CN108635576B - 一种免疫联合佐剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种免疫联合佐剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫联合佐剂及其制备方法与应用，属于兽用生物制品及其制备方法。该制剂由遴选的三种成分：CpG‑ODN、MDP、FIA制备而成，其免疫佐剂活性强，靶向性强，安全，能高效提高抗原免疫效果。

Description

一种免疫联合佐剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品及其制备方法，更确切地说，涉及一种免疫联合佐剂及其制备方法与应用。
背景技术
佐剂能显著提高抗原免疫原性或改变抗原诱导机体产生免疫应答类型，使机体免疫细胞向更合理的方向活化而产生人们预期的免疫反应及强度，因此，佐剂已成为疫苗研究的关键组成部分。目前，常用佐剂主要有无机佐剂、有机佐剂、油佐剂和新型佐剂，前三种佐剂在临床应用存在着各自不足，不同程度地限制了它们的使用。另外，研究表明，单独使用某一种佐剂产生的免疫效果不足以达到人们预期效果，并对改善抗原反应强度、免疫力维持时间等作用有限，不能达到理想效果。
发明内容
本发明的目的旨在解决上述问题，提供一种安全、高效、靶向性强且能够用于预防S.aureus感染疫苗的免疫联合佐剂。
首先，本发明提供一种免疫联合佐剂，包括CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(CpG-oligodeoxynucleotides，CpG-ODN)，胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide，MDP)和不完全弗罗因德佐剂(Freund’s Incomplete Adjuvant，FIA)。
优选地，CpG-ODN由遴选的含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸组成，并且，组成的CpG-ODN有磷硫酰修饰。
优选地，所述免疫联合佐剂由5-400ng/mL的CpG-ODN溶液、5-400ng/mL的MDP的溶液与FIA按体积比例1：1：(1-8)混合制成。
另外，本发明还提供一种上述免疫联合佐剂的制备方法，步骤如下：
(1)分别溶解CpG-ODN、MDP与FIA，配制成CpG-ODN溶液、MDP溶液。
(2)将步骤(1)所制备的CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA混合均匀即得免疫联合佐剂。
优选地，步骤(1)所述CpG-ODN与MDP分别溶解在ddH2O、0.85(wt)％NaCl溶液或PBS(PH＝7.4)溶液中，最优选PBS，PBS溶剂溶解CpG-ODN与MDP增强溶液稳定性。
优选地，CpG-ODN溶液与MDP溶液浓度为5-400ng/mL，最优选400ng/mL。
CpG-ODN溶液与MDP溶液配制后4℃保存备用。
优选地，步骤(2)所述CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA体积比为1:1:(1-8)。
同时，本发明还提供一种上述免疫联合佐剂在制备免疫原中的应用。
上述应用，步骤为：将所述免疫联合佐剂与靶标抗原混合，乳化后制成免疫原。制成的免疫原中，CpG-ODN与MDP终浓度均为30ng/mL，靶标抗原终浓度为0.5mg/mL。
本发明的有益效果：
(1)该佐剂能够有效促进Th1、Th2和Th17活化、增殖和分化，具有高效、靶向性。
(2)由于该联合佐剂能够有效发挥各自免疫优势作用，产生高效协同佐剂活性，从而高效提高靶标抗原的免疫原性。
(3)由于预防S.aureus感染关键在于选择新型免疫佐剂协同靶向激活Th1、Th17细胞、选取高效缓释抗原系统，从而最大程度地提高靶标抗原免疫原性，达到有效预防S.aureus感染目的，而该联合佐剂非常适合这方面的需要，因此其具有广阔的市场应用前景。
附图说明
n代表平行实验数目：
图1免疫小鼠血清抗体水平检测结果(n＝3)；
图2免疫小鼠血清抗体亚类检测结果(n＝3)；
图3.免疫小鼠淋巴细胞细胞因子IFN-γ分泌量(A)、IL-4分泌量(B)，(n＝3)；
图4免疫组小鼠脾细胞上清液中IL-10分泌水平(A)、IL-17分泌水平(B)，(n＝3)；
