CN105311647B - 丝切蛋白在防治乙型脑炎病毒感染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗乙型脑炎病毒(JEV)感染的新靶点及应用。本发明以人神经母细胞瘤细胞(SK‑N‑SH)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制JEV感染人神经母细胞瘤细胞(SK‑N‑SH)的宿主因子，从而保护神经系统的功能，预防病毒感染中枢神经系统而引发炎症。本发明提供了丝切蛋白在防治乙型脑炎病毒感染中的应用，本发明通过实验发现丝切蛋白(Cofilin)在JEV感染SK‑N‑SH中发挥着重要的作用，下调Cofilin的表达，能明显抑制JEV的感染。本发明提供了Cofilin在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点及应用。
背景技术
乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，为有包膜的单正链RNA病毒[Gubler,D.,G.Kuno,and L.Markoff.Flaviviruses,p.2007.1153-1252.In D.M.Knipe andP.M.Howley(ed.),Fields virology,5th ed.,vol.1.Lippincott-Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.]。JEV为流行性乙型脑炎的病原体，主要以蚊虫为媒介进行传播，感染后能够引发脑炎或脑膜炎等严重的急性神经系统症状，对人类健康威胁巨大。乙型脑炎主要流行于东亚、东南亚以及大洋洲的部分地区，目前主要的控制手段为疫苗预防以及蚊虫的消除，然而全球每年报告的乙型脑炎病例仍有35,000-50,000例，死亡人数超过10,000例[Misra,U.K.and J.Kalita.Overview:Japaneseencephalitis.Prog.Neurobiol.2010.91:108-120.]，由于诊断和报告机制不完善，实际的感染和死亡病例要超过这些数字，可见乙型脑炎仍然是危害公众健康的重大问题，因而研究JEV致病机理和预防手段，寻找新的抗病毒策略，已成为亟待解决的前沿课题。
JEV感染具有嗜神经性，易造成严重的中枢神经系统(CNS)疾病及其并发症，这也是导致乙型脑炎患者发展为重症甚至死亡的主要原因[Denizot M,Neal JW,GasqueP.Encephalitis due to emerging viruses:CNS innate immunity and potentialtherapeutic targets.J Infect.2012.65(1):1-16.]。研究表明，JEV感染主要通过两种方式引发神经细胞的凋亡：直接细胞凋亡和间接细胞凋亡。直接细胞凋亡是由于JEV直接在细胞内的大量扩增和繁殖，引起caspase等凋亡信号途径活化从而导致的细胞凋亡；间接细胞凋亡为JEV入侵后引发炎症反应，激活一系列炎症相关信号转导通路和大量的炎症因子，最终导致细胞的凋亡[Debapriya Ghosh,AnirbanBasu.Japanese Encephalitis-APathological and Clinical Perspective.PLoSNegl Trop Dis.2009.3(9):e437.]。在JEV感染导致的间接细胞凋亡中，JEV感染小胶质细胞(Microglia cells)能够引发IL-6，IL-8，TNFα等促炎细胞因子的释放，导致白细胞迁移浸润脑部中枢神经系统，加剧炎症反应；被JEV感染的星形胶质细胞也能产生干扰素诱导蛋白IP-10，促进自然杀伤细胞以及单核细胞迁移浸润脑部中枢神经系统，促进炎症反应和神经细胞的凋亡[Swarup V,Ghosh J,Das S,Basu A.Tumor necrosis factor receptor associated death domain mediatedneuronal death contributes to the glial activation and subsequentneuroinflammation inJapanese encephalitis.Neurochem Int.2008.52:1310-1321]。JEV侵入中枢神经系统后也能够感染神经干细胞(Neuronal progenitor cells，NPCs)，JEV感染神经干细胞后不会引发NPCs的凋亡，而是通过抑制细胞周期来影响NPCs的增殖和分化，这可能是导致婴幼儿感染后引发严重的后遗症的原因。此外，JEV可穿过胎盘屏障感染胎儿，从而影响胎儿神经系统的正常发育[Das S,Basu A.Japanese encephalitis virusinfects neural progenitor cells and decreases their proliferation.JNeurochem.2008.106:1624–1636.]。可见JEV最主要的危害在于感染中枢神经系统引发炎症反应。因此，探明JEV感染中枢神经系统的机制并以此寻找新的抗病毒靶点，对于保护防治JEV所导致的中枢神经系统感染及炎症至关重要。
为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其运输系统完成对宿主细胞的入侵，才能到达细胞特定区域内，在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此，作为病毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要靶标。研究表明，JEV可利用不同的宿主因子和感染途径来侵入靶细胞，如JEV可通过其包膜蛋白与热休克蛋白70相互作用来感染白纹伊蚊细胞(C6/36细胞)[Chuang CK,Yang TH,ChenTH,Yang CF,Chen WJ.Heat shock cognate protein 70isoform D is required forclathrin-dependent endocytosis of Japanese encephalitis virus in C6/36cells.JGen Virol.2015,96(Pt 4):793-803.]