ES2254055T3

ES2254055T3 - Flavivirus quimericos y/o de crecimiento restringido.

Info

Publication number: ES2254055T3
Application number: ES00102228T
Authority: ES
Inventors: Ching-Juh Lai; Michael Bray; Alexander G. Pletnev; Ruhe Men; Robert M. Chanock
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1991-09-19
Filing date: 1992-09-18
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2012-09-18
Also published as: AU667836B2; DE69233770D1; DK0872553T3; EP1018556B1; DE69231570D1; JP3681358B2; GR3035149T3; DE69233566D1; ATE186744T1; JPH06511150A; DE69230316D1; DE69233566T2; DK0604566T3; JP2003135085A; EP1605047A1; ATE443143T1; EP0604566B1; ATE197607T1; WO1993006214A1; CA2116980A1

Abstract

Un constructo de DNA recombinante que codifica al RNA del virus infeccioso estable de longitud completa del dengue de tipo 4, que contiene por lo menos una mutación que: i) reduce la glucosilación de la proteína de premembrana, proteína de envoltura o proteína de NS1(1), ii) reduce la rotura (división) de la proteína de premembrana en la pro teína de membrana, iii) es una sustitución en el sitio que codifica a la glicina, dicho sitio está situado en la posi ción +1 después del sitio de la rotura de la poliproteína NS1- NS2A o iv) es una sustitución de una secuencia que codifica a uno o varios de los ocho aminoácidos del sitio de rotura del extremo C de la NS1, dicha mutación se traduce en una reducción de la virulencia.

Description

Flavivirus quiméricos y/o de crecimiento restringido.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere en general a flavivirus quiméricos recombinantes viables y a vacunas para el virus del dengue y otros virus, incluidos el virus de la encefalitis transmitida por garrapata (TBEV). La invención se refiere además a secuencias de cDNA que codifican a transcritos de RNA para dirigir la producción del virus recombinante de dengue de tipo 4, virus del dengue quiméricos recombinantes mutantes del virus de tipo 4, virus quiméricos de dengue que incorporan mutaciones a los fragmentos de DNA recombinante generados a partir de los anteriores y las células transformadas con ellos.

Información de los antecedentes

La familia Flaviviridae incluye aproximadamente 60 virus de RNA de hebra positiva, envueltos, la mayoría de los cuales se transmiten mediante un vector insecto. Muchos miembros de esta familia provocan problemas significativos de salud pública en diferentes regiones del mundo (Monath, T.P., en: The Togoviridae and Flaviviridae, S. Schlesinger y col., coord., pp. 375-440, Plenum Press, Nueva York 1986). El genoma de todos los flavivirus secuenciados hasta el presente tiene el mismo orden de gen: 5'-C-preM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3', en el que los tres primeros genes codifican a las proteínas estructurales: la cápside (C), la proteína de premembrana (preM) y la proteína de la envoltura (E).

El dengue es una enfermedad vírica transmitida por mosquitos, que afecta a regiones tropicales y subtropicales de todo el planeta. El subgrupo de virus del dengue provoca más enfermedades humanas que cualquier otro miembro de la familia de los flavivirus. El dengue se caracteriza por la fiebre, erupciones cutáneas, cefaleas graves y dolor de articulaciones. Su índice de mortalidad es bajo. Sin embargo, a lo largo de las últimas décadas, se ha observado con frecuencia creciente en niños y en jóvenes adultos una forma más grave del dengue, caracterizada por hemorragias y colapso (shock) (fiebre hemorrágica de dengue/síndrome de colapso del dengue; DHF/DSS). La DHF/DSS se ha observa con frecuencia creciente en individuos que previamente han estado infectados con otro serotipo de virus del dengue. Esto permite suponer que el aumento inmune de la replicación vírica desempeña un papel en la patogénesis de la forma más grave de la enfermedad (Halstead, S.B., Science 239, 476-481, 1988).

Las epidemias de dengue son un importante problema para la salud pública en muchas regiones tropicales y subtropicales en las que abundan las especies de mosquitos vectores. A pesar de 40 años de investigaciones intensas, no se dispone de vacunas seguras y eficaces contra la enfermedad vírica del dengue. La OMS ha señalado el virus del dengue como un objetivo de alta prioridad para la investigación acelerada y el desarrollo de vacunas.

Al poco de su aislamiento en 1944, los virus del dengue se han pasado en repetidas ocasiones al cerebro del ratón, resultando de ello una selección de mutantes neurovirulentos en el ratón (Sabin, A.B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1, 30-50, 1952). Es interesante que los estudios realizados en voluntarios han puesto de manifiesto que los mutantes neurovirulentos adaptados al cerebro de ratón de tres cepas de virus del dengue de tipo 1 o de tipo 2 están atenuados pero continúan siendo inmunogénicos para los humanos (Sabin, A.B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1, 30-50, 1952; Sabin, A.B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 4, 198-207, 1955; Sabin, A.B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 4, 198-207, 1955; Schlesinger, R.W. y col., J. Immunol. 77, 352-364, 1956; Wisseman, C.L. y col., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 12, 620-623, 1963). Sin embargo, los mutantes no se han desarrollado más como cepas indicadas para las vacunas debido a los problemas de los antígenos de cerebro de ratón en las preparaciones de vacunas. Desde aquellas fechas se han seleccionado mutantes de virus que (i) poseen el fenotipo de tamaño pequeño de placa y/o (ii) son sensibles a la temperatura y/o (iii) se adaptan a los cultivos celulares derivados de un hospedante no natural (es decir, mutantes de la gama de hospedantes (host range), ni se han evaluado como candidatos para la inclusión en una vacuna de virus vivo atenuado (Harrison, V.R. y col., Infec. Immun. 18, 151-156, 1977; Hoke, C.H. y col., Am. J. Trop. Med. Hyg. 43, 219-226, 1990; Bhamarapravati, N. y col., boletín de la OMS 65, 189-195, 1987). Sin embargo, a pesar de los esfuerzos realizados durante 25 años todavía no se dispone de una vacuna segura y eficaz contra el dengue para el uso general. Se ha constatado que las vacunas de virus del dengue completo inactivado no son suficientemente inmunogénicas. Las vacunas de virus vivo, atenuado por una serie de pasajes por cultivos celulares, adolecen de inestabilidad genética, poca atenuación o poca inmunogenicidad. La presente invención constituye un progreso técnico importante que proporciona vacunas de dengue y de flavivirus quiméricos.

Los cuatro serotipos de virus del dengue (del tipo 1 al tipo 4) pueden distinguirse por neutralización de reducción en placa empleando anticuerpos monoclonales específicos de serotipos y mediante ensayos menos específicos empleando sueros policlonales (Bankcroft, W.M. y col., Pan Am. Hlth. Org. Sci. Publ. 375, 175-178, 1979; Henchal, E.A. y col., Am. J. Trop. Med. Hyg. 31, 548-555, 1982). La existencia de serotipos se descubrió por primera vez durante los primeros estudios realizados con voluntarios humanos, indicando que la infección con un serotipo de dengue induce una inmunidad homotípica prolongada, mientras que la inmunidad heterotípica duraba solamente de 3 a 5 meses (Sabin, A.B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1, 30-50, 1952). Una vacuna eficaz contra el dengue, que contenga los cuatro serotipos con el fin de inducir una amplia inmunidad contra los virus del dengue en general, sería muy útil para impedir la aparición de la DHF/DSS.

Se han determinado las secuencias completas de nucleótidos del virus del dengue de los tipos 3 y 4 y de varias cepas del virus de tipo 2, incluida el Nueva Guinea C neurovirulento en el ratón, sin embargo, solamente se ha secuenciado la porción 5' del genoma del virus del tipo 1 (Mackow, E. y col., Virology 159, 217-228, 1987; Zhao, B. y col., Virology 155, 77-88, 1986; Osatomi, K. & Sumiyoshi, H., Virology 176, 643-647, 1990; Irie, A. y col, Gene 75, 197-211, 1989; Mason, P.W. y col., Virology 161, 262-267, 1987; Hahn, Y.S. y col., Virology 162, 167-180, 1988). Los resultados de estos estudios indican los cuatro serotipos del virus del dengue comparten una organización común del genoma. Se ha descubierto que el genoma de la cepa caribeña 814669 del dengue de tipo 4 contiene 10646 nucleótidos (Mackow, E. y col., Virology 159, 217-228, 1987; Zhao, B. y col., Virology 155, 77-88, 1986). Los primeros 101 nucleótidos del extremo 5' y los últimos 384 del extremo 3' no son codificadores. El resto de la secuencia codifica a una poliproteína de 3386 aminoácidos, que incluye a las tres proteínas estructurales, la cápside (C), la premembrana (pre-M) y la envoltura (E), en su extremo N, seguidas de siete proteínas no estructurales en el orden indicado anteriormente, que es consistente con todos los genomas de flavivirus identificados hasta el momento. Se procesa la poliproteína para generar 11 ó más proteínas víricas por acción de peptidasa(s) de señalización celular y proteasas víricas (Markoff, L., J. Virol. 63, 3345-3352, 1989; Falgout, B. y col., J. Virol. 63, 1852-1860, 1989; Falgout, B. y col., J. Virol. 65, 2467-2476, 1991; Hori, H. & Lai, C.J., J. Virol. 64, 4573-4577, 1990).

Hemos construido con anterioridad un cDNA de virus de longitud completa del dengue que podría servir de molde para la transcripción del RNA infeccioso. Hemos obtenido un cDNA de virus de longitud completa del dengue clonado de forma estable y se observa que los transcritos de RNA "in vitro", derivados del molde de DNA, son infecciosos para células en cultivo. Sin embargo, este constructo infeccioso y los transcritos de RNA infecciosos generados hasta el momento son patógenos. Es más, los virus del dengue atenuados generados hasta el momento son genéticamente inestables y tienen el potencial de regenerar con el tiempo una forma patógena. Por otro lado, los virus atenuados son deseables porque se sabe que proporcionan una inmunidad a largo plazo. Por lo tanto, las modificaciones de este constructo o de los constructos quiméricos destinadas a la producción de un virus menos patógeno constituirán un avance considerable en la tecnología de las vacunas de flavivirus atenuados. Por consiguiente, hemos construido una serie de deleciones en la región 3' no codificadora del cDNA, que se describen en la presente, y hemos recuperado mutantes viables de virus del dengue para el análisis de sus características de crecimiento.

También otros miembros de la familia de los flavivirus son patógenos. Los ejemplos incluyen al virus de la encefalitis transmitida por garrapata y el virus de la encefalitis japonesa. Al igual que las vacunas de virus del dengue atenuado, también el virus de la encefalitis transmitida por garrapata (TBEV) atenuado tiende a ser genéticamente inestable y poco inmunogénico. Por lo tanto, otras vacunas de flavivirus atenuados constituirían también un avance técnico considerable. Por ello, esta invención emplea además constructos de cDNA recombinante de longitud completa modificado del virus del dengue o de otros flavivirus como estructuras para la manipulación genética y el desarrollo de virus quiméricos para la producción de vacunas contra otros flavivirus.

El virus de la encefalitis transmitida por garrapata (TBEV) se transmite exclusivamente por garrapatas y puede dividirse en dos subtipos serológicamente diferenciables: el subtipo "Eastern" (= oriental; cepa prototipo: Sofjin), predominante en Siberia y regiones del lejano oriente de Rusia y el subtipo "Western" (= occidental; cepa prototipo: Neudorfl), frecuente en Europa central y oriental. El TBEV provoca una enfermedad encefalítica grave, con un índice de mortalidad que se sitúa entre el 1 y el 30%. Véase un compendio del TBEV en Calisher y col. (J. Gen. Virol. 70, 37-43). Actualmente se dispone de una vacuna experimental TBE para la inactivación del TBEV con formalina, pero esta vacuna tiene diversas limitaciones. Por ejemplo, la vacuna no es suficientemente inmunogénica, por consiguiente se requieren vacunaciones repetidas para generar una respuesta inmune protectora. Incluso cuando se consigue la respuesta del anticuerpo a la vacuna, la vacuna no consigue proporcionar respuestas protectoras contra el virus en un 20% de la población. Por ello sigue habiendo demanda de una vacuna mejorada contra el TBEV.

La presente invención proporciona un constructo de DNA recombinante que codifica RNA vírico de tipo 4 del dengue, infeccioso, de longitud completa, estable, que contiene por lo menos una mutación que: i) reduce la glucosilación de la proteína premembrana, la proteína de envoltura o la proteína NS1(1), ii) reduce la rotura o división (cleavage) de la proteína de premembrana en la proteína de membrana, iii) es una sustitución en un sitio que codifica a la glicina, dicho sitio ocupa la posición +1 después del sitio de rotura de la poliproteína NS1-NS2A o iv) es una sustitución en una secuencia que codifica a uno o varios de los ocho aminoácidos del sitio de rotura del extremo C de la NS1, dicha mutación se traduce en una reducción de la virulencia.

Se proporciona además un virus quimérico que tiene un genoma que consta de una región de ácido nucleico que codifica operativamente proteínas estructurales de un subtipo de dengue y proteínas no estructurales de un subtipo diferente de dengue, dicho genoma consta por lo menos de una mutación que: i) reduce la glucosilación de la proteína de premembrana, de la proteína de envoltura o de la proteína NS1(1), ii) reduce la rotura de la proteína de premembrana en la proteína de membrana, iii) es un sustitución en un sitio que codifica a la glicina, dicho sitio está en la posición +1 después del sitio de rotura de la poliproteína NS1-NS2A o iv) es una sustitución en una secuencia que codifica a uno o varios de los ocho aminoácidos del sitio de rotura del extremo C de la NS1, dicha mutación se traduce en una reducción de la virulencia.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar un método para fabricar un producto de inmunización contra un primer flavivirus que consiste en:

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preparar un constructo de DNA que codifique operativamente la proteína de premembrana y la proteína de envoltura de dicho primer flavivirus y la proteína de la cápside y la proteína no estructural de un segundo flavivirus; dicho segundo flavivirus es un virus del dengue que tiene un genoma que contiene por lo menos una mutación que: i) reduce la glucosilación de la proteína premembrana, la proteína de envoltura o la proteína NS1(1), ii) reduce la rotura de la proteína de premembrana en la proteína de membrana, iii) es una sustitución en un sitio que codifica a la glicina, dicho sitio ocupa la posición +1 después del sitio de rotura de la poliproteína NS1-NS2A o iv) es una sustitución en una secuencia que codifica a uno o varios de los ocho aminoácidos del sitio de rotura del extremo C de la NS1, dicha mutación se traduce en una reducción de la virulencia; y dicho primer flavivirus no es un flavivirus del dengue;

generar transcritos de RNA infecciosos de dicho constructo de DNA;

introducir transcritos de RNA en una célula;

expresar dichos transcritos de RNA en dicha célula para producir virus;

recolectar dichos virus de dichas células; y

ensayar dichos virus en un vertebrado no humano; fabricando con ello un producto de inmunización contra dicho primer flavivirus.

En esta especificación se describe un constructo de DNA recombinante que contiene un ácido nucleico derivado por lo menos de dos flavivirus. El constructo incluye una región de ácido nucleico que codifica operativamente como máximo a dos proteínas estructurales del virus de la encefalitis transmitida por garrapata (TBEV). Esta región está unida operativamente a una región del ácido nucleico que codifica a proteínas estructurales de un flavivirus diferente de los TBEV. El constructo incluye una región de ácido nucleico que codifica operativamente a proteínas de cápside de flavivirus unidas operativamente a la región de ácido nucleico que codifica como máximo a dos proteínas estructurales del virus de la encefalitis transmitida por garrapata. Las regiones de ácido nucleico que codifican a la proteína de la cápside y a las proteínas no estructurales pueden ser de virus del dengue, por ejemplo el virus de tipo 4 del dengue. El constructo puede contener por lo menos una mutación del ácido nucleico derivado por lo menos de dos flavivirus. En esta forma de ejecución, la mutación impide la glucosilación de la proteína NS1(1). En otra forma, la mutación impide la producción de la proteína de membrana del flavivirus maduro. Esta mutación puede afectar la velocidad de crecimiento del virus. La descripción se refiere además a transcritos de RNA que corresponden a estos constructos de DNA recombinante.

Se describe además un virus quimérico que tiene un genoma derivado de un flavivirus. Este virus quimérico puede incluir una región de ácido nucleico que codifique como máximo dos proteínas estructurales del virus de la encefalitis transmitida por garrapata y una región de ácido nucleico que codifique a proteínas no estructurales de otros flavivirus.

El virus puede incluir una región de ácido nucleico que codifica a la proteína de la cápside de otros flavivirus. El ácido nucleico del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas puede codificar a un gran número de proteínas, por ejemplo la proteína de premembrana y/o la proteína de envoltura. El ácido nucleico que codifica a proteínas estructurales de otros flavivirus puede ser del virus del dengue, por ejemplo virus del dengue de tipo 4. En otro aspecto, el virus quimérico puede contener por lo menos una mutación del ácido nucleico. Esta mutación puede adoptar muchas formas, por ejemplo una mutación que impida la glucosilación de la proteína NS1(1) o una mutación que impida la producción de la proteína de membrana de flavivirus maduro. La mutación afecta con preferencia a la velocidad de crecimiento vírico.

Se describe además un virus quimérico que incluye una región de ácido nucleico que codifica a la proteínas de premembrana y de envoltura del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, una región de ácido nucleico que codifica a la proteína de la cápside de otro flavivirus, y una región de ácido nucleico que codifica a proteínas no estructurales del mismo flavivirus. El flavivirus puede ser, por ejemplo, un virus del dengue, por ejemplo un virus del dengue de tipo 4. El virus quimérico puede incluir por lo menos una mutación en la región de ácido nucleico que codifica a la proteína de la premembrana y de la envoltura del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. La mutación puede ser tal que impida la producción de la proteína de la membrana del flavivirus maduro. En otra forma preferida de ejecución, el virus quimérico incluye por lo menos una mutación de las regiones de ácido nucleico del flavivirus. Esta mutación puede ser una que impida la glucosilación de la proteína NS1(1).

La especificación describe una vacuna para humanos contra la encefalitis transmitida por garrapatas, que contiene un virus quimérico de la descripción que es capaz de generar una respuesta inmune protectora para los humanos contra un flavivirus. La descripción, por tanto, presenta un método de fabricación de una vacuna para humanos contra un flavivirus. Este método consiste en preparar un constructo de DNA que codifica operativamente la proteína de premembrana y de envoltura del flavivirus y la proteína de cápside y no estructural del virus del dengue, en generar transcritos de RNA infecciosos del constructo de DNA, en introducir los transcritos de RNA a una célula, en expresar los transcritos de RNA en la célula, en recolectar el virus de las células, en ensayar el virus en un vertebrado y en inocular el virus a los humanos. El paso de la preparación puede incluir mutaciones en el constructo de DNA.

Otro aspecto de la descripción es un virus quimérico que incluye una región de ácido nucleico que codifica a las proteínas de premembrana y de envoltura del virus de la encefalitis japonesa; una región de ácido nucleico que codifica a la proteína de la cápside de otro flavivirus; y una región de ácido nucleico que codifica a las proteínas no estructurales del mismo flavivirus, por ejemplo el virus del dengue.

Otro aspecto de la descripción consiste en presentar un virus quimérico que tiene un genoma de RNA. Este genoma puede incluir una región de ácido nucleico que codifica operativamente una proteína no estructural del virus del dengue de tipo 4 y una región de ácido nucleico que codifica operativamente una proteína estructural del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2, del virus del dengue de tipo 3, del virus de la fiebre amarilla, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o de otro flavivirus.

El genoma del flavivirus puede estar sustancialmente libre de ácido nucleico que codifique operativamente a la proteína estructural del virus del dengue de tipo 4.

El virus quimérico puede incluir RNA p2A(D1 WP) o p2A(D2 NGC). El virus quimérico puede incluir una región de ácido nucleico que codifique operativamente a una proteína no estructural del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2 o del virus del dengue de tipo 3 y puede incluir además una región de ácido nucleico que codifique operativamente la proteína estructural del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2, del virus del dengue de tipo 3, del virus del dengue de tipo 4, del virus de la fiebre amarilla, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y de otros flavivirus. El ácido nucleico que codifica operativamente a una proteína no estructural puede ser de otro virus diferente de la región del ácido nucleico que codifica a la proteína no estructural.

Otro aspecto de la descripción consiste en presentar un virus quimérico que tiene un genoma de RNA. Este genoma puede incluir una región de ácido nucleico que codifica operativamente a una proteína no estructural del virus de la fiebre amarilla, una región de ácido nucleico que codifique operativamente a una proteína estructural del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2, del virus del dengue de tipo 3, del virus del dengue de tipo 4, del virus de la fiebre amarilla, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o de otros flavivirus. La región de ácido nucleico que codifica operativamente a una proteína estructural puede ser de un virus diferente de la región de ácido nucleico que codifica operativamente a una proteína no estructural.

