JP2002325593A - キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス - Google Patents

キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ワクチンの調製に用いるためのあるキメラウイ
ルス。 【解決手段】本発明は、ワクチンの調製に用いるため
の、あるフラビウイルスからの少なくとも１つの構造タ
ンパク質をコード化する核酸配列と他のフラビウイルス
からの非構造タンパク質をコード化する核酸配列とを含
むゲノムを有するキメラウイルスを含む。このゲノム
は、好ましくはウイルス毒性を縮減する変異をウイルス
ゲノム内に有し、特に好ましい実施例においては、これ
らのワクチンはデングウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス
及び日本脳炎ウイルスのようなフラビウイルスから導か
れる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換え活性キメラ
フラビウイルスに関し、さらに、デング熱ウイルスと、
ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）を含むその他のフラ
ビウイルスに対するワクチンに関する。本発明は、さら
に、組換え４型デング熱ウイルスの生成を導くようにＲ
ＮＡ転写物をコードするｃＤＮＡ配列と、組換え突然変
異４型デング熱ウイルスキメラデング熱ウイルスと、組
換えＤＮＡ断片を作製して突然変異を組み込んだキメラ
デング熱ウイルスと、それらを用いて形質転換した細胞
に関する。
【０００２】
【従来の技術】フラビウイルス科（Flaviviridae）に
は、約６０個の包被正鎖ＲＮＡウイルスが含まれ、その
大半は昆虫により媒介される。この科に属する多数のウ
イルスは、世界各地で重大な公衆衛生上の問題を起こし
ている（Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ（１９８６）「トガウイ
ルス科（Togaviridae）およびフラビウイルス科」Ｓ．
Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ他編、３７５〜４４０頁、プレ
ナム・プレス社、ニューヨーク）。これまでに配列決定
されたすべてのフラビウイルスのゲノムは、同一の遺伝
子順序を有している。すなわち、５’−Ｃ−ｐｒｅＭ−
Ｅ−ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−
ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５−３’であり、最初の３つの遺伝子
は、構造タンパク質であるカプシド（Ｃ）と、プレメン
ブレンタンパク質（ｐｒｅＭ）と、エンベロープタンパ
ク質（Ｅ）をコードしている。デング熱は、蚊媒介ウイ
ルス性疾病であり、世界各地の熱帯および亜熱帯地域で
発生する。デング熱ウイルス亜群［ｓｕｂｇｒｏｕｐ］
は、フラビウイルス科の他のウイルスのどれよりもヒト
疾病を起こす。デング熱は、発熱、発疹、激しい頭痛、
関節痛を特徴としている。その死亡率は低い。しかしな
がら、過去数十年間にわたり、出血およびショックを特
徴とする、より重症のデング熱（デング出血熱／デング
熱ショック症候群；ＤＨＦ／ＤＳＳ）が、子供および若
者に増加している。ＤＨＦ／ＤＳＳは、ある血清型［ｓ
ｅｒｏｔｙｐｅ］のデング熱ウイルスにすでに感染した
者が別のデング熱ウイルスに感染した際に、もっとも頻
繁に発生する。このことは、ウイルス複製の免疫強化
が、より重症の疾病の病因においてある役割を果たして
いることを示唆している（Ｓ．Ｂ．Ｈａｌｓｔｅａｄ
（１９８８）サイエンス第２３９巻４７６〜４８１
頁）。デング熱伝染は、媒介となる蚊種が豊富な熱帯お
よび亜熱帯の多くの地域において、大きな公衆衛生問題
となっている。４０年間もの熱心な研究にもかかわら
ず、デング熱ウイルス疾病のための安全で有効なワクチ
ンはできていない。デング熱ウイルスは、ＷＨＯによ
り、研究促進およびワクチン開発の高優先度目標として
指定された。デング熱ウイルスは、１９４４年における
単離の後まもなく、マウスの脳において繰り返し継代培
養［ｐａｓｓａｇｅ］され、その結果、マウス神経毒性
［ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｔ］突然変異体が選抜され
た（Ａ．Ｂ．Ｓａｂｉｎ（１９５２）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔ
ｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第１巻３０〜５０頁）。興味
深いことに、被験希望者において実施された研究によ
り、１型または２型デング熱ウイルスの３つの株のマウ
ス脳適合神経毒性突然変異体は弱毒化されてはいるが、
なお、ヒトについて免疫原性をもつことが示された
（Ａ．Ｂ．Ｓａｂｉｎ（１９５２）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒ
ｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第１巻３０〜５０頁、Ａ．Ｂ．
Ｓａｂｉｎ（１９５５）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅ
ｄ．Ｈｙｇ．第４巻１９８〜２０７頁、Ａ．Ｂ．Ｓａｂ
ｉｎ（１９５５）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈ
ｙｇ．第４巻１９８〜２０７頁、Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓ
ｉｎｇｅｒ他（１９５６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第７７
巻３５２〜３６４頁、Ｃ．Ｌ．Ｗｉｓｓｅｍａｎ他（１
９６３）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．第１２巻６
２０〜６２３頁）。しかしながら、これらの突然変異体
は、ワクチン株候補としてはそれ以上開発されなかっ
た。これは、ワクチン製剤中のマウス脳抗原に対する懸
念の故である。このとき以来、（ｉ）小型プラーク（溶
菌斑）表現型を示した、および／または（ii）温度感受
性であった、および／または（iii ）人工的な宿主から
由来する細胞培養に適合した（すなわち宿主域突然変
異）ウイルス突然変異が、弱毒化生菌ウイルスワクチン
に包含させるための候補として選抜され評価されてきた
（Ｖ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ他（１９７７）Ｉｎｆｅ
ｃ．Ｉｍｍｕｎ．第１８巻１５１〜１５６頁；Ｃ．Ｈ．
Ｈｏｋｅ他（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．
Ｈｙｇ．第４３巻２１９〜２２６頁；Ｎ．Ｂｈａｍａｒ
ａｐｒａｖａｔｉ他（１９８７）Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ第６
５巻１８９〜１９５頁）。しかしながら、２５年間のこ
のような努力にもかかわらず、安全で効果的なデング熱
ワクチンは、一般用としてはまだ得られていない。不活
化全デング熱ウイルスワクチンは、免疫原性が不十分で
あることが証明されている。細胞培養において連続継代
培養により弱毒化された生菌ウイルスワクチンは、弱毒
化による遺伝子的不安定性や免疫原性の欠乏という難点
がある。本発明は、キメラデング熱ウイルスおよびキメ
ラフラビウイルスワクチンを提供することにより、技術
的発展をもたらすものである。４つの血清型のデング熱
ウイルス（１型〜４型）は、血清型特異的モノクローナ
ル抗体を用いたプラーク減縮中和法により、および、ポ
リクローナル血清を用いたやや特異性の低い試験により
区別することができる（Ｗ．Ｍ．Ｂａｎｋｃｒｏｆｔ他
（１９７９）Ｐａｎ Ａｍ．Ｈｌｔｈ．Ｏｒｇ．Ｓｃ
ｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁；Ｅ．Ａ．
Ｈｅｎｃｈａｌ他（１９８２）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍ
ｅｄ．Ｈｙｇ．第３１巻５４８〜５５５頁）。血清型の
存在は、ヒト被験希望者における初期の研究において最
初に発見され、１つの血清型のデング熱に感染すると耐
久性のある同型免疫が誘導されるものの異型免疫は３〜
５ケ月しか持続しないことが証明された（Ａ．Ｂ．Ｓａ
ｂｉｎ（１９５２）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．
Ｈｙｇ．第１巻３０〜５０頁）。デング熱ウイルス一般
に対して広範囲の免疫を誘導するために４つの血清型す
べてを含む効果的なデング熱ワクチンがあれば、ＤＨＦ
／ＤＳＳの発生を妨害することができるだろう。３型お
よび４型デング熱ウイルスおよびマウス神経毒性ニュー
ギニアＣ型を含む２型ウイルスの数株については、完全
なヌクレオチド配列が決定されている。しかしながら、
１型ウイルスゲノムについては、５’部分だけが配列決
定されているにすぎない（Ｅ．Ｍａｃｋｏｗ他（１９８
７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁；
Ｂ．Ｚｈａｏ他（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５
巻７７〜８８頁；Ｋ．ＯｓａｔｏｍｉおよびＨ．Ｓｕｍ
ｉｙｏｓｈｉ（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１７６巻
６４３〜６４７頁；Ａ．Ｉｒｉｅ他（１９８９）Ｇｅｎ
ｅ第７５巻１９７〜２１１頁；Ｐ．Ｗ．Ｍａｓｏｎ他
（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１６１巻２６２〜２６
７頁；Ｙ．Ｓ．Ｈａｈｎ他（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ第１６２巻１６７〜１８０頁）。これらの研究の成果
は、デング熱ウイルスの４つの血清型が共通のゲノム構
成をもつことを示している。４型デング熱のカリブ株８
１４６６９のゲノムは１０６４６個のヌクレオチドを含
むことがわかっている（Ｅ．Ｍａｃｋｏｗ他（１９８
７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２２８頁；
Ｂ．Ｚｈａｏ他（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５
巻７７〜８８頁）。５’末端における最初の１０１個の
ヌクレオチドおよび３’末端における最後の３８４個は
コードしていない。残りの配列は、３３８６個のアミノ
酸ポリタンパク質をコードしており、これには、３つの
構造タンパク質、すなわち、カプシド（Ｃ）、プレメン
ブレン（ｐｒｅ−Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）がそのＮ末
端に含まれ、７個の非構造タンパク質が上述した順序で
続いている。これは、これまでに識別されたすべてのフ
ラビウイルスゲノムに共通している。ポリタンパク質
は、細胞信号ペプチダーゼにより、および、ウイルスプ
ロテアーゼにより、１１個以上のウイルスタンパク質を
生じるようにプロセス（Ｌ．Ｍａｒｋｏｆｆ（１９８
９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６３巻３３４５〜３３５２頁；
Ｂ．Ｆａｌｇｏｕｔ他（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第
６３巻１８５２〜１８６０頁；Ｂ．Ｆａｌｇｏｕｔ他
（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６５巻２４６７〜２４
７６頁；Ｈ．ＨｏｒｉおよびＣ．Ｊ．Ｌａｉ（１９９
０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４巻４５７３〜４５７７
頁）。我々はすでに、感染性ＲＮＡの転写のための鋳型
として用いることのできる完全長デング熱ウイルスｃＤ
ＮＡを構築した。我々は、安定的にクローンされた完全
長デング熱ウイルスｃＤＮＡを得、ＤＮＡ鋳型から派生
した（インビトロ）試験管内ＲＮＡ転写物が培養中の細
胞に対して感染性をもつことがわかった。しかしなが
ら、この感染性構築物と、そこから生成された感染性Ｒ
ＮＡ転写物は病原性である。さらに、これまでに生成さ
れた弱毒化デング熱ウイルスは遺伝学的に不安定で、時
間がたつと病原性形態に逆戻りする可能性を有してい
る。それでも、弱毒化ウイルスは望ましい。その理由
は、弱毒化ウイルスにより長期間持続する免疫が得られ
ることが一般に知られているからである。したがって、
この構築物またはキメラ構築物を病原性の低いウイルス
の産生を導くように改変すれば、弱毒化フラビウイルス
ワクチン技術において相当の進歩となるだろう。したが
って、我々は、ここに開示するとおり、ｃＤＮＡの３’
非コード領域において一連の欠失を構築し、活性デング
熱ウイルス突然変異体を回収して増殖特性を分析した。
フラビウイルス科のその他のウイルスもやはり病原性で
ある。その例としては、ダニ媒介脳炎ウイルスおよび日
本脳炎ウイルスがあげられる。弱毒化デング熱ウイルス
ワクチンのように、弱毒化ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢ
ＥＶ）ウイルスは、遺伝学的に不安定で免疫性に乏しい
傾向があった。したがって、他の弱毒化フラビウイルス
ワクチンも、技術におけるかなりの前進となるであろ
う。すなわち、本発明は、さらに、他のフラビウイルス
に対するワクチン製造のための遺伝子操作およびキメラ
ウイルス開発のフレームワークとして、デング熱ウイル
スや別のフラビウイルスの改変完全長組換えｃＤＮＡ構
築物を採用する。ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）
は、ダニによってのみ媒介され、血清学的に区別できる
２つのサブタイプに分類される。ロシアのシベリア地方
と極東地方に優勢な東部サブタイプ（プロトタイプ株Ｓ
ｏｆｊｉｎ）と、ヨーロッパ東部および中央部に見られ
る西部サブタイプ（プロトタイプ株Ｎｅｕｄｏｒｆｌ）
である。ＴＢＥＶは、死亡率が１〜３０％の重い脳炎を
引き起こす。ＴＢＥＶの詳細についてはＣａｌｉｓｈｅ
ｒ他（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第７０巻３７〜４３
頁）を参照されたい。現在、ＴＢＥＶのホルマリン不活
化により製造された試験的ＴＢＥワクチンが入手できる
が、このワクチンはいくつかの制約を有している。たと
えば、このワクチンの免疫原性は十分ではないため、防
御免疫反応を生じさせるためには繰返し接種が必要であ
る。ワクチンに対する抗体反応があった場合でも、この
ワクチンは、個体群の２０％において、ウイルスに対す
る防御反応を提供することができない。したがって、よ
り改良されたＴＢＥＶワクチンが必要とされている。
【０００３】（発明の概要）一態様において、本発明
は、少なくとも２つのフラビウイルスから由来した核酸
を含む、組換えＤＮＡ構築物を提供する。この構築物
は、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）からの２つ以下
の構造タンパク質を作動可能（operably）にコード化す
る核酸領域を含む。この領域は、ＴＢＥＶ以外のフラビ
ウイルスからの構造タンパク質を作動可能にコード化す
る核酸領域に結合する。好ましくは、この構築物は、ダ
ニ媒介脳炎ウイルスからの２つ以下の構造タンパク質を
作動可能にコード化する核酸領域に結合する、フラビウ
イルスカプシドタンパク質を作動可能にコード化する核
酸領域を含む。カプシドタンパク質および非構造タンパ
ク質をコード化する核酸領域は、好ましくは、４型デン
グ熱ウイルスなどのデング熱ウイルス由来のものであ
る。好ましい形態において、この構築物は、少なくとも
２つのフラビウイルスに由来する核酸内に、少なくとも
１つの突然変異を含む。この好ましい形態の一実施例に
おいて、突然変異は、ＮＳ１（１）タンパク質グリコシ
ル化を排除する。この形態の別の実施例において、突然
変異は、成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産
生を妨害する。突然変異がウイルス増殖速度に影響する
ことが好ましい。さらに、本発明は、これらの組換えＤ
ＮＡ構築物に対応するＲＮＡ転写物を含む。本発明の別
の態様において、フラビウイルス由来のゲノムを有する
キメラウイルスが得られる。このキメラウイルスは、ダ
ニ媒介脳炎ウイルスからの２つ以下の構造タンパク質を
コード化する核酸領域と、他のフラビウイルスからの非
構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含む。好ま
しくは、このウイルスは、フラビウイルスファミリーの
他のメンバーからのカプシドタンパク質をコード化する
核酸領域を含む。ダニ媒介脳炎ウイルスからの核酸は、
プレメンブレンおよび／またはエンベロープタンパク質
など、多数のタンパク質のどれでもコード化することが
できる。他のフラビウイルスからの非構造タンパク質を
コード化する核酸は、好ましくは、４型デング熱ウイル
スなどのデング熱ウイルスである。一実施例において、
本発明の本態様のキメラウイルスは、核酸内に少なくと
も１つの突然変異を含む。この突然変異は、ＮＳ１
（１）タンパク質グリコシル化を排除する突然変異や、
成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害
する突然変異など、多数の形態のいずれをとってもよ
い。突然変異がウイルス増殖速度に影響することが好ま
しい。本発明の別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウイル
スのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質をコ
ード化する核酸領域と、別のフラビウイルスからのカプ
シドタンパク質をコード化する核酸領域と、同じフラビ
ウイルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領
域とを含むキメラウイルスが得られる。フラビウイルス
は、たとえば、４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウ
イルスである。本発明の本態様において、好ましい形態
のキメラウイルスは、ダニ媒介脳炎ウイルスのプレメン
ブレンおよびエンベロープタンパク質をコード化する核
酸領域内に少なくとも１つの突然変異を含む。突然変異
は、成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を
妨害するものを用いることができる。別の好ましい形態
において、キメラウイルスは、他のフラビウイルスから
の核酸領域内に少なくとも１つの突然変異を含む。この
突然変異は、ＮＳ１（１）タンパク質グリコシル化を排
除するものを用いることができる。さらに別の態様にお
いて、本発明によれば、脊椎動物において防御免疫反応
を生起することのできる、本発明のキメラウイルスから
なるダニ媒介脳炎に対するヒト用ワクチンが得られる。
すなわち、本発明は、さらに、フラビウイルスに対する
ヒト用ワクチンを製造する方法を含み、フラビウイルス
からのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質
と、デング熱ウイルスからのカプシドおよび非構造タン
パク質とをコード化することのできるＤＮＡ構築物を作
製し、上記ＤＮＡ構築物から感染性ＲＮＡ転写物を生成
し、上記ＲＮＡ転写物を細胞に導入し、上記細胞内でＲ
ＮＡ転写物を発現させ、上記細胞からウイルスを収穫
し、上記ウイルスを脊椎動物において試験し、上記ウイ
ルスをヒトに接種することを含む。本発明の好ましい態
様によれば、日本脳炎ウイルスのプレメンブレンおよび
エンベロープタンパク質をコード化する核酸領域と、別
のフラビウイルスからのカプシドタンパク質をコード化
する核酸領域と、デング熱ウイルスなどの、同じフラビ
ウイルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領
域とを含むキメラウイルスが得られる。本発明の別の態
様によれば、ＲＮＡゲノムを有するキメラウイルスが得
られる。このゲノムは、４型デング熱ウイルスの非構造
タンパク質を作動可能（operatively）にコード化する
核酸領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイ
ルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳
炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、または別のフラビ
ウイルスの構造タンパク質を作動可能にコード化する核
酸領域とを含む。本発明の一実施例において、キメラウ
イルスのゲノムは、４型デング熱ウイルス構造タンパク
質を作動可能にコード化する核酸を実質的にもっていな
い。このキメラウイルスの好ましい実施例は、ｐ２Ａ
（Ｄ１ＷＰ）またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）ＲＮＡを含
む。好ましくは、キメラウイルスは、１型デング熱ウイ
ルス、２型デング熱ウイルス、または３型デング熱ウイ
ルスの非構造タンパク質をコード化することのできる核
酸領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイル
ス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄
熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイル
ス、または別のフラビウイルスの構造タンパク質をコー
ド化することのできる核酸領域とを含む。非構造タンパ
ク質を作動可能にコード化することのできる核酸は、好
ましくは、非構造タンパク質を作動可能にコード化する
ことのできる核酸の領域とは異なるウイルス由来のもの
である。本発明の別の態様によれば、ＲＮＡゲノムを有
するキメラウイルスが得られる。このゲノムは、黄熱病
ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、
または別のフラビウイルスの非構造タンパク質を作動可
能にコード化する核酸領域と、１型デング熱ウイルス、
２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デ
ング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、
ダニ媒介脳炎ウイルス、または別のフラビウイルスの構
造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域とを含
む。構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸の領
域は、好ましくは、非構造タンパク質を作動可能にコー
ド化する核酸の領域とは異なるウイルス由来のものであ
る。本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物におい
てウイルスに対する防御免疫反応を生起することのでき
るワクチンが得られる。このワクチンは、安全でかつ免
疫学的に有効な量の本発明のウイルスのいずれかと、薬
学的および免疫学的に受容可能な担体とを含んでいる。
本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物においてウ
イルスに対する防御免疫反応を生起することのできる別
のワクチンが得られる。本発明の本態様において、この
ワクチンは、以下のウイルスの安全でかつ免疫学的に有
効な量を含む。ａ）４型デング熱ウイルスの非構造タン
パク質をコード化する核酸領域と、１型デング熱ウイル
スの構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むゲ
ノムをもつキメラウイルス、ｂ）４型デング熱ウイルス
の非構造タンパク質をコード化する核酸領域と、２型デ
ング熱ウイルスの構造タンパク質をコード化する核酸領
域とを含むゲノムをもつキメラウイルス、ｃ）４型デン
グ熱ウイルスの非構造タンパク質をコード化する核酸領
域と、３型デング熱ウイルスの構造タンパク質をコード
化する核酸領域とを含むゲノムをもつキメラウイルス、
ｄ）弱毒化４型デング熱ウイルス。本発明のさらなる態
様によれば、４型デング熱ウイルスの非構造領域と、１
型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デン
グ熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダ
ニ媒介脳炎ウイルス、および別のフラビウイルスのうち
の１つからの構造領域とを含むＤＮＡセグメントが得ら
れる。本発明の好ましい実施例において、ＤＮＡセグメ
ントは、構造および非構造領域に作動可能に結合するプ
ロモーターを含む。別の好ましい実施例において、ＤＮ
Ａセグメントは、プロモーターとしてＳＰ６またはＴ７
プロモーターを含む。さらに別の実施例において、ＤＮ
Ａセグメントはｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）またはｐ２Ａ（Ｄ２
ＮＧＣ）である。本発明の他のいくつかの態様によれ
ば、他のキメラＤＮＡセグメントが得られる。本発明の
これらの態様によるＤＮＡセグメントは、１型デング熱
ウイルス、２型デング熱ウイルス、または３型デング熱
ウイルスの非構造領域を含んでいる。これらのＤＮＡセ
グメントは、さらに、以下のウイルスのうちの１つから
の構造領域を含んでいる。１型デング熱ウイルス、２型
デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング
熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ
媒介脳炎ウイルス、フラビウイルス。ただし、構造領域
と非構造領域は同一ウイルス由来ではないことを条件と
する。本発明のさらなる態様によれば、ＤＮＡセグメン
トは、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳
炎ウイルス、および別のフラビウイルスのうちの１つか
らの非構造領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング
熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、
日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および別の
フラビウイルスのうちの１つからの構造領域とを含み、
構造領域は非構造領域とは異なるウイルス由来である。
本発明の別の態様によれば、フラビウイルスの非構造領
域またはその一部、および異なるフラビウイルスの構造
領域またはその一部からなるＤＮＡセグメントが得られ
る。本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物におい
てウイルスに対する防御免疫反応を生起することのでき
るワクチンが得られる。このワクチンは、安全かつ免疫
学的に有効な量のキメラウイルスを含む。このウイルス
のゲノムは、ダニ媒介脳炎ウイルスからの構造タンパク
質を作動可能にコード化する核酸と、デング熱ウイルス
からの非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸
とを含む。本発明のさらに別の態様によれば、別のキメ
ラウイルスが得られる。この態様において、キメラウイ
ルスは、ダニ媒介脳炎ウイルス構造タンパク質および４
型デング熱ウイルス非構造タンパク質とを作動可能にコ
ード化するウイルスのゲノムをもつ。好ましい実施例に
おいて、ウイルスの構造タンパク質はダニ媒介脳炎ウイ
ルス由来のものである。本発明のさらに別の態様によれ
ば、ダニ媒介脳炎ウイルス構造タンパク質および４型デ
ング熱ウイルス非構造タンパク質を作動可能にコード化
するＤＮＡセグメントが得られる。本発明のさらなる態
様によれば、感染性４型デング熱ウイルスＲＮＡをコー
ド化する、分離されたＤＮＡ断片が得られる。本発明の
さらに別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片とベクタ
ーからなる組換えＤＮＡ構築物が得られる。好ましい実
施例において、ベクターはプラスミドである。本発明の
さらなる態様によれば、ＤＮＡ断片の発現を可能とする
ようにして本発明の組換えＤＮＡ構築物で安定的に形質
転換された宿主細胞が得られる。好ましい実施例におい
て、宿主細胞は原核細胞である。本発明の別の態様によ
れば、４型デング熱ウイルスの突然変異を作製する方法
が得られる。この方法は、（ｉ）部位特異的突然変異誘
発により４型デング熱ウイルスのゲノムに突然変異を導
入し、（ii）突然変異を有する感染性４型デング熱ウイ
ルスを回収し、（iii ）回収したウイルスを評価するス
テップを含む。本方法の一実施例において、回収された
ウイルスは、弱毒化または無毒性の表現型について評価
される。本発明のさらに別の態様によれば、４型デング
熱ウイルスに対するヒト用ワクチンが得られる。このワ
クチンは、疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の
無毒性４型デング熱ウイルスと、薬学的に受容可能な担
体とを含む。好ましい実施例において、無毒性４型デン
グ熱ウイルスは、ウイルスゲノム内の重要な領域におい
て突然変異を加工することにより得られる。本発明のさ
らに別の態様によれば、キメラフラビウイルスＲＮＡを
コード化するＤＮＡ断片が得られる。キメラＲＮＡは、
たとえば、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイル
ス、３型デング熱ウイルスからなる群から選択されたウ
イルスを含んでいる。本発明のさらに別の態様によれ
ば、キメラデング熱ウイルスの構築のための方法が得ら
れる。この方法は、本発明の方法により得られた４型デ
ング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、異なるフラビウ
イルスからの、対応する遺伝子全体またはその画分［ｆ
ｒａｃｔｉｏｎ］で置換することを含んでいる。好まし
い実施例において、異なるフラビウイルスは以下のウイ
ルスの１つである。１型デング熱ウイルス、２型デング
熱ウイルス、３型デング熱ウイルス。別の好ましい実施
例において、４型デング熱ウイルスは少なくとも１つの
突然変異を含む。本発明は、デング熱ウイルスに対する
ヒト用ワクチンを提供する別の態様を含む。本態様にお
いて、本発明は、疾病に対して免疫を誘発するのに十分
な量の感染性キメラウイルスと、薬学的に受容可能な担
体とを含む。キメラウイルスは、たとえば、１型デング
熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイ
ルス、あるいは４型デング熱ウイルスに由来する。本発
明のさらに別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片と、
ベクターからなる組換えＤＮＡ構築物が得られる。１つ
の好ましい実施例において、ベクターはプラスミドであ
る。本発明のさらに別の態様によれば、ＤＮＡの発現を
可能とするようにして、本発明の方法により得られた組
換えＤＮＡ構築物で安定的に形質転換された宿主細胞が
得られる。好ましい実施例において、宿主細胞は原核細
胞である。本発明のさらに別の態様によれば、非構造タ
ンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳ１のＣ末端
における８個のアミノ酸のうちの１つ又はそれ以上をコ
ード化する配列内に置換突然変異を含む、４型デング熱
ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片が得られる。
本発明のさらなる態様によれば、非構造タンパク質ＮＳ
１−ＮＳ２Ａの開裂部位のつぎの＋１位置の部位であ
る、グリシンをコード化する部位に置換を含む、４型デ
ング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片が得ら
れる。本発明のさらなる態様によれば、３’側非コード
領域内に欠失を含む、４型デング熱ウイルスＲＮＡをコ
ード化するＤＮＡ断片が得られる。好ましい実施例にお
いて、欠失は、ヌクレオチド３０〜２０２個分の長さを
もつ。本発明の別の態様によれば、本発明のＤＮＡ断片
のいずれかとベクターとを含む組換えＤＮＡ構築物が得
られる。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のＤ
ＮＡ断片の感染性ＲＮＡ転写物が得られる。本発明のさ
らなる態様によれば、ＤＮＡ断片の発現を可能とするよ
うにして、本発明のＤＮＡ構築物でトランスフェクショ
ンされた宿主細胞が得られる。このような宿主細胞には
哺乳類または昆虫の細胞を用いることができる。本発明
のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイルスに対
するヒト用ワクチンが得られる。本発明の本態様におい
て、このワクチンは、疾病に対して免疫を誘発するのに
十分な量の、毒性低減化突然変異４型デング熱ウイルス
を含む。好ましい実施例において、突然変異４型デング
熱ウイルスは、ウイルスゲノムにおける３’側非コード
領域内に欠失突然変異を加工することにより得られる。
別の好ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウ
イルスは、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部
位のＮＳ１のＣ末端における８個のアミノ酸のうちの１
つ又はそれ以上をコード化するウイルスＤＮＡ配列内に
置換突然変異を加工することにより得られる。さらに別
の好ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウイ
ルスは、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位
のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化す
るウイルスＤＮＡ部位に置換を加工することにより得ら
れる。本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱
ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、異なるフラビウイルス
からの対応する遺伝子全体またはその画分で置換するこ
とを含む、キメラデング熱ウイルスの構築方法が得られ
る。好ましい実施例において、異なるフラビウイルス
は、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３
型デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎
ウイルスの１つである。別の好ましい実施例において、
キメラデング熱ウイルスの構築方法は、本発明による４
型デング熱ウイルスＤＮＡのＤＮＡ断片を、異なるフラ
ビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で
置換することを含む。好ましくは、フラビウイルスは、
１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デ
ング熱ウイルス、日本脳炎ウイルスからなる群から選択
される。さらに好ましくは、キメラデング熱ウイルスの
構築方法は、本発明による４型デング熱ウイルスＤＮＡ
のＤＮＡ断片を、フラビウイルスからの対応する遺伝子
全体またはその画分で置換することを含む。好ましい方
法において、フラビウイルスは、１型デング熱ウイル
ス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、日
本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスからなる群から
選択される。本発明のさらに１つの態様によれば、疾病
に対して免疫を誘発するのに十分な量を投与される、デ
ング熱ウイルスに対するワクチンが得られる。このワク
チンは、毒性が低減したキメラウイルスを含み、上記キ
メラウイルスは、３’側非コード領域に欠失を含む４型
デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片を含
む。好ましい実施例において、キメラウイルスは２型デ
ング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱
ウイルスからなる群から選択される。本発明のさらなる
態様は、以下の発明の詳細な説明を参照することによ
り、当業者にとって明らかになるであろう。
【０００４】
【発明の実施の形態】キメラフラビウイルスの生成 デング熱ウイルスは、ほぼ１１キロベースの正鎖ＲＮＡ
ゲノムを含み、このゲノムは、３つの構造タンパク質
（カプシド（Ｃ）、プレメンブレン（ｐｒｅＭ）、エン
ベロープ（Ｅ））を１つの読取りフレームでコードして
おり、７個の非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、Ｎ
Ｓ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５）がそれ
に続いている。本発明は、１つの「型（type）」のデン
グ熱ウイルスまたはフラビウイルスからの非構造タンパ
ク質と、異なる「型」のデング熱ウイルスまたは別のフ
ラビウイルスからの構造タンパク質とを含むキメラデン
グ熱ウイルスに関する。一実施例において、本発明は、 １）１型、２型、３型、４型デング熱ウイルス、黄熱病
ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、
またはフラビウイルスの非構造領域と、 ２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３
型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウ
イルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ま
たはフラビウイルスから選択された構造領域とを含み、
上記構造領域は上記非構造領域とは異なる「型」のデン
グ熱ウイルスまたはフラビウイルス由来のものであるこ
とを特徴とするキメラウイルスに関する。別の実施例に
おいて、本発明は、 １）４型デング熱ウイルス（ＤＥＮ４）の非構造領域
と、 ２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
１つの好ましい実施例において、このウイルスは、４型
デング熱ウイルス構造領域を実質的にもっていない。好
ましい実施例において、このウイルスはｐ２Ａ（Ｄ１Ｗ
Ｐ）またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）ＲＮＡからなる。さら
なる実施例において、本発明は、 １）１型デング熱ウイルスの非構造領域と、 ２）２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
さらなる実施例において、本発明は、 １）２型デング熱ウイルスの非構造領域と、 ２）１型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 １）３型デング熱ウイルスの非構造領域と、 ２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、４
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 １）黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎
ウイルス、およびフラビウイルスから選択された非構造
領域と、 ２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、４
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含み、上記構造領域は上記非構
造領域とは異なるウイルス由来のものであることを特徴
とする、キメラウイルスに関する。さらなる実施例にお
いて、本発明は、上記キメラウイルスの少なくとも１つ
と、薬学的ならびに免疫学的に受容可能な担体からなる
ワクチンに関する。ワクチンに含まれるウイルスの量
は、投与の経路に応じて選択される。皮下経路が好まし
いが、上述のワクチンは、皮内経路によっても投与でき
る。当業者であれば、いかなる治療法についても、投与
すべき量を容易に決定できることが理解されよう。さら
に別の実施例において、本発明は、 １）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、１型デング
熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、 ２）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、２型デング
熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、 ３）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、３型デング
熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、 ４）弱毒型４型デング熱ウイルスからなるワクチンに関
する。１つの好ましい実施例において、弱毒化ウイルス
は、非構造タンパク質領域（たとえば、改変されたＮＳ
１−ＮＳ２開裂部位配列）内に、突然変異（点突然変
異、欠失、挿入、これらの組合せ）を含む。別の好まし
い実施例において、弱毒化ウイルスは、３’非コード領
域内に、突然変異（点突然変異、欠失、挿入、これらの
組合せ）を含む。さらに好ましい実施例において、弱毒
化ウイルスは、５’非コード領域に、突然変異（点突然
変異、欠失、挿入、これらの組合せ）を含む。別の好ま
しい実施例において、弱毒化ウイルスは、天然由来のも
のまたは研究室で加工したものである。別の実施例にお
いて、本発明は、上述のウイルスの少なくとも１つをコ
ード化するＤＮＡセグメントに関する。１つの好ましい
実施例において、ＤＮＡセグメントは、構造および非構
造領域に作動可能に連結するプロモーター（好ましく
は、真核、原核、ウイルス性プロモーター、より好まし
くはＳＰ６またはＴ７プロモーター）を含む。別の好ま
しい実施例において、ＤＮＡセグメントはｐ２Ａ（Ｄ１
ＷＰ）またはｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を含む。すなわち、
当業者であれば、後述の実施例において提供される方法
を用いて、フラビウイルス科の１つのウイルスの構造領
域を、フラビウイルス科の別のウイルスからの非構造領
域に組合せて得られる型間組換え体を含むキメラデング
熱ウイルスワクチンを生成できることはいうまでもな
い。好ましい実施例において、４型デング熱ウイルス
（ＤＥＮ４）の非構造タンパク質を１型デング熱ウイル
スの構造タンパク質に組み込んだキメラデング熱ウイル
スが作製される。これらの方法の詳細は、Ｂｒａｙ他
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８８巻１
０４２〜１０４６頁、１９９１年）を参照されたい。後
述の実施例１７は、実施例１に説明するキメラデング熱
ウイルス製造のための方法につづいて４型デング熱ウイ
ルスの非構造領域をダニ媒介脳炎ウイルスの構造領域に
組み合わせたキメラウイルス（ＴＢＥＶ（ＣＭＥ）／Ｄ
ＥＮ４）の作製を開示している。これらの方法により作
製されたウイルスは培養中で複製され、組織培養細胞ま
たは実験動物の感染に用いられた。
【０００５】神経毒性に影響するデングゲノムにおける
突然変異 我々は、細胞培養における増殖特性およびプラーク形態
の変化を示す、３’非コード領域における欠失を含む一
連の活性デング熱ウイルス突然変異体を加工した。同様
に、我々は、ウイルスポリタンパク質の非構造タンパク
質領域の新規な開裂部位配列内に核酸酸置換を含む、別
の一連の、増殖制限されたデング熱ウイルス突然変異体
を加工した。複製能力が低下したデング熱ウイルス突然
変異体は、生菌ウイルスワクチンに用いるための適格性
を判定するために、実験動物における毒性の低下につい
て評価を受ける。本発明において、３’非コード領域内
に欠失を含む増殖制限された４型デング熱ウイルス突然
変異体の構築は、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡ
クローンを用いて重要な領域内に欠失を加工することに
より実行される。欠失突然変異は、アミノ酸置換突然変
異に比べて、表現型の逆転が少ないという利点をもって
いる。他の蚊媒介フラビウイルスと同様に、４型デング
熱ウイルスは、指定された保存配列１（ＣＳ−１）およ
び保存配列２（ＣＳ−２）の保存領域と、潜在的末端ス
テム・アンド・ループ構造とを含む３’非コード配列を
有している。ヌクレオチド３〜２０２個の範囲の欠失
は、４型デングｃＤＮＡのヌクレオチド３８４個の３’
非コード配列内のさまざまな位置に導入することができ
る。ＣＳ−１領域のｃＤＮＡクローン欠損配列から作製
され、しかしステム・アンド・ループ構造をとどめてい
るＲＮＡ転写物は、子孫ウイルスを生じることがなく、
欠失が致死的であることを示している。一方、たいてい
の他の３’非コード領域欠失構築物からは、感染性ウイ
ルスを回収することができる。これらの突然変異体およ
び野生型ウイルスのプラーク検定は、蚊細胞（Ｃ６／３
６）に対して実施することができる。分析の結果、ほと
んどの欠失突然変異体が、欠失の位置と程度に応じて、
１．０から０．３ｃｍにわたる、縮減サイズのプラーク
を形成することが示されている。プラーク形態のこのよ
うな変化は、これらの欠失突然変異体が増殖制限表現型
をあらわすことを示すものである。３’非コード領域内
に欠失を含むデング熱ウイルス突然変異体のこのパネル
は、実験動物においてそれらの感染性および免疫原性に
ついて評価することができる。実験霊長類に対して低下
した毒性を示す突然変異体は、ワクチンウイルス候補と
して選択され、ヒトにおける評価を受ける。さらに、本
発明は、３’非コード領域に欠失を含むＤＮＡ断片およ
びベクターを含む組換えＤＮＡ構築物に関する。さら
に、本発明は、ＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクシ
ョンした宿主細胞に関する。さらに、本発明は、ウイル
スゲノムの３’非コード領域に欠失突然変異を導入し、
欠失突然変異を宿す感染ウイルスを回収する工程を含
む、４型デング熱ウイルスの突然変異を生成する方法に
関する。別の実施例において、本発明は、非構造タンパ
ク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のＮＳ１のＣ末端にお
ける８個のアミノ酸のうちの１つ又はそれ以上をコード
化する配列内に置換を含む、４型デング熱ウイルスＲＮ
Ａをコード化するＤＮＡ断片に関する。置換の概略は図
１６に示されている。さらに、本発明は、非構造タンパ
ク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のつぎの＋１位置の部
位である、グリシンをコード化する位置に置換を含む、
４型デング熱ウイルスＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片
に関する。本発明は、さらに、ここに述べたＤＮＡ断片
の感染性ＲＮＡ転写物に関する。非構造タンパク質内に
突然変異を含む増殖制限された４型デング熱ウイルス突
然変異の構築は、完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡ
クローンを用いてこのような戦略的突然変異を加工する
ことにより実行できる。デング熱ウイルス非構造タンパ
ク質の機能的活性に影響する突然変異により、増殖制限
を誘起することができる。たとえば、開裂配列またはウ
イルスプロテアーゼ部分を改変することにより、ウイル
スポリタンパク質の開裂を最適以下に抑え、ウイルス増
殖を制限する。我々は、非効率的な開裂により増殖制限
されるデング熱ウイルス突然変異を構築するためのター
ゲットとして、ポリタンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂部
位を選択した。我々は、４型デング熱ウイルスＮＳ１−
ＮＳ２Ａ開裂には、ＮＳ１のＣ末端における８個のアミ
ノ酸ドメインが必要であることを証明した。我々は、さ
らに、これらの位置の各々における置換および開裂部位
のつぎの＋１位置のＧｌｙの置換の効果を証明した。こ
のドメインにおけるアミノ酸置換の突然変異のパネル
は、開裂に対する効果について評価された（図１６参
照）。開裂に対して広範囲の効果を生じた突然変異を識
別し、多数のこのような突然変異を選抜して、完全長４
型デング熱ウイルスｃＤＮＡクローンに組み込んだ。突
然変異体ｃＤＮＡ由来のＲＮＡ転写物を用いて細胞のト
ランスフェクションを行ない、これにより、ＮＳ１−Ｎ
Ｓ２Ａ開裂領域内に指定された突然変異をもつ活性デン
グ熱ウイルス突然変異体が生成された。これらの突然変
異体は、まず、蚊Ｃ６／３６細胞でのプラーク検定によ
り特徴づけられた。突然変異体のいくつかは、サイズの
縮小したプラークを生じ、これらの突然変異体ウイルス
が細胞培養において増殖制限を呈したことを示す。さら
に、本発明は、非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開
裂部位のＮＳ１のＣ末端における８個のアミノ酸の１つ
又はそれ以上をコード化する配列内に置換突然変異を含
むＤＮＡ断片と、ベクターを含む組換えＤＮＡ構築物に
関する。本発明は、さらに、ＤＮＡ構築物でトランスフ
ェクションした宿主細胞に関する。さらに、本発明は、
非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂部位のつぎの
＋１位置である、グリシンをコード化する位置に置換を
含むＤＮＡ断片と、ベクターを含む組換えＤＮＡ構築物
に関する。本発明は、さらに、ＤＮＡ構築物でトランス
フェクションした宿主細胞に関する。別の実施例におい
て、本発明は、上述したように、毒性の低下した突然変
異体４型デング熱ウイルスを、疾病に対して免疫を誘発
するのに十分な量含んでなる４型デング熱ウイルスに対
するヒト用ワクチンに関する。本発明の突然変異体は、
（１）ウイルス血症の期間として測定される毒性と、
（２）ウイルス感染後の抗体反応の種類と規模により示
される免疫原性について、霊長類において評価される。
サルにおいて毒性が低下しなお十分な免疫原性を維持す
るデング熱ウイルス突然変異体は、ヒトに対する臨床試
験において評価される。さらなる実施例において、本発
明は、４型デング３’非コード領域および／または非構
造タンパク質遺伝子内に、十分な弱毒化をもたらす突然
変異を含む４型デング熱ウイルスを構築すること、なら
びに、４型デング熱ウイルス突然変異体の各々を用いて
他のデング熱ウイルス血清型の抗原特異性をもつ型間キ
メラウイルスを構築しこれにより１型、２型、または３
型デング熱ウイルスにより発生する疾病の防御のために
用いることのできる弱毒化ウイルスを創作することに関
する。さらに、キメラウイルスは、日本脳炎ウイルスお
よびダニ媒介脳炎ウイルスなどのその他のフラビウイル
スに対する抗原特異性をもつものとしても構築すること
ができる。デング熱に対する免疫のための現在の戦略と
