DE69233566T2

DE69233566T2 - Chimäre und/oder wachstumsgehemmte Flaviviren

Info

Publication number: DE69233566T2
Application number: DE1992633566
Authority: DE
Inventors: Ching-Juh Lai; Michael Bray; Alexander G. Pletnev; Ruhe Men; Robert M. Chanock
Original assignee: US Department of Health and Human Services; US Government
Current assignee: US Department of Health and Human Services; US Government
Priority date: 1991-09-19
Filing date: 1992-09-18
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2012-09-19
Also published as: EP0872553B1; DE69231570T2; GR3032416T3; AU667836B2; JP2002325593A; JP3531934B2; AU2691492A; EP0872553A1; DE69230316T2; EP1018556A1; EP1605047A1; JP3681358B2; GR3035149T3; JP3681369B2; ATE197607T1; ES2153223T3; ES2140418T3; EP1605047B1; ATE186744T1; EP0604566A4

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen rekombinante lebensfähige chimäre Flaviviren und Impfstoffe für das Denguevirus und andere Flaviviren, einschließlich des durch Zecken übertragenen Encephalitisvirus (TBEV). Die Erfindung betrifft außerdem cDNA-Sequenzen, welche die RNA-Transkripte codieren, wodurch die Produktion eines rekombinanten Dengue-Typ 4-Virus, eines rekombinanten mutierten Dengue-Typ 4-Virus, von chimären Dengueviren, von chimären Dengueviren, in denen Mutationen in den davon hergestellten rekombinanten DNA-Fragmenten enthalten sind, gesteuert wird, sowie die damit transformierten Zellen.
Hintergrundinformationen
Zur Familie der Flaviviridae gehören etwa 60 Positiv-Strang-RNA-Viren mit Hülle, von denen die meisten durch einen Insektenvektor übertragen werden. Viele Mitglieder dieser Familie führen in verschiedenen Gebieten der Erde zu gravierenden Gesundheitsproblemen in der Bevölkerung (Monath, T. P., (1986), in: „The Togaviridae and Flaviviridae", S. Schlesinger et al., Hrsg., S. 375-440, Plenum Press, New York). Das Genom aller bisher sequenzierten Flaviviren weist die gleiche Reihenfolge der folgenden Gene auf: 5'-C-präM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3', wobei die ersten drei Gene die Strukturproteine Capsid (C), Prämembranprotein (Pre M) und Hüllprotein (E) codieren.
Dengue-Fieber ist eine durch Stechmücken übertragene Viruserkrankung, die in tropischen und subtropischen Gebieten überall auf der Erde auftritt. Die Untergruppe der Dengueviren verursacht mehr Krankheiten beim Menschen als irgendein anderes Mitglied der Flavivirus-Familie. Die Symptome von Dengue-Fieber sind Fieber, Ausschlag, schwere Kopfschmerzen und Gelenkschmerzen. Die Mortalitätsrate ist niedrig. In den letzten Jahrzehnten wurde jedoch mit zunehmender Häufigkeit bei Kindern und jungen Erwachsenen eine schwerere Form von Dengue-Fieber beobachtet, die sich in schweren Blutungen und Schock äußert (Dengue-hämorrhagisches Fieber/Dengue-Schocksyndrom; DHF/DSS). DHF/DSS tritt am häufigsten während einer Denguevirus-Infektion bei solchen Individuen auf, die vorher mit einem anderen Denguevirus-Serotyp infiziert waren.
Dies führte zu der Vermutung, dass bei der Pathogenese der schwereren Form der Krankheit eine immunologische Steigerung der viralen Replikation eine Rolle spielt (Halstead, S. B., Science 239 (1988), 476-481).
Dengue-Epidemien stellen in vielen tropischen und subtropischen Gebieten, wo die als Überträger fungierenden Stechmückenarten verbreitet sind, ein großes Gesundheitsproblem für die Bevölkerung dar. Trotz 40 Jahren intensiver Forschung sind keine sicheren und wirksamen Impfstoffe gegen das Dengue-Fieber verfügbar. Die WHO hat der beschleunigten Forschung und Impfstoffentwicklung gegen das Denguevirus eine hohe Priorität eingeräumt.
Bald nach ihrer Isolierung im Jahr 1944 wurden die Dengueviren wiederholt in Mausgehirn Passagen unterzogen; dies führte zur Selektion von Mausneurovirulenten Mutanten (Sabin, A. B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1 (1952), 30-50). Interessanterweise zeigten Untersuchungen, die an Freiwilligen durchgeführt wurden, dass die an Mausgehirn angepassten neurovirulenten Mutanten von drei Stämmen des Typ 1- oder Typ 2-Denguevirus zwar abgeschwächt, aber für den Menschen dennoch immunogen waren (Sabin, A. B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1 (1952), 30-50; Sabin, A. B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 4 (1955), 198-207; Schlesinger, R. W., et al., J. Immunol. 77 (1956), 352-364; Wisseman, C. L., et al., Amer. J. Trop. Med. 12 (1963), 620-623). Die Mutanten konnten jedoch nicht als Kandidaten für Impfstoff-Stämme weiterentwickelt werden, da in den Impfstoff-Präparaten Mausgehirn-Antigene vorhanden waren. Seit dieser Zeit sind Virusmutanten, die (i) den Phänotyp mit einer kleinen Plaque-Größe zeigten und/oder (ii) temperatursensitiv waren und/oder (iii) an Zellkulturen angepasst waren, die von einem nicht-natürlichen Wirt stammten (d.h. Wirtsbereichmutanten), selektiert und zum Einschluß in einem abgeschwächten Lebendvirus-Impfstoff als Kandidaten untersucht worden (Harrison, V. R., et al., Infec. Immun. 18 (1977), 151-156; Hoke, C. H., et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 43 (1990), 219-226; Bhamarapravati, N., et al., Bull. WHO 65 (1987), 189-195). Trotz dieser 25 Jahre dauernden Forschungsarbeiten wurden jedoch keine sicheren, wirksamen Dengue-Impfstoffe für die allgemeine Verwendung gefunden. Impfstoffe mit dem inaktivierten ganzen Denguevirus haben sich als nicht ausreichend immunogen herausgestellt. Lebendvirus-Impfstoffe, die durch eine serielle Passage in Zellkultur abgeschwächt wurden, zeigten bei der Abschwächung eine genetische Instabilität, oder sie wiesen eine schwache Immunogenität auf. Die vorliegende Erfindung stellt insofern einen technischen Durchbruch dar, da sie chimäre Dengue- und Flavivirus-Impfstoffe bereitstellt.
Die vier Serotypen von Dengueviren (Typ 1 bis Typ 4) lassen sich durch die Plaquereduktions-Neutralisierung unter Verwendung von Serotyp-spezifischen monoclonalen Antikörpern und durch weniger spezifische Tests unter Verwendung von polyclonalen Seren unterscheiden (Bankcroft, W. M., et al., Pan Am. Hlth. Org. Sci. Publ. 375 (1979), 175-178; Henchal, E. A., et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 31 (1982), 548-555). Das Vorliegen von Serotypen wurde erstmals während früherer Studien bei freiwilligen Versuchspersonen entdeckt, was zeigte, dass die Infektion mit einem Dengue-Serotyp eine dauerhafte homotypische Immunität induzierte, während eine heterotypische Immunität nur drei bis fünf Monate anhielt (Sabin, A. B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1 (1952), 30-50). Ein wirksamer Dengue-Impfstoff, der alle vier Serotypen enthält, so dass er eine weitreichende Immunität gegen Dengueviren im allgemeinen induziert, würde dazu beitragen, das Auftreten von DHF/DSS zu verhindern.
Die vollständigen Nucleotidsequenzen für die Denguevirus-Typen 3 und 4 und für mehrere Stämme des Typ 2-Virus, die den Maus-neurovirulenten Stamm New Guinea C umfassen, konnten bestimmt werden, wobei jedoch lediglich der 5'-Teil des Typ 1-Virusgenoms sequenziert wurde (Mackow, E., et al., Virology 159 (1987), 217-228; Zhao, B., et al., Virology 155 (1986), 77-88; Osatomi, K., und Sumiyoshi, H., Virology 176 (1990), 643-647; Irie, A., et al., Gene 75 (1989), 197-211; Mason, P. W., et al., Virology 161 (1987), 262-267; Hahn, Y. S., et al., Virology 162 (1988), 167-180). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass bei den vier Denguevirus-Serotypen die Organisation des Genoms übereinstimmt. Man fand heraus, dass das Genom des Dengue-Typ 4-Stamms Karibischer Stamm 814669 10646 Nucleotide enthält (Mackow, E., et al., Virology 159 (1987), 217-228; Zhao, B., et al., Virology 155 (1986), 77-88). Die ersten 101 Nucleotide am 5'-Ende und die letzten 384 Nucleotide am 3'-Ende sind nicht-codierend. Die restliche Sequenz codiert ein aus 3386 Aminosäuren bestehendes Polyprotein, das an seinem N-Terminus die drei Strukturproteine, nämlich Capsid (C), Prämembran (präM) und Hülle (E), enthält, gefolgt von sieben Nicht-Strukturproteinen in der vorstehend angegebenen Reihenfolge, die bei allen bisher identifizierten Flavivirusgenomen übereinstimmt. Das Polyprotein wird durch Zell-Signalpeptidase(n) und virale Proteasen prozessiert, wodurch 11 oder mehr virale Proteine entstehen (Markoff, L., J. Virol. 63 (1989), 3345-3352; Falgout, B., et al., J. Virol. 63 (1989), 1852-1860; Falgout B., et al., J. Virol. 65 (1991), 2467-2476; Hori, H., und Lai, C. J., J. Virol. 64 (1990), 4573-4577).
Zunächst haben wir eine Denguevirus-cDNA der vollen Länge konstruiert, die als Matrize für die Transkription von infektiöser RNA dienen konnte. Wir haben eine stabil clonierte Denguevirus-cDNA der vollen Länge erhalten und gezeigt, dass in vitro-RNA-Transkripte, die von der DNA-Matrize stammten, für Zellen in Kultur infektiös waren. Dieses infektiöse Konstrukt und die daraus hergestellten infektiösen RNA-Transkripte sind allerdings pathogen. Darüber hinaus sind die bisher erzeugten abgeschwächten Dengueviren genetisch instabil und bergen das Potential in sich, mit der Zeit wieder in eine pathogene Form überzugehen. Trotzdem sind abgeschwächte Viren zu bevorzugen, da man im allgemeinen weiß, dass sie eine lang anhaltende Immunität hervorrufen. Deshalb wären Modifikationen an diesem Konstrukt oder an chimären Konstrukten, die dann die Produktion eines weniger pathogenen Virus bewirken, ein deutlicher Fortschritt für die Technologie der abgeschwächten Flaviviren-Impfstoffe. Dementsprechend haben wir eine Reihe von Deletionen in dem nicht-codierenden 3'-Bereich der cDNA konstruiert, wie hier beschrieben, und wir haben lebensfähige Denguevirus-Mutanten gewonnen, um damit die Wachstumseigenschaften untersuchen zu können.
Auch andere Mitglieder der Flavivirus-Familie sind pathogen. Beispiele umfassen das durch Zecken übertragene Encephalitisvirus und das Japanische Encephalitisvirus. Wie die abgeschwächten Denguevirus-Impfstoffe zeigte auch das abgeschwächte zeckenübertragene Encephalitisvirus (TBEV) die Tendenz, genetisch instabil und schwach immunogen zu sein. Aus diesem Grund würden auch Impfstoffe mit anderen abgeschwächten Flaviviren einen deutlichen Fortschritt gegenüber dem gegenwärtigen Stand der Technik darstellen. Aus diesem Grund werden in dieser Erfindung außerdem modifizierte rekombinante cDNA-Konstrukte der vollen Länge von Denguevirus oder eines anderen Flavivirus als Grundgerüst für die Genmanipulation und die Entwicklung eines chimären Virus für die Herstellung von Impfstoffen gegen andere Flaviviren eingesetzt.
Das zeckenübertragene Virus (TBEV) wird ausschließlich durch Zecken übertragen und kann in zwei serologisch unterscheidbare Subtypen eingeteilt werden: in den Östlichen Subtyp (Prototyp-Stamm Sofjin), der in Teilen von Sibirien und im fernöstlichen Russland verbreitet ist, und in den Westlichen Subtyp (Prototyp-Stamm Neudorfl), der in Ost- und Zentraleuropa vorkommt. TBEV löst eine schwere Encephalitis aus, die eine Mortalitätsrate im Bereich von 1 bis 30 % hat. Ein Überblick über TBEV findet sich in Calisher et al. (J. Gen. Virol. 70, 37-43). Zur Zeit ist ein experimenteller TBE-Impfstoff verfügbar, der durch Formalin-Inaktivierung von TBEV hergestellt wurde, jedoch hat dieser Impfstoff mehrere Nachteile. Z.B. ist der Impfstoff nicht ausreichend immunogen, weshalb wiederholte Impfungen erforderlich sind, um eine schützende Immunantwort hervorzurufen. Auch wenn durch den Impfstoff Antikörper-Antworten erhalten werden, versagt der Impfstoff bei 20 % der Bevölkerung, schützende Antworten gegen das Virus bereitzustellen. Aus diesem Grund besteht immer noch ein Bedarf für einen verbesserten TBEV-Impfstoff.
Die vorliegende Erfindung stellt ein rekombinantes DNA-Konstrukt bereit, das stabile, die volle Länge umfassende infektiöse Dengue-Type 4-virale RNA codiert, umfassend mindestens eine Mutation, die i) die Glykosylierung des Prämembranproteins, Hüllproteins oder NS1(1)-Proteins reduziert, ii) die Spaltung des Prämembranproteins zu Membranprotein reduziert, iii) eine Substitution an einer Stelle ist, die Glycin codiert, wobei die Stelle an Position +1 ist, die der Polyprotein-NS1-NS2A-Spaltstelle folgt, oder iv) eine Substitution in einer Sequenz ist, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren an einer C-terminalen Spaltstelle von NS1 codiert, wobei diese Mutation zu einer verminderten Virulenz führt.
Weiter bereitgestellt wird ein chimäres Virus, das ein Genom hat, umfassend eine Region der Nucleinsäure, die operativ die Strukturproteine von einem Dengue-Subtyp und Nichtstrukturproteine von einem anderen Dengue-Subtyp codiert, wobei dieses Genom mindestens eine Mutation umfaßt, die i) die Glykosylierung des Prämembranproteins, Hüllproteins oder NS1(1)-Proteins reduziert, ii) die Spaltung des Prämembranproteins zu Membranprotein reduziert, iii) eine Substitution an einer Stelle ist, die Glycin codiert, wobei die Stelle an Position +1 ist, die der Polyprotein-NS1-NS2A-Spaltstelle folgt, oder iv) eine Substitution in einer Sequenz ist, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren an einer C-terminalen Spaltstelle von NS1 codiert, wobei diese Mutation zu einer verminderten Virulenz führt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Immunisierungsprodukts gegen ein erstes Flavivirus, umfassend: die Herstellung eines DNA-Konstruktes, das operativ Prämembranprotein und Hüllprotein dieses ersten Flavivirus und Capsidprotein und Nichtstrukturprotein eines zweiten Flavivirus codiert; wobei dieses zweite Flavivirus ein Dengue-Virus ist, das ein Genom hat, das mindestens eine Mutation umfaßt, die i) die Glykosylierung des Prämembranproteins, Hüllproteins oder NS1(1)-Proteins reduziert, ii) die Spaltung des Prämembranproteins zu Membranprotein reduziert, iii) eine Substitution an einer Stelle ist, die Glycin codiert, wobei die Stelle an Position +1 ist, die der Polyprotein-NS1-NS2A-Spaltstelle folgt, oder iv) eine Substitution in einer Sequenz ist, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren an einer C-terminalen Spaltstelle von NS1 codiert, wobei diese Mutation zu einer verminderten Virulenz führt; und wobei das erste Flavivirus ein Nicht-Dengue Flavivirus ist;
Herstellen von infektiösen RNA-Transkripten von diesem DNA-Konstrukt;
Einbringen der RNA-Transkripte in eine Zelle;
Exprimieren der RNA-Transkripte in dieser Zelle, um das Virus herzustellen;
Ernten des Virus aus diesen Zellen; und
Testen des Virus in einem nicht-menschlichen Vertebraten, wobei das Immunisierungsprodukt gegen dieses erste Flavivirus hergestellt wird.
In der Beschreibung wird ein rekombinantes DNA-Konstrukt beschrieben, das eine Nucleinsäure enthält, die von mindestens zwei Flaviviren stammt. Das Konstrukt umfasst einen Bereich einer Nucleinsäure, der nicht mehr als zwei Strukturproteine des durch Zecken übertragenen Encephalitisvirus (TBEV) funktionell codiert. Dieser Bereich ist mit einem Bereich einer Nucleinsäure funktionell verbunden, der Strukturproteine eines Flavivirus, das nicht TBEV ist, codiert. Das Konstrukt umfasst einen Bereich einer Nucleinsäure, der das Flavivirus-Capsidprotein funktionell codiert, und der funktionell verbunden ist mit einem Bereich einer Nucleinsäure, der nicht mehr als zwei Strukturproteine des durch Zecken übertragenen Encephalitisvirus funktionell codiert. Die Nucleinsäurebereiche, die ein Capsidprotein und Nicht-Strukturproteine codieren, können von einem Denguevirus, z.B. dem Dengue-Typ 4-Virus, stammen. Das Konstrukt kann mindestens eine Mutation in der Nucleinsäure, die von mindestens zwei Flaviviren stammt, enthalten. In dieser Form wird durch die Mutation die Glykosylierung des NS1(1)-Proteins aufgehoben. In einer anderen Form wird durch die Mutation die Produktion des reifen Flavivirus-Membranproteins verhindert. Die Mutation kann die Wachstumsrate des Virus beeinflussen. In der Beschreibung werden außerdem RNA-Transkripte beschrieben, die diesen rekombinanten DNA-Konstrukten entsprechen.
Desweiteren wird ein chimäres Virus beschrieben, das ein von einem Flavivirus stammendes Genom besitzt. Dieses chimäre Virus kann einen Bereich einer Nucleinsäure umfassen, der nicht mehr als zwei Strukturproteine des durch Zecken übertragenen Encephalitisvirus codiert, und einen Bereich einer Nucleinsäure, der Nicht-Strukturproteine von einem anderen Flavivirus codiert. Das Virus kann einen Bereich einer Nucleinsäure, der ein Capsidprotein des anderen Flavivirus codiert, einschließen. Die Nucleinsäure des durch Zecken übertragenen Encephalitisvirus kann beliebige von mehreren Proteinen codieren, z.B. das Prämembranprotein und/oder das Hüllprotein. Die Nucleinsäure, die Strukturproteine von anderen Flaviviren codiert, kann von einem Denguevirus, z.B. dem Dengue-Typ 4-Virus, sein. Gemäß eines Aspekts kann das chimäre Virus in der Nucleinsäure mindestens eine Mutation enthalten. Für diese Mutation sind mehrere Formen möglich, z.B. eine Mutation, durch die die Glykosylierung des NS1(1)-Proteins aufgehoben wird, oder eine, die die Produktion des reifen Flavivirus-Membranproteins verhindert. Die Mutation beeinflusst vorzugsweise die Wachstumsrate des Virus.
Weiter beschrieben wird ein chimäres Virus bereit, das einen Bereich einer Nucleinsäure, der die Prämembran- und Hüllproteine des durch Zecken übertragenen Encephalitisvirus codiert, einen Bereich einer Nucleinsäure, der das Capsidprotein von einem anderen Flavivirus codiert, und einen Bereich einer Nucleinsäure umfasst, der Nicht-Strukturproteine von dem gleichen Flavivirus codiert. Das Flavivirus kann z.B. ein Denguevirus, wie der Denguevirus-Typ 4, sein. Das chimäre Virus kann mindestens eine Mutation in dem Bereich einer Nucleinsäure, der das Prämembran- und Hüllprotein des durch Zecken übertragenen Encephalitisvirus codiert, umfassen. Die Mutation kann eine Mutation sein, die die Produktion des reifen Flavivirus-Membranproteins verhindert. In einer anderen bevorzugten Form umfasst das chimäre Virus mindestens eine Mutation in den Bereichen einer Nucleinsäure des Flavivirus. Diese Mutation kann eine Mutation sein, wodurch die Glykosylierung des NS1(1)-Proteins aufgehoben wird.
In der Beschreibung wird ein Impfstoff für Menschen gegen die durch Zecken übertragene Encephalitis beschrieben, der ein chimäres Virus der Beschreibung umfasst, das fähig ist, in einem Vertebraten eine schützende Immunantwort hervorzurufen. Somit zeigt die Beschreibung außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs für Menschen gegen ein Flavivirus auf. Dieses Verfahren umfasst das Herstellen eines DNA-Konstrukts, das das Prämembran- und Hüllprotein des Flavivirus und das Capsid- und Nicht-Strukturprotein von einem Denguevirus funktionell codiert, das Erzeugen von infektiösen RNA-Transkripten aus dem DNA-Konstrukt, das Einführen der RNA-Transkripte in eine Zelle, das Exprimieren der RNA-Transkripte in der Zelle, das Ernten des Virus aus den Zellen, das Testen des Virus in einem Vertebraten und das Impfen der Menschen mit dem Virus. Der Herstellungsschritt kann das Einführen von Mutationen in das DNA-Konstrukt umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Beschreibung stellt ein chimäres Virus dar, das einen Bereich einer Nucleinsäure umfasst, der die Prämembran- und Hüllproteine von dem Japanischen Encephalitisvirus codiert, einen Bereich einer Nucleinsäure, der das Capsidprotein von einem anderen Flavivirus codiert, und einen Bereich einer Nucleinsäure, der Nicht-Strukturproteine von dem gleichen Flavivirus codiert, z.B. von einem Denguevirus.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Beschreibung wird ein chimäres Virus beschrieben, das ein RNA-Genom besitzt. Dieses Genom kann einen Bereich einer Nucleinsäure umfassen, der ein Nicht-Strukturprotein von einem Typ 4-Denguevirus funktionell codiert, und einen Bereich einer Nucleinsäure, der ein Strukturprotein eines Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 3-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus oder eines anderen Flavivirus funktionell codiert. Das Genom des chimären Virus kann im wesentlichen frei von Nucleinsäure sein, die ein Strukturprotein von einem Typ 4-Denguevirus funktionell codiert. Das chimäre Virus kann p2A(D1 WP)- oder p2A(D2 NGC)-RNA umfassen. Das chimäre Virus kann einen Bereich einer Nucleinsäure umfassen, der ein Nicht-Strukturprotein von einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus oder Typ 3-Denguevirus funktionell codiert, und außerdem einen Bereich einer Nucleinsäure, der ein Strukturprotein von einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 3-Denguevirus, Typ 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus oder einem anderen Flavivirus funktionell codiert. Die Nucleinsäure, die ein Nicht-Strukturprotein funktionell codiert, kann von einem anderen Virus stammen als der Nucleinsäurebereich, der ein Nicht-Strukturprotein funktionell codiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Beschreibung wird ein chimäres Virus beschrieben, das ein RNA-Genom besitzt. Dieses Genom kann einen Bereich einer Nucleinsäure umfassen, der ein Nicht-Strukturprotein von einem Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus oder einem anderen Flavivirus funktionell codiert, und einen Bereich einer Nucleinsäure, der ein Strukturprotein von einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 3-Denguevirus, Typ 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus oder einem anderen Flavivirus funktionell codiert. Der Nucleinsäurebereich, der ein Strukturprotein funktionell codiert, kann von einem anderen Virus stammen als der Nucleinsäurebereich, der ein Nicht-Strukturprotein funktionell codiert.
In der Beschreibung wird weiter ein Impfstoff beschrieben, der fähig ist, in einem Vertebraten eine schützende Immunantwort gegen ein Virus hervorzurufen. Dieser Impfstoff umfasst eine sichere und immunologisch wirksame Menge eines der beschriebenen Viren und einen pharmazeutisch und immunologisch verträglichen Träger.
