EP2734270A1 - Plasmodium atténué ayant le gène hmgb2 désactivé comme vaccin - Google Patents

Plasmodium atténué ayant le gène hmgb2 désactivé comme vaccin

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Publication number
EP2734270A1
EP2734270A1 EP12750429.8A EP12750429A EP2734270A1 EP 2734270 A1 EP2734270 A1 EP 2734270A1 EP 12750429 A EP12750429 A EP 12750429A EP 2734270 A1 EP2734270 A1 EP 2734270A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
parasite
plasmodium
vaccine
gene
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP12750429.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Catherine VAQUERO
Sylvie BRIQUET
Nadou Essénia LAWSON-HOGBAN
Salaheddine MECHERI
Robert Menard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Institut Pasteur de Lille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Pierre et Marie Curie Paris 6, Institut Pasteur de Lille filed Critical Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Publication of EP2734270A1 publication Critical patent/EP2734270A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicine, and more particularly that of the fight against malaria. Technological background of the invention
  • Malaria is an infectious disease caused by a eukaryotic unicellular parasite of the genus Plasmodium. This parasitic disease is worldwide and causes serious economic and health problems in developing countries.
  • P. falciparum is the most deleterious species of the five types of Plasmodium that infect humans. According to the World Health Organization (WHO), P. falciparum is responsible for 250 to 500 million cases of acute illness and about 1 million deaths each year (mostly children under 5 and pregnant women). ).
  • the cerebral malaria is a severe neurological complication of malaria responsible for the vast majority of fatal cases of the disease. Even if the individual survives, cerebral malaria can lead to severe neurological sequelae, especially in young children whose immune systems are being formed.
  • cerebral pathology is probably the result of the sequestration of parasitized red blood cells in the micro-vessels of the main organs (spleen, lungs, heart, intestines, kidneys, liver and brain) and the production of pro-inflammatory cytokines in these same organs, leading to a systemic syndrome and condition that can lead to the death of the individual.
  • GAP Genetically Attenuated Parasites
  • PNP purine nucleoside phosphorylase
  • NT1 nucleoside transporter 1
  • the objective of the present invention is to provide novel vaccine compositions for preventing malaria, and more particularly the appearance of severe malaria infections such as cerebral malaria.
  • the inventors have demonstrated that a live parasite belonging to the genus Plasmodium, and in which the function of the hmgb2 gene has been inactivated, could be used as an immunogen in a malaria vaccine. They have observed that the administration of such a parasite induces an immune reaction in the host which makes it possible to obtain both the clearance of the parasite (parasite load below the threshold of detection by microscopy in the peripheral blood ) but also an effective and long-term protection against infection by Plasmodium, particularly by a highly pathogenic strain, and more particularly against the erythrocyte phase of the parasite which is responsible for the symptomatology of the disease and its transmission.
  • the present invention relates first of all to a living parasite belonging to the genus Plasmodium in which the function of the hmgb2 gene is inactivated for use in the prevention of malaria, and more particularly in the prevention of neuropaludism which is a severe neurological complication of disease.
  • the parasite according to the invention is used in the prevention of malaria or neuropaludism in a mammal, in particular a human.
  • the strain of the parasite may be selected from the group consisting of Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae and Plasmodium knowlesi.
  • the strain of the parasite is selected from the group consisting of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae and Plasmodium knowlesi, more particularly preferably in the group consisting of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale and Plasmodium malariae. .
  • the strain of the parasite is Plasmodium falciparum.
  • the strain of the parasite is Plasmodium berghei, in particular Plasmodium berghei NK65.
  • the parasite in its wild form does not cause neuropaludism.
  • the strain of the parasite is a strain of
  • the parasite according to the invention may be in intra-erythrocyte form, in particular in the form of trophozoites, merozoites or intra- erythrocytic schizonts, preferably in the form of merozoites or intra- erythrocytic schizonts.
  • the parasite according to the invention may be in the form of non-intra-erythrocyte merozoites, that is to say merozoites obtained from parasitized red blood cells by total or partial purification.
  • the parasite according to the invention may also be in the form of sporozoites.
  • the function of the hmgb2 gene can be inactivated by total or partial deletion of said gene, preferably by total deletion of said gene.
  • the coding region of the hmgb2 gene may be replaced by a selection marker, such as the human gene coding for dihydrofolate reductase.
  • the function of the hmgb2 gene can also be inactivated by means of an interfering AR blocking or decreasing the translation of the HMGB2 protein.
  • the function of one or more other genes can be inactivated.
  • the other gene or genes whose function is inactivated can be chosen from the group consisting of the genes encoding the purine nucleoside phosphorylase, the nucleoside transporter 1, UIS3, UIS4, p52 and p36, and a combination thereof. .
  • the present invention relates to an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising, as an immunogen, an immuno logically effective amount of a parasite according to the invention, and one or more pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • the present invention also relates to a vaccine against malaria comprising, as an immunogen, a parasite according to the invention, and one or more pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • the immunogenic composition or the vaccine may also comprise one or more immunological adjuvants.
  • the immunological adjuvant (s) may be selected from the group consisting of muramyl peptide adjuvants; trehalose dimycolate (TDM); lipopolysaccharide (LPS); monophosphoryl lipid A (MPL); carboxymethylcellulose; the complete adjuvant of Freund; incomplete Freund's adjuvant; adjuvants of "oil-in-water” emulsion type optionally added with squalene or squalane; mineral adjuvants; bacterial toxins; CpG oligodeoxynucleotides; saponins; synthetic copolymers; cytokines and imidazoquinolones.
  • TDM trehalose dimycolate
  • LPS lipopolysaccharide
  • MPL monophosphoryl lipid A
  • carboxymethylcellulose the complete adjuvant of Freund; incomplete Freund's adjuvant; adjuvants of "oil-in-water” emulsion type optionally added with squalene or s
  • the immunogenic composition or vaccine may be formulated for parenteral administration.
  • the immunogenic composition or the vaccine may comprise several parasites according to the invention.
  • the composition or the vaccine comprises between 10 and 10 7 , preferably between 10 and 10 5 , and more preferably between 10 2 and 10 5 parasites per injection dose.
  • the immunogenic composition or the vaccine comprises between 10 and 10 6 , preferably between 10 2 and 10 6 , parasites according to the invention in an intra-erythrocyte form per unit of dose.
  • the immunogenic composition or the vaccine comprises between 10 2 and 10 7 parasites according to the invention in the form of non-intra-erythrocyte merozoites per unit of dose.
  • the immunogenic composition or the vaccine comprises between 10 3 and 10 7 parasites according to the invention in the form of sporozoites per unit of dose.
  • the present invention relates to the use of a parasite according to the invention, for the preparation of a vaccine composition against malaria or cerebral malaria.
  • the present invention also relates to a method for immunizing a subject against malaria, comprising administering an immunogenic composition or vaccine according to the invention to said subject, preferably parenterally, particularly by subcutaneously, intramuscularly, intradermally or intravenously.
  • Figure 1 Parasitaemia of C57BL / 6 mice infected with parasitized red blood cells (GRP) with the wild-type parasite i3 ⁇ 4NK65 or the mutated parasite 3 ⁇ 4NK65 Ahmgb2 (10 5 and 10 6 GRP by intravenous injection, respectively). Parasitaemia is analyzed by microscopic counting of GRP in stained smears and presented as the percentage of GRP (mean ⁇ standard deviation). The experiment was done with 5 mice and repeated several times. The p value is 0.008.
  • GRP parasitized red blood cells
  • Figure 2 Study of the survival of the first-infected mice with the mutated parasite i3 ⁇ 4NK65 Ahmgb2 and then infected three times with the two wild pathogenic parasites i3 ⁇ 4NK65 and i3 ⁇ 4ANKA. The first test was done at day 19 (19 days after primary infection), the second at day 71 and finally the third day at day 166. At each challenge, the pathogenicity of the two GRP preparations infected with i3 ⁇ 4NK65 and i3 ⁇ 4ANKA was verified by infecting non-primo-infected mice of the same age and following their fate and death by hyperparasitaemia or neuropaludism. Five mice were analyzed for each experiment.
  • FIG. 3 Immunization of C57BL / 6 mice with different amounts of GRP infected with the mutated parasite 3 ⁇ 4NK65 Ahmgb2.
  • Ten mice were infected at time 0 with 10 3 ( ⁇ ), 10 4 (o) or 10 5 ( ⁇ ) GRP infected with i3 ⁇ 4NK65 Ahmgb2.
  • Na ⁇ ve mice were also challenged on day 24 with 10 5 GRPs infected with the wild-type pathogen i3 ⁇ 4NK65 (A) or i3 ⁇ 4ANKA ( ⁇ ).
  • HMGB1 protein In situations of danger for the cell (foreign body, inflammation), these proteins are secreted actively in the cellular medium and / or passively in case of cell necrosis, and act as real danger signals (alarmins) by activating macrophages and other competent cells of the immune system (Lotze and Tracey, 2005).
  • alarmins real danger signals
  • the involvement of human HMGB1 protein has been demonstrated in diseases causing systemic inflammation such as lupus erythematosus, septic shock or rheumatoid arthritis, and in some cancers.
  • the increase in human HMGB1 protein in patients' sera has been correlated with the severity of these diseases.
  • PfHMGB1 and PfHMGB2 small proteins of less than 100 amino acids. These two proteins, like their human counterparts, are capable of bending DNA and interacting with particular DNA structures (Briquet et al., 2006). They are also secreted and found in culture supernatants of P. falciparum.
  • the HMGB1 and 2 proteins of P. falciparum are capable of activating and inducing TNFa expression in mouse monocyte lines (Kumar et al., 2008).
  • the inventors have used C57BL / 6 mice infected with the P. berghei ANKA (i3 ⁇ 4ANKA) parasite as an animal model of neuropaludism.
  • This animal model reproduces the main characteristics of human pathology such as ataxia, disorientation in space, convulsions and coma. These clinical symptoms can lead to the death of the animal.
  • we observe in this model the sequestration of parasitized red blood cells, haemorrhages and brain lesions, the production of pro-inflammatory cytokines and the destruction of the blood-brain barrier.
  • all C57BL / 6 mice infected with the i3 ⁇ 4ANKA isolate die within about 7 days of cerebral malaria.
  • the inventors have observed that 60% of the mice infected with the ANKA Ahmgb2 parasite do not develop neuropaludism.
  • the inventors inactivated the hmgb2 gene of another P. berghei isolate, the NK65 isolate, which induces the death of C57BL / 6 mice by hyper-parasitaemia within 20 to 25 days after infection but does not cause cerebral malaria. They have first observed that the inactivation of this gene hampers the development of i3 ⁇ 4NK65 Ahmgb2 in the mouse with a clearance of the parasite in the peripheral blood obtained 10 to 15 days after infection.
  • the inventors have then demonstrated that the host response leading to the clearance of the parasite was sufficient to induce sterile immunity of more than six months, not only vis-à-vis the homologous wild strain 3 ⁇ 4NK65 but also vis-a-vis vis-à-vis the highly pathogenic heterologous i3 ⁇ 4ANKA strain that is capable of inducing cerebral malaria.
  • the present invention relates to a living parasite belonging to the genus Plasmodium in which the function of the hmgb2 gene is inactivated for use in the prevention of malaria or cerebral malaria, preferably in a mammal, and more particularly favorite in a human.
  • the parasite is preferably capable of developing in vertebrates, and more particularly in mammals, and belongs to the subgenus selected from the group consisting of Plasmodium vinckeia, Plasmodium plasmodium and Plasmodium laverania.
  • the parasite is capable of developing in a human host and belongs to the subgenus Plasmodium plasmodium or Plasmodium laverania.
  • the parasite belongs to a species responsible for malaria in humans, more particularly to a species selected from the group consisting of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae and Plasmodium knowlesi.
  • Plasmodium knowlesi is a parasite that mainly infects primates, more and more cases of human infections with this parasite are reported.
  • the parasite belongs to a species selected from the group consisting of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale and Plasmodium malariae. According to a particular embodiment, the parasite belongs to a species selected from the group consisting of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax and Plasmodium malariae. According to a preferred embodiment, the parasite belongs to the species Plasmodium falciparum.
  • the parasite belongs to a species that is capable of inducing an immune reaction but is not capable of provoking symptoms of malaria in humans.
  • this parasite is a parasite of rodents belonging to the subgenus Plasmodium vinckeia.
  • the use of rodent parasites in the context of vaccination in humans considerably reduces the risks associated with the administration of live parasites in the subject.
