ES2312758T3 - Seleccion de cepas eimeria de aves de corral mediante esporozitos extraintestinales. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para preparar oocistos no patógenos de una especie de Eimeria capaces de generar una respuesta inmunitaria contra la coccidiosis en aves de corral, en el que dicho procedimiento comprende la atenuación de una cepa de una especie de Eimeria mediante pasadas en serie de dicha cepa por lo menos nueve veces en aves SPF, y en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes: (i) inocular por lo menos un ave exenta de patógenos específicos (SPF) con oocistos de Eimeria; (ii) extraer sangre del ave de la etapa (i); (iii) inocular por lo menos una segunda ave SPF con sangre de la etapa (ii); (iv) recoger oocistos de Eimeria de un ave de la etapa (iii); (v) multiplicar los oocistos recogidos en la etapa (iv) en por lo menos otra ave SPF, y extraer oocistos de la misma; en el que las etapas (i) a (v) representan un ciclo que se repite por lo menos tres veces siendo los oocistos recogidos en la etapa (v) de cada ciclo, utilizados en la inoculación de la etapa (i) del siguiente ciclo.
Description
Selección de cepas Eimeria de aves de
corral mediante esporozitos extraintestinales.
La presente invención se refiere al desarrollo
de nuevas cepas de especies de Eimeria que tienen potentes
propiedades inmunógenas y baja patogenicidad, y que son útiles en la
producción de oocistos para vacunas contra coccidios. Además, la
invención se refiere a nuevos métodos para obtener cepas atenuadas
de especies de Eimeria que son útiles para formular vacunas
contra la coccidiosis.
La coccidiosis es una enfermedad aviar causada
por la infección de una o más de las muchas especies de coccidios,
que son parásitos protozoos intracelulares del subtipo
Apicomplexa y del género Eimeria. Se sabe que la
coccidiosis está causada por varias especies distintas de
Eimeria, a saber: Eimeria acervulina, E.
maxima, E. tenella, E. necatrix, E.
brunetti, E. mitis, E. praecox, y quizás E.
mivati y E. hagani. Las especies difieren en sus efectos
patógenos en las aves, y también el tipo de aves desempeña un
papel. Así, un pollo de engorde sufrirá considerables lesiones
producidas por un parásito tal como E. acervulina debido a
que infecta gran parte del intestino delgado, que es uno de los
principales centros donde se lleva a cabo la digestión de los
alimentos.
Durante su ciclo vital el parásito de
Eimeria atraviesa varias fases. El ciclo vital comienza
cuando el pollo ingiere el parásito en su fase infecciosa,
denominado oocisto esporulado, durante la alimentación en el suelo
o por inhalación de polvo. La pared del oocisto esporulado se rompe
debido a la acción mecánica en la molleja y en el intestino, con lo
que se liberan cuatro esporocistos. Los esporocistos pasan al
duodeno, donde quedan expuestos a las enzimas biliares y digestivas
que provocan la liberación de un promedio de dos esporozoítos por
esporocisto.
Los esporozoítos son móviles y buscan células
epiteliales adecuadas del hospedador con el objeto de penetrar y
reproducirse en ellas. Tras la infección de una célula epitelial, el
parásito entra en la fase de esquizonte del ciclo celular, en la
que produce de 8 a 16 hasta más de 200 merozoítos por esquizonte.
Una vez liberados del esquizonte, los merozoítos son capaces de
continuar la infección del epitelio. Después de dos a cinco de
estos ciclos de reproducción asexual, los merozoítos intracelulares
se convierten en formas sexuales conocidas como hembra o
macrogametocito, y macho o microgametocito. Tras la fertilización
del macrogametocito por los microgametos liberados a partir del
microgametocito, se forma un cigoto que crea a su alrededor una
pared quística. El oocisto recién formado se disemina con las heces
del pollo infectado.
Cuando se dan las condiciones ambientales
adecuadas de temperatura y humedad y suficiente oxígeno en el aire,
el oocisto esporulará para formar la fase infecciosa, con lo que
será capaz de infectar un nuevo hospedador y extender de este modo
la enfermedad. Por tanto, no es necesario ningún hospedador
intermediario para la transferencia del parásito de un ave a
otra.
El resultado de la infección del tubo digestivo
de un ave por un parásito de Eimeria puede ser una reducción
en el aumento de peso, una disminución en el procesamiento de los
alimentos, una paralización en la producción de huevos, y, en
algunos casos, la muerte. El aumento en la producción intensiva de
aves de corral se ha visto acompañado de importantes pérdidas
debidas a este parásito. Se calcula que las pérdidas en Estados
Unidos y Europa superan cientos de millones de dólares al año.
En la actualidad se han puesto en marcha varias
medidas para controlar la coccidiosis. Antes del advenimiento de
los agentes quimioterápicos los principales métodos empleados eran
la mejora de la higiene utilizando desinfectantes, junto con la
eliminación mecánica de los desechos. Además, la introducción de
agentes coccidiostáticos en los alimentos y en el agua potable,
junto con prácticas adecuadas de mantenimiento, se ha traducido en
un cierto éxito en el control de la enfermedad. Sin embargo, se ha
comprobado que dichos agentes presentan eficacia reducida con los
años, debido en parte al desarrollo de cepas de coccidios
resistentes a los fármacos. Además, se ha comprobado que varios
agentes quimioterápicos dejan residuos en la carne de aves
comerciales, con lo que deja de ser apta para el consumo.
