CN103361443A

CN103361443A - 一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒及检测方法

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Publication number: CN103361443A
Application number: CN2013102733642A
Authority: CN
Inventors: 曹广文; 殷建华; 张宏伟; 李淑华; 李自雄
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2013-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: CN103361443B

Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域。本发明提供了一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒，首先用环介导等温扩增技术（LAMP）直接检测出是否为黄病毒阳性，然后，在阳性的基础上，可同时检测和区分出乙型脑炎的病原体（JEV）、登革病原体(DEV)及西尼罗病原体(WNV)。本发明还提供了利用上述快速联合检测三种黄病毒的试剂盒进行检测的方法。本发明的试剂盒检测简便、快速、灵敏，可实现三种黄病毒的联合快速检测。

Description

一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体是指一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒及检测方法。

背景技术

黄病毒科中多种病毒能引起人类和动物的严重疾病，特别是脑炎和出血热，有较高的死亡率。该类病毒感染的临床表现比较复杂，常常被误诊或冠以“无名热”。目前在我国常见的黄病毒感染有登革热和乙型脑炎，随着改革开放和旅游事业的发展，可能还会有新的黄病毒出现，如西尼罗病毒目前在全球范围内仍呈现继续扩散的趋势。上海市作为国际化大都市，国际国内货物、人员往来不断增加，使西尼罗病毒通过动植物等货物传入的风险性很大。2012年上海市常住人口达2300万以上，大量境外人口入境带来突发传染病的严重威胁以及敌对势力在我市举办大型国际活动期间有实施生物恐怖袭击的潜在危险等，可预见的后果非常严重。因此有必要进行完善的技术储备，加强突发传染病病原体来源追踪和早期快速侦检研究对及时控制急性传染病疫情和生物灾难意义重大，但目前对于这些疾病的早期快速诊断尚无完善的方法。

1.流行性乙型脑炎(乙脑)病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)属于黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)，有包膜的单正链RNA病毒，三带喙库蚊为主要传播媒介，主要在亚洲流行，可引起严重的神经系统传染病，致死率高达30％左右；另有50％的患者会留下永久性的神经系统后遗症。据统计，亚洲每年乙脑发病人数达16000例左右，死亡5000例左右，中国除新疆、西藏、青海外，其它各省均有发病与流行，脑炎发病数占世界总发病数的80%以上，是危害我国人民生命及畜牧业的最重要的虫媒病毒之一。近年澳大利亚本土和美国的关岛地区也出现乙脑病例，说明该病的流行区域在不断扩大，已成为严重的公共卫生问题。故加强对其监测和诊断是十分必要的。

乙型脑炎病例的诊断主要依靠流行病学、临床特征和实验室检查三方面证据。实验室检查主要有血清学诊断、分离培养和分子生物学方法。然而，主要针对抗体的血清学诊断方法不能在疾病早期提供有力的诊断证据，不利于病人的早期诊断和治疗。病毒分离培养方法耗时、费力，检出率低。RT-PCR方法虽然灵敏并能在早期对病毒进行检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而使用受到限制。实时荧光定量PCR技术虽然具有高度特异性和精确度、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点，但由于实验成本高，使用仪器精良而不宜在基层和现场使用。

2.登革病毒(dengue virus，DV)属黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)，根据抗原性不同，可将登革病毒分为1、2、3、4四个血清型。登革病毒感染(dengue virus infect，DVI)可引起登革热(dengue fever，DF)和登革出血热(dengue hemorrhage fever，DHF)，后者死亡率较高。登革热是一种热带传染病，主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，其传染性仅次于艾滋病和SARS。近年来，登革热广泛流行于100多个国家和地区，特别是东南亚一带的流行甚为严重。据世界卫生组织报道，每年约有0.8～1亿例DVI，50万例DHF，2.5万人死亡，15亿人受到威胁。DHF的流行从1954年起迅速上升，2000年登革热曾在秘鲁流行，共有2.45万人被感染。2004年初，拉美9个国家共有27万人感染登革热。在我国登革热属于输入性流行，1978年广东省佛山市首次从病原学确诊登革热流行以来，我国共有650万人感染DV，500多人死亡。登革热临床表现复杂多样、传播迅速、发病率高、人群易感染，严重影响了人们的生活质量和身体健康。由于登革热没有特异性的治疗方法，也没有有效的疫苗进行预防，因此及时发现登革热疫情、阻止或减少本地登革热疫情传播就变得尤为重要。故研究快速检测方法在登革热的预防和控制中具有重要意义。

目前，登革病毒感染的诊断，主要依靠病毒分离和血清学检测。病毒分离法费时繁琐、至少需1周时间才能出结果，达不到早期快速诊断的目的。血清学诊断因与其他黄病毒存在广泛的交叉反应而受到干扰。近年来，随着分子生物学技术的不断发展与完善，以及技术服务市场化，对登革病毒感染的诊断，已经从传统的病毒分离、血清学检查，进入到对病毒RNA进行分子检测的新阶段，为登革热早期诊断和流行监测提供了有效手段，如RT-PCR，nested-PCR，Real-time PCR，TaqMan探针，基因芯片等，但这些技术方法或由于出现假阳性，或由于检测烦琐，成本高，实验室及仪器设备要求精良等，均不适宜在基层和现场使用。

