EP2945648A1 - Vaccins contre le paludisme gestationnel - Google Patents

Vaccins contre le paludisme gestationnel

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Publication number
EP2945648A1
EP2945648A1 EP14701072.2A EP14701072A EP2945648A1 EP 2945648 A1 EP2945648 A1 EP 2945648A1 EP 14701072 A EP14701072 A EP 14701072A EP 2945648 A1 EP2945648 A1 EP 2945648A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
idl
sequence
protein
seq
var2csa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP14701072.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicaise Tuikue Ndam
Philippe Deloron
Justin DORITCHAMOU
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Original Assignee
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut de Recherche pour le Developpement IRD filed Critical Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Publication of EP2945648A1 publication Critical patent/EP2945648A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the use of combinations of specific regions of the N-terminal portion of the VAR2CSA protein from different families or parasitic lines of Plasmodium jalciparum in the prevention and / or treatment of gestational malaria.
  • Malaria (or malaria) is the most common parasitic infection observed in the world. It is due to a parasite of the genus Plasmodium, which is transmitted during the bite by a female mosquito (Anopheles). Several species of Plasmodium can infect humans, but Plasmodium jalciparum is the most common and pathogenic species and the one responsible for fatal cases. Once introduced into the bloodstream, the parasite infects liver cells, in which it proliferates, before circulating again in the blood and invading red blood cells (erythrocytes or red blood cells). Malaria affects some 100 countries worldwide, particularly in the less-favored tropical areas of Africa, Asia and Latin America; Africa being by far the most affected continent.
  • malaria infection can cause a range of adverse effects: spontaneous abortion, premature delivery, low birth weight, congenital transmission, and neonatal death. In areas of Africa where malaria is endemic, 3 to 5% of infant deaths at birth can be attributed to gestational malaria. In addition, it also presents a real danger for the mother who can suffer from anemia sometimes severe or even fatal.
  • sulfadoxine-pyrimethamine Cot et al, Br Med Med, 2003, 67: 137-148.
  • the erythrocytes are then able to attach to the inner wall of the blood vessels, thereby preventing the transport of infected erythrocytes to the purifying organs of the immune system, one of whose roles is to destroy the cells recognized as abnormal.
  • parasitized erythrocytes attach to a sugar, chondroitin sulfate A (CSA), present in the placenta.
  • CSA chondroitin sulfate A
  • women acquire protective antibodies that block this adhesion.
  • One of the vaccine strategies is to recreate this protective immunity by blocking the adhesion of infected erythrocytes to the placenta.
  • the protein VAR2CSA one of the proteins of the PfEMP1 family, is currently the subject of much research with a view to obtaining a specific vaccine for pregnant women (Tuikue Ndam et al., J. Infect Dis., 2005, 192: 331-335, Chia et al., J. Infect Dis., 2005, 192: 1284-1293, Tuikue Ndam et al, J.
  • the present inventors have previously identified the N-terminal region of VAR2CSA, and in particular the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region consisting of the DBLlx domain, Interdomain Idl, and the DBL2x domain, as being that which contains epitopes capable of inducing antibodies blocking the adhesion of Plasmodium falciparum-infected red cells to the CSA, and the Idl-DBL2x subregion as the minimal antigenic region of VAR2CSA involved in the acquisition of protective immunity to placental sequestration that occurs in gestational malaria (WO 2012/014073).
  • the inventors By analyzing the sequences of parasitic isolates from pregnant to benign women, the inventors also demonstrated a segregation of parasitic variants in interdomain ID1 of VAR2CSA. This new area of dichotomy has never been described so far.
  • the sequence alignments led to the establishment of two consensus sequences representative of the Idl interdomain of VAR2CSA: the first Idl A (or SEQ ID NO: 11) corresponds to a newly identified cluster, and the second IdlB (or SEQ ID NO: 12) corresponds to the other group of sequences (which include the FCR3 line and the 3D7 line).
  • a first aspect of the present invention relates to the use of combinations of polypeptide sequences or polynucleotides corresponding to the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein from different Plasmodium parasitic families. falciparum, in the management of malaria of the pregnant woman.
  • the present invention relates to the use of isolated or purified polypeptide or polynucleotide sequences corresponding to the NTS-region.
  • the present invention relates to a combination of at least two polypeptides isolated or purified for use in the treatment or prevention of gestational malaria, the first isolated or purified polypeptide consisting of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of a first parasitic family of Plasmodium jalciparum, and the second isolated or purified polypeptide consisting of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of a second Parasitic family of Plasmodium jalciparum, for use in the treatment or prevention of gestational malaria.
  • the first family is the Plasmodium jalciparum parasitic family, the VAR2CSA protein of which is characterized by an interdomain Id1 which has the sequence sequence SEQ ID NO: 11 or which is encoded by the consensus nucleic sequence SEQ ID NO: 13, and the second family is the parasitic family of Plasmodium jalciparum whose VAR2CSA protein is characterized by an interdomain Id1 which has for sequence the consensus sequence SEQ ID NO: 12 or which is encoded by the consensus nucleic sequence SEQ ID NO: 14.
  • the second parasitic family of Plasmodium jalciparum comprises the parasitic line FCR3 and the parasitic line 3D7.
  • a combination according to the invention is characterized in that it consists of three isolated or purified polypeptides, the first isolated or purified polypeptide consisting of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the Plasmodium falciparum parasite family, the VAR2CSA protein of which is characterized by an Idl interdomain which is sequenced by the SEQ consensus sequence ID NO: 11 or which is encoded by the consensus nucleic acid sequence SEQ ID NO 13, the second isolated or purified polypeptide consisting of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the FCR3 line, and the isolated or purified third polypeptide consisting of the NTS-DBL1x-Id1-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the 3D7 line.
  • the NTS-DBL1x-Id1-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the FCR3 line has the sequence SEQ ID NO: 1 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 1, and the NTS-DBLlx-Idl region.
  • -DBL2x of the VAR2CSA protein of line 3D7 has the sequence SEQ ID NO: 5 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 5.
  • VAR2CSA of the FCR3 line has the sequence SEQ ID NO: 3 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 3
  • the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the 3D7 line has the sequence SEQ ID NO: 7 or a homologous sequence
  • the present invention also relates to a combination of at least two isolated or purified fusion proteins for use in the treatment or prevention of gestational malaria, wherein the combination corresponds to a combination of at least two isolated or purified polypeptides as described herein wherein each of the polypeptides is fused to a fusion partner sequence.
  • each of the fusion partner sequences is independently selected from the group consisting of the maltose binding protein, the signal sequence of the maltose binding protein, an S-tag, glutathione-S-transferase, thioredoxin , ⁇ -galactosidase, streptavidin, dihydrofolate reductase, pelB signal sequence, ompA signal sequence, alkaline phosphatase signal sequence, green fluorescent protein, toxins, human growth hormone, interleukin -2 (IL-2), the granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), calcitonin, interferon-beta, interferon-alpha, glucagon-like peptide 1 (GLP-1), glucagon-like peptide 2 (GLP-2), PA toxin, parathyroid hormones (PTH (1-34) and PTH (1-84)), butyrylcholinesterase,
  • the invention also relates to a combination of at least two polynucleotides isolated or purified for use in the treatment or prevention of gestational malaria, wherein each of the isolated or purified polynucleotides encodes a polypeptide as defined above or for a fusion protein such as than previously defined. More specifically, the invention relates to a combination of at least two isolated or purified polynucleotides, the first isolated or purified polynucleotide encoding a first polypeptide consisting of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of the protein.
  • the first family is the Plasmodium jalciparum parasitic family, the VAR2CSA protein of which is characterized by an interdomain Id1 which has the sequence sequence SEQ ID NO: 11 or which is encoded by the consensus sequence SEQ ID NO: 13 and the second family is the parasitic family of Plasmodium jalciparum whose VAR2CSA protein is characterized by an interdomain Id1 which has for sequence the consensus sequence SEQ ID NO: 12 or which is encoded by the consensus sequence SEQ ID NO: 14.
  • the second parasitic family of Plasmodium jalciparum comprises the parasitic strain FCR3 and the parasitic line
  • the combination according to the invention consists of three isolated or purified polynucleotides, the first isolated or purified polynucleotide encoding a first polypeptide consisting of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the Plasmodium falciparum parasitic family, the VAR2CSA protein of which is characterized by an interdomain Id1 which has for sequence the consensus sequence SEQ ID NO: 11 or which is encoded by the consensus sequence SEQ ID NO: 13 or for a first protein of fusion comprising the first polypeptide, and containing the elements necessary for the expression of said first polypeptide or of said first fusion protein in vitro and / or in vivo; the second isolated or purified polynucleotide encoding a second polypeptide consist
  • the NTS-DBL1x-Id1-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the FCR3 line has the sequence SEQ ID NO: 1 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 1, and the NTS-DBLlx-Idl region.
  • -DBL2x of the VAR2CSA protein of the 3D7 line has the sequence SEQ ID NO: 5 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the FCR3 line has the sequence SEQ ID NO: 3 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 3
  • the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the Line 3D7 has the sequence SEQ ID NO: 7 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the isolated or purified second polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, a sequence homologous to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, a homologous sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, a homologous sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, and a homologous sequence of SEQ ID NO: 8.
  • a second and third isolated or purified polynucleotide is present in the second isolated or purified polynucleotide preferably comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, a homologous sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, a homologous sequence of SEQ ID NO: 4, and the third isolated or purified polynucleotide preferably comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, a sequence homologous to SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, and a homologous sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the invention relates to an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient and at least one combination of polypeptides or fusion proteins or polynucleotides according to the invention.
  • an immunogenic composition is characterized in that it is capable of inducing antibodies that totally inhibit the adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to the placental CSA (chondroitin sulfate A) receptor.
  • the invention also relates to vaccines against gestational malaria.
  • the invention provides a vaccine comprising at least one combination of polypeptides or fusion proteins according to the invention, or at least one combination of polynucleotides according to the invention.
  • the polynucleotides of the combination present in a vaccine are inserted into at least one plasmid.
  • the vaccines according to the invention are characterized in that they are capable of inducing antibodies which totally inhibit the adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes to the placental CSA receptor.
  • the vaccines described herein may further include an adjuvant.
  • the invention in another variant of this aspect, relates to methods of treating or preventing gestational malaria.
  • the invention provides a method for inducing a protective immune response against Plasmodium falciparum in a human female, the method comprising a step of administering an effective amount of a composition immunogen or vaccine described herein.
  • the invention also provides a method of vaccinating a female human against Plasmodium falciparum, the method comprising a step of administering an effective amount of a vaccine, particularly a DNA vaccine described herein or a protein vaccine described here.
  • Methods of treatment and prevention of gestational malaria are primarily aimed at pre-pubertal girls and women of childbearing age.
  • a method of treating or preventing gestational malaria is characterized in that it induces, in female humans, antibodies that prevent the adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to CSA placental receiver.
  • administration of the immunogenic composition or vaccine can be by any suitable route.
  • the invention in another aspect, relates to a gestational malaria vaccination kit comprising at least one combination, or at least one immunogenic composition or at least one vaccine according to the invention and instructions for performing a vaccination against gestational malaria.
  • the at least two polypeptides or at least two fusion proteins or at least two polynucleotides of the combination, immunogenic composition or vaccine are separately provided in the kit.
  • the present invention relates to the use of combinations of specific regions of the N-terminal portion of the VAR2CSA protein from different parasitic families of Plasmodium falciparum, in the prevention and / or treatment of gestational malaria. .
  • the present invention relates to combinations of at least two polynucleotides or at least two polypeptides derived from the N-terminal portion of the extracellular domain of VAR2CSA of NTS-DBLlx-Idl-DBL2x and Idl-DBL2x. different parasitic families of Plasmodium falciparum, as well as their applications in the management of gestational malaria.
  • the invention relates to combinations of at least two polynucleotides or at least two polypeptides derived from the N-terminal region of the extracellular domain of VAR2CSA from two parasitic families of Plasmodium falciparum demonstrated by the inventors, and of which the segregation takes place in interdomain Idl of VAR2CSA.
  • the first family which is a newly identified cluster is characterized by a VAR2CSA protein having an Idl interdomain having for sequence the consensus sequence SEQ ID NO: 11 or which is encoded by the consensus nucleic sequence SEQ ID NO: 13.
  • gaTTAtaTAAAGgaTgATCCTTATTCC gaTTAtaTAAAGgaTgATCCTTATTCC.
  • GTTCTTTTGGAACA TCgTtTTCTTATgAAAaTAGTgTAA ...
  • the second family which is a cluster including the FCR3 line and the line
  • 3F7 is characterized by a VAR2CSA protein having an Idl interdomain having for sequence the consensus sequence SEQ ID NO: 12 or which is encoded by the consensus nucleotide sequence SEQ ID NO: 14.
  • SEQ ID NO: 12 is characterized by a VAR2CSA protein having an Idl interdomain having for sequence the consensus sequence SEQ ID NO: 12 or which is encoded by the consensus nucleotide sequence SEQ ID NO: 14.
  • the second parasitic family of Plasmodium falciparum demonstrated by the inventors comprises the parasitic strain FCR3 and the parasitic line 3D7.
  • VAR2CSA has been isolated from several parasitic strains including FCR3 (GenBank Accession Number: AY372123) and 3D7 (GenBank Accession Number: AE014188.3) and sequenced.
  • the corresponding VAR2CSA protein has been deduced (GenBank Accession Number: AAQ73926.1 for the FCR3 line and GenBank Accession Number: AAN36095.1 for the 3D7 line).
  • isolated or purified refers to a polypeptide or polynucleotide which, by its origin or manipulation, is separated from at least some components with which it is naturally associated. Alternatively or additionally, by “isolated or purified” is meant a polypeptide or polynucleotide that is produced or synthesized by humans.
  • NPS-DBLlx-DBL2x and “NTS-DBLlx-Idl-DBL2x” are here used interchangeably.
  • VAR2CSA constituted by the domains: Duffy-binding-like domain lx (DBLlx), interdomain 1 (Idl) and Duffy-binding-like domain 2x (DBL2x).
  • DBLlx Duffy-binding-like domain lx
  • Idl interdomain 1
  • DBL2x Duffy-binding-like domain 2x
  • Idl-DBL2x refers to the VAR2CSA region consisting of interdomain 1 (Idl) and the Duffy-binding-like domain 2x (DBL2x).
  • the polypeptide of a combination according to the invention consisting of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the parasitic line FCR3 has the sequence SEQ ID NO: 1, a homologous sequence of the sequence SEQ ID NO: 1 or a modified sequence of the sequence SEQ ID NO: 1; and the polypeptide of a combination according to the invention consisting of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the 3D7 parasite line has the sequence SEQ ID NO: 5, a sequence homologous to the sequence SEQ ID NO: Or a modified sequence of the sequence SEQ ID NO: 5.
  • peptide protein
  • peptide sequence polypeptide sequence
  • polypeptide polypeptide
  • peptide sequence homologous to the sequence SEQ ID NO: X is meant any peptide sequence which differs from the sequence SEQ ID NO: X by substitution, deletion, and / or insertion of an amino acid or of a reduced number amino acid positions at positions such that these homologous peptide sequences have substantially the same biological properties as the NTS-DBL1x-Idl-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of VAR2CSA of the FCR3 line or the lineage 3D7.
  • a homologous peptide sequence has a percentage of identity such that it is at least 75% identical to the sequence SEQ ID NO: X, preferably at least 85%, more preferably at least 95%.
  • percentage of identity or “homology” between two nucleotide sequences or two peptide sequences, it is meant to designate a percentage of nucleotides or identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after optimal alignment. This percentage is purely statistical and the differences between the two sequences are randomly distributed over the entire length of the sequence.