Se han llevado a cabo otras medidas
inmunológicas para el control de la enfermedad, incluido el
desarrollo de vacunas con organismos vivos y la utilización de
técnicas de ingeniería genética para formular vacunas. Muchas de
dichas medidas se han centrado en la utilización de proteínas de
Eimeria como componente activo de la vacuna. Por ejemplo,
Tomley et al., en las patentes US nº 5.885.568 y nº
6.001.363, proponen una proteína de Eimeria con propiedades
inmunógenas, así como secuencias de ADN que codifican dichas
proteínas. Una estrategia similar ha sido propuesta por Kok et
al., patente US nº 6.100.241. Una molécula de ADN que tiene una
secuencia de ácido nucleico particular se presenta en Andrews et
al., patentes US nº 4.874.705 y nº 5.187.080; mientras que
Mewman et al., patente US nº 5.028.694, describen una
proteína antigénica purificada capaz de provocar una respuesta
inmunitaria en un pollo contra Eimeria necatrix o
Eimeria tenella. También se describe una vacuna
contra la coccidiosis en Brown et al., patente US nº
6.019.985.
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En la técnica actual es necesario encontrar una
nueva vacuna contra la coccidiosis que sea eficaz, de fácil
administración, y rentable. También son necesarias cepas nuevas e
inventivas de la especie Eimeria que pueden utilizarse para
provocar una respuesta inmunitaria en aves de corral, y proporcionar
de este modo oocistos adecuados para una vacuna. También son
necesarios nuevos métodos para encontrar cepas atenuadas de
Eimeria que puedan utilizarse para el desarrollo de vacunas.
También es necesario en la técnica el desarrollo de cepas de
Eimeria cuyos oocistos, cuando se incorporan en una vacuna,
proporcionan protección cruzada contra una gama más amplia de
especies de Eimeria.
Por consiguiente, un primer objetivo de la
presente invención es proporcionar una cepa aislada de un protozoo,
caracterizada porque dicha cepa se ha atenuado para producir
oocistos no patógenos que provocan una respuesta inmunitaria contra
la coccidiosis en aves de corral.
Se ha comprobado que las especies de protozoos
que tienen un ciclo vital con coccidios y que, por tanto, generan
esporozoítos extraintestinales, son adecuadas para su utilización en
el desarrollo de vacunas. Por tanto, una primera realización de la
invención se refiere a una cepa aislada de un protozoo, como se ha
descrito anteriormente, en la que dicha cepa es una especie de
coccidios atenuada.
Se ha comprobado que las especies del género
Eimeria son particularmente ventajosas para el desarrollo de
nuevas vacunas víricas atenuadas contra la coccidiosis.
Sorprendentemente, se comprobado que las especies de Eimeria
pueden atenuarse mediante propagación por pases en serie para
producir oocistos no patógenos que mantienen la capacidad de
provocar una respuesta inmunitaria contra la coccidiosis en aves de
corral. Por consiguiente, un objetivo de la invención es
proporcionar una cepa aislada no patógena de una especie
seleccionada de entre el género Eimeria, en la que dicha cepa
se ha atenuado para producir oocistos no patógenos que generan una
respuesta inmunitaria contra la coccidiosis en aves de corral.
En particular, se ha comprobado que cuando se
hace pasar de forma sucesiva una cepa de una especie de
Eimeria a través de por lo menos nueve aves exentas de
patógenos específicos (SPF, por sus siglas en inglés), puede
producirse una cepa atenuada no patógena de Eimeria que
mantiene la capacidad para provocar una respuesta inmunitaria
protectora contra la coccidiosis en aves de corral. Por
consiguiente, una realización preferida de la invención se refiere
a una cepa aislada de una especie seleccionada de entre el género
Eimeria, en la que dicha cepa se ha atenuado mediante por lo
menos nueve pases en serie a través de aves SPF, para producir
oocistos no patógenos que generan una respuesta inmunitaria
protectora contra la coccidiosis en aves de corral.
La propagación excesiva por pases en serie de la
especie de Eimeria a través de aves SPF puede dar lugar a
una reducción en la capacidad de la cepa atenuada resultante para
provocar una respuesta inmunitaria protectora contra la
coccidiosis. A la hora de desarrollar una cepa atenuada con este fin
es necesario alcanzar un equilibrio entre el carácter
suficientemente no patógeno mientras se mantiene al mismo tiempo la
capacidad de la cepa atenuada para provocar una respuesta
inmunitaria que proporciona protección eficaz contra la coccidiosis.
Por consiguiente, el número de pases en serie utilizados en el
desarrollo de cepas eficaces adecuadas es también preferentemente
igual o inferior a veinticinco, más preferentemente igual o inferior
a veinte, y más preferentemente entre nueve y quince pases en
serie. En la realización más preferida, se obtiene una atenuación
adecuada realizando de nueve a doce pases en serie en aves SPF con
una cepa de una especie de Eimeria.
Para los efectos de la presente invención, las
cepas de una especie de Eimeria se seleccionan
preferentemente de entre el grupo constituido por Eimeria
acervulina, Eimeria maxima, Eimeria
tenella, Eimeria necatrix, Eimeria
brunetti, Eimeria mitis, Eimeria
praecox, Eimeria mivati, Eimeria
hagani, Eimeria adenoides, Eimeria
gallopavonis, Eimeria meleagridis y
Eimeria meleagrimitis.
Se ha comprobado que las cepas de la especie
Eimeria acervulina son particularmente susceptibles a la
atenuación según la presente invención, especialmente cuando se
trata de generar inmunidad en pollos. Por consiguiente, una
realización particularmente preferida de la invención se refiere a
una cepa que se ha atenuado para producir oocistos no patógenos que
generan una respuesta inmunitaria contra la coccidiosis, en la que
dicha cepa pertenece a la especie Eimeria acervulina. En la
realización más preferida de la invención, se proporciona una cepa
de Eimeria que tiene las características inmunógenas de la
cepa de E. acervulina depositada en la Colección Europea de
Cultivos Celulares con el número de acceso 02010911 (también
identificada como cepa A3C2A2).
Un tercer objetivo de la presente invención es
proporcionar una cepa aislada como se ha descrito anteriormente en
la presente memoria, para su utilización en la generación de
inmunidad contra la coccidiosis en aves de corral.
