JP4489943B2 - フラビウイルス感染の予防のための核酸ワクチン - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、フラビウイルスに対する新規なワクチンに関する。特に、このワクチンは、フラビウイルス(例えば、日本脳炎ウイルス(JEV))の構造タンパク質の遺伝子を含む組換え核酸である。これらのワクチンは、インビボで投与された場合、ウイルスタンパク質抗原の生合成のための転写単位として機能する。
【0002】
(発明の背景)
フラビウイルスは、フラビウイルス属のメンバーであり、これは、フラビウイルス科内に分類される。フラビウイルスは、ヒトおよび他の哺乳動物に対して非常に病原性である。ヒトに疾患を与えるフラビウイルスとしては、黄熱病ウイルス、JEV、デング熱ウイルス(4つの血清型、デング熱−1、デング熱−2、デング熱−3およびデング熱−4を含む)、ダニ媒介脳炎ウイルス、St.Louis脳炎ウイルス(SLEV)などが挙げられる。全体で、約70種が現在同定されている(Kunoら、J.of Virol.72:73−83(1998))。
【0003】
フラビウイルスは、一般に以下の3つの構造タンパク質を含む:M、マトリックスまたは膜タンパク質;E、エンベロープタンパク質;およびC、カプシドタンパク質(Monath、「Virology」(Fields編)、Raven Press,New York,1990,763−814頁:HeinzおよびRoehrig、「Immunochemistry of Viruses II:The Basis for Serodiagnosis and Vaccines」(van RegenmortelおよびNeurath編)、Elsevier、Amsterdam,1990、289−305頁)。Mは、約7〜8kDaの分子量(MW)を有し;そしてEは約55〜60kDaのMWを有する。Mは、prMと呼ばれる、より大きな前駆体として合成される。prMのさらなる部分は、成熟ビリオンの分泌前に、宿主細胞中でプロセシングされMを形成する。MおよびEは、フラビウイルス粒子の膜またはエンベロープ中に見出され、そしてウイルスの重要な免疫原性成分を構成すると長く考えられてきた。
【0004】
フラビウイルスは、RNAウイルスであり、その一本鎖RNAは、種々の種の間で、約10kbの長さを有する。Cタンパク質(そのMWは、12〜14kDaである)は、RNAと複合体化して、ヌクレオカプシド複合体を形成する。いくつかの非構造タンパク質もまた、RNAゲノム中にコードされ;これらは、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4BおよびNS5と呼ばれる。ゲノムは、ポリタンパク質として宿主細胞内で翻訳され、次いで、翻訳と同時に、または翻訳後にウイルス特異的プロテアーゼまたは宿主特異的プロテアーゼによって個々の遺伝子産物にプロセシングされる(図1)。
【0005】
米国特許第5,494,671号に要約されるように、いくつかのフラビウイルスのゲノムのヌクレオチド配列は、公知である。JEVヌクレオチド配列は、Sumiyoshiら(Virology 161:497−510(1987))およびHashimotoら(Virus Genes 1,305−317(1988))によって提供される。JEVの毒性株SA−14および中華人民共和国でワクチンとして使用される弱毒化株SA−14−14−2のヌクレオチド配列は、Nitayaphanらの研究において比較されている(Virology 177:541−552(1990))。
【0006】
他のフラビウイルス種の構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列もまた公知である。多くの場合において、完全ゲノムの配列が報告されている。利用可能な配列としては、デング熱1型ウイルス(Masonら、Virology 161:262−267(1987))。デング熱2型ウイルス(Deubelら、Virology 155:365−377(1986);Gruenbergら、J.Gen.Virol.69,1391−1398(1988);Hahnら、Virology 162,167−180(1988))、デング熱3型ウイルス(Osatimiら、Virus Genes 2:9−108(1988))、デング熱4型ウイルス(Mackowら、Virology 159:217−228(1987);Zhaoら、Virology 155,77−88(1986))、および黄熱病ウイルス(YFV)(Riceら、Science 229,726−733(1985))が挙げられる。
【0007】
JEVを含む、多くのフラビウイルスは、蚊によってヒトおよび他の宿主動物に伝播される。従って、これらは、広範な領域にわたって発生し、そしてこれらの伝播は、容易に妨害または防御されない。JEVは、成体および小児に感染し、そして熱帯および亜熱帯アジア地域において、幼児、小児、および高齢者の間で高い死亡率を引き起こす(Tsaiら、「Vaccines」(Plotkin編)W.B.Sanders.Philadelphia,Pa,1994、671−713頁)。生存者の間では、感染後に持続する、脳炎の症状に関連する、深刻な神経学上の結果が存在する。この地域の先進国(例えば、日本、中国、および韓国)において、不活性化JEVのワクチンの使用によって、JEVは非常に制御されている。にもかかわらず、この地域の他の国々においては、JEVは依然流行している。
【0008】
デング熱ウイルスもまた、蚊媒介性であり、熱帯および亜熱帯気候の地域で全体的に生じる。症状としては、熱、発疹、重篤な頭痛および関節痛が挙げられるが、デング熱からの死亡率は低い。デング熱ウイルスの蔓延は、非常に頻繁に、そして広範であるため、この疾患は主要な公衆衛生上の問題である。にもかかわらず、デング熱に対して予防するための安全かつ効果的なワクチンは、数十年の努力にもかかわらず、利用可能でない。従って、デング熱に対するワクチンの強い必要性が存在する。
【0009】
黄熱病は、南アメリカおよびサハラ砂漠以南のアフリカの熱帯地域で流行し、そして蚊によって伝播される。感染によって、黄疸を伴う、熱、悪寒、重篤な頭痛および他の痛み、食欲不振、悪心および嘔吐が生じる。生きたウイルスワクチンである17D(ニワトリ胚において増殖される)は、安全かつ効果的であると考えられる。にもかかわらず、穏やかな症状およびウイルス血症のその付随的発生を伴う生きたウイルスを投与の必要性を回避するワクチンの必要性が残存する。
【0010】
JEVに対する使用のために利用可能なワクチンとして、ホルマリン処理のような方法によって不活性化された生きたウイルス、および弱毒化ウイルスが挙げられる(Tsaiら)。全体的にウイルスワクチンは、効果的であるが、特定の問題および/または不利益を有する。ウイルスは、マウス脳または哺乳動物細胞を宿主として使用する細胞培養物中で培養される。このような培養方法は、煩雑であり、かつ高価である。さらに、ワクチンレシピエントにおける意図および所望しないアレルギー応答を潜在的に導く、宿主細胞(すなわち、脳または他の宿主)由来の抗原の最終ワクチン産物内への取り込みの付随性の危険性が存在する。ワクチン生産に関与する労働者の間での不注意な感染の危険性もまた存在する。最後に、ウイルスが、十分または完全に不活性化あるいは弱毒化され得ず、従って、ワクチンが実際に疾患を引き起こし得る危険性が存在する。
【0011】
2つのフラビウイルス間のキメラである組換えフラビウイルスは、WO93/06214に開示される。このキメラは、ある「型」または血清型のデング熱ウイルスあるいはフラビウイルス由来の非構造タンパク質と、異なる「型」または血清型のデング熱ウイルスあるいは別のフラビウイルス由来の構造タンパク質とを融合している構築物である。第2のフラビウイルスは、JEVであり得る。
【0012】
最近、いくつかの組換えサブユニットおよびウイルスワクチンが考案されている。米国特許第4,810,492号は、ワクチンにおける抗原としての使用のためにJEVのE糖タンパク質の産生を記載する。対応するDNAが、E.coli、酵母のような適切な宿主細胞、またはより高等な生物の細胞培養で抗原タンパク質を発現するために、発現系中にクローン化されている。米国特許第5,229,293号は、JEV Eタンパク質遺伝子を保持する組換えバキュロウイルスを開示する。このウイルスは、このEタンパク質が、ワクチンとしての使用のために産生および回収されるように、培養中の昆虫細胞を感染するために用いられる。
【0013】
米国特許第5,021,347号は、そのゲノム中にJEV Eタンパク質遺伝子が取り込まれた組換えワクシニアウイルスを開示する。生きた組換えワクチンウイルスは、JEVに対して免疫化するためのワクチンとして用いられる。このウイルスが、デング熱2型、デング熱4型、およびJEVのEタンパク質のC末端短縮型の遺伝子を取り込んだ組換えワクシニアウイルスおよび組換えバキュロウイルスは、米国特許第5,494,671号に開示されている。米国特許第5,514,375号は、prMからNS2Bまで延びるJEVオープンリーディングフレームの部分を発現する種々の組換えワクシニアウイルスを開示する。これらのポックスウイルスは、プロセッシクングされたMタンパク質およびEタンパク質を含む細胞外粒子の形成を誘導した。これらのJEVタンパク質をコードする2つの組換え体は、マウスにおいて、高力価の中和抗体および赤血球凝集素阻害抗体、および保護免疫を産生した。これらの効果の程度は、1回のみの後よりも2回の免疫化処理の後で大きかった。JEVタンパク質MおよびEタンパク質の遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスは、マウスに投与されたとき、保護免疫を与えた(Konishiら、Virology 180:401〜410(1991))。JEVからのprMおよびEの遺伝子を保持する組換えワクシニアウイルスで感染したHeLa細胞は、サブウイルス(subviral)粒子を産生することが示された(Kohishiら、Virology 188:714〜720(1992))。Dmitrievらは、ダニ媒介脳炎ウイルスからの構造タンパク質および特定の非構造的タンパク質をコードする組換えワクシニアウイルスを用いるマウスの免疫化を報告する(J.Biotechnol.44:97〜103(1996))。
【0014】
