CN105267985B - N-乙基马来酰亚胺敏感因子在防治乙型脑炎病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗乙型脑炎病毒(JEV)感染的新靶点及应用。本发明以人脑微血管内皮细胞(HBMEC)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制JEV感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的宿主因子，从而保护血脑屏障的功能，预防病毒穿过血脑屏障感染中枢神经系统。本发明提供了N‑乙基马来酰亚胺敏感因子在防治乙型脑炎病毒感染中的应用，本发明通过实验发现N‑乙基马来酰亚胺敏感因子(N‑ethylmaleimide sensitive factor,NSF)在JEV感染HBMEC中发挥着重要的作用，下调NSF的表达，能明显抑制JEV的感染。本发明提供了NSF在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用。

Description

N-乙基马来酰亚胺敏感因子在防治乙型脑炎病毒感染中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点及应用。

背景技术

乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，为有包膜的单正链RNA病毒[Gubler,D.,G.Kuno,and L.Markoff.Flaviviruses,p.2007.1153-1252.In D.M.Knipe andP.M.Howley(ed.),Fields virology,5th ed.,vol.1.Lippincott-Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.]。JEV为流行性乙型脑炎的病原体，主要以蚊虫为媒介进行传播，感染后能够引发脑炎或脑膜炎等严重的急性神经系统症状，对人类健康威胁巨大。乙型脑炎主要流行于东亚、东南亚以及大洋洲的部分地区，目前主要的控制手段为疫苗预防以及蚊虫的消除，然而全球每年报告的乙型脑炎病例仍有35,000-50,000例，死亡人数超过10,000例[Misra,U.K.and J.Kalita.Overview:Japaneseencephalitis.Prog.Neurobiol.2010.91:108-120.]，由于诊断和报告机制不完善，实际的感染和死亡病例要超过这些数字，可见乙型脑炎仍然是危害公众健康的重大问题，因而研究JEV致病机理和预防手段，寻找新的抗病毒策略，已成为亟待解决的前沿课题。

JEV感染具有嗜神经性，易造成严重的中枢神经系统(CNS)疾病及其并发症，这也是导致乙型脑炎患者发展为重症甚至死亡的主要原因[Denizot M,Neal JW,GasqueP.Encephalitis due to emerging viruses:CNS innate immunity and potentialtherapeutic targets.J Infect.2012.65(1):1-16.]。JEV经血液循环感染CNS需要穿越血脑屏障，然而病毒如何穿过血脑屏障侵入CNS的机制还不清楚。血脑屏障(Blood BrainBarrier，BBB)是位于循环系统和中枢神经系统之间一道主要的屏障，它限制着不同物质在两个部位之间的自由运输，对维持CNS的体内平衡以及保护CNS免受外界病原微生物的侵袭中起着至关重要的作用[Dyrna F,Hanske S,Krueger M,Bechmann I.The blood-brainbarrier.JNeuroimmunePharmacol.2013；8(4):763-73.]。血脑屏障是由无窗孔的脑微血管内皮细胞及其间的紧密连接、星形胶质细胞足突、细胞基膜和周细胞共同组成的一个细胞复合体。在这个细胞复合体中，最主要的物质结构基础是脑微血管内皮细胞(BrainMicrovascular Endothelial Cells，BMECs)及其紧密连接，其严整性的丢失被认为是病毒感染致脑组织损伤的一个重要原因。因此，探明JEV感染BMECs的机制并以此寻找新的抗病毒靶点，对于保护血脑屏障的功能，以及防治JEV所导致的中枢神经系统感染至关重要。

