KR101899790B1

KR101899790B1 - 클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 말라리아의 EF-1α 활성 저해용 조성물

Info

Publication number: KR101899790B1
Application number: KR1020170137107A
Authority: KR
Inventors: 박현; 김학성; 여선주; 유동욱; 도티환킴
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2018-09-20

Abstract

본 발명은 클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 말라리아의 EF-1α(Elongation Factor-1α) 활성 저해용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물이 말라리아 플라즈모디움 팔시파룸의 EF-1α의 발현 및 활성을 억제하여 항말라리아 효과를 보이는 점을 확인하였다. 이러한 사실을 토대로 페닐알라닌-클로로퀸 유도체 화합물의 항말라리아 작용기작에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있어 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 말라리아의 EF-1α 활성 저해용 조성물{Composition for inhibiting malaria EF-1α activity comprising a chloroquine-based α,β-unsaturated amide derivative compound as an active ingredient}

본 발명은 클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 말라리아의 EF-1α(Elongation Factor-1α) 활성 저해용 조성물에 관한 것이다.

말라리아는 실질적으로 공적 보건 및 재정적 부담을 야기한다. 2011년 한해에 약 20억불이 말라리아 방제에 사용되었다. 전세계적인 말라리아 조절 부담에도 불구하고, 수세기간의 연구 후에, 많은 연구자들은 온도 및 말리리아 발병율간의 환경적 변수사이의 기전적인 연계성을 충분히 밝히지 못한 실정이다. 말라리아는 한해에 백만명 이상의 사상자를 발생시키는 전계계적으로 심각한 건강 문제를 야기한다. 말라리아 환자수는 지난 세기에 43개국에서 50% 이상 감소하였다. 약 300-500 백만 환자 발생 및 2-3 백만 환자사망이 해마다 발생되었다. 말라리아 퇴치를 위한 기금이 2003년 약 US$100 백만불에서 2010년 US$1.6 십억불로 15배 정도 증가하였다. 말라리아는 플라즈모디움 속 (genus Plasmodium) 유래 유기체 및 플라즈모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)에 의한 것이고 이는 인체에 말라리아 주요 원인 기생충이며, 해마다 약 200만명을 감염시키고 600,000명의 사상자를 발생케 한다.

말라리아 백신이 유효하지 않아 화학요법제(Chemotherapy)가 주치료법이다. 수세기 동안 말라리아 치료법의 주요 약물로서 클로로퀸(Chloroquine; CQ)을 사용하여 왔다. 그러나, 클로로퀸 약물의 급속한 약물 내성 균주의 발생으로 그 효력을 상실하여 온 바, 아테미시닌(artemisinin) 기반 조합 치료법이 현재 전세계적 표준 치료법으로 제공되고 있다. 최근 들어, 아테미시닌(artemisinins)에 대한 내성 출현으로 새로운 항-말리리아제 개발에 대한 연구가 진행되어 왔다. 아테미시닌(artemisinin) 기반 조합 치료법은 일선의 치료제로서 사용되어 온 클로로퀸 및 설파독신(sulfadoxine)/피리메타민 (pyrimethamine)에 내성을 나타내는 플라즈모디움 속 기생충(genus Plasmodium)이 전세계적으로 급증하고 있다. 그러나, 아르테미신(artemisinins)에 대한 내성 문제가 증가하고 있으며 상이한 작용기전을 갖는 새로운 항-말라이아제 개발이 요구되고 있다.

한편, 한국등록특허 제1653677호에는 '클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 말라리아 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 말라리아의 EF-1α 활성 저해용 조성물'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물(본 발명에서 SKM13로 기재된 (S,E)-4-((7-클로로퀸 유도체놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide))을 말라리아 플라즈모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)에 처리하고, 비처리 대조구 말라리아와 비교하여 분비량이 줄어든 특정 단백질을 분석한 결과, EF-1α(Elongation Factor-1α)임을 확인하였다.

