MX2014000727A - Plasmodium atenuado con el gen hmgb2 desactivado como vacuna. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas composiciones y procedimientos para inmunizar un hospedador contra el paludismo utilizando un parásito Plasmodium atenuado genéticamente mediante la inactivación de la función del gen hmgb2.

Description

PLASMODIUM ATENUADO CON EL GEN HMGB2 DESACTIVADO COMO VACUNA Campo de la Invención La presente invención se refiere al ámbito de la medicina, y más particularmente al de la lucha contra el paludismo.

Antecedentes de la Invención El paludismo es una enfermedad infecciosa provocada por un parásito unicelular eucariota del género Plasmodium. Esta enfermedad parasitaria está presente en todo el mundo y produce graves problemas económicos y sanitarios en los países en desarrollo. P. falciparum es la especie más perjudicial de los cinco tipos de Plasmodium que infectan al hombre. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), P. falciparum es responsable de entre 250 y 500 millones de casos de enfermedad aguda y de aproximadamente 1 millón de muertes cada año (sobre todo en los niños menores de 5 años y en las mujeres embarazadas). El neuropaludismo es una complicación neurológica grave del paludismo responsable de la gran mayoría de los casos mortales de la enfermedad. Incluso si el individuo sobrevive, el neuropaludismo puede acarrear unas secuelas neurológicas graves, particularmente en los niños, cuyo sistema inmunitario esta en formación. La patogenia del neuropaludismo es compleja y todavía está lejos de ser completamente elucidada. En el momento actual, se admite gue la patología cerebral es realmente resultante del secuestro de los glóbulos rojos parasitados en los microvasos de los principales órganos (bazo, pulmones, corazón, intestinos, ríñones, hígado y cerebro) y de la producción de citocinas pro-inflamatorias en estos mismos órganos, que conducen a un síndrome y a un estado sistémico que puede implicar la muerte del individuo.

La lucha contra el paludismo es una de las grandes apuestas de la OMS, pero a día de hoy, todos los esfuerzos dirigidos a controlar esta enfermedad han fracasado. Durante los 30 últimos años, aunque las cifras de la OMS parecen alentadoras, la situación se ha deteriorado debido a la aparición de resistencias en los anofeles a los insecticidas .y a la creciente quimiorresistencia de P. falciparum a los medicamentos antipalúdicos (incluso utilizados en combinación) .

La lucha contra el paludismo se hace difícil por la ausencia de una vacuna realmente eficaz contra la enfermedad. Las primeras tentativas de desarrollar una vacuna datan de los años 70. Desde entonces se han multiplicado los ensayos de vacunas, pero se enfrentan a la complejidad del desarrollo del parásito en sus hospedadores sucesivos, el hombre y el mosquito, así como a un mecanismo de escape del sistema inmunitario extremadamente complicado que implica una importante variación antigénica del parásito.

Esta variación durante la fase eritrocitaria del parásito hace que la vacunación preventiva clásica con la ayuda de complejos de proteínas-péptidos de Plasmodium sea extremadamente difícil. Actualmente hay una vacuna contra el paludismo realizada a partir de proteínas del parásito en ensayos clínicos en fase III (RTS,S de GlaxoSmithKline Biologicals) . No obstante, los resultados obtenidos durante la fase II muestran que esta vacuna no reduce la aparición del paludismo clínico más que entre el 35% y el 49% del paludismo grave.

La obtención de una vacuna eficaz contra las formas - - eritrocítarias del parásito es por lo tanto una apuesta importante en el marco de la erradicación de la enfermedad, dado que dicha vacuna permitirla a la vez reducir los síntomas e igualmente la carga parasitaria y la cantidad de gametocitos en la sangre, y por lo tanto disminuir la transmisión del parásito.

Un estudio reciente ha demostrado que la administración repetida de dosis muy bajas de glóbulos rojos parasitados por P. falciparum 3D7 asociada a la toma simultánea de medicamentos antipalúdicos induce una inmunidad susceptible de proteger a los pacientes contra la fase eritrocitaria de una cepa homologa (Pombo y col. 2002) .

Se ha contemplado por tanto la utilización de parásitos vivos atenuados genéticamente (o GAP « Genetically Attenuated Parasites ») para inducir una protección estéril de larga duración. Así, se han descrito numerosos GAP. No obstante, la mayoría de los GAP se dirigen al estado hepatocitario a través de esporozoitos de los parásitos atenuados. Igualmente se han descrito dos GAP que se dirigen al estado eritrocitario : los parásitos de roedores P. yoelii en los que se ha inactivado la fosforilación de nucleósidos de purina (PNP) (Ting y col, 2008) o el transportador de nucleósidos 1 (NT1) (Aly y col, 2010) . Se ha demostrado que estos GAP confieren una inmunidad frente a una cepa homologa, pero igualmente y en menor medida, frente a cepas heterólogas. La eficacia y la inocuidad de las vacunas que utilizan estos parásitos vivos atenuados genéticamente permanece, no obstante, por determinar.

A día de hoy, sigue siendo crucial por tanto el desarrollo de nuevas estrategias que permitan particularmente atajar la aparición de brotes graves tales como el neuropaludismo, pero igualmente disminuir la carga parasitaria y la cantidad de gametocitos en la sangre periférica, y reducir asi el riesgo de la enfermedad.

Sumario de la Invención El objetivo de la presente invención es proporcionar nuevas composiciones de vacuna para prevenir el paludismo, y más particularmente la aparición de brotes graves de paludismo tales como el neuropaludismo.

Los inventores han demostrado que un parásito vivo perteneciente al género Plasmodium y en el que se ha inactivado la función del gen hmgb2 podría ser utilizado como inmunógeno en una vacuna contra el paludismo. En efecto, han observado que la administración de dicho parásito, que induce una reacción inmunitaria en el hospedador, permitiría obtener a la vez la eliminación del parásito (carga parasitaria por debajo del umbral de detección al microscopio en sangre periférica) , pero igualmente una protección eficaz y de larga duración contra una infección por un Plasmodium, particularmente por una cepa muy patógena, y más particularmente contra la fase eritrocitaria del parásito, que es responsable de la sintomatología de la enfermedad y de su transmisión.

Así, la presente invención concierne en primer lugar a un parásito vivo perteneciente al género Plasmodium en el que se ha inactivado la función del gen hmgb2 para su utilización en la prevención del paludismo, y más particularmente en la prevención del neuropaludismo, que es una complicación neurológica grave de la enfermedad.

Preferiblemente, el parásito según la invención se utiliza en la prevención del paludismo o del neuropaludismo en un mamífero, en particular en un ser humano.

La cepa del parásito puede seleccionarse de entre el grupo constituido por Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae y Plasmodium knowlesi. Preferiblemente, la cepa del parásito se selecciona de entre el grupo constituido por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae y Plasmodium knowlesi , de forma más particularmente preferida, de entre el grupo constituido por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae .

Según un modo particular de realización, la cepa del parásito es Plasmodium falciparum.

Según otro modo particular de realización, la cepa del parásito es Plasmodium berghei, en particular Plasmodium berghei NK65.

Preferiblemente, el parásito en su forma natural no provoca neuropaludismo .

Según un modo particular de realización, la cepa del parásito es una cepa de Plasmodium falciparum no citoadherente o con una capacidad de citoadherencia reducida, preferiblemente con una capacidad de citoadherencia reducida.

El parásito según la invención puede estar en una forma intraeritrocitaria, en particular en forma de trofozoítos, de merozoítos o de esquizontes intraeritrocitarios, preferiblemente en forma de merozoítos o de esquizontes intraeritrocitarios .

El parásito según la invención puede estar en forma de merozoítos no intraeritrocitarios, es decir, de merozoítos obtenidos a partir de glóbulos rojos parasitados mediante una purificación total o parcial.

El parásito según la invención puede igualmente estar en forma de esporozoitos .