La especificación describe además una vacuna capaz de generar una respuesta inmune protectora contra un virus en un vertebrado. Esta vacuna incluye una cantidad segura e inmunológicamente eficaz de uno cualquiera de los virus descritos y un vehículo farmacéutica e inmunológicamente aceptable.

Otro aspecto más consiste en describir otra vacuna capaz de generar una respuesta inmune protectora contra un virus en un vertebrado. En este aspecto, la vacuna incluye una cantidad segura e inmunológicamente eficaz de los virus siguientes: a) un virus quimérico, cuyo genoma incluye una región de ácido nucleico que codifica a una proteína no estructural del virus del dengue de tipo 4 y una región de ácido nucleico que codifica a una proteína estructural del virus del dengue de tipo 1, b) un virus quimérico, cuyo genoma incluye una región de ácido nucleico que codifica a una proteína no estructural del virus del dengue de tipo 4 y una región de ácido nucleico que codifica a una proteína estructural del virus del dengue de tipo 2, c) un virus quimérico, cuyo genoma incluye una región de ácido nucleico que codifica a una proteína no estructural del virus del dengue de tipo 4 y una región de ácido nucleico que codifica a la proteína estructural del virus del dengue de tipo 3 y d) un virus del dengue de tipo 4 atenuado.

Se describe además un segmento de DNA que incluye una región no estructural del virus del dengue de tipo 4 y una región estructural de uno de los virus siguientes: virus del dengue de tipo 1, virus del dengue de tipo 2, virus del dengue de tipo 3, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y otros flavivirus. El segmento de DNA puede contener un promotor unido operativamente con las regiones estructural y no estructural. El segmento de DNA puede contener un promotor que es un promotor SP6 o T7. El segmento de DNA puede ser el p2A(D1 WP) o el p2A(D2 NGC).

Otros aspectos de la especificación consisten en describir otros segmentos de DNA quimérico. Los segmentos de DNA de estos aspectos pueden incluir una región no estructural del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2 o del virus del dengue de tipo 3. Estos segmentos de DNA pueden incluir además una región estructural de uno de los virus siguientes: del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2, del virus del dengue de tipo 3, del virus del dengue de tipo 4, del virus de la fiebre amarilla, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o de otro flavivirus, con la condición de que la región estructural y la región no estructural no sean del mismo virus.

Otro aspecto de la especificación es describir un segmento de DNA que incluye una región no estructural de uno de los virus siguientes: virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y otros flavivirus, y una región estructural de uno de los virus siguientes: virus del dengue de tipo 1, virus del dengue de tipo 2, virus del dengue de tipo 4, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y otros flavivirus; pero la región estructural es un virus diferente del de la región no estructural.

La especificación describe además un segmento de DNA que contiene una región no estructural o una porción de la misma de un flavivirus y una región estructural o una porción de la misma de otro flavivirus.

Otro aspecto más de la especificación describe una vacuna capaz de generar una respuesta inmune protectora contra un virus en un vertebrado. Esta vacuna puede incluir una cantidad segura e inmunológicamente eficaz de un virus quimérico. El genoma del virus puede incluir un ácido nucleico que codifique operativamente a las proteínas estructurales del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y un ácido nucleico que codifique operativamente la proteína no estructural de un virus del dengue.

Se describe además otro virus quimérico. En este aspecto, el virus quimérico tiene un genoma del virus que codifica operativamente una proteína estructural de encefalitis transmitida por garrapatas y una proteína no estructural del virus de tipo 4 del dengue. Las proteínas estructurales de los virus pueden derivarse del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas.

Se describe además un segmento de DNA que codifica operativamente una proteína estructural de encefalitis transmitida por garrapatas y una proteína no estructural de virus de tipo 4 del dengue.

Se describe además un fragmento de DNA aislado que codifica un RNA vírico infeccioso de dengue de tipo 4. Se describe también un constructo de DNA recombinante que contiene el fragmento de DNA descrito en la especificación y un vector. El vector puede ser un plásmido. En otro aspecto se describe una célula hospedante transformada de modo estable con un constructo de DNA recombinante, de manera que permita la expresión del fragmento de DNA. La célula hospedante puede ser una célula procariota.

Otro aspecto descrito es un método para producir mutantes del virus de tipo 4 del dengue. Este método consiste en los pasos siguientes: (i) introducir mutaciones en el genoma del virus de tipo 4 del dengue mediante una mutagénesis dirigida a una posición, (ii) recuperar los virus infecciosos de tipo 4 del dengue que albergan las mutaciones y (iii) evaluar los virus recuperados. En este método, los virus recuperados pueden evaluarse analizando si tienen un fenotipo atenuado o no virulento.

En la especificación se describe además una vacuna para humanos contra el virus de tipo 4 del dengue que contiene un virus no virulento del tipo 4 del dengue, en una cantidad suficiente para inducir la inmunización de la enfermedad, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El virus no virulento del tipo 4 del dengue puede obtenerse por mutaciones de ingeniería genética en regiones del genoma vírico.

Otro aspecto más se refiere a un fragmento de DNA que codifica a un RNA flavivírico quimérico. El RNA quimérico incluye, por ejemplo, un componente elegido entre el grupo siguiente: el tipo 1 de dengue, el tipo 2 de dengue y el tipo 3 de dengue.

Otro aspecto más se refiere a un método para la construcción de virus quiméricos del dengue. Este método consiste en reemplazar fragmentos de DNA del virus del tipo 4 del dengue con arreglo al método de la presente invención por los correspondientes genes en bloque, o una fracción de los mismos, de un flavivirus. El flavivirus puede ser uno de los virus siguientes: el tipo 1 de dengue, el tipo 2 de dengue y el tipo 3 de dengue. En otra forma preferida de ejecución, el virus de tipo 4 del dengue contiene por lo menos una mutación.

Se describe además una vacuna para humanos contra el virus del dengue, que puede incluir un virus quimérico infeccioso en una cantidad suficiente para inducir la inmunización contra la enfermedad y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El virus quimérico es, por ejemplo, el virus del tipo 1 de dengue, del tipo 2 de dengue, del tipo 3 del dengue o del tipo 4 de dengue.

La invención proporciona un fragmento de DNA que codifica a un RNA vírico de tipo 4 del dengue, en el que el fragmento de DNA contiene una mutación de sustitución en la secuencia que codifica a uno o varios de los ocho aminoácidos del extremo C de la NS1 del sitio de rotura de la proteína no estructural NS1-NS2A.

En otro aspecto de la invención se proporciona un fragmento de DNA que codifica a un RNA vírico de tipo 4 del dengue, en el que el fragmento de DNA contiene una sustitución del sitio que codifica a la glicina, dicho sitio ocupa la posición +1 después del sitio de rotura de la proteína no estructural NS1-NS2A.

En otro aspecto más de la especificación se describe un fragmento de DNA que codifica un RNA vírico de tipo 4 del dengue, dicho fragmento de DNA contiene una deleción en la región no codificante 3'. La deleción puede tener una longitud de 30 a 202 nucleótidos.

En otro aspecto de la especificación se describe un transcrito infeccioso de RNA de un fragmento de DNA descrito en esta solicitud. En otro aspecto de la descripción se presenta una célula hospedante transfectada con constructos de DNA de manera que permita la expresión del fragmento de DNA. Dicha célula hospedante puede ser una célula de mamífero o de insecto.

En la especificación se describe además una vacuna para humanos contra el virus de tipo 4 del dengue que incluye un virus mutante del tipo 4 del dengue que posee una virulencia reducida, en una cantidad suficiente para inducir la inmunización contra la enfermedad. Dicho virus mutante de tipo 4 de dengue puede obtenerse por mutación mediante deleción de ingeniería genética en la región no codificante 3' del genoma vírico. En otra forma preferida de ejecución, el virus mutante del tipo 4 del dengue se obtiene por mutación mediante sustitución de ingeniería genética en la secuencia del DNA vírico que codifica a uno o a varios de los ocho aminoácidos del extremo C de la NS1 del sitio de rotura de la proteína no estructural NS1-NS2A. En otra forma preferida de ejecución, el virus mutante del tipo 4 del dengue se obtiene por sustitución de ingeniería genética en el sitio del DNA vírico que codifica a la glicina, dicho sitio ocupa la posición +1 después del sitio de rotura de la proteína no estructural NS1-NS2A.

En la especificación se describe además un método para la construcción de virus quiméricos de dengue que consiste en reemplazar fragmentos de DNA del virus de tipo 4 del dengue por los genes correspondientes en bloque, o unos fragmentos de los mismos, de un flavivirus. El flavivirus puede ser uno de los siguientes: virus de tipo 1 de dengue, de tipo 2 de dengue, de tipo 3 de dengue, de la encefalitis japonesa y de la encefalitis transmitida por garrapatas. El método para la construcción de virus quiméricos de dengue puede incluir el reemplazo de fragmentos de DNA del virus del tipo 4 del dengue descrito por los genes correspondientes en bloque, o una fracción de los mismos, de un flavivirus. En el método descrito, el flavivirus puede elegirse entre el grupo formado por los virus de tipo 1 de dengue, de tipo 2 de dengue, de tipo 3 de dengue, de la encefalitis japonesa y de la encefalitis transmitida por garrapa-
tas.

En un aspecto adicional se describe una vacuna contra el virus del dengue que puede administrarse en una cantidad suficiente para inducir la inmunización contra la enfermedad. La vacuna puede incluir un virus quimérico que posea una virulencia reducida, dicho virus quimérico contiene un fragmento de DNA que codifica a un RNA vírico de tipo 4 del dengue que contiene una deleción en la región no codificadora 3'. El virus quimérico puede elegirse entre el grupo formado por el virus del tipo 2 del dengue, del tipo 3 del dengue y del tipo 4 del dengue.

Figura 1. Estructura de los cDNA de virus de longitud completa del dengue empleados para obtención de virus quiméricos de dengue.

Figura 2. Porcentaje de células infectadas con virus y concentración de virus después de la transfección con transcritos de RNA.

Figura 3. Análisis de serotipos de virus quiméricos de dengue.

Figura 4. Análisis a través de gel de poliacrilamida de proteínas víricas de tipo 1, tipo 2 ó tipo 4 del dengue, producidas por virus parentales o quiméricos del dengue.

Figura 5. Morfología de las placas víricas en células LLC-MK_{2}.

Figura 6. Neurovirulencia en ratón de NGC parental de dengue de tipo 2 o de virus de tipo 4 de dengue o de virus quimérico de tipo 2/tipo 4.

En la figura 7 se representan las secuencias terminales de los cDNA clonados de virus de longitud completa del dengue, empleados para la transcripción del RNA infeccioso.

El cDNA de virus de dengue de longitud completa de 10646 nucleótidos se clona en posición adyacente a la secuencia del promotor de la polimerasa SP6 y en el diagrama aparece un sólido sitio de rotura Asp 718. Nótese que hay un resto C adicional en la posición entre el 10448 y el 10449 y un resto G adicional entre el 10470 y el 10471, que faltan en la secuencia original del virus de tipo 4 del dengue. Se presentan también las secuencias junto al extremo 5' y al extremo 3' previstos del transcrito de RNA. La G que inicia la transcripción se coloca antes de la secuencia 3' del dengue, indicándose con letra negrita. La secuencia de rotura Asp 718, la GGTACC, se coloca inmediatamente después de la secuencia 3' del dengue, indicándose con letra negrita.

En la figura 8 se representa un diagrama de clones cDNA de longitud completa del dengue y el modelo de digestión con endonucleasa de restricción.

En el diagrama se representa el clon cDNA de longitud completa del dengue que contiene la secuencia del promotor SP6 en el extremo 5' y un sitio de rotura Asp 718 en el extremo 3'. El sitio de rotura Bst B1 del nucleótido 5069 divide el genoma del dengue en dos fragmentos 5' y 3'. El reemplazo de estos fragmentos del clon 1A de longitud completa por los correspondientes fragmentos 5'-2, 3-B o 3'-C da lugar a las combinaciones de longitud completa que se indican.

En la figura 9 se representa el modelo de endonucleasa de restricción del clon cDNA de longitud completa del dengue digerido con Bgl II, Nsi I y Asp 718 y se analizan los productos digeridos por separación a través de un gel de agarosa. El M presenta fragmentos de DNA \lambda Hind III como marcadores de peso molecular en kilo(pares de bases).

En la figura 10 se representa una demostración de virus del dengue recuperado de RNA infeccioso que contiene la secuencia genómica del DNA molde.

Se recupera el virus de la progenie del dengue de células LLC-MK_{2} transfectadas con RNA transcritas de un clon 2A DNA (tipo salvaje de control) o del clon 2A (P) DNA que contiene un sitio Pst I en el nucleótido 3473 de la secuencia del dengue. El RNA genómico extraído del virus recuperado se utiliza para la transcripción inversa y el producto cDNA se utiliza como molde para producir un fragmento de DNA de 1343 bp (nucleótidos 3193-4536) por PCR utilizando los cebadores apropiados. Se representa la digestión del Pst I del producto de la PCR. La pista M representa los 123 escalones del DNA como marcadores de tamaño.

En la figura 11 se presenta una comparación de las proteínas del virus del dengue de células infectadas con el virus recuperado o con el virus parental.

Los lisados marcados con metionina-S^{35} de células LLC-MK_{2} infectadas con el virus del dengue recuperado o del virus de tipo salvaje parental se preparan por inmunoprecipitación con fluido ascítico de ratón hiperinmune al dengue. Se separan los inmunoprecipitados por electroforesis a través de un gel de SDS al 12% en poliacrilamida. Las pistas del gen indican que contienen lisados de células infectadas con: (1) virus parental del dengue; (2) virus del dengue recuperado del clon 2A DNA; (3) virus del dengue recuperado del clon 2A (P) DNA; la pista 4 es de un lisado de células falsamente infectadas; y la pista M contiene proteínas marcadoras de tamaño, en kilodaltones, que se indican en el margen izquierdo. Se señalan las bandas marcadas que corresponden a las proteínas del virus del dengue incluyen la PreM, E, NS y NS3. No se asignan las identidades de otras bandas marcadas.

La figura 12 proporciona la morfología de placa del virus de tipo 4 del dengue de tipo salvaje y su mutante derivado D4 de sustitución de aminoácidos (G_{1126}-E).

Se infectan células confluyentes de mosquito C6/C36 en un frasco de 76 cm^{3} con virus del dengue y después se añade una capa superpuesta de agarosa. Seis días después de la infección se tiñen las células con rojo neutro. El tamaño de placa se mide al día siguiente. El tamaño medio de placa del virus 4 del dengue de tipo salvaje y el mutante de sustitución se calcular a partir de 10 placas individuales. El virus mutante mostrado contiene Glu (E) en lugar de Gly (G) en la posición 1126 de la secuencia de polipéptido de tipo 4 del dengue. Esta posición corresponde a la posición +1 de la secuencia de rotura NS1-NS2A.

En la figura 13 se presenta la estructura y las propiedades del genoma de los mutantes del virus de tipo 4 del dengue, que contienen deleciones en la secuencia no codificadora 3'.

El mapa lineal mostrado representa la secuencia no codificadora 3' de 384 nucleótidos del virus de tipo 4 del dengue. En esta secuencia se representan por lo menos tres elementos de la secuencia: la secuencia conservada 2 (CS-2) del nt 234 al nt 211 y del nt 143 al nt 120, tal como se indica con los recuadros negros. La secuencia conservada 1 (CS-1) del nt 105 al nt 82 se indica con el recuadro en blanco y la estructura de tallo y bucle dentro de los últimos 84 nucleótidos. Se construyen siete clones cDNA, cada uno con una mutación de deleción de una longitud de 30 a 202 nucleótidos en las posiciones especificadas y los transcritos de RNA derivados se emplean para la transfección de células LLC-MK_{2} permisivas. El mutante D4 (\Delta3', 172-83) de cDNA que carece de la secuencia CS-1 entera es aparentemente letal, porque un virus viable no se detecta después de intentos repetidos. Los mutantes viables de deleción se recuperan de los seis transcritos restantes del RNA. Las propiedades de crecimiento del virus de tipo salvaje y sus mutantes derivados por deleción se comparan mediante ensayo de placa con monocapas de células LLC-MK_{2} teñidas seis días después de la infección. En las mismas condiciones, el virus de tipo salvaje presenta placas de un tamaño aproximado de 0,3 cm. Se emplea un sistema inverso de numeración para asignar las posiciones de nucleótido del virus de tipo 4 del dengue. Al último nucleótido 10646 se le asigna el nt 1 cuando se emplea este sistema de numeración.

En la figura 14 se ilustra la morfología de placa del virus de dengue 4 de tipo salvaje y los mutantes derivados, que contienen deleciones en la región no codificadora 3'.

Los ensayos de placa se realizan con células C6/36 de mosquito. Las células C6/36 confluyentes de mosquito en un frasco de 75 cm^{3} se infectan con virus de tipo 4 de dengue de tipo salvaje o virus de un mutante de deleción viable en una multiplicidad apropiada. Tal como se describe en los ejemplos, las células infectadas se tiñen con rojo neutro seis días después de la infección. El tamaño de la placa se mide al día siguiente. Para cada mutante se calcula el tamaño promedio de 10 placas individuales. El panel A presenta la monocapa de células no infectadas (simulación), los mutantes de deleción del virus de tipo 4 del dengue (\Delta3', 172-113), (\Delta3', 172-143) y el virus parental de tipo salvaje.

En la figura 15 se representa un virus de tipo salvaje y diversos mutantes de deleción, incluidos el (\Delta3', 243-183), (\Delta3', 303-183) y (\Delta3', 384-183). Se emplea el sistema de numeración inversa para asignar las posiciones de deleción de la secuencia de tipo 4 del dengue.

En la figura 16 se proporciona una tabla de las uniones NS1-NS2A.

En la figura 17 se recogen las uniones intergénicas de constructos quiméricos TBEV/DEN4. Se insertan los fragmentos de cDNA TBEV rotos con la enzima de restricción en el cDNA DEN4, en las posiciones apropiadas, que se indican con la secuencia subrayada. Los aminoácidos y las secuencias de nucleótidos codificadoras del TBEV se indican con letra negrita. El sistema de numeración de nucleótidos se publicó en Pletnev y col., Virology 174, 250-263, 1990.

La figura 18 es una fotografía del gel de poliacrilamida para la separación de proteínas víricas producidas por los virus DEN4 parental y TBE(ME)/DEN4 quimérico. Los lisados marcados con metionina[S^{35}] de células de simio infectadas con el virus vTBE(ME)/DEN4 o DEN4 o no infectadas se inmunoprecipitan con TBEV HMAF (1) o DEN4 HMAF (2), o suero de conejo específico de NS3 (3) o NS5 (4) o preM (5) o E (6) de DEN4 y se analizan en un gel de SDS-12% de poliacrilamida. Los pesos moleculares de los marcadores de proteína se expresan en kilodaltones. Las ubicaciones de proteínas DEN4 se indican a lo largo del margen derecho.

En la figura 19 se representan las curvas de crecimiento de vTBE(ME)/DEN4 y DEN4 en células LLC-MK_{2} y C6/36. Se recolectan las células en los tiempos indicados (días después de la infección) en un MOI de 0,01 pfu/célula y la concentración de virus se determina mediante un ensayo de placa.

La figura 20 es una copia de una fotografía de un filtro de nitrocelulosa con manchas de las muestras de RNA aislado de las células infectadas en cultivo de tejido. Los filtros tienen sondas de DNA con desplazamiento de mella (nick-translated) de pTBE(ME)/DEN4 marcado con [P^{32}].

La figura 21 es una fotografía del gel de poliacrilamida para la separación de proteínas de lisados celulares de células LLC-MK_{2} o C6/36 infectadas con vTBE(ME)/DEN4 y DEN4 en diversos tiempos después de la infección.

En la figura 22 se recogen los resultados de un estudio para determinar la eficacia protectora y la neurovirulencia del vTBE(ME)/DEN4 en ratones.

En la figura 23 se proporciona un listado de varias mutaciones incorporadas a título de ejemplo en el constructo TBE(ME)/DEN4 para evaluar el efecto de las mutaciones en la neurovirulencia.

En la figura 24 se recogen los resultados de los estudios de neurovirulencia empleando quimeras de TBE(ME)/
DEN4 recuperadas de constructos que contienen mutaciones representadas en la figura 23.

Descripción detallada de la invención Generación de flavivirus quiméricos

El virus del dengue contiene un genoma de RNA de hebra positiva de aproximadamente 11 kilobases, que en un marco abierto de lectura codifica a tres proteínas estructurales (cápside (C), premembrana (preM) y envoltura (E)), seguido por siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).

La presente invención se refiere a un virus quimérico del dengue que contiene proteínas no estructurales de un "tipo" de virus del dengue o un flavivirus y proteínas estructurales de un "tipo" diferente de virus del dengue o de otros flavivirus.

En una forma de ejecución, la presente invención se refiere a un virus quimérico que contiene:

1) una región no estructural del virus del dengue de tipo 1, 2, 3 ó 4, del virus de la fiebre amarilla, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o de un flavivirus y

2) una región estructural del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2, del virus del dengue de tipo 3, del virus del dengue de tipo 4, del virus de la fiebre amarilla, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o de un flavivirus, dicha región estructural es de un virus del dengue de "tipo" diferente al de la región no estructural.