  • optimal alignment and “best alignment”, which are used interchangeably herein, refer to the alignment for which the percent identity determined as described below is the highest.
  • the optimal alignment of the sequences necessary for comparison can be done manually or by means of computer software (GAP, BESTFIT, BLASTP, BLASTN, FASTA, and TFASTA, which are available either on the NCBI site or in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI).
  • the percentage of identity between two nucleotide sequences or two peptide sequences is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the number of identical positions. total of positions compared and multiplying the result by 100.
  • modified peptide sequence of the sequence SEQ ID NO: X is meant any polypeptide sequence which differs from SEQ ID NO: X by one or more modifications, such as, for example, post-translational cellular modifications (eg “editing” ", glycosylation, sulfation, etc.).
  • the present invention also relates to combinations of at least two fusion proteins for the treatment or prevention of gestational malaria, wherein each of the fusion proteins consists of an isolated or purified polypeptide as defined above fused to a given fusion partner sequence. .
  • fusion partner sequence is meant herein a peptide sequence which confers on the fusion protein one or more desirable properties.
  • a fusion partner sequence may consist of a protein that promotes the expression of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region or of the Idl-DBL2x region in the cell.
  • fusion protein eg comparison with a sequence corresponding to non-fused NTS-DBLlx-Idl-DBL2x or Idl-DBL2x, and / or to a protein that promotes the administration of the fusion protein to the vaccinated subject, and / or to a protein that increases the desired therapeutic effect (for example by increasing the immune and vaccine response) and / or a protein exhibiting biological or therapeutic activity.
  • Fusion partners that may be used in the context of the present invention include, without limitation, the maltose binding protein, the signal sequence of the maltose binding protein, poly-histidine segments capable of binding metal ions, an -Tag, glutathione-S-transferase, thioredoxin, ⁇ -galactosidase, streptavidin, dihydrofolate reductase, the pelB signal sequence, the ompA signal sequence, the alkaline phosphatase signal sequence, green fluorescent protein, a toxin such as for example enterotoxin LT of E.
  • fusion partners may be human growth hormone, an immunostimulatory cytokine such as: interleukin-2 (IL-2), a growth factor such as the granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), peptides or hormones such as calcitonin, interferon-beta, interferon-alpha, glucagon-like peptide 1 (GLP-1), glucagon-like peptide 2 (GLP-2), PA toxin, parathyroid hormone (PTH (1-34) and PTH (1-84)), butyrylcholinesterase, glucocerebrosidase (GBA), and exendin-4.
  • IL-2 interleukin-2
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • peptides or hormones such as calcitonin, interferon-beta, interferon-alpha,
  • the new cluster demonstrated by the present inventors is characterized by a VAR2CSA protein whose interdomain Id1 has as sequence the consensus sequence SEQ ID NO: 11 or is coded by the consensus sequence SEQ ID NO: 13.
  • the other cluster highlighted by the present inventors is characterized by a VAR2CSA protein whose interdomain Idl has as sequence the consensus sequence SEQ ID NO: 12 or is encoded by the consensus nucleotide sequence SEQ ID NO: 14.
  • Consensus sequence is meant an idealized sequence of a given region of a protein in which each position represents the amino acid met most frequently.
  • the consensus groups were established by comparison of real sequences.
  • the present invention also relates to combinations of at least two polynucleotides isolated or purified for use in the treatment or prevention of gestational malaria, wherein each of the isolated or purified polynucleotides encodes a polypeptide as defined above or for a fusion protein such as as defined above, and contains the elements necessary for the expression, in vitro and / or in vivo, of said polypeptide or of said fusion protein.
  • the invention relates to a combination of at least two polynucleotides, wherein each of the polynucleotides encodes a polypeptide consisting of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x region or the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of a lineage or parasitic family of Plasmodium falciparum given or for a fusion protein comprising said polypeptide, and wherein each of the isolated or purified polynucleotides contains the elements necessary for the expression of said polypeptide or said fusion protein in vitro or in vivo.
  • nucleotide sequence used interchangeably herein. By these terms is meant to designate a precise sequence of nucleotides, modified or not, for defining a region of a nucleic acid, and which may correspond to double-stranded DNA or single-stranded DNA as well as to transcription products. of these DNAs.
  • the elements necessary for the expression of a nucleotide sequence in vivo include, for example, a promoter, a transcription initiation region, and a transcription termination region that are functional in a mammalian cell, preferably a cell. human.
  • sequences that increase gene expression such as introns, enhancer sequences, and "leader" sequences, are often necessary for the expression of a coding sequence for an immunogenic protein.
  • these elements are preferably operably linked to the nucleotide sequence to be expressed.
  • the terms "operably linked” and “operably linked” are used interchangeably and refer to a functional link between the regulatory sequences and the nucleic acid sequence that they control.
  • promoters useful in the context of the present invention include, but are not limited to, promoters of SV40 virus, mouse mammary tumor virus (MMTV), HIV virus, Moloney virus, cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), Rous sarcoma virus (RSV), as well as promoters of human genes such as the human actin, myosin, hemoglobin, muscle creatine and metallothionein.
  • nucleotide sequence consisting of a given nucleotide sequence and the elements necessary for the expression of this nucleotide sequence are within the skill of those skilled in the art.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide which encodes the NTS-DBL1x-Id1-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the FCR3 line has the sequence SEQ ID NO: 2 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 2
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide which encodes the NTS-DBL1-Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the 3D7 line has the sequence SEQ ID NO: 6 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide which codes for the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the FCR3 line has the sequence SEQ ID NO: 4 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 4
  • the nucleotide sequence of the isolated or purified polynucleotide which encodes the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the 3D7 line has the sequence SEQ ID NO: 8 or a homologous sequence of SEQ ID NO: 8.
  • nucleotide sequence homologous to the sequence SEQ ID NO: X is meant any nucleotide sequence which differs from the sequence SEQ ID NO: X by substitution, deletion, and / or insertion of a nucleotide, or of a reduced number nucleotides, at positions such that these sequences encode the same polynucleotide or substantially the same polynucleotide as SEQ ID NO: X.
  • a “nucleotide sequence homologous to the sequence SEQ ID NO: X” is preferably a homologous sequence of SEQ ID NO: X which results from the degeneracy of the genetic code.
  • the polynucleotides, fusion proteins, and polypeptides of the present invention may be prepared by any suitable method.
  • Techniques for isolating or cloning a gene or nucleotide sequence encoding a specific domain of a protein are known in the art and include isolation from genomic DNA, preparation from complementary DNA, or combination of these methods.
  • the cloning of a gene, or a nucleotide sequence coding for a specific domain of a protein, from a genomic DNA can be carried out for example by using a polymerase chain reaction (PCR) or by screening libraries. expression to detect cloned DNA fragments with identical structural characteristics (Innis et al., "PCR: A Guide to Method and Application", 1990, Academy Press: New York).
  • nucleic acid amplification methods known to those skilled in the art can be used, such as, for example, ligase chain reaction (LCR), ligation-activated transcription (LAT) and NASBA (Nucleic) Acid Sequence Based Amplification). It is also possible to use a chemical synthesis method to prepare a nucleotide sequence. The methods of total chemical synthesis of DNA or RNA strands are known to those skilled in the art, and use commercial automated synthesizers.
  • LCR ligase chain reaction
  • LAT ligation-activated transcription
  • NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • Methods for preparing a peptide sequence include chemical methods (RB Merrifield, J. Am Chem Soc 1963, 85: 2149-2154, “Solid Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology, GB Fields (Ed), 1997). Academic Press: San Diego, CA), and recombinant methods (Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed, 1989, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring, NY) using host cells (particularly in the case of fusion proteins).
  • the polynucleotides or fusion proteins or polypeptides may be present in any proportions.
  • the two components may in particular be present in equal amounts.
  • the three components may in particular be present in equal amounts.
  • the combinations according to the invention are particularly suitable for use as medicaments in the management of gestational malaria. Indeed, as demonstrated by the inventors, these combinations make it possible to induce anti-adherence antibodies with a broad spectrum of activity. As such, they can be used, as such or in a modified form, as an immunogenic composition or vaccine.
  • conjugates comprise at least one of the polypeptides of a combination according to the invention, linked to a support.
  • Conjugates can be obtained by coupling via a convalent bond between a polypeptide and a physiologically acceptable, non-toxic, natural or synthetic carrier, capable, for example, of increasing the immunogenic nature of the polypeptide.
  • conjugates mention may be made by way of example, the application WO 2006/124712, which describes methods for preparing conjugates comprising a plurality of antigenic peptides of Plasmodium falciparum bound to a carrier protein improving the immunogenicity of said antigens.
  • the preferred supports according to the invention are chosen from viral particles, lipids, for example lipids of C16-C18 type, polylysines, poly (DL-alanine) -poly (Lysine) s, nitrocellulose, microparticles of polystyrene, microparticles of latex beads, biodegradable polymers, polyphosphoglycan microparticles, carrier proteins such as OPMC (outer membrane protein complex of Neisseria meningitidis) or improved OPMC, BSA (bovine serum albumin), TT (tetanus toxoid), ovalbumin, KLH (heyhole limpet hemocyanin), THY (bovine thyroglobulin), HbSAg and HBcAg of the hepatitis B virus, rotavirus capsid proteins, human papillomavirus LI protein, virus type particle (VLP) type 6, 11 and 16, PPD (purified protein derivative) tuberculin.
  • OPMC
  • An immunogenic composition according to the invention comprises, in addition to a combination described herein, a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • pharmaceutically acceptable carrier or excipient refers to any vehicle or medium which does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient of the composition, and which is not toxic to the individual to be treated. the concentration at which it is administered.
  • the use of such carriers or excipients for the formulation of active substances is well known in the art ("Remington's Pharmaceutical Sciences", EW Martin, 18 th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA).
  • an immunogenic composition of the present invention may vary depending on the route of administration and the dosage. After formulation with at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient, an immunogenic composition of the invention may be administered in any form suitable for administration to a human, for example in solid or liquid form. Those skilled in the art know how to select the most suitable vehicles and excipients for the preparation of a certain type of formulation. Thus, for example, excipients such as water, 2-3-butanediol, isotonic sodium chloride solution, synthetic mono or diglycerides, and oleic acid are often used for the formulation of injectable preparations.
  • excipients such as water, 2-3-butanediol, isotonic sodium chloride solution, synthetic mono or diglycerides, and oleic acid are often used for the formulation of injectable preparations.
  • Liquid compositions including emulsions, microemulsions, solutions, suspensions, syrups, etc., can be formulated in the presence of solvents, solubilizers, emulsifiers, oils, fatty acids and other additives. as suspending agents, preservatives, viscosizing agents, etc.
  • the solid compositions for oral administration may be formulated in the presence of an inert excipient such as sodium citrate, and optionally additives such as binding agents, humectants, disintegrating agents, absorption accelerators, lubricating agents, etc.
  • the immunogenic compositions and vaccines of the invention may comprise one or more adjuvants used in combination.
  • adjuvants such as Montanide and / or Alum may be used.
  • adjuvants such as QS21, SBQS2, MF59, mLT, PHL, CpG DNA, calcium phosphate, dehydrated calcium sulfate, PLG, CT, LTB, CT / LT, AS02A are also suitable.
  • the immunogenic compositions and vaccines according to the invention may further comprise at least one specific antigen of the pre-erythrocyte stages (CSP, TRAP, LSA-1, LSA-3, SALSA, STARP, EXP-1), asexual erythrocytes (MSP-1, MSP-3, AMA-1, EBA-175, GLURP, MSP-2, MSP-4, MSP-5, RAP-2, RESA, PfEMP-1, synthesized GPI toxin) or sexed (PfS25).
  • CSP pre-erythrocyte stages
  • TRAP pre-erythrocyte stages
  • LSA-1 LSA-1
  • LSA-3 SALSA
  • SALSA STARP
  • EXP-1 asexual erythrocytes
  • MSP-1, MSP-3, AMA-1, EBA-175, GLURP, MSP-2, MSP-4, MSP-5, RAP-2, RESA, PfEMP-1, synthesized GPI toxin or s
  • a vaccine against gestational malaria comprises at least one combination described herein and is used to induce in antibodies vaccinated antibodies inhibiting cytoadherence to CSA.
  • the invention relates to a DNA vaccine (also called plasmid vaccine or polunucleotide vaccine) against gestational malaria.
  • the invention also relates to a protein vaccine (also called polypeptide vaccine) against gestational malaria. Protein vaccines
  • the present invention therefore relates to a protein vaccine comprising a combination of at least two polypeptides as described above or a combination of at least two fusion proteins as described above.
  • a protein vaccine may be by any appropriate route, such as, for example, intravenously, subcutaneously, intradermally, orally, topically or systemically.
  • the present invention also relates to a DNA vaccine against gestational malaria.
  • the aim of genetic vaccination or DNA vaccination is to induce an immune response and consists in introducing directly into certain cells of the body a polynucleotide gene or sequence coding for a vaccinal antigen or a purified plasmid of DNA containing a coding sequence. for the vaccine antigen.
  • the cells in question are, in the example of the invention, muscle cells, but any other type of cell may be suitable, for example cells of the skin.
  • Administration is non-exclusive, by intramuscular injection or by "bombardment" of particles on the skin or nasally. DNA enters the muscle cells, skin cells or others; and these cells then themselves synthesize the antigen.
  • the antigen is presented to the immune system and triggers a response (the production of antibodies capable, during an infection, of specifically recognizing this antigen on the parasite).
  • the vaccine is therefore produced, locally, by the body of the individual to be immunized.
  • This method of vaccination, simple and inexpensive, has significant advantages in terms of effectiveness: the antigen thus produced is generally in its native peptide sequence, fused or not to one or more peptide sequences (fusion partners). Above all, it is produced in a prolonged way by the cells of the body, and this durable presentation of the antigen to the immune system should make it possible to avoid the recourse to the recalls.
  • DNA vaccines are chemically defined and thermally stable, which reduces the need to maintain the cold chain.
  • the present invention therefore relates to a DNA vaccine comprising a combination of at least two polynucleotides as described above.
  • a polynucleotide of a combination of the invention may be a naked DNA, in particular a circular vaccinia plasmid, supercoiled or not, or a linear DNA molecule incorporating and expressing in vivo a nucleotide sequence coding for the NTS-region. DBLlx-Idl-DBL2x or for the Idl-DBL2x region of the VAR2CSA protein of the FCR3 line or the 3D7 line or the new cluster.
  • naked DNA is meant, as is now commonly accepted, a DNA transcription unit in the form of a polynucleotide sequence comprising at least one nucleotide sequence coding for a vaccine antigen and the elements necessary for its in vivo expression.
  • the polynucleotides of a combination according to the invention may advantageously be inserted into a plasmid of the DNA-CSP type, Nyvac pf7, VR1020, VR1012, etc.
  • naked DNA is incorporated into a drug carrier.
  • suitable drug vectors include, but are not limited to, biodegradable microcapsules, immunostimulant complexes, liposomes, cationic lipids, and genetically attenuated live vectors such as viruses and bacteria.
  • a DNA vaccine of the invention may also be administered in conjunction with an agent that enhances the penetration of the vaccine genetic material into treated cells.
  • the DNA vaccine can be formulated to contain such an agent or be administered at the same time as such an agent.
  • agents that enhance the penetration of vaccine genetic material into treated cells include, but are not limited to, benzoic acid esters, anilides, amidines, urethanes, and their hydrochloride salts (US Patent 6,248,565).
  • Administration of DNA to cells may be promoted by chemical vectors (such as, for example, cationic polymers or cationic lipids), physical techniques such as electroporation, sonoporation, magnetofection, etc., or still viral vectors such as viruses associated with adenovirus, etc.