La función del gen hmgb2 puede ser inactivada mediante la deleción total o parcial de dicho gen, preferiblemente mediante la deleción total de dicho gen. En particular, la región codificante del gen hmgb2 puede ser sustituida por un marcador de selección, tal como el gen humano que codifica para la reductasa de dihidrofolato .

La función del gen hmgb2 puede ser igualmente inactivada mediante un ARN interferente que bloquee o disminuya la traducción de la proteina HMGB2.

En el parásito según la invención puede inactivarse la función de uno o varios de otros genes. En particular, el o los otros genes cuya función es inactivada pueden elegirse de entre el grupo constituido por los genes que codifican para la fosforilasa de nucleósidos de purina, para el transportador de nucleósidos 1, UIS3, UIS4, p52 y p36, y una combinación de los mismos.

En un segundo aspecto, la presente invención concierne a una composición inmunógena que comprende, como inmunógeno, una cantidad inmunológicamente eficaz de un parásito según la invención, y uno o varios excipientes o soportes farmacéuticamente aceptables. La presente invención concierne igualmente a una vacuna contra el paludismo que comprende, como inmunógeno, un parásito según la invención, y uno o varios excipientes o soportes farmacéuticamente aceptables. La composición inmunógena o la vacuna pueden comprender igualmente uno o varios coadyuvantes inmunológicos . En particular, el o los coadyuvantes inmunológicos pueden seleccionarse de entre el grupo constituido por los coadyuvantes de tipo muramilpéptido; dimicolato de trehalosa (TDM) ; lipopolisacáridos (LPS); monofosforil lipido A (MPL) ; carboximetil celulosa; el coadyuvante completo de Freund; el coadyuvante incompleto de Freund; coadyuvantes de tipo emulsiones de « aceite en agua » a las que eventualmente se les ha añadido escualeno o escualano; coadyuvantes minerales; toxinas bacterianas; oligodesoxinucleótidos CpG; saponinas; copolimeros sintéticos; citocinas e imidazoquinolonas .

La composición inmunógena o la vacuna puede formularse para ser administrada por via parenteral.

La composición inmunógena o la vacuna puede comprender varios parásitos según la invención.

De forma preferida, la composición o la vacuna comprende entre 10 y 107, preferiblemente entre 10 y 105, y de la forma más particularmente preferida entre 102 y 105 parásitos por dosis de inyección.

Según un modo de realización particular, la composición inmunógena o la vacuna comprende entre 10 y 106, preferiblemente entre 102 y 106, parásitos según la invención en una forma intraeritrocitaria por unidad de dosificación. Según otro modo de realización particular, la composición inmunógena o la vacuna comprende entre 102 y 107 parásitos según la invención en forma de merozoitos no intraeritrocitarios por unidad de dosificación.

Según otro modo más de realización particular, la composición inmunógena o la vacuna comprende entre 103 y 107 parásitos según la invención en forma de esporozoitos por unidad de dosificación.

En otro aspecto, la presente invención concierne a la utilización de un parásito según la invención para la preparación de una composición de vacuna contra el paludismo o el neuropaludismo .

En otro aspecto, la presente invención concierne igualmente a un procedimiento para inmunizar un sujeto contra el paludismo, que comprende la administración de una composición inmunógena o de una vacuna según la invención a dicho sujeto, preferiblemente por via parenteral, en particular por vía subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa.

Breve Descripción de las Figuras de la Invención Figura 1: parasitemia de ratones C57BL/6 infectados por glóbulos rojos parasitados (GRP) con el parásito natural PÓNK65 o con el parásito mutado PÓNK65 Ahmgb2 (105 y 106 GRP por inyección intravenosa, respectivamente) . La parasitemia se analiza mediante el recuento al microscopio de los GRP en frotis coloreados y se presenta como el porcentaje de GRP (media ± desviación típica) . El experimento se ha realizado con 5 ratones y se ha repetido varias veces. El valor de p es de 0,008.

Figura 2: estudio de la supervivencia de ratones infectados por primera vez con el parásito mutado PÓNK65 Ahmgb2 e infectados a continuación tres veces con los dos parásitos naturales PÓNK65 y PóANKA. La primera prueba se ha realizado el día J19 (19 días después de la primera infección), la segunda el día J71 y finalmente la tercera el día J162. En cada prueba se ha verificado la patogenicidad de las dos preparaciones de GRP infectados con PÓNK65 y con PóANKA infectando ratones de la misma edad no infectados previamente y siguiendo su progresión y muerte por hiperparasitemia o - - neuropaludismo . Se han analizado cinco ratones para cada uno de los experimentos .

Figura 3: inmunización de ratones C57BL/6 con diferentes cantidades de GRP infectados por el parásito mutado PÓNK65 Ahmgb2. Se han infectado diez ratones en el tiempo 0 con 103 (?), 104 (O) ó 10ü (?) GRP infectados por P6NK65 Ahmgb2. A continuación estos ratones han experimentado una prueba de infección en el día J24 con 105 GRP infectados con el parásito patógeno natural PÓNK65 (n = 5) o con PóANKA (n = 5) . Igualmente, ratones no sometidos previamente a experimentación han sufrido una prueba de infección en el día J24 con 10b GRP infectados con el parásito patógeno natural PÓNK65 (A) o con PóANKA (·) .

Descripción Detallada de la Invención La secuenciación del genoma de P. falciparum se consiguió en 2002. Este genoma comprende aproximadamente 5.500 genes, de los que aproximadamente el 50% tienen una función totalmente desconocida. Al estudiar los factores implicados en la regulación de la transcripción en P. falciparum, los inventores han apreciado cuatro HMGB (PfHMGBl de m4; High Mobility Group Box proteins) . Estas son proteínas nucleares no histona muy abundantes que tienen la particularidad de ser a la vez factores nucleares y mediadores extracelulares.

En el ser humano, donde han sido particularmente estudiadas, están presentes en el núcleo de las células y juegan el papel de factores arquitectónicos, participando en la regulación de la transcripción a través de la remodelación de la cromatina. En situaciones de peligro para la célula (cuerpo extraño, inflamación) , estas proteínas son secretas activamente en el medio celular y/o pasivamente en caso de necrosis celular, y - - actúan como verdaderas señales de peligro (alarminas) activando los macrófagos y otras células competentes del sistema inmunitario (Lotze and Tracey, 2005) . La implicación de la proteína HMGB1 humana ha sido demostrada en enfermedades que provocan una inflamación sistémica, tales como lupus eritematoso, choque séptico y poliartritis reumatoide, y en algunos cánceres. Finalmente, el aumento de la proteína HMGB1 humana en el suero de los pacientes se ha correlacionado con la gravedad de estas enfermedades.

En P. falciparum,. los inventores han estudiado particularmente la PfHMGBl y la PfHMGB2 , pequeñas proteínas de menos de 100 aminoácidos. Estas dos proteínas, al igual que sus homólogos humanos, son capaces de curvar el ADN y de interaccionar con estructuras particulares del ADN (Briquet y col. 2006). Igualmente son secretadas y encontradas en los sobrenadantes de cultivos de P. falciparum. Las proteínas HMGB1 y 2 de P. falciparum son capaces de activar y de inducir la expresión del TNFa en líneas de monocitos de ratón (Kumar y col. 2008) .

En la presente solicitud, los inventores han utilizado como modelo animal de neuropaludismo ratones C57BL/ 6 infectados por el parásito de P. berghei ANKA (PóANKA) . Este modelo animal reproduce las principales características de la patología humana, tales como ataxia, desorientación espacial, convulsiones y coma. Estos síntomas clínicos pueden conducir a la muerte del animal. Al igual que en el hombre, en este modelo se observa el secuestro de los glóbulos rojos parasitados, hemorragias y lesiones cerebrales, la producción de citocinas proinflamatorias y la destrucción de la barrera hematoencefálica . En este modelo, la totalidad de los ratones C57BL/ 6 infectados por la cepa clínica PóANKA morían a los 7 días aproximadamente de neuropaludismo . Por el contrario, los inventores han observado que el 60% de los ratones infectados por el parásito Pó ANKA Ahmgb2 no desarrollaban neuropaludismo .