이를 토대로 말라리아 플라즈모디움 팔시파룸으로부터 EF-1α 코딩 유전자를 분리하고, 이를 이용하여 재조합 EF-1α를 제조하여 정제된 EF-1α의 농도에 따른 GTPase 활성 분석 및 GTPase 활성에 대한 SKM13의 유효성을 평가한 결과, GTPase 활성을 가지는 EF-1α는 SKM13에 의해 발현이 억제되어 결국 항말라리아 효과를 가지는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 말라리아에 처리하는 단계를 포함하는 EF-1α(Elongation Factor-1α)의 활성을 저해하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 말라리아의 EF-1α(Elongation Factor-1α) 활성 저해용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 EF-1α(Elongation Factor-1α)의 활성 저해용 물질을 유효성분으로 함유하는 항말라리아용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물이 말라리아 플라즈모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)의 EF-1α(Elongation Factor-1α)의 발현 및 활성을 억제하여 항말라리아 효과를 보이는 점을 확인하였다. 이러한 사실을 토대로 클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물의 항말라리아 작용기작에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있어 관련 산업에 매우 유용하다.

도 1은 클로로퀴논-내성의 말라리아 균주인 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) FCR-3에 SKM13을 IC₅₀ 농도 370nM을 6시간 처리한 뒤 2D를 수행한 후 분석 결과(A), 감소된 단백질 스팟(spot)을 잘라서 in-gel 상태에서 LC-MS를 통해 분석(B)한 후 protein ID 분석 결과 EF-1a(Elongation factor 1-alpha)와 같은 서열로 확인되었다(C).
도 2는 본 발명에서 얻은 FCR-3 EF-1a 염기서열(비공개 서열, (3D7 EF-1a와 두 개의 염기서열 (노란색 highlight) 다름))(A). 클로닝을 위해 사용한 프라이머(B), FCR-3 EF-1a 아미노산 서열(3D7 EF-1a와 아미노산 서열 동일)(C), pET21b에 EF-a를 클로닝한 뒤, 대장균에서 발현하여 52kDa 단백질을 정제한 결과(D)이다.
도 3은 본 발명의 정제된 EF-1α(신장 인자 1-알파)의 상이한 농도에서의 GTP 잔존량을 분석한 결과(A) 및 EF-1α의 GTPase 활성에 대한 SKM13의 유효성(B)을 나타낸다.
도 4a는 SKM13 처리가 Schizont 단계가 아닌 Ring 단계에서 5시간 동안 EF-1a의 발현을 억제하는 것을 나타낸다. (상) 비처리 5시간, FCR-3의 Ring 단계, (하) SKM13 처리 5시간, FCR-3의 Ring 단계.
도 4b는 SKM13 처리가 Schizont 단계가 아닌 Ring 단계에서 5시간 동안 EF-1a의 발현을 억제하는 것을 나타낸다. (상) 비처리 5시간, FCR-3의 Schizont 단계, (하) SKM13 처리 5시간, FCR-3의 Schizont 단계.
도 5는 SKM13 처리가 Schizont 단계가 아닌 Ring 단계에서 5시간 동안 플라스모디움 팔시파룸 EF-1a가 감소하는 것을 나타내며(A), 대조구로 플라스모디움 팔시파룸 GAPDH는 Ring 단계 또는 Schizont 단계에서 감소하지 않았다. *는 A에서 플라스모디움 팔시파룸 EF-1a, B에서 플라스모디움 팔시파룸 GAPDH.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 말라리아에 처리하는 단계를 포함하는 EF-1α(Elongation Factor-1α)의 활성을 저해하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드는 클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물로, 이 외에도 (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N,N-디이소프로필펜트-2-에나미드{(S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N,N-diisopropylpent-2-enamide}, (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-이소프로필펜트-2-에나미드{(S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-isopropylpent-2-enamide}, (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-에틸펜트-2-에나미드{(S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-ethylpent-2-enamide}, (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-1-(피페리딘-1-일)펜트-2-엔-1-온{(S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-1-(piperidin-1-yl)pent-2-en-1-one}, (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-1-모르폴리노펜트-2-엔-1-온 {(S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-1-morpholinopent-2-en-1-one), (S,E)-N-벤질-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)펜트-2-에나미드((S,E)-N-benzyl-4-{(7-chloroquinolin-4-yl)amino)pent-2-enamide}, (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide), (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-페닐펜트-2-에나미드{(S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-phenylpent-2-enamide}, (S,E)-N-(4-부톡시페닐)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)펜트-2-에나미드{(S,E)-N-(4-butoxyphenyl)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)pent-2-enamide}, (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(4-에틸페닐)펜트-2-에나미드 {(S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(4-ethylphenyl)pent-2-enamide}, (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(4-(헥실옥시)페닐)펜트-2-에나미드 {(S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(4-(hexyloxy)phenyl)pent-2-enamide}, (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(4-이소프로필페닐)펜트-2-에나미드 {(S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(4-isopropylphenyl)pent-2-enamide}이 가능할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 EF-1α은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 EF-1α 단백질의 범위는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 GTPase 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 EF-1α 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 상기 EF-1α 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 말라리아는 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum), 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax), 난원형 말라리아(Plasmodium ovale) 또는 사일열 말라리아(Plasmodium malariae)일 수 있고, 바람직하게는 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide)를 유효성분으로 함유하는 말라리아의 EF-1α(Elongation Factor-1α) 활성 저해용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 EF-1α은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 말라리아는 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum), 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax), 난원형 말라리아(Plasmodium ovale) 또는 사일열 말라리아(Plasmodium malariae)일 수 있고, 바람직하게는 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 EF-1α(Elongation Factor-1α)의 활성 저해용 물질을 유효성분으로 함유하는 항말라리아용 조성물을 제공한다. 클로로퀸 기반 α,β-불포화아미드 유도체 화합물이 EF-1α의 발현 또는 활성을 저해함으로써 항말라리아 효과를 가지므로, EF-1α의 발현 또는 활성 저해용 물질은 항말라리아 효과를 가질 수 있는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 물질은 (S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. SKM13 ( IC ₅₀ ) 처리 후 2D 전기영동

