JPS63105682A - デングウイルス３型由来のｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、デング出血熱又はデングショック症候群を惹
起するデングウィルス３型の遺伝情報を担うデングウィ
ルス３型のゲノムＲＮＡ由来のｃＤＮＡに関するもので
ある。

〔従来技術〕

デングウィルスによる感染症は、ネッタイシマカ或いは
ヒトスジシマ力によって媒介される急性熱性疾患であっ
て、古くから知られている。

特に、１ｑｓｏ年代以降に高い死亡率を伴う、所謂、デ
ング出血熱又はデングショック症候群と呼ばれる疾患が
現われるようになってその研究が盛んに行われるように
なった。

デングウィルスは、フラビウイルス科フラビウイルス属
に分類され、血清学的に７型からグ型の互いに明確に区
別し得るダつの型が存在することが明らかにされた。

これらデングウィルスの遺伝情報は一本鎖ＲＮＡが担っ
ており、構造蛋白質、即ち、コア蛋白質、膜蛋白質およ
びエンベロープ蛋白質の３種類から成る構造蛋白質は、
約／　／　ｋｂ　の−重鎖ＲＮＡによってコードされて
いる。この蛋白質はデングウィルスのワクチンの開発に
有用であるが、未だ研究が十分性なわれておらず、有効
な予防ワクチンも開発段階にあるにすぎない。

本発明者らは、デングウィルスの蛋白質の解明に有用な
該蛋白質をコードするｃＤＮＡに着目した。

上述のグつの型のデングウィルスのうち、グ型の蛋白質
をコードするｃＤＮＡについてはＯａ　Ｊ　、−Ｌａ　
ｉらによって報告されている（　ＶＡＯＯＩＮＥＳｇ乙
　ＮＥＷ　　ＡＰＰＲＯＡＯＨＦｉＳ　　Ｔｏ　　ＩＭ
ＵＮＩＺＡＴ工ＯＮ　　、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ、　３９３−３９９．　（／
９ｇＡ）　）が、本発明者らは、デングウィルス３型の
ゲノムＲＮＡ由来のｃ　ＤＮＡを初めて得、その部分Ｄ
Ｎ、Ａ配列を決定し、本発明を完成するに到った。

〔発明の構成〕

以下、本発明を説明する。

丑ず、デングウィルス３型を例えばヒトスジシマ力由来
の細胞株Ｓ　Ａ　Ａ　Ｒ（Ｓｉｎｇｈｓ　Ａｅｄｅｓａ
ｌｂｏｐｉｃｔｕｓ　）からクローニングしたＣ乙／３
乙細胞株（、Ｔ、ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　（／７７ｇ）
、　ｑｏ、　ｓａ／−５ｙｙ　）等の培養細胞に、通常
、細胞当シ０．／〜０．００／フォーカス形成単位とな
るように常法に従って感染させ１．２７〜．２９℃で培
養してウィルスを増殖させる。

ウィルスの増殖が正寸る時期、通常、増殖開始後ｙｇ〜
／−〇時間後に培養を止め、遠心して細胞或いはその残
渣等を沈殿させ、ウィルスを上清に得る。

次いで、得られた上清に例えばポリエチレングリコール
を６〜７係及びＮａ０７等の塩類をλ〜３係となるよう
に添加して、約ｇ、０００×＆で、２０分〜／時間遠心
して精製されたウィルスを沈澱画分に得る。

」二記の様にして得られた精製ウィルスから常法に従っ
てＲＮＡをフェノール抽出し、次いでエタノールを加え
て沈澱させてウィルス由来のＲＮＡを得る。

得られたＲＮＡの大きさをアガロース電気泳動にて測定
し、約／　／　ｋｂ　のデングウィルス３型由来のゲノ
ムＲＮＡ（以下、単ＫｒＲＮＡＪという。）に該当する
ことを確認し、次のｃＤＮＡ合成の鋳型とする。

上記のようにして得られたＲＮＡの末端をポリアデニル
化しておき、その後、逆転写酵素の存在下、ｄＡＴＰ、
ｃｌＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びａｃＴｐ（以下、これらを「
ｄＮＴＰ」と略す。）と反応させ対応するｃＤＮＡを合
成する。

このｃＤＮＡを、例えば予めＢａｍ　ＨＩ　　メチジ−
セ存在下、Ｓ−アデノシルメチオニンテｃＤＮＡの「Ｇ
ＧＡＴＬＪ配列をもつ部分の「吉」をメチル化してＢａ
ｍ　ＨＩ　により消化されないように修飾しておき、こ
れに勘旦Ｈエ　リンカ−を結合させて後、別途咳匹−Ｈ
工　　で消化したｐｕｃ等のベクターに組み込み、組み
換えＤＮＡを得、これで大腸菌等を形質転換させる。

