重复)是通过该凝集素途径的有效的补体激活剂，其中MASP 2似乎激活补体，并且MASP 1激活凝结。较小的复合物(MBL三聚体单元的三至四个重复)是最有效的凝结激活剂(Krarup等，2007PLoS One，2(7)，e623)。
MBL是用于本文所述疫苗组合物的极好选择；然而，完整的分子通常不在全血存在下使用，因为野生型MBL具有多个功能结构域，其可以激活吞噬作用、血液凝结和补体，这可能干扰治疗性疫苗功能或使其复杂化。MBL的这种特征可以与本文提供的其病原体结合功能分离。更具体地，MBL含有四个部分，从N-末端到C-末端：可能参与巨噬细胞结合和/或MASP结合的基本上未知功能的小N末端结构域；可能涉及MASP结合和更高阶的寡聚化的胶原蛋白片段；足以三聚化的α-螺旋“颈缩”段；以及介导直接病原体结合的C末端的碳水化合物识别凝集素结构域。凝集素结构域可用于本发明而用于病原体分离。在一些实施方案中，凝集素包含MBL的颈部和凝集素结构域。例如，凝集素可包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基81至228，或MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基111至228。参见，例如，美国专利No.9,150,631。上述专利的全部内容在此引入作为参考。
凝集素(例如MBL)的结合特征可以通过定向进化用于改变的结合特异性来操控。可以修饰MBL以使其结合有限的一组糖或其他分子特征，使得修饰的MBL将结合选定的一组微生物以提供更具体的病原体类别捕获能力。例如，工程化的MBL可能能够捕获某些病原体类别，例如一种或多种细菌物种，例如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌；一种或多种病毒物种；一种或多种真菌物种；或一种或多种原生动物物种。
例如，用于本发明的疫苗组合物的工程化凝集素，例如MBL，可以通过观察与糖复合的MBL的原子结构，和然后突变以糖-特异性方式形成接触的适当氨基酸以使得独特的接触丢失或形成特定类型的空间位阻来产生。例如，大鼠MBL的三维结构已经在与高甘露糖寡糖、与N-乙酰葡糖胺和与甲基化岩藻糖的复合物中解析。His189Val和Ile207Val是修饰改变特异性的置换的实例。
定向进化策略可应用于MBL，以选择具有与特定类型病原体的特异性结合的MBL变体，所述病原体例如酵母、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、凝固酶阴性细菌和需氧细菌。可以通过本领域已知的任何方法分离具有特定特异性的MBL衍生物，例如标准的噬菌体展示策略。首先，可以从噬菌粒载体表达一组MBL变体；然后将该文库与目标靶标(例如大肠杆菌)结合，并进行一轮或两轮选择。随后，接着进行针对相关靶标(例如念珠菌属)的一轮阴性选择，获取那些不能结合的噬菌粒。然后重复这些阳性和阴性选择的循环，直到产生通常与靶标结合并且不与非靶标结合的噬菌体群体。该方法可以应用于需要差异结合的任何微生物菌株对，例如对给定抗生素具有抗性和敏感性的细菌。
MBL属于C型(钙依赖性)凝集素超家族中的胶原凝集素类别，其中的其他成员，如表面活性蛋白A、表面活性蛋白D、CL-L1和CL-P1，可能可用于构建工程化的凝集素以用于本发明的疫苗组合物。其他可能的凝集素包括ficollin，其也可以激活补体的凝集素途径并结合MASP蛋白。Ficollin蛋白与MBL有关，但具有不同的和更有限的特异性。在本文所述的疫苗组合物的情况中，一种选择是使用对应于上述MBL的凝集素结构域的ficollin的凝集素结构域。另一种方法是在MBL和一种或多种Ficollin之间使用区段或单个氨基酸的“改组”来产生可具有杂种特异性的杂合分子。上述定向进化和选择方法也可潜在地用于产生提供类别、亚类和物种特异性的工程化蛋白质。
调理素或凝集素，例如工程化的MBL或SPD，可以进一步包含免疫球蛋白Fc部分。例如，MBL的颈部和凝集素结构域可以在人IgG的Fc部分的下游融合。Fc部分可以包括IgG Fc结构域的CH2-CH3界面，其包含多个Fc受体的结合位点，包括葡萄球菌蛋白A。使用中，Fc部分二聚化并增强MBL凝集素与单糖结合的亲合亲和力。另外，可以除去重组凝集素的n-连接糖基化。例如，当MBL的颈部和凝集素结构域(例如，MBL的氨基酸残基81-228)与IgG的Fc部分融合时，可以通过将抗体中编号氨基酸的Kabat系统中的残基297处的氨基酸从天冬酰胺改变为天冬氨酸(N297D)来除去所得融合蛋白的糖基化，其对应于该特定FcMBL构建体中的氨基酸82。
调理素或凝集素，例如工程化的MBL或SPD，可进一步包含固体基质。用于融合MBL凝集素-Fc或SPD-Fc蛋白的附着的任何固体基质均可用于本发明的疫苗组合物中。固体基质可以促进病原体长期呈递给免疫细胞。固体基质的实例可包括但不限于珠，例如磁珠、微孔膜、中空纤维反应器、血液过滤膜和血流装置。
在一些实施方案中，固体基质可包含珠，例如磁珠，或其他结构化材料，其然后将病原体从样品(包括生物流体，例如血液或体外病原体培养物，以及如上所述的任何其他样品)中拉出，并浓缩和收集病原体，包括活的病原体。或者，固体基质可包括中空纤维反应器或任何其他血液过滤膜或流动装置(例如，简单的透析管)或其他树脂、纤维或薄片，以选择性地结合和隔离生物病原体。
珠，例如磁珠，可以是任何形状，包括但不限于球形、棒形、椭圆形、圆柱形、圆盘形等。在一些实施方案中，具有真正球形形状和确定的表面化学的珠(例如磁珠)用于最小化化学凝集和非特异性结合。如本文所用的术语“磁珠”是指被磁场梯度吸引或排斥或者具有非零磁化率的纳米或微米级颗粒。磁珠可以是顺磁性的或超顺磁性的。在一些实施方案中，磁珠是超顺磁性的。磁珠也称为磁性颗粒。在一些实施方案中，具有聚合物壳的磁珠用于保护病原体免于暴露于铁。例如，聚合物包被的磁珠可用于保护病原体免于暴露于铁。
珠(例如磁珠)的直径范围可以是1nm至1mm。例如，珠(例如磁珠)的直径为约50nm、直径为约128nm、直径为约500nm、直径为约1μm、直径为约250nm至约250μm、直径为约0.1μm至100μm、直径为0.1μm至50μm或直径为0.1μm至10μm。在一些实施方案中，磁珠是磁性纳米颗粒或磁性微颗粒。磁性纳米颗粒是一类可以使用磁场或磁场梯度进行操作的纳米颗粒。这种颗粒通常由磁性元素(如铁、镍或钴)组成。磁性纳米颗粒是众所周知的，并且其制备方法已在本领域中描述。参见，例如，美国专利No.6,878,445；No.5,543,158；No.5,578,325；No.6,676,729；No.6,045,925；和No.7,462,446；和美国专利公开号No.2005/0025971；No.2005/0200438；No.2005/0201941；No.2005/0271745；No.2006/0228551；No.2006/0233712；No.2007/01666232；和No.2007/0264199。上述专利和专利申请的全部内容在此引用作为参考。
用于本发明的疫苗组合物的磁珠是商业上容易且广泛可得的，具有或不具有能够结合亲和分子的官能团。合适的磁珠是可商购的，例如购自Dynal Inc.(Lake Success,NY)；PerSeptive Diagnostics,Inc.(Cambridge,MA)；Invitrogen Corp.(Carlsbad,CA)；Cortex Biochem Inc.(San Leandro,CA)；和Bangs Laboratories(Fishers,IN)。在特定实施方案中，该磁性颗粒是MyOne TM 磁珠(Dynal Inc.)。
调理素或凝集素，例如工程化的调理素或凝集素，可以通过本领域熟知用于将肽与其他分子缀合的方法与固体基质缀合。例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques(第2版，Academic Press(2008))和Niemeyr，Bioconjugation Protocols：Strategies&Methods，in Methods In Molecular Biology(Humana Press，2004)提供了许多用于将肽与其他分子缀合的方法和技术。
或者，可以将固体基质的表面功能化以包括与调理素或凝集素选择性结合的结合分子。这些结合分子也称为亲和分子。结合分子可以共价或非共价地结合在固体基质的表面上。如本文所用的术语“结合分子”或“亲和分子”是指能够特异性结合本文所述的工程化调理素或凝集素的任何分子。结合分子的代表性实例包括但不限于抗体、抗原、蛋白质、肽、核酸(DNA、RNA、PNA以及作为其混合物或包括核苷酸衍生物或类似物的核酸)；受体分子，如胰岛素受体；受体的配体(例如，对于胰岛素受体的胰岛素)；和生物的、化学的、聚合的或其他的对另一种分子有亲和力的分子，如生物素和抗生物素蛋白。
可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的任何一种将结合分子与固体基质的表面缀合。结合分子可以共价或非共价地与固体基质的表面偶联或缀合。结合分子和表面之间的共价连接也可以通过接头介导。结合分子和表面之间的非共价连接可以基于离子相互作用、范德华相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键、静电相互作用和/或形状识别相互作用。
本发明的疫苗组合物包含一种或多种生物制剂。如本文所用的术语“生物制剂”是指能够在受试者中募集免疫细胞的任何试剂。生物制剂可以是天然存在的、合成产生的或重组的化合物。适用于本发明要求保护的疫苗组合物的生物制剂包括佐剂；细胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、干扰素-γ(γ-IFN)、IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)；或生长因子，例如，转化生长因子-α(TGF-α)、TGF-β、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NFG)、神经营养因子、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、生长分化因子-9(GDF-9)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)。
根据本发明适用的生物制剂包括但不限于DNA分子、RNA分子、反义核酸、核酶、质粒、表达载体、标记蛋白、转录或延伸因子、细胞周期控制蛋白、激酶、磷酸酶、DNA修复蛋白、致癌基因、肿瘤抑制因子、血管生成蛋白、抗血管生成蛋白、细胞表面受体、辅助信号传导分子、转运蛋白、酶、抗菌剂、抗病毒剂、抗原，免疫原、凋亡诱导剂、抗-凋亡剂、细胞毒素和针对免疫抑制的抗体(例如，转化生长因子(TGF)-β抗体或拮抗剂，以及腺苷(A2aR)拮抗剂)。
适用于本发明的生物制剂还可包括但不限于生长因子、激素、神经递质、神经递质或生长因子受体、干扰素、白细胞介素、趋化因子、细胞因子、集落刺激因子、趋化因子(chemotactic factors)、MMP敏感底物、细胞外基质成分。示例性生物制剂包括但不限于生长激素、甲状旁腺激素(PTH)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-α(TGF-α)、TGF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NFG)、神经营养因子、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、生长分化因子-9(GDF-9)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)、干扰素-γ(γ-IFN)、IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)、纤维蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、透明质酸、含RGD的肽或多肽，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、FLT-3配体和CD40配体。本文还考虑了可有利地用于改变细胞功能的任何上述蛋白质的剪接变体，以及其小分子激动剂或拮抗剂。
