MX2008012056A - Vacuna de salmonera con virus vivos atenuada. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a mutantes de supresión guaB atenuados de una bacteria que infecta especies veterinarias, más en particular Salmonella enterica, a su uso y producción; la presente invención se refiere además a vacunas con virus vivos atenuada, basadas en tales mutantes para prevenir infecciones bacterianas, y más particularmente salmonelosis, en una especie veterinaria, más en particular aves de corral.

Description

VACUNA DE SALMONELA CON VIRUS VIVOS ATENUADA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a mutantes bacterianos atenuados, en particular a mutantes atenuados de Salmonella entérica y a una vacuna con virus vivos atenuada que comprende los mismos.

ESTADO DE LA TECNICA Las salmonelas son bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, móviles, que fermentan azúcares distintos de la lactosa, que pertenecen a la familia de las Enterobacteriaceae. Las salmonelas habitualmente se transmiten a los seres humanos por el consumo de alimentos contaminados y producen salmonelosis. Las salmonelas se han aislado de muchas especies animales incluyendo las vacas, los pollos, los pavos, las ovejas, los cerdos, los perros, los gatos, los caballos, los monos, las focas, los lagartos y las serpientes. El 95% de patógenos importantes de Salmonella pertenecen a Salmonella entérica, con S. entérica serovariedad Typhimurium (S. Typhimurium) y S. entérica serovariedad Enteritidis (S. Enteritidis) como serovariedades más frecuentes. Las infecciones por Salmonella son un problema médico y veterinario grave en todo el mundo y causan preocupación en la industria alimentaria. Los alimentos contaminados no se pueden identificar fácilmente. El control de la salmonelosis es importante, para evitar las infecciones humanas potencialmente letales y considerables pérdidas económicas para la industria conservera de animales. La presencia omnipresente de la Salmonella en la naturaleza complica el control de la enfermedad precisamente por la detección y erradicación de animales infectados. Se han probado varias estrategias de control basadas en los principios de exclusión competitiva y vacunación para controlar la infección de por ejemplo, las aves de corral. La vacunación de animales de granja se considera con frecuencia la vía más eficaz para prevenir las zoonosis producidas por la Salmonella. Las vacunas inactivadas de células completas y las vacunas de subunidades se utilizan en la prevención de las infecciones por Salmonella en los animales y en los seres humanos con resultados variables. Las vacunas inactivadas en general proporcionan poca protección frente a la salmonelosis. Las vacunas de Salmonella atenuadas con virus vivos son potencialmente superiores a las preparaciones inactivadas debido a: (i) su capacidad para producir inmunidad mediada por las células además de respuestas al anticuerpo; (ii) la administración oral sin riesgo de contaminación por la aguja; (iii) eficacia después de la administración de una sola dosis; (iv) producción de respuestas inmunitarias en múltiples puntos de la mucosa; (v) bajo coste de producción; y (vi) su posible utilización como vehículos para la administración de antígenos recombinantes al sistema inmunitario. Pocas vacunas de Salmonella con virus vivos atenuadas están realmente en el mercado porque los resultados con las cepas mutantes atenuadas no han sido siempre buenos. Por ejemplo, se han vacunado aves de corral con aro- o mutantes de AMPc, incluso muchos pollos muertos poco tiempo después de la vacunación. Como la infección por Salmonella con frecuencia se produce muy al principio, es crucial la vacunación de pollos muy jóvenes. Sin embargo, a esta edad éstos son muy sensibles a la Salmonella, debido posiblemente a la inmadurez de su sistema inmunitario. Además de la poca protección de los pollos vacunados, se observó a menudo una excreción prolongada de las cepas de la vacuna. La vacunación de aves con la cepa Megan®Vac1 , que lleva consigo eliminaciones en los genes cya y crp (patentes US No. 5,389,368; No. 5,855,879; No. 5,855,880) da como resultado una reducción del número de aves a partir del cual una cepa virulenta de la prueba de provocación con Salmonella puede aislarse 7 días después de la prueba de provocación. Sin embargo, esto no proporciona una protección completa (http://www.meganhealth.com/meganvac.html). Existe por lo tanto la necesidad todavía de mejorar las cepas atenuadas de la vacuna de Salmonella con virus vivos, y de mejorar las cepas atenuadas de la vacuna con virus vivos de las bacterias que infectan especies veterinarias en general. La información en la bibliografía sobre la influencia de mutaciones guaB sobre la virulencia de Salmonella y otras bacterias es escasa. McFarland y Stocker ( 1987, Microbial pathogenesis 3:129-141) describieron sobre la virulencia reducida de los mutantes por inserción de guaA y guaB Tn10 de S. Typhimurim y S. dublin en ratones BALB/c. A alta dosis (2.5x 107 cfu para S. Typhimurium y 104 cfu para S. dublin), sin embargo, estos autores describieron una gran letalidad, procedente de la multiplicación de la cepa auxótrofa. Wang et al. (2001, Infection and Immunity 69:4734-4741) describieron una pruebas preclínicas con una vacuna contra la fiebre tifoidea en seres humanos. La vacuna de Wang et al. comprendía un mutante guaBA de Salmonella typhi. Esta cepa atenuada, sin embargo, presentaba una virulencia residual significativa en ratones. La solicitud de patente internacional WO 99/58146 y la patente US No. 6,190,669 dan a conocer cepas de la vacuna de Salmonella typhi que albergan una mutación AguaBA, que se utilizan como vector con microbios vivos para administrar xenoantígenos.