En otra forma de ejecución, la presente invención se refiere a un virus quimérico que contiene:

1) una región no estructural del virus del dengue de tipo 4 (DEN4) y

2) una región estructural elegida entre el virus del dengue de tipo 1, el virus del dengue de tipo 2, el virus del dengue de tipo 3, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y un flavivirus. En una forma preferida de ejecución, el virus está sustancialmente libre de la región estructural del virus del dengue de tipo 4. En una forma preferida de ejecución, el virus contiene RNA p2A(D1 WP) o p2A(D2 NGC).

1) una región no estructural de virus del dengue de tipo 1 y

2) una región estructural del virus del dengue de tipo 2, del virus del dengue de tipo 3, del virus del dengue de tipo 4, del virus de la fiebre amarilla, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o de un flavivirus.

1) una región no estructural de virus del dengue de tipo 2 y

2) una región estructural del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 3, del virus del dengue de tipo 4, del virus de la fiebre amarilla, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o de un flavivirus.

1) una región no estructural de virus del dengue de tipo 3 y

2) una región estructural del virus del dengue de tipo 1, del virus del dengue de tipo 2, del virus del dengue de tipo 4, del virus de la fiebre amarilla, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o de un flavivirus.

1) una región no estructural elegida entre el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y un flavivirus y

2) una región estructural elegida entre el virus del dengue de tipo 1, el virus del dengue de tipo 2, el virus del dengue de tipo 4, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o un flavivirus; dicha región estructural es de un virus diferentes al de la región no estructural.

En otra forma de ejecución, la presente invención se refiere a una vacuna que contiene por lo menos uno de los virus quiméricos recién descritos y un vehículo farmacéutica e inmunológicamente aceptable.

La vacuna contiene virus en una cantidad elegida en función de la vía de administración. Aunque son preferidas las vías de administración subcutáneas, la vacuna recién descrita puede administrarse también por vía intradérmica. Un experto en la materia sabrá apreciar que se pueden determinar fácilmente las cantidades a administrar para cada régimen concreto de tratamiento.

En otra forma de ejecución más, la presente invención se refiere a una vacuna que contiene:

1) un virus quimérico que tiene una región no estructural del virus del dengue de tipo 4 y una región estructural del virus del dengue de tipo 1;

2) un virus quimérico que tiene una región no estructural del virus del dengue de tipo 4 y una región estructural del virus del dengue de tipo 2;

3) un virus quimérico que tiene una región no estructural del virus del dengue de tipo 4 y una región estructural del virus del dengue de tipo 3; y

4) un virus del dengue de tipo 4 atenuado.

En una forma preferida de ejecución, el virus atenuado contiene una mutación (mutación puntual, deleción, adición o una combinación de las mismas) en una región de proteína no estructural (por ejemplo una secuencia de sitio de rotura NS1-NS2 alterada). En otra forma preferida de ejecución, el virus atenuado contiene una mutación (mutación puntual, deleción, adición o una combinación de las mismas) en la región no codificadora 3'. En otra forma preferida de ejecución, el virus atenuado tiene una mutación (mutación puntual, deleción, adición o una combinación de las mismas) e la región no codificadora 5'. En otra forma preferida de ejecución, el virus atenuado se deriva naturalmente o se diseña por ingeniería genética en el laboratorio.

En una forma de ejecución, la presente invención se refiere a un segmento de DNA que codifica por lo menos a uno de los virus recién descritos. En una forma preferida de ejecución, el segmento de DNA contiene un promotor (con preferencia un promotor eucariota, procariota o vírico; con mayor preferencia un promotor SP6 o T7) unido operativamente a la región estructural y no estructural. En otra forma preferida de ejecución, el segmento de DNA contiene p2A(D1 WP) o p2A(D2 NGC).

Por lo tanto, utilizando los métodos facilitados en los ejemplos siguientes se contempla que el experto en la materia podrá generar vacunas de virus del dengue quimérico que contienen recombinantes intertípicos que combinan regiones estructurales de un miembro de la familia flavivirus con regiones no estructurales de otra familia de flavivirus. En una forma preferida de ejecución se producen virus del dengue quiméricos que incorporan proteínas no estructurales del virus del dengue de tipo 4 (DEN4) con proteínas estructurales del virus del dengue de tipo 1. Se encontrará un compendio de estos métodos en Bray y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 1042-1046, 1991.

En el siguiente ejemplo 17 se describe la producción de un virus quimérico que incorpora las regiones no estructurales del virus del dengue de tipo 4 con las regiones estructurales del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV(CME)/DEN4) con arreglo a los métodos facilitados para la producción del virus quimérico del dengue en el ejemplo 1. Los virus producidos por estos métodos y replicados en cultivos se utilizan para infectar células en cultivo de tejido o animales de laboratorio.

Mutaciones del genoma del virus del dengue que afectan la neurovirulencia

Hemos diseñado además una serie de mutantes viables del virus del dengue que contienen deleciones en la región no codificadora 3' y que presentan propiedades alteradas de crecimiento y de morfología de placa en cultivo celular. De igual manera hemos diseñado otra serie de mutantes de virus del dengue de crecimiento restringido que contienen sustituciones de aminoácidos en una nueva secuencia de sitios de rotura de la región no estructural de la poliproteína vírica. Se evalúa la virulencia reducida de los mutantes del virus del dengue con capacidad replicativa reducida en animales experimentales para determinar su idoneidad para el uso en una vacuna de virus vivo.

En la presente invención se efectúa la construcción de los mutantes de crecimiento restringido del virus del dengue de tipo 4, que contienen deleciones en la región no codificadora 3', empleando un clon de cDNA del virus del dengue de tipo 4 de longitud completa para las deleciones de ingeniería genética en regiones estratégicas. Los mutantes de deleción pueden ofrecer la ventaja de estar menos sujetos a la reversión del fenotipo que los mutantes de sustitución de aminoácidos.

Al igual que otros flavivirus transmitidos por mosquito, el virus del dengue de tipo 4 tienen una secuencia no codificadora 3' que contiene regiones conservadas, denominadas secuencia conservada 1 (CS-1) y secuencia conservada 2 (CS-2) y una estructura terminal potencial de tipo tallo-y-bucle. Las deleciones comprendidas entre 3 y 202 nucleótidos pueden introducirse en varias posiciones de la secuencia no codificadora 3' de 384 nucleótidos del cDNA del virus del dengue de tipo 4. Los transcritos de RNA obtenidos a partir de un clon de cDNA al que le falta la secuencia de la región CS-1, pero conserva la estructura de tallo-y-bucle, que no producen progenie, indican que la deleción es letal. Por otro lado, los virus infecciosos pueden recuperarse de gran parte de constructos de deleción de una región distinta de la región no codificadora 3'.

Los ensayos de placa de estos mutantes y el virus de tipo salvaje pueden realizarse en células de mosquito (C6/36). Los resultados de estos análisis indican que la mayor parte de mutantes de deleción forman placas que tienen un tamaño reducido, situándose entre 1,0 y 0,3 cm, en función de la ubicación y de la extensión de la deleción. Esta forma de morfología alterada de placa indica que estos mutantes de deleción presentan un fenotipo de restricción de crecimiento: la infectividad y la inmunogenicidad de este panel de mutantes de virus del dengue que contiene deleciones en la región no codificadora 3' puede evaluarse mediante ensayos con animales. Los mutantes que presentan una virulencia reducida para los primates experimentales son los virus candidatos para las vacunas que se evaluarán en humanos.

La presente invención se refiere además a un constructo de DNA recombinante que consta de un fragmento de DNA que contiene una deleción en la región no codificadora 3' y un vector. La invención se refiere además a células hospedantes transfectadas con el constructo de DNA. La invención se refiere también a un método para producir mutantes del virus del dengue de tipo 4 que consiste en los pasos de introducir mutaciones por deleción en la región no codificadora 3' del genoma vírico y recuperar los virus infecciosos que albergan las mutaciones por deleción.

En otra forma de ejecución, la presente invención se refiere a un fragmento de DNA que codifica a un RNA del virus del dengue de tipo 4, dicho fragmento contiene una sustitución en la secuencia que codifica a uno o varios de los ocho aminoácidos del extremo C de la NS1 del sitio de rotura de la proteína no estructural NS1-NS2A. En la figura 16 se recoge un resumen de las sustituciones. La presente invención se refiere también a un fragmento de DNA que codifica a un RNA del virus del dengue de tipo 4, dicho fragmento contiene una sustitución en la posición codificadora de la glicina, es decir, la posición +1 después del sitio de rotura de la proteína no estructural NS1-NS2A. La invención se refiere además a un transcrito de RNA infeccioso de los fragmentos de DNA descritos en esta solicitud.

La construcción de mutantes del virus del dengue del tipo 4 de crecimiento restrictivo que contienen mutaciones en las proteínas no estructurales pueden realizarse empleando un clon de cDNA del virus del dengue del tipo 4 de longitud completa para diseñar por ingeniería genética dichas mutaciones estratégicas. Las mutaciones que afectan la actividad funcional de las proteínas no estructurales del virus del dengue pueden provocar una restricción de crecimiento. Por ejemplo, una modificación de la secuencia de rotura o un resto de proteasa vírica puede traducirse en una rotura subóptima de la poliproteína vírica, restringiendo de este modo el crecimiento vírico.

Hemos elegido el sitio de rotura de la poliproteína NS1-NS2A como diana para la construcción de mutantes del virus del dengue que tienen un crecimiento restringido debido a una rotura o división ineficaz. Hemos puesto de manifiesto que la rotura NS1-NS2A del virus del dengue de tipo 4 requiere un dominio de 8 aminoácidos en el extremo C de la NS1. Hemos demostrado además el efecto de las sustituciones en cada una de estas posiciones y Gly en la posición +1 después del sitio de rotura.

Se ha evaluado un panel de mutaciones de sustitución de aminoácidos en este dominio con respecto su efecto en la rotura (véase figura 16). Se han identificado mutaciones que producen un amplio abanico de efectos en la rotura y se han seleccionado tales mutaciones para la incorporación en un clon cDNA de virus del dengue de tipo 4 de longitud completa. Se han utilizado transcritos de RNA derivados del cDNA mutante para transfectar células que producen mutantes viables del virus del dengue que lleven una mutación definida en la región de la rotura de la NS1-NS2A. Estos mutantes se caracterizan en primer lugar por ensayo de placa en células C6/36 de mosquito. Varios mutantes producen placas de tamaño reducido, que indica que estos virus mutantes presentan una restricción de crecimiento en cultivo celular.

La presente invención se refiere además a un constructo de DNA recombinante que consta de un fragmento de DNA que contiene una mutación de sustitución en la secuencia que codifica a uno o varios de los ochos aminoácidos del extremo C de la NS1 del sitio de rotura de la proteína no estructural NS1-NS2A y un vector. La invención se refiere también a células hospedantes transfectadas con el constructo de DNA.

Además, la presente invención se refiere a un constructo de DNA recombinante que contiene el fragmento de DN A que tiene una sustitución en la posición que codifica a la glicina, es decir, la posición +1 después del sitio de rotura de la proteína no estructural NS1-NS2A, y un vector. La invención se refiere además a células hospedantes transfectadas con el constructo de DNA.

En otra forma de ejecución, la presente invención se refiere a una vacuna para humanos contra el virus del dengue de tipo 4 que contiene un virus mutante del dengue de tipo 4, ya descrito antes, que presenta una virulencia reducida, en una cantidad suficiente para inducir la inmunización contra la enfermedad.

Los mutantes de la invención puede evaluarse en primates en los aspectos siguientes: (1) virulencia medida por la duración de la viremia y (2) inmunogenicidad indicada por el tipo y la magnitud de la respuesta de anticuerpo como consecuencia de la infección vírica. Durante los ensayos clínicos en humanos se pueden evaluar los mutantes del virus del dengue que presentan virulencia reducida, pero todavía conservan una inmunogenicidad suficiente en monos.

En otra forma de ejecución, la presente invención se refiere a la construcción de virus del dengue de tipo 4, que contienen mutaciones en la región no codificadora 3' del dengue de tipo 4 y/o genes de proteína no estructural que confieren una atenuación satisfactoria y el uso de cada uno de los mutantes del virus del dengue de tipo 4 para construir virus quiméricos intertípicos de especificidad antigénica de otros serotipos de virus del dengue, creando para ello virus atenuados que pueden utilizarse para prevenir la enfermedad causada por el virus del dengue de tipo 1, de tipo 2 o de tipo 3. Los virus quiméricos pueden construirse también con especificidad antigénica para otros flavivirus, como son el virus de la encefalitis japonesa y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas.

La estrategia actual de inmunización contra el dengue favorece e uso de una preparación de tipo vacuna que contenga los cuatro serotipos del dengue. Esto protegería a los individuos de regiones endémicas contra el riesgo de síndrome de choque hemorrágico grave del dengue, que resultaría de la posterior infección con un serotipo diferente de dengue. Actualmente se están preparando vacunas candidatas de dengue atenuado por técnicas estandarizadas que incluyen un pasaje en serie en células de un hospedante no natural. El éxito que se logra con estos mutantes de un hospedante es limitado. Por ejemplo, la vacuna del dengue 2 se ha observado que está atenuada satisfactoriamente, mientras que la vacuna del dengue 3 preparada por este método provoca fiebres de dengue en los voluntarios humanos.

La presente invención proporciona un método para construir virus quiméricos viables de dengue. La presente invención proporciona además métodos de producción de una vacuna eficaz contra los cuatro serotipos de dengue empleando virus quiméricos que comparten una base genética común de virus del dengue de tipo 4, que contiene las secuencias no codificadoras 5' y 3' del virus de tipo 4 así como secuencias codificadoras de todas sus 7 proteínas no estructuras.

A este fin hemos construido un virus del dengue de tipo 4 que contiene deleciones en el sistema no codificador 3' o en uno de los genes de proteína no estructural y hemos puesto de manifiesto que estos mutantes del virus del dengue presentan una restricción significativa de la capacidad replicativa. Por consiguiente, las mutaciones que confieren una atenuación satisfactoria pueden diseñarse dentro de estas regiones comunes, resultando de ello un grupo de cuatro virus de dengue clonados atenuados, que expresarían por separado las cuatro especificidades de serotipo de dengue. Estos virus pueden incluir el virus de tipo 4 parental, una quimera de tipo 1 (región estructural del gen de proteína)-tipo 4, una quimera similar de tipo 2-tipo 4 y una quimera similar de tipo 3-tipo 4, así como quimeras de los virus de la encefalitis japonesa y de la encefalitis transmitida por garrapatas.

Se ha constatado que las vacunas con virus del dengue completo inactivado carecen de inmunogenicidad suficiente. Las vacunas de virus vivo atenuado por pasaje en serie en cultivo celular han sufrido una atenuación insuficiente, una inestabilidad genética o una sobreatenuación. Una vacuna de dengue de tipo 2 se halla todavía en un estado inicial de desarrollo. Las vacunas vivas de los tres serotipos restantes no están disponibles. La presente invención constituye un avance técnico en la capacidad de construir virus del dengue con mutaciones definidas en el genoma vírico.

Vacuna del virus quimérico de la encefalitis transmitida por garrapatas

Se prepara el virus quimérico de la encefalitis transmitida por garrapatas por incorporación de tres secuencias de proteína estructural: cápside, membrana y envoltura en un constructo de virus del dengue que contenga secuencias que codifican a proteína no estructural del virus del dengue.

Es probable que el virus de la combinación de las encefalitis del dengue/transmitida por garrapatas (TBEV) requiera la cooperación del virus del dengue, la proteína vírica del TBEV y secuencias de ácido nucleico. El constructo ha generado virus que no son infecciosos, si se comparan con el virus natural. El DEN4 y el TBEV tienen la misma organización de genoma y comparten la misma estrategia de expresión genética, pero la comparación de las secuencias de los dos virus indica que la homología de secuencia es relativamente baja (Pletnev y col., Virology 174, 250-263, 1990; que se incorpora a la presente como referencia). Por ejemplo, la identidad de aminoácidos entre los dos virus es del 15,4% para la proteína de la cápside (C), del 15,9% para la proteína de membrana (M), del 36,5% para la glucoproteína de la envoltura (E) y del 39,1% para la proteína no estructural (NS1). La siguiente forma de ejecución describe una vacuna mejorada de TBEV quimérico.

Hemos descrito anteriormente cDNA de virus de longitud completa del dengue clonado, que hemos utilizado como molde para la transcripción "in vitro" del RNA infeccioso. Para ello se han clonado copias estables de longitud completa del cDNA del dengue en una cepa de E. coli empleando el vector pBR322. Se recupera el virus del dengue de células permisivas transfectadas con transcritos de RNA "in vitro" del cDNA. Las propiedades de los virus producidos por células transfectadas con transcritos de RNA infecciosos del cDNA del dengue son idénticas a las propiedades del virus del que se ha derivado del clon cDNA.

Además hemos descrito en esta invención la producción de un virus quimérico del dengue que tiene un genoma que contiene genes de proteína no estructural de un serotipo del virus del dengue y genes de proteína estructural de otro serotipo del virus del dengue. Como ejemplo de virus quimérico del dengue, se utilizan secuencias de genes de la cápside, la preM (premembrana) y la envoltura de un virus del dengue para reemplazar los genes correspondientes del virus del dengue de tipo 4 en un constructo de cDNA recombinante. Los virus producidos en células transfectadas con este constructo son útiles para la preparación de vacunas contra virus homotípicos del dengue. Tal como se ha descrito antes, esta solicitud describe además la construcción de virus quiméricos que contienen secuencias genéticas correspondientes a una región no estructural del virus del dengue a una región estructural de otro flavivirus. Se describe en particular un virus quimérico de encefalitis transmitida por garrapatas. Los métodos de esta invención descritos en la sección titulada "Generación de flavivirus quiméricos" ilustran la producción de un constructo de virus de dengue recombinante que incorpora las tres proteínas estructurales del TBEV. Los virus producidos en células transfectadas con este constructo son candidatos para las vacunas de virus vivos.

La invención asociada con esta solicitud proporciona una mejora significativa e inesperada de la producción de flavivirus quiméricos de la técnica anterior así como una evidencia concluyente de la utilidad de esta nueva estrategia de vacunación. El experto en la materia puede esperar que una combinación de flavivirus quimérico que incorpora todas las proteínas estructurales de un virus y los elementos no estructurales de un segundo virus se podrán recuperar fácilmente y replicar con eficacia en células cultivadas, debido a los posibles requisitos de cooperación funcional de las proteínas estructurales derivadas de los flavivirus poco afines. Sin embargo, de modo inesperado, la presente invención identifica un virus TBEV quimérico (TBEV/DEN4) que contiene dos proteínas estructurales (a saber, M y E) del genoma del TBEV que se combinan con una tercera proteína estructural (a saber, C) del virus del dengue.

Producción de constructos quiméricos TBEV/DEN4

Dado que la homología de secuencias de aminoácidos entre el DEN4 y el TBEV es baja, se ha preparado una serie de constructos de cDNA quimérico de TBEV y DEN4 sustituyendo las secuencias correspondientes de DEN4 por secuencias de TBEV. Estos constructos se obtienen empleando técnicas bien conocidas en biología molecular. Se ensayan los constructos para determinar si algunas de las distintas combinaciones genéticas daba lugar a un virus quimérico viable después de la transcripción "in vitro" del constructo de cDNA y la transfección del producto RNA en células susceptibles. Previamente se clonan fragmentos de cDNA subgenómico del TBEV (cepa Sofjin) y se determinan las secuencias de nucleótidos aplicando métodos bien conocidos de la técnica (véase Pletnev y col., Virology, lugar citado; y Pletnev y col., FEBS Lett. 200, 317-321, 1986). Estos plásmidos proporcionan secuencias de genes que se solapan, de modo que juntos abarcan la secuencia completa del genoma del TBEV. Empleando como moldes los plásmidos pGEM2-CME o pGEM2-ENS1 y cebadores oligonucleótidos apropiados (véase el ejemplo 17) se prepara una serie de fragmentos de cDNA de TBEV por una reacción en cadena de polimerasa (PCR), cada fragmento define uno o varios genes franqueados por sitios de rotura para las enzimas de restricción. Los fragmentos se recoge en la figura 17 y la secuencia de los fragmentos que se indica con las posiciones de los nucleótidos en el margen derecho puede encontrarse en la publicación de Pletnev y col., Virology 174, 250-263, 1990. En la figura 17 se representan siete fragmentos de cDNA de TBEV de este tipo y los extremos modificados, idóneos para la unión con los sitios apropiados, introducidos en transcritos RNA de cDNA de DEN4 mediante mutagénesis dirigida a una posición. Se construyen los plásmidos pGEM2-CME, que contienen los nucleótidos (nt) de 76 a 1977, y pGEM2-ENS1, que contiene los nucleótidos de 966 a 3672 de la secuencia del TBEV, a partir de los plásmidos p10, p4, p18, p2, p11 (véase Pletnev y col., Virology, 1990, lugar citado) por ligación de los fragmentos de TBEV en los sitios compartidos de enzima de restricción. Se utilizan los plásmidos DEN4 p5'-2 y p5'-2 (\DeltaPstI.XhoI) (Bray y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, lugar citado) y un derivado, el p5'-2(\DeltaPstI.XhoI.\DeltaHindIII) para la sustitución de uno o varios genes de TBEV en lugar de los genes correspondientes de DEN4. Los expertos en biología molecular serán capaces de utilizar las secuencias de cebador SEQ ID NO: 21-31, identificadas en el ejemplo 17, para generar los constructos quiméricos de TBEV. Las secuencias de las uniones de los constructos quiméricos se comprueban por secuenciación de ácidos nucleicos. Todos los plásmidos quiméricos resultantes contienen el promotor SP6 posicionado en dirección al extremo 5' (upstream) de una G que inicia la transcripción seguida por un resto A que representa el primer nucleótido del DEN4. Antes de la transcripción "in vitro" se linealizan los plásmidos en el sitio de rotura único Asp718, que sigue inmediatamente después del extremo 3' de la secuencia del DEN4. Los constructos se transcriben por transcripción "in vitro" empleando técnicas ya publicadas por Lai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5139-5143, 1991. Los productos de transcripción de los constructos quiméricos de la figura 17 se analizan para comprobar su infectividad, para ello se transfecta el RNA a células LLC-MK_{2} de simios.