在一些实施方案中，生物制剂包含一种或多种佐剂。佐剂是增强针对抗原的特异性免疫应答的化合物。将佐剂添加到疫苗中以刺激免疫系统对靶抗原的反应。佐剂可以增强高度纯化的或重组的抗原的免疫原性。佐剂可以减少保护性免疫需要的抗原的量或免疫次数。例如，佐剂可激活分泌抗体的B细胞以产生更高量的抗体。或者，佐剂可以作为抗原的贮库，在较长时间内呈递抗原，这可以帮助最大化免疫应答并提供更持久的保护。辅助剂也可用于通过帮助改变对特定类型的免疫系统细胞的免疫应答来增强疫苗的功效，例如，通过根据疫苗的目的激活T细胞而不是分泌抗体的B细胞。佐剂也用于从免疫的动物产生抗体(Petrovsky1等，2002，Immunology and Cell Biology 82：488-496)。
佐剂可根据其来源、作用机制或物理化学性质进行分类。例如，佐剂可分为三组：(i)活性免疫刺激剂，是增加对抗原的免疫应答的物质；(ii)载体，是提供T细胞辅助的免疫原性蛋白质；(iii)媒介佐剂，是用作抗原的基质的油乳液或脂质体以及刺激免疫应答(Edelman R.1992，AIDS Res.Hum.Retroviruses 8：1409-11)。可选的佐剂分类根据施用途径划分佐剂，即粘膜或肠胃外。第三种分类将佐剂分为明矾盐和其他矿物佐剂；tensoactive剂；细菌衍生物；媒介和缓释材料或细胞因子(Byars等，1990，LaboratoryMethods in Immunology：39-51)。第四种分类将佐剂分为以下组：基于凝胶的佐剂、tensoactive剂、细菌产物、油乳液、颗粒化佐剂、融合蛋白或脂肽(Jennings R等，1998，Dev.Biol.Stand，92：19-28)。
本发明的疫苗组合物可包含一种或多种佐剂。适用于本发明中的佐剂包括但不限于无机盐基佐剂，例如明矾基佐剂、钙基佐剂、铁基佐剂、锆基佐剂；颗粒状佐剂；粘膜佐剂；tensoactive佐剂；细菌来源的佐剂；油基佐剂；细胞因子、脂质体佐剂、聚合物微球佐剂、碳水化合物佐剂。
示例性的佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、Quil A、Quil A衍生的皂苷QS-21或其他类型的皂苷、Detox、ISCOM、革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖或脂多糖、海藻糖二霉菌酸酯、细菌核酸如含CpG基序的DNA、FIA、Montanide、Adjuvant 65、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Lipovant、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、AS03、AS04、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、STING，Toll样受体配体、CD40L、卵清蛋白(OVA)、单磷酰脂质A(MPL)、聚(I:C)、LPS(或MPLA)和OxPAPC的组合、MF59、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球、石蜡油、角鲨烯、病毒体、γ菊粉、葡聚糖、右旋糖苷、香菇多糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖，病原体相关分子模式(PAMPs)、损伤相关的分子模式分子(DAMP)、抗免疫抑制分子的抗体(例如，针对转化生长因子(TGF)-β的抗体或拮抗剂，A2aR拮抗剂)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
佐剂可包含多种递送系统，例如矿物盐、表面活性剂、合成微粒、水包油乳剂、免疫刺激复合物、脂质体、病毒体和病毒样颗粒。佐剂可进一步包含一种或多种免疫应答的增效剂，例如微生物衍生物(例如，细菌产物，毒素诸如霍乱毒素和来自大肠杆菌的热不稳定的毒素，脂质、脂蛋白、核酸、肽聚糖、碳水化合物、肽)、细胞、细胞因子(例如，树突细胞、IL-12和GM-CSF)、激素和小分子。适用于本发明的佐剂包括但不限于油基佐剂(例如弗氏佐剂)、CpG寡核苷酸、铝盐佐剂、钙盐佐剂、乳液和基于表面活性剂的制剂(例如，MF59、AS02、montanide、ISA-51、ISA-720和QA21)。有关疫苗佐剂改进的综述，请参阅Pashine等，2005，Nature Med.11(4)：S63-S68。
在一个实施方案中，佐剂包含一种或多种toll样受体(TLR)激动剂或由其组成。在一个实施方案中，TLR激动剂是病原体相关激动剂，其选自于三酰化脂肽(革兰氏阳性细菌)、肽聚糖(革兰氏阳性细菌)、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、LPS(牙龈卟啉单胞菌、肾脏钩端螺旋体)、GPI-锚蛋白(克氏锥虫)、奈瑟氏球菌孔蛋白、血细胞凝集素(MV)、磷脂甘露聚糖(念珠菌)、LAM(分枝杆菌)、ssRNA病毒(WNV)、dsRNA病毒(RSV，MCMV)、LPS(革兰氏阴性菌)、F-蛋白(RSV)、甘露聚糖(念珠菌)、葡萄糖肌醇磷脂(锥虫)、包膜蛋白(RSV和MMTV)、鞭毛蛋白(鞭毛细菌)、酚溶性调节蛋白(表皮葡萄球菌)、二酰化脂肽(支原体)、LTA(链球菌)、酵母聚糖(酵母属)、病毒ssRNA(流感病毒、VSV、HIV、HCV)、来自RNA病毒的ssRNA、dsDNA病毒(HSV、MCMV)、疟原虫色素(疟原虫)和未甲基化的CpG DNA(细菌和病毒)。在一个实施方案中，TLR激动剂是合成配体，其选自于Pam3Cys、CFA、MALP2、Pam2Cys、FSL-1、Hib-OMPC、Poly I:C；poly A:U、AGP、MPL A、RC-529、MDF2P、CFA、鞭毛蛋白(fiagellin)、MALP-2、Pam2Cys、FSL-1、鸟苷类似物、咪唑喹啉类(例如，咪喹莫特，R848，/>)、洛索立宾、咪唑喹啉、Loxoribine、ssPolyU、3M-012和CpG-寡核苷酸。
在一些实施方案中，佐剂包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的蛋白质。具体而言，GM-CSF是作为白细胞生长因子发挥功能的细胞因子。GM-CSF刺激干细胞以产生粒细胞和单核细胞。单核细胞离开血流，迁移到组织中，随后成熟为巨噬细胞。GM-CSF还具有募集和编程抗原呈递细胞的能力。
GM-CSF多肽可以从内源来源分离或在体内或体外合成。内源GM-CSF多肽分离自健康人组织。合成的GM-CSF多肽在将模板DNA转染或转化入宿主生物或细胞(例如哺乳动物或培养的人细胞系)中后合成。或者，合成的GM-CSF多肽通过聚合酶链反应(PCR)或本领域其他熟知的方法合成(Sambrook，J.等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory出版，NY，Vol.1,2,3(1989)，前述出版物的全部内容通过引用并入本文)。
GM-CSF多肽经修饰以增加体内蛋白质稳定性。或者，将GM-CSF多肽工程化为或多或少免疫原性的。GM-CSF多肽是重组的。或者，GM-CSF多肽是哺乳动物GM-CSF多肽的人源化衍生物。GM-CSF多肽所来源的示例性哺乳动物物种包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、山羊、鸟、猫、狗、猴或灵长类动物。在一些实施方案中，GM-CSF是重组人蛋白(PeproTech，目录号300-03)。在其他实施方案中，GM-CSF是重组鼠(小鼠)蛋白(PeproTech，目录号315-03)。在另一个实施方案中，GM-CSF是重组小鼠蛋白的人源化衍生物。
在一些实施方案中，佐剂包含胞嘧啶-鸟苷(CpG)寡核苷酸(CpG-ODN)序列，例如，佐剂包含CpG二核苷酸或CpG寡核苷酸。CpG位点是脱氧核糖核酸的区域，其中半胱氨酸核苷酸沿其长度紧邻在碱基的线性序列中的鸟嘌呤核苷酸存在(“p”代表它们之间的磷酸键并且将它们与胞嘧啶-鸟嘌呤互补碱基配对区分开)。CpG位点在DNA甲基化中起关键作用，DNA甲基化是细胞用于沉默基因表达的几种内源机制之一。启动子元件内CpG位点的甲基化可导致基因沉默。在细菌DNA中发现的CpG-ODN序列是有效的免疫调节剂，其刺激抗原呈递细胞(例如树突细胞)的活化，导致特定的T细胞反应。
用于本发明疫苗组合物的CpG寡核苷酸可以从内源来源分离或在体内或体外合成。内源性CpG寡核苷酸的示例性来源包括但不限于微生物、细菌、真菌、原生动物、病毒、霉菌或寄生虫。合成的CpG寡核苷酸在将模板DNA转染或转化到宿主生物体中后合成。或者，合成的CpG寡核苷酸通过聚合酶链式反应(PCR)或本领域其他熟知的方法来合成。
提供CpG寡核苷酸用于树突细胞的细胞摄取。在一个实施方案中，裸CpG寡核苷酸用于本发明的疫苗组合物中。术语“裸的”用于描述不含额外取代基的分离的内源或合成的多核苷酸(或寡核苷酸)。在另一个实施方案中，CpG寡核苷酸与一种或多种化合物结合以增加细胞摄取的效率。可选地或另外地，CpG寡核苷酸与一种或多种化合物结合以增加寡核苷酸在疫苗组合物和/或树突细胞内的稳定性。
CpG寡核苷酸在细胞摄取之前浓缩。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸使用聚乙烯亚胺(PEI)浓缩，所述聚乙烯亚胺是阳离子聚合物，其增加到树突细胞中的细胞摄取的效率。富含胺的聚阳离子(amine-rick polycation)PEI通过与DNA磷酸基团结合而浓缩质粒DNA，产生小的带正电荷的浓缩物，从而促进细胞膜结合和DNA摄取到细胞中(Godbey等，1999，Proc Natl Acad Sci USA，96(9)：5177-81)。
在一些实施方案中，生物制剂(例如佐剂)与固体基质(例如珠)连接。可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的任一种将生物制剂与固体基质的表面缀合，从而用于将蛋白质或肽与其他分子缀合。例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques(第2版，Academic Press(2008))和Niemeyr，Bioconjugation Protocols：Strategies&Methods，inMethods In Molecular Biology(Humana Press，2004)提供了许多用于肽与其他分子缀合的方法和技术。生物制剂可以共价或非共价地偶联或缀合到固体基质的表面。生物制剂和表面之间的共价连接也可以通过接头介导。生物制剂和表面之间的非共价连接可以基于离子相互作用、范德华相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键、静电相互作用和/或形状识别相互作用。
本发明的疫苗组合物中的生物制剂能够在受试者中募集和/或激活免疫细胞。免疫细胞是指免疫系统的任何细胞，其功能是针对传染病和外来侵入者保护身体。示例性免疫细胞包括但不限于T细胞、B细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、巨噬细胞、粒细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞。抗原呈递细胞(APC)，也称为辅助细胞，是在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原的细胞。抗原呈递细胞处理抗原并将它们呈递给免疫系统的T细胞。抗原呈递细胞可以在多种组织类型中找到。经典的抗原呈递细胞，包括巨噬细胞、B细胞和树突细胞，与MHC II类分子结合以将外来抗原呈递给辅助性T细胞。虽然可以表达MHC II类分子的其他细胞类型，例如肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和3型先天性淋巴细胞(ILC3)，也可以用作抗原呈递细胞(Kambayashi和Laufer，2014，Nature Reviews Immunology14,719-730)。抗原呈递细胞还可包括能够在细胞表面上向细胞毒性T细胞展示内源肽(通常使用MHC I类分子)的任何细胞，例如有核细胞。除MHC蛋白家族外，抗原呈递还依赖于APC和T细胞两者的表面上的其他特化信号传导分子。