組換えウイルスベクターがまた、デング熱のためのウイルスワクチンとして供するために調製された。Zhaoら(J.Virol.61、4019〜4022(1987))は、デング熱4型からの構造タンパク質およびNS1を保持する組換えワクシニアウイルスを調製し、そしてこの組換え体で哺乳動物細胞を感染した後発現を達成した。同様の発現が、標的昆虫細胞を感染する組換えバキュロウイルスを用いて得られた(Zhangら、J.Virol.62、3027〜3031(1988))。Brayら(J.Viorl.63、2853〜2856(1989))はまた、デング熱脳炎発症のために抗原投与されるとき、マウスに対して保護免疫を与えるEタンパク質遺伝子を基にした組換えワクシニアデング熱ワクチンを報告する。Falgoutら(J.Virol 63、1852〜1860(1989))およびFalgoutら、J.Virol.64、4356〜4363(1990)は、同様の結果を報告する。Zhangら(J.Virol 62、3027〜3031(1988))は、デング熱EおよびNS1タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスが同様に、抗原投与されるとき、デング熱脳炎に対してマウスを保護し得ることを示した。構造遺伝子および非構造遺伝子が、組換えウイルスワクチン中に取り込まれるその他の組み合わせは、有意な免疫を産生しない(Brayら、J.Virol.63、2853〜2856(1989))。また、サルは、Eタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスで免疫されたとき、デング熱ウイルス抗原投与に対する完全保護免疫を発生しなかった(Laiら(1990)119〜124頁、F.Brown、R.M.Chancock、H.S.GinsbergおよびR.Lerner(編)「Vaccines 90:Modern approaches to new vaccines including prevention of AIDS」、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY)。
【0015】
組換えDNA調製物を用いる免疫化が、離乳マウスをモデルとして用い、St Louis脳炎ウイルス(SLEV)およびデング熱2ウイルスについて報告されている(Phillpottsら、Arch.Virol.141:743〜749(1996);Kochelら、Vaccine 15:547〜552(1997))。SLEVのprMおよびE遺伝子をコードするプラスミドDNAは、DNA免疫化の単一または2回用量でのSLEV抗原投与に対して部分的保護を提供した。これらの実験では、コントロールマウスは、約25%の生存を示し、そしてDNA免疫化マウスでは保護抗体は検出されなかった(Phillpottsら)。prMを含む組換えデング熱2プラスミドDNAの3回の皮内注射を受けたマウスでは、100%が抗デング熱2中和抗体を発生し、そして対応するE遺伝子を受けたマウスの92%が同様に中和抗体を発生した(Kochelら)。2回用量スケジュールを用いる抗原投与実験は、しかし、致死的なデング熱2ウイルス抗原投与に対してマウスを保護しなかった。
【0016】
JEVに対する免疫化のために現在まで開発されたワクチンは、それらの使用にともなう多くの欠点および問題を有している。不活性化ウイルスワクチンはコスト高であり、そして調製が不便である。さらに、それは、このウイルスの調製に用いた宿主のタンパク質に由来するアレルギー反応のリスクを持っている。さらに、それは、それらの生産に雇われる労働者にかなりのリスクを提示する。候補の弱毒化JEVワクチンは、臨床試験を受けたが、1996年の時点では、中華人民共和国の外では広く承認は見出されていない(Hennessyら、Lancet 347:1583〜1586(1996))。JEVゲノムの特定のタンパク質のみの生合成発現に基づく組換えワクチンは、高い抗体力価を誘導しないようであり、そして、全ウイルス調製物のように、場合によっては、宿主生物からの抗原に対する、またはワクシニアウイルスベクターに対する有害なアレルギー反応のリスクを持つ。同様の問題がYFVに対するワクチンの調製にともなう。デング熱に対するワクチン開発は、より進行しておらず、そしてこのようなウイルスを基礎にするか、まは組換えタンパク質を基礎にするワクチンは、まさに暗示されたような問題と同様の問題に直面する。
【0017】
したがって、調製することが安価で、それらの製造に関与する労働者にリスクをほとんど提示せず、不純物または外来の免疫原性成分に起因する有害な免疫学的反応のリスクが最小であり、そして中和抗体および保護免疫を惹起することに高度に有効である、黄熱病、デング熱、JEVおよびSLEVのようなフラビウイルスに対するワクチンの必要性が存在する。さらに、必要な免疫する用量の数を最小にする、JEVおよび関連するフラビウイルスに対するワクチンの必要性が存在する。
【0018】
(発明の要旨)
本発明は、免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位(TU)を含む核酸分子を提供する。このTUは、細胞内に取りこまれた後、この抗原を合成するように宿主細胞を指向させる。本発明の重要な局面では、このフラビウイルスは、黄熱病ウイルス(YFV)、デング熱1型ウイルス、デング熱2型ウイルス、デング熱3型ウイルス、デング熱4型ウイルス、St.Louis脳炎ウイルス(SLEV)、または日本脳炎ウイルス(JEV)のいずれかである。本発明の重要な実施態様では、この抗原は、フラビウイルスMタンパク質、Eタンパク質、またはその両方であり得る。特に、このTUがMタンパク質およびEタンパク質の両方のためであるとき、宿主細胞は、M抗原およびE抗原を含むサブウイルス粒子を分泌する。本発明のさらなる重要な局面は、この核酸はDNA分子である。さらに重要な実施態様では、この核酸TUは、これがM抗原およびE抗原の発現を作動可能に制御するように適切に配置される制御配列を含む;この制御配列は、有利には、サイトメガロウイルス前初期プロモーターであり得る。さらなる実施態様では、この転写単位はまた、ポリAターミネーターを含む。
【0019】
本発明は、宿主細胞を免疫原性抗原を合成するように指向させる免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を持つ宿主細胞をさらに提供する。このフラビウイルスは、YFV、デング熱1型ウイルス、デング熱2型ウイルス、デング熱3型ウイルス、デング熱4型ウイルス、SLEV、またはJEVであり得る。重要な実施態様では、この抗原は、Mタンパク質、Eタンパク質、またはMタンパク質およびEタンパク質の両方であり得る;後者の場合、細胞は、M抗原およびE抗原を含むサブウイルス粒子を分泌する。
【0020】
さらに、本発明は、フラビウイルスに対して被験体をワクチン接種するための組成物を提供し、この組成物は、免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を含む。この転写単位は、被験体の身体内の細胞を、その中に取り込まれた後、免疫原性抗原を合成するように指向させる。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに包含する。重要な実施態様では、このフラビウイルスは、黄熱病ウイルス、デング熱1型ウイルス、デング熱2型ウイルス、デング熱3型ウイルス、デング熱4型ウイルス、SLEV、またはJEVであり得る。さらに、この抗原は、Mタンパク質、Eタンパク質、またはMタンパク質およびEタンパク質の両方であり得;後者の場合には、細胞は、フラビウイルスM抗原およびE抗原を含むサブウイルス粒子を分泌する。重要な実施態様では、核酸分子はDNA分子である。さらなる重要な実施態様では、転写単位は、それが、この核酸が被験体の細胞中に導入されるときM抗原およびE抗原の発現を作動可能に制御するように、適切に配置された制御配列をさらに含む;有利には、この制御配列はサイトメガロウイルス前初期プロモーターである。なおさらなる実施態様では、転写単位はまた、ポリAターミネーターを含む。
【0021】
本発明は、なお、さらに、フラビウイルスによる感染に対して被験体を免疫化する方法を提供する。この方法は、被験体に、免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を含むワクチン接種組成物の有効量を投与する工程を包含する。この転写単位は、被験体の身体内の細胞により取り込まれた後、この細胞が免疫原性抗原を合成するように指向させる。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。この方法の重要な実施態様では、フラビウイルスは、黄熱病ウイルス、デング熱1型ウイルス、デング熱2型ウイルス、デング熱3型ウイルス、デング熱4型ウイルス、SLEV、またはJEVであり得る。この方法のなおその他の重要な局面では、抗原は、Mタンパク質、Eタンパク質、またはMタンパク質およびEタンパク質の両方であり得る。抗原が、Mタンパク質およびEタンパク質の両方であるとき、被験体の身体内の細胞は、その中に核酸を取り込んだ後、フラビウイルスM抗原およびE抗原を含むサブウイルス粒子を分泌する。さらに、この方法の重要な実施態様では、このワクチン化組成物は、単回用量で被験体に投与され、そして非経口的経路を経由して投与される。この方法のなおさらなる局面では、この核酸はDNA分子である。この方法のなおさらなる実施態様では、この転写単位は、これが、M抗原およびE抗原の発現を作動可能に制御するように適切に配置された制御配列をさらに含む;この実施態様の重要な局面では、この制御配列は、サイトメガロウイルス前初期プロモーターである。さらに、この転写単位は、ポリAターミネーターをさらに含み得る。
【0022】