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Las técnicas de transfección utilizadas son la Lipofectina^{TM} (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersberg, Maryland) o el DOTAP (metilsulfato de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) para introducir los transcritos de RNA quimérico en células permisivas. En estos procedimientos se emplean cultivos de células LLC-MK_{2} de simios, pero está contemplado que para la replicación del TBEV puede emplearse alternativamente cualquier otro tipo de células permisivas. Se evalúa la presencia de virus en los cultivos transfectados a lo largo del tiempo mediante inmunofluorescencia empleando suero de conejo específico del TBEV o fluido ascítico de ratón hiperinmune. Las células transfectadas con transcritos de RNA del pTBE(ME)/DEN4 (incluidas las secuencias de las proteínas de premembrana y de envoltura del TBEV unido a la proteína de la cápside y las secuencias no estructurales del DEN4) se tiñen positivamente con suero de conejo específico del TBEV, con líquido ascítico de ratón hiperinmune (HMAF) específico del TBEV y con HMAF específico del DEN4. Los cultivos de control, infectados únicamente con DEN4, son negativos para el suero específico de TBEV marcado con inmunofluorescencia. Esto indica que el vTBE(ME)/DEN4 quimérico expresa tanto los antígenos específicos del TBEV como los del DEN4.

El virus quimérico se aísla de las trasfecciones vTBEV y se denomina TBE(CME)/DEN4 (el constructo genómico incluye los genes de la cápside, la membrana y la envoltura del TBEV y secuencias no estructurales del DEN4) y vTBE(ME)/DEN4. Tal como se describe en el ejemplo 17, dieciséis días después de la transfección con RNA de TBE(CME)/DEN4 aproximadamente el 1% de las células se tiñen positivamente con los antígenos específicos del TBEV y DEN4. El porcentaje de células positivas aumenta con el tiempo, formándose un pico de concentración de 6x10^{5} pfu/ml en el día 26 después de la transfección, con un 80% de células transfectadas. A diferencia de ello, las células transfectadas con RNA de TBE(ME)/DEN4 producen virus con mayor rapidez y en el día 16 está ya infectado el 100% del cultivo. En cambio, la concentración de virus TBE(ME)/DEN4 (denominados vTBE(ME)DEN4) presentes en las células transfectadas es de 4x10^{6} pfu/ml en el día 26 después de la infección. Además, se secuencia el virus de progenie producido a partir de células infectadas con los constructos quiméricos, confirmándose que las uniones de fragmentos genómicos de DEN4 y TBEV de los viriones quiméricos todavía se aparean en las uniones de los constructos quiméricos, tal como se ilustra en la figura 17.

Caracterización de los virus TBEV/DEN4

Los virus quiméricos se caracterizan empleando los métodos facilitados en el ejemplo 17 y todo el trabajo realizado con los virus quiméricos TBEV/DEN4 se realiza en un establecimiento de confinamiento BL-3.

Se comparan las proteínas producidas a partir de virus quiméricos con las proteínas producidas por el virus del dengue 4. Las proteínas del virus del dengue 4, recuperadas de clones cDNA de DEN4 de longitud completa, se identifican en la sección titulada "Generación de flavivirus quiméricos", ilustrada en la figura 4 y descrita por Bray y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, lugar citado). El modelo de separación de proteínas de virus del dengue se compara con las proteínas víricas quiméricas producidas por células infectadas con vTBE(ME)DEN4. En este ensayo (véanse la figura 18 y el ejemplo 18) se infectan células LLC-MK_{2} confluyentes en una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01. Se incuban los cultivos infectados con metionina-S^{35} empleando técnicas descritas por Lai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, lugar citado. Los lisados de células infectadas se inmunoprecipitan en la pista 1) con HMAF específico de TBEV; 2) con HMAF específico de DEN4; 3) suero de conejo dirigido contra la NS3 de DEN; 4) antisuero de conejo específico de la NS5 de DEN4; 5) antisuero de conejo específico de la preM de DEN4, o 6) antisuero de conejo específico de la proteína E del DEN4. Se analizan los inmunoprecipitados por electroforesis a través de gel de poliacrilamida (PAGE) en condiciones de desnaturalización, tal como se ilustra en la figura 18, empleando técnicas descritas por Laemmli (Nature 227, 680-685, 1970). Tanto el virus quimérico como el parental de DEN4 producen bandas de proteína identificadas como NS3 y NS5 de DEN4 (pistas 3 y 4). Las proteínas preM y E del DEN4 no se identifican en células infectadas con el virus quimérico, pero se identifican en las células infectadas con DEN4 (ver pistas 5 y 6). El HMAF específico del DEN4 precipita únicamente las bandas proteicas de los lisados celulares infectados con vTBE(ME)/DEN4 que comigran con las proteínas no estructurales NS1 y NS3 del DEN4 (pista 2). El HMAF de TBEV inmunoprecipita una proteína que tiene el tamaño correcto de una proteína E de TBEV (55 kDa) del lisado de células infectadas con el vTBE(ME)/DEN4 quimérico. Las proteínas de las células infectadas con el virus quimérico migran con mayor rapidez que la E del DEN4 (pistas 1 y 6). En los ensayos previos, el HMAF de TBEV no consigue precipitar las proteínas de preM ni de C del TBEV nativo de las células infectadas con TBEV. Por lo tanto, no se espera la identificación de las proteínas preM ni C del TBEV. El perfil de bandas de proteína producido en células LLC-MK_{2} por el vTBE(CME)/DEN4 es idéntico al producido por el vTBE(ME)/DEN4. Por tanto, los virus quiméricos producen las proteínas esperadas en las células LLC-MK_{2}.

Se evalúa la morfología de placa de los virus comparando las placas víricas producidas por el DEN4 con la de placas producidas a partir de constructos quiméricos. Las placas víricas de DEN4 tienen un tamaño medio de 12,1 mm en células C6/36 de mosquito, mientras que las placas producidas con vTBE(ME)/DEN4 tienen un tamaño medio de 6,5 mm. En cambio, las placas producidas por el vTBE(ME)/DEN4 son 5 veces más grandes que las producidas por el DEN4 en células LLC-MK_{2} de simios. Esto sugiere que el virus quimérico se replica con mayor eficacia en células LLC-MK_{2} que el DEN4. Estos resultados inesperados se confirman con el análisis de la velocidad de crecimiento y el rendimiento vírico del vTBE(ME)/DEN4 en células LLC-MK_{2} infectadas (ver figura 19).

Los virus quiméricos alcanzan una concentración de 10^{8} pfu/ml que es aproximadamente 1000 veces mayor que la lograda por el DEN4 parental en las mismas condiciones. El virus vTBE(ME)/DEN4 quimérico crece más lentamente en células C6/36 de mosquito y alcanza una concentración 100 veces menor que la producida por el DEN4 parental. El tamaño de placa del vTBE(ME)/DEN4 quimérico no difiere apreciablemente del DEN4 en células LLC-MK_{2}. En estos estudios se cuantifica el virus por ensayo de placa aplicando las técnicas descritas por Bancroft y col., Pan Am. Health Organ. Sci. Publ. 375, 175-178, 1979. La diferencia en el tamaño de placa puede reflejar una incompatibilidad de la proteína C del TBEV con el RNA vírico del DEN4, que impide la interacción eficaz de las proteínas durante el empaquetamiento del RNA vírico y la maduración vírica. Es posible además que la diferencia de tamaños de placa sea el resultado de una sustitución de los seis nucleótidos en dirección a 5' (upstream) del codón AUG de la región no codificadora 5' del DEN4. Este cambio de secuencia puede influir en la eficacia de la traducción de la proteína
vírica.

El análisis de la producción de RNA vírico (figura 20) de los constructos quiméricos junto con los datos proteicos de la figura 21 proporcionan una explicación del fenotipo de placa pequeña y de la reducida velocidad de crecimiento del vTBE(ME)/DEN4 en células C6/36 infectadas. Se recogen los cultivos de células LLC-MK_{2} o C6/36 (aproximadamente 10^{6} células) en diferentes momentos después de la adsorción del virus y se lisan en tampón que contiene dodecilsulfato sódico (SDS). Se aísla el RNA total del lisado celular y del medio por extracción con fenol, empleando técnicas descritas por Maniatis y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1982. Se desnaturalizan las muestras de RNA en formaldehído y se aplican a un filtro de nitrocelulosa (BA85, Schleicher y Schuell). Se hibridan los filtros con una sonda de DNA de pTBE(ME)/DEN4 marcada con [P^{32}] que ha sufrido desplazamiento de mella (nick-translated). Los transcritos de RNA obtenidos "in vitro" a partir del pTBE(ME)/DEN4 se emplean como control positivo.

Se comparan las proteínas víricas de las células LLC-MK_{2} o C6/36 infectadas con DEN4 con las proteínas víricas de las células LLC-MK_{2} o C6/36 infectadas con vTBE(ME)/DEN4. Las proteínas víricas del DEN4, incluidas la E, NS1 y NS3, se acumulan hasta un nivel alto en células LLC-MK_{2} o C6/36 infectadas con DEN4 después de 48 de la infección (figura 21). Sin embargo, la cinética de la síntesis de las proteínas víricas difiere entre las células LLC-MK_{2} y C6/36 infectadas con vTBE(ME)/DEN4. Las proteínas víricas se detectan después de 8 h de la infección en las células LLC-MK_{2}, mientras que las proteínas víricas no se detectan en las células C6/36 hasta después de pasadas 48 h de la invención. Aproximadamente el 70% de los viriones del vTBE(ME)/DEN4 permanece en el medio después de la inoculación a las células C6/36, mientras que solo una pequeña fracción del virus inoculado se encuentra en el medio en el caso de los cultivos celulares de LLC-MK_{2}. Estos resultados sugieren que la entrada del vTBE(ME)/DEN4 quimérico en las células LLC-MK_{2} es más eficaz que la entrada en las células C6/36 y, posiblemente como consecuencia de ello, el virus crece más lentamente y hasta una concentración más baja en estas células, si se compara con el virus DEN4. Después de la entrada en las células LLC-MK_{2}, la replicación del RNA vírico quimérico es más rápida que la del RNA vírico del DEN4. Por otro lado, la síntesis del RNA del virus quimérico es más lenta que la del DEN4 en las células C6/36 infectadas. Por lo tanto, el vTBE(ME)/DEN4 presenta una eficacia reducida para entrar en las células de mosquito y esto conlleva una producción reducida de RNA vírico y de proteínas. Estas observaciones son consistentes con la baja eficacia de transfección del RNA del virus TBEV en las células C6/36 (Mandl y col., J. Virol. 65, 4070-4077, 1991).

Los expertos en la materia comprenderán que existe una gran variedad de métodos para combinar secuencias de ácidos nucleicos de un virus con las secuencias de ácido nucleicos de otros virus. Tales esquemas de ligación y estrategias de clonación ya son conocidos en la técnica. Por lo tanto se contempla que pueden utilizarse otras técnicas y el uso de tales técnicas no se aparta de la invención reivindicada.

Eficacia de la vacuna quimérica y determinación de la neurovirulencia

Se evalúa la eficacia protectora del vTBE(ME)/DEN4 en forma de vacuna introduciendo la preparación del virus en animales experimentales a través de diversas vías de administración. Se compara la neurovirulencia del vTBE(ME)/DEN4 con la del virus del dengue parental después de la inoculación intracerebral (IC) a ratones. Otras vías de administración incluyen las inyecciones intradérmica (ID) o intraperitoneal (IP). En un ensayo se inyecta a ratones BALB/c lactantes de tres días de edad por vía IC una dosis de 10^{2} pfu del virus en 0,02 ml de MEM/0,25% de albúmina de suero humano y en otro conjunto de ensayos se inocula a ratones BALB/c hembras de seis semanas de edad por vías IC, ID o IP. Se observan los ratones durante 21 días, anotando los síntomas de encefalitis o muerte y los ratones adultos supervivientes se sangran 20 días después de la infección para evaluar la respuesta de anticuerpos al TBEV. Se tratan los ratones supervivientes por vía IP al cabo de 21 días de la infección con 10^{3} LD_{50} de TBEV (cepa Sofjin) en el establecimiento de confinamiento BL-4 para determinar la eficacia protectora de la vacuna.

El vTBE(ME)/DEN4 conserva la neurovirulencia de su TBEV original cuando se inocula a directamente al cerebro (IC) de ratones lactantes o adultos (figura 22 y ejemplo 21). Como control positivo se realizan comparaciones con una cepa representativa del TBEV (cepa Sofjin). El TBEV es muy neurovirulento y 0,1 pfu causan fácilmente una encefalitis fatal en el 50% de los ratones lactantes inoculados por vía IC. De igual manera, el TBEV es también muy neurovirulento para ratones adultos cuando se inocula por vía IP. En este caso la ID_{50} es de 14,2 pfu. En cambio, el vTBE(ME)/DEN4 no produce encefalitis cuando se inocula por vía periférica, ya sea ID, ya sea IP (véase la figura 22), lo cual indica que estas serían vías potencialmente seguras para la vacunación.

Se analiza la inmunogenicidad del vTBE(ME)/DEN4 por inmunoprecipitación del anticuerpo del virus empleando antígenos marcados con [S^{35}] y anticuerpo del suero de los ratones supervivientes. Los análisis de los inmunoprecipitados mediante electroforesis a través de gel de poliacrilamida indican que los anticuerpos específicos de la NS1 del DEN4 (una proteína codificada por el virus quimérico) se detectan fácilmente, pero los anticuerpos de la E del TBEV son de una concentración baja o no son detectables. Presumiblemente, dado que los ratones no son un hospedante natural del TBEV, la inoculación periférica de los ratones solo da pie a un nivel bajo de replicación vírica.

Se estudian los ratones que sobreviven a la inoculación IP o ID del vTBE(ME)/DEN4 para comprobar su resistencia al posterior tratamiento letal con TBEV. Veintiún días después de la inoculación con el virus vTBE(ME)/DEN4 o el DEN4, los ratones se tratan por vía IP con 10^{3} LD_{50} de la cepa muy neurovirulenta Sofjin del TBEV. Los ratones que sobreviven a la inoculación IP o ID con el vTBE(ME)/DEN4 quimérico quedan protegidos contra el tratamiento posterior, mientras que los tres grupos de ratones previamente inmunizados con el DEN4 mueren entre el día 11 y el día 20 (ver figura 22). Estos resultados indican que el virus en forma de vacuna es protector y específico para la infección del TBEV. Los ratones de control no inmunizados mueren de encefalitis entre el día 10 y el día 16 después de la infección con el TBEV. El virus vTBE(ME)/DEN4 provoca de modo uniforme la encefalitis en ratones lactantes y adultos después de la inoculación intracerebral, mientras que los ratones inoculados con el DEN4 desarrollan la enfermedad asociada con el virus del dengue con una frecuencia baja. Por lo tanto, el virus quimérico conserva la neurovirulencia del TBEV, del que derivan los genes de preM y de E. Esto indica que la mayoría, si no todos, de los determinantes genéticos de la neurovirulencia del TBEV en el ratón estriban en estos dos genes proteicos estructurales. Sin embargo, a diferencia del TBEV parental, el vTBE(ME)/DEN4 no es patógeno cuando se inoculan los ratones adultos por vía periférica, lo cual indica una pérdida de la neuroinvasividad en caso de inoculación periférica. Estos resultados sugieren que se requiere una región del genoma del TBEV, distinta de los genes preM y E, para que el TBEV pueda invadir el SNC y producir la encefalitis. Los ratones inoculados periféricamente con el vTBE(ME)/DEN4 quedan protegidos contra el posterior tratamiento intraperitoneal con una dosis letal del TBEV, mientras que los ratones inoculados de igual manera con el DEN4 no quedan protegidos. Estos resultados indican que las proteínas preM (premembrana), M y/o E del vTBE(ME)/DEN4 contienen más determinantes antigénicos de la inmunidad protectora contra la encefalitis del TBEV en ratones.

Modificación de la neurovirulencia del vTBE(ME)/DEN4 quimérico

Tal como se ha descrito en la sección anterior, titulada "Mutaciones del genoma del virus del dengue que afectan a la neurovirulencia", se ha modificado el constructo del virus del dengue recombinante por mutagénesis dirigida a una posición o por mutagénesis de PCR o similar para producir un virus modificado, idóneo para la vacunación gracias a sus características de neurovirulencia reducida. El genoma del vTBE(ME)/DEN4 puede modificarse aplicando técnicas similares a las descritas aquí para obtener una neurovirulencia reducida y, de este modo, mejorar la seguridad de una vacuna de virus atenuado contra el TBEV.

El éxito en la construcción de una quimera viable de TBEV/DEN4, que conserve los antígenos protectores del TBEV, pero esté exenta de la invasividad periférica del TBEV, proporcionará la base para acometer una nueva estrategia de inmunopropilaxis contra este importante patógeno, a saber, el desarrollo de una vacuna de TBEV atenuado. Sin embargo, antes de poder alcanzar este objetivo tiene que realizarse una modificación adicional de la quimera, a saber evitar la neurovirulencia para el SNC, medida después de la inoculación directa del virus en el cerebro. Dado que la quimera TBEV/DEN4 conserva la neurovirulencia de su TBEV original, es necesario eliminar esta propiedad a través de mutaciones estratégicas de ingeniería genética en la porción DEN4 o TBEV del genoma quimérico y evaluar su efecto en la neurovirulencia en el ratón. Estos mutantes pueden incluir potencialmente mutaciones introducidas en gran número de posiciones del genoma vírico. Los estudios iniciales han evaluado los virus quiméricos con las mutaciones siguientes: (1) deleciones en la región no codificadora 5'; (2) mutaciones para impedir el sitio de rotura de la preM a la M o los sitios de glucosilación de la preM, o de la E o de la proteína NS1; o (3) mutaciones puntuales en el gen de la E. Las mutaciones ensayadas se recogen en la figura 23.

Como parte de un estudio de modificación sistemática del constructo TBE(ME)/DEN4 y ensayar el efecto de las alteraciones genéticas en la neurovirulencia se han preparado seis constructos diferentes, que contienen uno o varios cambios en la secuencia de la proteína, véase el ejemplo 22. Se entenderá que aplicando las técnicas facilitadas en esta invención, un experto en la materia podrá crear un gran número de sustituciones, adiciones o deleciones en el constructo TBE(ME)/DEN4 y ensayar los cambios de neurovirulencia. De igual manera, un experto en la materia podrá combinar fácilmente las mutaciones indicadas en la figura 23 con estas o con otras mutaciones para ensayar el constructo quimérico que tenga con preferencia por lo menos una alteración de su composición genética y compararlo con el constructo quimérico que combine las secuencias nativas.

En los estudios para evaluar la capacidad de los constructos mutantes para dirigir la producción de virus quimérico mutante, se recuperan seis quimeras mutantes de células LLC-MK_{2} transfectadas y se analizan los virus para comprobar los cambios en la morfología de placa. La progenie de los virus TBE(ME)/DEN4 mutantes se amplifica por pasaje por las células LLC-MK_{2} y se analiza mediante ensayos de placa de células LLC-MK_{2} o células C6/36 de mosquito. Se analiza igualmente una quimera de TBE(ME)/DEN4 que incluye los tres genes proteicos estructurales del TBEV. Se utiliza también como control el DEN4 de tipo salvaje. Tal como se indica en la figura 24, el tamaño de placa de la mayoría de mutantes en cada línea celular se reduce, si se compara con las placas víricas del TBE(ME)/DEN4 parental, lo cual sugiere que estos mutantes están restringidos para la replicación vírica. Los mutantes que contienen un sitio de glucosilación defectuoso en la E o en la NS1 producen placas del tamaño más pequeño entre la serie de mutantes ensayados.

