KR102169664B1

KR102169664B1 - 열대열말라리아원충 유래의 EF-1α 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 말라리아 예방용 백신 조성물

Info

Publication number: KR102169664B1
Application number: KR1020190022500A
Authority: KR
Inventors: 박현; 여선주; 유동욱
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2020-10-23
Also published as: KR20200104066A

Abstract

본 발명은 열대열말라리아원충(Plasmodium falciparum) 유래의 EF-1α(elongation factor-1 alpha) 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 말라리아 예방용 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 이용한 말라리아 감염의 예방 방법에 관한 것이다.

Description

열대열말라리아원충 유래의 EF-1α 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 말라리아 예방용 백신 조성물{Vaccine composition for preventing malaria comprising recombinant EF-1α protein derived from Plasmodium falciparum as effective component}

본 발명은 열대열말라리아원충 유래의 EF-1α 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 말라리아 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

말라리아는 말라리아 원충(plasmodium)이 모기를 통해 사람이나 원숭이, 쥐, 조류 등의 몸에 들어가 기생하며 일으키는 전염병이다. 결핵에 이어 희생자 수가 가장 많은 전염병으로 꼽힌다. 해마다 200만명 이상이 감염되고, 이 중 약 50만명이 사망한다. 사망자의 대부분은 5살 이하의 어린이들이며, 빈도국에서는 말라리아 때문에 매일 어린이 1,000명이 희생되는 것으로 보고되었다. 감염 후 방치하면 심각한 합병증으로 사망에 이를 수 있지만, 대부분의 선진국에선 지금의 의료기술로도 충분히 치료가 가능하다. 하지만 감염자 수에 비해 치료받을 기회가 적은 아프리카 등지에서는 여전히 많은 환자가 희생되고 있는 게 현실이다.

말라리아 원충은 약물에 대한 저항성을 빨리 확보할 수 있고, 성체에 이르는 과정이 아주 복잡하기 때문에 효과적인 예방 백신 개발이 쉽지 않다.

말라리아는 현재까지 유효한 백신이 없어 화학요법제(Chemotherapy)가 주치료법이다. 수세기 동안 말라리아 치료법의 주요 약물로서 클로로퀸(Chloroquine; CQ)을 사용하여 왔다. 그러나, 클로로퀸 약물의 급속한 약물 내성 균주의 발생으로 그 효력을 상실하여 온 바, 아테미시닌(artemisinin) 기반 조합 치료법이 현재 전세계적 표준 치료법으로 제공되고 있다.

한편, 한국공개특허 제2010-0109556호에는 포자소체(circumsporozoite) 단백질을 포함하는 '말라리아 백신'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0095979호에는 '강화된 말라리아 MSP-1 서브유닛 백신'이 개시되어 있으나, 본 발명의 열대열말라리아원충 유래의 EF-1α 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 말라리아 예방용 백신 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 열대열말라리아원충(Plasmodium falciparum)으로부터 유래된 EF-1α(elongation factor-1 alpha) 재조합 단백질을 이용하여 실험동물에 면역화시킨 후 플라스모디움 베르헤이(Plasmodium berghei)를 감염시킨 결과, 비면역화 그룹에 비해 실험동물의 생존기간 및 생존율이 증가되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 열대열말라리아원충(Plasmodium falciparum) 유래의 EF-1α(elongation factor-1 alpha) 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 말라리아 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 말라리아 원충(plasmodium) 감염이 예상되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 말라리아 감염의 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물은 유효성분인 EF-1α 재조합 단백질에 의하여 말라리아원충이 감염되어도 이로 인한 피해를 감소시킬 수 있으므로, 효과적인 말라리아의 예방에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 발현·정제 후의 열대열말라리아원충(Plasmodium falciparum) 유래 EF-1α 재조합 단백질을 확인한 SDS-PAGE 겔 사진이다. 레인 1: 마커, 레인 2: 유도 전 펠렛, 레인 3: 유도 전 세포 용해물, 레인 4: IPTG(0.5 mM) 유도 후 펠릿, 레인 5: IPTG 유도 후 세포 용해물, 레인 6: 정제한 재조합 PfEF-1α 단백질.
도 2는 PfEF-1α 재조합 단백질의 백신 효과를 검증하기 위한 in vivo 실험 모식도이다.
도 3은 플라스모디움 베르헤이(Plasmodium berghei) 감염 후 실험동물의 원충혈증(parasitemia), 체중 및 생존율을 분석한 결과이다. No infection: normal 그룹.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 열대열말라리아원충(Plasmodium falciparum) 유래의 EF-1α(elongation factor-1 alpha) 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 말라리아 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물에 있어서, 상기 말라리아는 말라리아 원충(plasmodium)에 감염되어 발생하는 급성 열성 전염병을 의미한다.

