JPH02304031A - ニワトリコクシジウムの予防剤及び予防法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はニワトリコクシジウムの予防剤及びこれを用い
るニワトリコクシジウムの免疫学的予防法に関する。

〔従来の技術〕

ニワトリコクシジウム症は古くから知られている病気で
あるが、近年養鶏業が盛んになり、飼育の規模が大きく
なるにつれ、その影響は極めて大きくなっている。

このニワトリコクシジウム症の病原体は、いずれもコク
シジウムエイメリアに属する原虫であり、該原虫は発育
に従って外界型であるオーシスト、すなわち真の感染虫
体であるスポロゾイト、メロゾイト、マクロガメート、
ミクロガメート、チゴート等の形態に変化する。そして
ニワトリコクシジウム症は、鶏糞中のオーシストにより
経口的にニワトリに感染し、このオーシストがスポロシ
ストを経てスポロゾイトとなり、該スポロゾイトが増殖
するとシゾントが形成されるが、その破壊の際にニワト
リの腸粘膜組織や毛細微小血管等が破壊され、多量出血
が短時間に生じ、多くの場合ニワトリの発育に負荷をか
け、時には死に至らしめる病気である。急性のコクシジ
ウム症に羅患したニワトリは、血便等の症状が現われて
から１〜２日の間にその多くが死亡するため、治療より
も特に予防が有効とされている。かかる観点からニワト
リコクシジウムの感染虫体であるスポロゾイトをニワト
リに非経口的に投与するという予防手段が提案されてい
る〔特開昭５６−４９３２３号、同５７−１５９７１９
号〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところが上記ニワトリコクシジウム症の予防方法は、生
きているスポロゾイトをニワトリに直接投与する、所謂
生ワクチン療法である。そしてかかる予防方法において
は、化スポロゾイト製剤中からの雑菌の完全な除去は困
難であり、薬剤として用いる場合に保存性及び安全性の
面で大きな問題どなっていた。

〔課題を解決するだめの手段〕

かかる実情において、本発明者らは上記課題を解決すべ
く鋭意研究した結果、ニワトリ以外の動物より得られた
抗スポロゾイト抗体をニワトリに投与すれば、ニワ）　
ＩＪに対するコクシジウムの感染・発症を有効に抑制で
き、かつその製剤は安全性、保存性にも優れているもの
であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はニワトリ以外の動物より得られるニ
ワトリに感染性のあるコクシジウムのスポロゾイトに対
して特異的な抗体を有効成分とするニワトリコクシジウ
ムの予防剤、及び該抗体をニワトリに投与することを特
徴とするニワトリコクシジウムの予防法を提供するもの
である。

本発明ニワ）　ＩＪコクシジウム予防剤の有効成分であ
る、ニワトリに感染性のあるコクシジウムのスポロゾイ
トに対して特異的な抗体は、例えばニワトリに対して感
染性のあるコクシジウムのスポロゾイトをニワトリ以外
の動物に感作せしめ、該動物の体液より得ることができ
る。

免疫原であるコクシジウムのスポロゾイトとしては、ス
ポロゾイトそのものまたはその破砕物を用いることがで
きる。ここで、スポロゾイトは例えばニワトリコクシジ
ウム症に感染したニワトリの糞、腸管壁または腸管内容
物からオーシストを分離し、その皮膜を磨砕して得るこ
とができる。

またニワトリをコクシジウト症に感染させるためのコク
シジウム原虫としては、ニワトリに感染し、発症させる
ものなら特に限定されるものではないが、例えばエイメ
リア属のテネラ（ｔｅｎｅｌｌａ）　、マキシマ（ｍａ
ｘｉｍａ）、ネカトリックス（ｎｅｃａｔｒｉｘ）、ア
セルブリーナ（ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）等が挙げられる
。