しては、４つのデング熱血清型すべてを含むワクチン製
剤の使用が好ましい。このことは、異なるデング熱血清
型に連続して感染することから生じる重いデング出血性
ショック症候群の危険から、風土病地域の人々を守るこ
とになろう。現在、弱毒化デング熱ワクチン候補は、人
工的な宿主の細胞内の連続継代培養を含む標準的技術に
より作製されている。これらの宿主域突然変異体を用い
て達成された成功は、ごく限られたものに過ぎない。た
とえば、２型デング熱ワクチンは満足できる程度に弱毒
化されたけれども、この方法により作製された３型デン
グ熱ワクチンはヒト被験希望者にデング熱を引き起こし
た。本発明は、活性キメラデング熱ウイルスを構築する
方法を提供する。本発明は、さらに、４型ウイルス５’
および３’非コード配列と、その７個の非構造タンパク
質のすべてをコードする配列とを含む、共通の４型デン
グ熱ウイルス遺伝子的背景を共有するキメラウイルスを
用いて、４つのデング熱血清型すべてに対して有効なワ
クチンを製造する方法を提供する。この目的のため、我
々は、３’非コード系に、あるいは、非構造タンパク質
遺伝子の１つに欠失を含む４型デング熱ウイルスを構築
し、これらのデング熱ウイルス突然変異体が複製能力の
大幅な抑制を示すことを証明した。したがって、満足で
きる程度の弱毒化をもたらす突然変異をこれらの共通領
域内において加工することができ、その結果、４つのデ
ング熱血清型特異性を別々に発現することになる４個の
クローン化された弱毒化デング熱ウイルスのひと組が得
られる。これらのウイルスには、親４型ウイルス、１型
（構造タンパク質遺伝子領域）−４型キメラ、同様な２
型−４型キメラ、および同様な３型−４型キメラ、なら
びに、日本脳炎およびダニ媒介脳炎のキメラが含まれ
る。不活化全デング熱ウイルスワクチンは、十分な免疫
原性を欠くことが示されていた。細胞培養における連続
継代培養により弱毒化された生菌ウイルスワクチンは、
不十分な弱毒化、遺伝学的不安定性、過度の弱毒化など
の欠点をもっていた。２型デング熱ワクチンは、まだ、
開発の初期段階にある。残りの３つの血清型の生菌ワク
チンは得られていない。本発明は、ウイルスゲノム内に
指定された突然変異をもつデング熱ウイルスを構築する
能力における技術的進歩を提供する。
【０００６】キメラダニ媒介脳炎ウイルスワクチン カプシド、メンブレン、エンベロープの３つの構造タン
パク質配列を、デング熱ウイルス非構造タンパク質をコ
ード化する配列を含むデング熱ウイルス構築物に組み込
むことにより、ダニ媒介脳炎キメラウイルスが作製され
た。デング熱／ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）の組
合せは、デング熱ウイルスとＴＢＥＶウイルスタンパク
質および核酸配列の協力を必要とするようである。構築
物のウイルスは、それぞれ対応する天然のウイルスより
感染性が低かった。ＤＥＮ４およびＴＢＥＶは、同じゲ
ノム構成をもち、遺伝子発現の同じ戦略を共有する。し
かし、２つのウイルス間の配列を比較すると、配列相同
性が比較的低いことが示される（Ｐｌｅｔｎｅｖ他、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ第１７４巻２５０〜２６３頁（１９９
０）をここに参考として取り入れる）。たとえば、２つ
のウイルスの間のアミノ酸同一性は、カプシドタンパク
質（Ｃ）については１５．４％、メンブレンタンパク質
（Ｍ）については１５．９％、エンベロープグリコタン
パク質（Ｅ）については３６．５％、非構造タンパク質
（ＮＳ１）については３９．１％である。以下の実施例
に、改良されたキメラＴＢＥＶワクチンを開示する。我
々は、すでに、感染性ＲＮＡのインビトロ転写のための
鋳型として用いることのできるクローン化された完全長
デング熱ウイルスｃＤＮＡについて説明した。これは、
ｐＢＲ３２２ベクターを用いて大腸菌株内に安定な完全
長デング熱ｃＤＮＡコピーをクローン化することにより
達成された。デング熱ウイルスは、ｃＤＮＡのインビト
ロＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションした受容
細胞から回収された。デング熱ｃＤＮＡの感染性ＲＮＡ
転写物を用いてトランスフェクションした細胞により生
成されたウイルスの特性は、ｃＤＮＡクローンが由来し
たもとのウイルスの特性と同一であった。さらに、我々
は、本発明において、１つの血清型のデング熱ウイルス
の非構造タンパク質遺伝子と、別の血清型のデング熱ウ
イルスからの構造タンパク質遺伝子とを含むゲノムを有
するキメラデング熱ウイルスの作製を開示した。キメラ
デング熱ウイルスの１例として、１つのデング熱ウイル
スからのカプシド、ｐｒｅＭ（メンブレン）、エンベロ
ープ遺伝子配列を用いて、組換えｃＤＮＡ構築物におけ
る４型デング熱ウイルスの対応する遺伝子を置換した。
この構築物でトランスフェクションした細胞内で生成さ
れたウイルスは、同型デング熱ウイルスに対するワクチ
ンの作製において有用である。上述したように、本出願
は、さらに、デング熱ウイルスの非構造領域と別のフラ
ビウイルスの構造領域に対応する遺伝子配列を含むキメ
ラウイルスの構築を開示している。特に、キメラダニ媒
介脳炎ウイルスが開示されている。「キメラフラビウイ
ルスの生成」と題した項において概説した本発明の方法
は、ＴＢＥＶからの３つの構造タンパク質を組み込んだ
組換えデング熱ウイルス構築物の製造を開示している。
この構築物でトランスフェクションした細胞から生成さ
れるウイルスは、生菌ウイルスワクチンのためのウイル
ス候補である。本出願に係る発明は、キメラフラビウイ
ルス作製の技術に対する重要かつ予想外の改良と、この
新規なワクチン戦略の有用性についてのあらがえない証
拠を提供する。当業者であれば、１つのウイルスの構造
タンパク質のすべてを第２のウイルスの非構造要素に組
み込んだキメラフラビウイルス組合せが容易に回収可能
であり、培養細胞において効率的に複製することを期待
できる。これは、関連性の離れたフラビウイルス由来の
構造タンパク質の機能的協力という要件の可能性がある
ためである。しかしながら、予期せぬことに、本発明
は、ＴＢＥＶゲノムからの２つの構造タンパク質（すな
わちＭおよびＥ）を、デング熱ウイルスからの第３の構
造タンパク質（すなわちＣ）と組み合わせたキメラＴＢ
ＥＶウイルス（ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４）を識別する。
【０００７】キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４構築物の作製 ＤＥＮ４とＴＢＥＶとの間のアミノ酸配列相同性は低い
ため、ＴＢＥＶ配列を用いて対応するＤＥＮ４配列を置
換することにより、多様なＴＢＥＶおよびＤＥＮ４キメ
ラｃＤＮＡ構築物が作られた。これらの構築物は、分子
生物学分野において公知の技術を用いて作製された。ｃ
ＤＮＡ構築物のインビトロ転写およびＲＮＡ産物の受容
細胞内へのトランスフェクションの後、さまざまな遺伝
子組合せのいずれかにより活性キメラウイルスが産生さ
れるかどうかを決定するために、構築物を試験した。す
でに、ＴＢＥＶ（Ｓｏｆｊｉｎ株）のサブゲノムｃＤＮ
Ａ断片がクローンされ、公知の技術を用いてヌクレオチ
ド配列が決定された（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ、および、Ｐｌｅｔｎｅｖ他、ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ．第２００巻３１７〜３２１頁１９８６を参
照）。これらのプラスミドは、全ＴＢＥＶゲノム配列を
一緒に含む重複遺伝子配列を提供する。プラスミドｐＧ
ＥＭ２−ＣＭＥまたはｐＧＥＭ２−ＥＮＳ１を鋳型とし
て用い、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
（例１７参照）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
り一連のＴＢＥＶ ｃＤＮＡ断片を作製し、各断片は、
制限酵素開裂部位が脇にある１つ又はそれ以上の特異遺
伝子を定めている。断片は図１７に示されており、右端
のヌクレオチド位置により示される断片の配列は、Ｐｌ
ｅｔｎｅｖ他による刊行物（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１７４
巻２５０〜２６３頁、１９９０）において提供されてい
る。図１７に、７個のこのようなＴＢＥＶｃＤＮＡ断片
と、部位特異的突然変異誘発により完全長ＤＥＮ４ ｃ
ＤＮＡのＲＮＡ転写物内に同様に導入された適当な部位
に連結するのに適した修飾末端を示す。ＴＢＥＶ配列
の、ヌクレオチド（ｎｔ）７６〜１９７７を含むプラス
ミドｐＧＥＭ２−ＣＭＥおよびヌクレオチド９６６〜３
６７２を含むｐＧＥＭ２−ＥＮＳ１は、共有された制限
酵素部位におけるＴＢＥＶ断片のライゲーション（連
結）により、プラスミドｐ１０、ｐ４、ｐ１８、ｐ２、
ｐ１１から構築された（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ、１９９０参照）。プラスミドＤＥＮ４ｐ
５’−２およびｐ５’−２（ΔＰｓｔＩ、ＸｈｏＩ）
（前出のＢｒａｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．１９９１）、および誘導体ｐ５’−２（ΔＰｓ
ｔＩ、ＸｈｏＩ、ΔＨｉｎｄIII ）が、対応するＤＥＮ
４遺伝子のかわりに１つ又はそれ以上のＴＢＥＶ遺伝子
を置換するために用いられた。分子生物学の当業者であ
れば、実施例１７に示したプライマー配列すなわち配列
番号２１〜３１を用いてキメラＴＢＥＶ構築物を生成す
ることができる。キメラ構築物の接合部における配列
は、核酸配列決定により証明された。得られたキメラプ
ラスミドのすべては、ＤＥＮ４の第１のヌクレオチドを
あらわすＡ残基が後に続く転写開始のＧの上流に位置す
るＳＰ６プロモーターを含んでいた。プラスミドは、イ
ンビトロ転写物の前に、ＤＥＮ４配列の３’末端の直後
の唯一のＡｓｐ７１８開裂部位で線状化された。この構
築物は、Ｌａｉ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．第８８巻５１３９〜５１４３頁、１９９１）によ
り開示された技術を用いて、インビトロ転写により転写
された。図１７のキメラ構築物からの転写物は、サルＬ
ＬＣ−ＭＫ2細胞にＲＮＡをトランスフェクションする
ことにより、感染性について試験された。トランスフェ
クション処理には、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒ
ｇ）またはＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオ
イロキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニ
ウム硫酸ジメチル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）のいずれ
かを用い、キメラＲＮＡ転写物を受容細胞に導入した。
サルＬＬＣ−ＭＫ2細胞の培養をこれらの処理に用いた
が、ＴＢＥＶ複製のための受容細胞型のどれでもかわり
に用いることができることは言うまでもない。トランス
フェクションされた培養は、ＴＢＥＶ特異的ウサギ血清
または高度免疫マウス腹水を用いた免疫蛍光検査によ
り、時間に対するウイルスの存在について、評価され
た。ｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４（ＴＢＥＶのプレメン
ブレンおよびエンベロープタンパク質からの配列をＤＥ
Ｎ４のカプシドタンパク質および非構造配列に連結した
ものを含む）のＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクシ
ョンされた細胞は、ＴＢＥＶ特異的ウサギ血清、ＴＢＥ
Ｖ特異的高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）、およびＤＥ
Ｎ４特異的ＨＭＡＦで、陽性に染まった。ＤＥＮ４のみ
に感染した対照培養は、免疫蛍光標識されたＴＢＥＶ特
異的血清に対しては、陰性であった。このことは、キメ
ラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４がＴＢＥＶおよびＤＥＮ
４双方の特異抗原を発現したことを示す。キメラウイル
スをトランスフェクションｖＴＢＥＶから分離し、ＴＢ
Ｅ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４（ＴＢＥＶのカプシド、メンブ
レン、エンベロープ遺伝子と、ＤＥＮ４の非構造配列と
を含むゲノム構築物）と、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４
と呼ぶ。実施例１７に開示したように、ＴＢＥ（ＣＭ
Ｅ）／ＤＥＮ４のＲＮＡによるトランスフェクションの
１６日後、約１％の細胞が、ＴＢＥＶおよびＤＥＮ４特
異抗原に対して陽性に染まった。陽性細胞の割合は時間
とともに増加し、トランスフェクション後２６日目に６
×１０5ｐｆｕ／ｍＬのピーク力価を示し、８０％の細
胞がトランスフェクションされた。一方、ＴＢＥ（Ｍ
Ｅ）／ＤＥＮ４のＲＮＡを用いてトランスフェクション
した細胞はより迅速にウイルスを生成し１６日目に培養
の１００％が感染した。トランスフェクション細胞内に
存在するＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルス（ｖ ＴＢ
Ｅ（ＭＥ）／（ＤＥＮ４）で示す）の力価は、感染後２
６日目に４×１０6ｐｆｕ／ｍＬであった。さらに、キ
メラ構築物に感染させた細胞から生成された子孫ウイル
スの配列決定により、図１７に示すように、キメラビリ
オン（ウイルス粒子）からのゲノム断片のＤＥＮ４およ
びＴＢＥＶ接合部が、キメラ構築物の接合部に符合する
ことが確認された。
【０００８】ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ウイルスの性質 実施例１７において提供された方法を用いて、キメラウ
イルスの性質を調べた。キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ウイ
ルスを用いたすべての作業は、ＢＬ−３封じ込め設備に
おいて実施された。キメラウイルスから製造されたタン
パク質を、４型デング熱ウイルスから作製されたタンパ
ク質と比較した。完全長ＤＥＮ４ｃＤＮＡクローンから
回収した４型デング熱ウイルスのタンパク質は、「キメ
ラフラビウイルス」と題する項において同定され、図４
に示され、Ｂｒａｙ他（前出のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１））に開示されてい
る。デング熱ウイルスタンパク質のタンパク質分離のパ
ターンを、ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４感染細胞から生成
されたキメラウイルスタンパク質と比較した。この検定
（図１８および実施例１８参照）において、融合性ＬＬ
Ｃ−ＭＫ2細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）０．０１で感
染させた。前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）により開示された技
術を用いて、被感染培養を35Ｓメチオニンとともにイン
キュベートした。以下のレーンを用いて感染細胞溶解物
の免疫沈降検査を実施した。１）ＴＢＥＶ特異的ＨＭＡ
Ｆ、２）ＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦ、３）ＤＥＮ４ＮＳ３
に対して作製されたウサギ抗血清、４）ＤＥＮ４ＮＳ５
に特異なウサギ抗血清、５）ＤＥＮ４のｐｒｅＭに特異
なウサギ抗血清、６）ＤＥＮ４のＥタンパク質に特異な
ウサギ抗血清。免疫沈降物は、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔ
ｕｒｅ第２２７巻６８０〜６８５頁、１９７０）により
開示された技術を用い、図１８に示すように、変性条件
のもとで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
された。キメラおよび親ＤＥＮ４ウイルスのいずれも、
ＤＥＮ４ ＮＳ３およびＮＳ５として識別されたタンパ
ク質バンドを生じた（レーン３および４）。ＤＥＮ４の
ｐｒｅＭまたはＥタンパク質は、キメラウイルスに感染
した細胞においては識別されなかったが、ＤＥＮ４感染
細胞においては識別された（レーン５および６参照）。
ＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦは、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ
４感染細胞溶解物からのタンパク質バンドのみを沈降さ
せ、これはＤＥＮ４ ＮＳ１およびＮＳ３非構造タンパ
ク質と共に泳動した（レーン２）。ＴＢＥＶのＨＭＡＦ
は、キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４に感染した細胞
の溶解物からのＴＢＥＶのＥタンパク質（５５ｋＤａ）
について正確なサイズを有するタンパク質を免疫沈降し
た。キメラウイルス感染細胞タンパク質は、ＤＥＮ４の
Ｅよりも迅速に泳動した（レーン１および６）。以前の
実験において、ＴＢＥＶのＨＭＡＦは、ＴＢＥＶ感染細
胞からの天然ＴＢＥＶ ｐｒｅＭおよびＣタンパク質を
沈降しなかった。したがって、ＴＢＥＶのｐｒｅＭおよ
びＣタンパク質の同定は期待されなかった。ＬＬＣ−Ｍ
Ｋ2細胞においてｖＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４により
生成されたタンパク質バンドのプロフィールは、ｖＴＢ
Ｅ（ＭＥ）／ＤＥＮ４により生成されたものと同一であ
った。このように、キメラウイルスはＬＬＣ−ＭＫ2細
胞において期待されたタンパク質を生成した。ＤＥＮ４
により生じたウイルスプラークをキメラ構築物から生じ
たプラークと比較することにより、ウイルスのプラーク
形態観察を評価した。蚊Ｃ６／３６細胞上で、ＤＥＮ４
ウイルスプラークの平均サイズは１２．１ｍｍであっ
た。一方、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４は平均６．５ｍ
ｍのプラークを生じた。ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４
は、サルＬＬＣ−ＭＫ2細胞上にＤＥＮ４により生じる
ものと比べて５倍大きいプラークを生じた。このこと
は、キメラウイルスが、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞において、
ＤＥＮ４よりも効果的に複製したことを示唆する。これ
らの思わぬ結果は、被感染ＬＬＣ−ＭＫ2細胞における
ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４の増殖速度およびウイルス
収量の分析により確認された（図１９参照）。キメラウ
イルスの力価は１０8ｐｆｕ／ｍＬに達し、これは、同
一条件下で親ＤＥＮ４により達成されるものにくらべ
て、ほぼ１０００倍高い。キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／Ｄ
ＥＮ４ウイルスは、蚊Ｃ６／３６細胞上でゆっくりと増
殖し、親ＤＥＮ４により生成されるよりも１００倍低い
力価に達した。キメラｖＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４の
プラークサイズは、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞上のＤＥＮ４の
ものと比べて、検知できるほどには異なっていなかっ
た。これらの研究において、ウイルスは、Ｂａｎｃｒｏ
ｆｔ他（Ｐａｎ Ａｍ．Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．Ｓ
ｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁、１９７
９）に開示された技術を用いたプラーク検定により、測
定された。プラークサイズの相違は、ＴＢＥＶのＣタン
パク質とＤＥＮ４ウイルスＲＮＡとの非互換性を反映す
るものであり、これは、ウイルスＲＮＡパッケージング
およびウイルス成熟の際のタンパク質の効率的な相互作
用を妨げる。また、プラークサイズの相違は、ＤＥＮ４
の５’非コード領域におけるＡＵＧコドンの上流の６個
のヌクレオチドの置換の結果である可能性もある。この
配列変更は、ウイルスタンパク質翻訳の効率に影響し得
る。キメラ構築物からのウイルスＲＮＡ生成の分析（図
２０）は、図２１のタンパク質データとあわせて、被感
染Ｃ６／３６細胞におけるｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４
の小型プラーク表現型と増殖速度低下の説明を与える。
ＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞の培養（約１０6個
の細胞）は、ウイルス吸着の後のさまざまな時間に収集
され、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液
中に溶解された。Ｍａｎｉａｔｉｓ他（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，１９８２ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク）によ
り提供された技術を用いて、フェノール抽出により、全
ＲＮＡが細胞溶解物と培地から分離された。ＲＮＡ試料
をホルムアルデヒド中で変性し、ニトロセルロースフィ
ルター（ＢＡ８５，ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈ
ｕｅｌｌ）に塗布した。フィルターは、ニックトランス
レーションされた32Ｐ標識ｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４
のＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイズされた。ｐ
ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４からインビトロで作製された
ＲＮＡ転写物を陽性対照（コントロール）として用い
た。ＤＥＮ４に感染したＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３
６細胞からのウイルスタンパク質は、ｖＴＢＥ（ＭＥ）
／ＤＥＮ４に感染したＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６
細胞からのウイルスタンパク質と比較された。ＤＥＮ４
に感染したＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞におい
て、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ３を含むＤＥＮ４ウイルスタンパ
ク質は感染後４８時間で高レベルに蓄積した（図２
１）。しかしながら、ウイルスタンパク質合成の動態
は、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４感染ＬＬＣ−ＭＫ2と
Ｃ６／３６細胞では異なっていた。ウイルスタンパク質
は、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞においては感染後８時間と早く
検出された。一方、Ｃ６／３６細胞においては感染後４
８時間まではウイルスタンパク質は検出されなかった。
Ｃ６／３６細胞への接種の後、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥ
Ｎ４ビリオンの約７０％が培地中に残っていた。一方、
ＬＬＣ−ＭＫ2細胞培養の培地においては接種されたウ
イルスの小さなフラクションのみが見られた。この発見
は、キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４のＬＬＣ−ＭＫ
2細胞への導入は、Ｃ６／３６細胞への導入よりも、効
率的であることを示唆している。そしてその結果として
あり得ることは、このウイルスがＤＥＮ４ウイルスと比
較してこれらの細胞においてよりゆっくりと、かつ、よ
り低い力価に増殖するということである。ＬＬＣ−ＭＫ
2細胞への導入の後、キメラウイルスＲＮＡの複製は、
ＤＥＮ４ウイルスＲＮＡのそれとくらべて迅速であっ
た。一方、キメラウイルスのＲＮＡ合成は、被感染Ｃ６
／３６細胞におけるＤＥＮ４のそれよりもゆっくりであ
った。このように、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４は、蚊
細胞内への導入の効率が低く、これは、ウイルスＲＮＡ
およびタンパク質の生成低減に関連していた。これらの
観察結果は、ＴＢＥＶウイルスＲＮＡのＣ６／３６細胞
内へのトランスフェクションの効率が低いことと符合し
ている（Ｍａｎｄｌ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６５巻、４
０７０〜４０７７頁、１９９１年）。当業者には、１つ
のウイルスからの核酸配列を別のウイルスの核酸配列に
組合せるために用いることのできるさまざまな方法があ
ることが理解されよう。このようなライゲーション技法
とクローニング戦略は公知である。したがって、他の技
術を用い得ること、および、これらの技術の採用はクレ
ームされた発明から逸脱しないことは言うまでもない。
【０００９】キメラワクチンの効力と神経毒性の判定 ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４は、さまざまな投与経路を
介して試験動物にウイルス試料を導入することにより、
ワクチンとしての防御効力について評価された。親デン
