FR2978048A1 - Composition vaccinale contre le paludisme - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouvelles compositions et méthodes pour immuniser un hôte contre le paludisme en utilisant un parasite Plasmodium génétiquement atténué par l'inactivation de la fonction du gène hmgb2.

Description

La présente invention relève du domaine de la médecine, et plus particulièrement de celui de la lutte contre le paludisme. Arrière-plan technologique de l'invention Le paludisme est une maladie infectieuse causée par un parasite unicellulaire eucaryote du genre Plasmodium. Le paludisme est une maladie parasitaire mondialement présente et engendre de graves problèmes économiques et sanitaires dans les pays en développement. P. falciparum est l'espèce la plus délétère des cinq types de Plasmodium infectant l'homme. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), P. falciparum est responsable de 250 à 500 millions de cas de maladie aiguë et d'environ 1 million de décès chaque année (surtout les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes). Le neuropaludisme est une complication neurologique sévère du paludisme responsable de la grande majorité des cas mortels de la maladie. Même si l'individu survit, le neuropaludisme peut entraîner des séquelles neurologiques graves, notamment chez les jeunes enfants dont le système immunitaire est en cours de formation. La pathogénèse du neuropaludisme est complexe et encore loin d'être complètement élucidée. A l'heure actuelle, il est admis que la pathologie cérébrale est vraisemblablement la résultante de la séquestration des globules rouges parasités dans les micro-vaisseaux des principaux organes (rate, poumons, coeur, intestins, reins, foie et cerveau) et de la production de cytokines pro-inflammatoires dans ces mêmes organes, conduisant à un syndrome et état systémiques pouvant entraîner la mort de l' individu. La lutte contre le paludisme est un des grands enjeux de l'OMS, mais à ce jour, tous les efforts visant à maîtriser cette maladie ont échoué. Durant ces trente dernières années, la situation s'est même détériorée en raison de l'apparition de la résistance des anophèles aux insecticides et de la chimiorésistance grandissante de P. falciparum aux médicaments antipaludéens (même utilisés en combinaisons). La lutte contre le paludisme est rendue difficile par l'absence d'un vaccin réellement efficace contre la maladie. Les premières tentatives de développer un vaccin datent des années 70. Depuis, les essais vaccinaux se sont multipliés mais font face à la complexité du développement du parasite chez ses deux hôtes successifs, l'homme et le moustique ainsi qu'à un mécanisme d'échappement au système immunitaire extrêmement compliqué impliquant une importante variation antigénique du parasite.

Cette variation lors de la phase érythrocytaire du parasite rend la vaccination préventive classique à l'aide de complexes de protéines-peptides de Plasmodium extrêmement difficile. L'obtention d'un vaccin efficace contre les formes érythrocytaires du parasite est pourtant un enjeu majeur dans le cadre de l'éradication de la maladie étant donné qu'un tel vaccin permettrait à la fois de réduire les symptômes mais également la charge parasitaire et la quantité de gamétocytes dans le sang donc de diminuer la transmission du parasite. Une étude récente a montré que l'administration répétée de très faibles doses de globules rouges parasités par P. falciparum 3D7 associée à la prise simultanée de médicaments antipaludéens induisait une immunité susceptible de protéger les patients contre la phase érythrocytaire d'une souche homologue (Pombo et al. 2002). Il a donc a été envisagé d'utiliser des parasites vivants génétiquement atténués (ou GAP « Genetically Attenuated Parasites ») pour induire une protection stérile de longue durée. Plusieurs GAP ont ainsi été décrits. Cependant, la majorité de ces GAP cible le stade hépatocytaire via les sporozoïtes des parasites atténués. Deux GAP ciblant le stade érythrocytaire ont également été décrits: des parasites de rongeurs P. yoelii dans lesquels la purine nucléoside phosphorylase (PNP) (Ting et al., 2008) ou le transporteur nucléosidique 1 (NT1) (Aly et al., 2010) a été inactivé. Il a été montré que ces GAP confèrent une immunité vis-à-vis d'une souche homologue, mais également dans une moindre mesure, vis-à-vis de souches hétérologues. Un vaccin contre le paludisme est actuellement en phase III des essais cliniques (RTS,S de G1axoSmithKline Biologicals'). Cependant, les résultats obtenus durant la phase II montrent que ce vaccin ne réduit l'occurrence de paludisme clinique que de 35% et de 49% celui de paludisme sévère.

A ce jour, il demeure donc crucial de développer de nouvelles stratégies qui permettraient notamment d'enrayer l'apparition d'accès graves tels que le neuropaludisme mais également de diminuer la charge parasitaire et la quantité de gamétocytes dans le sang périphérique et ainsi réduire les risques de transmission de la maladie.

Résumé de l'invention L'objectif de la présente invention est de fournir de nouvelles compositions vaccinales pour prévenir le paludisme, et plus particulièrement l'apparition d'accès graves du paludisme tels que le neuropaludisme.