  • the immunogenic compositions and vaccines can be advantageously used to immunize female human beings (prepubertal girls and women of childbearing age) in the context of preventive gestational malaria therapy.
  • the invention also relates to methods of treating or preventing gestational malaria.
  • the invention provides a method for inducing a protective immune response against Plasmodium falciparum in a human female, the method comprising a step of administering an effective amount of an immunogenic composition or vaccine described right here.
  • the invention also provides a method of vaccinating a female human against Plasmodium falciparum, the method comprising a step of administering an effective amount of a vaccine, particularly a DNA vaccine or a protein vaccine described herein.
  • a method of treating or preventing gestational malaria is characterized in that it induces, in female humans, antibodies that prevent the adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to CSA placental receiver.
  • the administration of the immunogenic composition or the vaccine can be done by any appropriate route (oral, parenteral, mucosal).
  • administration of a DNA vaccine is intramuscular, intradermal, or mucosal.
  • administration of a protein vaccine is, for example, intravenous, subcutaneous, intradermal, oral, topical or systemic.
  • An immunogenic composition or a vaccine according to the invention may be administered in a single dose or in several doses. Those skilled in the art will be able to determine the effective dose of immunizing protein or DNA for use in each immunization or vaccination protocol.
  • kits for the prevention of gestational malaria More specifically, the kit comprises material useful for carrying out a vaccination according to the method of the invention.
  • a kit comprises a combination, an immunogenic composition or a vaccine according to the invention, and instructions for performing a vaccination against gestational malaria.
  • the kit may further include means for performing the vaccination.
  • kits according to the invention are configured such that the components of a combination according to the invention are provided separately (for example in different containers). Such a configuration allows both the simultaneous administration and the sequential administration of the components of the combination.
  • simultaneous administration is meant here a administration of the components, together or separately, at approximately the same time (for example, at an interval of 5, 10, 15 or 30 minutes each). other).
  • sequential administration is meant here an administration of the components separately and at different times (for example at different times of the same day, or at one or more days of interval).
  • the kit may comprise reagents or solutions for the preparation of the composition to be administered.
  • the various components of the kit may be provided in solid form (for example in freeze-dried form) or in liquid form.
  • a kit may optionally include a container each containing reagents or solutions, and / or containers (test tubes, flasks, etc.) to effect the preparation of the composition to be administered.
  • a notice in the form prescribed by a government agency regulating the sale and use of pharmaceutical products may be included in the kit.
  • Isolates of Plasmodium falciparum Field samples of infected erythrocytes were obtained from pregnant women at the Suru Lowski maternity hospital in the eastern region of Cotonou. The study site is characterized by hyper-endemic malaria in the lagoon zone and a high rate of malaria transmission with two peaks corresponding to the two rainy seasons (Akogbeto et al., Parasitologia, 1992, 34: 147-154). Peripheral venous blood was collected in vacutainers containing anticoagulant citrate phosphate dextrose adenine (CPDA), during prenatal visits and at the time of delivery. The erythrocytes were separated from the plasma and washed with RPMI 1640 (Lonza).
  • CPDA citrate phosphate dextrose adenine
  • erythrocyte pellets 200 ⁇ l were homogenized in 10 volumes of TRIzol reagent (Invitrogen) and frozen at -80 ° C. until extraction of the total RNA or frozen at -20 ° C. moment of extraction of the total DNA.
  • the pellets of erythrocytes infected with ring stage parasites were immediately cultured in vitro to obtain aged trophozoites as previously described (Trager et al., Science, 1976, 193: 673-675).
  • the isolates were grown in vessels containing RPMI 1640 supplemented with HEPES and L-glutamine (Lonza Biowhittaker), 0.3 g / L 1-glutamine, 0.05 g / L gentamicin, 5 g / L The albumax.
  • the culture vessels were placed under a 92.5% N2, 2% O2 and 5.5% CO2 atmosphere and incubated at 37 ° C for no more than 48 hours prior to testing.
  • the parasitic laboratory strains FCR3, HB3 and NF54 were cultured in 0+ erythrocytes and were selected after several panning steps on the BeWo cell line as previously described (Haase et al., Infect Immun., 2006, 74: 3035). -3038).
  • DNA Extraction and Genotyping msp The DNA was extracted from 100 pellet with the GeneJet Genomic Purification Kit (Fermentas) according to the manufacturer's recommendations. The mspl and msp2 genes were amplified by nested PCR using specific primers (Snounou et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 1999, 93: 369-374). The multiplicity of infection (MOI) was determined for each sample.
  • MOI multiplicity of infection
  • RNA extraction, cDNA synthesis and Genotyping of DBL2x The RNAs were extracted from frozen samples stored in the TRIzol reagent (In vitro gen) according to the manufacturer's recommendations. Total RNAs were treated with DNAse I (Invitrogen) for 15 minutes at room temperature according to the manufacturer's recommendations to eliminate any potential contamination with genomic DNA (gDNA). The absence of gDNA in the RNA samples was confirmed by a lack of amplification after 40 cycles of a real-time PCR with primers targeting housekeeping seryl-tRNA synthetase gene (Salanti et al, Mol Microbiol, 2003 49: 179-191).
  • RNA without DNA was performed with Thermoscript (Invitrogen) and random hexamer primers for 1 hour at 50 ° C in a total volume of 20 ⁇ L as recommended by the manufacturer.
  • DSM dimorphic sequence motif
  • DBL2x from VAR2CSA of Plasmodium falciparum isolates (Sander et al., PLoS One, 2009, 4: e6667), this domain was selected to amplify the cDNA of each isolate with a primer pair (5'-TTAYCCCCAAGAACACA-3 'and 5'-TTTT A ATTTTTTCC ATG A A-3 ').
  • Reactions were performed with high fidelity Taq Fusion Polymerase (to obtain higher yields and lower mutation rates) under the following conditions: 94 ° C for 1 minute followed by 35 cycles at 94 ° C for 30 minutes. seconds, 50 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 50 seconds, and final extension at 68 ° C for 10 minutes.
  • the PCR products were digested with the restriction enzymes BstCI (which cuts the FCR3 type DSMs) and Hppyl88I (which cuts the 3D7 DSMs) for 1 hour at 50 ° C and 37 ° C, respectively.
  • the digested products were separated by electrophoresis on 1.5% agarose gel.
  • the NTS-DBL1x-Idl-DBL2x fragment and the entire sequence of the optimized varlcsa gene of FCR3 and 3D7 parasite lines were used to produce specific anti-VAR2CSA IgGs, by DNA vaccination as previously described (Bigey et al., J. Infect Dis ., 2011, 204: 1125-1133). Briefly, the DNA sequences were cloned into a vector derived from pVax1 and fused to the mEPO signal sequence as previously described (Trollet et al., Infect Immun., 2009, 77: 2221-2229).
  • Immunizations were performed on Swiss female mice aged 6 weeks and rabbits from New Zealand (January-France). The mice were anesthetized by intraperitoneal injection with a ketamine-xylazine mixture and in the case of rabbits the injection was made at 5 sites along each longissimus dorsi muscle. DNA transfer was performed by transcutaneous electrical pulses applied by two stainless steel electrodes placed at each injection site. The animals were immunized on days 0, 30 and 60, and the antisera were collected on days 0 and 15 after each of the immunizations. Total IgG was purified in the final mouse or rabbit serum sample on a Hi-Trap column to which the corresponding recombinant protein had been coupled in accordance with the manufacturer's recommendations (GE Healthcare).
  • Suspensions enriched with erythrocytes infected with aged trophozoites were obtained by filtration on a magnetic column (VarioMACS, Miltenyi). The suspension, whose parasite density was adjusted to 20% in 1 ⁇ 10 5 cells, was then blocked for 30 minutes at room temperature (RT) in a solution of 3% BSA diluted in RPMI. The erythrocyte preparation was incubated with purified IgG (0.25 mg / mL) or 500 ⁇ g / mL soluble SCA (Sigma), and the cells were then adhered for 15 minutes at room temperature on Petri dishes. pre-coated with different ligands. The non-adherent cells were removed by an automatic washing system. The spots were fixed with 1.5% glutaraldehyde in PBS, stained with Giemsa solution and the infected infected erythrocytes were counted under a microscope.
  • Figure 1 is a graph showing the distribution of the dimorphic sequence signatures of the DBL2x region of VAR2CSA among parasites infecting pregnant women.
  • the dimorphic sequence motif (DSM) in DBL2x that distinguishes VAR2CSA alleles into two subgroups (types 3D7 and FCR3) were genotyped in parasites collected from pregnant women in Benin.
  • the proportions of type 3D7 (white histograms), type FCR3 (striped histograms) and mixing of the two genotypes (black histograms) are presented.
  • the multiplicity of infection (MOI) is indicated for each category.
  • Figure 2 is a graph showing the recognition of VAR2CSA expressed in IgG field isolates directed against the different constructs of Var2CSA.
  • VAR2CSA expressed by the IgGs induced against the VAR2CSA constructs (NTS-DBL2X / 3D7 and NTS-DBL2X / FCR3) and against the entire extracellular domain of VAR2CSA (NTS-DBL1-68 / FCR3) of the strain FCR3 has been studied on field isolates by flow cytometry.
  • the parasites were separated according to their category DSM (DSM 3D7, DSM FCR3 or DSM Blend FCR3 / 3D7).
  • the bars indicate the average MFI ratio (MFI corresponding to the reactivity of the IgG of the hyperimmune animal / MFI corresponding to the reactivity of the IgG of the same pre-immune animal.
  • Figure 3 includes two graphs showing the IgG adhesion inhibitory activity induced against each of the two 'serotypes' of NTS-DBL1x-Idl-DBL2x on field isolates. Inhibitory adhesion activity was assessed on 18 Plasmodium falciparum isolates freshly obtained from pregnant women. The data is presented as percent inhibition for each antibody normalized by the CSA inhibition value (used as a reference for maximum adhesion inhibition). Histograms are presented for each of the DSM types detected in the isolate: ⁇ for DSMs of type 3D7, m for DSMs of type FCR3, and ⁇ for DSMs of mixture of the two genotypes.
  • Figure 4 is a series of three graphs showing the inhibition profile of antibodies on strains selected and adapted and binding to the CSA.
  • the FCR3, HB3 and NF54 strains selected on Bewo cells were used to evaluate the ability of the antibodies induced to inhibit the adhesion of the 3 laboratory strains to CSPG.
  • the in vitro functionality of the antibody mixtures was also evaluated. The values presented are normalized with the inhibition value of the CSA.
  • Figure 5 is a representation of the phylogenetic relationships between sequences spanning the ID1-DBL2X region of VAR2CSA generated from the CDNA of 123 parasite isolates of pregnant women.
  • the phylogenetic tree illustrates the phylogenetic relationship between the different sequences, with the groupings of dichotomous variants defined in DBL2X that discriminates between the 3D7 and FCR3 clusters and the clusters of a new cluster whose identity is defined in the Idl region of VAR2CSA. Bootstrap values are shown at each main branch.
  • DSM type 3D7 transcripts were found in 54 isolates (44%) and FCR3 type DSM transcripts were found in 47 isolates (39%) ( Figure 1). In 21 isolates (17%), both types of transcripts were detected, suggesting a mixture of genotypes. No differences were observed between the MOIs of the isolates of the groups determined after the typing of varlcsa (the determined MOIs are 3.05 in isolates expressing type 3D7, 2.98 in isolates expressing type CFR3, and 3.6 in the isolates with a mixture of the two DSM signatures).
  • the anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x IgG specific to varlcsa variants of 3D7 and FCR3, and the IgGs induced against the entire extracellular domain of VAR2CSA were used in this experiment.
  • IgG induced against the entire extracellular domain of VAR2CSA was used to estimate the level of absolute recognition of the native VAR2CSA protein expressed on the surface of infected erythrocytes.
  • a high level of reactivity was observed with antibodies induced against the entire extracellular domain of VAR2CSA compared to antibodies directed against the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x domain of VAR2CSA regardless of the origin of the latter (P ⁇ 0.05 ).
  • Soluble CSA was used as a reference for maximum inhibition of adhesion.
  • the degree of parasite inhibition by anti-NTS-DBL1x-Idl-DBL2x antibodies of FCR3 and 3D7 variants was normalized to CSA inhibition.
  • the average antibody inhibitory activity on all isolates was 80% [interquartile range: 50.8 - 100] for the anti-NTS-DBL1x-Idl-DBL2x antibody of the FCR3 variant and 97% [interquartile range: 55.3 - 100] for the anti-NTS-DBL1x-Idl-DBL2x antibody of the variant 3D7.
  • Different modes of inhibition were observed with the antibodies as a function of the types of varlcsa isolates.
  • isolates OPT144 and OPT161 are not inhibited by the antibodies induced against serotype FCR3, and interestingly, these isolates bearing DSM of type 3D7 have been strongly inhibited by IgG specific to the NTS-DBL1x-Idl-domain. DBL2x of the variant 3D7.
  • a similar profile was obtained with the OPT105 isolate which is more strongly inhibited with the DSM serotype-specific IgG homologous to the FCR3 variant and less well inhibited with the 3D7 variant-specific anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x IgG.
  • the mixture of the anti-NTS-DBL1-Idl-DBL2x IgGs of the FCR3 line and the 3D7 line retains the property of completely inhibiting the adhesion of all the CSPG-infected erythrocytes.
  • Identification of a third cluster Sequence variations of the NTS-DBLlx-Idl-DBL2x domain of the VAR2CSA protein of the transcript of 123 parasite isolates of pregnant women from Benin were analyzed. Total RNA was extracted from freshly collected parasites, and the cDNA was synthesized. The var2csa gene was amplified from the cDNA using a high fidelity enzyme (Fusion), and universal primers were used. Ten (10) clones were sequenced for each isolate and the sequences were generated by multiple alignment of the protein and nucleic sequences.
  • VAR2CSA contains conserved anti-adherence epitopes and indicates that the development of an effective vaccine based on VAR2CSA will require the combination of a limited number of VAR2CSA variants.
  • the combination of the three major variants of VAR2CSA used in this work will be essential to develop an effective vaccine against placental malaria.

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Abstract

La présente invention concerne des combinaisons de polypeptides ou de polynucléotides correspondant à une région spécifique de la partie N-terminale de la protéine VAR2CSA de différentes familles ou lignées parasitaires de Plasmodium falciparum, et leur utilisation dans la prévention du paludisme gestationnel. L'invention vise également des compositions immunogènes et des vaccins utiles pour prévenir le paludisme chez la femme enceinte.

Description

VACCINS CONTRE LE PALUDISME GESTATIONNEL
Demande Parente
La présente demande internationale revendique la priorité de la demande française numéro FR 13 50508 déposée le 21 janvier 2013, dont le contenu est incorporé ici par référence dans son intégralité.
Domaine de l'Invention
La présente invention concerne l'utilisation de combinaisons de régions spécifiques de la partie N-terminale de la protéine VAR2CSA provenant de différentes familles ou lignées parasitaires de Plasmodium jalciparum dans la prévention et/ou le traitement du paludisme gestationnel.