Gemäß einem anderen Aspekt wird ein anderer Impfstoff beschrieben, der fähig ist, in einem Vertebraten eine schützende Immunantwort gegen ein Virus hervorzurufen. Gemäß diesem Aspekt umfasst der Impfstoff eine sichere und immunologisch wirksame Menge der folgenden Viren: a) eines chimären Virus, wobei das Genom des Virus einen Nucleinsäurebereich, der ein Nicht-Strukturprotein von einem Typ 4-Denguevirus codiert, und einen Nucleinsäurebereich umfasst, der ein Strukturprotein von einem Typ 1-Denguevirus codiert, b) eines chimären Virus, wobei das Genom des Virus einen Nucleinsäurebereich, der ein Nicht-Strukturprotein von einem Typ 4-Denguevirus codiert, und einen Nucleinsäurebereich umfasst, der ein Strukturprotein von einem Typ 2-Denguevirus codiert, c) eines chimären Virus, wobei das Genom des Virus einen Nucleinsäurebereich, der ein Nicht-Strukturprotein von einem Typ 4-Denguevirus codiert, und einen Nucleinsäurebereich umfasst, der ein Strukturprotein von einem Typ 3-Denguevirus codiert, und d) eines abgeschwächten Typ 4-Denguevirus.
Weiter beschrieben wird ein DNA-Segment, das einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 4-Denguevirus und einen Strukturbereich von einem der folgenden Viren umfasst: von einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 3-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus oder einem anderen Flavivirus. Das DNA-Segment kann einen Promotor enthalten, der mit den Struktur- und Nicht-Strukturbereichen funktionell verbunden ist. Das DNA-Segment kann einen Promotor enthalten, der ein SP6- oder T7-Promotor ist. Das DNA-Segment kann p2A(D1 WP) oder p2A(D2 NGC) sein.
Weitere Aspekte der Beschreibung beschreiben andere chimäre DNA-Segmente. Die DNA-Segmente dieser Aspekte können einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus oder Typ 3-Denguevirus umfassen. Diese DNA-Segmente können ferner einen Strukturbereich von einem der folgenden Viren umfassen: von einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 3-Denguevirus, Typ 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem Flavivirus, mit der Maßgabe, dass der Strukturbereich und der Nicht-Strukturbereich nicht von dem gleichen Virus stammen.
Ein weiterer Aspekt der Beschreibung beschreibt ein DNA-Segment, das einen Nicht-Strukturbereich von einem der folgenden Viren umfasst: von einem Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem anderen Flavivirus, und einen Strukturbereich von einem der folgenden Viren umfasst: von einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem anderen Flavivirus, wobei der Strukturbereich von einem anderen Virus stammt als der Nicht-Strukturbereich.
Die Beschreibung beschreibt ferner ein DNA-Segment, das einen Nicht-Strukturbereich oder einen Teil davon von einem Flavivirus und einen Strukturbereich oder einen Teil davon von einem anderen Flavivirus umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Beschreibung beschreibt einen Impfstoff, der fähig ist, in einem Vertebraten eine schützende Immunantwort gegen ein Virus hervorzurufen. Dieser Impfstoff kann eine sichere und immunologisch wirksame Menge eines chimären Virus umfassen. Das Genom des Virus kann eine Nucleinsäure umfassen, die die Strukturproteine von einem zeckenübertragenen Encephalitisvirus funktionell codiert, und eine Nucleinsäure, die das Nicht-Strukturprotein von einem Denguevirus funktionell codiert.
Außerdem wird ein weiteres chimäres Virus beschrieben. In diesem Aspekt hat das chimäre Virus ein Genom des Virus, das das zeckenübertragene Encephalitis-Strukturprotein und das Nicht-Strukturprotein von einem Dengue-Typ 4-Virus funktionell codiert. Die Strukturproteine des Virus können von einem zeckenübertragenen Encephalitisvirus stammen.
Desweiteren wird ein DNA-Segment beschrieben, das ein zeckenübertragenes Encephalitis-Strukturprotein und ein Nicht-Strukturprotein von einem Typ 4-Denguevirus funktionell codiert.
Desweiteren wird ein isoliertes DNA-Fragment beschrieben, das eine infektiöse Dengue-Typ 4-virale RNA codiert. Auch wird ein rekombinantes DNA-Konstrukt beschrieben, das das in der vorliegenden Beschreibung beschriebene DNA-Fragment und einen Vektor umfasst. Der Vektor kann ein Plasmid sein. Ein weiterer Aspekt beschreibt eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt in einer Art und Weise stabil transformiert ist, die die Expression des DNA-Fragments erlaubt. Die Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle sein.
Ein weiterer beschriebener Aspekt ist ein Verfahren zur Herstellung von Mutanten des Dengue-Typ 4-Virus. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (i) Einführen von Mutationen in das Genom eines Dengue-Typ 4-Virus durch ortsspezifische Mutagenese, (ii) Gewinnen von infektiösen Dengue-Typ 4-Viren, welche die Mutationen enthalten, und (iii) Untersuchen der gewonnen Viren. Gemäß diesem Verfahren können die gewonnen Viren auf den abgeschwächten oder avirulenten Phänotyp untersucht werden.
In der Beschreibung wird außerdem ein Impfstoff für Menschen gegen das Dengue-Typ 4-Virus beschrieben, der ein avirulentes Dengue-Typ 4-Virus in einer Menge umfasst, die ausreicht, um eine Immunisierung gegen die Krankheit zu induzieren, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Das avirulente Dengue-Typ 4-Virus kann erhalten werden, indem Mutationen an strategisch wichtigen Bereichen in das Virusgenom gentechnisch eingeführt werden.
Ein weiterer Aspekt bezieht sich auf ein DNA-Fragment, das eine chimäre Flavivirus-RNA codiert. Die chimäre RNA umfasst z.B. eine RNA, die aus der Gruppe von Dengue-Typ 1, Dengue-Typ 2 und Dengue-Typ 3 ausgewählt ist.
Ein weiterer Aspekt beschreibt ein Verfahren zur Konstruktion von chimären Dengueviren. Dieses Verfahren umfasst das Ersetzen von DNA-Fragmenten der Dengue-Typ 4-Virus-DNA gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durch entsprechende Gene im Block oder eine Fraktion davon von einem Flavivirus. Das Flavivirus kann eines der folgenden Viren sein: Dengue-Typ 1, Dengue-Typ 2 und Dengue-Typ 3. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Dengue-Typ 4-Virus mindestens eine Mutation.
Außerdem wird ein Impfstoff für Menschen gegen das Denguevirus beschrieben, der ein infektiöses chimäres Virus in einer Menge umfassen kann, die ausreicht, um eine Immunisierung gegen die Krankheit zu induzieren, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Das chimäre Virus ist z.B. ein Dengue-Typ 1-, Dengue-Typ 2-, Dengue-Typ 3- oder Dengue-Typ 4-Virus.
Die Erfindung stellt ein DNA-Fragment bereit, das eine Dengue-Typ 4-virale RNA codiert, wobei das DNA-Fragment eine Substitutionsmutation in der Sequenz enthält, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren am C-Terminus von NS1 der Spaltstelle des Nicht-Strukturproteins NS1-NS2A codiert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein DNA-Fragment bereit, das eine Dengue-Typ 4-virale RNA codiert, wobei das DNA-Fragment eine Substitution an der Stelle enthält, die Glycin codiert, wobei die Stelle an der Position +1 liegt, die auf die Spaltstelle des Nicht-Strukturproteins NS1-NS2A folgt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Beschreibung wird ein DNA-Fragment beschrieben, das eine Dengue-Typ 4-virale RNA codiert, wobei das DNA-Fragment eine Deletion im nicht-codierenden 3'-Bereich enthält. Die Deletion kann eine Länge zwischen 30 und 202 Nucleotiden aufweisen.
Ein weiterer Aspekt der Beschreibung beschreibt ein infektiöses RNA-Transkript eines vorliegend beschriebenen DNA-Fragments. Ein weiterer Aspekt der Beschreibung beschreibt eine Wirtszelle, die mit den DNA-Konstrukten in einer Art und Weise transformiert ist, die eine Expression des DNA-Fragments erlaubt. Eine solche Wirtszelle kann eine Säugerzelle oder eine Insektenzelle sein.
In der Beschreibung wird auch ein Impfstoff für Menschen gegen das Dengue-Typ 4-Virus beschrieben, der eine Dengue-Typ 4-Virus-Mutante umfasst, die eine reduzierte Virulenz zeigt, in einer Menge, die ausreicht, um eine Immunisierung gegen die Krankheit zu induzieren. Ein solches mutiertes Dengue-Typ 4-Virus kann erhalten werden, indem eine Deletionsmutation in den nicht-codierenden 3'-Bereich des Virusgenoms gentechnisch eingeführt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das mutierte Dengue-Typ 4-Virus erhalten, indem eine Substitutionsmutation in die virale DNA-Sequenz gentechnisch eingeführt wird, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren am C-Terminus von NS1 der Spaltstelle des Nicht-Strukturproteins NS1-NS2A codiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das mutierte Dengue-Typ 4-Virus erhalten, indem eine Substitution an der viralen DNA-Stelle gentechnisch eingeführt wird, die Glycin codiert, wobei die Stelle an der Position +1 liegt, die auf die Spaltstelle des Nicht-Strukturproteins NS1-NS2A folgt.
In der Beschreibung wird außerdem ein Verfahren zur Konstruktion von chimären Dengueviren beschrieben, umfassend das Ersetzen von DNA- Fragmenten der Dengue-Typ 4-Virus-DNA durch entsprechende Gene im Block oder eine Fraktion davon von einem Flavivirus. Das Flavivirus kann ein Virus sein aus der Gruppe von: Dengue-Typ 1-, Dengue-Typ 2-, Dengue-Typ 3-, Japanischen Encephalitis- und zeckenübertragenen Encephalitisvirus. Das Verfahren zur Konstruktion von chimären Dengueviren kann das Ersetzen von DNA-Fragmenten der beschriebenen Dengue-Typ 4-Virus-DNA durch entsprechende Gene im Block oder eine Fraktion davon von einem Flavivirus umfassen. In dem beschriebenen Verfahren kann das Flavivirus ausgewählt sein aus einer Gruppe, die aus einem Dengue-Typ 1-, Dengue-Typ 2-, Dengue-Typ 3-, Japanischen Encephalitis- und zeckenübertragenen Encephalitisvirus besteht.
Ein weiterer Aspekt beschreibt einen Impfstoff gegen das Denguevirus, der in einer Menge verabreicht werden kann, die ausreicht, um eine Immunisierung gegen die Krankheit zu induzieren. Der Impfstoff kannein chimäres Virus umfassen, das eine reduzierte Virulenz aufweist, wobei das chimäre Virus ein DNA-Fragment enthält, das eine Dengue-Typ 4-virale RNA codiert, die eine Deletion im nicht-codierenden 3'-Bereich enthält. Das chimäre Virus kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem Dengue-Typ 2-, Dengue-Typ 3- und Dengue-Typ 4-Virus besteht.
1. Struktur von Denguevirus-cDNAs der vollen Länge, die für die Herstellung von chimären Dengueviren verwendet wurden.
2. Prozentualer Anteil von Virus-infizierten Zellen und Titer des Virus nach der Transfektion mit RNA-Transkripten.
3. Serotyp-Analyse von chimären Dengueviren.
4. Polyacrylamid-Gel-Analyse von Dengue-Typ 1-, Typ 2- oder Typ 4-viralen Proteinen, hergestellt durch parentale oder chimäre Dengueviren.
5. Morphologie von viralen Plaques auf LLC-MK₂-Zellen.
6. Maus-Neurovirulenz eines parentalen Dengue-Typ 2-NGC oder Dengue-Typ 4-Virus oder Typ 2/Typ 4-chimären Virus.
In 7 sind die terminalen Sequenzen einer clonierten Denguevirus-cDNA der vollen Länge dargestellt, die für die Transkription infektiöser RNA verwendet wurde.
Die Denguevirus-cDNA der vollen Länge mit insgesamt 10646 Nucleotiden wurde neben die Promotorsequenz für die SP6-Polymerase und die einmalige Asp718-Spaltstelle cloniert, wie dargestellt. Dabei ist zu beachten, dass ein zusätzlicher C-Rest an der Position zwischen 10448 und 10449 und ein zusätzlicher G-Rest zwischen 10470 und 10471 vorliegt, die in der ursprünglichen Dengue-Typ 4-Virus-Sequenz fehlten. Außerdem sind die Sequenzen in der Nähe des vorausgesagten 5'-Terminus und 3'-Terminus des RNA-Transkripts dargestellt. Ein die Transkription einleitendes G wurde vor der 3'-Dengue-Sequenz plaziert, die mit fetten Buchstaben dargestellt ist. Die Asp718-Schnittstellen-Sequenz GGTACC wurde unmittelbar hinter der 3'-Dengue-Sequenz positioniert, die durch fette Buchstaben dargestellt ist.
In 8 sind die Clone der Dengue-cDNA der vollen Länge und das Restriktionsendonuclease-Spaltmuster graphisch dargestellt.
Die Abbildung zeigt den Clon der Dengue-cDNA der vollen Länge, enthaltend die SP6-Promotorsequenz am 5'-Ende und eine Asp718-Spaltstelle am 3'-Ende. Die BstB1-Spaltstelle an Nucleotid 5069 trennt das Dengue-Genom in die 5'- und 3'-Fragmente. Durch Ersatz dieser Fragmente in dem Clon 1A der vollen Länge durch die entsprechenden 5'-2-, 3'-B- oder 3'-C-Fragmente wurden andere Kombinationen der vollen Länge erhalten, wie dargestellt.
In 9 ist das Restriktionsendonuclease-Muster des Clons der Dengue-cDNA der vollen Länge dargestellt, der mit BgIII, NsiI und Asp718 gespalten wurde, und die Spaltprodukte wurden durch Auftrennen auf einem Agarosegel analysiert. In M sind λ-HindIII-DNA-Fragmente als Molekülgrössen-Marker in Kilobasenpaaren zu sehen.
In 10 wird gezeigt, dass das aus infektiöser RNA gewonnene Denguevirus die genomische Sequenz der Matrizen-DNA enthält.
Die Denguevirus-Nachkommenschaft wurde aus LLC-MK₂-Zellen gewonnen, die mit RNA transfiziert worden waren, die von Clon 2A-DNA (Wildtyp-Kontrolle) oder von Clon 2A (P)-DNA transkribiert worden war, die eine PstI-Stelle beim Nucleotid 3473 der Dengue-Sequenz enthielt. Die aus dem gewonnenen Virus extrahierte genomische RNA wurde für die reverse Transkription eingesetzt und das cDNA-Produkt als Matrize verwendet, wodurch das 1343 bp-DNA-Fragment (Nucleotide 3193-4536) durch PCR unter Verwendung der geeigneten Primer hergestellt wurde. Die PstI-Spaltung des PCR-Produktes ist dargestellt. In Bahn M ist die 123 DNA-Leiter als Größenmarker zu sehen.
In 11 ist ein Vergleich der Denguevirus-Proteine aus den mit dem gewonnen Virus und mit dem parentalen Virus infizierten Zellen dargestellt. ³⁵S-Methionin-markierte Lysate von LLC-MK₂-Zellen, die mit dem gewonnenen Denguevirus oder dem parentalen Wildtyp infiziert waren, wurden für die Immunfällung mit einer Dengue-spezifischen Hyperimmun-Maus-Aszitesflüssigkeit zubereitet. Die Immunpräzipitate wurden durch Elektrophorese auf einem 12 %-SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Die dargestellten Gel-Bahnen enthalten Lysate aus Zellen, die infiziert waren mit: (1) dem parentalen Denguevirus; (2) dem aus Clon 2A-DNA gewonnenen Denguevirus; (3) dem aus Clon 2A (P)-DNA gewonnenen Denguevirus; Bahn 4 stammt aus einem scheinbar infizierten Zelllysat; und Bahn M enthält Proteingrößenmarker in Kilodalton, die links angegeben sind. Die markierten Banden, die den Denguevirus-Proteinen entsprechen, umfassen präM, E, NS und NS3 und sind angegeben. Die Identitäten anderer markierter Banden wurden nicht zugeordnet.
In 12 ist die Plaque-Morphologie des Wildtyp-Dengue-Typ 4-Virus und seiner hergeleiteten Aminosäure-Substitutionsmutante D4 (G₁₁₂₆ → E) dargestellt. Konfluente Stechmücken-C6/36-Zellen in einem 76 cm²-Kolben wurden mit Denguevirus infiziert, und anschließend wurde eine Agarose-Schicht darüber geschichtet. Sechs Tage nach der Infektion wurden die Zellen mit Neutralrot gefärbt. Am nächsten Tag wurde die Größe der Plaques gemessen. Die durchschnittliche Plaque-Größe des Wildtyp-Dengue-Typ 4-Virus und der Substitutionsmutante wurde aus 10 einzelnen Plaques berechnet. Die gezeigte Virusmutante enthielt Glu (E) anstelle von Gly (G) an der Position 1126 der Dengue-Typ 4-Polypeptidsequenz. Diese Position entspricht der Position +1 an der NS1-NS2A-Schnittstellen-Sequenz.
In 13 sind die Genomstruktur und die Eigenschaften von Dengue-Typ 4-Virus-Mutanten dargestellt, die Deletionen in der nicht-codierenden 3'-Sequenz enthalten.
Die dargestellte lineare Karte zeigt die aus 384 Nucleotiden bestehende nicht-codierende 3'-Sequenz des Dengue-Typ 4-Virus. In diesem Bereich sind mindestens drei Sequenzelemente dargestellt: die konservierte Sequenz 2 (CS-2) am Nt. 234 bis Nt. 211 und am Nt. 143 bis Nt. 120, wie durch die gefüllten Kästchen angegeben, die konservierte Sequenz 1 (CS-1) am Nt. 105 bis Nt. 82, wie durch das leere Kästchen angegeben, und die Stamm-und-Schleifen-Struktur innerhalb der letzten 84 Nucleotide. Sieben cDNA-Clone, die jeweils eine Deletionsmutation mit einer Länge im Bereich von 30 bis 202 Nucleotiden an den angegebenen Positionen enthielten, wurden konstruiert und die hergeleiteten RNA-Transkripte für die Transfektion von permissiven LLC-MK₂-Zellen eingesetzt. Die cDNA der Mutante D4 (Δ3', 172-83), der die gesamte CS-1-Sequenz fehlt, war offensichtlich letal, denn nach wiederholten Versuchen konnte kein lebensfähiges Virus nachgewiesen werden. Lebensfähige Deletionsmutanten wurden aus den restlichen sechs RNA-Transkripten gewonnen. Die Wachstumseigenschaften des Wildtyp-Virus und seiner hergeleiteten Deletionsmutanten wurden durch einen Plaque-Test auf einschichtigen Zellrasen von LLC-MK₂-Zellen verglichen, die sechs Tage nach der Infektion angefärbt wurden. Unter den gleichen Bedingungen zeigte der Wildtyp Plaques mit einer Größe von etwa 0,3 cm. Die Nucleotidpositionen des Dengue-Typ 4-Virus wurden anhand eines reversen Numerierungssystems bezeichnet. Das letzte Nucleotid an Position 10646 wird in diesem Numerierungssystem mit Nt. 1 bezeichnet.
In 14 wird die Plaque-Morphologie des Wildtyp-Dengue-Typ 4-Virus und der hergeleiteten Mutanten erläutert, die Deletionen im nicht-codierenden 3'-Bereich enthalten.
Die Plaque-Tests wurden auf Stechmücken-C6/36-Zellen durchgeführt. Konfluente Stechmücken-C6/36-Zellen in einem 75 cm²-Kolben wurden mit dem Wildtyp-Dengue-Typ 4-Virus oder mit lebensfähigen Deletionsmutanten-Viren mit einer geeigneten Multiplizität infiziert. Wie in den Beispielen beschrieben, wurden die infizierten Zellen sechs Tage nach der Infektion mit Neutralrot gefärbt. Am nächsten Tag wurde die Größe der Plaques gemessen. Die durchschnittliche Plaque-Größe aus 10 einzelnen Plaques wurde für jede Mutante berechnet. A zeigt einen nicht-infizierten einschichtigen Zellrasen (Scheinprobe), Dengue-Typ 4-Virus-Deletionsmutanten (Δ3', 172-113) und (Δ3', 172-143) sowie das parentale Wildtyp-Virus.
In 15 sind das Wildtyp-Virus und mehrere Deletionsmutanten, einschließlich (Δ3', 243-183), (Δ3', 303-183) und (Δ3', 384-183), dargestellt. Das reverse Numerierungssystem wurde verwendet, um die Deletionspositionen der Dengue-Typ 4-Sequenz zu bezeichnen.
In 16 ist eine Tabelle mit NS1-NS2A-Übergängen dargestellt.
In 17 sind die intergenen Übergänge in chimären TBEV/DEN4-Konstrukten dargestellt. Die durch Restriktionsenzym gespaltenen TBEV-cDNA-Fragmente wurden an geeigneten Stellen in die DEN4-cDNA eingefügt, die durch die unterstrichenen Sequenz bezeichnet sind. Die Aminosäuren und die codierenden Nucleotidsequenzen von TBEV sind in fetten Buchstaben dargestellt. Als Numerierungssystem der Nucleotide wurde das von Pletnev et al., Virology 174 (1990), 250-263, beschriebene System verwendet.
18 stellt eine Fotografie einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von viralen Proteinen dar, die durch parentale DEN4- und chimäre TBE(ME)/DEN4-Viren hergestellt wurden. [³⁵S]-Methionin-markierte Lysate von vTBE(ME)/DEN4- oder DEN4-Virus-infizierten oder nicht-infizierten Affenzellen wurden unter Verwendung von TBEV HMAF (1) oder DEN4 HMAF (2) oder Kaninchenserum, spezifisch gegen NS3 (3) oder NS5 (4) oder präM (5) oder E (6) von DEN4, immungefällt und auf einem 12 %-SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert. Die Molekulargewichte von Proteinmarkern sind in Kilodalton angegeben. Die Lage der DEN4-Proteine ist jeweils am rechten Rand angegeben.
In 19 sind Wachstumskurven für vTBE(ME)/DEN4 und DEN4 auf LLC-MK₂- und C6/36-Zellen dargestellt. Die Zellen wurden zur angegebenen Zeit (Tage nach der Infektion) bei einem MOI-Wert von 0,01 PBE/Zelle geerntet, und der Virustiter wurde durch einen Plaque-Test bestimmt.
In 20 ist die Kopie einer Fotografie eines Nitrocellulosefilters dargestellt, das mit Proben einer aus infizierten Gewebekulturzellen isolierten RNA geblottet wurde. Die Filter wurden mit [³²P]-markierter pTBE(ME)/DEN4 nick-translatierter DNA abgesucht.
In 21 ist eine Fotografie einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von Zellysat-Protein aus vTBE(ME)/DEN4- und DEN4-infizierten LLC-MK₂- oder C6/36-Zellen zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion dargestellt.
In 22 sind die Ergebnisse einer Untersuchung dargestellt, wobei die Schutzwirkung und die Neurovirulenz von vTBE(ME)/DEN4 in Mäusen bestimmt wurden.
In 23 ist eine Liste von mehreren beispielhaften Mutationen angegeben, die in das TBE(ME)/DEN4-Konstrukt eingebaut wurden, um die Wirkung der Mutationen auf die Neurovirulenz zu bestimmen.
In 24 sind die Ergebnisse der Neurovirulenz-Untersuchungen zusammengefasst, wobei gewonnene TBE(ME)/DEN4-Chimäre aus Konstrukten verwendet wurden, die die in 23 dargestellten Mutationen enthielten.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Erzeugung von chimären Flaviviren
Das Denguevirus enthält ein etwa 11 Kilobasen großes positiv-Strang-RNA-Genom, das in einem offenen Leseraster für drei Strukturproteine codiert (Capsid (C), Prämembran (präM) und Hülle (E)), auf die die sieben Nicht-Strukturproteine (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) folgen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein chimäres Denguevirus, das Nicht-Strukturproteine von einem Denguevirus-„Typ" oder einem Flavivirus und Strukturproteine von einem anderen Denguevirus-„Typ" oder einem anderen Flavivirus enthält.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein chimäres Virus, umfassend:

1) einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 1-, 2-, 3- oder 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus oder einem Flavivirus und
2) einen Strukturbereich, ausgewählt aus einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 3-Denguevirus, Typ 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem Flavivirus, wobei der Strukturbereich von einem anderen Denguevirus-„Typ" oder Flavivirus stammt als der Nicht-Strukturbereich.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein chimäres Virus, umfassend:

1) einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 4-Denguevirus (DEN4) und
2) einen Strukturbereich, ausgewählt aus einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 3-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem Flavivirus. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Virus im wesentlichen frei von dem Typ 4-Denguevirus-Strukturbereich. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Virus p2A(D1 WP)- oder p2A(D2 NGC)-RNA.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein chimäres Virus, umfassend:

1) einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 1-Denguevirus und
2) einen Strukturbereich, ausgewählt aus einem Typ 2-Denguevirus, Typ 3-Denguevirus, Typ 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem Flavivirus.

1) einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 2-Denguevirus und
2) einen Strukturbereich, ausgewählt aus einem Typ 1-Denguevirus, Typ 3-Denguevirus, Typ 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem Flavivirus.

1) einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 3-Denguevirus und
2) einen Strukturbereich, ausgewählt aus einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem Flavivirus.

1) einen Nicht-Strukturbereich, ausgewählt aus einem Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem Flavivirus, und
2) einen Strukturbereich, ausgewählt aus einem Typ 1-Denguevirus, Typ 2-Denguevirus, Typ 4-Denguevirus, Gelbfiebervirus, Japanischen Encephalitisvirus, zeckenübertragenen Encephalitisvirus und einem Flavivirus, wobei der Strukturbereich von einem anderen Virus stammt als der Nicht-Strukturbereich.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Impfstoff, der mindestens eines der vorstehend beschriebenen chimären Viren und einen pharmazeutisch und immunologisch verträglichen Träger umfasst.
Der Impfstoff enthält ein Virus in einer Menge, die abhängig von der Applikationsroute gewählt wird. Obwohl subkutane Applikationsrouten bevorzugt sind, kann der vorstehend beschriebene Impfstoff auch durch eine intradermale Route appliziert werden. Für den Fachmann ist hieraus ersichtlich, dass die zu verabreichenden Mengen für ein bestimmtes Behandlungsprotokoll einfach bestimmt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Impfstoff, umfassend

1) ein chimäres Virus, das einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 4-Denguevirus und einen Strukturbereich von einem Typ 1-Denguevirus enthält;
2) ein chimäres Virus, das einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 4-Denguevirus und einen Strukturbereich von einem Typ 2-Denguevirus enthält;
3) ein chimäres Virus, das einen Nicht-Strukturbereich von einem Typ 4-Denguevirus und einen Strukturbereich von einem Typ 3-Denguevirus enthält; und
4) ein abgeschwächtes Typ 4-Denguevirus.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das abgeschwächte Virus eine Mutation (Punktmutation, Deletion, Addition oder eine Kombination der vorstehenden Mutationen) in einem Nicht-Strukturprotein-Bereich (z.B. eine veränderte NS1-NS2-Spaltstellen-Sequenz). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das abgeschwächte Virus eine Mutation (Punktmutation, Deletion, Addition oder eine Kombination der vorstehenden Mutationen) im nicht-codierenden 3'-Bereich. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das abgeschwächte Virus eine Mutation (Punktmutation, Deletion, Addition oder eine Kombination der vorstehenden Mutationen) im nicht-codierenden 5'-Bereich. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das abgeschwächte Virus auf natürlichem Weg hergeleitet oder im Labor gentechnisch hergestellt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Segment, das mindestens eines der vorstehend beschriebenen Viren codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das DNA-Segment einen Promotor (vorzugsweise einen eukaryotischen, prokaryotischen oder viralen Promotor; stärker bevorzugt einen SP6- oder T7-Promotor), der mit den Struktur- und Nicht-Strukturbereichen funktionell verbunden ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das DNA-Segment p2A(D1 WP) oder p2A(D2 NGC).
Somit kann ein Fachmann unter Verwendung der in den nachstehenden Beispielen bereitgestellten Verfahren chimäre Denguevirus-Impfstoffe herstellen, die Intertyp-Rekombinanten umfassen, bei denen Strukturbereiche von einem Mitglied der Flavivirus-Familie mit Nicht-Strukturbereichen von einer anderen Flavivirus-Familie kombiniert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden chimäre Dengueviren hergestellt, die die Nicht-Strukturproteine von einem Dengue-Typ 4 (DEN4) und die Strukturproteine von einem Dengue-Typ 1 enthalten. Ein weiterer Überblick dieser Verfahren findet sich in Bray et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), 1042-1046).
Im nachstehenden Beispiel 17 wird die Herstellung eines chimären Virus beschrieben, das die Nicht-Strukturbereiche von einem Dengue-Typ 4-Virus und die Strukturbereiche von einem zeckenübertragenen Encephalitisvirus enthält (TBEV(CME)/DEN4), wobei die Verfahren verwendet werden, die für die Herstellung des chimären Denguevirus in Beispiel 1 beschrieben werden. Das durch diese Verfahren hergestellte Virus replizierte sich in Kultur und wurde für die Infektion von Gewebekulturzellen oder Labortieren eingesetzt.
Mutationen im Dengue-Genom, die die Neurovirulenz beeinflussen
Wir haben außerdem eine Reihe von lebensfähigen Denguevirus-Mutanten gentechnisch hergestellt, die Deletionen in dem nicht-codierenden 3'-Bereich enthalten, die veränderte Wachstumseigenschaften und eine veränderte Plaque-Morphologie in Zellkultur zeigen. Ebenso haben wir eine andere Reihe von wachstumsgehemmten Denguevirus-Mutanten gentechnisch hergestellt, die Aminosäuresubstitutionen in einer neuen Spaltstellen-Sequenz in dem Nicht-Strukturprotein-Bereich des viralen Polyproteins enthalten. Die Denguevirus-Mutanten mit einer reduzierten replikativen Fähigkeit werden in Versuchstieren auf eine reduzierte Virulenz getestet, um ihre Eignung für die Verwendung in einem Lebendvirus-Impfstoff zu bestimmen.
In der vorliegenden Erfindung erfolgte die Konstruktion von wachstumsgehemmten Dengue-Typ 4-Virus-Mutanten, die Deletionen im nicht-codierenden 3'-Bereich enthalten, indem ein Clon mit Dengue-Typ 4-Virus-cDNA der vollen Länge verwendet wurde und hier in den strategisch wichtigen Bereichen Deletionen gentechnisch eingeführt wurden. Die Deletionsmutanten können den Vorteil haben, dass bei ihnen seltener eine Rückmutation des Phänotyps auftritt als bei den Aminosäure-Substitutionsmutanten.
Wie andere stechmückenübertragene Flaviviren hat das Dengue-Typ 4-Virus eine nicht-codierende 3'-Sequenz, die konservierte Regionen enthält, die mit konservierte Sequenz 1 (CS-1) und konservierte Sequenz 2 (CS-2) bezeichnet werden, und eine mögliche terminate Stamm-und-Schleifen-Struktur. Deletionen im Bereich von 3 bis 202 Nucleotiden können an verschiedenen Positionen in die aus 384 Nucleotiden bestehende nicht-codierende 3'-Sequenz der Dengue-Typ 4-cDNA eingeführt werden. RNA-Transkripte, die aus einem cDNA-Clon hergestellt werden, dem der CS-1-Bereich fehlt, bei dem jedoch die Stamm-und-Schleifen-Struktur beibehalten ist, produzieren keine Virus-Nachkommenschaft; dies zeigt, dass die Deletion letal ist. Andererseits können aus den meisten anderen Konstrukten mit Deletionen im nicht-codierenden 3'-Bereich infektiöse Viren gewonnen werden.
Der Plaque-Test dieser Mutanten und des Wildtyp-Virus kann auf Stechmückenzellen (C6/36) durchgeführt werden. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigen, dass die meisten Deletionsmutanten Plaques erzeugen, deren Größe reduziert ist und im Bereich von 1,0 bis 0,3 cm liegt, abhängig von der Lage und dem Ausmaß der Deletion. Diese Form einer veränderten Plaque-Morphologie zeigt, dass diese Deletionsmutanten einen wachstumsgehemmten Phänotyp aufweisen. Diese Gruppe von Denguevirus-Mutanten, die Deletionen im nicht-codierenden 3'-Bereich enthalten, kann in Versuchstieren auf ihre Infektiosität und Immunogenität getestet werden. Mutanten, die eine reduzierte Virulenz für Versuchsprimaten zeigen, können als Kandidaten für Impfstoffviren für den Test am Menschen ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein rekombinantes DNA-Konstrukt, das das DNA-Fragment, welches eine Deletion im nicht-codierenden 3'-Bereich enthält, und einen Vektor umfasst. Die Erfindung betrifft ferner Wirtszellen, die mit dem DNA-Konstrukt transfiziert sind. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Mutanten des Dengue-Typ 4-Virus, umfassend die Schritte des Einführens von Deletionsmutationen in den nicht-codierenden 3'-Bereich des Virusgenoms und des Gewinnens von infektiösen Viren, die die Deletionsmutationen enthalten.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Fragment, das eine Dengue-Typ 4-virale RNA codiert, wobei das Fragment eine Substitution in der Sequenz enthält, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren am C-Terminus von NS1 von der Spaltstelle des Nicht-Strukturproteins NS1-NS2A codiert. Eine Zusammenfassung der Substitutionen ist in 16 angegeben. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein DNA-Fragment, das eine Dengue-Typ 4-virale RNA codiert, wobei das Fragment eine Substitution an der Stelle enthält, die Glycin codiert, d.h. an der Position +1, die auf die Spaltstelle des Nicht-Strukturproteins NS1-NS2A folgt. Die Erfindung betrifft ferner ein infektiöses RNA-Transkript der hier beschriebenen DNA-Fragmente.
Die Konstruktion von wachstumsgehemmten Dengue-Typ 4-Virus-Mutanten, die Mutationen in den Nicht-Strukturproteinen enthalten, kann erfolgen, indem ein Clon mit Dengue-Typ 4-Virus-cDNA der vollen Länge verwendet wird, um solche strategisch wichtigen Mutationen gentechnisch herzustellen. Mutationen, die die funktionelle Aktivität der Nicht-Strukturproteine des Denguevirus beeinflussen, können eine Wachstumshemmung bewirken. Z.B. kann eine Modifikation einer Schnittstellen-Sequenz oder einer viralen Proteaseeinheit zu einer suboptimalen Spaltung des viralen Polyproteins führen und damit das virale Wachstum hemmen.
Wir haben die Polyprotein-NS1-NS2A-Spaltstelle als ein Ziel für die Konstruktion von Denguevirus-Mutanten ausgewählt, die aufgrund einer ineffizienten Spaltung wachstumsgehemmt sind. Wir haben gezeigt, dass für die Spaltung des Dengue-Typ 4-Virus-NS1-NS2A eine 8-Aminosäuren-Domäne am C-Terminus von NS1 erforderlich ist. Wir haben ferner die Wirkung von Substitutionen an jeder dieser Positionen und von Gly an der Position +1, die auf die Spaltstelle folgt, gezeigt.
Verschiedene Aminosäuresubstitutions-Mutationen in dieser Domäne wurden getestet, inwieweit sie eine Wirkung auf die Spaltung zeigten (vgl. 16). Mutationen wurden identifiziert, welche die verschiedensten Effekte auf die Spaltung zeigten, und mehrere solche Mutationen wurden für den Einbau in den Clon mit Dengue-Typ 4-Virus-cDNA der vollen Länge ausgewählt. RNA-Transkripte, die aus dieser Mutanten-cDNA hergeleitet wurden, wurden für die Transfektion von Zellen eingesetzt, die lebensfähige Denguevirus-Mutanten produzierten, welche eine definierte Mutation im NS1-NS2A-Spaltbereich enthielten. Diese Mutanten wurden zuerst durch einen Plaque-Test auf Stechmücken C6/36-Zellen charakterisiert. Mehrere Mutanten erzeugen Plaques mit reduzierter Größe; dies zeigt, dass diese mutierten Viren in der Zellkultur eine Wachstumshemmung aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Konstrukt, umfassend das DNA-Fragment, das eine Substitutionsmutation in der Sequenz enthält, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren am C-Terminus von NS1 der Spaltstelle des Nicht-Strukturproteins NS1-NS2A codiert, und einen Vektor. Die Erfindung betrifft außerdem Wirtszellen, die mit dem DNA-Konstrukt transfiziert sind.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA-Konstrukt, umfassend das DNA-Fragment, das eine Substitution an der Position enthält, die Glycin codiert, d.h. an der Position +1, die auf die Spaltstelle des Nicht-Strukturproteins NS1-NS2A folgt, und einen Vektor. Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die mit dem DNA-Konstrukt transfiziert sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Impfstoff für Menschen gegen Dengue-Typ 4-Virus, umfassend ein mutiertes Dengue-Typ 4-Virus, wie vorstehend beschrieben, das eine reduzierte Virulenz aufweist, in einer Menge, die ausreicht, um eine Immunisierung gegen die Krankheit zu induzieren.
Die Mutanten der Erfindung können in Primaten getestet werden auf: (1) Virulenz, die sich durch die Dauer der Virämie messen lässt, und (2) Immunogenität, die aufgrund der Art und der Stärke der auf die Virusinfektion folgenden Antikörperantwort bestimmt werden kann. Denguevirus-Mutanten, die in Affen eine reduzierte Virulenz zeigen, die jedoch noch eine ausreichende Immunogenität aufweisen, können in klinischen Studien am Menschen getestet werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Konstruktion von Dengue-Typ 4-Viren, die Mutationen in dem nicht-codierenden 3'-Bereich und/oder Nicht-Strukturprotein-Genen vom Dengue-Typ 4-Virus enthalten, die eine befriedigende Abschwächung bewirken, und die Verwendung der jeweiligen Dengue-Typ 4-Virus-Mutanten für die Konstruktion von intertypischen chimären Viren mit der Antigenspezifität von anderen Denguevirus-Serotypen, wodurch abgeschwächte Viren erzeugt werden, die zur Verhinderung einer durch Dengue-Typ 1, Typ 2- oder Typ 3-Virus ausgelösten Krankheit eingesetzt werden könnten. Chimäre Viren können auch mit einer Antigenspezifität für andere Flaviviren hergestellt werden, z.B. dem Japanischen Encephalitis- und zeckenübertragenen Encephalitisvirus.
Bei der herkömmlichen Strategie zur Immunisierung gegen Dengue-Fieber wird die Verwendung eines Impfstoffpräparats bevorzugt, das alle vier Dengue-Serotypen enthält. Hierdurch könnten Individuen in Endemiegebieten vor dem Risiko eines schweren Dengue-Hämorrhagie-Schocksydroms geschützt werden, das durch eine anschließende Infektion mit einem unterschiedlichen Dengue-Serotyp zustande kommt. Zur Zeit werden die als Kandidaten geeigneten abgeschwächten Dengue-Impfstoffe durch eine standardisierte Technik hergestellt, die eine serielle Passage in Zellen eines unnatürlichen Wirts umfasst. Der Erfolg, der mit diesen Wirtsbereichmutanten erhalten wurde, war jedoch begrenzt. Obwohl z.B. ein Dengue-2-Impfstoff als befriedigend abgeschwächt erkannt worden war, löste ein durch dieses Verfahren hergestellter Dengue-3-Impfstoff bei freiwilligen Versuchspersonen das Dengue-Fieber aus.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Konstruktion von lebensfähigen chimären Dengueviren bereit. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereit, der gegen alle vier Dengue-Serotypen wirksam ist, wobei chimäre Viren eingesetzt werden, denen der genetische Hintergrund des Dengue-Typ 4-Virus gemeinsam ist, der die nicht-codierenden 5'- und 3'-Sequenzen des Typ 4-Viruses und außerdem die Sequenz, die alle seine sieben Nicht-Strukturproteine codiert, umfasst.
Für diesen Zweck haben wir einen Dengue-Typ 4-Virus konstruiert, der Deletionen im nicht-codierenden 3'-System oder in einem der Nicht-Strukturprotein-Gene enthält, und wir haben gezeigt, dass diese Denguevirus-Mutanten eine signifikante Einschränkung der replikativen Fähigkeit aufweisen. Demgemäß können Mutationen, die eine befriedigende Abschwächung bewirken, innerhalb dieser allgemeinen Bereiche gentechnisch hergestellt werden; dies führt zu einem Satz von vier clonierten abgeschwächten Dengueviren, die die vier Dengue-Serotypspezifitäten getrennt exprimieren. Diese Viren können das parentale Typ 4-Virus, eine Typ 1 (Strukturprotein-Gen-Bereich)-Typ 4-Chimäre, eine ähnliche Typ 2-Typ 4-Chimäre und eine ähnliche Typ 3-Typ 4-Chimäre, sowie außerdem Chimäre aus dem Japanischen Encephalitis- und zeckenübertragenen Encephalitisvirus umfassen.
Bei Impfstoffen mit inaktivierten ganzen Dengue-Viren wurde gezeigt, dass ihnen eine ausreichende Immunogenität fehlt. Lebendvirus-Impfstoffe, die durch eine serielle Passage in Zellkultur abgeschwächt wurden, zeigten eine nicht ausreichende Abschwächung, eine genetische Instabilität oder eine Über-Abschwächung. Ein Dengue-Typ 2-Impfstoff befindet sich noch in einem frühen Entwicklungsstadium. Lebendimpfstoffe der restlichen drei Serotypen sind nicht verfügbar. Die vorliegende Erfindung stellt mit der Fähigkeit, Dengueviren mit definierten Mutationen im Virusgenom zu konstruieren, einen technischen Durchbruch dar.
Impfstoff mit einem chimären zeckenübertragenen Encephalitisvirus
Ein chimäres zeckenübertragenes Encephalitisvirus wurde hergestellt, indem die drei Strukturprotein-Sequenzen, Capsid, Membran und Hülle, in ein Denguevirus-Konstrukt eingebaut wurden, das Sequenzen enthielt, die Nicht-Strukturprotein des Denguevirus codierten.
Es ist wahrscheinlich, dass für eine Kombination aus Dengue- und zeckenübertragenen Encephalitisvirus (TBEV) das Zusammenspiel von Denguevirus- und TBEV-viralen Protein- und Nucleinsäuresequenzen erforderlich ist. Das Konstrukt erzeugte Viren, die nicht infektiös waren wie das jeweilige native Gegenstück. DEN4 und TBEV haben die gleiche Genomorganisation, und ihnen ist die gleiche Strategie der Genexpression gemeinsam, jedoch zeigt ein Vergleich der Sequenzen zwischen den zwei Viren, dass die Sequenzhomologie relativ gering ist (Pletnev et al., Virology 174 (1990), 250-263, hier durch Bezugnahme eingeschlossen). Z.B. beträgt die Identität der Aminosäuren zwischen den zwei Viren für das Capsidprotein (C) 15,4 %, für das Membranprotein (M) 15,9 %, für das Hüll-Glykoprotein (E) 36,5 % und für das Nicht-Strukturprotein (NS1) 39,1 %. Die folgende Ausführungsform beschreibt einen verbesserten chimären TBEV-Impfstoff.
Wir haben vorher eine clonierte Denguevirus-cDNA der vollen Länge beschrieben, die als Matrize für die in vitro-Transkription von infektiöser RNA eingesetzt werden kann. Dies wurde erreicht, indem stabile Dengue-cDNA-Kopien der vollen Länge unter Verwendung des Vektors pBR322 in einen Stamm von E. coli cloniert wurden. Das Denguevirus wurde aus den mit den in vitro-RNA-Transkripten der cDNA transfizierten permissiven Zellen gewonnen. Die Eigenschaften des Virus, das durch die mit infektiösen RNA-Transkripten der Dengue-cDNA transfizierten Zellen produziert worden war, waren mit den Eigenschaften des Virus identisch, aus dem der cDNA-Clon hergeleitet worden war.
Außerdem haben wir in der vorliegenden Erfindung die Herstellung eines chimären Denguevirus beschrieben, der ein Genom aufweist, das Nicht-Strukturprotein-Gene von einem Denguevirus-Serotyp und Strukturprotein-Gene von einem anderen Denguevirus-Serotyp enthält. Bei einem Beispiel eines chimären Denguevirus wurden die Capsid-, präM (Membran)- und Hüll-Gensequenzen von einem Denguevirus dafür verwendet, um die entsprechenden Gene des Dengue-Typ 4-Virus in einem rekombinanten cDNA-Konstrukt zu ersetzen. Die Viren, die in den mit diesem Konstrukt transfizierten Zellen produziert werden, können für die Herstellung von Impfstoffen gegen Homotyp-Dengueviren eingesetzt werden. Wie oben beschrieben, offenbart die vorliegende Anmeldung außerdem die Konstruktion eines chimären Virus, der Gensequenzen enthält, die einem Nicht-Strukturbereich eines Denguevirus und einem Strukturbereich eines anderen Flavivirus entsprechen. Insbesondere wird ein chimärer zeckenübertragener Encephalitisvirus beschrieben. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die in dem Abschnitt mit dem Titel „Erzeugung von chimären Flaviviren" dargestellt sind, beschreiben die Produktion eines rekombinanten Denguevirus-Konstrukts, in das drei Strukturproteine von TBEV eingebaut sind. Viren, die durch die mit diesem Konstrukt transfizierten Zellen produziert werden, sind als Kandidaten für Lebendvirus-Impfstoffe geeignet.
Die mit dieser Anmeldung zusammenhängende Erfindung stellt eine signifikante und unerwartete Verbesserung für die Herstellung von chimären Flaviviren und außerdem einen zwingenden Beweis für den Nutzen dieser neuen Impfstoffstrategie bereit. Ein Fachmann könnte davon ausgehen, dass eine chimäre Flavivirus-Kombination, in der alle Strukturproteine von einem Virus und die Nicht-Strukturelemente von einem zweiten Virus eingebaut sind, einfach zu gewinnen wäre und sich in gezüchteten Zellen effizient replizieren würde, denn bei Strukturproteinen, die von entfernt verwandten Flaviviren stammen, wäre möglicherweise ein funktionelles Zusammenspiel erforderlich. Jedoch wird durch die vorliegende Erfindung unerwarteterweise ein chimäres TBEV-Virus (TBEV/DEN4) identifiziert, das zwei Strukturproteine (d.h. M und E) aus dem TBEV-Genom enthält, die mit einem dritten Strukturprotein (d.h. C) von einem Denguevirus kombiniert sind.