3.西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）属黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)，为西尼罗病毒病病原体。西尼罗病毒是以鸟类为主要宿主，经库蚊等嗜鸟蚊传播的虫媒病毒，可引起人和马的西尼罗脑炎。该病毒广泛分布于非洲、中东、欧亚大陆及澳大利亚，近期又传入北美。特别是在美国，自1999年发现首例患者以来，西尼罗脑炎已连续流行5个季节，发病人数逐年攀升，传播范围几乎波及各个州。西尼罗病毒病目前在全球范围内仍呈现继续扩散的趋势，加拿大和欧洲一些国家相继出现了人感染而死于西尼罗脑炎的报道。西尼罗病毒病的危害已迫使各有关国家加大了对其研究的力度。目前，我国尚无WNV感染的病例报道，但由于我国地理景观复杂，动、植物区系丰富，可为WNV的自然循环提供必要的宿主、媒介和有利的生境，极有可能存在该传染病的自然疫源地。此外，候鸟迁徙和日益频繁的国际交流也将增加境外各种传染病传人的危险性。因此开展WNV相关研究，为WNV的传入与出现进行必要的技术储备，建立WNV快速检测方法，对于应对WNV的可能传入及控制流行意义重大。

目前已初步建立了一系列针对WNV的检测方法,PCR、TaqMan RT-PCR、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)、SYBR Green RT-PCR等核酸检测以及病毒分离、血清学分析等,核酸检测、活病毒分离培养等方法较成熟,但这些方法均耗时较长,不能在短时间内进行快速检测和大范围筛查，使WNV的早期监测受到了影响。

环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplificatlon，LAMP）技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是针对靶基因的6个部位设定3对引物（图2），利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增（图1）。最终产物形成不同柄－环结构的DNAs和不同分子量的如菜花样的多环产物（电泳结果如图3所示）。扩增效率较PCR大大提高（目的基因每半个循环被放大3倍），可以扩增几个拷贝数的目的基因，检测的灵敏度是PCR的10-100倍（图3）。由于其反应是多种引物共同启动，使得反应结果比PCR更特异。另外，由于实行的是等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于基层单位及现场快速检测。

本申请人已于2009年3月6日申请了中国发明专利CN200910047186.5，发明名称为“一种联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒及其检测方法”，公开号为CN101629215，选用了一些已有文献报道的乙型脑炎病毒引物、登革病毒引物和西尼罗病毒引物，应用该试剂盒时，由于缺少黄病毒科病毒引物，对检测结果为阴性的样品，只能明确其不存在流行性乙型脑炎病毒、登革病毒或西尼罗病毒，是否存在其他的黄病毒科病毒还是根本不存在黄病毒科病毒尚无判断，后续的检测将费时费力；并且该试剂盒检测时是分别一个一个地检测乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒，而并非同时的、快速的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒及检测方法，可检测临床样品中三种黄病毒(包括：乙型脑炎的病原体（JEV），登革病原体(DEV)及西尼罗病原体(WNV))存在，比现有的试剂盒和检测方法更快速、更特异、更灵敏、更简便。

本发明的第一方面，是提供一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒。首先用环介导等温扩增技术（LAMP）直接检测出是否为黄病毒阳性，然后，在阳性的基础上，可同时检测和区分出乙型脑炎的病原体（JEV）、登革病原体(DEV)及西尼罗病原体(WNV)。

该试剂盒包括主反应液A和特异引物P：

(1)主反应液A：

含有10倍等温反应缓冲液(Buffer)、浓度为5U/μl的禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV)、浓度为40U/μl的核酸酶抑制剂(Rnasin)、浓度为8U/μl的BstDNA聚合酶、浓度为10mM的dNTP、浓度为100mM的硫酸镁（MgSO₄）、和浓度为5M的酣菜碱（betaine）；

所述的10倍等温反应缓冲液，含有浓度为200mM、pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（200mM Tris-HCl,pH8.8）、浓度为100mM的氯化钾（100mM KCl）、浓度为100mM硫酸按（100mM(NH₄)₂SO₄）、浓度为20mM的硫酸镁（20mM MgSO₄）和浓度为1％的曲拉通X-100（1%Triton X-100）；

（2）特异引物P：

由黄病毒科病毒引物PFV、乙脑病毒引物PJEV、登革病毒Ⅰ型引物PDV1、登革病毒Ⅱ型引物PDV2、登革病毒Ⅲ型引物PDV3、登革病毒Ⅳ型引物PDV4、西尼罗病毒引物PWNV组成；

