JP6671364B2 - ワクチンおよび診断開発のための組換えデングウイルスについての方法および組成物 - Google Patents
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Description
この出願は、2014年11月2日に出願された米国仮出願第62/074,053号の35U.S.C.§119(e)による恩典を主張し、その仮出願の全内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
この発明は、National Institutes of Healthにより授与された認可番号AI 057157、AI 097560、AI 107731、およびAI 109761による政府支援で行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
T49E、K51T、E52Q、V53L、L55T、T58K、Y59L、S122L、G123E、K124P、T126E、N128K、L129V、I132Y、M199L、K200T、T205A、L207M、K210R、L214F、A222S、V270I、D271Q、S272N、G273S、D274G、N276T、H277S、およびM278I
の全部を含み、または全部ではない任意の組み合わせで含み、前記アミノ酸配列が、以下のアミノ酸置換:A71D、T148Q、D225T、V229P、D307K、K321Q、およびV362Pのうちの1つまたは複数を任意の組み合わせでさらに含み得る。
T300S、S303T、S307K、D309V、M312I、T320I、V322I、K323R、K325Q、A329D、A331S、V335I、I337F、R340T、V342L、N343E、E345R、K346H、V348L、V351L、S353T、S354V、T355N、L357I、A358V、E359T、N360E、T361K、N362D、V364P、T365V、L369A、V379I、G383E、N384P、S385G、A386Q、T388K、H390NおよびR393K
の全部を含み、または全部ではない任意の組み合わせで含む。
デング3とデング4の間の複雑な四次血清型特異的中和抗体エピトープの移植が、ポリクローナル中和応答の決定基を明らかにする
デングウイルス(DENV)は、世界中で最も重大なヒトアルボウイルス疾患であり、毎年、3億人以上の感染者がいる。しかしながら、DENV感染に対するヒト免疫応答の決定基はほとんど不明のままである。したがって、本発明者らは、ヒトにおけるDENV感染に対する抗体(Ab)応答を特徴づけるためのツールを開発することに着手した。逆遺伝学を用いて、本発明者らは、Ab−ウイルス相互作用を研究することを可能にする全ての4つのDENV血清型についての感染性クローン(IC)を開発した。モノクローナルAb(mAb)のパネルの特徴づけにより、DENV3の強い型特異的中和Abが同定された。構造情報に基づくアプローチを用いて、中和のエスケープをもたらす突然変異を含むエンベロープ(E)タンパク質ドメインI/II(EDI/II)ヒンジ領域の12Å領域を同定し、ヒトにおけるこのエピトープのポリクローナル免疫応答への寄与を評価するために、DENV4からDENV3へ移植した(rDENV3/4)。興味深いことに、このrDENV3/4は、DENV3血清に対して抵抗性になると同時に、ヒトDENV4免疫血清による中和に対する完全な感受性を獲得し、このEDI/IIヒンジ領域が、型特異的中和応答の主要な決定基を含有することを示している。DENV4への相互移植を行った時、mAb結合は、保持されず、中和プロフィールの有意なシフトはなく、レシピエントDENV血清型における隣接残基が、ビリオン表面上のエピトープ提示において役割を果たすことを示している。DENV3からDENV4への5個のアミノ酸残基の追加は、mAb結合および中和を回復させることができたが、ポリクローナル血清中和はほとんど変化しないままであった。最後に、本発明者らは、複数のE二量体に及ぶ残基を含む複雑な四次エピトープをDENV4へ移動させた(rDENV4/3)。このDENV4/3は、生存可能であり、高い感染力価へと成長し、DENV3免疫血清に対する感受性を示し、同時に、DENV4に対する中和応答は、ほとんど変化しないままであった。これらの結果は、合理的に設計されたDENVワクチンプラットフォームの未来開発を導くことができる型特異的中和応答の決定基への洞察を与えている。
デング3およびデング4の両方の型特異的中和決定基を捕獲する組換えデング4ウイルスの開発および特徴づけ
組換えDENV4作製のための逆遺伝学プラットフォームの開発
本発明者らは、組換えDENV3(rDENV3)の産生のための逆遺伝学系の作製および特徴づけを前に記載している(図1、パネルA)。同様の技術を利用して、本発明者らは、1989年にスリランカで単離され、かつジェノグループ(genogroup)Iに属するDENV4の臨床分離株についてのcDNA感染性クローン(IC)系を開発している。大腸菌における細菌プラスミド増幅中の不安定性および毒性を回避するために、DENV4ゲノムを4個の異なる断片へサブクローニングした(図1、パネルA)。DENV4ゲノムにおけるヌクレオチド(NT)位置3216(PflMI;認識配列:CCAAACAGTGG、配列番号7)、位置5482(DraIII;CACCAGGTG)、および位置8855(PflMI;CCAGATTTTGG、配列番号8)での天然に存在するクラスII制限エンドヌクレアーゼ部位を利用して、ゲノムcDNAを分割した。さらに、その細菌ベクター内で、かつT7プロモーター配列の上流のEcoRV部位を用いて、ゲノムの5’末端を生じさせ、一方、ベクターにおけるBsmBI部位を3’ゲノム末端のために用いた(図1、パネルA)。ゲノムcDNA断片を含有するプラスミドの細菌増幅後、プラスミドを、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、T4 DNAリガーゼでライゲーションし、5’キャップ類似体を含有するT7 RNAポリメラーゼで転写した。その後、インビトロで転写されたRNAを、ベロ−81細胞またはBHK−21細胞のいずれかへ電気穿孔した。細胞を4〜6日間、培養し、その時点で上清を収集し、遠心分離により清澄化し、さらに4日間、C6/36(ヒトスジシマカ(Aedes albopictus))細胞上へ継代した。再び、上清を収集し、清澄化し、作業用ウイルスストックとして用いるために力価測定した。rDENV4は、親の天然分離株のと同一の表現型性質(成長速度、ピーク感染力価、および感染巣形態/サイズ)を示した。
前の研究は、DENV3に特異的な、強く型特異的なヒトモノクローナル抗体(hmAb)(5J7)を同定した。しかしながら、これらの研究は、このhmAbからのDENV3中和のエスケープをもたらす単一の点突然変異を同定しただけだった。このhmAbエピトープをさらに特徴づけるために、本発明者らは、本発明者らの新規の逆遺伝学プラットフォームを用いて、このエピトープを含むアミノ酸(AA)残基をDENV3からDENV4へ移植しようとした。公開されたエスケープ突然変異と未公開のエスケープ突然変異の両方をガイドとして用いて、エンベロープドメインI/II(EDI/II)ヒンジ領域を含む約12オングストローム周径を、DENV3 Eタンパク質結晶構造上に、抗体エピトープ:パラトープ結合領域のフットプリントに近づけるように重ねた。DENV3とDENV4の間のAAおよびNTアラインメント後、血清型間バリアントAAを同定し、DENV3からDENV4への移植用に選択した。DENV4 ICにおけるNT配列を、DENV3に適合するAA変化を促進するように改変し、これらの変化を捕獲するサブゲノムcDNAを合成した(BioBasic;Amherst、NY)。rDENVを上記のように作製し、回収されたウイルスを表現型特徴づけのために用いた。エピトープ移植の成功の可能性を最大限にするために、3個の異なるrDENVを作製し、それぞれが、連続的追加のDENV3残基を含有し、したがって、より大きい理論上のエピトープフットプリントを移植する。これらのrDENVは、DENV4 M12、DENV4 M14、およびDENV4 M16と名付けられており、増加性サイズのDENV3配列がそれぞれ、移植されている(図1、パネルB〜C)。注目すべきことには、DENV4 M16へのDENV3移植は、5J7の仮説上の複雑な四次エピトープを含み、本発明者らの知る限りでは、この手のエピトープが初めて、異なるウイルス間で移植されていることを表している。
rDENV4/3ウイルス(DENV4 M12、M14、およびM16)の3つ全ては、エレクトロポレーションおよびその後のC6/36細胞上での継代後、回収に成功した。C6/36細胞からの(およびベロ−81細胞上での病巣形成アッセイにより測定された)ピーク感染力価は、親のWT DENV3およびDENV4 ICのそれに匹敵することが見出された(図2、パネルA)。DENV4 M12およびM14は、WT DENV3のと類似したピーク力価を示し、それらの全部が、この系においてWT DENV4のそれよりおよそ1log10の低下である。しかしながら、DENV4 M16は、より減弱した成長表現型を示し、ピーク力価は、約2×106ffu/ml(WT DENV3の約50分の1、WT DENV4の約300分の1)に達した(図2、パネルA)。それに応じて、感染巣サイズもまた、rDENVにおいて、それらのWT親と比較して小さかった。DENV4 M12およびM14病巣は、WTより小さいが、それでも、DENV4 M16より有意に大きく、DENV4 M16は、ベロ−81細胞上に非常に小さいピンポイント病巣を形成している(図2、パネルB)。