Los inventores han inactivado el gen hmgb2 de otra cepa clínica de P. berghei , la cepa clínica NK65, que induce la muerte de los ratones C57BL/ 6 por hiperparasitemia en entre 20 y 25 días después de la infección, pero no provoca neuropaludismo. En primer lugar, han observado que la inactivación de este gen entorpece el desarrollo de PÓNK65 ñhmgb2 en el ratón, con una eliminación del parásito en la sangre periférica obtenida entre 10 y 15 días después de la infección. Los inventores han demostrado a continuación que la respuesta del hospedador que conduce a la eliminación del parásito era suficiente para inducir una inmunidad estéril de más de seis meses, no solamente frente a la cepa natural homologa PÓNK65, sino también frente a la cepa heteróloga altamente patógena PóANKA, que es capaz de inducir un neuropaludismo .

Así, en un primer aspecto, la presente invención concierne a un parásito vivo perteneciente al género Plasmodium en el que se ha inactivado la función del gen hmgb2 para su utilización en la prevención del paludismo o del neuropaludismo, preferiblemente en un mamífero, y de la forma más particularmente preferida en un ser humano.

El parásito es, preferiblemente, capaz de desarrollarse en los vertebrados, y más particularmente en los mamíferos, y pertenece al subgénero seleccionado de entre el grupo constituido por Plasmodium vinckeia , Plasmodium plasmodium y Plasmodium laverania.

Según un modo de realización, el parásito es capaz de desarrollarse en un hospedador humano y pertenece al subgénero Plasmodium plasmodium o Plasmodium laverania . Preferiblemente, el parásito pertenece a una especie responsable del paludismo en el hombre, más particularmente a una especie seleccionada de entre el grupo constituido por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, -Plasmodium ovale, Pl asmodium malariae y Plasmodium knowlesi. Aunque Plasmodium knowlesi sea un parásito que infecta esencialmente a los primates, se informan de cada vez más casos de infecciones en seres humanos. De forma más particularmente preferida, el parásito pertenece a una especie seleccionada de entre el grupo constituido por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae . Según un modo de realización en particular, el parásito pertenece a una especie seleccionada de entre el grupo constituido por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax y Plasmodium malariae . Según un modo de realización preferido, el parásito pertenece a la especie Plasmodium falciparum.

Según otro modo de realización, el parásito pertenece a una especie que es capaz de inducir una reacción inmunitaria, pero no es capaz de provocar los síntomas del paludismo en el ser humano. Preferiblemente, este parásito es un parásito de roedores que pertenece al subgénero Plasmodium vinckeia . La utilización de parásitos de roedores en el marco de la vacunación humana permite reducir considerablemente los riesgos relacionados con la administración de parásitos vivos a un sujeto. El parásito de roedor puede ser modificado de forma que exprese una o varias proteínas de un Plasmodium que - - infecte al hombre, tal como P. falciparum, que es o son necesarias para la invasión de los glóbulos rojos humanos. Dichas proteínas se describen, por ejemplo, en el artículo de Triglia y col, 2000. De forma preferida, el parásito pertenece a la especie el parasite Plasmodium berghei o Plasmodium yoelii. De forma más particularmente preferida, el parásito pertenece a la especie Plasmodium berghei. Según un modo de realización preferido, el parasites la cepa clínica NK65 de la especie Plasmodium berghei.

Según un modo de realización particular, el parásito pertenece a una especie seleccionada de entre el grupo constituido por Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae y Plasmodium knowlesi. El parásito puede pertenecer igualmente a una especie seleccionada de entre el grupo constituido por Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae o de entre el grupo constituido por Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax y Plasmodium malariae, o incluso de entre el grupo constituido por Plasmodium berghei y Plasmodium falciparum.

Según un modo de realización preferido, la cepa natural del parásito, es decir, el parásito en el que el gen hmgb2 es activo, no provoca neuropaludismo . Esta cepa puede elegirse, por ejemplo, de entre el grupo formado por Plasmodium berghei NK65, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae y Plasmodium knowlesi. Esta cepa puede ser igualmente una cepa de Plasmodium falciparum que haya perdido su capacidad de citoadherencia o que tenga una capacidad de citoadherencia reducida. Según un modo de realización, la cepa natural del parásito es una cepa de Plasmodium falciparum no citoadherente . Según otro modo de realización, la cepa natural del parásito es una cepa de Plasmodium falciparum que tiene una capacidad de citoadherencia reducida. La citoadherencia es una propiedad de Plasmodium falciparum que está relacionada directamente con el desarrollo de neuropaludismo . En efecto, los glóbulos rojos infectados por una cepa de Plasmodium falciparum citoadherente tienen la capacidad de unirse a las moléculas superficiales de las células endoteliales tales como CD36, ICAM1, VCAM1 o PECA 1/CD31, y provocar asi una obstrucción vascular, una inflamación y lesiones en diferentes órganos, en particular en el cerebro. La capacidad de citoadherencia de una cepa puede evaluarse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, tal como, por ejemplo, la descrita en el articulo de Buffet y col, 1999 o el de Traoré y col, 2000. El término « capacidad de citoadherencia reducida » se refiere a una capacidad de citoadherencia más débil que la observada para una cepa de referencia de Plasmodium citoadherente, por ejemplo, la cepa Plasmodium falciparum 3D7. La citoadherencia puede estar reducida en al menos el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 95%, preferiblemente en al menos el 80%, y de la forma más particularmente preferida en al menos el 90%, con respecto a una cepa de referencia de Plasmodium citoadherente, por ejemplo, la cepa Plasmodium falciparum 3D7. Es posible obtener cepas de Plasmodium falciparum con una capacidad de citoadherencia reducida, por ejemplo, multiplicando los pases en cultivos ex vivo (Udeinya y col, 1983) . Se han descrito diferentes cepas de Plasmodium falciparum con una capacidad de citoadherencia reducida, por ejemplo, en el articulo de Trenholme y col, 2000 [Plasmodium falciparum en el que gen clag9 está inactivado) y de Nacer y col, 2011 {Plasmodium falciparum DIO y T9-96) . Asi, según un modo particular de realización, la cepa natural del parásito es una cepa de Plasmodium falciparum poco o nada citoadherente . En particular, la cepa natural del parásito puede ser una cepa de Plasmodium falciparum con una capacidad de citoadherencia reducida seleccionada de entre el grupo constituido por una cepa de Plasmodium falciparum en la que el gen clag está inactivado, de la cepa Plasmodium falciparum DIO y de la cepa Plasmodium falciparum T9-96.

En el parásito utilizado según la invención, la función del gen hmgb2 está inactivada. Esto significa que la actividad de la proteina HMGB2 codificada por este gen está totalmente o parcialmente inhibida, preferiblemente totalmente inhibida. Esta inhibición puede obtenerse mediante numerosos procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica. También es posible bloquear la función del gen a nivel de la transcripción, de la traducción o a nivel proteico, por ejemplo, bloqueando o disminuyendo la transcripción o la traducción del gen hmgb2 o perturbando el correcto plegamiento de la proteina o su actividad.

La función del gen hmgb2 puede inactivarse particularmente mediante la deleción total o parcial de este gen, o la inserción o la sustitución de uno o varios nucleótidos, de tal forma que se haga este gen inactivo.

Según un modo de realización particular, la función del gen hmgb2 es inactivada mediante la deleción total o parcial de este gen, preferiblemente mediante la deleción total.