Un cuarto objetivo la invención es proporcionar
una vacuna para aves de corral que comprende oocistos no patógenos
de una cepa atenuada de una especie seleccionada de entre el género
Eimeria y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en la
que dichos oocistos provocan una respuesta inmunitaria contra la
coccidiosis. Para los efectos de la presente vacuna, los oocistos
son preferentemente oocistos extraintestinales.
También se comprobado que se puede generar una
respuesta inmunitaria protectora contra la coccidiosis en aves
mediante la inoculación con una vacuna que comprende por lo menos
aproximadamente 10^{4} oocistos de una especie adecuadamente
atenuada de Eimeria por dosis. En una realización preferida
la vacuna de la presente invención comprende por lo menos
aproximadamente 10^{4} oocistos de Eimeria por dosis, en la
que dicha Eimeria se ha atenuado mediante por lo menos nueve
pases en serie a través de aves SPF. La especie de Eimeria
empleada para este fin es preferentemente Eimeria
acervulina.
Un quinto objetivo de la invención es
proporcionar un procedimiento para la preparación de oocistos no
patógenos de una especie de Eimeria, en el que dichos
oocistos son capaces de provocar una respuesta inmunitaria contra
la coccidiosis en aves de corral, en el que dicho procedimiento
comprende la atenuación de una cepa de una especie de
Eimeria mediante propagación por pases en serie de dicha cepa
por lo menos nueve veces en aves SPF. En una realiza-
ción preferida, se atenúa una cepa de una especie de Eimeria mediante un procedimiento que comprende las etapas:
ción preferida, se atenúa una cepa de una especie de Eimeria mediante un procedimiento que comprende las etapas:
- (i)
- inocular por lo menos un ave SPF con oocistos de Eimeria;
- (ii)
- extraer sangre del ave de la etapa (i);
- (iii)
- inocular por lo menos una segunda ave SPF con sangre de la etapa (ii);
- (iv)
- recoger oocistos de Eimeria a partir del ave de la etapa (iii);
- (v)
- multiplicar los oocistos recogidos en la etapa (iv) en por lo menos otra ave SPF, y extraer oocistos de la misma;
en el que las etapas (i) a (v) representan un
ciclo que se repite por lo menos tres veces, y en el que los
oocistos recogidos en la etapa (v) de cada ciclo se utilizan en la
inoculación de la etapa (i) del siguiente ciclo.
En otra realización preferida, la cepa
seleccionada para su atenuación mediante el procedimiento de la
invención es una cepa de la especie Eimeria acervulina.
Un sexto objetivo de la invención es
proporcionar oocistos no patógenos, que se obtienen mediante un
procedimiento según la descripción anterior, en el que dichos
oocistos son capaces de provocar una respuesta inmunitaria contra
la coccidiosis en aves de corral.
Un objetivo final de la invención es
proporcionar un método para inocular aves de corral contra la
coccidiosis, que comprende administrar a dichas aves de corral por
lo menos aproximadamente 10^{4} oocistos procedentes de una forma
atenuada de Eimeria acervulina, en la que dicha forma de
Eimeria se ha atenuado mediante por lo menos nueve pases en
serie a través de aves SPF.
La exposición anterior y otras características y
ventajas de la invención podrán apreciarse mejor a partir de la
descripción detallada de las realizaciones preferidas de la
invención presentadas a continuación.
Todas las realizaciones de la invención
descritas en lo sucesivo en la presente memoria están previstas para
su utilización en todas las aves de corral. Tal como se utiliza en
la presente memoria, "aves de corral" se refiere a aves
domesticadas destinadas a la producción de huevos o carne, e
incluyen, sin limitación, especies de importancia comercial tales
como pollos, pavos, patos, gansos, gallinas de Guinea, faisanes,
palomas, pavos reales, gallinas Bantam, y similares. En una
realización preferida la expresión "aves de corral" se refiere
a especies domésticas de pollos y pavos, más preferentemente la
invención se refiere a aves de corral que son especies de
pollos.
Podrá apreciarse que no es necesario todo el
oocisto de una cepa atenuada según la presente invención para
provocar una respuesta inmunitaria contra la coccidiosis. Por
consiguiente, en este sentido, la invención se refiere a un
microorganismo o microorganismos enteros o un fragmento o fragmentos
de los mismos, incluidas proteínas, polipéptidos o secuencias de
aminoácidos, que son útiles para provocar o generar una respuesta
inmunitaria en un animal tal como las aves de corral.
La expresión "no patógeno" se interpretará
conforme al conocimiento del experto en la materia, en el sentido
de que cualquier programa de vacunación puede provocar una reacción
adversa en un pequeño porcentaje de aves inoculadas, y en algunos
casos muertes a consecuencia de tal programa. La expresión "no
patógeno" se considerará relacionada con los programas de
vacunación en los que puedan darse tales casos.
La puntuación media de lesiones puede ser un
indicador particularmente útil de la patogenicidad de una cepa
atenuada según la presente invención. Este parámetro puede valorarse
de forma adecuada midiendo el desarrollo de lesiones en aves SPF
tras la inoculación (p.i). A los seis días p.i. las aves se
sacrifican y se les practican autopsias. A continuación las
lesiones en los intestinos pueden puntuarse con arreglo a lo
descrito por Johnson y Reid; "Anticoccidial drugs: Lesion scoring
techniques in battery and floor pen experiments with chickens";
Exp. Parasitol. 1970; 28: 30-36. Para los efectos de
la presente invención una cepa atenuada no patógena puede definirse
más específicamente como una cepa atenuada que da lugar a una
puntuación media de lesiones de menos de 2,0 para las aves de un
grupo que ha recibido un inoculación de 10^{4} oocistos atenuados,
más preferentemente dicha puntuación media de lesiones es igual o
inferior a 1,8; y lo más preferentemente es que sea igual o
inferior a 1,5.