Les inventeurs ont démontré qu'un parasite vivant appartenant au genre Plasmodium et dans lequel la fonction du gène hmgb2 a été inactivée pouvait être utilisé comme immunogène dans un vaccin contre le paludisme. Ils ont en effet observé, que l'administration d'un tel parasite induisait une réaction immunitaire chez l'hôte qui permettait d'obtenir à la fois la clairance du parasite (charge parasitaire en dessous du seuil de détection dans le sang périphérique) mais également une protection efficace et de longue durée contre une infection par un Plasmodium, notamment par une souche très pathogène, et plus particulièrement contre la phase érythrocytaire du parasite qui est responsable de la symptomatologie de la maladie et de sa transmission. Ainsi, la présente invention concerne tout d'abord un parasite vivant appartenant au genre Plasmodium dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée pour une utilisation dans la prévention du paludisme, et plus particulièrement dans la prévention du neuropaludisme qui est une complication neurologique sévère de la maladie. Le parasite peut être sélectionné dans le groupe constitué de Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae and Plasmodium knowlesi. De préférence, le parasite sous sa forme sauvage ne provoque pas de neuropaludisme. Dans un second aspect, la présente invention concerne une composition immunogène comprenant, en tant qu'immunogène, une quantité immunologiquement efficace d'un parasite selon l'invention, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables. La présente invention concerne également un vaccin contre le paludisme comprenant, en tant qu'immunogène, un parasite selon l'invention, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables. La composition immunogène ou le vaccin peut être formulé pour être administré par voie parentérale. De manière préférée, la composition ou le vaccin comprend entre 102 et 105 parasites par dose d'injection. 3 Dans un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un parasite selon l'invention, pour la préparation d'une composition vaccinale contre le paludisme ou le neuropaludisme. Dans un autre aspect, la présente invention concerne également une méthode 5 pour immuniser un sujet contre le paludisme, comprenant l'administration d'une composition immunogène ou d'un vaccin selon l'invention audit sujet. Brève description des dessins Figure 1: Parasitémie des souris C57B1/6 infectées par des globules rouges parasités (GRP) avec PbNK65 sauvage et muté PbNK65 Ohmgb2 (105 et 106 par 10 injection intraveineuse, respectivement). La parasitémie est analysée par comptage au microscope des GRP dans des frottis colorés et présentée comme le pourcentage des GRP (moyenne ± écart-type). L'expérience a été faite avec 5 souris et répétée plusieurs fois. La valeur p est de 0,008. Figure 2: Etude de la survie des souris primo-infectées avec PbNK65 Ohmgb2 15 et infectées ensuite trois fois avec les deux parasites sauvages pathogènes PbNK65 et PbANKA. La première épreuve a été faite à J19, le deuxième à J71 et enfin la troisième à J162. A chaque épreuve, la pathogénicité des deux préparations de GRP infectés avec PbNK65 et PbANKA a été vérifiée avec des souris de même âge pour le devenir et mort des souris par hyperparasitémie et neuropaludisme. Cinq souris ont été analysées 20 pour chacune des expériences. Description détaillée de l'invention Le séquençage du génome de P. falciparum s'est achevé en 2002. Ce génome comprend environ 5500 gènes dont 60% ont une fonction totalement inconnue. En étudiant les facteurs impliqués dans la régulation transcriptionnelle chez P. falciparum, 25 les inventeurs ont annoté quatre HMGB (PfHMGB 1 à 4; High Mobility Group Box proteins). Ce sont des protéines nucléaires non histone très abondantes qui ont la particularité d'être à la fois des facteurs nucléaires et des médiateurs extracellulaires. Chez l'homme, où elles ont été particulièrement étudiées, elles sont présentes dans le noyau des cellules et jouent le rôle de facteurs architecturaux, participant à la 30 régulation de la transcription via le remodelage de la chromatine. Dans des situations de danger pour la cellule (corps étranger, inflammation), ces protéines sont sécrétées activement dans le milieu cellulaire et/ou passivement en cas de nécrose cellulaire, et agissent en tant que véritables signaux de danger (alarmines) en activant les macrophages et autres cellules compétentes du système immunitaire. L'implication de la protéine HMGB 1 humaine a été démontrée dans les maladies provoquant une inflammation systémique telles que le lupus érythémateux, le choc septique ou la polyarthrite rhumatoïde, et dans certains cancers. Enfin, l'augmentation de la protéine HMGB 1 humaine, dans les sera de patients, a été corrélée avec la sévérité de ces maladies. Chez P. falciparum, les inventeurs ont plus particulièrement étudié PfHMGB 1 et PfHMGB2, petites protéines de moins de 100 acides aminés. Ces deux protéines, comme leurs homologues humaines sont capables de courber l'ADN et d'interagir avec des structures particulières de l'ADN (Briquet et al. 2006). Elles sont également sécrétées et retrouvées dans les surnageants de culture de P. falciparum. Les protéines HMGB1 et 2 de P. falciparum sont capables d'activer et d'induire l'expression de TNFa dans des lignées monocytaires de souris (Kumar et al. 2008). Dans la présente demande, les inventeurs ont utilisé comme modèle animal de neuropaludisme, des souris C57B1/6 infectées par le parasite de P. berghei ANKA (PbANKA). Ce modèle animal reproduit les principales caractéristiques de la pathologie humaine telles que l'ataxie, la désorientation dans l'espace, les convulsions et le coma. Ces symptômes cliniques peuvent conduire à la mort de l'animal. Comme chez l'homme, on observe dans ce modèle, la séquestration des globules rouges parasités, les hémorragies et lésions cérébrales, la production de cytokines pro-inflammatoires et la destruction de la barrière hémato-encéphalique. Dans ce modèle, la totalité des souris C57BL/6 infectées par l'isolat PbANKA meurent en 7 jours environ de neuropaludisme. En revanche, les inventeurs ont observés que 60% des souris infectées par le parasite PbANKA Ohmgb2 ne développaient pas de neuropaludisme. Les inventeurs ont inactivé le gène hmgb2 d'un autre isolat de P. berghei, l'isolat NK65, qui induit la mort des souris C57BL/6 par hyper-parasitémie en 20 à 25 jours après infection mais ne provoque pas de neuropaludisme. Ils ont tout d'abord observé que l'inactivation de ce gène entrave le développement de PbNK65 Ohmgb2 dans la souris avec une clairance du parasite obtenue 10 à 15 jours après l'infection. Les inventeurs ont ensuite démontré que la réponse immunitaire conduisant à la clairance du parasite était suffisante pour induire une immunité stérile de plus de six mois, non seulement vis-à-vis de la souche sauvage homologue PbNK65 mais également vis-à-vis de la souche hétérologue hautement pathogène PbANKA qui est capable d'induire un neuropaludisme.

Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention concerne un parasite vivant appartenant au genre Plasmodium dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée pour une utilisation dans la prévention du paludisme ou du neuropaludisme. Le parasite est, de préférence, capable de se développer chez les vertébrés, et plus particulièrement chez les mammifères, et appartient au sous-genre sélectionné dans le groupe constitué de Plasmodium vinckeia, Plasmodium plasmodium et Plasmodium laverania. Selon un mode de réalisation, le parasite est capable de se développer chez un hôte humain et appartient au sous-genre Plasmodium plasmodium ou Plasmodium laverania. De préférence, le parasite appartient à une espèce responsable du paludisme chez l'homme, plus particulièrement à une espèce sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi. Bien que Plasmodium knowlesi soit un parasite infectant essentiellement les primates, de plus en plus de cas d'infections humaines par ce parasite sont rapportés. De manière plus particulièrement préférée, le parasite appartient à une espèce sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale et Plasmodium malariae. Selon un autre mode de réalisation, le parasite appartient à une espèce qui est capable d'induire une réaction immunitaire mais n'est pas capable de provoquer les symptômes du paludisme chez l'humain. De préférence, ce parasite est un parasite de rongeurs appartenant au sous-genre Plasmodium vinckeia. L'utilisation de parasites de rongeurs dans le cadre de la vaccination chez l'homme permet de réduire considérablement les risques liés à l'administration de parasites vivants chez le sujet. Le parasite de rongeur peut être modifié de façon à exprimer une ou plusieurs protéines d'un Plasmodium infectant l'homme, tel que P. falciparum, qui est ou sont nécessaires à l'invasion des globules rouges humains. De telles protéines sont par exemple décrites dans l'article de Triglia et al., 2000. De manière préférée, le parasite appartient à l'espèce Plasmodium berghei ou Plasmodium yoelii. De manière plus particulièrement préférée, le parasite appartient à l'espèce Plasmodium berghei. Selon un mode de réalisation préféré, le parasite est l'isolat NK65 de l'espèce Plasmodium berghei. Selon un mode de réalisation particulier, le parasite est sélectionné dans le groupe constitué de Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi. Selon un mode de réalisation préféré, la souche sauvage du parasite, c'est-à-dire le parasite dans lequel le gène hmgb2 est actif, ne provoque pas de neuropaludisme. Cette souche peut être par exemple choisie dans le groupe constitué de Plasmodium berghei NK65, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi. Cette souche peut également être une souche de Plasmodium falciparum ayant perdu sa capacité de cyto-adhérence lors de passages en culture ex vivo. Dans le parasite utilisé selon l'invention, la fonction du gène hmgb2 est inactivée. Cela signifie que l'activité de la protéine HMGB2 codée par ce gène est totalement ou partiellement inhibée, de préférence totalement inhibée. Cette inhibition peut être obtenue par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. Il est ainsi possible de bloquer la fonction du gène au niveau transcriptionnel, traductionnel ou au niveau protéique, par exemple en bloquant ou diminuant la transcription ou la traduction du gène hmgb2 ou en perturbant le repliement correct de la protéine ou son activité. La fonction du gène hmbg2 peut notamment être inactivée par la délétion totale ou partielle de ce gène, ou l'insertion ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides de telle sorte à rendre ce gène inactif. Selon un mode de réalisation particulier, la fonction du gène hmbg2 est inactivée par délétion totale ou partielle de ce gène, de préférence par délétion totale. De manière préférée, la délétion du gène hmbg2 est obtenue par recombinaison homologue. Cette méthode est bien connue de l'homme du métier et a été appliquée de nombreuses fois aux parasites du genre Plasmodium (voir par exemple Thathy and Ménard, 2002). Selon un mode de réalisation particulier, la région codante du gène hmbg2 est remplacée par recombinaison homologue par un marqueur permettant de sélectionner les parasites dans lesquels la recombinaison a eu lieu. Le marqueur de sélection peut être, par exemple, le gène humain de la dihydrofolate réductase (dhfr) qui confère au parasite la résistance à la pyriméthamine. L'obtention de parasites dans lesquels le gène hmbg2 est délété, est exemplifiée dans la partie expérimentale. Selon un mode très particulier de l'invention, le parasite est un Plasmodium berghei, de préférence l'isolat NK65, dans lequel le gène hmgb2 a été remplacé par un marqueur de sélection, de préférence par le gène humain dhfr.

La fonction du gène hmbg2 peut également être inactivée en bloquant ou diminuant la traduction de l' ARNm de ce gène. L'interférence par l' ARN, qui permet d'inhiber de manière spécifique l'expression du gène cible, est un phénomène bien connu de l'homme du métier qui a déjà été utilisé pour inhiber l'expression de gènes de Plasmodium (voir, par exemple, McRobert and McConkey, 2002; Mohmmed et al., 2003 ; Gissot et al. 2004). De préférence, l'ARN interférent utilisé est un petit ARN interférent (ARNsi). Les références GenBank des séquences de gènes hmgb2 de différentes espèces de Plasmodium séquencées ainsi que celles des séquences protéiques correspondantes sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1. Référence GenBank des séquences nucléotidiques et protéiques de HMGB2 de différentes espèces de Plasmodium qui ont été séquencés à ce jour. Espèces Gène hmgb2 Protéine HMGB2 Plasmodium falciparum 3D7 XM_001349310 XP_001349346 (SEQ (SEQ ID No.l) ID No.2) Plasmodium vivax Sal-1 XM_001614943.1 XP_001614993.1 (SEQ (SEQ ID No.3) ID No.4) Plasmodium berghei str. ANKA XM_667771 (SEQ XP_672863 (SEQ ID ID No.5) No.6) Plasmodium knowlesi XM_002258117 XP_002258153 (SEQ (SEQ ID No.7) ID No.8) Plasmodium yoelii XM_722771 (SEQ XP_727864 (SEQ ID ID No.9) No.10) Les gènes hmgb2 des espèces de Plasmodium non encore séquencées sont 20 aisément identifiables par des méthodes bien connues de l'homme du métier, notamment par hybridation ou PCR.