De forma preferida, la deleción del gen hmgb2 se obtiene mediante una recombinación homologa. Este procedimiento es bien conocido por el experto en la técnica y se ha aplicado numerosas veces en parásitos del género Plasmodium (véase, por ejemplo, Thathy and Ménard, 2002). Según un modo de realización particular, la región codificante del gen hmgb2 es sustituida mediante recombinación homologa por un marcador que permite seleccionar los parásitos en los que la recombinación ha tenido lugar. El marcador de selección puede ser, por ejemplo, el gen humano de la reductasa de dihidrofolato (dhfr) que confiere al parásito resistencia a la pirimetamina . La obtención de parásitos en los que se ha delecionado el gen hmgb2 está ejemplificada en la parte experimental. Según un modo particular de la invención, el parásito utilizado es un parásito en el que el gen hmgb2 ha sido sustituido por un marcador de selección, preferiblemente por el gen humano dhfr. Según un modo muy particular de la invención, el parásito es un Plasmodium berghei r preferiblemente la cepa clínica NK65, en la que el gen hmgb2 ha sido sustituido por un marcador de selección, preferiblemente por el gen humano dhfr. Según otro modo particular de la invención, el parásito utilizado es un Plasmodium falciparum, preferiblemente nada o poco citoadherente, en el que el gen hmgb2 ha sido sustituido por un marcador de selección, preferiblemente por el gen humano dhfr.

La función del gen hmgb2 puede inactivarse igualmente bloqueando o disminuyendo la traducción del ARNm de este gen. La interferencia con el ARN, que permite inhibir de forma específica la expresión del gen objetivo, es un fenómeno bien - - conocido por el experto en la técnica que ya ha sido utilizado para inhibir la expresión de genes de Plasmodium (véase, por ejemplo, McRobert and McConkey, 2002; Mohmmed y col., 2003; Gissot y col. 2004) . Según un modo de realización, se introduce una secuencia codificante para un ARN interferente, o su precursor, en el genoma del parásito y su expresión es controlada mediante un promotor fuerte, preferiblemente constitutivo, tal como, por ejemplo, el promotor del factor de elongación eEFlcc, que es activo en todos los estadios de desarrollo del parásito, o el del gen HSP70, que es activo en los esporozoitos y durante el ciclo eritrocitario . La secuencia y la estructura del ARN interferente pueden ser elegidas fácilmente- por el experto en la técnica. De forma particular, el ARN interferente utilizado puede ser un ARN interferente pequeño (ARNsi) .

A continuación se presentan las referencias del GenBank de las secuencias de los genes hmgb2 de diferentes especies de Plasmodium secuenciados , asi como las de las secuencias proteicas correspondientes, en la tabla 1.

Tabla 1. Referencia del GenBank de las secuencias nucleotídicas y proteicas de HMGB2 de diferentes especies de Plasmodium que han sido secuenciados hasta el día de hoy.

- - Los genes hmgb2 de las especies de Plasmodium aún no secuenciadas son fácilmente identificables mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, particularmente mediante hibridación o PCR.

En el parásito según la invención, puede ser igualmente inactivada la función de uno o de varios genes distintos al hmgb2. El gen adicional cuya función se ha inactivado puede ser un gen que participe en la supervivencia del parásito en un hospedador mamífero, en particular en el ser humano. Preferiblemente, la inactivación de este gen adicional permite atenuar la virulencia del parásito conservando su carácter inmunógeno. Este gen adicional puede elegirse de entre el grupo formado por la fosforilasa de nucleósidos de purina (PNP; PFE0660c) , el transportador de nucleósidos 1 (NT1 ; PF130252), UIS3 (PF130012), UIS4 (PF100164 transcrito precoz) , p52 (PFD0215c proteína con un motivo de 6 cisteínas) y p36 (PFD0210c) , así como las combinaciones de los mismos (las referencias entre paréntesis son los números de entrada del banco PlasmoDB de las secuencias de Plasmodium falciparum 3D7, proporcionadas aquí como ejemplo).

Los procedimientos para cultivar los parásito según la invención, así como los procedimientos de conservación, en particular de criopreservación, de los parásitos, se han descrito previamente y son bien conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Leef y col, 1979; Orj ih y col, 1980) . Estos parásitos pueden cultivarse ex vivo con la ayuda de cultivos celulares, o in vivo en un animal, por ejemplo, un ratón.

Según un modo de realización, los parásitos según la invención se utilizan en una forma eritrocitaria, más particularmente en forma de merozoítos no intraeritrocitarios o en forma de merozoítos, de trofozoítos o de esquizontes intraeritrocitarios .

Según un modo particular de realización, los parásitos según la invención se utilizan en forma de merozoítos, de trofozoítos o de esquizontes intraeritrocitarios, es decir, en el interior de los glóbulos rojos Según otro modo particular de realización, los parásitos se utilizan en forma de merozoítos no intraeritrocitarios, es decir, de merozoítos parcialmente o totalmente purificados tras la ruptura de los glóbulos rojos parasitados. Los merozoítos pueden obtenerse según cualquiera de los procedimientos conocidos por el experto en la técnica, tales como el descrito en el artículo de Boyle y col., 2010.

Los glóbulos rojos parasitados pueden obtenerse mediante la introducción del parásito en un hospedador, preferiblemente en un ser humano, y la recuperación de los glóbulos rojos desde el hospedador infectado cuando la parasitemia alcanza un mínimo del 1%, preferiblemente entre el 5 y el 10%. Según un modo de realización preferido, los glóbulos rojos parasitados son recuperados a partir de un hospedador humano del grupo sanguíneo O y de factor Rhesus negativo.

Según otro modo preferido de realización, los glóbulos rojos parasitados se obtienen mediante infección ex vivo de glóbulos rojos humanos, preferiblemente de glóbulos rojos del grupo sanguíneo 0 y de factor Rhesus negativo. De forma opcional, los cultivos de glóbulos rojos parasitados pueden estar sincronizados de forma que se obtengan mayoritariamente merozoítos, trofozoítos o esquizontes intraeritrocitarios . Los procedimientos de cultivo ex vivo de parásitos de Plasmodium son bien conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Trager and Jensen, 1976) .

Pueden añadirse anticoagulantes tales como la heparina a los glóbulos rojos parasitados así obtenidos. Los glóbulos rojos parasitados pueden conservarse mediante congelación en presencia de uno o varios crioprotectores compatibles con una utilización in vivo, tales como, por ejemplo, glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO) . Los glóbulos rojos parasitados pueden conservarse igualmente mediante refrigeración a 4°C en un medio de conservación adaptado, por ejemplo, el medio SAGM (« Salino de Adenina Glucosa Manitol ») o una disolución CPD (Citrato Fosfato Dextrosa) , pero para una duración que no supere aproximadamente los 45 días.

Según otro modo de realización, los parásitos según la invención se utilizan en forma de esporozoítos . Los esporozoítos pueden obtenerse mediante la introducción del parásito en un hospedador mosquito en el que se va a multiplicar. Los esporozoítos se recuperan entonces a partir de las glándulas salivares de los mosquitos infectados. Los esporozoítos así obtenidos pueden conservarse mediante congelación, por ejemplo, en nitrógeno líquido, antes de ser - - descongelados para ser inyectados vivos en un hospedador. De forma alternativa, tras la recuperación desde las glándulas salivares de los mosquitos, los esporozoitos pueden conservarse mediante liofilización o refrigeración antes de su administración.

La administración del parásito según la invención en un sujeto permite, a pesar de una rápida eliminación del parásito, inducir en el sujeto una inmunidad de varios meses frente a una infección por un Plasmodium, en particular un Plasmodium elegido de entre el grupo formado por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium knowlesi , preferiblemente Plasmodium falciparum. Esta inmunidad puede ser particularmente una inmunidad cruzada frente a una infección por una cepa de Plasmodium diferente a la del parásito utilizado. En particular, la administración de un parásito según la invención perteneciente a una cepa que no provoque neuropaludismo puede desembocar en una inmunidad cruzada frente una infección por una cepa de Plasmodium capaz de provocar esta complicación neurológica grave. El parásito según la invención puede por tanto utilizarse para la prevención del paludismo y/o del neuropaludismo. De forma particular, la administración del parásito según la invención en un sujeto permite inducir una inmunidad de varios meses frente a la infección por un Plasmodium falciparum capaz de inducir un neuropaludismo y prevenir asi un paludismo y/o un neuropaludismo inducido por este parásito.