Contexte de l'Invention
Le paludisme (ou malaria) est la plus fréquente des infections parasitaires observées dans le monde. Il est dû à un parasite du genre Plasmodium, qui est transmis lors de la piqûre par une femelle moustique (Anophèles). Plusieurs espèces de Plasmodium peuvent infecter l'être humain, mais Plasmodium jalciparum est l'espèce la plus fréquente et la plus pathogène et celle qui est responsable des cas mortels. Une fois introduit dans le sang, le parasite infecte les cellules hépatiques, dans lesquelles il prolifère, avant de circuler à nouveau dans le sang et d'envahir les globules rouges (érythrocytes ou hématies). Le paludisme touche une centaine de pays dans le monde, particulièrement dans les zones tropicales défavorisées d'Afrique, d'Asie et d'Amérique latine ; l'Afrique étant, de loin, le continent le plus affecté. Selon les estimations de l'Organisation Mondiale de la Santé, le paludisme est responsable annuellement de 225 millions de cas de fièvres et environ 1 million de morts (World Malaria Report, WHO, 2010). Les moyens de lutte existants sont les médicaments antipaludiques (dont les plus connus sont la chloroquinine et la quinine) et la lutte contre les moustiques vecteurs du parasite. Mais la situation est d'autant plus préoccupante que depuis plusieurs années, les parasites développent de plus en plus de résistances aux médicaments et les moustiques développent des résistances aux insecticides. Aucun vaccin n'est aujourd'hui disponible. Le paludisme concerne majoritairement les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes, en particulier les primigestes (c'est-à-dire enceintes pour la première fois). Les femmes enceintes sont particulièrement vulnérables car le placenta constitue une cible où les parasites peuvent s'accumuler. Chez la femme enceinte, l'infection palustre peut provoquer toute une gamme d'effets dommageables : avortement spontané, accouchement prématuré, insuffisance pondérale à la naissance, transmission congénitale, et décès néonatal. Dans les zones d'Afrique où le paludisme est endémique, 3 à 5% des décès des nourrissons à la naissance peuvent être imputés au paludisme gestationnel. En outre, il présente également un réel danger pour la mère qui peut souffrir d'une anémie parfois sévère, voire mortelle. Actuellement, la prévention du paludisme chez la femme enceinte repose sur le traitement préventif par la sulfadoxine-pyriméthamine (Cot et al, Br. Med. Bull., 2003, 67: 137-148). Mais ce traitement intermittent n'est pas à même d'assurer une prévention du paludisme pendant l'ensemble de la grossesse : premièrement, parce que l'administration du médicament ne se fait qu'à partir de la 20eme semaine de grossesse (le risque tératogène au cours de l'embryogénèse étant considéré trop important) ; deuxièmement parce qu'il repose sur deux administrations à dose curative de sulfadoxine-pyriméthamine espacées d'au moins un mois, ce qui ne procure qu'une couverture médicamenteuse partielle ; et troisièmement, parce que l'efficacité de la sulfadoxine-pyriméthamine est en train de diminuer très largement dans l'ensemble des zones d'endémie palustre en raison de l'expansion de la résistance parasitaire (Cot et al, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1998, 59: 813-822; WHO/HTM/MAL/2005.1103. Geneva: World Health Organization; ter Kuile et al, JAMA, 2007, 297: 2603-2616; Mockenhaupt et al, J. Infect. Dis., 2008, 198: 1545- 1549; Briand et al, J. Infect. Dis., 2009, 991-1001; Harrington et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106: 9027-9032). Des médicaments sont actuellement à l'étude dans ce contexte, et de nombreux efforts sont également concentrés vers le développement d'un vaccin contre le paludisme gestationnel. La possibilité de vacciner la femme enceinte ou la jeune fille pré-pubère constituerait un avantage évident sur un traitement médicamenteux, dans la mesure où la couverture préventive de la grossesse serait étendue, et potentiellement de meilleure qualité.
Une des stratégies vaccinales envisagées pour lutter contre le paludisme gestationnel est de recréer l'immunité protectrice naturelle. En effet, la sévérité clinique du paludisme dû à Plasmodium falciparum est liée en partie à des altérations des érythrocytes infectés. Ces altérations sont induites par les protéines du parasite qui sont exportées à la surface des érythrocytes durant la phase de développement dans le sang. Certaines de ces protéines de surface de la famille PfEMPl (Plasmodium falciparum Erythrocyte Membrane Protein 1), codées par les parasites, confèrent de nouvelles propriétés de cytoadhérence aux érythrocytes. Les érythrocytes sont alors capables de se fixer à la paroi interne des vaisseaux sanguins, empêchant par là même l'acheminement des érythrocytes infectés vers les organes épurateurs du système immunitaire, dont l'un des rôles est de détruire les cellules reconnues comme anormales. Dans le cas du paludisme gestationnel, les érythrocytes parasités se fixent à un sucre, la chondroïtine sulfate A (CSA), présent dans le placenta. Après plusieurs grossesses, les femmes acquièrent des anticorps protecteurs qui bloquent cette adhésion. Une des stratégies vaccinales est de recréer cette immunité protectrice, en bloquant l'adhésion des érythrocytes infectés au placenta. La protéine VAR2CSA, une des protéines de la famille PfEMPl, fait actuellement l'objet de nombreuses recherches en vue de l'obtention d'un vaccin spécifique de la femme enceinte (Tuikue Ndam et al, J. Infect. Dis., 2005, 192: 331- 335 ; Chia et al, J. Infect. Dis., 2005, 192: 1284-1293; Tuikue Ndam et al, J. Infect. Dis., 2006, 193: 713-720 ; Dahlbàck et al, PLoS Pathogens, 2006, 2: 1069-1082 ; Badaut et al, Mol. Biochem. Parasitai., 2007, 15: 89-99; Khattab et al, Parasitai. Res., 2007, 101: 767-774; Guitard et al, Malaria J., 2008, 11: 7-10; Guitard et al, Malaria J., 2010, 9: 165; Gangnard et al, Mol. Biochem. Parasitai, 2010, 173: 115- 122 ; Gnidehou et al, Mol. Biochem. Parasitai, 2010, 5(10): el3105 ; WO 2012/014073). Ces travaux se heurtent au polymorphisme de VAR2CSA, mais des essais de phase 1 sont néanmoins envisagés. La totalité du domaine extracellulaire de cette protéine a été exprimée en système hétérologue (Srivastava et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107: 4884-4889; Khunrae et al, J. Mol. Biol, 2010, 397: 826-834), et les anticorps induits contre ce domaine extracellulaire présentent un très fort taux d' antiadhérence. Cependant, le développement de nouvelles approches vaccinales, devront prendre en compte les nombreux épitopes immunodominants qui n'induisent pas des anticorps « antiadhérence ».
Il apparaît donc crucial de continuer à explorer et développer de nouvelles stratégies de lutte et de prévention contre le paludisme gestationnel. Résumé de l'Invention
Les présents inventeurs ont précédemment identifié la région N-terminale de VAR2CSA, et notamment la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x consistant en le domaine DBLlx, interdomaine Idl et le domaine DBL2x, comme étant celle qui contient des épitopes capables d'induire in vivo des anticorps qui bloquent l'adhérence au CSA des hématies infectées par Plasmodium falciparum, et la sous- région Idl-DBL2x comme étant la région antigénique minimale de VAR2CSA impliquée dans l'acquisition de l'immunité protectrice vis-à-vis de la séquestration placentaire qui a lieu dans le paludisme gestationnel (WO 2012/014073). Ils ont maintenant découvert que la combinaison d'anticorps induits contre la région NTS- DBLlx-Idl-DBL2x de VAR2CSA des deux lignées parasitaires FCR3 et 3D7 de Plasmodium falciparum inhibent totalement la fixation des érythrocytes parasités à la chondroïtine sulfate A (CSA) aussi bien sur des isolais placentaires de terrain de femmes enceintes que sur des souches de laboratoire bien caractérisées. Par comparaison, les anticorps induits contre la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de VAR2CSA de chacune des deux lignées parasitaires FCR3 et 3D7 de Plasmodium falciparum utilisés séparément ne présentent un pourcentage d'inhibition que d'environ 70%. En analysant les séquences d'isolats parasitaires de femmes enceintes au bénin, les inventeurs ont également mis en évidence une ségrégation des variants parasitaires dans interdomaine Idl de VAR2CSA. Ce nouveau domaine de dichotomie n'a jamais été décrit jusqu'à présent. Les alignements de séquences ont conduit à l'établissement de deux séquences consensus représentatives de l'interdomaine Idl de VAR2CSA : la première Idl A (ou SEQ ID NO: 11) correspond à un cluster nouvellement identifié, et la deuxième IdlB (ou SEQ ID NO: 12) correspond à l'autre groupe de séquences (dont font partie la lignée FCR3 et la lignée 3D7).
En conséquence, un premier aspect de la présente invention concerne l'utilisation de combinaisons de séquences polypeptidiques ou polynucléotides correspondant à la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou à la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA provenant de différentes familles parasitaires de Plasmodium falciparum, dans la gestion du paludisme de la femme enceinte.
Plus spécifiquement, la présent invention concerne l'utilisation de séquences polypeptidiques ou polynucléotides isolés ou purifiés correspondant à la région NTS- DBLlx-Idl-DBL2x ou à la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA provenant de parasites Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CS A est caractérisée par un interdomaine Idl qui a comme séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11 (ou qui est codé par la séquence nucléique consensus SEQ ID NO: 13) et optionnellement de séquences polypeptidiques ou polynucléotides correspondant à la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou à la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA provenant de parasites Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl qui a comme séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 12 (ou qui est codé par la séquence nucléique consensus SEQ ID NO: 14).
En particulier, la présente invention concerne une combinaison d'au moins deux polypeptides isolés ou purifiés pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel, le premier polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA d'une première famille parasitaire de Plasmodium jalciparum, et le deuxième polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl- DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA d'une deuxième famille parasitaire de Plasmodium jalciparum, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel. Dans certains modes de réalisation préférés, la première famille est la famille parasitaire de Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl qui a pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11 ou qui est codé par la séquence nucléique consensus SEQ ID NO: 13, et la deuxième famille est la famille parasitaire de Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl qui a pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 12 ou qui est codé par la séquence nucléique consensus SEQ ID NO: 14.
Dans certains modes de réalisation, la deuxième famille parasitaire de Plasmodium jalciparum comprend la lignée parasitaire FCR3 et la lignée parasitaire 3D7.
Dans certains modes de réalisation, une combination selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle consiste en trois polypeptides isolés ou purifiés, le premier polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la famille parasitaire de Plasmodium falciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl qui a pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11 ou qui est codé par la séquence nucléique consensus SEQ ID NO 13, le deuxième polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3, et le troisième polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7. Dans certains modes de réalisation, la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 1 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 1, et la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 5 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 5. Dans certains modes de réalisation, la région Idl-DBL2x de la protéine
VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 3 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 3, et la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 7 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 7. La présente invention concerne également une combinaison d'au moins deux protéines de fusion isolées ou purifiées pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel, où la combinaison correspond à une combinaison d'au moins deux polypeptides isolés ou purifiés telle que décrite ici dans laquelle chacun des polypeptides est fusionné à une séquence partenaire de fusion.
Dans certains modes de réalisation, chacune des séquences partenaires de fusion est choisie indépendamment dans le groupe constitué de la protéine liant le maltose, la séquence signal de la protéine liant le maltose, un S-tag, la glutathione-S- transférase, la thiorédoxine, la β-galactosidase, la streptavidine, la dihydrofolate réductase, la séquence signal pelB, la séquence signal ompA, la séquence signal de l'alkaline phosphatase, la protéine fluorescente verte, les toxines, l'hormone de croissance humaine, l'interleukin-2 (IL-2), le granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), le granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), la calcitonine, l'interféron-beta, l'interféron- alpha, le glucagon like peptide 1 (GLP-1), le glucagon like peptide 2 (GLP-2), la toxine PA, les hormones parathyroïdiennes (PTH(l-34) and PTH(l-84)), la butyrylcholinestérase, la glucocérébrosidase (GBA), et l'exendine-4.
L'invention concerne aussi une combinaison d'au moins deux polynucléotides isolés ou purifiés pour utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel, où chacun des polynucléotides isolés ou purifiés code pour un polypeptide tel que défini précédemment ou pour une protéine de fusion telle que définie précédemment. Plus précisément, l'invention concerne une combinaison d'au moins deux polynucléotides isolés ou purifiés, le premier polynucléotide isolé ou purifié codant pour un premier polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx- Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA d'une première famille parasitaire de Plasmodium jalciparum ou pour une première protéine de fusion comprenant le première polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit premier polypeptide ou de ladite première protéine de fusion in vitro et/ou in vivo ; et le deuxième polynucléotide isolé ou purifié codant pour un deuxième polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA d'une deuxième famille parasitaire de Plasmodium jalciparum ou pour une deuxième protéine de fusion comprenant le deuxième polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit deuxième polypeptide ou de ladite deuxième protéine de fusion in vitro et/ou in vivo, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel.
Dans certains modes de réalisation, la première famille est la famille parasitaire de Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl qui a pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11 ou qui est codé par la séquence consensus SEQ ID NO: 13 et la deuxième famille est la famille parasitaire de Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl qui a pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 12 ou qui est codé par la séquence consensus SEQ ID NO: 14.
Dans certains modes de réalisation, la deuxième famille parasitaire de Plasmodium jalciparum comprend la lignée parasitaire FCR3 et la lignée parasitaire Dans certains modes de réalisation, la combinaison selon l'invetion consiste en trois polynucléotides isolés ou purifiés, le premier polynucléotide isolé ou purifié codant pour un premier polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la famille parasitaire de Plasmodium falciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl qui a pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11 ou qui est codé par la séquence consensus SEQ ID NO: 13 ou pour une première protéine de fusion comprenant le premier polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit premier polypeptide ou de ladite première protéine de fusion in vitro et/ou in vivo ; le deuxième polynucléotide isolé ou purifié codant pour un deuxième polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 ou pour une deuxième protéine de fusion comprenant le deuxième polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit deuxième polypeptide ou de ladite deuxième protéine de fusion in vitro et/ou in vivo ; et le troisième polynucléotide isolé ou purifié codant pour un troisième polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx- Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 ou pour une troisième protéine de fusion comprenant le troisième polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit troisième polypeptide ou de ladite troisième protéine de fusion in vitro et/ou in vivo.
Dans certains modes de réalisation, la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 1 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 1, et la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 5 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 5.
Dans certains modes de réalisation, la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 3 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 3, et la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 7 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 7.
Dans certains modes de réalisation, le deuxième polynucléotide isolé ou purifié comprend une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO: 2, une séquence homologue de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, une séquence homologue de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, une séquence homologue de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, et une séquence homologue de SEQ ID NO: 8.
Dans les modes de réalisation où un deuxième et un troisième polynucléotide isolé ou purifié sont présents dans le deuxième polynucléotide isolé ou purifié comprend préférablement une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO: 2, une séquence homologue de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, une séquence homologue de SEQ ID NO: 4, et le troisième polynucléotide isolé ou purifié comprend préférablement une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO: 6, une séquence homologue de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, et une séquence homologue de SEQ ID NO: 8.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition immunogène comprenant au moins un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique et au moins une combinaison de polypeptides ou de protéines de fusion ou de polynucléotides selon l'invention. Préférablement, une telle composition immunogène est caractérisée en ce qu'elle est capable d'induire des anticorps qui inhibent totalement l'adhésion d'érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum au récepteur placentaire CSA (chondroïtine sulfate A).
Dans une variante de cet aspect, l'invention se rapporte également à des vaccins contre le paludisme gestationnel. En particulier, l'invention fournit un vaccin comprenant au moins une combinaison de polypeptides ou de protéines de fusion selon l'invention, ou au moins une combinaison de polynucléotides selon l'invention. Dans certains modes de réalisation, les polynucléotides de la combinaison présente dans un vaccin sont insérés dans au moins un plasmide. Préférablement, les vaccins selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont capables d'induire des anticorps qui inhibent totalement l'adhésion d'érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum au récepteur placentaire CSA. Les vaccins décrits ici peuvent en outre comprendre un adjuvant.
