CN103842029A

CN103842029A - 作为疫苗的hmgb2基因失活的减毒疟原虫

Info

Publication number: CN103842029A
Application number: CN201280045498.2A
Authority: CN
Inventors: 凯瑟琳·瓦克罗; 西尔维·布里凯; 纳杜·埃塞尼亚·劳森-赫巴恩; 萨拉赫迪内·梅凯里; 罗伯特·梅纳德
Original assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2014-06-04
Also published as: FR2978048B1; BR112014001039A2; US20140154289A1; FR2978048A1; MX2014000727A; WO2013011247A1; AU2012285600A1; CA2841164A1; JP2014520563A; EP2734270A1

Abstract

本发明涉及用于通过使用经由灭活hmgb2基因的功能而遗传减毒的疟原虫寄生虫免疫宿主以对抗疟疾的新的组合物和方法。

Description

作为疫苗的HMGB2基因失活的减毒疟原虫

技术领域

本发明属于医药领域，尤其是防治疟疾。

背景技术

疟疾是由疟原虫(Plasmodium)属的真核单细胞寄生虫引起的传染病。这类寄生虫病出现在世界各地，并在发展中国家中导致严重的经济和健康问题。恶性疟原虫(P.falciparum)是感染人类的5类疟原虫中危害最大的种类。据世界卫生组织(法文缩写为OMS)，恶性疟原虫导致25000至50000万例急性疾病并且每年导致约100万例死亡(尤其是小于5岁的儿童和孕妇)。脑型疟疾是疟疾的一种严重神经性并发症，这类疾病致死病例中的绝大多数都归咎于此。即使个体存活了，脑型疟疾可导致严重的神经性副作用，特别是对于幼儿，其免疫系统尚在形成过程之中。脑型疟疾的发病机制复杂且仍然尚未完全阐明。目前认为，脑型病理可能是在主要器官(脾脏、肺、心脏、肠、肾、肝和脑)的微血管中被寄生的红细胞的隔离(séquestration)以及同样在这些器官中促炎细胞因子产生的结果，造成了可导致个体死亡的全身性综合征和状态。

防治疟疾是OMS的主要挑战之一，但迄今为止，旨在控制这种疾病的所有努力都失败了。在过去三十年中，尽管OMS的数据似乎是令人鼓舞的，但情况已然恶化，这是因为疟蚊(anophèles)对杀虫剂产生抗性并且恶性疟原虫对于抗疟疾药物(即使是组合使用)产生持续增加的化学抗性。

防治疟疾由于缺乏行之有效的抗这种疾病的疫苗而遇到困难。开发疫苗的第一次尝试可追溯到20世纪70年代。自那时以来，出现了越来越多的疫苗试验，而后者面临着寄生虫在其2个连续宿主(人和蚊子)中发育的复杂性，并且还面临着寄生虫逃避免疫系统的异常复杂的机制，其涉及相当高的抗原变异。

这种在寄生虫红细胞内期的变异使得传统的利用疟原虫蛋白质-肽复合物的预防性免疫变得极其困难。由寄生虫的蛋白质生产的疟疾疫苗目前处于临床试验的III期(RTS，S de GlaxoSmithKline Biologicals)。然而，来自II期的结果表明，该疫苗仅可减少35%的临床疟疾发生，且仅可减少49%的严重疟疾的发生。

获得有效对抗寄生虫的红细胞形式的疫苗无论如何仍然是根除疾病中的主要挑战，因为这样的疫苗将既可以减轻症状，又可以减少寄生虫载量和血液中配子体的量，从而减少寄生虫的传播。

最近的研究表明，极低剂量的由恶性疟原虫3D7寄生的红细胞与抗疟疾药物同时给药联合的重复给药诱导了能够保护患者以抵抗同源种属的红细胞内期的免疫(Pombo等人，2002)。

因此，设想利用遗传减毒的活寄生虫(或GAP，“遗传减毒寄生虫”)来诱导长期不育的保护。因此，几种GAP已被公开。然而，大多数的这类GAP经由减毒寄生虫的子孢子而靶向于肝细胞阶段。也已经公开了2个靶向红细胞内期的GAP：其中嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)(Ting等人，2008)或核苷转运蛋白1(NT1)(Aly等人，2010)已被失活的啮齿目动物寄生虫约氏疟原虫(P.yoelii)。已表明，这些GAP所提供的免疫是针对于同源种属的，但也在较小程度上针对于异源种属。然而，使用这些遗传减毒的活寄生虫的疫苗的疗效和无害性仍尚待确认。

因此，现在仍然有必要开发新的策略，以特定地抑制严重攻击的发生，如脑型疟疾的发生，同时也减少寄生虫载量和外周血中配子体的量，从而减少该疾病传播的风险。

发明内容

本发明的目的是提供新的用于预防疟疾的疫苗组合物，尤其是预防疟疾如脑型疟疾的严重攻击的发生。

发明人已经证实，属于疟原虫属的且其hmgb2基因功能已被失活的活寄生虫可以用作疟疾疫苗中的免疫原。实际上，已观察到，施用这种寄生虫在宿主中诱导了免疫反应，其可以清除寄生虫(寄生虫载量低于用显微镜在外周血中检测的阈值)，并有效地和长期地抵御疟原虫的感染，尤其是高致病种属，且尤其是抵御导致疾病症状和传播的寄生虫的红细胞内期。

因此，本发明首先涉及属于疟原虫属且其hmgb2基因功能已被失活的活寄生虫，其用于预防疟疾，尤其是预防具有严重神经性并发症的脑型疟疾。

优选地，本发明的寄生虫用于预防哺乳动物的疟疾或脑型疟疾，尤其是人类。

寄生虫的种属可以选自伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)。优选地，寄生虫的种属选自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫，更优选地，选自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫。