得られたスポロゾイトまたはその破砕物は、通常公知の
手段、例えば粗精物を適当な洗浄液で洗浄後、カラムク
ラマドグラフィー（例えばＤＦ。

５２カラム、力゛ラスウールカラム等）にイ寸ずことに
より精製して用いるのが好ましい。

上記免疫原の免疫に用いられる動物としては、スポロゾ
イトを接種することによりスポロゾイトに対する抗体を
その体内に産生ずる能力のあるニワ）　ＩＪ以外の動物
なら特に限定されないが、例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ
、モルモット、マウス等が挙げられる。就中、特にウサ
ギは、取扱いの容易性、効果及び副作用、特に血球の凝
集や自然抗体との反応による副作用がほとんどないとい
う点において好ましい。

免疫は一般的な方法により、例えば、上記免疫原を上記
の動物の静脈内、皮膜、皮下、腹腔内等に投与すること
よって実施される。より具体的には、免疫原を所望によ
り通常のアジュバントと併用しでニワ）ＩＪ以外の動物
に２〜１４日毎に数回投与することにより行なわれる。

」１記免疫により、当該動物の体内にはスポロゾイトに
対する抗体が産生されているので、該抗体を含有する体
液、例えば血液中から目的とする抗体を採取する。かか
る体液としては、採取の容易性、量から血液が好ましい
。目的とする抗体は、血清から塩析、ゲル濾過、アフィ
ニティークロマトグラフィー等の通常の手段でガンマグ
ロブリン画分、ＩｇＧ画分、ＩｇＭ画分に精製すること
もできるが、血清をそのままもしくは殺菌後抗血清とし
て用いることもできる。また、得られた抗血清、ガンマ
グロブリン画分、ＩｇＭ・ＩｇＧ画分く以下、抗血清等
という）はそのままニワトリに投与することが可能であ
るが、ニワトリ以外の動物の個体差を考慮して抗血清等
に対するニワ）　ＩＪの自然抗体を測定し、該反応の値
が低いものをニワトリに投与するのが好ましい。

なお、本発明においてはスポロゾイトに対して特異的な
抗体としてモノクローナル抗体も使用できるが、ポリク
ローナル抗体が好ましい。

本発明予防剤の投与形態は注射剤が好ましく、投与方法
としては静注又は皮下性が好ましい。注射剤を調製する
には、殺菌され、かつ血液と等張とした液剤、乳剤、懸
濁剤等の形態にするのが好ましい。これら液剤、乳剤、
懸濁剤の形態にするにあたっては、この分野において慣
用されている希釈剤、例えば水、エチルアルコール、プ
ロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコ
ール、ポリオキシエチレン化イソステアリルアルコール
、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を
用いることができる。また等張性の溶液を調製するにあ
たっては、例えば食塩、ブドウ糖、グリセリン等を製剤
中に配合してもよい。

さらに通常の溶解補助剤、緩衝剤を添加してもよい。

本発明予防剤の投与量は、抗血清として１０〜５００μ
Ｉｌ／ｂｏｄｙ程度、ガンマグロブリン画分として０．
０１〜１００１−ｔ　ｇ／ｂｏｄｙ程度力（好ましく、
投与時期は、初生ビナから成鶏まで任意である。

〔発明の効果〕

本発明のコクシジウム予防剤及び予防法によればニワト
リのコクシジウムの発症を有効に予防することができ、
さらに本発明予防剤は製剤が殺菌可能であり安全性、取
扱性にも優れたものである。

〔実施例〕

次に実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
する。

参考例−１免疫原の調製 急性盲腸コクシジウム（Ｅ　、ｔｅｎｅｌｌａの野性株
）のオーシストを１羽当り、１×１０５個を経口にて投
与して感染させた。その鶏の８日目の盲腸を摘出し、そ
の内容物を乳鉢にてすりつぶし、それを水に懸濁させ、
室温下１５００　ｒｐｍにて５分間の遠心洗浄を３〜４
回施した。