El término « prevención » según se utiliza en este documento, se refiere a una ausencia de síntomas o a la presencia de síntomas atenuados de la enfermedad tras el contacto con el - - parásito. En particular, el término « prevención del paludismo » se refiere a una ausencia de síntomas o a la presencia de síntomas atenuados en el sujeto tratado tras el contacto con un Plasmodium responsable del paludismo. El término « prevención del neuropaludismo » se refiere a una ausencia de síntomas o a la presencia de síntomas atenuados en el sujeto tratado tras el contacto con un Plasmodium responsable del paludismo y capaz de inducir un neuropaludismo. Este término puede referirse igualmente a la ausencia de desarrollo de un neuropaludismo o al desarrollo de un neuropaludismo menos grave o atenuado en un sujeto infectado por un Plasmodium responsable del paludismo y capaz de inducir un neuropaludismo.

En un segundo aspecto, la presente invención concierne a una composición inmunógena que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un parásito según la invención, y a uno o varios excipientes o soportes farmacéuticamente aceptables. El parásito comprendido en la composición es tal como el descrito anteriormente.

Según un modo de realización, la composición comprende un parásito según la invención en una forma eritrocitaria, más particularmente en forma de merozoítos, de trofozoitos o de esquizontes intraeritrocitarios o de merozoítos no intraeritrocitarios, preferiblemente en forma de merozoítos, de trofozoitos o de esquizontes intraeritrocitarios.

Según un modo particular de realización, la composición comprende glóbulos rojos parasitados con el parásito según la invención y que pueden ser obtenidos según el procedimiento descrito anteriormente y en la parte experimental.

Según otro modo de realización, el parásito comprendido en la composición está en forma de esporozoítos, tales como los descritos anteriormente.

La composición inmunógena es capaz de inducir en el sujeto en el que se administra una respuesta del sistema inmunitario contra el parásito que contiene. El término « cantidad inmunológicamente eficaz » tal como se utiliza aquí, se refiere a la cantidad de parásitos que es suficiente para desencadenar una respuesta inmunitaria en el sujeto.

Preferiblemente, la composición inmunógena es una vacuna contra el paludismo.

Según un modo de realización, la composición según la invención se obtiene poniendo en suspensión glóbulos rojos parasitados, merozoitos o esporozoítos, preferiblemente glóbulos rojos parasitados o esporozoítos, tales como los definidos anteriormente, en uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes pueden ser fácilmente elegidos por el experto en la técnica según la forma del parásito, intraeritrocitaria, merozoitos o esporozoítos, y según la vía de administración contemplada. Estos excipientes pueden elegirse particularmente de entre el grupo constituido por agua estéril, suero fisiológico estéril y tampón de fosfato. Igualmente pueden utilizarse otros excipientes bien conocidos por el experto en la técnica. Preferiblemente, en el caso en el que la composición comprenda glóbulos rojos parasitados, el excipiente utilizado es una disolución isotónica que asegure la integridad de los glóbulos rojos hasta la administración de la composición al sujeto. De forma preferida, la composición comprende igualmente al menos un anticoagulante tal como la heparina. La composición puede obtenerse igualmente mezclando los - - esporozoitos de los parásitos tales como los definidos anteriormente, con un soporte farmacéuticamente aceptable tal como, por ejemplo, liposomas.

Los excipientes o los soportes utilizados se eligen de forma que se asegure la integridad de los glóbulos rojos parasitados y/o la supervivencia de los esporozoitos o de los merozoítos . Los excipientes o los soportes utilizados se eligen de forma que se asegure la supervivencia de los parásitos de la invención, cualquiera que sea la forma utilizada (merozoitos, esporozoitos o formas intraeritrocitarias ) , hasta la administración de la composición al sujeto que se va a inmunizar.

Según un modo de realización preferido, el sujeto que se va a inmunizar es un mamífero, preferiblemente un ser humano.

La composición según la invención puede administrarse, por ejemplo, por vía parenteral, cutánea, mucosa, transmucosal o epidérmica. Preferiblemente, la composición está formulada para ser administrada por vía parenteral, en particular por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica . Según un modo de realización particular, el parásito está en una forma eritrocitaria, preferiblemente comprendido en los glóbulos rojos, y la composición está formulada para ser administrada por vía parenteral, preferiblemente por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica, y de la forma más particularmente preferida, por vía intravenosa. Según otro modo de realización particular, el parásito está en forma de esporozoitos y la composición está formulada para ser administrada por vía parenteral, preferiblemente por vía subcutánea, intramuscular o intradérmica, preferiblemente por vía intramuscular o subcutánea. Los procedimientos de - - administración de las composiciones que comprenden esporozoitos vivos son bien conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud internacional de patente WO 2004/045559 y el articulo de Hoffman y col, 2010) . Según un modo de realización, el parásito está en forma eritrocitaria y comprendido en los glóbulos rojos, y la composición según la invención comprende entre 10 y 106 glóbulos rojos parasitados (GRP) por unidad de dosificación, preferiblemente entre 100 y 10" GRP, de una forma particularmente preferida entre 100 y 105 GRP, y de la forma más particularmente preferida entre 100 y 104 GRP por unidad de dosificación. Según un modo particular de realización, el parásito está en forma eritrocitaria y comprendido en los glóbulos rojos, y la composición según la invención comprende entre 10 y 100 glóbulos rojos parasitados (GRP) por unidad de dosificación .

Según otro modo de realización, el parásito está en forma de merozoitos no intraeritrocitarios y la composición según la invención comprende entre 10? y 10' merozoitos por unidad de dosificación, preferiblemente entre 103 y 105 merozoitos por unidad de dosificación.

Según otro modo de realización más, el parásito está en forma de esporozoitos y la composición según la invención comprende entre 103 y 107 esporozoitos por unidad de dosificación, preferiblemente entre 104 y 105 esporozoitos por unidad de dosificación .

La dosis que se va a administrar puede ser fácilmente determinada por el experto en la técnica teniendo en cuenta los datos fisiológicos del sujeto que se va a inmunizar, tales como su edad y su estado inmunitario, el grado de - - inmunidad buscado, el número de dosis administradas y la vía de administración utilizada. La dosis que se va a administrar puede variar igualmente según el modo de conservación de los parásitos .

La composición según la invención puede comprender una o varias cepas de parásitos según la invención. Según un modo de realización, la composición comprende al menos una cepa de Plasmodium falciparum y una cepa de Plasmodium vivax en las que se ha inactivado la función del gen hmgb2.

La composición según la invención puede comprender igualmente uno o varios de otros parásitos del género Plasmodium atenuados genéticamente. Estos parásitos pueden presentar, por ejemplo, una alteración o una inactivación de la función del gen de la fosforilasa de nucleósidos de purina, del transportador de nucleósidos 1, UIS3, UIS4, p52 o p36, o ser parásitos atenuados obtenidos mediante irradiación. Estos parásitos pertenecen preferiblemente a una cepa seleccionada de entre el grupo formado por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae y Plasmodium knowlesi La composición según la invención puede comprender igualmente uno o varios coadyuvantes inmunológicos . Estos coadyuvantes estimulan el sistema inmunitario refuerzan asi la respuesta inmunitaria obtenida frente al parásito según la invención. Estos coadyuvantes inmunológicos comprenden, pero no se limitan a, coadyuvantes de tipo muramilpéptido tales como N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP) y sus derivados; dimicolato de trehalosa (TDM) ; lipopolisacáridos (LPS) ; monofosforil lipido A (MPL) ; carboximetil celulosa; coadyuvante completo de Freund; coadyuvante incompleto de - - Freund; coadyuvantes de tipo emulsiones « aceite en agua » a las que eventualmente se les ha añadido escualeno o escualano; coadyuvantes minerales tales como alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, de potasio o de calcio; toxinas bacterianas tales como la subunidad B de la toxina colérica, la forma inactiva de la toxina botulinica o la linfotoxina termolábil de Escherichia coli; oligodesoxinucleótidos CpG; saponinas; copolimeros sintéticos tales como copolimeros de polioxietileno (POE) y polioxipropileno (POP; citocinas o imidazoquinolonas . Pueden utilizarse combinaciones de coadyuvantes. Estos diferentes tipos de coadyuvantes son bien conocidos por el experto en la técnica. En particular, la composición según la invención puede comprender uno o varios coadyuvantes inmunológicos seleccionados de entre el grupo constituido por oligodesoxinucleótidos CpG y coadyuvantes minerales, en particular alumbre, y una combinación de los mismos.