Dans le parasite selon l'invention, la fonction d'un ou plusieurs gènes, autres que hmgb2, peut également être inactivée. Le gène additionnel dont la fonction est inactivée, peut être un gène participant à la survie du parasite chez un hôte mammifère, en particulier chez l'homme. De préférence, l'inactivation de ce gène additionnel permet d'atténuer la virulence du parasite tout en préservant son caractère immunogène. Ce gène additionnel peut être choisi dans le groupe constitué de la purine nucléoside phosphorylase (PNP; PFE0660c), le transporteur de nucléoside 1 (NT1; PF13_0252), UIS3 (PF13_0012), UIS4 (PF10_0164 transcrit précoce), p52 (PFD0215c protéine avec motif à 6 cystéines) et p36 (PFD0210c), ainsi que les combinaisons de ceux-ci (les références entre parenthèse sont les numéros d'entrée de la banque PlasmoDB des séquences de Plasmodium falciparum 3D7, données ici à titre d'exemple). Les méthodes pour cultiver les parasites selon l'invention ainsi que les méthodes de préservation, en particulier de cryopréservation, des parasites ont été précédemment décrites et sont bien connues de l'homme du métier (voir par exemple Leef et al., 1979; Orjih et al., 1980). Ces parasites peuvent être cultivés ex vivo à l'aide de cultures cellulaires ou in vivo chez un animal, par exemple une souris. Selon un mode de réalisation, les parasites selon l'invention sont utilisés sous une forme érythrocytaire, plus particulièrement sous forme de mérozoïtes, de trophozoïtes ou de schizontes intra-érythrocytaires. Les globules rouges parasités peuvent être obtenus par introduction du parasite chez un hôte, de préférence un humain, et récupération des globules rouges de l'hôte infecté lorsque la parasitémie atteint au minimum 1 %, de préférence entre 5 et 10 %. Selon un mode de réalisation préféré, les globules rouges parasités sont récupérés à partir d'un hôte humain du groupe sanguin O et de Rhésus négatif. Des anti-coagulants, tels que l'héparine, peuvent être ajoutés aux globules rouges ainsi prélevés. Les globules rouges parasités peuvent être conservés par congélation en présence d'un ou plusieurs cryoprotecteurs compatibles avec une utilisation in vivo, tels que par exemple le glycérol ou le diméthylsulfoxyde (DMSO). Les globules rouges parasités peuvent également être conservés par réfrigération à 4°C dans un milieu de conservation adapté, par exemple du milieu SAGM (« Saline Adénine Glucose Mannitol ») ou une solution CPD (Citrate Phosphate Dextrose), mais pour une durée n'excédant pas environ 45 jours. Selon un autre mode de réalisation, les parasites selon l'invention sont utilisés sous la forme de sporozoïtes. Les sporozoïtes peuvent être obtenus par introduction du parasite dans un hôte moustique où il va se multiplier. Les sporozoïtes sont alors récupérés à partir des glandes salivaires des moustiques infectés. Les sporozoïtes ainsi obtenus peuvent être conservés par congélation, par exemple dans l'azote liquide, avant d'être décongelés pour être injectés vivants dans un hôte. De manière alternative, après récupération à partir des glandes salivaires des moustiques, les sporozoïtes peuvent être conservés par lyophilisation ou réfrigération avant administration. L'administration du parasite selon l'invention chez un sujet permet, malgré une clairance parasitaire rapide, d'induire chez le sujet une immunité de plusieurs mois vis-à-vis d'une infection par un Plasmodium. Cette immunité peut notamment être une immunité croisée vis-à-vis d'une infection par une souche de Plasmodium différente de celle du parasite utilisé. En particulier, l'administration d'un parasite selon l'invention appartenant à une souche ne provoquant pas de neuropaludisme peut aboutir à une immunité croisée vis-à-vis d'une infection par une souche de Plasmodium capable de provoquer cette complication neurologique sévère. Le parasite selon l'invention peut donc être utilisé pour la prévention du paludisme ou du neuropaludisme. Le terme «prévention » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une absence de symptômes ou à la présence de symptômes atténués de la maladie après contact avec le parasite. En particulier, le terme « prévention du paludisme » se réfère à une absence de symptômes ou à la présence de symptômes atténués chez le sujet traité après contact avec un Plasmodium responsable du paludisme. Le terme «prévention du neuropaludisme » se réfère à une absence de symptômes ou à la présence de symptômes atténués chez le sujet traité après contact avec un Plasmodium responsable du paludisme et capable d'induire un neuropaludisme. Ce terme peut également se référer à l'absence de développement d'un neuropaludisme ou au développement d'un neuropaludisme peu sévère ou atténué chez un sujet infecté par un Plasmodium responsable du paludisme et capable d'induire un neuropaludisme.

Dans un second aspect, la présente invention concerne une composition immunogène comprenant une quantité immunologiquement efficace d'un parasite selon l'invention, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables. Le parasite compris dans la composition est tel que décrit ci-dessus. Selon un mode de réalisation, la composition comprend un parasite selon l'invention sous une forme érythrocytaire, plus particulièrement sous la forme de mérozoïtes, de trophozoïtes ou de schizontes intra-érythrocytaires. Selon un mode particulier de réalisation, la composition comprend des globules rouges parasités avec le parasite selon l'invention et qui peuvent être obtenus selon la méthode décrite ci-dessus et dans la partie expérimentale.

Selon un autre mode de réalisation, le parasite compris dans la composition est sous la forme de sporozoïtes tels que décrits ci-dessus. La composition immunogène est capable d'induire chez le sujet auquel elle est administrée, une réponse du système immunitaire à l'encontre du parasite qu'elle contient. Le terme « quantité immunologiquement efficace » tel qu'utilisé ici, se réfère à une quantité de parasites qui est suffisante pour déclencher une réponse immunitaire chez le sujet. De préférence, la composition immunogène est un vaccin contre le paludisme. Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention est obtenue en mettant en suspension des globules rouges parasités ou des sporozoïtes tels que définis ci-dessus, dans un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. Ces excipients peuvent notamment être choisis dans le groupe constitué d'eau stérile, de sérum physiologique stérile et de tampon phosphate. D'autres excipients bien connus de l'homme du métier peuvent également être utilisés. De préférence, dans le cas où la composition comprend des globules rouges parasités, l'excipient utilisé sera une solution isotonique assurant l'intégrité des globules rouges jusqu'à l'administration de la composition au sujet. La composition peut également être obtenue en mélangeant des sporozoïtes de parasites tels que définis ci-dessus, avec un support pharmaceutiquement acceptable tel que, par exemple, des liposomes.