抗原呈递细胞通过吞噬作用(巨噬细胞和树突细胞)或通过受体介导的内吞作用(B细胞)非常有效地内化抗原，将抗原加工成肽片段和然后在他们的膜上展示与II类MHC分子结合的那些肽。T细胞识别抗原呈递细胞的膜上的抗原II类MHC分子复合物并与之相互作用。然后由抗原呈递细胞产生另外的共刺激信号，导致T细胞的活化。共刺激分子和MHC II类的表达是专职性APC的限定特征。
抗原呈递细胞(APC)对于有效的适应性免疫应答至关重要，因为细胞毒性和辅助性T细胞的功能依赖于APC。抗原呈递允许适应性免疫的特异性，并且可以促进针对细胞内和细胞外病原体的免疫应答。
本发明的疫苗组合物可以进一步包含支架，所述支架包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活的免疫细胞。因此，本发明还提供了包含支架的疫苗组合物，其中所述支架包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞；和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体。支架提供物理结构，其中调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体或生物制剂可以结合或附着在其上或其中。该调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体可以包封在支架内用于递送或施用于受试者，因此防止病原体从疫苗组合物中任何不希望的渗漏。在一些实施方案中，疫苗组合物还包含一种或多种如本文所述的生物制剂。该生物制剂能够在受试者中募集和/或激活免疫细胞。在一些实施方案中，疫苗组合物包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在其他实施方案中，疫苗组合物包含胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列。在另一个实施方案中，疫苗组合物包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列的组合。
支架包含无毒性或无免疫原性的生物相容性材料。如本文所用的术语“生物相容性材料”是指在其植入受试者的生物组织中或放置在其附近时不会随着时间而明显退化和不会引起显著的免疫反应或有害的组织反应，例如毒性反应或显著的刺激，或当其与血液接触时不会诱导血液凝固或凝结的任何材料。
支架在体内可生物降解。在一些实施方案中，支架组合物基于选自温度、pH、水合状态和孔隙率、交联密度、类型和化学性质或主链键降解的敏感性的物理参数以预定速率降解，或者其基于化学聚合物的比例以预定的速率降解。例如，仅由丙交酯组成的高分子量聚合物在数年(例如1-2年)内降解，而由丙交酯和乙交酯的50:50混合物组成的低分子量聚合物在大约数周(例如，1、2、3、4、6、10周)内降解。由高分子量、高古罗糖醛酸藻酸盐组成的钙交联凝胶在体内经过数月(1、2、4、6、8、10、12个月)至数年(1、2、5年)降解，而由低分子量藻酸盐和/或已部分氧化的藻酸盐组成的凝胶将在大约数周内降解。
适合用作本发明支架的示例性生物材料包括糖胺聚糖、丝、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚e-己内酯(PCL)、聚环氧乙烷、聚丙烯富马酸酯(PPF)、聚丙烯酸(PAA)、聚羟基丁酸、水解聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、海藻酸酯；果胶酸；和藻酸盐，完全或部分氧化的藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、甲壳素、支链淀粉、结冷胶、黄原胶、胶原、明胶、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉及其组合。在某些实施方案中，生物材料选自聚(L-丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)、中孔二氧化硅、冷冻凝胶及其组合。
在一些实施方案中，支架包含大孔聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)。包含PLG支架的疫苗组合物能够在在施用到受试者中或受试者上的目标位点后的一段时间内(例如，在接下来的几天或几周内)逐渐从支架释放包封的组合物，例如调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体或生物制剂。因此，可以通过时间方式调节从支架释放包封的病原体的速率。结果，通过疫苗组合物中的病原体引发的免疫反应也可以在时间上受到控制。
在一些实施方案中，支架包含中孔二氧化硅(MPS)。在其他实施方案中，支架包含冷冻凝胶。参见，例如，国际专利公开号WO 2012/149358A1。上述专利申请的全部内容在此引入作为参考。
在一些实施方案中，支架包含不可生物降解的材料或对体内分解是抗性的。相对永久(抗降解)的支架组合物包括金属和一些聚合物，例如丝和塑料。
在一些实施方案中，支架(例如水凝胶)包含经修饰的生物材料，例如，生物材料上的位点用官能团，例如甲基丙烯酸基团(甲基丙烯酸酯(MA))或丙烯酸基团(丙烯酸酯)，修饰。甲基丙烯酸化的程度可在1％至90％之间变化。高于90％时，化学修饰可降低聚合物水溶性的溶解度。示例性的改性水凝胶是MA-藻酸盐(甲基丙烯酸化的藻酸盐)或MA-明胶。在MA-藻酸盐或MA-明胶的情况下，50％对应于藻酸盐或明胶的甲基丙烯酸化的程度。这意味着每隔一个重复单元含有甲基丙烯酸化的基团。
用于本发明支架的生物材料也可以用丙烯酸化的基团代替甲基丙烯酸化的基团进行修饰。然后将该产物称为丙烯酸化的聚合物。对于大多数聚合物，甲基丙烯酸化(或丙烯酸化)程度可以变化。此外，可以用点击部分修饰藻酸盐或明胶以产生点击-藻酸盐或点击-明胶冷冻凝胶(参见，例如，国际专利申请公开号WO2015154078，前述专利申请的全部内容通过引用并入本文)。此外，点击藻酸盐可以被氧化，并且在点击缀合之前使用氨硼烷或亚氯酸钠进一步加工以消除醛，从而产生可生物降解的点击藻酸盐冷冻凝胶(参见，例如，国际专利申请号PCT/US16/058866，上述专利申请的全部内容在此引入作为参考)。
本发明的支架可包括外表面。可选地或另外地，支架可包括内表面。本发明支架的外表面或内表面可以是实心的或多孔的。支架的孔径可以小于约10nm、在约100nm-20μm之间或者大于约20μm，例如，直至并且包括1000μm直径。例如，孔隙可以是纳米多孔的、微孔的或大孔的。例如，纳米孔的直径小于约10nm；微孔的直径在约100μm-20μm的范围内；并且，大孔大于约20μm，例如，大于约100μm，例如，大于约400μm，例如，大于600μm或大于800μm。
在一些实施方案中，本发明的支架组织成各种几何形状(例如，盘、珠、球粒)、壁龛、平面层(例如，薄片)。例如，可以皮下植入直径约0.1-200毫米的圆盘，例如5、10、20、40、50毫米。圆盘可具有0.1至10毫米的厚度，例如1、2、5毫米。圆盘易于压缩或冻干以施用于患者。用于皮下施用的示例性圆盘具有以下尺寸：8毫米直径和1毫米厚度。在一些实施方案中，支架可包含多种组分。多组分支架任选地构造成同心层，其中每个特征在于不同的物理性质，例如聚合物百分比、聚合物的交联百分比、水凝胶的化学组成、孔径、孔隙率和孔隙结构、刚度、韧性、延展性、粘弹性和/或药物组成。
在一些实施方案中，支架还包含一种或多种如本文所述的生物制剂。在一些实施方案中，生物制剂与支架或支架内的固体结构(例如珠)共价连接，从而使生物制剂相对固定在支架或支架内的固体结构(例如珠)内或其上。在其他实施方案中，生物制剂与支架非共价结合。非共价键包括静电、氢、范德华和疏水相互作用。在一些实施方案中，支架包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在其他实施方案中，支架包含胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列。在某些实施方案中，支架包含GM-CSF和CpG-ODN。
使用本领域已知的方法将生物制剂添加到支架中，包括表面吸收、物理固定，例如使用相变以将物质捕获在支架材料中。例如，生物制剂，例如生长因子，在其处于水相或液相中时与支架混合，并且在环境条件(例如，pH、温度、离子浓度)改变之后，液体凝胶化或凝固，从而捕获生物制剂。或者，将共价偶联(例如，使用烷化剂或酰化剂)用于以确定的构象在支架上提供稳定、长期的生物制剂呈现。在下表中提供了用于共价偶联这些物质的示例性试剂。在Hirano和Mooney，2005，Advanced Materials，16(1)：17-25中讨论了将生物制剂(例如蛋白质或肽)偶联到支架聚合物上的方法。其他有用的键合化学还包括Hermanson，1996，Bioconjugate Techniques，152-185中讨论的那些。
将肽/蛋白质与聚合物共价偶联的方法
[a]EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；DCC：二环己基碳二亚胺
支架使用本领域已知的方法组装，例如注射成型、预成型结构的冻干、印刷、自组装、相转化、溶剂浇铸、熔融加工、气体发泡、纤维形成/加工、颗粒浸出或其组合。然后将组装的支架用于制备本发明的疫苗组合物。
在一些实施方案中，支架适于植入。例如，使用聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)制备支架。如果植入，包含PLG支架的疫苗组合物可以在疫苗接种后容易地从受试者中移除。例如，在其中疫苗接种后引发过多的免疫反应或不希望的副作用的情况下，可以从受试者移除植入的疫苗组合物。在一些实施方案中，支架适合于注射。例如，支架在身体外部作为大孔支架形成。支架可以注入体内，因为孔隙塌陷并且凝胶变得非常小和可以通过针适配。参见，例如，WO 12/149358；和Bencherif等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109.48(2012):19590-5。每个前述参考文献的全部内容通过引用并入本文。
本发明的疫苗组合物可包含一种类型的病原体，或它们可包含多种类型的病原体，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50或更多种类型的病原体。疫苗组合物还可含有一种或多种类型的佐剂，其对免疫细胞编程以识别抗原并增强如本文所述的抗原呈递。
本发明的疫苗组合物可以全身施用，例如，肠道施用(例如，口服、含服、舌下或直肠施用)或肠胃外施用(例如，静脉内、动脉内、骨内、肌肉内、脑内、脑室内、鞘内或皮下施用)。本发明的疫苗组合物的其他合适的施用方式包括皮下、腹膜内、眼内、鼻内、透皮(例如，通过皮肤贴剂)、硬膜外、颅内、经皮、阴道内、子宫内、玻璃体内或经粘膜施用，或通过注射方式施用，或通过植入。
如实施例中所示，根据本文所述的疫苗组合物，在小鼠中皮下植入或注射疫苗组合物成功地保护小鼠免受致死剂量的细菌感染。具体地，与对照小鼠相比时，用本发明的疫苗组合物免疫的小鼠显示出显著延长的存活时间和各种器官中显著降低的病原体滴度。因此，在一些实施方案中，疫苗组合物适于植入，例如皮下植入。在一些实施方案中，疫苗组合物适合于在受试者中注射。在某些实施方案中，疫苗组合物适合于受试者口服施用。例如，疫苗组合物可以是用于口服施用的丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、咀嚼片、粉末、乳液或水性溶液的形式。
本发明的疫苗组合物具有优于现有疫苗的明显优势，因为仅一个单次施用就足以引发针对靶向的病原体的持续免疫反应，例如抗体介导的和/或细胞介导的免疫反应。实际上，如实施例1中所示，单剂量的本发明的疫苗组合物可以在至少90天的时间内保护接种疫苗的小鼠免受细菌攻击。
此外，疫苗组合物提供了优于本领域可得疫苗的另一种显著优点，因为它们可以在植入后容易地从受试者移除。例如，如果在受试者接受疫苗组合物后引发过多的免疫反应或不希望的副作用，则可以容易地从受试者中除去该疫苗组合物，例如PLG支架疫苗组合物。相反，一旦将现有疫苗注射到受试者体内，其不能被除去。