말라리아의 배양

혈액 단계의 실험실 클론 클로로퀴논-내성의 말라리아 균주인 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) FCR-3를 24mM 중탄산나트륨, 25mM HEPES, 0.8% 하이포크산틴, 0.9% Albumax, 25㎍/mL 젠타마이신을 보충한 RPMI 1640 배지에 현탁시킨 O형 인간 적혈구 세포의 5% 헤마토크릿을 이용한 연속 배양에서 유지하며 시험관내 배양했다. 배양물을 37℃ CO₂-O₂-N₂ 인큐베이터(5% CO₂, 5% O₂ 및 90% N₂로 이루어진 대기)에서 배양하고, 배지는 매일 교환했다. 배양을 상기 얇은 얼룩의 Giemsa 염색을 통해 일과로 모니터링했다. 기생체 배양은 5%(w/v) D-소르비톨을 이용한 처리에 의해 링 스테이지(ring stage)와 동시에 발생하도록 했다.

약물의 처리

SKM13((S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide))를 디메틸술폭시드(DMSO)에 용해시키고, 추가로 배양 배지를 이용해 희석해 원하는 농도를 수득했다. FCR-3을 수집하고, RPM 1500/5분으로 원심분리해 가라앉혔으며, 상층 신규 배지를 따라 내어 제거하고, SKM13를 플레이트에 첨가하고, CO₂-O₂-N₂ 다중-기체 인큐베이터에서 6h 동안 37℃에서 배양했다.