每种引物各包括20μM内引物FIP,20μM内引物BIP，10μM外引物F3，10μM外引物B3,20μM环引物FLP，20μM环引物BLP；各引物序列如下：

1)黄病毒科病毒引物PFV序列如下：

PFVF3 AAGCTACGAAGTGAAAGCCA

PFVB3 ACATCCATCTTGCCACGATG

PFVFIP CCACGTTTTGCAAGGTGTCCCATTTTCTCAGCCAGCTCAATGGTT

PFVBIP TGGGCAACAGCGCGTTTTTAAATTTTTCATGACCCTAGCTGTTCCT

PFVFLP TGACAGTATCCTAACTACCCCAT

PFVBLP GATACTAAAGCCCCAGAACCAC

2)乙脑病毒引物PJEV序列如下：

PJEVF3 AACCAACACTAGATGTCCGC

PJEVB3 TCAATGCTTCCTTTCCCGAA

PJEVFIP GCATCGAGCCACCGTTGAAATGTTTTGCCAACTTGCTGAAGTCAGG

PJEVBIP ACAACGAAAAACGTGCCGACAGTTTTCATCCATTTCCCCATCCGC

PJEVFLP GACTGAAGCGTGATAGCAGTAAC

PJEVBLP CAGCTACGTGTGCAAACAAGGC

3)登革病毒Ⅰ型引物PDV1序列如下：

PDV1F3 ACTGTTGGTGCAATGCCA

PDV1B3 GCATGTGCTAGAAAGAGGGC

PDV1FIP GCGACGGAACGCTTGTCTCGTTTTGGTGACCTATGGAACGTGTT

PDV1BIP AGCCGAAACGTGGATGTCCTCTTTTTAATCCTGGGTGTCTCAGAGC

PDV1FLP TGTAGGTCATTGTGTCCTCACA

PDV1BLP GGTGACCTATGGAACGTGTTC

4)登革病毒Ⅱ型引物PDV2序列如下：

PDV2F3 CCATGGACCTTGGTGAAT

PDV2B3 GTGTCTCCAGTCCCATTC

PDV2FIP AGTTGCACCAACAATCTATGTCTTCTTTTTGTGAAGATACAATCACGTACA

PDV2BIP ATGGGTAACTTATGGGACGTGTTTTTCCACATGTGGAACGAGTG

PDV2FLP TGGTTCATTCTGCCTGAGAAGA

PDV2BLP CCACCACAGGAGAACACAGA

5)登革病毒Ⅲ型引物PDV3序列如下：

PDV3F3 CCCCACATTACCGAAGTGG

PDV3B3 ACCTTCTCGACTTGTCTCCA

PDV3FIP GCGTCTATGCTCTCCAGCTTGATTTTTTGACTGCTGGTGCAACC

PDV3BIP AGATCAGTGGCGTTAGCTCCCCTTTTCATCCAGGTTTGAGTGCGT

PDV3FLP CCATAAGTCACCCATGTCGATGT

PDV3BLP GTCGGCATGGGACTGGACAC

6)登革病毒Ⅳ型引物PDV4序列如下：

PDV4F3 GGTCATGTATGGGACATGCA

PDV4B3 CGCTGGATTCCTGTTTGCC

PDV4FIP CAGCCCTTGTCTCCAATCCCATTTTTCTCAGAGTGGGGAACGGA

PDV4BIP ATCGGAAGGGGCTTGGAAACATTTTTCCTGCCAAGAGAGCGAAT

PDV4FLP GTGGTGTTAGGGCTACTGAGC

PDV4BLP CAGAGGGTAGAGAGTTGGATACT

7)西尼罗病毒引物PWNV序列如下：

PWNVF3 CGAAGTGGCCATTTTTGTCC

PWNVB3 ATGCATTGGTGTCAATCCCT

PWNVFIP ATCTCCCTGCCTGAGTGGCTCTTTTCAACTACTGTGGAGTCGCAC

PWNVBIP TGCGGCGCCTTCATACACACTTTTGACCGTGGTTCACAGTCC

PWNVFLP AGCCTGTGTGGAGTAGTTTCC

PWNVBLP AGCTTGGAGAATATGGAGAGGTG

所述的主反应液A为：

所述的特异性引物P为：

本发明的第二方面，是提供利用上述快速联合检测三种黄病毒的试剂盒进行检测的方法，将2μl待检RNA溶液加入装有16μl主反应液A和7μl特异性引物P的反应管中，充分混合，于63°C恒温水浴箱中放置30-60分钟。同时设立阴性对照。实验结束后利用紫外-可见光分光光度计在400nm波长处检测反应体系的吸光度(OD)值。取吸光度（OD）超过阴性对照管OD值（0.2）的两倍以上者即OD>0.4为结果判定阳性。

该方法包括以下步骤：

（A）样品中RNA的提取：使用TIANamp Virus DNA/RNA Kit（离心柱型)，操作按操作说明手册进行；

a）病人血清样本及细胞培养上清和鼠脑脊液中提取RNA

在装有250μl细胞培养上清液的1.5ml Eppendorf管中加入750μlTRIzol、LS、Reagen于漩涡混合器混匀；在该Eppendorf管中加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟，2-8℃12000r/min离心15分钟；取上层无色水相转移到另一新1.5ml Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10分钟；2-8℃12000r/min离心10分钟，弃上清，保留位于管底的RNA沉淀；用75℅乙醇1ml洗涤RNA沉淀，2-8℃7500r/min离心5分钟，弃上清，室温静置5-10分钟，使乙醇挥发；加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，保存备用。

b）组织样品中提取RNA

将100mg组织在研钵中磨碎,加入2ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理，研钵前用DEPC水处理；将匀浆加入1.5ml Eppendorf管中，室温放置5分钟；在该Eppendorf管中加入200μl氯仿，剧烈振荡3-5分钟，室温放置15分钟，2-8℃12000r/min离心15分钟；取上层无色水相转移到另一新1.5ml Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10分钟；2-8℃12000r/min离心10分钟，弃上清，保留位于管底的RNA沉淀；用75℅乙醇1ml洗涤RNA沉淀，2-8℃7500r/min离心5分钟，弃上清，室温静置5-10分钟，使乙醇挥发；加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，保存备用。

（B）环介导等温扩增（LAMP）：

在装有16μl主反应液A的反应管中，分别加入7μl特异性引物P，2μl待检RNA，于63°C恒温水浴箱中放置30-60分钟；同时设立RNA阴性对照；

（C）扩增产物的检测：紫外可见分光光度计400nm波长检测最终反应体系的吸光度(OD)值，步骤如下：

a）开机，仪器自检结束后，选择检测波长400nm，

b）用DEPC处理水调节零和调百，向比色皿中加入99μlDEPC处理水和1μl待检样品（样品要充分漩涡混匀），读取的吸光度值/100即为样品的检测OD值。按上述方法测定RNA阴性对照管OD值。