グ熱ウイルスと比較したｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４の
神経毒性は、マウスへの脳内接種（ＩＣ）により分析さ
れた。他の投与経路としては、皮内（ＩＤ）または腹腔
内（ＩＰ）注射が含まれる。１つの実験において、生後
３日のＢＡＬＢ／ｃマウス乳児に、ウイルス１０2ｐｆ
ｕをＭＥＭ０．０２ｍＬ／０．２５％ヒト血清アルブミ
ンに加えた服用量を、ＩＣ注射した。別の組の実験にお
いて、生後６週のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにＩＣ、ＩＤ、
ＩＰ接種を行なった。２１日間にわたり、脳炎の症候や
死亡について、マウスを観察した。生存した成体マウス
は感染後２０日後に採血し、ＴＢＥＶに対する抗体反応
を評価した。ワクチンの防御効力を判定するため、感染
後２１日目に、ＢＬ−４封じ込め設備において、生存し
たマウスに、１０3ＬＤ50 ＴＢＥＶ（Ｓｏｆｊｉｎ株）
をＩＰ投与した。ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４は、乳児ま
たは成体マウスの脳（ＩＣ）内に直接接種した場合、親
ＴＢＥＶの神経毒性を維持していた（図２２および実施
例２１）。陽性対照として、ＴＢＥＶの典型的な株（Ｓ
ｏｆｊｉｎ株）との比較を行なった。ＴＢＥＶは神経毒
性が高く、０．１ｐｆｕで、ＩＣ接種した乳児マウスの
５０％に新生児脳炎を起こした。同様に、ＴＢＥＶは、
ＩＰ接種した成体マウスに対しても神経毒性が高かっ
た。この場合には、ＩＤ50は１４．２ｐｆｕであった。
一方、ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４は、ＩＤまたはＩＰの
いずれかの周辺（末梢）経路により接種した場合には脳
炎を起こさず（図２２参照）、これらが潜在的に安全な
ワクチン接種経路であることが示された。ｖＴＢＥ（Ｍ
Ｅ）／ＤＥＮ４の免疫原性は、生存したマウスの血清抗
体を用いた35Ｓ標識抗原を使用して、ウイルスに対する
抗体の免疫沈降検査を行うことにより分析された。免疫
沈殿物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し
たところ、ＤＥＮ４ ＮＳ１（キメラウイルスによりコ
ード化されるタンパク質）に特異な抗体は容易に検出さ
れること、しかし、ＴＢＥＶ Ｅに対する抗体は力価が
低いか、検出不可能であることが明らかになった。マウ
スはＴＢＥＶに対する天然の宿主ではないため、マウス
の周辺接種では、低レベルのウイルス複製しか行なわれ
ないということが推定される。ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥ
Ｎ４のＩＰまたはＩＤ接種を生き延びたマウスは、つぎ
に、致死量の投与に対する抵抗の徴候について研究され
た。ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４またはＤＥＮ４ウイル
ス接種の２１日後、神経毒性の高いＴＢＥＶのＳｏｆｊ
ｉｎ株１０3ＬＤ50を投与した。キメラｖＴＢＥ（Ｍ
Ｅ）／ＤＥＮ４のＩＰまたはＩＤ接種で生き延びたマウ
スは、この投与に対して防御ができていた。一方、先に
ＤＥＮ４で免疫化されたマウスの３つのグループのすべ
ては、１１日〜２０日の間に死亡した（図２２参照）。
これらの結果は、ワクチンとしてのこのウイルスは、Ｔ
ＢＥＶ感染に対して防御的であり特異的であることを示
した。非免疫化対照マウスは、ＴＢＥＶ感染の後、１０
日〜１６日の間に脳炎で死亡した。ＴＢＥ（ＭＥ）／Ｄ
ＥＮ４ウイルスは、脳内接種の後、乳児および成体マウ
スの両方に、均等に脳炎を起こした。一方、ＤＥＮ４を
接種したマウスでは、デング熱ウイルス関連の疾病の発
生頻度は低かった。このように、キメラウイルスは、ｐ
ｒｅＭおよびＥ遺伝子が由来した、もとのＴＢＥＶのマ
ウス神経毒性を維持している。このことは、すべてでな
いとしても、ＴＢＥＶマウス神経毒性マップの遺伝的決
定基のほとんどが、これら２つの構造タンパク質遺伝子
内にあることを示している。しかしながら、親ＴＢＥＶ
とは異なり、ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４は、成体マウス
に周辺接種した場合には病原性ではなく、周辺接種によ
り神経侵入性の損失が起きたことが示される。これらの
発見は、ＴＢＥＶがＣＮＳに侵入し脳炎を生じるために
は、ｐｒｅＭおよびＥ遺伝子以外のＴＢＥＶゲノムの領
域が必要であることを示唆するものである。ｖＴＢＥ
（ＭＥ）／ＤＥＮ４で周辺接種したマウスは、次回の致
死量ＴＢＥＶの腹腔内投与に対して防御された。一方、
ＤＥＮ４で同様に接種したマウスではそうではなかっ
た。これらの発見は、ｖＴＢＥ（ＭＥ）ＤＥＮ４のｐｒ
ｅＭ（Ｍの前駆体）、Ｍ、および／またはＥタンパク質
が、マウスにおけるＴＢＥＶ脳炎に対する防御免疫の主
要な抗原決定基を含んでいることを示すものである。
【００１０】キメラｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４の神経
毒性の改変 上記の「神経毒性に影響するデングゲノムにおける突然
変異」と題する項において説明したように、組換えデン
グ熱ウイルス構築物を、部位特異的突然変異誘発または
ＰＣＲなどによる突然変異誘発により改変し、神経毒性
特性が低減したことによりワクチン接種に適した改変ウ
イルスを生成する。ここに開示するように、同様な技術
を用いて、ｖＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ゲノムを改変して神経
毒性を低減させることができ、これにより、ＴＢＥＶに
対する弱毒化ウイルスワクチンの安全性が改善される。
ＴＢＥＶの防御抗原を維持し、かつ、ＴＢＥＶの周辺侵
入性を欠く、活性ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４キメラを構築する
ことができれば、この重要な病原体の免疫予防のための
新規な戦略、すなわち、弱毒化ＴＢＥＶワクチンの開発
の基盤が得られる。しかしながら、このゴールに到達す
るには、まず、キメラのさらなる改変を達成しなければ
ならない。すなわち、ウイルスの脳内への直接接種によ
り測定される、ＣＮＳに対する神経毒性の除去である。
ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４キメラは、親ＴＢＥＶの神経毒性を
維持しているため、キメラゲノムのＤＥＮ４またはＴＢ
ＥＶ部分において戦略的突然変異を加工し、マウス神経
毒性に対するそれらの効果を評価することにより、この
特性を無効にする必要があった。これらの突然変異体
は、ウイルスゲノム内の位置のいくつにでも導入される
突然変異を潜在的に含んでいる。初期の研究は、以下の
突然変異をもつキメラウイルスを評価した。すなわち、
（１）５’非コード領域における欠失、（２）ｐｒｅＭ
−Ｍ開裂部位またはｐｒｅＭあるいはＥあるいはＮＳ１
タンパク質のグリコシル化部位を除去する突然変異、
（３）Ｅ遺伝子における点突然変異である。これまでに
試験された突然変異は図２４に含まれている。ＴＢＥ
（ＭＥ）ＤＥＮ４構築物を系統的に改変し、神経毒性に
対する遺伝子的変更の効果について試験を行なうという
研究の一部として、タンパク質配列に１つ又はそれ以上
の変化を含む、６個の異なる構築物を作製した。実施例
２２参照。当業者であれば、本発明において提供される
技術を用いて、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に対し
て任意の数の置換、挿入、欠失を作製し、神経毒性にお
ける変化を試験することができる。同様に、当業者であ
れば、遺伝子組成における好ましくは少なくとも１つの
変更を有するキメラ構築物を、天然の配列を組合せたキ
メラ構築物と比べて試験するために、図２３に示す突然
変異をこれらのまたはその他の突然変異と組合せること
が容易に行なえる。突然変異体キメラウイルスの作製を
導く突然変異構築物の能力を評価する研究において、ト
ランスフェクションされたＬＬＣ−ＭＫ2細胞から６個
の突然変異体キメラを回収し、プラーク形態観察におけ
る変化についてウイルスを分析した。突然変異体ＴＢＥ
（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルスの子孫をＬＬＣ−ＭＫ2細
胞内の継代培養により増幅し、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞上ま
たは蚊Ｃ６／３６細胞上でのプラーク検定により分析し
た。キメラウイルスＴＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４は、Ｔ
ＢＥＶの３つの構造タンパク質遺伝子すべてを含んでい
たが、同様に分析された。また、野生型ＤＥＮ４も、対
照として用いられた。図２４に示すように、各細胞株上
のたいていの突然変異体のプラークサイズは、親ＴＢＥ
（ＭＥ）／ＤＥＮ４のウイルスプラークに比して縮減し
ており、これらの突然変異体はウイルス複製について制
限されていることが示唆される。ＥまたはＮＳ１に欠陥
グルコシル化部位を含んでいた突然変異体は、試験され
た数組の突然変異体の中で最小サイズのプラークを生じ
た。突然変異体キメラ構築物は、マウスにおける神経毒
性についてさらに試験された。実施例２１に記載される
ように、および、実施例２３に記載されるように、マウ
スにウイルスを接種した。脳炎の徴候および死亡につい
て、被感染マウスを３１日間観察した。*ＮＳ１（１）
−Ｇｌｃ-および*ＰｒｅＭ／Ｍ-突然変異を含む構築物
のＬＤ50は、１００ｐｆｕより大きく、これらの突然変
異体がマウス神経毒性において１００倍以上減少したこ
とが示された。この発見は、ＮＳ１（１）−Ｇｌｃ-、
ＰｒｅＭ／Ｍ-、あるいは両方の突然変異を、マウス神
経毒性の弱毒化を提供するために用いることができるこ
とを示す。この発見は、同様の突然変異を、日本脳炎ウ
イルスを含む他の脳炎フラビウイルスの弱毒化を提供す
るためにも採用できることを示唆するものである。さら
に、ＬＤ50の値の増加により証明されるとおりマウスに
おける神経毒性低下を示すこれらのキメラ構築物は、つ
ぎに、霊長類において試験されることはいうまでもな
い。実施例２４は、霊長類におけるワクチン効力に対す
る試験法を提供する。霊長類研究における成功に続き、
本発明のワクチンは、ヒトに対する臨床試験において試
験される。当業者であれば、霊長類での研究をヒトにお
ける研究に適したものに改変することができる。したが
って、本出願の発明は、多数のワクチンを提供するとと
もに、デング熱ウイルスやその他のフラビウイルスの血
清型に対する防御免疫反応を発生させるためにキメラデ
ング熱ウイルスワクチンを作製することを当業者に教示
する。このようなワクチン試料は、好ましくは、キメラ
ウイルスの集団を含み、各ウイルスは少なくとも１つの
デング熱ウイルスに対して構造タンパク質を発現する。
ウイルス学および分子生物学の当業者であれば、ここに
開示された技術を用いて、１つのフラビウイルスの構造
領域と第２のウイルスの非構造領域とを組合せたキメラ
ウイルスを作製することができる。好ましくは、この第
２のウイルスはデング熱ウイルスである、さらに好まし
くは、この第２のウイルスは４型デング熱ウイルスであ
る。さらに、本発明は、部位特異的突然変異誘発などを
用いてデング熱ウイルス構築物を改変することにより改
良されたデング熱ウイルスワクチンを作製することを当
業者に教示する。これらの改変は、キメラウイルス構築
物に同様に組み込まれることは言うまでもない。本発明
は、さらに、デング熱ウイルスの非構造領域および少な
くとも１つの構造領域を、別のフラビウイルスからの構
造遺伝子領域と組合せて含むキメラウイルスの作製なら
びに試験を教示する。特に、４型デング熱ウイルスから
の１つの構造領域ならびに非構造領域と、ＴＢＥＶから
の２つの構造タンパク質をコードする配列とを含むキメ
ラウイルスを含む、ＴＢＥＶのためのワクチンが開示さ
れている。ＴＢＥＶ（ＭＥ）／ＤＥＮ４についてこれま
でに観察された、励みになる成果は、これらの技術が、
ＴＢＥＶよりもデング熱ウイルスにより密接に関連した
ウイルスに対するワクチンを作製する際にも有用である
ことを示唆している。このような例の１つは、極東にお
いて依然として大きな公衆衛生問題である日本脳炎ウイ
ルスである。すなわち、さらなる実施例において、本発
明の技術は、ＤＥＮ４ｃＤＮＡ非構造領域を、日本脳炎
ウイルスからの少なくとも１つの構造遺伝子とＤＥＮ４
の残りの構造遺伝子領域に組合せるために用いられる。
さらに、本発明の技術を用いて、異なるフラビウイルス
間の非構造領域および構造領域の他の組合せを同様にし
て作製し試験することができることは言うまでもない。
たとえば、日本脳炎ウイルスの組換え構築物を、ウイル
ス非構造領域はそのままにして、１つ又はそれ以上の構
造領域をダニ媒介脳炎ウイルスからの対応する遺伝子配
列で置換するように改変することができる。同様に、ダ
ニ媒介脳炎ウイルスをコード化する組換えｃＤＮＡを生
成し、構造領域を、デング熱ウイルス構造タンパク質を
コード化する少なくとも１つの遺伝子で置換することが
できる。ここにおよび下記の実施例において引用される
すべての刊行物は参照として取り入れられる。以下、本
発明の特別な実施例を詳細に検討し、本発明の範囲内で
の可能な変型について言及する。本発明を成功裡に実施
することのできる、さまざまな代替技術や手順が当業者
には知られている。
【００１１】
【発明の実施の形態】ウイルス ： ４型デング熱ウイル
ス株８１４６６９を用いて、完全長感染性ＲＮＡ転写物
の転写源として用いられる完全長ｃＤＮＡを構築した
（Ｅ．Ｍａｃｋｏｗ他（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第
１５９巻２１７〜２２８頁、Ｂ．Ｚｈａｏ他（１９８
６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁）。アカ
ゲザル胎児肺細胞継代培養レベル９の１型デング熱ウイ
ルス西太平洋株（Ｄ１ＷＰ）の標本は、Ｋ．Ｅｃｋｅｌ
ｓ博士の好意により提供された（ＷＲＡＩＲ、ワシント
ンＤＣ）（Ｋ．Ｔ．ＭｃＫｅｅ他（１９８７）Ａｍ．
Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第３６巻４３５〜４４
２頁）。マウス脳継代培養レベル３８の、マウス神経毒
性２型デング熱ウイルスニューギニアＣ株（Ｄ２ＮＧ
Ｃ）のマウス脳標本は、Ｄ．Ｄｕｂｏｉｓ博士の好意に
より提供された（ＷＲＡＩＲ、ワシントンＤＣ）（Ａ．
Ｂ．Ｓａｂｉｎ（１９５２）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．
Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第１巻３０〜５０頁）。１型および２
型デング熱ウイルスは、Ｃ６／３６蚊細胞内で１回、継
代培養することにより増幅された。つぎに、これらの３
つのウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ2サル腎臓細胞内で１
回、継代培養された。得られたウイルス懸濁液はプラー
ク形態観察およびマウス神経毒性の研究に用いられた。クローニングベクター ： ４型デングゲノムの５’側半
分を含むプラスミドｐ５’−２を、３つの構造タンパク
質遺伝子の置換を容易にするために改変した（Ｃ．Ｊ．
Ｌａｉ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁）。ま
ず、唯一のＸｈｏＩ部位が、部位特異的突然変異誘発に
より、Ｅの３’末端の近くの、４型デング配列のヌクレ
オチド２３４２（Ａ−Ｇ）に導入され、ｐ５’−２（Ｘ
ｈｏＩ）を作製した。このヌクレオチド変更はアミノ酸
配列を変更するものではなかった。このベクターはつぎ
に、デング配列内の唯一のＢｓｔＢＩ部位において、お
よび、ｐ５’−２内のデング配列の直後の唯一のＡｓｐ
７１８部位において、消化された。断片はデング４ゲノ
ムの３’側半分に連結され、完全長ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）
を作製した。第２に、フラビウイルスに保存されてい
る、ヌクレオチド８８のＢｇｌII部位は、ｐ５’−２内
の他の３つのＢｇｌII部位を除くことにより、唯一の部
位とされた。ｐＢＲ３２２およびＳＰ６プロモーター間
の接合部におけるＢａｌII部位は、ＮｏｔＩリンカーを
挿入することにより除去された。４１２８および４２７
７の他の２つの部位は、最近導入された３４７３のＰｓ
ｔＩ部位までベクターを短くすることにより、除去され
た（Ｋ．Ｔ．ＭｃＫｅｅ他（１９８７）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒ
ｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第３６巻４３５〜４４２頁）。
つぎに、プラスミドｐ５’−２（ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ）
をフラグメント交換に用い、キメラｃＤＮＡを作製し
た。図１は、構築された完全長デングｃＤＮＡを含む、
以下のプラスミドを示す。ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）は、４型
デングゲノムの完全なｃＤＮＡコピーであり、唯一のＸ
ｈｏＩ部位がＥ遺伝子の３’末端の近くに創製された。
ｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）は、ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）から、５’
非コード領域内のＢｇｌII部位と唯一のＸｈｏＩ部位と
の間の配列を、１型デング西太平洋株の対応するｃＤＮ
Ａで置換することにより、得られた。ｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧ
Ｃ）は、同様にして、ＢｇｌII−ＸｈｏＩ断片を、２型
デングニューギニアＣ株からの対応するｃＤＮＡで置換
することにより、作製された。Ｂ：ＢｇｌII、Ｘ：Ｘｈ
ｏＩ、Ａ：Ａｓｐ７１８制限酵素部位。キメラｃＤＮＡ ： Ｃ６／３６蚊細胞内で増殖した１型
または２型デング熱ウイルスを精製し、Ｂ．Ｚｈａｏ他
（１９８６）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８
頁）により説明された手順にしたがってビリオンＲＮＡ
を抽出した。１型デング配列のヌクレオチド２３０６〜
２３３８にハイブリダイズするネガティブセンスオリゴ
ヌクレオチドを用いて、逆転写により、１型デング第１
鎖ｃＤＮＡを合成した。このプライマー配列は、上記の
ｐ５’−２（ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ）内の４型デングＥ遺
伝子内の部位に対応する位置にＸｈｏＩ部位を創製する
ために、ヌクレオチド２３１６におけるサイレントな第
３塩基変更（Ａ−Ｇ）を含んでいた。つぎに、１型デン
グｃＤＮＡを鋳型として、ネガティブセンスオリゴヌク
レオチドおよび１型デングヌクレオチド５１〜７０にハ
イブリダイズする保存されたＢｇｌII部位を含むポジテ
ィブセンスプライマーを用いて、ＰＣＲにより２本鎖Ｄ
ＮＡを合成した。ＰＣＲ産物をＢｇｌIIおよびＸｈｏＩ
で消化し、つぎに、ｐ５’−２（ＸｈｏＩ，ＰｓｔＩ）
にクローン化し、対応する４型デング配列を置換した。
つぎに、１型デング配列を含むＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片
をｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）からの残りの４型デングｃＤＮＡ
に連結し、完全長キメラｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）を創製し
た。同様に、２型デングヌクレオチド２３１０〜２３６
４にハイブリダイズするネガティブセンスプライマーを
用いて、２型デング第１鎖ｃＤＮＡを合成した。このプ
ライマーは、２３３３におけるＴ−Ｃ、２３３６におけ
るＡ−Ｇ、２３３７におけるＣ−Ａの、３つの塩基変更
を含む。これらの変更は、上述した４型デング遺伝子に
おけるＸｈｏＩ部位に対応する位置にＸｈｏＩ部位を創
製する。これらの変更はアミノ酸配列を変えるものでは
なかった。ＰＣＲによる２本鎖ＤＮＡ合成のために、ネ
ガティブセンスプライマーが用いられ、１型デングに対
してはポジティブセンスプライマーが同じく用いられ
た。ＰＣＲ産物をＢｇｌIIおよびＸｈｏＩで消化し、ｐ
５’−２（ＸｈｏＩ）にクローン化し、ＣｌａＩ−Ｘｈ
ｏＩ断片を用いてｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）の対応する断片を
置換してｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を作製した。ＲＮＡ転写、トランスフェクション、およびウイルスの
回収 ： 完全長ＲＮＡ転写物を用いた細胞のトランスフ
ェクションは、Ｃ．Ｊ．Ｌａｉ他（１９９１）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８８巻５１
３９〜５１４３頁に記載されているようにして実施され
た。トランスフェクションの１０日後、細胞はトリプシ
ン処理され、６穴プレートおよびチェンバースライドに
移された。２日後、免疫蛍光検査（ＩＦＡ）により、デ
ング熱ウイルス抗原の存在について、スライド上の細胞
を試験した。ほとんどの細胞が感染したことがＩＦＡに
より示された場合には、６穴プレート内の細胞をトリプ
シン処理し、６倍量の非感染細胞と混合し、通常６〜７
日後に細胞病理効果（培地内の多数の死亡細胞の出現）
があらわれるまで、インキュベートした。つぎに、培地
を取り出し、細胞をかきとり、標準容積の５０％Ｅａｇ
ｌｅ最小必須培地／５０％血清に再懸濁し、凍結するこ
とにより、感染細胞を収穫した。他方、陽性細胞の割合
が小さい場合には、細胞をトリプシン処理し、新鮮培地
に１：３で希釈し、非感染細胞を添加せずに増殖させ
る。感染細胞の割合を週ベースで評価し、間隔をおいて
細胞溶解物を収穫しウイルスの力価を測定した。デング熱ウイルス抗原の検出 ： 感染細胞は、血清型特
異的モノクローナル抗体（ｍａｂ）１Ｆ１（１型デン
グ）、３Ｍ５（２型デング）、５Ｄ４（３型デング）、
１Ｈ１０（４型デング）およびＮＳ１特異的ｍａｂ１Ｇ
６（４型デング）を用いて、ＩＦＡにより分析された。
これらは、もともとＭ．Ｋ．Ｇｅｎｔｒｙ博士および
Ｅ．Ｈｅｎｃｈａｌ博士により作製されたものである
（ＷＲＡＩＲ、ワシントンＤＣ）（Ｅ．Ａ．Ｈｅｎｃｈ
ａｌ他（１９８２）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙ
ｇ．第３１巻５４８〜５５５頁）。モノクローナル抗体
は、１：５０〜１：３００の希釈で用いた。一方、フル
オレセイン接合抗マウス抗血清（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒ
ｄ−Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーラ
ンド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）は１：１００で用い
た。結果は写真で記録した。各ｍａｂについて、陰性結
果を生じた感染細胞を、陽性細胞と同じ露光時間で写真
撮影した。親（野生型）デング熱ウイルスと子孫ウイル
スｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のタンパク質を分析するため、６
穴プレート内のコンフルエントＬＬＣ−ＭＫ 2細胞をＭ
ＯＩ ０．２でウイルスに感染させた。感染の６日後、
６時間にわたり５０μＣｉ／ウェルのＳ−メチオニンを
含まない培地で細胞を標識した。つぎに、ＲＩＰＡ緩衝
液に細胞を溶解した。キメラウイルスｖ２Ａ（Ｄ１Ｗ
Ｐ）については、細胞のほぼ１００％が感染したとき
に、標識化を実施した。一方、ｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）に
ついては、約３０％が感染したときに標識化を実施し
た。適当な同型または異型高度免疫マウス腹水（ＨＭＡ
Ｆ）を用いて溶解物を沈殿させ、ＳＤＳ−１２％ポリア
クリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。プラーク形態 ： ウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞上で
のプラーク形態について調べられた（Ｗ．Ｈ．Ｂａｎｃ
ｒｏｆｔ他（１９７９）Ｐａｎ．Ａｍ．Ｈｌｔｈ．Ｏｒ
ｇ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８
頁）。プラーク形態の分析の前に、各親ウイルスをＬＬ
Ｃ−ＭＫ2細胞内で１回、継代培養した。インキュベー
ションの６〜９日後に、ニュートラルレッドを培養物に
重層した。乳児マウスにおけるキメラウイルスの評価 ： 生後３日
のスイスマウスに、２０００ｐｆｕの親またはキメラデ
ング熱ウイルスを、ウイルスに感染したＬＬＣ−ＭＫ2
細胞を希釈した溶解物の形で、脳内接種した。陰性対照
マウスには非感染細胞の溶解物を注射した。親４型デン
グ熱ウイルス（８１４６６９）、１型デング熱ウイルス
ＷＰ、または２型デング熱ウイルスＮＧＣについて、１
リットルが接種された。ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）、ｖ２Ａ
（Ｄ１ ＷＰ）、またはｖ２Ａ（Ｄ２ ＮＧＣ）につい
て、２リットルが接種された。２１日間にわたり、脳炎
の徴候および死亡について接種されたマウスを監視し
た。
【００１２】
【実施例】
【実施例１】キメラｃＤＮＡおよびウイルス 完全長４型デング熱ウイルスｃＤＮＡ（ｐ２Ａ）を用
い、構造遺伝子配列を１型または２型デング熱ウイルス
の対応する配列により置換したキメラウイルスを構築し