  • the rodent parasite may be modified to express one or more proteins of a human-infective Plasmodium, such as P. falciparum, which is or is necessary for the invasion of human red blood cells. Such proteins are for example described in the article by Triglia et al., 2000.
  • the parasite belongs to the species Plasmodium berghei or Plasmodium yoelii. More preferably, the parasite belongs to the species Plasmodium berghei. According to a preferred embodiment, the parasite is the NK65 isolate of the Plasmodium berghei species.
  • the parasite belongs to a species selected from the group consisting of Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae and Plasmodium knowlesi.
  • the parasite may also belong to a species selected from the group consisting of Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale and Plasmodium malariae or in the group consisting of Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax and Plasmodium malariae, or in the group group consisting of Plasmodium berghei and Plasmodium falciparum.
  • the wild strain of the parasite does not cause neuropaludism.
  • This strain may be, for example, chosen from the group consisting of Plasmodium berghei NK65, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae and Plasmodium knowlesi.
  • This strain may also be a strain of Plasmodium falciparum having lost its cyto-adhesion capacity or having a reduced cyto-adhesion capacity.
  • the wild strain of the parasite is a non-cyto-adherent Plasmodium falciparum strain.
  • the wild strain of the parasite is a strain of Plasmodium falciparum having a reduced cyto-adhesion capacity.
  • Cyto-adhesion is a property of Plasmodium falciparum that is directly related to the development of neuropaludism.
  • red blood cells infected with cytoplasmic Plasmodium falciparum strain have the ability to bind to endothelial cell surface molecules such as CD36, ICAM1, VCAM1 or PECAM1 / CD31, and thus to induce vascular obstruction, inflammation and damage to different organs, especially at the brain level.
  • the cyto-adhesion capacity of a strain can be evaluated by any technique known to those skilled in the art, such as, for example, that described in the article by Buffet et al, 1999 or that of Traoré et al. 5, 2000.
  • the term "reduced cyto-adhesion capacity" refers to a lower cyto-adhesion capacity than that observed on a cytoplasmic Plasmodium reference strain, for example the Plasmodium falciparum strain 3D7.
  • the cyto-adhesion can be reduced by at least 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 95%, preferably at least 80%, and more preferably at least 80%.
  • Plasmodium falciparum strain 3D7 a cytoplasmic Plasmodium reference strain
  • the wild strain of the parasite is a strain of Plasmodium falciparum little or no cyto-adherent.
  • the wild strain of the parasite may be a strain of Plasmodium falciparum with reduced cyto-adhesion ability selected from the group consisting of Plasmodium falciparum strain in which the clagC gene is inactivated, Plasmodium falciparum D10 strain and Plasmodium falciparum strain T9-96.
  • the function of the hmgb2 gene is inactivated.
  • This inhibition can be obtained by many methods well known to those skilled in the art. It is thus possible to block the function of the gene at the transcriptional, translational or protein level, for example by blocking or reducing the transcription or translation of the hmgb2 gene or by disrupting the correct folding of the gene.
  • the protein or its activity is the protein or its activity.
  • the function of the hmgb2 gene can in particular be inactivated by the total or partial deletion of this gene, or the insertion or substitution of one or more nucleotides so as to render this gene inactive.
  • the function of the hmgb2 gene is inactivated by total or partial deletion of this gene, preferably by total deletion.
  • the deletion of the hmgb2 gene is obtained by homologous recombination.
  • This method is well known to those skilled in the art and has been applied many times to parasites of the genus Plasmodium (see for example Thathy and Ménard, 2002).
  • the coding region of the hmgb2 gene is replaced by homologous recombination by a marker making it possible to select the parasites in which the recombination has taken place.
  • the selection marker may be, for example, the human dihydrofolate reductase (dhfr) gene which confers resistance to pyrimethamine on the parasite.
  • the parasite used is a parasite in which the hmgb2 gene has been replaced by a selection marker, preferably by the human dhfr gene.
  • the parasite is a Plasmodium berghei, preferably the NK65 isolate, in which the hmgb2 gene has been replaced by a selection marker, preferably by the human dhfr gene.
  • the parasite used is a Plasmodium falciparum, preferably not or slightly cyto-adherent, in which the hmgb2 gene has been replaced by a selection marker, preferably by the human gene dhfr.
  • the function of the hmgb2 gene can also be inactivated by blocking or decreasing the translation of the mRNA of this gene.
  • the interference with RNA which makes it possible to specifically inhibit the expression of the target gene, is a phenomenon well known to those skilled in the art which has already been used to inhibit the expression of Plasmodium genes (see for example, McRobert and McConkey, 2002, Mohmmed et al., 2003 and Gissot et al., 2004).
  • a sequence coding for an interfering RNA, or its precursor is introduced into the genome of the parasite and its expression is controlled by a strong, preferably constitutive, promoter, such as, for example, the promoter of the d eEF1cc elongation that is active in all stages of parasite development, or that of the HSP70 gene that is active in sporozoites and during the erythrocyte cycle.
  • a strong, preferably constitutive, promoter such as, for example, the promoter of the d eEF1cc elongation that is active in all stages of parasite development, or that of the HSP70 gene that is active in sporozoites and during the erythrocyte cycle.
  • the sequence and structure of the interfering RNA can be readily selected by those skilled in the art.
  • the interfering RNA used may be a small interfering RNA (siRNA).
  • hmgb2 genes of Plasmodium species not yet sequenced are easily identifiable by methods well known to those skilled in the art, in particular by hybridization or PCR.
  • the function of one or more genes, other than hmgb2 can also be inactivated.
  • the additional gene whose function is inactivated may be a gene involved in parasite survival in a mammalian host, particularly in humans.
  • the inactivation of this additional gene makes it possible to attenuate the virulence of the parasite while preserving its immunogenic nature.
  • This additional gene may be selected from the group consisting of purine nucleoside phosphorylase (PNP; PFE0660c), nucleoside transporter 1 (NT1; PF13 0252), UIS3 (PF130012), UIS4 (early transcript PF10 0164), p52 (PFD0215c 6-cysteine motif protein) and p36 (PFD0210c), as well as combinations thereof (references in parenthesis are the PlasmodB library entry numbers of Plasmodium falciparum 3D7 sequences, given here as an example ).
  • PNP purine nucleoside phosphorylase
  • NT1 nucleoside transporter 1
  • UIS3 PF130012
  • UIS4 early transcript PF10 0164
  • p52 PD0215c 6-cysteine motif protein
  • p36 p36
  • the parasites according to the invention are used in erythrocyte form, more particularly in the form of non-intraerythrocytic merozoites or in the form of merozoites, trophozoites or intra- erythrocytic schizonts.
  • the parasites according to the invention are used in the form of merozoites, trophozoites or intra- erythrocytic schizonts, that is to say within red blood cells.
  • the parasites are used in the form of non-intra-erythrocyte merozoites, that is to say merozoites partially or totally purified after rupture of parasitized red blood cells.
  • Merozoites can be obtained according to any of the methods known to those skilled in the art such as that described in the article by Boyle et al., 2010.
  • the parasitized red blood cells can be obtained by introducing the parasite into a host, preferably a human, and recovering red blood cells from the infected host when the parasitaemia reaches at least 1%, preferably between 5 and 10%. According to a preferred embodiment, the parasitized red blood cells are recovered from a human host of blood group O and negative Rh.
  • the parasitized red blood cells are obtained by ex vivo infection of human red blood cells, preferably red blood cells of blood group O and negative Rh.
  • cultures of parasitized red blood cells can be synchronized so as to obtain, for the most part, merozoites, trophozoites or intra- erythrocytic schizonts.
  • the methods of ex vivo culturing of Plasmodium parasites are well known to those skilled in the art (see, for example, Trager and Jensen, 1976).
  • Anti-coagulants such as heparin may be added to the parasitized red blood cells thus obtained.
  • the parasitized red blood cells can be preserved by freezing in the presence of one or more cryoprotectants compatible with an in vivo use, such as, for example, glycerol or dimethylsulfoxide (DMSO).
  • the parasitized red blood cells may also be stored by refrigeration at 4 ° C. in a suitable preservation medium, for example SAGM medium ("Adenine Saline"). Mannitol Glucose ”) or a CPD (Citrate Phosphate Dextrose) solution, but for a period not exceeding approximately 45 days.
  • the parasites according to the invention are used in the form of sporozoites.
  • Sporozoites can be obtained by introducing the parasite into a mosquito host where it will multiply. The sporozoites are then recovered from the salivary glands of infected mosquitoes. The sporozoites thus obtained can be stored by freezing, for example in liquid nitrogen, before being thawed for live injection into a host. Alternatively, after recovery from the salivary glands of the mosquitoes, the sporozoites can be preserved by lyophilization or refrigeration before administration.
  • the administration of the parasite according to the invention in a subject makes it possible, in spite of rapid parasite clearance, to induce in the subject an immunity of several months vis-à-vis infection with a Plasmodium, in particular a Plasmodium chosen from the group consisting of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae and Plasmodium knowlesi, preferably Plasmodium falciparum.
  • This immunity may especially be a cross-immunity to infection with a strain of Plasmodium different from that of the parasite used.
  • the administration of a parasite according to the invention belonging to a strain which does not cause neuropaludism can lead to cross-immunity with respect to an infection with a Plasmodium strain capable of causing this severe neurological complication.
  • the parasite according to the invention can therefore be used for the prevention of malaria and / or cerebral malaria.
  • the administration of the parasite according to the invention in a subject makes it possible to induce an immunity of several months vis-à-vis infection with Plasmodium falciparum capable of inducing a cerebral malaria and thus to prevent malaria and / or a neuropaludism induced by this parasite.
  • prevention refers to an absence of symptoms or the presence of attenuated symptoms of the disease after contact with the parasite.
  • malaria prevention refers to an absence of symptoms or to the presence of attenuated symptoms in the subject treated after contact with a Plasmodium responsible for malaria.
  • prevention of cerebral malaria refers to an absence of symptoms or to the presence of attenuated symptoms in the subject treated after contact with a Plasmodium responsible for malaria and capable of inducing a cerebral malaria. This term can also refer to the absence of development of a cerebral malaria or the development of a mild or attenuated cerebral malaria in a Plasmodium-infected person capable of inducing cerebral malaria.
  • the present invention relates to an immunogenic composition comprising an immunologically effective amount of a parasite according to the invention, and one or more pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • the parasite included in the composition is as described above.
  • the composition comprises a parasite according to the invention in an erythrocytic form, more particularly in the form of merozoites, trophozoites or intra-erythrocytic schizonts or non-intraerythrocytic merozoites, preferably in the form of merozoites, trophozoites or intra-erythrocytic schizonts.
  • the composition comprises red blood cells parasitized with the parasite according to the invention and which can be obtained according to the method described above and in the experimental part.
  • the parasite included in the composition is in the form of sporozoites as described above.
  • the immunogenic composition is capable of inducing in the subject to which it is administered, a response of the immune system against the parasite it contains.
  • the term "immunologically effective amount” as used herein refers to an amount of parasites that is sufficient to elicit an immune response in the subject.
  • the immunogenic composition is a vaccine against malaria.
  • the composition according to the invention is obtained by suspending parasitized red blood cells, merozoites or sporozoites, preferably parasitized red blood cells or sporozoites, as defined above, in one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • Excipients may be readily selected by those skilled in the art depending on the form of the parasite, intra- erythrocyte, merozoites or sporozoites, and depending on the intended route of administration. These excipients may especially be selected from the group consisting of sterile water, sterile saline and phosphate buffer. Other excipients well known to those skilled in the art can also be used.
  • the excipient used is an isotonic solution ensuring the integrity of the red blood cells until administration of the composition to the subject.
  • the composition also comprises at least one anticoagulant such as heparin.
  • composition may also be obtained by mixing sporozoites of parasites as defined above with a pharmaceutically acceptable carrier such as, for example, liposomes.
  • excipients or carriers used are chosen so as to ensure the integrity of parasitized red blood cells and / or the survival of sporozoites or merozoites.
  • the excipients or supports used are chosen so as to ensure the survival of the parasites of the invention, whatever the form used (merozoites, sporozoites or intraperiocytic forms), until the administration of the composition to the subject to be immunized. .
  • the subject to be immunized is a mammal, preferably a human.
  • composition according to the invention can be administered, for example, parenterally, cutaneously, mucosa, transmucosal or epidermal.
  • the composition is formulated to be administered parenterally, particularly subcutaneously, intramuscularly, intravenously or intradermally.
  • the parasite is in erythrocyte form, preferably included in red blood cells, and the composition is formulated to be administered parenterally, preferably subcutaneously, intramuscularly, intravenously or intradermally, and most preferably intravenously.