단백질 추출

6시간 후, 기생체를 수집하고, 800g/5분으로 원심분리해 가라앉혔으며, 상층액을 따라 내어 제거했다. 냉온 PBS 800g/5분 4℃로 3회 세척했다. 0.05% 사포닌 용액(펠렛:사포닌=1:4)을 첨가하고, 10분 동안 얼음 위에서 배양했다. 용액을 17000rpm/10분으로 원심분리해 가라앉히고, 무색이 될 때까지 10mM Tris-완충액(pH7.4)으로 여러번 세척했다(-80℃에서 원액저장). 펠렛을 가용화 완충액[9.8M 우레아, 2M 티오우레아, 4% CHAPS, 100mM DTT, 2% IPG 완충액(pH3-10)] 및 프로테아제 저해제로 현탁시켰다. 가용화 용액을 40% Amp, 8s/20s, 20회 초음파처리하고, 17000rpm/1h로 20℃에서 원심분리해 가라앉혔다. 2D quant Kit로 단백질의 농도를 측정하고, 단백질을 -20℃에서 저장했다. 시험관마다 500㎍를 2D clear up Kit로 정제하고, 단백질의 펠렛은 가용화 완충액으로 현탁시키고, 17000rpm/20분 및 20℃로 원심분리해 가라앉혔다. 농도를 다시 측정하고, 2D에 이용했다.

단백질의 2D 겔 분리

IPG 스트립(PH3-10, 17cm)을 총 단백질을 1000㎍로 포함하는 재수화 완충액[9M 우레아, 0.5% CHAPS, 2% IPG 완충액(PH3-10), 60mM DTT, 및 0.003% 브로모페놀 블루]에 재수화시켰다. IPG 스트립을 50V, 9h, 20C에서 재수화시켰다. 제1차원 분리를 위해서는, IEF에 대한 전압 설정이 30분 동안 200V, 1분 동안 500V, 및 45분 동안 8,000V, 이어서 최종 9시간 동안 8,000V였다. 이어서, 스트립을 평형화 용액[6M 우레아, 50mM Tris-HCl, pH 6.8, 30% 글리세롤, 2% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 및 0.001% 브로모페놀 블루]에서 2회 연속하여 평형화시켰는데, 여기서 최초 평형화는 1% DTT를 포함했고, 두번째는 2.5% 요오도아세트아미드를 포함했다. 제2차원 전개를 위해, 2-DE를 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전개시켰다. 전개 조건은 15W/겔로 30분 수행하였으며, 35W/겔로 6시간 수행하였다. 젤은 CBB(Coomassie brilliant blue) 방법으로 염색하였다. 이후 eMass 센터에 분석을 의뢰하여 단백질을 동정하였다.

2. rEF - 1α : 재조합 항원 발현

클로로퀸-내성 균주 P.f FCR - 3를 Mini Kit를 mRNA 추출에 이용했다. PCR은 프라이머 5'-GGA TCC AAT GGG TAA GGA AAA AAC AC-3'(정방향, 서열번호 3) 및 5'-CTC GAG TTT TTT GGC TGG TGC T-3'(역방향, 서열번호 4)를 이용해 실행했다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95℃에서 5분; 이어서, 95℃에서 30초, 56℃에서 45초 및 72℃에서 1분을 30회 순환; 최종 단계로는 72℃에서 5분. PCR은 CFX96 Touch™Real-Time PCR Detection System(Bio-RAD #1845096)을 이용해 실시했다. PCR 산물을 pGEM-T 벡터에 라이게이션하고, DH5a 컴피턴트 세포에 형질전환했으며, EF1a의 클로닝 플라스미드는 DH5a로부터 추출했고, pET21b 벡터와의 라이게이션을 위해 효소 BamHI/XhoI로 절단한 후, PET21b-EF1a 전장 플라스미드를 BL21DE3 컴피턴트 세포에 추가로 형질전환했다.