图5免疫小鼠用金黄色葡萄球菌攻毒后的存活率：S.aureus Newman株(A)，S.aureus Wood46株(B)，(n＝10)。
具体实施方式
通过下面给出的本发明的具体实施例和免疫效力试验可以进一步清楚地理解本发明，但下述实施例不是对本发明的限定。
实施例1免疫联合佐剂的制备
(1)分别溶解CpG-ODN、MDP与FIA，配制成CpG-ODN溶液、MDP溶液。
(2)将步骤(1)所制备的CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA混合均匀即得免疫联合佐剂，
步骤(1)所述CpG-ODN与MDP分别溶解在dd H2O中。
CpG-ODN溶液与MDP溶液浓度为5ng/mL。
CpG-ODN溶液与MDP溶液配制后4℃保存备用。
步骤(2)所述CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA积比为1:1:1。
实施例2免疫联合佐剂的制备
(1)分别溶解CpG-ODN、MDP与FIA，配制成CpG-ODN溶液、MDP溶液。
(2)将步骤(1)所制备的CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA混合均匀即得免疫联合佐剂，
步骤(1)所述CpG-ODN与MDP分别溶解在0.85(wt)％NaCl溶液中。
CpG-ODN溶液与MDP溶液浓度为75ng/mL。
CpG-ODN溶液与MDP溶液配制后4℃保存备用。
步骤(2)所述CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA体积比为1:1:8。
实施例3免疫联合佐剂的制备
(1)分别溶解CpG-ODN、MDP与FIA，配制成CpG-ODN溶液、MDP溶液。
(2)将步骤(1)所制备的CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA混合均匀即得免疫联合佐剂，
步骤(1)所述CpG-ODN与MDP分别溶解在PBS(PH＝7.4)溶液中，PBS溶剂溶解CpG-ODN与MDP增强溶液稳定性。
CpG-ODN溶液与MDP溶液浓度为400ng/mL。
CpG-ODN溶液与MDP溶液配制后4℃保存备用。
步骤(2)所述CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA体积比为1:1:4。
实施例4免疫原的制备
将实施例3制备的免疫联合佐剂与ALS3(T细胞表位)-TRAP(ATT)蛋白(2mg/mL)溶液按照体积比3:1混合之后、使用乳化器将其制成免疫原，使CpG-ODN和MDP工作浓度均为30ng/mL，ALS3-TRAP蛋白浓度为0.5mg/mL。
实施例5免疫效力试验
采用上述实施例4制成的免疫原免疫6-8周龄健康雌性SPF级C57/B6小鼠，即ALS3(T细胞表位)-TRAP(ATT)+CpG+MDP+FIA为实验组，同时，以ATT+MDP+FIA组、ATT+CpG+FIA组、ATT+MDP组、ATT+CpG组、ATT+CpG+MDP组、ATT+FIA组和PBS组作为对照组。免疫过程中，每只小鼠的免疫注射剂量为200μL(对照组涉及的ALS3-TRAP、CpG、MDP和FIA成分含量均与实验组相同)，免疫部位为大腿外侧肌肉。第一次免疫后21天进行加强免疫(即重新进行一次免疫注射)。加强免疫21d后，采用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体水平及亚类分析，利用ELISPOT方法评价小鼠脾脏中淋巴细胞活化情况，采用S.aureus攻毒实验确定免疫小鼠的免疫保护率。
(1)抗体检测结果
抗体水平检测结果显示ATT+CpG+MDP+FIA组IgG抗体水平量最高，虽然与ATT+MDP+FIA组和ATT+CpG+FIA组相比无显著差异，但与其它各组相比，差异极显著(P<0.01)，详见图1。
采用间接ELISA方法检测各组抗体亚类水平。酶标仪OD450下读取数值，处理分析后如图2。结果表明抗体亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3中IgG1亚类含量最高，其中，ATT+CpG+MDP+FIA组IgG1含量最高，与ATT+MDP+FIA组和ATT+CpG+FIA组相比无显著性差异，与其它组相比差异极显著(P<0.01)。