根据一个具体实施方式，寄生虫的种属是恶性疟原虫。

根据另一个具体实施方式，寄生虫的种属是伯氏疟原虫，尤其是伯氏疟原虫NK65。

优选地，野生型形式的寄生虫不引起脑型疟疾。

根据一个具体实施方式，寄生虫的种属是非细胞粘附的或具有降低的细胞粘附能力的恶性疟原虫种属，优选具有降低的细胞粘附能力的。

本发明的寄生虫可以是红细胞内的形式，特别是红细胞内滋养体、裂殖子或裂殖体的形式，优选是红细胞内裂殖子或裂殖体的形式。

本发明的寄生虫可以是非红细胞内裂殖子的形式，即通过完全或部分纯化而从被寄生的红细胞中获得的裂殖子的形式。

本发明的寄生虫也可以是子孢子的形式。

hmgb2基因的功能可以通过完全或部分缺失所述基因而失活，优选通过完全缺失所述基因。尤其是，hmgb2基因的编码区可以被替换为选择标记，例如编码二氢叶酸还原酶的人类基因。

hmgb2基因的功能也可以通过干扰RNA的方法而失活，干扰RNA阻塞或减少HMGB2蛋白的翻译。

在本发明的寄生虫中，一种或多种其它基因的功能可被失活。尤其是，功能被失活的其它基因可以选自编码嘌呤核苷磷酸化酶、核苷转运蛋白1、UIS3、UIS4、p52和p36的基因及其组合。

在第二方面中，本发明涉及免疫原性组合物，其包含作为免疫原的免疫有效量的本发明的寄生虫以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或支持物。本发明还涉及疟疾疫苗，其包括作为免疫原的本发明的寄生虫以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或支持物。

免疫原性组合物或疫苗还可以包含一种或多种免疫佐剂。特别是，免疫佐剂可以选自胞壁肽类；海藻糖二霉菌酸酯(TDM)；脂多糖(LPS)；单磷酰脂质A(MPL)；羧甲基纤维素；完全弗氏(Freund)佐剂；不完全弗氏佐剂；任选地补充角鲨烯或角鲨烷的“水包油”乳液型佐剂，；矿物佐剂；细菌毒素；CpG寡脱氧核苷酸；皂苷；合成的共聚物；细胞因子和咪唑喹诺酮类(imidazoquinolones)的佐剂。

免疫原性组合物或疫苗可以被配制为肠胃外给药。

免疫原性组合物或疫苗可以包括多种本发明的寄生虫。

优选地，组合物或疫苗的每注射剂量包括在10至10⁷之间，优选在10至10⁵之间，更特别是优选在10²至10⁵之间的寄生虫。

根据一个具体实施方式，免疫原性组合物或疫苗的每剂量单位包括在10至10⁶之间，优选在10²至10⁶之间的红细胞内形式的本发明的寄生虫。

根据另一个具体实施方式，免疫原性组合物或疫苗的每剂量单位包括在10²至10⁷之间的非红细胞内裂殖子形式的本发明的寄生虫。

根据另一个具体实施方式，免疫原性组合物或疫苗的每剂量单位包括在10³至10⁷之间的子孢子形式的寄生虫。

在另一个方面中，本发明涉及本发明的寄生虫用于制备对抗疟疾或脑型疟疾的疫苗组合物中的用途。

在另一个方面中，本发明还涉及免疫受试者以对抗疟疾的方法，包括对所述受试者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗，优选胃肠外给药，特别是皮下、肌内、皮内或静脉内给药。

附图说明

图1：感染有用野生型寄生虫PbNK65或突变的寄生虫PbNK65 Δhmgb2寄生的红细胞（法文缩写为GRP)的C57BL/6小鼠的寄生虫血症(Parasitémie)(分别每静脉注射10⁵和10⁶的GRP)。通过在显微镜下对染色涂片中的GRP进行计数以分析寄生虫血症，并表示为GRP的百分比(平均值±标准偏差)。实验用5只小鼠进行，并重复数次。p值为0.008。

图2：研究用突变的寄生虫PbNK65 Δhmgb2进行初次感染并随后用2个致病的野生型寄生虫PbNK65和PbANKA感染三次的小鼠的存活率。第一组攻击在J19(初次感染后19天)进行，第二组在J71进行，最后第三组在J162进行。在每组攻击时，通过感染未受到初次感染的同龄小鼠，并通过监控因严重寄生虫血症(hyperparasitémie)或脑型疟疾所致的境况及死亡的情况来验证2种感染了PbNK65和PbANKA的GRP制剂的致病性。每次试验对5只小鼠进行分析。

图3：用不同量的感染了突变的寄生虫PbNK65 Δhmgb2的GRP免疫C57BL/6小鼠。在时间0时，用10³(□)、10⁴(○)或10⁵(Δ)的感染了PbNK65Δhmgb2的GRP感染10只小鼠。之后，这些小鼠在J24用10⁵的感染了野生型致病寄生虫PbNK65(n=5)或PbANKA(n=5)的GRP进行感染攻击。首次用于试验的小鼠(Des souris

)也在J24用10⁵的感染了野生型致病寄生虫PbNK65(▲)或PbANKA(●)的GRP进行感染攻击。

具体实施方式

恶性疟原虫基因组测序已于2002年完成。该基因组包含约5500个基因，其中50%以上的基因具有完全未知的功能。在研究恶性疟原虫中涉及转录调控的因子时，发明人注释了4个HMGB(PfHMGB1至4；高迁移率族蛋白)。这些是非常丰富的具有细胞核因子和细胞外介质的特异性的非组蛋白核蛋白。

在人类中，已经对其进行了详细研究，其存在于细胞核中并发挥构件因子(facteurs architecturaux)的作用，通过染色质重塑参与转录调节。在对细胞而言危险的情况下(异物，炎症)，这些蛋白被主动分泌到细胞介质中和/或在细胞坏死的情况下被动分泌，并通过激活巨噬细胞和其它免疫系统的感应细胞(cellules compétentes)而发挥实际危险信号(alarmines)的作用(Lotze和Tracey，2005)。人HMGB1蛋白在疾病中的介入已证明会引起全身性炎症反应，如红斑狼疮、脓毒性休克或类风湿关节炎和某些癌症。最后，人HMGB1蛋白在患者的血清中的增加与这些疾病的严重程度相关。

在恶性疟原虫中，本发明人已更具体地研究了PfHMGB1和PfHMGB2，其都是小于100个氨基酸的小蛋白。这两种蛋白，同其人类同源基因一样，能够弯曲DNA（法文缩写为ADN）并与特定DNA结构相互作用(Briquet等人，2006)。其也分泌到恶性疟原虫培养物上清液中并在恶性疟原虫培养物上清液中被发现。恶性疟原虫的HMGB1和2蛋白能够在小鼠单核细胞系中激活和诱导TNFα的表达(Kumar等人，2008)。

