JP2002325593A - キメラおよび/または増殖制限されたフラビウイルス - Google Patents

キメラおよび/または増殖制限されたフラビウイルス

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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】ワクチンの調製に用いるためのあるキメラウイ
ルス。 【解決手段】本発明は、ワクチンの調製に用いるため
の、あるフラビウイルスからの少なくとも1つの構造タ
ンパク質をコード化する核酸配列と他のフラビウイルス
からの非構造タンパク質をコード化する核酸配列とを含
むゲノムを有するキメラウイルスを含む。このゲノム
は、好ましくはウイルス毒性を縮減する変異をウイルス
ゲノム内に有し、特に好ましい実施例においては、これ
らのワクチンはデングウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス
及び日本脳炎ウイルスのようなフラビウイルスから導か
れる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換え活性キメラ
フラビウイルスに関し、さらに、デング熱ウイルスと、
ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)を含むその他のフラ
ビウイルスに対するワクチンに関する。本発明は、さら
に、組換え4型デング熱ウイルスの生成を導くようにR
NA転写物をコードするcDNA配列と、組換え突然変
異4型デング熱ウイルスキメラデング熱ウイルスと、組
換えDNA断片を作製して突然変異を組み込んだキメラ
デング熱ウイルスと、それらを用いて形質転換した細胞
に関する。
【0002】
【従来の技術】フラビウイルス科(Flaviviridae)に
は、約60個の包被正鎖RNAウイルスが含まれ、その
大半は昆虫により媒介される。この科に属する多数のウ
イルスは、世界各地で重大な公衆衛生上の問題を起こし
ている(T.P.Monath(1986)「トガウイ
ルス科(Togaviridae)およびフラビウイルス科」S.
Schlesinger他編、375〜440頁、プレ
ナム・プレス社、ニューヨーク)。これまでに配列決定
されたすべてのフラビウイルスのゲノムは、同一の遺伝
子順序を有している。すなわち、5’−C−preM−
E−NS1−NS2A−NS2B−NS3−NS4A−
NS4B−NS5−3’であり、最初の3つの遺伝子
は、構造タンパク質であるカプシド(C)と、プレメン
ブレンタンパク質(preM)と、エンベロープタンパ
ク質(E)をコードしている。デング熱は、蚊媒介ウイ
ルス性疾病であり、世界各地の熱帯および亜熱帯地域で
発生する。デング熱ウイルス亜群[subgroup]
は、フラビウイルス科の他のウイルスのどれよりもヒト
疾病を起こす。デング熱は、発熱、発疹、激しい頭痛、
関節痛を特徴としている。その死亡率は低い。しかしな
がら、過去数十年間にわたり、出血およびショックを特
徴とする、より重症のデング熱(デング出血熱/デング
熱ショック症候群;DHF/DSS)が、子供および若
者に増加している。DHF/DSSは、ある血清型[s
erotype]のデング熱ウイルスにすでに感染した
者が別のデング熱ウイルスに感染した際に、もっとも頻
繁に発生する。このことは、ウイルス複製の免疫強化
が、より重症の疾病の病因においてある役割を果たして
いることを示唆している(S.B.Halstead
(1988)サイエンス第239巻476〜481
頁)。デング熱伝染は、媒介となる蚊種が豊富な熱帯お
よび亜熱帯の多くの地域において、大きな公衆衛生問題
となっている。40年間もの熱心な研究にもかかわら
ず、デング熱ウイルス疾病のための安全で有効なワクチ
ンはできていない。デング熱ウイルスは、WHOによ
り、研究促進およびワクチン開発の高優先度目標として
指定された。デング熱ウイルスは、1944年における
単離の後まもなく、マウスの脳において繰り返し継代培
養[passage]され、その結果、マウス神経毒性
[neurovirulent]突然変異体が選抜され
た(A.B.Sabin(1952)Amer.J.T
rop.Med.Hyg.第1巻30〜50頁)。興味
深いことに、被験希望者において実施された研究によ
り、1型または2型デング熱ウイルスの3つの株のマウ
ス脳適合神経毒性突然変異体は弱毒化されてはいるが、
なお、ヒトについて免疫原性をもつことが示された
(A.B.Sabin(1952)Amer.J.Tr
op.Med.Hyg.第1巻30〜50頁、A.B.
Sabin(1955)Amer.J.Trop.Me
d.Hyg.第4巻198〜207頁、A.B.Sab
in(1955)Amer.J.Trop.Med.H
yg.第4巻198〜207頁、R.W.Schles
inger他(1956)J.Immunol.第77
巻352〜364頁、C.L.Wisseman他(1
963)Amer.J.Trop.Med.第12巻6
20〜623頁)。しかしながら、これらの突然変異体
は、ワクチン株候補としてはそれ以上開発されなかっ
た。これは、ワクチン製剤中のマウス脳抗原に対する懸
念の故である。このとき以来、(i)小型プラーク(溶
菌斑)表現型を示した、および/または(ii)温度感受
性であった、および/または(iii )人工的な宿主から
由来する細胞培養に適合した(すなわち宿主域突然変
異)ウイルス突然変異が、弱毒化生菌ウイルスワクチン
に包含させるための候補として選抜され評価されてきた
(V.R.Harrison他(1977)Infe
c.Immun.第18巻151〜156頁;C.H.
Hoke他(1990)Am.J.Trop.Med.
Hyg.第43巻219〜226頁;N.Bhamar
apravati他(1987)Bull.WHO第6
5巻189〜195頁)。しかしながら、25年間のこ
のような努力にもかかわらず、安全で効果的なデング熱
ワクチンは、一般用としてはまだ得られていない。不活
化全デング熱ウイルスワクチンは、免疫原性が不十分で
あることが証明されている。細胞培養において連続継代
培養により弱毒化された生菌ウイルスワクチンは、弱毒
化による遺伝子的不安定性や免疫原性の欠乏という難点
がある。本発明は、キメラデング熱ウイルスおよびキメ
ラフラビウイルスワクチンを提供することにより、技術
的発展をもたらすものである。4つの血清型のデング熱
ウイルス(1型〜4型)は、血清型特異的モノクローナ
ル抗体を用いたプラーク減縮中和法により、および、ポ
リクローナル血清を用いたやや特異性の低い試験により
区別することができる(W.M.Bankcroft他
(1979)Pan Am.Hlth.Org.Sc
i.Publ.第375巻175〜178頁;E.A.
Henchal他(1982)Am.J.Trop.M
ed.Hyg.第31巻548〜555頁)。血清型の
存在は、ヒト被験希望者における初期の研究において最
初に発見され、1つの血清型のデング熱に感染すると耐
久性のある同型免疫が誘導されるものの異型免疫は3〜
5ケ月しか持続しないことが証明された(A.B.Sa
bin(1952)Amer.J.Trop.Med.
Hyg.第1巻30〜50頁)。デング熱ウイルス一般
に対して広範囲の免疫を誘導するために4つの血清型す
べてを含む効果的なデング熱ワクチンがあれば、DHF
/DSSの発生を妨害することができるだろう。3型お
よび4型デング熱ウイルスおよびマウス神経毒性ニュー
ギニアC型を含む2型ウイルスの数株については、完全
なヌクレオチド配列が決定されている。しかしながら、
1型ウイルスゲノムについては、5’部分だけが配列決
定されているにすぎない(E.Mackow他(198
7)Virology第159巻217〜228頁;
B.Zhao他(1986)Virology第155
巻77〜88頁;K.OsatomiおよびH.Sum
iyoshi(1990)Virology第176巻
643〜647頁;A.Irie他(1989)Gen
e第75巻197〜211頁;P.W.Mason他
(1987)Virology第161巻262〜26
7頁;Y.S.Hahn他(1988)Virolog
y第162巻167〜180頁)。これらの研究の成果
は、デング熱ウイルスの4つの血清型が共通のゲノム構
成をもつことを示している。4型デング熱のカリブ株8
14669のゲノムは10646個のヌクレオチドを含
むことがわかっている(E.Mackow他(198
7)Virology第159巻217〜228頁;
B.Zhao他(1986)Virology第155
巻77〜88頁)。5’末端における最初の101個の
ヌクレオチドおよび3’末端における最後の384個は
コードしていない。残りの配列は、3386個のアミノ
酸ポリタンパク質をコードしており、これには、3つの
構造タンパク質、すなわち、カプシド(C)、プレメン
ブレン(pre−M)、エンベロープ(E)がそのN末
端に含まれ、7個の非構造タンパク質が上述した順序で
続いている。これは、これまでに識別されたすべてのフ
ラビウイルスゲノムに共通している。ポリタンパク質
は、細胞信号ペプチダーゼにより、および、ウイルスプ
ロテアーゼにより、11個以上のウイルスタンパク質を
生じるようにプロセス(L.Markoff(198
9)J.Virol.第63巻3345〜3352頁;
B.Falgout他(1989)J.Virol.第
63巻1852〜1860頁;B.Falgout他
(1991)J.Virol.第65巻2467〜24
76頁;H.HoriおよびC.J.Lai(199
0)J.Virol.第64巻4573〜4577
頁)。我々はすでに、感染性RNAの転写のための鋳型
として用いることのできる完全長デング熱ウイルスcD
NAを構築した。我々は、安定的にクローンされた完全
長デング熱ウイルスcDNAを得、DNA鋳型から派生
した(インビトロ)試験管内RNA転写物が培養中の細
胞に対して感染性をもつことがわかった。しかしなが
ら、この感染性構築物と、そこから生成された感染性R
NA転写物は病原性である。さらに、これまでに生成さ
れた弱毒化デング熱ウイルスは遺伝学的に不安定で、時
間がたつと病原性形態に逆戻りする可能性を有してい
る。それでも、弱毒化ウイルスは望ましい。その理由
は、弱毒化ウイルスにより長期間持続する免疫が得られ
ることが一般に知られているからである。したがって、
この構築物またはキメラ構築物を病原性の低いウイルス
の産生を導くように改変すれば、弱毒化フラビウイルス
ワクチン技術において相当の進歩となるだろう。したが
って、我々は、ここに開示するとおり、cDNAの3’
非コード領域において一連の欠失を構築し、活性デング
熱ウイルス突然変異体を回収して増殖特性を分析した。
フラビウイルス科のその他のウイルスもやはり病原性で
ある。その例としては、ダニ媒介脳炎ウイルスおよび日
本脳炎ウイルスがあげられる。弱毒化デング熱ウイルス
ワクチンのように、弱毒化ダニ媒介脳炎ウイルス(TB
EV)ウイルスは、遺伝学的に不安定で免疫性に乏しい
傾向があった。したがって、他の弱毒化フラビウイルス
ワクチンも、技術におけるかなりの前進となるであろ
う。すなわち、本発明は、さらに、他のフラビウイルス
に対するワクチン製造のための遺伝子操作およびキメラ
ウイルス開発のフレームワークとして、デング熱ウイル
スや別のフラビウイルスの改変完全長組換えcDNA構
築物を採用する。ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)
は、ダニによってのみ媒介され、血清学的に区別できる
2つのサブタイプに分類される。ロシアのシベリア地方
と極東地方に優勢な東部サブタイプ(プロトタイプ株S
ofjin)と、ヨーロッパ東部および中央部に見られ
る西部サブタイプ(プロトタイプ株Neudorfl)
である。TBEVは、死亡率が1〜30%の重い脳炎を
引き起こす。TBEVの詳細についてはCalishe
r他(J.Gen.Virol.第70巻37〜43
頁)を参照されたい。現在、TBEVのホルマリン不活
化により製造された試験的TBEワクチンが入手できる
が、このワクチンはいくつかの制約を有している。たと
えば、このワクチンの免疫原性は十分ではないため、防
御免疫反応を生じさせるためには繰返し接種が必要であ
る。ワクチンに対する抗体反応があった場合でも、この
ワクチンは、個体群の20%において、ウイルスに対す
る防御反応を提供することができない。したがって、よ
り改良されたTBEVワクチンが必要とされている。
【0003】(発明の概要)一態様において、本発明
は、少なくとも2つのフラビウイルスから由来した核酸
を含む、組換えDNA構築物を提供する。この構築物
は、ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)からの2つ以下
の構造タンパク質を作動可能(operably)にコード化す
る核酸領域を含む。この領域は、TBEV以外のフラビ
ウイルスからの構造タンパク質を作動可能にコード化す
る核酸領域に結合する。好ましくは、この構築物は、ダ
ニ媒介脳炎ウイルスからの2つ以下の構造タンパク質を
作動可能にコード化する核酸領域に結合する、フラビウ
イルスカプシドタンパク質を作動可能にコード化する核
酸領域を含む。カプシドタンパク質および非構造タンパ
ク質をコード化する核酸領域は、好ましくは、4型デン
グ熱ウイルスなどのデング熱ウイルス由来のものであ
る。好ましい形態において、この構築物は、少なくとも
2つのフラビウイルスに由来する核酸内に、少なくとも
1つの突然変異を含む。この好ましい形態の一実施例に
おいて、突然変異は、NS1(1)タンパク質グリコシ
ル化を排除する。この形態の別の実施例において、突然
変異は、成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産
生を妨害する。突然変異がウイルス増殖速度に影響する
ことが好ましい。さらに、本発明は、これらの組換えD
NA構築物に対応するRNA転写物を含む。本発明の別
の態様において、フラビウイルス由来のゲノムを有する
キメラウイルスが得られる。このキメラウイルスは、ダ
ニ媒介脳炎ウイルスからの2つ以下の構造タンパク質を
コード化する核酸領域と、他のフラビウイルスからの非
構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含む。好ま
しくは、このウイルスは、フラビウイルスファミリーの
他のメンバーからのカプシドタンパク質をコード化する
核酸領域を含む。ダニ媒介脳炎ウイルスからの核酸は、
プレメンブレンおよび/またはエンベロープタンパク質
など、多数のタンパク質のどれでもコード化することが
できる。他のフラビウイルスからの非構造タンパク質を
コード化する核酸は、好ましくは、4型デング熱ウイル
スなどのデング熱ウイルスである。一実施例において、
本発明の本態様のキメラウイルスは、核酸内に少なくと
も1つの突然変異を含む。この突然変異は、NS1
(1)タンパク質グリコシル化を排除する突然変異や、
成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害
する突然変異など、多数の形態のいずれをとってもよ
い。突然変異がウイルス増殖速度に影響することが好ま
しい。本発明の別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウイル
スのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質をコ
ード化する核酸領域と、別のフラビウイルスからのカプ
シドタンパク質をコード化する核酸領域と、同じフラビ
ウイルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領
域とを含むキメラウイルスが得られる。フラビウイルス
は、たとえば、4型デング熱ウイルスなどのデング熱ウ
イルスである。本発明の本態様において、好ましい形態
のキメラウイルスは、ダニ媒介脳炎ウイルスのプレメン
ブレンおよびエンベロープタンパク質をコード化する核
酸領域内に少なくとも1つの突然変異を含む。突然変異
は、成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を
妨害するものを用いることができる。別の好ましい形態
において、キメラウイルスは、他のフラビウイルスから
の核酸領域内に少なくとも1つの突然変異を含む。この
突然変異は、NS1(1)タンパク質グリコシル化を排
除するものを用いることができる。さらに別の態様にお
いて、本発明によれば、脊椎動物において防御免疫反応
を生起することのできる、本発明のキメラウイルスから
なるダニ媒介脳炎に対するヒト用ワクチンが得られる。
すなわち、本発明は、さらに、フラビウイルスに対する
ヒト用ワクチンを製造する方法を含み、フラビウイルス
からのプレメンブレンおよびエンベロープタンパク質
と、デング熱ウイルスからのカプシドおよび非構造タン
パク質とをコード化することのできるDNA構築物を作
製し、上記DNA構築物から感染性RNA転写物を生成
し、上記RNA転写物を細胞に導入し、上記細胞内でR
NA転写物を発現させ、上記細胞からウイルスを収穫
し、上記ウイルスを脊椎動物において試験し、上記ウイ
ルスをヒトに接種することを含む。本発明の好ましい態
様によれば、日本脳炎ウイルスのプレメンブレンおよび
エンベロープタンパク質をコード化する核酸領域と、別
のフラビウイルスからのカプシドタンパク質をコード化
する核酸領域と、デング熱ウイルスなどの、同じフラビ
ウイルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領
域とを含むキメラウイルスが得られる。本発明の別の態
様によれば、RNAゲノムを有するキメラウイルスが得
られる。このゲノムは、4型デング熱ウイルスの非構造
タンパク質を作動可能(operatively)にコード化する
核酸領域と、1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイ
ルス、3型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳
炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、または別のフラビ
ウイルスの構造タンパク質を作動可能にコード化する核
酸領域とを含む。本発明の一実施例において、キメラウ
イルスのゲノムは、4型デング熱ウイルス構造タンパク