Según otro aspecto, la invención concierne a la utilización de un parásito vivo perteneciente al género Plasmodium en el que se ha inactivado la función del gen h gb2 para la preparación de una composición de vacuna contra el paludismo o el neuropaludismo.

La invención concierne igualmente a un procedimiento para producir una composición vacuna contra el paludismo o el neuropaludismo según la invención.

Según un modo de realización, el procedimiento comprende la etapa que consiste en mezclar glóbulos rojos infectados con un parásito vivo según la invención, con uno o varios excipientes o soportes farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, los glóbulos rojos son glóbulos rojos - - humanos obtenidos a partir de un hospedador del grupo sanguíneo 0 y con factor Rhesus negativo.

Según otro modo de realización, el procedimiento comprende la etapa consistente en mezclar merozoítos no intraeritrocitarios vivos de un parásito según la invención, con uno o varios excipientes o soportes farmacéuticamente aceptables .

Según otro modo más de realización, el procedimiento comprende la etapa consistente en mezclar esporozoítos vivos de un parásito según la invención con uno o varios excipientes o soportes farmacéuticamente aceptables.

Según un modo de realización preferido, los parásitos, en forma de glóbulos rojos parasitados, de merozoítos o en forma de esporozoítos, se mezclan igualmente con uno o varios coadyuvantes inmunológicos . Estos coadyuvantes pueden ser tales como los definidos anteriormente.

El procedimiento puede comprender además una etapa previa que comprende la obtención de dichos glóbulos rojos parasitados, de dichos merozoítos o de dichos esporozoítos, por ejemplo, mediante los procedimientos descritos anteriormente.

La composición o la vacuna obtenida puede conservarse antes de su administración, por ejemplo, congelada o refrigerada si contiene glóbulos rojos parasitados, o congelada, refrigerada o liofilizada si contiene esporozoítos o merozoítos. Preferiblemente, la composición o la vacuna obtenida se conserva congelada antes de su administración. En el caso de una liofilización se añade un diluyente apropiado al liofilizado antes de su administración, tal como, por ejemplo, agua estéril o suero fisiológico estéril, preferiblemente suero fisiológico estéril.

- - Los diferentes modos de realización concernientes al parásito y a la composición según la invención son contemplados igualmente en este aspecto.

Según otro aspecto, la invención concierne a un procedimiento para inmunizar un sujeto contra el paludismo que comprende la administración de una composición inmunógena o de una vacuna según la invención a dicho sujeto.

Preferiblemente, el sujeto es un mamífero, más particularmente un ser humano.

Según un modo de realización preferido, el procedimiento comprende la administración de una vacuna según la invención a dicho sujeto.

Según un modo de realización, el procedimiento comprende la administración de una dosis única de la composición inmunógena o de la vacuna según la invención.

Según otro modo de realización, el procedimiento comprende la administración de una pluralidad de dosis de la composición inmunógena o de la vacuna según la invención. La inmunización del sujeto puede obtenerse tras la administración de 2 a 6 dosis. Preferiblemente, se observa un intervalo de aproximadamente 4 a 8 semanas, preferiblemente de aproximadamente 6 a 8 semanas, entre cada administración.

Los inventores han demostrado que la administración de una única dosis que comprende 105 glóbulos rojos parasitados con un parásito según la invención permite obtener una inmunidad estéril al menos 6 meses en un mamífero. Según un modo preferido de realización, el procedimiento comprende la administración de una primera dosis de la composición inmunógena o de la vacuna según la invención, seguido de la administración de una segunda dosis aproximadamente entre seis meses y un año después. Preferiblemente, las dosis comprenden entre 10 y 106, preferiblemente entre 100 y 106, glóbulos rojos parasitados, entre 102 y 107 merozoítos o entre 10J y 107 esporozoitos . Según un modo de realización preferido, las dosis comprenden aproximadamente 103 glóbulos rojos parasitados. Según otro modo de realización preferido, las dosis comprenden entre 10 y 100 glóbulos rojos parasitados .

La inmunidad del sujeto frente al paludismo o al neuropaludisitio puede ser total o incompleta. En el caso de una inmunidad incompleta, la gravedad de los síntomas de la enfermedad declarada en un sujeto inmunizado será reducida en comparación con los observados en un sujeto no inmunizado. En el caso de una inmunidad total, el sujeto inmunizado no presentará ningún síntoma de la enfermedad tras un contacto con el parásito.

Según un modo de realización preferido, la inmunidad obtenida por la administración de la composición según la invención es una inmunidad estéril. Esto significa que el desarrollo de los parásitos administrados está muy alterado, y que aproximadamente entre 2 y 4 semanas después de la administración, los parásitos ya no serán detectados en la sangre periférica del sujeto.

La invención concierne igualmente a un procedimiento para inmunizar un sujeto contra el paludismo, que comprende la administración de un parásito según la invención en forma de esporozoitos a dicho sujeto mediante las picaduras de mosquitos infectados por dicho parásito. Los ejemplos que siguen se presentan a modo ilustrativo y no limitante.

Ejemplos Al estudiar la función de las proteínas HMGB, los inventores han demostrado recientemente que la proteína HMGB2 de P. berghei está implicada en el establecimiento de un neuropaludismo experimental (NPE) en un modelo de ratón C57BL/6 infectados por el parásito de P. berghei ANKA (PóANKA) . La inactivación del gen hmgb2 en PóANKA, sin implicar el desarrollo del parásito en los ratones C57BL/6, induce sin embargo un retraso en el establecimiento del NPE, incluso su abolición completa en el 65% de los casos. Además, se ha demostrado que la administración de las proteínas recombinantes HMGB2 a ratones previamente infectados por PóANKA Ahmgb2 permite restaurar el desarrollo del neuropaludismo .

Materiales y procedimientos Ratones Los ratones utilizados son ratones C57BL/6 (Charles River Laboratories). Estos ratones son sensibles al neuropaludismo experimental (NP-S) .

Parásitos naturales El parásito P. berghei ANKA (PóANKA) ( RA-867) indujo la muerte de ratones C57BL/6 por neuropaludismo en 7 +/- 1 días. Este parásito posee una etiqueta de GFP bajo el control del promotor eefl (Thaty and Ménard, 2002) .

El parásito P. berghei NK65 (P6NK65) (MRA-268) (de Sa y col. 2009) indujo la muerte de ratones C57BL/6 por hiperparasitemia en entre 20 y 25 días después de la infección. Por el contrario, este parásito no provoca neuropaludismo .

Obtención del parásito PbNK65 Ahmgb2 Construcción del vector de clonación: las regiones que flaquean la fase abierta de lectura en 5'UTR y 3'UTR del gen hmgb2r denominadas respectivamente anteriormente RHl y RH2 (y con una longitud de aproximadamente 500 pb) , se han amplificado con la ayuda de cebadores específicos, mediante PCR a partir del ADN genómico del parásito PÓNK65 (Tabla 2) clonados en el vector pCR®II-TOPO (Invitrogen) . A continuación se han transformado bacterias Escherichia coli One Shot® TOP 10 electrocompetentes con estos constructos y se han seleccionado en medio T,R que contiene ampicilina y la canamicina .

Tabla 2. Cebadores de amplificación de las regiones de homología RHl y RH2 Los cebadores que sirven para la amplificación han sido diseñados de forma que se agreguen para - RHl: un sitio de restricción Apal en 5' UTR y un sitio restricción Smal en 3'UTR, y - RH2 : un sitio de restricción Notl en 5 ' UTR y un sitio restricción Ascl en 3'UTR de la secuencia. Estos sitios restricción permiten la inserción de los fragmentos de la PCR en el vector.