3つのrDENVにおける、hmAb 5J7に対するエピトープがDENV3からDENV4へ移植されたレベルを決定するためにアッセイを実施した。DENV3特異的hmAb 5J7の、WTウイルスおよびrDENVウイルスの両方との結合を評価するためにELISAを行った。これらにより、5J7はWT DENV3と結合したが、WT DENV4と結合せず、前のデータと一致することが明らかにされた。興味深いことに、5J7は、DENV4 M12を全く結合することができなかったが、DENV4 M14およびM16の両方は、WT DENV3のレベルに近く、またはそれを超えるレベルで5J7結合を促進するのにDENV3エピトープを十分、提示した(図4、パネルA)。これらのデータは、わずか4個のAA(DENV4 M12とM14の間での移植されたAAにおける違い)が、5J7のDENV4 M14との結合を与えるのに関与したことを示している。これらの結合研究への推論として、ウイルス中和アッセイを、5J7を用いて実施し、rDENV4パネルの中和に対する感受性を評価した。ELISA結合データと一致して、DENV4 M12は、5J7で中和され得ず、一方、DENV4 M14およびM16の両方は、5J7により、WT DENV3のAb濃度に匹敵するAb濃度で中和された(図4BおよびC)。意義深いことには、これらの結果は、高度に異なる(成熟対未成熟)ウイルス粒子について中和感受性を獲得していると考えられた2つの異なる細胞株(ベロ−81、およびDC−SIGNを発現するU937)において、(DENV4 M14について)一貫性があり、これらのrDENVの粒子成熟状態が5J7中和に影響を及ぼし得ないことを示している。
本発明者らのrDENV4/3パネルの、ポリクローナル抗体中和に対する感受性を評価するために、一次DENV感染後の回復期患者から収集されたドナー血清を、病巣低下アッセイ(ベロ−81)およびフローサイトメトリに基づいたアッセイ(U937−DC−SIGN)に用いた。ELISA結合アッセイおよび5J7 hmAb中和アッセイと同様に、DENV4 M12は、ベロ細胞においてDENV3特異的血清による中和に対する感受性の増加を示さなかった(図5、パネルD)。しかしながら、DENV4 M14は、ベロ細胞において、WT DENV3のとほとんど同一で、かつWT DENV4のより有意に高い中和表現型を示し(図5、パネルA〜C)、このrDENV4/3ウイルスが、ヒトにおける自然DENV3感染により生じたポリクローナル抗体応答による中和に対する感受性を獲得したことを示している。さらに、この表現型は、U937−DC−SIGN細胞において確認され、DENV4 M16に広げられ(図5、パネルE〜G)、その場合、どちらのrDENVについても、DENV3抗血清によるポリクローナル中和は、WT DENV3に匹敵したが、WT DENV4は、最低の血清希釈度(1:20)においてさえも中和されなかった。ベロ細胞におけるDENV4 M16の小さい病巣表現型のために、この細胞型における中和アッセイは技術的に困難であり、それゆえに、このrDENVについての中和データは、U937−DC−SIGNに制限され、そのフローサイトメトリに基づいたアッセイは、減弱したウイルスにおいてさえも容易に実施されるからである。まとめると、これらのデータは、DENV4 M14およびM16は、DENV3型特異的中和のポリクローナル決定基を捕獲しており、中和感受性において二価を示すことを示している。
rDENV4/3ウイルスのパネルが、非特異的様式での中和に対するそれらの感受性を増加させるように改変されている可能性を排除するために、回復期のヒト患者から収集された一次DENV1およびDENV2血清での中和アッセイを実施した。一次DENV1血清は、高レベルで中和されたWT DENV1とは正反対に、ベロ細胞においてDENV4 M12またはM14のいずれも全く中和できなかった(図7、パネルA〜B)。さらに、DENV2血清もまた、DENV4 M14を中和できなかったが、試験された1つの試料は、WT DENV2のよりはるかに低いレベルではあるが、DENV4 M12を中和した(図7、パネルC〜D)。まとめると、これらの結果は、DENV4背景におけるDENV3中和感受性の獲得はDENV3特異的であり、rDENVパネルをヘテロタイプの血清による中和に対して感受性をより高くさせる全体的な構造変化の結果ではないことを示している。
デング1およびデング2の両方の型特異的中和決定基を捕獲する組換えデング2ウイルスの開発および特徴づけ
組換えDENV1およびDENV2作製のための逆遺伝学プラットフォームの開発
本発明者らは、組換えDENV3(rDENV3)の産生のための逆遺伝学系の作製および特徴づけを前に記載している。同様の技術を利用して、本発明者らは、2007年のニカラグアにおけるエピデミックから単離されたDENV2の臨床分離株(V1210)と共に、DENV1 Western Pacific 1974(WestPac74)についてのcDNA感染性クローン(IC)系を開発している。大腸菌における細菌プラスミド増幅中の不安定性および毒性を回避するために、両方のゲノムを4個の異なる断片へサブクローニングした(図8、パネルA)。DENV1ゲノムにおけるヌクレオチド(NT)位置2052(PflMI;認識配列:CCACCTTTTGG、配列番号9)、4215(PflMI;CCACTAGCTGG、配列番号10)、および8563(PflMI;CCAAACCATGG、配列番号11)での天然に存在するクラスII制限エンドヌクレアーゼ部位を利用して、ゲノムcDNAを分割した。さらに、その細菌ベクター内で、かつT7プロモーター配列の上流のEcoRV部位を用いて、ゲノムの5’末端を生じさせ、一方、ベクターにおけるSapI部位を3’ゲノム末端のために用いた(図8、パネルA)。DENV2について、第1のゲノム分割は、位置2340(断片Aとベクターの間のDraIII;認識配列:CACTGTGTG)で生じた。ゲノム配列を保存するために、DraIII部位(CACnnnGTG)を、A断片の3’末端に利用し、一方、AlwNI(CAGnnnCTG)部位を、B断片の5’末端に用いた。認識部位のベクター領域(かつDENVゲノム配列ではない)におけるエンドヌクレアーゼ認識配列を突然変異させることにより、これらの2つの制限エンドヌクレアーゼ消化物のライゲーションされた生成物は、消化を促進するためのDENVゲノムへの突然変異の導入なしに、天然DENV2ゲノム配列を保存する。NT4662(DraIII;CACGTGGTG)、および7414(DraIII;CACACTGTG)における追加のゲノム接合部を利用して、ゲノムcDNAを分割した。さらに、その細菌ベクター内で、かつT7プロモーター配列の上流のSpeI部位を用いて、ゲノムの5’末端を生じさせ、一方、ベクターにおけるEciI部位を3’ゲノム末端のために用いた(図8、パネルA)。ゲノムcDNA断片を含有するプラスミドの細菌増幅後、プラスミドを、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、T4 DNAリガーゼでライゲーションし、5’キャップ類似体を含有するT7 RNAポリメラーゼで転写した。その後、インビトロで転写されたRNAを、ベロ−81細胞またはBHK−21細胞のいずれかへ電気穿孔した。細胞を4〜6日間、培養し、その時点で上清を収集し、遠心分離により清澄化し、さらに4日間、C6/36(ヒトスジシマカ)細胞上へ継代した。再び、上清を収集し、清澄化し、作業用ウイルスストックとして用いるために力価測定した。rDENV1およびrDENV2は、親の天然分離株のと同一の表現型性質(成長速度、ピーク感染力価、および感染巣形態/サイズ)を示した(データ未呈示)。
前の研究は、DENV1に特異的な、強く型特異的なヒトモノクローナル抗体(hmAb)(1F4)を同定した。DENV1と結合したこのhmAbの結晶構造、および同定された接触アミノ酸(AA)残基を利用して、本発明者らは、本発明者らの新規の逆遺伝学プラットフォームを用いて、このエピトープを含むAA残基をDENV1からDENV2へ移植しようとした。DENV1とDENV2の間のAAおよびNTアラインメント後、血清型間バリアントAAを同定し、DENV1からDENV2への移植のために選択した。DENV2 ICにおけるNT配列を、DENV1に適合するAA変化を促進するように改変し(図8、パネルB〜C)、これらの変化を捕獲するサブゲノムcDNAを合成した(BioBasic;Amherst、NY)。rDENVを上記のように作製し、回収されたウイルスを表現型特徴づけに用いた。このrDENVは、DENV2−1F4Eと名付けられている(図8、パネルB〜C)。
rDENV2/1は、エレクトロポレーションおよびその後のC6/36細胞上での継代後、回収に成功した。C6/36細胞からのピーク感染力価が測定され、C6/36細胞における親のWT DENV1およびDENV2 ICのそれに匹敵することを見出されたが(図9、パネルB)、ベロ細胞において非常に減弱していた(およそ3log10)(図9、パネルA)。適応度分析を、C6/36蚊細胞上で、多段階成長曲線(MOI=0.01)を用いて行った(図9、パネルC)。一般的に、初期時点(<96接種後時間(hpi))では、有意な適応度欠損は見られなかった。DENV2−1F4Eは、96hpiにおける力価の降下を示したが、これは、120hpi以降、力価はWT DENV1および2と等価であったため、その場限りの遅れであった(図9、パネルC)。細胞の健康が、このその場限りの減弱した時点において影響を及ぼしている可能性があり、それゆえに、さらなる調査が必要とされる。しかしながら、これらのデータは、DENV2−1F4Eが、WT DENV1および2と比較して、節足動物細胞において有意な成長減弱を示さないことを示している。成長速度データに応じて、DENV2−1F4E(図9、パネルD)は、WT DENV1および2と比較して、感染巣のサイズまたは形態の実質的違いを示していない。これらのデータは、DENV1の移植された領域を含有するrDENV2−1F4Eが生存可能であり、さらなる特徴づけのための適切な成長特性を示すことを示している。