Les excipients ou supports utilisés devront être choisis de façon à permettre d'assurer l'intégrité des globules rouges parasités ou la survie des sporozoïtes, Les excipients ou supports utilisés devront être choisis de sorte à assurer la survie des parasites de l'invention, quelle que soit la forme utilisée (sporozoïtes ou formes intraérythrocytaires), jusqu'à l'administration de la composition au sujet à immuniser.

Selon un mode de réalisation préféré, le sujet à immuniser est un mammifère, de préférence un humain. La composition selon l'invention peut être administrée, par exemple, par voie parentérale, cutanée, muqueuse, trans-muqueuse ou épidermique. De préférence, la composition est formulée pour être administrée par voie parentérale, par exemple par voie sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse ou intradermique. Selon un mode de réalisation particulier, le parasite est sous une forme érythrocytaire, de préférence compris dans des globules rouges, et la composition est 5 formulée pour être administrée par voie parentérale. Selon un autre mode de réalisation particulier, le parasite est sous forme de sporozoïtes et la composition est formulée pour être administrée par voie intramusculaire. Les méthodes d'administration de compositions comprenant des sporozoïtes vivants sont bien connues de l'homme du métier (voir par exemple la 10 demande internationale de brevet WO 2004/045559). Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend entre 100 et 106 globules rouges parasités (GRP) par unité de dose, de préférence entre 100 et 105 GRP, de manière particulièrement préférée entre 100 et 104 GRP par unité de dose. Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend 15 entre 103 et 107 sporozoïtes par unité de dose, de préférence entre 104 et 105 sporozoïtes par unité de dose. La dose à administrer peut être aisément déterminée par l'homme du métier en tenant compte des données physiologiques du sujet à immuniser telles que son âge ou son état immunitaire, du degré d'immunité recherché et du nombre de doses 20 administrées. La composition selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs souches de parasites selon l'invention. Selon un mode de réalisation, la composition comprend au moins une souche de Plasmodium falciparum et une souche de Plasmodium vivax dans lesquelles la fonction du gène hmgb2 est inactivée. 25 La composition selon l'invention peut également comprendre d'autres parasites génétiquement atténués. Ces parasites peuvent, par exemple, présenter un altération ou une inactivation de la fonction du gène de la purine nucléoside phosphorylase, du transporteur de nucléoside 1, UIS3, UIS4, p52 ou p36, ou être des parasites atténués obtenus par irradiation. 30 La composition selon l'invention peut également comprendre un ou plusieurs adjuvants immunologiques qui stimulent le système immunitaire et renforcent ainsi la réponse immunitaire obtenue vis-à-vis du parasite selon l'invention. Ces adjuvants immunologiques comprennent, sans y être limités, des adjuvants de type muramylpeptide tels que la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP) et ses dérivés ; le tréhalose dimycolate (TDM) ; le lipopolysaccharide (LPS) ; le monophosphoryl lipide A (MPL) ; la carboxy-méthylcellulose ; l'adjuvant complet de Freund ; l'adjuvant incomplet de Freund ; des adjuvants de type émulsions «huile dans eau » éventuellement additionnés de squalène ou squalane ; les adjuvants minéraux tels que l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium, de potassium ou de calcium ; des toxines bactériennes telles que la sous-unité B de la toxine cholérique, la forme inactivée de la toxine pertussique ou la lymphotoxine thermolabile d'Escherichia coli ; des oligodésoxynucléotides CpG ; des saponines; des copolymères synthétiques tels que des copolymères de polyoxyéthylène (POE) et polyoxypropylène (POP); des cytokines ; ou des imidazoquinolones. Des combinaisons d'adjuvants peuvent être utilisées. Ces différents types d'adjuvants sont bien connus de l'homme du métier.

Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un parasite vivant appartenant au genre Plasmodium dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée pour la préparation d'une composition vaccinale contre le paludisme ou le neuropaludisme. L'invention concerne également une méthode pour produire une composition vaccinale contre le paludisme ou le neuropaludisme.

Selon un mode de réalisation, la méthode comprend l'étape consistant à mélanger des globules rouges parasités avec un parasite vivant selon l'invention, avec un excipient ou support pharmaceutiquement acceptable. Selon un autre mode de réalisation, la méthode comprend l'étape consistant à mélanger des sporozoïtes vivants d'un parasite selon l'invention avec un excipient ou 25 support pharmaceutiquement acceptable. La méthode peut en outre comprendre une étape préalable comprenant l'obtention desdits globules rouges parasités ou desdits sporozoïtes, par exemple à l'aide des méthodes décrites ci-dessus. La composition ou le vaccin obtenu peut être conservé avant administration, par 30 exemple congelé ou réfrigéré s'il contient des globules rouges parasités, ou congelé, réfrigéré ou lyophilisé s'il contient des sporozoïtes. De préférence, la composition ou le vaccin obtenu est conservé congelé avant administration. Dans le cas d'une lyophilisation, un diluant approprié sera ajouté au lyophilisat avant administration, de préférence de l'eau stérile ou du sérum physiologique stérile. Les différents modes de réalisation concernant le parasite et la composition selon l'invention sont également envisagés dans cet aspect.

Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour immuniser un sujet contre le paludisme, comprenant l'administration d'une composition immunogène ou d'un vaccin selon l'invention audit sujet. De préférence, le sujet est un mammifère, plus particulièrement un humain.