在本申请中，发明人用感染了伯氏疟原虫ANKA寄生虫(PbANKA)的C57BL/6小鼠作为脑型疟疾的动物模型。这种动物模型再现了人类病理学的主要特点，如共济失调、空间定向力障碍、抽搐和昏迷。这些临床症状可以导致动物死亡。与人类类似，被寄生的红细胞的隔离、脑出血和病变、促炎症性细胞因子的产生和血-脑屏障的破坏都可在此模型中观察到。在该模型中，所有感染了PbANKA分离株的C57BL/6小鼠在约7天内死于脑型疟疾。在另一个方面中，本发明人观察到60%的感染了寄生虫PbANKA Δhmgb2的小鼠未发展成脑型疟疾。

发明人失活了另一种伯氏疟原虫分离株即NK65分离株的hmgb2基因，其在感染后20至25天后因严重寄生虫血症诱导C57BL/6小鼠死亡，但不引起脑型疟疾。他们首先观察到这种基因的失活阻碍了小鼠中PbNK65 Δhmgb2的发育，并在感染后10至15天时所获得的外周血中，寄生虫被清除了。发明人随后证实，导致寄生虫清除的宿主反应足以引起持续多于6个月的不育的免疫(immunité stérile)，这不仅针对于同源野生型种属PbNK65，而且还针对于能够诱导脑型疟疾的高致病性异源种属PbANKA。

因此，在第一方面中，本发明涉及属于疟原虫属且其hmgb2基因功能被失活的活寄生虫，其用于疟疾或脑型疟疾的预防，优选在哺乳动物中，尤其是优选在人类中。

寄生虫优选能够在脊椎动物中发育，尤其是在哺乳动物中，并且属于选自芬凯虫属（Plasmodium vinckeia）、疟原虫属（Plasmodium plasmodium）和拉符虫属（Plasmodium laverania）的亚属。

根据一个实施方式，寄生虫能够在人类宿主中发育并属于疟原虫属（Plasmodium plasmodium）或拉符虫属（Plasmodium laverania）亚属。优选地，寄生虫属于导致人类疟疾的种类，特别是选自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫的种类。虽然诺氏疟原虫是基本上感染灵长类动物的寄生虫，但有越来越多的人类感染这种寄生虫的病例被报道。更特别优选的为，寄生虫属于选自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的种类。根据一个具体实施方式，寄生虫属于选自恶性疟原虫、间日疟原虫和三日疟原虫的种类。根据一个优选的实施方式，寄生虫属于恶性疟原虫的种类。

根据另一个实施方式，寄生虫属于能够在人类中诱导免疫反应，但并不能够引起疟疾症状的种类。优选地，该寄生虫属于芬凯虫属（Plasmodiumvinckeia）亚属的啮齿动物寄生虫。在对人类接种疫苗的过程中使用啮齿动物寄生虫可显著减少与对受试者施用活寄生虫相关的风险。啮齿动物寄生虫可以被修饰，以表达一种或多种感染人类的疟原虫如恶性疟原虫中的蛋白，其是侵入人类红细胞所需要的。这样的蛋白是，例如，在Triglia等人，2000中所描述的蛋白。优选地，寄生虫属于伯氏疟原虫或约氏疟原虫的种类。更特别优选地，寄生虫属于伯氏疟原虫的种类。根据一个优选的实施方式，寄生虫是伯氏疟原虫种类的NK65分离株。

根据一个具体实施方式，寄生虫属于选自伯氏疟原虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫的种类。寄生虫也可以属于选自伯氏疟原虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的种类，或选自伯氏疟原虫、恶性疟原虫、间日疟原虫和三日疟原虫的种类，或选自伯氏疟原虫和恶性疟原虫的种类。

根据一个优选的实施方式，寄生虫的野生型种属，即其hmgb2基因有活性的寄生虫，不引起脑型疟疾。该种属可能，例如，选自伯氏疟原虫NK65、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫。该种属也可以是已失去其细胞粘附能力或具有降低的细胞粘附能力的恶性疟原虫种属。根据一个实施方式，寄生虫的野生型种属是非细胞粘附的恶性疟原虫种属。根据另一个实施方式，寄生虫的野生型种属是具有降低的细胞粘附能力的恶性疟原虫种属。细胞粘附是恶性疟原虫的性质，其直接关系到脑型疟疾的发展。实际上，感染了细胞粘附的恶性疟原虫种属的红细胞能结合到内皮细胞的表面分子上，如CD36、ICAM1、VCAM1或PECAM1/CD31，并因此在各种器官，尤其是脑中引起血管阻塞、炎症和损伤。种属的细胞粘附能力可以通过任何本领域技术人员已知的技术进行评估，例如在Buffet等人，1999或在Traore等人，2000中所描述的。术语“降低的细胞粘附能力”是指比参照的细胞粘附的疟原虫种属，例如恶性疟原虫3D7种属中所观察到的细胞粘附能力低的细胞粘附能力。以细胞粘附的疟原虫种属，如恶性疟原虫3D7种属作参照，细胞粘附可以减少至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%，优选至少80%，更优选至少90%。例如，可以通过在培养基中多次离体传代(Udeinya等人，1983)来获得具有降低的细胞粘附能力的恶性疟原虫种属。例如在Trenholme等人，2000中(其clag9基因被失活的恶性疟原虫)和Nacer等人，2011(恶性疟原虫D10和T9-96)中描述了具有降低的细胞粘附能力的各种恶性疟原虫种属。因此，根据一个具体实施方式，寄生虫的野生型种属是鲜有细胞粘附的或非细胞粘附的恶性疟原虫种属。尤其是，寄生虫的野生型种属可以是具有降低的细胞粘附能力的恶性疟原虫种属，其选自器clag9基因被失活的恶性疟原虫种属、恶性疟原虫D10种属和恶性疟原虫T9-96种属。

本发明使用的寄生虫中，hmgb2基因的功能是被失活的。这意味着，由该基因编码的HMGB2蛋白的活性被完全或部分抑制，优选为完全抑制。这种抑制可以通过本领域技术人员公知的多种方法而获得。因此，可以在转录或翻译水平或在蛋白质水平上阻断基因功能，例如通过阻断或降低hmgb2基因的转录或翻译或者通过破坏蛋白的正确折叠或其活性。