DENV2−1F4Eにおける、hmAb 1F4に対するエピトープがDENV1からDENV2へ移植されたレベルを決定するためにアッセイを実施した。DENV1特異的hmAb 1F4の、WTウイルスおよびrDENVウイルスの両方との結合を評価するためにELISAを行った。これらにより、1F4はWT DENV1と結合したが、WT DENV2と結合せず、前のデータと一致することが明らかにされた。興味深いことに、1F4は、WT DENV1に匹敵するレベルでDENV2−1F4Eと結合した(図10、パネルA)。これらのデータは、DENV1と結合した1F4の結晶構造において同定された残基が、DENV1とDENV2の間で、モノクローナルAb結合を移植するのに十分であることを示している。これらの結合研究への推論として、ウイルス中和アッセイを、1F4およびDENV2−1F4Eを用いて実施した。ELISA結合データと一致して、DENV2−1F4Eは、WT DENV1のAb濃度に匹敵するAb濃度での1F4により中和された(図10、パネルB〜C)。意義深いことには、これらの結果は、2つの異なる細胞株(C6/36、およびDC−SIGNを発現するU937)において、一貫性がある。
本発明者らのrDENV2/1ウイルスの、ポリクローナル抗体中和に対する感受性を評価するために、一次DENV1感染後の回復期患者から収集されたドナー血清を、フローサイトメトリに基づいた(U937−DC−SIGN)アッセイに用いた。ベロ細胞におけるDENV2−1F4Eの小さい病巣表現型のために、この細胞型における中和アッセイは技術的に困難であり、それゆえに、このrDENVについての中和データは、U937−DC−SIGNに制限され、そのフローサイトメトリに基づいたアッセイは、減弱したウイルスにおいてさえも容易に実施されるからである。ELISA結合アッセイおよび1F4 hmAb中和アッセイと同様に、DENV2−1F4Eは、U937−DC−SIGN細胞において、WT DENV1とほぼ同一で、かつWT DENV2より有意に高い、中和表現型を示し(図11、パネルA〜B)、このrDENV2/1ウイルスが、ヒトにおける自然DENV1感染により生じたポリクローナル抗体応答による中和に対する感受性を獲得していることを示している。hmAb 1F4データと共にこれらのデータは、DENV2−1F4EがDENV1型特異的中和のポリクローナル決定基を獲得し、中和感受性において二価性を示すことを示している。
本発明者らのキメラrDENVの減弱のレベルを評価するために、本発明者らは、DENV疾患の免疫不全マウスモデルにおいて、DENV2−1F4Eの死亡率をそれの親のWT DENV1およびDENV1と比較した。インターフェロンα/β受容体およびインターフェロンγ受容体の両方が欠損したC57BL/6に、3.3×106ffu(C6/36力価)のDENV1、DENV2、またはDENV2−1F4Eを腹腔内に接種した。マウスの体重を計り、研究の終了まで56dpiの間、マウスをモニターした。図12に示されているように、WT DENV1およびDENV2を接種されたマウスは、80%より高い死亡率を示したが、等価用量のDENV2−1F4Eを受けたマウスのいずれも、感染に屈せず(p=0.0076)、このrDENVについての高程度の減弱を示している。これらのデータは、二価ウイルスを作製するためのDENVのキメラ化が、ワクチン開発に適し得るインビボ弱毒のレベルを導入することを示している。
血清型2中和ヒト抗体応答をマッピングするためのキメラ組換えデングウイルスの使用
デングウイルス(DENV;DV)は、世界中で最も重大なヒトアルボウイルス病原体であり、毎年、推定3億9千万人の感染者と9千6百万人の症候性症例がある。世界人口のほぼ半分が、疾患のリスクがあり、まだなお、デング疾患を処置または防止する認可されたワクチンまたは治療用物質がない。デング感染は、デング熱(激しい骨および関節の痛みによって特徴づけられる自己限定的発熱性疾患)、または不適切な凝固、血管漏出、および最も重篤な例においては、典型的には致死的である多臓器不全によって強調されるデング出血熱およびデングショック症候群として知られたより重篤な形として現れ得る。デングウイルスは、4つの異なる血清型として存在し、1つの血清型による感染は、その後の他のものによる感染からの保護を与えない。それどころか、単一のデング血清型に対する免疫は、別の血清型による感染で重篤な疾患のリスクの増加と関連しており、ワクチン設計にとって、困惑させる因子となっている。伝統的なワクチン接種ストラテジーは、各血清型に対して等価の免疫応答を誘発するために4つの異なるウイルスのカクテルを利用しているが、これまで、相変わらずこの目標を達成することには至っていない。それゆえに、デング感染に対する複雑な免疫応答の我々の理解を助けるための診断ツール、および新しいワクチン設計を導き、かつ作製するための新しいテクノロジーの切羽詰まった必要性がある。この発明報告は、複数の血清型に対するヒト抗体応答を特徴づけるために、およびまた、単一のウイルス接種菌液の状況内で、複数の血清型に対する免疫応答を誘発する能力がある新しい多価ワクチン候補を作製するために用いることができる、異種性血清型の重要な抗原性コンポーネントを含有する新規の組換えキメラデングウイルスのパネルの作製を記載する。本発明者らは、抗原移植のこのストラテジーが、他のヒトおよび動物病原体についての複数のワクチンプラットフォームに適合し、重要なことには、デングウイルスワクチン開発の大きなブレークスルーを表すと考えている。
DENV2とDENV4の間で異なるアミノ酸残基を同定するために、エンベロープドメインIII(EDIII)領域のアミノ酸配列(アミノ酸位置296〜395)をアラインメントした(図13、パネルA)。DENV2とDENV4の間で異なる残基は、強調されており、合計40個であり、DENV4由来のそれらの残基は、できる限り最少のヌクレオチド変化を生じさせることにより、DENV2由来のそれらと置き換えられた。40個の異にするアミノ酸は、EDIII全体に及び、そのドメインの表面露出残基、内部残基、および端の残基を含み、おそらく、他の単量体および二量体と相互作用する(図13、パネルB)。組換えウイルスの作製は、親の野生型ウイルスを生み出すために用いられる4断片のクローニングストラテジーを利用する。DENV−4Aプラスミドカセットは、エンベロープ糖タンパク質を含有し、EDIIIは灰色で強調されている(図13、パネルC)。組換えDENV−4Aと共にDENV−4B、C、およびDのプラスミドカセットを用いて、DV4−EDIII−DV2ウイルスが生じ得る。組換えウイルスへ導入された40個のアミノ酸変化のうち、そのアミノ酸の14個が、電荷の変化を導入する(表1)。6個の残基は、負電荷を増加させ、8個の残基は、より多い正電荷を導入する。
ウイルスに存在するEタンパク質およびprMタンパク質の比を測定するために、ウイルスにおいてイムノブロッティングを実施した(図14)。DENV2は、Eに対して高レベルのprMを示し、不完全なフューリンプロセシングまたはprM解離のいずれかによる、高度に未成熟のウイルスを示している。DENV4およびDV4−EDIII−DV2のどちらも、検出可能なprMを有さず、これらのウイルスが高度に成熟であることを示唆している。しかしながら、DENV2とその2つのDENV4主鎖型ウイルスとの間で検出されるEタンパク質の量における有意な差のため、本発明者らは、これらのビリオンの表面上にいくつかのprMの存在を除外することができない。
多段階成長曲線を用いる実験により、DV4−EDIII−DV2は、DENV2およびDENV4の両方の親ウイルスと比較して、ベロ細胞において2log10の成長減弱を有する(図15、パネルA)。DV4−EDIII−DV2は、ベロ細胞において、両方の親ウイルス間の中間の形態を有する感染巣を形成する(図15、パネルB)。ベロ細胞における追加の1〜2日間の感染にも関わらず、DV4−EDIII−DV2病巣は、親ウイルス病巣のサイズに達していない。
2D22は、DENV2に非常に型特異的であるヒトモノクローナル抗体(MAb)である(図17、パネルA)。以前、ベロ細胞において2D22の存在下でDENV2を継代することにより、エスケープ突然変異体を作製した。このエスケープ突然変異体は、EDIIIの中央に1つの点突然変異、R323Gを有し(図17、パネルB)、DENV Eのこの領域が、2D22エピトープ内に含まれ得ることを示している。ELISA結合により、DV4−EDIII−DV2が、DV4レベルより上だが、DV2レベルには達しない、2D22との部分的結合を獲得していることが示されている(図17、パネルC)。交差反応性DENV mAbである、2J20との結合(図17、パネルD)は、同等レベルのウイルスが結合アッセイにおいて存在し、しかもDV4−EDIII−DV2形態が維持されていることを示している。
6個の追加のDENV2 MAbのパネルを用いて、DV4−EDIII−DV2をさらに特徴づけた(表2)。これらのMAbの多くは、組換えEDIII(rEDIII)と結合せず、それには、2D22が挙げられ、それはそれのエピトープの部分としてEDIIIを含有することを本発明者らは示している(図17)。rEDIII単独との結合の欠如を説明するのに、2D22が、E単量体全体、E二量体、または完全なウイルス構造においてのみ存在する複雑なエピトープを用いるということはあり得る。このパネルにおける他のMAbが同じ要求性を有することはあり得る。エスケープ突然変異体を作製することによる、またはアラニンスキャニング突然変異を通してのいずれかで決定される、結合に重要な残基などの追加の情報が、その表に含まれる。
DV4−E88はマウスDV4型特異的MAbであり、知られたEDIIIエピトープ、ならびにエスケープ突然変異体を通して位置づけられた、特異的残基331および361に関わる(表2、および図19、パネルA)。予想された通り、DV4−E88はDV4を中和するが、DV2を中和しない。DENV4のEDIIIがDENV2由来のそれと置き換えられたため、DV4−E88によるDV4−EDIII−DV2中和は喪失した。
ポリクローナル免疫血清に存在する抗体が、EDIIIを認識するかどうかを試験するために、12個のDENV2ポリクローナル免疫血清を、DV4−EDIII−DV2に対して試験した(図20、パネルA〜L)。DV4−EDIII−DV2は、DENV2に匹敵する、DENV2血清による中和に対する感受性を獲得している。DENV4は、試験された最高濃度における血清のいずれによっても中和されない。異なる血清での中和価の範囲(約50から約3,000までの範囲)に関わらず、平均DV4−EDIII−DV2中和価は、DENV2より高い(図22、パネルA)。