（D）结果判定：测定管OD值超过阴性对照管OD值两倍以上者(即OD值>0.4)判定为阳性。

本发明建立了3种黄病毒联合快速检测的LAMP检测试剂盒及其检测方法，采用环介导等温扩增（LAMP）技术，特异性强。且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属锅或水浴箱即可。且结果不必用凝胶电泳方法或使用荧光染料来观察，只需用普通的分光光度计即可。快速、准确性高、灵敏性好、应用方便，可广泛应用于医疗卫生、出入境检疫等领域。

另外，输入携带病毒的蚊类是虫媒传染病疫情蔓延和新流行区形成的重要原因。国境口岸对输入性蚊类检测对于防止病毒从境外传入十分必要。但目前用于对病人的诊断和对病毒的研究，检测的样本大多为人体血清或动物组织，对蚊体检测少有报道，尚无适合的方法、技术和规程。本发明的3种黄病毒联合检测试剂盒不仅适用于病人的诊断还适用于对蚊体内病毒的检测。对于了解蚊体内病毒的携带情况以及可携带和传播黄病毒的蚊种具有重要意义。

本发明的试剂盒利用黄病毒科的几种黄病毒共同的基因片段，设计出该片段的特异性引物，利用该引物可检测出样品是否为黄病毒阳性，故该试剂盒只需要一套引物便可对大样本进行初次筛选，当结果为阳性时可进一步做三种病毒的检验，具体明确为哪一种病毒。

本发明的试剂盒及检测方法可提供简便、快速、灵敏的3种黄病毒的联合快速检测。

附图说明

图1为LAMP反应原理；

图2为LAMP反应引物设计；

图3为LAMP与PCR反应结果电泳对比图

A、C为LAMP反应电泳图；B、D为对应的PCR反应电泳图；

A、B为西尼罗病毒（WNvirus strains NY99毒株）；C、D为乙脑病毒（Encephalitis Virus strains aoArS982毒株）；病毒RNA倍比稀释为（10^－1、10^－3、10^－5、10^－7、10^－9、10^－11、10^－13、10^－15），后两管（9-10管）为阴性对照；

图4为乙脑病毒LAMP反应OD值监测；

图5为乙脑病毒LAMP反应real-time监测；

图6为登革病毒LAMP反应OD值监测；

图7为登革病毒LAMP反应real-time监测；

图8为西尼罗病毒LAMP反应OD值监测；

图9为西尼罗病毒LAMP反应real-time监测。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：本发明的试剂盒

按下列配方制作三种黄热病毒联合快速检测的LAMP试剂盒：

（1）16μl主反应液A：含有2.5μl10×Buffer，1.0μl AMV(5U/μl),0.25μlRnasin(40U/μl),2.0μl Bst DNA聚合酶(8U/μl),3.5μl10mM dNTP，1.5μl100mM的MgSO4，4.0μl5M的betaine和1.25μl DEPC处理水。

其中：10倍等温反应缓冲液含有浓度为200mM、pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（200mM Tris-HCl,pH8.8）、浓度为100mM的氯化钾（100mM KCl）、浓度为100mM硫酸按（100mM(NH₄)₂SO₄）、浓度为20mM的硫酸镁（20mM MgSO₄）和浓度为1％的曲拉通X-100（1%Triton X-100）。

（2）特异性引物P：包括特异性扩增黄病毒科病毒,乙脑病毒，登革病毒，西尼罗病毒的LAMP特异性引物PFVP，JEV，PDV（包括PDV1，PDV2，PDV3，PDV4）和PWNV。各引物组成分别为:2μl20μM内引物FIP，2μl20μM内引物BIP，0.5μl10μM外引物F3，0.5μl10μM外引物B3，1.0μl20μM环引物FLP，1.0μl20μM环引物BLP。总体积量为7μl。各引物序列分别如下：