OBJETIVOS DE LA INVENCION Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar cepas de Salmonella entérica atenuadas. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una vacuna con virus vivos atenuada contra la salmonelosis y procedimientos de prevención basados en la misma. Incluso otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar cepas con virus vivos atenuadas que son útiles como vector con microbios vivos y como vacunas mediadas por ADN que expresan xenoantígenos. Dichas cepas son muy adecuadas para el desarrollo de vacunas incluyendo las vacunas polivalentes. Aún otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para conseguir un mutante por eliminación de S. entérica para su utilización en una vacuna atenuada con virus vivos. Además otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar los mismos materiales y procedimientos para la preparación de cepas atenuadas de bacterias que infectan especies veterinarias, aves de corral más en particular. El objetivo general consiste en mejorar la seguridad de los alimentos y la salud de los animales.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un primer aspecto de la invención se refiere a una cepa muíante atenuada de Salmonella entérica que no puede formar nucleótidos de guanina de nuevo, y en la que dicho mutante contiene una mutación por eliminación en el gen guaB. El principio tal como se demuestra en la presente memoria para S. entérica puede aplicarse a cualquier organismo que pueda utilizar el nucleótido de guanina como intermediario. Un aspecto de la invención se refiere por consiguiente a una cepa mutante atenuada de una bacteria que infecta especies veterinarias que contiene una mutación por eliminación en el gen guaB. La expresión "especie veterinaria que infecta una bacteria" en el contexto de la invención se refiere en particular a bacterias que son patógenas para especies veterinarias, y que pueden atenuarse por una mutación por eliminación en el gen guaB. La especie veterinaria que infecta bacterias puede ser una bacteria Gram-negativa. Para las aves de corral resultan preferidas las bacterias Gram-negativas tales como Salmonella, Pasteurella, Escherichia coli, etc. Son más preferidas Salmonella entérica y E. coli (patógena). "Patógena para" significa que la bacteria, si no está atenuada, puede producir una enfermedad infecciosa en la especie veterinaria. Los mutantes de la invención no pueden expresar un producto génico GuaB funcional. En otras palabras la función del gen guaB está alterada, por lo cual se obtiene una cepa auxótrofa atenuada.

La cepa mutante de la invención, que lleva una mutación por eliminación en el gen guaB, no puede crecer en un medio mínimo A, a menos que este medio esté enriquecido con guanina, xantina, guanosina o xantosina 0.3 mM. La presente invención en particular tiene por objeto proporcionar cepas atenuadas de S. Enteritidis y S. Typhimurium. Preferentemente la mutación por eliminación en el gen guaB se introduce en la cepa 76Sa88 del fago tipo 4 S. Enteritidis de la cepa progenitora o en la cepa precursora 1491 S96 de S. Typhimurium. Una de las cepas atenuadas de S. entérica obtenida según la invención es una cepa SM69 de S. Enteritidis con el número de registro LMG P-21641 . Otro ejemplo es la cepa SM86 de S. Typhimurium con el número de registro LMG P-21646. Las cepas mutantes atenuadas de la invención son muy adecuadas para su utilización en una vacuna atenuada con microbios vivos incluyendo una vacuna polivalente o multivalente. La cepa mutante atenuada de la invención puede codificar y expresar un xenoantígeno y puede como tal utilizarse como vector con microbios vivos y/o como vacuna mediada por el ADN. En un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica o a una vacuna para inmunizar una especie veterinaria contra una infección bacteriana (por ejemplo salmonelosis causada por Salmonellae) que comprende: - una cantidad farmacéuticamente eficaz o inmunizadora de una cepa mutante según la invención, que no puede formar de nuevo nucleótidos de guanina debido a una mutación por eliminación en el gen guaB; y - un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones preferidas son las que comprenden una cepa mutante de Salmonella entérica según la invención. La cepa atenuada de la invención puede transferir ADN que codifica a un xenoantígeno en una célula eucariótica. Este xenoantígeno puede ser codificado por un plásmido compuesto por la cepa mutante atenuada de la invención y expresado en el mismo. En general se administran aproximadamente de 102 cfu a aproximadamente 1010 cfu, preferentemente aproximadamente 105 cfu a aproximadamente 1010 cfu (ejemplos de una cantidad farmacéuticamente eficaz o inmunizadora). Una dosis inmunizadora oscila según la vía de administración. Los expertos en la materia pueden encontrar que la dosis eficaz para una vacuna administrada por vía parenteral puede ser inferior a la de una vacuna similar que se administre mediante agua potable y similares. Las cepas atenuadas de la invención, y las composiciones farmacéuticas o las vacunas que comprenden las mismas, son muy adecuadas para inmunizar un animal o una especie veterinaria contra una infección bacteriana (por ejemplo salmonelosis) posiblemente otras enfermedades (en el caso de una vacuna multivalente).