为了失活该基因，尤其可以通过完全或部分缺失该基因，或者插入或替换一个或多个核苷酸使hmgb2基因的功能失活。

根据一个具体实施方式，hmgb2基因的功能通过完全或部分缺失该基因而失活，优选通过完全缺失。

优选地，通过同源重组获得hmgb2基因的缺失。该方法是本领域技术人员所公知的，并已多次应用于疟原虫属的寄生虫(参见，如Thathy和Ménard，2002)。根据一个具体实施方式，通过同源重组将hmgb2基因的编码区替换为标记物，该标记物使得可以筛选发生重组的寄生虫。选择标记可以是，例如赋予寄生虫乙胺嘧啶抗性的人类二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。在实验部分例证了缺失hmgb2基因的寄生虫的获取。根据本发明的一个具体实施方式，使用的寄生虫是将其hmgb2基因替换为选择标记的寄生虫，优选为人类dhfr基因。根据本发明的一个非常具体的实施方式，寄生虫是伯氏疟原虫，优选为NK65分离株，其中hmgb2基因已被替换为选择标记，优选为人类dhfr基因。根据本发明的另一个具体实施方式，使用的寄生虫是恶性疟原虫，其优选是非细胞粘附或鲜有细胞粘附的，其中hmgb2基因已被替换为选择标记，优选人类dhfr基因。

也可通过阻断或降低该基因的mRNA（法文缩写为ARNm）的翻译使hmgb2基因的功能失活。RNA（法文缩写为ARN）干扰可以特异性抑制靶基因的表达，其是本领域技术人员公知的现象并且已被用于抑制疟原虫基因的表达(参见，例如McRobert和McConkey，2002；Mohmmed等人，2003；Gissot等人，2004)。根据一个实施方式，编码干扰RNA或其前体的序列被引入到寄生虫的基因组中且由强启动子控制其表达，优选组成型启动子，例如，eEF1α延伸因子的启动子，该因子在寄生虫发育的所有阶段都有活性，或者HSP70基因的启动子，该基因在子孢子和整个红细胞周期中都有活性。本领域技术人员可以容易地选择干扰RNA的序列和结构。尤其是，所使用的干扰RNA可以是小干扰RNA(siRNA，法文缩写为ARNsi)。

下述表1中给出了已经测序的不同疟原虫种类的hmgb2基因的序列及其相应蛋白序列的GenBank号。

表1.目前已测序的不同疟原虫种类的HMGB2的核苷酸和蛋白序列的GenBank号

尚未测序的疟原虫种类的hmgb2基因可以容易地通过本领域技术人员所公知的方法进行鉴定，尤其是通过杂交或PCR。

本发明的寄生虫中，也可以将hmgb2以外的一个或多个基因的功能失活。另外的其功能被失活的基因可以是参与寄生虫在哺乳动物宿主，尤其是人类中生存的基因。优选地，该另外的基因的失活能够减弱寄生虫的毒性并同时保持其免疫原性性质。这一另外的基因可以选自嘌呤核苷磷酸化酶(PNP；PFE0660c)、核苷转运蛋白1(NT1；PF13_0252)、UIS3(PF13_0012)、UIS4(PF10_0164早期转录本)、p52(具有6-半胱氨酸基序的PFD0215c蛋白)和p36(PFD0210c)及其组合(括号内的参考是恶性疟原虫3D7序列的banquePlasmoDB登记号，通过举例在此给出)。

用于培养本发明的寄生虫的方法以及保藏尤其是低温保藏寄生虫的方法在先前已进行了描述并且被本领域技术人员所熟知(参见，例如Leef等人，1979；Orjih等人，1980)。这些寄生虫可用细胞培养基离体培养或在动物中体内培养，例如在小鼠中。

根据一个实施方式，以红细胞的形式使用本发明的寄生虫，尤其是以非红细胞内裂殖子的形式或以红细胞内裂殖子(

)、滋养体(

)或裂殖体(schizontes)的形式。

根据一个具体的实施方式，以在红细胞内的红细胞内裂殖子、滋养体或裂殖体的形式使用本发明的寄生虫。

根据另一个具体的实施方式，以非红细胞内裂殖子的形式使用寄生虫，即在被寄生的红细胞破裂后部分或完全纯化的裂殖子。可根据本领域技术人员已知的方法获得裂殖子，如Boyle等人，2010的文章中所述的方法。

可以通过将寄生虫引入优选为人类的宿主并当寄生虫血症达到最小值1%，优选在5%至10%之间时回收受感染宿主的红细胞而获得被寄生的红细胞。根据一个优选的实施方式，被寄生的红细胞回收自血型为O且Rh阴性的人类宿主。

根据另一个优选的实施方式，被寄生的红细胞取自离体感染的人类红细胞，优选血型为O且Rh阴性的红细胞。任选地，将被寄生的红细胞培养物同步化以主要获得红细胞内裂殖子、滋养体或裂殖体。离体培养疟原虫寄生虫的方法是本领域技术人员所熟知的(参见，例如Trager和Jensen，1976)。

抗凝剂如肝素，可以添加到因此所获得的被寄生的红细胞中。在存在一种或多种与体内使用相容的冷冻保护剂，如甘油或二甲亚砜(DMSO)时，可以通过冷冻保藏被寄生的红细胞。被寄生的红细胞也可通过在4℃冷藏于适当的保存介质中而进行保存，例如SAGM(“盐水嘌呤葡萄糖甘露醇”)介质或CPD(柠檬酸磷酸葡萄糖)溶液，但为期不超过约45天。

根据另一个实施方式，以子孢子的形式使用本发明的寄生虫。可通过将寄生虫引入可使其增殖的蚊子宿主来获得子孢子。之后，从受感染的蚊子的唾腺回收子孢子。在解冻以将活的子孢子注射到宿主之前，通过冷冻如液氮来保藏因此所获得的子孢子。或者，在从蚊子唾腺回收之后，在施用前，通过冻干或冷冻来保存子孢子。

对受试者施用本发明的寄生虫，尽管寄生虫清除很快，也能够在受试者中诱导持续数月的针对疟原虫感染的免疫，尤其是选自恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫的疟原虫，优选为恶性疟原虫。该免疫尤其可以是针对异于所使用的寄生虫的其它疟原虫种属感染的交叉免疫。尤其是，施用属于不引起脑型疟疾的种属的本发明的寄生虫会导致针对能引起严重神经性并发症的疟原虫种属感染的交叉免疫。因此，本发明的寄生虫可以用于预防疟疾和/或脑型疟疾。尤其是，对受试者施用本发明的寄生虫能诱导持续数月的针对能诱导脑型疟疾的恶性疟原虫感染的免疫，从而预防由这种寄生虫引起的疟疾和/或脑型疟疾。