  • the parasite is in the form of sporozoites and the composition is formulated to be administered parenterally, preferably subcutaneously, intramuscularly or intradermally, preferably intramuscularly or subcutaneously.
  • Methods of administering compositions comprising live sporozoites are well known to those skilled in the art (see, for example, International Patent Application WO 2004/045559 and Hoffman et al., 2010).
  • the parasite is in erythrocyte form and included in red blood cells and the composition according to the invention comprises between 10 and 10 6 parasitized red blood cells (GRP) per unit dose, preferably between 100 and 10 6 GRP, particularly preferably between 100 and 10 5 GRP, and most preferably between 100 and 10 4 GRP per unit dose.
  • the parasite is in erythrocyte form and included in red blood cells and the composition according to the invention comprises between 10 and 100 parasitized red blood cells (GRP) per unit of dose.
  • the parasite is in the form of merozoites non intraerythrocytic and the composition of the invention comprises between 10 2 and 10 7 merozoites per unit dose, preferably between 10 3 and 10 5 merozoites per unit dose.
  • the parasite is in the form of sporozoites and the composition according to the invention comprises between 10 3 and 10 7 sporozoites per unit dose, preferably between 10 4 and 10 5 sporozoites per unit dose.
  • the dose to be administered can be easily determined by those skilled in the art taking into account the physiological data of the subject to be immunized such as its age or immune status, the degree of immunity sought, the number of doses administered and the route of administration. administration used.
  • the dose to be administered may also vary according to the mode of conservation of the parasites.
  • composition according to the invention may comprise one or more strains of parasites according to the invention.
  • the composition comprises at least one strain of Plasmodium falciparum and a strain of Plasmodium vivax in which the function of the hmgb2 gene is inactivated.
  • composition according to the invention may also comprise one or more other parasites genetically attenuated Plasmodium genus.
  • These parasites may, for example, exhibit alteration or inactivation of purine nucleoside phosphorylase, nucleoside transporter 1, UIS3, UIS4, p52 or p36, or may be attenuated parasites obtained by irradiation.
  • These parasites preferably belong to a strain selected from the group consisting of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae and Plasmodium knowlesi.
  • composition according to the invention may also comprise one or more immunological adjuvants.
  • immunological adjuvants include, but are not limited to, adjuvants of the type muramylpeptide such as N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP) and its derivatives; trehalose dimycolate (TDM); lipopolysaccharide (LPS); monophosphoryl lipid A (MPL); carboxymethylcellulose; the complete adjuvant of Freund; incomplete Freund's adjuvant; adjuvants of "oil-in-water” emulsion type optionally added with squalene or squalane; mineral adjuvants such as alum, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, potassium phosphate or calcium phosphate; bacterial toxins such as the cholera toxin subunit B, the inactivated form of the per
  • composition according to the invention may comprise one or more immunological adjuvants selected from the group consisting of CpG oligodeoxynucleotides and mineral adjuvants, in particular alum, and a combination thereof.
  • the invention relates to the use of a living parasite belonging to the genus Plasmodium in which the function of the hmgb2 gene is inactivated for the preparation of a vaccine composition against malaria or cerebral malaria.
  • the invention also relates to a method for producing a vaccine composition against malaria or cerebral malaria according to the invention.
  • the method comprises the step of mixing infected red blood cells with a live parasite according to the invention, with one or more pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • the red blood cells are human red blood cells obtained from a host of blood group O and Rh negative.
  • the method comprises the step of mixing living non-intraerythrocyte merozoites of a parasite according to the invention with one or more pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • the method comprises the step of mixing live sporozoites of a parasite according to the invention with one or more pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • the parasites in the form of parasitized red blood cells, merozoites or in the form of sporozoites, are also mixed with one or more immunological adjuvants.
  • immunological adjuvants may be as defined above.
  • the method may further comprise a prior step comprising obtaining said parasitized red blood cells, said merozoites or said sporozoites, for example using the methods described above.
  • composition or vaccine obtained may be stored before administration, for example frozen or refrigerated if it contains parasitized red blood cells, or frozen, refrigerated or lyophilized if it contains sporozoites or merozoites.
  • the composition or the vaccine obtained is stored frozen before administration.
  • a suitable diluent is added to the lyophilisate before administration, such as, for example, sterile water or sterile saline, preferably sterile saline.
  • the invention in another aspect, relates to a method for immunizing a subject against malaria, comprising administering an immunogenic composition or vaccine according to the invention to said subject.
  • the subject is a mammal, more particularly a human.
  • the method comprises administering a vaccine according to the invention to said subject.
  • the method comprises the administration of a single dose of the immunogenic composition or of the vaccine according to the invention.
  • the method comprises the administration of a plurality of doses of the immunogenic composition or of the vaccine according to the invention. Immunization of the subject can be obtained after administration of 2 to 6 doses. Preferably, a delay of about 4 to 8 weeks, preferably about 6 to 8 weeks, is observed between each administration.
  • the inventors have demonstrated that the administration of a single dose comprising 10 5 parasitized red blood cells with a parasite according to the invention made it possible to obtain a sterile immunity of at least 6 months in a mammal.
  • the method comprises the administration of a first dose of the immunogenic composition or of the vaccine according to the invention followed by the administration of a second dose about six months to one year later.
  • the doses comprise between 10 and 10 6 , preferably between 100 and 10 6 , parasitized red blood cells, between 10 2 and 10 7 merozoites or between 10 3 and 10 7 sporozoites. In a preferred embodiment, the doses comprise about 10 3 parasitized red blood cells. According to another preferred embodiment, the doses comprise between 10 and 100 parasitized red blood cells.
  • the subject's immunity to malaria or cerebral malaria may be complete or incomplete.
  • incomplete immunity the severity of the symptoms of the disease reported in an immunized subject will be reduced compared to those observed in a non-immune subject.
  • total immunity the immune subject will not report any symptoms of the disease after contact with the parasite.
  • the immunity obtained by administering the composition according to the invention is a sterile immunity. This means that the development of the administered parasites is very altered and that about 2 to 4 weeks after administration, the parasites are no longer detected in the peripheral blood of the subject.
  • the invention also relates to a method for immunizing a subject against malaria, comprising administering a parasite according to the invention in the form of sporozoites to said subject through mosquito bites infected with said parasite.
  • the inventors have recently shown that the P. berghei HMGB2 protein is involved in the establishment of experimental neuropaludism (NPE) in a model of C57BL / 6 mice infected with the P. berghei ANKA parasite. (i3 ⁇ 4ANKA).
  • NPE experimental neuropaludism
  • the inactivation of the hmgb2 gene in i3 ⁇ 4ANKA without hindering the development of the parasite in C57BL / 6 mice, nevertheless causes a delay in the establishment of the NPE or even its complete abolition in 65% of cases.
  • the administration of recombinant proteins HMGB2 to mice previously infected with i3 ⁇ 4ANKA Ahmgb2 was able to restore the development of neuropaludism.
  • mice used are C57BL / 6 mice (Charles River Laboratories). These mice are sensitive to experimental neuropaludism (NP-S).
  • the P. berghei ANKA (i3 ⁇ 4ANKA) parasite induces the death of C57BL / 6 mice by neuropaludism in 7 days +/- 1.
  • This parasite has a GFP label under the control of the eefl promoter (Thaty and Ménard, 2002 ).
  • P. berghei parasite NK65 (i3 ⁇ 4NK65) (MRA-268) (from Sa et al., 2009) induced death of C57BL / 6 mice by hyper-parasitaemia within 20 to 25 days after infection. On the other hand, this parasite does not cause neuropaludism.
  • RH1 meaning 5 'CGATGCGGGCCC AAAAAGGTAAAT ATGAAAAAGAAAGGTT3'
  • RH1 an Apal restriction site at 5 'UTR and a Smal restriction site at 3' UTR
  • RH2 a NotI restriction site at 5 'UTR and an Ascl restriction site at 3'UTR of the sequence. These restriction sites allow the insertion of fragments
  • the 5 'and 3' untranslated regions RH1 and RH2 were then inserted into a pBC SK-Hudhfr vector (Stratagene) containing the human dihydrofolate reductase gene (hudhfr) under the control of the 5'UTR efla promoter and the dhfr / ts (dhfr / thymidilate synthase) at 3'UTR.
  • RH1 was inserted in 5'UTR of the Hudhfr cassette and RH2 in 3'UTR.
  • the 2 RH1 and RH2 regions matched with the complementary sequences of the hmgb2 gene in the P. berghei genome, allow a double homologous recombination at this gene and, therefore, its deletion.
  • Hudhfr confers resistance to pyrimethamine and mutant parasites were selected using this drug.
  • the GRPs culture was centrifuged for 10 min at 1500 rpm and the pellet was then taken up in 35 ml of complete culture medium in a 50 ml conical bottom tube.
  • Ten milliliters of 50% Nycodenz (Lucron Bioproducts, 1 ⁇ 2 dilution in 1X PBS) were then gently added to the GRPs culture to create a density gradient at the bottom of the tube. Twenty minutes of centrifugation at 450 g, TA, without brake, resulted in the purification of GRPs which then form a brown ring in the middle of the tube.
  • the brown ring of GRPs was removed (-20 ml) then washed with 20 ml of complete culture medium. After 8 min of centrifugation at 450 g, the pellet of mature schizonts was finally taken up in 3 ml of complete culture medium which was then distributed in 3 1.5 ml Eppendorf tubes. This operation had to be done in a very delicate way because the schizonts are fragile. At this stage, the amount of schizonts obtained was sufficient to achieve up to 10 independent transfections.
  • the pellet of schizonts in each tube was then taken up in 100 ⁇ l of the electroporation buffer (Nucleofector Solution 88A6, AMAXA) with 5 ⁇ g of each of the plasmid constructs obtained (pBC- 5'RHlH " ⁇ i / z / r3'RH2 for pbhmgbl or pbhmgbl), previously digested with ApaI and AscI.
  • the parasites were transfected using the U33 program of the electroporator, Nucleofector AMAXA.
  • the electric shock induces the rupture of the mature schizont membrane and the merozoites thus released can internalize the linearized plasmids.
  • Fifty microliters of complete culture medium were added immediately to the contents of the cuvette and two 3-week-old Swiss mice were immediately infected with 100 ⁇ g each of transfected merozoites.
  • the selection drug pyrimethamine
  • the pyrimethamine solution was prepared as follows: 70 mg pyrimethamine (Sigma Aldrich), 10 ml DMSO, qsp 1 L water, pH 3.5-5.5.
  • the C57BL / 6 mice were infected, intraperitoneally with 200 ⁇ l each, with one ampoule containing 10 7 GRPs / 200 ⁇ l.
  • parasitaemia reached 1-5% (5-6 days after infection)
  • approximately 100 ⁇ of blood was collected from the animal's cheek in a tube containing heparin. This blood was washed twice with 1 ml of cold PBS and centrifuged for 5 min at 3800 rpm. After dilution to 1/1000 and counting cells, C57BL / 6 mice were infected with 10 5 GRPs. Measuring parasitaemia
  • Parasitaemia is analyzed by microscopic counting of parasitized red blood cells (RBCs) in stained smears.
  • the blood is taken from infected mice, by intracardiac puncture (anesthetized animal) when the parasitaemia reaches between 3 and 10% (5 to 6 days after infection with 10 7 parasitized red blood cells) in a tube containing heparin and still stored in ice until freezing in liquid nitrogen in the following cryopreservant mixture: 1 vol. Pure glycerol (Sigma Aldrich) + 9 vol Alsever's Solution (Sigma Aldrich).
  • the stabilates are carried out with 1 volume of the collected blood to which 2 volumes of the cryopreservant mixture are added. The aliquots are frozen in liquid nitrogen (about 300 ⁇ l per mouse) and then stored at -80 ° C.
  • Ampoules as previously, the blood is collected by intracardiac puncture but, when the parasitaemia reaches between 1 and 5%. This blood is washed several times with cold PBS and centrifuged for 5 min at 3800 rpm. Then ampoules of 10 7 GRPs / 200 ⁇ are made in a cryopreservant mixture see previous paragraph after counting the number of parasitized red blood cells.
  • the mutated parasite was no longer detected in blood smears while parasite development wilderness continued until death by hyper-parasitaemia about 25 days after infection. Indeed, while the wild parasite continues to develop, infection with i3 ⁇ 4NK65 Ahmgb2 induces an immune response in the C57BL / 6 mouse that alters the development of this parasite. Several independent mutated clones were obtained showing the same clearance kinetics during their development in C57BL / 6 mice.