質を作動可能にコード化する核酸を実質的にもっていな
い。このキメラウイルスの好ましい実施例は、p2A
(D1WP)またはp2A(D2NGC)RNAを含
む。好ましくは、キメラウイルスは、1型デング熱ウイ
ルス、2型デング熱ウイルス、または3型デング熱ウイ
ルスの非構造タンパク質をコード化することのできる核
酸領域と、1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイル
ス、3型デング熱ウイルス、4型デング熱ウイルス、黄
熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイル
ス、または別のフラビウイルスの構造タンパク質をコー
ド化することのできる核酸領域とを含む。非構造タンパ
ク質を作動可能にコード化することのできる核酸は、好
ましくは、非構造タンパク質を作動可能にコード化する
ことのできる核酸の領域とは異なるウイルス由来のもの
である。本発明の別の態様によれば、RNAゲノムを有
するキメラウイルスが得られる。このゲノムは、黄熱病
ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、
または別のフラビウイルスの非構造タンパク質を作動可
能にコード化する核酸領域と、1型デング熱ウイルス、
2型デング熱ウイルス、3型デング熱ウイルス、4型デ
ング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、
ダニ媒介脳炎ウイルス、または別のフラビウイルスの構
造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域とを含
む。構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸の領
域は、好ましくは、非構造タンパク質を作動可能にコー
ド化する核酸の領域とは異なるウイルス由来のものであ
る。本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物におい
てウイルスに対する防御免疫反応を生起することのでき
るワクチンが得られる。このワクチンは、安全でかつ免
疫学的に有効な量の本発明のウイルスのいずれかと、薬
学的および免疫学的に受容可能な担体とを含んでいる。
本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物においてウ
イルスに対する防御免疫反応を生起することのできる別
のワクチンが得られる。本発明の本態様において、この
ワクチンは、以下のウイルスの安全でかつ免疫学的に有
効な量を含む。a)4型デング熱ウイルスの非構造タン
パク質をコード化する核酸領域と、1型デング熱ウイル
スの構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むゲ
ノムをもつキメラウイルス、b)4型デング熱ウイルス
の非構造タンパク質をコード化する核酸領域と、2型デ
ング熱ウイルスの構造タンパク質をコード化する核酸領
域とを含むゲノムをもつキメラウイルス、c)4型デン
グ熱ウイルスの非構造タンパク質をコード化する核酸領
域と、3型デング熱ウイルスの構造タンパク質をコード
化する核酸領域とを含むゲノムをもつキメラウイルス、
d)弱毒化4型デング熱ウイルス。本発明のさらなる態
様によれば、4型デング熱ウイルスの非構造領域と、1
型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、3型デン
グ熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダ
ニ媒介脳炎ウイルス、および別のフラビウイルスのうち
の1つからの構造領域とを含むDNAセグメントが得ら
れる。本発明の好ましい実施例において、DNAセグメ
ントは、構造および非構造領域に作動可能に結合するプ
ロモーターを含む。別の好ましい実施例において、DN
Aセグメントは、プロモーターとしてSP6またはT7
プロモーターを含む。さらに別の実施例において、DN
Aセグメントはp2A(D1WP)またはp2A(D2
NGC)である。本発明の他のいくつかの態様によれ
ば、他のキメラDNAセグメントが得られる。本発明の
これらの態様によるDNAセグメントは、1型デング熱
ウイルス、2型デング熱ウイルス、または3型デング熱
ウイルスの非構造領域を含んでいる。これらのDNAセ
グメントは、さらに、以下のウイルスのうちの1つから
の構造領域を含んでいる。1型デング熱ウイルス、2型
デング熱ウイルス、3型デング熱ウイルス、4型デング
熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ
媒介脳炎ウイルス、フラビウイルス。ただし、構造領域
と非構造領域は同一ウイルス由来ではないことを条件と
する。本発明のさらなる態様によれば、DNAセグメン
トは、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳
炎ウイルス、および別のフラビウイルスのうちの1つか
らの非構造領域と、1型デング熱ウイルス、2型デング
熱ウイルス、4型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、
日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および別の
フラビウイルスのうちの1つからの構造領域とを含み、
構造領域は非構造領域とは異なるウイルス由来である。
本発明の別の態様によれば、フラビウイルスの非構造領
域またはその一部、および異なるフラビウイルスの構造
領域またはその一部からなるDNAセグメントが得られ
る。本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物におい
てウイルスに対する防御免疫反応を生起することのでき
るワクチンが得られる。このワクチンは、安全かつ免疫
学的に有効な量のキメラウイルスを含む。このウイルス
のゲノムは、ダニ媒介脳炎ウイルスからの構造タンパク
質を作動可能にコード化する核酸と、デング熱ウイルス
からの非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸
とを含む。本発明のさらに別の態様によれば、別のキメ
ラウイルスが得られる。この態様において、キメラウイ
ルスは、ダニ媒介脳炎ウイルス構造タンパク質および4
型デング熱ウイルス非構造タンパク質とを作動可能にコ
ード化するウイルスのゲノムをもつ。好ましい実施例に
おいて、ウイルスの構造タンパク質はダニ媒介脳炎ウイ
ルス由来のものである。本発明のさらに別の態様によれ
ば、ダニ媒介脳炎ウイルス構造タンパク質および4型デ
ング熱ウイルス非構造タンパク質を作動可能にコード化
するDNAセグメントが得られる。本発明のさらなる態
様によれば、感染性4型デング熱ウイルスRNAをコー
ド化する、分離されたDNA断片が得られる。本発明の
さらに別の態様によれば、本発明のDNA断片とベクタ
ーからなる組換えDNA構築物が得られる。好ましい実
施例において、ベクターはプラスミドである。本発明の
さらなる態様によれば、DNA断片の発現を可能とする
ようにして本発明の組換えDNA構築物で安定的に形質
転換された宿主細胞が得られる。好ましい実施例におい
て、宿主細胞は原核細胞である。本発明の別の態様によ
れば、4型デング熱ウイルスの突然変異を作製する方法
が得られる。この方法は、(i)部位特異的突然変異誘
発により4型デング熱ウイルスのゲノムに突然変異を導
入し、(ii)突然変異を有する感染性4型デング熱ウイ
ルスを回収し、(iii )回収したウイルスを評価するス
テップを含む。本方法の一実施例において、回収された
ウイルスは、弱毒化または無毒性の表現型について評価
される。本発明のさらに別の態様によれば、4型デング
熱ウイルスに対するヒト用ワクチンが得られる。このワ
クチンは、疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の
無毒性4型デング熱ウイルスと、薬学的に受容可能な担
体とを含む。好ましい実施例において、無毒性4型デン
グ熱ウイルスは、ウイルスゲノム内の重要な領域におい
て突然変異を加工することにより得られる。本発明のさ
らに別の態様によれば、キメラフラビウイルスRNAを
コード化するDNA断片が得られる。キメラRNAは、
たとえば、1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイル
ス、3型デング熱ウイルスからなる群から選択されたウ
イルスを含んでいる。本発明のさらに別の態様によれ
ば、キメラデング熱ウイルスの構築のための方法が得ら
れる。この方法は、本発明の方法により得られた4型デ
ング熱ウイルスDNAのDNA断片を、異なるフラビウ
イルスからの、対応する遺伝子全体またはその画分[f
raction]で置換することを含んでいる。好まし
い実施例において、異なるフラビウイルスは以下のウイ
ルスの1つである。1型デング熱ウイルス、2型デング
熱ウイルス、3型デング熱ウイルス。別の好ましい実施
例において、4型デング熱ウイルスは少なくとも1つの
突然変異を含む。本発明は、デング熱ウイルスに対する
ヒト用ワクチンを提供する別の態様を含む。本態様にお
いて、本発明は、疾病に対して免疫を誘発するのに十分
な量の感染性キメラウイルスと、薬学的に受容可能な担
体とを含む。キメラウイルスは、たとえば、1型デング
熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、3型デング熱ウイ
ルス、あるいは4型デング熱ウイルスに由来する。本発
明のさらに別の態様によれば、本発明のDNA断片と、
ベクターからなる組換えDNA構築物が得られる。1つ
の好ましい実施例において、ベクターはプラスミドであ
る。本発明のさらに別の態様によれば、DNAの発現を
可能とするようにして、本発明の方法により得られた組
換えDNA構築物で安定的に形質転換された宿主細胞が
得られる。好ましい実施例において、宿主細胞は原核細
胞である。本発明のさらに別の態様によれば、非構造タ
ンパク質NS1−NS2Aの開裂部位のNS1のC末端
における8個のアミノ酸のうちの1つ又はそれ以上をコ
ード化する配列内に置換突然変異を含む、4型デング熱
ウイルスRNAをコード化するDNA断片が得られる。
本発明のさらなる態様によれば、非構造タンパク質NS
1−NS2Aの開裂部位のつぎの+1位置の部位であ
る、グリシンをコード化する部位に置換を含む、4型デ
ング熱ウイルスRNAをコード化するDNA断片が得ら
れる。本発明のさらなる態様によれば、3’側非コード
領域内に欠失を含む、4型デング熱ウイルスRNAをコ
ード化するDNA断片が得られる。好ましい実施例にお
いて、欠失は、ヌクレオチド30〜202個分の長さを
もつ。本発明の別の態様によれば、本発明のDNA断片
のいずれかとベクターとを含む組換えDNA構築物が得
られる。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のD
NA断片の感染性RNA転写物が得られる。本発明のさ
らなる態様によれば、DNA断片の発現を可能とするよ
うにして、本発明のDNA構築物でトランスフェクショ
ンされた宿主細胞が得られる。このような宿主細胞には
哺乳類または昆虫の細胞を用いることができる。本発明
のさらに別の態様によれば、4型デング熱ウイルスに対
するヒト用ワクチンが得られる。本発明の本態様におい
て、このワクチンは、疾病に対して免疫を誘発するのに
十分な量の、毒性低減化突然変異4型デング熱ウイルス
を含む。好ましい実施例において、突然変異4型デング
熱ウイルスは、ウイルスゲノムにおける3’側非コード
領域内に欠失突然変異を加工することにより得られる。
別の好ましい実施例において、突然変異4型デング熱ウ
イルスは、非構造タンパク質NS1−NS2Aの開裂部
位のNS1のC末端における8個のアミノ酸のうちの1
つ又はそれ以上をコード化するウイルスDNA配列内に
置換突然変異を加工することにより得られる。さらに別
の好ましい実施例において、突然変異4型デング熱ウイ
ルスは、非構造タンパク質NS1−NS2Aの開裂部位
のつぎの+1位置の部位である、グリシンをコード化す
るウイルスDNA部位に置換を加工することにより得ら
れる。本発明のさらに別の態様によれば、4型デング熱
ウイルスDNAのDNA断片を、異なるフラビウイルス
からの対応する遺伝子全体またはその画分で置換するこ
とを含む、キメラデング熱ウイルスの構築方法が得られ
る。好ましい実施例において、異なるフラビウイルス
は、1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、3
型デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎
ウイルスの1つである。別の好ましい実施例において、
キメラデング熱ウイルスの構築方法は、本発明による4
型デング熱ウイルスDNAのDNA断片を、異なるフラ
ビウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で
置換することを含む。好ましくは、フラビウイルスは、
1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、3型デ
ング熱ウイルス、日本脳炎ウイルスからなる群から選択
される。さらに好ましくは、キメラデング熱ウイルスの
構築方法は、本発明による4型デング熱ウイルスDNA
のDNA断片を、フラビウイルスからの対応する遺伝子
全体またはその画分で置換することを含む。好ましい方
法において、フラビウイルスは、1型デング熱ウイル
ス、2型デング熱ウイルス、3型デング熱ウイルス、日
本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスからなる群から
選択される。本発明のさらに1つの態様によれば、疾病
に対して免疫を誘発するのに十分な量を投与される、デ
ング熱ウイルスに対するワクチンが得られる。このワク
チンは、毒性が低減したキメラウイルスを含み、上記キ
メラウイルスは、3’側非コード領域に欠失を含む4型
デング熱ウイルスRNAをコード化するDNA断片を含
む。好ましい実施例において、キメラウイルスは2型デ
ング熱ウイルス、3型デング熱ウイルス、4型デング熱
ウイルスからなる群から選択される。本発明のさらなる
態様は、以下の発明の詳細な説明を参照することによ
り、当業者にとって明らかになるであろう。
【0004】
【発明の実施の形態】キメラフラビウイルスの生成 デング熱ウイルスは、ほぼ11キロベースの正鎖RNA
ゲノムを含み、このゲノムは、3つの構造タンパク質
(カプシド(C)、プレメンブレン(preM)、エン
ベロープ(E))を1つの読取りフレームでコードして
おり、7個の非構造タンパク質(NS1、NS2A、N
S2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)がそれ
に続いている。本発明は、1つの「型(type)」のデン
グ熱ウイルスまたはフラビウイルスからの非構造タンパ
ク質と、異なる「型」のデング熱ウイルスまたは別のフ
ラビウイルスからの構造タンパク質とを含むキメラデン
グ熱ウイルスに関する。一実施例において、本発明は、 1)1型、2型、3型、4型デング熱ウイルス、黄熱病
ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、
またはフラビウイルスの非構造領域と、 2)1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、3
型デング熱ウイルス、4型デング熱ウイルス、黄熱病ウ
イルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ま
たはフラビウイルスから選択された構造領域とを含み、
上記構造領域は上記非構造領域とは異なる「型」のデン
グ熱ウイルスまたはフラビウイルス由来のものであるこ
とを特徴とするキメラウイルスに関する。別の実施例に
おいて、本発明は、 1)4型デング熱ウイルス(DEN4)の非構造領域
と、 2)1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、3
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
1つの好ましい実施例において、このウイルスは、4型
デング熱ウイルス構造領域を実質的にもっていない。好
ましい実施例において、このウイルスはp2A(D1W
P)またはp2A(D2NGC)RNAからなる。さら
なる実施例において、本発明は、 1)1型デング熱ウイルスの非構造領域と、 2)2型デング熱ウイルス、3型デング熱ウイルス、4
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
さらなる実施例において、本発明は、 1)2型デング熱ウイルスの非構造領域と、 2)1型デング熱ウイルス、3型デング熱ウイルス、4
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 1)3型デング熱ウイルスの非構造領域と、 2)1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、4
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 1)黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎
ウイルス、およびフラビウイルスから選択された非構造
領域と、 2)1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、4
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含み、上記構造領域は上記非構
造領域とは異なるウイルス由来のものであることを特徴
とする、キメラウイルスに関する。さらなる実施例にお
いて、本発明は、上記キメラウイルスの少なくとも1つ
と、薬学的ならびに免疫学的に受容可能な担体からなる
ワクチンに関する。ワクチンに含まれるウイルスの量
は、投与の経路に応じて選択される。皮下経路が好まし
いが、上述のワクチンは、皮内経路によっても投与でき
る。当業者であれば、いかなる治療法についても、投与