为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞自身的物质运输系统将病毒运输至细胞内特定区域以达到成功感染的目的。因此，作为病毒感染宿主细胞的首要环节，病毒入侵已成为抗病毒药物筛选的重要靶标。研究表明，JEV可利用不同的宿主因子和囊泡运输途径来侵入靶细胞，JEV需借助网格蛋白依赖的内吞途径(clathrin-mediated endocytosis)感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)[Nawa M,Takasaki T,Yamada K,Kurane I,AkatsukaT.Interference in Japanese encephalitis virus infection of Vero cells by acationic amphiphilic drug,chlorpromazine.J Gen Virol.2003,84(Pt 7):1737-41.]，但感染神经细胞并不需要依赖网格蛋白[Kalia M,Khasa R,Sharma M,Nain M,VratiS.Japanese encephalitis virus infects neuronal cells through a clathrin-independent endocytic mechanism.J Virol,2013,87(1):148-62.]。JEV可通过其包膜蛋白与热休克蛋白70相互作用来感染白纹伊蚊细胞(C6/36细胞)[Chuang CK,Yang TH,ChenTH,Yang CF,Chen WJ.Heat shock cognate protein 70 isoform D is required forclathrin-dependent endocytosis of Japanese encephalitis virus in C6/36cells.J Gen Virol.2015,96(Pt 4):793-803.]以及人肝癌细胞(Huh7细胞)[Zhu YZ,CaoMM,Wang WB,et al.Association of heat-shock protein 70 with lipid rafts isrequired for Japanese encephalitis virus infection in Huh7 cells.J GenVirol.2012,93(Pt 1):61-71.]。JEV入侵入靶细胞内需要早期内吞小体分子参与对病毒颗粒的运输[Zhu YZ,Xu QQ,Wu DG,et al.Japanese encephalitis virus enters ratneuroblastoma cells via a pH-dependent,dynamin and caveola-mediatedendocytosis pathway.J Virol.2012,86(24):13407-22.]。目前，关于JEV感染BMECs的途径及机制仍不清楚。

病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的宿主细胞分子，这些宿主细胞运输分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞以及分泌中发挥着重要的作用。如GTP酶激活蛋白分子GRAF1在网格蛋白非依赖型的囊泡运输中具有重要的调节作用；属于Rab蛋白家族成员之一的小GTP结合蛋白6(Rab6)调节了蛋白分子在早期内吞小体以及由高尔基体到内质网的运输过程；小GTP结合蛋白7(Rab7)参与了中期以及晚期内吞小体的形成与物质运输过程；N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)在囊泡转运、特定靶细胞膜识别以及膜融合的过程中发挥重要作用；分选连接蛋白(sorting nexin)参与了胞内囊泡的运输以及蛋白酶由早期内体到溶酶体的转运等[Doherty GJ,McMahon HT.Mechanisms ofendocytosis.Annu Rev Biochem.2009,78:857-902.]。这些分子中在JEV感染中的作用还未有报道。

N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide sensitive factor,NSF)是蛋白转运机制中的一个重要组分，参与多种途径的囊泡介导的蛋白转运以及膜融合的过程，尤其在细胞内囊泡转运神经肽类激素或神经递质释放过程中起重要作用[Lowenstein CJ,Tsuda H.N-ethylmaleimide-sensitive factor:a redox sensor in exocytosis.BiolChem.2006,387(10-11):1377-83.]。NSF也被证实参与了病原微生物对宿主细胞的感染过程。如NSF受体蛋白分子参与了免疫缺陷病毒(HIV-1)在宿主细胞内的组装与病毒颗粒的释放过程[Anjali Joshi,Himanshu Garg,Sherimay D.Ablan,and Eric O.Freed.Evidenceof a Role for Soluble N-Ethylmaleimide-sensitiveFactor Attachment ProteinReceptor(SNARE)Machinery inHIV-1 Assembly and Release.J Biol Chem.2011,286(34):29861-71.]；NSF受体蛋白分子能够与蓝舌病毒(Bluetongue Virus)衣壳蛋白VP5相互作用从而影响病毒的组装过程[Bishnupriya,Bhattacharya,Polly Roy.BluetongueVirus Outer Capsid Protein VP5 Interacts with MembraneLipid Rafts via a SNAREDomain.J Virol.2008,82(21):10600-12.]。可见NSF在参与病毒感染与致病过程中发挥着重要作用。

目前还没有任何关于N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)在JEV感染中作用的报道，对于该分子进行深入研究不仅能够提升对JEV感染与致病机制的认识，也可以为预防与治疗JEV感染提供新的思路与靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点。