一方、上記ＲＮＡを鋳型として同位体標識したｃＤＮＡ
を調製しておき、これをプローブとして形質転換体をス
クリーニングしてデングウィルス３型ｃＤＮＡを含む形
質転換体を得る。

得られた形質転換体を培養してｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを増幅し
、フェノール抽出及びエタノール沈澱によって目的ｃ　
ＤＮＡを得る。

かくして得られる本発明のｃＤＮＡは、コ末鎖であり、
約／　／　ｋｂの大きさを有する。そして、本発明のｃ
ＤＮＡは後述するようにデング！−ト季をコードする一
般式（Ｉ）で表わされる塩基配列で示されるＤＮＡを含
んでいる。

〔発明の効果〕

本発明のｃＤＮＡを使用すれば、例えばデングウィルス
３型のワクチンを開発するのに有用なデングウィルス３
型の蛋白質を量産することが可能である。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて更に具体的に本発明を説明する。

実施例／ （１）　　デングウィルス３型の培養 （１）　ヒトスジシマ力由来の細胞株Ｓ　ＡＡＲ（Ｓｉ
ｎｇｈ’ｓ　Ａｅｄ、ｅｓ　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ　）
からクローニングしたＣ乙／３乙細胞（Ｊ、ｇｅｎ、Ｖ
ｉｒｏｌ、、皿。

５Ｊ　／−３１１１１（／り７ｇ））をＰｈａｒｍａｃ
ｉａ社製”　０ｙｔｏｄｅｘ　ｌ　”　３　、！ｉ’に
付着させ、１０％牛脂児血清を含むイーグル最小培地（
５ｃｉｅｎｃｅ。

／、３０．　’１．３２−’１．３７（／灯９）　７３
０　ｍｌ　Ｆり　入ッｆ４Ｂｅｌｌｃｏ　Ｇｌａｓｓ社
製Ｍｉｃｒｏ　Ｃａｒｒｉｅｒ　５ｐｉｎｎｅｒＦｌａ
ｓｋ中で−ざ℃で回転培養（４ｔｏ〜６゜ｒｐｍ　）　
Ｌ、約／　Ｏｏ個／フラスコの細胞密度にした。

（２）培養後、３０分間静置してマイクロキャリアーを
沈め培養液をデカンテーションで除去した。この細胞に
細胞当シｏ、ｏｉフォーカス形成単位となるようにデン
グウィルス３型、Ｈ−ｇ７株、を５ｏｒｎｌ接種し、室
温で３０分間感染させた。

（３）　　感染後、２％牛脂児血清を含むイーグル最小
培地７００　ｍｌを加え、２ｇ℃で夕日間培養した。

培養土清約ｑｓｏｍｌをｇ、ｏｏｏｘｇで１０分間ＩＩ
　℃で遠心し、上清を得た。この上清にポリエチレング
リコール＃乙ｏｏ。

をり左ｇ及びＮａＯ，ｄを／乙、乙３Ｉ加えてグ℃で／
昼夜攪拌した。これをｇ、ｏｏｏｘｇで２０分間り℃で
遠心して沈査として約Ωｇ（湿重量）の精製されたウィ
ルスを得た。

（ｉｊｌＲＩＪＡの抽出 （１）上記（１）で得た沈査（ウィルス）をトリス塩酸
（ｐａ７．ｇ）溶液／　ｒｎｌに懸濁し、これに７倍容
量のフェノールを加えてＲＮＡをフェノール抽出した。

水層的／　ｍｌを得、それに２倍容量のエタノールを加
えてＲＮＡを沈澱させ、ｉｏ、ｏθ０×ＩでｌＳ分間遠
心して沈査（ユｏｏμＩ　）を得た。

得られた沈査を約１００μｌのトリス塩酸（ｐＨ７，ｇ
　）緩衝液に溶解してその一部をアガロース電気泳動に
かけ、含まれるＲＮＡの大きさを測定して、約／／ｋｂ
のデングウィルス３型由来のＲＮＡに該当することを確
認した。

（ｉｉｉｌ　　ＣＤ　Ｎ　Ａの合成 （１）　　ｓ　ｏ　＠　Ｍ　）リス塩酸（ｐＨ７，９）
に溶解した上記（１１）で精製したＲＮＡ約２０μｇを
／　０　＠Ｍ　ＭＩＯＩＪｘ１．２．３　ｍＭ　ＭｎＯ
４、，２！ｒ０７７℃ＭＮａ０７　、０．３ＴＩＩ９／
ｍ１ＢＳＡ　、　／　７７１ＭＡ　ＴＰ　、　３０ｕｎ
ｉｔｓ　ＲＮａｓｅ阻害剤及び／　ｕｎｉｔポリＡポリ
メラーゼを含む溶液に全量でＳＯμｌ　となるように溶
解し、３７℃でＳ分間ＲＮＡのポリアデニル化を行なっ
た。