以及人肝癌细胞(Huh7细胞)[Zhu YZ,Cao MM,WangWB,et al.Association of heat-shock protein 70with lipid rafts is required forJapanese encephalitis virus infection in Huh7cells.J Gen Virol.2012,93(Pt1):61-71.]。JEV可借助网格蛋白依赖的内吞途径(clathrin-mediated endocytosis)感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)[Nawa M,Takasaki T,Yamada K,Kurane I,AkatsukaT.Interference in Japanese encephalitis virus infection of Vero cells by acationic amphiphilic drug,chlorpromazine.J Gen Virol.2003,84(Pt 7):1737-41.]，但感染神经细胞并不需要依赖网格蛋白[Kalia M,Khasa R,Sharma M,Nain M,VratiS.Japanese encephalitis virus infects neuronal cells through a clathrin-independent endocytic mechanism.J Virol,2013,87(1):148-62.]。目前在啮齿类动物神经细胞感染实验表明JEV采用小窝(caveola)介导的内吞完成入侵[Zhu YZ,Xu QQ,WuDG,et al.Japanese encephalitis virus enters rat neuroblastoma cells via a pH-dependent,dynamin and caveola-mediated endocytosis pathway.J Virol.2012,86(24):13407-22.]，但关于JEV感染人神经系统的具体途径及机制仍不清晰。
病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子以及细胞骨架系统，这些宿主细胞转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞以及分泌中发挥着重要的作用。如网格蛋白(clathrin)主要负责受体介导的的内吞过程；Flotillin分子能够与脂筏内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内；ADP核糖基化因子6分子参与调解细胞质膜运输和胞内肌动蛋白装配；GTP酶激活蛋白分子GRAF1在网格蛋白非依赖型的囊泡运输中具有重要的调节作用；epsin蛋白与huntingtin相关蛋白1(HIP1)都参与调节网格蛋白介导的内吞囊泡的运输过程；diaphanous相关成蛋白(DIAPH1)调节了细胞骨架肌动蛋白的装配；丝切蛋白(Cofilin)通过其磷酸化与去磷酸化作用调节了肌动蛋白丝的形成，从而影响细胞运动以及分子的运输等[Doherty GJ,McMahon HT.Mechanisms of endocytosis.AnnuRev Biochem.2009,78:857-902.]。在这些分子中，网格蛋白被证实分别参与了JEV感染的过程，而其它分子在JEV感染中的作用还未有报道。
丝切蛋白(Cofilin)是存在于真核生物中的一种低分子量(21kD)的肌动蛋白结合蛋白，属于肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家族(actin depolymerizing factor,ADF/cofilin)。它能够切断肌动蛋白丝并结合到肌动蛋白单体(G-actin)上，从而加快体内肌动蛋白的转换率，在重塑肌动蛋白骨架中发挥重要作用[Barbara W.Bernstein and JamesR.Bamburg.ADF/Cofilin:a functional node in cellBiology.Trends in CellBiology,2010,20(4):187-195.]。Cofilin通过对细胞骨架系统重塑，调节了细胞的迁移以及肿瘤细胞的侵袭与分化。研究也发现，Cofilin参与了多种病原微生物对宿主细胞的感染过程。在HIV感染T细胞的过程中，病毒包膜蛋白与受体CXCR4相互作用能够激活Cofilin，从而使病毒颗粒突破外层肌动蛋白的限制从而有效感染T细胞[Yoder A1,Yu D,Dong L,etal.HIV envelope-CXCR4signaling activates cofilin to overcome cortical actinrestriction in resting CD4T cells.Cell.2008,134(5):782-92.]；单纯疱疹病毒1型能够通过EGFR-PI3K信号通路激活Cofilin，Cofilin的磷酸化与去磷酸化的双重作用介导了病毒侵入到神经细胞中去[Zheng K,Xiang Y,Wang X,et al.Epidermal growth factorreceptor-PI3K signaling controls cofilin activity to facilitate herpessimplex virus 1entry into neuronal cells.MBio.2014Jan14；5(1):e00958-13.]。可见Cofilin蛋白在参与病毒感染与致病过程中的重要作用。
目前还没有任何关于丝切蛋白分子在JEV感染中作用的报道，对于该分子进行深入研究不仅能够提升对JEV感染与致病机制的认识，也可以为预防与治疗JEV感染提供新的思路与靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点。
本发明的另一目的在于提供丝切蛋白(Cofilin)分子的新用途，特别是在抗乙型脑炎病毒感染中的应用。
本发明的第三目的在于提供干扰Cofilin蛋白分子表达的siRNA。
本发明的主要技术方案是：