本発明のこれらの局面および実施態様は、その別の属性および利点の基礎である。完全ゲノムを包含する配列よりむしろフラビウイルスゲノムの部分のみを含む核酸構築物であることにより、この核酸TU含有ワクチンは完全に生育不能である。したがって、それは、その製造に関与するものに対し、そしてこのワクチンを受ける被験体のいずれにもフラビウイルスによる感染の危険を引き起こさない。この核酸ワクチンは、調製することおよび投与することが容易であり、そして使用の前の貯蔵に対して安定である。予期せぬことに、本発明の核酸ワクチンは、単回用量のみの投与後、哺乳動物において保護免疫を付与することにおいて本質的に100%成功することが見出された。さらなる予期せぬ結果は、この核酸TUが、ミルクを通じてその子孫に移行され得る雌の哺乳動物においてフラビウイルスに対する免疫を発生し得ることである。理論によって制限されることを望むことなく、本発明者らは、保護免疫を与えることにおける核酸の成功の可能な機構は、このワクチンが投与される被験体の細胞のような、核酸を保有する宿主細胞が、フラビウイルスのM抗原およびE抗原を含む細胞下粒子を産生することであると考える。これらの粒子は、病原性フラビウイルスその自身の免疫原性属性を緊密に模倣し得る。
【0023】
(発明の詳細な説明)
本発明は、Mタンパク質抗原およびEタンパク質抗原のような、フラビウイルス抗原タンパク質をコードする核酸転写単位を包含する。この核酸は、この核酸が適切な宿主細胞により取り込まれるとき、特にこの宿主細胞が被験体の細胞であるとき、Mタンパク質抗原およびEタンパク質抗原を発現するように機能する。本発明はまた、その活性因子が、核酸転写単位(TU)であるワクチンを包含する。本発明は、培養宿主細胞がそれらの中に核酸TUを含むとき、培養宿主細胞をさらに包含する。さらに本発明は、被験体に、核酸TU分子を含む有効量のワクチンを投与することによって、フラビウイルス感染に対して被験体を免疫化する方法を包含する。
【0024】
本明細書で用いる「核酸転写単位」または「核酸転写単位分子」は、1つ以上の特定の遺伝子をコードする核酸に関する。このTUは、適切な宿主細胞中に導入された後、この核酸は、特定の遺伝子(単数または複数)によりコードされる1つ以上の特定の遺伝子産物の生合成を誘導するという生物学的活性を有する。この遺伝子産物(単数または複数)は、このTUに化学的に関係しない、タンパク質のようなその他の生物学的高分子である。この核酸TUは、細胞がその細胞成分を採用し、その遺伝子(単数または複数)がこのTU中に含まれる特定の遺伝子産物(単数または複数)を産生するように細胞を誘導する。任意の核酸がTUとして供され得るが、好適な実施態様では、このTUは、プラスミドまたは類似のベクターであるDNAであり、ここで、このプラスミドまたはベクターは、マーカー遺伝子のコード配列またはこのTUの実験および生合成を促進するその他の配列構築物をさらに包含する。
【0025】
本明細書で用いる「制御配列」は、核酸TU内に取り込まれる調節ヌクレオチド配列であり、宿主細胞の適切な細胞成分と相互作用し、そしてこのTUによりコードされる遺伝子産物の増大したか、または活性化された生合成を導く。したがって、適切な制御配列は、それとともに、宿主細胞の成分が相互作用する能力を有するものであり、遺伝子産物の刺激された合成が起こる。特定の遺伝子に関して、核酸中で作動可能に配置されるとき、制御配列は、この特定遺伝子の発現を効果的に制御する。
【0026】
本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、制御配列として作用する核酸TUにおけるヌクレオチド配列である。
【0027】
本明細書中で使用される用語「ターミネーター」は、成熟mRNAの3’末端でポリアデニル化を誘導するように作用する伸長したヌクレオチド配列である。ターミネーター配列は、特定のコード配列の後ろ、またはそのコード配列の下流に見出される。
【0028】
本明細書中で使用される用語「宿主細胞」は、1つ以上の産物をコードする核酸TUを有するか、またはこのようなTUが導入される原核生物細胞または真核生物細胞である。従って、宿主細胞は、外来または異種の物質(TU)を有し、これは、成分としてそこに天然には見出されないか、または固有ではない。適切な宿主細胞は、TUの導入の結果としての遺伝子産物の生合成の能力を有する細胞である。特に、適切な宿主細胞は、制御配列に、そしてターミネーター配列(あるとすれば)に応答する細胞である。これらの配列は、TU内に含まれ得る。本発明の重要な実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の特定の重要な実施態様において、宿主細胞は、ヒトまたは非ヒト被験体の身体に天然に存在する細胞であり、TUは、これらの身体にワクチンの成分として投与される。あるいは、分析目的において、診断適用において、または証明目的のために、哺乳動物細胞は、インビトロで培養されたヒトまたは非ヒト細胞であり得る。
【0029】
本明細書中で使用される特定の病原体に対して特異的な「ワクチン」または「被験体にワクチン接種するための組成物」は、被験体に投与される場合に、被験体において免疫原性応答を導く調製物に関する。本明細書中で使用される「免疫原性」応答は、病原体に対する防御免疫を被験体に付与する応答である。理論に拘束されることは望まないが、免疫原性応答は、中和抗体の生成から、または免疫系の細胞傷害性細胞から、またはその両方から生じ得る。本明細書中で使用される「免疫原性抗原」は、被験体に導入される場合、または本発明の場合においては、宿主もしくは被験体の細胞内で合成される場合に免疫原性応答を導く抗原である。本明細書中で使用されるワクチンまたはワクチン接種組成物の「有効量」は、被験体に投与された場合に、防御免疫を被験体に付与するに十分な量である。歴史的には、ワクチンは、病原体を含む1つ以上の特定の分子成分もしくは構造(特に、その表面)を活性な素因として含むと理解されてきた。このような構造は、病原性生物において一般に見出される表面成分(例えば、タンパク質)、複合糖質、および/または複合脂質を含み得る。
【0030】
しかし、本明細書中で記載されるように、用語「ワクチン」または「被験体にワクチン接種するための組成物」は、前述の段落でまとめられた従来の意味を拡大することが強調される。本明細書中で使用されるこれらの用語はまた、本発明の核酸TU分子またはTUを含む組成物に関する。このTUは、被験体の細胞内でTUによりコードされた1つ以上の特定化された遺伝子産物の生合成を誘導する。ここで、この遺伝子産物は、特定化された病原体の抗原性タンパク質である。次いで、生合成抗原は、免疫原として作用する。既に述べられたように、TU(従ってワクチン)は、特定化された免疫原性抗原に対して特定化された遺伝子を有する任意の核酸であり得る。本発明の特定の好ましい実施態様において、ワクチンであるTUは、DNAである。このTUは、分子生物学、細胞生物学、およびウイルス免疫学の分野の当業者の便宜のためにさらなる遺伝子もしくは特定の配列を組み込むプラスミドまたはベクターであり得る(「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版、Sambrook、FritschおよびManiatis、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,NY,1989;ならびに「Current Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら、John Wiley and Sons,New York 1987(季刊誌)を参照のこと、これらは、本明細書中に参考として援用される)。
【0031】
本発明の核酸TU分子は、核酸または核酸誘導体を示す。そのヌクレオチド配列は、フラビウイルス(例えば、JEV、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルスおよびセントルイス脳炎ウイルス)の抗原性タンパク質に関連した特定の遺伝子産物をコードする。任意の核酸は、TUとして作用し得るが、重要な実施態様においては、TUはDNAである。あるいは、核酸はRNA分子であり得る。それらはまた、DNAもしくはRNAのいくつかの誘導体のうちの任意の1つであり得る。その骨格であるリン酸ジエステル結合は、薬剤としてTUの安定性を増大させるために化学的に改変されている。このように想定された改変としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ホスホロチオエート誘導体またはホスホネート誘導体;誘導体のこれらおよび他の例は、核酸化学分野の当業者に周知である。
【0032】
JEVは、そのゲノムが特徴づけられ、かつ配列決定されている(図1および2を参照のこと)RNAウイルスである。M構造遺伝子の遺伝子は、細胞内に翻訳されるプレM配列(prM)を含む。この配列は、JEV粒子のアセンブリを細胞内で可能にする。次いで、このプレM配列は、遺伝子産物から切断されて、分泌前に成熟Mタンパク質を含むウイルス粒子を得る。関連するフラビウイルス(例えば、YFV、デング熱ウイルス、およびSLEV)は、同様のゲノム構造および機能を有する(例えば、図6および7を参照のこと)。
【0033】
本発明のフラビウイルスMおよびEタンパク質の重要なTUは、DNAである。前述の段落における議論に従って、このDNAは、同様に、プレM配列を含むMの遺伝子をコードする;このRNAはまた、Eタンパク質の遺伝子もまたコードする。このようにして、意図された遺伝子産物は、宿主細胞内でサブウイルス(subvirus)粒子を形成することを可能にする。次いで、宿主細胞は、完全なビリオンに関して生じるのと同様な様式で、プレM配列を切断し得る。
【0034】
インビボでのワクチンとして有効に機能するために、抗原をコードする配列の翻訳を増強または促進するという効果を有する制御配列を、核酸TU内に含むことは有利である。このようなプロモーターの使用は、分子生物学、細胞生物学、およびウイルス免疫学の分野の当業者には周知である「(「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第2版、Sambrook、FritschおよびManiatis、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989;ならびに「Current Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら、John Wiley and Sons,New York 1987(季刊誌)を参照のこと)。核酸TUは、哺乳動物宿主においてワクチンとして使用されることが意図されるため、使用されるプロモーターは、好ましくは、哺乳動物細胞において効率的に作動するプロモーターである。このようなプロモーターは、翻訳が促進される遺伝子に関して、このプロモーターがこのような翻訳を作動可能に促進し得る位置に配置される。本発明の重要な実施態様において、このプロモーターは、サイトメガロウイルス初期プロモーターである。さらに、本発明のさらに好ましい実施態様において、TU核酸において、遺伝子の後にターミネーター配列が続く(Sambrookら)。本発明の特定の実施態様は、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方に関する。多くのプロモーター配列は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて有用であることは公知である(Sambrookらを参照のこと)。