재조합체 BL21-pET21b-EF1a를 앰피실린(100㎍/ml)을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 37℃에서 밤새 배양했다. 선별 콜로니를 접종하고, 앰피실린(100㎍/ml) 및 3% 에탄올을 함유하는 250ml LB 배지 중에 37℃에서 OD 값이 0.5 내지 0.6에 도달할 때까지 진탕하며 희석(1:100)했고, 이어서 0.5mM 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 함께 22℃에서 18시간 동안 진탕하면서 유도했다. 세포를 8000rpm로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 결합 완충액(20mM Tris PH7.5, 300mM NaCl 25mM 이미다졸)으로 세척하고, 프로테아제 저해제 칵테일(complete™ULTRA Tablets, Roche사, 독일)을 함유하는 결합 완충액에 재현탁시켜 40% AMP(15초 펄스, 15초 휴지)로 15분 동안 얼음 위에서 초음파처리했다. 원심분리는 17000rpm로 4℃에서 15분 동안 실시하고, 상층액을 NI-NTA 친화성 컬럼에 이용하고, 세척용 완충액(20mM 이미다졸, 300mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH7.5)으로 세척했다. 재조합체 EF1a 단백질을 용리 완충액(250mM의 이미다졸, 300mM NaCl, 20mM Tris-Cl pH 7.5)으로 용리하고, 단백질 순도를 SDS-PAGE로 체크했다.

3. rEF - 1α의 GTPase 효소 검정

재조합체 EF1a 단백질을 GTPase-Glo™Assay Kit을 이용한 GTPase 효소 검정에 이용했다. EF1a 단백질을 각 웰에 GTPase 완충액을 이용해 1, 4, 7, 10, 24㎍로 희석하고, 30분 동안 37℃에서 배양했다. GTPase 완충액 및 GAPDH은 양성 대조군이었다. 2X GTP 용액을 각 웰에 첨가함으로써 60분 동안의 실온에서의 GTPase 반응을 개시했다. 재건된 GTPase-Glo™ Reagent(ADP 10mM, GTPase-Glo™ 완충액 및 GTPase-Glo™ Reagent, 500X)를 완료된 GTPase 반응에 첨가하고, 간단히 혼합하고 30분 동안 실온에서 진탕하면서 배양했다. 검출 시약을 첨가하고, 플레이트를 5 내지 10분 동안 실온에 배양한 후, 발광을 측정했다. GraphPad Prism 소프트웨어로 결과를 산출했으며, 6㎍이 재조합체 EF1a 단백질의 50% 효소 활성 값이라는 점을 알았다. 후속 단계로, 항-말라리아 약물 SKM13를 최적 농도로 희석하여, EF1a 단백질을 30분 동안 37℃에서 처리했다. 상기 방법에 따라 GTPase reaction:GTPase-Glo™ Reagent:Detection Reagent에 대해 1:1:2 부피 비율을 유지했으며, 발광을 측정했다.

4. SKM13 존재 하의 말라리아 균주인 플라스모디움 팔시파룸 ( Plasmodium falciparum ) EF-1α의 IFA 검정

클로로퀴논-내성 균주 P.f FCR-3을 항-말라리아 약물 SKM13로 5시간 동안 처리했다. 감염된 RBC를 커버슬립에 스미도록 하고, 밤새 건조시켰다. 감염된 RBC를 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 고정시킨 후, 0.1% Triton 완충액에서 40분 동안 배양하고, 2% BSA로 2시간 동안 블로킹했다. 플라스모디움 EF1a 폴리클로날 항체(1:1000 희석)를 사용해 EF1a 단백질을 4℃에서 밤새 시험했다. 이어서, 혈구들을 AF488 컨쥬게이션된 항 마우스 HRP 2차 항체(1:10000 희석)와 함께 1시간 동안 배양했다. 단계 사이사이에서 PBS로 3회 세척했다. 커버슬립을 DAPI을 포함하는 마운팅 매질로 마운팅했다. 형광 영상은 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSCM) USING A 1000X 유침 대물렌즈로 가시화했다.