本发明，以人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制JEV感染人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)的宿主因子，从而保护中枢神经系统的功能。本实验选择了一组参与或调节宿主细胞跨膜转运以及细胞骨架重塑的分子来进行筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌以及对细胞骨架的调节过程中发挥着重要作用，它们往往也是在病毒感染过程中易被病毒“劫持”并利用的分子。这些分子包括：ADP核糖基化因子6(ARF6)、丝切蛋白(Cofilin)、网格蛋白重链(CLTC)、epsin蛋白1(EPN1)、diaphanous相关成蛋白(DIAPH1)、epsin蛋白2(EPN2)、Flotillin蛋白1(FLOT1)、Flotillin蛋白2(FLOT2)、GTP酶激活蛋白(GRAF1)、huntingtin相关蛋白1(HIP1R)。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列，然后设计siRNA，通过下调这些分子，来观察对JEV感染的影响。
我们发现丝切蛋白(Cofilin)在JEV感染SK-N-SH中发挥着重要的作用，下调Cofilin的表达，能明显抑制JEV的感染。
本发明的第一方面，提供了丝切蛋白(Cofilin)作为一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点。
本发明的第二方面，提供了丝切蛋白(Cofilin)在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用。
进一步地，本发明还提供丝切蛋白(Cofilin)在制备预防或治疗乙型脑炎药物中的应用。
本发明所述的丝切蛋白(Cofilin)在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用，该药物具体是指能够抑制或下调Cofilin的表达量的试剂。
所述的抑制下调Cofilin的表达量的试剂可以是siRNA、shRNA、包含siRNA、shRNA的重组载体(如质粒)等。
本发明的第三方面，本发明提供了丝切蛋白(Cofilin)的干扰RNA在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用，或丝切蛋白(Cofilin)在制备预防或治疗乙型脑炎药物中的应用，所述的药物为干扰RNA(siRNA)，其序列如下：
UGACAGGGAUCAAGCAUGAAU(SEQ ID NO:7)、
CUUCUAACCGCAAUAGUGACU(SEQ ID NO:8)、
GUUUAGUUCUGUGUAUAAAUG(SEQ ID NO:9)。
其中，以如SEQ ID NO:8所示的siRNA下调Cofilin的表达量效果最佳，且降低乙型脑炎病毒对SK-N-SH细胞的感染最为明显。
本发明筛选到能够抑制乙型脑炎病毒感染SK-N-SH细胞的一个新的宿主细胞分子Cofilin。Cofilin基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了乙型脑炎病毒对SK-N-SH细胞的感染。
因此本发明为临床预防和治疗因乙型脑炎病毒感染所导致的中枢神经系统炎症提供了新的靶点和治疗方案。
附图说明
图1为转染有效siRNA后的干扰效率及细胞毒性检测，图中主坐标轴表示干扰效率，次坐标轴表示对细胞毒性的影响；
CTRL：不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组)；
NT：转染non-targeting siRNA的SK-N-SH细胞组(阴性对照组)；
siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的SK-N-SH细胞组(实验组)。图2为免疫荧光法检测各宿主分子下调后对JEV感染的影响，其中A为下调各分子后对病毒感染性影响的免疫荧光检测图，荧光所示为JEV包膜蛋白阳性的细胞，B为下调各分子后对病毒感染的抑制率图；
CTRL：不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组)；
NT：转染non-targeting siRNA的SK-N-SH细胞组(阴性对照组)；
siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的SK-N-SH细胞组(实验组)。图3为Cofilin下调后对JEV感染的影响，其中A为Western Blot检测Cofilin蛋白的表达图，B为荧光定量PCR法检测JEV病毒量图；
CTRL：不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组)；
NT-CTRL：转染non-targeting siRNA的SK-N-SH细胞组(阴性对照组)；
Cofilin：转染针对Cofilin基因的siRNA(SEQ ID NO:8)的SK-N-SH细胞组。
图4为转染Cofilin分子的不同干扰序列后的干扰效率及对JEV感染性的影响图，A为Cofilin基因的mRNA水平检测图，B为JEV病毒量检测图；
CTRL：不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组)；
NT-CTRL：转染non-targeting siRNA的SK-N-SH细胞组(阴性对照组)；
Cofilin-7：转染针对Cofilin基因的siRNA(SEQ ID NO:7)的SK-N-SH细胞组；
Cofilin-8：转染针对Cofilin基因的siRNA(SEQ ID NO:8)的SK-N-SH细胞组；
Cofilin-9：转染针对Cofilin基因的siRNA(SEQ ID NO:9)的SK-N-SH细胞组。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：
1设计、合成各宿主细胞分子的特异性siRNA序列。
1.1针对各个目的基因，检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除antisense链的5’端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见表1。
1.2单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。
表1. siRNA靶点的设计