本文中使用的术语“预防”是指在与寄生虫接触后缺乏症状或存在减弱的疾病症状。尤其是，术语“预防疟疾”是指在与导致疟疾的疟原虫相接触之后在受治疗的受试者中缺乏症状或存在减弱的症状。术语“预防脑型疟疾”是指在与导致疟疾并能够诱导脑型疟疾的疟原虫相接触之后在受治疗的受试者中缺乏症状或存在减弱的症状。该术语也可指，在感染了导致疟疾并能够诱导脑型疟疾的疟原虫的受试者中，缺乏脑型疟疾的发展或脑型疟疾的发展不是很严重或减弱。

在第二方面中，本发明涉及免疫原性组合物，其包括免疫有效量的本发明的寄生虫以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或支持物。组合物中所包括的寄生虫如上所述。

根据一个实施方式，组合物包括红细胞形式的本发明的寄生虫，尤其是红细胞内裂殖子、滋养体或裂殖体，或者非红细胞内裂殖子的形式，优选红细胞内裂殖子、滋养体或裂殖体的形式。

根据一个具体的实施方式，组合物包括被本发明的寄生虫寄生的红细胞并且其能根据上述和实验部分所述的方法获得。

根据另一个实施方式，组合物中所包含的寄生虫是如上所述的子孢子的形式。

免疫原性组合物能够在被给药的受试者中诱导免疫系统抵抗所包含的寄生虫的应答。此处使用的术语“免疫有效量”是指足以触发受试者的免疫应答的寄生虫的量。

优选地，免疫原性组合物是疟疾疫苗。

根据一个实施方式，如上所定义，通过在一种或多种药学上可接受的赋形剂中悬浮被寄生的红细胞、裂殖子或子孢子获得本发明的组合物，优选被寄生的红细胞或子孢子。根据寄生虫的形式：红细胞内、裂殖子或子孢子，并根据设想的给药途径，本领域技术人员可以容易地选择赋形剂。这些赋形剂可尤其选自无菌水、无菌生理盐水和磷酸盐缓冲液。其它本领域技术人员所熟知的赋形剂也可以使用。优选地，在组合物包括被寄生的红细胞的情况下，所使用的赋形剂是等渗溶液，以确保直至对受试者施用组合物时红细胞的完整性。优选地，组合物还包含至少一种抗凝血剂，如肝素。

还可以通过混合如上所定义的寄生虫子孢子和药学上可接受的支持物如脂质体以获得组合物。

选择所使用的赋形剂或支持物以确保被寄生的红细胞的完整性和/或子孢子或裂殖子的存活。选择所使用的赋形剂或支持物，以确保无论使用何种形式(裂殖子、子孢子或红细胞内形式)，直到对将要免疫的受试者施用组合物时，本发明的寄生虫都是存活的。

根据一个优选的实施方式，待免疫的受试者是哺乳动物，优选人类。

本发明的组合物可通过如肠胃外、皮下、粘膜、跨粘膜或表皮给药。优选地，配制组合物以使其通过肠胃外进行给药，尤其是通过皮下、肌内、静脉内或皮内。

根据一个具体的实施方式，寄生虫是红细胞的形式，优选包含于红细胞中，并且配制组合物以进行肠胃外给药，优选为皮下、肌内、静脉内或皮内，更优选为静脉内。

根据另一个具体实施方式，寄生虫是子孢子的形式，并且配制组合物以进行肠胃外给药，优选皮下、肌内或皮内，优选肌内或皮下。用于施用包括活子孢子的组合物的方法是本领域技术人员所公知的(参见，例如国际专利申请WO2004/045559和Hoffman等人，2010的文章)。

根据一个实施方式，寄生虫是红细胞的形式并包含于红细胞内，并且每剂量单位的本发明的组合物包括在10和10⁶之间的被寄生的红细胞(GRP)，优选每剂量单位在100至10⁶之间的GRP，更优选在100至10⁵之间的GRP，极其优选每剂量单元在100至10⁴之间的GRP。根据一个具体实施方式，寄生虫是红细胞的形式并包含于红细胞内，并且每剂量单位的本发明的组合物包括在10至100之间的被寄生的红细胞(GRP)。

根据另一个实施方式，寄生虫是非红细胞内裂殖子的形式，并且每剂量单位的本发明的组合物包括在10²至10⁷之间的裂殖子，优选每剂量单位在10³至10⁵之间的裂殖子。

根据另一个实施方式，寄生虫是子孢子的形式，并且每剂量单位的本发明的组合物包括在10³至10⁷之间的子孢子，优选每剂量单位在10⁴至10⁵之间的子孢子。

本领域技术人员可以基于待免疫受试者的生理数据容易地确定给药剂量，如其年龄或免疫状态、所需的免疫程度、给药剂量的次数和使用的给药途径。给药剂量也可以根据寄生虫保藏模式而有所变化。

本发明的组合物可以包括一种或多种种属的本发明的寄生虫。根据一个实施方式，组合物包括至少一种恶性疟原虫种属和一种间日疟原虫种属，其中hmgb2基因功能被失活。

本发明的组合物还可以包括一种或多种其它的遗传减毒的疟原虫属的寄生虫。这些寄生虫可以例如存在嘌呤核苷磷酸化酶基因、核苷转运蛋白1、UIS3、UIS4、P52或P36基因的功能的修饰或失活，或者是因辐照所获得的减毒的寄生虫。这些寄生虫优选属于选自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫的种属。

本发明的组合物还可以包括一种或多种免疫佐剂。这些佐剂刺激免疫系统，从而增强了因本发明的寄生虫所获得的免疫应答。这些免疫佐剂包括但不限于胞壁肽类的佐剂，如N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)及其衍生物；海藻糖二霉菌酸酯(TDM)；脂多糖(LPS)；单磷酰脂质A(MPL)；羧甲基纤维素；完全弗氏佐剂；不完全弗氏佐剂；任选补充有角鲨烯或角鲨烷的“水包油”乳液型佐剂；矿物佐剂，如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钾或磷酸钙；细菌毒素，如霍乱毒素B亚基、来源于大肠杆菌的百日咳毒素或不耐热淋巴毒素的失活形式；CpG寡脱氧核苷酸；皂苷；合成的共聚物，如聚氧乙烯(POE)和聚氧丙烯(POP)的共聚物；细胞因子；或咪唑喹诺酮。也可以使用佐剂的组合。这些不同类型的佐剂是本领域技术人员所熟知的。尤其是，本发明的组合物可以包括选自CpG寡核苷酸和矿物佐剂，尤其是明矾和其组合的一种或多种免疫佐剂。