Para los efectos de la presente invención una
"respuesta inmunitaria" se considerará que se refiere a una
respuesta de inmunidad celular o de inmunidad humoral que genera un
cierto nivel de inmunidad contra la coccidiosis, de modo que en el
caso de una exposición posterior a una cepa virulenta de protozoos
se confiera algún grado de protección a las aves vacunadas frente a
la muerte, la enfermedad, o el deterioro del estado general. El
grado de protección generado por la inoculación con una cepa
atenuada de la invención puede definirse en función del desarrollo
de lesiones en aves cuando se infectan de nuevo posteriormente con
la cepa original o con una cepa similar no atenuada. En este
sentido, una respuesta inmunitaria protectora puede definirse como
una respuesta que, tras la reinfección con una dosis de 10^{4} de
oocistos de la cepa original o de una cepa similar no atenuada, da
lugar a una puntuación media de lesiones igual o inferior a 1,50,
más preferentemente igual o inferior a 1,00, más preferentemente
igual o inferior a 0,50, y aún más preferentemente igual o inferior
a 0,25. Según la metodología citada anteriormente, en la
realización más preferida se registrará una puntuación media de
lesiones de 0,00 para cepas atenuadas capaces de generar la máxima
respuesta inmunitaria protectora contra la coccidiosis en aves de
corral. "Inmunógena" ha de interpretarse como la capacidad de
generar una respuesta inmunitaria según dicha definición.
Para los efectos de la presente invención la
expresión "inocular" se refiere a cualquier forma de introducir
los agentes infecciosos en las aves.
En una realización, la invención se refiere un
método para obtener una cepa inmunógena adecuada para la generación
de oocistos para su utilización en una vacuna contra la coccidiosis.
El método implica por lo menos aproximadamente tres ciclos de una
especie de Eimeria en especímenes donantes de aves de corral
para obtener una cepa atenuada que presente un inmunógeno adecuado.
De este modo, el método puede utilizarse para atenuar la cepa de
Eimeria, de modo que sea al mismo tiempo no patógena y eficaz
para la producción de oocistos que provoquen una respuesta
inmunitaria para el desarrollo de vacunas.
En un aspecto adicional de la invención se
proporciona un método para atenuar una o más cepas de
Eimeria, que comprende la propagación sucesiva por pases de
la cepa a través de por lo menos tres grupos de aves de corral
exentas de patógenos específicos, en el que cada uno de los ciclos
comprende por lo menos dos grupos sucesivos de inoculaciones. La
invención también proporciona otro método para atenuar Eimeria
acervulina, que comprende el ciclo de:
- a)
- inocular por lo menos un primer grupo de aves donantes exentas de patógenos específicos con oocistos generados a partir de una cepa virulenta de E. acervulina;
- b)
- extraer sangre de este primer grupo de aves donantes mediante sacrificio por hemorragia aproximadamente 3 a aproximadamente 6 horas tras la inoculación;
- c)
- inocular por lo menos un segundo grupo de aves donantes exentas de patógenos específicos con la sangre obtenida;
- d)
- recoger oocistos del segundo grupo de aves; y
- e)
- multiplicar los oocistos para completar de este modo sustancialmente el ciclo; y después repetir el ciclo utilizando los oocistos multiplicados en el subprocedimiento e),
de modo que se completan aproximadamente tres
ciclos.
En el primer ciclo, el método implica inocular
especímenes donantes de aves de corral exentas de patógenos
específicos (SPF), preferentemente uno o más pollos donantes, con
una cantidad de oocistos de una especie de Eimeria.
Preferiblemente, la especie es una especie virulenta de
Eimeria que produce esporozoítos circulantes en las aves de
corral hospedadoras, y es más preferentemente E. acervulina.
La dosis de exposición por unidad de aves de corral, por ejemplo,
un ave, se sitúa en el intervalo de aproximadamente 10^{6} a
aproximadamente 10^{8} oocistos, y es preferentemente
aproximadamente 1 x 10^{7} oocistos. Los oocistos se esporulan
preferentemente antes de la inoculación utilizando métodos
disponibles en la técnica. El número de especímenes donantes de
aves de corral puede variar algo, pero se encuentra generalmente en
el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 pollos,
preferentemente aproximadamente 3 a aproximadamente 12 pollos,
siendo preferibles pollos jóvenes recién salidos del cascarón o
polluelos.
A continuación, se extrae sangre de por lo menos
algunos de los polluelos donantes, preferentemente aproximadamente
3 horas hasta aproximadamente 6 horas tras la inoculación (p.i.),
más preferentemente aproximadamente 3 horas p.i. Después se utiliza
la sangre extraída de dichos polluelos donantes para inocular,
preferentemente por vía oral con los alimentos, otro grupo de
especímenes de aves de corral SPF. A continuación se recogen los
oocistos de este grupo de aves que han sido inoculadas con las
muestras de sangre. Estos oocistos se recogen preferentemente a
partir de las heces de las aves infectadas. Dichos oocistos
recogidos se multiplican después en un grupo adicional de
especímenes de aves de corral SPF. (La multiplicación, tal como se
utiliza el término en la técnica, aumenta la cantidad y/o la
concentración de oocistos disponibles). Después se recogen las heces
de dichos especímenes infectados, y se aíslan los oocistos de las
heces. Este procedimiento completaría el primer ciclo. Estos
oocistos, a su vez, se utilizan después preferentemente para la
propagación por pases adicionales del parásito en un ciclo
posterior.
De este modo, un ciclo comprendería los
siguientes subprocedimientos:
- 1)
- Inoculación de la sangre de aves donantes con oocistos esporulados;
- 2)
- Recogida de muestras de sangre de las aves donantes;
- 3)
- Inoculación de nuevas aves con sangre obtenida de las aves donantes;
- 4)
- Recogida de oocistos de las aves inoculadas con muestras de sangre;
- 5)
- Multiplicación de oocistos, y recogida de los mismos para su utilización en ciclos posteriores.