【0035】
本発明の核酸TUの調製は、分子生物学の分野の当業者に周知の方法により容易に達成される。関連する手順は、例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,NY、1989、ならびに「Current Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら、John Wiley and Sons,New York 1987(季刊誌)に記載される。フラビウイルスRNA分子は、例えば、フラビウイルス属および他の群のウイルスにもまた精通したウイルス学者に広く知られた方法により生存ウイルスのサンプルから単離され得る。JEVで使用される方法は、Kunoら(1990)に要約されている。逆転写酵素を使用して、cDNA合成のためのテンプレートとしてRNAを使用する。cDNAからプレM〜E遺伝子を含むフラグメント(図2を参照のこと)は、このようなフラグメントを提供するためにcDNAを適切に切断することが公知である制限ヌクレアーゼで消化することにより得られ得る。JEVの制限酵素消化の例は、例えば、Nitayaphanら(1990)およびKonishiら(1991)に提供される。プロモーター(例えば、サイトメガロウイルスプロモーター)およびポリアデニル化シグナルの組み込みは、同様に分子生物学および組換えDNA工学の当業者に周知である。所望の遺伝子および制御配列を含むTUを有する核酸分子が調製される場合、これは、核酸フラグメントを増幅する方法により多量に得られ得る。このような方法は、分子生物学および組換えDNA工学の当業者に広く公知である。これらの方法の例としては、細胞(例えば、原核生物細胞)において培養すること、および培養を完了した後にプラスミドを採取すること、ならびにポリメラーゼ連鎖反応を使用する方法による核酸フラグメントの増幅による複製のための、核酸フラグメントのプラスミドへの組み込みが挙げられる。これらの例は、TUを含む核酸が得られ得る方法を制限することを意図しない。
【0036】
本発明のTU含有核酸分子は、分子生物学およびウイルス免疫学の分野の当業者に周知の多くの方法において適切な宿主細胞へ導入され得る。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:宿主細胞により取り込まれるプラスミドまたは類似の核酸ベクターへの組み込み、またはリポソームのような小胞脂質構造(特に、カチオン性脂質を含むリポソーム)中へのカプセル化、またはエンドサイトーシスによって宿主細胞に取り込まれる粒子への吸着。
【0037】
一般に、宿主細胞は、核酸TUを有する原核生物細胞または真核生物細胞であるか、またはそこに、このようなTU分子は導入される。本発明のTUは、コードされたEおよびM抗原の細胞内生合成を誘導する。適切な宿主細胞は、核酸の導入の結果として遺伝子産物の生合成の能力を有する細胞である。本発明の特定の実施態様において、適切な宿主細胞は、TU内に含まれ得る制御配列およびターミネーター配列(あるとすれば)に応答する宿主細胞である。この様式で応答するために、このような宿主細胞は、制御配列およびターミネーターと相互作用し、そして機能の、それぞれ促進および終結を行うように作用する成分をその内部に含む。宿主細胞がインビトロで培養される場合、この宿主細胞は、原核生物であってもよいし、単細胞の真核生物細胞であってもよく、哺乳動物細胞であってもよい。本発明の特定の実施態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。これらの場合において、合成されたEタンパク質遺伝子産物およびMタンパク質遺伝子産物は、分析適用において、もしくは診断適用において、または証明目的のための使用が利用可能である。
【0038】
好都合な環境において、宿主細胞が培養哺乳動物細胞であるような場合、E抗原およびM抗原は、サブウイルス粒子の形態で分泌される。これらは、表面微細構造形態および免疫原性特性が生存ウイルスと似たEタンパク質およびMタンパク質の凝集物である。しかし、本発明の核酸TUはフラビウイルスゲノムの残りに含まれないため、取り込まれるキャプシドはなく、そして最も重要なことには、感染性ウイルスRNAがない。
【0039】
本発明の別の重要な実施態様において、この宿主細胞は、被験体の天然の細胞成分である。この被験体に対して、TUはワクチンとして投与される。そのように投与された場合、核酸TUは、被験体の細胞により取り込まれ、このことによってこれらの細胞は本明細書中で記載されるように宿主細胞になると理解される。被験体の細胞は、任意のプロモーター配列およびターミネーター(存在するとすれば)に応答する能力を有する。いずれの場合においても、TU核酸は、フラビウイルスのE遺伝子産物およびM遺伝子産物を合成するように被験体の細胞を誘導する。理論的考察により拘束されることは望まないが、インビトロで培養された哺乳動物宿主細胞で生じたことが見出されさえすれば、被験体の宿主細胞は、M抗原およびE抗原からなるサブウイルス粒子をインビボで生成すると考えられる。このよなサブウイルス粒子は、次いで、インビボで免疫原として作用し、被験体の免疫系を刺激して、被験体に防御免疫を付与する免疫学的応答を生成すると考えられる。再び、理論により制限されることは望まないが、得られる防御免疫は、体液性免疫または細胞性免疫のいずれかを介して(すなわち、それぞれ、MHCクラスII拘束機構またはMHCクラスI拘束機構のいずれかを介するか、あるいはその両方によるか)であり得る。
【0040】
本発明に従って、被験体は、被験体にM抗原およびE抗原の遺伝子をコードする核酸TUの有効量を投与することにより、フラビウイルス(例えば、JEV、YFV、デング熱ウイルス、およびSLEV)による感染に対して免疫され得る。この核酸は、被験体の細胞に組み込まれた後に、フラビウイルスのM抗原およびE抗原の合成を導く。
【0041】
核酸TUを被験体に投与するために、この核酸TUは、薬学的に受容可能なキャリアもまた含む組成物に組み込まれる。このようなキャリアは、薬学の当業者に周知である。それらとしては、注射用水、および一般的な生理学的緩衝液が挙げられる(Remington,Pharmaceutical Sciences)。それらはまた、薬学分野および免疫学分野の当業者に公知であるように、小胞またはリポソーム構造(特にカチオン性脂質を含むもの)を含み得る。
【0042】
有効量のワクチン接種組成物は、被験体に投与される場合、被験体に防御免疫を付与する量であることが、ウイルス免疫学分野の当業者により容易に決定される。このような決定を行うために、当業者は、ワクチンを投与した被験体の血液中に存在する、フラビウイルスのM特異的抗体およびE特異的抗体ならびに/またはフラビウイルスのM特異的細胞傷害性Tリンパ球およびE特異的細胞傷害性Tリンパ球を誘導する能力を評価し得る。さらに、生JEVでのチャレンジにより実験動物に付与された防御免疫のレベルを決定し得る。このようなチャレンジ実験は、ウイルス免疫学の当業者に周知である。一般に、JEV、YFV、デング熱ウイルス、またはSLEVによる感染に対して被験体を免疫するために、本発明に従って、そしてこのような方法において使用される核酸TUが、全体のサイズが異なり得ることを認識して、約0.1μg/kg体重〜約50μg/kg体重の範囲にわたる用量が使用され得る。
【0043】
DNAである本発明のTUが、単一の有効用量のTUのみの投与の後に、約100%の有効性レベルで防御免疫を付与することが見出されたことは予測外であった。このことは、1回以上の追加免疫ワクチン接種をしばしば必要とし、かつ有効性ほぼ100%まで防御免疫を付与し得ない従来のワクチンを使用して行った多くの免疫方法(上記)とは対照的であった。
【0044】
この防御免疫がワクチン接種した雌性被験体からこの被験体の子孫に移行し得ることが見出されたことはさらに予測外であった。新生仔マウスの有意な割合は、それらの母親が本発明のTU DNAを使用してワクチン接種した後のウイルスチャレンジに対して防御されることを示した。理論に制限されることは望まないが、種々の病原体に対して特異的な中和抗体が母乳に存在することに起因して、新生仔哺乳動物に受動免疫が付与され得ることは公知である。新生仔で見出されたJEVに対する防御免疫がこのようにして新生仔に移行した可能性がある。
【0045】
本発明の特定の実施態様は、以下の実施例において記載される。これらの例は、本明細書中で開示されるように本発明の範囲を限定することは意図されない。
【0046】
(実施例)
本発明の核酸TU分子を調製し、そしてこれを発現することに関して、分子生物学および組換えDNA技術を利用する一般的な方法は、例えば、「Current Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら、John Wiley and Sons,New York 1987(季刊誌)ならびに「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第2版、Sambrook、FritschおよびManiatis、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989に記載される。
【0047】