Dans une autre variante de cet aspect, l'invention concerne des méthodes de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel. En particulier, l'invention fournit une méthode pour induire une réponse immunitaire protectrice contre Plasmodium falciparum chez un être humain de sexe féminin, la méthode comprenant une étape d'administration d'une quantité efficace d'une composition immunogène ou d'un vaccin décrit ici. L'invention fournit également une méthode de vaccination d'un être humain de sexe féminin contre Plasmodium falciparum, la méthode comprenant une étape d'administration d'une quantité efficace d'un vaccin, en particulier d'un vaccin ADN décrit ici ou d'un vaccin protéique décrit ici. Les méthodes de traitement et de prévention du paludisme gestationnel s'adressent principalement aux jeunes filles pré-pubères et aux femmes en âge de procréer. Dans certains modes de réalisation préférés, une méthode de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel est caractérisée en ce qu'elle induit, chez l'être humain de sexe féminin, des anticorps qui empêchent l'adhésion d'érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum au récepteur placentaire CSA. Dans les méthodes de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel selon l'invention, l'administration de la composition immunogène ou du vaccin peut se faire par n'importe quelle voie appropriée.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un kit de vaccination contre le paludisme gestationnel comprenant au moins une combinaison, ou au moins une composition immunogène ou au moins un vaccin selon l'invention et des instructions pour effectuer une vaccination contre le paludisme gestationnel. Dans certains modes de réalisation, les au moins deux polypeptides ou au moins deux protéines de fusion ou au moins deux polynucléotides de la combinaison, de la composition immunogène ou du vaccin sont fournis séparément dans le kit.
Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l'invention est donnée ci-dessous.
Description Détaillée de l'Invention
D'une manière générale, la présente invention se rapporte à l'utilisation de combinaisons de régions spécifiques de la partie N-terminale de la protéine VAR2CSA provenant de différentes familles parasitaires de Plasmodium falciparum, dans la prévention et/ou le traitement du paludisme gestationnel.
I - NTS-DBLlx-Idl-DBL2x et Idl-DBL2x
Polynucléotides et Polypeptides Relatifs à NTS-DBLlx-Idl-DBL2x et Idl-DBL2x La présente invention se rapporte à des combinaisons d'au moins deux polynucléotides ou d'au moins deux polypeptides dérivés de la partie N-terminale du domaine extracellulaire de VAR2CSA de différentes familles parasitaires de Plasmodium falcip arum, ainsi qu'à leurs applications dans la gestion du paludisme gestationnel. En particulier, l'invention concerne des combinaisons d'au moins deux polynucléotides ou d'au moins deux polypeptides dérivés de la région N-terminale du domaine extracellulaire de VAR2CSA de deux familles parasitaires de Plasmodium falciparum mises en évidence par les inventeurs, et dont la ségrégation a lieu dans interdomaine Idl de VAR2CSA.
La première famille qui est un cluster nouvellement identifié est caractérisée par une protéine VAR2CSA ayant un interdomaine Idl ayant pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO : 11 ou qui est codé par la séquence nucléique consensus SEQ ID NO : 13.
SEQ ID NO: 11
dY ! K . #PYS . EyGKLLkFDNTNAFkESiT . nkNVCsCSgnEKliis#GSssS . SFGT SfSY#nS ! . TSnKRkECkQIKFSGNKNNMNInICSTQD. #nLLVkl##LLKgFC#tc dt . iG . VEVVsE#NCEEQYKKLLPcLEKCT ! LnCNECNKTrcKpLKK . #EkWIWgKp kq.. aGLQkE
où "!" est l'un de I et V, "#" est l'un de N, D, Q, E, B, et Z, et "." est soit un gap, soit une position où aucun consensus n'a été atteint.
SEQ ID NO: 13
gaTTAtaTAAAGgaTgATCCTTATTCC . cAGAAtATGGAAAACTATTAAaaTTTGAT AACACTAATGCATTTAaaGAAtcTatAACAT . TaAcAAaAATGTATGTTcTTGtAGt ggtaaTGAAAAATtGatcAtAtCaGAaGGATCATcAaGTTCA . GTTCTTTTGGAACA TCgTtTTCTTATgAAAaTAGTgTAA ... CATCaAAtAAgAGAAAaGAATGTaaACAA ATAAAATTTAGTGGTAATAAAAATAATATGAATATTAAtATATGTT . CCACGCAGGA T .. aAcAAtTTgTTGGTAaAATTagAGGAgTTATTGAAAgGTTTTTGCgATAcATgT GacacTgaTAtTGGAG ... TTGAGGTAGTTaGTGAGaAtAATTGCGAAGAGCAATAT AAAAAACTGCTCCCCTgTCTTGAGAAATGcACTgTTTTGAaTTGTAATGAATGCAAT AAAACTcgATgTAAAccaTTAAAAAAGgaacAAGAAAaATGGATtTGGggtAAAcca aaacaagaagctGcaGGgTTgCAAaAAGAa
où "." est soit un gap, soit une position où aucun consensus n'a été atteint. La deuxième famille qui est un cluster comprenant la lignée FCR3 et la lignée
3F7 est caractérisée par une protéine VAR2CSA ayant un interdomaine Idl ayant pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO : 12 ou qui est codé par la séquence nucléique consensus SEQ ID NO : 14. SEQ ID NO: 12
. Y ! KdDPYsaEY . TKLSFI lNsSDa#tsSeki . knnDEvCNcNESel ssVgqaqtS . psS#KtCiTHSsIkaNKKKvCKdVKLG! r#nDKdLk ! CVIEdtsLsGV#NCCcqDlL giLQEncsD.NksgSSSNGSC#nkn## . C#knL#kvlASLtNgYKc#KCKSeqSkkn n .. WiWkK . sGne . GLQkE
où "!" est l'un de I et V, "#" est l'un de N, D, Q, E, B, et Z, et "." est soit un gap, soit une position où aucun consensus n'a été atteint.
SEQ ID NO: 13
aaTTAtaTAAAgGaTGATCCTTATTcCgcAGAATATgcAACtAAATTATCATTTATT ttAAATtCATCAGATgCtaAtAcTtCGTCTGaAaaAata . aAAAaaATaATGATGAA GtATGTAACtgTAATGAATCAGaAATTtCATctGTTGgACaGGcAcaAAcATCgGgT ccgTcGTCgaAtAAAaCATGTAtCACACATAGcTccATAaaAgCTAATAAGAAAAAA GtATGTAAAgATGTAAAGTTGGGTgTTcgTgAaAAtGATAAaGaTTTGAaAaTATGC GTAATTGAGgAcactTCCTTaaGTGGTGTTGAaAATTGTTGTTgCcAAGATTTaTTG gGAATtCTTCAAGAAaaTtGtAgTGATAAtAA . c . a . GTGgATCTAGTTCTAATGGT AGTTGTgATAAcAAaAaTcAGGAaG . ATGTgAAAaaAAtTTAGAaaAAGtacTTGCA TCTTTAactAATgGTTATAAAtgCgAcAAATGTAAATCTGgAacATCAA . Aa .... T AAcAAaAaaTGGAtATGGAaAAAAT . CtcTGGTaatgaagaaGGATTACAAaAaGAA où "." est soit un gap, soit une position où aucun consensus n'a été atteint. La deuxième famille parasitaire de Plasmodium falciparum mises en évidence par les inventeurs comprend la lignée parasitaire FCR3 et la lignée parasitaire 3D7. Le gène codant pour VAR2CSA a été isolé chez plusieurs souches parasitaires dont FCR3 (GenBank Accession Number: AY372123) et 3D7 (GenBank Accession Number: AE014188.3) et séquencé. La protéine VAR2CSA correspondante a été déduite (GenBank Accession Number: AAQ73926.1 pour la lignée FCR3 et GenBank Accession Number: AAN36095.1 pour la lignée 3D7).
Le terme "isolé ou purifié", tel qu'employé ici pour qualifier un polypeptide ou polynucléotide, désigne un polypeptide ou polynucléotide qui, de par son origine ou sa manipulation, est séparé d'au moins certains composants avec lesquels il est naturellement associé. Alternativement ou additionnellement, par "isolé ou purifié", on entend un polypeptide ou polynucléotide qui est produit ou synthétisé par l'homme. Les termes "NTS-DBLlx-DBL2x" et "NTS-DBLlx-Idl-DBL2x" sont ici employés indifféremment. Ils désignent la région de VAR2CSA constituée par les domaines : Duffy-binding-like domain lx (DBLlx), interdomaine 1 (Idl) et Duffy- binding-like domain 2x (DBL2x). Le terme "Idl-DBL2x" désigne la région de VAR2CSA constituée par interdomaine 1 (Idl) et le Duffy-binding-like domain 2x (DBL2x).
Dans certains modes de réalisation préférés, le polypeptide d'une combinaison selon l'invention consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée parasitaire FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 1, une séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 1 ou une séquence modifiée de la séquence SEQ ID NO: 1 ; et le polypeptide d'une combinaison selon l'invention consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée parasitaire 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 5, une séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 5 ou une séquence modifiée de la séquence SEQ ID NO: 5. Dans d'autres modes de réalisation préférés, le polypeptide d'une combinaison selon l'invention consistant en la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée parasitaire FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 3, une séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 3 ou une séquence modifiée de la séquence SEQ ID NO: 3, et le polypeptide d'une combinaison selon l'invention consistant en la région Idl- DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée parasitaire 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 7, une séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 7 ou une séquence modifiée de la séquence SEQ ID NO: 7.
Les termes "peptide", "protéine", "séquence peptidique", "séquence polypeptidique", et "polypeptide" sont ici employés indifféremment. Par ces termes, on entend désigner un enchaînement précis d'acides aminés, modifiés ou non, liés entre eux par des liaisons peptidiques.
Par "séquence peptidique homologue de la séquence SEQ ID NO: X", on entend toute séquence peptidique qui diffère de la séquence SEQ ID NO: X par substitution, délétion, et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit de acide aminés, à des positions telles que ces séquences peptidiques homologues ont substantiellement les mêmes propriétés biologiques que la région NTS-DBLlx-Idl- DBL2x ou la région Idl-DBL2x de VAR2CSA de la lignée FCR3 ou de la lignée 3D7. De préférence, une telle séquence peptidique homologue a un pourcentage d'identité tel qu'elle est identique à au moins 75% de la séquence SEQ ID NO: X, préférablement au moins 85%, plus préférablement encore au moins 95%.
Par "pourcentage d'identité" ou "homologie" entre deux séquences nucléotidiques ou deux séquences peptidiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après alignement optimal. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties au hasard et sur toute la longueur de la séquence. Les termes "alignement optimal" et "meilleur alignement", qui sont utilisés de façon interchangeable ici, désignent l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme décrit ci-dessous est le plus élevé. L'alignement optimal des séquences, nécessaire à la comparaison, peut être réalisé manuellement ou au moyen de logiciels informatiques (GAP, BESTFIT, BLASTP, BLASTN, FASTA, et TFASTA, qui sont disponibles soit sur le site NCBI, soit dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI). Le pourcentage d'identité entre deux séquences nucléotidiques ou deux séquences peptidiques est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100.
Par "séquence peptidique modifiée de la séquence SEQ ID NO: X ", on entend toute séquence polypeptidique qui diffère de la SEQ ID NO : X par une ou plusieurs modifications, telles que par exemple les modifications cellulaires post- traductionnelles (ex. "editing", glycosylation, sulfatation, etc). La présente invention concerne également des combinaisons d'au moins deux protéines de fusion pour le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel, où chacune des protéines de fusion consiste en un polypeptide isolé ou purifié tel que défini précédemment fusionné à une séquence partenaire de fusion donnée.
Par "séquence partenaire de fusion", on entend ici une séquence peptidique qui confère à la protéine de fusion une ou plusieurs propriétés souhaitables. Ainsi, une séquence partenaire de fusion peut consister en une protéine qui favorise l'expression de la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou de la région Idl-DBL2x dans la cellule hôte lors de la préparation de la protéine de fusion, et/ou en une protéine qui facilite la purification de la protéine de fusion, et/ou en une protéine qui augmente la stabilité (ex. stabilité plasmatique) de la protéine de fusion (par comparaison avec une séquence correspondant à NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou à Idl-DBL2x non fusionnée), et/ou en une protéine qui favorise l'administration de la protéine de fusion au sujet vacciné, et/ou en une protéine qui augmente l'effet thérapeutique recherché (par exemple en augmentant la réponse immune et vaccinale) et/ou en une protéine présentant une activité biologique ou thérapeutique.
Les partenaires de fusion qui peuvent être utilisés dans le contexte de la présente invention incluent, sans limitation, la protéine liant le maltose, la séquence signal de la protéine liant le maltose, des segments poly-histidine capables de lier des ions métalliques, un S-Tag, la glutathione-S-transférase, la thiorédoxine, la β- galactosidase, streptavidine, dihydrofolate réductase, la séquence signal pelB, la séquence signal ompA, la séquence signal de l'alkaline phosphatase, protéine fluorescente verte, une toxine telle que, par exemple l'entéro toxine LT de E. coli ou sa sous-unité B, un domaine du fragment C de la toxine tétanique, la toxine du choléra ou sa sous-unité B, CTA1-DD. D'autres partenaires de fusion peuvent être l'hormone de croissance humaine, une cytokine immuno stimulante telle que : interleukin-2 (IL-2), un facteur de croissance tel que le granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), le granulocyte colony stimulating factor (G- CSF), des peptides ou hormones tels que la calcitonin, l'interféron-beta, interféron- alpha, le glucagon like peptide 1 (GLP-1), glucagon like peptide 2 (GLP-2), PA toxin, parathyroid hormone (PTH(l-34) and PTH(l-84)), butyrylcholinesterase, glucocérébrosidase (GBA), et exendin-4. Le nouveau cluster mis en évidence par les présents inventeurs est caractérisé par une protéine VAR2CSA dont interdomaine Idl a comme séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11 ou est codé par la séquence consensus SEQ ID NO : 13. L'autre cluster mis en évidenc par les présents inventeurs est caractérisé par une protéine VAR2CSA dont interdomaine Idl a comme séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 12 ou est codé par la séquence nucléique consensus SEQ ID NO: 14. On entend par "séquence consensus" une séquence idéalisée d'une région donnée d'une protéine dans laquelle chaque position représente l'acide aminé rencontré le plus fréquemment. Les séqeunces consensus ont été établies par comparaison de séquences réelles.
La présente invention concerne également des combinaisons d'au moins deux polynucléotides isolés ou purifiés pour utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel, où chacun des polynucléotides isolés ou purifiés code pour un polypeptide tel que défini précédemment ou pour une protéine de fusion telle que définie précédemment, et contient les éléments nécessaires à l'expression, in vitro et/ou in vivo, dudit polypeptide ou de ladite protéine de fusion. Plus précisément, l'invention concerne une combinaison d'au moins deux polynucléotides, où chacun des polynucléotides code pour un polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA d'une lignée ou famille parasitaire de Plasmodium falciparum donnée ou pour une protéine de fusion comprenant ledit polypeptide, et où chacun des polynucléotides isolés ou purifiés contient les éléments nécessaires à l'expression dudit polypeptide ou de ladite protéine de fusion in vitro ou in vivo.
Les termes "séquence nucléotidique", "acide nucléique", "séquence nucléique", "polynucléotide" et "oligonucléotide" sont ici employés indifféremment. Par ces termes, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir une région d'un acide nucléique, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin ou un ADN simple brin qu'à des produits de transcription de ces ADNs.