En el segundo ciclo, los oocistos encontrados en
las heces tras la multiplicación y la recogida del primer ciclo
mencionados anteriormente se utilizan después para inocular otro
grupo de especímenes de aves de corral SPF. Es deseable que los
oocistos estén esporulados. En una realización preferida, el nivel
de dosis es superior al utilizado en el primer ciclo anterior. Por
consiguiente, es deseable que aproximadamente 1 x 10^{7} a
aproximadamente 3 x 10^{7} de los oocistos obtenidos en el primer
ciclo se utilicen inicialmente para inocular la sangre de aves
donantes en el segundo ciclo. Preferiblemente, se utilizan
aproximadamente 2 x 10^{7} oocistos por dosis, o aproximadamente
el doble de oocistos por dosis utilizados en el primer ciclo.
Después, se repiten los subprocedimientos 2) a 5) descritos
anteriormente en especímenes de aves de corral SPF en el segundo
ciclo.
En el tercer ciclo, los oocistos recogidos a
partir de las heces de especímenes de aves de corral infectadas
tras el segundo ciclo se utilizan para inocular por lo menos un
tercer grupo de aves de corral SPF, hasta un total de tres (3X)
ciclos para la cepa particular de Eimeria. Al comienzo del
tercer ciclo, es deseable que se utilicen aproximadamente 1 x
10^{7} a aproximadamente 3 x10^{7} de los oocistos obtenidos en
el segundo ciclo para la inoculación inicial de la sangre de aves
donantes en el tercer ciclo. Preferiblemente, se utilizan
aproximadamente 2 x 10^{7} oocistos por dosis, o aproximadamente
el doble de oocistos por dosis que el que se utilizó en el primer
ciclo. Después, los subprocedimientos 2) a 5) descritos
anteriormente se repiten de nuevo como parte del tercer ciclo.
Los expertos en la materia pueden prever ciclos
adicionales con oocistos de la cepa de Eimeria aplicados a
grupos adicionales de aves de corral SPF, pero esta estrategia es
menos preferida en la presente memoria por motivos tanto de coste
como de tiempo. Los solicitantes han descubierto que se prefiere
utilizar un total de aproximadamente tres ciclos como se ha
descrito anteriormente.
A continuación se aísla una cepa final de E.
acervulina después del procedimiento anterior de tres ciclos,
que se ha atenuado como resultado del mismo. La cepa se obtiene a
partir de uno o más miembros de las aves inoculadas al finalizar el
tercer ciclo. La cepa se obtiene utilizando procedimientos de
aislamiento disponibles en la técnica. Dicha cepa puede utilizarse
después como inmunógeno. La cepa se inocula en un grupo adicional
de aves de corral SPF para generar oocistos para una vacuna. Los
oocistos se obtienen preferentemente recogiéndolos de las heces de
las aves de corral expuestas a la cepa. También pueden recogerse a
partir de la sangre, si se desea.
Una cepa preferida de E. acervulina ha
sido aislada en la actualidad e identificada como la cepa A3C2A2,
que se ha depositado en la Colección Europea de Cultivos Celulares,
en Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido, el 19 de diciembre de 2001, con
el número de acceso provisional 02010911 (y allí está disponible), y
funcionará como cepa inmunógena adecuada.
Se ha comprobado que los oocistos generados a
partir de una cepa de Eimeria obtenida según la metodología
descrita en la presente memoria producen un alto grado de
inmunogenicidad cuando se incorporan en una vacuna. Se ha
comprobado asimismo que dichos oocistos son también mucho menos
patógenos que los generados a partir de la cepa original (antes de
los ciclos de inoculación) de Eimeria. Los oocistos generados
según el procedimiento descrito en la presente memoria presentan
también típicamente una protección cruzada más elevada, lo que
significa que ofrecen protección contra una gama más amplia de
especies de Eimeria. De este modo, es deseable que una
vacuna de la invención que utilice oocistos de Eimeria,
preferentemente de E. acervulina, ofrezca protección contra
por lo menos tres, y preferentemente por lo menos cuatro de otras
especies de Eimeria, incluidas, sin limitación, E.
maxima, E. tenella, E. necatrix y E.
brunetti.
Por consiguiente, la invención está dirigida
también a cubrir otras cepas inmunógenas, así como a productos
derivados de las mismas, por ejemplo, oocistos y vacunas que
contienen dichos oocistos, que tienen las características de la
cepa de E. acervulina, y los productos concomitantes
obtenidos siguiendo la metodología descrita en la presente
memoria.
La vacuna final de la invención debe contener
por lo menos aproximadamente 10^{4} oocistos por dosis,
preferentemente oocistos esporulados, para generar una respuesta
inmunógena suficiente en un animal. La vacuna puede contener
también una cantidad mayor de oocistos por dosis, tal como por lo
menos aproximadamente 10^{5} oocistos por dosis; por
consiguiente, es deseable un intervalo de aproximadamente 10^{4} a
aproximadamente 10^{6} oocistos por dosis.
La vacuna descrita en la presente memoria puede
administrarse por vía oral, subcutánea, intradérmica, intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa o intranasal, así como por otras vías
de administración conocidas en la técnica. Entre las anteriores es
generalmente preferida la vía de administración oral. De este modo,
la vacuna puede administrarse a aves de corral jóvenes en el agua
potable, o con los alimentos, por ejemplo. La vacuna puede
administrarse in ovo, pero se administra generalmente a
animales jóvenes post ovum, siendo generalmente los mejores
candidatos aquellos que tienen entre pocas horas y pocas semanas de
edad. En general se prevé administrar una dosis por animal, pero
también se encuentran dentro del alcance de la invención dosis de
refuerzo posteriores.
La vacuna de la invención se formula con un
excipiente farmacéuticamente aceptable, que puede incluir medios
acuosos así como suspensiones o emulsiones, y similares. El
excipiente puede incluir también sales, conservantes, tampones de
pH, estabilizantes y emulsionantes disponibles en la técnica.