すべき量を容易に決定できることが理解されよう。さら
に別の実施例において、本発明は、 1)4型デング熱ウイルスの非構造領域と、1型デング
熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、 2)4型デング熱ウイルスの非構造領域と、2型デング
熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、 3)4型デング熱ウイルスの非構造領域と、3型デング
熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、 4)弱毒型4型デング熱ウイルスからなるワクチンに関
する。1つの好ましい実施例において、弱毒化ウイルス
は、非構造タンパク質領域(たとえば、改変されたNS
1−NS2開裂部位配列)内に、突然変異(点突然変
異、欠失、挿入、これらの組合せ)を含む。別の好まし
い実施例において、弱毒化ウイルスは、3’非コード領
域内に、突然変異(点突然変異、欠失、挿入、これらの
組合せ)を含む。さらに好ましい実施例において、弱毒
化ウイルスは、5’非コード領域に、突然変異(点突然
変異、欠失、挿入、これらの組合せ)を含む。別の好ま
しい実施例において、弱毒化ウイルスは、天然由来のも
のまたは研究室で加工したものである。別の実施例にお
いて、本発明は、上述のウイルスの少なくとも1つをコ
ード化するDNAセグメントに関する。1つの好ましい
実施例において、DNAセグメントは、構造および非構
造領域に作動可能に連結するプロモーター(好ましく
は、真核、原核、ウイルス性プロモーター、より好まし
くはSP6またはT7プロモーター)を含む。別の好ま
しい実施例において、DNAセグメントはp2A(D1
WP)またはp2A(D2NGC)を含む。すなわち、
当業者であれば、後述の実施例において提供される方法
を用いて、フラビウイルス科の1つのウイルスの構造領
域を、フラビウイルス科の別のウイルスからの非構造領
域に組合せて得られる型間組換え体を含むキメラデング
熱ウイルスワクチンを生成できることはいうまでもな
い。好ましい実施例において、4型デング熱ウイルス
(DEN4)の非構造タンパク質を1型デング熱ウイル
スの構造タンパク質に組み込んだキメラデング熱ウイル
スが作製される。これらの方法の詳細は、Bray他
(Proc.Natl.Acad.Sci.第88巻1
042〜1046頁、1991年)を参照されたい。後
述の実施例17は、実施例1に説明するキメラデング熱
ウイルス製造のための方法につづいて4型デング熱ウイ
ルスの非構造領域をダニ媒介脳炎ウイルスの構造領域に
組み合わせたキメラウイルス(TBEV(CME)/D
EN4)の作製を開示している。これらの方法により作
製されたウイルスは培養中で複製され、組織培養細胞ま
たは実験動物の感染に用いられた。
【0005】神経毒性に影響するデングゲノムにおける
突然変異 我々は、細胞培養における増殖特性およびプラーク形態
の変化を示す、3’非コード領域における欠失を含む一
連の活性デング熱ウイルス突然変異体を加工した。同様
に、我々は、ウイルスポリタンパク質の非構造タンパク
質領域の新規な開裂部位配列内に核酸酸置換を含む、別
の一連の、増殖制限されたデング熱ウイルス突然変異体
を加工した。複製能力が低下したデング熱ウイルス突然
変異体は、生菌ウイルスワクチンに用いるための適格性
を判定するために、実験動物における毒性の低下につい
て評価を受ける。本発明において、3’非コード領域内
に欠失を含む増殖制限された4型デング熱ウイルス突然
変異体の構築は、完全長4型デング熱ウイルスcDNA
クローンを用いて重要な領域内に欠失を加工することに
より実行される。欠失突然変異は、アミノ酸置換突然変
異に比べて、表現型の逆転が少ないという利点をもって
いる。他の蚊媒介フラビウイルスと同様に、4型デング
熱ウイルスは、指定された保存配列1(CS−1)およ
び保存配列2(CS−2)の保存領域と、潜在的末端ス
テム・アンド・ループ構造とを含む3’非コード配列を
有している。ヌクレオチド3〜202個の範囲の欠失
は、4型デングcDNAのヌクレオチド384個の3’
非コード配列内のさまざまな位置に導入することができ
る。CS−1領域のcDNAクローン欠損配列から作製
され、しかしステム・アンド・ループ構造をとどめてい
るRNA転写物は、子孫ウイルスを生じることがなく、
欠失が致死的であることを示している。一方、たいてい
の他の3’非コード領域欠失構築物からは、感染性ウイ
ルスを回収することができる。これらの突然変異体およ
び野生型ウイルスのプラーク検定は、蚊細胞(C6/3
6)に対して実施することができる。分析の結果、ほと
んどの欠失突然変異体が、欠失の位置と程度に応じて、
1.0から0.3cmにわたる、縮減サイズのプラーク
を形成することが示されている。プラーク形態のこのよ
うな変化は、これらの欠失突然変異体が増殖制限表現型
をあらわすことを示すものである。3’非コード領域内
に欠失を含むデング熱ウイルス突然変異体のこのパネル
は、実験動物においてそれらの感染性および免疫原性に
ついて評価することができる。実験霊長類に対して低下
した毒性を示す突然変異体は、ワクチンウイルス候補と
して選択され、ヒトにおける評価を受ける。さらに、本
発明は、3’非コード領域に欠失を含むDNA断片およ
びベクターを含む組換えDNA構築物に関する。さら
に、本発明は、DNA構築物を用いてトランスフェクシ
ョンした宿主細胞に関する。さらに、本発明は、ウイル
スゲノムの3’非コード領域に欠失突然変異を導入し、
欠失突然変異を宿す感染ウイルスを回収する工程を含
む、4型デング熱ウイルスの突然変異を生成する方法に
関する。別の実施例において、本発明は、非構造タンパ
ク質NS1−NS2Aの開裂部位のNS1のC末端にお
ける8個のアミノ酸のうちの1つ又はそれ以上をコード
化する配列内に置換を含む、4型デング熱ウイルスRN
Aをコード化するDNA断片に関する。置換の概略は図
16に示されている。さらに、本発明は、非構造タンパ
ク質NS1−NS2Aの開裂部位のつぎの+1位置の部
位である、グリシンをコード化する位置に置換を含む、
4型デング熱ウイルスRNAをコード化するDNA断片
に関する。本発明は、さらに、ここに述べたDNA断片
の感染性RNA転写物に関する。非構造タンパク質内に
突然変異を含む増殖制限された4型デング熱ウイルス突
然変異の構築は、完全長4型デング熱ウイルスcDNA
クローンを用いてこのような戦略的突然変異を加工する
ことにより実行できる。デング熱ウイルス非構造タンパ
ク質の機能的活性に影響する突然変異により、増殖制限
を誘起することができる。たとえば、開裂配列またはウ
イルスプロテアーゼ部分を改変することにより、ウイル
スポリタンパク質の開裂を最適以下に抑え、ウイルス増
殖を制限する。我々は、非効率的な開裂により増殖制限
されるデング熱ウイルス突然変異を構築するためのター
ゲットとして、ポリタンパク質NS1−NS2A開裂部
位を選択した。我々は、4型デング熱ウイルスNS1−
NS2A開裂には、NS1のC末端における8個のアミ
ノ酸ドメインが必要であることを証明した。我々は、さ
らに、これらの位置の各々における置換および開裂部位
のつぎの+1位置のGlyの置換の効果を証明した。こ
のドメインにおけるアミノ酸置換の突然変異のパネル
は、開裂に対する効果について評価された(図16参
照)。開裂に対して広範囲の効果を生じた突然変異を識
別し、多数のこのような突然変異を選抜して、完全長4
型デング熱ウイルスcDNAクローンに組み込んだ。突
然変異体cDNA由来のRNA転写物を用いて細胞のト
ランスフェクションを行ない、これにより、NS1−N
S2A開裂領域内に指定された突然変異をもつ活性デン
グ熱ウイルス突然変異体が生成された。これらの突然変
異体は、まず、蚊C6/36細胞でのプラーク検定によ
り特徴づけられた。突然変異体のいくつかは、サイズの
縮小したプラークを生じ、これらの突然変異体ウイルス
が細胞培養において増殖制限を呈したことを示す。さら
に、本発明は、非構造タンパク質NS1−NS2Aの開
裂部位のNS1のC末端における8個のアミノ酸の1つ
又はそれ以上をコード化する配列内に置換突然変異を含
むDNA断片と、ベクターを含む組換えDNA構築物に
関する。本発明は、さらに、DNA構築物でトランスフ
ェクションした宿主細胞に関する。さらに、本発明は、
非構造タンパク質NS1−NS2Aの開裂部位のつぎの
+1位置である、グリシンをコード化する位置に置換を
含むDNA断片と、ベクターを含む組換えDNA構築物
に関する。本発明は、さらに、DNA構築物でトランス
フェクションした宿主細胞に関する。別の実施例におい
て、本発明は、上述したように、毒性の低下した突然変
異体4型デング熱ウイルスを、疾病に対して免疫を誘発
するのに十分な量含んでなる4型デング熱ウイルスに対
するヒト用ワクチンに関する。本発明の突然変異体は、
(1)ウイルス血症の期間として測定される毒性と、
(2)ウイルス感染後の抗体反応の種類と規模により示
される免疫原性について、霊長類において評価される。
サルにおいて毒性が低下しなお十分な免疫原性を維持す
るデング熱ウイルス突然変異体は、ヒトに対する臨床試
験において評価される。さらなる実施例において、本発
明は、4型デング3’非コード領域および/または非構
造タンパク質遺伝子内に、十分な弱毒化をもたらす突然
変異を含む4型デング熱ウイルスを構築すること、なら
びに、4型デング熱ウイルス突然変異体の各々を用いて
他のデング熱ウイルス血清型の抗原特異性をもつ型間キ
メラウイルスを構築しこれにより1型、2型、または3
型デング熱ウイルスにより発生する疾病の防御のために
用いることのできる弱毒化ウイルスを創作することに関
する。さらに、キメラウイルスは、日本脳炎ウイルスお
よびダニ媒介脳炎ウイルスなどのその他のフラビウイル
スに対する抗原特異性をもつものとしても構築すること
ができる。デング熱に対する免疫のための現在の戦略と
しては、4つのデング熱血清型すべてを含むワクチン製
剤の使用が好ましい。このことは、異なるデング熱血清
型に連続して感染することから生じる重いデング出血性
ショック症候群の危険から、風土病地域の人々を守るこ
とになろう。現在、弱毒化デング熱ワクチン候補は、人
工的な宿主の細胞内の連続継代培養を含む標準的技術に
より作製されている。これらの宿主域突然変異体を用い
て達成された成功は、ごく限られたものに過ぎない。た
とえば、2型デング熱ワクチンは満足できる程度に弱毒
化されたけれども、この方法により作製された3型デン
グ熱ワクチンはヒト被験希望者にデング熱を引き起こし
た。本発明は、活性キメラデング熱ウイルスを構築する
方法を提供する。本発明は、さらに、4型ウイルス5’
および3’非コード配列と、その7個の非構造タンパク
質のすべてをコードする配列とを含む、共通の4型デン
グ熱ウイルス遺伝子的背景を共有するキメラウイルスを
用いて、4つのデング熱血清型すべてに対して有効なワ
クチンを製造する方法を提供する。この目的のため、我
々は、3’非コード系に、あるいは、非構造タンパク質
遺伝子の1つに欠失を含む4型デング熱ウイルスを構築
し、これらのデング熱ウイルス突然変異体が複製能力の
大幅な抑制を示すことを証明した。したがって、満足で
きる程度の弱毒化をもたらす突然変異をこれらの共通領
域内において加工することができ、その結果、4つのデ
ング熱血清型特異性を別々に発現することになる4個の
クローン化された弱毒化デング熱ウイルスのひと組が得
られる。これらのウイルスには、親4型ウイルス、1型
(構造タンパク質遺伝子領域)−4型キメラ、同様な2
型−4型キメラ、および同様な3型−4型キメラ、なら
びに、日本脳炎およびダニ媒介脳炎のキメラが含まれ
る。不活化全デング熱ウイルスワクチンは、十分な免疫
原性を欠くことが示されていた。細胞培養における連続
継代培養により弱毒化された生菌ウイルスワクチンは、
不十分な弱毒化、遺伝学的不安定性、過度の弱毒化など
の欠点をもっていた。2型デング熱ワクチンは、まだ、
開発の初期段階にある。残りの3つの血清型の生菌ワク
チンは得られていない。本発明は、ウイルスゲノム内に
指定された突然変異をもつデング熱ウイルスを構築する
能力における技術的進歩を提供する。
【0006】キメラダニ媒介脳炎ウイルスワクチン カプシド、メンブレン、エンベロープの3つの構造タン
パク質配列を、デング熱ウイルス非構造タンパク質をコ
ード化する配列を含むデング熱ウイルス構築物に組み込
むことにより、ダニ媒介脳炎キメラウイルスが作製され
た。デング熱/ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)の組
合せは、デング熱ウイルスとTBEVウイルスタンパク
質および核酸配列の協力を必要とするようである。構築
物のウイルスは、それぞれ対応する天然のウイルスより
感染性が低かった。DEN4およびTBEVは、同じゲ
ノム構成をもち、遺伝子発現の同じ戦略を共有する。し
かし、2つのウイルス間の配列を比較すると、配列相同
性が比較的低いことが示される(Pletnev他、V
irology第174巻250〜263頁(199
0)をここに参考として取り入れる)。たとえば、2つ
のウイルスの間のアミノ酸同一性は、カプシドタンパク
質(C)については15.4%、メンブレンタンパク質
(M)については15.9%、エンベロープグリコタン
パク質(E)については36.5%、非構造タンパク質
(NS1)については39.1%である。以下の実施例
に、改良されたキメラTBEVワクチンを開示する。我
々は、すでに、感染性RNAのインビトロ転写のための
鋳型として用いることのできるクローン化された完全長
デング熱ウイルスcDNAについて説明した。これは、
pBR322ベクターを用いて大腸菌株内に安定な完全
長デング熱cDNAコピーをクローン化することにより
達成された。デング熱ウイルスは、cDNAのインビト
ロRNA転写物を用いてトランスフェクションした受容
細胞から回収された。デング熱cDNAの感染性RNA
転写物を用いてトランスフェクションした細胞により生
成されたウイルスの特性は、cDNAクローンが由来し
たもとのウイルスの特性と同一であった。さらに、我々
は、本発明において、1つの血清型のデング熱ウイルス
の非構造タンパク質遺伝子と、別の血清型のデング熱ウ
イルスからの構造タンパク質遺伝子とを含むゲノムを有
するキメラデング熱ウイルスの作製を開示した。キメラ
デング熱ウイルスの1例として、1つのデング熱ウイル
スからのカプシド、preM(メンブレン)、エンベロ
ープ遺伝子配列を用いて、組換えcDNA構築物におけ
る4型デング熱ウイルスの対応する遺伝子を置換した。
この構築物でトランスフェクションした細胞内で生成さ
れたウイルスは、同型デング熱ウイルスに対するワクチ
ンの作製において有用である。上述したように、本出願
は、さらに、デング熱ウイルスの非構造領域と別のフラ
ビウイルスの構造領域に対応する遺伝子配列を含むキメ
ラウイルスの構築を開示している。特に、キメラダニ媒
介脳炎ウイルスが開示されている。「キメラフラビウイ
ルスの生成」と題した項において概説した本発明の方法
は、TBEVからの3つの構造タンパク質を組み込んだ
組換えデング熱ウイルス構築物の製造を開示している。
この構築物でトランスフェクションした細胞から生成さ
れるウイルスは、生菌ウイルスワクチンのためのウイル
ス候補である。本出願に係る発明は、キメラフラビウイ
ルス作製の技術に対する重要かつ予想外の改良と、この
新規なワクチン戦略の有用性についてのあらがえない証
拠を提供する。当業者であれば、1つのウイルスの構造
タンパク質のすべてを第2のウイルスの非構造要素に組
み込んだキメラフラビウイルス組合せが容易に回収可能
であり、培養細胞において効率的に複製することを期待
できる。これは、関連性の離れたフラビウイルス由来の
構造タンパク質の機能的協力という要件の可能性がある
ためである。しかしながら、予期せぬことに、本発明
は、TBEVゲノムからの2つの構造タンパク質(すな
わちMおよびE)を、デング熱ウイルスからの第3の構
造タンパク質(すなわちC)と組み合わせたキメラTB
EVウイルス(TBEV/DEN4)を識別する。
【0007】キメラTBEV/DEN4構築物の作製 DEN4とTBEVとの間のアミノ酸配列相同性は低い
ため、TBEV配列を用いて対応するDEN4配列を置
換することにより、多様なTBEVおよびDEN4キメ
ラcDNA構築物が作られた。これらの構築物は、分子
生物学分野において公知の技術を用いて作製された。c
DNA構築物のインビトロ転写およびRNA産物の受容
細胞内へのトランスフェクションの後、さまざまな遺伝
子組合せのいずれかにより活性キメラウイルスが産生さ
れるかどうかを決定するために、構築物を試験した。す
でに、TBEV(Sofjin株)のサブゲノムcDN
A断片がクローンされ、公知の技術を用いてヌクレオチ
ド配列が決定された(前出のPletnev他、Vir
ology、および、Pletnev他、FEBS L
ett.第200巻317〜321頁1986を参
照)。これらのプラスミドは、全TBEVゲノム配列を
一緒に含む重複遺伝子配列を提供する。プラスミドpG
EM2−CMEまたはpGEM2−ENS1を鋳型とし
て用い、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
(例17参照)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によ
り一連のTBEV cDNA断片を作製し、各断片は、
制限酵素開裂部位が脇にある1つ又はそれ以上の特異遺
伝子を定めている。断片は図17に示されており、右端
のヌクレオチド位置により示される断片の配列は、Pl
etnev他による刊行物(Virology第174
巻250〜263頁、1990)において提供されてい
る。図17に、7個のこのようなTBEVcDNA断片
と、部位特異的突然変異誘発により完全長DEN4 c
DNAのRNA転写物内に同様に導入された適当な部位
に連結するのに適した修飾末端を示す。TBEV配列
の、ヌクレオチド(nt)76〜1977を含むプラス
ミドpGEM2−CMEおよびヌクレオチド966〜3
672を含むpGEM2−ENS1は、共有された制限
酵素部位におけるTBEV断片のライゲーション(連
結)により、プラスミドp10、p4、p18、p2、
p11から構築された(前出のPletnev他、Vi
rology、1990参照)。プラスミドDEN4p
5’−2およびp5’−2(ΔPstI、XhoI)
(前出のBray他、Proc.Natl.Acad.