DENV4ポリクローナル免疫血清は、DENV4の中和価と類似した中和価で、DV4−EDIII−DV2を中和する(図21、パネルA〜F)。これらのデータは、主要なDENV4中和エピトープがDENV2と異なり、DENV2 EDIIIがDENV4へ導入された場合、破壊されないことを示唆している。DENV2ポリクローナル免疫血清に関して見られたように、DV4−EDIII−DV2平均中和価は、DENV4の中和価に匹敵する(図22、パネルB)。
DV4−EDIII−DV2がヘテロタイプのDENV1またはDENV3ポリクローナル免疫血清によって中和されるかどうかを試験するために、同じFRNTアッセイを、回復期のDENV1およびDENV3ドナー由来の血清を用いて実施した。いくつかの場合において、DV4−EDIII−DV2は、親のDENV4中和価のレベルより上の中和に対するわずかな感受性を獲得しているが、それは、DENV2中和のレベルを超えず、いずれの場合でも、ホモタイプの中和より実質的に低い(図23、パネルA〜B)。
組換えウイルスを、4断片クローニングストラテジーを用いて構築し、同じストラテジーを、野生型DENV感染性クローンを作製するのに用いる。DENV−4ゲノムを、4つの別々のDNAプラスミドへサブクローニングする。T7プロモーターを、A断片の5’末端へ導入し、固有のIIS型制限部位を、各断片の5’末端および3’末端へ導入する。これらの制限部位は、プラスミドが、正しい方向でのみ組み立てられてDENVゲノム配列を生じるであろうことを確実にする。
蚊ヒトスジシマカC6/36細胞を、MEM(Gibco)培地中、32℃で成長させた。ベロ−81細胞をDMEM中、37℃で維持した。レトロウイルス形質導入によりDC−SIGNを安定的に発現するヒト単球リンパ腫細胞株U937(U937+DC−SIGN)を、RPMI−1640(Gibco)中、37℃で維持し、50mM β−メルカプトエタノールを追加した。培地にFBS(ベロ−81細胞およびU937+DC−SIGN細胞について10%、C6/36について5%)を追加し、感染培地を作製するために、FBSを2%まで低下させた。全ての培地に、さらに、100U/mlペニシリンおよび100mg/mlストレプトマイシンを追加した。U937+DC−SIGNに、さらに、0.1mM非必須アミノ酸および2mMグルタミンを追加した。全ての細胞を5%CO2中、インキュベートした。
(ELISAによって前に力価測定されているような)等量のウイルスを、抗E抗体を用いて捕獲した。一次抗体2D22および2J20を4倍希釈して、希釈系列の作製を開始した。アルカリフォスファターゼ連結型二次抗体を用いて、一次抗体のP−ニトロフェニルリン酸基質との結合を検出し、反応の色変化を、分光光度法を用いて定量化した。
ヒトDENV免疫血清を、以前の自然DENV感染が確認された個体から収集した。追加のヒト免疫血清を、DENVワクチンを与えられた個体から収集した。非ヒト霊長類免疫血清を、DENV感染後、収集した。
感染の1日前、24ウェルプレートに、5×104個のベロ−81細胞または1×105個のC6/36細胞のいずれかを播種した。感染の前に成長培地を除去した。ウイルスストックを10倍の段階希釈し、その後、37℃で1時間、インキュベートすることによりウイルス力価測定を実施した。インキュベーション後、ウイルス希釈溶液を、細胞へ、37℃で1時間、加え、その後、2%FBS、100U/mlペニシリン、および100mg/mlストレプトマイシンを追加したOptiMEM(Gibco)中の1ml 1%メチルセルロースでオーバーレイした。37℃での3〜6日間のインキュベーション後、オーバーレイを除去し、細胞をPBSで洗浄し、80%メタノール中に固定した。プレートを、PBS中に作製された5%インスタントミルクでブロッキングし、その後、抗E MAb 4G2および抗PrM MAb 2H2(どちらもブロッキングバッファー中、1:500に希釈されている)とインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ブロッキングバッファー中1:2500に希釈されたHRPコンジュゲート型ヤギ抗マウスAb(Sigma)とインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、病巣を、TrueBlue HRP基質(KPL)で発色させ、病巣をカウントした。
ベロ細胞またはC6/36細胞のいずれかを、0.01の感染多重度(MOI)で感染させた。24時間ごとに、培養上清を採取し、遠心分離して細胞片を除去した。試料を、使用するまで、−80℃で凍結させた。新鮮な培地に毎日、交換した。ウイルスを、上記のようなそれらを増殖する細胞型において力価測定した。
FRNTアッセイにおいて行ったように、ウイルスを、U937+DC−SIGN感染培地中に希釈し、4倍希釈系列のMAbと混合した。ウイルスおよびMAb混合物を37℃で1時間、インキュベートした。その後、ウイルスおよびMAb混合物を、96ウェル丸底プレートのウェルあたり5×104個のU937+DC−SIGN細胞に加え、37℃で2時間、インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、感染培地で2回、洗浄し、その後、成長培地中に再び、懸濁させた。感染から1日後、細胞を遠心分離して収集し、PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。その後、細胞を透過処理し、1%正常マウス血清中でブロッキングした。細胞を、Alex Fluor 488で直接的に標識された抗E 2H2の1:400希釈溶液で染色した。陽染性細胞のパーセンテージを、Guava easyCyteフローサイトメータ(Millipore)で測定した。
ウイルスストックをPBS中で希釈し、4×Laemmliサンプルバッファー(Bio−Rad)と混合し、50℃で10分間、加熱した。試料を、12% PROTEAN TGXゲル(Bio−Rad)上に流し、PVDF膜に転写し、PBS+0.05% Tween中の5%インスタントミルクにおいて、4℃で一晩、ブロッキングした。膜を、ブロッキングバッファー中、0.5ug/ml抗E 4G2、0.5ug/ml抗PrM 2H12および5L20で、37℃、2時間、探索した。洗浄後、HRPコンジュゲート型抗マウスおよび抗ヒト二次抗体をブロッキングバッファー中、1:10,000希釈し、室温で1時間、インキュベートした。膜を化学発光基質に曝露し、フィルム上に顕出させた。
血清型2中和ヒト抗体応答をマッピングするためのキメラ組換えデングウイルスの使用
4つのデングウイルス(DENV)血清型(DENV1〜4)の1つでの一次感染は、感染した血清型を中和する抗体を生じるが、他の血清型を中和する抗体は生じない。本発明者らのグループは、自然DENV感染に曝露した人々からの、血清型特異的な、強く中和するモノクローナル抗体(hMAb)の単離を以前、報告している。本発明者らは、これらのhMAbが、無傷ウイルス粒子上でのみ発現している複雑な四次構造エピトープと結合することを実証している。最近、本発明者らは、これらの複雑なエピトープが血清型の間で移植されている生存可能な組換えDENVを作製することが可能であることを報告した。DENV3/4キメラを用いることにより、本発明者らは、エンベロープ(E)タンパク質のドメインI/IIの間のヒンジ領域が、血清型3および4を中和する型特異的抗体の主要な標的であるエピトープを含有することを観察した。最新の研究において、本発明者らは、同様のアプローチを用いて、中和hMAbおよび一次DENV2ヒト免疫血清により認識されるDENV2の部位を位置づけている。本発明者らの研究により、血清型3および4について以前に定義されたEDI/IIヒンジ領域エピトープとは異なる新規な四次構造依存性DENV2エピトープの同定がもたらされた。重要なことには、本発明者らは、機能の獲得と喪失の研究を用いて、DENV1〜4 E糖タンパク質における異なる位置が、固有の長続きする中和エピトープをコードし、そのエピトープが血清型の間で移植可能であることを実証している。DENV2エピトープの位置、ならびに自然感染およびワクチンに曝露された人々における中和抗体についての標的としてのそれの相対的重要性を調べた。
DENV2(右)由来の残基を、DENV4主鎖へ移動させて、組換えDENV4/2ウイルス(rDENV4/2、図24、パネルA)を作製した。DENVゲノムを操作するための逆遺伝学系を用いた(図24、パネルB)。上=DENV2、下=DENV4。DENVゲノムを、個々に突然変異させることができる4つのプラスミドカセットへ分割し、共にライゲーションし、細胞へ電気穿孔し、組換えウイルスが生じる。DENV4−Aカセットは、突然変異が生じるエンベロープ遺伝子を含有する。そのDENV4残基をDENV2由来のそれらと置き換えることにより、DENV遺伝子主鎖上に全体的に構築されたrDENV4/2ウイルスが生じる。
血清型特異的RT−PCRのためにRT−PCRプライマーを設計した(図25、パネルA)。利用されるプライマーは、高度に保存された3’末端NS1遺伝子を標的にする共通センスオリゴヌクレオチド、および高度に多様なNS2A遺伝子を標的にする血清型特異的アンチセンスプライマーを含んだ。ウイルスをC6/36細胞中で成長させ、培養上清を収集し、遠心分離して、いかなる細胞片も除去した。ウイルスRNAを、QIAGEN QIAmpウイルスRNA Miniprepキットを用いて単離した。PCRを35サイクル、実行し、PCR産物を、1.5%超高純度アガロースゲル上で分析した。対照RNA(DV1/DV2/DV3/DV4)および水を、陽性および陰性対照として流した(図25、パネルB)。予想される産物サイズ:DV1=205bp、DV2=539bp、DV3=455bp、DV4=401bp。
rDENV4/2(下)を親DENV4(上)から識別するために、制限断片長多型(RFLP)分析を用いた。rDENV4/2を作製するためにDENV4 Eゲノムへ導入された突然変異(アスタリスクで表されている)は、DENV4に存在するXmnI制限酵素部位を破壊している(図26、パネルA)。PCR産物をゲル精製し、XmnIで消化した。消化産物を1.5%超高純度アガロースゲル上で分析した(図26、パネルB)。予想される産物サイズ:消化されていない完全長=1031bp、消化産物=931bpおよび113bp。