Los constructos de mutante quimérico se ensayan además para comprobar su neurovirulencia en ratones. Se inoculan los ratones con el virus del modo descrito en el ejemplo 21 y 23. Se observan los ratones infectados y se anotan los signos de encefalitis y la muerte a lo largo de 31 días. Los constructos que contienen las mutaciones NS1(1)-Glc^{-} y preM/M^{-} presentan una LD50 mayor que 100 pfu, lo cual indica que estos mutantes presentan una reducción superior a 100 veces de la neurovirulencia en el ratón. Este resultado indica que la mutación NS1(1)-Glc^{-}, la preM/M^{-} o ambas pueden utilizarse para conferir una atenuación a la neurovirulencia en el ratón. Este resultado sugiere que pueden realizarse mutaciones similares para conferir una atenuación a otros flavivirus encefalíticos, incluido el virus de la encefalitis japonesa.

Se contempla además que aquellos constructos quiméricos que presentan una reducción de la neurovirulencia en los ratones, manifestada a través de valores mayores de LD_{50}, se ensayen a continuación en los primates. En el ejemplo 24 se presenta un esquema de ensayos para vacunar primates con eficacia. Después de realizar con éxito el estudio en primates se ensayarán las vacunas de esta invención en ensayos clínicos con humanos. Los expertos en la materia podrán modificar los estudios de los primates para convertirlos en idóneos para el estudio humano.

Por lo tanto, las invenciones de esta solicitud proporcionan un gran número de vacunas y ensayan a los expertos en la materia a preparar vacunas de virus quiméricos del dengue para generar respuestas inmunes protectoras a los serotipos del virus del dengue o de otros flavivirus. Tal preparación de vacuna puede contener con preferencia un conjunto de virus quiméricos, cada uno de los cuales expresa una proteína estructural por lo menos de un virus del dengue. Utilizando las técnicas descritas aquí, el experto en virología y en biología molecular podrá generar virus quiméricos que incorporen regiones estructurales de un flavivirus junto con regiones no estructurales de un segundo virus. Este segundo virus es con preferencia un virus del dengue y con mayor preferencia este segundo virus es un virus del dengue de tipo 4. Esta invención enseña además al experto en la materia a modificar el constructo del virus del dengue empleando una mutagénesis dirigida a una posición o una técnica similar para producir una vacuna mejora del virus del dengue y se contempla que estas modificaciones puedan incorporarse de manera similar al constructo de virus quimérico. La invención enseña además a preparar y ensayar los virus quiméricos que incluyen regiones no estructurales y por lo menos una región estructural de un virus del dengue en combinación con regiones genéticas estructurales de otro flavivirus. Se publica en particular una vacuna contra el TBEV que es un virus quimérico que contiene una región estructural junto con regiones no estructurales del dengue 4 y secuencias que codifican a dos proteínas estructurales del TBEV.

Los resultados alentadores observados hasta el presente con la quimera del TBEV(ME)/DEN4 sugieren que estas técnicas son también útiles para producir una vacuna contra virus más afines al virus del dengue que al TBEV. Un ejemplo de ello es el virus de la encefalitis japonesa, que continúa siendo un problema importante para la salud pública del lejano oriente. Por lo tanto, en una forma de ejecución, las técnicas de esta invención se utilizan para combinar regiones no estructurales del cDNA del DEN4 con por lo menos una región estructural del virus de la encefalitis japonesa y las demás regiones genéticas estructurales del DEN4.

Se contempla además que otras combinaciones de regiones no estructurales y de regiones estructurales de diferentes flavivirus puedan prepararse y ensayarse de modo similar, empleando las técnicas de esta invención. Por ejemplo, un constructo recombinante de virus de la encefalitis japonesa puede modificarse para reemplazar una o varias regiones estructurales por las secuencias genéticas correspondientes del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, al tiempo que se continúa el abastecimiento de regiones víricas no estructurales. De modo similar se puede generar un cDNA recombinante que codifique al virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y reemplazar las regiones estructurales por lo menos con un gen que codifique a la proteína estructural del virus del dengue.

Todas las publicaciones citadas aquí y en los ejemplos siguientes se incorporan como referencia. Las formas concretas de ejecución de la invención se discutirán con detalle y se mencionarán las posibles variantes dentro del alcance de la invención. Existe un gran número de técnicas y procedimientos alternativos, disponibles para los expertos en la materia, que permiten igualmente realizar con éxito la invención presente.

Ejemplos e información general relativa a los mismos Virus

Se utiliza la cepa 814669 del virus del dengue de tipo 4 para la construcción de un cDNA de longitud completa, que sirve como fuente de los transcritos de RNA infeccioso de longitud completa (Mackow, E. y col., Virology 159, 217-228, 1987; Zhao, B. y col., Virology 155, 77-88, 1986. Una preparación del virus del dengue de tipo 1, cepa Western Pacific (D1 WP), un nivel 9 de pasaje por células fetales de pulmón de macaco de la India, ha sido cedida gentilmente por el Dr. K. Eckels (WRAIR, Washington, DC) (McKee, K.T. y col., Am. J. Trop. Med. Hyg. 36, 435-442, 1987). Una preparación de cerebro de ratón de virus del dengue de tipo 2, neurovirulento para el ratón, cepa Nueva Guinea C (D2 NGC), nivel 38 de pasaje por cerebro de ratón, ha sido cedida gentilmente por el Dr. D. Dubois (WRAIR, Washington, DC) (Sabin, A.B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1, 30-50, 1952). Se amplifican los virus del dengue 1 y del dengue 2 mediante un pasaje por células C6/36 de mosquito. Cada uno de estos tres virus se somete después a un pasaje, una vez, por células de riñón de simio LLC-MK_{2} y la suspensión vírica resultante se utiliza para estudiar la morfología de placa y la neurovirulencia en ratón.

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Vectores de clonación

Se modifica el plásmido p5'-2, que contiene la mitad 5' del cDNA del genoma del dengue 4, para facilitar el reemplazo de los tres genes de proteína estructural (Lai, C.J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5139-5143, 1991). En primer lugar se introduce un sitio Xho I único mediante una mutagénesis dirigida a la posición del nucleótido 2342 (A-G) de la secuencia del dengue 4, junto al extremo 3' de la E, creando el p5'-2 (Xho I). Este nucleótido no altera la secuencia de aminoácidos. Después se digiere este vector en el sitio único Bst BI dentro de la secuencia del dengue y en el sitio único Asp 718, que está situado inmediatamente después de la secuencia p5'-2 del dengue y se liga el fragmento con la mitad 3' del genoma del dengue 4, creando el p2A (Xho I) de longitud completa. En segundo lugar se convierte en único el sitio Bgl II del nucleótido 88, que se conserva entre los flavivirus, mediante la eliminación de otros tres sitios Bgl II del p5'-2. Se elimina el sitio Bal II de la unión entre el pBR322 y el promotor SP6 insertando un engarce (linker) Not I. Se eliminan otros dos sitios, en 4128 y en 4277, acortando el vector al sitio recién introducido Pst I de 3473 (McKee, K.T. y col., Am. J. Trop. Med. Hyg. 36, 435-442, 1987). A continuación se emplea el plásmido p5'-2 (Xho I, Pst I) para el intercambio de fragmentos y la creación del cDNA quimérico.

En la figura 1 se representa los plásmidos siguientes, que contienen el cDNA de longitud completa del dengue, que se han construido: p2A (Xho I), una copia de cDNA completo del genoma del dengue 4, en el que se ha creado un sitio único Xho I junto al extremo 3' del gen de la E; p2A (D1 WP), derivado del p2A (Xho I) por reemplazo de la secuencia entre el sitio Bgl II de la región 5' no codificadora y el sitio único Xho I por el correspondiente cDNA de la cepa Western Pacific de dengue 1; p2A (D2 NGC), preparado de igual manera pero reemplazando el fragmento BgI II-XHO I por el cDNA correspondiente a partir de la cepa Nueva Guinea de dengue 2; Sitios de enzima de restricción B: Bgl II; X: Xho I; A: Asp 718.

cDNA quimérico

Se purifican el virus de dengue de tipo 1 y de tipo 2, cultivados en células C6/36 de mosquito y se extrae el RNA virión con arreglo al procedimiento descrito por Zhao, B. y col., Virology 155, 77-88, 1986. Se sintetiza el cDNA de primera hebra del dengue 1 por transcripción inversa, empleando un oligonucleótido de sentido negativo que se hibrida con los nucleótidos 2306-2338 de la secuencia del dengue 1. Esta secuencia de cebador contiene un cambio de tercera base silencioso (A-G) en el nucleótido 2316 para crear un sitio Xho I en la posición correspondiente al sitio del gen de la E del dengue 4 en p5'-2 (Xho I, Pst I), descrito antes. Después se utiliza el cDNA del dengue 1 como molde para sintetizar el DNA de doble hebra mediante PCR, empleando el oligonucleótido de sentido negativo y el cebador de sentido positivo que se hibrida con los nucleótidos 51-70 del dengue 1 y contiene el sitio Bgl II conservado. Se digiere el producto de la PCR con el Bgl II y el Xho I y después se clona en el p5'-2 (Xho I, Pst I), reemplazando la correspondiente secuencia del dengue 4. Después se une el fragmento Cla I-Xho I, que contiene la secuencia del dengue 1, con el cDNA restante del dengue 4 del p2A (Xho I) para crear una quimera p2A de longitud completa (D1 WP). De modo similar se sintetiza el cDNA de primera hebra del dengue 2, empleando un cebador de sentido negativo que se hibrida con los nucleótidos 2310-2364 del dengue 2. Este cebador contiene tres cambios de base: T-C en 2333, A-G en 2336 y C-A en 2337. Estos cambios crean un sitio Xho I en la posición correspondiente al sitio Xho I del gen de la E del dengue 4, descrito antes. Estos cambios no alteran la secuencia de aminoácidos. Para la síntesis de DNA de doble hebra por PCR se emplea un cebador de sentido negativo, mientras que el cebador de sentido positivo es el mismo que se emplea para el dengue 1. El producto de la PCR se digiere con el Bgl II y el Xho I, se clona en el p5'-2 (Xho I) y se utiliza el fragmento Cla I-Xho I para reemplazar el correspondiente fragmento de p2A (Xho I) y crear el p2A (D2 NGC).

Transcripción de RNA, transfección y recuperación del virus

La transfección de células con los transcritos de RNA de longitud completa se realiza del modo descrito por Lai, C.J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5139-5143, 1991. Diez días después de la transfección se tripsinizan las células y se transfieren a una placa de 6 hoyos y a una corredera de cámara. Dos días después se ensayan las células de la corredera por inmunofluorescencia (IFA) para detectar los antígenos del virus del dengue. Si la IFA pone de manifiesto que la mayoría de células están infectadas, entonces se tripsinizan las células de la placa de 6 hoyos, se mezclan con un exceso 6 veces mayor de células no infectadas y se incuban hasta que resultan evidentes los efectos citopáticos (aparición de numerosas células muertas en el medio), por lo general después de 6-7 días. Se recolectan las células infectadas sacando el medio, raspando las paredes, resuspendiendo las células en un volumen estándar de medio esencial mínimo Eagle al 50%/suero al 50% y después congelándolas. Por otro lado, si un pequeño porcentaje de células es positivo, se tripsinizan las células, se diluyen 1:3 en medio fresco y se mantienen en cultivo sin añadir células no infectadas. Entonces se estima el porcentaje de células infectadas en una base semanal y se recolectan los lisados celulares y se valora su concentración de virus a intervalos.

Detección de antígenos del virus del dengue

Se analizan por IFA las células infectadas, empleando anticuerpos monoclonales (mab) 1F1 específicos de serotipo (dengue 1), 3M5 (dengue 2), 5D4 (dengue 3) y 1H10 (dengue 4) y mab 1G6 específicos de la NS1 (dengue 4), producidos originalmente por el Dr. M.K. Gentry y el Dr. E. Henchal (WRAIR, Washington, DC) (Henchal, E.A. y col., Am. J. Trop. Med. Hyg. 31, 548-555, 1982). Los anticuerpos monoclonales se utilizan en una dilución de 1:50 a 1:300, mientras que el antisuero anti-ratón conjugado con fluoresceína (Kierkegaard-Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) se utiliza en 1:100. Los resultados se registran fotográficamente; para cada mab se fotografían las células infectadas que producen un resultado negativo con el mismo tiempo de exposición que las células positivas. Para analizar las proteínas de los virus de dengue parentales (tipo salvaje) y del virus de progenie v2A (Xho I) se infectan células confluyentes LLC-MK_{2} en una placa de 6 hoyos con virus en una MOI de 0,2. Seis días después de la infección se marcan las células con 50 \muCi/hoyo de medio exento de metionina-S durante 6 horas y después se lisan las células con tampón RIPA. Para el virus quimérico v2A (D1 WP) se realiza el marcado cuando aprox. el 100% de las células está infectado; para el v2A (D2 NGC) se realiza el marcado cuando el 30% está infectado. Se precipitan los lisados con el fluido ascítico de ratón hiperinmune (HMAF) apropiado, homotípico o heterotípico, y se analizan por electroforesis a través de geles de SDS-12% de poliacrilamida.

Morfología de placa

Se caracterizan los virus por morfología de placa en células LLC-MK_{2} (Bancroft y col., Pan Am. Health Organ. Sci. Publ. 375, 175-178, 1979). Cada virus parental se pasa una vez por células LLC-MK_{2} antes del análisis de la morfología de placa. Se añade una capa superior de rojo neutro a los cultivos después de 6-9 días de incubación.

Evaluación de virus quiméricos en ratones lactantes

Se inoculan por vía intracerebral 2000 pfu de virus de dengue parental o quimérico a ratones suizos de tres días de edad, en forma de un lisado diluido de células LLC-MK_{2} infectadas con el virus. Se inyecta un lisado de células sin infectar a los ratones del control negativo. Se inocula un litro con virus parental del dengue de tipo 4 (814669), virus del dengue de tipo 1 WP o virus del dengue de tipo 2 NGC. Se inoculan dos litros con v2A (Xho I), v2A (D1 WP) o v2A (D2 NGC). Se hace el seguimiento de los ratones inoculados durante 21 días, anotándose los signos de encefalitis o la muerte.

Ejemplo 1 cDNA & virus quiméricos

Se utiliza el cDNA de virus del dengue de tipo 4 de longitud completa (p2A) para construir virus quiméricos, cuyas secuencias de genes estructurales se han reemplazado por las secuencias correspondientes de virus del dengue de tipo 1 o de tipo 2. El virus de tipo 1 (WP) que se elige a tal fin es una cepa de pasaje lento a través de cultivo en tejido, que no se ha adaptado al crecimiento en el cerebro del ratón. La cepa de tipo 2 (NGC) es una mutante muy neurovirulenta que se selecciona durante una serie de pasajes intracerebrales en ratón. La mutante de tipo 2 se elige para este estudio porque ofrece la posibilidad de mapear los determinantes genéticos de la neurovirulencia en ratones.

La transformación de bacterias de la cepa HD 1528 de E. coli con constructos de plásmido p2A (Xho I), p2A (D1 WP) o p2A (D2 NGC) produce una población estable de plásmidos. La estructura prevista de estos plásmidos se presenta en la figura 1. Su estructura se verifica por mapeo con enzima de restricción.

Aproximadamente la mitad de las células LLC-MK_{2} transfectadas con transcritos de RNA de p2A (Xho I) son positivas de antígenos de virus del dengue por tinción de inmunofluorescencia en el día 12 (figura 2A).

En la figura 2 se representan: (A) células LLC-MK_{2} transfectadas con la misma concentración de transcritos de RNA de p2A (Xho I), p2A (D1 WP) o p2A (D2 NGC). El porcentaje de células infectadas con virus después de la transfección se estima por IFA después de reextender en placas en medio fresco; (B) se recolectan las células infectadas cuando la mayoría de las células es positiva según la IFA. La valoración de la concentración del virus se realiza por ensayo en placa (Bancroft, W.H. y col., Pan Am. Health Organ. Sci. Publ. 375, 175-178, 1979).

En un estudio previo se observa una proporción similar de células positivas de antígeno, del orden del 20 al 50%, después de 12 días de la transfección con transcritos de p2A y p2A (Pst I), que en ambos casos da lugar a virus con fenotipo de tipo salvaje (Lai, C.J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5139-5143, 1991). En contraste con ello, en el día 12 menos del 1% de las células transfectadas con transcritos de p2A (D1 WP) o p2A (D2 NGC) son positivas. El porcentaje de células infectadas con v2A (D1 WP) aumenta aproximadamente hasta el 5% en el día 19, hasta el 30% en el día 26 y hasta el 80% en el día 33, en este momento la concentración de virus presentes en las células transfectadas es de 5 x 10^{6} pfu/ml (figura 2A y 2B). En contraste con ello, el v2A (D2 NGC) crece más lentamente: hemos estimado que el 1% de las células son positivas en el día 19, pero menos de un tercio de las células se ha infectado en el día 54. La concentración del virus es de solamente 1,5 x 10^{2} pfu/ml en el día 30, 2,5 x 10^{2} en el día 44 y no alcanza los 10^{4} pfu/ml hasta el día 58. Al cabo de 72 días de la transfección, la mayoría de células están infectadas y la concentración de la suspensión celular se sitúa en 10^{2} pfu/ml.

La concentración de virus producido por las células transfectadas con transcritos de RNA de p2A (Xho I) (10^{6} pfu/ml) es la misma que se observa cuando los cultivos celulares se infectan con el virus de tipo 4 en una MOI de 0,1. Además, la concentración más elevada de virus producida por los cultivos transfectados con la quimera del tipo 1/tipo 4 (5 x 10^{6} pfu/ml) es similar a la observada después de la infección de cultivos celulares con el virus del tipo 1 en una MOI de 0,1 (1,5 x 10^{7} pfu/ml). La concentración máxima de la quimera de tipo 2/tipo 4 producida después de la transfección (10^{2} pfu/ml) es similar a la producida por cultivos celulares infectados con el virus original del tipo 2 en una MOI de 0,5.

Ejemplo 2 Caracterización de proteínas quiméricas estructurales

Se realiza una inmunofluorescencia indirecta para caracterizar los virus de progenie, tal como se indica en la figura 3.

En la figura 3 se presenta el ensayo de inmunofluorescencia realizado en células LLC-MK_{2} infectadas con v2A (Xho I), v2A (D1 WP) o v2A (D2 NGC) o en células no infectadas. Se utilizan anticuerpos monoclonales en diluciones de 1:50 a 1:300, mientras que el anticuerpo anti-ratón conjugado con fluoresceína se emplea en 1:100. La especificidad de serotipo de los anticuerpos monoclonales se indica en el margen izquierdo.

Se tiñen las células infectadas con v2A (Xho I) con un mab 1H10 específico de dengue 4 mediante IFA, pero no fija al mab 1F1 específico del dengue 1 ni el mab 3M5 específico del dengue 2. Como estaba previsto, las células infectadas con v2A (D1 WP) solo reaccionan con el 1F1 y las infectadas con v2A (D2 NGC) se tiñen solamente con el 3H5. El mab 5D4, específico del virus del dengue 3, no reacciona con ninguna de las células infectadas. Estos resultados indican que los dos virus quiméricos presentan la antigenicidad especificada por sus genes de proteína estructural. Como era de esperar el mab 1G5, específico de la proteína NS1 no estructural del dengue 4, tiñe las células infectadas por la progenie del cDNA del dengue de tipo 4, es decir 2A (Xho I), así como de los virus quiméricos, 2A (D1 WP) o 2A (D2 NGC) derivados del virus de tipo 4.

Las proteínas del virus parental del dengue de tipo 4 y de la progenie v2A (Xho I) derivada de su cDNA aparecen como idénticas cuando se analizan por inmunoprecipitación con HMAF homotípico y posterior electroforesis a través de gel de poliacrilamida (figura 4). En la figura 4 se presentan lisados marcados con metionina-S^{35} de células LLC-MK_{2} infectadas con el virus o de células control no infectadas que se inmunoprecipitan con líquido ascítico de ratón hiperinmune (HMAF) dirigido contra el dengue 1, 2 ó 4 y se analizan por electroforesis a través de un gel de SDS-12% de poliacrilamida (acrilamida:bis = 60:1,6). En la parte superior de cada pista el virus se indica verticalmente, mientras que el HMAF, con el que se inmunoprecipita el lisado, se indica horizontalmente. Marcadores: los marcadores de tamaño molecular de proteína se expresan en kilodaltones. Las ubicaciones de las glucoproteínas de E y de preM del dengue 1, 2 y 4 se indican (figura 4).