本发明的另一目的在于提供N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)的新用途，特别是在抗乙型脑炎病毒感染中的应用。

本发明的第三目的在于提供干扰N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)表达的siRNA。

本发明的主要技术方案是：

本发明，以人脑微血管内皮细胞(HBMEC)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制JEV感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的宿主因子，从而保护血脑屏障的功能。本实验选择了一组参与或调节宿主细胞囊泡运输的分子来进行筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞以及分泌中发挥着重要的作用，它们往往也是在病毒感染过程中易被病毒“劫持”并利用的分子。这些分子包括：GTP酶激活蛋白(GRAF1)、N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)、小GTP结合蛋白6A(Rab6A)、小GTP结合蛋白6B(Rab6B)、小GTP结合蛋白7B(Rab7B)、小GTP结合蛋白7L1(Rab7L1)、触结合蛋白1(SYT1)、突触结合蛋白2(SYT2)、分选连接蛋白1(SNX1)、分选连接蛋白2(SNX2)。GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列，然后设计siRNA，通过下调这些分子，来观察对JEV感染的影响。

我们发现N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)在JEV感染HBMEC中发挥着重要的作用，下调NSF的表达，能明显抑制JEV的感染。

本发明的第一方面，提供了N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)作为一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点。

本发明的第二方面，提供了N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用。

进一步地，本发明还提供N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)在制备预防或治疗乙型脑炎药物中的应用。

本发明所述的N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用，该药物具体是指能够抑制或下调NSF的表达量的试剂。

所述的抑制下调NSF的表达量的试剂可以是siRNA、shRNA、包含siRNA、shRNA的重组载体(如质粒)等。

本发明的第三方面，本发明提供了N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)的干扰RNA在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用，或N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)在制备预防或治疗乙型脑炎药物中的应用，所述的药物为干扰RNA(siRNA)，其序列如下：

CAACAGUUGGCCGAUUAGAAG(SEQ ID NO:4)、

CAGUUACUCGAGUUCUAGAUG(SEQ ID NO:5)、

UGGACUAAGUGGAACGUUCUC(SEQ ID NO:6)。

其中，以如SEQ ID NO:6所示的siRNA下调NSF的表达量效果最佳，且降低乙型脑炎病毒对HBMEC细胞的感染最为明显。

本发明筛选到能够抑制乙型脑炎病毒感染HBMEC细胞的一个新的宿主细胞分子NSF。NSF基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了乙型脑炎病毒对HBMEC细胞的感染。

因此本发明为临床预防和治疗因乙型脑炎病毒感染所导致的血脑屏障的失能提供了新的靶点和治疗方案。

附图说明

图1为转染有效siRNA后的干扰效率及细胞毒性检测，图中主坐标轴表示干扰效率，次坐标轴表示对细胞毒性的影响；

CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；

NT：转染non-targeting siRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组(实验组)。

图2为免疫荧光法检测各宿主分子下调后对JEV感染的影响，其中A为下调各分子后对病毒感染性影响的免疫荧光检测图，荧光所示为JEV包膜蛋白阳性的细胞，B为下调各分子后对病毒感染的抑制率图；

CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；

NT：转染non-targeting siRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组(实验组)。

图3为NSF下调后对JEV感染的影响，其中A为Western Blot检测NSF蛋白的表达图，B为荧光定量PCR法检测JEV病毒量图；

CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targeting siRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；

NSF：转染针对NSF基因的siRNA(SEQ ID NO:6)的HBMEC细胞组。

图4为转染NSF分子的不同干扰序列后的干扰效率及对JEV感染性的影响图，A为NSF基因的mRNA水平检测图，B为JEV病毒量检测图；

CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；

NT-CTRL：转染non-targeting siRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；

NSF-4：转染针对NSF基因的siRNA(SEQ ID NO:4)的HBMEC细胞组；

NSF-5：转染针对NSF基因的siRNA(SEQ ID NO:5)的HBMEC细胞组；

NSF-6：转染针对NSF基因的siRNA(SEQ ID NO:6)的HBMEC细胞组。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：

1设计、合成各宿主细胞分子的特异性siRNA序列。

1.1针对各个目的基因，检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除antisense链的5’端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见表1。