根据另一个方面，本发明涉及属于疟原虫属并且其hmgb2基因的功能被失活的活寄生虫用于制备对抗疟疾或脑型疟疾的疫苗组合物的用途。

本发明还涉及用于制造对抗疟疾或脑型疟疾的本发明的疫苗组合物的方法。

根据一个实施方式，方法包括将感染了本发明的活寄生虫的红细胞与一种或多种药学上可接受的赋形剂或支持物相混合的步骤。优选地，红细胞是获自血型为O且Rh阴性的宿主的人类红细胞。

根据另一个实施方式，方法包括将本发明的寄生虫的活非红细胞内裂殖子与一种或多种药学上可接受的赋形剂或支持物相混合的步骤。

根据另一个实施方式，方法包括将本发明的寄生虫的活子孢子与一种或多种药学上可接受的赋形剂或支持物相混合的步骤。

根据一个优选的实施方式，寄生虫是也以被寄生的红细胞的形式、或裂殖子、或子孢子的形式与一种或多种免疫佐剂相混合。这些佐剂可以如上所定义。

方法还可以包括前置步骤，前置步骤包括如使用上述方法来获得所述被寄生的红细胞、所述裂殖子或所述子孢子。

所获得的组合物或疫苗可以在给药前进行保藏，例如如果其包含被寄生的红细胞，则冷冻或冷藏；如果其包含子孢子或裂殖子，则冷冻、冷藏或冻干。优选地，所获得的组合物或疫苗在给药前进行冷冻保藏。在冻干的情况下，给药前将合适的稀释剂加入到冻干物中，例如无菌水或无菌生理盐水，优选无菌生理盐水。

在这一方面，还考虑了关于本发明的寄生虫和组合物的不同实施方式。

根据另一个方面，本发明涉及免疫受试者以对抗疟疾的方法，包括对所述受试者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。

优选地，受试者是哺乳动物，尤其是人类。

根据一个优选的实施方式，方法包含对所述受试者施用本发明的疫苗。

根据一个实施方式，方法包含施用单剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。

根据另一个实施方式，方法包括施用多个剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。在施用2至6个剂量后可以获得受试者的免疫。优选地，在每次给药之间有约4至8周的间隔，优选约6至8周。

发明人已经证明，施用单次剂量的包括10⁵寄生有本发明的寄生虫的红细胞可以使哺乳动物获得持续至少6个月的不育免疫。根据一个优选的实施方式，方法包括施用第一剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗，再在约半年至一年后施用第二剂量。优选地，剂量包括在10和10⁶、优选在100至10⁶之间的被寄生的红细胞，在10²至10⁷之间的裂殖子或在10³至10⁷之间的子孢子。根据一个优选的实施方式，剂量包含约10³的被寄生的红细胞。根据另一个优选的实施方式，剂量包括在10至100之间的被寄生的红细胞。

受试者针对疟疾或脑型疟疾的免疫可能是完全或不完全的。在不完全免疫的情况下，与未免疫受试者中观察到的症状相比，免疫的受试者中已存在疾病的症状的严重性被减弱。在完全免疫的情况下，与寄生虫相接触后，免疫的受试者未出现疾病的症状。

根据一个优选的实施方式，通过施用本发明的组合物所获得的免疫是不育免疫。这意味着，所施用的寄生虫的发育是高度修饰的，并且在给药约2至4周后在受试者的外周血中检测不到寄生虫。

本发明还涉及免疫受试者以对抗疟疾的方法，包括以感染了所述寄生虫的蚊子叮咬的方法对所述受试者施用子孢子形式的本发明的寄生虫。

下述实施例用于说明而并非限制的目的。

实施例

当研究HMGB蛋白的功能时，发明人最近发现，伯氏疟原虫的HMGB2蛋白在感染了伯氏疟原虫ANKA寄生虫(PbANKA)的C57BL/6小鼠模型中参与了实验性脑型疟疾(NPE)的建立。PbANKA中的hmgb2基因的失活并不阻碍寄生虫在C57BL/6小鼠中的发育，但却诱导了NPE建立的延迟，甚至在65%的情况下完全取消了NPE的建立。此外，已表明，对先前感染了PbANKA Δhmgb2的小鼠施用重组HMGB2蛋白可以恢复脑型疟疾的发展。

材料和方法

小鼠

所用的小鼠是C57BL/6小鼠(Charles River实验室)。这些小鼠对实验性脑型疟疾(NP-S)是敏感的。

野生型寄生虫

由于脑型疟疾，在7天+/-1时，伯氏疟原虫ANKA寄生虫(PbANKA)(MRA-867)诱导了C57BL/6小鼠的死亡。这种寄生虫具有受eef1启动子控制的GFP标签(Thaty和Ménard，2002)。

因感染后20至25天时的严重寄生虫血症，伯氏疟原虫NK65寄生虫(PbNK65)(MRA-268)(de Sa等人，2009)诱导了C57BL/6小鼠的死亡。另一方面，这种寄生虫不会引起脑型疟疾。

获得PbNK65 Δhmgb2寄生虫

构建克隆载体：hmgb2基因的5'UTR和3'UTR位置中的开放阅读框侧翼的区域分别在下文中命名为RH1和RH2(具有约500bp（法文缩写为pb）的长度)，并通过PCR使用特异性引物(表2)从PbNK65寄生虫的基因组DNA中进行扩增，将其克隆到

II-TOPO载体(Invitrogen)中。再将这些构建体转化到大肠杆菌(Escherichia coli)One

TOP10电转感受态细菌中，并在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基上进行筛选。

表2：用于扩增RH1和RH2同源区域的引物

设计用于扩增的引物，以添加，

-RH1：5'UTR位置中的ApaⅠ限制性酶切位点和3'UTR位置中的SmaⅠ限制性酶切位点，和

-RH2：5'UTR位置中的Not I限制性酶切位点和序列的3'UTR位置中的Asc I限制性酶切位点。这些限制性酶切位点可以使PCR片段插入到载体中。

然后，将5'和3'非翻译区RH1和RH2插入到pBC SK-Hudhfr载体(Stratagene)中，其中该载体包括在5'UTR位置的受启动子ef1α控制的人二氢叶酸还原酶(hudhfr)基因以及在3'UTR位置的dhfr/ts(dhfr/胸苷酸合成酶)。将RH1插入到相对于Hudhfr盒的5'UTR位置且RH2插入在3'UTR位置。在同源重组中，2个RH1和RH2区域与伯氏疟原虫基因组的hmgb2基因的互补序列相配对，使在该基因水平进行双同源重组，结果是使基因缺失。Hudhfr赋予乙胺嘧啶抗性并通过使用这种药物选择突变体寄生虫。