本发明的疫苗组合物是高度稳定的并且能够便于携带和在室温下储存而不需要冷藏。冷冻干燥后，该疫苗组合物可具有约1天至约1年，例如约10天至约1年、约30天至约1年、约2个月至约1年、约3个月至约1年、约4个月至约1年、约5个月至约1年、约6个月至约1年、约7个月至约1年、约8个月至约1年、约9个月至约1年、约10个月至约1年的保质期。在一些实施方案中，该疫苗组合物具有至少1年的保质期，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
本发明的疫苗组合物允许快速和直接分离在来自患有传染病的患者的血液样品中循环的病原体(包括已知和未知的病原体)、存在于其他生物体液中的病原体或存在于体外培养物中的病原体，和因此与常规抗生素疗法相比，大大增加了免疫反应。要求保护的疫苗组合物还可用于针对难以分离和纯化的病原体使用。本发明的疫苗组合物还具有优于现有疫苗的额外改进。例如，使用所要求保护的疫苗组合物的疫苗接种可以以更可控的、局部的和更安全的方式进行，而不损害疫苗组合物的功效。所要求保护的疫苗的稳定性提高使得它们是便携的并且可以在室温下长期储存而无需冷藏。此外，当组合物中包含一种以上类型的病原体时，疫苗组合物可以是多价疫苗，并且还可以用于针对给定病原体的不同物种或菌株接种疫苗。这些改进避免了当前病原体疫苗的主要局限性，并且对于公众是非常有意义的，特别是在流行病时期，例如对于发展中国家的人群，或者对于军事用途具有重要价值，其中容易获得的疫苗是非常需要的。例如，病原体可以使用工程化的凝集素(例如，工程化的MBL)直接且快速地从患有传染病或具有传染病风险的受试者(例如人)分离，通过抗生素处理中和，掺入支架组合物(例如，PLG支架)中，和然后将其施用回到相同的人类受试者或不同的人类受试者以用于治疗传染病。或者，可将疫苗组合物冻干并在室温下储存约1天至约1年，然后施用于受试者以诱导针对疫苗组合物内的病原体或病原体片段的免疫反应，从而治疗传染病。这是非常有益的，特别是在非常需要包围接种来治疗传染病或防止传染性病原体的传播的情况下。本发明的疫苗组合物可以容易地获得，然后施用于感染的个体或与感染组群接触或有感染的风险的任何其他个体。
本发明还提供了稳定的支架组合物。该稳定的支架组合物包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞，其中所述支架是冻干的，并且其中所述支架具有约30天至约1年的保质期。
另一方面，本发明提供稳定的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体。调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体包含与调理素或凝集素结合的源自受试者的病原体或其片段，其中调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体是冻干的，并且其中调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体具有约30天至约1年的保质期。
在另一方面，本发明提供了支架组合物。该支架组合物包含生物材料并且能够在受试者中募集和激活免疫细胞，其中该支架包含固体基质，例如珠，例如磁珠，并且其中该固体基质适合于病原体粘附。本发明的支架组合物是稳定的并且可以容易地获得，例如，在战争期间或在大流行病期间。如本文所述的，能够在受试者中诱导传染病的任何病原体或病原体片段可以被引入本发明的支架组合物中以产生疫苗组合物。一旦病原体或病原体片段例如从来自受试者(例如人)的样品或从体外培养物分离，然后掺入支架组合物中，其可引入本发明的支架组合物中，且然后施用于受试者以治疗传染病。这些支架组合物是非常有用的和非常需要的，例如，在流行病期间，或者对于军事用途具有很大价值，其中容易获得的疫苗是非常需要的。
III.制剂
本发明的疫苗组合物可直接用于治疗和预防各种疾病(例如传染病)的目的。可以使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂配制本发明的疫苗组合物。例如，在将组合物配制成液体的情况下，其可包含无菌盐水、葡萄糖溶液或缓冲溶液，或其他药学上可接受的无菌流体。在一些实施方案中，制剂用于皮内或皮下施用。在一些实施方案中，制剂用于吸入或吹入(通过口腔或鼻子)。在一些实施方案中，所述制剂用于口服、口腔、肠胃外、阴道或直肠施用。本文所用的术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。在一些实施方案中，该制剂用于植入。
优选地，疫苗组合物配制为在储存和运输期间提供调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体或生物制剂的提高的化学稳定性。例如，在一个实施方案中，该制剂防止或减少蛋白质寡聚化或聚集。在另一个实例中，该制剂防止或减少氨基酸残基的氧化。制剂可以是冻干的或为液体制剂。冻干制剂具有约1天至约1年的保质期，例如约10天至约1年、约30天至约1年、约2个月至约1年、约3个月至约1年、约4个月至约1年、约5个月至约1年、约6个月至约1年、约7个月至约1年、约8个月至约1年、约9个月至约1年、约10个月至大约1年。在一些实施方案中，制剂具有至少1年的保质期，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
在一些实施方案中，该疫苗组合物配制用于注射。在某些实施方案中，疫苗组合物是无菌冻干制剂，基本上不含污染的细胞物质、化学物质、病毒或毒素。在一个具体实施方案中，在无菌单剂量容器中提供注射用制剂。该制剂可以含有或不含有添加的防腐剂。液体制剂可以采取诸如油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
在一个实施方案中，制剂包含脂质体。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物与一种或多种用于治疗传染病的其他治疗剂一起配制。
本发明的疫苗组合物可以配制成药物组合物，并且可以包括一种或多种药学上可接受的载体、添加剂或媒介。在一个实施方案中，该一种或多种药学上可接受的载体、添加剂或媒介选自于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(SEDDS)(例如d-I-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、用于药物剂型中的表面活性剂(如吐温)或其他类似的聚合物递送基质、血清蛋白质(如人血清白蛋白)、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精也可有利地用于增强本文所述制剂的化合物的递送。本发明的疫苗组合物还可包含药学上可接受的酸、碱或缓冲剂以增强配制的化合物或其递送形式的稳定性。
在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物是用于吸入和/或经鼻施用的溶液或粉末的形式。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂(如，例如，吐温80)和悬浮剂配制这些组合物。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂中包括甘露醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，常规使用无菌的非挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的非挥发油，其包括合成的单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，可用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似的分散剂，它们通常用于药学上可接受的剂型如乳液和/或悬浮液的配制。其他常用的表面活性剂如Tweens或Spans和/或通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它类似的乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目的。
在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物是口服可接受剂型的形式，包括但不限于，固体药物，如丸剂、片剂、颗粒剂、软凝胶剂、可咀嚼剂、粉剂和胶囊剂；液体药物，如乳液和水性悬浮液、分散液和溶液；吸入剂和冻干药物。在口服片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服施用含水性悬浮液和/或乳液时，可将活性成分悬浮或溶解在油相中，与乳化剂和/或悬浮剂混合。如果需要，可以加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。这些药物可以通过常规药学实践制备。
IV.本发明的方法
本发明的疫苗组合物可用于预防和治疗各种疾病，例如传染病。如本文提供的实施例中所示，用本发明的疫苗组合物(例如，在PLG或MPS支架内包含凝集素结合的病原体构建体及CpG和GM-CSF佐剂的疫苗)免疫小鼠成功地保护小鼠抵抗致死剂量的细菌，与对照相比时，导致接种疫苗的小鼠的存活时间显著延长和各种器官中病原体滴度降低。
因此，在一个方面，本发明提供了治疗需要的受试者的病原体感染的方法。该方法包括施用如本文所述的疫苗组合物，从而治疗受试者中的病原体感染。
另一方面，本发明提供了针对病原体感染给受试者接种疫苗的方法。该方法包括施用如本文所述的疫苗组合物，从而针对病原体感染对受试者接种疫苗。
本发明还提供了在需要的受试者中治疗抗生素抗性细菌感染的方法。该方法包括施用如本文所述的疫苗组合物，从而治疗受试者中的抗生素抗性的细菌感染。在一些实施方案中，疫苗组合物对受试者中的抗生素抗性细菌具有特异性。
本发明进一步提供降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法。该方法包括施用如本文所述的疫苗组合物，从而降低受试者中的病原体水平。在一些实施方案中，病原体的水平在受试者的器官中降低。在一些实施方案中，该器官选自肺、肝、肾和脾。
另一方面，本发明提供了提高具有病原体感染的受试者的存活率的方法。该方法包括施用如本文所述的疫苗组合物，从而提高受试者的存活率。
在一个方面，本发明提供了降低需要的受试者中与病原体感染相关的疼痛水平的方法。该方法包括施用如本文所述的疫苗组合物，从而降低受试者中与病原体感染相关的疼痛水平。
另一方面，本发明提供了降低需要的受试者中与病原体感染相关的痛苦程度的方法。该方法包括施用如本文所述的疫苗组合物，从而降低受试者中与病原体感染相关的痛苦程度。
在一些实施方案中，受试者患有传染病或处于患传染病的风险中。传染病是由病原微生物(如细菌、病毒、寄生虫或真菌)引起的。该疾病可以直接或间接地从一个人扩散到另一个人。传染病也可以从动物传播到人类。