Herstellung von chimären TBEV/DEN4-Konstrukten
Da die Aminosäuresequenz-Homologie zwischen DEN4 und TBEV niedrig ist, wurden verschiedene chimäre cDNA-Konstrukte aus TBEV und DEN4 hergestellt, indem die entsprechenden DEN4-Sequenzen durch TBEV-Sequenzen ersetzt wurden. Diese Konstrukte wurden durch Techniken erzeugt, die dem Fachmann der Molekularbiologie bekannt sind. Die Konstrukte wurden getestet, wobei bestimmt wurde, ob eine der unterschiedlichen Genkombinationen ein lebensfähiges chimäres Virus ergibt, nachdem das cDNA-Konstrukt in vitro transkribiert und das RNA-Produkt in empfängliche Zellen transfiziert worden war. Vorher wurden schon subgenomische cDNA-Fragmente von TBEV (Stamm Sofjin) cloniert und die Nucleotidsequenzen bestimmt, wobei bekannte Techniken verwendet wurden (vgl. Pletnev et al., Virology, a.a.O., und Pletnev et al., FEBS Lett. 200 (1986), 317-321). Diese Plasmide stellen überlappende Gensequenzen bereit, die zusammen die gesamte TBEV-Genomsequenz umfassen. Unter Verwendung der Plasmide pGEM2-CME oder pGEM2-ENS1 als Matrize und geeigneter Oligonucleotid-Primer (vgl. Beispiel 17) wurden durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) verschiedene TBEV-cDNA-Fragmente hergestellt, wobei jedes Fragment ein oder mehrere spezifische Gene definierte, die durch Restriktionsenzym-Spaltstellen flankiert waren. Die Fragmente sind in 17 dargestellt, wobei die Sequenz der Fragmente, deren Nucleotidpositionen am rechten Rand angegeben sind, in der Veröffentlichung von Pletnev et al., Virology 174 (1990), 250-263, verfügbar ist. 17 zeigt sieben solche TBEV-cDNA-Fragmente und die modifizierten Termini, die für eine Kopplung an die passenden Stellen geeignet sind, die ebenso in die RNA-Transkripte der DEN4-cDNA der vollen Länge durch ortsspezifische Mutagenese eingeführt wurden. Die Plasmide pGEM2-CME, enthaltend die Nucleotide (Nt.) 76 bis 1977, und pGEM2-ENS1, enthaltend die Nucleotide 966-3672 der TBEV-Sequenz, wurden aus den Plasmiden p10, p4, p18, p2, p11 (vgl. Pletnev et al., Virology (1990), a.a.O.) konstruiert, indem die TBEV-Fragmente an gemeinsamen Restriktionsenzym-Stellen ligiert wurden. Die Plasmide DEN4-p5'-2 und p5'-2 (ΔPst I, Xho I) (Bray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1991), a.a.O.) und ein Derivat, p5'-2 (ΔPst I, Xho I, ΔHind III) wurden für die Substitution von einem oder mehreren TBEV-Genen anstelle der entsprechenden DEN4-Gene eingesetzt. Der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie kann anhand der Primersequenzen SEQ ID NO: 21 bis 31, wie in Beispiel 17 dargestellt, die chimären TBEV-Konstrukte herstellen. Die Sequenzen an den Übergängen der chimären Konstrukte wurden durch Nucleinsäure-Sequenzierung bestätigt. Alle resultierenden chimären Plasmide enthielten den SP6-Promotor, der stromaufwärts eines die Transkription initiierenden G-Restes positioniert war, gefolgt von einem A-Rest, der das erste DEN4-Nucleotid darstellt. Vor der in vitro-Transkription wurden die Plasmide an der einzigen Asp718-Spaltstelle, die unmittelbar auf das 3'-Ende der DEN4-Sequenz folgt, linearisiert. Die Konstrukte wurden durch in vitro-Transkription transkribiert, wobei die von Lai et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 5139-5143) beschriebenen Techniken eingesetzt wurden. Die Produkte der Transkription aus den chimären Konstrukten von 17 wurden auf Infektiosität getestet, indem die RNA in LLC-MK₂-Affenzellen transfiziert wurde.
Bei den Transfektionsverfahren wurde entweder Lipofectin^TM (Bethesda Research Laboratories Inc., Gaithersberg, Maryland) oder DOTAP (N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) eingesetzt, um die chimären RNA-Transkripte in permissive Zellen einzuführen. In diesen Verfahren wurden Kulturen von LLC-MK₂-Affenzellen verwendet, es ist jedoch so gemeint, dass auch ein beliebiger anderer permissiver Zelltyp für die TBEV-Replikation eingesetzt werden kann. Die transfizierten Kulturen wurden durch Immunfluoreszenz auf das Vorliegen des Virus über eine bestimmte Zeit getestet, wobei ein TBEV-spezifisches Kaninchenserum oder eine TBEV-spezifische Hyperimmun-Maus-Aszitesflüssigkeit verwendet wurde. Zellen, die mit RNA-Transkripten von pTBE(ME)/DEN4 (umfassend Sequenzen von den Prämembran- und Hüllproteinen von TBEV, gekoppelt an Capsidprotein- und Nicht-Struktursequenzen von DEN4) transfiziert waren, zeigten mit einem TBEV-spezifischen Kaninchenserum, einer TBEV-spezifischen Hyperimmun-Maus-Aszitesflüssigkeit (HMAF) und einer DEN4-spezifischen HMAF eine positive Färbung. Kontrollkulturen, die mit DEN4 alleine infiziert waren, waren für Immunfluoreszenz-markiertes TBEV-spezifisches Serum negativ. Dies zeigte, dass chimäre vTBE(ME)/DEN4 sowohl TBEV- als auch DEN4-spezifische Antigene exprimierten.
Ein chimäres Virus, das aus den Transfektionen vTBEV isoliert wurde, wird mit TBE(CME)/DEN4 (das genomische Konstrukt umfasst die Capsid-, Membran- und Hüllgene von TBEV und Nicht-Struktursequenzen von DEN4) und vTBE(ME)/DEN4 bezeichnet. Wie in Beispiel 17 beschrieben, zeigten 16 Tage nach der Transfektion mit TBE(CME)/DEN4-RNA etwa 1 % der Zellen eine positive Färbung auf TBEV- und DEN4-spezifische Antigene. Der prozentuale Anteil der positiven Zellen nahm mit der Zeit zu und erreichte am Tag 26 nach der Transfektion einen maximalen Titer von 6 × 10⁵ PBE/ml, wobei 80 % der Zellen transfiziert waren. Im Gegensatz dazu erzeugten die mit TBE(ME)/DEN4-RNA transfizierten Zellen das Virus schneller, wobei die Kultur am Tag 16 zu 100 % infiziert war. Im Gegensatz dazu betrug der Titer des in den transfizierten Zellen vorliegenden TBE(ME)/DEN4-Virus (bezeichnet mit vTBE(ME)/DEN4)) am Tag 26 nach der Infektion 4 × 10⁶ PBE/ml. Außerdem wurde die Virus-Nachkommenschaft, die aus den mit den chimären Konstrukten infizierten Zellen produziert worden war, sequenziert, um zu bestätigen, dass die DEN4- und TBEV-Übergänge der genomischen Fragmente aus den chimären Virionen noch mit den Übergängen der chimären Konstrukte, wie in 17 dargestellt, übereinstimmten.
Charakterisierung von TBEV/DEN4-Viren
Das chimäre Virus wurde anhand der in Beispiel 17 dargestellten Verfahren charakterisiert, wobei alle Arbeiten mit den chimären TBEV/DEN4-Viren in einer BL-3-Sicherheitsvorrichtung durchgeführt wurden.
Die durch die chimären Viren erzeugten Proteine wurden mit den Proteinen verglichen, die durch das Dengue-4-Virus hergestellt wurden. Proteine des Dengue-4-Virus, die aus dem DEN4-cDNA-Clon der vollen Länge gewonnen wurden, wurden in dem vorstehenden Abschnitt mit der Überschrift „Erzeugung von chimären Flaviviren" identifiziert, in 4 erläutert und von Bray et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), a.a.O.) beschrieben. Das Muster der Proteintrennung von Denguevirus-Protein wurde mit chimären Virusproteinen verglichen, die aus vTBE(ME)DEN4-infizierten Zellen hergestellt wurden. In diesem Test (vgl. 18 und Beispiel 18) wurden konfluente LLC-MK₂-Zellen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 infiziert. Die infizierten Kulturen wurden mit ³⁵S-Methionin inkubiert, wobei die von Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), a.a.O., beschriebenen Techniken eingesetzt wurden. Die Lysate der infizierten Zellen wurden immungefällt mit: Bahn 1), TBEV-spezifische HMAF; 2) DEN4-spezifische HMAF; 3) Kaninchenserum, das gegen DEN-NS3 gerichtet war; 4) Kaninchen-Antiserum, das für DEN4-NS5 spezifisch war; 5) Kaninchen-Antiserum, das für DEN4-präM spezifisch war, oder 6) Kaninchen-Antiserum, das für DEN4-E-Protein spezifisch war. Die Immunpräzipitate wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) unter denaturierenden Bedingungen analysiert, wie in 18 dargestellt, wobei die von Laemmli (Nature 227 (1970), 680-685) beschriebenen Techniken verwendet wurden. Sowohl chimäre als auch parentale DEN4-Viren erzeugten Proteinbanden, die als DEN4-NS3 und -NS5 identifiziert wurden (Bahnen 3 und 4). Die DEN4-präM- oder -E-Proteine wurden in den mit dem chimären Virus infizierten Zellen nicht identifiziert, sie wurden jedoch in den DEN4-infizierten Zellen identifiziert (vgl. Bahnen 5 und 6). DEN4-spezifische HMAF fällte nur Proteinbanden in Lysaten von vTBE(ME)/DEN4-infizierten Zellen, die gemeinsam mit den Nicht-Strukturproteinen DEN4-NS1 und -NS3 liefen (Bahn 2). TBEV-HMAF immun-fällte aus dem Lysat von Zellen, die mit dem chimären vTBE(ME)/DEN4 infiziert waren, ein Protein, das die korrekte Größe für das TBEV-E-Protein aufwies (55 kDa). Das Protein aus den mit dem chimären Virus infizierten Zellen lief schneller als DEN4-E (Bahnen 1 und 6). In früheren Experimenten bewirkte TBEV-HMAF keine Fällung von nativen TBEV-präM- und C-Proteinen aus TBEV-infizierten Zellen. Deshalb war die Identifizierung von TBEV-präM- und -C-Proteinen nicht zu erwarten. Das Profil der in LLC-MK₂-Zellen durch vTBE(CME)/DEN4 produzierten Proteinbanden war identisch mit dem, das durch vTBE(ME)/DEN4 produziert wurde. Somit erzeugten die chimären Viren in LLC-MK₂-Zellen die erwarteten Proteine.
Die Plaque-Morphologie der Viren wurde festgestellt, indem die durch DEN4 erzeugten viralen Plaques mit den Plaques verglichen wurden, die durch die chimären Konstrukte hergestellt wurden. Die DEN4-Virus-Plaques wiesen auf Stechmücken-C6/36-Zellen eine durchschnittliche Größe von 12,1 mm auf, wohingegen die durch vTBE(ME)/DEN4 erzeugten Plaques im Durchschnitt eine Größe von 6,5 mm zeigten. Im Gegensatz dazu erzeugte vTBE(ME)/DEN4 auf LLC-MK₂-Affenzellen Plaques, die fünfmal größer waren als die durch DEN4 hergestellten Plaques. Dies legte nahe, dass das chimäre Virus sich in LLC-MK₂-Zellen effizienter replizierte als DEN4. Diese unerwarteten Ergebnisse wurden durch die Analyse der Wachstumsrate und der Virusausbeute von vTBE(ME)/DEN4 in infizierten LLC-MK₂-Zellen bestätigt (vgl. 19).
Das chimäre Virus erreichte einen Titer von 10⁸ PBE/ml; dieser Titer ist etwa 1000-mal höher als der Titer, der unter den gleichen Bedingungen durch das parentale DEN4 erreicht wird. Das chimäre vTBE(ME)/DEN4-Virus wuchs auf Stechmücken-C6/36-Zellen langsam und erreichte einen Titer, der 100-mal niedriger war als der durch das parentale DEN4 erhaltene Titer. Die Plaque-Größe des chimären vTBE(CME)/DEN4 unterschied sich auf LLC-MK₂-Zellen nicht nennenswert von der des DEN4. Bei diesen Untersuchungen wurde das Virus durch den Plaque-Test quantitativ bestimmt, wobei die von Bancroft et al. (Pan Am. Health Org. Sci. Publ. 375 (1979), 175-178) beschriebenen Verfahren eingesetzt wurden. Der Unterschied in der Plaque-Größe könnte eine Unverträglichkeit des TBEV-C-Proteins mit der DEN4-Virus-RNA widerspiegeln, die eine effiziente Wechselwirkung der Proteine während der Verpackung der Virus-RNA und der Virus-Reifung verhindert. Außerdem könnte der Unterschied in der Plaque-Größe das Ergebnis einer Substitution der sechs Nucleotide stromaufwärts des Codons AUG in dem nicht-codierenden 5'-Bereich von DEN4 sein. Diese Sequenzänderung könnte die Effizienz der viralen Proteintranslation beeinflussen.
Die Analyse der Virus-RNA-Produktion (20) aus den chimären Konstrukten bietet zusammen mit den Proteinergebnissen von 21 eine Erklärung für den Phänotyp mit einer kleinen Plaque-Größe und die verminderte Wachstumsrate von vTBE(ME)/DEN4 in infizierten C6/36-Zellen. Kulturen von LLC-MK₂- oder C6/36-Zellen (etwa 10⁶ Zellen) wurden zu verschiedenen Zeiten nach der Adsorption des Virus gewonnen und in einem Natriumdodecylsulfat (SDS) enthaltenden Puffer lysiert. Die gesamte RNA wurde aus dem Zell-Lysat und dem Medium durch Phenolextraktion isoliert, wobei die Verfahren von Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) eingesetzt wurden. Die RNA-Proben wurden in Formaldehyd denaturiert und auf ein Nitrocellulosefilter (BA85, Schleicher und Schuell) aufgetragen. Die Filter wurden mit einer nick-translatierten [³²P]-markierten pTBE(ME)/DEN4-DNA-Sonde hybridisiert. Die in vitro aus pTBE(ME)/DEN4 hergestellten RNA-Transkripte wurden als positive Kontrolle eingesetzt.
Virusproteine aus DEN4-infizierten LLC-MK₂- oder C6/36-Zellen wurden mit Virusproteinen aus vTBE(ME)/DEN4-infizierten LLC-MK₂- oder C6/36-Zellen verglichen. DEN4-Virusproteine, einschließlich E, NS1 und NS3, akkumulierten in DEN4-infizierten LLC-MK₂- oder C6/36-Zellen 48 Stunden nach der Infektion auf einem hohen Niveau (21). Jedoch unterschieden sich die Kinetiken der Virusprotein-Synthese von vTBE(ME)/DEN4-infizierten LLC-MK₂-Zellen und C6/36-Zellen voneinander. Virusproteine wurden in den LLC-MK₂-Zellen bereits acht Stunden nach der Infektion nachgewiesen, während sie in den C6/36-Zellen bis 48 Stunden nach der Infektion nicht nachgewiesen werden konnten. Etwa 70 % der vTBE(ME)/DEN4-Virionen verblieben nach dem Beimpfen der C6/36-Zellen im Medium, wohingegen bei den LLC-MK₂-Zellkulturen nur eine kleine Fraktion des eingeimpften Virus im Medium gefunden wurde. Dieses Ergebnis legt nahe, dass das chimäre vTBE(ME)/DEN4 in die LLC-MK₂-Zellen effizienter eindringen konnte als in die C6/36-Zellen und dass die Folge davon möglicherweise darin bestand, dass das Virus in diesen Zellen im Vergleich zu dem DEN4-Virus langsamer und bis zu einem niedrigeren Titer wuchs. Nach dem Eindringen in die LLC-MK₂-Zellen erfolgte die Replikation der chimären Virus-RNA schneller als die der DEN4-Virus-RNA. Andererseits lief die RNA-Synthese des chimären Virus in infizierten C6/36-Zellen langsamer ab als die von DEN4. Somit zeigte vTBE(ME)/DEN4 beim Eindringen in Stechmückenzellen eine verminderte Effizienz; dies ging mit einer verminderten Produktion von Virus-RNA und Virus-Proteinen einher. Diese Beobachtungen stimmen mit der geringen Effizienz der Transfektion von TBEV-Virus-RNA in C6/36-Zellen überein (Mandl et al., J. Virol. 65 (1991), 4070-4077).
Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Verfahren bekannt, die verwendet werden können, um die Nucleinsäuresequenzen aus einem Virus in die Nucleinsäuresequenzen eines anderen Virus einzubauen. Solche Ligierungsschemata und Clonierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Daher können auch andere Verfahren in Betracht gezogen werden, deren Verwendung die beanspruchte Erfindung jedoch nicht beeinträchtigen würde.
Wirksamkeit des chimären Impfstoffs und Bestimmung der Neurovirulenz
vTBE(ME)/DEN4 wurde auf die Schutzwirkung als Impfstoff untersucht, indem das Viruspräparat über verschiedene Applikationswege in Versuchstiere eingebracht wurde. Die Neurovirulenz von vTBE(ME)/DEN4 im Vergleich zum parentalen Denguevirus wurde analysiert, indem Mäuse intracerebral (ic) geimpft wurden. Andere Applikationswege umfassten intradermale (id) oder intraperitoneale (ip) Injektionen. In einem Experiment erhielten drei Tage alte gesäugte BALB/c-Mäuse ic-Injektionen mit einer Dosis von 10² PBE Virus in 0,02 ml MEM/0,25 % menschlichem Serumalbumin, und in einer anderen Versuchsreihe wurden sechs Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse ic, id oder ip geimpft. Die Mäuse wurden 21 Tage beobachtet, ob Symptome einer Encephalitis auftraten oder ob sie verendeten, und von den überlebenden erwachsenen Mäusen wurde 20 Tage nach der Infektion Blut abgenommen, um die Antikörperantwort auf TBEV zu bestimmen. Die überlebenden Mäuse wurden am Tag 21 nach der Infektion mit 10³ LD₅₀ TBEV (Stamm Sofjin) in einer BL-4-Sicherheitsvorrichtung belastungsinfiziert ("challenged"), wodurch die Schutzwirkung des Impfstoffs bestimmt wurde.
vTBE(ME)/DEN4 wies noch die Neurovirulenz seines TBEV-Vorläufers auf, wenn es direkt in das Gehirn (ic) von gesäugten oder erwachsenen Mäusen geimpft wurde (22 und Beispiel 21). Als positive Kontrolle wurden Vergleiche mit einem repräsentativen Stamm von TBEV (Stamm Sofjin) angestellt. TBEV ist stark neurovirulent, und 0,1 PBE lösten in 50 % der gesäugten Mäuse, die ic infiziert wurden, rasch eine letale Encephalitis aus. Ebenso war TBEV für erwachsene, ip-infizierte Mäuse stark neurovirulent. In diesem Fall betrug der ID₅₀-Wert 14,2 PBE. Im Gegensatz dazu löste vTBE(ME)/DEN4 keine Encephalitis aus, wenn es über eine periphere Route, entweder id oder ip, geimpft wurde (vgl. 22); hieraus wird deutlich, dass dies sichere, bzw. möglicherweise sichere Routen für die Impfung waren.
Die Immunogenität von vTBE(ME)/DEN4 wurde durch Immunfällung von Antikörpern gegen das Virus getestet, wobei [³⁵S]-markierte Antigene und Serumantikörper von überlebenden Mäusen verwendet wurden. Die Analyse der Immunpräzipitate durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte, dass Antikörper, die für DEN4-NS1 (ein durch das chimäre Virus codiertes Protein) spezifisch waren, schnell nachgewiesen werden konnten, dass jedoch Antikörper gegen TBEV-E entweder mit einem niedrigen Titer vorlagen oder nicht nachweisbar waren. Da Mäuse kein natürlicher Wirt von TBEV sind, erlaubte eine periphere Impfung der Mäuse vermutlich lediglich eine schwache Virusreplikation.
Mäuse, die eine ip- oder id-Impfung von vTBE(ME)/DEN4 überlebten, wurden daraufhin untersucht, ob sie eine Resistenz gegen eine anschließende letale TBEV-Belastungsinfektion aufwiesen. 21 Tage nach der Impfung mit dem vTBE(ME)/DEN4- oder dem DEN4-Virus wurden die Mäuse mit 10³ LD₅₀ des stark neurovirulenten Stamms Sofjin von TBEV ip belastungsinfiziert. Die Mäuse, die eine ip- oder id-Impfung mit dem chimären vTBE(ME)/DEN4 überlebt hatten, waren gegen die anschließende Belastungsinfektion geschützt, wohingegen alle drei Gruppen von Mäusen, die vorher mit DEN4 immunisiert worden waren, zwischen Tag 11 und Tag 20 verendeten (vgl. 22). Diese Ergebnisse zeigten, dass das Virus als Impfstoff gegen eine TBEV-Infektion Schutz bietet und hierfür spezifisch ist. Die nicht-immunisierten Kontrollmäuse verendeten an Encephalitis zwischen Tag 10 und Tag 16 nach der TBEV-Infektion. Das TBE(ME)/DEN4-Virus löste sowohl in gesäugten als auch in erwachsenen Mäusen gleichermaßen nach der intracerebralen Impfung eine Encephalitis aus, wohingegen bei den mit DEN4-geimpften Mäusen mit geringer Häufigkeit eine Denguevirus-assoziierte Erkrankung entstand. Somit bleibt bei dem chimären Virus die Maus-Neurovirulenz von TBEV erhalten, aus dem seine prä M- und E-Gene hergeleitet wurden. Dies zeigt, dass die meisten, wenn nicht alle, der genetischen Determinanten der Maus-Neurovirulenz von TBEV innerhalb dieser zwei Strukturprotein-Gene liegen. Jedoch war vTBE(ME)/DEN4, anders als das parentale TBEV, nicht pathogen, wenn erwachsene Mäuse peripher geimpft wurden; dies zeigt, dass bei einer peripheren Impfung die Fähigkeit zur Neuroinvasion verlorenging. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein Bereich des TBEV-Genoms, der von den präM- und E-Genen verschieden ist, dafür verantwortlich ist, dass TBEV ins ZNS eindringen und eine Encephalitis auslösen kann. Mäuse, die peripher mit vTBE(ME)/DEN4 geimpft wurden, waren gegen eine anschließende intraperitoneale Belastungsinfektion mit einer letalen Dosis von TBEV geschützt, wohingegen Mäuse, die ebenso mit DEN4 geimpft wurden, dies nicht waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die präM-(Vorläufer von M), M- und/oder E-Proteine von vTBE(ME)/DEN4 wesentliche Antigendeterminanten für eine schützende Immunität gegen die TBEV-Encephalitis in Mäusen enthalten.
Modifikation der Neurovirulenz des chimären vTBE(ME)/DEN4
Wie in dem vorstehenden Abschnitt mit dem Titel „Mutationen im Dengue-Genom, die die Neurovirulenz beeinflussen" beschrieben, wurde das rekombinante Denguevirus-Konstrukt durch ortsspezifische Mutagenese oder Mutagenese durch PCR oder dergleichen modifiziert, so dass ein modifiziertes Virus hergestellt wurde, das aufgrund seiner verminderten Neurovirulenz für die Impfung geeignet war. Das vTBEV/DEN4-Genom kann durch ähnliche Techniken wie den hier beschriebenen modifiziert werden, um eine verminderte Neurovirulenz zu erhalten, und auf diese Weise die Sicherheit eines abgeschwächten Virusimpfstoffs für TBEV zu erhöhen.
Der Erfolg bei der Konstruktion einer lebensfähigen TBEV/DEN4-Chimären, bei der die schützenden Antigene von TBEV erhalten bleiben, der jedoch die periphere Invasivität von TBEV fehlt, stellt die Grundlage für eine neue Strategie der Immunprophylaxe dieses wichtigen Pathogens bereit, nämlich die Entwicklung eines abgeschwächten TBEV-Impfstoffs. Bevor jedoch dieses Ziel verwirklicht werden kann, muß noch eine weitere Modifikation der Chimäre erreicht werden, nämlich die Aufhebung der Neurovirulenz für das ZNS, die durch direktes Impfen des Virus in das Gehirn gemessen werden kann. Da die TBEV/DEN4-Chimäre noch die Neurovirulenz ihres TBEV-Vorläufers besitzt, war es erforderlich, diese Eigenschaft durch die gentechnische Einbringung von strategisch wichtigen Mutationen im DEN4- oder TBEV-Teil des chimären Genoms zu entfernen und ihre Wirkung auf die Maus-Neurovirulenz zu testen. Diese Mutanten können möglicherweise Mutationen enthalten, die an einer beliebigen Zahl von Stellen in das Virusgenom eingeführt wurden. Durch einleitende Untersuchungen wurden chimäre Viren mit den folgenden Mutationen erhalten, (1) Deletionen im nicht-codierenden 5'-Bereich, (2) Mutationen, wodurch die präM-zu-M-Spaltstelle oder die Glykosylierungsstellen des präM- oder E- oder NS1-Proteins entfernt werden, oder (3) Punktmutationen im E-Gen. Die bisher getesteten Mutationen sind in 23 dargestellt.