본 발명에 따른 EF-1α(elongation factor-1 alpha) 재조합 단백질의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 상기 백신 조성물은 면역원성을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 상기 백신은 서브유닛 백신(subunit vaccine)인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. "서브유닛 백신"이란, 미생물에서 분리한 감염방어항원물질을 포함한 백신을 말하는 것으로, 단백질 정제 또는 유전자 재조합 기술로 미생물의 일부 단백질만을 사용하는 단백질 서브유닛 백신을 의미한다.

본 발명에서 용어, "예방"이란, 조성물의 투여로 말라리아 원충 감염증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 백신 조성물은 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다.

수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.

또한, 상기 백신 조성물은 어주번트(adjuvant, 면역조성제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 어주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용 가능한 어주번트로는 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 백신 조성물은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 중에서 선택된 어느 하나의 투여경로를 통해 투여될 수 있으며, 볼루스로 투여하거나 서서히 주입할 수 있으나, 바람직하게는 주사로 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양으로, 부작용 또는 심각하거나 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량의 수준은 치료하려는 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 재조합 EF-1α 단백질의 제거 속도, 치료 지속 기간, 재조합 EF-1α 단백질과 조합되거나 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. "치료상 유효량"의 결정시, 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.

본 발명은 또한, 상기 백신 조성물을 말라리아 원충(plasmodium) 감염이 예상되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 말라리아 감염의 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 말라리아 원충은 플라스모디움 베르헤이(Plasmodium berghei)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 개체는 인간을 제외한 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 말라리아 원충의 배양

클로로퀸(Chloroquine) 저항성 열대열말라리아원충(Plasmodium falciparum) FCR-3 실험용 클론의 혈액 단계(blood stage)를 in vitro에서 배양하였다. 배양은 RPMI 1640 배지에 인간 O형 적혈구 세포를 5% 헤마토크리트(hematocrit)로 함유시키고, 24 mM 중탄산나트륨, 25 mM HEPES, 0.8% 히포잔틴, 0.9% 알부맥스(albumax) 및 25 ㎍/㎖ 젠타마이신을 보충하였다. 배양은 CO₂-O₂-N₂ 배양기(대기 조성: 5% CO₂, 5% O₂ 및 90% N₂)에서 37℃의 온도 조건으로 배양하였으며, 배지는 매일 교체하여 주었다. 배양은 주기적으로 도말하여 김자염색(Giemsa staining)으로 모니터링하였다.