可以用本发明的疫苗组合物预防性或治疗性地治疗的传染病包括但不限于结核病、麻疹、脑膜炎球菌性脑膜炎、铜绿假单胞菌、基孔肯雅热、疟疾、斑块、HIV/AIDS、肺炎、鼻病毒病、春夏脑膜脑炎(SSME)、风疹、脊髓灰质炎、狂犬病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、布鲁里溃疡、埃博拉病毒病、黄热病、登革热病、沙眼、南美锥虫病、流感、天花、禽流感、霍乱、地中海热、波状热、马耳他热、传染性流产、流行性流产、牛布氏杆菌病、沙门氏菌食物中毒、肠道副伤寒(enteric paratyphosis)、细菌性痢疾、假结核病、瘟疫、鼠疫热(pestilential fever)、Vibrios、旋转病、牛钩端螺旋体病(Weil’s disease)、出血性黄疸(出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae))、犬钩端螺旋体病(犬钩端螺旋体(L.canicola))、奶工热(哈德焦钩端螺旋体(L.hardjo))、回归热、蜱媒回归热、螺旋体热(spirochetal fever)、流浪热(vagabond fever)、饥馑热、莱姆关节炎、班恩沃思综合征、蜱传脑膜多神经炎(tick-borne meningopolyneuritis)、慢性游走性红斑病、弧菌病、Colibacteriosis、colitoxe ia、白痢、猪肠道水肿、肠道副伤寒、葡萄球菌性饮食中毒、葡萄球菌性胃肠炎、犬冠状病毒(CCV)或犬细小病毒性肠炎、猫传染性腹膜炎病毒、传染性胃肠炎(TGE)病毒、Hagerman Redmouth病(ERMD)、传染性造血坏死(IHN)、猪放线杆菌(嗜血杆菌)胸膜肺炎、汉森氏病、链霉菌病、绵羊真菌性皮炎、类鼻疽、Whitmore病、弗朗西斯病、鹿蝇热、兔热、O'Hara病、链杆菌热、哈佛希尔热、流行性关节炎红斑、鼠咬热(sodoku)、船运或运输热、出血性败血症、饲鸟病、鹦鹉热、衣原体病、北美芽生菌病、芝加哥病、吉尔克里斯特病、猫抓热病、良性淋巴网织细胞增多病、良性非细菌性淋巴结炎、杆菌性血管瘤病、杆菌性肝紫癜病、Q热、巴尔干流感、巴尔干流行性感冒、屠宰场热、蜱传热、肺立克次氏体病(pneumorichettsiosis)、美国蜱斑疹伤寒、蜱传斑疹伤寒、水疱性立克次氏体病、KewGardens斑疹热、蚤传斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、城市斑疹伤寒、癣菌病、皮肤癣菌病、癣、毛癣菌、小孢子虫病、股癣(Jock Itch)、足癣、申克孢子丝菌、二相性真菌、隐球菌病和组织胞浆菌病、猴良性表皮痘、BEMP、猴疱疹病毒、乙型猿猴病毒病、C型昏睡性脑炎、黄热病、黑色呕吐(Black Vomit)、汉坦病毒肺综合征、韩国出血热、流行性肾病、流行性出血热、出血性肾变病肾炎、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、加州脑炎/拉克罗斯脑炎、非洲出血热、绿猴或南非小猿猴病、恐水症、狂犬病(Lyssa)、传染性肝炎、流行性肝炎、流行性黄疸、风疹、麻疹Morbilli、猪和马流感、禽瘟、新城疫、梨形虫病、弓形虫病、非洲睡眠病、冈比亚锥虫病、罗得西亚锥虫病、查加斯病、Chagas-Mazza病、南美锥虫病、痢疾内变形虫、小袋虫痢疾、隐孢子虫病、贾第虫病、微孢子虫病、异尖线虫病、旋毛虫病、管圆线虫病(Angiostrongylosis)、嗜酸性粒细胞性脑膜炎或脑膜脑炎(广州管圆线虫(A.cantonensis))、腹部管圆线虫病(哥斯达黎加管圆线虫(A.costaricensis))、钩虫病、板口线虫病、钩口线虫病(Hookwormdisease)、毛细线虫病、布鲁线虫病(Brugiasis)、弓蛔虫病、结节线虫病、类圆线虫病、毛状腺虫病、蛔虫病、裂头绦虫病、裂头蚴病、棘球蚴病、包虫病、Echinococcus granulosis、囊型包虫病、绦虫感染、血吸虫等。
还可以使用本发明的疫苗组合物治疗由传染性病原体引起的恶性疾病。此类疾病的实例包括但不限于，由EBV引起的伯基特淋巴瘤、由劳氏逆转录病毒引起的劳氏肉瘤、由8型疱疹病毒引起的卡波西肉瘤、由HTLV-1逆转录病毒引起的成人T细胞白血病或由HTLV-JJ引起的毛细胞白血病，以及由传染剂和病毒引起的许多其他肿瘤和白血病。
此外，使用本发明的疫苗组合物可以治疗或预防由未知病原体引起的疾病，尤其是恶性或免疫疾病。这些疾病的非限制性实例包括白血病如急性白血病、急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞性白血病如成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性、红白血病，慢性白血病如慢性髓细胞性或粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病，真性红细胞增多症，Sezary细胞白血病，淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金病，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，重链病，实体肿瘤如肉瘤和癌瘤，纤维肉瘤，粘膜肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，卡波西肉瘤，淋巴管内皮瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞瘤，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，Wilms'瘤，宫颈癌，子宫癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，蕈样真菌病或佩吉特样网状细胞增多症。
在一些实施方案中，可通过本发明的方法治疗的传染病是慢性传染病。在一些实施方案中，可通过本发明的方法治疗的传染病是急性传染病。
本发明的方法可包括单独地施用疫苗组合物或将其作为治疗方案或组合疗法的部分施用。如本文所用的术语“给予”、“施用”或“给药”是指植入、吸收、摄取、注射或吸入本发明的疫苗组合物，而不管其形式如何。在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物的单次施用对于本文所述的方法是足够的。单剂量的本发明的疫苗组合物可以导致针对传染的病原体的持续免疫应答，例如抗体介导的和/或细胞介导的免疫应答。在其他实施方案中，疫苗组合物可以以多次施用来施用，例如，在初免-加强策略中。在一些实施方案中，在较早的初始免疫中给予的相同疫苗用于随后的加强免疫。在其他实施方案中，可以用含有相同抗原的不同类型的疫苗进行初免-加强。在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物在零时间施用，并且本发明的第二疫苗组合物在一段时间后施用，例如10至30天、10至60天或10至100天。
目前开发的疫苗通常需要多次免疫接种才能使疫苗获得成功。对于儿科人群，可能需要多达五次免疫接种，如白喉/破伤风和百日咳(DTP)疫苗的情况，其在出生后的前六个月内给予三次，然后在出生的第二年进行第四次给药，以及在四到六岁之间进行最终加强。尽管如此，一些疫苗甚至在早已接受完整免疫系列的成年人中也需要额外的加强，例如，破伤风-白喉(Td)疫苗，在人的整个一生中推荐每10年加强一次。公认的是，即使是最成功的疫苗，多次免疫(即“初免-加强”)也是至关重要的。该原理适用于减毒活疫苗(例如，口服脊髓灰质炎疫苗)、灭活疫苗(例如，甲型肝炎疫苗)、重组蛋白亚基疫苗(例如，乙型肝炎疫苗)和多糖疫苗(例如，乙型流感嗜血杆菌疫苗)。然而，本发明的疫苗组合物具有优于现有疫苗的明显优势，因为对于本文所述的方法，仅一个单次施用就足够了。实际上，如实施例1中所示，单剂量的本发明的疫苗组合物成功地赋予了长期免疫应答并且在90天的时间内保护接种疫苗的小鼠免受细菌攻击。
在一些实施方案中，将本发明的一种或多种疫苗组合物在一个或多个部位施用于受试者。优选地，每个部位引流(drain)至淋巴结或淋巴结组。在一些实施方案中，所述部位选自右臂、左臂、右大腿、左大腿、右肩、左肩、右胸、左胸、腹部、右臀部和左臀部。在一些实施方案中，所述部位是或引流至非包囊的淋巴组织簇，所述淋巴组织簇选自扁桃体、腺样体、阑尾和派尔集合淋巴结。在一些实施方案中，将本发明的疫苗组合物施用于引流至脾脏的部位。
任何合适的施用途径都包括在本发明的方法中，例如，皮内、皮下、静脉内、肌肉内或粘膜。粘膜施用途径包括但不限于口腔、直肠、阴道和鼻腔施用。在一些实施方案中，疫苗组合物经皮、皮内、皮下、口服、直肠、阴道或通过吸入施用。在其他实施方案中，将疫苗组合物植入受试者体内。
当疫苗组合物为支架的形式时，受试者疫苗接种的方法包括在受试者中注射或植入支架组合物，优选皮下植入。在某些实施方案中，受试者疫苗接种的方法可包括在受试者解剖结构的一个或多个区域中植入或注射支架疫苗组合物。
本文公开的方法可以应用于广泛的受试者。在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物，例如人类、胚胎、马、狗、猫、奶牛、绵羊、猪、鱼、两栖动物、爬行动物、山羊、鸟、猴子、小鼠，兔子和大鼠。在其他实施方案中，该受试者是人类。在某些实施方案中，该受试者是胚胎。
本文所用的术语“治疗”或“处理”是指部分或完全地减轻、抑制、改善和/或缓解受试者所患的传染性疾病或病症。在某些情况下，治疗可导致受试者患有的传染性疾病或病症(例如，疼痛或痛苦)的持续不存在。
在一些情况下，治疗方法可包括如受试者所患的传染性疾病或病症的预防或治疗所需的单次施用、多次施用和重复施用。在一些情况下，治疗方法可包括在治疗前、治疗期间和/或治疗后评估受试者的疾病水平。在一些情况下，治疗可以持续直到检测到受试者中疾病水平的降低。
本文的方法包括施用有效量的疫苗组合物以达到所需或所述的效果，例如从受试者中消除传染性病原体，从而治疗传染性疾病。任何特定患者的具体剂量和治疗方案取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、疾病的严重程度和病程、病症或症状、患者对疾病、病症或症状的倾向以及治疗医师的判断。
施用后，可以评估受试者以检测、评价或确定传染性疾病的水平。在一些情况下，治疗可以持续直到检测到受试者中传染性疾病水平的变化，例如降低。
在改善患者的病症(例如，受试者的疾病水平的变化，例如降低)后，如果需要，可以施用维持剂量的本发明的疫苗组合物。随后，根据症状的变化，可以将施用的剂量或频率或两者降低至保持改善的病症的水平。然而，在任何疾病症状复发时，患者可能需要长期的间歇性治疗。
在一些实施方案中，本发明疫苗组合物的有效量是足以降低患有传染病或病症的受试者中传染病或病症的严重性的量，或足以降低或改善其一种或多种症状的严重性的量，或足以预防传染病或病症的进展的量，或足以增强或改善与本发明的疫苗组合物同时、在其之前或之后施用的另一种疗法或治疗剂的治疗效果的量。
传染病的症状是本领域技术人员所熟知的。传染病的示例性体征和症状包括但不限于发烧、腹泻、疲劳、肌肉疼痛、咳嗽、流鼻涕、眼睛发红和流泪、疼痛、痛苦、食欲不振、恶心、腹部不适、虚弱、体重减轻和皮疹。
在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物的有效量是足以产生针对本发明疫苗组合物的一种或多种病原体或病原体片段的分泌抗体的B细胞或细胞毒性T细胞介导的免疫应答的量。可以使用本领域技术人员可获得的任何常规方法来确定本发明的疫苗组合物引发免疫应答的能力。在一些实施方案中，每种组合物的有效量是足以在受试者中产生细胞毒性T细胞反应的量，例如通过混合淋巴细胞T细胞测定法测量的。
在一些实施方案中，施用于受试者或受试者的特定部位的疫苗组合物的有效量是递送1皮克至1000微克的组合物的一种或多种病原体或病原体片段的量。在一些实施方案中，病原体或病原体片段的量为约1pg至约1000μg。在一些实施方案中，病原体或病原体片段的量为1μg至100μg、1μg至200μg、1μg至300μg、1μg至400μg、1μg至500μg、1μg至600μg、1μg至700μg、1μg至800μg或1μg至900μg。在一些实施方案中，病原体或病原体片段的量为1μg至10μg、1μg至20μg、1μg至30μg、1μg至40μg、1μg至50μg、1μg至60μg、1μg至70μg、1μg至80μg或1μg至90μg。在一些实施方案中，病原体或病原体片段的量为1pg至100μg、1pg至90μg、1pg至80μg、1pg至70μg、1pg至60μg、1pg至50μg、1pg至40μg、1pg至30μg、1pg至20μg或1pg至10μg。在其他实施方案中，病原体或病原体片段的量为10pg至1μg、20pg至1μg、30pg至1μg、40pg至1μg、50pg至1μg、60pg至1μg、70pg至1μg、80pg至1μg、90pg至1μg、100pg至1μg、1000pg至1μg。
本发明还提供了治疗有此需要的受试者的病原体感染的方法。该方法包括施用如本文所述的支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而治疗受试者中的病原体感染。
另一方面，本发明提供了针对病原体感染给受试者接种疫苗的方法。该方法包括施用如本文所述的支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而针对病原体感染对受试者接种疫苗。