た。この目的のために選択された１型ウイルス（ＷＰ）
は、マウスの脳内での増殖に適さなかった低レベルの継
代組織培養株であった。２型株（ＮＧＣ）は、マウスに
おける脳内連続継代培養の間に選抜された神経毒性の高
い突然変異体であった。２型突然変異体がこの研究のた
めに選択されたのは、マウス神経毒性の遺伝的決定基の
マッピングの可能性を提供するからである。プラスミド
構築体ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）、ｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）、また
はｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を用いた大腸菌ＨＤ１５２８株
の形質転換により、安定なプラスミド集団が創製され
た。これらのプラスミドの推定された構造は図１に示さ
れている。これらの構造は制限酵素マッピングにより証
明された。第１２日目のデング熱ウイルス抗原に対する
免疫蛍光染色により、ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）からのＲＮＡ
転写物でトランスフェクションされたＬＬＣ−ＭＫ2細
胞のほぼ半数が陽性であった（図２Ａ）。図２は、
（Ａ）ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）、ｐ２Ａ（Ｄ１Ｗ）、または
ｐ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）からのＲＮＡ転写物を同一濃度で
用いてトランスフェクションしたＬＬＣ−ＭＫ2細胞を
示す。トランスフェクション後のウイルス感染細胞のパ
ーセンテージは、新鮮培地中に移した後でＩＦＡにより
測定された。（Ｂ）細胞の大多数がＩＦＡで陽性となっ
たときに感染細胞を収穫した。ウイルスの力価測定はプ
ラーク検定により実施された（Ｗ．Ｈ．Ｂａｎｃｒｏｆ
ｔ他（１９７９）ＰａｎＡｍ．Ｈｌｔｈ．Ｏｒｇ．Ｓｃ
ｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁）。以前の
研究において、ｐ２Ａおよびｐ２Ａ（ＰｓｔＩ）からの
転写物を用いたトランスフェクションの１２日後に、２
０〜５０％の範囲の同様な割合の抗原陽性細胞が観察さ
れた。いずれの場合にも野生型表現型をもつウイルスが
産生された（Ｃ．Ｊ．Ｌａｉ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８８巻５１３９
〜５１４３頁）。一方、ｐ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）またはｐ２
Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）からの転写物を用いてトランスフェク
ションされた細胞は、１２日目に、その１％未満が陽性
であった。ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）に感染した細胞の割合
は、１９日目にほぼ５％、２６日目に３０％、３３日目
に８０％に増加した。このとき、トランスフェクション
された細胞内に存在するウイルスの力価は５×１０6ｐ
ｆｕ／ｍＬであった（図２Ａおよび２Ｂ）。また、ｖ２
Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）はよりゆっくりと増殖した。我々は、
１９日目に細胞の１％が陽性であると算定したが、５４
日目までに感染したのは細胞の３分の１に満たなかっ
た。ウイルス力価は３０日目には１．５×１０2ｐｆｕ
／ｍＬ、４４日目には２．５×１０2に過ぎなかった。
１０4ｐｆｕ／ｍＬに到達したのは５８日目であった。
トランスフェクションの７２日後に、細胞の大多数が感
染し、細胞懸濁液の力価が１０ 2ｐｆｕ／ｍＬであるこ
とが認められた。ｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）ＲＮＡ転写物（１
０6ｐｆｕ／ｍＬ）でトランスフェクションした細胞に
より生成されるウイルスの力価は、細胞培養に４型ウイ
ルスをＭＯＩ ０．１で感染させたときに観察されたも
のと同じであった。さらに、１型／４型キメラ（５×１
０6ｐｆｕ／ｍＬ）でトランスフェクションされた培養
により生成されるウイルスの最高力価は、１型ウイルス
（１．５×１０7ｐｆｕ／ｍＬ）をＭＯＩ０．１で用い
て細胞培養を感染させた後に観察されたものと同じであ
った。トランスフェクション（１０2ｐｆｕ／ｍＬ）の
後に生成される２型／４型キメラの最高力価は、ＭＯＩ
０．５で親２型ウイルスに感染させた細胞培養により生
成されたものと同じであった。
【００１３】
【実施例２】キメラ構造タンパク質の性質 図３に示すように、子孫ウイルスを調べるために、間接
的免疫蛍光検査を実施した。図３は、ｖ２Ａ（Ｘｈｏ
Ｉ）、ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）、または、ｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧ
Ｃ）に感染させたＬＬＣ−ＭＫ2細胞、もしくは非感染
細胞上で実施された免疫蛍光検定を示す。モノクローナ
ル抗体は、１：５０〜１：３００の希釈で用いた。一
方、フルオレセイン接合抗マウス抗体は１：１００で用
いた。モノクローナル抗体の血清型特異性は左側に示さ
れている。ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）に感染させた細胞は、Ｉ
ＦＡにより、４型デング特異的ｍａｂＩＨ１０で染まっ
たが、１型デング特異的ｍａｂ １Ｆ１または２型デン
グ特異的ｍａｂ ３Ｍ５には結合しなかった。予測され
たように、ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）に感染した細胞は１Ｆ１
とのみ反応した。ｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）に感染したもの
は、３Ｈ５のみに染まった。３型デングに特異的なｍａ
ｂ ５Ｄ４は、どの感染細胞とも反応しなかった。これ
らの結果は、キメラウイルスの両方とも、その構造タン
パク質遺伝子により特定される免疫原性をあらわすこと
を示した。期待されるように、４型デング非構造タンパ
ク質ＮＳ１に特異的なｍａｂ １Ｇ５は、４型デングｃ
ＤＮＡすなわち２Ａ（ＸｈｏＩ）の子孫に感染した細胞
を染めた。なお、４型ウイルスに由来するキメラウイル
ス２Ａ（Ｄ１ＷＰ）または２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）の各々に
ついても同様であった。親４型デング熱ウイルスの、お
よび、そのｃＤＮＡ由来の子孫ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のタ
ンパク質は、同型ＨＭＡＦを用いた免疫沈殿検査とその
後のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する
と、同一のようであった（図４）。図４は、ウイルス感
染ＬＬＣ−ＭＫ2細胞または非感染対照細胞の35Ｓ−メ
チオニン標識された溶解物を示し、１型、２型、４型デ
ングに対して作製された高度免疫マウス腹水（ＨＭＡ
Ｆ）で免疫沈降され、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミ
ドゲル（アクリルアミド：ビス＝６０：１．６）上の電
気泳動により分析された。各レーンの先頭に、ウイルス
が縦に示され、溶解物を免疫沈降させたＨＭＡＦが横に
示されている。マーカー：タンパク質分子サイズマーカ
ーはキロダルトンである。１型、２型、４型デングのＥ
およびｐｒｅ−Ｍグリコタンパク質の位置が示されてい
る（図４）。さらに、親１型デング熱ウイルス（ＷＰ）
および２型デング熱ウイルス（ＮＧＣ）のタンパク質を
分析した。１型デングおよび２型デングのＥグリコタン
パク質は共に移動したが、それらは４型デングよりもゆ
っくりと移動した。同様に、１型および２型デングのｐ
ｒｅ−Ｍグリコタンパク質は共に移動したが、やはり４
型デングのｐｒｅ−Ｍよりもゆっくりと移動した。Ｅタ
ンパク質の相対的な分子サイズの相違はほぼ４ｋｄであ
った。一方、ｐｒｅ−Ｍタンパク質については約１ｋｄ
であった。これらＥおよびｐｒｅ−Ｍの分子サイズの相
違は、おそらく、グリコシル化の程度における変化また
は配座的相違によるものであろう。ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）
およびｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）ウイルスの免疫沈降された
タンパク質はハイブリッドパターンを示した。１型デン
グＨＭＡＦを用いて免疫沈降したｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）の
ｐｒｅ−ＭおよびＥは、親１型デングのｐｒｅ−Ｍおよ
びＥと共に移動した。しかし４型デングＨＭＡＦは、４
型デング非構造タンパク質と共に移動したバンドだけを
沈降した。親２型デングのｐｒｅ−ＭおよびＥも同様で
あったが、４型デングＨＭＡＦは４型ウイルスのものに
似ている非構造タンパク質を沈降させた。親４型デング
熱ウイルスおよびそのｃＤＮＡ由来の子孫ｖ２Ａ（Ｘｈ
ｏＩ）は、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞（図示せず）上に同様の
プラークを生成した。親ウイルスのプラークは、感染の
６日後にニュートラルレッドで染色すると明確に目視で
きた。しかし、キメラｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）は、その時
点では、検出可能なプラークを生成しなかった。しかし
ながら、染色を第９日まで遅らせると、非常に小さいｖ
２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）プラークが検出され、これはｖ２Ａ
（ＸｈｏＩ）または野生型２型デングＮＧＣのものより
も非常に小さかった（図５）。４型デング８１４６６９
のプラークは、子孫ウイルスｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のそれ
とは異ならなかった。ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）のプラークは
基本的にｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のものと同様であった。図
５は、被感染ＬＬＣ−ＭＫ2細胞の単層を示し、子孫ウ
イルスｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）のものとは異なっている。ｖ
２Ａ（Ｄ１ＷＰ）のプラークは基本的にはｖ２２Ａ（Ｘ
ｈｏＩ）のものと同様であった。図５は、デングウイル
スに感染し、ついでアガロースオーバーレイが加えられ
たＬＬＣ−ＭＫ2の単層（モノレイヤー）を示す（Ｗ．
Ｈ．Ｂａｎｃｒｏｆｔ他（１９７９）Ｐａｎ Ａｍ．Ｈ
ｌｔｈ．Ｏｒｇ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５
〜１７８頁）。細胞単層の感染の９日後、ニュートラル
レッドを重層し、翌日プラークの写真を撮影した。Ａ：
２Ａ（ＸｈｏＩ）、Ｂ：２Ａ（Ｄ１ＮＧＣ）、Ｃ：野生
型ＮＧＣ３型デング。
【００１４】
【実施例３】乳児マウスに対するウイルスの神経毒性 キメラｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を、その親ウイルスである
マウス脳適合２型デングＮＧＣおよびｖ２Ａ（Ｘｈｏ
Ｉ）と、マウス神経毒性について比較した。２型デング
ＮＧＣはもっとも迅速な致死性をもつことが証明され
た。接種後第５日または第６日に１０匹のマウスの各々
が脳炎で死亡し、平均生存時間は５．１日であった。一
方、キメラｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧＣ）を接種した１５匹のマ
ウスの各々は死亡するまで８〜１１日間生存し、平均生
存期間９．１日であった（図６）。図６は、親またはキ
メラデングウイルス２０００ｐｆｕを、被感染ＬＬＣ−
ＭＫ2細胞を希釈した溶解物の形で脳内接種した生後３
日のスイスマウスについて示す。注射されたマウスの数
は：２型デング（ＮＧＣ）１０匹、ｖ２Ａ（Ｄ２ＮＧ
Ｃ）１５匹、４型デング８１４６６９ １２匹、ｖ２Ａ
（ＸｈｏＩ）１８匹。陰性対照（マウス１１匹）には非
感染細胞の希釈溶解物を注射した。マウスは、脳炎の徴
候および死亡について毎日観察された。生存分布におけ
る差異は大きい（ｐ＝００００１、スミルノフ２点統
計）。さらに、親ウイルス４型デング８１４６６９は、
その子孫ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ）と比較された。親ウイルス
を接種した１２匹のマウスのうち５匹が脳炎で死亡し、
最初の死亡は第１１日に起きた。一方、ｖ２Ａ（Ｘｈｏ
Ｉ）を接種した１８匹のマウスのうちただ１匹だけが接
種の１６日後に死亡し残りは健康を保った。生存分布
は、スミルノフ統計によれば大きく異なってはいない
（ｐ＞．１４）が、２つのグループの生存率はフィッシ
ャー精密試験では異なっている（ｐ＝．０２５６）。こ
のことは、４型デング８１４６６９、または、ウイルス
調製におけるビリオンのサブセットが、ある程度の神経
毒性を所有していること、および、子孫ウイルスｖ２Ａ
（ＸｈｏＩ）が非神経毒性の下位集団［ｓｕｂ−ｐｏｐ
ｕｌａｔｉｏｎ］をつくるかクローニングまたはウイル
ス繁殖の際に生じるヌクレオチド変化を含むことを示唆
している。親１型デング熱ウイルス（ＷＰ）を接種した
マウスと、またはそのキメラ子孫ｖ２Ａ（Ｄ１ＷＰ）を
注射した１２匹のマウスと、非感染細胞の溶解物を受け
入れた１１匹のいずれも、脳炎を起こさなかったし死亡
しなかった。
【００１５】突然変異分析 我々は、４型デング熱ウイルスゲノムの完全長にわたる
一連のデングｃＤＮＡインサートをクローン化した。こ
れらは、実施例４にあるように、完全長デングＤＮＡを
クローン化するという最初の試行において用いられた。
【００１６】
【実施例４】ＳＰ６プロモーターを含むプラスミドｐＢ
Ｒ３２２における完全長デングＤＮＡをクローン化する
最初の試行 さまざまな４型デングｃＤＮＡインサートを、共有され
た制限酵素部位において連結し、ｐＢＲ３２２の同じＰ
ｓｔＩクローニング部位を用いて、完全長デングＤＮＡ
コピーを形成した。インビトロ転写のために、ＳＰ６ポ
リメラーゼプロモーター配列を、デング配列の前の５’
末端に配置した。ＲＮＡ転写物の予測された５’配列は
図７に示されている。第１のデングヌクレオチドのＡ残
基は、Ｇで始まる正常ＳＰ６ポリメラーゼ転写物の直後
に位置している。ゲノムＲＮＡの５’末端に存在するｍ
７Ｇキャップ構造は、転写反応にｍ７ＧｐｐｐＧ類似物
を添加することにより得られる。このようなＤＮＡ構造
は、５’末端に付加ヌクレオチドを含むデングＲＮＡを
生成することになるだろう。ランオフ［ｒｕｎ−ｏｆ
ｆ］転写物を作製するために、唯一のＡｓｐ７１８開裂
配列が、デング配列の３’末端に導入された。図７に示
すように、鋳型鎖中には、Ａｓｐ７１８開裂部位の前に
５個の付加ヌクレオチドが存在する。転写が最後のヌク
レオチドに進むと、ＲＮＡ転写物には、３’末端におけ
るこれらの５個の付加残基が含まれることになる。形質
転換のための宿主として大腸菌株ＨＢ１０１を用いたこ
の研究中に気づいたことは、完全長デングＤＮＡを含む
プラスミドは、再配列を経た多くの形質転換体における
プラスミドとしてしばしば不安定であり、予測された制
限酵素パターンをもつクローンＤＮＡを単離するために
は多数のコロニーをスクリーニングしなければならない
ということである。我々は、異なる大腸菌株により作製
されるプラスミドの安定性を調べた。研究室ですでに用
いられていた、形質転換に高度に適した市販の大腸菌株
ＤＨ５αおよび大腸菌株ＤＢ１５２８を、大腸菌株ＨＢ
１０１と比較した。ＤＢ１５２８株は、ＨＢ１０１より
もコロニーサイズが３〜４倍大きい形質転換体を産生し
た。特に、ＤＢ１５２８の形質転換体は、一般に、予測
された制限酵素パターンをもつプラスミドを産生し、こ
のことは、大腸菌株ＤＢ１５２８が、安定的にクローン
化されたデング完全長ＤＮＡを生成するための優秀な株
であることを示唆している。しかしながら、トランスフ
ェクション細胞上で試験した場合、この第１の完全長デ
ングＤＮＡクローンから作製されたインビトロＲＮＡ転
写物は、デング熱ウイルスを産生しなかった。ここで、
免疫蛍光検定により検出されるように、１００倍低い濃
度の、陽性対照としてのビリオンＲＮＡはデング熱ウイ
ルスを産生した。
【００１７】
【実施例５】独立に由来するＤＮＡクローンを用いた、
完全長構築物におけるデングＤＮＡセグメントの置換 感染性ＲＮＡ転写物を産生できないのは、完全長クロー
ンにおける欠陥突然変異の存在によるものであると説明
された。このような突然変異は、ウイルス株における欠
陥集団のクローニングまたはプラスミドのクローニング
または繁殖の際の結合エラーから生じると推定される。
我々は、１つ又はそれ以上の欠陥突然変異を含むデング
ＤＮＡセグメントを、独立にクローン化したデングＤＮ
Ａ構築物からの対応するセグメントで置換することに決
定した。系統的な置換実験のためのフレームワークとし
て、デング配列の５’および３’断片を別々にクローン
化した。ヌクレオチド５０６９における唯一のＢｓｔＢ
１部位を用いて、完全長デング配列を、各々ゲノムの約
５０％を示す２つの断片に分離した。ＳＰ６プロモータ
ーを含む第１の完全長クローンの５’断片は、５’−１
と呼ばれ、ＢｓｔＢ１とＡｓｐ７１８の間の残りの３’
配列は３’−Ａと呼ばれた。第２の５’断片５’−２を
含むプラスミドは、独立に由来するひと組のデングｃＤ
ＮＡインサートから構築された。唯一のＡｓｐ７１８部
位は、デング配列のＢｓｔＢ１部位の下流のｐＢＲ３２
２のＰｓｔＩ部位に導入された。このように、このプラ
スミドは、完全長ＤＮＡ構築物に３’断片を挿入するた
めのクローニングベクターとしても適している。２つの
付加３’断片３’−Ｂおよび３’−Ｃも、デングｃＤＮ
Ａインサートの独立したひと組から構築された（図
８）。第１の完全長クローン１Ａ内の３’断片を３’−
Ｂおよび３’−Ｃ断片で置換すると、２つの別の完全長
クローン１Ｂおよび１Ｃが作製された。同様に、３つの
完全長ＤＮＡ構築物すべてにおいて５’断片を５’−２
断片で置換すると、３つの別の完全長クローン、すなわ
ち、２Ａ、２Ｂ、２Ｃが生成された。これらのプラスミ
ドをＢｇｌII、ＮｓｉＩ、Ａｓｐ７１８で消化すると、
図９に示されるように、６個の完全長クローンすべてに
ついて区別不可能な、予測されたＤＮＡ断片のパターン
を示した。このように、大腸菌株ＤＢ１５２８中の完全
長デングＤＮＡ配列を明らかに含むプラスミドの増殖に
成功することによって、培養細胞における感染性の評価
のためのインビトロＲＮＡ転写物の生成が可能となっ
た。
【００１８】
【実施例６】インビトロで作製されたＲＮＡ転写物の感
染性についての最初の証拠 構築された完全長デングＤＮＡ鋳型から生成されたＲＮ
Ａ転写物は、ＬＬＣ−ＭＫ2のトランスフェクションに
より、感染性についてそれぞれ試験された。デング感染
細胞は、間接的免疫蛍光検定により検出されるとおり、
２Ａ ＲＮＡでのトランスフェクションの１０日後に容
易に観察された。他の４つの完全長ＤＮＡクローンから
のＲＮＡ転写物は、この検定では陰性であり、これらの
ＤＮＡクローンは、クローン１Ａのように、制限酵素分
析では検出できない致死突然変異を含んでいることが示
された。上述したデング熱ウイルス感染細胞の陽性判定
に加えて、感染性デング熱ウイルスを、培地または２Ａ
ＲＮＡトランスフェクション細胞の細胞溶解物から回
収した。トランスフェクション細胞溶解物中に存在する
デング熱ウイルスの力価は１０5ｐｆｕ／ｍＬであっ
た。２Ａ ＲＮＡ転写物をＤＮａｓｅＩを用いて処理し
た場合、その感染性には影響がなかったが、ＲＮａｓｅ
処理ではその感染性は完全に損なわれた。ＲＮＡを用い
た細胞モノレイヤーのトランスフェクションの後、デン
グ熱ウイルスのプラーク形成は行なわれなかったため、
ウイルスの生成は、ウイルス増幅のための延長されたイ
ンキュベーションの後で判定された。この間接的免疫蛍
光検定手順を用いて、感染性は、ゲノムＲＮＡ１ｎｇま
たは２ＡＲＮＡ転写物１０ｎｇの最小濃度において検出
された。この試験のこれらの結果は、クローン２Ａから
作製されたＲＮＡ転写物が、受容培養細胞のトランスフ
ェクションの後で、感染性を持つことを示している。
【００１９】
【実施例７】ＲＮＡ転写物の感染性についてのその他の
証拠 クローン２Ａ ＲＮＡ転写物でトランスフェクションし
た細胞により、感染性デング熱ウイルスが生成されたこ
とを正式に証明するため、デングゲノムのヌクレオチド
３４７３に新たなＰｓｔＩ部位を創製するがアミノ酸配
列には影響しない２つの突然変異（Ｇ３４７３−→Ｔお
よびＣ３４７６−→Ｔ）を、完全長デングクローン２Ａ
ＤＮＡに導入した。この突然変異ＤＮＡから作製され
たＲＮＡ転写物を、ＤＮａｓｅＩを用いた消耗性消化に
よりＤＮＡ鋳型を完全に除去したのち、細胞のトランス
フェクションに用いた。トランスフェクションされた細
胞は感染性デング熱ウイルスを生成した。子孫ウイルス
から抽出されたゲノムＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡ産物
をＰＣＲのための鋳型として用いて、ヌクレオチド３１
９３〜４５３６の間にＤＮＡ断片を生成した。図１０に
示すように、ＰＣＲＤＮＡ産物のＰｓｔＩ消化は、Ｐｓ
ｔＩ開裂配列の存在により予測されるように、それぞれ
２８０個および１０６３個の塩基対の長さの２つの断片
を産生した。２Ａ ＲＮＡ由来のウイルスの対照ＰＣＲ
ＤＮＡ産物は、ＰｓｔＩ消化に対しては非感受性であっ
た。この観察は、突然変異体２Ａ ＤＮＡのＲＮＡ転写
物に由来する子孫ウイルスがＰｓｔＩ部位を含むことの
証拠を提供した。
【００２０】
【実施例８】インビトロで転写された感染性ＲＮＡから
回収されたデング熱ウイルス クローン２Ａまたはクローン２Ａ（Ｐｓｔ）鋳型から作
製されたＲＮＡ転写物を用いてトランスフェクションし
た細胞の溶解物から子孫デング熱ウイルスを分離し、Ｌ
ＬＣ−ＭＫ2細胞単層上でのプラーク形成能力につい
て、親・野生型ウイルスと比較した。感染の６日後、子
孫ウイルスおよび親ウイルスは、ともに、さまざまな大
きさの特徴的なデングプラークを生成した。蚊細胞内の
継代培養により増殖した親ウイルスでは圧倒的に小型プ
ラークがみられたが、子孫ウイルスでは混合的でありし
かし主に大きいプラークが生成され、回収されたウイル
スがクローン化集団を提供することを示唆している。子
孫ウイルス感染細胞および親ウイルス感染細胞において
生成されたデング特異タンパク質についても比較を行な
った。図１１に示すように、デング高度免疫腹水により
沈殿させたＰｒｅＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２、およびその
他未決定のデングタンパク質バンドのプロフィールは、
子孫ウイルスおよび親ウイルス双方について識別不可能
であるように見えた。この結果は、回収されたデング熱
ウイルスが、ｃＤＮＡクローンが由来するもとのウイル
スと同じ遺伝子型および表現型を呈することを示すもの
である。 ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂接合部におけるアミノ酸置換によ
る活性デング熱ウイルスの加工
【００２１】
【実施例９】開裂部位配列におけるアミノ酸置換を特定
するＮＳ１−ＮＳ２Ａ ＤＮＡの構築 真正［ａｕｔｈｅｎｔｉｃ］ＮＳ１の発現のために構築
された中間組換えｐＳＣ１１−ＮＳ１−ＮＳ２Ａ ＤＮ
Ａをこの研究に用いた。デング熱ウイルスＤＮＡは、２
４アミノ酸Ｎ末端信号のためのコード配列と、ＮＳ１お
よびＮＳ２Ａの完全ポリペプチド配列を含んでいた。ま
ず、このプラスミドＤＮＡを、突然変異を含むＤＮＡセ
グメントの置換を容易にするために改変した。２つのサ
イレントな突然変異が、オリゴヌクレオチド特異的突然
変異誘発により、ＮＳ１−ＮＳ２ＡＤＮＡ（Ｇ3473→Ｔ
およびＣ3476→Ａ）に導入された。これらの変更は、ヌ
クレオチド（ｎｔ）３４７６に新たなＰｓｔＩ部位を作
製した。組換えプラスミドは、デングＮＳ１コード配列
中のｎｔ３３２０に唯一のＮｃｏＩ部位を含んでいた。
ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂接合部はｎｔ３４７７に位置して
いる。開裂部位配列にアミノ酸置換を導入するために、
オリゴヌクレオチド誘発突然変異により、ヌクレオチド
変更を行った。一連のオリゴヌクレオチドを合成し、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における負鎖プライマー
として用いた。正鎖プライマーは、５’ＡＡＧＧＣＴＡ
ＴＧＣＣＡＣＧＣＡＡＡ３’（配列番号１）であり、Ｎ
ｃｏＩ部位の上流に位置していた。たとえば、開裂位置
−２（Ｔｈｒ1124）において、オリゴＧＣＣ ＣＴＧ
ＧＣＣ ＧＧＣ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＴＧＴＧＡ ＴＴ
Ｔ ＧＡＣ ＣＡＴ（配列番号２）が、ＴｈｒをＬｙｓ
で置換するために用いられた。同様にして、オリゴＧＣ
Ｃ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＧＣＣＴＧ ＣＡＣ ＣＴＧ
ＴＧＡ ＴＴＴ ＧＡＣ ＣＡＴ（配列番号３）が、Ｔ
ｈｒをＧｌｎで置換するために用いられ、オリゴＧＣＣ
ＣＴＧ ＧＣＣＧＧＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＴＧ Ｔ
ＧＡ ＴＴＴ ＧＡＣ ＣＡＴ（配列番号４）が、Ｔｈ
ｒをＬｅｕで置換するために用いられた。同様に、オリ
ゴＴＴＣＴＧＡ ＴＧＴ ＧＣＣ ＣＴＧ ＴＴＣ Ｇ