Als Teil einer Untersuchung zur systematischen Modifikation des TBE(ME)/DEN4-Konstrukts und zum Testen der Wirkung der genetischen Veränderungen auf die Neurovirulenz wurden sechs unterschiedliche Konstrukte hergestellt, die eine oder mehrere Veränderungen in der Proteinsequenz enthielten, vgl. Beispiel 22. Selbstverständlich kann ein Fachmann unter Verwendung der in dieser Erfindung bereitgestellten Techniken eine beliebige Anzahl von Substitutionen, Additionen oder Deletionen am TBE(ME)/DEN4-Konstrukt herstellen und auf Veränderungen in der Neurovirulenz testen. Ebenso kann ein Fachmann einfach die in 23 dargestellten Mutationen mit diesen oder anderen Mutationen kombinieren, um das chimäre Konstrukt zu testen, das im Vergleich zu dem chimären Konstrukt, das native Sequenzen kombiniert, vorzugsweise mindestens eine Änderung in der genetischen Zusammensetzung aufweist.
In den Untersuchungen, bei denen die Fähigkeit der mutierten Konstrukte festgestellt wurde, die Produktion des mutierten chimären Virus zu steuern, wurden aus den transfizierten LLC-MK₂-Zellen sechs mutierte Chimären gewonnen, und die Viren wurden auf Änderungen in der Plaque-Morphologie untersucht. Die Nachkommenschaft der mutierten TBE(ME)/DEN4-Viren wurde durch Passage in LLC-MK₂-Zellen amplifiziert und durch Plaque-Test auf LLC-MK₂-Zellen oder auf Stechmücken-C6/36-Zellen analysiert. Ebenso wurde die Chimäre TBE(CME)/DEN4 analysiert, die alle drei Strukturprotein-Gene von TBEV umfasste. Der Wildtyp DEN4 wurde als Kontrolle eingesetzt. Wie in 24 dargestellt war die Plaque-Größe der meisten Mutanten auf beiden Zellinien im Vergleich zu den Virusplaques des parentalen TBE(ME)/DEN4 reduziert; dies legt nahe, dass bei diesen Mutanten die Virusreplikation gehemmt war. Mutanten, die eine defekte Glykosylierungsstelle in E oder NS1 enthielten, erzeugten unter den getesteten Mutanten die kleinsten Plaques.
Die mutierten chimären Konstrukte wurden außerdem auf Neurovirulenz in Mäusen getestet. Die Mäuse wurden mit dem Virus infiziert, wie in Beispiel 21 und in Beispiel 23 beschrieben. Die infizierten Mäuse wurden 31 Tage beobachtet, ob bei ihnen Zeichen einer Encephalitis auftraten oder ob sie verendeten. Konstrukte, die *NS1(1)-Glc^–- und *präM/M^–-Mutationen enthielten, zeigten einen LD₅₀-Wert, der größer als 100 PBE war; dies macht deutlich, dass bei diesen Mutanten die Maus-Neurovirulenz um mehr als 100-fach reduziert ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass die NS1(1)-Glc^–-, die präM/M^–-Mutation oder beide Mutationen eingesetzt werden können, um eine Abschwächung der Maus-Neurovirulenz zu bewirken. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ähnliche Mutationen auch verwendet werden können, um die Abschwächung anderer Encephalitis-Flaviviren, einschließlich des Japanischen Encephalitis-Virus, zu bewirken.
Ferner wird ins Auge gefasst, dass die chimären Konstrukte, die eine Verminderung der Neurovirulenz in Mäusen zeigen, die durch erhöhte LD₅₀-Werte deutlich wird, als nächstes in Primaten getestet werden. In Beispiel 24 wird ein Schema bereitgestellt, mit dem die Wirksamkeit eines Impfstoffs in Primaten getestet werden kann. Nach erfolgreichen Studien an Primaten werden die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung dann in klinischen Studien an Menschen getestet. Der Fachmann kann die Primatenstudien so modifizieren, dass sie für die Tests am Menschen geeignet sind.
Aus diesem Grund stellen die Erfindungen dieser Anmeldung eine Reihe von Impfstoffen bereit und geben dem Fachmann die Anleitung zum Herstellen von chimären Denguevirus-Impfstoffen, mit denen schützende Immunantworten gegen die Serotypen des Denguevirus oder gegen andere Flaviviren erzeugt werden können. Ein solches Impfstoffpräparat kann vorzugsweise einen Pool von chimären Viren enthalten, die jeweils ein Strukturprotein für mindestens ein Denguevirus exprimieren. Unter Verwendung der hier beschriebenen Techniken kann ein Fachmann der Virologie und Molekularbiologie chimäre Viren herstellen, die Strukturbereiche eines Flavivirus und Nicht-Strukturbereiche eines zweiten Virus enthalten. Vorzugsweise ist dieses zweite Virus ein Denguevirus, und stärker bevorzugt ist dieses zweite Virus ein Dengue-Typ 4-Virus. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung die Anleitung für einen Fachmann bereit, das Denguevirus-Konstrukt durch ortsspezifische Mutagenese oder dergleichen zu modifizieren, um einen verbesserten Denguevirus-Impfstoff herzustellen, und es wird angenommen, dass diese Modifikationen ebenso in das chimäre Viruskonstrukt eingebaut werden können. Die Erfindung beschreibt ferner die Herstellung und das Testen von chimären Viren, die Nicht-Strukturbereiche und mindestens einen Strukturbereich eines Denguevirus in Kombination mit Strukturbereichen von einem anderen Flavivirus umfassen. Insbesondere wird ein Impfstoff für TBEV beschrieben, der ein chimäres Virus darstellt, das einen Strukturbereich in Kombination mit Nicht-Strukturbereichen von einem Dengue-4-Virus und Sequenzen, die zwei Strukturproteine codieren, von TBEV enthält.
Die bisher an der TBEV(ME)/DEN4-Chimären beobachteten ermutigenden Ergebnisse legen nahe, dass diese Techniken auch eingesetzt werden können, um einen Impfstoff gegen Viren herzustellen, die mit dem Denguevirus näher verwandt sind als TBEV. Ein solches Beispiel ist das Japanische Encephalitis-Virus, das immer noch ein großes Gesundheitsproblem für die Bevölkerung in Fernost darstellt. Somit werden die Techniken der vorliegenden Erfindung in einer weiteren Ausführungsform dafür eingesetzt, die Nicht-Strukturbereiche der DEN4-cDNA mit mindestens einem Strukturgen des Japanischen Encephalitis-Virus und den restlichen Strukturgenbereichen von DEN4 zu kombinieren.
Ferner wird in Betracht gezogen, dass andere Kombinationen von Nicht-Strukturbereichen und Strukturbereichen von verschiedenen Flaviviren ebenso unter Einsatz der erfindungsgemäßen Techniken hergestellt und getestet werden könnten. Z.B. könnte ein rekombinantes Konstrukt des Japanischen Encephalitis-Virus modifiziert werden, wobei ein Strukturbereich oder mehrere Strukturbereiche durch entsprechende Gensequenzen des zeckenübertragenen Encephalitis-Virus ersetzt wird/werden, während die viralen Nicht-Strukturbereiche bestehen bleiben. Ebenso könnte man eine rekombinante cDNA erzeugen, die das zeckenübertragene Encephalitis-Virus codiert, und die Strukturbereiche durch mindestens ein Gen ersetzen, das ein Strukturprotein des Denguevirus codiert.
Alle hier und in den nachstehenden Beispielen zitierten Veröffentlichungen sind durch Bezugnahme eingeschlossen. Besondere Ausführungsformen der Erfindung werden ausführlich erläutert, und außerdem wird Bezug genommen auf mögliche Variationen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Es gibt eine Vielzahl von verschiedenen Techniken und Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind und mit deren Hilfe die geplante Erfindung erfolgreich durchgeführt werden kann.
Beispiele und damit zusammenhängende allgemeine Angaben
Viren:
Das Dengue-Typ 4-Virus, Stamm 814669, wurde für die Konstruktion der cDNA der vollen Länge eingesetzt, die als Quelle der infektiösen RNA-Transkripte der vollen Länge diente (Mackow, E., et al., Virology 159 (1987), 217-228; Zhao, B., et al., Virology 155 (1986), 77-88). Ein Präparat des Dengue-Typ 1-Virus, Western Pacific Stamm (D1 WP), fötale Rhesuslungenzellen-Passagestufe 9, wurde freundlicherweise von Dr. K. Eckels (WRAIR, Washington DC) zur Verfügung gestellt (McKee, K. T., et al., Am J. Trop. Med. Hyg. 36 (1987), 435-442). Ein Mausgehirn-Präparat des Maus-neurovirulenten Dengue-Typ 2-Virus, New Guinea C Stamm (D2 NGC), Mausgehirn-Passagestufe 38, wurde freundlicherweise von Dr. D. Dubois (WRAIR, Washington DC) zur Verfügung gestellt (Sabin, A. B., Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1 (1952), 30-50). Die Dengue-1- und Dengue-2-Viren wurden durch eine Passage in C6/36-Stechmückenzellen amplifiziert. Jedes dieser drei Viren wurde sodann einmal in LLC-MK₂-Affennierenzellen einer Passage unterworfen und die resultierende Virussuspension für die Untersuchung von Plaque-Morphologie und Maus-Neurovirulenz eingesetzt.
Clonierungsvektoren:
Das Plasmid p5'-2, das die 5'-Hälfte der Dengue-4-Genom-cDNA enthält, wurde modifiziert, um den Austausch der drei Strukturprotein-Gene zu erleichtern (Lai, C. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 5139-5143). Zuerst wurde eine einmalige Xho I-Stelle durch ortsspezifische Mutagenese am Nucleotid 2342 (A-G) der Dengue-4-Sequenz in der Nähe des 3'-Endes von E eingeführt, wodurch p5'-2 (Xho I) hergestellt wurde. Diese Nucleotidänderung bewirkte keine Veränderung der Aminosäuresequenz. Sodann wurde dieser Vektor an der einmaligen Bst BI-Stelle innerhalb der Dengue-Sequenz und an der einmaligen Asp 718-Stelle, die in p5'-2 unmittelbar auf die Dengue-Sequenz folgt, gespalten und das Fragment mit der 3'-Hälfte des Dengue-4-Genoms verknüpft, wodurch p2A (Xho I) der vollen Länge erzeugt wurde. Als zweites wurde die Bgl II-Stelle am Nucleotid 88, die bei den Flaviviren konserviert ist, zur einmaligen Stelle gemacht, indem drei andere Bgl II-Stellen in p5'-2 entfernt wurden. Die Bal II-Stelle am Übergang von pBR322 und dem SP6-Promotor wurde entfernt, indem ein Not I-Linker eingefügt wurde. Zwei andere Stellen an den Positionen 4128 und 4277 wurden entfernt, indem der Vektor bis zu der kürzlich eingeführten Pst I-Stelle an Postition 3473 (McKee, K. T., et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 36 (1987), 435-442) gekürzt wurde. Das Plasmid p5'-2 (Xho I, Pst I) wurde anschließend für den Fragment-Austausch eingesetzt, wodurch eine chimäre cDNA hergestellt wurde.
In 1 sind die folgenden Plasmid-Konstrukte, die Dengue-cDNA der vollen Länge enthalten, dargestellt: p2A (Xho I), eine vollständige cDNA-Kopie des Dengue-4-Genoms, in der in der Nähe des 3'-Endes des E-Gens eine einmalige Xho I-Stelle erzeugt wurde; p2A (D1 WP), das von p2A (Xho I) hergeleitet wurde, indem die Sequenz zwischen der Bgl II-Stelle in dem nicht-codierenden 5'-Bereich und der einmaligen Xho I-Stelle durch die entsprechende cDNA des Dengue-1-Western Pacific-Stamms ersetzt wurde; p2A (D2 NGC), das ebenso hergestellt wurde, indem das Bgl II-Xho I-Fragment durch die entsprechende cDNA des Dengue-2-New Guinea C-Stamms ersetzt wurde. B: Bgl II-; X: Xho I-; A: Asp 718-Restriktionsenzym-Stellen.
Chimäre cDNA:
Das in C6/36-Stechmückenzellen gezüchtete Dengue-Typ 1- oder -Typ 2-Virus wurde gereinigt und die Virion-RNA gemäß dem von Zhao, B., et al. (Virology 155 (1986), 77-88) beschriebenen Verfahren extrahiert. Der erste Strang cDNA vom Dengue-1-Virus wurde durch reverse Transkription synthetisiert, wobei ein Negativ-Sense-Oligonucleotid eingesetzt wurde, das mit den Nucleotiden 2306 bis 2338 der Dengue-1-Sequenz hybridisierte. Diese Primersequenz enthielt einen stummen dritten Basenaustausch (A-G) am Nucleotid 2316, wodurch eine Xho I-Stelle an der Position erzeugt wurde, die der Stelle im Dengue-4-E-Gen in p5'-2 (Xho I, Pst I) entsprach, wie vorstehend beschrieben. Die Dengue-1-cDNA wurde sodann als Matrize für die Synthese von doppelsträngiger DNA durch PCR eingesetzt, wobei das Negativ-Sense-Oligonucleotid und ein Positiv-Sense-Primer verwendet wurden, der mit den Dengue-1-Nucleotiden 51 bis 70 hybridisierte und die konservierte Bgl II-Stelle enthielt. Das PCR-Produkt wurde mit Bgl II und Xho I gespalten und sodann in p5'-2 (Xho I, Pst I) cloniert, wobei die entsprechende Dengue-4-Sequenz ersetzt wurde. Das Cla I-Xho I-Fragment, das die Dengue-1-Sequenz enthielt, wurde sodann mit der restlichen Dengue-4-cDNA von p2A (Xho I) verknüpft, wodurch die Chimäre p2A (D1 WP) der vollen Länge erzeugt wurde. Ebenso wurde der erste Strang cDNA vom Dengue-2-Virus synthetisiert, indem ein Negativ-Sense-Primer eingesetzt wurde, der mit den Dengue-2-Nucleotiden 2310 bis 2364 hybridisierte. Dieser Primer enthält drei Basenaustausche: T-C an Position 2333, A-G an Position 2336 und C-A an Position 2337. Durch diese Austausche wird eine Xho I-Stelle an der Position erzeugt, die der Xho I-Stelle in dem Dengue-4-E-Gen entspricht, wie vorstehend beschrieben. Diese Austausche bewirkten keine Änderung der Aminosäuresequenz. Für die Synthese der doppelsträngigen DNA durch PCR wurde der Negativ-Sense-Primer eingesetzt, und der Positiv-Sense-Primer war der gleiche wie beim Dengue-1-Virus. Das PCR-Produkt wurde mit Bgl II und Xho I gespalten, in p5'-2 (Xho I) cloniert und das Cla I-Xho I-Fragment zum Ersetzen des entsprechenden Fragments von p2A (Xho I) verwendet, wodurch p2A (D2 NGC) hergestellt wurde.
RNA-Transkription, Transfektion und Gewinnung des Virus:
Die Transfektion der Zellen mit RNA-Transkripten der vollen Länge erfolgte wie beschrieben (Lai, C. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 5139-5143). Zehn Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und auf eine Platte mit sechs Vertiefungen und auf einen Kammer-Objektträger überführt. Zwei Tage später wurden die Zellen auf dem Objektträger durch einen Immunfluoreszenz-Test (IFA) auf das Vorliegen von Denguevirus-Antigenen getestet. Sofern der IFA zeigte, dass die meisten Zellen infiziert waren, wurden die Zellen in der Platte mit den sechs Vertiefungen mit Trypsin behandelt, mit einem sechsfachen Überschuss an nicht-infizierten Zellen gemischt und so lange inkubiert, bis die cytopathischen Effekte (Vorliegen von zahlreichen toten Zellen im Medium) sichtbar wurden, üblicherweise nach sechs bis sieben Tagen. Anschließend wurden die infizierten Zellen geerntet, indem das Medium entfernt, sodann die Zellen abgenommen und in einem Standardvolumen von 50 % essentiellem Eagle-Minimalmedium/50 % Serum resuspendiert und anschließend eingefroren wurden. Andererseits, wenn ein kleiner Prozentsatz der Zellen positiv war, wurden die Zellen mit Trypsin behandelt, in frischem Medium 1:3 verdünnt und ohne Zusatz von nicht-infizierten Zellen wachsen gelassen. Sodann wurde der prozentuale Anteil der infizierten Zellen wöchentlich bestimmt und Zell-Lysate wurden in bestimmten Abständen geerntet, und der Virustiter wurde bestimmt.
Nachweis von Denguevirus-Antigenen:
Die infizierten Zellen wurden durch IFA analysiert, indem die Serotyp-spezifischen monoclonalen Antikörper (mab) 1F1 (Dengue-1), 3M5 (Dengue-2), 5D4 (Dengue-3) und 1H10 (Dengue-4) und der NS1-spezifische mab 1G6 (Dengue-4) eingesetzt wurden, ursprünglich hergestellt von Dr. M. K. Gentry und Dr. E. Henchal (WRAIR, Washington DC) (Henchal, E. A., et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 31 (1982), 548-555). Die monoclonalen Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:50 bis 1:300 eingesetzt, während das Fluorescein-konjugierte Anti-Maus-Antiserum (Kierkegaard-Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) mit einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt wurde. Die Ergebnisse wurden fotografisch aufgezeichnet; für jeden mab wurden die infizierten Zellen, die ein negatives Ergebnis ergaben, bei der gleichen Expositionszeit fotografiert wie die positiven Zellen. Um die Proteine von parentalen (Wildtyp) Dengueviren und des Virusabkömmlings v2A (Xho I) zu analysieren, wurden konfluente LLC-MK₂-Zellen in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit dem Virus bei einem MOI-Wert von 0,2 infiziert. Sechs Tage nach der Infektion wurden die Zellen sechs Stunden mit 50 μCi/Vertiefung eines S-Methionin-freien Mediums markiert, und sodann wurden die Zellen mit RIPA-Puffer lysiert. Bei dem chimären Virus v2A (D1 WP) erfolgte die Markierung, als etwa 100 % der Zellen infiziert waren, während die Markierung von v2A (D2 NGC) durchgeführt wurde, als etwa 30 % infiziert waren. Die Lysate wurden mit der entsprechenden homotypischen oder heterotypischen Hyperimmun-Maus-Aszitesflüssigkeit (HMAF) gefällt und durch Elektrophorese auf 12 % SDS-Polyacrylamidgelen analysiert.
Plaque-Morphologie.
Die Plaque-Morphologie der Viren wurde an LLC-MK₂-Zellen untersucht (Bancroft, W. H., et al., Pan. Am. Hlth. Org. Sci. Publ. 375 (1979), 175-178). Jedes parentale Virus wurde vor der Analyse der Plaque-Morphologie einmal in LLC-MK₂-Zellen einer Passage unterworfen. Nach sechs bis neun Tagen Inkubation wurden die Kulturen mit Neutralrot überschichtet.
Test der chimären Viren in gesäugten Mäusen:
Drei Tage alte Swiss-Mäuse wurden intracerebral mit 2000 PBE des parentalen oder des chimären Denguevirus in Form eines verdünnten Lysats von Virus-infizierten LLC-MK₂-Zellen infiziert. Die Mäuse der negativen Kontrolle erhielten Injektionen mit einem Lysat von nicht-infizierten Zellen. Ein Wurf wurde mit dem parentalen Dengue-Typ 4-Virus (814669), dem Dengue-Typ 1-Virus WP oder dem Dengue-Typ 2-Virus NGC geimpft. Zwei Würfe wurden mit v2A (Xho I), v2A (D1 WP) oder v2A (D2 NGC) geimpft. Die geimpften Mäuse wurden 21 Tage überwacht, ob Zeichen einer Encephalitis auftraten oder ob sie verendeten.
Beispiel 1
Chimäre cDNA und Viren
Die cDNA der vollen Länge des Dengue-Typ 4-Virus (p2A) wurde für die Konstruktion chimärer Viren verwendet, wobei ihre Strukturgen-Sequenzen durch die entsprechenden Sequenzen eines Dengue-Typ 1- oder Typ 2-Virus ersetzt wurden. Das für diesen Zweck ausgewählte Typ 1-Virus (WP) war ein Stamm mit wenig Gewebekulturpassagen, der nicht an das Wachstum in Mausgehirn angepasst worden war. Der Typ 2-Stamm (NGC) war eine stark neurovirulente Mutante, die während einer Reihe von intracerebraler Passagen in Mäusen selektiert worden war. Die Typ 2-Mutante wurde für diese Untersuchung ausgewählt, da sie die Möglichkeit bot, die genetischen Determinanten der Maus-Neurovirulenz zu kartieren.
Die Transformation von E. coli-Bakterien, Stamm HD 1528, mit den Plasmidkonstrukten p2A (Xho I), p2A (D1 WP) oder p2A (D2 NGC) erzeugte eine stabile Plasmidpopulation. Die vorausgesagte Struktur dieser Plasmide ist in 1 dargestellt. Ihre Struktur wurde durch Restriktionsenzym-Kartierung bestätigt.
Etwa die Hälfte der mit RNA-Transkripten von p2A (Xho I) transfizierten LLC-MK₂-Zellen waren am Tag 12 bei der Immunfluoreszenz-Färbung zum Nachweis von Denguevirus-Antigenen positiv (2A).
2 zeigt (A) LLC-MK₂-Zellen, die mit der gleichen Konzentration von RNA-Transkripten von p2A (Xho I), p2A (D1 W) oder p2A (D2 NGC) transfiziert worden waren. Der prozentuale Anteil der mit Virus infizierten Zellen nach der Transfektion wurde nach der erneuten Plattierung in einem frischen Medium durch IFA bestimmt. (B) Die infizierten Zellen wurden geerntet, wenn die Mehrzahl der Zellen beim IFA positiv war. Die Titration des Virus erfolgte durch den Plaque-Test (Bancroft, W. H., et al., Pan Am. Hlth. Org. Sci. Publ. 375 (1979), 175-178).
In einer früheren Studie wurde ein ähnlicher Anteil von Antigen-positiven Zellen im Bereich von 20 bis 50 % 12 Tage nach der Transfektion mit Transkripten von p2A und p2A (Pst I) beobachtet, die in beiden Fällen ein Virus mit Wildtyp-Phänotyp ergaben (Lai, C. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 5139-5143). Im Gegensatz dazu war am Tag 12 weniger als 1 % der mit Transkripten von p2A (D1 WP) oder p2A (D2 NGC) transfizierten Zellen positiv. Der prozentuale Anteil der mit v2A (D1 WP) infizierten Zellen stieg am Tag 19 auf etwa 5 %, am Tag 26 auf etwa 30 % und am Tag 33 auf etwa 80 % an; zu diesem Zeitpunkt betrug der in den transfizierten Zellen vorliegende Virustiter 5 × 10⁶ PBE/ml (2A und 2B). Im Gegensatz dazu wuchs v2A (D2 NGC) langsamer. Wir schätzten, dass 1 % der Zellen am Tag 19 positiv war, dass jedoch weniger als ein Drittel der Zellen am Tag 54 infiziert worden war. Der Virustiter betrug nach 30 Tagen lediglich 1,5 × 10² PBE/ml, nach 44 Tagen 2,5 × 10² PBE/ml und erreichte bis Tag 58 nicht 10⁴ PBE/ml. 72 Tage nach der Transfektion war die Mehrzahl der Zellen infiziert, und der Titer der Zellsuspension betrug 10² PBE/ml.
Der Virustiter, der durch die mit p2A (Xho I)-RNA-Transkripten (10⁶ PBE/ml) transfizierten Zellen produziert wurde, war gleich groß wie der Titer, der bei den mit Typ 4-Virus mit einem MOI-Wert von 0,1 infizierten Zellkulturen festgestellt wurde. Außerdem war der höchste Virustiter, der durch die mit der Typ 1/Typ 4-Chimäre (5 × 10⁶ PBE/ml) transfizierten Kulturen produziert wurde, ähnlich wie der Titer, der nach der Infektion von Zellkulturen mit dem Typ 1-Virus bei einem MOI-Wert von 0,1 (1,5 × 10⁷ PBE/ml) beobachtet wurde. Der höchste Titer, der nach der Transfektion der Typ 2/Typ 4-Chimäre (10² PBE/ml) erzeugt wurde, war ähnlich wie der Titer, der durch Zellkulturen produziert wurde, die mit ihrem Typ 2-Vorläufer bei einem MOI-Wert von 0,5 infiziert worden waren.
Beispiel 2
Charakterisierung von chimären Strukturproteinen
Anhand der indirekten Immunfluoreszenz wurde die Virus-Nachkommenschaft charakterisiert, wie in 3 dargestellt.