Sci.1991)、および誘導体p5’−2(ΔPs
tI、XhoI、ΔHindIII )が、対応するDEN
4遺伝子のかわりに1つ又はそれ以上のTBEV遺伝子
を置換するために用いられた。分子生物学の当業者であ
れば、実施例17に示したプライマー配列すなわち配列
番号21〜31を用いてキメラTBEV構築物を生成す
ることができる。キメラ構築物の接合部における配列
は、核酸配列決定により証明された。得られたキメラプ
ラスミドのすべては、DEN4の第1のヌクレオチドを
あらわすA残基が後に続く転写開始のGの上流に位置す
るSP6プロモーターを含んでいた。プラスミドは、イ
ンビトロ転写物の前に、DEN4配列の3’末端の直後
の唯一のAsp718開裂部位で線状化された。この構
築物は、Lai他(Proc.Natl.Acad.S
ci.第88巻5139〜5143頁、1991)によ
り開示された技術を用いて、インビトロ転写により転写
された。図17のキメラ構築物からの転写物は、サルL
LC−MK2細胞にRNAをトランスフェクションする
ことにより、感染性について試験された。トランスフェ
クション処理には、LipofectinTM(Beth
esdaResearch Laboratorie
s,Inc.、メリーランド州Gaithersber
g)またはDOTAP(N−[1−(2,3−ジオレオ
イロキシ)プロピル−N,N,N−トリメチルアンモニ
ウム硫酸ジメチル、Boehringer Mannh
eim、インディアナ州インディアナポリス)のいずれ
かを用い、キメラRNA転写物を受容細胞に導入した。
サルLLC−MK2細胞の培養をこれらの処理に用いた
が、TBEV複製のための受容細胞型のどれでもかわり
に用いることができることは言うまでもない。トランス
フェクションされた培養は、TBEV特異的ウサギ血清
または高度免疫マウス腹水を用いた免疫蛍光検査によ
り、時間に対するウイルスの存在について、評価され
た。pTBE(ME)/DEN4(TBEVのプレメン
ブレンおよびエンベロープタンパク質からの配列をDE
N4のカプシドタンパク質および非構造配列に連結した
ものを含む)のRNA転写物を用いてトランスフェクシ
ョンされた細胞は、TBEV特異的ウサギ血清、TBE
V特異的高度免疫マウス腹水(HMAF)、およびDE
N4特異的HMAFで、陽性に染まった。DEN4のみ
に感染した対照培養は、免疫蛍光標識されたTBEV特
異的血清に対しては、陰性であった。このことは、キメ
ラvTBE(ME)/DEN4がTBEVおよびDEN
4双方の特異抗原を発現したことを示す。キメラウイル
スをトランスフェクションvTBEVから分離し、TB
E(CME)/DEN4(TBEVのカプシド、メンブ
レン、エンベロープ遺伝子と、DEN4の非構造配列と
を含むゲノム構築物)と、vTBE(ME)/DEN4
と呼ぶ。実施例17に開示したように、TBE(CM
E)/DEN4のRNAによるトランスフェクションの
16日後、約1%の細胞が、TBEVおよびDEN4特
異抗原に対して陽性に染まった。陽性細胞の割合は時間
とともに増加し、トランスフェクション後26日目に6
×105pfu/mLのピーク力価を示し、80%の細
胞がトランスフェクションされた。一方、TBE(M
E)/DEN4のRNAを用いてトランスフェクション
した細胞はより迅速にウイルスを生成し16日目に培養
の100%が感染した。トランスフェクション細胞内に
存在するTBE(ME)/DEN4ウイルス(v TB
E(ME)/(DEN4)で示す)の力価は、感染後2
6日目に4×106pfu/mLであった。さらに、キ
メラ構築物に感染させた細胞から生成された子孫ウイル
スの配列決定により、図17に示すように、キメラビリ
オン(ウイルス粒子)からのゲノム断片のDEN4およ
びTBEV接合部が、キメラ構築物の接合部に符合する
ことが確認された。
【0008】TBEV/DEN4ウイルスの性質 実施例17において提供された方法を用いて、キメラウ
イルスの性質を調べた。キメラTBEV/DEN4ウイ
ルスを用いたすべての作業は、BL−3封じ込め設備に
おいて実施された。キメラウイルスから製造されたタン
パク質を、4型デング熱ウイルスから作製されたタンパ
ク質と比較した。完全長DEN4cDNAクローンから
回収した4型デング熱ウイルスのタンパク質は、「キメ
ラフラビウイルス」と題する項において同定され、図4
に示され、Bray他(前出のProc.Natl.A
cad.Sci.USA(1991))に開示されてい
る。デング熱ウイルスタンパク質のタンパク質分離のパ
ターンを、vTBE(ME)DEN4感染細胞から生成
されたキメラウイルスタンパク質と比較した。この検定
(図18および実施例18参照)において、融合性LL
C−MK2細胞を、感染多重度(MOI)0.01で感
染させた。前出のLai他、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA(1991)により開示された技
術を用いて、被感染培養を35Sメチオニンとともにイン
キュベートした。以下のレーンを用いて感染細胞溶解物
の免疫沈降検査を実施した。1)TBEV特異的HMA
F、2)DEN4特異的HMAF、3)DEN4NS3
に対して作製されたウサギ抗血清、4)DEN4NS5
に特異なウサギ抗血清、5)DEN4のpreMに特異
なウサギ抗血清、6)DEN4のEタンパク質に特異な
ウサギ抗血清。免疫沈降物は、Laemmli(Nat
ure第227巻680〜685頁、1970)により
開示された技術を用い、図18に示すように、変性条件
のもとで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
された。キメラおよび親DEN4ウイルスのいずれも、
DEN4 NS3およびNS5として識別されたタンパ
ク質バンドを生じた(レーン3および4)。DEN4の
preMまたはEタンパク質は、キメラウイルスに感染
した細胞においては識別されなかったが、DEN4感染
細胞においては識別された(レーン5および6参照)。
DEN4特異的HMAFは、vTBE(ME)/DEN
4感染細胞溶解物からのタンパク質バンドのみを沈降さ
せ、これはDEN4 NS1およびNS3非構造タンパ
ク質と共に泳動した(レーン2)。TBEVのHMAF
は、キメラvTBE(ME)/DEN4に感染した細胞
の溶解物からのTBEVのEタンパク質(55kDa)
について正確なサイズを有するタンパク質を免疫沈降し
た。キメラウイルス感染細胞タンパク質は、DEN4の
Eよりも迅速に泳動した(レーン1および6)。以前の
実験において、TBEVのHMAFは、TBEV感染細
胞からの天然TBEV preMおよびCタンパク質を
沈降しなかった。したがって、TBEVのpreMおよ
びCタンパク質の同定は期待されなかった。LLC−M
2細胞においてvTBE(CME)/DEN4により
生成されたタンパク質バンドのプロフィールは、vTB
E(ME)/DEN4により生成されたものと同一であ
った。このように、キメラウイルスはLLC−MK2
胞において期待されたタンパク質を生成した。DEN4
により生じたウイルスプラークをキメラ構築物から生じ
たプラークと比較することにより、ウイルスのプラーク
形態観察を評価した。蚊C6/36細胞上で、DEN4
ウイルスプラークの平均サイズは12.1mmであっ
た。一方、vTBE(ME)/DEN4は平均6.5m
mのプラークを生じた。vTBE(ME)/DEN4
は、サルLLC−MK2細胞上にDEN4により生じる
ものと比べて5倍大きいプラークを生じた。このこと
は、キメラウイルスが、LLC−MK2細胞において、
DEN4よりも効果的に複製したことを示唆する。これ
らの思わぬ結果は、被感染LLC−MK2細胞における
vTBE(ME)/DEN4の増殖速度およびウイルス
収量の分析により確認された(図19参照)。キメラウ
イルスの力価は108pfu/mLに達し、これは、同
一条件下で親DEN4により達成されるものにくらべ
て、ほぼ1000倍高い。キメラvTBE(ME)/D
EN4ウイルスは、蚊C6/36細胞上でゆっくりと増
殖し、親DEN4により生成されるよりも100倍低い
力価に達した。キメラvTBE(CME)/DEN4の
プラークサイズは、LLC−MK2細胞上のDEN4の
ものと比べて、検知できるほどには異なっていなかっ
た。これらの研究において、ウイルスは、Bancro
ft他(Pan Am.Health Organ.S
ci.Publ.第375巻175〜178頁、197
9)に開示された技術を用いたプラーク検定により、測
定された。プラークサイズの相違は、TBEVのCタン
パク質とDEN4ウイルスRNAとの非互換性を反映す
るものであり、これは、ウイルスRNAパッケージング
およびウイルス成熟の際のタンパク質の効率的な相互作
用を妨げる。また、プラークサイズの相違は、DEN4
の5’非コード領域におけるAUGコドンの上流の6個
のヌクレオチドの置換の結果である可能性もある。この
配列変更は、ウイルスタンパク質翻訳の効率に影響し得
る。キメラ構築物からのウイルスRNA生成の分析(図
20)は、図21のタンパク質データとあわせて、被感
染C6/36細胞におけるvTBE(ME)/DEN4
の小型プラーク表現型と増殖速度低下の説明を与える。
LLC−MK2またはC6/36細胞の培養(約106
の細胞)は、ウイルス吸着の後のさまざまな時間に収集
され、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む緩衝液
中に溶解された。Maniatis他(Molecul
ar Cloning,A Laboratory M
anual,1982 Cold Spring Ha
rbor Laboratory,ニューヨーク)によ
り提供された技術を用いて、フェノール抽出により、全
RNAが細胞溶解物と培地から分離された。RNA試料
をホルムアルデヒド中で変性し、ニトロセルロースフィ
ルター(BA85,SchleicherおよびSch
uell)に塗布した。フィルターは、ニックトランス
レーションされた32P標識pTBE(ME)/DEN4
のDNAプローブを用いて、ハイブリダイズされた。p
TBE(ME)/DEN4からインビトロで作製された
RNA転写物を陽性対照(コントロール)として用い
た。DEN4に感染したLLC−MK2またはC6/3
6細胞からのウイルスタンパク質は、vTBE(ME)
/DEN4に感染したLLC−MK2またはC6/36
細胞からのウイルスタンパク質と比較された。DEN4
に感染したLLC−MK2またはC6/36細胞におい
て、E、NS1、NS3を含むDEN4ウイルスタンパ
ク質は感染後48時間で高レベルに蓄積した(図2
1)。しかしながら、ウイルスタンパク質合成の動態
は、vTBE(ME)/DEN4感染LLC−MK2
C6/36細胞では異なっていた。ウイルスタンパク質
は、LLC−MK2細胞においては感染後8時間と早く
検出された。一方、C6/36細胞においては感染後4
8時間まではウイルスタンパク質は検出されなかった。
C6/36細胞への接種の後、vTBE(ME)/DE
N4ビリオンの約70%が培地中に残っていた。一方、
LLC−MK2細胞培養の培地においては接種されたウ
イルスの小さなフラクションのみが見られた。この発見
は、キメラvTBE(ME)/DEN4のLLC−MK
2細胞への導入は、C6/36細胞への導入よりも、効
率的であることを示唆している。そしてその結果として
あり得ることは、このウイルスがDEN4ウイルスと比
較してこれらの細胞においてよりゆっくりと、かつ、よ
り低い力価に増殖するということである。LLC−MK
2細胞への導入の後、キメラウイルスRNAの複製は、
DEN4ウイルスRNAのそれとくらべて迅速であっ
た。一方、キメラウイルスのRNA合成は、被感染C6
/36細胞におけるDEN4のそれよりもゆっくりであ
った。このように、vTBE(ME)/DEN4は、蚊
細胞内への導入の効率が低く、これは、ウイルスRNA
およびタンパク質の生成低減に関連していた。これらの
観察結果は、TBEVウイルスRNAのC6/36細胞
内へのトランスフェクションの効率が低いことと符合し
ている(Mandl他、J.Virol.第65巻、4
070〜4077頁、1991年)。当業者には、1つ
のウイルスからの核酸配列を別のウイルスの核酸配列に
組合せるために用いることのできるさまざまな方法があ
ることが理解されよう。このようなライゲーション技法
とクローニング戦略は公知である。したがって、他の技
術を用い得ること、および、これらの技術の採用はクレ
ームされた発明から逸脱しないことは言うまでもない。
【0009】キメラワクチンの効力と神経毒性の判定 vTBE(ME)/DEN4は、さまざまな投与経路を
介して試験動物にウイルス試料を導入することにより、
ワクチンとしての防御効力について評価された。親デン
グ熱ウイルスと比較したvTBE(ME)/DEN4の
神経毒性は、マウスへの脳内接種(IC)により分析さ
れた。他の投与経路としては、皮内(ID)または腹腔
内(IP)注射が含まれる。1つの実験において、生後
3日のBALB/cマウス乳児に、ウイルス102pf
uをMEM0.02mL/0.25%ヒト血清アルブミ
ンに加えた服用量を、IC注射した。別の組の実験にお
いて、生後6週のBALB/c雌マウスにIC、ID、
IP接種を行なった。21日間にわたり、脳炎の症候や
死亡について、マウスを観察した。生存した成体マウス
は感染後20日後に採血し、TBEVに対する抗体反応
を評価した。ワクチンの防御効力を判定するため、感染
後21日目に、BL−4封じ込め設備において、生存し
たマウスに、103LD50 TBEV(Sofjin株)
をIP投与した。vTBE(ME)DEN4は、乳児ま
たは成体マウスの脳(IC)内に直接接種した場合、親
TBEVの神経毒性を維持していた(図22および実施
例21)。陽性対照として、TBEVの典型的な株(S
ofjin株)との比較を行なった。TBEVは神経毒
性が高く、0.1pfuで、IC接種した乳児マウスの
50%に新生児脳炎を起こした。同様に、TBEVは、
IP接種した成体マウスに対しても神経毒性が高かっ
た。この場合には、ID50は14.2pfuであった。
一方、vTBE(ME)DEN4は、IDまたはIPの
いずれかの周辺(末梢)経路により接種した場合には脳
炎を起こさず(図22参照)、これらが潜在的に安全な
ワクチン接種経路であることが示された。vTBE(M
E)/DEN4の免疫原性は、生存したマウスの血清抗
体を用いた35S標識抗原を使用して、ウイルスに対する
抗体の免疫沈降検査を行うことにより分析された。免疫
沈殿物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し
たところ、DEN4 NS1(キメラウイルスによりコ
ード化されるタンパク質)に特異な抗体は容易に検出さ
れること、しかし、TBEV Eに対する抗体は力価が
低いか、検出不可能であることが明らかになった。マウ
スはTBEVに対する天然の宿主ではないため、マウス
の周辺接種では、低レベルのウイルス複製しか行なわれ
ないということが推定される。vTBE(ME)/DE
N4のIPまたはID接種を生き延びたマウスは、つぎ
に、致死量の投与に対する抵抗の徴候について研究され
た。vTBE(ME)/DEN4またはDEN4ウイル
ス接種の21日後、神経毒性の高いTBEVのSofj
in株103LD50を投与した。キメラvTBE(M
E)/DEN4のIPまたはID接種で生き延びたマウ
スは、この投与に対して防御ができていた。一方、先に
DEN4で免疫化されたマウスの3つのグループのすべ
ては、11日〜20日の間に死亡した(図22参照)。
これらの結果は、ワクチンとしてのこのウイルスは、T
BEV感染に対して防御的であり特異的であることを示
した。非免疫化対照マウスは、TBEV感染の後、10
日〜16日の間に脳炎で死亡した。TBE(ME)/D
EN4ウイルスは、脳内接種の後、乳児および成体マウ
スの両方に、均等に脳炎を起こした。一方、DEN4を
接種したマウスでは、デング熱ウイルス関連の疾病の発
生頻度は低かった。このように、キメラウイルスは、p
reMおよびE遺伝子が由来した、もとのTBEVのマ
ウス神経毒性を維持している。このことは、すべてでな
いとしても、TBEVマウス神経毒性マップの遺伝的決
定基のほとんどが、これら2つの構造タンパク質遺伝子
内にあることを示している。しかしながら、親TBEV
とは異なり、vTBE(ME)DEN4は、成体マウス
に周辺接種した場合には病原性ではなく、周辺接種によ
り神経侵入性の損失が起きたことが示される。これらの
発見は、TBEVがCNSに侵入し脳炎を生じるために
は、preMおよびE遺伝子以外のTBEVゲノムの領
域が必要であることを示唆するものである。vTBE
(ME)/DEN4で周辺接種したマウスは、次回の致
死量TBEVの腹腔内投与に対して防御された。一方、