Otro aspecto de la invención por consiguiente se refiere a un procedimiento de inmunización de animales, preferentemente de especies veterinarias, más preferentemente aves de corral tales como pollos contra una infección por una bacteria (por ejemplo salmonelosis causada por Salmonellae), comprendiendo dicho procedimiento la etapa siguiente: administrar al animal o especie veterinaria necesitado de la misma una cantidad inmunizadora de una cepa mutante atenuada de la invención y/o de una vacuna que comprende la misma, con lo cual se provoca a continuación una respuesta inmunitaria protectora en el animal o especie veterinaria. Ejemplos de especies veterinarias que van a ser inmunizadas contra la salmonelosis: aves de corral, ganado pequeño o pesado tales como pollos, pavos, patos, codornices, gallinas de Guinea, cerdos, ovejas, terneras, vacas, etc. En general, se administra una dosis apropiada a estos animales, preferentemente por vía oral, nasal o parenteral. Un último aspecto de la invención se refiere a una cepa mutante de la invención para su utilización como medicamento (por ejemplo para su utilización en una vacuna). Otro aspecto todavía de la invención se refiere a la utilización de una cepa mutante atenuada de la invención para la preparación de un medicamento, tal como una vacuna, para la prevención (y/o tratamiento) de una enfermedad producida por un patógeno (la bacteria infecciosa) tal como la salmonelosis. Los ejemplos de animales o especies veterinarias que van a ser tratados y dosis recomendadas se proporcionan anteriormente.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se descubrió sorprendentemente que una mutación por eliminación en el gen guaB puede conducir a cepas atenuadas de Salmonella entérica con virulencia significativamente reducida y que pueden provocar una respuesta inmunitaria en el ganado animal. Dicha eliminación atenuaría cualquier organismo que pueda utilizar el nucleótido guanina como intermediario. El término "gen" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la secuencia de codificación y a sus secuencias reguladoras tales como las señales de activación y terminación. El mutante por eliminación según la invención es en el que está inactivada la enzima IMP deshidrogenasa de la ruta metabólica de la purina (codificada por guaB). Dicha inactivación puede obtenerse mediante una eliminación mediante la cual la función del gen guaB se altera, lo que conduce a una función inválida (no se forma ningún producto génico funcional) del gen o genes afectado(s). Un experto en la materia conoce cómo obtener dichos mutantes y una prueba sencilla puede decir si la función del gen guaB está alterada. La cepa mutante que no puede expresar un producto del gen guaB funcional no puede desarrollarse en un medio Mínimo A, a menos que este medio esté enriquecido con guanina, xantina, guanosina o xantosina (por ejemplo 0.3 mM). El objetivo de la invención consiste en proporcionar, entre otras, cepas atenuadas de S. Enteritidis y S. Typhimurium ya que éstas son las serovariedades más comunes de S. entérica. La presente invención proporciona cepas atenuadas. La invención proporciona entre otras cepas atenuadas de Salmonella entérica para su utilización, entre otras, como vacunas activas atenuadas contra la salmonelosis, como vector con microbios vivos y/o como vacunas mediadas por ADN que expresan xenoantígenos. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "xenoantígeno" significa un xenoantígeno para la Salmonella. Las vacunas de vector con microbios vivos, denominadas también "vacunas vehículo" y "sistemas de administración de antígenos de virus vivos", comprenden un área excitante y versátil de la vacunología (Levine et al., 1990, Microecol. Ther. 19:23-32). En este procedimiento, se modifica una vacuna vírica o bacteriana con microbios vivos de modo que expresa xenoantígenos protectores de otros microorganismos y administra los antígenos al sistema inmunitario, estimulando de este modo una respuesta inmunítaha protectora. Los vectores bacterianos vivos que se están publicando incluyen, entre otros, la Salmonella atenuada. Un objetivo de la invención consiste en proporcionar cepas atenuadas, similares a las cepas atenuadas de S. entérica para su utilización en una vacuna con virus vivos posiblemente una vacuna con virus vivos polivalente o multivaleníe. Uno de los objetivos de la invención consiste por consiguiente en proporcionar una vacuna contra la por ejemplo la salmonelosis que comprende: - una cantidad farmacéuticamente eficaz o un inmunizadora de un mutante de la invención (por ejemplo un mutante de Salmonella entérica) que no puede formar de nuevo nucleótidos de guanina, en la que dicho mutante contiene una mutación por eliminación en el gen guaB; y - un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar una vacuna con virus vivos de vector que comprende: - una cantidad farmacéuticamente eficaz o un inmunizadora de un mutante de la invención (por ejemplo un mutante de Salmonella entérica), que no puede formar de nuevo nucleótidos de guanina, en la que dicho mutante contiene una mutación en el gen guaB, y en la que dicho mutante codifica y expresa un xenoantígeno; y - un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El xenoantígeno específico empleado en el vector con virus vivos (S. entérica) no es crítico para la presente invención. Aún otro objetivo de la invención consiste en proporcionar una vacuna mediada por ADN que comprende: - una cantidad farmacéuticamente eficaz o una cantidad inmunizadora de un mutante de la invención (por ejemplo un mutante de Salmonella entérica), que no puede formar de nuevo nucleótidos de guanina, en la que dicho muíante contiene una mutación en el gen guaB, en la que dicho mutante contiene un plásmido que codifica y se expresa en una célula eucariótica, un xenoantígeno; y - un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los detalles en cuanto a la construcción y utilización de vacunas mediadas por ADN pueden encontrarse en la patente US No. 5,877,159, que está incorporada como referencia en la presente