ウイルスをC6/36細胞中で成長させ、培養上清を収集し、遠心分離して、いかなる細胞片も除去した。試料を12%SDS−PAGEゲル上に流し、ブロットを抗E抗体(4G2)および抗PrM抗体(2H12および5L20)で探索した(図27)。DENV2は、実質的なレベルのPrMが存在し、不完全なフューリンプロセシングまたはPrM解離のいずれかを示している。PrMバンドは、DENV4またはrDENV4/2のいずれの試料においても検出されない。
ベロ−81細胞を、MOI=0.01で、DENV2、DENV4、およびrDENV4/2に感染させた。ウイルス上清を24時間ごとに収集し、続いて、ベロ−81細胞において力価測定した(図28、パネルA)。DENVは、ベロ−81細胞において感染巣を形成する。DENV2、DENV4、およびrDENV4/2をそれぞれ、感染から5日後、4日後、および6日後に固定した(図28、パネルB)。rDENV4/2は、両方の親ウイルスより小さい病巣を示した。
C6/36細胞を、MOI=0.01で、DENV2、DENV4、およびrDENV4/2に感染させた。ウイルス上清を24時間ごとに収集し、続いて、C6/36細胞において力価測定した(図29、パネルA)。DENVは、C6/36細胞において感染巣を形成する。DENV2、DENV4、およびrDENV4/2をそれぞれ、感染から4日後、3日後、および5日後に固定した(図29、パネルB)。さらに何日間かの成長で、rDENV4/2病巣は、親ウイルスに匹敵するサイズに達する。
四次エピトープと結合する、強中和性DV2 MAbである、ヒトMAb 2D22の結合の概要は、図30、パネルAに示されている。2D22は、DENV2を中和することに対して高い特異性を示す。ELISAアッセイにより、親DV4のレベルより上であるが、DV2レベルまでではない、2D22のrDENV4/2への部分的結合の転移が示されている(図30、パネルB)。交差反応性対照抗体の2J20のELISA結合は、存在する同等レベルのウイルス、およびウイルス完全性の維持を示した(図30、パネルC)。ベロ−81に基づいた病巣低下中和試験(FRNT)を、2D22を用いて実施し、FRNT50(感染の50%を中和するのに必要とされる抗体の濃度)値を計算した(図30、パネルD)。U937+DC−SIGNに基づいた中和アッセイ(Neut)を、2D22を用いて実施し、Neut50値を計算した(図30、パネルE)。両方のアッセイにおいて(図30、パネルD〜E)、rDENV4/2は、2D22による中和を、DV2より高いレベルで獲得した。DV4は、いずれのアッセイにおいても、最高濃度の2D22で中和されなかった。
ベロ−81 FRNTアッセイにより、rDENV4/2が、親DENV2に匹敵するレベルで、DENV2ポリクローナル免疫血清による中和を獲得したことが示された(図31、パネルA)。rDENV4/2は、DENV4ポリクローナル免疫血清による中和の喪失は示さなかった(図31、パネルB)。rDENV4/2は、親DENV2またはDENV4の中和価のいずれよりも上のヘテロタイプのDENV1ポリクローナル免疫血清(図31、パネルC)およびDENV3ポリクローナル免疫血清(図31、パネルD)による中和の獲得は示さなかった。自然感染または実験的ワクチン接種のいずれかを有する個体由来の血清は、示された通り、コード化されている。FRNT50<20を有する試料は、19の血清希釈係数にグラフ化されている。
組換えDENVの野生型DENV配列とのアミノ酸アラインメント
DV4−EDIII−DV2の野生型DENV4およびDENV2とのアミノ酸配列アラインメントは図32Aに示されている。DENV2−1F4Eの野生型DENV2およびDENV1とのアミノ酸配列アラインメントは図32Bに示されている。最後に、DENV4 M12、DENV4 M14、およびDENV4 M16の野生型DENV4およびDENV3とのアミノ酸アラインメントは図32Bに示されている。
1.N52Q、V55T、S138T、V139I
2.A168S、P169S、A180T、L181V、L183M(#1に列挙されたものに加えて)
1.N52E、P53V、V55L、S138T
2.A168S、A180E(#1に列挙されたものに加えて)
1.S225T、E229P、E307K
1.K122L、K123E、P132Y
2.E71D、E148Q、D225T、S229P、V307K(#1に列挙されたものに加えて)
1.Y81S、K83S、V242N、R247K
2.I68T、A71E、T72S、R93K、R94H、D95S、V96M、V113I(#1に列挙されたものに加えて)
1.I68T、D71E、A80P、T81S、V83N、T242N、A243P、E249D
2.R93K、R94H、T95S、F96M、S112G、L113I、I114V(#1に列挙されたものに加えて)
1.D71E、A80P、V81S、P83N、A243P、E249D
2.I68T、T95S、Y96M、S112G、L113I(#1に列挙されたものに加えて)
1.Q52N、T55V、T138S、I139V
2.S168A、S169P、T180A、V181L、M183L(#1に列挙されたものに加えて)
3.K122L、K123E、P132Y
4.E71D、E148Q、D225T、S227P、V307K(#3に列挙されたものに加えて)
5.1、2、3、4、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ(すなわち、1+3、1+4、2+3、2+4)
1.Q52N、T55V、T138S、I139V
2.S168A、S169P、T180A、V181L、M183L(#1に列挙されたものに加えて)
1.K122L、K123E、P132Y
2.E71D、E148Q、D225T、S229P、V307K(#1に列挙されたものに加えて)
1.Q52N、T55V、T138S、I139V
2.S168A、S169P、T180A、V181L、M183L(#1に列挙されたものに加えて)
3.K122L、K123E、P132Y
4.E71D、E148Q、D225T、S227P、V307K (#3に列挙されたものに加えて)
5.1、2、3、4、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
1.V122L、T123E、K124P、L214F
2.S225T、E229P、E307K(#1に列挙されたものに加えて)
1.I68T、D71E、A80P、T81S、V83N、T242N、A243P、E249D
2.R93K、R94H、T95S、F96M、S112G、L113I、I114V(#1に列挙されたものに加えて)
3.V122L、T123E、K124P、L214F
4.S225T、E229P、E307K(#3に列挙されたものに加えて)
5.1、2、3、4、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
1.I68T、D71E、A80P、T81S、V83N、T242N、A243P、E249D
2.R93K、R94H、T95S、F96M、S112G、L113I、I114V(#1に列挙されたものに加えて)
1.I68T、D71E、A80P、T81S、V83N、T242N、A243P、E249D
2.R93K、R94H、T95S、F96M、S112G、L113I、I114V(#1に列挙されたものに加えて)
3.V122L、T123E、K124P、L214F
4.S225T、E229P、E307K(#3に列挙されたものに加えて)
5.1、2、3、4、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
1.S169P、T180A
2.Q52N、L53P、T55V(#1に列挙されたものに加えて)
1.D71E、A80P、V81S、P83N、A243P、E249D
2.I68T、T95S、Y96M、S112G、L113I(#1に列挙されたものに加えて)
3.S169P、T180A
4.Q52N、L53P、T55V(#3に列挙されたものに加えて)
5.1、2、3、4、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
1.D71E、A80P、V81S、P83N、A243P、E249D
2.I68T、T95S、Y96M、S112G、L113I(#1に列挙されたものに加えて)
1.D71E、A80P、V81S、P83N、A243P、E249D
2.I68T、T95S、Y96M、S112G、L113I(#1に列挙されたものに加えて)
3.S169P、T180A
4.Q52N、L53P、T55V(#3に列挙されたものに加えて)
5.1、2、3、4、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
1.T49E、S122L、G123E、I132Y
2.A71D、T148Q、D225T、V229P、D307K、K321Q、V362P(#1に列挙されたものに加えて)
3.S168A、E180A
4.E52N、V53P、L55V、T138S(#3に列挙されたものに加えて)
5.1、2、3、4、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
1.Y81S、K83S、V242N、R247K
2.I68T、A71E、T72S、R93K、R94H、D95S、V96M、V113I(#1に列挙されたものに加えて)
3.S168A、E180A
4.E52N、V53P、L55V、T138S(#3に列挙されたものに加えて)
5.1、2、3、4、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
1.Y81S、K83S、V242N、R247K
2.I68T、A71E、T72S、R93K、R94H、D95S、V96M、V113I(#1に列挙されたものに加えて)
3.T49E、S122L、G123E、I132Y
4.A71D、T148Q、D225T、V229P、D307K、K321Q、V362P(#3に列挙されたものに加えて)
5.1、2、3、4、および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