寄生虫的转染和突变体寄生虫的选择：根据Koning-Ward等人，2000中所描述的方案转染伯氏疟原虫的裂殖子。通过静脉注射实施所有的感染。

用2.6×10⁶的PbANKA或PbNK65的GRP感染2只3周龄的瑞士小鼠。当寄生虫血症达到2%至3%之间时(主要的幼龄阶段)(stades jeunesmajoritaires)，通过心脏内穿刺在有肝素的情况下采集血液(1.5至2ml的血液)。在5ml的包含补充了1体积的胎牛血清(Invitrogen)的4体积的RPMI1640(Invitrogen)的完全培养基中简单洗涤血液。450g离心8min后，用50ml的完全培养基溶解GRP。再将进一步加了50ml完全培养基的细胞悬浮液置于500ml的锥形烧瓶中在1.5至2bar的压力下于36.5℃以70rpm转速振荡培养过夜。

次日，通过涂片确认主要存在的为成熟裂殖体之后，GRP培养物以1500rpm的转速离心10min，然后在50ml锥形管中将沉淀溶解于35ml的完全培养基中。随后将10毫升的50%的Nycodenz(Lucron生物制品，1/2稀释于1×PBS中)十分小心地加入到GRP培养物中，从而在管底部建立密度梯度。于450g，AT，无制动地离心20分钟以使GRP得到纯化，其因此在管中部形成棕色环。收集GRP的棕色环(～20ml)，再用20ml完全培养基洗涤。于450g离心8min后，将成熟裂殖体的沉淀最终溶解于3ml的完全培养基中，再将其分装于3个1.5ml的EP管中。这一操作必须非常温和地进行，因为裂殖体非常脆弱。在此阶段，所获得的裂殖体的量足以进行多达10个独立的转染。在最后以16000g旋转5秒之后，将每个管中的裂殖体沉淀和所获得的各自5μg的用ApaI和AscI预先消化的质粒构建体(用于pbhmgb1或pbhmgb2的pBC-5'RH1Hudhfr3'RH2)溶解于100μl的电穿孔缓冲液(NucleofectorSolution88A6，AMAXA)中。用Amaxa的Nucleofector电穿孔仪的U33程序转染寄生虫。电击导致成熟裂殖体的膜破裂，并且因此释放的裂殖子可以纳入线性化的质粒。将50微升的完全培养基立即加入到反应杯的内容物中并立刻用各自100μl的转染的裂殖子感染2只3周龄的瑞士小鼠。在感染后的J1，将筛选药物乙胺嘧啶施用到饮用水中并每天进行涂片。以如下方式制备乙胺嘧啶溶液：70mg乙胺嘧啶(Sigma Aldrich)、10ml的DMSO中，补足1L的水，pH3.5-5.5。当小鼠变成感染寄生虫的阳性小鼠(约感染后J6)并且寄生虫血症达到2%至10%之间时，通过心脏内穿刺采集其血液。

寄生虫培养条件及接种

用各自200μl的含有10⁷的GRP/200μl的安瓿经腹膜内给药感染C57BL/6小鼠。当寄生虫血症达到1%至5%之间时(感染后5-6天)，从动物的面颊采集约100μl的血液并加入到含有肝素的管中。用1ml的冷PBS洗涤血液2次并以3800rpm离心5min。稀释至1/1000并细胞计数后，用10⁵的GRP感染C57BL/6小鼠。

寄生虫血症的测量

通过在显微镜下对染色涂片中的被寄生的红细胞(GRP)进行计数而分析寄生虫血症。

制备被寄生的红细胞以及冷冻GRP

用各自200μl的含有10⁷的GRP/200μl的安瓿经腹膜内给药感染C57BL/6小鼠。

制备了2种类型的寄生虫储备。

稳定生物(Stabilats)：当寄生虫血症达到3%至10%之间时(用10⁷的被寄生的红细胞感染5至6天后)，通过心脏内穿刺(动物被麻醉)从受感染的小鼠中采集血液并加到含有肝素的管中并始终置于冰上，直到于下述低温保藏混合物中于液氮冷冻时：1体积的纯甘油(Sigma Aldrich)+9体积的Alsever’s溶液(Sigma Aldrich)。用1体积所采集的血液制备稳定生物，在所述血液中加入了2体积的低温保藏混合物。等份部分冷冻于液氮中(每只小鼠约300μl)，并随后储存于-80℃。

安瓿(Ampoules)：如上所述，通过心脏内穿刺采集血液，但此时是当寄生虫血症达到1%至5%之间时。将血液用冷PBS洗涤数次并以3800rpm离心5min。参见前段，对被寄生的红细胞的数目进行计数后，制备含有在低温保藏混合物中的10⁷GRP/200μl的安瓿。

结果

HMGB2蛋白在PbNK65寄生虫发育中的作用

发明人证明，hmgb2基因的失活阻碍了PbNK65 Δhmgb2在C57BL/6(NP-S)小鼠中的发育，并且根据寄生虫的感染剂量，在感染后的10至15天(J10-J15)寄生虫被清除了。图1示出了在感染了被野生型PbNK65或PbNK65Δhmgb2寄生的红细胞的C57BL/6小鼠中的3次实验的平均值(n=5只小鼠每实验)。在感染后约15天观察到突变的寄生虫的清除。在血液涂片上不再能检测到突变的寄生虫，而野生型寄生虫持续发育直至小鼠在感染后约25天因严重寄生虫血症而死亡。这是因为，虽然野生型寄生虫继续发育，但PbNK65 Δhmgb2的感染诱导了C57BL/6小鼠中的免疫反应，其修饰了该寄生虫的发育。所获得的数个独立的突变克隆在C57BL/6小鼠中的发育过程中都显示了相同的清除动力学。

通过PbNK65 Δhmgb2的初次感染所诱导的不育保护

在用突变的寄生虫PbNK65 Δhmgb2(10⁵GRP，经腹膜内或静脉内注射)进行初次感染的C57BL/6小鼠中，进行从1次到3次的连续感染攻击的数个实验。当在C57BL/6小鼠的血液中不再能检测到寄生虫时(约J19)，发明人进行了第一次感染攻击(J19)，之后用2种高度致病的野生型寄生虫于J71进行第二次感染攻击并于J162进行第三次感染攻击：