memoria en su totalidad. De nuevo, el xenoantígeno específico empleado en la vacuna mediada por ADN no es crítico para la presente invención. La decisión de si expresar el xenoantígeno por ejemplo, en S. entérica (utilizando un activador procariótico en una vacuna de vector con virus vivos) o en las células invadidas por ejemplo por S. entérica (utilizando un activador eucariótico en una vacuna mediada por ADN) puede basarse en qué construcción de vacuna para este antígeno específico proporciona la mejor respuesta ínmunitaria en los estudios con animales o en las pruebas clínicas, y/o, si la glucosilación de un antígeno es esencial para su inmunogenicidad protectora, y/o, si la configuración terciaria correcta de un antígeno se consigue mejor con una forma de expresión que con la otra (patente US No. 5,783,196). En las vacunas de la presente invención, la cantidad farmacéuticamente eficaz o la cantidad inmunizadora de los mutantes de la presente invención que debe administrarse variará dependiendo de la edad, el peso y el sexo del paciente. "Cantidad inmunizadora" tal como se utiliza en la presente memoria significa de hecho una cantidad que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en el animal que recibe la composición/vacuna farmacéutica. La respuesta inmunitaria provocada puede ser una respuesta humoral, de las mucosas, local y/o celular. El vehículo o díluyente específico farmacéuticamente aceptable empleado no es crítico para la presente invención y son convencionales en la técnica. Ejemplos de diluyentes incluyen: tampón para tamponar los ácidos gástricos en el estómago, tal como tampón de citrato (pH 7.0) que contiene sacarosa, tampón de bicarbonato (pH 7.0) solo o tampón bicarbonato (pH 7.0) que contiene ácido ascórbico, lactosa y opcionalmente aspartamo. Ejemplos de vehículos incluyen: proteínas, por ejemplo, como las que se encuentran en la leche desnatada; azúcares; por ejemplo sacarosa; o polividona. Los mutantes por eliminación según la invención han sido creados mediante técnicas de recombinación homologas convencionales, por lo que parte del gen guaB, por ejemplo parte de la secuencia de codificación de guaB, en la primera etapa está sustituida por un gen con resistencia y secuencias de FRT adyacentes. Preferentemente, en una segunda etapa, dicho gen con resistencia se separa por recombinacion entre las dos secuencias de FRT. Una secuencia de FRT y las secuencias P1 y P2 de cebado permanecen por el mecanismo molecular de la recombinación que elimina el gen con resistencia a antibióticos según Datsenko y Wanner (2000) (véase por ejemplo la Figura 4). Un ejemplo específico de la invención se refiere por ejemplo a mutantes por eliminación de guaB de S. Enteritidis que comprenden un gen guaB mutado o la secuencia de codificación que comprende SEC. ID. No.: 12.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática de la serie de reacciones de la biosíntesis del monofosfato de guanosina (adaptada de Zalkin y Nygaard, 1996, en "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, Second edition", 1996 F.C. Neidhardt ed. ASM Press, Washington D.C., vol. 1 , ch. 34:561 -579). AICAR: 5'-fosforribosil-4-carboxamida-5-aminoimidazol; ATP: trifosfato de adenosina; G: guanina; GMP: monofosfato de guanosina; GR: guanosina; Hx: hipoxantina; HxR: ribósido de hipoxantina (inosina); IMP: monofosfato de inosina; X: xantina, XMP: monofosfato de xantosina; guaA: GMP sintetasa, guaB: IMP deshidrogenasa; guaC: GMP reductasa. La Figura 2 representa el contigo 1294 del genoma de S. Enteritidis (SEC. ID. No.: 10). El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA del gen guaB están en negrita. La Figura 3 representa la secuencia del fragmento Aguafí de S. Enteritidis clonado en pUC18 (SEC. ID. No.: 1 1 ). Los cebadores que se utilizaron son los indicados por flechas horizontales. El fragmento generado con los cebadores GuaB6-GuaB7 se clonó en pUC18. El codón de iniciación ATG y de terminación TGA del gen guaB de la enzima de restricción Smal CCCGGG se indican en negrita. La Figura 4 representa la secuencia nucleotídica del fragmento por PCR de S. Enteritidis, que incluye la eliminación de guaB, obtenida tras el secuenciado, utilizando el cebador GuaBI O (SEC. ID. No.: 12). El fragmento por PCR se amplió con los cebadores GuaB6-GuaB7, utilizando el ADN genómico completo del muíante SM20. La secuencia FRT restante está indicada en letra negrita en cursiva y los cebadores P1 y P2 por flechas (Datsenko y Wanner, 2000, PNAS 97:6640-6645). Los codones de iniciación ATG y de terminación TGA del gen guaB están indicadas en negrita. La Figura 5 representa el gen guaB de S. Typhimurium LT2, apartado 1 17 de 220 del genoma completo (SEC. ID. No.: 13). El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA del gen guaB están en negrita. La invención se describirá con mayor detalle en los ejemplos y las modalidades siguientes haciendo referencia a los dibujos adjuntos. Las modalidades y ejemplos específicos no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de la invención reivindicada.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 La mutación auxótrofa afecta al gen guaB Un muíante auxótrofo de la inserción de una S. Enteritidis natural se obtuvo por mutagénesis de la inserción. Solamente cuando se enriquece con guanina, xantina, guanosina o xantosina 0.3 mM pudo desarrollarse la cepa mutante en medio Mínimo A. Estos datos sugieren fuertemente que la mutación auxótrofa de la cepa afecta al gen guaB, que codifica la enzima IMP deshidrogenasa (EC 1 .1 .1 .205). Esta enzima transforma la inosina-5'-monofosfato (IMP) en monofosfato de xantosina (XMP) como se indica en la Figura 1 . Un mutante de la inserción puede revertir, restaurando de este modo la patogenicidad de la cepa. Esto limita su aplicación en una cepa con microbios vivos atenuada. En este aspecto se prefieren mutantes por eliminación. Se crearon por consiguiente y se probaron los mutantes por eliminación de guaB de S. Enteritidis y S. Typhimurium. Los genes guaB de ambas serovariantes se proporcionan en las Figuras 2 y 5.