1)黄病毒科病毒引物PFV序列如下：

PFVF3 AAGCTACGAAGTGAAAGCCA（SEQ ID NO:1）

PFVB3 ACATCCATCTTGCCACGATG（SEQ ID NO:2）

PFVFIP CCACGTTTTGCAAGGTGTCCCATTTTCTCAGCCAGCTCAATGGTT（SEQ ID NO:3）

PFVBIP TGGGCAACAGCGCGTTTTTAAATTTTTCATGACCCTAGCTGTTCCT（SEQ ID NO:4）

PFVFLP TGACAGTATCCTAACTACCCCAT（SEQ ID NO:5）

PFVBLP GATACTAAAGCCCCAGAACCAC（SEQ ID NO:6）

2)乙脑病毒引物PJEV序列如下：

PJEVF3 AACCAACACTAGATGTCCGC（SEQ ID NO:7）

PJEVB3 TCAATGCTTCCTTTCCCGAA（SEQ ID NO:8）

PJEVFIP GCATCGAGCCACCGTTGAAATGTTTTGCCAACTTGCTGAAGTCAGG（SEQ ID NO:9）

PJEVBIP ACAACGAAAAACGTGCCGACAGTTTTCATCCATTTCCCCATCCGC（SEQ ID NO:10）

PJEVFLP GACTGAAGCGTGATAGCAGTAAC（SEQ ID NO:11）

PJEVBLP CAGCTACGTGTGCAAACAAGGC（SEQ ID NO:12）

3)登革病毒Ⅰ型引物PDV1序列如下：

PDV1F3 ACTGTTGGTGCAATGCCA（SEQ ID NO:13）

PDV1B3 GCATGTGCTAGAAAGAGGGC（SEQ ID NO:14）

PDV1FIP GCGACGGAACGCTTGTCTCGTTTTGGTGACCTATGGAACGTGTT（SEQ ID NO:15）

PDV1BIP AGCCGAAACGTGGATGTCCTCTTTTTAATCCTGGGTGTCTCAGAGC（SEQ ID NO:16）

PDV1FLP TGTAGGTCATTGTGTCCTCACA（SEQ ID NO:17）

PDV1BLP GGTGACCTATGGAACGTGTTC（SEQ ID NO:18）

4)登革病毒Ⅱ型引物PDV2序列如下：

PDV2F3 CCATGGACCTTGGTGAAT（SEQ ID NO:19）

PDV2B3 GTGTCTCCAGTCCCATTC（SEQ ID NO:20）

PDV2FIP AGTTGCACCAACAATCTATGTCTTCTTTTTGTGAAGATACAATCACGTACA（SEQ ID NO:21）

PDV2BIP ATGGGTAACTTATGGGACGTGTTTTTCCACATGTGGAACGAGTG（SEQ ID NO:22）

PDV2FLP TGGTTCATTCTGCCTGAGAAGA（SEQ ID NO:23）

PDV2BLP CCACCACAGGAGAACACAGA（SEQ ID NO:24）

5)登革病毒Ⅲ型引物PDV3序列如下：

PDV3F3 CCCCACATTACCGAAGTGG（SEQ ID NO:25）

PDV3B3 ACCTTCTCGACTTGTCTCCA（SEQ ID NO:26）

PDV3FIP GCGTCTATGCTCTCCAGCTTGATTTTTTGACTGCTGGTGCAACC（SEQ ID NO:27）

PDV3BIP AGATCAGTGGCGTTAGCTCCCCTTTTCATCCAGGTTTGAGTGCGT（SEQ ID NO:28）

PDV3FLP CCATAAGTCACCCATGTCGATGT（SEQ ID NO:29）

PDV3BLP GTCGGCATGGGACTGGACAC（SEQ ID NO:30）

6)登革病毒Ⅳ型引物PDV4序列如下：

PDV4F3 GGTCATGTATGGGACATGCA（SEQ ID NO:31）

PDV4B3 CGCTGGATTCCTGTTTGCC（SEQ ID NO:32）

PDV4FIP CAGCCCTTGTCTCCAATCCCATTTTTCTCAGAGTGGGGAACGGA（SEQ ID NO:33）

PDV4BIP ATCGGAAGGGGCTTGGAAACATTTTTCCTGCCAAGAGAGCGAAT（SEQ ID NO:34）

PDV4FLP GTGGTGTTAGGGCTACTGAGC（SEQ ID NO:35）

PDV4BLP CAGAGGGTAGAGAGTTGGATACT（SEQ ID NO:36）

7)西尼罗病毒引物PWNV序列如下：

PWNVF3 CGAAGTGGCCATTTTTGTCC（SEQ ID NO:37）

PWNVB3 ATGCATTGGTGTCAATCCCT（SEQ ID NO:38）

PWNVFIP ATCTCCCTGCCTGAGTGGCTCTTTTCAACTACTGTGGAGTCGCAC（SEQ ID NO:39）

PWNVBIP TGCGGCGCCTTCATACACACTTTTGACCGTGGTTCACAGTCC（SEQ ID NO:40）

PWNVFLP AGCCTGTGTGGAGTAGTTTCC（SEQ ID NO:41）

PWNVBLP AGCTTGGAGAATATGGAGAGGTG（SEQ ID NO:42）

实施例2：LAMP反应产物浊度检测值（OD值）和LAMP real-time荧光监测值的相关性分析

根据LAMP反应DNA扩增的同时产生大量焦磷酸镁（MagnesiumPyrophosphate）的原理，反应体系呈现一定的混浊度，因此可以通过检测浊度即焦磷酸镁盐的吸光度（吸收波长400nm）间接反应DNA的扩增情况。

1）LAMP反应中焦磷酸镁生成量的检测方法：

将已知病毒的RNA作10²倍比稀释（10^－1、10^－3、10^－5、10^－7、10^－9、10^－ ¹¹、10^－13、10^－15），取16μl的主反应液A和7μl的特异性引物P混合，各管分别加入经10²倍比稀释的不同浓度的RNA2μl，总体积为25μl，混匀后置于63°C恒温水浴箱中放置60分钟，利用紫外-可见光分光光度计检测反应体系的OD值，每隔5分钟检测一次，每个时间点设计3个平行管，取各时间点3个平行管OD值的平均值计为检测结果。同时设立RNA阴性对照。（检测结果见表1，图4）

表1：三种黄病毒（RAN10^－1）LAMP反应紫外-可见光分光光度计吸光度检测结果

2）LAMP反应real-time监测：

按上述方法配制25μl不同RNA浓度（10^－1、10^－3、10^－5、10^－7、10^－9、10^－11、10^－13、10^－15）的LAMP反应体系，各体系中分别加入1μl20×SYBRGreenⅠ染料(使用浓度为0.8×)，每个浓度作3个平行孔，放入Real-time仪中（Roch lightcycle480），63°C,60min（每间隔1分钟为1个循环）。收集监测各时间点的荧光信号强度。同时设立RNA阴性对照。（监测结果见表2，图5）