1.Y81S、K83S、V242N、R247K
2.I68T、A71E、T72S、R93K、R94H、D95S、V96M、V113I(#1に列挙されたものに加えて)
3.T49E、S122L、G123E、I132Y
4.A71D、T148Q、D225T、V229P、D307K、K321Q、V362P(#3に列挙されたものに加えて)
5.S168A、E180A
6.E52N、V53P、L55V、T138S
7.1、2、3、4、5、6および最初の配列のありとあらゆる組み合わせ
出願時の特許請求の範囲は以下の通りである。
[請求項1]
デングウイルスE糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスE糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスE糖タンパク質であって、前記デングウイルスE糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型4由来であり、前記抗体がデングウイルス血清型3と反応性である、キメラデングウイルスE糖タンパク質。
[請求項2]
前記抗体がモノクローナル抗体5J7である、請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質。
[請求項3]
アミノ酸配列:
T49E、K51T、E52Q、V53L、L55T、T58K、Y59L、S122L、G123E、K124P、T126E、N128K、L129V、I132Y、M199L、K200T、T205A、L207M、K210R、L214F、A222S、V270I、D271Q、S272N、G273S、D274G、N276T、H277S、およびM278I
を含み、前記アミノ酸配列が以下のアミノ酸置換:A71D、T148Q、D225T、V229P、D307K、K321Q、およびV362Pのうちの1つまたは複数を任意の組み合わせでさらに含む、請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質。
[請求項4]
アミノ酸配列:
[請求項5]
アミノ酸配列:
[請求項6]
デングウイルスE糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型由来のタンパク質ドメインを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスE糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスE糖タンパク質であって、前記デングウイルスE糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型4由来であり、前記タンパク質ドメインがデングウイルス血清型2由来である、キメラデングウイルスE糖タンパク質。
[請求項7]
前記タンパク質ドメインがE糖タンパク質ドメインIIIである、請求項6に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質。
[請求項8]
アミノ酸配列:
T300S、S303T、S307K、D309V、M312I、T320I、V322I、K323R、K325Q、A329D、A331S、V335I、I337F、R340T、V342L、N343E、E345R、K346H、V348L、V351L、S353T、S354V、T355N、L357I、A358V、E359T、N360E、T361K、N362D、V364P、T365V、L369A、V379I、G383E、N384P、S385G、A386Q、T388K、H390N、R393K
を含む、請求項6に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質。
[請求項9]
アミノ酸配列:
[請求項10]
デングウイルスE糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープを導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスE糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスE糖タンパク質であって、前記デングウイルスE糖タンパク質主鎖がデングウイルス血清型2由来であり、前記抗体がデングウイルス血清型1と反応性である、キメラデングウイルスE糖タンパク質。
[請求項11]
前記抗体がモノクローナル抗体1F4である、請求項10に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質。
[請求項12]
アミノ酸配列:
[請求項13]
請求項1〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子またはウイルス様粒子(VLP)。
[請求項14]
請求項1〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質をコードする単離された核酸分子。
[請求項15]
請求項13に記載のフラビウイルス粒子またはVLPをコードする単離された核酸分子。
[請求項16]
請求項13に記載のフラビウイルス粒子を含むフラビウイルス粒子の集団。
[請求項17]
請求項1〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を薬学的に許容される担体中に含む組成物。
[請求項18]
請求項14または15に記載の核酸分子を薬学的に許容される担体中に含む組成物。
[請求項19]
請求項16に記載の集団を薬学的に許容される担体中に含む組成物。
[請求項20]
請求項13に記載のフラビウイルス粒子および/またはVLPを薬学的に許容される担体中に含む組成物。
[請求項21]
対象においてデングウイルスに対する免疫応答を生じさせる方法であって、前記対象に、有効量の、請求項1〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質、請求項13に記載のフラビウイルス粒子、請求項13に記載のVLP、請求項14〜15のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項16に記載の集団、および/または請求項17〜20のいずれか一項に記載の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法。
[請求項22]
対象においてデングウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項1〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質、請求項13に記載のフラビウイルス粒子、請求項13に記載のVLP、請求項14〜15のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項16に記載の集団、および/または請求項17〜20のいずれか一項に記載の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法。
[請求項23]
対象においてデングウイルス感染に関連した障害を防止する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項1〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質、請求項13に記載のフラビウイルス粒子、請求項13に記載のVLP、請求項14〜15のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項16に記載の集団、および/または請求項17〜20のいずれか一項に記載の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法。
[請求項24]
デングウイルス感染の影響から対象を保護する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項1〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質、請求項13に記載のフラビウイルス粒子、請求項13に記載のVLP、請求項14〜15のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項16に記載の集団、および/または請求項17〜20のいずれか一項に記載の組成物、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む方法。
[請求項25]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
a)請求項1〜5のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を、上記のステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
c)ステップ(b)における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体の存在を同定するステップ
を含む方法。
[請求項26]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
a)請求項6〜9のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を、上記のステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
c)ステップ(b)における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体の存在を同定するステップ
を含む方法。
[請求項27]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