Les éléments nécessaires à l'expression d'une séquence nucléotidique in vivo incluent, par exemple, un promoteur, une région d'initiation de la transcription, et une région de terminaison de la transcription qui sont fonctionnels dans une cellule mammalienne, préférablement une cellule humaine. De plus, des séquences qui augmentent l'expression génique, comme les introns, les séquences "enhancer" et les séquences "leader" sont souvent nécessaires pour l'expression d'une séquence codant pour une protéine immunogène. Comme il est connu dans l'art, ces éléments sont préférablement liés de façon opérationnelle à la séquence nucléotidique qui doit être exprimée. Les termes "lié opérationnellement" et "lié de façon opérationnelle" sont utilisés indifféremment et font référence à un lien fonctionnel entre les séquences régulatrices et la séquence d'acide nucléique qu'elles contrôlent. Des exemples de promoteurs utiles dans le contexte de la présente invention incluent de façon non-limitative les promoteurs du virus SV40, du virus de tumeur mammaire de souris (MMTV), du virus VIH, du virus de Moloney, du cytomégalovirus (CMV), du virus Epstein-Barr (EBV), du virus sarcome Rous (RSV), ainsi que les promoteurs de gènes humains tels que le gène humain de l'actine, de la myosine, de l'hémoglobine, de la créatine musculaire et de la métallothionéine .
La construction d'un polynucléotide consistant en une séquence nucléotidique donnée et les éléments nécessaires à l'expression de cette séquence nucléotidique entre dans les compétences de l'homme du métier.
Dans certains modes de réalisation préférés, la séquence nucléotidique du polynucléotide qui code pour la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 2 ou une séquence homologue de la SEQ ID NO: 2, et la séquence nucléotidique du polynucléotide qui code pour la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 6 ou une séquence homologue de la SEQ ID NO: 6.
Dans d'autres modes de réalisation préférés, la séquence nucléotidique du polynucléotide qui code pour la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 4 ou une séquence homologue de la SEQ ID NO: 4, et la séquence nucléotidique du polynucléotide isolé ou purifié qui code pour la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 8 ou une séquence homologue de la SEQ ID NO: 8.
Par "séquence nucléotidique homologue de la séquence SEQ ID NO: X", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID NO: X par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucléotide, ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences codent pour le même polynucléotide ou substantiellement le même polynucléotide que la SEQ ID NO: X. Une "séquence nucléotidique homologue de la séquence SEQ ID NO: X" est préférablement une séquence homologue de SEQ ID NO: X qui résulte de la dégénérescence du code génétique. Préparations de Polynucléotides et Polypeptides Relatifs à NTS-DBLlx-Idl- DBL2x et Idl-DBL2x
Les polynucléotides, protéines de fusion et polypeptides de la présente invention peuvent être préparés par n'importe quelle méthode appropriée. Les techniques pour isoler ou cloner un gène ou une séquence nucléotidique codant pour un domaine spécifique d'une protéine sont connues dans l'art et incluent l'isolation à partir d'ADN génomique, la préparation à partir d'ADN complémentaire, ou une combinaison de ces méthodes. Le clonage d'un gène, ou d'une séquence nucléotidique codant pour un domaine spécifique d'une protéine, à partir d'un ADN génomique peut être effectué par exemple en utilisant une réaction de chaîne polymérase (PCR) ou par criblage de librairies d'expression pour détecter les fragments d'ADN clonés avec des caractéristiques structurelles identiques (Innis et al., "PCR: A Guide to Method and Application", 1990, Académie Press: New York). D'autres méthodes d'amplification d'acides nucléiques connues de l'homme du métier peuvent être utilisées, comme par exemple, une réaction en chaîne par ligase (LCR), une transcription activée par ligation (LAT) et la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification). Il est également possible d'utiliser une méthode de synthèse chimique pour préparer une séquence nucléotidique. Les méthodes de synthèse chimique totale de brins d'ADN ou d'ARN sont connues de l'homme du métier, et utilisent des synthétiseurs automatisés commerciaux.
Les méthodes pour préparer une séquence peptidique incluent les méthodes chimiques (R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85: 2149-2154; "Solid Phase Peptide Synthesis" , Methods in Enzymology, G.B. Fields (Ed.), 1997, Académie Press: San Diego, CA), et les méthodes recombinantes (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Press: Cold Spring, NY) utilisant des cellules hôtes (en particulier dans le cas des protéines de fusion).
Composition d'une Combinaison
Dans une combinaison selon l'invention, les polynucléotides ou protéines de fusion ou polypeptides peuvent être présents dans n'importe quelles proportions. Dans les modes de réalisation où une combinaison de l'invention n'est constituée que de deux composants (deux polypeptides, deux protéines de fusion ou deux polynucléotides), les deux composants peuvent en particulier être présents en quantités égales. Dans les modes de réalisation où une combinaison de l'invention est constituée de trois composants (trois polypeptides, trois protéines de fusion ou trois polynucléotides), les trois composants peuvent en particulier être présents en quantités égales.
Les quantités respectives des composants d'une combinaison peuvent être déterminées et/ou optimisées par l'homme du métier en fonction de l'utilisation de la combinaison et/ou de la nature de ses composants.
II - Compositions Immunogènes et Vaccins
Les combinaisons selon l'invention sont particulièrement adéquates pour une utilisation comme médicaments dans la gestion du paludisme gestationnel. En effet, comme l'ont démontré les inventeurs, ces combinaisons permettent d'induire des anticorps anti- adhérence à large spectre d'activité. A ce titre, elles peuvent être utilisés, comme telles ou sous une forme modifiée, en tant que composition immunogène ou vaccin.
Une modification appropriée des polypeptides contenus dans une combinaison selon l'invention est la réalisation de conjugués. Ceux-ci comportent au moins un des polypeptides d'une combinaison selon l'invention, lié à un support. Les conjugués peuvent être obtenus par couplage via une liaison convalente entre un polypeptide et un support physiologiquement acceptable, non toxique, naturel ou synthétique, susceptible par exemple d'accroître le caractère immunogène du polypeptide.
Concernant les conjugués, on citera à titre d'exemple, la demande WO 2006/124712, qui décrit des méthodes de préparation de conjugués comportant une pluralité de peptides antigéniques de Plasmodium falciparum liés à une protéine support améliorant l'immunogénicité desdits antigènes.
Les supports préférés selon l'invention sont choisis parmi les particules virales, des lipides, par exemple des lipides de type C16-C18, les polylysines, les poly(DL- alanine)-poly(Lysine)s, la nitrocellulose, les microparticles de polystyrène, les microparticules de billes de latex, les polymères biodégradables, les microparticules de polyphosphoglycanes, les protéines supports telles que l'OPMC (outer membrane protein complex of Neisseria meningitidis) ou l'OPMC améliorié, la BSA (bovine sérum albumin), le TT (tetanus toxoid), l'ovalbumine, la KLH (heyhole limpet hemocyanin), la THY (bovine thyroglobulin), l'HbSAg et l'HBcAg du virus de l'hépatite B, les protéines capsides rotavirus, la protéine Ll du virus papillome humain, la VLP (virus like particle) de type 6, 11 et 16, le tuberculin PPD (purified protein derivative).
Compositions Immunogènes
Une composition immunogène selon l'invention comprend, en plus d'une combinaison décrite ici, un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. Le terme "véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique" désigne tout véhicule ou milieu qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique du principe actif de la composition, et qui n'est pas toxique pour l'individu à la concentration à laquelle il est administré. L'utilisation de tels véhicules ou excipients pour la formulation de substances actives est bien connue dans l'art ("Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co . : Easton, PA) .
La formulation d'une composition immunogène de la présente invention peut varier en fonction de la voie d'administration et du dosage. Après formulation avec au moins un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, une composition immunogène de l'invention peut être administrée sous toute forme appropriée pour l'administration à un être humain, par exemple sous forme solide ou liquide. L'homme du métier sait sélectionner les véhicules et excipients les plus appropriés à la préparation d'un certain type de formulation. Ainsi, par exemple, les excipients tels que l'eau, 2-3-butanediol, solution isotonique de chlorure de sodium, mono ou diglycérides synthétiques, et acide oléique sont souvent utilisés pour la formulation de préparations injectables. Les compositions liquides, y compris les émulsions, microémulsions, solutions, suspensions, sirops, etc., peuvent être formulées en présence de solvants, d'agents solubilisants, d'émulsifiants, d'huiles, d'acides gras et d'autres additifs comme des agents de suspension, des conservateurs, des agents viscosants, etc. Les compositions solides pour administration par voie orale peuvent être formulées en présence d'un excipient inerte comme le citrate de sodium, et éventuellement d'additifs tels que des agents liants, des agents humectants, des agents de désintégration, des accélérateurs d'absorption, des agents lubrifiants, etc. Selon un mode de réalisation préféré, les compositions immunogènes et les vaccins de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants utilisés en combinaison. Des adjuvants classiques tels que le Montanide et/ou l'Alum peuvent être utilisés. Cependant d'autres adjuvants tels que QS21, SBQS2, MF59, mLT, PHL, CpG DNA, phosphate de calcium, sulfate de calcium déshydraté, PLG, CT, LTB, CT/LT, AS02A sont également appropriés.
Les compositions immunogènes et vaccins selon l'invention peuvent comporter en outre au moins un antigène spécifique des stages préérythrocytaires (CSP, TRAP, LSA-1, LSA-3, SALSA, STARP, EXP-1), érythrocytaires asexués (MSP-1, MSP-3, AMA-1, EBA-175, GLURP, MSP-2, MSP-4, MSP-5, RAP-2, RESA, PfEMP-1, toxine GPI synthétituq) ou sexués (PfS25).
Vaccins, Vaccins Polypeptidiques, Vaccins ADN
D'une façon générale un vaccin contre le paludisme gestationnel selon l'invention comprend au moins une combinaison décrite ici et est utilisé pour induire chez les sujets vaccinés des anticorps inhibiteurs de la cytoadhérence au CSA. En particulier, l'invention concerne un vaccin ADN (également appelé vaccin plasmidique ou vaccin polunucléotidique) contre le paludisme gestationnel. L'invention concerne aussi un vaccin protéique (également appelé vaccin polypeptidique) contre le paludisme gestationnel. Vaccins Protéiques
La présente invention a donc pour objet un vaccin protéique comprenant une combinaison d'au moins deux polypeptides telle que décrite plus haut ou une combinaison d'au moins deux protéines de fusion telle que décrite plus haut.
La préparation d'un vaccin protéique, qui peut se faire par voie chimique ou biochimique (protéine recombinante) entre dans les compétences de l'homme du métier.
L'administration d'un vaccin protéique peut se faire par n'importe quelle voie appropriée, comme par exemple par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, orale, topique ou systémique. Vaccins ADN
La présente invention a aussi également pour objet un vaccin ADN contre le paludisme gestationnel. La vaccination génétique ou vaccination par ADN a pour but d'induire une réponse immunitaire et consiste à introduire directement dans certaines cellules de l'organisme un gène ou une séquence polynucléotidique codant pour un antigène vaccinal ou un plasmide purifié d'ADN contenant une séquence codant pour l'antigène vaccinal. Les cellules concernées sont, dans l'exemple de l'invention, des cellules musculaires, mais tout autre type de cellule peut convenir, comme par exemple les cellules de la peau. L'administration se fait, de façon non- exclusive, par injection intra-musculaire ou par "bombardement" de particules sur la peau ou encore par voie nasale. L'ADN pénètre dans les cellules musculaires, les cellules de la peau ou autres; et ces cellules synthétisent ensuite elle-même l'antigène. L'antigène est présenté au système immunitaire et déclenche une réponse (la production d'anticorps capables, lors d'une infection, de reconnaître spécifiquement cet antigène sur le parasite). Le vaccin est donc produit, localement, par l'organisme de l'individu à immuniser. Cette méthode de vaccination, simple et peu coûteuse, présente d'importants avantages en termes d'efficacité: l'antigène ainsi produit se présente généralement sous sa séquence peptidique native, fusionnée ou non à une ou plusieurs séquences peptidiques (partenaires de fusion). Surtout, il est produit de façon prolongée par les cellules de l'organisme, et cette présentation durable de l'antigène au système immunitaire devrait permettre d'éviter le recours aux rappels. De plus, les vaccins ADN sont chimiquement définis et thermiquement stables, ce qui réduit la nécessité de maintenir la chaîne du froid.
La présente invention a donc pour objet un vaccin ADN comprenant une combinaison d'au moins deux polynucléotides telle que décrite plus haut. Un polynucléotide d'une combinaison de l'invention peut être un ADN nu, en particulier plasmide vaccinal circulaire, super-enroulé ou non, ou une molécule d'ADN linéaire, incorporant et exprimant in vivo une séquence nucléotidique codant pour la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou pour la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 ou de la lignée 3D7 ou du nouveau cluster. Par "ADN nu", on entend comme cela est aujourd'hui communément accepté, une unité de transcription ADN sous forme d'une séquence polynucléotidique comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour un antigène vaccinal et les éléments nécessaires à son expression in vivo. Les polynucléotides d'une combinaison selon l'invention peuvent être avantageusement insérés dans un plasmide de type DNA-CSP, Nyvac pf7, VR1020, VR1012, etc.
Il est également envisagé que l'ADN nu soit incorporé dans un vecteur de médicament. Des exemples de vecteurs de médicaments appropriés incluent de façon non-limitative des microcapsules biodégradables, des complexes immuno- stimulants, des liposomes, des lipides cationiques et des vecteurs vivants génétiquement atténués comme des virus et des bactéries.
Un vaccin ADN de l'invention peut également être administré en conjonction avec un agent qui améliore la pénétration du matériel génétique du vaccin dans les cellules traitées. Ainsi le vaccin ADN peut être formulé pour contenir un tel agent ou être administré en même temps qu'un tel agent. Des exemples d'agents qui améliorent la pénétration du matériel génétique du vaccin dans les cellules traitées incluent de façon non limitative les esters d'acide benzoïque, les anilides, les amidines, les uréthanes, et leurs sels d' hydrochlorure (Brevet U.S. 6,248,565). L'administration de l'ADN aux cellules peut-être favorisée par des vecteurs chimiques (comme, par exemple, les polymères cationiques ou les lipides cationiques), des techniques physiques telles que l'électroporation, la sonoporation, la magnétofection, etc, ou encore des vecteurs viraux tels que les virus associés à l'adénovirus, etc.
III - Utilisations des Compositions Immunogènes et Vaccins
Les compositions immunogènes et les vaccins peuvent être avantageusement utilisés pour immuniser des êtres humains de sexe féminin (des jeunes filles prépubères et des femmes en âge de procréer) dans le cadre d'une thérapie préventive du paludisme gestationnel.
En conséquence, l'invention concerne également des méthodes de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel. En particulier, l'invention fournit une méthode pour induire une réponse immunitaire protectrice contre Plasmodium falciparum chez un être humain de sexe féminin, la méthode comprenant une étape d'administration d'une quantité efficace d'une composition immunogène ou d'un vaccin décrit ici. L'invention fournit également une méthode de vaccination d'un être humain de sexe féminin contre Plasmodium falciparum, la méthode comprenant une étape d'administration d'une quantité efficace d'un vaccin, en particulier d'un vaccin ADN ou d'un vaccin protéique décrit ici.
Dans certains modes de réalisation préférés, une méthode de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel est caractérisée en ce qu'elle induit, chez l'être humain de sexe féminin, des anticorps qui empêchent l'adhésion d'érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum au récepteur placentaire CSA.
Dans les méthodes de traitement ou de prévention du paludisme gestationnel selon l'invention, l'administration de la composition immunogène ou du vaccin peut se faire par n'importe quelle voie appropriée (voie orale, parentérale, mucosale). Dans certains modes de réalisation, l'administration d'un vaccin ADN se fait par voie intramusculaire, intradermique, ou mucosale. Dans d'autres modes de réalisation, l'administration d'un vaccin protéique se fait, par exemple, par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, orale, topique ou systémique.
Une composition immunogène ou un vaccin selon l'invention peut être administré en une seule dose ou en plusieurs doses. L'homme de l'art saura déterminer la dose efficace de protéine immunisante ou d'ADN à utiliser dans chaque protocole d'immunisation ou de vaccination.