Se analizan también las proteínas del virus parental del dengue de tipo 1 (WP) y del virus del dengue de tipo 2 (NGC). Las glucoproteínas de la E del dengue 1 y del dengue 2 co-migran, pero migran con mayor lentitud que la proteína de la E del dengue 4. De igual manera, las glucoproteínas de la pre-M del dengue 1 y 2 comigran, pero también migran con mayor lentitud que la pre-M del dengue 4. La diferencia en peso molecular relativo entre las proteínas E es aproximadamente de 4 kd, mientras que la de las proteínas de pre-M es de aprox. 1 kd. Estas diferencias en tamaño molecular de la E y de la pre-M se deben probablemente a la variación en el grado de glucosilación o a diferencias conformacionales. Las proteínas inmunoprecipitadas de los virus v2A (D1 WP) y v2A (D2 NGC) presentan un modelo híbrido. La pre-M y la E de v2A (D1 WP), inmunoprecipitadas con HMAF de dengue 1, co-migran con la pre-M y la E del dengue 1 parental, pero el HMAF del dengue 4 precipita solamente bandas que co-migran con las proteínas no estructurales del dengue 4. De modo similar, la pre-M y la E del dengue 2 parental, mientras que el HMAF del dengue 4 precipita proteínas no estructurales similares a las del virus de tipo 4.

El virus parental del dengue de tipo 4 y su progenie v2A derivada del cDNA (Xho I) produce placas similares en células LLC-MK_{2} (no representadas). Las placas de virus parentales son claramente visibles cuando se tiñen con rojo neutro seis días después de la infección, pero la quimera v2A (D2 NGC) no consigue producir placas detectables en el mismo tiempo. Sin embargo, si se retrasa la tinción hasta el día 9, se detectan placas muy pequeñas de v2A (D2 NGC), mucho más pequeñas que las de v2A (Xho I) o de NGC del dengue 2 de tipo salvaje (figura 5). Las placas de 814669 del dengue 4 no difieren de las del virus de progenie v2A (Xho I). Las placas de v2A (D1 WP) son básicamente similares a las de v2A (Xho I).

En la figura 5 se representan monocapas de células LLC-MK_{2} infectadas que difieren de las del virus de progenie v2A (Xho I). Las placas de v2A (D1 WP) son básicamente similares a las de v22A (Xho I).

En la figura 5 se representan monocapas de células LLC-MK_{2} infectadas con el virus del dengue y posterior capa superior de agarosa (Bancroft y col., Pan Am. Health Organ. Sci. Publ. 375, 175-178, 1979). Se aplica una capa superior de rojo neutro 9 días después de la infección de la monocapa de células y se fotografían las placas al día siguiente. A: 2A (Xho I); B: 2A (D1 NGC); C: NGC de dengue 3 de tipo salvaje.

Ejemplo 3 Virulencia de los virus en ratones lactantes

Se comparan la quimera v2A (D2 NGC) con virus parentales, NGC de dengue 2 adaptado al cerebro del ratón y v2A (Xho I), en cuanto a su neurovirulencia en el ratón. El NGC del dengue 2 demuestra ser el más rápidamente letal: cada uno de los 10 ratones muere por encefalitis en el día 5 o en día 6 después de la inoculación, con un tiempo medio de supervivencia de 5,1 días, mientras que cada uno de los 15 ratones inoculados con la quimera v2A (D2 NGC) sobrevive 8-11 días antes de morir, con un tiempo medio de supervivencia de 9,1 días (figura 6).

En la figura 6 se representan ratones suizos de tres días de edad, a los que se inoculan por vía intracerebral 2000 pfu de virus del dengue parental o quimérico, en forma de un lisado diluido de células LLC-MK_{2} infectadas. El número de ratones que reciben la inyección es: dengue 2 (NGC), 10 ratones; v2A (D2 NGC), 15; 814669 dengue 4, 12; v2A (Xho I), 18. Los controles negativos (11 ratones) reciben una inyección de lisado diluido de células no infectadas. Se hace el seguimiento diario de los ratones para anotar los síntomas de encefalitis o la muerte.

La diferencia en las distribuciones de supervivencia es significativa (p = 0,0001, estadística Smirnov de dos puntos). El virus parental 814669 de dengue 4 se compara también con su progenie v2A (Xho I). Cinco de los 12 ratones inoculados con el virus parental mueren por encefalitis, la primera muerte se produce en el día 11, mientras que solamente muere uno de los 18 ratones inoculados con v2A (Xho I) en el día 16 después de la inoculación; el resto permanecen sanos. Aunque las distribuciones de supervivencia no difieren significativamente según la estadística de Smirnov (p > 0,14), el porcentaje de supervivencia de los dos grupos difieren cuando se aplica el ensayo exacto de Fisher (p = 0,0256). Esto sugiere que el virus 814669 del dengue 4 o un subconjunto de viriones de la preparación del virus posee un grado de virulencia y que el virus de progenie v2A (Xho I) puede constituir una subpoblación no neurovirulenta o puede contener cambios de nucleótidos que surgen durante la clonación o la propagación del virus. Ninguno de los 12 ratones inoculados con el virus parental del dengue de tipo 1 (WP) ni de los 18 inyectados con su progenie quimérica v2A (D1 WP) ni 11 que reciben el lisado de células no infectadas desarrolla encefalitis ni muere.

Análisis mutacional

Hemos clonado una serie de insertos de cDNA de dengue que abarcan la longitud entera del genoma del virus del dengue de tipo 4. Se emplean como ensayo inicial para clonar un DNA de dengue de longitud completa, del modo descrito en el ejemplo 4.

Ejemplo 4 Ensayo inicial para clonar un DNA de dengue de longitud completa en el plásmido pBR322 que contiene el promotor SP6

Se unen los diversos insertos de cDNA de dengue de tipo 4 en los sitios compartidos de enzimas de restricción para formar una copia de DNA de dengue de longitud completa empleando el mismo sitio de clonación Pst I del pBR322. Para la transcripción "in vitro" se coloca la secuencia de promotor de polimerasa SP6 en el extremo 5' que antecede a la secuencia del dengue. La secuencia 5' prevista de los transcritos de RNA se representa en la figura 7. El resto A del primer nucleótido del dengue se posiciona inmediatamente después de la G que inicia la transcripción normal de la polimerasa SP6. La estructura de gorra (cap) m7G que está presente en el extremo 5' del RNA genómico se crea mediante la incorporación de un análogo pppG de m7G a la reacción de transcripción. Tal estructura de DNA podría generar un RNA de dengue que contenga un nucleótido adicional en el extremo 5'. Para producir transcritos derivados (run-off) se introduce una secuencia única de rotura Asp 718 en el extremo 3' de la secuencia del dengue. Tal como se indica en la figura 7, en la hebra del molde están presentes 5 nucleótidos adicionales que preceden el sitio de rotura Asp 718. Si la transcripción progresa hasta el último nucleótido, los transcritos de RNA contendrán estos 5 restos adicionales en sus extremos 3'.

Durante este estudio, empleando la cepa HB101 de E. coli como hospedante para la transformación, se observa que el plásmido que contiene el DNA de dengue de longitud completa es a menudo inestable porque el plásmido de muchos transformantes sufre una reordenación y tienen que explorarse muchas colonias para aislar un DNA clon que tenga el modelo de enzima de restricción previsto. Hemos procurado examinar la estabilidad del plásmido producido con diferentes cepas de E. coli. La cepa DH5\alpha de E. coli, muy competente en transformación, que es un producto comercial, y la cepa DB1528 de E. coli, empleadas anteriormente en el laboratorio, se comparan con la cepa HB101 de E. coli. Se encuentra que la cepa DB1528 produce transformantes que poseen un tamaño de colonia 3-4 veces mayor que los transformantes de BH101. Pero sobre todo, los transformantes de DB1528 dan lugar en general a plásmidos que tienen el modelo previsto de enzima de restricción, lo cual sugiere que la DB1528 de E. coli es la cepa a elegir para producir DNA de longitud completa del dengue clonado de forma estable. Sin embargo, los transcritos de RNA "in vitro" obtenidos a partir de este primer clon de DNA de dengue de longitud completa no consiguen producir el virus del dengue cuando se ensayan en células transfectadas, en las que el RNA de virión como control positivo y en una concentración 100 veces menos produce el virus del dengue, que se detecta por el ensayo ya indicado de la inmunofluorescencia.

Ejemplo 5 Reemplazo de segmentos de DNA del dengue en constructos de longitud completa con clones de DNA derivados independientemente

Se ha razonado que el fracaso en productos transcritos de RNA infecciosos se debe a la presencia de mutaciones defectuosas en el clon de longitud completa. Tales mutaciones pueden surgir presumiblemente de la clonación de una población defectuosa en las existencias del virus o a un error de unión durante la clonación o la propagación del plásmido. Hemos decidido llevar a cabo un reemplazo de segmentos del DNA del dengue que puedan contener una o varias mutaciones defectuosas por los correspondientes segmentos de constructos de DNA del dengue, clonados independientemente. Con el fin de proporcionar una estructura al ensayo de reemplazo sistemático, hemos clonado por separado los fragmentos 5' y 3' de la secuencia del dengue. El único sitio Bst B1 del nucleótido 5069 se utiliza para dividir secuencias de longitud completa del dengue en dos fragmentos, cada uno de los cuales representa aproximadamente el 50% del genoma. El fragmento 5' del primer clon de longitud completa que contiene el promotor SP6 se denomina 5'-l y la restante secuencia 3' entre el Bst B1 y el Asp 718 se denomina 3'-A. Se construye un plásmido que contiene el segundo fragmento 5', 5'-2, a partir de un grupo derivado independientemente de insertos de cDNA de dengue. Se introduce un único sitio Asp 718 en el sitio Pst I del pBR322 en dirección a 3' (downstream) del sitio Bst B1 de la secuencia del dengue. De este modo, este plásmido es también idóneo para el uso como vector de clonación para la inserción del fragmento 3' en la construcción de DNA de longitud completa. Se construyen también dos fragmentos 3' adicionales, el 3'-B y el 3'-C, a partir de una serie independiente de insertos de cDNA de dengue (figura 8). El reemplazo del fragmento 3' del primer clon 1A de longitud completa por los fragmentos 3'-B o 3'-C produce otros dos clones de longitud completa, el 1B y el 1C. De manera similar, la sustitución del fragmento 5' en los tres constructos de DNA de longitud completa por el fragmento 5'-2 da lugar a otros tres clones de DNA de longitud completa, a saber, el 2A, el 2B y el 2C. La digestión de estos plásmidos con el Bgl II, Nsi I y Asp 718 presenta un modelo de fragmentos de DNA previstos, que es indistinguible entre los seis clones de longitud completa representados en la figura 9. Por lo tanto, el éxito en la propagación del plásmido que contiene aparentemente la secuencia de DNA de longitud completa del dengue en la cepa DB1528 de E. coli permite la producción de transcritos de RNA "in vitro" para la evaluación de su infectividad en células en cultivo.

Ejemplo 6 Evidencia inicial de la infectividad de los transcritos de RNA producidos "in vitro"

Se ensaya la infectividad de transcritos de RNA producidos a partir de moldes construidos de DNA de longitud completa de dengue mediante la transfección de células LLC-MK_{2}. Las células infectadas de dengue se observan rápidamente al cabo de 10 días de la infección con RNA de 2A, la detección se efectúa por ensayo de inmunofluorescencia indirecta. Los transcritos de RNA de otros cuatro clones de DNA de longitud completa son negativos en este ensayo, lo cual indica que estos clones de DNA, por ejemplo el clon 1A, contienen mutaciones letales que no se detectan en el análisis de enzimas de restricción.

Además de la identificación positiva de las células infectadas con el virus del dengue, descrita antes, el virus infeccioso del dengue se recupera del medio o del lisado de células transfectadas con RNA de 2A. La concentración del virus del dengue presente en el lisado de células transfectadas es de 10^{1} pfu/ml. El tratamiento de los transcritos de RNA de 2A con la DNasa I no afecta su infectividad, mientras que el tratamiento con RNasa elimina por completo su infectividad. Dado que no se efectúa la extensión en placas del virus del dengue después de la transfección de monocapas de células con RNA, la producción del virus se identifica después de la incubación extensa para la amplificación del virus. Empleando este procedimiento de ensayo de inmunofluorescencia indirecta se detecta la infectividad en una concentración mínima con 1 ng de RNA genómico o con 10 ng de transcritos de RNA de 2A. Los resultados de este ensayo indican que los transcritos de RNA obtenidos a partir del clon 2A son infecciosos después de la transfección de células cultivadas permisivas.

Ejemplo 7 Otra evidencia de la infectividad de transcritos de RNA

Con el fin de proporcionar una prueba formal de que el virus infeccioso del dengue se produce en las células transfectadas con transcritos de RNA del clon 3A, se introducen en el clon 2A del DNA de longitud completa del dengue dos mutaciones (G3473 \rightarrow Tand C3476 \rightarrow T) que crean un nuevo sitio Pst I en el nucleótido 3473 del genoma del dengue, pero que no afectan la secuencia de aminoácidos. Los transcritos de RNA obtenidos a partir de este DNA mutante, una vez completada la eliminación del molde de DNA por digestión exhaustiva con DNasa I, se utilizan para la transfección a las células. Las células transfectadas producen virus infeccioso del dengue. El RNA genómico extraído del virus de progenie se transcribe inversamente y el cDNA producto se utiliza como molde para la PCR con el fin de generar un fragmento de DNA entre los nucleótidos 3193-4536. Tal como se indica en la figura 10, la digestión del Pst I del DNA producto de la PCR da lugar a dos fragmentos de una longitud de 280 y 1063 pares de bases, como era previsible por la presencia de la secuencia de rotura Pst I. El DNA de control producto de la PCR del virus derivado del RNA de 2A es insensible a la digestión de Pst I. Esta observación confirma que el virus de progenie derivado de transcritos de RNA del DNA del mutante 2A contiene el sitio Pst I.

Ejemplo 8 Virus del dengue recuperado de RNA infeccioso transcrito "in vitro"

Se aísla el virus de progenie del dengue del lisado de células transfectadas con transcritos de RNA obtenidos a partir del molde del clon 2A o del clon 2A (Pst) y se compara con el virus parental de tipo salvaje en lo referente a la capacidad de placa en monocapas de células LLC-MK_{2}. Seis días después de la infección, tanto el virus de progenie como el virus parental producen placas características de dengue de tamaños variables. El virus parental cultivo por pasaje en células de mosquito presenta placas predominantemente pequeñas y el virus de progenie las presenta mixtas pero en general más grandes, lo cual sugiere que el virus recuperado puede representar una población clonada. Se comparan también las proteínas específica del dengue producidas en células infectadas con el virus de progenie y en células infectadas con el virus parental. Tal como se indica en la figura 11, el perfil de las bandas de proteínas, incluidas la preM, la E, la NS1, la NS2 y otras proteínas de dengue no asignadas, precipitadas con líquido ascítico de ratón hiperinmune al dengue, parecen ser indistinguibles tanto para el virus de progenie como para el virus parental. Este resultado indica que el virus del dengue recuperado presenta el mismo genotipo y fenotipo que el virus a partir del cual se deriva del clon de cDNA.

Ingeniería genética de virus viables de dengue por sustitución de aminoácidos en la unión de rotura NS1-NS2A Ejemplo 9 Construcción de sustituciones de aminoácidos específicos de DNA de NS1-NS2A en la secuencia del sitio de rotura

En este estudio se emplea el DNA recombinante intermedio de pSC11-NS1-NS2A construido para la expresión de la NS1 auténtica. El DNA del virus del dengue contiene la secuencia codificadora de la señal N-terminal de 24 aminoácidos y las secuencias de los polipéptidos enteros de la NS1 y de la NS2A. Inicialmente se modifica este DNA plásmido para facilitar el reemplazo de segmentos de DNA que contienen mutaciones. Por mutagénesis directa de oligonucleótidos se introducen dos mutaciones silenciosas en el DNA de NS1-NS2A (G_{3473}-T y C_{3476}-A). Estos cambios crean un nuevo sitio PstI en el nucleótido (nt) 3476. El plásmido recombinante contiene un sitio NcoI único en el nt 3320 dentro de la secuencia codificadora de NS1 del dengue. La unión de rotura NS1-NS2A se sitúa en el nt 3477. Con el fin de introducir sustituciones de aminoácidos en la secuencia del sitio de rotura, se crean cambios de nucleótidos mediante mutagénesis dirigida de oligonucleótidos. Se sintetiza una serie de oligonucleótidos y se emplean como cebadores de hebra negativa en una reacción en cadena de polimerasa (PCR). El cebador de hebra positiva es el 5'-AAGGCTATGCCACGCAAA-3' (SEQ ID NO: 1), que se sitúa en dirección a 5' (upstream) del sitio NcoI. Por ejemplo, en la posición de rotura se utilizan 2 oligos (Thr_{1124}) GCC CTG GCC GGC CTT CAC CTG TGA TTT GAC CAT (SEQ ID NO: 2) para sustituir la Lys por la Thr. De igual manera, se emplea el oligo GCC CTG GCC GGC CTG CAC CTG TGA TTT GAC CAT (SEQ ID NO: 3) para sustituir la Gln por la Thr y se utiliza el oligo GCC CTG GCC GGC CAG CAC CTG TGA TTT GAC CAT (SEQ ID NO: 4) para sustituir la Leu por la Thr. De manera similar, se emplea el oligo TTC TGA TGT GCC CTG TTC GGC CGT CAC CTG TGA (SEQ ID NO: 5) para sustituir la Glu por la Gly_{1120} en la posición de rotura +1, o se usa el oligo TTC TGA TGT GCC CTG CCA GGC CGT CAC CTG TGA (SEQ ID NO: 6) para sustituir el Trp por la misma Gly en la posición de rotura +1.

Para la construcción del DNA recombinante intermedio que contenga la mutación especificada se reemplaza el fragmento de DNA entre el sitio PstI recién creado y el sitio único NcoI por la serie de DNA productos de la PCR, que se rompen (dividen) con NcoI y PstI. Los virus recombinantes de la viruela, que expresan estas secuencias mutantes NS1-NS2A, se obtienen con arreglo a los procedimientos descritos anteriormente (Zhao, B., Prince, G., Horswood, R., Eckels, K., Summers, P., Chanock, R. y Lai, C.J., 1987). La expresión de proteínas estructurales de virus del dengue y de la proteína no estructural NS1 por virus recombinantes de la viruela, véase J. Virol. 61, 4019-4022.

Ejemplo 10 Análisis de la rotura en la unión NS1-NS2A

Se infectan células confluyentes CV-1 en una placa de 6 hoyos con virus recombinante de viruela a razón de 5 pfu por célula y se mantienen en un medio esencial mínimo más un 2% de suero fetal bovino (MEM2). Al cabo 16-20 horas de la infección se retira el medio y se coloca un MEM2 libre de metionina y después de 1 hora de incubación se sustituye este medio por 0,7 ml de MEM2 exento de metionina que contiene 100 \muCi de metionina-S^{35} (actividad específica > 800 \muci/mol). Después de un período de marcado de dos horas se lisan las células con tampón RIPA (1% de desoxicolato sódico, 1% de Nonidot P-40, 0,1% de dodecilsulfato sódico [SDS]), Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M) y se centrifuga el lisado para eliminar los desechos celulares. Se utiliza el líquido sobrenadante transparente del lisado para el análisis de las proteínas del virus del dengue por inmunoprecipitación, empleando fluido ascítico de ratón hiperinmune al dengue (HMAF). Se analizan los inmunoprecipitados por separación electroforética en un gel de SDS-12% de poliacrilamida (proporción acrilamida/bis: 60:1,6). Se visualizan las bandas de proteína marcada por fluorografía. Las bandas de gel correspondientes al producto previo NS1-NS2A sin romper y el producto de la NS1 rota se escinden y se cuenta la radiactividad en un contador de centelleo líquido.

Para determinar el grado de rotura de la unión NS1-NS2A se corrige la inmunoprecipitabilidad diferencial entre la NS1-NS2A y la NS1 suponiendo que el marcador total de la NS1-NS2A expresada es el mismo en las células infectadas con cada mutante y con cada entrada de pfu. La NS1-NS2A de tipo salvaje se expresa predominantemente en la NS1 rota y el producto previo NS1-NS2A no se detecta. El grado de rotura del virus de tipo salvaje se asigna como 100%.

Ejemplo 11 Construcción de cDNA de extensión completa del virus del dengue de tipo 4 especificando las sustituciones de aminoácidos en la secuencia de rotura NS1-NS2A

Se seleccionan los mutantes de DNA NS1-NS2A, que presentan un grado de rotura reducida en la unión NS1-NS2A y se han construido y analizado en la sección anterior, para la construcción de mutantes de virus del dengue que contengan tales sustituciones de aminoácidos. Se emplean cuatro mutaciones establecidas anteriormente: (1) Gly en la rotura positiva +1 Glu, (2) Thr en la posición -2 respecto a Lys, (3) Thr en la posición -2 respecto a Gln y (4) Thr en la posición -2 respecto a Leu. Se digiere el DNA mutante psc11-NS1-NS2A con SpeI en el nt 3338 y StuI en el nt 3616 para aislar un fragmento de 278 nt. Este fragmento de DNA, que contiene la mutación, se utiliza para reemplazar el correspondiente fragmento de DNA de tipo salvaje del plásmido p5'-2 que contiene la mitad 5' de la secuencia del cDNA del dengue. El restante fragmento 3' del cDNA del dengue entre el BstE1 (nt 5069) y Asp718 del extremo 3' se une con el DNA del p5'-2 en los sitios compartidos de rotura por enzima de restricción. De esta manera se crea un cDNA de longitud completa que se clona empleando el vector pBR322. Esta serie de cDNA contiene secuencias mutantes que codifican sustituciones de aminoácidos en la unión de rotura NS1-NS2A.