1.野生型同源寄生虫PbNK65，其导致小鼠因严重寄生虫血症而死亡，和

2.野生型异源寄生虫PbANKA，其导致小鼠因脑型疟疾而死亡。

图2给出了3次连续感染攻击的实验结果。所有用PbNK65 Δhmgb2进行初次感染的小鼠都在3次感染攻击中存活了，且不育保护持续至少7个月。在每次攻击时，发明人都证实了，野生型PbNK65寄生虫在首次接受实验的小鼠中持续发育至约25天，在该时间点，小鼠开始因严重寄生虫血症而死亡，且野生型PbANKA寄生虫在首次接受实验的小鼠中持续发育至约7天，在该时间点，小鼠因脑型疟疾而死亡(用于寄生虫的致病性和鼠龄的对照)。

为了确定必要且充分促进不育保护的感染了PbNK65 Δhmgb2的红细胞的最小剂量，在用10⁵至10³的GRP(图3)以及甚至用10²的GRP(结果未显示)进行初次感染的小鼠进行感染攻击。这些实验表明，注射了10²或10³的GRP可以在通过静脉注射10⁵的野生型PbNK65或PbANKA GRP而进行的感染攻击中诱导不育保护。

结论

这些结果表明，用PbNK65 Δhmgb2寄生虫进行初次感染后可以诱导不育免疫(在外周血中不再能检测到寄生虫)。这种保护不仅扩展到野生型同源寄生虫PbNK65还扩展到能诱导脑型疟疾的异源寄生虫PbANKA。

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Claims

1.一种属于疟原虫属且hmgb2基因功能被失活的活寄生虫，其用于预防哺乳动物的疟疾或脑型疟疾。

2.根据权利要求1所述的寄生虫，其中寄生虫选自伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)和诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)。

3.根据权利要求1或2所述的寄生虫，其中寄生虫选自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫。

4.根据权利要求1至3任一项所述的寄生虫，其中寄生虫是恶性疟原虫。

5.根据权利要求1至4任一项所述的寄生虫，其中寄生虫的野生型形式不引起脑型疟疾。

6.根据权利要求1、2和5任一项所述的寄生虫，其中寄生虫是伯氏疟原虫NK65(Plasmodium berghei NK65)。

7.根据权利要求1至5任一项所述的寄生虫，其中寄生虫是非细胞粘附的或细胞粘附能力降低的恶性疟原虫。

8.根据权利要求7所述的寄生虫，其中寄生虫是细胞粘附能力降低的恶性疟原虫种属。

9.根据权利要求1至8任一项所述的寄生虫，其中寄生虫是非红细胞内裂殖子的形式。

10.根据权利要求1至8任一项所述的寄生虫，其中寄生虫是红细胞内的形式。

11.根据权利要求10所述的寄生虫，其中寄生虫是红细胞内滋养体、裂殖子或裂殖体的形式。

12.根据权利要求11所述的寄生虫，其中寄生虫是红细胞内裂殖子或裂殖体的形式。

13.根据权利要求1至8任一项所述的寄生虫，其中寄生虫是子孢子的形式。

14.根据权利要求1至13任一项所述的寄生虫，其中通过hmgb2基因的完全或部分缺失使hmgb2基因的功能失活。

15.根据权利要求14所述的寄生虫，其中通过hmgb2基因的完全缺失使hmgb2基因的功能失活。

16.根据权利要求14或15所述的寄生虫，其中hmgb2基因的编码区被替换为选择标记。

17.根据权利要求16所述的寄生虫，其中选择标记是编码二氢叶酸还原酶的人类基因。

18.根据权利要求1至13任一项所述的寄生虫，其中利用阻塞或减少HMGB2蛋白翻译的干扰RNA使hmgb2基因的功能失活。

19.根据权利要求1至18任一项所述的寄生虫，其中一种或多种其它基因的功能被失活。

20.根据权利要求19所述的寄生虫，其中其功能被失活的其它基因选自编码嘌呤核苷磷酸化酶、核苷转运蛋白1、UIS3、UIS4、p52和p36的基因及其组合。

21.一种免疫原性组合物，其包括免疫有效量的作为免疫原的权利要求1至20中任一项所定义的寄生虫，和一种或多种药学上可接受的赋形剂或支持物。

22.一种疟疾疫苗，其包括作为免疫原的权利要求1至20中任一项所定义的寄生虫，和一种或多种药学上可接受的赋形剂或支持物。

23.根据权利要求21所述的免疫原性组合物或权利要求22所述的疫苗，其还包括一种或多种免疫佐剂。

24.根据权利要求23所述的免疫原性组合物或疫苗，其中免疫佐剂选自胞壁肽类的佐剂；海藻糖二霉菌酸酯(TDM)；脂多糖(LPS)；单磷酰脂质A(MPL)；羧甲基纤维素；完全弗氏佐剂；不完全弗氏佐剂；任选地补充有角鲨烯或角鲨烷的“水包油”乳液型佐剂；矿物佐剂；细菌毒素；CpG寡脱氧核苷酸；皂苷；合成的共聚物；细胞因子和咪唑喹诺酮。

25.根据权利要求21、23和24任一项所述的免疫原性组合物或权利要求22至24中任一项所述的疫苗，其被配制为肠胃外给药形式。

26.根据权利要求21和23至25任一项所述的免疫原性组合物或权利要求22至25中任一项所述的疫苗，其包括数种权利要求1至20中任一项所定义的寄生虫。

27.根据权利要求21和23至26任一项所述的免疫原性组合物或权利要求22至26中任一项所述的疫苗，其每剂量单位包括在10至10⁶之间的，优选在10²至10⁶之间的红细胞内形式的所述寄生虫。

28.根据权利要求21和23至26任一项所述的免疫原性组合物或权利要求22至26中任一项所述的疫苗，其每剂量单位包括在10³至10⁷之间的子孢子形式的寄生虫。

29.根据权利要求21和23至26任一项所述的免疫原性组合物或根据权利要求22至26中任一项所述的疫苗，其每剂量单位包括在10²至10⁷之间的非红细胞内裂殖子形式的寄生虫。

30.权利要求1至20任一项所述的寄生虫用于制备对抗疟疾或抗脑型疟疾的疫苗组合物的用途。

31.一种免疫受试者以对抗疟疾的方法，其包括对所述受试者施用权利要求21和23至29中任一项所述的免疫原性组合物或权利要求22至29中任一项所述的疫苗。

32.根据权利要求31所述的方法，其中组合物或疫苗是经肠胃外施用的。

33.根据权利要求32所述的方法，其中组合物或疫苗经皮下、肌内、皮内或静脉内给药。