  • Figure 2 shows the results of an experiment with three successive infection tests. All mice primed with i3 ⁇ 4NK65 Ahmgb2 survived the three infection tests with continued sterile protection for at least 7 months. At each challenge, the inventors verified that the development of the wild-type parasite i3 ⁇ 4NK65 in naive mice continues until about 25 days when the mice begin to die from hyper-parasitaemia and that the development of the wild-type 3 ⁇ 4ANKA parasite in naive mice continues until about 7 days when the mice die of cerebral malaria (the witnesses of the pathogenicity of the parasites and the age of the mice).

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles compositions et méthodes pour immuniser un hôte contre le paludisme en utilisant un parasite Plasmodium génétiquement atténué par l'inactivation de la fonction du gène hmgb2.

Description

PLASMODIUM ATTÉNUÉ AYANT LE GÈNE HMGB2
DÉSACTIVÉ COMME VACCIN
La présente invention relève du domaine de la médecine, et plus particulièrement de celui de la lutte contre le paludisme. Arrière-plan technologique de l'invention
Le paludisme est une maladie infectieuse causée par un parasite unicellulaire eucaryote du genre Plasmodium. Cette maladie parasitaire est mondialement présente et engendre de graves problèmes économiques et sanitaires dans les pays en développement. P. falciparum est l'espèce la plus délétère des cinq types de Plasmodium infectant l'homme. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), P. falciparum est responsable de 250 à 500 millions de cas de maladie aiguë et d'environ 1 million de décès chaque année (surtout les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes). Le neuropaludisme est une complication neurologique sévère du paludisme responsable de la grande majorité des cas mortels de la maladie. Même si l'individu survit, le neuropaludisme peut entraîner des séquelles neurologiques graves, notamment chez les jeunes enfants dont le système immunitaire est en cours de formation. La pathogénèse du neuropaludisme est complexe et encore loin d'être complètement élucidée. A l'heure actuelle, il est admis que la pathologie cérébrale est vraisemblablement la résultante de la séquestration des globules rouges parasités dans les micro-vaisseaux des principaux organes (rate, poumons, cœur, intestins, reins, foie et cerveau) et de la production de cytokines pro-inflammatoires dans ces mêmes organes, conduisant à un syndrome et état systémiques pouvant entraîner la mort de l'individu.
La lutte contre le paludisme est un des grands enjeux de l'OMS, mais à ce jour, tous les efforts visant à maîtriser cette maladie ont échoué. Durant ces trente dernières années, même si les chiffres de l'OMS semblent encourageants, la situation s'est détériorée en raison de l'apparition de la résistance des anophèles aux insecticides et de la chimiorésistance grandissante de P. falciparum aux médicaments antipaludéens (même utilisés en combinaisons).
La lutte contre le paludisme est rendue difficile par l'absence d'un vaccin réellement efficace contre la maladie. Les premières tentatives de développer un vaccin datent des années 70. Depuis, les essais vaccinaux se sont multipliés mais font face à la complexité du développement du parasite chez ses deux hôtes successifs, l'homme et le moustique ainsi qu'à un mécanisme d'échappement au système immunitaire extrêmement compliqué impliquant une importante variation antigénique du parasite.
Cette variation lors de la phase érythrocytaire du parasite rend la vaccination préventive classique à l'aide de complexes de protéines-peptides de Plasmodium extrêmement difficile. Un vaccin contre le paludisme réalisé à partir de protéines du parasite est actuellement en phase III des essais cliniques (RTS, S de GlaxoSmithKline Biologicals). Cependant, les résultats obtenus durant la phase II montrent que ce vaccin ne réduit l'occurrence de paludisme clinique que de 35% et de 49% celui de paludisme sévère.
L'obtention d'un vaccin efficace contre les formes érythrocytaires du parasite est pourtant un enjeu majeur dans le cadre de l'éradication de la maladie étant donné qu'un tel vaccin permettrait à la fois de réduire les symptômes mais également la charge parasitaire et la quantité de gamétocytes dans le sang donc de diminuer la transmission du parasite.
Une étude récente a montré que l'administration répétée de très faibles doses de globules rouges parasités par P. falciparum 3D7 associée à la prise simultanée de médicaments antipaludéens induisait une immunité susceptible de protéger les patients contre la phase érythrocytaire d'une souche homologue (Pombo et al. 2002).
II a donc a été envisagé d'utiliser des parasites vivants génétiquement atténués
(ou GAP « Genetically Attenuated Parasites ») pour induire une protection stérile de longue durée. Plusieurs GAP ont ainsi été décrits. Cependant, la majorité de ces GAP cible le stade hépatocytaire via les sporozoïtes des parasites atténués. Deux GAP ciblant le stade érythrocytaire ont également été décrits: des parasites de rongeurs P. yoelii dans lesquels la purine nucléoside phosphorylase (PNP) (Ting et al, 2008) ou le transporteur nucléosidique 1 (NT1) (Aly et al, 2010) a été inactivé. Il a été montré que ces GAP confèrent une immunité vis-à-vis d'une souche homologue, mais également dans une moindre mesure, vis-à-vis de souches hétérologues. L'efficacité et l'innocuité de vaccins utilisant ces parasites vivants génétiquement atténués restent cependant à déterminer.
A ce jour, il demeure donc crucial de développer de nouvelles stratégies qui permettraient notamment d'enrayer l'apparition d'accès graves tels que le neuropaludisme mais également de diminuer la charge parasitaire et la quantité de gamétocytes dans le sang périphérique et ainsi réduire les risques de transmission de la maladie.
Résumé de l'invention
L'objectif de la présente invention est de fournir de nouvelles compositions vaccinales pour prévenir le paludisme, et plus particulièrement l'apparition d'accès graves du paludisme tels que le neuropaludisme.
Les inventeurs ont démontré qu'un parasite vivant appartenant au genre Plasmodium, et dans lequel la fonction du gène hmgb2 a été inactivée pouvait être utilisé comme immunogène dans un vaccin contre le paludisme. Ils ont en effet observé, que l'administration d'un tel parasite induisait une réaction immunitaire chez l'hôte qui permettait d'obtenir à la fois la clairance du parasite (charge parasitaire en dessous du seuil de détection par microscopie dans le sang périphérique) mais également une protection efficace et de longue durée contre une infection par un Plasmodium, notamment par une souche très pathogène, et plus particulièrement contre la phase érythrocytaire du parasite qui est responsable de la symptomatologie de la maladie et de sa transmission.
Ainsi, la présente invention concerne tout d'abord un parasite vivant appartenant au genre Plasmodium dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée pour une utilisation dans la prévention du paludisme, et plus particulièrement dans la prévention du neuropaludisme qui est une complication neurologique sévère de la maladie.
De préférence, le parasite selon l'invention est utilisé dans la prévention du paludisme ou neuropaludisme chez un mammifère, en particulier un humain.
La souche du parasite peut être sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi. De préférence, la souche du parasite est sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi, de manière plus particulièrement préférée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale et Plasmodium malariae.
Selon un mode particulier de réalisation, la souche du parasite est Plasmodium falciparum. Selon un autre mode particulier de réalisation, la souche du parasite est Plasmodium berghei, en particulier Plasmodium berghei NK65.
De préférence, le parasite sous sa forme sauvage ne provoque pas de neuropaludisme.
Selon un mode particulier de réalisation, la souche du parasite est une souche de
Plasmodium falciparum non cyto-adhérente ou ayant une capacité de cyto-adhérence réduite, de préférence ayant une capacité de cyto-adhérence réduite.
Le parasite selon l'invention peut être sous une forme intra-érythrocytaire, en particulier sous la forme de trophozoïtes, mérozoïtes ou de schizontes intra- érythrocytaires, de préférence sous la forme de mérozoïtes ou de schizontes intra- érythrocytaires.
Le parasite selon l'invention peut être sous la forme de mérozoïtes non intra- érythrocytaires, c'est-à-dire de mérozoïtes obtenus à partir de globules rouges parasités par purification totale ou partielle.
Le parasite selon l'invention peut également être sous la forme de sporozoïtes.
La fonction du gène hmgb2 peut être inactivée par délétion totale ou partielle dudit gène, de préférence par délétion totale dudit gène. En particulier, la région codante du gène hmgb2 peut être remplacée par un marqueur de sélection, tel que le gène humain codant pour la dihydrofolate réductase.
La fonction du gène hmgb2 peut également être inactivée au moyen d'un AR interfèrent bloquant ou diminuant la traduction de la protéine HMGB2.
Dans le parasite selon l'invention, la fonction d'un ou plusieurs autres gènes peut être inactivée. En particulier, le ou les autres gènes dont la fonction est inactivée peuvent être choisis dans le groupe constitué des gènes codant pour la purine nucléoside phosphorylase, le transporteur de nucléoside 1, UIS3, UIS4, p52 et p36, et une combinaison de ceux-ci.
Dans un second aspect, la présente invention concerne une composition immunogène comprenant, en tant qu'immunogène, une quantité immuno logiquement efficace d'un parasite selon l'invention, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables. La présente invention concerne également un vaccin contre le paludisme comprenant, en tant qu'immunogène, un parasite selon l'invention, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables. La composition immunogène ou le vaccin peut également comprendre un ou plusieurs adjuvants immunologiques. En particulier, le ou les adjuvants immuno logiques peuvent être sélectionnés dans le groupe constitué des adjuvants de type muramylpeptide; le tréhalose dimycolate (TDM) ; le lipopolysaccharide (LPS) ; le monophosphoryl lipide A (MPL) ; la carboxy-méthylcellulose ; l'adjuvant complet de Freund ; l'adjuvant incomplet de Freund ; des adjuvants de type émulsions « huile dans eau » éventuellement additionnés de squalène ou squalane ; les adjuvants minéraux; des toxines bactériennes; des oligodésoxynucléotides CpG ; des saponines; des copolymères synthétiques; des cytokines et des imidazoquinolones.
La composition immunogène ou le vaccin peut être formulé pour être administré par voie parentérale.
La composition immunogène ou le vaccin peut comprendre plusieurs parasites selon l'invention.
De manière préférée, la composition ou le vaccin comprend entre 10 et 107, de préférence entre 10 et 105, et de manière plus particulièrement préférée entre 102 et 105 parasites par dose d'injection.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition immunogène ou le vaccin comprend entre 10 et 106, de préférence entre 102 et 106, parasites selon l'invention sous une forme intra-érythrocytaire par unité de dose.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la composition immunogène ou le vaccin comprend entre 102 et 107 parasites selon l'invention sous la forme de mérozoïtes non intra-érythrocytaires par unité de dose.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier, la composition immunogène ou le vaccin comprend entre entre 103 et 107 parasites selon l'invention sous la forme de sporozoïtes par unité de dose.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un parasite selon l'invention, pour la préparation d'une composition vaccinale contre le paludisme ou le neuropaludisme.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne également une méthode pour immuniser un sujet contre le paludisme, comprenant l'administration d'une composition immunogène ou d'un vaccin selon l'invention audit sujet, de préférence par voie parentérale, en particulier par voie sous-cutanée, intramusculaire, intradermique ou intraveineuse. Brève description des dessins
Figure 1: Parasitémie des souris C57BL/6 infectées par des globules rouges parasités (GRP) avec le parasite sauvage i¾NK65 ou le parasite muté i¾NK65 Ahmgb2 (105 et 106 GRP par injection intraveineuse, respectivement). La parasitémie est analysée par comptage au microscope des GRP dans des frottis colorés et présentée comme le pourcentage des GRP (moyenne ± écart-type). L'expérience a été faite avec 5 souris et répétée plusieurs fois. La valeur p est de 0,008.
Figure 2: Etude de la survie des souris primo-infectées avec le parasite muté i¾NK65 Ahmgb2 et infectées ensuite trois fois avec les deux parasites sauvages pathogènes i¾NK65 et i¾ANKA. La première épreuve a été faite à J19 (19 jours après la primo-infection), le deuxième à J71 et enfin la troisième à J162. A chaque épreuve, la pathogénicité des deux préparations de GRP infectés avec i¾NK65 et i¾ANKA a été vérifiée en infectant des souris de même âge non primo-infectées et en suivant leur devenir et mort par hyperparasitémie ou neuropaludisme. Cinq souris ont été analysées pour chacune des expériences.