反応溶液に７倍容量のフェノールを加えてＲＮＡをフェ
ノール抽出し、得られた水層に２倍容量のエタノールを
加えてＲＮＡを沈澱させ、１０，０００ｘ９でｌＳ分間
遠心してポリアデニル化されだＲＮＡ（約／ＳμＩ）を
得た。

（２）得られたポリアデニル化されたＲＮＡをθ、／　
　ＭＫＯＩＩ　、　／　　ＯｍＭ　　ＭＩＯＩＪｘ　　
、　　Ｉ　Ｏ７７１ＭＤＴＴ　、　／　ｍＭ　ｄＮＴＰ
Ｓ２０　ｔｉｇオリゴ（ｄＴ）＋ｘａ、５０ｍＭ）リス
塩酸（ｐＨ７，９）及び３０ｕｎｉｔｓ逆転写酵素を含
む溶液に全量でＳＯμノ　となるように溶解し、り２℃
で７時間反応させた。

次いで、該反応液に０．　／　ｍＭ　ＭｐＳＯ＋、０、
！；Ｔｎｆ’ｍｌ！　Ｂ　ＳＡ　、／　ｍＭ　　ｄＮＴ
Ｐ　、１００μＭＮＡＤ、’　０．３　Ｍ　）リス塩酸
（ｐＨ７，９）、２　！；　ｕｎｉｔｓＲＮａｓｅＨ１
／　ｕｎｉｔ大腸菌ＤＮＡリガーゼ及び２０　ｕｎｉｔ
ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■を含む溶液／３０μｌを
加え、更に７３℃で１時間反応させた。

反応後、前記と同様にして生成したｃＤＮＡをフェノー
ル抽出し、エタノール沈澱させた。

この沈澱（約ｉｘμｇ）を／　０　＠Ｍ　Ｍｙ　ａｃｔ
、！；　ＯｍＭ　Ｎａ０７．０．／　ｍ９／ｍｌ　ＢＳ
Ａ　、　／　７１１Ｍ　ＤＴＴ。

７ｍＭ（ｉＮＴＰ及び、ｔｏ７７１Ｍ）リス塩酸（ｐａ
７．９）を含む反応液１００μｌに溶解し、更にλｕｎ
ｉｔｓ　（Ｄ　ＴグＤＮＡポリメラーゼを加えて３７℃
で７０分間反応させた。

反応後、前記と同様にしてフェノール抽出、エタノール
沈澱によってｃＤＮＡ約１０μｇを得た。

（１■）　　デングウィルス３型由来のｃＤＮＡのクロ
ーニング 上記（１１すで得たｃＤＮＡ（Ｊ末鎖）約／　０ｌｔｊ
ｉを３０ｍＭ　）リス塩酸、ｐＨ７Ｊ、１０ｍＭＥＤＴ
Ａ。

３ｍＭ２−メルカプトエタノール、ｇｏμＭＳ−アデノ
シルメチオニｙ　及ヒ／　ＯｕｎｉｔｓＢａｎ　Ｈエメ
チラーゼを含む反応液中にて３７℃、７時間反応させて
メチル化した。

反応後、フェノール抽出及びエタノール沈澱によジメチ
ル化されたｃ　ＤＮＡを得、５０ｍＭ　’）リス塩酸、
ｐＨ７，ｇ、１０ｍＭ　Ｍｇ０４．２０７７１Ｍ　ＤＴ
Ｔ　、　／　ｍＭ　ＡＴＰ及び！；　Ｏｆｉｇ／ｍｅ　
ＢＳＡを含む反応液２０μｌに溶解し、更にＢａｍＨニ
リンカーをＣＤＮＡの１０モル倍加え、ｇｏｃで９時間
反応させた。