Además, la vacuna puede contener también uno o más adyuvantes para
mejorar el rendimiento o aumentar la actividad, tal como la
respuesta inmunitaria, y puede incluir, por consiguiente,
materiales tales como aceites, muramil-dipéptido,
hidróxido de aluminio, saponina, polianiones, sustancias
anfipáticas, y similares. Una cantidad preferida de un excipiente
farmacéuticamente aceptable por dosis (incluido cualquier adyuvante
o adyuvantes) se encuentra, por tanto, dentro del intervalo de
aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 ml, siendo
preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 ml, y
aún más deseable de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 ml.
La vacuna descrita en la presente memoria
también puede contener otros agentes inmunógenos para las aves de
corral. De este modo, por ejemplo, también pueden formularse como
parte de la vacuna de la invención inmunógenos relacionados con
patógenos responsables de enfermedades tales como la causada por el
virus de la enfermedad de Newcastle (NDV). Por tanto, la vacuna
descrita en la presente memoria puede ser monovalente, o puede ser
también bivalente, trivalente, tetravalente, o pentavalente,
etc.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar varios aspectos preferidos de la invención, pero no deben
considerarse como limitativos del alcance de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se presentan
exclusivamente a título ilustrativo, y no deben considerarse como
limitativos del alcance de la invención.
Los pollos de engorde Arbor Acres machos,
exentos de coccidiosis, se obtuvieron del criadero comercial de
Arbor Acres, en Putten, Holanda, y se alojaron en jaulas en
condiciones aisladas cuando tenían un día de edad. Parte de los
polluelos se utilizaron como polluelos donantes, y dichos polluelos
donantes fueron inoculados con oocistos esporulados de E.
acervulina a los 14 días de edad. Todas las aves donantes
destinadas a un pase de propagación fueron alojadas en una
jaula.
Se extrajo sangre de los polluelos donantes,
tres animales cada vez, a las 3 o 6 horas tras la inoculación
(p.i.), y cada muestra individual de sangre se utilizó para inocular
otros tres polluelos. Las aves que recibieron sangre de un polluelo
donante fueron alojadas en una jaula. Se examinaron las heces para
detectar oocistos, y los oocistos de muestras positivas
seleccionadas se utilizaron para la siguiente propagación por pases.
Se llevaron a cabo tres ciclos en serie para obtener la cepa
inmunógena final.
Los oocistos de las muestras positivas
seleccionadas se multiplicaron en cuatro polluelos SPF por muestra
antes del siguiente ciclo. Los polluelos SPF se obtuvieron del
Servicio de Salud Animal, en Deventer, Holanda, y se alojaron en
grupos en celdas aisladas.
Se determinó la patogenicidad de los oocistos
recogidos después de los ciclos 1 y 3 y se comparó con la
patogenicidad de la cepa original utilizando 10 pollos de engorde
Arbor Acres machos, exentos de coccidiosis, por dosis, y cuatro
dosis por cepa; un total de 80 aves por ciclo. Parte de los
polluelos utilizados para la determinación de la patogenicidad de
los oocistos recogidos después del ciclo 3 fueron utilizados también
para determinar la inmunogenicidad de dichos oocistos tras la
reinoculación con la cepa original en comparación con la
inmunogenicidad de la cepa original. Los polluelos se alojaron en
grupos en jaulas en condiciones de aislamiento.
Todas las aves fueron alojadas en el animalario
del Servicio de Salud Animal, en Deventer, Holanda, en la casa 3 de
Het Spelderholt, situada en Beekbergen, Holanda, y recibieron
alimentos exentos de aditivos anticoccídicos.
Para este ciclo se utilizaron 26 pollos de
engorde. Se inocularon ocho polluelos donantes con oocistos
esporulados de E. acervulina y se extrajo sangre de seis
polluelos donantes, tres animales cada vez, a las 3 y 6 horas p.i.
Cada una de las seis muestras de sangre individuales se utilizó para
inocular otros tres polluelos, y los oocistos purificados a partir
de las muestras de heces positivas fueron multiplicados en polluelos
SPF. Se determinó la patogenicidad de una cepa aislada
multiplicada. A continuación se muestran los grupos y el número de
polluelos.
Para cada uno de los dos ciclos siguientes se
utilizaron 15 pollos de engorde. Se inocularon seis polluelos
donantes con oocistos esporulados de E. acervulina y se
extrajo sangre de tres polluelos donantes a las 3 horas p.i. Cada
muestra individual de sangre se utilizó para inocular otros tres
polluelos, y los oocistos purificados a partir de todas las
muestras de heces positivas se multiplicaron en polluelos SPF. Se
determinó la patogenicidad y la inmunogenicidad de la cepa aislada
multiplicada después del ciclo 3. A continuación se presentan los
grupos y los números de polluelos.
E. acervulina se obtuvo originalmente del
Laboratorio Veterinario Central, en Weybridge, Reino Unido, y se
propagó por pases en el Servicio de Salud Animal, en Deventer,
Holanda. Para el primer ciclo de esporozoítos extraintestinales se
preparó una suspensión en solución salina que contenía 10^{7}
oocistos esporulados de E. acervulina por ml. Para los dos
ciclos siguientes se prepararon suspensiones en solución salina que
contenían 2x10^{7} oocistos esporulados de E. acervulina
por ml obtenidos tras la multiplicación del ciclo previo.
Se inocularon polluelos donantes por vía oral en
los alimentos con 10^{7} (1.^{er} ciclo) o 2x10^{7} (ciclos
siguientes) oocistos esporulados de E. acervulina en 1 ml de
solución salina por polluelo a los 14 días de edad. Los polluelos
fueron mantenidos sin comida durante 12 horas antes de la
inoculación. Parte de los polluelos donantes se sacrificaron por
hemorragia practicada mediante punción cardíaca, tres animales cada
vez, a las 3 o 6 horas p.i. La sangre se recogió en tubos
heparinizados de 10 ml, que contenían 15 U.I. de heparina de litio
por ml de sangre (Sarstedt, Etten-Leur). Los
polluelos fueron anestesiados por inyección intramuscular de
xilazina (Rompun, 5 mg/kg de peso corporal) y ketamina (25 mg/kg de
peso corporal), obtenida de AUV, Cuijck, Holanda.