表2:三种黄病毒（RAN10^－1）LAMP反应real-time荧光监测结果

3）相关性分析：

将同一RNA浓度相同时间点LAMP反应体系中吸光度的检测结果（OD值）与real-time监测结果（染料荧光强度）进行相关性分析，若两者存在数量上的相关关系，可以通过对反应体系OD值的检测间接反应DNA的扩增情况。（见表3，图3）

表3：三种黄病毒LAMP反应测得的OD值与real-time荧光监测结果相关性

结果表明①3种黄病毒RNA的LAMP扩增中，各个时间点吸光度（OD值）的检测结果（反应浊度变化）与同一时间点real-time两种荧光染料的监测结果（DNA的生成量）呈现高度的线性相关性，相关系数r在0.90以上。因此可以通过检测反应产物中浊度的变化间接反应LAMP的扩增情况。②所有不同浓度的RNA阳性的病毒在LAMP反应进行30分钟内均出现明显的扩增，OD≥0.4，RNA阴性对照的平均OD值为0.2。③样品吸光度超出阴性对照吸光度2倍以上者为检测结果阳性，考虑到所用样本LAMP反应出现阳性的时间（the time of positivity，Tp）均在30分钟内，规定LAMP反应阳性结果的CUTOFF值为：LAMP反应进行30分钟，检测样品的OD值≥0.4以上者为结果阳性。

实施例3：用本发明的试剂盒进行检测

1).材料与方法

1.1病毒株来源

1～4型登革病毒国际标准毒株(Ⅰ型Hawaii株、Ⅱ型New Guinea C株、Ⅲ型H87株和Ⅳ型H241株)，由广州军区疾病预防控制中心提供。上述国际标准毒株分别经乳鼠脑内种及C6/36细胞培养复活。

乙脑病毒（SA-14，SH-103，FJ-03）由北京疾病预防中心病毒病研究所惠赠，乙脑病毒（SHJ0701，SHJ0708）由上海市疾病预防控制中心微生物室惠赠。

西尼罗病毒采用人工合成目的基因的方法，参考GeneBank中WN virusstrain NY99（accession number AF196835）序列，合成基因组1021-1240区域的220bp序列，克隆到载体pUC57上，插入位点为SmaI，受体菌为大肠杆菌DH5a菌株。提取纯化质粒DNA，紫外分光光度法定量，制备阳性质粒DNA模板。由上海生物工程研究所完成。

1.2样品中RNA的提取

1）病人血清样本及细胞培养上清和鼠脑脊液中提取RNA

在装有250μl细胞培养上清液的1.5ml Eppendorf管中加入750μl TRIzol、LS、Reagen于漩涡混合器混匀；在该Eppendorf管中加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟，2-8℃12000r/min离心15分钟；取上层无色水相转移到另一新1.5ml Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10分钟；2-8℃12000r/min离心10分钟，弃上清，保留位于管底的RNA沉淀；用75℅乙醇1ml洗涤RNA沉淀，2-8℃7500r/min离心5分钟，弃上清，室温静置5-10分钟，使乙醇挥发；加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，保存备用。

2）组织样品中提取RNA：

1.3逆转录

登革病毒1-4型分别以国际标准毒株Ⅰ型Hawaii株、Ⅱ型New Guinea C株、Ⅲ型H87株和Ⅳ型H241株cDNA为LAMP模板，用随机引物进行登革病毒1-4型国际标准毒株RNA逆转录为cDNA。所用试剂盒为promega A3500，按试剂盒说明书操作。首先将RNA溶液于反应前70℃温育5min，然后迅速放置冰盒上以消除二级结构的影响。