(実施例1.JEV prM抗原およびE抗原をコードする転写単位を含む組換えプラスミドの調製) ゲノムRNAを、QIAampTMウイルスRNAキット(Qiagen,Santa Clarita,CA)を使用してマウス脳から増殖させた150μLのJEV株SA 14ウイルス種から抽出した。RNA(シリカ膜に吸着させた)を80μLの、ヌクレアーゼを含まない水に溶出し、そしてJEV prM遺伝子コード配列およびE遺伝子コード配列の増幅のためのテンプレートとして使用した。プライマー配列をNitayaphanら(1980)の研究から得た。ゲノムヌクレオチド領域389〜2478を含む単一のcDNAフラグメントを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により増幅した。制限部位KpnIおよびXbaI、コンセンサスKozakリボソーム結合配列、ならびに翻訳開始部位を、アンプリフィアー(amplifier)14DV389(SEQ ID NO:1)によりcDNAの5’末端に操作した。インフレームの翻訳終結コドン、次いで、NotI制限部位を、アンプリフィアーc14DV2453(SEQ ID NO:2)によりcDNAの3’末端に導入した(図2を参照のこと)。ワンチューブ(one−tube)RT−PCRを、Titan RT−PCRキット(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)を使用して行った。10μLのウイルスRNAを、1μLの14DV389(50μM)および1μLのc14DV2453(50μM)ならびに18μLのヌクレアーゼを含まない水を混合し、そしてこの混合物を85℃で5分間加熱し、次いで、4℃に冷却した。75μLの反応混合物[20μL 5×緩衝液、2μLのdNTP混合物(それぞれ10mM)、5μLのジチオスレイトール(0.1mM)、0.5μLのRNasinTM(40U/μL、Boehringer Mannheim)、2μLのポリメラーゼ混合物、および45.5μLのヌクレアーゼを含まない水]を添加し、そしてRT−PCRを以下のとおり行った:1サイクル(50℃で30分、94℃で3分、50℃で30秒、68℃で2.5分)、9サイクル(94℃で30秒、50℃で30秒、68℃で2.5分)、20サイクル(94℃で30秒、50℃で30秒、最初のサイクルにおいて68℃で2.5分(この後、1サイクル毎に5秒ずつ増加させる))、そして68℃で15分の最後の伸長。RT−PCR産物をQIAquickTMPCR精製キット(Qiagen)により精製し、そして50μLの1mM Tris−HCl、pH7.5で溶出した。
【0048】
すべてのベクターの構築および分析を、標準的な技術(Sambrookら、1989)を用いて行った。KpnIおよびNotIヌクレアーゼを用いて消化したRT−PCR増幅されたcDNAを、真核生物発現プラスミドベクター(pCDNA3、Invitrogen、Carlsbad、CA)のKpnI−NotI部位に挿入した。エレクトロポレーションにコンピテントなEscherichia coli XL1−Blue細胞(Stratagene、La Jolla、CA)を、エレクトロポレーション(Gene PulserTM、Bio−Rad、Hercules、CA)によって形質転換し、そして100μg/mLのカルベニシリン(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)を含むLB寒天プレート上にプレーティングした。クローンを拾い上げ、そして100μg/mLのカルベニシリンを含む3mLのLBブロス中に接種した。プラスミドDNAを、14時間培養物から、QIAprepTMSpin Miniprep Kit(Qiagen)を使用して抽出した。自動化DNA配列決定を、推奨されるように(Applied Biosystems/Perkin Elmer、Foster City、CA)実行した。cDNAの両方の鎖を配列決定し、そしてもともとのSA14株についての配列(Nitayaphanら、1990)と同一であることを示した。
【0049】
プラスミドpCDNA3(Invitrogen、Carlsbad、CA)の、fl ori、SV40 ori、ネオマイシン耐性遺伝子、およびSV40ポリ(A)エレメントを含むヌクレオチド(nt)1289〜nt3455までのフラグメントを、PvuII消化により欠失させ、次いで連結してpCBampプラスミドを生成した。pCBampのNcoI/KpnI部位にキメライントロン挿入を含むベクターpCIBampを、NotIおよびKpnIを用いる消化によってpCI(Promega、Madison、WI)からのイントロン配列を切り出すことによって構築した。生じる566bpフラグメントを、NotI−KpnIを用いて消化してその289bpフラグメントを置き換えることによってpCBampにクローニングした。図3は、プラスミドpCDA3、プラスミドpCBampおよびプラスミドpCIBampの間の関係を表す。
【0050】
これらのプラスミドから、JEV prMタンパク質およびEタンパク質をコードする転写単位を含むプラスミドを調製した。pCDNA3ベクター由来の組換えプラスミドpCDJE2−7のJEV prMコード領域およびEコード領域を含むcDNAフラグメントを、NotIおよびKpnIまたはXbaIを用いる消化によって切り出し、そしてpCBamp、pCIBamp、pCEP4(Invitrogen、Carlsbad、CA)もしくはpREP4(Invitrogen、Carlsbad、CA)のKpnI−NotI部位、またはpRc/RSV発現ベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA)のSpeI−NotI部位にクローニングして、それぞれpCBJE1−14、pCIBJES14、pCEJE、pREFE、およびpRCJEを作製した。各々のプラスミドのクローン由来のcDNAの両方の鎖を配列決定し、そして正しいヌクレオチド配列を有する組換えクローンを同定した。哺乳動物細胞のインビトロ形質転換またはマウス免疫実験における使用のためのプラスミドDNAを、EndoFreeTMPlasmid Maxi Kit(Qiagen)を使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【0051】
(実施例2:種々の組換えプラスミドによって発現されるJEV prMタンパク質およびEタンパク質の間接的免疫蛍光抗体アッセイを用いる評価) 種々の組換え発現プラスミドによるJEV特異的遺伝子産物の発現を、間接的免疫蛍光抗体アッセイ(IFA)によって、COS−1、COS−7、およびSV−T2(それぞれ、ATCC、Rockville MD;1650−CRL、1651−CRL、および163.1−CCL)の、一過性にトランスフェクトされた細胞株において評価した。SV−T2細胞株をさらなる試験から除外した。なぜなら、予備的な結果が、形質転換されたSV−T2細胞の1〜2%のみがJEV抗原陽性であることを示したからである。形質転換のために、細胞を、150cm2培養フラスコ中で75%コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン処理し、そして4℃でリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に再懸濁させて、最終細胞数を1mLあたり5×106にした。10μgのプラスミドDNAを、150V、960μF、および100Ω抵抗に設定したBioRad Gene PulseTM(Bio−Rad)を用いて、300μLの細胞懸濁物中にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの5分後、細胞を25mLの新鮮な培地で希釈し、そして75cm2フラスコ中に播種した。形質転換の48時間後、培地を細胞から取り除き、そしてその細胞をトリプシン処理し、そして3%正常ヤギ血清を有する5mL PBS中に再懸濁した。10μLのアリコートをスライド上にスポットし、風乾し、そして−20℃で20分間アセトンを用いて固定した。IFAを、プラスミドで形質転換しアセトン固定した細胞を用いて、フルオレセインイソチオシアネート結合体化ヤギ抗マウス免疫グロブリンG(Sigma Chemical Co.)およびJEV HIAFを使用して行った。
【0052】
JEV prMタンパク質およびEタンパク質の発現に対する種々のプロモーターおよびポリ(A)エレメントの影響を決定するために、COS−1細胞株およびCOS−7細胞株を、等量のpCDJE2−7プラスミドDNA、pCEJEプラスミドDNA、pREJEプラスミドDNA、またはpRCJEプラスミドDNAによって一過性に形質転換した。JEV抗原は、4つすべての組換えプラスミドによって形質転換した両方の細胞株において発現され、従ってCMVまたはRSV(ラウス肉腫ウイルス)のプロモーターおよびBGHまたはSV40のポリ(A)エレメントが機能的に活性であることが確認された。しかし、IFA陽性細胞の数およびIFA強度によってそれぞれ決定されるような、形質転換された細胞のパーセンテージおよび発現されたJEV抗原のレベルは、種々のプラスミドの間で大きく異なっていた(表1を参照のこと)。pCDJE2−7、pCBJE1−14、およびpCIBJES14によって形質転換された著しく高いパーセンテージのCOS−1細胞は、JEV抗原を発現し、そしてその発現されたタンパク質のレベルは、JEV感染細胞に匹敵した。他方、pCEJEベクター、pREJEベクター、またはpRCJEベクターを用いてトランスフェクトされた細胞は、低いパーセンテージの抗原発現細胞、ならびに低い強度の蛍光を有した。このことは、抗原の弱い発現を示す。
【0053】
pCDJE2−7によって増強されたJEVタンパク質発現がSV−40によってコードされる真核生物の複製起点によって影響を受けたか否かを確認するために、プラスミドpCBJE1−14が構築され、その結果、pCDJE2−7由来のfl ori、SV40 ori、ネオマイシン耐性遺伝子、およびSV40ポリ(A)エレメントを含む2166bpのフラグメントが欠失された。次いで、キメライントロンをpCBJE1−14に挿入して、pCIBJES14を生成した。このpCIBJES14プラスミドを、JEVタンパク質の発現がイントロン配列によって増強され得るか否かを決定するために使用した。形質転換後、pCBJE1−14ベクターおよびpCIBJES14ベクターの両方を保有する細胞は、pCDJE2−7を用いて観察されたのと同様のレベルのJEV抗原を発現した(表1を参照のこと)。この結果は、組換えベクターによるJEV prM抗原およびE抗原の発現は、転写調節エレメントによってのみ影響を受けることを示す。真核生物の複製起点もイントロン配列もいずれも、使用された細胞においてJEV抗原発現を増強しなかった。CMVプロモーターおよびBGHポリ(A)を含むベクター(図3を参照のこと)を、さらなる分析のために選択した。