在一个方面，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗抗生素抗性细菌感染的方法。该方法包括施用如本文所述的支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而治疗受试者中的抗生素抗性细菌感染。在一些实施方案中，疫苗组合物对受试者中的抗生素抗性细菌是特异性的。
另一方面，本发明提供降低具有病原体感染的受试者中的病原体水平的方法。该方法包括施用如本文所述的支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而降低受试者中的病原体水平。在一些实施方案中，病原体的水平在受试者的器官中降低。在一些实施方案中，该器官选自肺、肝、肾和脾。
在一个方面，本发明提供了提高具有病原体感染的受试者的存活率的方法。该方法包括施用如本文所述的支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而提高受试者的存活率。
另一方面，本发明提供降低有此需要的受试者中与病原体感染相关的痛苦程度的方法。该方法包括施用如本文所述的支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而降低与受试者中的病原体感染相关的痛苦程度。
在另一方面，本发明提供了降低有此需要的受试者中与病原体感染相关的疼痛水平的方法。该方法包括施用如本文所述的支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，从而降低与受试者中的病原体感染相关的疼痛水平。
在一些实施方案中，将支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体同时施用于受试者。在其他实施方案中，将支架组合物与调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体分开施用，例如在其之前或之后施用于受试者。
本发明还提供了产生疫苗的方法。该方法包括使包含病原体或其片段的样品与调理素或凝集素接触，其中该调理素或凝集素能够结合样品中的病原体或其片段，从而形成调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；从样品分离调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；将调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体与能够在受试者中募集免疫细胞的生物制剂组合，从而产生疫苗。
另一方面，本发明提供了产生疫苗的方法，其包括使包含病原体或其片段的样品与调理素或凝集素接触，其中调理素或凝集素能够结合样品中的病原体或其片段，从而形成调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；从样品分离调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；将分离的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体与支架组合，从而产生疫苗。
再另一方面，本发明提供了产生疫苗的方法，其包括给受试者施用调理素或凝集素，其中该调理素或凝集素能够结合来自受试者的病原体或其片段，从而形成调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；从受试者分离调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体；和将分离的调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体与支架组合，从而产生疫苗。
在一些实施方案中，病原体源自受试者体内。在其他实施方案中，病原体源自体外培养物、微生物裂解产物、粗裂解产物或纯化的裂解产物。在某些实施方案中，该病原体是合成的病原体。
在一些实施方案中，病原体包含病原体相关分子模式(PAMP)。在一些实施方案中，该PAMP选自病原体片段、病原体碎片、病原体核酸、病原体脂蛋白、病原体表面糖蛋白、病原体膜组分和从病原体释放的组分。
V.试剂盒
本发明还提供了用于针对病原体感染对受试者接种疫苗的试剂盒。此类试剂盒可包括本文所述的组合物。此类试剂盒还可利于本文所述方法的实施。
在一个方面，试剂盒包含本发明的疫苗组合物和将疫苗组合物施用于受试者的说明书。在一些实施方案中，将疫苗组合物预先包装在无菌容器中。
在另一方面，该试剂盒包含本发明的支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，以及将支架组合物和调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体施用于受试者的说明书。在一些实施方案中，将支架组合物或者调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体预先包装在无菌容器中。该支架组合物或调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体可以预先包装在不同的无菌容器中或在相同的无菌容器中。
每个容器中的组合物可以是药学上可接受的溶液的形式，例如与无菌盐水、葡萄糖溶液或缓冲溶液或其他药学上可接受的无菌流体组合。或者，可以将组合物冻干或干燥。试剂盒任选地还在单独的容器中包含药学上可接受的溶液(例如，盐水、葡萄糖溶液等)，优选无菌的，以重构组合物而形成用于注射目的的溶液。
本发明的试剂盒可任选地包含可用于实施本发明方法的其他组分。所述试剂盒可包含用于施用的一个或多个可重复使用的或一次性的装置(例如，注射器、针、配药笔)，优选以无菌形式包装，和/或包装的酒精棉片。
在某些实施方案中，可以向试剂盒提供描述本发明方法的性能的说明材料。试剂盒可包括用于通过临床医生或患者施用或递送疫苗组合物的说明书。在另一个实施方案中，试剂盒可包括用于正确储存和处理疫苗组合物的说明书。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例无意以任何方式进行限制。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部内容以及附图在此引入作为参考。
实施例
实施例1.感染疫苗研究
FcMBL珠的制备
使用磁性FcMBL珠来捕获病原体或病原体片段，例如病原体相关分子模式(PAMP)。简言之，将1μM链霉抗生物素蛋白包被的超顺磁珠(Dynal，Life Technologies)与FcMBL偶联。FcMBL是工程化的凝集素，其由与具有工程化的氨基氧基生物素位点的人IgG的Fc区融合的甘露糖结合凝集素(MBL)的碳水化合物识别结构域(CRD)组成。使用FcMBL的Fc区末端上的氨基氧生物素使FcMBL融合蛋白在珠上定位。已经测试了其他珠与FcMBL的偶联并用于捕获病原体或病原体片段，例如500nm Ademtech超顺磁珠。还测试了FcMBL与不含链霉抗生物素蛋白的珠的直接偶联，并显示其可用于病原体捕获。用于生成疫苗的珠的最终浓度为5mg/mL。
病原体样品的制备
可以从任何感染分离用于疫苗的病原体。例如，可以培养病原体用于PAMP制备。或者，可以直接从血液样品捕获PAMP。使用从婴儿脊髓性脑膜炎分离的致病性RS218大肠杆菌的MDR菌株进行本研究中的实验。RS218具有血清型O18ac:H7:K1。
RS218大肠杆菌在补充有10％葡萄糖的RPMI培养基中生长至0.5McF(1e8 CFU/mL)。RPMI培养基用于避免酵母提取物和其他可能干扰FcMBL捕获或危害疫苗生成的组分。用1mg/mL头孢吡肟和500μg/mL阿米卡星处理足够的细菌(每个支架至少1mL细菌溶液)24小时。通过铺板接种过夜确认完全杀死细菌(其中检测到0CFU)。
使用涂覆有FcMBL的磁性调理素结合生物脾脏透析样治疗装置捕获RS218的细胞壁病原体相关分子模式(PAMP)。然后在存在或不存在CpG和GM-CSF佐剂的情况下使用PLGA支架将捕获的RS218包括在治疗性疫苗中用于体内小鼠模型研究。
由FcMBL捕获的PAMP是含有碳水化合物的膜组分或RS218片段，例如，泡、囊泡或LPS。为了量化由FcMBL捕获的PAMP，使用真菌MBL靶标，甘露聚糖，生成标准曲线(图2)。简而言之，将用FcMBL包被的1μM超顺磁珠用于捕获缓冲液或供体全血中的甘露聚糖。将连续稀释的甘露聚糖与FcMBL珠混合，并通过ELISA定量。通过标准曲线的插补，将RS218细胞壁片段作为MBL结合的病原体相关分子模式(mPAMP)定量(图3)。对于RS218细菌，选择25μL/mL珠上的15ng/mL PAMP用于随后的疫苗生成。
FcMBL-RS218 PAMP珠的制备
基于对抗生素处理的RS218细菌的PAMP定量，将250μl珠(5mg/mL)加入到10mL稀释的灭活细菌溶液(相当于15ng/mL PAMP)中并孵育20分钟。用磁力去除珠，在TBST 5mM Ca++中洗涤1次，并重悬于10mL的TBST 5mM的Ca++中用于生成疫苗。通过铺板再次确认不存在活细菌(0CFU)。将样品储存在-80℃下。
使用FcMBL ELISA将捕获的RS218细胞壁片段的量作为MBL结合的病原体相关分子模式(mPAMP)定量(图4)。筛选捕获前和捕获后抗生素处理的RS218溶液以确定RS218中mPAMP的量在用FcMBL珠处理时是否相同。测试100μL的RS218样品。如图4所示，与无珠对照(RS218珠前样品)相比，FcMBL珠捕获的RS218具有相似的mPAMP量。
包括EDTA对照以证明FcMBL珠的mPAMP捕获的钙依赖性，其表明mPAMP和FcMBL珠之间的特异性结合。还通过比较捕获前和捕获后抗生素处理的RS218溶液来量化内毒素捕获(表1)。
表1.FcMBL珠捕获的内毒素的定量
使用PLG支架和FcMBL捕获的RS218制备疫苗装置
研究中使用的疫苗装置是根据基于WDVAX临床试验对于标准PLG黑素瘤支架开发的方案制造的。将FcMBL珠掺入支架中，类似于黑素瘤肿瘤裂解产物的掺入。
本研究中使用的PLG球为30μm聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)球。对于对照假装置，将180mg空白PLG球与1.3g筛分的蔗糖(250-400μm)混合。称量所得混合物并称出等量以确保制造10个对照假装置。
对于珠/病原体装置(PLG支架和FcMBL捕获的RS218)，将180mg空白PLG球加入10mlFcMBL捕获的RS218细胞壁片段的悬浮液中，充分混合，冷冻并冻干约7天。将冻干粉末(304mg)与1.3g筛分的蔗糖(250-400μm)混合。称量所得混合物并称出等量以确保制备10个珠/病原体装置。
对于完全疫苗组合物，将180mg具有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的PLG球加入10ml FcMBL捕获的RS218细胞壁片段的悬浮液中，充分混合，冷冻并冻干约7天。将冻干粉末(310mg)与1.3g筛分的蔗糖(250-400μm)和300mg CpG混合。使用聚乙烯亚胺(PEI)浓缩CpG。称重所得混合物并称出等量以确保制备10个疫苗组合物。
为制备疫苗组合物，将适量的冻干粉末置于8mm直径的模具中，并使用液压机在1500psi下成形。一旦形成，将组合物在压力室中通过过夜暴露于800psi的CO2，然后快速释放压力来发泡。将所有组合物储存在-20℃下直至准备用于动物植入。
使用PLG支架和FcMBL捕获的阴沟肠杆菌制备疫苗装置
使用与上文针对大肠杆菌RS218列出的相同方法进行阴沟肠杆菌的制备。简而言之，将阴沟肠杆菌生长至1e8 CFU/mL，用头孢吡肟(1mg/mL)和阿米卡星(500μg/mL)处理，并通过平板接种证实病原体完全死亡。使用1μM FcMBL珠捕获PAMP，并通过FcMBL ELLecSA(Cartwright等，EBioMedicine 9(2016)217-227)定量。然后将含有PAMP的珠掺入PLG支架中。
为了制造PLGA疫苗支架，将含有包封的GM-CSF(9μg)的18mg PLG微球与含有15PAMPS的溶液混合直至获得均匀粉末，然后使用液氮冷冻并在100毫托以下冻干过夜。在装置压制和高压CO2发泡(7-900PSI)之前，将所得粉末与30mg CpG和130mg蔗糖充分混合。在植入前将所得装置在WFI中浸提3小时。