1.4环介导等温扩增：

依次将16μl主反应液A和7μl特异性引物P加入到反应管中，再加入2μl待检RNA,于63°C恒温水浴箱中放置30分钟。同时设立RNA阴性对照。

主反应液A为：

特异性引物P为：

1.5扩增产物的检测：

紫外-可见分光光度计400nm波长检测最终反应体系的吸光度(OD)值。步骤如下：

1）开机，仪器自检结束后，选择检测波长400nm；

2）用DEPC处理水调节零和调百，向比色皿中加入99μlDEPC处理水和1μl待检样品（样品要充分漩涡混匀），读取的吸光度值/100即为样品的检测OD值。

1.6结果判定：

测定管吸光度（OD）>0.4为结果判定阳性。实验结果表明RNA阴性对照管吸光度OD值为0.2.通常以OD值超过阴性对照OD值2倍以上的者为判定阳性。（如表4）

表4：三种黄病毒（RAN10^－1）LAMP反应紫外-可见光分光光度计吸光度检测结果

实施例4：对照实验

为了更好的验证本发明中所设计引物的优越性，特设此对照实验，重新设计一套引物，其余同实施例1、3，各引物序列分别如下：

1)黄病毒科病毒引物PFV序列如下：

PFVF3 GCGATGTTTCCCCGAACC

PFVB3 TCCAGGTTTTTGCTCAACCA

PFVFIP TACCACCTGCCCTGAGCCTCTTTTATACGGTAGCGGCACTGT

PFVBIP CGGTAAAGTCCAAGTGGCCCGTTTTACGGTCAATCACTTGTGTGT

PFVFLP CGCCCGACGACATCCATA

PFVBLP CTCGAGAGTGAAGGTTTACTTTACG

2)乙脑病毒引物PJEV序列如下：

PJEVF3 ACTGCTATCACGCTTCAGTC

PJEVB3 CTCTGGCTGGATTGTTCTCC

PJEVFIP ACATAGCTGCTATCAGCGCGTTTTTTACCGATATTTCAACGGTGGC

PJEVBIP GTGGGTGGGGAAATGGATGTGGTTTTGCCTTGCTGGTGCAAGAA

PJEVFLP CCAGTCGTGGGACATCGA

PJEVBLP CTTTTCGGAAAAGGAAGCATTGAC

3)登革病毒Ⅰ型引物PDV1序列如下：

PDV1F3 CCTCTGCAGGTGTCAACATG

PDV1B3 GGAACGCTTGTCTCGTCG

PDV1FIP GCCTTAGTGATCCGAGGGCATTTTTTTGCACCCTTATTGCGATGG

PDV1BIP ACGTTGACTGTTGGTGCAATGCTTTTTTCGCCAGTTTGAGAACACG

PDV1FLP TGTCCTCACATAACTCTCCCAAAT

PDV1BLP GGACACATGGGTGACCTATGG

4)登革病毒Ⅱ型引物PDV2序列如下：

PDV2F3 GATCAGTGGCACTCGTTC

PDV2B3 GACAGCTGTCAGTAAGATGA

PDV2FIP TCTCTGGGCATGTTTCCAGGTTTTAATGGGACTGGAGACACG

PDV2BIP TGGATCTTGAGACATCCAGGCTTTTTGGGCTCTTTGGAAATGTG

PDV2FLP CCTTCTGATGACATCCATGTTTCAG

PDV2BLP TTACCATAATGGCAGCAATCCTG

5)登革病毒Ⅲ型引物PDV3序列如下：

PDV3F3 CGAAGTGGAGCCTGAAGAC

PDV3B3 CAAGCTCCTTCAGCCGAC

PDV3FIP CGCGTCTATGCTCTCCAGCTTGTTTTATTGACTGCTGGTGCAACC

PDV3BIP AGATCAGTGGCGTTAGCTCCCCTTTTATCCAGGTTTGAGTGCGTG

PDV3FLP TCCATAAGTCACCCATGTCGA

PDV3BLP CGGCATGGGACTGGACA

6)登革病毒Ⅳ型引物PDV4序列如下：

PDV4F3 GGTCATGTATGGGACATGCA

PDV4B3 CGCTGGATTCCTGTTTGCC

PDV4FIP CAGCCCTTGTCTCCAATCCCATTTTTCTCAGAGTGGGGAACGGA

PDV4BIP TCATCGGAAGGGGCTTGGAAACTTTTATCCTGCCAAGAGAGCGA

PDV4FLP TGGTGTTAGGGCTACTGAGC

PDV4BLP CTCAGAGGGTAGAGAGTTGGATACT

7)西尼罗病毒引物PWNV序列如下：

PWNVF3 CGAAGTGGCCATTTTTGTCC

PWNVB3 TGTTCCAACAGTCATCACGT

PWNVFIP GCTGAATCTCCCTGCCTGAGTGTTTTTACTGTGGAGTCGCACGG

PWNVBIP GCGGCGCCTTCATACACACTAATTTTGTGTCAATCCCTGACCGTG

PWNVFLP CCAGCCTGTGTGGAGTAGTTT

PWNVBLP AGCTTGGAGAATATGGAGAGGT

实施步骤如例2的检测，所得实验结果显示，该对照试验存在以下缺点：

a.特异性不强：该对照试验存在一定的假阳性，直接影响了对实验结果的判断；

b.反应条件不够稳定：在实验过程中容易受到污染，水浴中易产生气溶胶，影响结果的检测；

c.扩增效果（凝胶电泳）不如本发明试剂盒所产生的条带清晰。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒是利用环介导等温扩增技术同时检测乙型脑炎的病原体、登革病原体及西尼罗病原体，该试剂盒包括主反应液A和特异引物P：

(Ⅰ)主反应液A：

含有10倍等温反应缓冲液、浓度为5U/μl的禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶、浓度为40U/μl的核酸酶抑制剂、浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶、浓度为10mM的dNTP、浓度为100mM的硫酸镁、和浓度为5M的酣菜碱；

所述的10倍等温反应缓冲液，含有浓度为200mM、pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、浓度为100mM的氯化钾、浓度为100mM硫酸按、浓度为20mM的硫酸镁和浓度为1％的曲拉通X-100；