3 zeigt einen Immunfluoreszenztest, der auf LLC-MK₂-Zellen, die mit v2A (Xho I), v2A (D1 WP) oder v2A (D2 NGC) infiziert waren, oder auf nicht-infizierten Zellen durchgeführt wurde. Monoclonale Antikörper wurden in Verdünnungen von 1:50 bis 1:300 verwendet, der Fluorescein-konjugierte Anti-Maus-Antikörper wurde in der Verdünnung von 1:100 eingesetzt. Die Serotyp-Spezifität der monoclonalen Antikörper ist am linken Rand angegeben.
Die mit v2A (Xho I) infizierten Zellen wurden im IFA mit dem Dengue-4-spezifischen mab 1H10 angefärbt, zeigten jedoch keine Bindung an den Dengue-1-spezifischen mab 1F1 oder den Dengue-2-spezifischen mab 3M5. Wie vorausgesagt, reagierten die mit v2A (D1 WP) infizierten Zellen nur mit 1F1, und die mit v2A (D2 NGC) infizierten Zellen wurden nur mit 3H5 angefärbt. Der mab 5D4, der für das Dengue-3-Virus spezifisch ist, reagierte mit keiner der infizierten Zellen. Diese Ergebnisse zeigten, dass beide chimären Viren die Antigenität aufwiesen, die durch ihre Strukturprotein-Gene spezifiziert war. Wie zu erwarten war, färbte der mab 1G5, der für das Dengue-4-Nicht-Strukturprotein NS1 spezifisch war, Zellen an, die mit den Abkömmlingen der Dengue-Typ 4-cDNA, d.h. 2A (Xho I), und auch mit einem der vom Typ 4-Virus hergeleiteten chimären Viren 2A (D1 WP) oder 2A (D2 NGC) infiziert waren.
Die Proteine des parentalen Dengue-Typ 4-Virus und von seinem cDNA-abgeleiteten Abkömmling v2A (Xho I) schienen identisch zu sein, wenn sie durch Immunfällung mit homotypischer HMAF und anschließender Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert wurden (4). 4 zeigt die ³⁵S-Methionin-markierten Lysate von Virus-infizierten LLC-MK₂-Zellen oder von nicht-infizierten Kontrollzellen. Die Zellen wurden mit der Hyperimmun-Maus-Aszitesflüssigkeit (HMAF), die gegen Dengue-1, 2 oder 4 hergestellt worden war, immungefällt und durch Elektrophorese auf einem 12 % SDS-Polyacrylamidgel (Acrylamid:Bis = 60:1,6) analysiert. Oben an jeder Bahn ist das Virus senkrecht angegeben, während die HMAF, mit der das Lysat immungefällt wurde, waagrecht angegeben ist. Marker: Die Marker der Protein-Molekülgrößen sind in Kilodalton angegeben. Die Lage der E- und präM-Glykoproteine von Dengue-1, 2 und 4 ist angegeben (4).
Außerdem wurden die Proteine des parentalen Dengue-Typ 1-Virus (WP) und des Dengue-Typ 2-Virus (NGC) analysiert. Die E-Glykoproteine der Dengue-1- und Dengue-2-Viren liefen zusammen, jedoch wanderten sie langsamer als das E-Protein des Dengue-4-Virus. Ebenso wanderten die präM-Glykoproteine der Dengue-1- und 2-Viren zusammen, sie liefen jedoch auch langsamer als das präM des Dengue-4-Virus. Der Unterschied in der relativen Molekülgröße der E-Proteine betrug etwa 4 kd, während der Unterschied der präM-Proteine etwa 1 kd ausmachte. Diese Unterschiede in der Molekülgröße von E und präM waren möglicherweise auf eine Variation im Ausmaß der Glykosylierung oder auf Unterschiede in der Konformation zurückzuführen. Die immungefällten Proteine der Viren v2A (D1 WP) und v2A (D2 NGC) wiesen ein Hybridmuster auf. PräM und E von v2A (D1 WP) zeigten eine Immunfällung mit Dengue-1-HMAF, sie wanderten zusammen mit präM und E des parentalen Dengue-1, jedoch fällte Dengue-4-HMAF nur Banden, die mit den Nicht-Strukturproteinen des Dengue-4-Virus zusammenliefen. Ebenso präM und E des parentalen Dengue-2-Virus, während Dengue-4-HMAF Nicht-Strukturproteine fällte, die denjenigen des Typ 4-Virus glichen.
Das parentale Dengue-Typ 4-Virus und sein cDNA-hergeleiteter Abkömmling v2A (Xho I) erzeugten auf LLC-MK₂-Zellen ähnliche Plaques (nicht gezeigt). Die Plaques der parentalen Viren waren deutlich sichtbar, wenn sie sechs Tage nach der Infektion mit Neutralrot angefärbt wurden, dagegen hatte die Chimäre v2A (D2 NGC) zu diesem Zeitpunkt keine nachweisbaren Plaques erzeugt. Wenn mit der Färbung jedoch bis zum Tag neun gewartet wurde, konnten sehr kleine v2A (D2 NGC)-Plaques nachgewiesen werden, die viel kleiner waren als die Plaques von v2A (Xho I) oder von dem Wildtyp Dengue-2-NGC (5). Die Plaques von Dengue-4-814669 unterschieden sich nicht von den Plaques des Virusabkömmlings v2A (Xho I). Die Plaques von v2A (D1 WP) waren im wesentlichen ähnlich zu den Plaques von v2A (Xho I).
In 5 sind einschichtige Zellrasen von infizierten LLC-MK₂-Zellen dargestellt, diese unterscheiden sich von denjenigen des Virusabkömmlings v2A (Xho I). Die Plaques von v2A (D1 WP) waren im wesentlichen ähnlich zu den Plaques von v2A (Xho I).
In 5 sind einschichtige Zellrasen von LLC-MK₂-Zellen dargestellt, die mit dem Denguevirus infiziert wurden, anschließend wurden sie mit Agarose überschichtet (Bancroft, W. H., et al., Pan Am. Hlth. Org. Sci. Publ. 375 (1979), 175-178). Die Neutralrot-Schicht wurde neun Tage nach der Infektion des einschichtigen Zellrasens aufgetragen, und am nächsten Tag wurden die Plaques fotografiert. A: 2A (Xho I); B: 2A (D1 NGC); C: Wildtyp NGC-Dengue-3.
Beispiel 3
Virulenz der Viren für gesäugte Mäuse
Die Chimäre v2A (D2 NGC) wurde bezüglich Neurovirulenz bei Mäusen mit ihren parentalen Viren, dem an Mausgehirn angepassten Dengue-2-NGC und dem v2A (Xho I) verglichen. Dabei zeigte sich, dass das Dengue-2-NGC am schnellsten letal wirkte. Die zehn Mäuse starben jeweils am Tag 5 oder am Tag 6 nach der Impfung an Encephalitis, wobei die durchschnittliche Überlebenszeit 5,1 Tage betrug, während die 15 Mäuse, die mit der Chimären v2A (D2 NGC) geimpft worden waren, acht bis elf Tage überlebten, bevor sie verendeten, wobei die durchschnittliche Überlebenszeit 9,1 Tage betrug (6).
In 6 sind drei-Tage-alte Swiss-Mäuse dargestellt, die intracerebrale Injektionen mit 2000 PBE entweder des parentalen oder des chimären Denguevirus in Form eines verdünnten Lysats von infizierten LLC-MK₂-Zellen erhielten. Die folgende Anzahl von Mäusen erhielt Injektionen: Dengue-2 (NGC), 10 Mäuse; v2A (D2 NGC), 15 Mäuse; Dengue-4 814669, 12 Mäuse; v2A (Xho I), 18 Mäuse. Den negativen Kontrollen (11 Mäusen) wurde ein verdünntes Lysat von nicht-infizierten Zellen injiziert. Anschließend wurden die Mäuse täglich untersucht, ob sie Zeichen einer Encephalitis zeigten oder ob sie verendet waren.
Der Unterschied in der Verteilung der überlebenden Mäuse ist signifikant (p = 00001, Zweipunkt-Statistik von Smirnov). Auch das parentale Dengue-4-Virus 814669 wurde mit seinem Abkömmling v2A (Xho I) verglichen. Fünf der 12 mit dem parentalen Virus geimpften Mäuse verendeten an Encephalitis, wobei die erste Maus am Tag 11 verendete, während lediglich eine der mit v2A (Xho I) geimpften 18 Mäuse 16 Tage nach der Impfung verendete und der Rest gesund blieb. Obwohl die Verteilung der überlebenden Mäuse bei den zwei Gruppen nach der Smirnov-Statistik (p > 0,14) nicht signifikant verschieden ist, unterscheidet sich der prozentuale Anteil der überlebenden Tiere bei den zwei Gruppen im Fischer-Exakttest (p = 0,0256). Dies legt nahe, dass Dengue-4 814669 oder eine Untergruppe von Virionen im Viruspräparat ein bestimmtes Ausmaß an Neurovirulenz besitzt und dass der Virusabkömmling v2A (Xho I) möglicherweise eine nicht-neurovirulente Subpopulation darstellt oder Nucleotid-Änderungen enthält, die während der Clonierung oder Vermehrung des Virus entstanden sind. Keine der zwölf mit dem parentalen Dengue-Typ 1-Virus (WP) geimpften Mäuse oder der 18 mit seinem chimären Abkömmling v2A (D1 WP) injizierten Mäuse oder der elf Mäuse, die ein Lysat von nicht-infizierten Zellen erhalten hatten, erkrankte an Encephalitis oder verendete.
Mutationsanalyse
Wir clonierten eine Serie von Dengue-cDNA-Insertionen, die die gesamte Länge des Dengue-Typ 4-Virusgenoms überspannten. Diese wurden in einem ersten Versuch zur Clonierung einer Dengue-DNA der vollen Länge eingesetzt, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Beispiel 4
Erster Versuch zur Clonierung einer Dengue-DNA der vollen Länge in Plasmid pBR322, enthaltend den SP6-Promotor
Die verschiedenen Dengue-Typ 4-cDNA-Insertionen wurden an gemeinsamen Restriktionsenzym-Stellen verknüpft, so dass eine Dengue-DNA-Kopie der vollen Länge erhalten wurde, wobei die gleiche Pst I-Clonierungsstelle von pBR322 verwendet wurde. Für die in vitro-Transkription wurde die Sequenz des SP6-Polymerase-Promotors am 5'-Ende vor der Dengue-Sequenz plaziert. Die vorausgesagte 5'-Sequenz der RNA-Transkripte ist in 7 dargestellt. Der A-Rest des ersten Dengue-Nucleotids ist so positioniert, dass er unmittelbar auf den G-Rest folgt, der die normale Transkription der SP6-Polymerase einleitet. Die m7G-Kappen-Struktur, die am 5'-Ende der genomischen RNA vorliegt, wurde erhalten, indem bei der Transkriptionsreaktion ein m7G pppG-Analogon eingebaut wurde. Eine solche DNA-Struktur würde eine Dengue-RNA erzeugen, die ein zusätzliches Nucleotid am 5'-Terminus enthält. Zur Herstellung von run off-Transkripten wurde eine einmalige Asp 718-Schnittstelle am 3'-Ende der Dengue-Sequenz eingeführt. Wie in 7 dargestellt, liegen im Matrizenstrang fünf zusätzliche Nucleotide vor der Asp 718-Schnittstelle vor. Wenn die Transkription bis zum letzten Nucleotid abläuft, enthalten die RNA-Transkripte an ihrem 3'-Terminus diese fünf zusätzlichen Reste.
Während dieser Studie, bei der E. coli Stamm HB101 als Wirt für die Transformation eingesetzt wurde, wurde festgestellt, dass ein Plasmid, das die Dengue-DNA der vollen Länge enthielt, häufig instabil war, weil bei dem Plasmid in vielen Transformanten eine Umlagerung stattfand, und dass viele Kolonien durchgemustert werden mussten, um eine Clon-DNA mit dem vorausgesagten Restriktionsenzym-Muster zu isolieren. Wir untersuchten die Stabilität von Plasmiden, die durch unterschiedliche Stämme von E. coli produziert wurden. Die stark Transformations-kompetenten, im Handel verfügbaren E. coli-Stämme DH5α und DB1528, die früher im Labor eingesetzt wurden, wurden mit dem E. coli-Stamm HB101 verglichen. Dabei wurde gefunden, dass der Stamm DB1528 Transformanten erzeugte, deren Koloniengröße drei- bis viermal größer war als bei den HB101-Transformanten. Vor allem ergaben die Transformanten von DB1528 im allgemeinen ein Plasmid mit dem vorausgesagten Restriktionsenzym-Muster; dies legt nahe, dass E. coli DB1528 der Stamm der Wahl für die Herstellung einer stabil clonierten Dengue-DNA der vollen Länge ist. Jedoch konnte aus den in vitro-RNA-Transkripten, die aus diesem Dengue-DNA-Clon der vollen Länge hergestellt worden waren, beim Testen auf transfizierten Zellen kein Denguevirus produziert werden, bei denen die als positive Kontrolle eingesetzte Virion-RNA bei einer 100- mal niedrigeren Konzentration Denguevirus ergab, wie durch einen angegebenen Immunfluoreszenz-Test nachgewiesen werden konnte.
Beispiel 5
Ersetzen von Dengue-DNA-Segmenten in dem Konstrukt der vollen Länge durch unabhängig hergeleitete DNA-Clone
Man nahm an, dass die Unfähigkeit zur Produktion von infektiösen RNA-Transkripten auf dem Vorliegen von Defektmutationen im Clon der vollen Länge beruhte. Solche Mutationen können vermutlich durch die Clonierung einer defekten Population der Virusstammlösung oder durch einen Kopplungsfehler während der Clonierung oder Vermehrung des Plasmids zustande kommen. Wir entschlossen uns dazu, die Dengue-DNA-Segmente, die möglicherweise eine oder mehrere Defektmutationen enthielten, gegen die entsprechenden Segmente aus unabhängig clonierten Dengue-DNA-Konstrukten auszutauschen. Um eine Grundstruktur für ein systematisches Austauschexperiment bereitzustellen, wurden die 5'- und 3'-Fragmente der Dengue-Sequenz getrennt cloniert. Die einmalige Bst B1-Stelle am Nucleotid 5069 wurde eingesetzt, um die Dengue-Sequenz der vollen Länge in zwei Fragmente aufzutrennen, die jeweils etwa 50 % des Genoms darstellten. Das 5'-Fragment des ersten Clons der vollen Länge, das den SP6-Promotor enthielt, wurde mit 5'-1 bezeichnet, und die restliche 3'-Sequenz zwischen Bst B1 und Asp 718 wurde mit 3'-A bezeichnet. Ein Plasmid, welches das zweite 5'-Fragment, 5'-2, enthielt, wurde aus einem unabhängig hergeleiteten Satz von Dengue-cDNA-Insertionen konstruiert. Eine einmalige Asp 718-Stelle wurde an der Pst I-Stelle von pBR322 stromabwärts der Bst B1-Stelle der Dengue-Sequenz eingeführt. Somit war dieses Plasmid auch für die Verwendung als Clonierungsvektor für die Insertion des 3'-Fragments in die DNA-Konstruktion der vollen Länge geeignet. Zwei weitere 3'-Fragmente, 3'-B und 3'-C, wurden noch aus einer unabhängigen Gruppe von Dengue-cDNA-Insertionen konstruiert (8). Durch Austausch des 3'-Fragments in dem ersten Clon der vollen Länge, 1A, durch die 3'-B- oder 3'-C-Fragmente wurden zwei weitere Clone der vollen Länge, 1B und 1C, hergestellt. Ebenso ergab die Substitution des 5'-Fragments in allen drei DNA-Konstrukten der vollen Länge durch das 5'-2-Fragment drei andere DNA-Clone der vollen Länge, d.h. 2A, 2B und 2C. Die Spaltung dieser Plasmide mit Bgl II, Nsi I und Asp 718 zeigte ein Muster von vorausgesagten DNA-Fragmenten, das bei allen sechs Clonen der vollen Länge nicht zu unterscheiden war, wie in 9 dargestellt. Durch die erfolgreiche Vermehrung eines Plasmids, das offensichtlich die Dengue-DNA-Sequenz der vollen Länge enthielt, im E. coli-Stamm BD1528 wurde es somit möglich gemacht, RNA-Transkripte für die Beurteilung ihrer Infektiosität in gezüchteten Zellen in vitro herzustellen.
Beispiel 6
Erster Beweis für die Infektiosität von in vitro-hergestellten RNA-Transkripten
Die RNA-Transkripte, die aus den konstruierten Dengue-DNA-Matrizen der vollen Länge hergestellt wurden, wurden jeweils auf Infektiosität getestet, indem sie auf LLC-MK₂-Zellen transfiziert wurden. Zehn Tage nach der Transfektion mit 2A-RNA wurden Dengue-infizierte Zellen leicht festgestellt; diese wurden durch einen indirekten Immunfluoreszenz-Test nachgewiesen. Die RNA-Transkripte von den anderen vier DNA-Clonen der vollen Länge waren bei diesem Test negativ; dies zeigt, dass diese DNA-Clone, wie Clon 1A, Letalmutationen enthielten, die durch die Restriktionsenzym-Analyse nicht nachgewiesen werden konnten.
Zusätzlich zu der vorstehend beschriebenen positiven Identifizierung von Denguevirus-infizierten Zellen wurde das infektiöse Denguevirus aus dem Medium oder aus dem Zell-Lysat von 2A-RNA-transfizierten Zellen gewonnen. Der Titer des im Lysat der transfizierten Zellen vorliegenden Dengue-Virus betrug 10¹ PBE/ml. Eine Behandlung von 2A-RNA-Transkripten mit DNase I hatte keinen Einfluss auf ihre Infektiosität, während eine RNase-Behandlung ihre Infektiosität vollständig aufhob. Da die Plaque-Bildung beim Denguevirus nicht direkt nach der Transfektion von einschichtigen Zellrasen durch RNA erfolgte, wurde die Virusproduktion erst nachgewiesen, nachdem eine längere Inkubation für die Virusamplifikation erfolgt war. Mit diesem indirekten Immunfluoreszenz-Testverfahren wurde die Infektiosität bei einer minimalen Konzentration mit 1 ng genomischer RNA oder mit 10 ng 2A-RNA-Transkripten nachgewiesen. Diese Ergebnisse des Tests zeigen, dass die aus Clon 2A hergestellten RNA-Transkripte nach der Transfektion von permissiven gezüchteten Zellen infektiös waren.
Beispiel 7
Weitere Beweise für die Infektiosität der RNA-Transkripte
Um einen formalen Beweis zu erbringen, dass durch die mit den RNA-Transkripten des Clons 3A transfizierten Zellen ein infektiöses Denguevirus produziert wurde, wurden zwei Mutationen (G₃₄₇₃ → T und C₃₄₇₆ → T), die eine neue Pst I-Stelle am Nucleotid 3473 im Dengue-Genom erzeugten, jedoch keinen Einfluss auf die Aminosäuresequenz hatten, in die DNA der vollen Länge des Dengue-Clons 2A eingeführt. Die aus dieser mutierten DNA hergestellten RNA-Transkripte wurden, nachdem die DNA-Matrize durch eine gründliche Spaltung mit DNase I vollständig entfernt worden war, für die Transfektion von Zellen eingesetzt. Die transfizierten Zellen produzierten infektiöses Denguevirus. Die aus der Virus-Nachkommenschaft extrahierte genomische RNA wurde revers transkribiert und das cDNA-Produkt als Matrize für die PCR zur Erzeugung eines DNA-Fragments zwischen den Nucleotiden 3193 und 4536 eingesetzt. Wie in 10 dargestellt, ergab die Pst I-Spaltung des PCR-DNA-Produkts zwei Fragmente mit einer Länge von 280 und 1063 Basenpaaren, wie es aufgrund des Vorliegens der Pst I-Schnittstellen-Sequenz vorausgesagt worden war. Das aus der 2A-RNA des Kontrollvirus hergeleitete PCR-DNA-Produkt war unempfindlich gegenüber einer Spaltung mit Pst I. Diese Beobachtung war der Beweis, dass der Virusabkömmling, der von den RNA-Transkripten der mutierten 2A-DNA hergeleitet war, die Pst I-Stelle enthielt.
Beispiel 8
Denguevirus, das aus in vitro-transkribierter infektiöser RNA gewonnen wurde
Die Denguevirus-Nachkommenschaft wurde aus dem Lysat der Zellen isoliert, die mit den aus der Clon-2A- oder Clon-2A (Pst)-Matrize hergestellten RNA-Transkripten transfiziert worden waren, und bezüglich ihrer Fähigkeit zur Plaque-Bildung auf einschichtigen Zellrasen von LLC-MK₂-Zellen mit dem parentalen Wildtyp-Virus verglichen. Sechs Tage nach der Infektion produzierten sowohl der Virusabkömmling als auch das parentale Virus charakteristische Dengue-Plaques mit verschiedenen Größen. Obwohl das parentale Virus, das durch Passagen in Stechmückenzellen gezüchtet wurde, hauptsächlich kleine Plaques zeigte, ergab der Virusabkömmling gemischte, jedoch größtenteils große Plaques; dies legt nahe, dass das gewonnen Virus möglicherweise eine clonierte Population darstellt. Außerdem wurden die Dengue-spezifischen Proteine verglichen, die in den mit Virusabkömmling infizierten Zellen und in den mit dem parentalen Virus infizierten Zellen produziert wurden. Wie in 11 dargestellt, war das Profil der Proteinbanden, umfassend präM, E, NS1, NS2, sowie von anderen nicht bezeichneten Dengue-Proteinbanden, die durch eine Dengue-spezifische Hyperimmun-Aszitesflüssigkeit gefällt wurden, anscheinend bei der Virus-Nachkommenschaft und beim parentalen Virus nicht zu unterscheiden. Dieses Ergebnis macht deutlich, dass das gewonnene Denguevirus den gleichen Genotyp und Phänotyp wie das Virus aufwies, von dem der cDNA-Clon hergeleitet wurde.
Gentechnische Herstellung eines lebensfähigen Denguevirus durch Aminosäure-Substitution am NS1-NS2A-Schnittstellen-Übergang
Beispiel 9
Konstruktion von NS1-NS2A-DNA mit Aminosäure-Substitutionen an der Schnittstellen-Sequenz
In dieser Studie wurde eine intermediäre rekombinante pSC11-NS1-NS2A-DNA verwendet, die für die Expression von authentischem NS1 konstruiert wurde. Die Denguevirus-DNA enthielt die codierende Sequenz für das N-terminale 24-Aminosäuren-Signal und die gesamte Polypeptidsequenz von NS1 und NS2A. Zuerst wurde diese Plasmid-DNA modifiziert, um den Austausch von DNA- Segmenten zu erleichtern, die Mutationen enthielten. Zwei stumme Mutationen wurden in die NS1-NS2A-DNA (G₃₄₇₃ → T und C₃₄₇₆ → A) durch Oligonucleotid-spezifische Mutagenese eingeführt. Durch diese Änderungen wurde eine neue Pst I-Stelle am Nucleotid (Nt.) 3476 erzeugt. Das rekombinante Plasmid enthielt eine einmalige Nco I-Stelle am Nt. 3320 in der Dengue-NS1-codierenden Sequenz. Der NS1-NS2A-Schnittstellen-Übergang liegt am Nt. 3477. Um Aminosäure-Substitutionen an der Schnittstellen-Sequenz einzuführen, wurden durch Oligonucleotid-spezifische Mutagenese Änderungen von Nucleotiden erzeugt. Eine Reihe von Oligonucleotiden wurde synthetisiert und in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) als Negativ-Strang-Primer eingesetzt. Der Positiv-Strang-Primer war 5' AAGGCTATGCCACGCAAA 3' (SEQ ID NO: 1), diese Sequenz liegt stromaufwärts der Nco I-Stelle. Z.B. wurde an der Schnittstellen-Position –2 (Thr₁₁₂₄) das Oligo GCC CTG GCC GGC CTT CAC CTG TGA TTT GAC CAT (SEQ ID NO: 2) eingesetzt, um Lys anstelle von Thr einzufügen. Ebenso wurde das Oligo GCC CTG GCC GGC CTG CAC CTG TGA TTT GAC CAT (SEQ ID NO: 3) verwendet, um Gln für Thr zu substituieren, und das Oligo GCC CTG GCC GGC CAG CAC CTG TGA TTT GAC CAT (SEQ ID NO: 4) wurde verwendet, um Leu anstelle von Thr einzusetzen. Ebenso wurde das Oligo TTC TGA TGT GCC CTG TTC GGC CGT CAC CTG TGA (SEQ ID NO: 5) eingesetzt, um Glu für Gly₁₁₂₀ an der Schnittstellen-Position +1 zu substituieren, oder das Oligo TTC TGA TGT GCC CTG CCA GGC CGT CAC CTG TGA (SEQ ID NO: 6) wurde verwendet, um Trp für das gleiche Gly an der Schnittstellen-Position +1 zu substituieren.