a)請求項10〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を、上記のステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
c)ステップ(b)における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体の存在を同定する、ステップ
を含む方法。
[請求項28]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
a)請求項1〜5のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
b)ステップ(a)における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体の存在を同定する、ステップ
を含む方法。
[請求項29]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
a)請求項6〜9のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
b)ステップ(a)における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体の存在を同定する、ステップ
を含む方法。
[請求項30]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
a)請求項10〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
b)ステップ(a)における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体の存在を同定する、ステップ
を含む方法。
[請求項31]
対象においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項1〜5のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
c)前記生物学的試料が、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
d)前記生物学的試料が、(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項32]
対象においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項6〜9のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
c)前記生物学的試料が、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
d)前記生物学的試料が、(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項33]
対象においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項10〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
c)前記生物学的試料が、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
d)前記生物学的試料が、(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項34]
対象においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項1〜5のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
b)前記生物学的試料が、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
c)前記生物学的試料が、(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項35]
対象においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項6〜9のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
b)前記生物学的試料が、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
c)前記生物学的試料が、(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項36]
対象においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項10〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
b)前記生物学的試料が、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
c)前記生物学的試料が、(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項37]
試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する抗体を検出する方法であって、
a)前記試料を請求項1〜5のいずれか一項に記載のE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する抗体を検出するステップ
を含む方法。
[請求項38]
試料においてデングウイルス血清型2および/または4に対する抗体を検出する方法であって、
a)前記試料を請求項6〜9のいずれか一項に記載のE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する抗体を検出するステップ
を含む方法。
[請求項39]
試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する抗体を検出する方法であって、
a)前記試料を請求項10〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する抗体を検出するステップ
を含む方法。
[請求項40]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する抗体を同定する方法であって、
a)請求項1〜5のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を(a)のE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
c)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
[請求項41]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型2および/または4に対する抗体を同定する方法であって、
a)請求項6〜9のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を(a)のE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
c)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型2および/または4に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
[請求項42]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する抗体を同定する方法であって、
a)請求項10〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む組成物を、前記対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を(a)のE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
c)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
[請求項43]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する抗体を同定する方法であって、
a)請求項1〜5のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型3および/または4に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
[請求項44]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型2および/または4に対する抗体を同定する方法であって、
a)請求項6〜9のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型2および/または4に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
[請求項45]
対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する抗体を同定する方法であって、
a)請求項10〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルス血清型1および/または2に対する抗体を同定するステップ
を含む方法。
[請求項46]
対象においてデングウイルス血清型3および/または4に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項1〜5のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型3および/または4に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項47]