DEN4で同様に接種したマウスではそうではなかっ
た。これらの発見は、vTBE(ME)DEN4のpr
eM(Mの前駆体)、M、および/またはEタンパク質
が、マウスにおけるTBEV脳炎に対する防御免疫の主
要な抗原決定基を含んでいることを示すものである。
【0010】キメラvTBE(ME)/DEN4の神経
毒性の改変 上記の「神経毒性に影響するデングゲノムにおける突然
変異」と題する項において説明したように、組換えデン
グ熱ウイルス構築物を、部位特異的突然変異誘発または
PCRなどによる突然変異誘発により改変し、神経毒性
特性が低減したことによりワクチン接種に適した改変ウ
イルスを生成する。ここに開示するように、同様な技術
を用いて、vTBEV/DEN4ゲノムを改変して神経
毒性を低減させることができ、これにより、TBEVに
対する弱毒化ウイルスワクチンの安全性が改善される。
TBEVの防御抗原を維持し、かつ、TBEVの周辺侵
入性を欠く、活性TBEV/DEN4キメラを構築する
ことができれば、この重要な病原体の免疫予防のための
新規な戦略、すなわち、弱毒化TBEVワクチンの開発
の基盤が得られる。しかしながら、このゴールに到達す
るには、まず、キメラのさらなる改変を達成しなければ
ならない。すなわち、ウイルスの脳内への直接接種によ
り測定される、CNSに対する神経毒性の除去である。
TBEV/DEN4キメラは、親TBEVの神経毒性を
維持しているため、キメラゲノムのDEN4またはTB
EV部分において戦略的突然変異を加工し、マウス神経
毒性に対するそれらの効果を評価することにより、この
特性を無効にする必要があった。これらの突然変異体
は、ウイルスゲノム内の位置のいくつにでも導入される
突然変異を潜在的に含んでいる。初期の研究は、以下の
突然変異をもつキメラウイルスを評価した。すなわち、
(1)5’非コード領域における欠失、(2)preM
−M開裂部位またはpreMあるいはEあるいはNS1
タンパク質のグリコシル化部位を除去する突然変異、
(3)E遺伝子における点突然変異である。これまでに
試験された突然変異は図24に含まれている。TBE
(ME)DEN4構築物を系統的に改変し、神経毒性に
対する遺伝子的変更の効果について試験を行なうという
研究の一部として、タンパク質配列に1つ又はそれ以上
の変化を含む、6個の異なる構築物を作製した。実施例
22参照。当業者であれば、本発明において提供される
技術を用いて、TBE(ME)/DEN4構築物に対し
て任意の数の置換、挿入、欠失を作製し、神経毒性にお
ける変化を試験することができる。同様に、当業者であ
れば、遺伝子組成における好ましくは少なくとも1つの
変更を有するキメラ構築物を、天然の配列を組合せたキ
メラ構築物と比べて試験するために、図23に示す突然
変異をこれらのまたはその他の突然変異と組合せること
が容易に行なえる。突然変異体キメラウイルスの作製を
導く突然変異構築物の能力を評価する研究において、ト
ランスフェクションされたLLC−MK2細胞から6個
の突然変異体キメラを回収し、プラーク形態観察におけ
る変化についてウイルスを分析した。突然変異体TBE
(ME)/DEN4ウイルスの子孫をLLC−MK2
胞内の継代培養により増幅し、LLC−MK2細胞上ま
たは蚊C6/36細胞上でのプラーク検定により分析し
た。キメラウイルスTBE(CME)/DEN4は、T
BEVの3つの構造タンパク質遺伝子すべてを含んでい
たが、同様に分析された。また、野生型DEN4も、対
照として用いられた。図24に示すように、各細胞株上
のたいていの突然変異体のプラークサイズは、親TBE
(ME)/DEN4のウイルスプラークに比して縮減し
ており、これらの突然変異体はウイルス複製について制
限されていることが示唆される。EまたはNS1に欠陥
グルコシル化部位を含んでいた突然変異体は、試験され
た数組の突然変異体の中で最小サイズのプラークを生じ
た。突然変異体キメラ構築物は、マウスにおける神経毒
性についてさらに試験された。実施例21に記載される
ように、および、実施例23に記載されるように、マウ
スにウイルスを接種した。脳炎の徴候および死亡につい
て、被感染マウスを31日間観察した。*NS1(1)
−Glc-および*PreM/M-突然変異を含む構築物
のLD50は、100pfuより大きく、これらの突然変
異体がマウス神経毒性において100倍以上減少したこ
とが示された。この発見は、NS1(1)−Glc-
PreM/M-、あるいは両方の突然変異を、マウス神
経毒性の弱毒化を提供するために用いることができるこ
とを示す。この発見は、同様の突然変異を、日本脳炎ウ
イルスを含む他の脳炎フラビウイルスの弱毒化を提供す
るためにも採用できることを示唆するものである。さら
に、LD50の値の増加により証明されるとおりマウスに
おける神経毒性低下を示すこれらのキメラ構築物は、つ
ぎに、霊長類において試験されることはいうまでもな
い。実施例24は、霊長類におけるワクチン効力に対す
る試験法を提供する。霊長類研究における成功に続き、
本発明のワクチンは、ヒトに対する臨床試験において試
験される。当業者であれば、霊長類での研究をヒトにお
ける研究に適したものに改変することができる。したが
って、本出願の発明は、多数のワクチンを提供するとと
もに、デング熱ウイルスやその他のフラビウイルスの血
清型に対する防御免疫反応を発生させるためにキメラデ
ング熱ウイルスワクチンを作製することを当業者に教示
する。このようなワクチン試料は、好ましくは、キメラ
ウイルスの集団を含み、各ウイルスは少なくとも1つの
デング熱ウイルスに対して構造タンパク質を発現する。
ウイルス学および分子生物学の当業者であれば、ここに
開示された技術を用いて、1つのフラビウイルスの構造
領域と第2のウイルスの非構造領域とを組合せたキメラ
ウイルスを作製することができる。好ましくは、この第
2のウイルスはデング熱ウイルスである、さらに好まし
くは、この第2のウイルスは4型デング熱ウイルスであ
る。さらに、本発明は、部位特異的突然変異誘発などを
用いてデング熱ウイルス構築物を改変することにより改
良されたデング熱ウイルスワクチンを作製することを当
業者に教示する。これらの改変は、キメラウイルス構築
物に同様に組み込まれることは言うまでもない。本発明
は、さらに、デング熱ウイルスの非構造領域および少な
くとも1つの構造領域を、別のフラビウイルスからの構
造遺伝子領域と組合せて含むキメラウイルスの作製なら
びに試験を教示する。特に、4型デング熱ウイルスから
の1つの構造領域ならびに非構造領域と、TBEVから
の2つの構造タンパク質をコードする配列とを含むキメ
ラウイルスを含む、TBEVのためのワクチンが開示さ
れている。TBEV(ME)/DEN4についてこれま
でに観察された、励みになる成果は、これらの技術が、
TBEVよりもデング熱ウイルスにより密接に関連した
ウイルスに対するワクチンを作製する際にも有用である
ことを示唆している。このような例の1つは、極東にお
いて依然として大きな公衆衛生問題である日本脳炎ウイ
ルスである。すなわち、さらなる実施例において、本発
明の技術は、DEN4cDNA非構造領域を、日本脳炎
ウイルスからの少なくとも1つの構造遺伝子とDEN4
の残りの構造遺伝子領域に組合せるために用いられる。
さらに、本発明の技術を用いて、異なるフラビウイルス
間の非構造領域および構造領域の他の組合せを同様にし
て作製し試験することができることは言うまでもない。
たとえば、日本脳炎ウイルスの組換え構築物を、ウイル
ス非構造領域はそのままにして、1つ又はそれ以上の構
造領域をダニ媒介脳炎ウイルスからの対応する遺伝子配
列で置換するように改変することができる。同様に、ダ
ニ媒介脳炎ウイルスをコード化する組換えcDNAを生
成し、構造領域を、デング熱ウイルス構造タンパク質を
コード化する少なくとも1つの遺伝子で置換することが
できる。ここにおよび下記の実施例において引用される
すべての刊行物は参照として取り入れられる。以下、本
発明の特別な実施例を詳細に検討し、本発明の範囲内で
の可能な変型について言及する。本発明を成功裡に実施
することのできる、さまざまな代替技術や手順が当業者
には知られている。
【0011】
【発明の実施の形態】ウイルス : 4型デング熱ウイル
ス株814669を用いて、完全長感染性RNA転写物
の転写源として用いられる完全長cDNAを構築した
(E.Mackow他(1987)Virology第
159巻217〜228頁、B.Zhao他(198
6)Virology第155巻77〜88頁)。アカ
ゲザル胎児肺細胞継代培養レベル9の1型デング熱ウイ
ルス西太平洋株(D1WP)の標本は、K.Eckel
s博士の好意により提供された(WRAIR、ワシント
ンDC)(K.T.McKee他(1987)Am.
J.Trop.Med.Hyg.第36巻435〜44
2頁)。マウス脳継代培養レベル38の、マウス神経毒
性2型デング熱ウイルスニューギニアC株(D2NG
C)のマウス脳標本は、D.Dubois博士の好意に
より提供された(WRAIR、ワシントンDC)(A.
B.Sabin(1952)Amer.J.Trop.
Med.Hyg.第1巻30〜50頁)。1型および2
型デング熱ウイルスは、C6/36蚊細胞内で1回、継
代培養することにより増幅された。つぎに、これらの3
つのウイルスは、LLC−MK2サル腎臓細胞内で1
回、継代培養された。得られたウイルス懸濁液はプラー
ク形態観察およびマウス神経毒性の研究に用いられた。クローニングベクター : 4型デングゲノムの5’側半
分を含むプラスミドp5’−2を、3つの構造タンパク
質遺伝子の置換を容易にするために改変した(C.J.
Lai他(1991)Proc.Natl.Acad.
Sci.USA第88巻5139〜5143頁)。ま
ず、唯一のXhoI部位が、部位特異的突然変異誘発に
より、Eの3’末端の近くの、4型デング配列のヌクレ
オチド2342(A−G)に導入され、p5’−2(X
hoI)を作製した。このヌクレオチド変更はアミノ酸
配列を変更するものではなかった。このベクターはつぎ
に、デング配列内の唯一のBstBI部位において、お
よび、p5’−2内のデング配列の直後の唯一のAsp
718部位において、消化された。断片はデング4ゲノ
ムの3’側半分に連結され、完全長p2A(XhoI)
を作製した。第2に、フラビウイルスに保存されてい
る、ヌクレオチド88のBglII部位は、p5’−2内
の他の3つのBglII部位を除くことにより、唯一の部
位とされた。pBR322およびSP6プロモーター間
の接合部におけるBalII部位は、NotIリンカーを
挿入することにより除去された。4128および427
7の他の2つの部位は、最近導入された3473のPs
tI部位までベクターを短くすることにより、除去され
た(K.T.McKee他(1987)Am.J.Tr
op.Med.Hyg.第36巻435〜442頁)。
つぎに、プラスミドp5’−2(XhoI,PstI)
をフラグメント交換に用い、キメラcDNAを作製し
た。図1は、構築された完全長デングcDNAを含む、
以下のプラスミドを示す。p2A(XhoI)は、4型
デングゲノムの完全なcDNAコピーであり、唯一のX
hoI部位がE遺伝子の3’末端の近くに創製された。
p2A(D1WP)は、p2A(XhoI)から、5’
非コード領域内のBglII部位と唯一のXhoI部位と
の間の配列を、1型デング西太平洋株の対応するcDN
Aで置換することにより、得られた。p2A(D2NG
C)は、同様にして、BglII−XhoI断片を、2型
デングニューギニアC株からの対応するcDNAで置換
することにより、作製された。B:BglII、X:Xh
oI、A:Asp718制限酵素部位。キメラcDNA : C6/36蚊細胞内で増殖した1型
または2型デング熱ウイルスを精製し、B.Zhao他
(1986)(Virology第155巻77〜88
頁)により説明された手順にしたがってビリオンRNA
を抽出した。1型デング配列のヌクレオチド2306〜
2338にハイブリダイズするネガティブセンスオリゴ
ヌクレオチドを用いて、逆転写により、1型デング第1
鎖cDNAを合成した。このプライマー配列は、上記の
p5’−2(XhoI,PstI)内の4型デングE遺
伝子内の部位に対応する位置にXhoI部位を創製する
ために、ヌクレオチド2316におけるサイレントな第
3塩基変更(A−G)を含んでいた。つぎに、1型デン
グcDNAを鋳型として、ネガティブセンスオリゴヌク
レオチドおよび1型デングヌクレオチド51〜70にハ
イブリダイズする保存されたBglII部位を含むポジテ
ィブセンスプライマーを用いて、PCRにより2本鎖D
NAを合成した。PCR産物をBglIIおよびXhoI
で消化し、つぎに、p5’−2(XhoI,PstI)
にクローン化し、対応する4型デング配列を置換した。
つぎに、1型デング配列を含むClaI−XhoI断片
をp2A(XhoI)からの残りの4型デングcDNA
に連結し、完全長キメラp2A(D1WP)を創製し
た。同様に、2型デングヌクレオチド2310〜236
4にハイブリダイズするネガティブセンスプライマーを
用いて、2型デング第1鎖cDNAを合成した。このプ
ライマーは、2333におけるT−C、2336におけ
るA−G、2337におけるC−Aの、3つの塩基変更
を含む。これらの変更は、上述した4型デング遺伝子に
おけるXhoI部位に対応する位置にXhoI部位を創
製する。これらの変更はアミノ酸配列を変えるものでは
なかった。PCRによる2本鎖DNA合成のために、ネ
ガティブセンスプライマーが用いられ、1型デングに対
してはポジティブセンスプライマーが同じく用いられ
た。PCR産物をBglIIおよびXhoIで消化し、p
5’−2(XhoI)にクローン化し、ClaI−Xh
oI断片を用いてp2A(XhoI)の対応する断片を
置換してp2A(D2NGC)を作製した。RNA転写、トランスフェクション、およびウイルスの
回収 : 完全長RNA転写物を用いた細胞のトランスフ
ェクションは、C.J.Lai他(1991)Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA第88巻51
39〜5143頁に記載されているようにして実施され
た。トランスフェクションの10日後、細胞はトリプシ
ン処理され、6穴プレートおよびチェンバースライドに
移された。2日後、免疫蛍光検査(IFA)により、デ
ング熱ウイルス抗原の存在について、スライド上の細胞
を試験した。ほとんどの細胞が感染したことがIFAに
より示された場合には、6穴プレート内の細胞をトリプ
シン処理し、6倍量の非感染細胞と混合し、通常6〜7
日後に細胞病理効果(培地内の多数の死亡細胞の出現)
があらわれるまで、インキュベートした。つぎに、培地
を取り出し、細胞をかきとり、標準容積の50%Eag
le最小必須培地/50%血清に再懸濁し、凍結するこ
とにより、感染細胞を収穫した。他方、陽性細胞の割合
が小さい場合には、細胞をトリプシン処理し、新鮮培地
に1:3で希釈し、非感染細胞を添加せずに増殖させ
る。感染細胞の割合を週ベースで評価し、間隔をおいて
細胞溶解物を収穫しウイルスの力価を測定した。デング熱ウイルス抗原の検出 : 感染細胞は、血清型特
異的モノクローナル抗体(mab)1F1(1型デン
グ)、3M5(2型デング)、5D4(3型デング)、
1H10(4型デング)およびNS1特異的mab1G
6(4型デング)を用いて、IFAにより分析された。
これらは、もともとM.K.Gentry博士および
E.Henchal博士により作製されたものである
(WRAIR、ワシントンDC)(E.A.Hench
al他(1982)Am.J.Trop.Med.Hy
g.第31巻548〜555頁)。モノクローナル抗体
は、1:50〜1:300の希釈で用いた。一方、フル
オレセイン接合抗マウス抗血清(Kierkegaar
d−Perry Laboratories、メリーラ
ンド州Gaithersburg)は1:100で用い
た。結果は写真で記録した。各mabについて、陰性結
果を生じた感染細胞を、陽性細胞と同じ露光時間で写真
撮影した。親(野生型)デング熱ウイルスと子孫ウイル
スv2A(XhoI)のタンパク質を分析するため、6
穴プレート内のコンフルエントLLC−MK 2細胞をM
OI 0.2でウイルスに感染させた。感染の6日後、
6時間にわたり50μCi/ウェルのS−メチオニンを
含まない培地で細胞を標識した。つぎに、RIPA緩衝
液に細胞を溶解した。キメラウイルスv2A(D1W
P)については、細胞のほぼ100%が感染したとき
に、標識化を実施した。一方、v2A(D2NGC)に
ついては、約30%が感染したときに標識化を実施し
た。適当な同型または異型高度免疫マウス腹水(HMA
F)を用いて溶解物を沈殿させ、SDS−12%ポリア
クリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。プラーク形態 : ウイルスは、LLC−MK2細胞上で