(2)淋巴细胞活化分析结果
为了检测抗原刺激机体引起的Th1及Th2细胞免疫应答，应用ELISPOT方法测定各实验组和对照组小鼠的淋巴细胞IFN-γ、IL-4分泌量。图3所测结果显示ATT+CpG+MDP+FIA组中IFN-γ含量高于其它各组，具有极显著差异(P<0.01)，而IL-4含量除与ATT+CpG+FIA组相比无显著差异外，同其它各组比较具有差异极显著(P<0.01)。
为了检测抗原刺激机体引起的Treg及Th17细胞免疫应答，应用ELISA方法测定各实验重组蛋白免疫组和对照免疫组小鼠脾脏细胞上清液中IL-10、IL-17分泌水平。结果如图4所示，结果表明ATT+CpG+MDP+FIA组小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-10分泌量与PBS+FIA组、ATT+CpG组、ATT+FIA组、ATT+CpG+MDP组比较差异极显著(P<0.01)，与其它各组无显著差异；而ATT+CpG+MDP+FIA组上清液中IL-17分泌量同其它各组比较具有差异极显著(P<0.01)。
(3)小鼠免疫保护率的分析
用S.aureus Newman株和S.aureus Wood46株进行攻毒，结果显示S.aureusNewman株攻毒后3d，PBS+FIA组小鼠存活率为20％，此时ATT+CpG+MDP+FIA组免疫存活率为80％，ATT+CpG+FIA组免疫存活率为80％，ATT+MDP+FIA组免疫存活率为60％，ATT+CpG+MDP组免疫存活率为50％，ATT+CpG组免疫存活率为50％，ATT+MDP组免疫存活率为40％，ATT+FIA组免疫存活率为30％。Wood46攻毒后3d，PBS+FIA组小鼠存活率为10％，此时ATT+CpG+MDP+FIA组免疫存活率为80％，免疫保护率最高，ATT+CpG+FIA组免疫存活率为70％，ATT+MDP+FIA组免疫存活率为60％，ATT+CpG+MDP组与ATT+CpG组免疫存活率均不高于50％，ATT+MDP组与ATT+FIA组免疫存活率均为30％。详见图5。
试验证明：CpG-ODN、MDP与FIA作为一种新型联合佐剂，能够协同发挥各自的免疫优势作用，具有极强的高效性、靶向性和免疫活性作用，能显著增强靶标抗原的免疫原性，为新型联合佐剂的研发提供了重要参考。

Claims (5)

1.一种免疫联合佐剂，其特征在于：包括含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸（CpG-oligodeoxynucleotides，CpG-ODN），胞壁酰二肽（Muramyl Dipeptide，MDP）和不完全弗罗因德佐剂（Freund’s incomplete adjuvant，FIA）；CpG-ODN由遴选的含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸组成，并且组成的CpG-ODN有磷硫酰修饰；由400 ng/mL的CpG-ODN溶液、400 ng/mL的MDP的溶液与FIA按体积比例1：1：4混合制成；所述免疫联合佐剂用以增强ALS3-TRAP蛋白的免疫原性。
2.一种权利要求1所述免疫联合佐剂的制备方法，其特征在于：步骤如下：
（1）分别溶解CpG-ODN、MDP与FIA，配制成CpG-ODN溶液、MDP溶液；
（2）将步骤（1）所制备的CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA混合均匀即得免疫联合佐剂；
步骤（2）所述CpG-ODN溶液、MDP溶液与FIA体积比为1：1：4；步骤（1）所述CpG-ODN与MDP分别溶解在PBS溶液中，PH=7.4；CpG-ODN溶液与MDP溶液浓度为400 ng/mL。
3.一种权利要求1所述免疫联合佐剂在制备增强ALS3-TRAP蛋白的免疫原性的免疫原中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤为：将所述免疫联合佐剂与靶标抗原混合，乳化后制成免疫原。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：制成的免疫原中，CpG-ODN与MDP终浓度均为30 ng/mL，靶标抗原终浓度为0.5 mg/mL。
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