2. 항원 발현

클로로퀸 저항성 열대열말라리아원충(P. falciparum) FCR-3을 게노믹 DNA 및 mRNA 추출을 위해 사용하였다. 정방향 (5'-GGA TCC AAT GGG TAA GGA AAA AAC AC-3', 서열번호 2) 및 역방향 (5'-CTC GAG TTT TTT GGC TGG TGC T-3', 서열번호 3) 프라이머를 이용하여 전장의 PfEF1-1α(GenBank accession number: AVN98121.1) 유전자를 증폭하였다. PCR은 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)을 이용하였으며, 반응 조건은 하기와 같다: 95℃ 5분 → [95℃ 30초 → 56℃ 45초 → 72℃ 1분](30회) → 72℃ 5분. PCR 산물은 pET21b+ 벡터(Novagen, USA)에 클로닝하였으며, 상기 재조합 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 재조합 항원의 발현을 위하여, 상기 형질전환 대장균을 100 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 250 ㎖의 LB 액체배지에 접종하고, 37℃에서 OD₆₀₀값이 0.5~0.6이 될때까지 진탕배양하였다. 그 후, 0.5 mM의 IPTG(isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 22℃에서 18시간 배양하여 항원 단백질의 발현을 유도하였다. 그 후, 15,941 xg, 4℃, 10분의 조건으로 원심분리하여 세포 펠릿을 회수하고 결합 버퍼(20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 300 mM NaCl, 25 mM imidazole)로 세척한 후 원심분리하여 세포 펠릿을 재회수하고, 프로테아제 저해제 칵테일(complete™ ULTRA Tablets, Roche, Germany)을 첨가한 결합 버퍼를 이용하여 재현탁시키고 아이스(ice)에 15분간 두었다. 27,237 xg, 4℃, 15분의 조건으로 원심분리하고, His₆ 태그-융합된 EF-1α 단백질의 정제를 위해서 상층액을 NI-NTA 친화성 컬럼(Thermo-Fisher Scientific, USA)에 로딩하였다. 그 후, 세척 버퍼(20 mM imidazole, 300 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5)를 이용하여 세척하고, 용출 버퍼(250 mM imidazole, 300 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl, pH 7.5)를 사용하여 재조합 PfEF-1α(이하, rPfEF-1α)를 용출시켰다. 정제된 rPfEF-1α는 SDS-PAGE 겔에 로딩하여 확인하였다.

3. 백신 효능 검증을 위한 동물 실험

6주령의 BalB/c 암컷 생쥐(Orient Bio Co., Korea)를 구입하여 순화시켰다. 모든 실험동물들은 제한된 조건하에서 식이하며 유지시켰다. 동물 실험은 원광대학교 실험동물운영위원회의 승인된 실험 절차에 따라 수행되었다(WKU16-40).

면역화를 위해, rPfEF-1α(200 ㎍/mouse)을 주 1회, 복강으로, 총 3주 동안 접종하였다. 최종 면역화 1주일 후, MR4(Malaria Research and Reference Reagent Resource Center)로부터 분양받은 아토바퀸(atovaquone) 저항성 플라스모디움 베르헤이(P. berghei) NAT 균주를 생쥐에 감염시켰다. 본 발명에서는 1×10⁴개의 P. berghei-감염된 적혈구/200 ㎕를 복강으로 주입하여 각각의 생쥐를 감염시켰다. P. berghei 감염 후, 매일 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 원충혈증(parasitemia)을 분석하였으며, 생쥐의 체중 및 생존율을 18일 동안 매일 분석하였다.

실시예 1. EF-1α(elongation factor-1 alpha) 재조합 단백질의 발현

대장균 세포에서 발현시킨 재조합 PfEF-1α(rPfEF-1α) 단백질은 IPTG 발현 유도 후 세포 펠릿에서 확인되었으며, 최종 정제한 재조합 PfEF-1α(rPfEF-1α) 단백질은 52kDa의 크기로 확인되었다(도 1).

실시예 2. r Pf EF-1α의 백신 효능 평가

rPfEF-1α의 말라리아 백신의 항원으로서의 효능을 평가하기 위해, 동물 실험을 수행하였으며, 방법은 도 2에 개시된 것과 같다.