のプラーク形態について調べられた(W.H.Banc
roft他(1979)Pan.Am.Hlth.Or
g.Sci.Publ.第375巻175〜178
頁)。プラーク形態の分析の前に、各親ウイルスをLL
C−MK2細胞内で1回、継代培養した。インキュベー
ションの6〜9日後に、ニュートラルレッドを培養物に
重層した。乳児マウスにおけるキメラウイルスの評価 : 生後3日
のスイスマウスに、2000pfuの親またはキメラデ
ング熱ウイルスを、ウイルスに感染したLLC−MK2
細胞を希釈した溶解物の形で、脳内接種した。陰性対照
マウスには非感染細胞の溶解物を注射した。親4型デン
グ熱ウイルス(814669)、1型デング熱ウイルス
WP、または2型デング熱ウイルスNGCについて、1
リットルが接種された。v2A(XhoI)、v2A
(D1 WP)、またはv2A(D2 NGC)につい
て、2リットルが接種された。21日間にわたり、脳炎
の徴候および死亡について接種されたマウスを監視し
た。
【0012】
【実施例】
【実施例1】キメラcDNAおよびウイルス 完全長4型デング熱ウイルスcDNA(p2A)を用
い、構造遺伝子配列を1型または2型デング熱ウイルス
の対応する配列により置換したキメラウイルスを構築し
た。この目的のために選択された1型ウイルス(WP)
は、マウスの脳内での増殖に適さなかった低レベルの継
代組織培養株であった。2型株(NGC)は、マウスに
おける脳内連続継代培養の間に選抜された神経毒性の高
い突然変異体であった。2型突然変異体がこの研究のた
めに選択されたのは、マウス神経毒性の遺伝的決定基の
マッピングの可能性を提供するからである。プラスミド
構築体p2A(XhoI)、p2A(D1WP)、また
はp2A(D2NGC)を用いた大腸菌HD1528株
の形質転換により、安定なプラスミド集団が創製され
た。これらのプラスミドの推定された構造は図1に示さ
れている。これらの構造は制限酵素マッピングにより証
明された。第12日目のデング熱ウイルス抗原に対する
免疫蛍光染色により、p2A(XhoI)からのRNA
転写物でトランスフェクションされたLLC−MK2
胞のほぼ半数が陽性であった(図2A)。図2は、
(A)p2A(XhoI)、p2A(D1W)、または
p2A(D2NGC)からのRNA転写物を同一濃度で
用いてトランスフェクションしたLLC−MK2細胞を
示す。トランスフェクション後のウイルス感染細胞のパ
ーセンテージは、新鮮培地中に移した後でIFAにより
測定された。(B)細胞の大多数がIFAで陽性となっ
たときに感染細胞を収穫した。ウイルスの力価測定はプ
ラーク検定により実施された(W.H.Bancrof
t他(1979)PanAm.Hlth.Org.Sc
i.Publ.第375巻175〜178頁)。以前の
研究において、p2Aおよびp2A(PstI)からの
転写物を用いたトランスフェクションの12日後に、2
0〜50%の範囲の同様な割合の抗原陽性細胞が観察さ
れた。いずれの場合にも野生型表現型をもつウイルスが
産生された(C.J.Lai他(1991)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA第88巻5139
〜5143頁)。一方、p2A(D1WP)またはp2
A(D2NGC)からの転写物を用いてトランスフェク
ションされた細胞は、12日目に、その1%未満が陽性
であった。v2A(D1WP)に感染した細胞の割合
は、19日目にほぼ5%、26日目に30%、33日目
に80%に増加した。このとき、トランスフェクション
された細胞内に存在するウイルスの力価は5×106
fu/mLであった(図2Aおよび2B)。また、v2
A(D2NGC)はよりゆっくりと増殖した。我々は、
19日目に細胞の1%が陽性であると算定したが、54
日目までに感染したのは細胞の3分の1に満たなかっ
た。ウイルス力価は30日目には1.5×102pfu
/mL、44日目には2.5×102に過ぎなかった。
104pfu/mLに到達したのは58日目であった。
トランスフェクションの72日後に、細胞の大多数が感
染し、細胞懸濁液の力価が10 2pfu/mLであるこ
とが認められた。p2A(XhoI)RNA転写物(1
6pfu/mL)でトランスフェクションした細胞に
より生成されるウイルスの力価は、細胞培養に4型ウイ
ルスをMOI 0.1で感染させたときに観察されたも
のと同じであった。さらに、1型/4型キメラ(5×1
6pfu/mL)でトランスフェクションされた培養
により生成されるウイルスの最高力価は、1型ウイルス
(1.5×107pfu/mL)をMOI0.1で用い
て細胞培養を感染させた後に観察されたものと同じであ
った。トランスフェクション(102pfu/mL)の
後に生成される2型/4型キメラの最高力価は、MOI
0.5で親2型ウイルスに感染させた細胞培養により生
成されたものと同じであった。
【0013】
【実施例2】キメラ構造タンパク質の性質 図3に示すように、子孫ウイルスを調べるために、間接
的免疫蛍光検査を実施した。図3は、v2A(Xho
I)、v2A(D1WP)、または、v2A(D2NG
C)に感染させたLLC−MK2細胞、もしくは非感染
細胞上で実施された免疫蛍光検定を示す。モノクローナ
ル抗体は、1:50〜1:300の希釈で用いた。一
方、フルオレセイン接合抗マウス抗体は1:100で用
いた。モノクローナル抗体の血清型特異性は左側に示さ
れている。v2A(XhoI)に感染させた細胞は、I
FAにより、4型デング特異的mabIH10で染まっ
たが、1型デング特異的mab 1F1または2型デン
グ特異的mab 3M5には結合しなかった。予測され
たように、v2A(D1WP)に感染した細胞は1F1
とのみ反応した。v2A(D2NGC)に感染したもの
は、3H5のみに染まった。3型デングに特異的なma
b 5D4は、どの感染細胞とも反応しなかった。これ
らの結果は、キメラウイルスの両方とも、その構造タン
パク質遺伝子により特定される免疫原性をあらわすこと
を示した。期待されるように、4型デング非構造タンパ
ク質NS1に特異的なmab 1G5は、4型デングc
DNAすなわち2A(XhoI)の子孫に感染した細胞
を染めた。なお、4型ウイルスに由来するキメラウイル
ス2A(D1WP)または2A(D2NGC)の各々に
ついても同様であった。親4型デング熱ウイルスの、お
よび、そのcDNA由来の子孫v2A(XhoI)のタ
ンパク質は、同型HMAFを用いた免疫沈殿検査とその
後のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する
と、同一のようであった(図4)。図4は、ウイルス感
染LLC−MK2細胞または非感染対照細胞の35S−メ
チオニン標識された溶解物を示し、1型、2型、4型デ
ングに対して作製された高度免疫マウス腹水(HMA
F)で免疫沈降され、SDS−12%ポリアクリルアミ
ドゲル(アクリルアミド:ビス=60:1.6)上の電
気泳動により分析された。各レーンの先頭に、ウイルス
が縦に示され、溶解物を免疫沈降させたHMAFが横に
示されている。マーカー:タンパク質分子サイズマーカ
ーはキロダルトンである。1型、2型、4型デングのE
およびpre−Mグリコタンパク質の位置が示されてい
る(図4)。さらに、親1型デング熱ウイルス(WP)
および2型デング熱ウイルス(NGC)のタンパク質を
分析した。1型デングおよび2型デングのEグリコタン
パク質は共に移動したが、それらは4型デングよりもゆ
っくりと移動した。同様に、1型および2型デングのp
re−Mグリコタンパク質は共に移動したが、やはり4
型デングのpre−Mよりもゆっくりと移動した。Eタ
ンパク質の相対的な分子サイズの相違はほぼ4kdであ
った。一方、pre−Mタンパク質については約1kd
であった。これらEおよびpre−Mの分子サイズの相
違は、おそらく、グリコシル化の程度における変化また
は配座的相違によるものであろう。v2A(D1WP)
およびv2A(D2NGC)ウイルスの免疫沈降された
タンパク質はハイブリッドパターンを示した。1型デン
グHMAFを用いて免疫沈降したv2A(D1WP)の
pre−MおよびEは、親1型デングのpre−Mおよ
びEと共に移動した。しかし4型デングHMAFは、4
型デング非構造タンパク質と共に移動したバンドだけを
沈降した。親2型デングのpre−MおよびEも同様で
あったが、4型デングHMAFは4型ウイルスのものに
似ている非構造タンパク質を沈降させた。親4型デング
熱ウイルスおよびそのcDNA由来の子孫v2A(Xh
oI)は、LLC−MK2細胞(図示せず)上に同様の
プラークを生成した。親ウイルスのプラークは、感染の
6日後にニュートラルレッドで染色すると明確に目視で
きた。しかし、キメラv2A(D2NGC)は、その時
点では、検出可能なプラークを生成しなかった。しかし
ながら、染色を第9日まで遅らせると、非常に小さいv
2A(D2NGC)プラークが検出され、これはv2A
(XhoI)または野生型2型デングNGCのものより
も非常に小さかった(図5)。4型デング814669
のプラークは、子孫ウイルスv2A(XhoI)のそれ
とは異ならなかった。v2A(D1WP)のプラークは
基本的にv2A(XhoI)のものと同様であった。図
5は、被感染LLC−MK2細胞の単層を示し、子孫ウ
イルスv2A(XhoI)のものとは異なっている。v
2A(D1WP)のプラークは基本的にはv22A(X
hoI)のものと同様であった。図5は、デングウイル
スに感染し、ついでアガロースオーバーレイが加えられ
たLLC−MK2の単層(モノレイヤー)を示す(W.
H.Bancroft他(1979)Pan Am.H
lth.Org.Sci.Publ.第375巻175
〜178頁)。細胞単層の感染の9日後、ニュートラル
レッドを重層し、翌日プラークの写真を撮影した。A:
2A(XhoI)、B:2A(D1NGC)、C:野生
型NGC3型デング。
【0014】
【実施例3】乳児マウスに対するウイルスの神経毒性 キメラv2A(D2NGC)を、その親ウイルスである
マウス脳適合2型デングNGCおよびv2A(Xho
I)と、マウス神経毒性について比較した。2型デング
NGCはもっとも迅速な致死性をもつことが証明され
た。接種後第5日または第6日に10匹のマウスの各々
が脳炎で死亡し、平均生存時間は5.1日であった。一
方、キメラv2A(D2NGC)を接種した15匹のマ
ウスの各々は死亡するまで8〜11日間生存し、平均生
存期間9.1日であった(図6)。図6は、親またはキ
メラデングウイルス2000pfuを、被感染LLC−
MK2細胞を希釈した溶解物の形で脳内接種した生後3
日のスイスマウスについて示す。注射されたマウスの数
は:2型デング(NGC)10匹、v2A(D2NG
C)15匹、4型デング814669 12匹、v2A
(XhoI)18匹。陰性対照(マウス11匹)には非
感染細胞の希釈溶解物を注射した。マウスは、脳炎の徴
候および死亡について毎日観察された。生存分布におけ
る差異は大きい(p=00001、スミルノフ2点統
計)。さらに、親ウイルス4型デング814669は、
その子孫v2A(XhoI)と比較された。親ウイルス
を接種した12匹のマウスのうち5匹が脳炎で死亡し、
最初の死亡は第11日に起きた。一方、v2A(Xho
I)を接種した18匹のマウスのうちただ1匹だけが接
種の16日後に死亡し残りは健康を保った。生存分布
は、スミルノフ統計によれば大きく異なってはいない
(p>.14)が、2つのグループの生存率はフィッシ
ャー精密試験では異なっている(p=.0256)。こ
のことは、4型デング814669、または、ウイルス
調製におけるビリオンのサブセットが、ある程度の神経
毒性を所有していること、および、子孫ウイルスv2A
(XhoI)が非神経毒性の下位集団[sub−pop
ulation]をつくるかクローニングまたはウイル
ス繁殖の際に生じるヌクレオチド変化を含むことを示唆
している。親1型デング熱ウイルス(WP)を接種した
マウスと、またはそのキメラ子孫v2A(D1WP)を
注射した12匹のマウスと、非感染細胞の溶解物を受け
入れた11匹のいずれも、脳炎を起こさなかったし死亡
しなかった。
【0015】突然変異分析 我々は、4型デング熱ウイルスゲノムの完全長にわたる
一連のデングcDNAインサートをクローン化した。こ
れらは、実施例4にあるように、完全長デングDNAを
クローン化するという最初の試行において用いられた。
【0016】
【実施例4】SP6プロモーターを含むプラスミドpB
R322における完全長デングDNAをクローン化する
最初の試行 さまざまな4型デングcDNAインサートを、共有され
た制限酵素部位において連結し、pBR322の同じP
stIクローニング部位を用いて、完全長デングDNA
コピーを形成した。インビトロ転写のために、SP6ポ
リメラーゼプロモーター配列を、デング配列の前の5’
末端に配置した。RNA転写物の予測された5’配列は
図7に示されている。第1のデングヌクレオチドのA残
基は、Gで始まる正常SP6ポリメラーゼ転写物の直後
に位置している。ゲノムRNAの5’末端に存在するm
7Gキャップ構造は、転写反応にm7GpppG類似物
を添加することにより得られる。このようなDNA構造
は、5’末端に付加ヌクレオチドを含むデングRNAを
生成することになるだろう。ランオフ[run−of
f]転写物を作製するために、唯一のAsp718開裂
配列が、デング配列の3’末端に導入された。図7に示
すように、鋳型鎖中には、Asp718開裂部位の前に
5個の付加ヌクレオチドが存在する。転写が最後のヌク
レオチドに進むと、RNA転写物には、3’末端におけ
るこれらの5個の付加残基が含まれることになる。形質
転換のための宿主として大腸菌株HB101を用いたこ
の研究中に気づいたことは、完全長デングDNAを含む
プラスミドは、再配列を経た多くの形質転換体における
プラスミドとしてしばしば不安定であり、予測された制
限酵素パターンをもつクローンDNAを単離するために
は多数のコロニーをスクリーニングしなければならない
ということである。我々は、異なる大腸菌株により作製
されるプラスミドの安定性を調べた。研究室ですでに用
いられていた、形質転換に高度に適した市販の大腸菌株
DH5αおよび大腸菌株DB1528を、大腸菌株HB
101と比較した。DB1528株は、HB101より
もコロニーサイズが3〜4倍大きい形質転換体を産生し
た。特に、DB1528の形質転換体は、一般に、予測
された制限酵素パターンをもつプラスミドを産生し、こ
のことは、大腸菌株DB1528が、安定的にクローン
化されたデング完全長DNAを生成するための優秀な株
であることを示唆している。しかしながら、トランスフ
ェクション細胞上で試験した場合、この第1の完全長デ
ングDNAクローンから作製されたインビトロRNA転
写物は、デング熱ウイルスを産生しなかった。ここで、
免疫蛍光検定により検出されるように、100倍低い濃
度の、陽性対照としてのビリオンRNAはデング熱ウイ
ルスを産生した。
【0017】
【実施例5】独立に由来するDNAクローンを用いた、
完全長構築物におけるデングDNAセグメントの置換 感染性RNA転写物を産生できないのは、完全長クロー
ンにおける欠陥突然変異の存在によるものであると説明
された。このような突然変異は、ウイルス株における欠
陥集団のクローニングまたはプラスミドのクローニング
または繁殖の際の結合エラーから生じると推定される。
我々は、1つ又はそれ以上の欠陥突然変異を含むデング
DNAセグメントを、独立にクローン化したデングDN
A構築物からの対応するセグメントで置換することに決
定した。系統的な置換実験のためのフレームワークとし
て、デング配列の5’および3’断片を別々にクローン
化した。ヌクレオチド5069における唯一のBstB
1部位を用いて、完全長デング配列を、各々ゲノムの約
50%を示す2つの断片に分離した。SP6プロモータ
ーを含む第1の完全長クローンの5’断片は、5’−1
と呼ばれ、BstB1とAsp718の間の残りの3’
配列は3’−Aと呼ばれた。第2の5’断片5’−2を
含むプラスミドは、独立に由来するひと組のデングcD
NAインサートから構築された。唯一のAsp718部
位は、デング配列のBstB1部位の下流のpBR32
2のPstI部位に導入された。このように、このプラ
スミドは、完全長DNA構築物に3’断片を挿入するた
めのクローニングベクターとしても適している。2つの
付加3’断片3’−Bおよび3’−Cも、デングcDN
Aインサートの独立したひと組から構築された(図
8)。第1の完全長クローン1A内の3’断片を3’−
Bおよび3’−C断片で置換すると、2つの別の完全長
クローン1Bおよび1Cが作製された。同様に、3つの
完全長DNA構築物すべてにおいて5’断片を5’−2
断片で置換すると、3つの別の完全長クローン、すなわ
ち、2A、2B、2Cが生成された。これらのプラスミ