使用MPS支架和FcMBL捕获的RS218制备疫苗装置
FcMBL捕获的RS218珠的制备与上述相同。为了制备MPS疫苗支架，将3μg的GM-CSF、10mg的CpG和含有15PAMPS的溶液加载到10mg的MPS上，并使用旋转混合器在室温下剧烈混合过夜。然后将MPS冻干并在注射前在注射用水(WFI)中重构。
PLG支架疫苗接种保护小鼠免受致死RS218感染的影响
为了研究疫苗组合物的功效，首先用疫苗组合物免疫小鼠，然后用亚致死剂量的RS218细菌攻击。具体地，将使用磁性FcMBL珠捕获的RS218掺入具有CpG和GM-CSF佐剂的PLG支架中以产生完全的疫苗组合物(图5A-5B)。可清楚地看到FcMBL珠分散在整个PLG支架中的孔和空腔中(图5B)。然后将疫苗组合物皮下植入小鼠体内。将仅含有支架的假装置用作阴性对照。在分析中也包括其中由FcMBL珠捕获RS218掺入没有任何佐剂的PLG支架中的珠/病原体装置。每个处理组中包括10只小鼠。
免疫后21天，小鼠通过腹膜内注射用高的但亚致死剂量的RS218(每只小鼠5e6CFU)攻击48小时。如果临床状况要求，则在感染后12小时或更早时人道地处死小鼠。当临床评分降至2/5时和当动物没有恢复或发生通过护理没有改善的严重疼痛和痛苦时，出现人道终点。
生存曲线分析
在RS218感染的小鼠中监测存活率。如图6所示，用完全疫苗组合物(具有FcMBL珠捕获的RS218和GM-CSF/CpG的PLG支架)和珠/病原体装置(具有FcMBL珠捕获的RS218而没有GM-CSF/CpG的PLG支架)治疗的小鼠比用假装置(单独的支架)治疗的小鼠经历更长的存活时间。当用完全疫苗组合物免疫48小时后，10只小鼠中有9只存活。相比之下，50％的接受假装置的小鼠在注射亚致死剂量的RS218细菌后约10小时死亡，和用珠/病原体装置免疫的小鼠的一半在20小时后死亡。这些结果表明添加佐剂如GM-CSF和CpG增强疫苗组合物的功效，导致存活时间增加，并且需要FcMBL捕获的病原体和佐剂两者用于保护性疫苗接种。
器官病原体计数
为了定量RS218感染小鼠中所选器官内的病原体负荷，以无菌方式收集器官培养物，通过机械破碎处理并铺板。简言之，将以无菌方式收获的器官加入珠磨管中。向含有珠和器官的每个管中加入1mL无菌盐水。对每个管进行称重，并将每个管以每秒30的频率珠磨5分钟。以1：100和1：10,000滴定液化的器官。将未稀释的1：100和1：10,000器官样品螺旋铺板在绵羊血琼脂上，在37℃下过夜生长并测定病原体负荷。表2中描述了感染小鼠中的器官病原体计数。图7A表明在接受完全疫苗组合物的小鼠中病原体的总体滴度显著降低2.5-3.5个量级(p＝0.0021-0.0057)，而对于接受珠/病原体装置和假对照的小鼠，没有观察到统计学上显著的差异。对于单个器官中的病原体负荷观察到类似的结果。如图7B所示，在接受完全疫苗组合物(具有FcMBL珠捕获的RS218和GM-CSF/CpG的PLG支架)的小鼠的肺、肝、肾和脾中的RS218水平均显著降低，而接受珠/病原体装置的小鼠具有与对照小鼠相似的病原体水平，进一步表明添加佐剂如GM-CSF和CpG增强了疫苗组合物的功效并且是保护性疫苗接种所必需的。
表2.感染小鼠中的器官病原体计数
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具有FcMBL捕获的RS218的疫苗和具有RS218裂解产物的疫苗之间的比较
为了确定观察到的完全疫苗组合物的保护作用是否可以用不含FcMBL珠的RS218裂解产物再现，制备了含有FcMBL捕获的RS218片段或单独的全RS218裂解产物的具有CpG/GM-CSF的PLG疫苗支架。
将小鼠分成三个处理组，并将PLG支架皮下植入21天。第1组(n＝10)接受假装置(支架和CpG/GM-CSF)，第2组(n＝10)接受含有具有捕获的RS218片段的FcMBL珠的含CpG/GM-CSF的支架，和第3组(n＝10)接受含有全RS218裂解产物的具有CpG/GM-CSF的支架。在第2组和第3组中使用相同量的RS218。
免疫后21天，小鼠通过腹膜内注射用致死剂量的RS218(在20小时的90％的致死剂量(LD90))攻击，然后进行48小时。如图8所示，接受第2组和第3组疫苗组合物的小鼠受到针对RS218感染的保护，并且在与接受假对照的小鼠相比具有延长的存活时间。接受第2组疫苗组合物的10只小鼠中的9只和接受第3组疫苗组合物的10只小鼠中的10只存活，而接受假对照的10只小鼠中的9只在约12小时时被安乐死以避免过度疼痛和痛苦。
器官病原体计数的结果进一步表明，包含具有捕获的RS218片段的FcMBL珠(第2组)或全RS218裂解产物(第3组)的疫苗组合物有效保护小鼠免于RS218感染。图9证明接受第2组和第3组疫苗组合物两者的小鼠在器官中具有显著少于假接种组1的小鼠的病原体。对于第2组小鼠，CFU/g滴度在肺、肾、脾中下降4-6个量级，和肝脏中下降约2个量级。对于第3组小鼠，CFU/g滴度在肺、肝、肾和脾中下降3-4个量级。因此，在与第3组中的小鼠相比时，在第2组的接种小鼠中，大多数器官(即肺、肾和脾)中RS218的水平进一步降低，除了肝脏之外。
这些结果表明细菌裂解产物和FcMBL珠捕获的细菌片段可以与PLG支架组合使用以产生功能性疫苗组合物并保护小鼠免受致命的感染攻击。然而，具有FcMBL珠捕获的病原体片段的疫苗组合物显示出优于直接使用细菌裂解产物的显著优势，因为没有观察到诸如裂解产物浸出和脓肿形成的副作用。
如图10C所示，在植入有含全RS218裂解产物的PLG疫苗支架的小鼠(第3组)中观察到显著的内毒素渗漏，而含有FcMBL捕获的RS218片段的PLG疫苗支架证明没有这种渗漏(第2组)。另外，在48小时处死时，在第3组小鼠的支架周围观察到形成大的脓肿，并且支架不能从粘附分离(图11C)。相反，第2组小鼠中的疫苗组合物大部分是完整和清洁的，几乎没有侵蚀迹象(图11B)，和第1组对照小鼠具有完整的支架而没有免疫反应的迹象(图11A)。疫苗接种后28天，仍然存在假疫苗(第1组)和包含具有捕获的RS218片段的FcMBL珠的疫苗组合物(第2组)，然而，其中RS218裂解产物直接掺入PLG支架中(第3组)，存在强烈的局部炎性反应和支架被降解掉，且这些小鼠在疫苗部位有脓肿。
还量化来自PLG疫苗支架的CpG和GM-CSF泄漏水平，并在三个处理组之间进行了比较。图10A和10B表明，对于CpG和GM-CSF泄漏没有观察到显著差异。
因此，虽然包含细菌裂解产物和FcMBL珠捕获的细菌片段两者的疫苗组合物显示出保护小鼠免受细菌感染的致死攻击，但具有FcMBL珠捕获的病原体片段的疫苗组合物呈现更安全、更受控和局部化的选择而不损害疫苗组合物的功效。
具有FcMBL捕获的病原体的疫苗组合物的交叉反应性
为了确定本发明的疫苗组合物是否可用于针对病原体的不同物种，使用与上文所列相同的方法制备含有CpG/GM-CSF和FcMBL捕获的阴沟肠杆菌裂解产物的PLG疫苗支架。简而言之，阴沟肠杆菌生长至1e8 CFU/mL，用头孢吡肟(1mg/mL)和阿米卡星(500μg/mL)处理，通过平板接种确认病原体完全死亡。使用1μM FcMBL珠捕获PAMP并通过FcMBL ELLecSA定量。然后将含有PAMP的珠掺入PLG支架中。
小鼠通过腹膜内注射用致死剂量的RS218(具有20小时的LD90)攻击。阴沟肠杆菌和大肠杆菌都是肠杆菌科的成员。如图12A所示，具有涂覆有阴沟肠杆菌裂解产物的FcMBL珠的PLG-GMCSF/CpG的预防性疫苗针对RS218攻击后保护了78％的小鼠，直到96小时研究结束时，而仅有GM-CSF募集和CpG佐剂的PLG支架(不含FcMBL珠和细菌裂解产物)在96小时仅保护20％的动物。含有GM-CSF/CpG和涂覆有RS218裂解产物的FcMBL珠的PLG支架的疫苗针对RS218攻击保护100％的小鼠直到96小时研究结束时。
另外，图12B显示接受具有涂覆阴沟肠杆菌裂解产物的FcMBL珠的PLG-GMCSF/CpG疫苗的小鼠中病原体计数降低。
这些结果表明，本发明的疫苗组合物能够靶向给定病原体的不同物种或菌株，因此赋予了优于现有疫苗的显著优势。
单一植入剂量的疫苗组合物的长期效果
为了确定本发明的疫苗组合物是否可赋予针对病原体的长期保护作用，小鼠首先在第1天用具有涂覆大肠杆菌RS218裂解产物的FcMBL珠的PLG-GMCSF/CpG疫苗组合物免疫，在第21天用亚致死剂量的RS218细菌(具有20小时的LD90)进行攻击，并在第60天和第90天再次攻击。如图15A所示，接受疫苗组合物的所有小鼠存活超过90天，其中对照小鼠在第21天的RS218攻击后立即死亡。这些结果表明疫苗组合物能够针对感染的病原体产生长期保护作用，并且单剂量的疫苗组合物可以保护感染的受试者至少90天。
为了证实疫苗组合物的持续作用，小鼠在第1天接种疫苗，然后在第90天用更高的RS218剂量攻击，具有8小时的90％致死剂量。图15B显示75％的接受PLG疫苗组合物的小鼠在RS218攻击后存活超过120天，而对照小鼠在攻击后立即死亡。
MPS支架疫苗接种保护小鼠免于致死的RS218感染
产生包含中孔二氧化硅(MPS)支架的疫苗组合物。为了研究基于MPS的疫苗组合物的功效，小鼠首先用疫苗组合物免疫，然后用亚致死剂量的RS218细菌攻击(在36小时的LD100)。具体地，将FcMBL捕获的RS218片段掺入具有CpG和GM-CSF佐剂的MPS支架中以产生完全的疫苗组合物。然后将疫苗组合物注射到小鼠中。将不同剂量的捕获的病原体(3个PAMP单位和15个PAMP单位)涂覆在FcMBL珠上，然后掺入MPS-GMCSF/CpG支架中。还将15个PAMP单位的RS218掺入PLG支架中作为对照。
如图13所示，含有GM-CSF/CpG和15个PAMP单位的MPS支架保护90％的小鼠免于21天的攻击，而含有3个PAMP单位的MPS支架仅保护70％。接受含有GM-CSF/CpG和15个PAMP涂覆的FcMBL珠的PLG支架的所有小鼠也从攻击存活。
使用不同的病原体剂量(7.5PAMP单位)制备另一组基于MPS的疫苗。图14显示含有GM-CSF/CpG和7.5PAMP单位的MPS疫苗保护90％小鼠免于RS218攻击直至96小时的研究结束(10小时的LD90)(n＝12)。然而，接种假疫苗的小鼠只有50％从细菌攻击存活(n＝6)。
总之，这些结果证明加载有FcMBL捕获的病原体和具有佐剂如CpG/GM-CSF的PLG或MPS支架可以起到有效的疫苗组合物的作用并保护小鼠免于致死的细菌感染。用这些疫苗组合物免疫的小鼠表现出显著延长的存活时间和较低的器官病原体计数。将FcMBL珠捕获的病原体或病原体相关分子模式与疫苗支架(例如PLG或MPS支架)组合的能力允许产生针对所有类型的病原体的高效病原体疫苗，其可以在传染病的治疗中具有很大用途。此外，非传染性疫苗的使用和防止病原体从疫苗组合物中泄漏的能力大大降低了病原体毒素泄漏所经历的严重副作用，从而导致更安全和更受控的疫苗组合物。此外，本发明的疫苗组合物能够靶向给定病原体的不同物种或菌株，并产生针对感染病原体的长期保护作用。实际上，单剂量的本发明的疫苗组合物可以在90天的时间内保护接种疫苗的小鼠免受细菌攻击。
该结果是临床显著的，因为疫苗组合物和方法证明了在体内靶向特定病原体以产生免疫的能力，导致不同的和保护性的免疫反应。
实施例2.疫苗组合物的机理分析
进行另外的实验以确定疫苗组合物(加载有FcMBL捕获的病原体和佐剂如CpG/GM-CSF的PLG或MPS支架)所涉及的免疫反应的种类。具体地，进行测定以确定本发明的疫苗组合物是否介导细胞介导的反应或抗体介导的反应。在接种疫苗的动物中，测量所选细胞因子的水平和特定IgG(例如IgG1和IgG2a)的水平响应于RS218感染的变化。细胞因子水平的重大变化将指示疫苗组合物主要通过细胞介导的反应起作用，而IgG水平的显著变化将表明抗体介导的反应。
进行组织学研究以确定本发明的疫苗组合物是否能够引发针对感染的病原体的细胞介导的免疫反应。小鼠用具有FcMBL珠捕获的RS218和GM-CSF/CpG的PLG支架植入，或注射具有FcMBL珠捕获的RS218和GM-CSF/CpG的MPS支架。将含有假疫苗和完整疫苗的植入部位移出、包埋、切片并用苏木精伊红染色以鉴定浸润的免疫细胞。如图16所示，在对照PLG假装置中没有细胞累积，而对于PLG和MPS支架观察到密集的细胞浸润，表明由疫苗组合物引发细胞介导的反应。