EJEMPLO 2 Mutantes por eliminación de guaB Construcción de los mutantes por eliminación de guaB Se crearon mutantes por eliminación de guaB según el procedimiento para generar mutaciones por eliminación en el genoma K 2 de Escherichia coli {Datsenko y Wanner, 2000, PNAS 97:6640-6645, incorporada como referencia en la presente memoria). Este procedimiento se basa en la recombinación homologa, mediada por el sistema bacteriófago ? Red recombinasa, de un fragmento lineal de ADN generado por PCR. La secuencia guaB se sustituye de este modo por un gen con resistencia a antibióticos. Este gen con resistencia es adyacente a las secuencias de FRT (secuencias diana de reconocimiento de FLP) y puede escindirse del genoma por recombinación especifica para el sitio, mediada por la FLP recombinasa. Se aplicó PCR por solapamiento (Ho et al., 1989, Gene 77:51-59) para construir un fragmento lineal. El principio se basa en la utilización de dos series de cebador, un par corriente arriba (GuaB3-GuaB4; GuaB3: 5' GGCTGCGA TT GGCGAGGTAG TA 3 SEC. ID. No.: 2; GuaB4: 5' GGTGA TCCCG GGCGTCAAAC GTCAGGGCTT CTTTA 3', SEC. ID. No.: 3) y un par corriente abajo (GuaB5-GuaB2; GuaB5: 5' TTGACGCCCG GGATCACCAA AGAGTCCCCG AACTA 3', SEC. ID. No.: 4; GuaB2: 5' CGTTCAGGCG CAACAGGCCG TTGT 3 SEC. ID. No.: 1 ) del gen guaB. Ambas series contienen cebadores (GuaB4 y GuaB5) que son parcialmente complementarios y a los cuales se añade una secuencia de restricción Smal. Tras la hibridación de las secuencias complementarias resultantes y la elongación de la cadena, la PCR con los cebadores externos (GuaB6-GuaB7; GuaB6: 5' GCAACAACTC CTGCTGGTTA 3 SEC. ID. No.: 5; GuaB7: 5' AGACCGAGGA TCACTTTA TC 3 SEC. ID. No.: 6) generó un fragmento con una secuencia Smal de 6 pares de bases que sustituye a un segmento interno de 861 pares de bases de la secuencia de codificación guaB. Este fragmento guaB se clonó en el vector pUC18 (véase la Figura 3). El gen con resistencia al cloranfenicol (cat) con sus secuencias FRT adyacentes se amplió utilizando los cebadores P1 (5' GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC 3', SEC. ID. No.: 8) y P2 (5' CA TA TGAA TA TCCTCCTTAG 3', SEC. ID. No.: 9) {Datsenko y Wanner, 2000) y el ADN plásmido pKD3 {Datsenko y Wanner, 2000) como plantilla. Este fragmento de PCR se ligó en la secuencia Smal del fragmento guaB clonado. El fragmento deseado se generó utilizando cebadores anidados (GuaB6-GuaB7). El fragmento por PCR resultante se electroporó en la cepa 76Sa88 tipo 4 del fago S. Enteritidis (una cepa clínica procedente de un pavo, obtenido en el Veterinary and Agrochemical Research Centre, Groeselenberg 99, B-1 180 Ukkel, Bélgica) que alberga el plásmido pKD46 de replicación sensible a la temperatura, que codifica al sistema de bacteriófago Lambda Red recombinasa. Se probaron transformantes resistentes al cloranfenicol en medio Mínimo A y en medio Mínimo A enriquecido con guanina 0.3 mM. Los mutantes AguaB::catFRT se confirmaron por PCR utilizando las siguientes combinaciones de cebador: GuaB6-GuaB7, GuaB6-P2, GuaB7-P1 y P1 -P2. El mutante ñguaBr.catFRT de S. Enteritidis (SM12) se transformó con el plásmido pCP20 de replicacion sensible a la temperatura por electroporación. El plásmido pCP20 codifica la FLP recombinasa, que reconoce las secuencias FRT, para eliminar el gen cat. La cepa resultante se denominó SM20. El fragmento por PCR en el que está situada la eliminación se obtuvo utilizando ADN genómico completo del mutante SM20 y la combinación de cebador GuaB6-GuaB7 (véase la Figura 4). La mutación AguaB se confirmó por secuenciado de este fragmento, utilizando el cebador GuaBI O (5' AGGAAGTTTG AGAGGA TAA 3', SEC. ID. No.: 7). En el Cuadro 1 se proporcionan las secuencias de todos los cebadores mencionados anteriormente. Para evitar la presencia de posibles mutaciones adicionales, producidas por la expresión del sistema de la Red recombinasa, se construyó una cepa isógena. La mutación AguaBr.catFRT de la SM12 mutante fue transducida por el bacteriófago P22 HT int' {Davis, R. W., Botstein D. y Roth, J.R. (1980) en Advanced Bacterial Genetics, A manual for genetic engineering. Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, N. Y.) para 76Sa88 de S. Enteritidis natural. Se eliminó el gen cat utilizando el plásmido pCP20. La cepa resultante se denominó SM69 (número de depósito LMG P-2 641 ). Se construyó un mutante AguaB de la cepa 149 S96 de S. Typhimurium utilizando el mismo procedimiento y los mismos cebadores. Las cepas resultantes AguaB.xatFRT de S. Typhimurium y AguaB de S. Typhimurium se denominaron SM9 y SM 9 respectivamente. SM86 (con el número de depósito LMG P-21646) es la cepa isógena obtenida de la misma, después de la transducción por el lisado del bacteriófago P22 HT int' de la cepa SM9 y la escisión del gen cat utilizando el plásmido pCP20. Los mutantes SM19, SM20, SM86 y SM69 de AguaB son sensibles al bacteriófago P22. Esto prueba la presencia de lipopolisacáridos (LPS) intactos.