IV - Kits
La présente invention vise également un kit pour la prévention contre le paludisme gestationnel. Plus spécifiquement, le kit comprend du matériel utile pour la réalisation d'une vaccination selon la méthode de l'invention. En général, un kit comprend une combinaison, une composition immunogène ou un vaccin selon l'invention, et des instructions pour effectuer une vaccination contre le paludisme gestationnel. De façon optionnelle, le kit peut en outre comprendre des moyens pour effectuer la vaccination.
Dans certains modes de réalisation, un kit selon l'invention est configuré de telle sorte que les composants d'une combinaison selon l'invention sont fournis séparément (par exemple dans des récipients différents). Une telle configuration permet aussi bien l'administration simultanée que l'administration séquentielle des composants de la combinaison. Par "administration simultanée", on entend ici une administration des composants, ensemble ou séparément, à approximativement le même moment (par exemple, à un intervalle de 5, 10, 15 ou 30 minutes les uns autres). Par "administration séquentielle", on entend ici une administration des composants séparément et à différents moments (par exemple à différentes heures du même jour, ou à un ou plusieurs jours d'intervalle).
Le kit peut comprendre des réactifs ou des solutions pour la préparation de la composition à administrer. Les différents composants du kit peuvent être fournis sous forme solide (par exemple sous forme lyophilisée) ou sous forme liquide. Un kit peut éventuellement inclure un récipient contenant chacun des réactifs ou solutions, et/ou des récipients (tubes à essais, flacons, etc.) pour réaliser la préparation de la composition à administrer. Enfin, une notice sous la forme prescrite par une agence gouvernementale régulant la vente et l'utilisation de produits pharmaceutiques peut être incluse dans le kit.
A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence.
Les exemples suivants et les figures sont présentés pour illustrer certains modes de réalisation des procédures décrites ci-dessus et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention. Exemples
Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif seulement et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention.
Il a été démontré que des anticorps contre des constructions correspondant à une région de la partie N-terminale de VAR2CSA d'un seul variant parasitaire ne pouvaient inhiber que 70% de l'adhérence au CSA d'isolats de femmes enceintes (Bigey et al, J Infect Dis., 2011, 204: 1125-1133 ; Bordbar et al, Vaccine, 2012, 30: 1343-1348). Les inventeurs ont précédemment identifié une région dimorphique dans le domaine DBL2x de VAR2CSA (Sander et al, PLoS One, 2009, 4: e6667), conduisant à deux catégories phylogénétique distincte de type FCR3 et de type 3D7. Dans l'étude présentée ci-dessous, les inventeurs ont étudié la prévalence des types de variant du DBL2x dimorphique parmi les parasites Plasmodium falciparum isolés d'échantillons obtenus de femmes enceintes du Bénin et la capacité inhibitrice d'adhésion d'anticorps spécifiques induits contre la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de chaque sérotype sur les érythrocytes infectés isolés de femmes enceintes. Méthodes et Matériels Utilisés
Isolais de Plasmodium falciparum. Les femmes enceintes n'ont été inclues dans la présente étude qu'après leur consentement obtenu par écrit. L'étude a été approuvée par le Comité Consultatif de Déontologie et d'Ethique de l'IRD (Institut de Recherche pour le Développement), et le comité d'éthique de la faculté des sciences de la santé (Université de Abomey-Calavi, Bénin). Toutes les procédures utilisées dans la présente étude sont conformes aux régulations Européennes et Nationales. La procédure d'immunisation animale est conforme aux directives du FELASA (Fédération of Laboratory Animal Science Associations) et a été approuvée par le Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale affilié à l'Université Paris Descartes.
Isolais de Plasmodium falciparum. Les échantillons de terrain d' érythrocytes infectés ont été obtenus de femmes enceintes à la maternité Suru Léré dans la région Est du Cotonou. Le site d'étude est caractérisé par un paludisme hyper-endémique dans la zone lagunaire et un fort taux de transmission du paludisme avec deux pics correspondant aux deux saisons pluvieuses (Akogbeto et al., Parasitologia, 1992, 34: 147-154). Du sang veineux périphérique a été collecté dans des Vacutainers contenant l'anticoagulant citrate phosphate dextrose adénine (CPDA), lors des visites prénatales et au moment de l'accouchement. Les érythrocytes ont été séparés du plasma et lavés avec du RPMI 1640 (Lonza). 200 \L de culots d' érythrocytes ont été homogénéisés dans 10 volumes de réactif TRIzol (Invitrogen) et congelés à -80°C jusqu'au moment de l'extraction de l'ARN total ou congelés à -20°C jusqu'au moment de l'extraction de l'ADN total. Les culots des érythrocytes infectés par des parasites au stade d'anneaux (ring ou trophozoïte jeune) ont été immédiatement cultivés in vitro pour obtenir des trophozoïtes âgés comme précédemment décrit (Trager et al., Science, 1976, 193: 673-675). En bref, les isolais ont été cultivés dans des récipients contenant du RPMI 1640 additionné d'HEPES et de L-glutamine (Lonza Biowhittaker), 0,3 g/L l-glutamine, 0,05 g/L gentamicine, 5 g/L albumax. Les récipients de culture ont été mis sous atmosphère d'un mélange de 92,5% N2, 2% 02 et 5,5% C02 et incubés à 37°C pour pas plus de 48 heures avant les tests. Les souches parasitaires de laboratoire FCR3, HB3 et NF54 ont été cultivées dans des érythrocytes 0+ et ont été sélectionnées après plusieurs étapes de panning sur la lignée cellulaire BeWo comme précédemment décrit (Haase et al, Infect. Immun., 2006, 74: 3035-3038).
Extraction d'ADN et Génotypage msp. L'ADN a été extrait de 100 de culot de sang avec le kit GeneJet Genomic Purification (Fermentas) conformément aux recommandations du fabricant. Les gènes mspl et msp2 ont été amplifiés par nested PCR en utilisant des amorces spécifiques (Snounou et al., Trans R Soc Trop Med Hyg , 1999, 93: 369-374). La multiplicité d'infection (MOI) a été déterminée pour chaque échantillon.
Extraction d'ARN, Synthèse de cDNA et Génotypage des DBL2x. Les ARN ont été extraits d'échantillons congelés conservés dans le réactif TRIzol (In vitro gen) conformément aux recommandations du fabricant. Les ARN totaux ont été traités avec DNAse I (Invitrogen) pendant 15 minutes à température ambiante conformément aux recommandations du fabricant pour éliminer toute contamination potentielle par de l'ADN génomique (gADN). L'absence de gADN dans les échantillons d'ARN a été confirmée par une absence d'amplification après 40 cycles d'une PCR en temps réelle avec des amorces ciblant le gène housekeeping seryl- tRNA synthetase (Salanti et al, Mol Microbiol, 2003, 49: 179-191). La transcription inverse de l'ARN (sans ADN) a été effectuée avec du Thermoscript (Invitrogen) et des amorces hexamères aléatoires pendant 1 heure à 50°C dans un volume total de 20\L conformément aux recommandations du fabricant. Pour le génotypage du motif de séquence dimorphique (DSM) dans le domaine
DBL2x de VAR2CSA des isolais de Plasmodium falciparum (Sander et al, PLoS One, 2009, 4: e6667), ce domaine a été sélectionné pour amplifier le cDNA de chaque isolât avec une paire d'amorces (5'-TTAYCCCCAAGAACACA-3' et 5'- TTTT A AATTTTTTCC ATG A A- 3 ' ) . Les réactions ont été effectuées avec la Polymérase Taq Fusion de fidélité élevée (pour obtenir des rendements plus élevés et des taux de mutation plus faibles) dans les conditions suivantes: 94°C pendant 1 minute, suivi de 35 cycles à 94°C pendant 30 secondes, 50°C pendant 30 secondes et 68°C pendant 50 secondes, et une extension finale à 68°C pendant 10 minutes. Les produits de PCR ont été digérés avec les enzymes de restriction BstCI (qui coupe les DSM de type FCR3) et Hppyl88I (qui coupe les DSM de type 3D7) pendant 1 heure à 50°C et 37°C, respectivement. Les produits digérés ont été séparés par électrophorèse sur 1,5% de gel d'agarose.
Production des Anticorps et Préparation des IgG. Le fragment NTS-DBLlx- Idl-DBL2x et la séquence entière du gène optimisé varlcsa des lignées parasitaires FCR3 et 3D7 ont été utilisés pour produire des IgG anti-VAR2CSA spécifiques, par vaccination ADN comme précédemment décrit (Bigey et al., J Infect Dis., 2011, 204: 1125-1133). En bref, les séquences d'ADN ont été clonées dans un vecteur dérivé de pVaxl et fusionné à la séquence signal mEPO comme précédemment décrit (Trollet et al., Infect Immun., 2009, 77: 2221-2229). Des immunisations ont été effectuées sur des souris femelles suisses âgées de 6 semaines et sur des lapins de Nouvelle- Zélande (Janvier- France). Les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale avec un mélange kétamine-xylazine et dans le cas des lapins l'injection a été effectuée à 5 sites le long de chaque muscle longissimus dorsi. Le transfert d'ADN a été effectué par des impulsions électriques transcutanées appliquées par deux électrodes en acier inoxydable placées à chaque site d'injection. Les animaux ont été immunisés aux jours 0, 30 et 60, et les antisera ont été collectés aux jours 0 et 15 après chacune des immunisations. Les IgG totaux ont été purifiés dans l'échantillon final de sérum de souris ou de lapin sur colonne Hi-Trap sur laquelle la protéine recombinante correspondante avait été couplée conformément aux recommandations du fabricant (GE Healthcare).
Cytométrie de Flux. La réactivité des IgG purifiés envers la surface des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum a été analysée par cytométrie de flux (FACS Calibur) comme précédemment décrit (Magistrado et al., Vaccine, 2011, 29: 437-443). En bref, les érythrocytes infectés adhérant au CSA (FCR3-Bewo et HB3-Bewo) et les isolats parasitaires de terrain ont été enrichis par exposition à un champ magnétique d'intensité élevée (VarioMACS and CS columns, Miltenyi). Pour chaque test, 2xl05 d' érythrocytes infectés ont été marqués avec du bromure d'éthydium, et séquentiellement exposés à un IgG de lapin, et puis à un anticorps anti-lapin conjugué à FITC (Invitrogen). Les données ont été acquises et analysées, et l'intensité médiane de fluorescence (MFI) a été déterminée. Le marquage de la surface de VAR2CSA est considéré comme positif si le rapport de MFI est supérieur à 1,2 (MFI avec post- immunisation IgG au jour 75 / MFI avec pré-immunisation IgG au jour 0) comme décrit par Magistrado et al. (Vaccine, 2011, 29: 437-443).
Tests d'Inhibition d'Adhésion. La capacité des anticorps à inhiber l'adhésion des érythrocytes infectés à la chondroïtine sulfate (CSPG) a été déterminée par un test en boîtes de Pétri précédemment décrit (Bigey et al., J Infect Dis., 2011, 204:1125-1133). Brièvement, des boîtes de Pétri (Falcon 351029) ont été recouvertes par des spots de 100 x 15 mm de 20 \L de 5 mg/mL CSPG-Decorin (Sigma) ou de 10 μg/mL d'albumine de sérum bovin (BSA) dilué dans du PBS. Les spots ont été incubés pendant la nuit à 4°C en chambre humide. Chaque spot a été bloqué avec 3% BSA dans du PBS pendant 30 minutes à 37°C. Des suspensions enrichies en érythrocytes infectés de trophozoïtes âgés ont été obtenues par filtration sur une colonne magnétique (VarioMACS, Miltenyi). La suspension dont la densité parasitaire a été ajustée à 20% dans lxlO5 cellules, a ensuite été bloquée pendant 30 minutes à température ambiante (RT) dans une solution de BSA à 3% diluée dans du RPMI. La préparation érythrocytaire a été incubée avec des IgG purifiés (0,25 mg/mL) ou 500 μg/mL de CSA soluble (Sigma), et les cellules ont ensuite été mises à adhérer pendant 15 minutes à température ambiante sur des boîtes de Pétri pré- coatées avec différents ligands. Les cellules non-adhérentes ont été éliminées par un système de lavage automatique. Les spots ont été fixés avec 1,5% de glutaraldéhyde dans du PBS, colorés avec une solution de Giemsa et les érythrocytes infectés adhérents ont été comptés au microscope.
Légendes des Figures
Figure 1 est un graphe montrant la distribution des signatures de séquence dimorphique de la région DBL2x de VAR2CSA parmi les parasites infectant les femmes enceintes. Le motif de séquence dimorphique (DSM) dans DBL2x qui distingue les allèles de VAR2CSA en deux sous-groupes (les types 3D7 et FCR3) ont été génotypés dans des parasites collectés chez des femmes enceintes au Bénin. Les proportions du type 3D7 (histogrammes blancs), du type FCR3 (histogrammes rayés) et de mélange des deux génotypes (histogrammes noirs) sont présentées. La multiplicité d'infection (MOI) est indiquée pour chaque catégorie. Figure 2 est un graphe montrant la reconnaissance de VAR2CSA exprimé dans des isolais de terrain par les IgG dirigés contre les différentes constructions de Var2CSA. La capacité de reconnaissance de VAR2CSA exprimé par les IgG induits contre les constructions de VAR2CSA (NTS-DBL2X/3D7 et NTS-DBL2X/FCR3) et contre le domaine extracellulaire entier de VAR2CSA (NTS-DBL1-68/FCR3) de la souche FCR3 a été étudiée sur des isolais de terrain par cytométrie de flux. Les parasites ont été séparés en fonction de leur catégorie DSM (DSM 3D7, DSM FCR3 ou DSM Mélange FCR3/3D7). Les barres indiquent la moyenne du rapport MFI (MFI correspondant à la réactivité de l'IgG de l'animal hyper- immune / MFI correspondant à la réactivité de l'IgG du même animal pré-immun.
Figure 3 comprend deux graphes montrant l'activité inhibitrice d'adhésion d'IgG induit contre chacun des deux 'sérotypes' de NTS-DBLlx-Idl-DBL2x sur des isolais de terrain. L'activité inhibitrice d'adhésion a été évaluée sur 18 isolais de Plasmodium falciparum fraîchement obtenus de femmes enceintes. Les données sont présentées sous forme de pourcentage d'inhibition pour chaque anticorps normalisé par la valeur d'inhibition du CSA (utilisée comme référence de l'inhibition d'adhésion maximale). Les histogrammes sont présentés pour chacun des types de DSM détectés dans l'isolât:□ pour les DSM de type 3D7, m pour les DSM de type FCR3, et■ pour les DSM de mélange des deux génotypes. Figure 4 est une série de trois graphes montrant le profil d'inhibition des anticorps sur des souches sélectionnées et adaptées et se liant au CSA. Les souches FCR3, HB3 et NF54 sélectionnées sur les cellules Bewo (FCR3-Bewo, HB36-Bewo et NF54-Bewo) ont été utilisées pour évaluer la capacité des anticorps induits à inhiber l'adhérence des 3 souches de laboratoire à CSPG. La fonctionnalité in vitro des mélanges d'anticorps a également été évaluée. Les valeurs présentées sont normalisées avec la valeur d'inhibition du CSA.
Figure 5 est une représentation des relations phylogénétiques entre les séquences couvrant la région ID1-DBL2X de VAR2CSA générées à partir du CDNA de 123 isolais parasitaires de femmes enceintes. L'arbre phylogénétique illustre la relation phylogénétique entre les différentes séquences, avec les regroupements des variants dichotomiques définis dans le DBL2X qui discrimine les clusters 3D7 et FCR3 et les regroupements d'un nouveau cluster dont l'identité est définie dans la région Idl de VAR2CSA. Les valeurs de bootstrap sont indiquées à chaque bifurcation principale.