Las regiones 5' y 3' no traducidas RH1 y RH2 se insertan a continuación en un vector pBC SK-Hudhfr (Stratagene) que contiene el gen de la reductasa de dihidrofolato humana (hudhfr) bajo el control del promotor efla en 5'UTR y de la dhfr/ts (dhfr/sintasa de timidilato) en 3'UTR. RH1 se ha insertado en 5'UTR del cásete Hudhfr y RH2 en 3'UTR. Durante la recombinación homologa, las 2 regiones RH1 y RH2 se aparean con las secuencias complementarias del gen hmgb2 en el genoma de P. berghei , lo que permite una doble recombinación homologa a nivel de este gen, y de hecho, su deleción. La Hudhfr confiere resistencia a la pirimetamina, y los parásitos mutantes se han seleccionado con la ayuda de este fármaco.

Transfección de los parásitos y selección de los parásitos mutantes: los merozoitos de P. berghei se han transfectado siguiendo el protocolo descrito por Koning-Ward y col, 2000. Todas las infecciones se han realizado por inyección intravenosa.

Se han infectado dos ratones Swiss de 3 semanas con 2, 6 x 10° GRPs PéANKA o PÓNK65. Cuando la parasitemia alcanza entre el 2 y el 3% (estadios jóvenes mayoritarios) , se ha recogido sangre con heparina mediante punción entra cardiaca (entre 1,5 y 2 mi de sangre) . La sangre se ha lavado brevemente con 5 mi de medio de cultivo completo constituido por 4 vol de RPMI 1640 (Invitrogen) al que se le ha añadido 1 vol de suero bovino fetal ( InVitrogen) . Después de una centrifugación de 8 min a 450 g, los GRPs se han recogido en 50 mi de medio de cultivo completo. La suspensión celular, a la que se le han añadido 50 mi complementarios de medio de cultivo completo, se ha puesto entonces en cultivo toda la noche, en un Erlen Meyer de 500 mi, a 36,5°C, con agitación a 70 rpm y bajo una presión de 1,5 a 2 bar.

Al dia siguiente, después de verificar mediante frotis la presencia mayoritaria de esquizontes maduros, el cultivo de GRPs se ha centrifugado durante 10 min a 1.500 rpm, y después se ha recogido el sedimento en 35 mi de medio de cultivo completo en un tubo de fondo cónico de 50 mi. A continuación se han añadido suavemente diez mililitros de Nycodenz al 50% (Lucron Bioproducts, dilución ½ en PBS 1 X) al cultivo de GRPs para crear un gradiente de densidad en el fondo del tubo. Veinte minutos de centrifugación a 450 g, a TA, sin parar, han implicado la purificación de los GRPs, que forman entonces un anillo marrón en la mitad del tubo. El anillo marrón de GRPs se ha recogido (~20 mi) y después se ha lavado con 20 mi de medio de cultivo completo. Después de 8 min de centrifugación a 450 g, el sedimento de esquizontes maduros se ha recogido finalmente en 3 mi de medio de cultivo completo que a continuación se han distribuido en 3 tubos Eppendorf de 1,5 mi. Esta operación ha tenido que ser realizada de forma muy delicada ya que los esquizontes son frágiles. En esta etapa, la cantidad de esquizontes obtenidos ha sido suficiente para realizar hasta 10 transfecciones independientes. Después de un último «spin» de 5 s a 16.000 g, el sedimento de esquizontes de cada tubo se ha recogido después en 100 µ? de tampón de electroporación (Nucleofector Solution 88A6, AMAXA) con 5 µg de cada uno de los constructos plasmidicos obtenidos (pBC-5'KHlHudhfr3'KH2 para pbhmgbl o - - pbhmgb2) , digeridos previamente por Apal y Ascl . Los parásitos han sido transfectados utilizando el programa U33 del electroporador, Nucleofector AMAXA. El choque eléctrico induce la ruptura de la membrana de los esquizontes maduros, y los merozoitos asi liberados pueden internalizar los plásmidos linealizados . Inmediatamente se han añadido cincuenta microlitros de medio de cultivo completo al contenido de la cubeta e inmediatamente se han infectado dos ratones Swiss de 3 semanas con 100 µ?, cada uno, de merozoitos transfectados . En el día Jl después de la infección se ha administrado el fármaco de selección, la pirimetamina en el agua de bebida y se han realizado frotis todos los días. La disolución de pirimetamina se ha preparado de la siguiente forma: 70 mg de pirimetamina (Sigma Aldrich) , 10 mi de DMSO, csp 1 1 de agua, pH 3,5 - 5,5. Cuando los ratones han resultado positivos para la presencia de parásitos (aproximadamente el día J6 después de la infección) y cuando la parasitemia ha alcanzado entre el 2 y el 10%, se ha recogido su sangre mediante punción intracardiaca .

Condiciones de cultivo de los parásitos e inoculación Los ratones C57BL/ 6 han sido infectados intraperitonealmente con 200 µ? cada uno de una ampolla que contiene 10' GRPs/200 µ? . Cuando la parasitemia ha alcanzado entre el 1 y el 5% (5 6 días después de la infección) , se han recogido aproximadamente 100 µ? de sangre del carrillo del animal en un tubo que contiene heparina. Esta sangre se ha lavado 2 veces con 1 mi de PBS frió y se ha centrifugado durante 5 min a 3.800 rpm. Tras una dilución a 1/1.000 y el recuento de las células, los ratones C57BL/6 han sido infectados con 105 GRPs.

Medición de la parasitemia La parasitemia se analiza mediante el recuento al microscopio de los glóbulos rojos parasitados (GRP) en los frotis coloreados .

Preparaciones de los glóbulos rojos parasitados y congelación de los GRP Los ratones C57BL/ 6 son infectados intraperitonealmente con 200 µ? cada uno de una ampolla que contiene 107 GRPs/200 µ? . Se realizan dos tipos de reservas de parásitos.

Estabilizados: la sangre se recoge de los ratones infectados mediante punción intracardiaca (animal anestesiado) cuando la parasitemia alcanza entre el 3 y el 10% (de 5 a 6 días después de la infección con 107 glóbulos rojos parasitados) en un tubo que contiene heparina y conservados siempre en hielo hasta su congelación en nitrógeno líquido en la siguiente mezcla de criopreservación : 1 vol de glicerol puro (Sigma Aldrich) + 9 vol de Alsever's Solution (Sigma Aldrich) . Los estabilizados se realizan con 1 vol de la sangre recogida al que se añaden 2 vol de la mezcla de criopreservación. Se congelan partes alícuotas en nitrógeno líquido (aproximadamente 300 µ? por ratón) y a continuación se conservan a -80°C.

Ampollas: como anteriormente, la sangre se recoge mediante punción intracardiaca, pero cuando la parasitemia alcanza entre el 1 y el 5%. Esta sangre se lava varias veces con PBS frío y se centrifuga 5 min a 3.800 rpm. Después se rellenan ampollas con 107 GRPs/200 µ? en una mezcla de criopreservación, véase el párrafo anterior, tras el recuento - - del número de glóbulos rojos parasitados.

Resultados Papel de la proteina HMGB2 en el desarrollo del parásito PbNK65 Los inventores han demostrado que la inactivación del gen hmgb2 impedia el desarrollo de PÓNK65 Ahmgb2 en el ratón C57BL/6 (NP-S) , con una eliminación del parásito entre 10 y 15 días después de la infección (J10 - J15) en función de la dosis infectante de parásitos. La figura 1 representa la media de 3 experimentos (n = 5 ratones por experimento) en el transcurso de los cuales los ratones C57BL/6 han sido infectados con glóbulos rojos parasitados con PÓNK65 natural o con P0NK65 Ahmgb2. Esta eliminación del parásito mutado se ha observado aproximadamente 15 días después de la infección. El parásito mutado ya no se ha detectado en los frotis sanguíneos durante el desarrollo del parásito natural, seguido hasta la muerte por hiperparasitemia aproximadamente 25 días después de la infección. En efecto, cuando el parásito natural continúa desarrollándose, la infección con PÓNK65 Ahmgb2 induce una respuesta inmunitaria en el ratón C57BL/6 que altera el desarrollo de este parásito. Se han obtenido varios clones mutantes independientes que muestran la misma cinética de eliminación durante su desarrollo en los ratones C57BL/6.