【0054】
【表1】
(実施例3:インビトロで形質転換された、JEV特異的遺伝子産物を構成的に発現する安定な細胞株の選択) 先の実施例において記載されたように、COS−1細胞を、10μgのpCDJE2−7 DNAを用いて、エレクトロポレーションによって形質転換した。非選択培養培地中での24時間のインキュベーション後、細胞をネオマイシン(0.5mg/mL、Sigma Chemical Co.)を用いて処理した。2〜3週間後に見えるようになったネオマイシン耐性コロニーを、ネオマイシン含有培地中での限界希釈によってクローニングした。ベクターにコードされるJEV遺伝子産物の発現を、最初にJEV HIAFを用いるIFAによってスクリーニングした。1つのJEV−IFA陽性クローン(JE−4B)および1つの陰性クローン(JE−5A)をさらなる分析のために選択し、そして200μg/mLのネオマイシンを含有する培地中で維持した。
【0055】
JE−4Bクローンによって発現されるJEV Eタンパク質の確実性を、JEV E特異的マウスモノクローナル抗体(Mab)(Kimura−Kurodaら、J.Virol.45、124−132(1983);Kimura−Kurodaら、J.Gen.Virol.67、2663−2672(1986);Zhangら、J.Med.Virol.29、133−138(1989);およびRoehrigら、Virol.128、118−126(1983))のパネルを使用するIFAによるエピトープマッピングによって実証した。JEV HIAFおよび正常マウス血清を、陽性抗体コントロールおよび陰性抗体コントロールとしてそれぞれ使用した。4つのJEV特異的Mab、6つのフラビウイルス亜群特異的Mab、および2つのフラビウイルス群反応性Mabが、4BクローンまたはJEV感染COS−1細胞と同様に反応した(表2を参照のこと)。
【0056】
【表2】
(実施例4:JE−4B COS−1細胞株によって分泌されるサブウイルス粒子の抗原性特性および免疫学的検出)
(a.サブウイルス粒子の調製) JE−4B COS−1細胞を、200μg/mLのネオマイシンを含む培地中で増殖させ、そして維持した。培養した培地を、慣用的に収集し、そして4℃で保存し、そして週に2回補充し、そしてその細胞を7〜10日毎に1:5に分割した。培養培地を、Sorvall F16/250ローター中にて4℃で、10,000rpmで30分間の遠心分離により清澄化し、そしてさらにSorvall TH641ローター中にて、4℃で、5%ショ糖クッション(w/w、10mM Tris−HCl、pH 7.5、100mM NaCl(TN緩衝液)を用いて調製した)を通して39,000rpmで4時間遠心分離した。細胞内粒子を含むペレットを、TN緩衝液中で再懸濁し、そして4℃で保存した。あるいは、7%または10%(w/v)のPEG−8000を、清澄化した培養培地に添加した。この混合物を4℃で少なくとも2時間攪拌し、そして沈殿した粒子を10,000rpm、30分間の遠心分離によって収集した。沈殿をTN緩衝液中に再懸濁し、そして4℃で保存した。サブウイルス粒子を、TN中の5〜25%連続ショ糖勾配中の、4℃における38,000rpm、90分間の速度レートゾーン遠心分離(rate zonal centrifugation)によって、ペレット化した調製物およびPEG沈殿させた調製物の両方から精製した。1mLの画分を、勾配の上端から収集し、抗原捕捉ELISA(以下を参照のこと)によって試験し、そして陽性画分をTN中の25〜50%ショ糖勾配にロードした。これを、4℃で35,000rpmの平衡密度遠心分離で一晩遠心分離した。平衡勾配からの0.9mLの画分を、下端から収集した。これらを抗原捕捉ELISAによって試験し、そしてpH 6.6における赤血球凝集(HA)活性について評価した。各画分の100μLのアリコートを正確に秤量し、その密度を決定した。ELISA陽性画分をプールし、そして4℃、39,000rpm、3〜4時間でペレット化し、そしてそのペレットをTN緩衝液中に再懸濁した。抗原捕捉ELISAおよびHA力価を、ペレット化したサンプルで決定した。JEV感染COS−1細胞上清もまた、上記に詳述されるような同様の精製プロトコルに供し、そして勾配分析についての陽性コントロールとして使用した。JEビリオンをまた、グリセロール/酒石酸平衡勾配中の沈降によって、感染5〜6日後の感染したC6/36細胞から精製した。
【0057】
(b.サブウイルス粒子のウェスタンブロット) サブウイルス粒子の勾配精製したサンプルを、電気泳動サンプル緩衝液と混合し、そしてLaemmli(Nature 277、680−685(1970))によって記載されるように、ドデシル硫酸ナトリウムを含む10または12.5%ポリアクリルアミドゲル(SDS−PAGE)上で泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、そしてポリクローナルJEV HIAF、フラビウイルス交叉反応性抗E Mab 4G2(Henchalら、Amer.J.Trop.Med.Hyg.31、830−836(1982))、またはマウス抗prMペプチド超免疫血清(JM01、Chiuehら、未公開結果)を用いて免疫化学的に検出した。図4は、JEVに感染したC6/36細胞およびJE−4B COS−1細胞によって産生されるMタンパク質とEタンパク質との比較を示す。Eタンパク質に対するいくつかの非特異的な反応性が、正常マウス腹水およびJmol抗ペプチド血清中で観察された。MおよびEに対してサイズが同一であるタンパク質は、サブウイルス粒子中で分泌され、そしてE特異的Mab 4G2およびprM特異的JM01抗血清によってそれぞれ検出され得る。
【0058】
(c.培養培地中のJEVサブウイルス粒子の密度勾配検出) ELISAのために、抗原捕捉抗体(4G2)を、0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液、pH 9.6中で希釈し、96ウェルマイクロタイタープレート(Immulon II、Dynatech、Chantilly、VA)を、4℃で一晩のインキュベーションによりコートするために使用した。PBS中の3%正常ヤギ血清を用いてブロッキングした後、2倍連続希釈サンプルを、4G2コートしたプレートに添加し、そして37℃で1.5時間インキュベートした。捕捉された抗原を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化6B6C−1 Magによって検出し、そして37℃で1時間インキュベートした。次いで、固相における酵素活性をTMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)−ELISA(Life Technologies、Grand Island、NY)を用いて検出した。
【0059】
JE−4B細胞の15×150cm2フラスコからの細胞培養培地の約500mLを、細胞を播種してから4日後に収集した。PEG沈殿させたサブウイルス粒子を、2mLのTN緩衝液、pH 7.5中に再懸濁し、この再懸濁したペレットの0.7mLアリコートを、5〜25%ショ糖勾配にロードした。サブウイルス粒子を破壊するTriton X−100を、別の0.7mLのアリコートに、0.1%の最終濃度で添加し、そしてこれを0.1% Triton X−100を含むTN緩衝液中で調製した5〜25%ショ糖勾配にロードした。明確な不透明なバンドが、Triton X−100を含む勾配の上端から約2.5cmで観察されたが、界面活性剤を含まない勾配中では観察されなかった。画分(1mL)を各勾配の上端から下端まで収集し、そして抗原捕捉ELISAによって分析した(図5)。抗原は画分4〜6中で検出された。このことは、サブウイルス粒子に特徴的な比較的迅速な沈降を示す。JE−4B培養培地からのPEG沈殿物のTriton X−100による処理により、ELISA反応性の物質の位置が、勾配の上端に移動した。このように、Triton X−100による処理は、ゆっくりと沈降する分子のみを産生する。同様な知見は、Konishiら、1992(Virol.188:714−720)によって報告された。これらの結果は、prM/MおよびEを含む迅速に沈降するサブウイルス粒子は、界面活性剤処理によって破壊され得ることを示す。
【0060】
HA活性を、ClarkおよびCasalsの方法(Amer.J.Trop.Med.Hyg.7:561−573(1958))によって、6.1〜7.0のpH範囲で測定した。JE−4B細胞によって分泌されるサブウイルス粒子およびJEVに感染したCOS−1細胞によって産生されるビリオン粒子は、6.6であると決定された最適pHを有する同様のHAプロフィールを有した。
【0061】
(実施例5:本発明のpCDJE2−7核酸ワクチンおよび市販のJEVワクチンでワクチン接種したマウスにおける免疫応答の比較)5匹の3週齢の雌性ICR非近交系マウスの群に、100μLのdH2O中のpCDJE2−7プラスミドの100μgを用いて、左および右四頭筋に筋肉内注射するか、またはJE−VAX(阪大微生物病研究所で製造され、そしてConnnaught Laboratories、Swiftwater、PAにより販売される)の皮下投与(ヒトへの投与量の1/5である)を行った。関連しないタンパク質をコードしそして発現するプラスミドpCDNA3/CAT(Invitrogen)を、陰性のワクチン接種コントロールとして用いた。pCDJE2−7でワクチン接種したマウスの1つの群を除いて、全ての動物を、3週間後、さらなる用量のプラスミドまたはJE−VAXで、追加免疫(ブースト)した。マウスを、接種後、3、6、9、23、40および60週で後眼窩洞から採血した。JEV抗体力価を、精製JEVに対する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、またはプラーク減少中和試験(PRNT)(Roehringら、Virol.171 49〜60(1989)ならびにHuntおよびCalisher、Amer J Trop.Med.Hyg.28:740〜749(1979))により決定した。
【0062】