Für die Konstruktion einer intermediären rekombinanten DNA, die die angegebenen Mutation enthielt, wurde das DNA-Fragment zwischen der neu erzeugten Pst I-Stelle und der einmaligen Nco I-Stelle durch die Serie von PCR-DNA-Produkten ersetzt, die mit Nco I und Pst I gespalten wurden. Rekombinante Vacciniaviren, die diese mutierten NS1-NS2A-Sequenzen exprimierten, wurden nach dem früher beschriebenen Verfahren hergestellt (Zhao, B., Prince, G., Horswood, R., Eckels, K., Summers, P., Chanock, R., und Lai, C. J., „Expression of Dengue Virus Structural Proteins and Nonstructural Protein NS1 by a Recombinant Vaccinia Virus", J. Virol. 61 (1987), 4019-4022).
Beispiel 10
Analyse der Spaltung am NS1-NS2A-Übergang
Konfluente CV-1-Zellen in einer Platte mit sechs Vertiefungen wurden mit einem rekombinanten Vacciniavirus mit 5 PBE pro Zelle infiziert und in minimalem essentiellem Medium plus 2 % fötalem Kälberserum (MEM2) gehalten. 16 bis 20 Stunden nach der Infektion wurde das Medium entfernt und durch ein Methionin-freies MEM2 ersetzt, und nach einer Stunde Inkubation wurde dieses Medium durch 0,7 ml eines Methionin-freien MEM2 ersetzt, das 100 μCi von ³⁵S-Methionin (spezifische Aktivität > 800 μCi/Mol) enthielt. Nach einer zweistündigen Markierung wurden die Zellen in RIPA-Puffer (1 % Natriumdesoxycholat, 1 % Nonidot P-40, 0,1 % Natriumdodecylsulfat [SDS], 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl) lysiert, und das Lysat wurde zur Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert. Der klare Überstand des Lysats wurde für die Analyse der Denguevirus-Proteine durch Immunfällung verwendet, wobei eine Dengue-spezifische Hyperimmun-Maus-Aszitesflüssigkeit (HMAF) eingesetzt wurde. Die Immunpräzipitate wurden durch elektrophoretische Auftrennung auf einem 12 % SDS-Polyacrylamidgel (Acrylamid/Bis-Verhältnis 60:1,6) analysiert. Die markierten Proteinbanden wurden durch Fluorgraphie sichtbar gemacht. Die Gelbanden, die dem ungespaltenen NS1-NS2A-Vorläufer und dem gespaltenen NS1-Produkt entsprachen, wurden ausgeschnitten, und die Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler ermittelt.
Um das Ausmaß der Spaltung am NS1-NS2A-Übergang zu bestimmen, wurden die Unterschiede bei der Immunfällbarkeit zwischen NS1-NS2A und NS1 unter der Annahme korrigiert, dass die gesamte Markierung des exprimierten NS1-NS2A in den Zellen, die mit der jeweiligen Mutante bei gleichem PBE-Einsatz infiziert waren, gleich war. Wildtyp-NS1-NS2A wurde hauptsächlich als gespaltenes NS1 exprimiert, und der NS1-NS2A-Vorläufer konnte nicht nachgewiesen werden. Das Ausmaß der Spaltung für das Wildtyp-Virus wurde auf 100 % festgelegt.
Beispiel 11
Konstruktion einer Dengue-Typ 4-cDNA der vollen Länge mit Aminosäure- Substitutionen an der NS1-NS2A-Schnittstellen-Sequenz
Mutanten der NS1-NS2A-DNA, die ein Spektrum einer verminderten Spaltung am NS1-NS2A-Übergang zeigten, wie im vorstehenden Abschnitt konstruiert und analysiert, wurden für die Konstruktion von Denguevirus-Mutanten, die solche Aminosäure-Substitutionen enthielten, selektiert. Vier solche schon früher hergestellten Mutationen wurden verwendet: (1) Gly an der Schnittstelle positiv +1 wird zu Glu, (2) Thr an der Position –2 wird zu Lys, (3) Thr an der Position –2 wird zu Gln, und (4) Thr an der Position –2 wird zu Leu. Die Mutanten-psc11-NS1-NS2A-DNA wurde mit Spe I am Nt. 3338 und Stu I am Nt. 3616 gespalten, wodurch ein 278-Nt.-Fragment isoliert wurde. Dieses DNA-Fragment, das die Mutation enthielt, wurde für den Austausch des entsprechenden Wildtyp-DNA-Fragments in Plasmid p5'-2 verwendet, das die 5'-Hälfte der Dengue-cDNA-Sequenz enthielt. Das restliche 3'-Dengue-cDNA-Fragment zwischen Bst E1 (Nt. 5069) und Asp 718 am 3'-Ende wurde mit der p5'-2-DNA an den gemeinsamen Restriktionsenzym-Schnittstellen verknüpft. Auf diese Weise wurde eine cDNA der vollen Länge erzeugt und unter Verwendung des pBR322-Vektors cloniert. Diese cDNA-Serie enthielt mutierte Sequenzen, die Aminosäure-Substitutionen am NS1-NS2A-Schnittstellen-Übergang codierten.
Beispiel 12
Denguevirus-Typ 4-Virusmutanten, die eine suboptimale Spaltung am NS1-NS2A-Übergang zeigen
Ein Hauptschwerpunkt wird nun darauf gelegt, die molekulare Aufklärung des Denguevirus für die Entwicklung von sicheren und wirksamen abgeschwächten Lebendvirus-Impfstoffen gegen die Dengue-Krankheit zu nutzen. Die Einschränkung der Replikation des Denguevirus sollte zu einer Abschwächung führen. Die Modifikation einer Schnittstellen-Sequenz oder von viralen Protease-Komponenten bewirkt möglicherweise eine suboptimale Spaltung des viralen Polyproteins, wodurch das Wachstum des Virus eingeschränkt wird.
Die Schnittstelle des Polyproteins NS1-NS2A wurde als das erste Ziel für die Konstruktion von Denguevirus-Mutanten ausgewählt, die aufgrund einer ineffizienten Spaltung wachstumsgehemmt sind. Wir haben gezeigt, dass für die NS1-NS2A-Spaltung des Dengue-Typ 4-Virus eine aus acht Aminosäuren bestehende Sequenz am C-Terminus von NS1 erforderlich ist, die dem Schnittstellen-Übergang vorangeht (Hori, H., und Lai, C. J., „Cleavage of Dengue Virus NS1-NS2A Requires an Octapeptide Sequence at the C Terminus of NS1", J. Virol. 64 (1990), 4573-4577).
Der Vergleich der aus acht Aminosäuren bestehenden Sequenz unter den Flaviviren zeigte ein interessantes Motiv, in dem Ala (–1), Val (–3), Ser (–5), Val (–7) und Met/Leu (–8) streng konserviert sind, wohingegen Thr (–2), Gln (–4) und Lys (–6) variieren. Die Wirkung von Aminosäure-Substitutionen der Reste Ala an der Position –1, Thr an der Position –2, Val an der Position –3 und Gly an der Position +1 wurde untersucht. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in 16 dargestellt. Eine Aminosäure-Substitution an der konservierten Position –1 oder –3 ergab eine schwache Spaltung. Substitutionen von Aminosäuren an der nicht-konservierten Position –2 oder +1 zeigten keine Wirkung auf die Spaltung oder nur eine mäßige Verminderung der Spaltung.
Eine Reihe von Aminosäure-Substitutionen, die ein Wirksamkeitsspektrum bei der Spaltung abdeckten, wurden für den Einbau in die cDNA der vollen Länge ausgewählt und die in vitro-hergeleiteten RNA-Transkripte für die Konstruktion von Denguevirus-Mutanten verwendet. Eine Denguevirus-Mutante, die mit DEN4 (Gly₁₁₂₀ → Glu) bezeichnet wurde und die Glu anstelle von Gly (+1) enthielt, und drei andere Mutanten, die mit DEN4 (Thr₁₁₂₄ → Lys), DEN4 (Thr₁₁₂₄ → Gln) und DEN4 (Thr₁₁₂₄ → Leu) bezeichnet wurden und Substitutionen von Thr (2) enthielten, wurden aus transfizierten LLC-MK₂-Zellen gewonnen.
Die Wachstumseigenschaften dieser Mutanten wurden durch einen Plaque-Test auf Stechmücken-C6/36-Zellen charakterisiert, wie nachstehend beschrieben. 12 zeigt die Ergebnisse dieses Tests von DEN4 (Gly₁₁₂₄ → Glu) und von einem Kontrollvorläufervirus. Die Plaque-Größe der Virusmutante betrug etwa 0,1 cm im Durchmesser und war im Vergleich zu der Plaque-Größe von 1,1 cm des Vorläufervirus stark reduziert; andere Denguevirus-Mutanten zeigten auch eine reduzierte Plaque-Größe; dies legt nahe, dass diese Viren in gezüchteten Zellen eine Wachstumshemmung aufwiesen. Man kann davon ausgehen, dass die durch die suboptimale Spaltung zustande kommende Wachstumshemmung möglicherweise eine starke Wirkung auf die Virulenz des Virus im infizierten Wirt hat.
Gentechnische Herstellung von lebensfähigen Denguevirus-Mutanten mit Deletionen im nicht-codierenden 3'-Bereich
Beispiel 13
Konstruktion einer Dengue-cDNA, die Deletionen im nicht-codierenden 3'-Bereich enthält
Um die Einführung von Deletionsmutationen in das 384-Nucleotid der nicht-codierenden 3'-Region zu erleichtern, wurde das 540-Nt.-Subfragment der Dengue-4-cDNA zwischen der einmaligen Bam HI-Stelle am Nt. 10104 und der Asp 718-Stelle am 3'-Ende zuerst in den Clonierungsvektor pGEM3 eingefügt. In diesem rekombinanten Plasmid liegt die einmalige Apa I-Stelle am Nt. 10470 der Dengue-4-Sequenz etwa in der Mitte der nicht-codierenden 3'-Sequenz. Unter Verwendung der günstig gelegenen Apa I-Stelle wurden zwei Serien von Deletionsmutationen konstruiert. Eine Serie von Konstrukten enthielt Deletionen stromabwärts der Apa I-Stelle, und die andere Serie von Deletionen wurde stromaufwärts der Apa I-Stelle plaziert. Durch Oligonucleotid-spezifische Mutagenese wurde die erste Serie von Deletionsmutationen mit einer Länge im Bereich von 30 bis 90 Nucleotiden gentechnisch hergestellt.
Die folgenden Oligonucleotide, enthaltend die Apa I-Schnittstelle, die geeigneten Deletionen wie angegeben, gefolgt von der Stromabwärts-Sequenz, wurden in der PCR als Positiv-Strang-Primer eingesetzt.
Der Negativ-Strang-Primer war das Oligo GAG CTG GTA CCA GAA CCT GTT GGA TCA A (SEQ ID NO: 10), das die 3'-Dengue-Sequenz enthält, auf die die Asp 718-Schnittstellen-Sequenz folgt. Die Dengue-4-cDNA der vollen Länge (Clon 2A) wurde als Matrize eingesetzt. Diese Deletionsmutationen wurden in die Dengue-4-Sequenz eingeführt, indem das DNA-Fragment des Wildtyp-Virus zwischen der Apa I- und der Asp 718-Stelle in dem rekombinanten Plasmid pGEM3 durch die PCR-DNA-Produkte ersetzt wurde, die mit Apa I und Asp 718 gespalten worden waren.
Entsprechend wurde auch eine Oligonucleotid-spezifische Mutagenese durchgeführt, wodurch die zweite Serie von Deletionsmutationen mit einer Länge im Bereich von 61 bis 202 Nucleotiden gentechnisch hergestellt wurde; sodann wurden sie stromaufwärts der Apa I-Stelle plaziert. Die folgenden Oligonucleotide wurden synthetisiert und in einer PCR als Negativ-Strang-Primer eingesetzt.
Der Positiv-Strang-Primer war das Oligo GCC TCC ATG GCC ATA TGC TCA GC (SEQ ID NO: 15), das zwischen den Nucleotiden 9885 und 9907 stromaufwärts der Bam HI-Stelle liegt. Die Dengue-4-cDNA der vollen Länge wurde als Matrize eingesetzt. Wie früher beschrieben, wurde zur Einführung dieser Deletionsmutationen in die Dengue-4-Sequenz das DNA-Fragment des Wildtyp-Virus zwischen der Bam HI- und der Apa I-Stelle in dem intermediären Plasmid pGEM3 durch die PCR-DNA-Produkte ersetzt, die mit Bam HI und Apa I gespalten worden waren. Im letzten Schritt der gentechnischen Herstellung der cDNA-Matrize wurden die BamHI-Asp718-Fragmente von beiden Serien von Konstrukten isoliert und zusammen mit der restlichen Dengue-4-Sequenz cloniert.
Beispiel 14
RNA-Transkription, Transfektion und Gewinnung des Virus
Die Denguevirus-cDNA-Clone wurden durch Spaltung mit Asp 718 am 3'-Ende linearisiert, und die lineare DNA wurde als Matrize für die in vitro-Transkription durch SP6-Polymerase eingesetzt. Die Transfektion der Zellen mit RNA-Transkripten erfolgte wie beschrieben (Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 5139-5143). Zehn Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und auf eine Platte mit sechs Vertiefungen und einen Kammer-Objektträger übertragen. Zwei Tage später wurden die Zellen auf dem Objektträger durch einen Immunfluoreszenz-Test (IFA) auf das Vorliegen von Denguevirus-Antigenen getestet. Wenn der IFA ergab, dass die meisten Zellen infiziert waren, wurden die infizierten Zellen in der Platte mit den sechs Vertiefungen geerntet, indem das Medium entfernt, die Zellen abgenommen, in einem Standardvolumen von 50 % essentiellem Eagle-Minimalmedium/50 % Serum resuspendiert und anschließend eingefroren wurden. Andererseits, wenn nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen positiv war, wurden die Zellen mit Trypsin behandelt, in frischem Medium 1:3 verdünnt und gezüchtet. Sodann wurde der prozentuale Anteil der infizierten Zellen wöchentlich bestimmt, und Zell-Lysate wurden geerntet.
Beispiel 15
Plaque-Morphologie
Die Viren wurden auf die Plaque-Morphologie auf von Primaten stammenden LLC-MK₂-Zellen oder auf Stechmücken C6/36-Zellen charakterisiert (Bancroft et al., Pan Am. Health Organ. Sci. Publ. 375 (1979), 175-178; Hoke et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 43 (1990), 219-226). Das parentale Wildtyp-Virus wurde einmal in LLC-MK₂-Zellen einer Passage unterworfen, anschließend folgte die Analyse der Plaque-Morphologie. Genauer gesagt wurden die LLC-MK₂-Zellen in einem 25-cm²-Kolben mit 0,2 ml des zu testenden Denguevirus in seriellen 10-fachen Verdünnungen in Medium 199, das 2 % fötales Rinderserum enthielt, infiziert. Nach der Absorption für eine Stunde bei 35°C wurden zu jedem einschichtigen Zellrasen 7 ml einer Agarose-Überschichtung zugefügt, die 1 × Medium 199, 0,3 % Natriumbicarbonat, ½ × Eagle-Basalmedium-Vitamine und ½ × Eagle-Basalmedium-Aminosäuren, 10 % fötales Rinderserum, 0,5 % Agarose enthielt. Nach sechstägiger Inkubation bei 35°C wurden die Kolben mit 4,0 ml einer normalen Kochsalzlösung, die 0,5 % ME-Agarose und 1:7500 Neutralrot enthielt, ein zweites Mal überschichtet. Die Virus-Plaques erschienen innerhalb von 24 Stunden nach der Färbung. Die Plaque-Morphologie auf C6/36-Zellen wurde untersucht, um alle isolierten Virusmutanten zu charakterisieren. Für diesen Zweck wurden konfluente C6/36-Zellen in einem 75-cm²-Kolben mit 0,5 ml eines Virus beimpft, das in MEM plus 2 % fötalem Rinderserum seriell verdünnt worden war, und die Absorption ein bis zwei Stunden bei 35°C zugelassen. Die infizierten Zellen wurden sodann mit 20 ml pro Kolben einer Agarose-Überschichtung versetzt (1 × Hank's Balanced Salt Solution, 0,5 % Lactalbumin-Hydrolysat, 10 % fötales Rinderserum, 0,12 % Natriumbicarbonat, 0,75 % Seakem^TM GTG-Agarose). Die Kulturen wurden sieben Tage bei 35°C inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen mit 5 ml einer flüssigen Neutralrot-Färbelösung angefärbt, die aus 8,0 g/l NaCl, 0,4 g/l KCl, 1,0 g/l Glucose, 22,5 mg/l Na₂HCO₂ und 3,3 mg/l Neutralrot bestand. Nach drei bis fünf Stunden Inkubation bei 35°C wurde die überschüssige Färbelösung entfernt, und die Kulturen wurden wieder in den Inkubator gestellt. Die Plaques wurden im allgemeinen nach 24 bis 36 Stunden im Inkubator sichtbar.
Beispiel 16
Dengue-Typ 4-Virus-Mutanten, die eine Deletion im nicht-codierenden 3'-Bereich enthielten
Anhand des rekombinanten Dengue-DNA-Systems sind wir nun in der Lage, Denguevirus-Mutanten zu konstruieren, die Deletionen in den nicht-codierenden 5'- und 3'-Bereichen der Virus-RNA als auch dem codierenden Bereich enthalten. Deletionsmutanten würden den Vorteil bieten, dass sie weniger einer Reversion des Phänotyps unterworfen sind als Aminosäure-Substitutionsmutanten. Bei der gentechnischen Herstellung von Deletionsmutationen in dem nicht-codierenden 3'-Bereich des Dengue-Typ 4-Virusgenoms wurden Fortschritte gemacht. Wie andere durch Stechmücken übertragene Flaviviren enthält das Dengue-Typ 4-Virus Abschnitte von konservierten Sequenzen, die mit konservierte Sequenz 1 (CS-1) und konservierte Sequenz 2 (CS-2) bezeichnet sind, und eine mögliche terminate Stamm- und Schleifen-Struktur im nicht-codierenden 3'-Bereich.
Deletionen im Bereich von 30 bis 120 Nucleotiden wurden an verschiedenen Stellen in der nicht-codierenden 3'-Sequenz aus 385 Nucleotiden der Dengue-Typ 4-Virus-RNA erzeugt. Mutierte RNA, die von einem cDNA-Clon transkribiert wurde, dem Sequenzen in der CS-1-Region fehlten, bei dem jedoch die Stamm-und-Schleifen-Struktur erhalten geblieben war, erzeugten keine Virus-Nachkommenschaft; dies legt nahe, dass das Deletionsvirus aus den meisten anderen Deletionskonstrukten gewonnen worden war (13). Der Plaque-Test dieser Mutanten und die Wildtyp-Virus-Kontrolle erfolgte auf C6/36-Zellen.
Die Ergebnisse dieser Analyse zeigten, dass die meisten dieser Mutanten Plaques bildeten, die eine kleinere Größe im Bereich von 1,0 bis 0,3 cm aufwiesen, abhängig von der Lage und dem Ausmaß der Deletion (14 und 15). Die veränderte Plaque-Morphologie macht deutlich, dass diese Deletionsmutanten einen wachstumsgehemmten Phänotyp besassen. Diese Gruppe von Deletionsmutanten kann noch andere interessante und möglicherweise wichtige Eigenschaften besitzen, z.B. eine abgeschwächte Virulenz für Versuchstiere und Menschen.
Beispiel 17
Chimäre TBEV/DEN4-cDNA der vollen Länge und Herstellung von chimären Viren
Früher wurden schon subgenomische cDNA-Fragmente des TBEV (Stamm Sofjin) cloniert, und die Nucleotidsequenz wurde bestimmt (vgl. Pletnev et al., Virology (1990), vorstehend). Die Plasmide pGEM2-CME, enthaltend die Nucleotide (Nt.) 76 bis 1977, und pGEM2-ENS1, enthaltend die Nucleotide 966 bis 3672 der TBEV-Sequenz, wurden von Dr. E. Yu. Dobricova (Novosibirsk Institute of Bioorganic Chemistry, Russland) aus den Plasmiden p10, p4, p18, p2, p11 (Pletnev et al., vorstehend) bereitgestellt, indem die TBEV-Segmente an gemeinsamen Restriktionsenzym-Stellen verknüpft wurden. Die Plasmide DEN4-p5'-2 und -p5'-2 (ΔPst I, Xho I) und ein Derivat p5'-2 (ΔPst I, Xho I, Δ Hind III) (Bray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), vorstehend) wurden als das rekombinante cDNA-Konstrukt für die Substitution eines oder mehrerer TBEV-Gene anstelle der entsprechenden DEN4-Gene eingesetzt. Synthetische Oligonucleotide (Oligos) wurden als Negativ- oder Positiv-Strang-Primer für die Herstellung von doppelsträngigen DNAs durch Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Die Sequenzen für die Restriktionsenzym-Spaltung wurden an den Übergängen zwischen den Genen von TBEV und DEN4 oder in der Nähe davon durch PCR-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese eingeführt (17). Anfangs wurden sieben intermediäre chimäre Plasmide, die die angegebenen TBEV-Gene enthielten, konstruiert, und nach der Transformation von E. coli Stamm BD1528 wurden stabile TBEV/DEN4-cDNAs der vollen Länge identifiziert (beschrieben von Lai et al., (1991), vorstehend). Die Sequenzen, welche im Bereich der Übergänge zwischen den TBEV- und DEN4-Genen in jedem Plasmid lagen, wurden durch Nucleinsäure-Sequenzierung bestätigt, wobei Techniken eingesetzt wurden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind. Alle chimären Plasmide enthielten den SP6-Promotor, der stromaufwärts eines die Transkription einleitenden G-Restes positioniert war, gefolgt von einem A-Rest, der das erste DEN4-Nucleotid darstellt. Vor der in vitro-Transkription wurden die Plasmide an der einmaligen Asp 718-Schnittstelle unmittelbar folgend auf das 3'-Ende der DEN4-Sequenz linearisiert (unter Verwendung der durch Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), vorstehend, bereitgestellten Techniken). Die Gewinnung der chimären Viren und die anschließende Untersuchung ihrer Eigenschaften erfolgten in einer BL-3-Sicherheitsvorrichtung. Die Transkriptionsreaktionen wurden im wesentlichen durchgeführt, wie von Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), vorstehend, beschrieben. Vor der Transfektion wurde das Transkriptionsgemisch 15 Minuten bei 37°C mit 40 U/ml DNase I behandelt. Anschließend wurden die RNA-Transkripte für die Transfektion von semi-konfluenten LLC-MK₂-Affenzellen in Gegenwart von (i) Lipofectin^TM (Bethesda Research Laboratories, Inc.), wie früher von Lai et al., vorstehend, beschrieben, oder von (ii) N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N- trimethylammoniummethylsulfat (DOTAP) (Boehringer Mannheim) eingesetzt. Bei der Transfektion mit DOTAP enthielt das Transfektionsgemisch RNA-Transkripte (2 μg) in 40 μl eines 0,02 mM Hepes-Puffers, pH 7,05, und 12 μl DOTAP in 30 μl Hepes-Puffer. Nach zehnminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 2 ml Medium 199 zugefügt, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt; 0,5 ml des Gemisches wurden auf subkonfluenten Zellen in vier Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen verteilt. Zehn Tage später wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und auf eine Platte mit sechs Vertiefungen und auf Kammer-Objektträger überführt und zwei weitere Tage in Wachstumsmedium inkubiert. Die Zellen auf den Objektträgern wurden durch einen Immunfluoreszenz-Test (IFA) getestet, um das Vorliegen von DEN4- oder TBEV-Antigenen nachzuweisen, wobei eine 1:100-Verdünnung einer DEN4-spezifischen Hyperimmun-Maus-Aszitesflüssigkeit (HMAF), einer TBEV-spezifischen HMAF oder eines TBEV-spezifischen Kaninchenserums (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. A. S. Karavanov, Institute of Poliomyelitis, Moskau, Russland) eingesetzt wurde. Fluorescein-konjugiertes Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-Serum (Kirkegaard-Perry, Gatithersberg, Maryland) wurde in der gleichen Verdünnung verwendet. Wenn der IFA ergab, dass 50 bis 80 % der Zellen infiziert waren, wurden die Zellen in der Platte mit den sechs Vertiefungen mit Trypsin behandelt, mit einem zweifachen Überschuss von nicht-infizierten Zellen gemischt und in einem T₇₅-Kolben sechs Tage gezüchtet. Anschließend wurden die infizierten Zellen zusammen mit dem Medium geerntet, mit einem gleichen Volumen von fötalem Rinderserum gemischt und als Zellsuspension eingefroren. Das aufgetaute Zell-Lysat wurde sodann als Quelle der chimären Virus-Nachkommenschaft verwendet. Bei den Transfektionsexperimenten unter Verwendung von Lipofectin^TM oder DOTAP wurden nur TBE(ME)/DEN4 und TBE(CME)/DEN4 identifiziert. Die Virus-Nachkommenschaft wurde durch einen Immunfluoreszenz-Test identifiziert.