ドをBglII、NsiI、Asp718で消化すると、
図9に示されるように、6個の完全長クローンすべてに
ついて区別不可能な、予測されたDNA断片のパターン
を示した。このように、大腸菌株DB1528中の完全
長デングDNA配列を明らかに含むプラスミドの増殖に
成功することによって、培養細胞における感染性の評価
のためのインビトロRNA転写物の生成が可能となっ
た。
【0018】
【実施例6】インビトロで作製されたRNA転写物の感
染性についての最初の証拠 構築された完全長デングDNA鋳型から生成されたRN
A転写物は、LLC−MK2のトランスフェクションに
より、感染性についてそれぞれ試験された。デング感染
細胞は、間接的免疫蛍光検定により検出されるとおり、
2A RNAでのトランスフェクションの10日後に容
易に観察された。他の4つの完全長DNAクローンから
のRNA転写物は、この検定では陰性であり、これらの
DNAクローンは、クローン1Aのように、制限酵素分
析では検出できない致死突然変異を含んでいることが示
された。上述したデング熱ウイルス感染細胞の陽性判定
に加えて、感染性デング熱ウイルスを、培地または2A
RNAトランスフェクション細胞の細胞溶解物から回
収した。トランスフェクション細胞溶解物中に存在する
デング熱ウイルスの力価は105pfu/mLであっ
た。2A RNA転写物をDNaseIを用いて処理し
た場合、その感染性には影響がなかったが、RNase
処理ではその感染性は完全に損なわれた。RNAを用い
た細胞モノレイヤーのトランスフェクションの後、デン
グ熱ウイルスのプラーク形成は行なわれなかったため、
ウイルスの生成は、ウイルス増幅のための延長されたイ
ンキュベーションの後で判定された。この間接的免疫蛍
光検定手順を用いて、感染性は、ゲノムRNA1ngま
たは2ARNA転写物10ngの最小濃度において検出
された。この試験のこれらの結果は、クローン2Aから
作製されたRNA転写物が、受容培養細胞のトランスフ
ェクションの後で、感染性を持つことを示している。
【0019】
【実施例7】RNA転写物の感染性についてのその他の
証拠 クローン2A RNA転写物でトランスフェクションし
た細胞により、感染性デング熱ウイルスが生成されたこ
とを正式に証明するため、デングゲノムのヌクレオチド
3473に新たなPstI部位を創製するがアミノ酸配
列には影響しない2つの突然変異(G3473−→Tお
よびC3476−→T)を、完全長デングクローン2A
DNAに導入した。この突然変異DNAから作製され
たRNA転写物を、DNaseIを用いた消耗性消化に
よりDNA鋳型を完全に除去したのち、細胞のトランス
フェクションに用いた。トランスフェクションされた細
胞は感染性デング熱ウイルスを生成した。子孫ウイルス
から抽出されたゲノムRNAを逆転写し、cDNA産物
をPCRのための鋳型として用いて、ヌクレオチド31
93〜4536の間にDNA断片を生成した。図10に
示すように、PCRDNA産物のPstI消化は、Ps
tI開裂配列の存在により予測されるように、それぞれ
280個および1063個の塩基対の長さの2つの断片
を産生した。2A RNA由来のウイルスの対照PCR
DNA産物は、PstI消化に対しては非感受性であっ
た。この観察は、突然変異体2A DNAのRNA転写
物に由来する子孫ウイルスがPstI部位を含むことの
証拠を提供した。
【0020】
【実施例8】インビトロで転写された感染性RNAから
回収されたデング熱ウイルス クローン2Aまたはクローン2A(Pst)鋳型から作
製されたRNA転写物を用いてトランスフェクションし
た細胞の溶解物から子孫デング熱ウイルスを分離し、L
LC−MK2細胞単層上でのプラーク形成能力につい
て、親・野生型ウイルスと比較した。感染の6日後、子
孫ウイルスおよび親ウイルスは、ともに、さまざまな大
きさの特徴的なデングプラークを生成した。蚊細胞内の
継代培養により増殖した親ウイルスでは圧倒的に小型プ
ラークがみられたが、子孫ウイルスでは混合的でありし
かし主に大きいプラークが生成され、回収されたウイル
スがクローン化集団を提供することを示唆している。子
孫ウイルス感染細胞および親ウイルス感染細胞において
生成されたデング特異タンパク質についても比較を行な
った。図11に示すように、デング高度免疫腹水により
沈殿させたPreM、E、NS1、NS2、およびその
他未決定のデングタンパク質バンドのプロフィールは、
子孫ウイルスおよび親ウイルス双方について識別不可能
であるように見えた。この結果は、回収されたデング熱
ウイルスが、cDNAクローンが由来するもとのウイル
スと同じ遺伝子型および表現型を呈することを示すもの
である。 NS1−NS2A開裂接合部におけるアミノ酸置換によ
る活性デング熱ウイルスの加工
【0021】
【実施例9】開裂部位配列におけるアミノ酸置換を特定
するNS1−NS2A DNAの構築 真正[authentic]NS1の発現のために構築
された中間組換えpSC11−NS1−NS2A DN
Aをこの研究に用いた。デング熱ウイルスDNAは、2
4アミノ酸N末端信号のためのコード配列と、NS1お
よびNS2Aの完全ポリペプチド配列を含んでいた。ま
ず、このプラスミドDNAを、突然変異を含むDNAセ
グメントの置換を容易にするために改変した。2つのサ
イレントな突然変異が、オリゴヌクレオチド特異的突然
変異誘発により、NS1−NS2ADNA(G3473→T
およびC3476→A)に導入された。これらの変更は、ヌ
クレオチド(nt)3476に新たなPstI部位を作
製した。組換えプラスミドは、デングNS1コード配列
中のnt3320に唯一のNcoI部位を含んでいた。
NS1−NS2A開裂接合部はnt3477に位置して
いる。開裂部位配列にアミノ酸置換を導入するために、
オリゴヌクレオチド誘発突然変異により、ヌクレオチド
変更を行った。一連のオリゴヌクレオチドを合成し、ポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR)における負鎖プライマー
として用いた。正鎖プライマーは、5’AAGGCTA
TGCCACGCAAA3’(配列番号1)であり、N
coI部位の上流に位置していた。たとえば、開裂位置
−2(Thr1124)において、オリゴGCC CTG
GCC GGC CTT CAC CTGTGA TT
T GAC CAT(配列番号2)が、ThrをLys
で置換するために用いられた。同様にして、オリゴGC
C CTG GCC GGCCTG CAC CTG
TGA TTT GAC CAT(配列番号3)が、T
hrをGlnで置換するために用いられ、オリゴGCC
CTG GCCGGC CAG CAC CTG T
GA TTT GAC CAT(配列番号4)が、Th
rをLeuで置換するために用いられた。同様に、オリ
ゴTTCTGA TGT GCC CTG TTC G
GC CGT CAC CTGTGA(配列番号5)
が、開裂位置+1においてGly1120をGluで置換す
るために用いられ、あるいは、オリゴTTC TGA
TGT GCC CTGCCAGGC CGT CAC
CTG TGA(配列番号6)が、開裂位置+1にお
いて同じGlyをTrpで置換するために用いられた。
特定された突然変異を含む中間組換えDNAの構築のた
め、あらたに作製されたPstI部位と唯一のNcoI
部位の間のDNA断片を、NcoIおよびPstIで開
裂されたPCR DNA産物のシリーズで置換した。こ
れらの突然変異体NS1−NS2A配列を発現する組換
えワクシニアウイルスは、すでに説明された手順(B.
Zhao、G.Prince、R.Horswood、
K.Eckels、P.Summers、R.Chan
ock、およびC.J.Lai(1987)、組換え体
ワクシニアウイルスによるデング熱ウイルス構造タンパ
ク質および非構造タンパク質NS1の発現、J.Vir
ol.第61巻4019〜4022頁)にしたがって作
製された。
【0022】
【実施例10】NS1−NS2A接合部における開裂の
分析 6穴プレート内のコンフルエントCV−1細胞を、細胞
あたり5pfuの組換えワクシニアウイルスに感染さ
せ、最小必須培地に2%ウシ胎児血清(MEM2)を加
えた中に保持した。感染の16〜20時間後、培地を取
り出してメチオニン非含有MEM2とともに置いた。1
時間のインキュベーションの後、この培地は、ふたた
び、100μの35Sメチオニン(比放射能>800μ/
mol)を含む0.7mLのメチオニン遊離MEM2と
ともに置かれた。2時間の標識期間の後、RIPA緩衝
液(デオキシコール酸ナトリウム1%、Nonidot
P−40を1%、硫酸ドデシルナトリウム[SDS]
0.1%、0.1M トリス塩酸、pH7.5、0.1
5M NaCl)に細胞を溶解し、溶解物を遠心分離し
て細胞砕片を除く。溶解物の澄んだ上澄み液に対して、
デング高度免疫マウス腹水(HMAF)を用いた免疫沈
降検査を行ない、デング熱ウイルスを分析した。免疫沈
殿物は、SDS−12%ポリアクリルアミドゲル(アク
リルアミド/ビス比60:1.6)上の電気泳動分離に
より分析された。標識されたタンパク質バンドは、蛍光
撮影により視覚化された。非開裂NS1−NS2A前駆
体および開裂NS1産物に対応するゲルバンドが切り出
され、液体シンチレーションカウンターで放射能が計測
された。NS1−NS2A接合部における開裂の程度を
判定するために、発現したNS1−NS2Aの総標識
は、同じpfu使用で各突然変異体に感染した細胞にお
いて同じであるという仮定にもとづいて、NS1−NS
2AおよびNS1の間の免疫沈降能力差を補正した。野
生型NS1−NS2Aは、開裂されたNS1を優勢的に
発現し、NS1−NS2A前駆体は検出されなかった。
野生型ウイルスについての開裂度を100%と定めた。
【0023】
【実施例11】NS1−NS2A開裂配列におけるアミ
ノ酸置換を特定する完全長4型デングcDNAの構築 前項において構築され分析された、NS1−NS2A接
合部における開裂度が低下したNS1−NS2A DN
Aの突然変異体は、このようなアミノ酸置換を含むデン
グ熱ウイルス突然変異体の構築のために選抜された。す
でに構築された以下の4つの突然変異が採用された。
(1)開裂位置+1におけるGlyをGluに置換、
(2)−2位置のThrをLysに置換、(3)−2位
置のThrをGlnに置換、(4)−2位置のThrを
Leuに置換。突然変異体psc11−NS1−NS2
A DNAを、nt3338のSpeIおよびnt36
16のStuIで消化し、278個を断片として分離し
た。突然変異を含むこのDNA断片は、デングcDNA
配列の5’側半分を含むプラスミドp5’−2内の対応
する野生型DNA断片の置換に用いられた。BstE1
(nt5069)と3’末端のAsp718の間の残り
の3’デングcDNA断片は、共有制限酵素開裂部位に
おいてp5’−2DNAに連結された。このようにし
て、完全長cDNAが作製され、pBR322ベクター
を用いてクローン化された。このシリーズのcDNA
は、NS1−NS2A開裂接合部にアミノ酸置換をコー
ド化する突然変異された配列を含んでいた。
【0024】
【実施例12】NS1−NS2A接合部における最適で
ない開裂を呈する4型デング熱ウイルス突然変異体 ここで重要なことは、デング熱疾病に対する安全で効果
的な弱毒化生菌ウイルスワクチンの開発に、デング熱ウ
イルスの分子理解を応用することである。デング熱ウイ
ルス複製の制限は弱毒化を誘起するであろう。開裂配列
またはウイルスプロテアーゼ構成要素の改変の結果、ウ
イルスポリタンパク質の開裂は最適以下となり、ウイル
ス増殖が制限される。ポリタンパク質NS1−NS2A
開裂部位は、その非効率的開裂の故に、増殖制限された
デング熱ウイルス突然変異体を構築するための第1のタ
ーゲットとして選択された。我々は、4型デング熱ウイ
ルスのNS1−NS2A開裂には、開裂接合部の前のN
S1のC末端に8アミノ酸配列が必要であることを証明
した(H.HoriおよびC.J.Lai(199
0)。デング熱ウイルスNS1−NS2Aの開裂には、
NS1のC末端にオクタペプチド配列が必要である。
J.Virol.第64巻4573〜4577頁)。フ
ラビウイルス間で8アミノ酸配列を比較すると、Ala
(−1)、Val(−3)、Ser(−5)、Val
(−7)、Met/Leu−8)は正確に保存されるの
に対し、Thr(−2)、Gln(−4)、Lys(−
6)は変化するという興味深い特色が明らかになった。
位置−1のAla、位置−2のThr、位置−3のVa
l、位置+1のGlyのアミノ酸置換の効果を分析し
た。この分析の結果は図16に示されている。保存され
た位置−1または−3におけるアミノ酸置換は、低レベ
ルの開裂を生じた。非保存位置−2または+1における
アミノ酸置換は、効果がないかもしくはごくおだやかな
開裂低減を呈した。ある範囲の開裂効率を生じたアミノ
酸置換のパネルを、完全長cDNAへの組み込みのため
に選抜し、インビトロ由来RNA転写物をデング熱ウイ
ルス突然変異体の構築のために用いた。1つのデング熱
ウイルス突然変異体は、Gly(+1)のかわりにGl
uを含むDEN4(Gly1120→Glu)であり、他の
3つの突然変異体は、DEN4(Thr1124→Ly
s)、DEN4(Thr1124→Gln)、DEN4(T
hr1124→Leu)であり、Thr(2)の置換を含ん
でいる。これらはトランスフェクションしたLLC−M
2細胞から回収された。以下に述べるように、これら
の突然変異体の増殖特性は、蚊C6/36細胞上のプラ
ーク検定により調べられた。図12はDEN4(Gly
1124→Glu)および対照親ウイルスに対するこの検定
の結果を示す。突然変異体ウイルスのプラークサイズは
直径約0.1cmが計測され、親ウイルスの1.1cm
のプラークサイズと比較して大きく縮減していた。その
他のデング熱ウイルス突然変異体もプラークサイズの縮
減を示し、これらのウイルスが培養細胞において増殖制
限を示すことを示唆している。最適以下の開裂に起因す
る増殖制限は、感染宿主におけるウイルス毒性に対し
て、大きな効果をもつようである。 活性デング熱ウイルス3’非コード領域欠失突然変異体
の加工
【0025】
【実施例13】3’非コード領域に欠失を含むデングc
DNAの構築 ヌクレオチド384個の3’非コード領域への欠失突然
変異の導入を容易にするために、まず、nt10104
の唯一のBamHI部位と3’末端のAsp718部位
の間の4型デングcDNAの540ntのサブフラグメ
ントを、pGEM3クローニングベクターに挿入した。
この組換えプラスミドにおいて、4型デング配列のnt
10470の唯一のApaI部位は、3’非コード配列
のほぼ中心点に位置している。この便利な位置にあるA
paI部位を用いて、2つの欠失突然変異配列を構築し
た。すなわち、構築物の1つの配列は、ApaI部位の
下流に欠失を含んでいた。他の配列の欠失はApaI部
位の上流に位置していた。ヌクレオチド30〜90個の
長さをもつ欠失突然変異の第1の配列を加工するため
に、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発が実施され
た。ApaI開裂部位に指定された適当な欠失を含み、
下流配列が続く以下のオリゴヌクレオチドを、PCRに
おける正鎖プライマーとして用いた。 オリゴCAA AAG GGG GCC CAA GAC TAG AGG TTA CAG GAG ACC−(Δ3’172−143)(配列番号7) オリゴCAA AAG GGG GCC CAA CAA AAA CAG CAT ATT GAC GCT GGG−(Δ3’172−113)(配列番 号8) オリゴCAA AAG GGG GCC CAA CAG AGA TCC TGC TGC TGT CTC TGC--(Δ3’172−83)(配列番号 9) 負鎖プライマーは、オリゴGAG CTG GTA C
CA GAA CCTGTT GGA TCA A(配
列番号10)であり、これは、3’デング配列にAsp
718開裂配列がつづいたものを含んでいる。完全長4
型デングcDNA(クローン2A)を鋳型として用い
た。これらの欠失突然変異を4型デング配列に導入する
ために、pGEM3組換えプラスミド中のApaIおよ
びAsp718部位の間の野生型ウイルスDNA断片
を、ApaIおよびAsp718で開裂したPCR D
NA産物で置換した。同様に、ヌクレオチド61〜20
2個の長さをもつ欠失突然変異の第2の配列を加工しA
paI部位の上流に配置するために、オリゴヌクレオチ
ド特異的突然変異誘発を施した。下記のオリゴヌクレオ
チドが合成され、PCRにおける負鎖プライマーとして