5. SKM13 존재 하의 말라리아 균주인 플라스모디움 팔시파룸 ( Plasmodium falciparum ) EF-1α의 웨스턴 블랏 검정

EF1a 단백질을 웨스턴 블랏 분석으로 확인했다. 클로로퀴논-내성 균주 P.fFCR-3를 항-말라리아 약물 SKM13로 3 및 5시간 동안 처리했다. 전체 단백질을 RIPA 용해 완충액(50mM Tris PH7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% 소듐 데옥시콜레이트) 및 프로테아제 저해제 칵테일을 이용해 1시간 동안 얼음 위에서 수집한 후, 17000rpm로 30분 동안 4℃에서 원심분리했다. 전체 단백질의 농도를 측정하고, 각 레인에서 SDS-PAGE 겔 상에 10㎍로 로딩해 60V로 전개시켰다. 이어서, 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 5% 탈지유로 2시간 동안 블로킹하고, 플라스모디움 EF1a 폴리클로날 항체(1:5000 희석) 또는 플라스모디움 GAPDH와 함께 밤새 4℃에서 배양했다. 이후, 토끼 항-마우스 IgG H&L(HRP) 2차 항체(1:200000)를 이용해, 1시간 동안 실온에서 검사했다. 멤브레인을 PBS로 세척한 후, 기판에서 배양하고, Bio-Rad ChemiDoc XRS+를 이용해 결과를 체크했다.

실시예 1. SKM13 처리에 따른 말라리아 균주인 플라스모디움 팔시파 룸( Plasmodium falciparum ) FCR -3에서의 특이적으로 발현이 변화된 단백질의 분리 동정

클로로퀴논-내성의 말라리아 균주인 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) FCR-3에 SKM13((S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide))을 IC₅₀ 농도 370nM을 6시간 처리한 뒤 2D를 수행한 결과(도 1A), 50kDa 크기의 감소된 spot이 발견되었고, 감소된 단백질 스팟(spot)을 잘라서 in-gel 상태에서 LC-MS를 통해 분석한 후(도 1B) protein ID 분석 결과 EF-1a(Elongation factor 1-alpha)와 같은 서열로 확인되었다(도 1C). 도 2에 기재한 바와 같이, FCR-3 EF-1a 염기서열(비공개 서열, (3D7 EF-1a와 두 개의 염기서열 (노란색 highlight) 다름))(도 2A)은 서열번호 1로 기재하였으며, FCR-3 EF-1a 아미노산 서열(3D7 EF-1a와 아미노산 서열 동일)(도 2C)은 서열번호 2로 기재하였다. 또한 pET21b에 FCR-3 EF-1a를 클로닝한 뒤, 대장균에서 발현하여 52kDa 단백질을 정제하였다(도 2D).

실시예 2. 본 발명의 정제된 EF-1α 의 농도에 따른 GTPase 활성 분석 및 GTPase 활성에 대한 SKM13의 유효성 평가

본 발명에서 정제된 EF-1α는 내생 GTPase 활성을 보유하는지 조사하였다. EF-1α의 상이한 농도에서의 GTPase 활성을 분석한 결과, 증가된 농도의 EF-1α는 농도 의존적으로 감소된 GTP 잔존량을 나타냈다(도 3A). 왜냐하면, EF-1α는 GTP 기질을 촉매하기 때문에, 잔존하는 GTP의 양은 감소했다. 따라서, 발광은 EF-1α 존재하에서 낮았다. EF-1α에 대한 활성의 EC₅₀은 6㎍으로 측정되었다.

GTPase 활성에 대한 SKM13의 유효성을 분석하고자, 총 6㎍의 EF-1α에 상이한 농도의 SKM13로 처리했고, 그 결과로부터 SKM13가 EF-1α의 활성을 억제하며, 따라서 GTPase 활성을 감소시킨다는 점을 확인하였다(도 3B). 또한, SKM13는 EF-1α의 효소 활성을 투여량에 좌우해 억제했다. 효소 활성의 EC₅₀은 SKM13은 5.47nM, CQ는 66.32nM로 측정되었다. 따라서, SKM13는 EF-1α의 효소 활성을 억제함에 있어서 클로로퀸보다 더욱 효율적이었다.