Pruebas de virulencia y protección con el mutante SM20 por eliminación de quaB en ratones Se probó la virulencia del mutante SM20 en ratones por infección oral de ratones BALB/c hembra de 6 a 8 semanas de vida en dos experimentos independientes. Éstos se realizaron como se describió anteriormente. La cepa natural 76Sa88 de S. Enteritidis se probó en paralelo como referencia positiva. El mutante SM50 de 76Sa88 AaroA de S. Enteritidis se incluyó en el experimento como referencia de la vacuna. Este mutante lleva una eliminación precisa de la secuencia de codificación aroA completa y se construyó por el procedimiento de Datsenko y Wanner (2000). Los datos completos se dan proporcionan en los Cuadros 2 y 3. Estos resultados demuestran que el mutante SM20 de AguaB está muy atenuado en los ratones pero presenta todavía alguna patogenicidad residual cuando se administra a esta dosis elevada. La inmunización oral con el mutante produce inmunidad protectora contra la infección por una dosis alta de la correspondiente cepa 76Sa88 de S. Enteritidis natural patógena. La protección es por lo menos igual a la protección proporcionada por el mutante SM50 de AaroA de S. Enteritidis.

Pruebas de virulencia y protección con los mutantes SM69 y SM86 por eliminación de guaB isógeno en ratones La virulencia de los mutantes SM69 y SM86 en ratones se probó por infección oral de ratones BALB/c hembra de 6 a 8 semanas de vida. Esto se realizó como se describe a continuación. Las cepas 76Sa88 de S. Enteritidis natural y la 1491 S96 de S. Typhimurium se probaron en paralelo como referencias positivas. Los datos completos se proporcionan en los Cuadros 4 a 7.

Estos resultados demuestran que los mutantes SM69 y SM86 de AguaB están muy atenuados en ratones pero todavía presentan alguna patogenicidad residual cuando se administran a esta dosis elevada. La inmunización oral con los mutantes produce inmunidad protectora contra infección por una dosis elevada de la correspondiente cepa natural patógena.

Evaluación de seguridad del mutante SM69 por eliminación de AguaB de S. Enteritidis en pollos de un día de vida por las vías intratraqueal y alimentación forzada por vía oral El objetivo de este estudio fue evaluar la seguridad de la cepa patrón SM69 mutante de AguaB de S. Enteritidis sembrada en pollos de un d ía de vida. Se utilizó la mortalidad como parámetro principal para la determinación de la seguridad. Los pollos con un día de vida se agruparon por las patas y se colocaron al azar en cada uno de los cuatro grupos de tratamiento (Grupo 1 : SM69-IT, grupo 2: SM69-OG, grupo 3: PBS-IT y Grupo 4: PBS-OG). Después de la inoculación por siembra del patrón, las aves de los grupos 1 y 2 se colocaron en un separador y las de los grupos 3 y 4 en otro separador. A los pollos de los grupos 1 y 2 se les inoculó con el patrón SM69 sembrado por vía intratraqueal (IT) o por vía de alimentación forzada por vía oral (OG), respectivamente, con un valor existente de 1 .28 * 108 cfu/0.2 mi por ave. A los pollos en los grupos 3 y 4 se les administró 0.2 mi de PBS (solución salina tamponada con fosfato) por ave por vía intratraqueal o alimentación forzada por vía oral, respectivamente. Después de la inoculación de SM69 o de PBS, se observó la mortalidad de los pollos diariamente hasta 38 días después de la inoculación.

El Cuadro 8 resume los resultados de la mortalidad para los 4 grupos. En el grupo 1 , un ave murió durante la inoculación debido a traumatismo por inoculación. Dos aves murieron 2 días después de la inoculación (DPI). Tres aves murieron desde el día 3 al día 13 (a 3, 5 y 13 DPI respectivamente). Un total de 6 aves por lo tanto murieron en el grupo 1. En el grupo 2, murieron dos aves en total. Una murió durante la inoculación debido al traumatismo por inoculación y otra murió al 5o día después de la inoculación. No murió ningún ave en los grupos tratados con PBS ya sea por vía intratraqueal o por alimentación forzada por vía oral. Este estudio indica que la cepa SM69 mutante de ÁguaB de S.

Enteritidis no es segura cuando se administra a razón de 1 .28 * 108 cfu por ave con un día de vida por vía intratraqueal o por alimentación forzada por vía oral.