反応後、常法に従い、目的ｃＤＮＡをアガロースゲル電
気泳動で精製し、≦ｉｍＨ工で消化し、これ式別途ルユ
Ｈ工で消化したｐＵ。

ベクター（Ｇｅｎｅ、　、Ｌｌ、　１０．３　（７９ｇ
ｋ）　）の拒Ｈ工部位に挿入して組換えＤＮＡを得、該
ＤＮＡで大腸菌ＤＨＩ株を形質転換した。

次いで、得られた形質転換体をＬＢ培地で３７℃、／乙
時間培養しコロニーを形成した。

一方、上記（ｉｉｉｌの（２）で得たポリアデニル化Ｒ
ＮＡ約／　μｇを０．７　ＭＫＯｌ、　／　ＯｍＭ　Ｍ
ｙ、Ｏｌ、、／　０７ＨＭＤＴＴ、　／ｍＭｄＮＴＰ、
　１００μＯ１〔α」２Ｐ−）ｄＡＴＰ、　２μオリゴ
（ｄＴ）、、２．、　ｊＯｍＭ　）リス塩酸（ｐＨ７，
９）及び、３　ｕｎｉｔｓ逆転写酵素を含む溶液に全量
１０μｌ　となるように溶解し、夕２℃で７時間反応さ
せ標識されたｃＤＮＡプローブを得た。これをグローブ
としてコロニーハイブリダイゼーション法（Ｍｑｌｅｃ
ｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ、　（１９ｇ２）、　３／、３
．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｓ　
、　）によりスクリーニングすることによって目的のデ
ングウィルス３型由来のｃＤＮＡが組込まれた形質転換
体を選択した。

該形質転換体をＬＢ培地で、７７℃、ＩＡ時間培養し、
得られた菌体約／、９（湿重量）よジアルカリ法（Ｍｏ
ｌθｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　、　（／　９　ｇ　
、２　）、３６ｇ、　ＯｏＭ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｓ、　）にてプラスミドＤＮＡを抽出した
。

Ｍ　　デングウィルス３型由来のｃ　ＤＮＡの部分核酸
配列決定 上記（１ｖ）で得たｃＤＮＡのうち約３　ｋｂ　のＯＤ
　Ｎ　Ａ　ｔ　ｏ　μｇを、！ｒＯｍＭ）リス塩酸、ｐ
Ｈ−ざ、θ、／　−１７７１Ｍ　０ａＯＡｘ、／　、、
２７７１Ｍ　９０１１ｔ、ｌｌ’ｏ。

＠Ｍ　Ｎａ０７及び＋２　ｕｎｉｔｓ　Ｂａｌ　、？　
／ヌクレアーゼを含む反応液１００μｌ　に溶解し、２
０℃で反応させた。反応開始後３分、６分、７０分及び
／３分に夫々反応液２０μｌを取シ出し、フェノール抽
出及びエタノール沈澱により種々の大きさの断片を含む
ｃＤＮＡを得た。

次いで、得られたｃＤＮＡの両端を平滑末端とする為に
常法に従いＴ４ポリメラーゼで３７°Ｃ１３０分間処理
し、シ、ｎｃｌ消化したｐＵｏ／９のａｉｎｃ１１部位
にＴ４１．リガーゼ存在下で同上ｃＤＮＡを結合させ、
組み換えプラスミドを得、このプラスミドで大腸菌ＪＭ
ｇ、？を形質転換した。

得られた形質転換体をθ、ｏ　ｏ　ｌｌ係Ｘ　−ｇａｌ
を含むＬＢ培地で３７℃、／６時間生育させ、コロニー
を形成させた。その内、白いコロニーを形成したものを
選択した。

得られた形質転換体をＬＢ培地で３７℃で１０時間培養
し、得られた菌体／ｇ（湿重量）よシ前述のアルカリ法
にてプラスミドＤＮＡを抽出した。

かくして得られた夫々の大きさのｃＤＮＡを用い、Ｈａ
ｔｔＯｒｉ　＆　５ａｋａｉの”　Ｃｈａｉｎ　ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｏｎ法　”　　（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　　、乙−５，２，２
３２（／９ｇｘ）　）に従って、その塩基配列を決定し
た。その結果、上記（１ｖ）で得た約３　ｋｂのｃ　Ｄ
ＮＡは、下記一般式（Ｉ）で表わされる部分塩基配列を
有することが判った。一般式（Ｉ）で表わされる塩基配
列を有するＤＮＡは、デングウィルス３型の工／ベロー
プ蛋白質をコードしている。

一般式（１） ＡＡ−３’ ｊＡＵＡＡＡＵけＬｊＬ；ｔ、ｊ’ｊ、けけＡＬｔＡＡ
ＡＡ　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（但し、上記式中で、Ｎ
は未特定のデオキシリボ核酸残基の塩基を示す。） 出　願　人　　三菱化成工業株式会社 代　理　人　　弁理士　長谷用　　− ほか／名

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記一般式（ I ）の塩基配列で示される部分Ｄ
   ＮＡ配列を有する、デングウイルス３型由来のｃＤＮＡ
   。 一般式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 （但し、上記式中で、Ｎは未特定のデオキシリボ核酸残
   基の塩基を示す。）