실시예 3. SKM13 처리에 따른 말라리아 균주인 플라스모디움 팔시파 룸( Plasmodium falciparum ) FCR-3의 분열 단계별 영향 평가

본 발명에서 SKM13 처리가 말라리아 균주인 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)의 Schizont 단계가 아닌 Ring 단계에서 5시간 동안 EF-1a의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(도 4). 또한, SKM13 처리는 Schizont 단계가 아닌 Ring 단계에서 5시간 동안 플라스모디움 팔시파룸 EF-1a을 감소시키는 것을 확인하였으며, 대조구로 플라스모디움 팔시파룸 GAPDH는 SKM13 처리구에서 Ring 단계 또는 Schizont 단계에서 감소하지 않았다(도 5).

<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Composition for inhibiting malaria EF-1alpha activity comprising a chloroquine-based alpha, beta-unsaturated amide derivative compound as an active ingredient <130> PN17394 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1332 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 1 atgggtaagg aaaaaacaca tattaactta gttgttattg gtcacgtcga tagtggaaaa 60 tcaaccacta caggtcacat tatttacaaa ttaggaggta tagatagaag aactattgaa 120 aaatttgaga aagaatctgc tgaaatgggt aagggtagtt ttaaatatgc atgggtttta 180 gataaactta aggcagaaag agaaagaggt attaccattg atattgcctt atggaaattt 240 gaaaccccaa ggtatttctt tactgtcatt gatgcaccag gtcacaagga ttttattaaa 300 aatatgatta caggtacatc acaagcagat gttgctttat tagttgtccc agctgaagta 360 ggtggtttcg aaggtgcctt ttcaaaggaa ggtcaaacaa aggaacacgc tttattagca 420 tttaccttag gtgtaaaaca aattgttgtc ggtgttaaca agatggatac tgtcaaatat 480 tctgaagaca gatatgaaga aattaaaaaa gaagttaagg attacttgaa gaaagtagga 540 taccaagctg ataaagttga ttttattcca atttctggtt ttgaaggtga taatttaatc 600 gaaaaatcag ataaaacacc atggtataaa ggaagaacct taatagaagc ccttgatact 660 atggaaccac caaagagacc ttacgacaag ccattaagaa ttccacttca aggtgtttac 720 aaaatcggtg gtattggtac cgtccctgtt ggtcgtgttg aaacaggtat cttaaaagcc 780 ggtatggttt taaacttcgc tccatcagct gttgtgtctg aatgtaaatc agttgaaatg 840 cacaaggaag ttttggaaga agctagacca ggagacaaca ttggttttaa cgtaaagaat 900 gtttctgtta aagaaatcaa gagaggttac gttgcttcag atactaaaaa tgaaccagca 960 aaaggatgct ccaaatttac tgctcaagtt attatattga accaccctgg tgaaatcaaa 1020 aatggttata ccccagtttt ggattgtcac acatctcaca tttcatgtaa atttttaaac 1080 attgattcca agatcgacaa acgttcaggt aaagttgttg aagaaaatcc aaaagctatc 1140 aaatcaggag attcagcttt agttagtttg gaacctaaga aacctatggt tgttgaaacc 1200 tttactgaat atccaccatt aggaagattc gctattcgtg atatgagaca aaccattgct 1260 gtcggtatca ttaaatcagt tgaaaagaaa gaacctggag ctgttacagc taaagcacca 1320 gccaaaaaat aa 1332 <210> 2 <211> 443 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 2 Met Gly Lys Glu Lys Thr His Ile Asn Leu Val Val Ile Gly His Val 1 5 10 15 Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Ile Ile Tyr Lys Leu Gly 20 25 30 Gly Ile Asp Arg Arg Thr Ile Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ser Ala Glu 35 40 45 Met Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys 50 55 60 Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ala Leu Trp Lys Phe 65 70 75 80 Glu Thr Pro Arg Tyr Phe Phe Thr Val Ile Asp Ala Pro Gly His Lys 85 90 95 Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gln Ala Asp Val Ala 100 105 110 Leu Leu Val Val Pro Ala Glu Val Gly Gly Phe Glu Gly Ala Phe Ser 115 120 125 Lys Glu Gly Gln Thr Lys Glu His Ala Leu Leu Ala Phe Thr Leu Gly 130 135 140 Val Lys Gln Ile Val Val Gly Val Asn Lys Met Asp Thr Val Lys Tyr 145 150 155 160 Ser Glu Asp Arg Tyr Glu Glu Ile Lys Lys Glu Val Lys Asp Tyr Leu 165 170 175 Lys Lys Val Gly Tyr Gln Ala Asp Lys Val Asp Phe Ile Pro Ile Ser 180 185 190 Gly Phe Glu Gly Asp Asn Leu Ile Glu Lys Ser Asp Lys Thr Pro Trp 195 200 205 Tyr Lys Gly Arg Thr Leu Ile Glu Ala Leu Asp Thr Met Glu Pro Pro 210 215 220 Lys Arg Pro Tyr Asp Lys Pro Leu Arg Ile Pro Leu Gln Gly Val Tyr 225 230 235 240 Lys Ile Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr Gly 245 250 255 Ile Leu Lys Ala Gly Met Val Leu Asn Phe Ala Pro Ser Ala Val Val 260 265 270 Ser Glu Cys Lys Ser Val Glu Met His Lys Glu Val Leu Glu Glu Ala 275 280 285 Arg Pro Gly Asp Asn Ile Gly Phe Asn Val Lys Asn Val Ser Val Lys 290 295 300 Glu Ile Lys Arg Gly Tyr Val Ala Ser Asp Thr Lys Asn Glu Pro Ala 305 310 315 320 Lys Gly Cys Ser Lys Phe Thr Ala Gln Val Ile Ile Leu Asn His Pro 325 330 335 Gly Glu Ile Lys Asn Gly Tyr Thr Pro Val Leu Asp Cys His Thr Ser 340 345 350 His Ile Ser Cys Lys Phe Leu Asn Ile Asp Ser Lys Ile Asp Lys Arg 355 360 365 Ser Gly Lys Val Val Glu Glu Asn Pro Lys Ala Ile Lys Ser Gly Asp 370 375 380 Ser Ala Leu Val Ser Leu Glu Pro Lys Lys Pro Met Val Val Glu Thr 385 390 395 400 Phe Thr Glu Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe Ala Ile Arg Asp Met Arg 405 410 415 Gln Thr Ile Ala Val Gly Ile Ile Lys Ser Val Glu Lys Lys Glu Pro 420 425 430 Gly Ala Val Thr Ala Lys Ala Pro Ala Lys Lys 435 440 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggatccaatg ggtaaggaaa aaacac 26 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgagtttt ttggctggtg ct 22

Claims

(S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 인체 외의 말라리아에 처리하는 단계를 포함하는 EF-1α(Elongation Factor-1α)의 활성을 저해하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 EF-1α은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 말라리아는 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum), 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax), 난원형 말라리아(Plasmodium ovale) 또는 사일열 말라리아(Plasmodium malariae)인 것을 특징으로 하는 방법.
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(S,E)-4-((7-클로로퀴놀린-4-일)아미노)-N-(2-디메틸아미노)에틸)-5-페닐펜트-2-에나미드((S,E)-4-((7-chloroquinolin-4-yl)amino)-N-(2-dimethylamino)ethyl)-5-phenylpent-2-enamide) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항말라리아용 조성물.
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