Figure 3 : Immunisation de souris C57BL/6 avec différentes quantités de GRP infectés par le parasite muté i¾NK65 Ahmgb2. Dix souris ont été infectées au temps 0 avec 103 (□), 104 (o) ou 105 (Δ) GRP infectés par i¾NK65 Ahmgb2. Ces souris ont ensuite subi une épreuve d'infection à J24 avec 105 GRP infectés avec le parasite pathogène sauvage i¾NK65 (n=5) ou i¾ANKA (n=5). Des souris naïves ont également subi une épreuve d'infection à J24 avec 105 GRP infectés avec le parasite pathogène sauvage i¾NK65 (A) ou i¾ANKA (·).
Description détaillée de l'invention
Le séquençage du génome de P. falciparum s'est achevé en 2002. Ce génome comprend environ 5500 gènes dont plus de 50 % ont une fonction totalement inconnue. En étudiant les facteurs impliqués dans la régulation transcriptionnelle chez P. falciparum, les inventeurs ont annoté quatre HMGB (PfHMGBl à 4; High Mobility Group Box proteins). Ce sont des protéines nucléaires non histone très abondantes qui ont la particularité d'être à la fois des facteurs nucléaires et des médiateurs extracellulaires. Chez l'homme, où elles ont été particulièrement étudiées, elles sont présentes dans le noyau des cellules et jouent le rôle de facteurs architecturaux, participant à la régulation de la transcription via le remodelage de la chromatine. Dans des situations de danger pour la cellule (corps étranger, inflammation), ces protéines sont sécrétées activement dans le milieu cellulaire et/ou passivement en cas de nécrose cellulaire, et agissent en tant que véritables signaux de danger (alarmines) en activant les macrophages et autres cellules compétentes du système immunitaire (Lotze and Tracey, 2005). L'implication de la protéine HMGB1 humaine a été démontrée dans les maladies provoquant une inflammation systémique telles que le lupus érythémateux, le choc septique ou la polyarthrite rhumatoïde, et dans certains cancers. Enfin, l'augmentation de la protéine HMGB1 humaine, dans les sera de patients, a été corrélée avec la sévérité de ces maladies.
Chez P.falciparum, les inventeurs ont plus particulièrement étudié PfHMGBl et PfHMGB2, petites protéines de moins de 100 acides aminés. Ces deux protéines, comme leurs homologues humaines sont capables de courber l'ADN et d'interagir avec des structures particulières de l'ADN (Briquet et al. 2006). Elles sont également sécrétées et retrouvées dans les surnageants de culture de P. falciparum. Les protéines HMGB1 et 2 de P. falciparum sont capables d'activer et d'induire l'expression de TNFa dans des lignées monocytaires de souris (Kumar et al. 2008).
Dans la présente demande, les inventeurs ont utilisé comme modèle animal de neuropaludisme, des souris C57BL/6 infectées par le parasite de P. berghei ANKA (i¾ANKA). Ce modèle animal reproduit les principales caractéristiques de la pathologie humaine telles que l'ataxie, la désorientation dans l'espace, les convulsions et le coma. Ces symptômes cliniques peuvent conduire à la mort de l'animal. Comme chez l'homme, on observe dans ce modèle, la séquestration des globules rouges parasités, les hémorragies et lésions cérébrales, la production de cytokines pro- inflammatoires et la destruction de la barrière hémato-encéphalique. Dans ce modèle, la totalité des souris C57BL/6 infectées par l'isolât i¾ANKA meurent en 7 jours environ de neuropaludisme. En revanche, les inventeurs ont observé que 60% des souris infectées par le parasite ô ANKA Ahmgb2 ne développaient pas de neuropaludisme.
Les inventeurs ont inactivé le gène hmgb2 d'un autre isolât de P. berghei, l'isolât NK65, qui induit la mort des souris C57BL/6 par hyper-parasitémie en 20 à 25 jours après infection mais ne provoque pas de neuropaludisme. Ils ont tout d'abord observé que l'inactivation de ce gène entrave le développement de i¾NK65 Ahmgb2 dans la souris avec une clairance du parasite dans le sang périphérique obtenue 10 à 15 jours après l'infection. Les inventeurs ont ensuite démontré que la réponse de l'hôte conduisant à la clairance du parasite était suffisante pour induire une immunité stérile de plus de six mois, non seulement vis-à-vis de la souche sauvage homologue i¾NK65 mais également vis-à-vis de la souche hétérologue hautement pathogène i¾ANKA qui est capable d'induire un neuropaludisme.
Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention concerne un parasite vivant appartenant au genre Plasmodium dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée pour une utilisation dans la prévention du paludisme ou du neuropaludisme, de préférence chez un mammifère, et de manière tout particulièrement préférée chez un humain.
Le parasite est, de préférence, capable de se développer chez les vertébrés, et plus particulièrement chez les mammifères, et appartient au sous-genre sélectionné dans le groupe constitué de Plasmodium vinckeia, Plasmodium plasmodium et Plasmodium laverania.
Selon un mode de réalisation, le parasite est capable de se développer chez un hôte humain et appartient au sous-genre Plasmodium plasmodium ou Plasmodium laverania. De préférence, le parasite appartient à une espèce responsable du paludisme chez l'homme, plus particulièrement à une espèce sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi. Bien que Plasmodium knowlesi soit un parasite infectant essentiellement les primates, de plus en plus de cas d'infections humaines par ce parasite sont rapportés. De manière plus particulièrement préférée, le parasite appartient à une espèce sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale et Plasmodium malariae. Selon un mode de réalisation particulier, le parasite appartient à une espèce sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax et Plasmodium malariae. Selon un mode de réalisation préféré, le parasite appartient à l'espèce Plasmodium falciparum.
Selon un autre mode de réalisation, le parasite appartient à une espèce qui est capable d'induire une réaction immunitaire mais n'est pas capable de provoquer les symptômes du paludisme chez l'humain. De préférence, ce parasite est un parasite de rongeurs appartenant au sous-genre Plasmodium vinckeia. L'utilisation de parasites de rongeurs dans le cadre de la vaccination chez l'homme permet de réduire considérablement les risques liés à l'administration de parasites vivants chez le sujet. Le parasite de rongeur peut être modifié de façon à exprimer une ou plusieurs protéines d'un Plasmodium infectant l'homme, tel que P . falciparum, qui est ou sont nécessaires à l'invasion des globules rouges humains. De telles protéines sont par exemple décrites dans l'article de Triglia et al., 2000. De manière préférée, le parasite appartient à l'espèce Plasmodium berghei ou Plasmodium yoelii. De manière plus particulièrement préférée, le parasite appartient à l'espèce Plasmodium berghei. Selon un mode de réalisation préféré, le parasite est l'isolât NK65 de l'espèce Plasmodium berghei.
Selon un mode de réalisation particulier, le parasite appartient à une espèce sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi. Le parasite peut également appartenir à une espèce sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale et Plasmodium malariae ou dans le groupe constitué de Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax et Plasmodium malariae, ou encore dans le groupe constitué de Plasmodium berghei et Plasmodium falciparum.
Selon un mode de réalisation préféré, la souche sauvage du parasite, c'est-à-dire le parasite dans lequel le gène hmgb2 est actif, ne provoque pas de neuropaludisme. Cette souche peut être par exemple choisie dans le groupe constitué de Plasmodium berghei NK65, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi. Cette souche peut également être une souche de Plasmodium falciparum ayant perdu sa capacité de cyto-adhérence ou ayant une capacité de cyto- adhérence réduite. Selon un mode de réalisation, la souche sauvage du parasite est une souche de Plasmodium falciparum non cyto-adhérente. Selon un autre mode de réalisation, la souche sauvage du parasite est une souche de Plasmodium falciparum ayant une capacité de cyto-adhérence réduite. La cyto-adhérence est une propriété de Plasmodium falciparum qui est directement liée au développement du neuropaludisme. En effet, les globules rouges infectés par une souche de Plasmodium falciparum cyto- adhérente ont la capacité de se lier à des molécules de surface des cellules endothéliales telles que CD36, ICAM1, VCAM1 ou PECAM1/CD31, et ainsi de provoquer une obstruction vasculaire, une inflammation et des dommages au niveau de différents organes, en particulier au niveau cérébral. La capacité de cyto-adhérence d'une souche peut être évaluée par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier, telle que, par exemple, celle décrite dans l'article de Buffet et al, 1999 ou celui de Traoré et 5 al, 2000. Le terme « capacité de cyto-adhérence réduite » se réfère à une capacité de cyto-adhérence plus faible que celle observée sur une souche de référence de Plasmodium cyto-adhérente, par exemple la souche Plasmodium falciparum 3D7. La cyto-adhérence peut être réduite d'au moins 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%, de préférence d'au moins 80%, et de manière plus particulièrement préférée d'au moins
10 90%), par rapport à une souche de référence de Plasmodium cyto-adhérente, par exemple la souche Plasmodium falciparum 3D7. Il est possible d'obtenir des souches de Plasmodium falciparum ayant une capacité de cyto-adhérence réduite, par exemple en multipliant les passages en culture ex vivo (Udeinya et al, 1983). Différentes souches de Plasmodium falciparum avec une capacité de cyto-adhérence réduite ont été décrites,
15 par exemple dans l'article de Trenholme et al, 2000 {Plasmodium falciparum dans lequel le gène clag9 est inactivé) et de Nacer et al, 2011 {Plasmodium falciparum D10 et T9-96). Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, la souche sauvage du parasite est une souche de Plasmodium falciparum peu ou non cyto-adhérente. En particulier, la souche sauvage du parasite peut être une souche de Plasmodium falciparum avec une 0 capacité de cyto-adhérence réduite sélectionnée dans le groupe constitué d'une souche Plasmodium falciparum dans lequel le gène clagÇ est inactivé, de la souche Plasmodium falciparum D10 et de la souche Plasmodium falciparum T9-96.
Dans le parasite utilisé selon l'invention, la fonction du gène hmgb2 est inactivée. Cela signifie que l'activité de la protéine HMGB2 codée par ce gène est 5 totalement ou partiellement inhibée, de préférence totalement inhibée. Cette inhibition peut être obtenue par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. Il est ainsi possible de bloquer la fonction du gène au niveau transcriptionnel, traductionnel ou au niveau protéique, par exemple en bloquant ou diminuant la transcription ou la traduction du gène hmgb2 ou en perturbant le repliement correct de
30 la protéine ou son activité.
La fonction du gène hmgb2 peut notamment être inactivée par la délétion totale ou partielle de ce gène, ou l'insertion ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides de telle sorte à rendre ce gène inactif. Selon un mode de réalisation particulier, la fonction du gène hmgb2 est inactivée par délétion totale ou partielle de ce gène, de préférence par délétion totale.
De manière préférée, la délétion du gène hmgb2 est obtenue par recombinaison homologue. Cette méthode est bien connue de l'homme du métier et a été appliquée de nombreuses fois aux parasites du genre Plasmodium (voir par exemple Thathy and Ménard, 2002). Selon un mode de réalisation particulier, la région codante du gène hmgb2 est remplacée par recombinaison homologue par un marqueur permettant de sélectionner les parasites dans lesquels la recombinaison a eu lieu. Le marqueur de sélection peut être, par exemple, le gène humain de la dihydrofolate réductase (dhfr) qui confère au parasite la résistance à la pyriméthamine. L'obtention de parasites dans lesquels le gène hmgb2 est délété, est exemplifïée dans la partie expérimentale. Selon un mode particulier de l'invention, le parasite utilisé est un parasite dans lequel le gène hmgb2 a été remplacé par un marqueur de sélection, de préférence par le gène humain dhfr. Selon un mode très particulier de l'invention, le parasite est un Plasmodium berghei, de préférence l'isolât NK65, dans lequel le gène hmgb2 a été remplacé par un marqueur de sélection, de préférence par le gène humain dhfr. Selon un autre mode particulier de l'invention, le parasite utilisé est un Plasmodium falciparum, de préférence non ou peu cyto-adhérent, dans lequel le gène hmgb2 a été remplacé par un marqueur de sélection, de préférence par le gène humain dhfr.
La fonction du gène hmgb2 peut également être inactivée en bloquant ou diminuant la traduction de l'ARNm de ce gène. L'interférence par l'ARN, qui permet d'inhiber de manière spécifique l'expression du gène cible, est un phénomène bien connu de l'homme du métier qui a déjà été utilisé pour inhiber l'expression de gènes de Plasmodium (voir, par exemple, McRobert and McConkey, 2002; Mohmmed et al., 2003 ; Gissot et al. 2004). Selon un mode de réalisation, une séquence codant pour un ARN interfèrent, ou son précurseur, est introduite dans le génome du parasite et son expression est contrôlée par un promoteur fort, de préférence constitutif, tel que, par exemple, le promoteur du facteur d'élongation eEFlcc qui est actif dans tous les stades du développement du parasite, ou celui du gène HSP70 qui est actif dans les sporozoïtes et lors du cycle érythrocytaire. La séquence et la structure de l'ARN interfèrent peuvent être aisément choisies par l'homme du métier. De manière particulière, l'ARN interfèrent utilisé peut être un petit ARN interfèrent (ARNsi). Les références GenBank des séquences de gènes hmgb2 de différentes espèces de Plasmodium séquencées ainsi que celles des séquences protéiques correspondantes sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1. Référence GenBank des séquences nucléotidiques et protéiques de HMGB2 de différentes espèces de Plasmodium qui ont été séquencés à ce jour.