Selon un mode de réalisation préférée, la méthode comprend l'administration d'un vaccin selon l'invention audit sujet. Selon un mode de réalisation, la méthode comprend l'administration d'une dose unique de la composition immunogène ou du vaccin selon l'invention. Selon un autre mode de réalisation, la méthode comprend l'administration d'une pluralité de doses de la composition immunogène ou du vaccin selon l'invention. L'immunisation du sujet peut être obtenue après l'administration de 2 à 6 doses. De préférence, un délai d'environ 6 à 8 semaines est observé entre chaque administration. Les inventeurs ont démontré que l'administration d'une seule dose comprenant 105 globules rouges parasités avec un parasite selon l'invention permettait d'obtenir une immunité stérile d'au moins 6 mois chez un mammifère. Selon un mode préféré de réalisation, la méthode comprend l'administration d'une première dose de la composition immunogène ou du vaccin selon l'invention suivi de l'administration d'une seconde dose environ six mois à un an plus tard. De préférence, les doses comprennent entre 100 et 106 globules rouges parasités ou entre 103 et 10' sporozoïtes. Selon un mode de réalisation préférée, les doses comprennent environ 103 globules rouges parasités. L'immunité du sujet vis-à-vis du paludisme ou du neuropaludisme peut être totale ou incomplète. Dans le cas d'une immunité incomplète, la gravité des symptômes de la maladie déclarée chez un sujet immunisé sera réduite par comparaison à ceux observés chez un sujet non immunisé. Selon un mode de réalisation préféré, l'immunité obtenue par administration de la composition selon l'invention est une immunité stérile. Cela signifie que le développement des parasites administrés est très altéré et qu'environ 2 à 4 semaines après l'administration, les parasites ne sont plus détectés dans le sang du sujet. Les exemples qui suivent sont présentés dans un but illustratif et non limitatif. Exemples En étudiant la fonction des protéines HMGB, les inventeurs ont récemment montré que la protéine HMGB2 de P. berghei est impliquée dans l'établissement du neuropaludisme expérimental (NPE) dans un modèle de souris C57B1/6 infectées par le parasite de P. berghei ANKA (PbANKA). L'inactivation du gène hmgb2 chez PbANKA, sans entraver le développement du parasite chez les souris C57B1/6, induit néanmoins un retard dans l'établissement du NPE voire son abolition complète dans 65% des cas. De plus, il a été montré que l'administration de protéines recombinantes HMGB2 à des souris préalablement infectées par PbANKA Ohmgb2 permettait de restaurer le développement du neuropaludisme. Matériels et méthodes Souris Les souris utilisées sont des souris C57BL/6 (Charles River Laboratories). Ces souris sont sensibles au neuropaludisme expérimental (NP-S). Parasites sauvages Le parasite P. berghei ANKA (PbANKA) (MRA-867) induit la mort de souris C57BL/6 20 par neuropaludisme en 7 jours +/- 1. Ce parasite possède une étiquette GFP sous le contrôle du promoteur eefl (Thaty and Ménard, 2002). Le parasite P. berghei NK65 (PbNK65) (MRA-268) (de Sa et al. 2009) induit la mort des souris C57BL/6 par hyper-parasitémie en 20 à 25 jours après infection. En revanche, ce parasite ne provoque pas de neuropaludisme. 25 Obtention du parasite PbNK65 Ohmgb2 Construction du vecteur de clonage: les régions qui flanquent la phase ouverte de lecture en 5'UTR et 3'UTR du gène hmgb2, respectivement nommées ci-dessous RH1 et RH2 (et d'une longueur d'environ 500 pb), ont été amplifiées à l'aide d'amorces spécifiques, par PCR à partir de l'ADN génomique du parasite PbNK65 (Tableau 2) clonées dans le vecteur pCR~II-TOPO (Invitrogen). Des bactéries Escherichia coli One Shot® TOP10 électro-compétentes ont ensuite été transformées avec ces constructions et sélectionnées sur milieu LB contenant de l'ampicilline et de la kanamycine. Tableau 2 : Amorces d'amplification des régions d'homologies RH1 et RH2 RH1 sens 5'CGATGCGGGCCCAAAAAGGTAAATATGAAAAAGAAAG GTT3' (SEQ ID No : 11) RH1 anti- sens 5'CGATGCCCCGGGTTTGCAATGGAAACATATCAGTT3' (SEQ ID No : 12) RH2 sens 5'CCAGTGAGTGCGGCCGCGGAGCCTTTTGTATGTGCTTTT TG3' (SEQ ID No : 13) RH2 anti- sens 5' AGCTGGCGCGCCAAGTATTGCAGTAGCATTTTCTTTAAA T3' (SEQ ID No : 14) Les amorces servant à l'amplification ont été dessinées de sorte à adjoindre pour - RH1 : un site de restriction ApaI en 5' UTR et un site de