pCDJE2−7核酸ワクチンおよびJE−VAXは、マウスのすべての3つの群において第1のワクチン接種後3週間で100%のセロコンバージョンを提供した(表3)。JEVのELISAおよびPRNT抗体力価は、免疫後それぞれ6週および9週で最高レベルに達した。1用量のDNAワクチンを投与されたマウスは、2用量を投与されたマウスと類似の抗体応答を有した。匹敵するELISA抗体力価は、DNAワクチン接種群において60週まで維持され、その後実験を終了した。しかし、JE−VAX群における4匹のマウスの1匹のみが接種後60週でJEV抗体陽性であった。pCDNA3/CATコントロール群は、どんな測定可能なJEV抗体も有さなかった。これらの結果は、JEV特異的核酸ワクチンの単回用量が、市販のFDA承認のJE−VAXワクチンよりも、マウスにおいてJEV抗体を維持することにおいてより効果的であることを実証する。
【0063】
【表3】
(実施例6:異なる年齢での、ワクチン接種の効力についての、本発明の種々の核酸ワクチン構築物および市販のJEVワクチンの比較)類似のレベルのJEVタンパク質をpCDJE2−7 pCBJE1−14またはpCIBJES14のいずれかにより形質転換したCOS−1細胞により発現させた。これらの核酸構築物によるJEV抗体誘導を、ワクチン接種で2つの異なる年齢でJE−VAX市販ワクチンと比較した。3日(雌性、雄性とも混在)または3週齢(雌性)のICR非近交系マウス(1群あたり10匹)を50または100μgのプラスミドDNAを用いて筋肉内に、またはヒトへの投与量の1/10または1/5であるJE−VAXの用量を用いて皮下にワクチン接種した。血清標本を免疫後3および7週で収集し、そして抗原として精製されたJEVを用いてELISAにより1:1600希釈で試験した。結果を表4に示す。
【0064】
プラスミドpCBJE1−14は、最高程度のセロコンバージョン(すなわち、1:1600より大きい抗体力価)を提供した。これは、ワクチン接種の両方の年齢で80〜100%を達成する。pCDJE2−7またはpCIBJES14の投与は、3日齢のマウスをワクチン接種した場合、7週で中度のセロコンバージョン(それぞれについて60%)を提供したが、ワクチン接種の3週後に測定した場合はより弱いセロコンバージョン(それぞれ40%および10%)を提供した。しかし、これらのプラスミドを3週齢で投与した場合、90%または100%のセロコンバージョンをワクチン接種後3週および7週の両方で獲得した。対照的に、市販のワクチンであるJE−VAXは、3日齢で投与された場合、セロコンバージョンを付与せず、そして3週齢で投与された場合、100%であった。このようにJEV prMおよびEについてのTUの核酸は、市販のワクチンの非常に高用量より良好なセロコンバージョンの程度、そして若年およびより成熟した動物の両方において予想外に高いセロコンバージョンを提供した。
【0065】
【表4】
(実施例7.本発明の核酸ワクチンにより付与される防御的免疫) 実施例6由来の3日齢のワクチン接種群を、マウス順応性JEV株SA14の50,000pfu/100μLの腹腔内注射により、ワクチン接種の7週後チャレンジし、そして3週間観察した。種々の核酸TU含有ワクチン構築物を投与した群において、21日目まで100%の防御を達成した(表5)。対照的にJE−VAXワクチン接種マウスの60%およびpCDNA3/CATワクチン接種陰性コントロールの70%は、21日のウイルスチャレンジに生存しなかった。これらの結果は、本発明のこの核酸TUが、予想外に、ワクチン接種されたマウスに効果的な防御を付与したことを示唆する。これは、本発明の核酸ワクチンの、ヒトの幼児期ワクチンとしての使用の可能性を示唆する。対照的に、現在用いられる不活化ヒトワクチンであるJE−VAXは、若年の動物においては効果的でないようである。
【0066】
【表5】
(実施例8:母性抗体力価に相関する胎仔マウスの受動的防御) 3週齢の雌性ICRマウスを、pCDJE2−7プラスミドDNA(100μg/100μL)から2日間空けて1用量または2用量のいずれかでワクチン接種するか、またはヒトの1/5の用量であるJE−VAXの2用量でワクチン接種した。陰性コントロール群には、pCDNA−3/CATプラスミドの100μg/100μLの2用量を投与した。母性抗体による受動防御を、実験の雌性マウスと非免疫の雄性マウスとの交配(初めのワクチン接種後9週または第2のワクチン接種後6週で生じた)から得られる仔において評価した。仔を、マウス適合SA14ウイルスの5,000pfu/100μLの腹腔内投与により、生後3〜15日でチャレンジし、そして3週間毎日観察した(表6を参照)。生存率は、母性中和抗体力価と相関した。1:80のPRNTを有する母により授乳された仔の100%がウイルス感染に対して生存したが、コントロールの母からの仔は全く生存しなかった(表6)。それぞれ、1:20および1:40のPRNT力価を有する母により授乳された、より齢上の仔において、45%および75%の部分的防御を観察した。生存率はまた、仔が免疫母体から授乳された時間の長さと相関した。ちょうど示されるように、13〜15日齢の仔は高い生存率を有した。しかし、3〜4日齢の仔は、母体が1:20または1:40のPRNT力価を有した場合、ウイルスチャレンジに対して全く生存しなかった。このように母性抗体は、子孫に部分的防御免疫〜完全防御免疫を提供する。さらに、JEV抗体を、ELISAにより、チャレンジ後の仔の血清の97%(29/30)において検出した。
【0067】
【表6】
(実施例9:黄熱病ウイルス(YFV)またはセントルイス脳炎ウイルス(SLEV)のprMおよびEタンパク質のコード配列を含む組換えプラスミドの調製) pCDJE2−7組換えプラスミド構築に類似の戦略を用いて、YFVおよびSLEVの組換えプラスミドを調製した。ゲノムRNAを、Q1AampTMViral RNAキット(Qiagen、Santa Clarita、CA)を用いて、150μLのYFV株TRI−788379またはSLE株78V−6507ウイルス種から抽出した。このウイルスRNAを、YFVまたはSLEV prMおよびE遺伝子コード領域の増幅のための鋳型として用いた。増幅されたYFVおよびSLEV DNA産物のプライマー配列および構造をそれぞれ、図6および7に示す。RT−PCRで増幅したcDNA(KpnIおよびNotI酵素で消化された)を真核生物の発現プラスミドベクター、pCDNA3(Invitrogen)のKpnI−NotI部位に挿入した。cDNAの両方の鎖を配列決定し、そしてYFV株TRI−788379またはSLEV株78V−6507(未公表;Chang,1998)由来の配列に対する同一性を確認した。組換えプラスミドpCDYF2およびpCDSLE4−3(それぞれ、YEVまたはSLEVのprMおよびEのコーディング領域のヌクレオチド配列を含んだ)を、EndoFreeTMPlasmid Maxi Kit(Qiagen)を用いて精製し、そしてインビトロ形質転換またはマウス免疫に用いた。
【0068】
YFVまたはSLEV特異的抗原を、それぞれ、pCDYF2またはpCDSLE4−3により形質転換されたCOS−1細胞において発現した(図8)。発現されたタンパク質のレベルは、YFV感染COS−1細胞コントロールまたはSLEV感染COS−1細胞コントロールと類似であった。JEVモデルと同様に、ウイルス抗原の遺伝子を保有するベクターにより形質転換された、YFVまたはSLEV抗原性タンパク質を構成的に発現する、COS−1細胞株を得た。YFVまたはSLEV E特異的Mabのパネルを用いるIFAによるエピトープマッピングは、真正のEタンパク質がpCDYF2かまたはpCDSLE4−3により形質転換されたCOS−1細胞により発現されたことを示した。予備研究は、3週齢の雌性ICRマウスの100%が、脱イオン水中の100μg/100μLのpCDSLE4−3プラスミドの単回用量での筋肉内接種後、セロコンバージョンされたことを示した。
【0069】
(実施例10:デング2型構造タンパク質のコード配列を含むプラスミドの調製) JEVについて実行された手順(実施例1を参照のこと)と同様の手順に従って、デング2型抗原の核酸TUを含むベクターを調製する。
【0070】
prMからEへのデング2型遺伝子領域を含むプラスミドを構築する。デング2型のprMおよびEの遺伝子(Deubelら、Virology 155:365〜377(1986);Gruenbergら、J.Gen.Virol.69:1301〜1398(1988);Hahnら、Virology 162:167〜180(1988))をpCDNA3のようなプラスミドに連結させ、次いで、切除し、そしてpCBamp、pCEP4、pREP4、またはpRc/RSV(Invitrogen、Carlsbad,CAにより供給)のようなベクターにクローニングし、発現可能にした。必要に応じて、cDNA配列にコードされるデング2型ウイルス特異的配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような手順を用いて増幅され得る。あるいは、ウイルスRNAが遺伝子領域の供給源である場合、DNA配列は逆転写酵素PCR手順により増幅され得る。5’末端で開始コドンおよび3’末端で終止コドンを含むDNAフラグメントを、サイトメガロウイルス(CMV)前初期(IE)プロモーター、開始コドンおよびターミネーターがデング2型ウイルス配列に作動可能に連結されるような方法で、適切な制限ヌクレアーゼ特異的部位で発現ベクターにクローニングする。
【0071】
(実施例11:デング2型DNAワクチンを用いるマウスのワクチン接種) 実施例10において調製されたprM〜Eの遺伝子領域をコードするデング2型核TUワクチンを、注射用水または緩衝化生理食塩水のような適切な薬学的キャリアに懸濁し、そして離乳マウスの群に筋肉内注射する。コントロール群には、デング2型特異的遺伝子を欠失する同等のプラスミド調製物を投与する。デング2型特異的抗体の生成および/またはデング2型特異的な免疫系の細胞傷害性細胞を以後、固定した間隔(例えば、毎週の間隔)で評価する。核酸TUワクチンの投与後約2〜4ヶ月で、マウスをデング2型ウイルスでチャレンジする。ウイルス血症のレベルを、以後、適切な間隔(例えば、2日ごと)に評価する。母性抗体による受動的防御を図8に示すように評価する。
【図面の簡単な説明】
【図1】 フラビウイルスポリプロテインプロセッシングの概略図である。中央の水平領域は、ウイルスゲノムの概略図を提供する。直線は、5’および3’非翻訳領域を示し、そして箱で囲った領域は、構造タンパク質(左および上)および非構造タンパク質(右および下)のオープンリーディングフレームを示す。宿主細胞シグナラーゼによる切断は、構造領域および非構造領域を分離するEタンパク質C末端におけるトランスローケーションと同時に起こる。ズブチラーゼ様細胞酵素であるフリン(furin)が、prM切断の原因であり得る。ウイルスポリプロテインの潜在的な膜貫通ドメインが斜線領域により示される。