2 siRNA序列筛选与干扰效果鉴定
2.1 RNA转染
转染步骤参照Lipofectamine 2000说明书
1)提前12-16小时将SK-N-SH细胞(购自ATCC公司，保藏号：ATCC HTB-11)铺在24孔细胞培养板上培养，使得转染时细胞密度为80％-90％。
2)取2μLLipofectamine 2000加入50μLopti-MEM中并轻柔混匀，室温孵育5分钟；另取5μL浓度为5μM的干扰RNA和50μLopti-MEM混合。孵育结束后，将稀释的Lipofectamine2000转染试剂加入稀释的RNA中，并轻柔吹吸混匀。室温孵育20min后，加入SK-N-SH细胞中，补加400μLopti-MEM，使得RNA终浓度为50nM。
3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。
2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平
1)TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，具体步骤如下：
转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1ml TRIzol，充分混合室温裂解细胞3-5分钟。加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15秒。于4℃、12,000转离心15分钟。取上层水相并转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充分混合，室温沉淀10分钟。于4℃、12,000转离心10分钟。弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇。于4℃、12,000离心5分钟。充分弃上清，室温晾干RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀，得到总RNA。
2)利用takara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA，具体步骤如下：
在PCR管中加入如下反应体系，
5×PrimeScript Buffer 2μL
PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μL
Random 6mers 0.5μL
Total RNA 500ng
Rnase Free dH2O up to 10μL
轻柔混合混匀，置于37℃反应15分钟，然后置于85℃加热5秒钟灭活逆转录酶。
3)荧光定量RT-PCR检测
利用takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行反应，反应体系如下，
SYBR Premix Ex Taq 10μL
Forward Primer 0.4μL
Revers Primer 0.4μL
DNA模板 2μL
dH2O 7.2μL
Total 20μL
利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，95℃预变性2min，进行40个PCR循环，95℃5秒，60℃30秒。
3细胞毒性实验
采用CCK-8方法检测转染siRNA后对细胞增殖的影响，具体步骤如下：
收集对数生长期细胞，以每孔5000个的密度接种于96孔板。待细胞过夜贴壁后，转染各siRNA，培养48小时后检测细胞增殖情况。弃去原有培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，培养3h后用多功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。实验独立重复3次，计算平均值。
4 JEV病毒感染SK-N-SH细胞
4.1 SK-N-SH细胞的JEV病毒感染实验
SK-N-SH细胞转染RNA后72小时，进行JEV病毒感染实验。将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝0.5的病毒量接种JEV，37℃孵育2h后弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，加入新鲜培养基继续培养。
4.2免疫荧光染色检测JEV抗原表达
SK-N-SH细胞感染病毒后继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，具体步骤如下：
1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入100μl预冷甲醇，于-20℃条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。
2)透膜：固定后的细胞每孔加入100μl 0.1％TritonX-100，室温孵育15min，用预冷PBS洗涤3次。
3)封闭：每孔加入100μl 3％BSA，于室温下孵育1h。
4)一抗孵育：每孔加入JEV特异性鼠源单抗(1:500稀释)100μl，室温孵育1h，用预冷的PBS洗涤3次。
5)二抗孵育：每孔加入AF 488荧光标记抗鼠IgG(1:1000稀释)100μl，室温避光孵育1h，用预冷的PBS避光洗涤2次。
6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000，PBS稀释)，室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤3次。
7)荧光显微镜下检测并计算绿色AF 488阳性细胞克隆数。
4.3蛋白免疫印迹。
(1)用蛋白裂解液分别提取对照组与Cofilin干扰组SK-N-SH细胞的总蛋白。
(2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并截取相应条带用电转仪转到PVDF膜上。
(3)蛋白的非特异性位点用5％的脱脂牛奶封闭，然后用Cofilin抗体封闭，4℃过夜，用TBST缓冲液洗三遍，洗去一抗。
(4)然后用HRP标记的二抗室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。
(5)最后，利用显色液显色并拍照分析.