その沈査をとり、雑菌を除去し、オーシストを成熟させ
るため、２．５％の重クロム酸水溶液を用い、２６〜２
８℃の卵Ｔ卵器中にて４〜５日間インキュベートした。

さらにこれを１５０　Ｏｒｐｍで５分間遠心してその沈
査をとり、殺菌及び残留盲腸夾雑物を溶解するため、該
沈査に６倍容以上の２５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液
を加え攪拌した。攪拌後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）　（
ｐＨ７，２）で洗浄して、次亜塩素酸ナトリウムを除き
、ＰＢＳに再懸濁して、オーシストと等量のガラスピー
ズ（φ−１＋＋ｏ）（井内盛栄堂）を加え、よく攪拌し
てオーシストを破壊した。これにさらに０．２％トリプ
シンと２％タウデオキシコール酸ナトリウムを加えて４
１℃で一時間反応させた。反応後０．０２％のトリプシ
ンインヒビターを加えて反応を止め、ＰＢＳで洗浄後、
ガラスウールカラム（和光紬薬製）に通してスポロゾイ
トを精製し、免疫原とした。

参考例−２ ウサギ（日本内色種、雌、３ｋｇ以上）に前記参考例−
１で得られた、エイメリア・テネラのスポロゾイトを１
個体当り、１×１０７個静注し、５目間隔で５〜７回免
疫した。最終免疫後５日目に全採血した。採血後これを
遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）に付し、抗血清を
得た。該抗血清を５６℃で３０分間の処理に付し非動化
した。

参考例−３ 抗血清に飽和硫安を加えて、３３％の硫安塩析を行い、
ＰＢＳで可溶化後、再度硫安塩析（３０％）し、ＰＢＳ
による可溶化後、ＰＢＳによる透析（４℃、−昼夜）を
２回行い、ガンマグロブリン画分を得た。

参考例−４ニワトリに対する各種の動物の血清の作用 （１）　　ニワ）ＩＪの血球の凝集能 各種の動物の血清（ウサギ、ヤギ、牛、人、ウサギ抗ス
ポロゾイト血清）を２倍〜２０４８　（２″′）倍まで
、段階希釈し、９６穴プレートに５０μβずつ入れ、ニ
ワトリ血球（ＩＸＩＯ８個／ｍ１ｌ）５０μｌを加えて
、３７℃で一時間反応させて、各々の凝集能を検討した
。

結果を図１に示す。図１よりウサギ血清及びウサギ抗ス
ポロゾイト血清はニワトリ血球に対して凝集能がほとん
どなく、抗血清投与によるニワトリに対する負担も少な
いことが期待される。

実施例−１インビトロにおける抗コクシジウム作用試験 ■　抗血清を用いたアッセイ 参考例−１により得られたスポロゾイト　（１×１０７
個／ｍＡ）１００μｊ２にＰＢＳにより種々の濃度に希
釈された抗血清を１００ｕＡ加え、さらにニワトリの新
鮮血液を５０μｌ加え、これを３７℃で一時間反応させ
た。

反応終了後ＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウム（１０
μｇ／ｎ＋１）を２０μｌｌ加えて、これを室温で１５
分間放置してフローサイトメトリー（Ｅ　Ｐ　Ｉ　ＣＳ
−Ｃ，Ｃｏｕｎｌｔｅｒ　Ｂｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）に
て細胞の状態を測定した。

■　ガンマグロブリン画分を用いたアッセイ参考例−１
により得られたスポロゾイト　（１×１０７個／ｍｊり
１００μＡにＰＢＳにより種々の濃度に希釈したガンマ
グロブリン画分１００μｌを加え、これを３７℃にて１
時間反応させた。対照としては正常家兎血清のガンマグ
ロブリン両分を用いた。反応終了後、Ｉ）　Ｂ　Ｓで洗
浄し、ヨウ化プロビジウム（１０μｇ／　ｍβ）を２０
μβ加え、室温で１５分間放置し、上記フローサイトメ
トリーで細胞の状態を測定した。