Cada muestra individual de sangre se utilizó
para inocular otros tres polluelos por vía oral en los alimentos
con 3 ml de sangre heparinizada por polluelo a los 14 días de edad.
Diez minutos después de la inoculación, las aves recibieron por vía
oral 1 ml de una suspensión alcalina compuesta de 10 comprimidos de
Rennie adquiridos en una farmacia normal, que contenían 680 mg de
carbonato de calcio y 80 mg de carbonato de magnesio por comprimido,
suspendidos en 20 ml de agua corriente.
Las heces del resto de las aves donantes y de
las aves inoculadas con sangre se recogieron por cada jaula y cada
24 horas en los días 3 a 6 o 7 p.i., y se hizo el recuento de los
oocistos como se describe más adelante. Los oocistos se purificaban
a partir de las heces recogidas si los recuentos de oocistos
resultaban positivos utilizando una técnica de flotación en
solución salina. Tras la purificación, los oocistos aislados se
suspendieron en una solución de bicromato de potasio al 2% (p/v) y
la suspensiones se insuflaron con burbujas de aire utilizando
técnicas habituales empleadas en acuarios, durante 48 horas a 29ºC,
para provocar la esporulación de los oocistos. Después se procedió
al recuento de los oocistos en la suspensiones.
Los oocistos esporulados se multiplicaron en
cuatro aves SPF por muestra. A los seis días de edad, las aves SPF
se inocularon por vía oral con los alimentos empleando 3 ml de
oocistos esporulados obtenidos de muestras de heces. Se recogieron
las heces de las aves SPF de cada jaula en los días 4 a 6 p.i., y
los oocistos se purificaron a partir de las heces y se
contaron.
Para la multiplicación después del ciclo 1, las
aves de los grupos 11 y 12 recibieron oocistos aislados a partir de
las muestras de heces A2 y A3, que contenían 10.000 y 45.000
oocistos en total, respectivamente. Las cepas aisladas obtenidas
después de los ciclos siguientes se multiplicaron dos veces debido
al bajo número de oocistos en las cepas aisladas.
Se recogieron aproximadamente 25 muestras de
heces recién depuestas por cada jaula, y un máximo de 100 g de
heces se pesó, se suspendió en una solución de cloruro de sodio al
10% (p/v) (densidad = 1,1) y se mezcló hasta homogeneidad. Se
mezclaron partes alícuotas de 1 ml de las heces suspendidas con 9 ml
una solución saturada de cloruro de sodio. Los oocistos se contaron
en muestras por triplicado de las heces suspendidas diluidas
utilizando una cámara de recuento según lo descrito por Hawkley, y
se calculó el número de oocistos por gramo de heces.
Se determinó la patogenicidad de los oocistos
después de los ciclos 1 y 3, y se comparó con la patogenicidad de
la cepa original utilizando 10 pollos de engorde por dosis y cuatro
dosis por muestra. Se inocularon dosis de 10^{3}, 10^{4},
10^{5} y 10^{6} oocistos esporulados por ave por vía oral a los
8 días de edad. Los polluelos se alojaron en grupos en jaulas. Se
recogieron las heces de cada jaula en los días 4 a 6 o 7 p.i., y el
recuento de oocistos en las heces se realizó como se ha descrito
anteriormente. A los 6 días p.i. se sacrificaron las aves por
electrocución. Se practicaron autopsias a todas las aves
sacrificadas, y las lesiones en los intestinos se puntuaron con
arreglo a lo descrito por Johnson y Reid (citado anteriormente).
Para la determinación de la patogenicidad de los
oocistos recogidos después del ciclo 1, toda las aves fueron
sacrificadas y pesadas a los 6 días p.i.. Para la determinación de
la patogenicidad de los oocistos recogidos después de la
propagación por pases número 3, se sacrificaron cinco aves de cada
grupo a los 6 días p.i., y el resto de las aves se utilizaron para
determinar la inmunogenicidad. Se recogieron las heces de cada jaula
de 10 aves en los días 4 a 6, y de 5 aves de cada jaula en el día 7
p.i.
Se determinó la inmunogenicidad de los oocistos
recogidos después del ciclo 3 y se comparó con la inmunogenicidad
de la cepa original utilizando cinco pollos de engorde de cada grupo
empleado para la determinación de la patogenicidad. Todas las aves
se pesaron y se reinocularon por vía oral con 10^{5} oocistos
esporulados de la cepa original por cada ave a los 9 días p.i. Se
recogieron las heces de cada jaula a los días 4 a 6 p.i., y los
oocistos de las heces se contaron como se ha descrito anteriormente.
A los 6 días después de la reinoculación se sacrificaron todas las
aves por electrocución y se pesaron. Se practicaron autopsias a
todas las aves y las lesiones de los intestinos se puntuaron como
se ha descrito anteriormente.
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No se encontraron oocistos en las heces de
polluelos inoculados a los 3 días p.i. Se encontraron oocistos en
las heces de aves inoculadas con sangre obtenida de aves donantes a
las 3 horas p.i., en vez de en las heces de aves inoculadas con
sangre obtenida a las 6 horas p.i. Todas las muestras de heces de
los grupos A2 y A3 resultaron positivas para la presencia de
oocistos a los 5 días p.i., y los oocistos se purificaron a partir
de las heces de dichos grupos. Tras la esporulación, se obtuvieron
las siguientes muestras:
Los oocistos recogidos de los grupos A2 y A3 se
multiplicaron en aves SPF. Tras la multiplicación, los oocistos en
las heces de aves que habían recibido oocistos aislados del grupo A2
se habían encogido y no estaba clara la viabilidad de dichos
oocistos. A partir de las aves del grupo 12 que habían recibido
oocistos aislados del grupo A3, se recogieron 500 ml que contenían
290.000 oocistos por ml, y se determinó la patogenicidad de dichos
oocistos.