Ejemplo 12 Mutantes del virus del dengue de tipo 4 que presentan una rotura subóptima en la unión NS1-NS2A

Ahora se pone un énfasis especial en la aplicación de la comprensión molecular del virus del dengue para desarrollar vacunas de virus vivo atenuado que sean seguras y eficaces contra la enfermedad del dengue. La restricción de la replicación del virus del dengue se traducirá en una atenuación. La modificación de una secuencia de rotura o de los componentes de la proteasa vírica se traducirá en una rotura subóptima de la poliproteína vírica, restringiendo de este modo el crecimiento vírico.

Se elige el sitio de rotura de la poliproteína NS1-NS2A como primera diana para la construcción de mutantes del virus del dengue que tengan un crecimiento restringido a raíz de una rotura ineficaz. Hemos demostrado que la rotura NS1-NS2A del virus del dengue de tipo 4 requiere una secuencia de 8 aminoácidos en el extremo NS1 antes de la unión a romper (Hori, H. y Lai, C.J., 1990). La rotura del NS1-NS2A del virus del dengue requiere una secuencia de octapéptido en el extremo C de la NS1, véase J. Virol. 64, 4573-4577.

La comparación de la secuencia de 8 aminoácidos entre los flavivirus pone de manifiesto un motivo interesante, en el que Ala(-1), Val(-3), Ser(-5), Val(-7) y Met/Leu(-8) están conservados estrictamente, mientras que Thr(-2), Gln(-4) y Lys(-6) varían. Se analiza el efecto de las sustituciones de aminoácido Ala de la posición -1, Thr de la posición -2, Val de la posición -3 y Gly de la posición +1. El resultado de este análisis se presenta en la figura 16. La sustitución de aminoácidos en la posición conservada -1 ó -3 dan lugar a un nivel bajo de rotura. Las sustituciones de aminoácidos en la posición no conservada -2 ó +1 no tiene efecto o solamente una reducción moderada de la rotura.

Para la incorporación al cDNA de longitud completa se selecciona un panel de sustituciones de aminoácidos que producen un intervalo de eficacias de rotura y para la construcción de los mutantes del virus del dengue se utilizan los transcritos de RNA derivados "in vitro". A partir de células LLC-MK_{2} transfectadas se recupera un mutante del virus del dengue denominado DEN4(Gly_{1120}-Glu), que contiene la Glu sustituyendo a la Gly (+1) y otros tres mutantes denominados DEN4(Thr_{1124}-Lys), DEN4(Thr_{1124}-Gln) y DEN4(Thr_{1124} -Leu), que contienen sustitución de Thr(2).

Las propiedades de crecimiento de estos mutantes se caracteriza mediante ensayo de placa con células C6/36 de mosquito, del modo descrito a continuación. En la figura 12 se presenta el resultado de este ensayo del DEN4(Gly_{1124}-Glu) y el virus original de control. El tamaño de placa del virus mutante medido es de aproximadamente 0,1 cm de diámetro, valor muy reducido si se compara con el tamaño de placa de 1,1 cm para el virus original; otros mutantes del virus del dengue presentan también un tamaño de placa reducido, lo cual sugiere que estos virus presentan una restricción de crecimiento en células cultivadas. Es probable que la restricción del crecimiento resultante de una rotura subóptima pueda tener un efecto profundo en la virulencia vírica para el hospedante infectado.

Ingeniería genética de mutantes viables del virus del dengue por deleción de la región 3' no codificadora Ejemplo 13 Construcción de cDNA de dengue que contiene deleciones en la región 3' no codificadora

Para facilitar la introducción de mutaciones de deleción en la región 3' no codificadora de 384 nucleótidos, el subfragmento de 540 nt del cDNA del dengue 4 entre el sitio único BamHl en el nt 10104 y el sitio Asp718 del extremo 3' se inserta inicialmente en el vector de clonación pGEM3. En este plásmido recombinante, el sitio único ApaI del nt 10470 de la secuencia del dengue 4 se coloca aproximadamente en el punto central de la secuencia 3' no codificadora. Empleando un sitio ApaI ubicado convenientemente se construyen dos series de mutaciones por deleción: una serie de constructos contiene deleciones en dirección a 3' (dowstream) del sitio ApaI y la otra serie de deleciones se coloca en dirección a 5' (upstream) del sitio ApaI. Se realiza la mutagénesis dirigida a un oligonucleótido para diseñar la primera serie de mutaciones de deleción, que abarcan de 30 a 90 nucleótidos en longitud.

Los siguientes nucleótidos que contienen el sitio de rotura ApaI, las deleciones apropiadas que se indican, seguido por la secuencia en dirección a 3' se emplean como cebadores de hebra positiva para la PCR.

100

El cebador de hebra negativa es el oligo GAG CTG GTA CCA GAA CCT GTT GGA TCA A (SEQ ID NO: 10), que contiene la secuencia 3' del dengue seguida por la secuencia de rotura Asp718. Como molde se emplea el cDNA (clon 2A) de longitud completa del dengue 4. Para introducir estas mutaciones por deleción en la secuencia del dengue 4 se reemplaza el fragmento del DNA del virus de tipo salvaje entre los sitios ApaI y Asp718 del plásmido recombinante pGEM3 por los productos DNA de la PCR que se rompen con ApaI y Asp718.

De manera similar se realiza también una mutagénesis dirigida a oligonucleótido para diseñar la segunda serie de mutaciones que van de 61 a 202 nucleótidos en longitud y para colocarlos después del sitio ApaI en dirección a 5'. Se sintetizan los oligonucleótidos siguientes y se utilizan como cebadores de hebra negativa en la PCR.

101

El cebador de hebra positiva es el oligo GCC TCC ATG GCC ATA TGC TCA GC (SEQ ID NO: 15) que se sitúa entre los nucleótidos 9885-9907 del sitio BamH1 en dirección a 5'. Como molde se emplea el cDNA de longitud completa del dengue 4. Tal como se ha descrito anteriormente, para introducir estas mutaciones de deleción en la secuencia del dengue de tipo 4 se reemplaza el fragmento de DNA del virus de tipo salvaje entre el sitio BamH1 y el sitio ApaI del plásmido intermedio pGEM3 por los productos DNA de la PCR que se rompen con BamH1 y ApaI. En el último estadio del diseño se aíslan el molde cDNA, los fragmentos BamH1-Asp718 de ambas series de constructos y se clonan con la secuencia restante del dengue 4.

Ejemplo 14 Transcripción de RNA, transfección y recuperación del virus

Se linealizan los clones de cDNA del virus del dengue por digestión con Asp718 del extremo 3' y se emplea el DNA lineal como molde para la transcripción "in vitro" mediante la polimerasa SP6. La transfección de las células con transcritos de RNA se realiza del modo descrito (Lai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5139-5143, 1991). Diez días después de la transfección se tripsinizan las células y se transfieren a una placa de 6 hoyos y a una corredera de cámara. Dos días después se ensayan las células de la corredera por inmunofluorescencia (IFA) para detectar los antígenos del virus del dengue. Si la IFA pone de manifiesto que la mayoría de células están infectadas, entonces se tripsinizan las células de la placa de 6 hoyos, se mezclan con un exceso 6 veces mayor de células no infectadas, entonces se recolectan las células infectadas de la placa de 6 hoyos sacando el medio, raspando las paredes, resuspendiendo las células en un volumen estándar de medio esencial mínimo Eagle al 50%/suero al 50% y después congelándolas. Por otro lado, si un pequeño porcentaje de células es positivo, se tripsinizan las células, se diluyen 1:3 en medio fresco y se mantienen en cultivo. Entonces se estima el porcentaje de células infectadas en una base semanal y se recolectan los lisados celulares.

Ejemplo 15 Morfología de placa

Se caracterizan los virus mediante morfología de placa en células LLC-MK_{2} derivadas de primate o en células C6/36 de mosquito (Bankcroft y col., Pan Am. Health. Organ. Sci. Publ. 375, 175-178, 1979; Hoke y col., Am. J. Trop. Med. Hyg. 43, 219-226, 1990). Se pasa el virus parental de tipo salvaje una vez por células LLC-MK_{2} antes del análisis de morfología de placa. En concreto, se inyectan células LLC-MK_{2} en un frasco de 25 cm^{3} con 0,2 ml de virus del dengue a ensayar en una serie de diluciones de 10 veces en un medio 199 que contiene un 2% de suero fetal bovino. Después de la absorción a 35ºC durante 1 hora, a cada monocapa se le añaden 7 ml de una capa superior de agarosa que contiene 1x medio 199, un 0,3% de bicarbonato sódico 1/2x, vitaminas en medio basal Eagle y 1/2x aminoácidos en medio basal Eagle, un 10% de suero fetal bovina, un 0,5% de agarosa. Después de una incubación a 35ºC durante seis días se recubren los frascos por segunda vez con 4,0 ml de una solución salina normal que contiene un 0,5% de ME agarosa y rojo neutro al 1:7.500. Las placas de virus aparecen al cabo de 24 horas de la tinción. Se lleva a cabo una morfología de placa en células C6/36 para caracterizar todos los mutantes de virus aislados. A tal fin se inoculan células concluyentes C6/36 en un frasco de 75 cm^{3} con 0,5 ml de virus diluido en serie con MEM más un 2% de suero fetal bovino, se deja absorber a 35ºC durante 1-2 horas. Después se añaden a las células infectadas 20 ml/frasco de una capa superior de agarosa (1x solución salina equilibrada de Hank, un 0,5% de lactalbúmina hidrolizada, un 10% de suero fetal bovino, un 0,12% de bicarbonato sódico, un 0,75% de Seakem^{TM} GTG agarosa). Los cultivos se incuban a 35ºC durante 7 días. Después se tiñen los cultivos con 5 ml de una solución de tinción de rojo neutro líquido, que contiene 8,0 g/l de NaCl, 0,4 g/l de KCl, 1,0 g/l de glucosa, 22,5 mg/l de Na_{2}HCO2 y 3,3 mg/l de rojo neutro. Después de una incubación a 35ºC durante 3-5 horas se elimina el exceso de tintura y se vuelven los cultivos al incubador. En general, las placas son visibles después de 24-36 horas de incubador.

Ejemplo 16 Mutantes del virus del dengue de tipo 4 que contienen deleción en la región 3' no codificadora

El sistema de DNA recombinante del dengue nos permite ahora construir además mutantes de virus del dengue que contienen deleciones en las regiones no codificadoras 5' y 3' del RNA vírico así como en la región codificadora. Los mutantes de deleción podrían ofrecer la ventaja de estar menos sujetos a la reversión de fenotipo que los mutantes de sustitución de aminoácidos. Se han hecho progresos en la ingeniería de las mutaciones de deleción en la región no codificadora 3' del genoma del virus del dengue de tipo 4. Al igual que los flavivirus transmitidos por mosquitos, el virus del dengue de tipo 4 contiene tramos de secuencias conservadas, llamados secuencia conservada 1 (CS-1) y secuencia conservada 2 (CS-2) y una estructura terminal de tallo y bucle potencial en la región no codificadora 3'.

Se han producido deleciones que contienen de 30 a 120 nucleótidos en diversas ubicaciones de la secuencia 3' no codificadora de 385 nucleótidos del RNA del virus del dengue de tipo 4. El RNA mutante transcrito a partir de un clon de cDNA que carece de secuencias en la región CS-1, pero conservan la estructura de tallo y bucle no producen virus de progenie, lo cual sugiere que el virus de deleción se ha recuperado a partir de muchos otros constructos de deleción (figura 13). El ensayo de placa de estos mutantes y del control de virus de tipo salvaje se han efectuado en células C6/36.

Los resultados de este análisis revelan que la mayoría de estos mutantes forman placas que tienen un tamaño reducido, comprendido entre 1,0 y 0,3 cm, dependiendo de la ubicación y de la extensión de la deleción (figuras 14 y 15). La alteración de la morfología de placa indica que estos mutantes de deleción presentan un fenotipo de restricción de crecimiento. Este panel de mutantes de deleción puede presentar otras propiedades interesantes y potencialmente importantes, por ejemplo una virulencia reducida para los animales experimentales y para los humanos.

Ejemplo 17 cDNA de TBEV/DEN4 quimérico de longitud completa y producción de virus quiméricos

Se clonan previamente fragmentos de cDNA subgenómico del TBEV (cepa Sofjin) y se determina la secuencia de nucleótidos (véase Pletnev y col., Virology, 1990, lugar citado). La Dra. E. Yu. Dobricova (Novosibirsk Institute of Bioorganic Chemistry, Rusia) proporciona los plásmidos pGEM2-CME que contiene los nucleótidos (nt) 76-1977 y el pGEM2-ENS1 que contiene los nucleótidos 966-3672 de la secuencia del TBEV a partir de los plásmidos p10, p4, p18, p2, p11 (Pletnev y col., lugar citado) uniendo los segmentos de TBEV por los sitios compartidos de enzimas de restricción. Se utilizan los plásmidos p5'-2 y p5'-2 (\DeltaPstI, XhoI) y el derivado p5'-2 (\DeltaPstI,XhoI,\DeltaHindIII) del DEN4 (Bray y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, lugar citado) como constructo de cDNA recombinante para la sustitución de uno o varios genes de TBEV en lugar de los genes correspondientes de DEN4. Los oligonucleótidos (oligos) sintéticos se utilizan como cebadores de hebra negativa o positiva para generar DNS de doble hebra mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de rotura por enzima de restricción se introducen en las uniones intergénicas del TBEV y DEN4 o junto a ellas, mediante una mutagénesis dirigida a una posición dirigida por PCR (figura 17). Se construyen inicialmente siete plásmidos quiméricos intermedios que contienen los genes indicados de TBEV y se identifican los cDNA estables de longitud completa del TBEV/DEN4 después de la transformación en la cepa BD1528 de la E. coli (descrita por Lai y col., 1991, lugar citado). Las secuencias que rodean las uniones entre los genes de TBEV y de DEN4 de cada plásmido se confirman por secuenciación de ácidos nucleicos empleando técnicas bien conocidas en biología molecular. Todos los plásmidos quiméricos contienen el promotor SP6 que ocupa una posición situada después de la G, que inicia la transcripción, en dirección a 5' (upstream) y seguida por un resto A que representa el primer nucleótido del DEN4. Antes de la transcripción "in vitro" se linealizan los plásmidos en el único sitio de rotura Asp718, que sigue inmediatamente después del extremo 3' de la secuencia DEN4 (empleando las técnicas descritas por Lai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, lugar citado). La recuperación de los virus quiméricos y el posterior estudio de sus propiedades se realiza en el establecimiento de confinamiento BL-3. Las reacciones de transcripción se llevan a cabo fundamentalmente del modo descrito por Lai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, lugar citado. Antes de la transfección se trata la mezcla de transcripción con 40 u/ml de DNasa I a 37ºC durante 15 min. Después se emplean los transcritos de RNA para transfectar las células LLC-MK_{2} semiconfluyentes de simios en presencia de (i) Lipofectina^{TM} (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersberg, Maryland) del modo descrito anteriormente por Lai y col., lugar citado o (ii) metilsulfato de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP) (Boehringer Mannheim). En las condiciones de transfección del DOTAP, la mezcla de transfección contiene transcritos de RNA (2 \mug) en 40 \mul de tampón Hepes 0,02 mM, pH 7,05 y 12 \mul de DOTAP en 30 \mul de tampón Hepes. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 min se añaden 2 ml de medio 199 que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS); 0,5 ml de la mezcla se distribuye a células subconfluyentes en 4 hoyos de la placa de 24 hoyos. Pasados diez días se tripsinizan las células y se transfieren a una placa de 6 hoyos y a correderas de cámara para una incubación adicional de 2 días en el medio de cultivo. Se ensayan las células de las correderas mediante inmunofluorescencia (IFA) para detectar la presencia de antígenos de DEN4 o de TBEV empleando una dilución 1:100 en líquido ascítico de ratón hiperinmune (HMAF) específico del DEN4, HMAF específico del TBEV o suero de conejo específico del TBEV (suministrado gentilmente por el Dr. A.S. Karavanov, Instituto de Poliomielitis, Moscú, Rusia). Se utiliza el suero anti-ratón o anti-conejo conjugado con fluoresceína (Kierkegaard-Perry, Gaithersberg, Maryland) en igual dilución. Cuando el IFA indica que están infectadas del 50 al 80% de las células, se tripsinizan las células en una placa de 6 hoyos, se mezclan con un exceso 2 veces mayor de células no infectadas y se cultivan en un frasco T_{75} durante 6 días. Después se recolectan las células infectadas junto con el medio, se mezclan con un volumen igual de suero fetal bovino y se congelan en forma de suspensión celular. Se emplea el lisado celular descongelado como fuente de virus quimérico de progenie. En los ensayos de transfección empleando Lipofectina^{TM} o DOTAP solamente se identifican el TBE(ME)/DEN4 y el TBE(CME)/DEN4. El virus de progenie se identifica por ensayo de inmunofluorescencia.

Para verificar la estructura genómica del virus quimérico de progenie TBE(ME)/DEN4, denominado vTBEV(ME)/DEN4, se aísla el RNA celular total de células LLC-MK_{2} infectadas por extracción con fenol empleando técnicas descritas por Mackow y col., Virology 159, 217-228, 1987. Para la transcripción inversa se emplea como cebador el oligo 5'-GCT CCG GGG TGT AAG TCC ATT-3' (SEQ ID NO: 16), complementario de las posiciones de nucleótidos (nt) 5090-5110 (véase Mackow y col., Virology 159, 217-228, 1987) de la secuencia del DEN4. Se emplea un cDNA de hebra simple como molde y un oligo 5'-GAC CGA CAA GGA CAG TTC CAA ATC GGA-3' (SEQ ID NO: 17) en las posiciones de nt 18-44 de la secuencia del DEN4 actúa como cebador de hebra positiva y el oligo 5'-CTT TTT GGA ACC ATT GGT GAC T-3' (SEQ ID NO: 18) en las posiciones de nt 2130-2152 de la secuencia del TBEV como cebador de hebra negativa para la PCR. Para las posiciones de nucleótido relativas al virus del dengue, véase Zhao y col., Virology 155, 77-88, 1986; y para las posiciones de nucleótidos del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, véase Pletnev y col., Virology, 1990, lugar citado. El DNA de 2118 pares de bases (pb) producto de la PCR se digiere con PstI, BglII o EcoRi para verificar la presencia de sitios de enzimas de restricción. De manera similar se utilizan en la PCR el oligo 5'-GTC CGG CCG TCA CCT GTG ATT-3' (SEQ ID NO: 19) y el oligo 5'-TCA CGG TGC ACA CAT TTG GAA AAC-3' (SEQ ID NO: 20) (complementario del genoma del DEN4 en los nt 3459-3480 y complementario de la hebra negativa del genoma del TBEV en los nt 967-985, respectivamente). Se digiere el producto de la PCR con EcoRI, PstI, BamHI, XhoI o SphI para verificar la secuencia de DNA. El DNA (2118 bp) producto de la PCR del genoma de vTBE(ME)/DEN4 se digiere con enzimas de nucleasas de restricción HindIII y BamHI. Se purifica el subfragmento HindIII-BamHI (1922 bp) por PAGE y se clona en el vector pGEM3 en los sitios de restricción complementarios. La secuencia de la unión entre el gen C del DEN4 (nt 300-398) y el gen de preM del TBEV (nt 418-460) se confirma por secuenciación de ácidos nucleicos. Los oligonucleótidos empleados para la construcción del DNA quimérico TBE/DEN4 incluyen:

Oligos específicos del TBEV

1

Oligos específicos del DEN4

2

3

La SEQ ID NO: 23 se utiliza para preparar la unión de la región no codificadora 5' del DEN4/cápside de TBEV para formar el sitio Bgl II/Bam Hl. Las SEQ ID NO: 30 y 24 se utilizan para preparar la unión de DEN4 C/TBEV preM para formar los sitios Pstl/Pstl. Las SEQ ID NO: 28 y 21 se utilizan para preparar la unión de DEN4 preM/TBEV E para formar sitios Bam H1/Bg1 II. La unión DEN4 NS1/TBEV NS1 se prepara empleando la SEQ ID NO: 26 para formar los sitios Xho 1/Xho 1. La unión TBEV E/DEN4 NS1 se prepara empleando la SEQ ID NO: 25 para formar los sitios Xho1/Xho1. La unión de TBEV C/DEN4 preM se prepara empleando las SEQ ID NO: 27 y 31 para generar sitios Pst1/Pst1 y la unión TBEV NS1/DEN4 NS2A se prepara utilizando las SEQ ID NO: 22 y 29 para generar sitios Sph1/Sph1. Los signos + y - asociados con las secuencias indican los cebadores en la dirección hacia 5' (upstream) y en la dirección hacia 3' (downstream), respectivamente.