【図2】 JEVゲノムのマップ(上)、prM−Eタンパク質コード領域(下)の発現のための転写単位を構築するために逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で用いたオリゴヌクレオチドのDNA配列(中)を示す図である。ウイルスポリプロテインの潜在的な膜貫通ドメインが斜線領域により示される。
【図3】 プラスミドベクターpCDNA3、pCBamp、およびpCIBamp、およびそれらの間の関係を示す概略図である。これらのプラスミドは、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター/エンハンサーエレメント、BGHp(A)(ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列)、E.coliにおける選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子およびColE1複製起点を含む。E.coli細胞中の一本鎖レスキューのためのf1複製起点、SV40複製起点(SV40 ORI)、ネオマシン耐性コード領域、およびSV40p(A)配列をpCDNA3から欠失し、pCBampを生成した。イントロン配列を、pCBampのNcoI−KpnI部位中に挿入し、プラスミドpCIBampを生成した。CMVプロモーター/エンハンサーのTATAボックスと、BGHp(A)との間に位置する、フラビウイルス構造タンパク質遺伝子の挿入のための多重クローニング部位を示す。
【図4】 JE−4B COS−1培養液からのスクロース勾配精製サブウイルス粒子のSDS−PAGE−イムノブロット分析を示す図である(4B、各ペアの右のレーン)。JEV感染C6/36細胞培養からの密度勾配精製JEビリオンをポジティブコントロールとして用いた(JEV、各ペアの左レーン)。JE HIAF(超免疫腹水(ascetic));4G2、抗Eモノクローナル抗体;JM01、抗Mモノクローナル抗体;NMAF(正常マウス腹水)。
【図5】 Triton X−100処理ありまたはなしで、JE−4B細胞培養培地のPEG沈殿物から調製された比率ゾーンスクロース勾配分析におけるE抗原のプロフィールを示す図である。
【図6】 黄熱病ウイルス(YFV)ゲノム(上)のマップ、およびYFV prM−Eタンパク質コード領域(下)の発現のための転写単位を構築するための逆転写酵素−PCRに用いたオリゴヌクレオチドのDNA配列(中)を示す図である。ウイルスポリプロテインの潜在的な膜貫通ドメインが斜線領域により示される。
【図7】 St.Louis脳炎ウイルス(SLEV)ゲノムのマップ(上)、およびSLEV prM−Eタンパク質コード領域(下)の発現のための転写単位を構築するための逆転写酵素−PCRに用いたオリゴヌクレオチドのDNA配列(中)を示す図である。ウイルスポリプロテインの潜在的な膜貫通ドメインが斜線領域により示される。
【図8】 YFVまたはSLEV HIAFのいずれかを用いる間接免疫蛍光抗体アッセイ(IFA)により検出されたYFまたはSLEウイルスタンパク質の写真を示す。ウイルスタンパク質prMおよびEは、それぞれ、pCDYF2またはpCDSLE4−3により形質転換されたCOS−1細胞中で発現された。
【配列表】
Claims (26)
- 免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子であって、ここで、該転写単位は、宿主細胞に取り込まれた後に、該宿主細胞に該免疫原性抗原の合成を指向し;
該免疫原性フラビウイルス抗原は、Mタンパク質およびEタンパク質の両方であり;
該転写単位がK−pr−M−Eの構造を有する、核酸分子であって、
ここでKは、GCCGCCGCCからなるコンセンサスKozakリボソーム結合配列であり;
pr−Mは、プレM配列を含むMタンパク質をコードする配列であり;
Eは、Eタンパク質をコードする配列である、
核酸分子。 - 前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング熱1型ウイルス、デング熱2型ウイルス、デング熱3型ウイルス、デング熱4型ウイルス、および日本脳炎ウイルス(JEV)からなる群より選択される、請求項1に記載の核酸分子。
- DNA分子である、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記転写単位が、適切に配置された制御配列をさらに含み、この結果、該制御配列がM抗原およびE抗原の発現を作動可能に制御する、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記制御配列が、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである、請求項4に記載の核酸分子。
- 前記転写単位が、ポリAターミネーターをさらに含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を保持する宿主細胞であって、ここで、該転写単位は、該宿主細胞に該免疫原性抗原の合成を指向し;
該免疫原性フラビウイルス抗原は、Mタンパク質およびEタンパク質の両方であり;
該転写単位がK−pr−M−Eの構造を有する、宿主細胞であって、
ここでKは、GCCGCCGCCからなるコンセンサスKozakリボソーム結合配列であり;
pr−Mは、プレM配列を含むMタンパク質をコードする配列であり;
Eは、Eタンパク質をコードする配列である、
宿主細胞。 - 前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング熱1型ウイルス、デング熱2型ウイルス、デング熱3型ウイルス、デング熱4型ウイルス、およびJEVからなる群より選択される、請求項7に記載の宿主細胞。
- フラビウイルスの免疫原性抗原の転写単位を含む核酸分子を含む、該フラビウイルスに対して被験体をワクチン接種するための組成物であって、ここで、該転写単位は、該被験体の体内の細胞に取り込まれた後、該細胞に該免疫原性抗原の合成を指向し、かつここで、該組成物はさらに薬学的に受容可能なキャリアを含み;
該フラビウイルスの該免疫原性抗原は、Mタンパク質およびEタンパク質の両方であり;
該転写単位がK−pr−M−Eの構造を有する、組成物であって、
ここでKは、GCCGCCGCCからなるコンセンサスKozakリボソーム結合配列であり;
pr−Mは、プレM配列を含むMタンパク質をコードする配列であり;
Eは、Eタンパク質をコードする配列である、
組成物。 - 前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング熱1型ウイルス、デング熱2型ウイルス、デング熱3型ウイルス、デング熱4型ウイルス、およびJEVからなる群より選択される、請求項9に記載のワクチン接種組成物。
- 前記核酸分子がDNA分子である、請求項9に記載のワクチン接種組成物。
- 前記転写単位が、適切に配置された制御配列をさらに含み、この結果、前記核酸が前記被験体の前記細胞に導入された場合、該制御配列がM抗原およびE抗原の発現を作動可能に制御する、請求項9に記載のワクチン接種組成物。
- 前記制御配列が、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである、請求項12に記載のワクチン接種組成物。
- 前記転写単位が、ポリAターミネーターをさらに含む、請求項9に記載のワクチン接種組成物。
- フラビウイルスによる感染に対して被験体を免疫するための組成物であって、免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を含む、ワクチン接種組成物であり、ここで、該転写単位は、該被験体の体内の細胞に取り込まれた後、該細胞に該免疫原性抗原の合成を指向し、かつここで、該組成物はさらに薬学的に受容可能なキャリアを含み;
該免疫原性フラビウイルス抗原は、Mタンパク質およびEタンパク質の両方であり;
該転写単位がK−pr−M−Eの構造を有する、組成物であって、
ここでKは、GCCGCCGCCからなるコンセンサスKozakリボソーム結合配列であり;
pr−Mは、プレM配列を含むMタンパク質をコードする配列であり;
Eは、Eタンパク質をコードする配列である、
、組成物。 - 前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング熱1型ウイルス、デング熱2型ウイルス、デング熱3型ウイルス、デング熱4型ウイルス、およびJEVからなる群より選択される、請求項15に記載の被験体を免疫化するための組成物。
- 前記ワクチン接種組成物が単回用量で被験体に投与するに適切に処方される、請求項15に記載の被験体を免疫化するための組成物。
- 非経口経路での投与のための組成物である、請求項15に記載の組成物。
- 前記核酸分子がDNA分子である、請求項15に記載の被験体を免疫するための組成物。
- 前記転写単位が、適切に配置された制御配列をさらに含み、この結果、該制御配列がM抗原およびE抗原の発現を作動可能に制御する、請求項15に記載の被験体を免疫するための組成物。
- 前記制御配列が、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである、請求項20に記載の被験体を免疫するための組成物。
- 前記転写単位が、ポリAターミネーターをさらに含む、請求項15に記載の被験体を免疫するための組成物。
- 前記フラビウイルスが、St.Louis脳炎ウイルスである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記フラビウイルスが、St.Louis脳炎ウイルスである、請求項7に記載の核酸前駆体を保持する宿主細胞。
- 前記フラビウイルスが、St.Louis脳炎ウイルスである、請求項9に記載のワクチン接種組成物。
- 前記フラビウイルスが、St.Louis脳炎ウイルスである、請求項15に記載のフラビウイルスによる感染に対して被験体を免疫するための組成物。
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