restriction SmaI en 3'UTR, et - RH2 : un site de restriction NotI en 5' UTR et un site de restriction AscI en 3'UTR de la séquence. Ces sites de restrictions permettent l'insertion des fragments 10 PCR dans le vecteur. Les régions 5' et 3' non traduites RH1 et RH2 ont ensuite été insérées dans un vecteur pBC SK-Hudhfr (Stratagene) contenant le gène de la dihydrofolate réductase humaine (hudhfr) sous le contrôle du promoteur efla en 5'UTR et de la dhfr/ts (dhfr/thymidilate synthase) en 3'UTR. RH1 a été insérée en 5'UTR de la cassette 15 Hudhfr et RH2 en 3'UTR. Lors de la recombinaison homologue, les 2 régions RH1 et RH2 se sont appariées avec les séquences complémentaires du gène hmgb2 dans le génome de P. berghei, permettre une double recombinaison homologue au niveau de ce gène et, de ce fait, sa délétion. La Hudhfr confère la résistance à la pyriméthamine et les parasites mutants ont été sélectionnés à l' aide de cette drogue. 20 Transfection des parasites et sélection des parasites mutants: les mérozoïtes de P. berghei ont été transfectés en suivant le protocole décrit par de Koning-Ward et al, 2000. Toutes les infections ont été réalisées par injection intra veineuse. Deux souris Swiss de 3 semaines ont été infectées avec 2,6.106 GRPs PbANKA ou PbNK65. Lorsque la parasitémie atteignait entre 2 et 3 % (stades jeunes majoritaires), le sang a été prélevé sous héparine par ponction intra cardiaque (1,5 à 2 ml de sang). Le sang a été lavé brièvement dans 5 ml de milieu de culture complet constitué de 4 vol de RPMI 1640 (Invitrogen) additionné de 1 vol de sérum de veau foetal (InVitrogen). Après centrifugation 8 min à 450 g, les GRPs ont été repris dans 50 ml de milieu de culture complet. La suspension cellulaire, à laquelle ont été ajoutés 50 ml supplémentaires de milieu de culture complet, a alors été mise en culture toute la nuit, dans un Erlen Meyer de 500 ml, à 36,5 °C, sous agitation à 70 rpm et sous une pression de 1,5 à 2 bars. Le lendemain, après vérification par frottis de la présence majoritaire de schizontes matures la culture de GRPs a été centrifugée 10 min à 1500 rpm puis le culot a été repris dans 35 ml de milieu de culture complet dans un tube à fond conique de 50 ml. Dix millilitres de Nycodenz 50 % (Lucron Bioproducts, dilution dans du PBS 1 X) ont ensuite été tout doucement additionnés à la culture de GRPs de manière à créer un gradient de densité au fond du tube. Vingt minutes de centrifugation à 450 g, TA, sans frein, ont entraîné la purification des GRPs qui forment alors un anneau brun au milieu du tube. L'anneau brun de GRPs a été prélevé (-20 ml) puis lavé avec 20 ml de milieu de culture complet. Après 8 min de centrifugation à 450 g, le culot de schizontes matures a été finalement repris dans 3 ml de milieu de culture complet qui ont ensuite été distribués dans 3 tubes Eppendorf de 1,5 ml. Cette opération a du être réalisée de manière très délicate car les schizontes sont fragiles. À cette étape, la quantité de schizontes obtenus a été suffisante pour réaliser jusqu'à 10 transfections indépendantes. Après un dernier «spin» 5 sec à 16000 g, le culot de schizontes dans chaque tube a été alors repris dans 100 µl du tampon d'électroporation (Nucleofector Solution 88A6, AMAXA) avec 5 µg de chacune des constructions plasmidiques obtenues (pBC- 5'RH1Hudhfr3'RH2 pour pbhmgbl ou pbhmgb2), digérées au préalable par ApaI et AscI. Les parasites ont été transfectés en utilisant le programme U33 de l'électroporateur, Nucleofector AMAXA. Le choc électrique induit la rupture de la membrane des schizontes matures et les mérozoïtes ainsi libérés peuvent internaliser les plasmides linéarisés. Cinquante microlitres de milieu de culture complet ont été additionnés tout de suite au contenu de la cuvette et deux souris Swiss de 3 semaines ont été immédiatement infectées avec 100 µl, chacune, de mérozoïtes transfectés. À J1 après l'infection, la drogue de sélection, la pyriméthamine a été administrée dans l'eau de boisson et des frottis ont été réalisés tous les jours. La solution de pyriméthamine a été préparée de la manière suivante: 70 mg de pyriméthamine (Sigma Aldrich), 10 ml DMSO, qsp 1 L eau, pH 3,5-5,5. Lorsque les souris sont devenues positives pour la présence de parasites (environ J6 après l'infection) et que la parasitémie a atteint entre 2 et 10 %, leur sang a été prélevé par ponction intra cardiaque.