Una muestra de heces del grupo C resultó
positiva para la presencia de oocistos a los 5 y 6 días p.i., y los
oocistos se purificaron a partir de las heces recogidas en dichos
días. La cepa aislada denominada A3C2 contenía un menor número de
oocistos, y los oocistos se multiplicaron en aves SPF. Tras la
multiplicación, se recogieron 24 x 10^{6} oocistos, y dichos
oocistos se multiplicaron una vez más en aves SPF.
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra de heces del grupo A resultó
positiva para la presencia de oocistos a los 5 días p.i., y los
oocistos se purificaron a partir de las heces. La cepa aislada
denominada A3C2A2 contenía un bajo número de oocistos, y los
oocistos se multiplicaron dos veces en aves SPF. Tras la
multiplicación, se recogieron los oocistos y se determinó la
patogenicidad y la inmunogenicidad de dichos oocistos.
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Se determinó la patogenicidad de los oocistos
recogidos después de los ciclos 1 y 3. Los resultados se resumen en
las Tablas 1 y 2. Después del ciclo 1 no se observaron diferencias
claras en la media del peso corporal, puntuación media de lesiones
o número de oocistos por gramo de heces.
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Después del ciclo 3, las puntuaciones medias de
lesiones fueron menores con oocistos del ciclo 3 que con oocistos
de la cepa original tras dosis de 10^{4} oocistos o más por ave.
Sin embargo, no se observaron diferencias claras en el número de
oocistos por gramo de heces en comparación con la cepa original. El
número de oocistos estaba en conformidad con la dosis inoculada en
ambos casos. El número de oocistos en las heces de aves que habían
recibido dosis mayores de la cepa aislada indica que dichas aves
estaban considerablemente infectadas, pero que la puntuación de
lesiones no aumentaba con la dosis inoculada.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la inmunogenicidad de oocistos
recogidos después del ciclo 3. Los resultados se resumen en la
Tabla 3. En el grupo inoculado con 10^{3} oocistos por ave se
observaron pocas lesiones. También se encontraron oocistos en las
heces de dicho grupo. En los grupos inoculados con dosis mayores de
la cepa aislada, no se observaron lesiones ni oocistos en las
heces. Todos los grupos inoculados con dosis de 10^{4} oocistos,
o más, por ave de la cepa aislada estaban protegidos contra la
reinoculación con la cepa original. Estos resultados se contraponen
a los del grupo testigo (a la derecha) que fueron reinoculados con
la cepa original tras sobrevivir a la exposición con la cepa
original.
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\newpage
Tras la multiplicación, los oocistos en las
heces de aves que habían recibido oocistos aislados después del
primer ciclo del grupo A2 se habían encogido y no estaba clara la
viabilidad de dichos oocistos. Este efecto puede deberse al tiempo
que dichos oocistos habían estado expuestos a la solución saturada
de sal durante la purificación. No se observaron desviaciones de
los oocistos antes de la multiplicación.
El primer ciclo de oocistos extraintestinales de
E. acervulina tuvo éxito con el grupo A3, pero la
reproducibilidad y la patogenicidad de los oocistos aislados no
fueron diferentes a las de la cepa original de E.
acervulina.
El número de oocistos en las heces de aves que
habían recibido las dosis superiores en el ciclo 3 de la cepa
aislada indicaba que dichas aves estaban considerablemente
infectadas. Sin embargo, la puntuación de las lesiones no aumentó
con la dosis inoculada. Si la puntuación de las lesiones es un
parámetro adecuado de la patogenicidad de la cepa, entonces la cepa
aislada A3C2A2 es considerablemente menos patógena que la cepa
original de E. acervulina.
Tras la reinoculación con la cepa original, las
aves inoculadas con 10^{3} oocistos de la cepa aislada A3C2A2 por
ave mostraron pocas lesiones, y se encontraron oocistos en las heces
de este grupo. Las aves inoculadas con dosis de 10^{4} oocistos,
o más, por ave de la cepa aislada A3C2A2 estaban protegidas contra
la reinoculación con la cepa original.
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Claims (6)
1. Procedimiento para preparar oocistos no
patógenos de una especie de Eimeria capaces de generar una
respuesta inmunitaria contra la coccidiosis en aves de corral, en el
que dicho procedimiento comprende la atenuación de una cepa de una
especie de Eimeria mediante pasadas en serie de dicha cepa
por lo menos nueve veces en aves SPF, y en el que dicho
procedimiento comprende las etapas siguientes:
- (i)
- inocular por lo menos un ave exenta de patógenos específicos (SPF) con oocistos de Eimeria;
- (ii)
- extraer sangre del ave de la etapa (i);
- (iii)
- inocular por lo menos una segunda ave SPF con sangre de la etapa (ii);
- (iv)
- recoger oocistos de Eimeria de un ave de la etapa (iii);
- (v)
- multiplicar los oocistos recogidos en la etapa (iv) en por lo menos otra ave SPF, y extraer oocistos de la misma;
en el que las etapas (i) a (v) representan un
ciclo que se repite por lo menos tres veces siendo los oocistos
recogidos en la etapa (v) de cada ciclo, utilizados en la
inoculación de la etapa (i) del siguiente ciclo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha cepa se selecciona de entre la especie Eimeria
acervulina.
3. Procedimiento de preparación de una vacuna
que comprende la preparación de oocistos según la reivindicación 1
ó 2, y la formulación con un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
4. Cepa A3C2A2 de Eimeria acervulina
depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares con el
número de acceso 02010911.
5. Utilización de oocistos de la cepa según la
reivindicación 4 en la preparación de una vacuna destinada a la
protección de aves de corral contra la coccidiosis.
6. Utilización según la reivindicación 5, en la
que el método de protección comprende administrar por lo menos
10^{4} oocistos según la reivindicación 4.
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