1.2单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。

表1.siRNA靶点的设计

2 siRNA序列筛选与干扰效果鉴定

2.1 RNA转染

转染步骤参照Lipofectamine 2000说明书

1)提前12-16小时将HBMEC细胞(购自Sciencell，保藏号：1000)铺在24孔细胞培养板上培养，使得转染时细胞密度为80％-90％。

2)取2μLLipofectamine 2000加入50μLopti-MEM中并轻柔混匀，室温孵育5分钟；另取5μL浓度为5μM的干扰RNA和50μLopti-MEM混合。孵育结束后，将稀释的Lipofectamine2000转染试剂加入稀释的RNA中，并轻柔吹吸混匀。室温孵育20min后，加入HBMEC细胞中，补加400μLopti-MEM，使得RNA终浓度为50nM。

3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。

2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平

1)TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，具体步骤如下：

转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1ml TRIzol，充分混合室温裂解细胞3-5分钟。加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15秒。于4℃、12,000转离心15分钟。取上层水相并转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充分混合，室温沉淀10分钟。于4℃、12,000转离心10分钟。弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇。于4℃、12,000离心5分钟。充分弃上清，室温晾干RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀，得到总RNA。

2)利用takara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA，具体步骤如下：

在PCR管中加入如下反应体系，

5×PrimeScript Buffer 2μL

PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μL

Random 6 mers 0.5μL

Total RNA 500ng

Rnase Free dH₂O up to 10μL

轻柔混合混匀，置于37℃反应15分钟，然后置于85℃加热5秒钟灭活逆转录酶。

3)荧光定量RT-PCR检测

利用takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行反应，反应体系如下，

SYBR Premix Ex Taq 10μL

Forward Primer 0.4μL

Revers Primer 0.4μL

DNA模板 2μL

dH₂O 7.2μL

Total 20μL

利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，95℃预变性2min，进行40个PCR循环，95℃5秒，60℃30秒。

3细胞毒性实验

采用CCK-8方法检测转染siRNA后对细胞增殖的影响，具体步骤如下：

收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。待细胞过夜贴壁后，转染各siRNA，培养48小时后检测细胞增殖情况。弃去原有培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，培养3h后用多功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。实验独立重复3次，计算平均值。

4 JEV病毒感染HBMEC细胞

4.1 HBMEC细胞的JEV病毒感染实验

HBMEC细胞转染RNA后72小时，进行JEV病毒感染实验。将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝1的病毒量接种JEV，37℃孵育2h后弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，加入新鲜培养基继续培养。

4.2免疫荧光染色检测JEV抗原表达

HBMEC细胞感染病毒后继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，具体步骤如下：

1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入100μl预冷甲醇，于-20℃条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。

2)透膜：固定后的细胞每孔加入100μl 0.1％TritonX-100，室温孵育15min，用预冷PBS洗涤3次。

3)封闭：每孔加入100μl 3％BSA，于室温下孵育1h。

4)一抗孵育：每孔加入JEV特异性鼠源单抗(1:500稀释)100μl，室温孵育1h，用预冷的PBS洗涤3次。

5)二抗孵育：每孔加入AF 488荧光标记抗鼠IgG(1:1000稀释)100μl，室温避光孵育1h，用预冷的PBS避光洗涤2次。

6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000，PBS稀释)，室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤3次。

7)荧光显微镜下检测并计算绿色AF 488阳性细胞克隆数。

4.3蛋白免疫印迹。

(1)用蛋白裂解液分别提取对照组与NSF干扰组HBMEC细胞的总蛋白。

(2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并截取相应条带用电转仪转到PVDF膜上。

(3)蛋白的非特异性位点用5％的脱脂牛奶封闭，然后用NSF抗体封闭，4℃过夜，用TBST缓冲液洗三遍，洗去一抗。

(4)然后用HRP标记的二抗室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。

(5)最后，利用显色液显色并拍照分析.