Résultats
Détermination de la Multiplicité d'Infection et Typage Moléculaire de var2csa parmi les Parasites Isolés de Femmes Enceintes. Au total, 122 parasites ont été collectés, et il a été déterminé par génotypage de msp-2 que la multiplicité d'infections (MOI) est de 3,10 génotypes distincts par isolât avec une fourchette de 1 à 7. Une méthode de PCR-RFLP a été développée et mise en œuvre sur tous les isolais pour étudier la distribution des deux variants majeurs de varlcsa parmi les isolais de terrain du Bénin. L'analyse de la région dimorphique de varlcsa dans les isolais de femmes enceintes a révélé la présence d'au moins un des deux variants dimorphiques décrits par Sander et al. (PLoS One, 2009, 4: e6667) dans tous les parasites. Les transcrits de DSM de type 3D7 ont été retrouvés dans 54 isolais (44%) et les transcrits de DSM de type FCR3 ont été retrouvés dans 47 isolais (39%) (Figure 1). Dans 21 isolais (17%), les deux types de transcrits ont été détectés, suggérant un mélange de génotypes. Aucune différence n'a été observée entre les MOI des isolais des groupes déterminées après le typage de varlcsa (les MOI déterminés sont de 3,05 dans les isolais exprimant le type 3D7, de 2,98 dans les isolais exprimant le type CFR3 et de 3,6 dans les isolais avec un mélange des deux signatures DSM).
IgG Spécifiquement Induits contre la Région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x des Lignées FCR3 et 3D7 reconnaissent tous les Isolais des Femmes Enceintes. Le niveau de reconnaissance de VAR2SCA exprimé à la surface des érythrocytes a été estimé immunologiquement sur 47 érythrocytes infectés par Plasmodium jalciparum isolés de femmes enceintes. Parmi ces isolais, il a été trouvé que 16 d'entre eux présentent le DSM de type 3D7, 21 présentent le DSM de type FCR3 et un mélange de génotypes a été détecté dans 10 isolais. Les érythrocytes infectés ont été marqués et évalués par cytométrie de flux en utilisant des IgG purifiés de sera d'animaux vaccinés. Les IgG anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x spécifiques aux variants varlcsa de 3D7 et FCR3, et les IgG induits contre le domaine extracellulaire entier de VAR2CSA ont été utilisés dans cette expérience. Les IgG induits contre le domaine extracellulaire entier de VAR2CSA ont été utilisés pour estimer le niveau de reconnaissance absolu de la protéine VAR2CSA native exprimée à la surface des érythrocytes infectés. Un niveau de réactivité élevé a été observé avec des anticorps induits contre le domaine extracellulaire entier de VAR2CSA comparé aux anticorps dirigés contre le domaine NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de VAR2CSA quelle que soit l'origine de ce dernier (P < 0,05). Cependant, aucune différence significative n'a été observée entre les niveaux de reconnaissance de la protéine native VAR2CSA par les IgG anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x induits contre le variant FCR3 et contre le variant 3D7 (P = 0,59). Les inventeurs ont ensuite étudié si la reconnaissance de surface des anticorps était influencée par le génotype de varlcsa. Les isolats ont été divisés en fonction du type de DSM de leur varlcsa. Les données des érythrocytes infectés marqués par chaque anticorps ont été séparées en fonction du DSM des isolats. Aucune différence significative n'a été observée au niveau de la reconnaissance de VAR2CSA par chaque anticorps testé quel que soit le type de DSM (Figure 2).
Propriétés d'Inhibition de l'Adhésion des IgG anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x Spécifiques des Variants FCR3 et 3D7. L'analyse de l'activité inhibitrice des anticorps a été également effectuée sur 18 échantillons d' érythrocytes infectés se liant au CSA obtenus de femmes enceintes du Bénin. Le typage des DSM de ces isolats a révélé que 6 d'entre eux (33%) expriment le DSM de type 3D7 de varlcsa ; 8 (44%) expriment le DSM de type FCR3 de varlcsa ; et 4 (22%) sont des mélanges des deux types (Figure 3).
Le CSA soluble a été utilisé comme référence de l'inhibition maximale d'adhésion. Le degré d'inhibition des parasites par les anticorps anti-NTS-DBLlx- Idl-DBL2x des variants FCR3 et 3D7 a été normalisé à l'inhibition de CSA. La moyenne de l'activité inhibitrice des anticorps sur tous les isolats est de 80% [écart interquartile: 50,8 - 100] pour l'anticorps anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x du variant FCR3 et 97% [écart interquartile: 55,3 - 100] pour l'anticorps anti-NTS-DBLlx-Idl- DBL2x du variant 3D7. Différents modes d'inhibition ont été observés avec les anticorps en fonction des types de varlcsa des isolats. 16 des 18 isolats testés (89%) ont été efficacement inhibés par les anticorps induits contre le domaine NTS-DBLlx- Idl-DBL2x du variant FCR3 (43-100%) alors qu'une forte activité inhibitrice des anticorps induits contre le domaine NTS-DBLlx-Idl-DBL2x du variant 3D7 (50- 100%) a été observée sur 15 des 18 isolats (84% testés). Cependant, il apparaît que les activités des deux types d'anticorps sur les différents isolats testés diffèrent les unes des autres. L'effet inhibiteur de l'un des deux types d'anticorps peut être faible dans un isolât alors que les anticorps induits contre l'autre sérotype peut présenter un effet inhibiteur élevé sur le même parasite. Par exemple, les isolats OPT144 et OPT161 ne sont pas inhibés par les anticorps induits contre le sérotype FCR3, et de façon intéressante, ces isolats portant le DSM de type 3D7 ont été fortement inhibés par les IgG spécifiques du domaine NTS-DBLlx-Idl-DBL2x du variant 3D7. Un profil similaire a été obtenu avec l'isolât OPT105 qui est plus fortement inhibé avec l'IgG spécifique du sérotype DSM homologue du variant FCR3 et moins bien inhibé avec les IgG anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x spécifique du variant 3D7. Au contraire, dans deux isolats avec des sérotypes 3D7 (OPT127 et OPT141), une meilleure inhibition a été observée avec des anticorps induits contre le sérotype FCR3 opposé. D'une manière générale, une complémentarité d'inhibition a été observée sur les isolats de terrain, avec une augmentation substantielle dans la portée de l'inhibition d'adhérence des isolats de terrain au CSPG atteignant maintenant 100% des isolats actuellement inhibés. De plus, 8 des 10 isolats (80%) avec un DSM de type 3D7 de varlcsa ont été inhibés avec des anticorps anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x induits contre le variant DSM homologue alors que tous les isolats avec le DSM de type FCR3 de varlcsa ont été efficacement inhibés par les IgG anti-NTS-DBLlx-Idl- DBL2x spécifiques du sérotype FCR3. La capacité des anticorps à inhiber l'adhérence au CSA d'érythrocytes infectés exprimant VAR2CSA et le comportement du mélange des deux anticorps induits contre le domaine NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de VAR2CSA ont été étudiés sur les souches de laboratoire et des souches sélectionnées par Bewo : FCR3 et HB3 (qui ont un DSM de type FCR3) et NF54 (qui un background de type 3D7). Une activité inhibitrice élevée a été obtenue avec des anticorps envers des érythrocytes infectés appartenant au DSM homologue. Les anticorps anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x induits contre le variant FCR3 inhibent totalement (100%) l'adhérence au CSA des lignées FCR23 et HB3 (Figure 4). Cependant, seule une inhibition partielle de ces lignées (20% à 40%) a été observée avec les IgG anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x induits contre le variant 3D7, qui par ailleurs inhibent fortement l'adhérence au CSA du parasite NF54. De plus, le mélange des IgG anti-NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la lignée FCR3 et de la lignée 3D7 conserve la propriété d'inhiber totalement l'adhérence de tous les érythrocytes infectés à CSPG. Identification d'un troisième cluster. Les variations de séquence du domaine NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA du transcrit de 123 isolais parasitaires de femmes enceintes du Bénin ont été analysées. L'ARN total a été extrait des parasites fraîchement collectés, et l'ADNc a été synthétisé. Le gene var2csa a été amplifié à partir de l'ADNc en utilisant un enzyme haute fidélité (Fusion), et des amorces universelles ont été utilisées. Dix (10) clones ont été séquencés pour chaque isolât et les séquences ont été générées par alignement multiple des séquences protéiques et nucléiques.
Les résultats des analyses ont clairement mis en évidence une ségrégation des variants parasitaires dans la région Idl de VAR2CSA. Ce nouveau domaine de dichotomie, qui n'a pas été décrit jusqu'à maintenant, est localisé dans une région critique de la protéine VAR2CSA qui est essentielle à ses propriétés de liaison au CSA. Cette ségrégation très nette des séquences aura des implications dans la combinaison d'un nombre limité de variants requis pour un vaccin optimal basé sur VAR2CSA.
Les alignements de séquences ont conduit à l'établissement de deux séquences consensus représentatives de interdomaine Idl de VAR2CSA. La première, ID1A ou SEQ ID NO: 11 correspond au cluster nouvellement identifié, et la deuxième ID1B ou SEQ ID NO: 12 correspond à l'autre groupe de séquences. Conclusions
Ce travail démontre que que la région NTS-DBL2X de VAR2CSA contient des épitopes anti-adhérence conservés et indique que le développement d'un vaccin efficace à base de VAR2CSA nécessitera la combinaison d'un nombre restreint de variants VAR2CSA. La combinaison des trois variants majeurs de VAR2CSA utilisés dans ce travail sera essentielle pour développer un vaccin efficace contre le paludisme placentaire.

Claims

Revendications
Combinaison d'au moins deux polypeptides isolés ou purifiés, le premier polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA d'une première famille parasitaire de Plasmodium jalciparum, et le deuxième polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl- DBL2x de la protéine VAR2CSA d'une deuxième famille parasitaire de Plasmodium jalciparum, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la première famille est la famille parasitaire de Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl qui a pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11 ou qui est codé par la séquence consensus SEQ ID NO: 13, et la deuxième famille est la famille parasitaire de Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl qui a pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 12 ou qui est codé par la séquence consensus SEQ ID NO: 14.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la deuxième famille parasitaire de Plasmodium jalciparum comprend la lignée parasitaire FCR3 et la lignée parasitaire 3D7.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle consiste en trois polypeptides isolés ou purifiés, le premier polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la famille parasitaire de Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl ayant pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11, le deuxième polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS- DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3, et le troisième polypeptide isolé ou purifié consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7. Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisée en ce que la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 1 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 1, et la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 5 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 5.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisée en ce que la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 3 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 3, et la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 7 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 7.
Combinaison pour l'utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que chacun des aux moins deux polypeptides isolés ou purifiés est fusionné à une séquence partenaire de fusion, formant ainsi une protéine de fusion.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que chacune des séquences partenaires de fusion est choisie indépendamment dans le groupe constitué de la protéine liant le maltose, la séquence signal de la protéine liant le maltose, un S-tag, la glutathione-S-transférase, la thiorédoxine, la β-galactosidase, la streptavidine, la dihydrofolate réductase, la séquence signal pelB, la séquence signal ompA, la séquence signal de l'alkaline phosphatase, la protéine fluorescente verte, les toxines, l'hormone de croissance humaine, l'interleukin-2 (IL-2), le granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), le granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), la calcitonine, l'interféron-beta, l'interféron-alpha, le glucagon like peptide 1 (GLP-1), le glucagon like peptide 2 (GLP-2), la toxine PA, les hormones parathyroïdiennes (PTH(l-34) and PTH(l-84)), la butyrylcholinestérase, la glucocérébrosidase (GBA), et l'exendine-4.
Combinaison d'au moins deux polynucléotides isolés ou purifiés, le premier polynucléotide isolé ou purifié codant pour un premier polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA d'une première famille parasitaire de Plasmodium jalciparum ou pour une première protéine de fusion comprenant le première polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit premier polypeptide ou de ladite première protéine de fusion in vitro et/ou in vivo ; et le deuxième polynucléotide isolé ou purifié codant pour un deuxième polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA d'une deuxième famille parasitaire de Plasmodium falciparum ou pour une deuxième protéine de fusion comprenant le deuxième polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit deuxième polypeptide ou de ladite deuxième protéine de fusion in vitro et/ou in vivo, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du paludisme gestationnel.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la première famille est la famille parasitaire de Plasmodium falciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl ayant pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11 et la deuxième famille est la famille parasitaire de Plasmodium falciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl ayant pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 12.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la première famille est la famille parasitaire de Plasmodium falciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl codé par la séquence consensus SEQ ID NO: 13 et la deuxième famille est la famille parasitaire de Plasmodium falciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl codée par la séquence consensus SEQ ID NO: 14.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 10 ou la revendication 11, caractérisée en ce que la deuxième famille parasitaire de Plasmodium falciparum comprend la lignée parasitaire FCR3 et la lignée parasitaire 3D7.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle consiste en trois polynucléotides isolés ou purifiés, le premier polynucléotide isolé ou purifié codant pour un premier polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la famille parasitaire de Plasmodium jalciparum dont la protéine VAR2CSA est caractérisée par un interdomaine Idl ayant pour séquence la séquence consensus SEQ ID NO: 11 ou étant codé par la séquence consensus SEQ ID NO: 13 ou pour une première protéine de fusion comprenant le premier polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit premier polypeptide ou de ladite première protéine de fusion in vitro et/ou in vivo ; le deuxième polynucléotide isolé ou purifié codant pour un deuxième polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx- Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 ou pour une deuxième protéine de fusion comprenant le deuxième polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit deuxième polypeptide ou de ladite deuxième protéine de fusion in vitro et/ou in vivo ; et le troisième polynucléotide isolé ou purifié codant pour un troisième polypeptide consistant en la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x ou la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 ou pour une troisième protéine de fusion comprenant le troisième polypeptide, et contenant les éléments nécessaires à l'expression dudit troisième polypeptide ou de ladite troisième protéine de fusion in vitro et/ou in vivo.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce que la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 1 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 1, et la région NTS-DBLlx-Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 5 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 5.
Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce que la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée FCR3 a la séquence SEQ ID NO: 3 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 3, et la région Idl-DBL2x de la protéine VAR2CSA de la lignée 3D7 a la séquence SEQ ID NO: 7 ou une séquence homologue de SEQ ID NO: 7. Combinaison pour l'utilisation selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce que le deuxième polynucléotide isolé ou purifié, et éventuellement le troisième polynucléotide isolé ou purifié, comprend une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO: 2, une séquence homologue de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, une séquence homologue de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, une séquence homologue de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, et une séquence homologue de SEQ ID NO: 8.
Composition immunogène comprenant au moins un véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique et au moins une combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 16.
Utilisation d'une composition immunogène selon la revendication 17 dans la prévention ou le traitement du paludisme gestationnel.
Vaccin contre le paludisme gestationnel comprenant au moins une combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 16.
Vaccin ADN contre le paludisme gestationnel comprenant au moins une combinaison selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, caractérisé en ce que les polynucléotides de la combinaison sont insérés dans au moins un plasmide.
Vaccin selon la revendication 19 ou la revendication 20 comprenant en outre au moins un adjuvant.
Kit de vaccination contre le paludisme gestationnel comprenant au moins une combinaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, ou une composition immunogène selon la revendication 17 ou un vaccin selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, et des instructions pour effectuer une vaccination contre le paludisme gestationnel.
Kit selon la revendication 22, caractérisé en ce que les au moins deux polypeptides ou au moins deux protéines de fusion ou au moins deux polynucléotides de la combinaison sont fournis séparément dans le kit.
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