Um die Genomstruktur der chimären TBE(ME)/DEN4-Virus-Nachkommenschaft, genannt vTBE(ME)/DEN4, zu bestätigen, wurde die gesamte zelluläre RNA aus infizierten LLC-MK₂-Zellen durch Phenol-Extraktion isoliert, wobei die von Mackow et al., Virology 159 (1987), 217-228, bereitgestellten Techniken verwendet wurden. Das Oligo 5' GCTCCGGGGTGTAAGTCCATT 3' (SEQ ID NO: 16), das komplementär ist zu den Nucleotid (Nt.)-Positionen 5090 bis 5110 (vgl. Mackow et al., Virology 159 (1987), 217-228) der DEN4-Sequenz, wurde als Primer für die reverse Transkription eingesetzt. Einzelsträngige cDNA diente als Matrize und das Oligo 5' GACCGACAAGGACAGTTCCAAATCGGA 3' (SEQ ID NO: 17) an den Nt.-Positionen 18 bis 44 der DEN4-Sequenz wurde als der Positiv-Strang-Primer eingesetzt, und das Oligo 5' CTTTTTGGAACCATTGGTGACT 3' (SEQ ID NO: 18) an den Nt.-Positionen 2130 bis 2152 der TBEV-Sequenz diente als der Negativ-Strang-Primer für die PCR. Die das Denguevirus betreffenden Nucleotidpositionen finden sich in Zhao et al., Virology 155 (1986), 77-88, und die Nucleotidpositionen, die das durch Zecken übertragene Encephalitis-Virus betreffen, finden sich in Pletnev et al., Virology (1990), a.a.O. Das DNA-Produkt der PCR mit 2118 Basenpaaren (bp) wurde mit Pst I, Bgl II oder Eco RI gespalten, um das Vorliegen von Restriktionsenzym-Stellen zu bestätigen. Ebenso wurden auch das Oligo 5' GTCCGGCCGTCACCTGTGATT 3' (SEQ ID NO: 19) und das Oligo 5' TCACGGTGCACACATTTGGAAAAC 3' (SEQ ID NO: 20) (komplementär zu dem DEN4-Genom an den Nucleotiden 3459 bis 3480 bzw. komplementär zu dem negativen Strang des TBEV-Genoms an den Nucleotiden 967 bis 985) in der PCR eingesetzt. Das PCR-Produkt wurde mit Eco RI, Pst I, Bam HI, Xho I oder Sph I gespalten, um die DNA-Sequenz zu bestätigen. Das PCR-DNA-Produkt (2118 bp) aus dem vTBE(ME)/DEN4-Genom wurde mit den Restriktions-Endonucleaseenzymen Hind III und Bam HI gespalten. Das HindIII-BamHI-Subfragment (1922 bp) wurde durch PAGE gereinigt und an den komplementären Restriktionsstellen in den Vektor pGEM3 cloniert. Die Sequenz des Übergangs zwischen dem C-Gen von DEN4 (Nt. 300 bis 398) und dem präM-Gen von TBEV (Nt. 418 bis 460) wurde durch Nucleinsäuresequenzierung bestätigt. Die Oligonucleotide, die für die Konstruktion der chimären TBE/DEN4-DNA verwendet wurden, umfassten: TBEV-spezifische Oligos:
DEN4-spezifische Oligos:
Die SEQ ID NO: 23 wurde für die Herstellung des Übergangs der DEN4-nicht-codierenden 5'-Region und des TBEV-Capsids eingesetzt, wodurch eine Bgl II/Bam HI-Stelle hergestellt wurde. Die Sequenzen SEQ ID NO: 30 und 24 wurden für die Herstellung des DEN4-C/TBEV-präM-Übergangs verwendet, wodurch Pst I/Pst I-Stellen erzeugt wurden. Die Sequenzen SEQ ID NO: 28 und 21 wurden für die Herstellung des DEN4-präM/TBEV-E-Übergangs verwendet, wodurch Bam HI/Bgl II-Stellen erzeugt wurden. Der DEN4-NS1/TBEV-NS1-Übergang wurde unter Verwendung der SEQ ID NO: 26 hergestellt, wodurch Xho I/Xho I-Stellen erzeugt wurden. Der TBEV-E/DEN4-NS1-Übergang wurde unter Verwendung der SEQ ID NO: 25 hergestellt, wodurch Xho I/Xho I-Stellen erzeugt wurden. Der TBEV-C/DEN4-präM-Übergang wurde unter Verwendung der Sequenzen SEQ ID NO: 27 und 31 hergestellt, wodurch Pst I/Pst I-Stellen erzeugt wurden, und der TBEV-NS1/DEN4-NS2A-Übergang wurde unter Verwendung der Sequenzen SEQ ID NO: 22 und 29 hergestellt, wodurch Sph I/Sph I-Stellen erzeugt wurden. Die im Zusammenhang mit den Sequenzen angegebenen Zeichen + und – bezeichnen Stromaufwärts- bzw. Stromabwärts-Primer.
Beispiel 18
Proteinanalyse der chimären Virionen
Um die Proteine zu analysieren, die durch DEN4-v2A(Xho I), das Dengue-4-Virus-cDNA-Konstrukt der vollen Länge, oder vTBE(ME)/DEN4 produziert wurden, wurden konfluente LLC-MK₂-Zellen in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit dem entsprechenden Virus bei einem MOI-Wert von 1,0 infiziert. Sechs Tage nach der Infektion wurden die Zellen mit [³⁵S]-Methionin (60 μCi pro Vertiefung, spezifische Aktivität 600 Ci/mMol) in Methionin-freiem MEM (essentielles Eagle-Minimalmedium) vier Stunden markiert, wie von Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), a.a.O. beschrieben. Die Lysate wurden immungefällt mit 1) TBEV-spezifischer HMAF; 2) DEN4-spezifischer HMAF; 3) einem gegen TBEV-E hergestellten Kaninchenserum oder 4) einem Kaninchen-Antiserum, das für das DEN4-präM-, -E-, -NS3- oder -NS5-Protein spezifisch war. Die Immunpräzipitate wurden durch PAGE unter denaturierenden Bedingungen analysiert, wobei die von Laemmli, a.a.O., beschriebenen Techniken verwendet wurden.
Analyse der Proteinsynthese zu bestimmten Zeiten
Einschichtige Zellrasen von LLC-MK₂- oder C6/36-Zellen in T₂₅-Kolben wurden mit vTBE(ME)/DEN4 oder DEN4 (v2A(Xho I)) bei einem MOI-Wert von 1 infiziert. Nach einstündiger Adsorption bei 37°C wurde das Virus-Impfmaterial entfernt und frisches Medium zu den Zellen zugegeben. Die Analyse der Proteinsynthese erfolgte, indem die infizierten Zellen zu verschiedenen Zeiten (0, 4, 8, 24 und 48 Stunden) nach der Virusadsorption mit Methionin-freiem MEM 20 Minuten inkubiert und mit [³⁵S]-Methionin im gleichen Medium zwei Stunden markiert wurden. Das Lysat der markierten Zellen wurde mit DEN4-spezifischer HMAF gefällt und durch PAGE und Autoradiographie analysiert.
Beispiel 19
Wachstumsanalyse des chimären Konstrukts
Das parentale DEN4-Virus und seine chimären Viren wurden durch Plaque-Test auf LLC-MK₂-Affenzellen und Stechmücken-C6/36-Zellen charakterisiert. Die Techniken des Plaque-Tests sind in Bancroft et al., a.a.O., beschrieben. Die Wachstumsanalyse, wie in 19 dargestellt, wurde durchgeführt, indem die Menge des Virus, das in den mit DEN4 oder TBE(ME)/DEN4 infizierten LLC-MK₂- und C3/36-Kulturen vorlag, an verschiedenen Tagen nach der Infektion quantitativ bestimmt wurde. Nach der Infektion und Virusadsorption wurden die Kulturen geerntet und von jeder Kultur Proben für den Plaque-Test entnommen. Der sich mit der Zeit ändernde Virustiter in log (PBE/ml) ist als Wachstumskurve dargestellt.
Beispiel 20
Analyse der Virus-RNA-Synthese
Für die Analyse der Virus-RNA-Synthese wurden infizierte LLC-MK₂- oder C6/36-Zellen (etwa 10⁶ Zellen) zu verschiedenen Zeiten (0, 4, 8, 24 und 48 Stunden) nach der Virusadsorption entnommen, mit 0,5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, gewaschen und anschließend in einem Puffer lysiert, der 0,3 M NaAc, pH 5,2, 5 mM EDTA und 1 % SDS enthielt. Die Gesamt-RNA wurde aus dem Zell-Lysat und dem Medium durch Phenol-Extraktion isoliert, wobei die von Maniatis et al., a.a.O., beschriebenen Techniken verwendet wurden. Die RNA-Proben wurden denaturiert, indem sie in 6 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat), enthaltend 7,5 % (Gew./Vol.) Formaldehyd, bei 60°C 15 Minuten inkubiert wurden, und sodann an ein Nitrocellulose-Filter BA85 (Schleicher und Schuell) gebunden. Die Filter wurden eine Stunde bei 80°C gebacken und sodann eine Stunde bei 65°C in einer Lösung vorhybridisiert, die 6 × SSC, 3 × Denhardt-Lösung, 25 mM Na₂HPO₄ (pH 6,5), 0,1 % SDS und 25 μg/ml Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 65°C in der gleichen Lösung fortgesetzt, die eine nick-translatierte [³²P]-markierte pTBE(ME)/DEN4-DNA-Sonde (50 ng/ml, spezifische Aktivität 3,4 × 10⁸ CpM/μg) enthielt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter fünfmal in 0,1 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS, bei 65°C gewaschen, getrocknet und mit einem Röntgenfilm bei 70°C in Kontakt gebracht. Außerdem wurde die Radioaktivität der [³²P]-DNA, die mit der RNA hybridisiert war, in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen. Die aus pTBE(ME)/DEN4 in vitro hergestellten RNA-Transkripte wurden als positive Kontrolle eingesetzt.
Beispiel 21
Test der Schutzwirkung des Impfstoffpräparats und Neurovirulenz der chimären Viren
vTBE(ME)/DEN4 und das parentale Denguevirus wurden auf Neurovirulenz getestet, indem Mäuse über intracerebrale (ic), intradermale (id) oder intraperitoneale (ip) Routen geimpft wurden. Drei Tage alte gesäugte BALB/c-Mäuse erhielten ic-Injektionen mit einer Dosis von 10² PBE Virus in 0,02 ml von MEM/0,25 % menschlichem Serumalbumin. Sechs Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse erhielten (i) ic-Injektionen mit einer Dosis von 10³ PBE des Virus, verdünnt wie vorstehend, in einem Volumen von 0,03 ml, oder (ii) id- oder ip-Injektionen mit 10³ PBE eines Virus, verdünnt in einem Volumen von 0,10 ml. Die Mäuse wurden 21 Tage beobachtet, ob Symptome einer Encephalitis auftraten oder ob sie verendeten, und von den überlebenden erwachsenen Mäusen wurde 20 Tage nach der Infektion Blut abgenommen, um die Antikörperantworten auf das eingeimpfte Virus zu testen. Die überlebenden Mäuse wurden am Tag 21 mit 10³ LD₅₀ TBEV (Stamm Sofjin) in einer BL-4-Sicherheitsvorrichtung belastungsinfiziert.
Beispiel 22
Konstruktion und Sequenzierung von chimären Virusmutanten
Die Mutationen wurden in das TBEV(ME)/DEN4-Konstrukt durch ortsspezifische Mutagenese eingeführt, wobei das herkömmliche Oligo-PCR-Verfahren verwendet wurde, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt ist (vgl. die nachstehenden Oligo-Sequenzen). Die resultierenden Konstrukte wurden durch die in Beispiel 17 beschriebenen Verfahren in LLC-MK₂-Zellen transfiziert. Die aus den mutagenisierten Konstrukten gewonnene Virus-Nachkommenschaft wurde auf Veränderungen der Plaque-Morphologie untersucht, wobei die in Beispiel 19 beschriebenen Techniken eingesetzt wurden. Strategische Mutationen wurden in das TBE(ME)/DEN4-cDNA-Konstrukt der vollen Länge eingeführt, um systematisch Modifikationen in vorher festgelegten Regionen des chimären Virusgenoms zu erhalten. Sechs mutierte Chimären wurden aus den transfizierten LLC-MK₂-Zellen gewonnen, und die Virus-Nachkommenschaft wurde auf ihre Fähigkeit analysiert, bei Mäusen Neurovirulenz zu induzieren. Außerdem wurden weitere virale Wachstumseigenschaften bei den gezüchteten Zellen untersucht. Wie in 23 dargestellt, konnte für vier Virusmutanten, bei denen die Glykosylierungsstelle im präM-, E- oder NS1-Glykoprotein aufgehoben worden war, vorausgesagt werden, dass sie an der bezeichneten Stelle einen Glykosylierungsdefekt aufweisen. Die Mutante *präM/M^– enthielt eine defekte Schnittstellen-Sequenz am intergenen Übergang zwischen präM und M. Die Mutante *E enthielt zwei Aminosäure-Substitutionen, wobei diese Substitutionen ausgewählt wurden, weil diese Aminosäuren nur in Stechmücken-übertragenen Flaviviren vorkommen.
Die Mutationen wurden in das TBE(ME)/DEN4-Konstrukt durch ortsspezifische Mutagenese gemäß dem herkömmlichen Oligo-PCR-Verfahren eingeführt. Kurz gesagt wurden ein Positiv-Strang-Oligo und sein komplementäres Negativ-Strang-Oligo, die jeweils die mutierte Sequenz und eine einmalige Restriktionsenzym-Stelle enthielten, zusammen mit dem Oligo des entsprechenden Stromabwärts- oder Stromaufwärts-Primer-Paars in einer PCR eingesetzt. Die beiden PCR-Produkte wurden an der gemeinsamen einmaligen Restriktionsenzym-Stelle verknüpft. Auf diese Weise wurde das resultierende DNA-Fragment, das die mutierte Sequenz enthielt, zum Austausch gegen das entsprechende Wildtyp-DNA-Fragment in der TBE(ME)/DEN4-cDNA der vollen Länge hergestellt. Im folgenden sind spezifische mutierte chimäre DNAs und Oligonucleotide zusammengestellt, die bei der Konstruktion verwendet wurden.
Beispiel 23
Analyse der Neurovirulenz in Mäusen
Außerdem wurden die mutierten chimären Viruspräparate in Mäuse ic geimpft und mit DEN4, TBE(ME)/DEN4 und TBE(CME)/DEN4 verglichen, wobei die in Beispiel 21 beschriebenen Techniken verwendet wurden. Die letale Dosis, die erforderlich war, um die Hälfte der getesteten Tiere zu töten, wurde für jedes der mutierten chimären Viren verglichen. Sechs Wochen alte BALB/c-Mäuse in Gruppen zu acht Tieren erhielten intracerebrale Impfungen mit den verschiedenen mutierten Chimären TBE(ME)/DEN4, TBE(CME)/DEN4 oder DEN4 in einer Dosis von 1000, 100, 10, 1 und 0,1 PBE. Die infizierten Mäuse wurde 31 Tage beobachtet, ob Zeichen einer Encephalitis auftraten oder ob sie verendeten. Die 50 %-Letaldosis (LD₅₀) wurde für jedes Virus berechnet und der Wert als Basis für die Maus-Neurovirulenz verwendet. Wie aus 24 ersichtlich, lag der LD₅₀ des parentalen TBE(ME)/DEN4-Virus etwa bei 10 PBE. Dieses Niveau des LD₅₀-Werts wurde auch bei verschiedenen mutierten Viren beobachtet. Wenigstens zwei Mutanten, *NS1(1)-Glc^– und *präM/M^–, zeigten einen LD₅₀-Wert von mehr als 100 PBE, dies weist darauf hin, dass eine mehr als 100-fache Verminderung der Neurovirulenz bei Mäusen vorlag. Dieses Ergebnis macht deutlich, dass die NS1(1)-Glc^–- oder die präM/M^–-Mutation in dem chimären Virusgenom jeweils eine Abschwächung der Maus-Neurovirulenz bewirken kann. Diese Virusmutanten sollten getrennt oder gemeinsam nützlich sein für eine weitere Untersuchung ihrer Eignung als Impfstoffkandidaten.
Beispiel 24
Test von optimierten chimären Konstrukten in Primaten
Es wurde festgestellt, dass sub-humane Primaten, nicht jedoch andere Tiere, mit dem Denguevirus leicht über die periphere Route infiziert werden können (Simmons et al., Philipp. J. Sci. 44 (1931), 1-247; und Rosen, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7 (1958), 406-410). Die Infektion von Affen stellt das Versuchssystem dar, das der Denguevirus-Infektion des Menschen am nächsten kommt. Die Antwort von Rhesusaffen auf eine Dengue-Infektion gleicht der von Menschen, insofern, daß eine vier bis sechs Tage dauernde Virämie auftritt, jedoch entwickeln niedrigere Primaten keine klinischen Dengue-Symptome. Die Aufgaben der Studien mit Dengue- oder anderen Flaviviren an Affen bestehen darin, (1) die Immunogenität von verschiedenen Impfstoff-Kandidaten zu testen; (2) die Infektiosität und Virulenz (abgeschwächter Phänotyp) der Kandidaten für Lebend-Denguevirus- oder chimären Denguevirus-Impfstoffe zu testen, was durch die Dauer der Virämie in Tagen und dem höchsten Virustiter in PBE/ml gemessen werden kann; und (3) die Schutzwirkung der vorstehend erwähnten Impfstoffe bei einer Belastungsinfektion mit einem homotypischen Denguevirus oder einem anderen Flavivirus der gleichen Chimärvirus-Spezifität zu bestimmen.

(1) Impfung: Jeder Rhesusaffe wird mit insgesamt 3 × 10⁶ PBE eines Virus geimpft, das in essentiellem Eagle-Minimalmedium/0,25 % menschlichem Serumalbumin verdünnt ist. Normalerweise werden zwei subkutane Dosen an anästhesierte Tiere verabreicht.
(2) Blutentnahme: Nach der Impfung mit dem Denguevirus oder dem chimären Denguevirus werden zwei Wochen lang täglich Blutproben zu 3,0 ml und nach drei, vier, sechs und acht Wochen zu 5,0 ml entnommen.
(3) Belastungsinfektion mit dem Denguevirus oder einem anderen Flavivirus: Wenn die Virusbelastungsinfektion zur Bewertung der Schutzwirkung als ausreichend erachtet wird, erhalten die Affen subkutane Impfungen mit einem nicht-abgeschwächten Virus mit 10⁵ PBE/Dosis in einem Volumen von 0,5 ml in den oberen Armbereich.
(4) Labortests: Mit den Serumproben wird folgendes bestimmt: (a) die Dauer der Virämie durch direkten Virus-Plaque-Test; (b) der Titer der für Denguevirus oder andere Flaviviren spezifischen Antikörper durch Radio-Immunfällung und ELISA; und (c) der Titer der neutralisierenden Antikörper durch den Plaquereduktions-Neutralisierungs-Test, wobei alle Tests dem Fachmann auf dem Gebiet der Impfstoff-Entwicklung bekannt sind.

Hier wurden besondere Ausführungsformen der Erfindung ausführlich beschrieben, für den Fachmann ist es jedoch offensichtlich, dass diese Ausführungsformen nur als Beispiel dienen und den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken sollen, der in den folgenden Patentansprüchen festgelegt ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinantes DNA-Konstrukt, das stabile, die volle Länge umfassende infektiöse Dengue-Typ 4-virale RNA codiert, umfassend mindestens eine Mutation, die i) die Glykosylierung des Prämembranproteins, Hüllproteins oder NS1(1)-Proteins reduziert, ii) die Spaltung des Prämembranproteins zu Membranprotein reduziert, iii) eine Substitution an einer Stelle ist, die Glycin codiert, wobei die Stelle an Position +1 ist, die der Polyprotein-NS1-NS2A-Spaltstelle folgt, oder iv) eine Substitution in einer Sequenz ist, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren an einer C-terminalen Spaltstelle von NS1 codiert, wobei diese Mutation zu einer verminderten Virulenz führt.
Chimäres Virus, das ein Genom hat, umfassend eine Region der Nucleinsäure, die operativ die Strukturproteine von einem Dengue-Subtyp und Nichtstrukturproteine von einem anderen Dengue-Subtyp codiert, wobei dieses Genom mindestens eine Mutation umfaßt, die i) die Glykosylierung des Prämembranproteins, Hüllproteins oder NS1(1)-Proteins reduziert, ii) die Spaltung des Prämembranproteins zu Membranprotein reduziert, iii) eine Substitution an einer Stelle ist, die Glycin codiert, wobei die Stelle an Position +1 ist, die der Polyprotein-NS1-NS2A-Spaltstelle folgt, oder iv) eine Substitution in einer Sequenz ist, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren an einer C-terminalen Spaltstelle von NS1 codiert, wobei diese Mutation zu einer verminderten Virulenz führt.
Verfahren zur Herstellung eines Immunisierungsprodukts gegen ein erstes Flavivirus, umfassend: Bereitstellen eines DNA-Konstruktes, das operativ Prämembranprotein und Hüllprotein dieses ersten Flavivirus und Capsidprotein und Nichtstrukturprotein eines zweiten Flavivirus codiert; wobei dieses zweite Flavivirus ein Dengue-Virus ist, das ein Genom hat, das mindestens eine Mutation umfaßt, die i) die Glykosylierung des Prämembranproteins, Hüllproteins oder NS1(1)-Proteins reduziert, ii) die Spaltung des Prämembranproteins zu Membranprotein reduziert, iii) eine Substitution an einer Stelle ist, die Glycin codiert, wobei die Stelle an Position +1 ist, die der Polyprotein-NS1-NS2A-Spaltstelle folgt, oder iv) eine Substitution in einer Sequenz ist, die eine oder mehrere von acht Aminosäuren an einer C-terminalen Spaltstelle von NS1 codiert, wobei diese Mutation zu einer verminderten Virulenz führt; und wobei das erste Flavivirus ein Nicht-Dengue Flavivirus ist; Herstellen von infektiösen RNA-Transkripten von diesem DNA-Konstrukt; Einbringen der RNA-Transkripte in eine Zelle; Exprimieren der RNA-Transkripte in dieser Zelle, um das Virus herzustellen; Ernten des Virus aus diesen Zellen; und Testen des Virus in einem nicht-menschlichen Vertebraten, wobei das Immunisierungsprodukt gegen dieses erste Flavivirus hergestellt wird.