Evaluación de la seguridad del mutante SM69 por eliminación de AguaB de S. Enteritidis en pollos de 2 semanas de vida por las vías intratraqueal y de alimentación forzada por vía oral Se evaluó a continuación la seguridad de la cepa SM69 mutante de AguaB de S. Enteritidis en pollos sin patógeno específico (SPF) de 2 semanas de vida por las vías intratraqueal y de alimentación forzada por vía oral. Se utilizó la mortalidad como criterio principal y el peso corporal como criterio secundario para la determinación de la seguridad. Las aves a las 2 semanas de vida se agruparon por las patas y se colocaron al azar en cada uno de los cuatro grupos de tratamiento: SM69-IT, SM69-OG, Poulvac ST-IT y PBS-IT. Diez aves del grupo 1 se inocularon con SM69 por vía intratraqueal; diez aves del grupo 2 se inocularon con SM69 por alimentación forzada por vía oral; diez aves del grupo 3 se inocularon con una vacuna con AroA de S. Typhimurium (Poulvac® ST) por vía intratraqueal; y cinco aves del grupo 4 se inocularon con PBS por vía intratraqueal. Los pollos en los grupos 1 y 2 se inocularon con el patrón SM69 sembrado por vía intratraqueal o alimentación forzada por vía oral, respectivamente, con el valor real de 2.304 ? 108 cfu/0.2 mi por ave. A los pollos del grupo 3 se les administró 2.19 ? 108 cfu/0.2 mi por ave de Poulvac® ST por vía intratraqueal. A los pollos del grupo 4 se les administró 0.2 mi de PBS por ave por vía intratraqueal. Tras la inoculación, las aves de los grupos 1 y 2 del tratamiento se colocaron en un separador y las de los grupos 3 y 4 en otro separador. Tras las inoculaciones, se observó la mortalidad cada día hasta 21 días después de la inoculación. Se registró también el peso corporal de todas las aves al final del periodo de estudio (21 días). Se utilizaron Poulvac® ST y PBS como referencias del procedimiento intratraqueal. Durante el período de observación de 21 días, un ave del grupo de tratamiento intratraqueal SM69 (grupo 1 ) murió por un saco vitelino infectado. No se asoció ninguna mortalidad con la inoculación de SM69, lo que indica que la cepa SM69 es segura en el valor probado, 2.304 ? 108 cfu por ave por las vías intratraqueal y de alimentación forzada por vía oral. Como cabía esperar, no se observó ninguna muerte ya sea en las aves tratadas con Poulvac® ST al valor de 2.19 * 108 cfu por ave o en las aves tratadas con PBS, lo que indica que el estudio era válido (Cuadro 9). Se comparó el peso corporal entre los grupos en un análisis de modelo de varianza (ANOVA) con el peso corporal como variable dependiente y el tratamiento se incluyó como una variable independiente. Se hicieron comparaciones de los grupos utilizando la prueba de Tukey para comparaciones múltiples. El nivel de significación se fijó a una p <0.05. El estudio se consideró válido porque los pollos de referencia (grupo de referencia con PBS) permanecieron sanos y libres de signos clínicos o de enfermedades o mortalidad en todo el estudio. No hubo diferencias significativas en el peso corporal final en los pollos a los que se les administró SM69 por inoculación intratraqueal o de alimentación forzada por vía oral, Poulvac® ST o PBS (Cuadro 5). Aun cuando no se creó ninguna referencia de las aves en cada grupo a un día de vida, era improbable que hubiera una diferencia significativa en el peso corporal inicial entre los cuatro grupos ya que las aves se colocaron al azar en cada uno de los 4 grupos de tratamiento. Ya que ninguna mortalidad era atribuible a la inoculación de SM69, puede sacarse en conclusión que la cepa mutante SM69 de AguaB de S. Enteritidis es segura cuando se administra a un valor probado de 2.304 ? 08 cfu/0.2 mi de dosis para aves de 2 semanas de vida, ya sea por vía de inoculación intratraqueal o por alimentación forzada por vía oral. Las inoculaciones de SM69 no tuvieron efecto sobre el peso corporal final de las aves, siendo el peso del ave el segundo parámetro de seguridad evaluado en la presente memoria. Se ha realizado un depósito según el Tratado de Budapest en la BCCM/LMG Culture Collection, Laboratorium voor Microbiologie, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante (Bélgica) para los microorganismos siguientes: SM69 de Salmonella Enteritidis con el número de depósito LMG P-21641 (fecha de depósito: 9 de agosto de 2002) y SM86 de S. Typhimurium con el número de depósito LMG P-21646 (fecha de depósito: 28 de agosto de 2002). Los depósitos se han realizado en nombre del Prof. J.-P. Hernalsteens, dirección anterior: Vrije Universiteit Brussel, Laboratorium Genetische Virologie, Paardenstraat 65, B-1640 Sint-Genesius-Rhode, dirección actual: Vrije Universiteit Brussel, Onderzoeksgroep Genetische Virologie, Pleinlaan 2, B-1050 Bruselas, Bélgica.