Les gènes hmgb2 des espèces de Plasmodium non encore séquencées sont aisément identifiables par des méthodes bien connues de l'homme du métier, notamment par hybridation ou PCR.
Dans le parasite selon l'invention, la fonction d'un ou plusieurs gènes, autres que hmgb2, peut également être inactivée. Le gène additionnel dont la fonction est inactivée, peut être un gène participant à la survie du parasite chez un hôte mammifère, en particulier chez l'homme. De préférence, l'inactivation de ce gène additionnel permet d'atténuer la virulence du parasite tout en préservant son caractère immunogène. Ce gène additionnel peut être choisi dans le groupe constitué de la purine nucléoside phosphorylase (PNP; PFE0660c), le transporteur de nucléoside 1 (NT1; PF13 0252), UIS3 (PF13 0012), UIS4 (PF10 0164 transcrit précoce), p52 (PFD0215c protéine avec motif à 6 cystéines) et p36 (PFD0210c), ainsi que les combinaisons de ceux-ci (les références entre parenthèse sont les numéros d'entrée de la banque PlasmoDB des séquences de Plasmodium falciparum 3D7, données ici à titre d'exemple).
Les méthodes pour cultiver les parasites selon l'invention ainsi que les méthodes de préservation, en particulier de cryopréservation, des parasites ont été précédemment décrites et sont bien connues de l'homme du métier (voir par exemple Leef et al, 1979; Orjih et al, 1980). Ces parasites peuvent être cultivés ex vivo à l'aide de cultures cellulaires ou in vivo chez un animal, par exemple une souris.
Selon un mode de réalisation, les parasites selon l'invention sont utilisés sous une forme érythrocytaire, plus particulièrement sous forme de mérozoïtes non intra- érythrocytaires ou sous forme de mérozoïtes, de trophozoïtes ou de schizontes intra- érythrocytaires.
Selon un mode particulier de réalisation, les parasites selon l'invention sont utilisés sous forme de mérozoïtes, de trophozoïtes ou de schizontes intra- érythrocytaires, c'est-à-dire à l'intérieur de globules rouges.
Selon un autre mode particulier de réalisation, les parasites sont utilisés sous forme de mérozoïtes non intra-érythrocytaires, c'est-à-dire de mérozoïtes partiellement ou totalement purifiés après rupture des globules rouges parasités. Les mérozoïtes peuvent être obtenus selon l'une quelconque des méthodes connues de l'homme du métier telle que celle décrite dans l'article de Boyle et al., 2010.
Les globules rouges parasités peuvent être obtenus par introduction du parasite chez un hôte, de préférence un humain, et récupération des globules rouges de l'hôte infecté lorsque la parasitémie atteint au minimum 1 %, de préférence entre 5 et 10 %. Selon un mode de réalisation préféré, les globules rouges parasités sont récupérés à partir d'un hôte humain du groupe sanguin O et de Rhésus négatif.
Selon un autre mode préféré de réalisation, les globules rouges parasités sont obtenus par infection ex vivo de globules rouges humains, de préférence des globules rouges de groupe sanguin O et de Rhésus négatif. De façon optionnelle, les cultures de globules rouges parasités peuvent être synchronisées de manière à obtenir majoritairement des mérozoïtes, des trophozoïtes ou des schizontes intra- érythrocytaires. Les méthodes de cultures ex vivo des parasites Plasmodium sont bien connues de l'homme du métier (voir par exemple, Trager and Jensen, 1976).
Des anti-coagulants, tels que l'héparine, peuvent être ajoutés aux globules rouges parasités ainsi obtenus. Les globules rouges parasités peuvent être conservés par congélation en présence d'un ou plusieurs cryoprotecteurs compatibles avec une utilisation in vivo, tels que par exemple le glycérol ou le diméthylsulfoxyde (DMSO). Les globules rouges parasités peuvent également être conservés par réfrigération à 4°C dans un milieu de conservation adapté, par exemple du milieu SAGM (« Saline Adénine Glucose Mannitol ») ou une solution CPD (Citrate Phosphate Dextrose), mais pour une durée n'excédant pas environ 45 jours.
Selon un autre mode de réalisation, les parasites selon l'invention sont utilisés sous la forme de sporozoïtes. Les sporozoïtes peuvent être obtenus par introduction du parasite dans un hôte moustique où il va se multiplier. Les sporozoïtes sont alors récupérés à partir des glandes salivaires des moustiques infectés. Les sporozoïtes ainsi obtenus peuvent être conservés par congélation, par exemple dans l'azote liquide, avant d'être décongelés pour être injectés vivants dans un hôte. De manière alternative, après récupération à partir des glandes salivaires des moustiques, les sporozoïtes peuvent être conservés par lyophilisation ou réfrigération avant administration.
L'administration du parasite selon l'invention chez un sujet permet, malgré une clairance parasitaire rapide, d'induire chez le sujet une immunité de plusieurs mois vis- à-vis d'une infection par un Plasmodium, en particulier un Plasmodium choisi dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi, de préférence Plasmodium falciparum. Cette immunité peut notamment être une immunité croisée vis-à-vis d'une infection par une souche de Plasmodium différente de celle du parasite utilisé. En particulier, l'administration d'un parasite selon l'invention appartenant à une souche ne provoquant pas de neuropaludisme peut aboutir à une immunité croisée vis-à-vis d'une infection par une souche de Plasmodium capable de provoquer cette complication neurologique sévère. Le parasite selon l'invention peut donc être utilisé pour la prévention du paludisme et/ou du neuropaludisme. De manière particulière, l'administration du parasite selon l'invention chez un sujet permet d'induire une immunité de plusieurs mois vis-à-vis d'une infection par un Plasmodium falciparum capable d'induire un neuropaludisme et ainsi de prévenir un paludisme et/ou un neuropaludisme induit par ce parasite.
Le terme « prévention » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une absence de symptômes ou à la présence de symptômes atténués de la maladie après contact avec le parasite. En particulier, le terme « prévention du paludisme » se réfère à une absence de symptômes ou à la présence de symptômes atténués chez le sujet traité après contact avec un Plasmodium responsable du paludisme. Le terme « prévention du neuropaludisme » se réfère à une absence de symptômes ou à la présence de symptômes atténués chez le sujet traité après contact avec un Plasmodium responsable du paludisme et capable d'induire un neuropaludisme. Ce terme peut également se référer à l'absence de développement d'un neuropaludisme ou au développement d'un neuropaludisme peu sévère ou atténué chez un sujet infecté par un Plasmodium responsable du paludisme et capable d'induire un neuropaludisme. Dans un second aspect, la présente invention concerne une composition immunogène comprenant une quantité immunologiquement efficace d'un parasite selon l'invention, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables. Le parasite compris dans la composition est tel que décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, la composition comprend un parasite selon l'invention sous une forme érythrocytaire, plus particulièrement sous la forme de mérozoïtes, de trophozoïtes ou de schizontes intra-érythrocytaires ou de mérozoïtes non intra-érythrocytaires, de préférence sous la forme de mérozoïtes, de trophozoïtes ou de schizontes intra-érythrocytaires.
Selon un mode particulier de réalisation, la composition comprend des globules rouges parasités avec le parasite selon l'invention et qui peuvent être obtenus selon la méthode décrite ci-dessus et dans la partie expérimentale.
Selon un autre mode de réalisation, le parasite compris dans la composition est sous la forme de sporozoïtes tels que décrits ci-dessus.
La composition immunogène est capable d'induire chez le sujet auquel elle est administrée, une réponse du système immunitaire à l'encontre du parasite qu'elle contient. Le terme « quantité immunologiquement efficace » tel qu'utilisé ici, se réfère à une quantité de parasites qui est suffisante pour déclencher une réponse immunitaire chez le sujet.
De préférence, la composition immunogène est un vaccin contre le paludisme. Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention est obtenue en mettant en suspension des globules rouges parasités, des mérozoïtes ou des sporozoïtes, de préférence des globules rouges parasités ou des sporozoïtes, tels que définis ci- dessus, dans un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. Les excipients peuvent être aisément choisis par l'homme du métier selon la forme du parasite, intra- érythrocytaire, mérozoïtes ou sporozoïtes, et selon la voie d'administration envisagée. Ces excipients peuvent notamment être choisis dans le groupe constitué d'eau stérile, de sérum physiologique stérile et de tampon phosphate. D'autres excipients bien connus de l'homme du métier peuvent également être utilisés. De préférence, dans le cas où la composition comprend des globules rouges parasités, l'excipient utilisé est une solution isotonique assurant l'intégrité des globules rouges jusqu'à l'administration de la composition au sujet. De manière préférée, la composition comprend également au moins un anti-coagulant tel que l'héparine.
La composition peut également être obtenue en mélangeant des sporozoïtes de parasites tels que définis ci-dessus, avec un support pharmaceutiquement acceptable tel que, par exemple, des liposomes.
Les excipients ou supports utilisés sont choisis de façon à assurer l'intégrité des globules rouges parasités et/ou la survie des sporozoïtes ou des mérozoïtes. Les excipients ou supports utilisés sont choisis de sorte à assurer la survie des parasites de l'invention, quelle que soit la forme utilisée (mérozoïtes, sporozoïtes ou formes intra- érythrocytaires), jusqu'à l'administration de la composition au sujet à immuniser.
Selon un mode de réalisation préféré, le sujet à immuniser est un mammifère, de préférence un humain.
La composition selon l'invention peut être administrée, par exemple, par voie parentérale, cutanée, muqueuse, trans-muqueuse ou épidermique. De préférence, la composition est formulée pour être administrée par voie parentérale, en particulier par voie sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse ou intradermique.
Selon un mode de réalisation particulier, le parasite est sous une forme érythrocytaire, de préférence compris dans des globules rouges, et la composition est formulée pour être administrée par voie parentérale, de préférence par voie sous- cutanée, intramusculaire, intraveineuse ou intradermique, et de manière tout particulièrement préférée par voie intraveineuse.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le parasite est sous forme de sporozoïtes et la composition est formulée pour être administrée par voie parentérale, de préférence par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique, de préférence par voie intramusculaire ou sous-cutanée. Les méthodes d'administration de compositions comprenant des sporozoïtes vivants sont bien connues de l'homme du métier (voir par exemple la demande internationale de brevet WO 2004/045559 et l'article de Hoffman et al, 2010).
Selon un mode de réalisation, le parasite est sous forme érythrocytaire et compris dans des globules rouges et la composition selon l'invention comprend entre 10 et 106 globules rouges parasités (GRP) par unité de dose, de préférence entre 100 et 106 GRP, de manière particulièrement préférée entre 100 et 105 GRP, et de manière tout particulièrement préférée entre 100 et 104 GRP par unité de dose. Selon un mode particulier de réalisation, le parasite est sous forme érythrocytaire et compris dans des globules rouges et la composition selon l'invention comprend entre 10 et 100 globules rouges parasités (GRP) par unité de dose.
Selon un autre mode de réalisation, le parasite est sous forme de mérozoïtes non intra-érythrocytaires et la composition selon l'invention comprend entre 102 et 107 mérozoïtes par unité de dose, de préférence entre 103 et 105 mérozoïtes par unité de dose.
Selon encore un autre mode de réalisation, le parasite est sous forme de sporozoïtes et la composition selon l'invention comprend entre 103 et 107 sporozoïtes par unité de dose, de préférence entre 104 et 105 sporozoïtes par unité de dose.
La dose à administrer peut être aisément déterminée par l'homme du métier en tenant compte des données physiologiques du sujet à immuniser telles que son âge ou son état immunitaire, du degré d'immunité recherché, du nombre de doses administrées et la voie d'administration utilisée. La dose à administrer peut également varier selon le mode de conservation des parasites.
La composition selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs souches de parasites selon l'invention. Selon un mode de réalisation, la composition comprend au moins une souche de Plasmodium falciparum et une souche de Plasmodium vivax dans lesquelles la fonction du gène hmgb2 est inactivée.