Ejemplo 18 Análisis de proteínas de viriones quiméricos

Para analizar las proteínas producidas por el v2A (XhoI) de DEN4, el constructo del cDNA de longitud completa del virus del dengue 4 o el vTBE(ME)/DEN4, se infectan células confluyentes LLC-MK_{2} en una placa de 6 hoyos con el virus respectivo en una MOI de 1,0. Seis días después de la infección se marcan las células con metionina-[S^{35}] (60 \muCi por hoyo, actividad específica: 600 Ci/mmol) en MEM exento de metionina (medio esencial mínimo Eagle) durante 4 h, del modo descrito por Lai y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, lugar citado. Se inmunoprecipitan los lisados con 1) HMAF específico de TBEV; 2) HMAF específico de DEN4; 3) suero de conejo contra E de TBEV, o 4) antisuero de conejo específico de las proteínas preM, E, NS3 o NS5 de DEN4. Se analizan los inmunoprecipitados por PAGE en condiciones de desnaturalización empleando las técnicas descritas por Laemmli, lugar citado.

Análisis de la síntesis de proteínas a lo largo del tiempo

Se infectan monocapas de células LLC-MK_{2} o C6/36 en frascos T_{25} con vTBE(ME)/DEN4 o 2vA (XhoI) de DEN4 en una MOI de 1. Después de la adsorción a 37ºC durante 1 h se separa el inóculo vírico y se añade medio fresco a las células. Para el análisis de la síntesis de proteínas se incuban durante 20 min las células infectadas durante varios tiempos (0, 4, 8, 24 y 48 horas) después de la adsorción del virus con MEM exento de metionina y se marcan con metionina-[S^{35}] en el mismo medio durante 2 h. Se precipitan los lisados de las células marcadas con HMAF específico de DEN4 y se analizan por PAGE y autorradiografía.

Ejemplo 19 Análisis del crecimiento del constructo quimérico

Se caracterizan el DEN4 parental y sus virus quiméricos por ensayo de placa en células LLC-MK_{2} de simio y C6/36 de mosquito. Las técnicas para el ensayo de placa se describen en Bancroft y col., lugar citado. El análisis del crecimiento representado en la figura 19 se realiza cuantificando la cantidad de virus presentes en cultivos de células LLC-MK_{2} y C6/36 infectadas con DEN4 o TBE(ME)/DEN4 en diversos días después de la infección. Después de la infección y de la adsorción del virus, se recolectan los cultivos y se depositan muestras de cada cultivo en las placas de ensayo. La concentración variable del virus en log (pfu/ml) se presenta en forma de curvas de crecimiento frente al tiempo.

Ejemplo 20 Análisis de la síntesis del RNA vírico

Para el análisis de la síntesis del RNA vírico se recogen células LLC-MK_{2} o C6/36 infectadas (aproximadamente 10^{6} células) en diversos tiempos (0, 4, 8, 24, 48 h) después de la adsorción del virus, se enjuagan con 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, y después se lisan en un tampón que contiene NaAc 0,3 M, pH 5,2, EDTA 5 mM y un 1% de SDS. Se aísla el DNA total del lisado celular y del medio por extracción con fenol, empleando técnicas descritas por Maniatis y col., lugar citado. Las muestras de RNA se desnaturalizan por incubación en 6xSSC (1xSSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 0,015 M) que contiene un 7,5% (p/vol) de formaldehído a 60ºC durante 15 min y se fijan sobre un filtro BA85 de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell). Se cuecen los filtros a 80ºC durante 1 h y se prehibridan a 65ºC durante 1 h en una solución que contiene 6xSSC, 3x solución de Denhardt, Na_{2}HPO_{4} 25 mM (pH 6,5), un 0,1% de SDS y 25 \mug/ml de DNA de esperma de salmón. Se prosigue la hibridación a 65ºC durante una noche en la misma solución que contiene una sonda de DNA de pTBE(ME)/DEN4 que ha sufrido desplazamiento de mella (nick-translated) y se ha marcado con [P^{32}] (50 ng/ml, actividad específica: 3,4 x 10^{8} cpm/\mug). Después de la hibridación se lavan los filtros cinco veces con 0,1xSSC que contiene un 0,1% de SDS a 65ºC, se secan y se exponen a una película de rayos X a 70ºC. Se mide también la radiactividad del DNA-[P^{32}] hibridado con el RNA en un contador de centelleo líquido. Como control positivo se utilizan los transcritos de RAN obtenidos "in vitro" a partir del pTBE(ME)/DEN4.

Ejemplo 21 Ensayo de la eficacia protectora de la preparación de vacuna y de la neurovirulencia de los virus quiméricos

Se analiza la neurovirulencia de los virus vTBE(ME)/DEN4 y del virus parental del dengue por inoculación a ratones por vía intracerebral (IC), intradérmica (ID) o intraperitoneal (IP). Se inyecta a ratones BALB/c lactantes de tres días de edad por vía IC una dosis de 10^{2} pfu del virus en 0,02 ml de MEM/0,25% de albúmina de suero humano. Se inocula a ratones BALB/c hembras de seis semanas de edad (i) por vía IC una dosis de 10^{3} pfu del virus, diluido del modo indicado antes, en un volumen de 0,03 ml, o bien (ii) se inocula por vía ID o IP una dosis de 10^{3} pfu del virus en un volumen de 0,10 ml. Se observan los ratones durante 21 días, anotando los síntomas de encefalitis o muerte y los ratones adultos supervivientes se sangran 20 días después de la infección para evaluar la respuesta de anticuerpos a los virus inoculados. Se tratan los ratones supervivientes por vía IP al cabo de 21 días de la infección con 10^{3} LD_{50} de TBEV (cepa Sofjin) en el establecimiento de confinamiento BL-4.

Ejemplo 22 Construcción y secuenciación de mutantes de virus quiméricos

Se introducen mutaciones en el constructo de TBEV(ME)/DEN4 empleando una mutagénesis dirigida a una posición con arreglo al procedimiento estándar dirigido por PCR para oligos, bien conocido de los expertos en biología molecular (véase las siguientes secuencias de oligos). Se transfectan los constructos resultantes a células LLC-MK_{2} empleando las técnicas descritas en el ejemplo 17. Se evalúa el virus de progenie, recuperado de los constructos mutagenizados, para determinar las alteraciones en la morfología de placa con arreglo a las técnicas descritas en el ejemplo 19. Se introducen mutaciones estratégicas en el constructo de cDNA de longitud completa del TBE(ME)/DEN4 con el fin de lograr modificaciones sistemáticas de regiones predeterminadas del genoma del virus quimérico. Se recuperan seis quimeras mutantes de las células LLC-MK_{2} transfectadas y se analiza el virus de progenie para determinar su capacidad de inducir neurovirulencia en los ratones. Se evalúan además otras propiedades de crecimiento vírico en las células cultivadas. Tal como se recoge en la figura 23, se prevé que cuatro mutantes de virus, que contienen el sitio suprimido de glucosilación en la glucoproteína preM, E o NS1, van a presentar un defecto de glucosilación en el sitio indicado. El mutante *preM/M^{-} contiene una secuencia defectuosa de rotura en la unión intergénica preM/M. El mutante *E contiene dos sustituciones de aminoácidos, estas sustituciones se eligen porque estos aminoácidos solamente se encuentran en los flavivirus transmitidos por mosquitos.

Se introducen las mutaciones en el constructo TBE(ME)/DEN4 por mutagénesis dirigida a una posición con arreglo a un procedimiento estándar dirigido por PCR para oligos. Resumiendo, en la PCR se utilizan un oligo de hebra positiva y su oligo complementario de hebra negativa, cada uno de ellos contiene una secuencia de mutación y un único sitio de enzima de restricción, junto con el oligo del respectivo par de cebadores en dirección a 3' (downstream) o en dirección a 5' (upstream). Ambos productos de la PCR se unen por el sitio compartido único de enzima de restricción. De este modo se obtiene el fragmento resultante de DNA, que contiene la secuencia mutada, para sustituir el correspondiente fragmento de DNA de tipo salvaje en el cDNA de longitud completa del TBE(ME)/DEN4. A continuación se presenta una lista de DNA de mutantes quiméricos y de oligonucleótidos empleados para su construcción.

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

Además, el cebador en dirección a 5' (upstream) es el de la SEQ ID NO: 44:

\hskip0,6cm6

y el cebador en dirección a 3' (downstream) es el de la SEQ ID NO: 45:

7

Ejemplo 23 Análisis de la neurovirulencia en ratones

Además, se inoculan preparaciones de virus quimérico mutado por vía IC a ratones y se comparan con el DEN4, el TBE(ME)/DEN4 y el TBE(CME)/DEN4 aplicando técnicas descritas en el ejemplo 21. Se compara la dosis letal, que se requiere para matar a la mitad de los animales del ensayo, para cada uno de los virus quiméricos mutados. Se inoculan por vía intracerebral a ratones BALB/c de seis semanas de edad, repartidos en grupos de 8, varias quimeras mutantes, el TBE(ME)/DEN4, el TBE(CME)/DEN4 y el DEN4, en dosis de 1000, 100, 10, 1 y 0,1 pfu. Se observan los ratones infectados durante 31 días, anotando los síntomas de encefalitis o la muerte. La dosis letal del 50% (LD50) se calcula para cada virus y se toma el valor hallado como base para la neurovirulencia en el ratón. Tal como se desprende de la figura 24, la LD50 del virus parental TBE(ME)/DEN4 es de aproximadamente 10 pfu. Este nivel de LD50 se observa también en varios virus mutantes. Por lo menos dos mutantes, el *NS1(1)-Glc+ y el *preM/M-, presentan LD50 mayores que 100 pfu, lo cual indica que estos mutantes poseen una reducción más de 100 veces mayor de su neurovirulencia en el ratón. Estos resultados indican que la mutación NS1(1)-Glc- o la preM/M- del genoma del virus quimérico puede conferir en cada caso una atenuación de la neurovirulencia en el ratón. Estos virus mutantes, por separado o juntos, pueden ser valiosos para la posterior evaluación de su utilidad como candidatos para vacunas.

Ejemplo 24 Ensayo de constructos quiméricos optimizados en primates

Se acepta que los primates subhumanos, pero no otros animales, se infectan con facilidad con el virus del dengue a través de una ruta periférica (Simmons y col., Philipp. J. Sci. 44, 1-247, 1931 y Rosen, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7, 406-410, 1958). La infección de monos constituye el sistema experimental más parecido a la infección de humanos con el virus del dengue. La respuesta del macaco de la India a la infección del dengue es similar a la de los humanos, por el hecho de darse una viremia de cuatro a seis días, aunque los primates inferiores no presentan los síntomas clínicos del dengue. Los objetivos de los estudios del dengue o de otros flavivirus son: (1) evaluar la inmunogenicidad de varias vacunas candidatas; (2) evaluar la infectividad y la virulencia (fenotipo de atenuación) de las vacunas candidatas de virus del dengue vivo o del virus del dengue quimérico, expresadas como duración de la viremia en días y el pico de la concentración del virus en pfu/ml; y (3) evaluar la eficacia protectora de las vacunas recién mencionadas por comparación con el virus homotípico del dengue o con otros flavivirus de igual especificidad que el virus quimérico.

(1) Inoculación: se inocula cada macaco de la India con un total de 3x10^{6} pfu de virus diluidos en medio mínimo esencial Eagle/0,25% de albúmina de suero humano. Normalmente se administran dos dosis subcutáneas a los animales anestesiados.

(2) Extracción de sangre: después de la inoculación del virus del dengue o de un virus quimérico del dengue se extrae cada día una muestra de sangre de 3,0 ml durante dos semanas y 5,0 ml al cabo de 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas y 8 semanas.

(3) Comparación con virus del dengue u otros flavivirus: cuando se considera oportuna la comparación de virus para evaluar la eficacia protectora, se inocula a los monos el virus no atenuado a razón de 10^{5} pfu/dosis por vía subcutánea en un volumen de 0,5 ml, en la zona superior del brazo.

(4) Ensayos de laboratorio: se utilizan muestras de suero para determinar: (a) la duración de la viremia mediante un ensayo directo del virus en placas; (b) la concentración de anticuerpos específicos del dengue o de otros flavivirus por radio-inmunoprecipitación y ELISA; y (c) la concentración de anticuerpos de neutralización en un ensayo de neutralización por reducción en placa; todos los ensayos mencionados son conocidos de los expertos en la técnica de desarrollo de vacunas.

Las formas de ejecución concretas de la invención se han descrito con detalle, por lo que los expertos en la materia comprenderán que estas formas de ejecución son ilustrativas y no limitantes y el verdadero alcance de la invención debería interpretarse sobre la base de las reivindicaciones que siguen.

(1) Información general

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Solicitantes:

\vskip0.800000\baselineskip

: Los Estados Unidos de América, representados por el Secretario del Departamento de Salud y Servicios Humanos,

\vskip0.800000\baselineskip

: Lai, Ching-Juh (solo Estados Unidos)

\vskip0.800000\baselineskip

: Bray, Michael (solo Estados Unidos)

\vskip0.800000\baselineskip

: Men, Ruhe (solo Estados Unidos)

\vskip0.800000\baselineskip

: Pethel, Michele (solo Estados Unidos)

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Título de la invención: flavivirus quiméricos y/o de crecimiento restringido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Número de secuencias: 45

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Dirección postal:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Dirección: Knobbe, Martens, Olson y Bear

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Calle: 620 Newport Center Drive, 16th. Floor

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Ciudad: Newport Beach

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Estado: CA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): Nación: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): Código postal: 92660

\vskip0.800000\baselineskip

(v): Forma leíble con ordenador:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Tipo de soporte: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Ordenador: PC IBM o compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Programa informático: PatentIn, edición nº 1.0, versión nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): Datos actuales de solicitud:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Número de solicitud:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Fecha del depósito:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Clasificación:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): Información del abogado/agente:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Nombre: Altman, Daniel E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Número de registro: 34,115

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Número de referencia/docket: NIH024.024HPC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): Información de telecomunicación:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Teléfono: 714-760-0404

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Telefax: 714-760-9502

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGCTATGC CACGCAAA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCTGGCCG GCCTTCACCT GTGATTTGAC CAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCTGGCCG GCCTGCACCT GTGATTTGAC CAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCTGGCCG GCCAGCACCT GTGATTTGAC CAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTGATGTG CCCTGTTCGG CCGTCACCTG TGA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTGATGTG CCCTGCCAGG CCGTCACCTG TGA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAAGGGGG CCCAAGACTA GAGGTTACAG GAGACC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAAGGGGG CCCAACAAAA ACAGCATATT GACGCTGGG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAAGGGGG CCCAACAGAG ATCCTGCTGC TGTCTCTGC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCTGGTAC CAGAACCTGT TGGATCAA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGGCTTGG GCCCCCGCGT ACAGCTTCCG TGGCGC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGGCTTGG GCCCCGGAGC TACAGGCAGC ACGGTT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGGCTTGG GCCCCCGTGG CACAAGTGGC CTGACT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGGCTTGG GCCCCCTTACA GAACTCCTTC ACTCTCTGA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTCCATGG CCATATGCTC AGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCCGGGGT GTAAGTCCAT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCGACAAG GACAGTTCCA AATCGGA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTTTGGAA CCATTGGTGA CT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCGGCCGT CACCTGTGAT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACGGTGCA CACATTTGGA AAAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGTTTATA GATCTCGGTG CACACATTTG GAAAAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCATTGTC TGCATGCACC ATTGAGCGGA CAAGCCC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTAGGAGAA CGGATCCTGG GGATGGCCGG GAAGGCCATT CTG

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCAAAAGAA GGTCTGCAGT AGACTGGACA GGTTGG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGGAAGCT CATGGACATG GTCGGATTCC TCGAGTTCAG GCCCAACCAG GC

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGGCCTGG TTGGGCCGAA CTCGAGGAAT CCGACCATGT C

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 27

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCAGTCTA CTGCAGACCT TCTTTTGCCA CGTCTTTG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACGCATCGG GATCCGTAGG ATGGGGCGAC CAGCAT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 29

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACAGGTGC ATGCCGGACA GGGCACATCA GAAACT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 30

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCAATGTT ACTGCAGACC TTTTTCTCCC GTTC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 31

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGAAAAA GGTCTGCAGT AACATTGCTG TGCTTGATTC CC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 32

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGCAACCC AGGTGCGTGT CGATCGTGGC ACCTGTGTGA TCCTGG

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGGATCAC ACAGGTGCCA CGATCGACAC GCACCTGGGT TGCCGC

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGATTAC GTCGCTGCTC TAGAGACTCA CAGTGGAAGA AAA

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTCTTCCA CTGTGAGTCT CTAGAGCAGC GACGTAATCC CCC

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 36

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCACCCCAG AAGCAAGGAT CCGCACATTT TTAATAGACG GAC

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 37

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCGTCTAT TAAAAATGTG CGGATCCTTG CTTCTGGGGT GAA

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 38

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGATAGAGA GCTCAAGGAT CCAGACTTGG CAGATAGAGA

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 39

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCATATATA TTTTTCCCCT TTACACTCTG TCATC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 40

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCAAGAA CAAGACGCGT AGTGCTGATC CCATCCCAC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 41

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGGGATCA GCACTACGCG TCTTGTTCTT GATCCTTCTT G

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 42

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGACCAGA GCGATCGAGG CTGGGGCAAC GGGTGTGGAT TTTTTGGAAA A

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 43

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCCAGCCT CGATCGCTCT GGTCTCTCTT ACACACTTAC GACGG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 44

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCGACAAG GACAGTTCCA AATCGGA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información de la SEQ ID NO: 45

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Tipo de molécula: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Hipotética: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Antisentido: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia SEQ ID NO: 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGAACTGT GAAGCCCAGA AACAGAGTGA TTCCTCCAAC AGCTATGCA

\hfill

49

Claims

1. Un constructo de DNA recombinante que codifica al RNA del virus infeccioso estable de longitud completa del dengue de tipo 4, que contiene por lo menos una mutación que: i) reduce la glucosilación de la proteína de premembrana, proteína de envoltura o proteína de NS1(1), ii) reduce la rotura (división) de la proteína de premembrana en la proteína de membrana, iii) es una sustitución en el sitio que codifica a la glicina, dicho sitio está situado en la posición +1 después del sitio de la rotura de la poliproteína NS1-NS2A o iv) es una sustitución de una secuencia que codifica a uno o varios de los ocho aminoácidos del sitio de rotura del extremo C de la NS1, dicha mutación se traduce en una reducción de la virulencia.

2. Un virus quimérico que tiene un genoma que consta de una región de ácido nucleico que codifica operativamente proteínas estructurales de un subtipo del dengue y proteínas no estructurales de otro subtipo diferentes del dengue, dicho genoma consta por lo menos de una mutación que: i) reduce la glucosilación de la proteína de premembrana, proteína de envoltura o proteína de NS1(1), ii) reduce la rotura de la proteína de premembrana en la proteína de membrana, iii) es una sustitución en el sitio que codifica a la glicina, dicho sitio está situado en la posición +1 después del sitio de la rotura de la poliproteína NS1-NS2A o iv) es una sustitución de una secuencia que codifica a uno o varios de los ocho aminoácidos del sitio de rotura del extremo C de la NS1, dicha mutación se traduce en una reducción de la virulencia.

3. Un método para obtener un producto de inmunización contra un primer flavivirus que consiste en: preparar un constructo de DNA que codifica operativamente una proteína de premembrana y una proteína de envoltura de dicho primer flavivirus y la proteína de cápside y la proteína no estructural de un segundo flavivirus; dicho segundo flavivirus es un virus del dengue que tiene un genoma que contiene por lo menos una mutación que: i) reduce la glucosilación de la proteína de premembrana, proteína de envoltura o proteína de NS1(1), ii) reduce la rotura (división) de la proteína de premembrana en la proteína de membrana, iii) es una sustitución en el sitio que codifica a la glicina, dicho sitio está situado en la posición +1 después del sitio de la rotura de la poliproteína NS1-NS2A o iv) es una sustitución de una secuencia que codifica a uno o varios de los ocho aminoácidos del sitio de rotura del extremo C de la NS1, dicha mutación se traduce en una reducción de la virulencia; y dicho primer flavivirus no es un flavivirus del dengue;

generar transcritos de RNA infeccioso de dicho constructo de DNA;

introducir los transcritos de RNA en una célula;

expresar dichos transcritos de RNA en dicha célula para producir el virus;

recolectar dicho virus de dichas células; y

ensayar dicho virus en un vertebrado no humano; obtener de este modo dicho producto de inmunización contra dicho primer flavivirus.