ＧＣ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＴＧＴＧＡ（配列番号５）
が、開裂位置＋１においてＧｌｙ1120をＧｌｕで置換す
るために用いられ、あるいは、オリゴＴＴＣ ＴＧＡ
ＴＧＴ ＧＣＣ ＣＴＧＣＣＡＧＧＣ ＣＧＴ ＣＡＣ
ＣＴＧ ＴＧＡ（配列番号６）が、開裂位置＋１にお
いて同じＧｌｙをＴｒｐで置換するために用いられた。
特定された突然変異を含む中間組換えＤＮＡの構築のた
め、あらたに作製されたＰｓｔＩ部位と唯一のＮｃｏＩ
部位の間のＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで開
裂されたＰＣＲ ＤＮＡ産物のシリーズで置換した。こ
れらの突然変異体ＮＳ１−ＮＳ２Ａ配列を発現する組換
えワクシニアウイルスは、すでに説明された手順（Ｂ．
Ｚｈａｏ、Ｇ．Ｐｒｉｎｃｅ、Ｒ．Ｈｏｒｓｗｏｏｄ、
Ｋ．Ｅｃｋｅｌｓ、Ｐ．Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｒ．Ｃｈａｎ
ｏｃｋ、およびＣ．Ｊ．Ｌａｉ（１９８７）、組換え体
ワクシニアウイルスによるデング熱ウイルス構造タンパ
ク質および非構造タンパク質ＮＳ１の発現、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．第６１巻４０１９〜４０２２頁）にしたがって作
製された。
【００２２】
【実施例１０】ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接合部における開裂の
分析 ６穴プレート内のコンフルエントＣＶ−１細胞を、細胞
あたり５ｐｆｕの組換えワクシニアウイルスに感染さ
せ、最小必須培地に２％ウシ胎児血清（ＭＥＭ２）を加
えた中に保持した。感染の１６〜２０時間後、培地を取
り出してメチオニン非含有ＭＥＭ２とともに置いた。１
時間のインキュベーションの後、この培地は、ふたた
び、１００μの35Ｓメチオニン（比放射能＞８００μ／
ｍｏｌ）を含む０．７ｍＬのメチオニン遊離ＭＥＭ２と
ともに置かれた。２時間の標識期間の後、ＲＩＰＡ緩衝
液（デオキシコール酸ナトリウム１％、Ｎｏｎｉｄｏｔ
Ｐ−４０を１％、硫酸ドデシルナトリウム［ＳＤＳ］
０．１％、０．１Ｍ トリス塩酸、ｐＨ７．５、０．１
５Ｍ ＮａＣｌ）に細胞を溶解し、溶解物を遠心分離し
て細胞砕片を除く。溶解物の澄んだ上澄み液に対して、
デング高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）を用いた免疫沈
降検査を行ない、デング熱ウイルスを分析した。免疫沈
殿物は、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル（アク
リルアミド／ビス比６０：１．６）上の電気泳動分離に
より分析された。標識されたタンパク質バンドは、蛍光
撮影により視覚化された。非開裂ＮＳ１−ＮＳ２Ａ前駆
体および開裂ＮＳ１産物に対応するゲルバンドが切り出
され、液体シンチレーションカウンターで放射能が計測
された。ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接合部における開裂の程度を
判定するために、発現したＮＳ１−ＮＳ２Ａの総標識
は、同じｐｆｕ使用で各突然変異体に感染した細胞にお
いて同じであるという仮定にもとづいて、ＮＳ１−ＮＳ
２ＡおよびＮＳ１の間の免疫沈降能力差を補正した。野
生型ＮＳ１−ＮＳ２Ａは、開裂されたＮＳ１を優勢的に
発現し、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ前駆体は検出されなかった。
野生型ウイルスについての開裂度を１００％と定めた。
【００２３】
【実施例１１】ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂配列におけるアミ
ノ酸置換を特定する完全長４型デングｃＤＮＡの構築 前項において構築され分析された、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接
合部における開裂度が低下したＮＳ１−ＮＳ２Ａ ＤＮ
Ａの突然変異体は、このようなアミノ酸置換を含むデン
グ熱ウイルス突然変異体の構築のために選抜された。す
でに構築された以下の４つの突然変異が採用された。
（１）開裂位置＋１におけるＧｌｙをＧｌｕに置換、
（２）−２位置のＴｈｒをＬｙｓに置換、（３）−２位
置のＴｈｒをＧｌｎに置換、（４）−２位置のＴｈｒを
Ｌｅｕに置換。突然変異体ｐｓｃ１１−ＮＳ１−ＮＳ２
Ａ ＤＮＡを、ｎｔ３３３８のＳｐｅＩおよびｎｔ３６
１６のＳｔｕＩで消化し、２７８個を断片として分離し
た。突然変異を含むこのＤＮＡ断片は、デングｃＤＮＡ
配列の５’側半分を含むプラスミドｐ５’−２内の対応
する野生型ＤＮＡ断片の置換に用いられた。ＢｓｔＥ１
（ｎｔ５０６９）と３’末端のＡｓｐ７１８の間の残り
の３’デングｃＤＮＡ断片は、共有制限酵素開裂部位に
おいてｐ５’−２ＤＮＡに連結された。このようにし
て、完全長ｃＤＮＡが作製され、ｐＢＲ３２２ベクター
を用いてクローン化された。このシリーズのｃＤＮＡ
は、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂接合部にアミノ酸置換をコー
ド化する突然変異された配列を含んでいた。
【００２４】
【実施例１２】ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接合部における最適で
ない開裂を呈する４型デング熱ウイルス突然変異体 ここで重要なことは、デング熱疾病に対する安全で効果
的な弱毒化生菌ウイルスワクチンの開発に、デング熱ウ
イルスの分子理解を応用することである。デング熱ウイ
ルス複製の制限は弱毒化を誘起するであろう。開裂配列
またはウイルスプロテアーゼ構成要素の改変の結果、ウ
イルスポリタンパク質の開裂は最適以下となり、ウイル
ス増殖が制限される。ポリタンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａ
開裂部位は、その非効率的開裂の故に、増殖制限された
デング熱ウイルス突然変異体を構築するための第１のタ
ーゲットとして選択された。我々は、４型デング熱ウイ
ルスのＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂には、開裂接合部の前のＮ
Ｓ１のＣ末端に８アミノ酸配列が必要であることを証明
した（Ｈ．ＨｏｒｉおよびＣ．Ｊ．Ｌａｉ（１９９
０）。デング熱ウイルスＮＳ１−ＮＳ２Ａの開裂には、
ＮＳ１のＣ末端にオクタペプチド配列が必要である。
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４巻４５７３〜４５７７頁）。フ
ラビウイルス間で８アミノ酸配列を比較すると、Ａｌａ
（−１）、Ｖａｌ（−３）、Ｓｅｒ（−５）、Ｖａｌ
（−７）、Ｍｅｔ／Ｌｅｕ−８）は正確に保存されるの
に対し、Ｔｈｒ（−２）、Ｇｌｎ（−４）、Ｌｙｓ（−
６）は変化するという興味深い特色が明らかになった。
位置−１のＡｌａ、位置−２のＴｈｒ、位置−３のＶａ
ｌ、位置＋１のＧｌｙのアミノ酸置換の効果を分析し
た。この分析の結果は図１６に示されている。保存され
た位置−１または−３におけるアミノ酸置換は、低レベ
ルの開裂を生じた。非保存位置−２または＋１における
アミノ酸置換は、効果がないかもしくはごくおだやかな
開裂低減を呈した。ある範囲の開裂効率を生じたアミノ
酸置換のパネルを、完全長ｃＤＮＡへの組み込みのため
に選抜し、インビトロ由来ＲＮＡ転写物をデング熱ウイ
ルス突然変異体の構築のために用いた。１つのデング熱
ウイルス突然変異体は、Ｇｌｙ（＋１）のかわりにＧｌ
ｕを含むＤＥＮ４（Ｇｌｙ1120→Ｇｌｕ）であり、他の
３つの突然変異体は、ＤＥＮ４（Ｔｈｒ1124→Ｌｙ
ｓ）、ＤＥＮ４（Ｔｈｒ1124→Ｇｌｎ）、ＤＥＮ４（Ｔ
ｈｒ1124→Ｌｅｕ）であり、Ｔｈｒ（２）の置換を含ん
でいる。これらはトランスフェクションしたＬＬＣ−Ｍ
Ｋ2細胞から回収された。以下に述べるように、これら
の突然変異体の増殖特性は、蚊Ｃ６／３６細胞上のプラ
ーク検定により調べられた。図１２はＤＥＮ４（Ｇｌｙ
1124→Ｇｌｕ）および対照親ウイルスに対するこの検定
の結果を示す。突然変異体ウイルスのプラークサイズは
直径約０．１ｃｍが計測され、親ウイルスの１．１ｃｍ
のプラークサイズと比較して大きく縮減していた。その
他のデング熱ウイルス突然変異体もプラークサイズの縮
減を示し、これらのウイルスが培養細胞において増殖制
限を示すことを示唆している。最適以下の開裂に起因す
る増殖制限は、感染宿主におけるウイルス毒性に対し
て、大きな効果をもつようである。 活性デング熱ウイルス３’非コード領域欠失突然変異体
の加工
【００２５】
【実施例１３】３’非コード領域に欠失を含むデングｃ
ＤＮＡの構築 ヌクレオチド３８４個の３’非コード領域への欠失突然
変異の導入を容易にするために、まず、ｎｔ１０１０４
の唯一のＢａｍＨＩ部位と３’末端のＡｓｐ７１８部位
の間の４型デングｃＤＮＡの５４０ｎｔのサブフラグメ
ントを、ｐＧＥＭ３クローニングベクターに挿入した。
この組換えプラスミドにおいて、４型デング配列のｎｔ
１０４７０の唯一のＡｐａＩ部位は、３’非コード配列
のほぼ中心点に位置している。この便利な位置にあるＡ
ｐａＩ部位を用いて、２つの欠失突然変異配列を構築し
た。すなわち、構築物の１つの配列は、ＡｐａＩ部位の
下流に欠失を含んでいた。他の配列の欠失はＡｐａＩ部
位の上流に位置していた。ヌクレオチド３０〜９０個の
長さをもつ欠失突然変異の第１の配列を加工するため
に、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発が実施され
た。ＡｐａＩ開裂部位に指定された適当な欠失を含み、
下流配列が続く以下のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲに
おける正鎖プライマーとして用いた。 オリゴＣＡＡ ＡＡＧ ＧＧＧ ＧＣＣ ＣＡＡ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＧＧ ＴＴＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＣＣ−（Δ３’１７２−１４３）（配列番号７） オリゴＣＡＡ ＡＡＧ ＧＧＧ ＧＣＣ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＡＧ ＣＡＴ ＡＴＴ ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＧＧ−（Δ３’１７２−１１３）（配列番 号８） オリゴＣＡＡ ＡＡＧ ＧＧＧ ＧＣＣ ＣＡＡ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＣＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＧＣ--（Δ３’１７２−８３）（配列番号 ９） 負鎖プライマーは、オリゴＧＡＧ ＣＴＧ ＧＴＡ Ｃ
ＣＡ ＧＡＡ ＣＣＴＧＴＴ ＧＧＡ ＴＣＡ Ａ（配
列番号１０）であり、これは、３’デング配列にＡｓｐ
７１８開裂配列がつづいたものを含んでいる。完全長４
型デングｃＤＮＡ（クローン２Ａ）を鋳型として用い
た。これらの欠失突然変異を４型デング配列に導入する
ために、ｐＧＥＭ３組換えプラスミド中のＡｐａＩおよ
びＡｓｐ７１８部位の間の野生型ウイルスＤＮＡ断片
を、ＡｐａＩおよびＡｓｐ７１８で開裂したＰＣＲ Ｄ
ＮＡ産物で置換した。同様に、ヌクレオチド６１〜２０
２個の長さをもつ欠失突然変異の第２の配列を加工しＡ
ｐａＩ部位の上流に配置するために、オリゴヌクレオチ
ド特異的突然変異誘発を施した。下記のオリゴヌクレオ
チドが合成され、ＰＣＲにおける負鎖プライマーとして
用いられた。 オリゴＣＣＴ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＣＧＣ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＴＴ ＣＣＧ ＴＧＧ ＣＧＣ--（Δ３’，２４３−１８３）（配列番号１１ ） オリゴＣＣＴ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＣＴ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＣＧ ＧＴＴ--（Δ３’，３０３−１８３）（配列番号１２ ） オリゴＣＣＴ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＣＧＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＧＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＡＣＴ--（Δ３’，３３３−１８３）（配列番号１３ ） オリゴＣＣＴ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＴＴＡ ＣＡＧ ＡＡＣ ＴＣＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＴＣ ＴＧＡ--（Δ３’，３８４−１８３）（配列 番号１４） 正鎖プライマーはオリゴＧＣＣ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣ
Ｃ ＡＴＡ ＴＧＣＴＣＡ ＧＣ（配列番号１５）であ
り、これは、ＢａｍＨＩ部位の上流のヌクレオチド９８
８５〜９９０７の間に位置している。完全長４型デング
ｃＤＮＡを鋳型として用いた。先に説明したように、こ
れらの欠失突然変異を４型デング配列に導入するため
に、中間体ｐＧＥＭ３プラスミド中のＢａｍＨＩおよび
ＡｐａＩ部位の間の野生型ウイルスＤＮＡ断片を、Ｂａ
ｍＨＩおよびＡｐａＩで開裂したＰＣＲ ＤＮＡ産物で
置換した。ｃＤＮＡ鋳型を加工する最終段階において、
構築物の両方の配列からのＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７１８断
片が分離され、残りの４型デング配列でクローン化され
た。
【００２６】
【実施例１４】ＲＮＡ転写、トランスフェクションおよ
びウイルスの回収 デング熱ウイルスｃＤＮＡクローンは、３’末端におけ
るＡｓｐ７１８での消化により線状化され、線状ｃＤＮ
Ａは、ＳＰ６ポリメラーゼによるインビトロ転写のため
の鋳型として用いられた。ＲＮＡ転写物による細胞のト
ランスフェクションは、先に説明されているように実施
された（Ｌａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ第８８巻５１３９〜５１４３頁（１９９
１））。トランスフェクションの１０日後、細胞をトリ
プシン処理し、６穴プレートおよびチェンバースライド
に移した。２日後、免疫蛍光検査（ＩＦＡ）により、デ
ング熱ウイルス抗原の形跡について、スライド上の細胞
を試験した。ＩＦＡにより大半の細胞が感染したことが
示された場合には、６穴プレート上の感染細胞は、培地
を取り出し、細胞を掻き取り、標準容積の５０％イーグ
ル最小必須培地／５０％血清に再懸濁し、凍結させるこ
とにより、収穫された。一方、陽性の細胞の割合が小さ
い場合には、細胞をトリプシン処理し、新鮮な媒地中に
１：３で希釈し、増殖させた。感染細胞の割合は週ベー
スで算定され、細胞溶解物を収穫した。
【００２７】
【実施例１５】プラーク形態観察 ウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞または蚊Ｃ６／Ｃ３６
細胞上のプラーク形態について調べられた（Ｂａｎｋｃ
ｒｏｆｔ他、Ｐａｎ Ａｍ．Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａ
ｎ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．第３７５巻１７５〜１７８頁
（１９７９）；Ｈｏｋｅ他、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅ
ｄ．Ｈｙｇ．第４３巻２１９〜２２６頁（１９９
０））。プラーク形態の分析の前に、親・野生型ウイル
スは、ＬＬＣ−ＭＫ 2細胞中で１回、継代培養された。
すなわち、２％ウシ胎児血清を含む培地１９９中に試験
すべきデング熱ウイルス０．２ｍＬを連続１０倍希釈
し、これを２５ｃｍ2ビンに入れたＬＬＣ−ＭＫ2細胞に
注入した。３５℃で１時間の吸着の後、各単層に、１×
培地１９９、０．３％重炭酸ナトリウム、１／２×イー
グル基本培地ビタミン、１／２ｘイーグル基本培地アミ
ノ酸、１０％ウシ胎児血清、０．５％アガロースを含む
７ｍＬのアガロースを重層した。３５℃で６日間のイン
キュベーションの後、このビンに、０．５％ＭＥアガロ
ースおよび１：７，５００ニュートラルレッドを含む通
常生理食塩水４ｍＬを２回目のオーバーレイとしてかけ
た。染色から２４時間以内にウイルスプラークがあらわ
れた。Ｃ６／３６細胞上のプラーク形態観察を行ない、
分離されたすべてのウイルス突然変異体が調べられた。
この目的のため、７５ｃｍ2ビンに入れたのコンフルエ
ントなＣ６／３６細胞に、２％ウシ胎児血清を加えたＭ
ＥＭに連続的に希釈された０．５ｍＬのウイルスを接種
し、１〜２時間３５℃で吸着させた。つぎに被感染細胞
に、２０ｍＬ／フラスコのアガロース（１×ハンク平衡
食塩溶液、０．５％ラクトアルブミン加水分解物、１０
％ウシ胎児血清、０．１２％重炭酸ナトリウム、０．７
５％ ＳｅａｋｅｍTM ＧＴＧアガロース）を重層し
た。培養を３５℃で７日間、インキュベートした。つぎ
に、ＮａＣｌ ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．４ｇ／Ｌ、グ
ルコース１．０ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＣＯ2 ２２．５ｍｇ／
Ｌ、ニュートラルレッド３．３ｍｇ／Ｌからなるニュー
トラルレッド染色液５ｍＬを用いて培養物を染色した。
３５℃で３〜５時間のインキュベーションののち、余分
の染色液を取り除き培養物はインキュベータに戻した。
一般に、インキュベータ内で２４〜３６時間経過した後
プラークがあらわれた。
【００２８】
【実施例１６】３’非コード領域に欠失を含む４型デン
グ熱ウイルス突然変異体 ここで、デング組換えＤＮＡ系により、ウイルスＤＮＡ
の５’および３’非コード領域ならびにコード領域にお
ける欠失を含むデングウイルス突然変異体を構築するこ
とも可能となる。欠失突然変異体は、アミノ酸置換突然
変異体よりも、表現型の復帰が起きることが少ないとい
う利点を提供する。４型デング熱ウイルスゲノムの３’
非コード領域における欠失突然変異の加工において進展
がみられた。他の蚊媒介フラビウイルスと同様に、４型
デング熱ウイルスは、保存配列１（ＣＳ−１）および保
存配列２（ＣＳ−２）と呼ばれる伸張した保存配列と、
３’非コード領域内の末端ステムアンドループを取り得
る構造を含む。ヌクレオチド３０〜１２０個の範囲の欠
失は、４型デング熱ウイルスＲＮＡのヌクレオチド３８
５個の３’非コード配列のさまざまな位置において作製
された。ＣＳ−１領域に配列を欠いていても、ステムア
ンドループ構造は維持しているｃＤＮＡクローンから転
写された突然変異体ＲＮＡは、子孫ウイルスを生成せ
ず、これは、欠失ウイルスがほとんどの他の欠失構築物
から回収されたことを示唆している（図１３）。これら
の突然変異体および野生型ウイルス対照のプラーク検定
はＣ６／３６細胞上で実施された。この分析の結果、こ
れらの突然変異体のほとんどが、欠失の位置と程度に応
じて１．０〜０．３ｃｍの範囲の縮減サイズのプラーク
を形成したことが示された（図１４および１５）。プラ
ーク形態の変化は、これらの欠失突然変異体が増殖制限
表現型をあらわしたことを示すものである。この欠失突
然変異体のパネルは、実験動物およびヒトに対する毒性
低減など、その他の興味深い潜在的に重要な特性をみせ
る。
【００２９】
【実施例１７】完全長キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ ｃＤ
ＮＡおよびキメラウイルスの生成 すでに、ＴＢＥＶ（Ｓｏｆｊｉｎ株）のサブゲノムｃＤ
ＮＡ断片がクローン化され、ヌクレオチド配列が決定さ
れた（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１
９９０）参照）。ＴＢＥＶ配列のヌクレオチド（ｎｔ）
７６〜１９７７を含むプラスミドｐＧＥＭ２−ＣＭＥお
よびヌクレオチド９６６〜３６７２を含むｐＧＥＭ２−
ＥＮＳ１は、Ｅ．Ｙｕ．Ｄｏｂｒｉｃｏｖａ博士（Ｎｏ
ｖｏｓｉｂｉｒｓｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉ
ｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ロシア）によ
り、共有される制限酵素部位においてＴＢＥＶセグメン
トを連結することにより、プラスミドｐ１０、ｐ４、ｐ
１８、ｐ２、ｐ１１から（前出のＰｌｅｔｎｅｖ他）提
供された。プラスミドＤＥＮ４ ｐ５’−２およびｐ
５’−２（ΔＰｓｔＩ，ＸｈｏＩ）および誘導体ｐ５’
−２（ΔＰｓｔＩ，ＸｈｏＩ，ΔＨｉｎｄIII ）（前出
のＢｒａｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．（１９９１））が、対応するＤＥＮ４遺伝
子に代えて１つ又はそれ以上のＴＢＥＶ遺伝子を置換す
るための組換えｃＤＮＡ構築物として、用いられた。合
成オリゴヌクレオチド（オリゴ）は、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）により２本鎖ＤＮＡを生成するための負
または正鎖プライマーとして用いられた。ＰＣＲ特異的
部位特異的突然変異誘発により、制限酵素開裂配列を、
ＴＢＥＶおよびＤＥＮ４遺伝子間接合部またはその近く
に導入した（図１７）。まず、示されたＴＢＥＶ遺伝子
を含む７個の中間キメラプラスミドが構築され、安定な
完全長ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４ ｃＤＮＡが、大腸菌株ＢＤ
１５２８（前出のＬａｉ他（１９９１）により説明され
ている）の形質転換後に同定された。各プラスミド内の
ＴＢＥＶおよびＤＥＮ４遺伝子の間の接合部を囲む配列
は、分子生物学の分野で公知の技術を用いた核酸配列決
定により確認された。すべてのキメラプラスミドは、第
１のＤＥＮ４ヌクレオチドであるＡ残基が続く転写開始
点Ｇの上流に位置するＳＰ６プロモーターを含んでい
た。インビトロ転写の前に、ＤＥＮ４配列の３’末端の
直後の唯一のＡｓｐ開裂部位において、プラスミドを線
状化した（前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）に説明された技術を
用いて）。キメラウイルスの回収とその特性の研究は、
ＢＬ−３封じ込め設備において実施された。転写反応
は、実質的に、前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）に記載されてい
るように実施された。トランスフェクションの前に、３
７℃で１５分間、４０ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩを用いて
転写混合物を処理した。つぎに、ＲＮＡ転写物は、
（ｉ）前出のＬａｉ他によりすでに述べられているＬｉ
ｐｏｆｅｃｔｉｎTM（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、または
（ii）Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロ
ピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサ
ルフェート（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｅｈｅｉｍ）の存在のもとで、セミコンフルエン
トなサルＬＬＣ−ＭＫ2細胞のトランスフェクションに
用いられた。ＤＯＴＡＰトランスフェクション条件のも
とで、トランスフェクション混合物は、０．０２ｍＭの
Ｈｅｐｅｓ緩衝液４０μＬ、ｐＨ７．０５中にＲＮＡ転
写物（２μｇ）、および、Ｈｅｐｅｓ緩衝液３０μＬ中
にＤＯＴＡＰ １２μＬを含んでいた。室温において１
０分間のインキュベーションの後、１０％のウシ胎児血
清（ＦＢＳ）を含む２ｍＬの培地１９９を添加した。混
合物０．５ｍＬを、２４穴プレートの４つのウェル中の
半融合性細胞に分注した。１０日後、細胞をトリプシン
処理し、６穴プレートとチェンバースライドに移し、さ
らに２日間、増殖培地においてインキュベーションし
た。スライド上の細胞を免疫蛍光検定（ＩＦＡ）により
試験し、１：１００希釈のＤＥＮ４特異高度免疫マウス
腹水（ＨＭＡＦ）、ＴＢＥＦ特異的ＨＭＡＦ、またはＴ
ＢＥＶ特異的ウサギ血清（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ Ｐ
ｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、ロシア、モスクワのＡ．
Ｓ．Ｋａｒａｖａｎｏｖ博士の好意により提供された）
を用いてＤＥＮ４またはＴＢＥＶ抗原の存在を検出し
た。フルオレセイン接合抗マウスまたは抗ウサギ血清
（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ、メリーランド州
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）を同一希釈で用いた。ＩＦ
Ａにより５０〜８０％の細胞が感染したことが示された
場合には、６穴プレート内の細胞をトリプシン処理し、
２倍量の非感染細胞と混合し、Ｔ75フラスコ中で６日間
増殖させた。つぎに、被感染細胞を培地とともに収穫
し、同一容積のウシ胎児血清と混合し、細胞懸濁液とし
て凍結した。解凍された細胞溶解物を、子孫キメラウイ
ルスの源として用いた。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTMまたは
ＤＯＴＡＰを用いたトランスフェクション実験により、
ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４およびＴＢＥ（ＣＭＥ）／Ｄ
ＥＮ４のみが同定された。子孫ウイルスは免疫蛍光検定
により同定された。ｖＴＢＥＶ（ＭＥ）／ＤＥＮ４と呼
ばれる子孫キメラＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルスの
ゲノム構造を証明するために、Ｍａｃｋｏｗ他、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７〜２１８頁（１９８７）に
提供される技術を用いたフェノール抽出により、総細胞
ＲＮＡを感染ＬＬＣ−ＭＫ2細胞から分離した。ＤＥＮ
４配列のヌクレオチド（ｎｔ）位置５０９０〜５１１０
（Ｍａｃｋｏｗ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５９巻２１７
〜２２８頁１９８７参照）に対して相補的なオリゴ５’
ＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡＴＴ３’（配
列番号１６）を、逆転写のためのプライマーとして用い
た。一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い、ＤＥＮ４配列の
ｎｔ位置１８〜４４のオリゴ５’ＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧ
ＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＧＧＡ３’（配列番号１
７）をＰＣＲの正鎖プライマーとして、ＴＢＥＶ配列の
ｎｔ位置２１３０〜２１５２のオリゴ５’ＣＴＴＴＴＴ
ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴ３’（配列番号１
８）を負鎖プライマーとして用いた。デング熱ウイルス
に関連するヌクレオチド位置については、Ｚｈａｏ他、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１５５巻７７〜８８頁１９８６参
照。ダニ媒介脳炎ウイルスに関連するヌクレオチド位置
については、前出のＰｌｅｔｎｅｖ他、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ（１９９０）を参照。制限酵素部位の存在を証明する
ため、２１１８塩基対（ｂｐ）のＰＣＲ ＤＮＡ産物
は、ＰｓｔＩ、ＢｇｌII 、またはＥｃｏＲＩで消化さ
れた。同様に、オリゴ５’ＧＴＣＣＧＧＣＣＧＴＣＡＣ
ＣＴＧＴＧＡＴＴ３’（配列番号１９）およびオリゴ
５’ＴＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡ
Ｃ３’（配列番号２０）（これらはそれぞれ、３４５９
〜３４８０ｎｔのＤＥＮ４ゲノムに相補的、および、９
６７〜９８５ｎｔのＴＢＥＶゲノムの負鎖に相補的であ
る）を、ＰＣＲに用いた。ＤＮＡ配列を証明するため、
ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘ
ｈｏＩ、またはＳｐｈＩで消化された。ｖＴＢＥ（Ｍ
Ｅ）／ＤＥＮ４ゲノムからのＰＣＲＤＮＡ産物（２１１
８ｂｐ）は、ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩ制限エンド
ヌクレアーゼ酵素を用いて消化された。ＨｉｎｄIII −
ＢａｍＨＩ−サブフラグメント（１９２２ｂｐ）をＰＡ
ＧＥにより精製し、相補的な制限部位においてｐＧＥＭ
３ベクター内にクローン化した。ＤＥＮ４（３００〜３
９８ｎｔ）のＣ遺伝子とＴＢＥＶ（４１８〜４６０ｎ
ｔ）のｐｒｅＭ遺伝子の間の接合部の配列は、核酸配列
決定により確認された。ＴＢＥ／ＤＥＮ４キメラＤＮＡ
の構築に用いられたオリゴヌクレオチドは以下のものを
含む。 ＴＢＥＶ特異的オリゴ ５’ＣＣＧＧＴＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣ
ＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣ＋（配列番号２１） ５’ＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡＴＴ
ＧＡＧＣＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣ−（配列番号２２） ５’ＣＴＴＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡ
ＴＧＧＣＣＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧ＋（配列番
号２３） ５’ＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＡＧＡ
ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＧＧ＋（配列番号２４） ５’ＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣ
ＧＧＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＣＣＡＡＣＣ
ＡＧＧＣ−（配列番号２５） ５’ＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＧＡＡＣＴＣ
ＧＡＧＧＡＡＴＣＣＧＡＣＣＡＴＧＴＣ＋（配列番号２
６） ５’ＧＴＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＴ
ＴＴＴＧＣＣＡＣＧＴＣＴＴＴＧ−（配列番号２７） ＤＥＮ４特異オリゴ ５’ＴＡＣＧＣＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＧＧＡＴＧ
ＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴ−（配列番号２８） ５’ＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧ
ＣＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＣＴ＋（配列番号２９） ５’ＣＡＧＣＡＡＴＧＴＴＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴ
ＴＴＣＴＣＣＣＧＴＴＣ−（配列番号３０） ５’ＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＡＡＣ
ＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＴＣＣＣ＋（配列番号
３１） 配列番号２３は、ＤＥＮ４の５’非コード領域／ＴＢＥ
Ｖカプシド接合を作製するために用いられ、ＢｇｌII／
ＢａｍＨＩ部位を形成した。配列番号３０および２４
は、ＤＥＮ４ Ｃ／ＴＢＥＶ ｐｒｅＭ接合を作製するた
めに用いられ、ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩ部位を形成した。配
列番号２８および２１は、ＤＥＮ４ ｐｒｅＭ／ＴＢＥ
Ｖ Ｅ接合を作製するために用いられ、ＢａｍＨＩ／Ｂ
ｇｌII部位を形成した。ＤＥＮ４ ＮＳ１／ＴＢＥＶ Ｎ
Ｓ１接合は、配列番号２６を用いて作製され、ＸｈｏＩ
／ＸｈｏＩ部位を形成した。ＴＢＥＶ Ｅ／ＤＥＮ４ Ｎ
Ｓ１接合は配列番号２５を用いて作製され、ＸｈｏＩ／
ＸｈｏＩ部位を形成した。ＴＢＥＶ Ｃ／ＤＥＮ４ ｐｒ
ｅＭ接合は配列番号２７および３１を用いて作製され、
ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩ部位を形成した。ＴＢＥＶ ＮＳ１
／ＤＥＮ４ ＮＳ２Ａ接合は配列番号２２および２９を
用いて作製され、ＳｐｈＩ／ＳｐｈＩ部位を生成した。
配列に付した＋および−の符号は、それぞれ上流および
下流のプライマーを示す。
【００３０】
【実施例１８】キメラビリオンのタンパク質分析 ＤＥＮ４ｖ ２Ａ（ＸｈｏＩ）、完全長４型デング熱ウ
イルスｃＤＮＡ構築物、または、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／Ｄ
ＥＮ４により生成されるタンパク質を分析するために、
６穴プレート内のコンフルエントなＬＬＣ−ＭＫ2細胞
を、ＭＯＩ １．０で各ウイルスに感染させた。感染の
６日後、前出のＬａｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）に述べられているよう
に、メチオニン非含有ＭＥＭ（イーグル最小必須培地）
中の35Ｓメチオニン（ウェルあたり６０μＣｉ、比放射
能６００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）で４時間にわたり、細胞を
標識した。１）ＴＢＥＶ特異的ＨＭＡＦ、２）ＤＥＮ４
特異的ＨＭＡＦ、３）ＴＢＥＶ Ｅに対して作製された
ウサギ血清、または、４）ＤＥＮ４ ｐｒｅＭ、Ｅ、Ｎ
Ｓ３、または、ＮＳ５タンパク質に特異なウサギ抗血清
を用いて、溶解物を免疫降させた。前出のＬａｅｍｍｌ
ｉにより説明される技術を用いて、変性条件下でＰＡＧ
Ｅにより免疫沈降物を分析した。 時間に対するタンパク質合成の分析 Ｔ25フラスコに入れたＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６
細胞単層に、ＭＯＩ １で、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ
４またはＤＥＮ４（ｖ２Ａ（ＸｈｏＩ））を感染させ
た。３７℃で１時間の吸着の後、ウイルス接種物を取り
出し、新鮮培地を細胞に添加した。タンパク質合成の分
析のため、ウイルス吸着後さまざまな時間（０、４、
８、２４、４８時間）経過した被感染細胞を、メチオニ
ン非含有ＭＥＭとともに、２０分間インキュベートし、
同じ培地中で２時間にわたり、35Ｓメチオニンで標識し
た。標識された細胞の溶解物をＤＥＮ４特異的ＨＭＡＦ
を用いて沈降させ、ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフ
ィにより分析した。
【００３１】
【実施例１９】キメラ構築物の増殖分析 親ＤＥＮ４およびそのキメラウイルスは、サルＬＬＣ−
ＭＫ2および蚊Ｃ６／３６細胞上のプラーク検定によ
り、調べられた。プラーク検定の技術は前出のＢａｎｃ
ｒｏｆｔ他に説明されている。図１９に示されている増
殖分析は、感染後のさまざまな日付に、ＤＥＮ４または
ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４に感染したＬＬＣ−ＭＫ2お
よびＣ６／３６培養中に存在するウイルスの量を計量す
ることにより、実施された。感染およびウイルス吸着の
後、培養を収穫し、各培養をプラーク検定によりサンプ
リングした。Ｌｏｇ（ｐｆｕ／ｍＬ）で表したウイルス
力価の変化は、時間に対する増殖曲線として与えられて
いる。
【００３２】
【実施例２０】ウイルスＲＮＡ合成の分析 ウイルスＲＮＡ合成の分析のために、被感染ＬＬＣ−Ｍ
Ｋ2またはＣ６／３６細胞（約１０6個の細胞）をウイル
ス吸着後のさまざまな時間（０、４、８、２４、４８時
間）に収集し、０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）ｐＨ７．５で洗浄し、ついで、０．３Ｍ ＮａＡ
ｃ、ｐＨ５．２、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳを含む
緩衝液中に溶解した。前出のＭａｎｉａｔｉｓ他により
提供される技術を用いて、フェノール抽出により、総Ｒ
ＮＡを細胞溶解物および培地から分離した。６０℃で１
５分間、７．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ホルムアルデヒドを
含む ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよ
び０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）中でのインキュ
ベーションにより、ＲＮＡ試料は変性され、ニトロセル
ロースフィルターＢＡ８５（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよ
びＳｃｈｕｅｌｌ）に接合された。フィルターは８０℃
で１時間焼かれ、６×ＳＳＣ、３×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶
液、２５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．５）、０．１％
ＳＤＳ、２５μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中
において、６５℃で１時間、プレハイブリダイゼーショ
ンされた。ニックトランスレーションされた32Ｐ標識ｐ
ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ ＤＮＡプローブ（５０ｎｇ
／ｍＬ、比放射能３．４×１０8ｃｐｍ／μｇ）を含む
同じ溶液中で、６５℃で一晩、ハイブリダイゼーション
が続けられた。ハイブリダイゼーションの後、６５℃
で、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中でフィルタ
ーを５回洗浄し、乾燥し、７０℃でＸ線フィルムに曝し
た。また、ＲＮＡにハイブリダイズされた32Ｐ標識ＤＮ
Ａの放射能が、液体シンチレーションカウンターで計測
された。ｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４からインビトロで
作製されたＲＮＡ転写物が、陽性対照として用いられ
た。
【００３３】
【実施例２１】ワクチン試料の防御効力とキメラウイル
スの神経毒性の試験 ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４および親デング熱ウイルス
は、マウスに脳内（ＩＣ）、皮内（ＩＤ）、腹腔内（Ｉ
Ｐ）経路により接種することにより、神経毒性について
分析された。生後３日の乳児ＢＡＬＢ／ｃマウスに、
０．０２ｍＬＭＥＭ／０．２５％ヒト血清アルブミン中
にウイルス１０2ｐｆｕを加えて、ＩＣ注射で投与し
た。生後６週のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに、（ｉ）１０3
ｐｆｕのウイルスを上記のとおり希釈し、容積０．０３
ｍＬにしてＩＣ接種により投与、または、（ii）０．１
０ｍＬに希釈した１０3ｐｆｕのウイルスをＩＤまたは
ＩＰ接種した。マウスは、２１日間、脳炎の徴候や死亡
について観察され、生き延びた成体マウスは、感染の２
０日後に採血して接種されたウイルスに対する抗体反応
を評価した。生存マウスに対しては、第２１日に、ＢＬ
−４封じ込め設備において、１０3ＬＤ50ＴＢＥＶ（Ｓ
ｏｆｊｉｎ株）をＩＰ投与した。
【００３４】
【実施例２２】キメラウイルス突然変異体の構築および
配列決定 分子生物学の当業者に公知の標準的オリゴＰＣＲ操作手
順にしたがい、部位特異的突然変異誘発を用いて、ＴＢ
ＥＶ（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に突然変異を導入した
（下記のオリゴ配列参照）。得られた構築物は、実施例
１７に開示された技術を用いて、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞内
にトランスフェクションされた。突然変異誘発された構
築物から回収した子孫ウイルスは、実施例１９において
提供されている技術を用いてプラーク形態の変化につい
て評価された。キメラウイルスゲノムの予め定められた
領域内に改変を系統的に達成するために、完全長ＴＢＥ
（ＭＥ）／ＤＥＮ４ｃＤＮＡ構築物に戦略的突然変異を
導入した。６個の突然変異キメラが、トランスフェクシ
ョンされたＬＬＣ−ＭＫ2細胞から回収され、子孫ウイ
ルスが、マウス神経毒性を誘導する能力について分析さ
れた。さらに、他のウイルス増殖特性が、培養細胞にお
いて評価された。図２３に示すように、ＰｒｅＭ、Ｅ、
または、ＮＳ１グリコタンパク質における切断されたグ
リコシル化部位を含む４つのウイルス突然変異が、示さ
れた部位におけるグルコシル化欠損を示すものと予測さ
れた。変異*ＰｒｅＭ／Ｍ-は、ＰｒｅＭ／Ｍ遺伝子間接
合部において欠陥開裂配列を含んでいた。変異*Ｅは、
２つのアミノ酸置換を含み、これらの置換が選択された
理由は、これらのアミノ酸が蚊媒介フラビウイルス内に
のみ見られるからである。突然変異は、標準的オリゴＰ
ＣＲ起動手順にしたがい、部位特異的突然変異誘発によ
り、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に導入された。要
するに、正鎖オリゴおよびその相補的負鎖オリゴは、そ
れぞれ突然変異配列と唯一の制限酵素部位を含んでいる
が、ＰＣＲにおいて、それぞれ下流または上流プライマ
ー対のオリゴとともに用いられる。両方のＰＣＲ産物
は、共有される唯一の制限酵素部位において連結され
た。このようにして、突然変異された配列を含む、ＤＮ
Ａ断片産物が作製され、完全長ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ
４ ｃＤＮＡにおける対応する野生型ＤＮＡ断片を置換
した。以下は特異的突然変異体キメラＤＮＡおよび構築
に用いられたオリゴヌクレオチドのリストである。 （１）変異ＰｒｅＭ／Ｍ−Ｇｌｃ： ５’ＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＧＴＧＴＣＧＡ
ＴＣＧＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧ＋
（配列番号３２） ５’ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＧＡ
ＴＣＧＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＧＣ−
（配列番号３３） （２）変異Ｅ−Ｇｌｃ： ５’ＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＡＧ
ＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡ＋（配列番
号３４） ５’ＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＧＡＧＴＣＴＣＴＡ
ＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＡＡＴＣＣＣＣＣ−（配列番
号３５） （３）変異ＮＳ１（１）−Ｇｌｃ： ５’ＴＴＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡＧＣＡＡＧＧＡＴＣＣＧ
ＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣ＋（配列番
号３６） ５’ＧＴＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＧ
ＡＴＣＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡ−（配列番
号３７） （４）変異ＮＳ１（２）−Ｇｌｃ： ５’ＴＧＧＡＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＡ
ＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＡＧＡＧＡ＋（配列番号３
８） ５’ＴＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣ
ＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡ−（配列番号３
９） （５）変異ＰｒｅＭ／Ｍ： ５’ＧＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＡＧＴ
ＧＣＴＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡＣ＋（配列番号４０） ５’ＧＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＣＴ
ＴＧＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＴＧ（配列番号４
１） （６）変異Ｅ： ５’ＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＣＧＡＧＧＣＴＧ
ＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡ
ＡＡＡ＋（配列番号４２） ５’ＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＧＡＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴ
ＣＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＡＣＧＡＣＧＧ−（配
列番号４３） さらに、上流プライマーは（配列番号４４） ５’ＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴ
ＣＧＧＡ＋および下流プライマーは（配列番号４５） ５’ＣＴＴＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣ
ＡＧＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＣ
Ａ−
【００３５】
【実施例２３】マウスにおける神経毒性の分析 さらに、突然変異されたキメラウイルス調製物は、マウ
スにＩＣ接種され、実施例２１に提供されている技術を
用いて、ＤＥＮ４、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４およびＴ
ＢＥ（ＣＭＥ）／ＤＥＮ４と比較された。試験動物の半
数を死亡させるのに必要な致死量が、突然変異キメラウ
イルスの各々について比較された。生後６週間のＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの８匹ずつのグループに、さまざまな変異
キメラ、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４、ＴＢＥ（ＣＭＥ）
／ＤＥＮ４、またはＤＥＮ４を、１０００、１００、１
０、１、０．１ｐｆｕの投与量で、脳内接種した。被感
染マウスは、３１日間、脳炎の徴候および死亡について
観察された。５０％致死量（ＬＤ５０）が各ウイルスに
ついて算出され、その値がマウス神経毒性の基盤として
用いられた。図２４に示すように、親ＴＢＥ（ＭＥ）／
ＤＥＮ４ウイルスのＬＤ５０は約１０ｐｆｕであった。
このレベルのＬＤ５０は、いくつかの変異ウイルスにつ
いても観察された。少なくとも２つの突然変異体、すな
わち*ＮＳ１（１）−Ｇｌｃ-および*ＰｒｅＭ／Ｍ-のＬ
Ｄ５０は、１００ｐｆｕよりも大きく、これらの突然変
異体のマウス神経毒性は１００倍以上減少したことを示
している。この発見は、キメラウイルスゲノムにおける
ＮＳ１（１）−Ｇｌｃ-またはＰｒｅＭ／Ｍ-突然変異
は、それぞれ、マウス神経毒性の弱毒化を提供すること
を示すものである。これらの突然変異ウイルスは、個別
にまたは組合わせて、ワクチン候補としての有用性のさ
らなる評価に有益であろう。
【００３６】
【実施例２４】霊長類における最適化キメラ構築物の試
験 その他の動物ではなく、ヒトよりも下位の霊長類は、周
辺経路により容易にデング熱ウイルスに感染することが
証明されている（Ｓｉｍｍｏｎｓ他、Ｐｈｉｌｉｐｐ．
Ｊ．Ｓｃｉ．第４４巻１〜２４７頁、１９３１およびＲ
ｏｓｅｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．第７
巻：４０６〜４１０頁、１９５８）。サルの感染は、ヒ
トのデング熱ウイルス感染に最も近い実験系である。デ
ング感染に対するアカゲザルの反応は、４〜６日のウイ
ルス血症があるという点において、ヒトのそれと類似し
ている。これよりも低級な霊長類は臨床的デング徴候を
起こさない。サルにおけるデングその他のフラビウイル
ス研究の目的は、（１）さまざまなワクチン候補の免疫
原性を評価すること、（２）ウイルス血症の期間を日数
で、ピークウイルス力価をｐｆｕ／ｍＬで計測して、デ
ングまたはキメラデング熱生菌ウイルスワクチン候補の
感染性および毒性（弱毒化表現型）を評価すること、
（３）同型デング熱ウイルスまたは同一のキメラウイル
ス特異性をもつその他のフラビウイルスによる投与に対
する上記ワクチンの防御効力を評価すること、である。 （１）接種：各アカゲザルに、イーグル最小必須培地／
０．２５％ヒト血清アルブミンに希釈した合計３×１０
6ｐｆｕのウイルスを接種する。通常、麻酔された動物
に２回の皮下投与を施す。 （２）血液採取：デング熱ウイルスまたはキメラデング
熱ウイルスの接種の後、３．０ｍＬの血液試料を２週間
のあいだ毎日と、３週目、４週目、６週目、８週目に採
取する。 （３）デング熱ウイルスまたは他のフラビウイルスの投
与：ウイルス投与が、防御効力を評価するために適切で
あると考えられる場合、１０5ｐｆｕ／１投与の非弱毒
化ウイルスを容積０．５ｍＬにしてサルの上腕部に皮下
接種する。 （４）研究室内検定：血清試料を用いて以下を決定し
た。（ａ）直接的ウイルスプラーク検定によるウイルス
血症期間、（ｂ）放射性免疫沈降およびＥＬＩＳＡによ
るデングまたは他のフラビウイルス特異抗体の力価、
（ｃ）プラーク縮減中和試験による中和抗体の力価。こ
れらすべての試験はワクチン開発技術の当業者には公知
である。以上、本発明を特別の実施例について説明した
が、当業者であれば、これらの実施例は例示のためのも
のに過ぎず本発明を限定するものではないことが理解さ