Protección estéril inducida por una primera infección con PbNK65 Ahmgb2 Se han realizado varios experimentos con entre una y tres pruebas de infección sucesivas en ratones C57BL/6 infectados por primera vez con el parásito mutado PÓNK65 Ahmgb2 (105 GRP por vía intraperitoneal o intravenosa) . Cuando el parásito ya no era detectado en la sangre de los ratones C57BL/6 (alrededor del día J19) , los inventores procedieron a la primera prueba de infección ( J19) , después a la segunda el día J71 y a la tercera el día J162 con dos parásitos naturales altamente patógenos: 1. el parásito homólogo natural PÓNK65 que conduce a la muerte de los ratones por hiperparasitemia y 2. el parásito heterólogo PóA KA que conduce a la muerte de los ratones por neuropaludismo .

La figura 2 presenta los resultados del experimento con tres pruebas de infección sucesivas. Todos los ratones infectados por primera vez con PÓNK65 Ahmgb2 han sobrevivido a las tres pruebas de infección con el mantenimiento de la protección estéril durante al menos 7 meses. En cada prueba, los inventores han verificado que el desarrollo del parásito natural PÓNK65 en los ratones sin experimentación previa se siguió hasta aproximadamente 25 días, cuando los ratones comenzaron a morir por hiperparasitemia y que el desarrollo del parásito PóANKA natural en los ratones sin experimentación previa se siguió hasta aproximadamente 7 días, cuando los ratones murieron por neuropaludismo (los controles de la patogenicidad de los parásitos y de la edad de los ratones) .

Con el fin de determinar la menor dosis de glóbulos rojos infectados por PÓNK65 Ahmgb2 necesaria y suficiente para promover la protección estéril, se han llevado a cabo pruebas de infección en ratones infectados por primera vez con entre 105y 103 GRP (Figura 3) e incluso con 102 GRP (resultados no presentados) . Estos experimentos han demostrado que la inyección de 102 o de 103 GRP permite inducir una protección estéril durante una prueba de infección llevada a cabo mediante inyección la intravenosa de 105 GRP de PbNK65 o de PóANKA natural .

Conclusión Estos resultados demuestran que puede se inducir una inmunidad estéril (los parásitos ya no son detectados en la sangre periférica) después de una primera infección con el parásito PÓNK65 Ahmgb2. Esta protección se extiende no solamente al parásito homólogo salvaje PÓNK65, sino también al parásito heterólogo PóANKA capaz de inducir un neuropaludismo .

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Claims (33)

REIVINDICACIONES

1. Parásito vivo perteneciente al género Plasmodium en el que se ha inactivado la función del gen hmgb2 para una utilización en la prevención del paludismo o del neuropaludismo en un mamífero.

2. Parásito según la reivindicación 1, en el que la cepa del parásito se selecciona de entre el grupo formado por Plasmodium berghei , Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae y Plasmodium knowlesi .

3. Parásito según la reivindicación 1 o 2, en el que la cepa del parásito se selecciona de entre el grupo formado por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae .

4. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cepa del parásito es Plasmodium falciparum.

5. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el parásito en su forma natural no provoca neuropaludismo .

6. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5, en el que la cepa del parásito es Plasmodium berghei NK65.

7. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones a 5, en el que la cepa del parásito es una cepa de Plasmodi falciparu no citoadherente o con una capacidad de citoadherencia reducida.

8. Parásito según la reivindicación 7, en el que la cepa del parásito es una cepa de Plasmodium falciparum con una capacidad de citoadherencia reducida.

9. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones a 8, en el que el parásito está en forma de merozoitos intraeritrocitarios .

10. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el parásito está en una forma int aeritrocítaria .

11. Parásito según la reivindicación 10, en el que el parásito está en forma de trofozoítos, de merozoitos o de esquizontes intraeritrocitarios.

12. Parásito según la reivindicación 11, en el que el parásito está en forma de merozoitos o de esquizontes intraeritrocitarios

13. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el parásito está en forma de esporozoitos.

14. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la función del gen hmgb2 se ha inactivado mediante la deleción total o parcial de dicho gen.

15. Parásito según la reivindicación 14, en el que la función del gen hmgb2 se ha inactivado mediante la deleción total de dicho gen.

16. Parásito según la reivindicación 14 o 15, en el que la región codificante del gen hmgb2 está sustituida por un marcador de selección.

17. Parásito según la reivindicación 16, en el que el marcador de selección es el gen humano que codifica para la reductasa de dihidrofolato .

18. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la función del gen hmgb2 se ha inactivado mediante un ARN interferente que bloquea o que disminuye la traducción de la proteina HMGB2.

19. Parásito según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que se ha inactivado la función de uno o de varios de otros genes .

20. Parásito según la reivindicación 19, en el que el o los otros genes cuya función se ha inactivado se eligen de entre el grupo formado por los genes que codifican para la fosforilasa de nucleósidos de purina, del transportador de nucleósidos 1, UIS3, UIS4, p52 y p36, y una combinación de los mismos.

21. Composición inmunógena que comprende, como inmunógeno, una cantidad inmunológicamente eficaz de un parásito tal como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, y uno o varios excipientes o soportes farmacéuticamente aceptables.

22. Vacuna contra el paludismo que comprende, como inmunógeno, un parásito tal como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, y uno o varios excipientes o soportes farmacéuticamente aceptables.

23. Composición inmunógena según la reivindicación 21 o vacuna según la reivindicación 22 que comprende además uno o varios coadyuvantes inmunológicos .

24. Composición inmunógena o vacuna según la reivindicación 23, en la que el o los coadyuvantes inmunológicos se seleccionan de entre el grupo formado por los coadyuvantes de tipo muramilpéptido; dimicolato de trehalosa (TDM) ; lipopolisacáridos (LPS) ; monofosforil lipido A (MPL) ; carboximetil celulosa; el coadyuvante completo de Freund; el coadyuvante incompleto de Freund; coadyuvantes de tipo emulsiones de « aceite en agua » a las que eventualmente se les ha añadido escualeno o escualano; coadyuvantes minerales; toxinas bacterianas; oligodesoxinucleótidos CpG; saponinas; copolimeros sintéticos; citocinas e imidazoquinolonas .

25. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23 y 24 o vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, formulada para ser administrada por via parenteral.

Composición inmunógena según una cualquiera de las vindicaciones 21, 23 a 25 o vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, que comprende varios parásitos tales como los definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

27. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23 a 26 o vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, que comprende entre 10 y 10°, preferiblemente entre 102 y 10b, de dichos parásitos en forma intraeritrocitaria por unidad de dosificación.

28. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23 a 26 o vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, que comprende entre 103 y 107 parásitos en forma de esporozoitos por unidad de dosificación .

29. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23 a 26 o vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, que comprende entre 102 y 107 parásitos en forma de merozoítos no intraeritrocitarios por unidad de dosificación.

30. Utilización de un parásito tal como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, para la preparación de una composición de vacuna contra el paludismo o el neuropaludismo .

31. Procedimiento para inmunizar un sujeto contra el paludismo, que comprende la administración de una composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 21, 23 a 29 o de una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29 a dicho sujeto.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que la composición o la vacuna es administrada por vía parenteral.

33. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que la composición o la vacuna es administrada por vía subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevas composiciones y procedimientos para inmunizar un hospedador contra el paludismo utilizando un parásito Plasmodium atenuado genéticamente mediante la inactivación de la función del gen hmgb2.