为了确定疫苗组合物是否介导针对感染的病原体的抗体介导的免疫反应，测量了IgG水平。使用检测抗RS218 PAMP IgG和IgM抗体的Sera ELISA进行分析。将96孔微量培养板用RS218裂解产物包被、封闭，并洗涤平板。将样品在103-106之间稀释，然后在室温下孵育。在用HRP山羊抗小鼠IgG二抗缀合物一起温育之前，将平板抽吸并洗涤。最后，加入TMB底物以产生酶促反应并孵育。然后使用分光光度计在450nm的波长下分析样品。然后可以计算连续稀释的结果以确定0.5AU的光密度，其用作建立抗体滴度的惯例。图17显示接受疫苗组合物的小鼠中IgG滴度显著增加，并且IgG水平的增加持续约90天的时间。图17还显示，与原始小鼠相比，疫苗接种后21天抗体滴度增加>1个量级，进一步表明疫苗组合物引发了长期的抗体介导的免疫反应。
实施例3.疫苗接种保护免受多种病原体感染
疫苗接种保护小鼠免受结核分枝杆菌感染
结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTb)引起的传染病。结核病通常会影响肺部，但也可能影响身体的其他部分。大多数结核感染没有症状；在这种情况下，它被称为潜伏性结核病。大约10％的潜伏感染进展为活动性疾病，其如果不治疗，将杀死大约一半的感染者。FcMBL可结合结核分枝杆菌(MTb)细胞壁的甘露糖基化组分，例如，甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)(图18)。
为了确定本发明的疫苗组合物是否可用于对抗结核病，用单剂量的基于MPS的疫苗组合物免疫小鼠，所述疫苗组合物含有GM-CSF/CpG和涂覆有甘露糖封端的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)裂解物的FcMBL珠。图19显示，与疫苗接种前的原始动物相比，单剂量的疫苗组合物使LAM特异性IgG的滴度增加约2-3个量级(p＝<0.001)。此外，在MPS支架内也观察到巨噬细胞、CD4+T细胞和树突细胞的量的显著增加(图20)，证明在接种疫苗的小鼠中也产生了细胞介导的抗LAM免疫反应。为了制备用于FACS分析的细胞，通过在37℃下在胶原酶IV(1mg/ml)中消化20分钟，然后通过70μm筛网过滤来制备来自感染疫苗支架的单细胞悬浮液。用于细胞选通的脾对照通过70μm筛网压碎，和用ACK缓冲液(150mM NH4Cl，1mM KHCO3，Na2EDTA 0.1mM)裂解红细胞。用Fc模块(抗小鼠CD16/32)处理细胞，并用针对CD3e(PE，BDBiosciences)、CD4(PECY7，BD Biosciences)、CD8(FITC，BD Biosciences)的抗体染色。使用FlowJo(Tree Star)分析流式细胞术数据。通过使用血细胞计数器结合来自流式分析的细胞密度来确定支架中CD4+和CD8+T细胞的数量。
这些数据表明，本发明的疫苗组合物能够靶向结核分枝杆菌，和因此在治疗结核病方面具有很大的潜力。
疫苗接种对抗其他病原体
由于FcMBL能够捕获多种病原体属，产生了用于其他病原体的疫苗组合物，例如革兰氏阴性细菌(大肠杆菌RS218)、革兰氏阳性细菌(MRSA)LAM(结核分枝杆菌-细胞壁组分)、真菌(白色念珠菌)、病毒(HIV gp120抗原)和寄生虫(阴道毛滴虫抗原)。
用合适的抗生素处理每种活的病原体。使用头孢吡肟(1mg/mL)和万古霉素(500μg/mL)杀死MRSA，并使用两性霉素B(1mg/mL)杀死白色念珠菌。FcMBL捕获的病原体/抗原包被的珠的制备与以上病原体和FcMBL-RS218 PAMP珠的制备的章节中描述的相同。
图21A显示用不同量的病原体片段涂覆FcMBL珠粒用于疫苗制备。小鼠然后用单剂量的基于MPS的疫苗组合物接种，所述疫苗组合物含有GM-CSF/CpG和用来自传染性微生物的样品包被的FcMBL珠。图21B显示在所有情况下LAM特异性IgG的滴度比接种前的原始动物增加，证明疫苗组合物适合于靶向和介导针对多种病原体物种的免疫反应。
除抗体介导的免疫反应外，疫苗组合物还能够引发针对靶向的病原体的细胞介导的免疫反应。疫苗接种动物的脾脏中浸润细胞的FACS分析表明针对掺入疫苗中的滴虫裂解产物的细胞介导的抗毛滴虫反应(图22)。对照脾脏(原始)与接种动物组相比显示出更少的浸润性CD4+T细胞和CD11c细胞。
实施例4.具有FcSPD捕获的RS218的MPS支架疫苗接种
可选的凝集素用于捕获病原体。肺表面活性物质(脂质和蛋白质的复杂混合物)对肺功能是必要的。表面活性蛋白D(SPD)是与MBL相关的另一种集合素(具有胶原区域的C型凝集素)。SPD在肺的宿主防御中起主要作用。产生FcSPD融合蛋白，其与FcMBL具有77％的蛋白质序列同一性。FcSPD捕获的RS218珠的制备与上述相似。
如图23所示，FcSPD能够结合RS218大肠杆菌和FcSPD捕获的RS218，其在掺入MPS支架中时，也在接种疫苗的小鼠中发动免疫反应。在接种疫苗的小鼠中观察到抗体滴度增加，证明包含FcSPD捕获的病原体的疫苗组合物也能够介导针对感染的病原体的免疫反应。
等同
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规的实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在由以下权利要求所涵盖。整个本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用并入本文。
Claims (20)
1.一种疫苗组合物，其包含
调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体，和能够在受试者中募集免疫细胞的生物制剂。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述生物制剂选自于白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、Fms相关酪氨酸激酶配体(FTL)-3配体、CCL19、CCL21、M-SCF、MIF、CD40L、CD3、ICAM、转化生长因子(TGF)-β、胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
3.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述生物制剂包含佐剂。
4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自于胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、卵清蛋白(OVA)、单磷酰脂质A(MPL)、聚(I:C)、MF59、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙、Quil A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、FIA、montanide、佐剂65、lipovant、聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球、石蜡油、角鲨烯、病毒体、AS03、AS04、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、STING、Toll样受体配体、CD40L、病原体相关分子模式(PAMP)、损伤相关分子模式分子(DAMPs)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、转化生长因子(TGF)-β抗体或拮抗剂、A2aR拮抗剂、脂多糖(LPS)、Fas配体、Trail、淋巴细胞趋化因子、甘露聚糖(M-FP)、APG-2、Hsp70和Hsp90。
5.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中该凝集素结合的病原体构建体包含凝集素、凝集素的一部分、工程化的凝集素或其部分。
6.如权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述凝集素是胶原凝集素。
7.如权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述凝集素是ficollin。
8.如权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基81-228。
10.如权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述凝集素包含MBL(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基111-228。
11.如权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述甘露糖结合凝集素(MBL)能够结合所述病原体。
12.如权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述凝集素包含表面活性蛋白D(SPD)。
13.如权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述表面活性蛋白D(SPD)能够结合所述病原体。
14.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含免疫球蛋白(IgG)Fc部分。
15.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述调理素结合的或凝集素结合的病原体构建体还包含固体基质。
16.如权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述固体基质选自于磁珠、微孔膜、中空纤维反应器、血液过滤膜和血流装置。
17.如权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述固体基质是磁珠。
18.如权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述病原体以约1pg至约1000μg的量存在于所述固体基质上。
19.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述病原体是选自于细菌、真菌、病毒和寄生虫的传染性微生物，或其片段。
20.如权利要求19所述的疫苗组合物，其中所述细菌选自于鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、脆弱拟杆菌(Bacterioides fragilis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus inf b)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)(MDR/CRE)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒杆菌(paratyphi)、鼠伤寒杆菌(typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、新型梭菌(Clostridium neoformans)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、棒状杆菌(Corynebacterium spp)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、耐万古霉素肠球菌(VRE)(vancomycin-resistant Enterococci)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鸟分枝杆菌(Mycobactrium avium)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)、痤疮丙酸杆菌(P.acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A群链球菌(Strep)、B群链球菌(无乳链球菌)和C群链球菌。
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