れよう。本発明の真の範囲は下記の請求の範囲に鑑みて
解釈されるべきである。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、キメラデング熱ウイルスの作製に用い
られる完全長デング熱ウイルスｃＤＮＡの構造を示す。
【図２】図２は、ＲＮＡ転写物を用いたトランスフェク
ション後の、ウイルス感染細胞のパーセンテージとウイ
ルスの力価［ｔｉｔｅｒ］を示す。
【図３】図３は、キメラデング熱ウイルスの血清型分析
を示す。
【図４】図４は、親またはキメラのデング熱ウイルスに
より生成された１型、２型、または４型ウイルスタンパ
ク質のポリアクリルアミドゲル分析を示す。
【図５】図５は、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞上のウイルスプラ
ークの形態観察を示す。
【図６】図６は、親２型ＮＧＣまたは４型デング熱ウイ
ルスまたは２型／４型キメラウイルスのマウス神経毒性
を示す。
【図７】図７は、感染性ＲＮＡの転写に用いられるクロ
ーン化された完全長デング熱ウイルスｃＤＮＡの末端配
列を示す。合計１０６４６個のヌクレオチドの長さをも
つ完全長デング熱ウイルスｃＤＮＡは、図示のように、
ＳＰ６ポリメラーゼのためのプロモーター配列および唯
一のＡｓｐ７１８開裂部位に隣接してクローン化され
る。ここで、１０４４８および１０４４９の間の位置に
付加Ｃ残基が、１０４７０および１０４７１の間に付加
Ｇ残基が存在する。これらはもとの４型デング熱ウイル
ス配列にはなかったものである。ＲＮＡ転写物の予測
５’末端および３’末端の近くの配列も示されている。
転写開始のＧは、太字体で示される３’デング配列の前
に配置されていた。Ａｓｐ７１８開裂配列ＧＧＴＡＣＣ
は、太字体で示される３’デング配列の直後に位置して
いた。
【図８】図８は、完全長デングｃＤＮＡクローンおよび
制限エンドヌクレアーゼ消化パターンを示す。図には、
５’端にＳＰ６プロモーター、３’端にＡｓｐ７１８開
裂部位を含む完全長デングｃＤＮＡクローンが示されて
いる。ヌクレオチド５０６９のＢｓｔＢ１開裂部位によ
り、デングゲノムは５’および３’断片に分離される。
完全長クローン１Ａの断片を、対応する５’−２、３’
−Ｂ、または３’−Ｃ断片で置換することにより、図示
されている他の完全長の組合せが得られる。
【図９】図９は、ＢｇｌII，ＮｓｉＩ、およびＡｓｐ７
１８で消化された完全長デングｃＤＮＡクローンの制限
エンドヌクレアーゼパターンを示し、消化物はアガロー
スゲル上での分離により分析された。Ｍは、キロ塩基対
の分子サイズマーカーとしてのλＨｉｎｄIII ＤＮＡ断
片を示す。
【図１０】図１０は、感染ＲＮＡから回収されたデング
熱ウイルスが鋳型ＤＮＡのゲノム配列を含むことの実例
を示す。子孫デング熱ウイルスは、クローン２ＡＤＮＡ
（野生型対照（コントロール））から、または、デング
配列のヌクレオチド３４７３のＰｓｔＩ部位を含むクロ
ーン２Ａ（Ｐ）ＤＮＡから転写されたＲＮＡでトランス
フェクションしたＬＬＣ−ＭＫ2細胞から回収された。
回収されたウイルスから抽出されたゲノムＲＮＡは、逆
転写に用いられ、ｃＤＮＡ産物は、適当なプライマーを
用いたＰＣＲにより１３４３ｂｐのＤＮＡ断片（ヌクレ
オチド３１９３〜４５３６）を製造するための鋳型とし
て用いられた。ＰＣＲ産物のＰｓｔＩ消化が図示されて
いる。レーンＭは、サイズマーカーとしての１２３のＤ
ＮＡラダーを示す。
【図１１】図１１は、回収されたウイルスおよび親ウイ
ルスに感染した細胞からのデング熱ウイルスタンパク質
の比較を示す。回収されたデング熱ウイルスまたは親野
生型ウイルスに感染したＬＬＣ−ＭＫ2細胞からの溶解
物［ライゼート（lysates）］を35Ｓメチオニンで標識
したものを用意し、デング高度免疫マウス腹水を用いた
免疫沈降を行なった。沈殿物は、ＳＤＳ−１２％ポリア
クリルアミドゲル上の電気泳動により分離された。図示
のゲルレーンは、下記のものに感染した細胞からの溶解
物を含んでいる。（１）親デング熱ウイルス、（２）ク
ローン２ＡＤＮＡから回収されたデング熱ウイルス、
（３）クローン２Ａ（Ｐ）ＤＮＡから回収されたデング
熱ウイルス。レーン４はダミー［ｍｏｃｋ］感染細胞溶
解物からのものである。レーンＭは、左側に示したキロ
ダルトンのタンパク質サイズマーカーを含む。Ｐｒｅ
Ｍ、Ｅ、ＮＳ、ＮＳ３を含むデング熱ウイルスタンパク
質に対応する標識バンドが図示されている。その他の標
識バンドの特定はしなかった。
【図１２】図１２は、野生型４型デング熱ウイルスと、
それに由来するアミノ酸置換突然変異体Ｄ４（Ｄ1126−
Ｅ）のプラーク形態観察を示す。７６ｃｍ2ビンに入れ
た集密な（コンフルエント(confluent)な）蚊Ｃ６／３
６細胞をデング熱ウイルスに感染させ、次に、アガロー
スのオーバーレイを加えた。感染の６日後、ニュートラ
ルレッドを用いて細胞を染色した。翌日、プラークサイ
ズを測定した。１０個の別々のプラークから、野生型４
型デング熱ウイルスおよび置換突然変異体の平均プラー
クサイズを算出した。図示の突然変異ウイルスは、４型
デングポリペプチド配列の１１２６位置に、Ｇｌｙ
（Ｇ）を置換したＧｌｕ（Ｅ）を含んでいた。この位置
は、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂配列の＋１位置に対応する。
【図１３】図１３は、３’非コード配列中に欠失を含む
４型デング熱ウイルス突然変異のゲノム構造と特性を示
す。図示の線形マップは、４型デング熱ウイルスのヌク
レオチド３８４個の３’非コード配列を示す。この領域
には、少なくとも３つの配列要素が示されている。塗り
潰した四角形で示したのは、ｎｔ２３４からｎｔ２１
１、および、ｎｔ１４３からｎｔ１２０の保存配列２
（ＣＳ−２）である。白抜きの四角形で示したのは、ｎ
ｔ１０５からｎｔ８２の保存配列１（ＣＳ−１）であ
り、最後の８４個のヌクレオチド内にはステム・アンド
・ループ構造がある。各々特定の位置に長さ３０〜２０
２個のヌクレオチドの欠失突然変異を含む、７個のｃＤ
ＮＡクローンが構築され、これから誘導されたＲＮＡ転
写物を用いて、受容（permissive）ＬＬＣ−ＭＫ2細胞
のトランスフェクションを行なった。ＣＳ−１配列を全
く欠いた突然変異Ｄ４（Δ３’、１７２〜８３）ｃＤＮ
Ａは致死突然変異のようである。というのは、活性ウイ
ルスが試行を繰返しても検出されなかったからである。
活性欠失突然変異体は、残り６個のＲＮＡ転写物から回
収された。感染の６日後、野生型ウイルスとこれから誘
導された欠失突然変異体の増殖特性を、染色したＬＬＣ
−ＭＫ2細胞単層上のプラーク検定により比較した。同
一条件のもとで、野生型ウイルスは約０．３ｃｍの大き
さのプラークを示した。逆番号付与システム（reverse
numbering system）を用いて、４型デング熱ウイルスの
ヌクレオチド位置を割り当てた。１０６４６の最後のヌ
クレオチドには、この番号付与システムを用いてｎｔ１
が割り当てられた。
【図１４】図１４は、野生型デング熱ウイルス、およ
び、これから誘導された、３’非コード領域に欠失を含
む突然変異体のプラーク形態観察を示す。プラーク検定
は、蚊Ｃ６／３６細胞に対して実施された。７５ｃｍ2
ビンに入れたコンフルエントな蚊Ｃ６／３６細胞を、野
生型４型デング熱ウイルスまたは活性欠失突然変異体ウ
イルスに、適当な多重度で感染させた。実施例に述べる
ように、感染の６日後に、被感染細胞をニュートラルレ
ッドで染色した。翌日、プラークサイズを測定した。各
突然変異体について、１０個の別々のプラークの平均プ
ラークサイズを算出した。パネルＡは、非感染細胞単層
（ダミー）、４型デング熱ウイルス欠失突然変異体（Δ
３’、１７２〜１１３）、（Δ３’、１７２〜１４
３）、親・野生型ウイルスを示す。
【図１５】図１５は、野生型ウイルスと、欠失突然変異
体（Δ３’、２４３〜１８３）、（Δ３’、３０３〜１
８３）、（Δ３’、３８４〜１８３）を示す。逆番号付
与システムを用いて４型デング配列の欠失位置を割り当
てた。
【図１６】図１６は、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ接合部の表を示
す。
【図１７】図１７は、キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４構築物
における遺伝子間接合部を示す。制限酵素で開裂したＴ
ＢＥＶｃＤＮＡ断片を、下線を付した配列により示され
る適当な部位において、ＤＥＮ４ ｃＤＮＡに挿入し
た。ＴＢＥＶのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配
列は太字で示されている。ヌクレオチド番号付与システ
ムは、Ｐｌｅｔｎｅｖ他によりＶｉｒｏｌｏｇｙ第１７
４巻２５０〜２６３頁（１９９０）に開示されたもので
ある。
【図１８】図１８は、親ＤＥＮ４およびキメラＴＢＥ
（ＭＥ）／ＤＥＮ４ウイルスにより産生されたウイルス
タンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の写真であ
る。ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４またはＤＥＮ４ウイル
スに感染したサル細胞、または、非感染のサル細胞の溶
解物を35Ｓメチオニンで標識し、ＴＢＥＶのＨＭＡＦ
（１）、またはＤＥＮ４のＨＭＡＦ（２）、またはＤＥ
Ｎ４のＮＳ３（３）、ＮＳ５（４）、ｐｒｅＭ（５）、
Ｅ（６）に特異的なウサギ血清を用いた免疫沈殿を行な
い、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上で分析し
た。タンパク質マーカーの分子量はキロダルトンで示
す。ＤＥＮ４タンパク質の位置は右端に沿って示されて
いる。
【図１９】図１９は、ＬＬＣ−ＭＫ2およびＣ６／３６
細胞上のｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４およびＤＥＮ４に
ついての増殖曲線を示す。細胞は、細胞当り０．０１ｐ
ｆｕのＭＯＩで、図示の時点（感染後日数）において細
胞を収穫し、プラーク検定によりウイルス力価を判定し
た。
【図２０】図２０は、被感染組織培養細胞から分離した
ＲＮＡの試料をブロットしたニトロセルロースフィルタ
ーの写真のコピーである。フィルターは、32Ｐで標識し
たｐＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４ニックトランスレーショ
ンＤＮＡをプローブとして検査された。
【図２１】図２１は、感染後のさまざまな時点におけ
る、ｖＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４およびＤＥＮ４に感染
したＬＬＣ−ＭＫ2またはＣ６／３６細胞からの細胞溶
解物タンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の写真で
ある。
【図２２】図２２は、マウスにおけるｖＴＢＥ（ＭＥ）
／ＤＥＮ４の防御効力および神経毒性を判定するための
研究の結果を示す。
【図２３】図２３は、神経毒性に対する突然変異の効果
を評価するために、ＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４構築物に
組み込んだいくつかの突然変異例のリストである。
【図２４】図２４は、図２３に示した突然変異を含む構
築物から回収したＴＢＥ（ＭＥ）／ＤＥＮ４キメラを用
いた神経毒性研究の結果をまとめたものである。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The United States of America <120> Chimeric and/or Growth-Restricted Flaviviruses <130> P-9751 <141> 2002-03-04 <150> US 07/761,222 <151> 1991-09-19 <150> US 07/761,224 <151> 1991-09-19 <160> 45 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 1 aaggctatgc cacgcaaa 18 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 2 gccctggccg gccttcacct gtgatttgac cat 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 3 gccctggccg gcctgcacct gtgatttgac cat 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 4 gccctggccg gccagcacct gtgatttgac cat 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 5 ttctgatgtg ccctgttcgg ccgtcacctg tga 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 6 ttctgatgtg ccctgccagg ccgtcacctg tga 33 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 7 caaaaggggg cccaagacta gaggttacag gagacc 36 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 8 caaaaggggg cccaacaaaa acagcatatt gacgctggg 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 9ｃａａａａｇｇｇｇｇ ｃｃｃａａｃａｇａｇ ａｔｃｃｔｇｃｔｇｃ
ｔｇｔｃｔｃｔｇｃ ３９ <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 10 gagctggtac cagaacctgt tggatcaa 28 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 11 cctggcttgg gcccccgcgt acagcttccg tggcgc 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 12 cctggcttgg gccccggagc tacaggcagc acggtt 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 13 cctggcttgg gcccccgtgg cacaagtggc ctgact 36 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 14 cctggcttgg gccccttaca gaactccttc actctctga 39 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 15 gcctccatgg ccatatgctc agc 23 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 16 gctccggggt gtaagtccat t 21 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 17 gaccgacaag gacagttcca aatcgga 27 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 18 ctttttggaa ccattggtga ct 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 19 gtccggccgt cacctgtgat t 21 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 20 tcacggtgca cacatttgga aaac 24 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 21 ccggtttata gatctcggtg cacacatttg gaaaac 36 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 22 ctccattgtc tgcatgcacc attgagcgga caagccc 37 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 23 cttaggagaa cggatcctgg ggatggccgg gaaggccatt ctg 43 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 24 ggcaaaagaa ggtctgcagt agactggaca ggttgg 36 <210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 25 gaaggaagct catggacatg gtcggattcc tcgagttcag gcccaaccag gc 52 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 26 cctggcctgg ttgggccgaa ctcgaggaat ccgaccatgt c 41 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 27 gtccagtcta ctgcagacct tcttttgcca cgtctttg 38 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 28 tacgcatcgg gatccgtagg atggggcgac cagcat 36 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 29 tcacaggtgc atgccggaca gggcacatca gaaact 36 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 30 cagcaatgtt actgcagacc tttttctccc gttc 34 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 31 gggagaaaaa ggtctgcagt aacattgctg tgcttgattc cc 42 <210> 32 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 32 gcggcaaccc aggtgcgtgt cgatcgtggc acctgtgtga tcctgg 46 <210> 33 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 33 ccaggatcac acaggtgcca cgatcgacac gcacctgggt tgccgc 46 <210> 34 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 34 gggggattac gtcgctgctc tagagactca cagtggaaga aaa 43 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 35 ttttcttcca ctgtgagtct ctagagcagc gacgtaatcc ccc 43 <210> 36 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 36 ttcaccccag aagcaaggat ccgcacattt ttaatagacg gac 43 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 37 gtccgtctat taaaaatgtg cggatccttg cttctggggt gaa 43 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 38 tggatagaga gctcaaggat ccagacttgg cagatagaga 40 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 39 cccatatata tttttcccct ttacactctg tcatc 35 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 40 ggatcaagaa caagacgcgt agtgctgatc ccatcccac 39 <210> 41 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>＜２２３＞ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ： ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｅ <400> 41 gatgggatca gcactacgcg tcttgttctt gatccttctt g 41 <210> 42 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 42 agagaccaga gcgatcgagg ctggggcaac gggtgtggat tttttggaaa a 51 <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 43 gccccagcct cgatcgctct ggtctctctt acacacttac gacgg 45 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 44 gaccgacaag gacagttcca aatcgga 27 <210> 45 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 45 cttgaactgt gaagcccaga aacagagtga ttcctccaac agctatgca 49
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 プレトネフ，アリグザンダー ジー. アメリカ合衆国，20814，メリーランド, ベセスダ，モントローズ アベニュー, ＃102 10423番地 (72)発明者 メン，ルーエ アメリカ合衆国，20895，メリーランド, ケジントン，コネチカット アベニュー, ノースウエスト 11344番地 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 CA07 DA02 DA06 EA04 GA11 4B065 AA26X AA95Y AB01 BA02 CA45 4C085 AA03 BA61 CC08 DD62

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 安定な、完全長の、感染性４型デング熱
    ウイルスＲＮＡをコード化する、単離された組換えＤＮ
    Ａ構築物。
  2. 【請求項２】 さらにベクターを含むことを特徴とする
    請求の範囲第１項に記載の単離された組換えＤＮＡ構築
    物。
  3. 【請求項３】 前記ベクターはプラスミドであることを
    特徴とする請求の範囲第２項に記載の分離された組換え
    ＤＮＡ構築物。
  4. 【請求項４】 前記ＤＮＡ構築物の発現を可能とするよ
    うに、請求の範囲第２項による組換えＤＮＡ構築物で安
    定的に形質転換された宿主細胞。
  5. 【請求項５】 前記細胞は原核細胞であることを特徴と
    する請求の範囲第４項に記載の宿主細胞。
  6. 【請求項６】 少なくとも１つの突然変異をさらに含む
    ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ構築
    物。
  7. 【請求項７】 あるサブタイプのデングからの構造タン
    パク質と、異なるサブタイプのデングからの非構造タン
    パク質とを作動可能にコード化する核酸領域を有するゲ
    ノムをもち、前記ゲノムはさらに、プレメンブレンタン
    パク質、エンベロープタンパク質、またはＮＳ１（１）
    タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ又はそれ以
    上の突然変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレン
    タンパク質への開裂を減少させる１つ又はそれ以上の突
    然変異、ポリタンパク質ＮＳ１−ＮＳ２Ａ開裂部位のつ
    ぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化する部
    位における１つ又はそれ以上の置換、３’非コード末端
    の最も３’寄りのヌクレオチドを第１番とした、ヌクレ
    オチド１１３番および３８４番までの間（１１３番およ
    び３８４番を含む）の少なくともヌクレオチド３０個か
    らなる１つ又はそれ以上の欠失、ＮＳ１のＣ末端開裂部
    位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード
    化する配列における１つ又はそれ以上の突然変異からな
    る群から選択される当然変異を含むことを特徴とするキ
    メラウイルス。
  8. 【請求項８】 デング熱に対するワクチンにおいて、請
    求の範囲第７項の前記キメラウイルスと、薬学的に許容
    可能な担体とを含み、前記ワクチンは、デング熱ウイル
    スに対して脊椎動物に防御免疫反応を起こすことのでき
    ることを特徴とするワクチン。
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