CUADRO 1 Secuencias de los cebadores SEC. ID. No.: Cebador Secuencia 1 GuaB2 5' CGTTCAGGCGCAACAGGCCGTTGT 3' 2 GuaB3 5' GGCTGCGATTGGCGAGGTAGTA 3' 3 GuaB4 5' GGI A!CCCGGGCGICAAACGTCAGGGCTTCn IA 3' 4 GuaB5 5' TTGACGCCCGGGATCACCAAAGAGTCCCCGAACTA 3' 5 GuaB6 5' GCAACAACTCCTGCTGGTTA 3' 6 GuaB7 5' AGACCGAGGATCACTTTATC 3' 7 GuaBIO 5' AGGAAGTTTGAGAGGATAA 3' 8 P1 5' GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 3' 9 P2 5' CATATGAATATCCTCCTTAG 3' CUADRO 2 Prueba de virulencia en ratones BALB/c del mutante SM20 por eliminación de guaB de S. Enteritidis Infección Supervivencia Día de Estado de los ratones Cepa Dosis muerte Primer experimento referencia negativa: leche 11/11 Sin síntomas de enfermedad referencia positiva: 76Sa88 de S. Enteritidis 2.1x10a 0/5 7, 7, 8, 8, 9 referencia de la vacuna: aroA S 50 de S. 2.5x10B 10/10 / Sin síntomas de Enteritidis enfermedad AguaB SM20 de S. Enteritidis 5.1x10" 9/10 3 Síntomas de enfermedad entre el 7° y el 14° día tras la infección Segundo experimento referencia negativa: leche 4/4 / Sin síntomas de enfermedad referencia positiva: 76Sa88 de S. Enteritidis 1.4x10s 0/3 8, 9, 9 referencia de la vacuna: AaroA SM50 de S. 2.1x108 3/3 / Sin síntomas de Enteritidis enfermedad AguaB SM20 de S. Enteritidis 1.9x10a 3/3 / Sin síntomas de enfermedad CUADRO 3 Prueba de provocación de ratones vacunados con el mutante S 20 por eliminación de guaB de S. Enteritidis Vacunación Prueba de provocación Supervivencia Día de Estado de los ratones Cepa Dosis Cepa Dosis muerte Primer experimento referencia negativa: / referencia / 6/6 / Sin síntomas de enfermedad leche negativa: leche referencia negativa: / 76Sa88 de S. 1.5? 10? 0/5 7, 8, 8, Síntomas de enfermedad a leche Enteritidis 8, 9 partir del 5° día tras la prueba de provocación Referencia de la 2.5x 10a 76Sa88 de S. 1.5? 10? 3/5 9, 13 Síntomas de enfermedad vacuna: aroA SM50 Enteritidis entre el 7° y el 14° día tras la de S. Enteritidis prueba de provocación Agi/aS SM20 de S. 5.1 x 10a 76Sa88 de S. 1 .5x 10a 5/5 / Los ratones son menos Enteritidis Enteritidis activos entre el día 1 1 ° y el 14° tras la prueba de provocación CUADRO 3 Continuación Vacunación Prueba de provocación Supervivencia Día de Estado de los ratones Cepa Dosis Cepa Dosis muerte Segundo experimento referencia negativa: / referencia / 2/2 / Sin síntomas de enfermedad leche negativa: leche referencia negativa: / 76Sa88 de S. 1.5x10s 0/2 9, 18 leche Enteritidis Referencia de la 2.1*10* 76Sa88 de S. 1.5x10a 1/3 9, 21 Síntomas de enfermedad vacuna: AaroA SM50 Enteritidis entre el día 7° y el 21° tras la de S. Enteritidis prueba de provocación AguaS SM20 de S. 1.9* 10B 76Sa88 de S. 1.5?10? 2/3 10 Síntomas de enfermedad a Enteritidis Enteritidis partir del 9° día tras la infección CUADRO 4 Prueba de virulencia en ratones BALB/c con el mutante S 69 por eliminación de guaB de S. Enteritidis CUADRO 5 Prueba de provocación de los ratones vacunados con el mutante SMS69 por eliminación de guaB de S. Enteritidis Vacunación Prueba de provocación Supervivencia Día de Estado de los Cepa Dosis Cepa Dosis muerte ratones referencia Cepa 76Sa88 natural de S. 3.1 x 1 0a 0/4 8, 8, 8, Síntomas graves negativa: leche - Enteritidis 9 del 5o día en adelante AguaB SM69 7.6x 1 0a Cepa 76Sa88 natural de S. 3.1 x 1 0a 2/5 8, 8, 19 Síntomas graves de S. Enteritidis Enteritidis del 5o día en adelante CUADRO 6 Experimentos de virulencia con cepas mutantes isógenas de 1491S96 de S. Typhimurium en ratones BALB/c. Inoculación oral con de los mutantes de la cepa de S. Typhimurium * inoculada con aproximadamente 10 células (valor exacto no determinado) ** muertos tras una lucha CUADRO 7 Experimentos de protección con cepas mutantes isógenas de S. Typhimurium en ratones BALB/c. inoculación oral con aproximadamente 108 células de la cepa 1491S96 de S. Typhimurium * inoculada con aproximadamente 10 células (valor exacto no determinado) CUADRO 8 Evaluación de seguridad del mutante SM69 por eliminación de guaB de S. Enteritidis en pollos de un día de vida IT Intratraqueal OG Alimentación forzada por vía oral DPI Días tras la inoculación * En el grupo 1 , 1 ave murió durante la inoculación; 1 ave murió a los 3, 5 y 1 3 DPI; y 2 aves a los 2 DPI respectivamente ** En el grupo 2, 1 ave murió durante la inoculación; y 1 ave murió a los 5 días DPI.

CUADRO 9 Evaluación de seguridad del mutante SM69 por eliminación de guaB de S. Enteritidis en pollos de 2 semanas de vida IT Intratraqueal OG Alimentación forzada por vía oral DPI Días tras la inoculación * Muerte debida a infección del saco vitelino ** Vacuna AroA' con microbios vivos de S. Typhimurium contra S. Typhimurium

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Una cepa mutante atenuada de una bacteria que infecta una especie veterinaria, que no puede formar nucleótidos de guanina de nuevo, en la que dicho mutante contiene una mutación por eliminación en el gen guaB. 2 - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la especie veterinaria son las aves de corral. 3. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque es una cepa de Salmonella entérica o de Escherichia coli (patógena). 4. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque dicha cepa mutante codifica y expresa un xenoantígeno. 5. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque es una cepa de S. Enteritidis o de S. Typhimurium. 6.- La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque dicha mutación se introduce en la cepa 76Sa88 del fago tipo 4 de S. Enteritidis de la cepa progenitora. 7. - La cepa mutante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque es la cepa SM69 de S. Enteritidis con el número de depósito LMG P-21641 . 8. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque dicha mutación se Introduce en la cepa progenitora 1491 S96 de S. Typhimurium. 9. - La cepa mutante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque es la cepa SM86 de S. Typhimurium con el número de depósito LMG P-21646. 10.- Una vacuna para inmunizar una especie veterinaria contra una infección bacteriana que comprende: una cantidad farmacéuticamente eficaz o inmunizadora de una cepa mutante como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que no puede formar de nuevo nucleótidos de guanina debido a una mutación por eliminación en el gen guaB; y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 1 1 . - La vacuna de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha cepa mutante codifica y expresa un xenoantígeno. 12. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 10 u 1 1 , caracterizada además porque dicha cepa mutante comprende un plásmido que codifica y expresa, en una célula eucarlótica, un gen extraño. 13. - Un procedimiento de inmunización de una especie veterinaria contra una infección bacteriana, comprendiendo dicho procedimiento la etapa que consiste en: administrar a una especie veterinaria necesitada de la misma una cantidad inmunizadora de una cepa mutante como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o una vacuna como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12. 14.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la especie veterinaria son las aves de corral. 1 5.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado además porque la cepa mutante y/o la vacuna se administra por vía oral, nasal o parenteral. 16.- La cepa mutante atenuada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada además porque está destinada para su uso como medicamento. 17.- El uso de una cepa mutante atenuada como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de un medicamento o una vacuna para la prevención y/o el tratamiento de una infección por una bacteria en una especie veterinaria, preferentemente las aves de corral.