4.4RT-PCR检测细胞中JEV病毒量
SK-N-SH细胞感染病毒后继续培养48h，采用TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，并逆转录获得cDNA，通过RT-PCR检测JEV病毒量。具体步骤同2.2所示。
实验结果：
1设计、合成并筛选有效的siRNA
针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰靶点序列，并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，如表1所示。
采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到SK-N-SH细胞中去，48h后通过RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，最终筛选到干扰效果最佳的siRNA序列进行后续实验，其干扰效率如表2所示，其中加粗数据表示为干扰效率最高，其对应序列为抑制相应基因表达的最佳siRNA序列。
表2RT-PCR法检测siRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率
注：CTRL：不转染任何siRNA的SK-N-SH细胞组(空细胞组)
NT：转染non-targeting siRNA的SK-N-SH细胞组(阴性对照组)
siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的SK-N-SH细胞组(实验组)。
2 siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测
挑选出的针对各宿主分子的有效siRNA转染SK-N-SH细胞，转染后48h通过RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，同时采用CCK8检测转染后对SK-N-SH细胞毒性的影响。
结果如图1所示，转染有效siRNA组与CTRL组相比，转染各siRNA后能够明显抑制相应基因的表达水平(P＜0.01)。转染Cofilin siRNA(SEQ ID NO:8)的抑制效率可达到62.21％。
细胞毒性实验表明，各siRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P＞0.05)，对细胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。
3 siRNA干扰后对JEV病毒感染的影响
转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染相同剂量的JEV病毒，感染48h后，采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后对JEV感染的影响，发现与对照组相比，转染CofilinsiRNA(SEQ ID NO:8)使Cofilin基因下调后，JEV包膜蛋白抗原阳性的细胞数明显减少，提示Cofilin基因的下调能够降低JEV对SK-N-SH细胞的感染(图2A)。通过计算病毒量发现，Cofilin基因下调后对病毒的抑制率最高，达到62.67％，而下调其余宿主分子后，对JEV感染的抑制率较低(图2B)。
为明确Cofilin对JEV感染的抑制作用，在转染Cofilin分子siRNA后，通过免疫印迹法检测Cofilin蛋白分子的表达，并在感染JEV后通过RT-PCR检测JEV病毒量。结果显示，转染Cofilin分子siRNA(SEQ ID NO:8)后，能够明显抑制Cofilin蛋白分子的表达(图3A)。与对照组相比，Cofilin蛋白表达下调后，SK-N-SH细胞中的病毒量也显著下降(图3B)，与免疫荧光法检测结果相一致。这些结果表明，与对照细胞相比，下调Cofilin基因后JEV对SK-N-SH细胞的感染能力明显下降，病毒量减少。
进一步，分别转染三条Cofilin分子的siRNA观察对病毒感染性的影响。结果表明不同的siRNA对Cofilin分子的下调效率不同(图4A)，其中siRNA(SEQ ID NO:8)的干扰效率最高，与前面的结果相一致。检测干扰后对JEV感染性的影响发现，CofilinsiRNA(SEQ IDNO:7)与CofilinsiRNA(SEQ ID NO:9)对Cofilin基因表达的抑制率分别为38％与39％(图4A)，对JEV感染的抑制率分别为46％与45％(图4B)；随着CofilinsiRNA(SEQ ID NO:8)对Cofilin基因表达抑制率增高至66％(图4A)，对JEV感染的抑制率也增高至70％(图4B)，这些结果提示随着对Cofilin分子的下调效率的增高，对JEV感染的抑制率也在升高，表明Cofilin分子在JEV感染SK-N-SH中发挥着重要作用。因此，Cofilin可作为抑制JEV对SK-N-SH细胞感染的新的宿主靶点。
通过以上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制JEV感染SK-N-SH细胞的一个新的宿主细胞分子Cofilin。Cofilin基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了JEV对SK-N-SH细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗因JEV感染所导致的血脑屏障的失能提供了新的靶点和治疗方案。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (1)
1.丝切蛋白在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用；所述的药物是丝切蛋白的干扰RNA，所述的干扰RNA的序列选自以下任一：
UGACAGGGAUCAAGCAUGAAU(SEQ ID NO:7)、
CUUCUAACCGCAAUAGUGACU(SEQ ID NO:8)、
GUUUAGUUCUGUGUAUAAAUG(SEQ ID NO:9)。
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