結果を表１に示す。

以下余白 この結果より、抗血清においては、ニワトリの血清を加
えると否どに係わらず、その細胞障害側には影響を与え
ず、１０００倍希釈してもコクシジウムの細胞に著効を
示した。

又、ガンマグロブリン画分の場合は、５００倍程鹿の希
釈倍率が適切であることが示された。

また、１０．０００倍希釈の抗血清を用いた場合のフロ
ーサイトメトリーのパターン中のスポロゾイト数は、コ
ントロールの場合は２０．６３６個であったのに対し、
抗血清処理を施した場合は４．４９４個であった。

実施例−２ニワトリにおける本発明の効果ブロイラ一種
アーバーエーカーの初生ひなに抗スポロゾイトウサギ血
清（ｘ　１０．０００）又は正常ウサギ血清（ｘｌＯ）
を各０．５＋ｎｊ！背部皮下に投与した。投与？週間後
に参考例−１で得られたオーシス）５Ｘ１０’個／ｂｏ
ｄｙの割合で経口投与し、５日後の血便及び８日後の相
対体重増加率、血中ヘモグロビン含量（Ｈｂ）、病変度
及びスポルレーションを調べ、抗血清の抗コクシジウム
効果を検討した。

各試験項目の測定は以下の如く行った。

（１）血便指数− 飼育スケジュールの下に敷いである紙の血便のないもの
を０、紙面がほとんど血便のものを４とし、その間を度
合いに応じて順に１．２゜３とした。

（２）相対体重増加率： （３）　　ヘモグロビン含量（Ｈｂ）：ヘモグロビンＢ
−テストワコー１１光純１）を用いた。

（４）病変度： 盲腸の萎縮、出血の程度及び炎症滲出物の量の程度を以
下の判定指標に従って判断し、病変度とした。病変度及
び判定指標（Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａ：８日間） ０：病変みられず ＋１＝盲腸壁に極めて少数の点状出血斑が散在している
が、壁の肥厚はない。内容物は正常である。

＋２：内容物にわずかな血液を生じ、多数の出血病巣が
みられる。盲腸壁は幾分肥厚している。

＋３：多数の血液、あるいは盲腸コアー（凝血又は灰白
色チーズ状バナナ型の塊）を盲腸内に含み、盲腸壁の肥
厚及び盲腸の変形、萎縮が明瞭である。

＋４＝盲腸は著しく萎縮し、病変は直腸部まで達する。

壁は極度に肥厚し盲腸内には凝血あるいは盲腸コアーを
含んでいる。

尚、両側の盲腸の病変が一定でない場合は重い方の病変
を判定し指数をとる。

（５）スポルレーション：実験群の盲腸内容物を取り出
し、乳鉢ですりつぶした後、２５％ 次亜塩素酸ナトリウム液にて夾雑物を 溶解除去し、さらに２．５％重クロム酸カリウム液にて
未熟オーシストを浮遊 させ、２６〜２８℃で５日間培養して 顕微鏡下で成熟度を測定する。

結果を表２に示す。

以下余白 以上の結果より、抗血清投与によりコクシジウム諸症状
が緩和され、体重減少が極めて少なく、血液所見は非感
染と同等の値を示し、かつオーシストのスポルレーショ
ンは抗血清投与により形成不全となり、感染率の低下が
認められた。

【図面の簡単な説明】

図１は各種血清のニワトリ血球に対する凝集能を示す図
面である。 以　　」二

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ニワトリ以外の動物より得られるニワトリに感染性
   のあるコクシジウムのスポロゾイトに対して特異的な抗
   体を有効成分とするニワトリコクシジウムの予防剤。 ２、ニワトリ以外の動物より得られるニワトリに感染性
   のあるコクシジウムのスポロゾイトに対して特異的な抗
   体をニワトリに投与することを特徴とするニワトリコク
   シジウムの予防法。