（Ⅱ）特异引物P：

ⅰ)黄病毒科病毒引物PFV序列如下：

PFVF3 AAGCTACGAAGTGAAAGCCA

PFVB3 ACATCCATCTTGCCACGATG

PFVFIP CCACGTTTTGCAAGGTGTCCCATTTTCTCAGCCAGCTCAATGGTT

PFVBIP TGGGCAACAGCGCGTTTTTAAATTTTTCATGACCCTAGCTGTTCCT

PFVFLP TGACAGTATCCTAACTACCCCAT

PFVBLP GATACTAAAGCCCCAGAACCAC

ⅱ)乙脑病毒引物PJEV序列如下：

PJEVF3 AACCAACACTAGATGTCCGC

PJEVB3 TCAATGCTTCCTTTCCCGAA

PJEVFIP GCATCGAGCCACCGTTGAAATGTTTTGCCAACTTGCTGAAGTCAGG

PJEVBIP ACAACGAAAAACGTGCCGACAGTTTTCATCCATTTCCCCATCCGC

PJEVFLP GACTGAAGCGTGATAGCAGTAAC

PJEVBLP CAGCTACGTGTGCAAACAAGGC

ⅲ)登革病毒Ⅰ型引物PDV1序列如下：

PDV1F3 ACTGTTGGTGCAATGCCA

PDV1B3 GCATGTGCTAGAAAGAGGGC

PDV1FIP GCGACGGAACGCTTGTCTCGTTTTGGTGACCTATGGAACGTGTT

PDV1BIP AGCCGAAACGTGGATGTCCTCTTTTTAATCCTGGGTGTCTCAGAGC

PDV1FLP TGTAGGTCATTGTGTCCTCACA

PDV1BLP GGTGACCTATGGAACGTGTTC

ⅳ)登革病毒Ⅱ型引物PDV2序列如下：

PDV2F3 CCATGGACCTTGGTGAAT

PDV2B3 GTGTCTCCAGTCCCATTC

PDV2FIP AGTTGCACCAACAATCTATGTCTTCTTTTTGTGAAGATACAATCACGTACA

PDV2BIP ATGGGTAACTTATGGGACGTGTTTTTCCACATGTGGAACGAGTG

PDV2FLP TGGTTCATTCTGCCTGAGAAGA

PDV2BLP CCACCACAGGAGAACACAGA

ⅴ)登革病毒Ⅲ型引物PDV3序列如下：

PDV3F3 CCCCACATTACCGAAGTGG

PDV3B3 ACCTTCTCGACTTGTCTCCA

PDV3FIP GCGTCTATGCTCTCCAGCTTGATTTTTTGACTGCTGGTGCAACC

PDV3BIP AGATCAGTGGCGTTAGCTCCCCTTTTCATCCAGGTTTGAGTGCGT

PDV3FLP CCATAAGTCACCCATGTCGATGT

PDV3BLP GTCGGCATGGGACTGGACAC

ⅵ)登革病毒Ⅳ型引物PDV4序列如下：

PDV4F3 GGTCATGTATGGGACATGCA

PDV4B3 CGCTGGATTCCTGTTTGCC

PDV4FIP CAGCCCTTGTCTCCAATCCCATTTTTCTCAGAGTGGGGAACGGA

PDV4BIP ATCGGAAGGGGCTTGGAAACATTTTTCCTGCCAAGAGAGCGAAT

PDV4FLP GTGGTGTTAGGGCTACTGAGC

PDV4BLP CAGAGGGTAGAGAGTTGGATACT

ⅶ)西尼罗病毒引物PWNV序列如下：

PWNVF3 CGAAGTGGCCATTTTTGTCC

PWNVB3 ATGCATTGGTGTCAATCCCT

PWNVFIP ATCTCCCTGCCTGAGTGGCTCTTTTCAACTACTGTGGAGTCGCAC

PWNVBIP TGCGGCGCCTTCATACACACTTTTGACCGTGGTTCACAGTCC

PWNVFLP AGCCTGTGTGGAGTAGTTTCC

PWNVBLP AGCTTGGAGAATATGGAGAGGTG

。

2.一种利用如权利要求1所述的快速联合检测三种黄病毒的试剂盒的检测的方法，其特征在于，该方法是将2μl待检RNA溶液加入装有16μl主反应液A和7μl特异性引物P的反应管中，充分混合，于63°C恒温水浴箱中放置30-60分钟；同时设立阴性对照；反应结束后利用紫外-可见光分光光度计在400nm波长处检测反应体系的吸光度值。

3.根据权利要求2所述的一种利用如权利要求1所述的快速联合检测三种黄病毒的试剂盒的检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（A）样品中RNA的提取：使用TIANamp Virus DNA/RNA Kit离心柱型，操作按操作说明手册进行；

a）病人血清样本及细胞培养上清和鼠脑脊液中提取RNA

在装有250μl细胞培养上清液的1.5ml Eppendorf管中加入750μlTRIzol、LS、Reagen于漩涡混合器混匀；在该Eppendorf管中加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟，2-8℃12000r/min离心15分钟；取上层无色水相转移到另一新1.5ml Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10分钟；2-8℃12000r/min离心10分钟，弃上清，保留位于管底的RNA沉淀；用75℅乙醇1ml洗涤RNA沉淀，2-8℃7500r/min离心5分钟，弃上清，室温静置5-10分钟，使乙醇挥发；加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，保存备用；

b）组织样品中提取RNA

将100mg组织在研钵中磨碎,加入2ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理，研钵前用DEPC水处理；将匀浆加入1.5ml Eppendorf管中，室温放置5分钟；在该Eppendorf管中加入200μl氯仿，剧烈振荡3-5分钟，室温放置15分钟，2-8℃12000r/min离心15分钟；取上层无色水相转移到另一新1.5ml Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10分钟；2-8℃12000r/min离心10分钟，弃上清，保留位于管底的RNA沉淀；用75℅乙醇1ml洗涤RNA沉淀，2-8℃7500r/min离心5分钟，弃上清，室温静置5-10分钟，使乙醇挥发；加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，保存备用；

（B）环介导等温扩增：

（C）扩增产物的检测：

紫外可见分光光度计400nm波长检测最终反应体系的吸光度值，步骤如下：

a）开机，仪器自检结束后，选择检测波长400nm；

b）用DEPC处理水调节零和调百，向比色皿中加入99μlDEPC处理水和1μl待检样品，读取的吸光度值/100即为样品的检测OD值；按上述方法测定RNA阴性对照管OD值。