対象においてデングウイルス血清型2および/または4に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項6〜9のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型2および/または4に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項48]
対象においてデングウイルス血清型1および/または2に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項10〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を投与されている対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型1および/または2に対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項49]
対象においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項1〜5のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を(a)のE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
c)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項50]
対象においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項6〜9のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を(a)のE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
c)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
[請求項51]
対象においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項10〜12のいずれか一項に記載のE糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、対象に、前記E糖タンパク質に対する抗体応答を誘導するのに有効な量で投与するステップ、
b)前記対象由来の生物学的試料を(a)のE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
c)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含む方法。
Claims (11)
- i)デングウイルスE糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型と反応性である抗体により認識されるエピトープ、または
ii)デングウイルスE糖タンパク質主鎖のデングウイルス血清型とは異なるデングウイルス血清型由来のタンパク質ドメイン
を導入するアミノ酸置換を含むデングウイルスE糖タンパク質主鎖を含むキメラデングウイルスE糖タンパク質であって、前記キメラデングウイルスE糖タンパク質が、
アミノ酸配列:
- 請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子またはウイルス様粒子(VLP)。
- 請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質または請求項2に記載のフラビウイルス粒子またはVLPをコードする単離された核酸分子。
- 請求項2に記載のフラビウイルス粒子を含むフラビウイルス粒子の集団。
- 請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質、請求項2に記載のフラビウイルス粒子及び/またはVLP、請求項3に記載の核酸分子、または請求項4に記載の集団を、薬学的に許容される担体中に含む組成物。
- i)対象にワクチン接種してデングウイルスに対する免疫応答を生じさせる、
ii)対象においてデングウイルス感染を処置する、
iii)対象においてデングウイルス感染に関連した障害を防止する、または
iv)デングウイルス感染の影響から対象を保護する
方法における使用のための、請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質、請求項2に記載のフラビウイルス粒子、請求項2に記載のVLP、請求項3に記載の核酸分子、請求項4に記載の集団、及び/または請求項5に記載のいずれかの組成物、あるいはそれらの組み合わせ。 - 対象由来の生物学的試料においてデングウイルスに対する中和抗体の存在を同定する方法であって、
a)請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質が投与された対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、および
b)ステップ(a)における中和を検出し、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルスに対する中和抗体の存在を同定するステップ
を含み、
i)前記中和抗体が、デングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号5を含むE糖タンパク質である、または
ii)前記中和抗体が、デングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号6を含むE糖タンパク質である、または
iii)前記中和抗体が、デングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号3または配列番号4を含むE糖タンパク質である、
方法。 - 対象においてデングウイルスに対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質を含む免疫原性組成物が投与された対象由来の生物学的試料を、前記E糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子と、前記フラビウイルス粒子の中和を検出することができる条件下で接触させるステップ、
b)前記生物学的試料が、ステップ(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含むかどうかを決定するステップ、ならびに
c)前記生物学的試料が、(a)のE糖タンパク質を含むフラビウイルス粒子を中和する抗体を含む場合には、前記対象においてデングウイルスに対する中和抗体を誘導するものとして前記免疫原性組成物を同定するステップ
を含み、
i)前記中和抗体が、デングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号5を含むE糖タンパク質である、または
ii)前記中和抗体が、デングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号6を含むE糖タンパク質である、または
iii)前記中和抗体が、デングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号3または配列番号4を含むE糖タンパク質である、
方法。 - 試料においてデングウイルスに対する中和抗体を検出する方法であって、
a)前記試料を、請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質と、抗原/抗体複合体を形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記試料においてデングウイルスに対する抗体を検出するステップ
を含み、
i)前記中和抗体が、デングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号5を含むE糖タンパク質である、または
ii)前記中和抗体が、デングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号6を含むE糖タンパク質である、または
iii)前記中和抗体が、デングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号3または配列番号4を含むE糖タンパク質である、
方法。 - 前記試料が、請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質を含む免疫原性組成物が投与された対象由来の生物学的試料であり、それにより、前記対象由来の生物学的試料においてデングウイルスに対する中和抗体を同定する、請求項9に記載の方法。
- 対象においてデングウイルスに対する中和抗体を誘導する免疫原性組成物を同定する方法であって、
a)請求項1に記載のキメラデングウイルスE糖タンパク質を含む免疫原性組成物が投与された対象由来の生物学的試料を、抗原/抗体複合体が形成し得る条件下で接触させるステップ、ならびに
b)抗原/抗体複合体の形成を検出し、それにより、前記対象においてデングウイルスに対する抗体を誘導する免疫原性組成物を同定するステップ
を含み、
i)前記中和抗体が、デングウイルス血清型2および/または4に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号5を含むE糖タンパク質である、または
ii)前記中和抗体が、デングウイルス血清型1および/または2に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号6を含むE糖タンパク質である、または
iii)前記中和抗体が、デングウイルス血清型3および/または4に対する中和抗体であり、前記E糖タンパク質が、配列番号3または配列番号4を含むE糖タンパク質である、方法。
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