면역화 또는 비면역화 후 플라스모디움 베르헤이(P. berghei)를 감염시킨 결과, 비면역화된 플라스모디움 감염 비교군은 12일째까지 약 20~40%의 기생충동력학을 보이다, 13일째에 모두 사망하는 것으로 관찰된 반면, rPfEF-1α로 면역화한 뒤 플라스모디움을 감염시킨 실험군에서는 17일까지 40% 이상의 기생충동력학을 보이고 최종 18일째에 30%의 생존율을 보이는 것으로 확인되었다(도 3a 및 3c). 또한, 비면역화된 플라스모디움 감염 비교군은 12일째에 약 13 g 수준으로 체중이 감소한 반면, rPfEF-1α로 면역화한 뒤 플라스모디움을 감염시킨 실험군은 감염 후 17일까지 14 g 이상의 체중을 보이는 것을 알 수 있었다(도 3b). 상기 결과를 통해, 본 발명의 rPfEF-1α가 말라리아용 백신을 위한 항원으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Vaccine composition for preventing malaria comprising recombinant EF-1a protein derived from Plasmodium falciparum as effective component <130> PN19066 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 443 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 1 Met Gly Lys Glu Lys Thr His Ile Asn Leu Val Val Ile Gly His Val 1 5 10 15 Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Ile Ile Tyr Lys Leu Gly 20 25 30 Gly Ile Asp Arg Arg Thr Ile Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ser Ala Glu 35 40 45 Met Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys 50 55 60 Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ala Leu Trp Lys Phe 65 70 75 80 Glu Thr Pro Arg Tyr Phe Phe Thr Val Ile Asp Ala Pro Gly His Lys 85 90 95 Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gln Ala Asp Val Ala 100 105 110 Leu Leu Val Val Pro Ala Glu Val Gly Gly Phe Glu Gly Ala Phe Ser 115 120 125 Lys Glu Gly Gln Thr Lys Glu His Ala Leu Leu Ala Phe Thr Leu Gly 130 135 140 Val Lys Gln Ile Val Val Gly Val Asn Lys Met Asp Thr Val Lys Tyr 145 150 155 160 Ser Glu Asp Arg Tyr Glu Glu Ile Lys Lys Glu Val Lys Asp Tyr Leu 165 170 175 Lys Lys Val Gly Tyr Gln Ala Asp Lys Val Asp Phe Ile Pro Ile Ser 180 185 190 Gly Phe Glu Gly Asp Asn Leu Ile Glu Lys Ser Asp Lys Thr Pro Trp 195 200 205 Tyr Lys Gly Arg Thr Leu Ile Glu Ala Leu Asp Thr Met Glu Pro Pro 210 215 220 Lys Arg Pro Tyr Asp Lys Pro Leu Arg Ile Pro Leu Gln Gly Val Tyr 225 230 235 240 Lys Ile Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr Gly 245 250 255 Ile Leu Lys Ala Gly Met Val Leu Asn Phe Ala Pro Ser Ala Val Val 260 265 270 Ser Glu Cys Lys Ser Val Glu Met His Lys Glu Val Leu Glu Glu Ala 275 280 285 Arg Pro Gly Asp Asn Ile Gly Phe Asn Val Lys Asn Val Ser Val Lys 290 295 300 Glu Ile Lys Arg Gly Tyr Val Ala Ser Asp Thr Lys Asn Glu Pro Ala 305 310 315 320 Lys Gly Cys Ser Lys Phe Thr Ala Gln Val Ile Ile Leu Asn His Pro 325 330 335 Gly Glu Ile Lys Asn Gly Tyr Thr Pro Val Leu Asp Cys His Thr Ser 340 345 350 His Ile Ser Cys Lys Phe Leu Asn Ile Asp Ser Lys Ile Asp Lys Arg 355 360 365 Ser Gly Lys Val Val Glu Glu Asn Pro Lys Ala Ile Lys Ser Gly Asp 370 375 380 Ser Ala Leu Val Ser Leu Glu Pro Lys Lys Pro Met Val Val Glu Thr 385 390 395 400 Phe Thr Glu Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe Ala Ile Arg Asp Met Arg 405 410 415 Gln Thr Ile Ala Val Gly Ile Ile Lys Ser Val Glu Lys Lys Glu Pro 420 425 430 Gly Ala Val Thr Ala Lys Ala Pro Ala Lys Lys 435 440 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggatccaatg ggtaaggaaa aaacac 26 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcgagtttt ttggctggtg ct 22

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 열대열말라리아원충(Plasmodium falciparum) 유래의 EF-1α(elongation factor-1 alpha) 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 말라리아 예방용 서브유닛 백신(subunit vaccine) 조성물로서,
상기 말라리아는 아토바퀸(atovaquone) 저항성 플라스모디움 베르헤이(Plasmodium berghei)인 것을 특징으로 하는 서브유닛 백신 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 어주번트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 서브유닛 백신 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 및 비강 중에서 선택된 어느 하나의 투여경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 서브유닛 백신 백신 조성물.
제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 서브유닛 백신(subunit vaccine) 조성물을 말라리아 원충(plasmodium) 감염이 예상되는 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 말라리아 감염의 예방 방법으로서,
상기 말라리아는 아토바퀸(atovaquone) 저항성 플라스모디움 베르헤이(Plasmodium berghei)인 것을 특징으로 하는 예방 방법.
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