Conditions de culture des parasites et inoculation Les souris C57BL/6 ont été infectées, en intra-péritonéale avec 200 µl chacune, d'une ampoule contenant 10' GRPs/200 pl. Lorsque la parasitémie a atteint entre 1 et 5 % (5-6 jours après infection), environ 100 µl de sang ont été prélevés à la joue de l'animal dans un tube contenant de l'héparine. Ce sang a été lavé 2 fois avec 1 ml de PBS froid et centrifugé 5 min à 3800 rpm. Après dilution au 1/1000 et comptage des cellules, les souris C57BL/6 ont été infectées avec 105 GRPs. Mesure de la parasitémie La parasitémie est analysée par comptage au microscope des globules rouges parasités (GRP) dans des frottis colorés.

Préparations des globules rouges parasités et congélation des GRP Les souris C57BL/6 sont infectées, en intra-péritonéale avec 200 µl chacune, d'une ampoule contenant 10' GRPs/200 µl. Deux types de stocks de parasites sont réalisés. Stabilats: le sang est prélevé chez des souris infectées, par ponction intracardiaque (animal anesthésié) lorsque la parasitémie atteint entre 3 et 10 % (5 à 6 jours après infection à l'aide de 107 globules rouges parasités) dans un tube contenant de l'héparine et toujours conservé dans la glace jusqu'à la congélation dans l'azote liquide dans le mélange cryopréservant suivant: 1 vol Glycérol pur (Sigma Aldrich) + 9 vol d'Alsever's Solution (Sigma Aldrich). Les stabilats sont réalisés avec 1 vol du sang prélevé auquel sont additionnés 2 vol du mélange cryopréservant. Les parties aliquotes sont congelées dans l'azote liquide (environ 3001a.1 par souris) et conservés ensuite à -80 °C. Ampoules: comme précédemment, le sang est prélevé par ponction intracardiaque mais, lorsque la parasitémie atteint entre 1 et 5 %. Ce sang est lavé plusieurs fois avec du PBS froid et centrifugé 5 min à 3800 rpm. Puis des ampoules de 107 GRPs/200 µl sont réalisées dans un mélange cryopréservant voir paragraphe précédent après comptage du nombre des globules rouges parasités. Résultats Rôle de la protéine HMGB2 dans le développement du parasite PbNK65 Les inventeurs ont démontré que l'inactivation du gène hmgb2 entravait le développement de PbNK65 Ahmgb2 dans la souris C57B1/6 (NP-S) avec une clairance du parasite 10 à 15 jours après l'infection (J10-J15) en fonction de la dose infectante de parasites. La figure 1 représente la moyenne de 3 expériences (souris n=5 par expérience) au cours desquelles les souris C57B1/6 ont été infectées à l'aide de globules rouges parasités avec PbNK65 sauvage ou PbNK65 Ahmgb2. Cette clairance du parasite muté a été observée environ 15 jours après infection. Le parasite muté n'était plus détecté dans les frottis sanguins alors que le développement du parasite sauvage se poursuivait jusqu'à la mort par hyper-parasitémie environ 25 jours après infection. En effet, alors que le parasite sauvage continue à se développer, l'infection avec PbNK65 Ahmgb2 induit une réponse immunitaire chez la souris C57B1/6 qui altère le développement de ce parasite. Plusieurs clones mutés indépendants ont été obtenus montrant la même cinétique de clairance lors de leur développement dans les souris C57B1/6. Protection stérile induite par une primo-infection avec PbNK65 Ahmgb2 Plusieurs expériences ont été réalisées avec de une à trois épreuves d'infection successives dans des souris C57B1/6 primo-infectées avec le parasite muté PbNK65 Ahmgb2 (105 GRP par voie intrapéritonéale ou intraveineuse). Lorsque le parasite n'était plus détecté dans le sang des souris C57B1/6 (vers J19), les inventeurs procédaient à la première épreuve d'infection (J19), puis la seconde à J71 et la troisième à J162 avec deux parasites sauvages hautement pathogènes: 1. le parasite homologue sauvage PbNK65 conduisant à la mort des souris par hyperparasitémie et 2. le parasite hétérologue PbANKA sauvage qui induit la mort des souris par neuropaludisme.

La figure 2 présente les résultats d'une expérience avec trois épreuves d'infection successives. Toutes les souris primo-infectées avec PbNK65 Ahmgb2 ont survécu aux trois épreuves d'infection avec maintien d'une protection stérile pendant au moins 7 mois. A chaque épreuve, les inventeurs ont vérifié que le développement du parasite sauvage PbNK65 dans les souris naïves se poursuit jusqu'à environ 25 jours où les souris commencent à mourir d'hyper-parasitémie et que le développement du parasite PbANKA sauvage dans les souris naïves se poursuit jusqu'à environ 7 jours où les souris meurent de neuropaludisme (les témoins de la pathogénicité des parasites et de l'âge des souris). Afin de déterminer la plus petite dose de globules rouges infectés par PbNK65 Ohmgb2 nécessaire et suffisante pour promouvoir la protection stérile, des épreuves d'infection ont été menées sur des souris primo-infectées avec 105 à 10' GRP. Ces expériences ont montré que l'injection de seulement 100 GRP permettait d'induire une protection stérile lors d'une épreuve d'infection menée par injection intraveineuse de 105 GRP de PbNK65 ou PbANKA sauvage. Conclusion Ces résultats montrent qu'une immunité stérile (les parasites ne sont plus détectés dans le sang périphérique) peut être induite après une primo-infection avec le parasite PbNK65 Ohmgb2, Cette protection s'étend non seulement au parasite homologue sauvage PbNK65 mais également au parasite hétérologue PbANKA capable d'induire un neuropaludisme.

Références bibliographiques Aly et al. Cell Microbiol.

2010 Ju1;12(7):930-8, Briquet et al. Eukaryotic Cell, 2006, 5: 672-82, de Koning-Ward et al. Annu Rev Microbiol, 2000. 54: 157-85, De Sa et al. Parasitology Research, 2009, 105: 275-279, Gissot et al. J Mol Biol. 2005, 346(1):29-42, Kumar et al. Parasitology International, 2008, 57: 150-157, Leef et al. Bull World Health Organ. 1979;57 Suppl 1:87-91, McRobert and McConkey. Mol Biochem Parasitol.

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Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Parasite vivant appartenant au genre Plasmodium dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée pour une utilisation dans la prévention du paludisme ou du 5 neuropaludisme chez un mammifère.
2. 2. Parasite selon la revendication 1, dans lequel la souche du parasite est sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi.
3. 3. Parasite selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la souche du parasite est sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale et Plasmodium malariae. 15
4. 4. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le parasite sous sa forme sauvage ne provoque pas de neuropaludisme.
5. 5. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 4, dans lequel la souche du parasite est Plasmodium berghei NK65.
6. 6. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la souche du parasite est une souche de Plasmodium falciparum ayant perdu sa capacité de cytoadhérence. 25
7. 7. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le parasite est sous une forme intra-érythrocytaire.
8. 8. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le parasite est sous la forme de sporozoïtes.
9. 9. Composition immunogène comprenant, en tant qu'immunogène, une quantité immunologiquement efficace d'un parasite tel que défini dans l'une quelconque des 22 10 20 30revendications 1 à 8, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables.
10. 10. Vaccin contre le paludisme comprenant, en tant qu'immunogène, un parasite tel que 5 défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables.
11. 11. Composition immunogène selon la revendication 9 ou vaccin selon la revendication 10 comprenant en outre un ou plusieurs adjuvants immunologiques.
12. 12. Composition immunogène selon la revendication 9 ou 11 ou vaccin selon la revendication 10 ou 11, formulé pour être administré par voie parentérale.
13. 13. Composition immunogène ou vaccin selon la revendication 12, comprenant entre 15 10' et 106 parasites tels que définis dans la revendication 7, par unité de dose.
14. 14. Composition immunogène ou vaccin selon la revendication 12, comprenant entre 103 et 10' parasites tels que définis dans la revendication 8, par unité de dose. 20
15. 15. Utilisation d'un parasite tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la préparation d'une composition vaccinale contre le paludisme ou le neuropaludisme. 10