La composition selon l'invention peut également comprendre un ou plusieurs autres parasites du genre Plasmodium génétiquement atténués. Ces parasites peuvent, par exemple, présenter un altération ou une inactivation de la fonction du gène de la purine nucléoside phosphorylase, du transporteur de nucléoside 1, UIS3, UIS4, p52 ou p36, ou être des parasites atténués obtenus par irradiation. Ces parasites appartiennent de préférence à une souche sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi
La composition selon l'invention peut également comprendre un ou plusieurs adjuvants immuno logiques. Ces adjuvants stimulent le système immunitaire et renforcent ainsi la réponse immunitaire obtenue vis-à-vis du parasite selon l'invention. Ces adjuvants immuno logiques comprennent, sans y être limités, des adjuvants de type muramylpeptide tels que la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP) et ses dérivés ; le tréhalose dimycolate (TDM) ; le lipopolysaccharide (LPS) ; le monophosphoryl lipide A (MPL) ; la carboxy-méthylcellulose ; l'adjuvant complet de Freund ; l'adjuvant incomplet de Freund ; des adjuvants de type émulsions « huile dans eau » éventuellement additionnés de squalène ou squalane ; les adjuvants minéraux tels que l'alun, l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium, de potassium ou de calcium ; des toxines bactériennes telles que la sous-unité B de la toxine cholérique, la forme inactivée de la toxine pertussique ou la lymphotoxine thermolabile à' Escherichia coli ; des oligodésoxynucléotides CpG ; des saponines; des copolymères synthétiques tels que des copolymères de polyoxyéthylène (POE) et polyoxypropylène (POP); des cytokines ; ou des imidazoquinolones. Des combinaisons d'adjuvants peuvent être utilisées. Ces différents types d'adjuvants sont bien connus de l'homme du métier. En particulier, la composition selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs adjuvants immuno logiques sélectionnés dans le groupe constitué d'oligodésoxynucléotides CpG et d'adjuvants minéraux, en particulier d'alun, et d'une combinaison de ceux-ci.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un parasite vivant appartenant au genre Plasmodium dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée pour la préparation d'une composition vaccinale contre le paludisme ou le neuropaludisme.
L'invention concerne également une méthode pour produire une composition vaccinale contre le paludisme ou le neuropaludisme selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, la méthode comprend l'étape consistant à mélanger des globules rouges infectés avec un parasite vivant selon l'invention, avec un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables. De préférence, les globules rouges sont des globules rouges humains obtenus d'un hôte du groupe sanguin O et de Rhésus négatif.
Selon un autre mode de réalisation, la méthode comprend l'étape consistant à mélanger des mérozoïtes non intra-érythrocytaires vivants d'un parasite selon l'invention avec un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables. Selon un encore autre mode de réalisation, la méthode comprend l'étape consistant à mélanger des sporozoïtes vivants d'un parasite selon l'invention avec un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables.
Selon un mode de réalisation préférée, les parasites, sous la forme de globules rouges parasités, de mérozoïtes ou sous la forme de sporozoïtes, sont également mélangés avec un ou plusieurs adjuvants immuno logiques. Ces adjuvants peuvent être tels que définis ci-dessus.
La méthode peut en outre comprendre une étape préalable comprenant l'obtention desdits globules rouges parasités, desdits mérozoïtes ou desdits sporozoïtes, par exemple à l'aide des méthodes décrites ci-dessus.
La composition ou le vaccin obtenu peut être conservé avant administration, par exemple congelé ou réfrigéré s'il contient des globules rouges parasités, ou congelé, réfrigéré ou lyophilisé s'il contient des sporozoïtes ou des mérozoïtes. De préférence, la composition ou le vaccin obtenu est conservé congelé avant administration. Dans le cas d'une lyophilisation, un diluant approprié est ajouté au lyophilisât avant administration, tel que, par exemple, de l'eau stérile ou du sérum physiologique stérile, de préférence du sérum physiologique stérile.
Les différents modes de réalisation concernant le parasite et la composition selon l'invention sont également envisagés dans cet aspect.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour immuniser un sujet contre le paludisme, comprenant l'administration d'une composition immunogène ou d'un vaccin selon l'invention audit sujet.
De préférence, le sujet est un mammifère, plus particulièrement un humain. Selon un mode de réalisation préférée, la méthode comprend l'administration d'un vaccin selon l'invention audit sujet.
Selon un mode de réalisation, la méthode comprend l'administration d'une dose unique de la composition immunogène ou du vaccin selon l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, la méthode comprend l'administration d'une pluralité de doses de la composition immunogène ou du vaccin selon l'invention. L'immunisation du sujet peut être obtenue après l'administration de 2 à 6 doses. De préférence, un délai d'environ 4 à 8 semaines, de préférence d'environ 6 à 8 semaines, est observé entre chaque administration. Les inventeurs ont démontré que l'administration d'une seule dose comprenant 105 globules rouges parasités avec un parasite selon l'invention permettait d'obtenir une immunité stérile d'au moins 6 mois chez un mammifère. Selon un mode préféré de réalisation, la méthode comprend l'administration d'une première dose de la composition immunogène ou du vaccin selon l'invention suivi de l'administration d'une seconde dose environ six mois à un an plus tard. De préférence, les doses comprennent entre 10 et 106, de préférence entre 100 et 106, globules rouges parasités, entre 102 et 107 mérozoïtes ou entre 103 et 107 sporozoïtes. Selon un mode de réalisation préféré, les doses comprennent environ 103 globules rouges parasités. Selon un autre mode de réalisation préféré, les doses comprennent entre 10 et 100 globules rouges parasités.
L'immunité du sujet vis-à-vis du paludisme ou du neuropaludisme peut être totale ou incomplète. Dans le cas d'une immunité incomplète, la gravité des symptômes de la maladie déclarée chez un sujet immunisé sera réduite par comparaison à ceux observés chez un sujet non immunisé. Dans le cas d'une immunité totale, le sujet immunisé ne déclarera aucun symptôme de la maladie après un contact avec le parasite.
Selon un mode de réalisation préféré, l'immunité obtenue par administration de la composition selon l'invention est une immunité stérile. Cela signifie que le développement des parasites administrés est très altéré et qu'environ 2 à 4 semaines après l'administration, les parasites ne sont plus détectés dans le sang périphérique du sujet.
L'invention concerne également une méthode pour immuniser un sujet contre le paludisme, comprenant l'administration d'un parasite selon l'invention sous la forme de sporozoïtes audit sujet par le biais de morsures de moustiques infectés par ledit parasite.
Les exemples qui suivent sont présentés dans un but illustratif et non limitatif. Exemples
En étudiant la fonction des protéines HMGB, les inventeurs ont récemment montré que la protéine HMGB2 de P. berghei est impliquée dans l'établissement du neuropaludisme expérimental (NPE) dans un modèle de souris C57BL/6 infectées par le parasite de P. berghei ANKA (i¾ANKA). L'inactivation du gène hmgb2 chez i¾ANKA, sans entraver le développement du parasite chez les souris C57BL/6, induit néanmoins un retard dans l'établissement du NPE voire son abolition complète dans 65% des cas. De plus, il a été montré que l'administration de protéines recombinantes HMGB2 à des souris préalablement infectées par i¾ANKA Ahmgb2 permettait de restaurer le développement du neuropaludisme.
Matériels et méthodes
Souris
Les souris utilisées sont des souris C57BL/6 (Charles River Laboratories). Ces souris sont sensibles au neuropaludisme expérimental (NP-S).
Parasites sauvages
Le parasite P. berghei ANKA (i¾ANKA) (MRA-867) induit la mort de souris C57BL/6 par neuropaludisme en 7 jours +/- 1. Ce parasite possède une étiquette GFP sous le contrôle du promoteur eefl (Thaty and Ménard, 2002).
Le parasite P. berghei NK65 (i¾NK65) (MRA-268) (de Sa et al. 2009) induit la mort des souris C57BL/6 par hyper-parasitémie en 20 à 25 jours après infection. En revanche, ce parasite ne provoque pas de neuropaludisme.
Obtention du parasite PbNK65 Ahmgb2 Construction du vecteur de clonage: les régions qui flanquent la phase ouverte de lecture en 5 'UTR et 3 'UTR du gène hmgb2, respectivement nommées ci-dessous RH1 et RH2 (et d'une longueur d'environ 500 pb), ont été amplifiées à l'aide d'amorces spécifiques, par PCR à partir de l'ADN génomique du parasite i¾NK65 (Tableau 2) clonées dans le vecteur pCR®II-TOPO (Invitrogen). Des bactéries Escherichia coli One Shot® TOP 10 électro-compétentes ont ensuite été transformées avec ces constructions et sélectionnées sur milieu LB contenant de l'ampicilline et de la kanamycine.
Tableau 2. ÷ Amorces d'amplification des régions d'homologies RH1 et RH2
RH1 sens 5 ' CGATGCGGGCCC AAAAAGGTAAAT ATGAAAAAGAAAGGTT3 '
(SEQ ID No : 11)
RH1 anti-sens 5'CGATGCCCCGGGTTTGCAATGGAAACATATCAGTT3' (SEQ ID
No : 12)
RH2 sens 5 ' CCAGTGAGTGCGGCCGCGGAGCCTTTTGTATGTGCTTTTTG3 '
(SEQ ID No : 13)
RH2 anti-sens 5 'AGCTGGCGCGCC AAGTATTGCAGTAGCATTTTCTTTAAAT3 '
(SEQ ID No : 14) Les amorces servant à l'amplification ont été dessinées de sorte à adjoindre pour
- RHl : un site de restriction Apal en 5' UTR et un site de restriction Smal en 3'UTR, et
- RH2 : un site de restriction Notl en 5 ' UTR et un site de restriction Ascl en 3'UTR de la séquence. Ces sites de restrictions permettent l'insertion des fragments
PCR dans le vecteur.
Les régions 5' et 3' non traduites RHl et RH2 ont ensuite été insérées dans un vecteur pBC SK-Hudhfr (Stratagene) contenant le gène de la dihydrofolate réductase humaine (hudhfr) sous le contrôle du promoteur efla en 5'UTR et de la dhfr/ts (dhfr/thymidilate synthase) en 3'UTR. RHl a été insérée en 5'UTR de la cassette Hudhfr et RH2 en 3'UTR. Lors de la recombinaison homologue, les 2 régions RHl et RH2 se sont appariées avec les séquences complémentaires du gène hmgb2 dans le génome de P. berghei, permettre une double recombinaison homologue au niveau de ce gène et, de ce fait, sa délétion. La Hudhfr confère la résistance à la pyriméthamine et les parasites mutants ont été sélectionnés à l'aide de cette drogue.
Transfection des parasites et sélection des parasites mutants: les mérozoïtes de P. berghei ont été transfectés en suivant le protocole décrit par de Koning-Ward et al, 2000. Toutes les infections ont été réalisées par injection intra veineuse.
Deux souris Swiss de 3 semaines ont été infectées avec 2,6.106 GRPs i¾ANKA ou i¾NK65. Lorsque la parasitémie atteignait entre 2 et 3 % (stades jeunes majoritaires), le sang a été prélevé sous héparine par ponction intra cardiaque (1,5 à 2 ml de sang). Le sang a été lavé brièvement dans 5 ml de milieu de culture complet constitué de 4 vol de RPMI 1640 (Invitrogen) additionné de 1 vol de sérum de veau fœtal (InVitrogen). Après centrifugation 8 min à 450 g, les GRPs ont été repris dans 50 ml de milieu de culture complet. La suspension cellulaire, à laquelle ont été ajoutés 50 ml supplémentaires de milieu de culture complet, a alors été mise en culture toute la nuit, dans un Erlen Meyer de 500 ml, à 36,5 °C, sous agitation à 70 rpm et sous une pression de 1,5 à 2 bars.