4.4 RT-PCR检测细胞中JEV病毒量

HBMEC细胞感染病毒后继续培养48h，采用TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，并逆转录获得cDNA，通过RT-PCR检测JEV病毒量。具体步骤同2.2所示。

实验结果：

1设计、合成并筛选有效的siRNA

针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰靶点序列，并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，如表1所示。

采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到HBMEC细胞中去，48h后通过RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，最终筛选到干扰效果最佳的siRNA序列进行后续实验，其干扰效率如表2所示，其中加粗数据表示为干扰效率最高，其对应序列为抑制相应基因表达的最佳siRNA序列。

表2 RT-PCR法检测siRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率

注：CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)

NT：转染non-targeting siRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)

siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组(实验组)。

2 siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测

挑选出的针对各宿主分子的有效siRNA转染HBMEC细胞，转染后48h通过RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，同时采用CCK8检测转染后对HBMEC细胞毒性的影响。

结果如图1所示，转染有效siRNA组与CTRL组相比，转染各siRNA后能够明显抑制相应基因的表达水平(P＜0.01)。转染NSFsiRNA(SEQ ID NO:6)的抑制效率可达到66％。

细胞毒性实验表明，各siRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P＞0.05)，对细胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。

3 siRNA干扰后对JEV病毒感染的影响

转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染相同剂量的JEV病毒，感染48h后，采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后对JEV感染的影响，发现与对照组相比，转染NSFsiRNA(SEQ ID NO:6)使NSF基因下调后，JEV包膜蛋白抗原阳性的细胞数明显减少，提示NSF基因的下调能够降低JEV对HBMEC细胞的感染(图2A)。通过计算病毒量发现，与对照组相比NSF基因下调后对病毒的抑制率达到75.33％，而下调其余分子后对JEV感染的抑制率较低，没有明显抑制JEV对HBMEC细胞的感染(图2B)。

为明确NSF对JEV感染的抑制作用，在转染NSF分子siRNA后，通过免疫印迹法检测NSF蛋白分子的表达，并在感染JEV后通过RT-PCR检测JEV病毒量。结果显示，转染NSF分子siRNA(SEQ ID NO:6)后，能够明显抑制NSF蛋白分子的表达(图3A)。与对照组相比，NSF蛋白表达下调后，HBMEC细胞中的病毒量也显著下降(图3B)，与免疫荧光法检测结果相一致。这些结果表明，与对照细胞相比，下调NSF基因后JEV对HBMEC细胞的感染能力明显下降，病毒量减少。

进一步，分别转染三条NSF分子的siRNA观察对病毒感染性的影响。结果表明不同的siRNA对NSF分子的下调效率不同(图4A)，其中siRNA(SEQ ID NO:6)的干扰效率最高，与前面的结果相一致。检测干扰后对JEV感染性的影响发现，三条NSF分子的siRNA对病毒感染的抑制率均可达到55％以上(图4B)。NSF siRNA(SEQ ID NO:4)与NSF siRNA(SEQ ID NO:5)对NSF基因表达的抑制率分别为50％与40％(图4A)，对JEV感染的抑制率分别为59％与57％(图4B)；随着NSF siRNA(SEQ ID NO:6)对NSF基因表达抑制率增高至70％(图4A)，对JEV感染的抑制率也增高至78％(图4B)，这些结果提示随着对NSF分子的下调效率的增高，对JEV感染的抑制率也在升高，表明NSF分子在JEV感染HBMEC中发挥着重要作用。因此，NSF可作为抑制JEV对HBMEC细胞感染的新的宿主靶点。

通过以上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制JEV感染HBMEC细胞的一个新的宿主细胞分子NSF。NSF基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了JEV对HBMEC细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗因JEV感染所导致的血脑屏障的失能提供了新的靶点和治疗方案。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (1)

1.N-乙基马来酰亚胺敏感因子在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用，所述的药物是N-乙基马来酰亚胺敏感因子的干扰RNA，所述的干扰RNA的序列选自以下任一：

CAACAGUUGGCCGAUUAGAAG(SEQ ID NO:4)、

CAGUUACUCGAGUUCUAGAUG(SEQ ID NO:5)、

UGGACUAAGUGGAACGUUCUC(SEQ ID NO:6)。