Le lendemain, après vérification par frottis de la présence majoritaire de schizontes matures la culture de GRPs a été centrifugée 10 min à 1500 rpm puis le culot a été repris dans 35 ml de milieu de culture complet dans un tube à fond conique de 50 ml. Dix millilitres de Nycodenz 50 % (Lucron Bioproducts, dilution ½ dans du PBS 1 X) ont ensuite été tout doucement additionnés à la culture de GRPs de manière à créer un gradient de densité au fond du tube. Vingt minutes de centrifugation à 450 g, TA, sans frein, ont entraîné la purification des GRPs qui forment alors un anneau brun au milieu du tube. L'anneau brun de GRPs a été prélevé (-20 ml) puis lavé avec 20 ml de milieu de culture complet. Après 8 min de centrifugation à 450 g, le culot de schizontes matures a été finalement repris dans 3 ml de milieu de culture complet qui ont ensuite été distribués dans 3 tubes Eppendorf de 1,5 ml. Cette opération a du être réalisée de manière très délicate car les schizontes sont fragiles. A cette étape, la quantité de schizontes obtenus a été suffisante pour réaliser jusqu'à 10 transfections indépendantes. Après un dernier «spin» 5 sec à 16000 g, le culot de schizontes dans chaque tube a été alors repris dans 100 μΐ du tampon d'électroporation (Nucleofector Solution 88A6, AMAXA) avec 5 μg de chacune des constructions plasmidiques obtenues (pBC- 5'RHlH«<i/z/r3'RH2 pour pbhmgbl ou pbhmgbl), digérées au préalable par Apal et Ascl. Les parasites ont été transfectés en utilisant le programme U33 de l'électroporateur, Nucleofector AMAXA. Le choc électrique induit la rupture de la membrane des schizontes matures et les mérozoïtes ainsi libérés peuvent internaliser les plasmides linéarisés. Cinquante microlitres de milieu de culture complet ont été additionnés tout de suite au contenu de la cuvette et deux souris Swiss de 3 semaines ont été immédiatement infectées avec 100 μΐ, chacune, de mérozoïtes transfectés. A Jl après l'infection, la drogue de sélection, la pyriméthamine a été administrée dans l'eau de boisson et des frottis ont été réalisés tous les jours. La solution de pyriméthamine a été préparée de la manière suivante: 70 mg de pyriméthamine (Sigma Aldrich), 10 ml DMSO, qsp 1 L eau, pH 3,5-5,5. Lorsque les souris sont devenues positives pour la présence de parasites (environ J6 après l'infection) et que la parasitémie a atteint entre 2 et 10 %, leur sang a été prélevé par ponction intra cardiaque. Conditions de culture des parasites et inoculation
Les souris C57BL/6 ont été infectées, en intra-péritonéale avec 200 μΐ chacune, d'une ampoule contenant 107 GRPs/200 μΐ. Lorsque la parasitémie a atteint entre 1 et 5 % (5-6 jours après infection), environ 100 μΐ de sang ont été prélevés à la joue de l'animal dans un tube contenant de l'héparine. Ce sang a été lavé 2 fois avec 1 ml de PBS froid et centrifugé 5 min à 3800 rpm. Après dilution au 1/1000 et comptage des cellules, les souris C57BL/6 ont été infectées avec 105 GRPs. Mesure de la parasitémie
La parasitémie est analysée par comptage au microscope des globules rouges parasités (GRP) dans des frottis colorés.
Préparations des globules rouges parasités et congélation des GRP Les souris C57BL/6 sont infectées, en intra-péritonéale avec 200 μΐ chacune, d'une ampoule contenant 107 GRPs/200 μΐ.
Deux types de stocks de parasites sont réalisés.
Stabilats: le sang est prélevé chez des souris infectées, par ponction intracardiaque (animal anesthésié) lorsque la parasitémie atteint entre 3 et 10 % (5 à 6 jours après infection à l'aide de 107 globules rouges parasités) dans un tube contenant de l'héparine et toujours conservé dans la glace jusqu'à la congélation dans l'azote liquide dans le mélange cryopréservant suivant: 1 vol Glycérol pur (Sigma Aldrich) + 9 vol d'Alsever's Solution (Sigma Aldrich). Les stabilats sont réalisés avec 1 vol du sang prélevé auquel sont additionnés 2 vol du mélange cryopréservant. Les parties aliquotes sont congelées dans l'azote liquide (environ 300μ1 par souris) et conservés ensuite à -80 °C.
Ampoules: comme précédemment, le sang est prélevé par ponction intracardiaque mais, lorsque la parasitémie atteint entre 1 et 5 %. Ce sang est lavé plusieurs fois avec du PBS froid et centrifugé 5 min à 3800 rpm. Puis des ampoules de 107 GRPs/200 μΐ sont réalisées dans un mélange cryopréservant voir paragraphe précédent après comptage du nombre des globules rouges parasités.
Résultats
Rôle de la protéine HMGB2 dans le développement du parasite PbNK65
Les inventeurs ont démontré que l'inactivation du gène hmgb2 entravait le développement de i¾NK65 Ahmgb2 dans la souris C57BL/6 (NP-S) avec une clairance du parasite 10 à 15 jours après l'infection (J10-J15) en fonction de la dose infectante de parasites. La figure 1 représente la moyenne de 3 expériences (souris n=5 par expérience) au cours desquelles les souris C57BL/6 ont été infectées à l'aide de globules rouges parasités avec i¾NK65 sauvage ou i¾NK65 Ahmgb2. Cette clairance du parasite muté a été observée environ 15 jours après infection. Le parasite muté n'était plus détecté dans les frottis sanguins alors que le développement du parasite sauvage se poursuivait jusqu'à la mort par hyper-parasitémie environ 25 jours après infection. En effet, alors que le parasite sauvage continue à se développer, l'infection avec i¾NK65 Ahmgb2 induit une réponse immunitaire chez la souris C57BL/6 qui altère le développement de ce parasite. Plusieurs clones mutés indépendants ont été obtenus montrant la même cinétique de clairance lors de leur développement dans les souris C57BL/6.
Protection stérile induite par une primo-infection avec PbNK65 Ahmgb2
Plusieurs expériences ont été réalisées avec de une à trois épreuves d'infection successives dans des souris C57BL/6 primo-infectées avec le parasite muté i¾NK65 Ahmgb2 (105 GRP par voie intrapéritonéale ou intraveineuse). Lorsque le parasite n'était plus détecté dans le sang des souris C57BL/6 (vers J19), les inventeurs procédaient à la première épreuve d'infection (J19), puis la seconde à J71 et la troisième à J162 avec deux parasites sauvages hautement pathogènes:
1. le parasite homologue sauvage i¾NK65 conduisant à la mort des souris par hyperparasitémie et
2. le parasite hétéro logue i¾ANKA sauvage qui induit la mort des souris par neuropaludisme.
La figure 2 présente les résultats d'une expérience avec trois épreuves d'infection successives. Toutes les souris primo-infectées avec i¾NK65 Ahmgb2 ont survécu aux trois épreuves d'infection avec maintien d'une protection stérile pendant au moins 7 mois. A chaque épreuve, les inventeurs ont vérifié que le développement du parasite sauvage i¾NK65 dans les souris naïves se poursuit jusqu'à environ 25 jours où les souris commencent à mourir d'hyper-parasitémie et que le développement du parasite i¾ANKA sauvage dans les souris naïves se poursuit jusqu'à environ 7 jours où les souris meurent de neuropaludisme (les témoins de la pathogénicité des parasites et de l'âge des souris).
Afin de déterminer la plus petite dose de globules rouges infectés par i¾NK65 Ahmgb2 nécessaire et suffisante pour promouvoir la protection stérile, des épreuves d'infection ont été menées sur des souris primo-infectées avec 105 à 103 GRP (Figure 3) et même 102 GRP (résultats non présentés). Ces expériences ont montré que l'injection de 102 ou 103 GRP permettait d'induire une protection stérile lors d'une épreuve d'infection menée par injection intraveineuse de 105 GRP de i¾NK65 ou i¾ANKA sauvage.
Conclusion
Ces résultats montrent qu'une immunité stérile (les parasites ne sont plus détectés dans le sang périphérique) peut être induite après une primo-infection avec le parasite i¾NK65 Ahmgb2. Cette protection s'étend non seulement au parasite homologue sauvage ÔNK65 mais également au parasite hétérologue i¾ANKA capable d'induire un neuropaludisme.
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Claims

Revendications
1. Parasite vivant appartenant au genre Plasmodium dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée pour une utilisation dans la prévention du paludisme ou du neuropaludisme chez un mammifère.
2. Parasite selon la revendication 1, dans lequel la souche du parasite est sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi.
3. Parasite selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la souche du parasite est sélectionnée dans le groupe constitué de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale et Plasmodium malariae.
4. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la souche du parasite est Plasmodium falciparum.
5. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le parasite sous sa forme sauvage ne provoque pas de neuropaludisme.
6. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 5, dans lequel la souche du parasite est Plasmodium berghei NK65.
7. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la souche du parasite est une souche de Plasmodium falciparum non cyto-adhérente ou ayant une capacité de cyto-adhérence réduite.
8. Parasite selon la revendication 7, dans lequel la souche du parasite est une souche de Plasmodium falciparum ayant une capacité de cyto-adhérence réduite.
9. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le parasite est sous la forme de mérozoïtes non intra-érythrocytaires.
10. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le parasite est sous une forme intra-érythrocytaire.
5 11. Parasite selon la revendication 10, dans lequel le parasite est sous la forme de trophozoïtes, mérozoïtes ou de schizontes intra-érythrocytaires.
12. Parasite selon la revendication 11, dans lequel le parasite est sous la forme de mérozoïtes ou de schizontes intra-érythrocytaires
10
13. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le parasite est sous la forme de sporozoïtes.
14. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel la fonction du 15 gène hmgb2 est inactivée par délétion totale ou partielle dudit gène.
15. Parasite selon la revendication 14, dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée par délétion totale dudit gène.
20 16. Parasite selon la revendication 14 ou 15, dans lequel la région codante du gène hmgb2 est remplacée par un marqueur de sélection.
17. Parasite selon la revendication 16, dans lequel le marqueur de sélection est le gène humain codant pour la dihydrofolate réductase.
25
18. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel la fonction du gène hmgb2 est inactivée au moyen d'un AR interfèrent bloquant ou diminuant la traduction de la protéine HMGB2.
30 19. Parasite selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel la fonction d'un ou plusieurs autres gènes est inactivée.
20. Parasite selon la revendication 19, dans lequel le ou les autres gènes dont la fonction est inactivée sont choisis dans le groupe constitué des gènes codant pour la purine nucléoside phosphorylase, le transporteur de nucléoside 1, UIS3, UIS4, p52 et p36, et une combinaison de ceux-ci.
5
21. Composition immunogène comprenant, en tant qu'immunogène, une quantité immuno logiquement efficace d'un parasite tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 20, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables.
10
22. Vaccin contre le paludisme comprenant, en tant qu'immunogène, un parasite tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 20, et un ou plusieurs excipients ou supports pharmaceutiquement acceptables.
15 23. Composition immunogène selon la revendication 21 ou vaccin selon la revendication 22 comprenant en outre un ou plusieurs adjuvants immuno logiques.
24. Composition immunogène ou vaccin selon la revendication 23, dans lequel le ou les adjuvants immunologiques sont sélectionnés dans le groupe constitué des adjuvants de 0 type muramylpeptide; le tréhalose dimycolate (TDM) ; le lipopolysaccharide (LPS) ; le monophosphoryl lipide A (MPL) ; la carboxy-méthylcellulose ; l'adjuvant complet de Freund ; l'adjuvant incomplet de Freund ; des adjuvants de type émulsions « huile dans eau » éventuellement additionnés de squalène ou squalane ; les adjuvants minéraux; des toxines bactériennes; des oligodésoxynucléotides CpG ; des saponines; des copolymères 5 synthétiques; des cytokines et des imidazoquinolones.
25. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 21, 23 et 24 ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, formulé pour être administré par voie parentérale.
30
26. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 21, 23 à 25 ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 22 à 25, comprenant plusieurs parasites tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 20.
27. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 21, 23 à 26 ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, comprenant entre 10 et 106, de préférence entre 102 et 106, desdits parasites sous une forme intra-érythrocytaire par
5 unité de dose.
28. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 21, 23 à 26 ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, comprenant entre 103 et 107 parasites sous la forme de sporozoïtes par unité de dose.
10
29. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 21, 23 à 26 ou vaccin selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, comprenant entre 102 et 107 parasites sous la forme de mérozoïtes non intra-érythrocytaires par unité de dose.
15 30. Utilisation d'un parasite tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 20, pour la préparation d'une composition vaccinale contre le paludisme ou le neuropaludisme.
31. Méthode pour immuniser un sujet contre le paludisme, comprenant l'administration 0 d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 21, 23 à 29 ou d'un vaccin selon l'une quelconque des revendications 22 à 29 audit sujet.
32. Méthode selon la revendication 31, dans laquelle la composition ou le vaccin est administré par voie parentérale.
5
33. Méthode selon la revendication 32, dans laquelle la composition ou le vaccin est administré par voie sous-cutanée, intramusculaire, intradermique ou intraveineuse.
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