用いられた。 オリゴCCT GGC TTG GGC CCC CGC GTA CAG CTT CCG TGG CGC--(Δ3’,243−183)(配列番号11 ) オリゴCCT GGC TTG GGC CCC GGA GCT ACA GGC AGC ACG GTT--(Δ3’,303−183)(配列番号12 ) オリゴCCT GGC TTG GGC CCC CGT GGC ACA AGT GGC CTG ACT--(Δ3’,333−183)(配列番号13 ) オリゴCCT GGC TTG GGC CCC TTA CAG AAC TCC TTC ACT CTC TGA--(Δ3’,384−183)(配列 番号14) 正鎖プライマーはオリゴGCC TCC ATG GC
C ATA TGCTCA GC(配列番号15)であ
り、これは、BamHI部位の上流のヌクレオチド98
85〜9907の間に位置している。完全長4型デング
cDNAを鋳型として用いた。先に説明したように、こ
れらの欠失突然変異を4型デング配列に導入するため
に、中間体pGEM3プラスミド中のBamHIおよび
ApaI部位の間の野生型ウイルスDNA断片を、Ba
mHIおよびApaIで開裂したPCR DNA産物で
置換した。cDNA鋳型を加工する最終段階において、
構築物の両方の配列からのBamHI−Asp718断
片が分離され、残りの4型デング配列でクローン化され
た。
【0026】
【実施例14】RNA転写、トランスフェクションおよ
びウイルスの回収 デング熱ウイルスcDNAクローンは、3’末端におけ
るAsp718での消化により線状化され、線状cDN
Aは、SP6ポリメラーゼによるインビトロ転写のため
の鋳型として用いられた。RNA転写物による細胞のト
ランスフェクションは、先に説明されているように実施
された(Lai他、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA第88巻5139〜5143頁(199
1))。トランスフェクションの10日後、細胞をトリ
プシン処理し、6穴プレートおよびチェンバースライド
に移した。2日後、免疫蛍光検査(IFA)により、デ
ング熱ウイルス抗原の形跡について、スライド上の細胞
を試験した。IFAにより大半の細胞が感染したことが
示された場合には、6穴プレート上の感染細胞は、培地
を取り出し、細胞を掻き取り、標準容積の50%イーグ
ル最小必須培地/50%血清に再懸濁し、凍結させるこ
とにより、収穫された。一方、陽性の細胞の割合が小さ
い場合には、細胞をトリプシン処理し、新鮮な媒地中に
1:3で希釈し、増殖させた。感染細胞の割合は週ベー
スで算定され、細胞溶解物を収穫した。
【0027】
【実施例15】プラーク形態観察 ウイルスは、LLC−MK2細胞または蚊C6/C36
細胞上のプラーク形態について調べられた(Bankc
roft他、Pan Am.Health Orga
n.Sci.Publ.第375巻175〜178頁
(1979);Hoke他、Am.J.Trop.Me
d.Hyg.第43巻219〜226頁(199
0))。プラーク形態の分析の前に、親・野生型ウイル
スは、LLC−MK 2細胞中で1回、継代培養された。
すなわち、2%ウシ胎児血清を含む培地199中に試験
すべきデング熱ウイルス0.2mLを連続10倍希釈
し、これを25cm2ビンに入れたLLC−MK2細胞に
注入した。35℃で1時間の吸着の後、各単層に、1×
培地199、0.3%重炭酸ナトリウム、1/2×イー
グル基本培地ビタミン、1/2xイーグル基本培地アミ
ノ酸、10%ウシ胎児血清、0.5%アガロースを含む
7mLのアガロースを重層した。35℃で6日間のイン
キュベーションの後、このビンに、0.5%MEアガロ
ースおよび1:7,500ニュートラルレッドを含む通
常生理食塩水4mLを2回目のオーバーレイとしてかけ
た。染色から24時間以内にウイルスプラークがあらわ
れた。C6/36細胞上のプラーク形態観察を行ない、
分離されたすべてのウイルス突然変異体が調べられた。
この目的のため、75cm2ビンに入れたのコンフルエ
ントなC6/36細胞に、2%ウシ胎児血清を加えたM
EMに連続的に希釈された0.5mLのウイルスを接種
し、1〜2時間35℃で吸着させた。つぎに被感染細胞
に、20mL/フラスコのアガロース(1×ハンク平衡
食塩溶液、0.5%ラクトアルブミン加水分解物、10
%ウシ胎児血清、0.12%重炭酸ナトリウム、0.7
5% SeakemTM GTGアガロース)を重層し
た。培養を35℃で7日間、インキュベートした。つぎ
に、NaCl 8.0g/L、KCl 0.4g/L、グ
ルコース1.0g/L、Na2HCO2 22.5mg/
L、ニュートラルレッド3.3mg/Lからなるニュー
トラルレッド染色液5mLを用いて培養物を染色した。
35℃で3〜5時間のインキュベーションののち、余分
の染色液を取り除き培養物はインキュベータに戻した。
一般に、インキュベータ内で24〜36時間経過した後
プラークがあらわれた。
【0028】
【実施例16】3’非コード領域に欠失を含む4型デン
グ熱ウイルス突然変異体 ここで、デング組換えDNA系により、ウイルスDNA
の5’および3’非コード領域ならびにコード領域にお
ける欠失を含むデングウイルス突然変異体を構築するこ
とも可能となる。欠失突然変異体は、アミノ酸置換突然
変異体よりも、表現型の復帰が起きることが少ないとい
う利点を提供する。4型デング熱ウイルスゲノムの3’
非コード領域における欠失突然変異の加工において進展
がみられた。他の蚊媒介フラビウイルスと同様に、4型
デング熱ウイルスは、保存配列1(CS−1)および保
存配列2(CS−2)と呼ばれる伸張した保存配列と、
3’非コード領域内の末端ステムアンドループを取り得
る構造を含む。ヌクレオチド30〜120個の範囲の欠
失は、4型デング熱ウイルスRNAのヌクレオチド38
5個の3’非コード配列のさまざまな位置において作製
された。CS−1領域に配列を欠いていても、ステムア
ンドループ構造は維持しているcDNAクローンから転
写された突然変異体RNAは、子孫ウイルスを生成せ
ず、これは、欠失ウイルスがほとんどの他の欠失構築物
から回収されたことを示唆している(図13)。これら
の突然変異体および野生型ウイルス対照のプラーク検定
はC6/36細胞上で実施された。この分析の結果、こ
れらの突然変異体のほとんどが、欠失の位置と程度に応
じて1.0〜0.3cmの範囲の縮減サイズのプラーク
を形成したことが示された(図14および15)。プラ
ーク形態の変化は、これらの欠失突然変異体が増殖制限
表現型をあらわしたことを示すものである。この欠失突
然変異体のパネルは、実験動物およびヒトに対する毒性
低減など、その他の興味深い潜在的に重要な特性をみせ
る。
【0029】
【実施例17】完全長キメラTBEV/DEN4 cD
NAおよびキメラウイルスの生成 すでに、TBEV(Sofjin株)のサブゲノムcD
NA断片がクローン化され、ヌクレオチド配列が決定さ
れた(前出のPletnev他、Virology(1
990)参照)。TBEV配列のヌクレオチド(nt)
76〜1977を含むプラスミドpGEM2−CMEお
よびヌクレオチド966〜3672を含むpGEM2−
ENS1は、E.Yu.Dobricova博士(No
vosibirsk Institute of Bi
oorganic Chemistry、ロシア)によ
り、共有される制限酵素部位においてTBEVセグメン
トを連結することにより、プラスミドp10、p4、p
18、p2、p11から(前出のPletnev他)提
供された。プラスミドDEN4 p5’−2およびp
5’−2(ΔPstI,XhoI)および誘導体p5’
−2(ΔPstI,XhoI,ΔHindIII )(前出
のBray他、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA.(1991))が、対応するDEN4遺伝
子に代えて1つ又はそれ以上のTBEV遺伝子を置換す
るための組換えcDNA構築物として、用いられた。合
成オリゴヌクレオチド(オリゴ)は、ポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)により2本鎖DNAを生成するための負
または正鎖プライマーとして用いられた。PCR特異的
部位特異的突然変異誘発により、制限酵素開裂配列を、
TBEVおよびDEN4遺伝子間接合部またはその近く
に導入した(図17)。まず、示されたTBEV遺伝子
を含む7個の中間キメラプラスミドが構築され、安定な
完全長TBEV/DEN4 cDNAが、大腸菌株BD
1528(前出のLai他(1991)により説明され
ている)の形質転換後に同定された。各プラスミド内の
TBEVおよびDEN4遺伝子の間の接合部を囲む配列
は、分子生物学の分野で公知の技術を用いた核酸配列決
定により確認された。すべてのキメラプラスミドは、第
1のDEN4ヌクレオチドであるA残基が続く転写開始
点Gの上流に位置するSP6プロモーターを含んでい
た。インビトロ転写の前に、DEN4配列の3’末端の
直後の唯一のAsp開裂部位において、プラスミドを線
状化した(前出のLai他、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA(1991)に説明された技術を
用いて)。キメラウイルスの回収とその特性の研究は、
BL−3封じ込め設備において実施された。転写反応
は、実質的に、前出のLai他、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA(1991)に記載されてい
るように実施された。トランスフェクションの前に、3
7℃で15分間、40u/mLのDNaseIを用いて
転写混合物を処理した。つぎに、RNA転写物は、
(i)前出のLai他によりすでに述べられているLi
pofectinTM(Bethesda Resear
ch Laboratories,Inc.)、または
(ii)N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロ
ピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムメチルサ
ルフェート(DOTAP)(Boehringer M
anneheim)の存在のもとで、セミコンフルエン
トなサルLLC−MK2細胞のトランスフェクションに
用いられた。DOTAPトランスフェクション条件のも
とで、トランスフェクション混合物は、0.02mMの
Hepes緩衝液40μL、pH7.05中にRNA転
写物(2μg)、および、Hepes緩衝液30μL中
にDOTAP 12μLを含んでいた。室温において1
0分間のインキュベーションの後、10%のウシ胎児血
清(FBS)を含む2mLの培地199を添加した。混
合物0.5mLを、24穴プレートの4つのウェル中の
半融合性細胞に分注した。10日後、細胞をトリプシン
処理し、6穴プレートとチェンバースライドに移し、さ
らに2日間、増殖培地においてインキュベーションし
た。スライド上の細胞を免疫蛍光検定(IFA)により
試験し、1:100希釈のDEN4特異高度免疫マウス
腹水(HMAF)、TBEF特異的HMAF、またはT
BEV特異的ウサギ血清(Instituteof P
oliomyelitis、ロシア、モスクワのA.
S.Karavanov博士の好意により提供された)
を用いてDEN4またはTBEV抗原の存在を検出し
た。フルオレセイン接合抗マウスまたは抗ウサギ血清
(Kirkegaard−Perry、メリーランド州
Gaithersberg)を同一希釈で用いた。IF
Aにより50〜80%の細胞が感染したことが示された
場合には、6穴プレート内の細胞をトリプシン処理し、
2倍量の非感染細胞と混合し、T75フラスコ中で6日間
増殖させた。つぎに、被感染細胞を培地とともに収穫
し、同一容積のウシ胎児血清と混合し、細胞懸濁液とし
て凍結した。解凍された細胞溶解物を、子孫キメラウイ
ルスの源として用いた。LipofectinTMまたは
DOTAPを用いたトランスフェクション実験により、
TBE(ME)/DEN4およびTBE(CME)/D
EN4のみが同定された。子孫ウイルスは免疫蛍光検定
により同定された。vTBEV(ME)/DEN4と呼
ばれる子孫キメラTBE(ME)/DEN4ウイルスの
ゲノム構造を証明するために、Mackow他、Vir
ology第159巻217〜218頁(1987)に
提供される技術を用いたフェノール抽出により、総細胞
RNAを感染LLC−MK2細胞から分離した。DEN
4配列のヌクレオチド(nt)位置5090〜5110
(Mackow他、Virology第159巻217
〜228頁1987参照)に対して相補的なオリゴ5’
GCTCCGGGGTGTAAGTCCATT3’(配
列番号16)を、逆転写のためのプライマーとして用い
た。一本鎖cDNAを鋳型として用い、DEN4配列の
nt位置18〜44のオリゴ5’GACCGACAAG
GACAGTTCCAAATCGGA3’(配列番号1
7)をPCRの正鎖プライマーとして、TBEV配列の
nt位置2130〜2152のオリゴ5’CTTTTT
GGAACCATTGGTGACT3’(配列番号1
8)を負鎖プライマーとして用いた。デング熱ウイルス
に関連するヌクレオチド位置については、Zhao他、
Virology第155巻77〜88頁1986参
照。ダニ媒介脳炎ウイルスに関連するヌクレオチド位置
については、前出のPletnev他、Virolog
y(1990)を参照。制限酵素部位の存在を証明する
ため、2118塩基対(bp)のPCR DNA産物
は、PstI、BglII 、またはEcoRIで消化さ
れた。同様に、オリゴ5’GTCCGGCCGTCAC
CTGTGATT3’(配列番号19)およびオリゴ
5’TCACGGTGCACACATTTGGAAAA
C3’(配列番号20)(これらはそれぞれ、3459
〜3480ntのDEN4ゲノムに相補的、および、9
67〜985ntのTBEVゲノムの負鎖に相補的であ
る)を、PCRに用いた。DNA配列を証明するため、
PCR産物は、EcoRI、PstI、BamHI、X
hoI、またはSphIで消化された。vTBE(M
E)/DEN4ゲノムからのPCRDNA産物(211
8bp)は、HindIII およびBamHI制限エンド
ヌクレアーゼ酵素を用いて消化された。HindIII −
BamHI−サブフラグメント(1922bp)をPA
GEにより精製し、相補的な制限部位においてpGEM
3ベクター内にクローン化した。DEN4(300〜3
98nt)のC遺伝子とTBEV(418〜460n
t)のpreM遺伝子の間の接合部の配列は、核酸配列
決定により確認された。TBE/DEN4キメラDNA
の構築に用いられたオリゴヌクレオチドは以下のものを
含む。 TBEV特異的オリゴ 5’CCGGTTTATAGATCTCGGTGCAC
ACATTTGGAAAAC+(配列番号21) 5’CTCCATTGTCTGCATGCACCATT
GAGCGGACAAGCCC−(配列番号22) 5’CTTAGGAGAACGGATCCTGGGGA
TGGCCGGGAAGGCCATTCTG+(配列番
号23) 5’GGCAAAAGAAGGTCTGCAGTAGA
CTGGACAGGTTGG+(配列番号24) 5’GAAGGAAGCTCATGGACATGGTC
GGATTCCTCGAGTTCAGGCCCAACC
AGGC−(配列番号25) 5’CCTGGCCTGGTTGGGCCGAACTC
GAGGAATCCGACCATGTC+(配列番号2
6) 5’GTCCAGTCTACTGCAGACCTTCT
TTTGCCACGTCTTTG−(配列番号27) DEN4特異オリゴ 5’TACGCATCGGGATCCGTAGGATG
GGGCGACCAGCAT−(配列番号28) 5’TCACAGGTGCATGCCGGACAGGG
CACATCAGAAACT+(配列番号29) 5’CAGCAATGTTACTGCAGACCTTT
TTCTCCCGTTC−(配列番号30) 5’GGGAGAAAAAGGTCTGCAGTAAC
ATTGCTGTGCTTGATTCCC+(配列番号
31) 配列番号23は、DEN4の5’非コード領域/TBE
Vカプシド接合を作製するために用いられ、BglII/
BamHI部位を形成した。配列番号30および24
は、DEN4 C/TBEV preM接合を作製するた
めに用いられ、PstI/PstI部位を形成した。配
列番号28および21は、DEN4 preM/TBE
V E接合を作製するために用いられ、BamHI/B
glII部位を形成した。DEN4 NS1/TBEV N
S1接合は、配列番号26を用いて作製され、XhoI
/XhoI部位を形成した。TBEV E/DEN4 N
S1接合は配列番号25を用いて作製され、XhoI/
XhoI部位を形成した。TBEV C/DEN4 pr
eM接合は配列番号27および31を用いて作製され、
PstI/PstI部位を形成した。TBEV NS1
/DEN4 NS2A接合は配列番号22および29を
用いて作製され、SphI/SphI部位を生成した。
配列に付した+および−の符号は、それぞれ上流および
下流のプライマーを示す。
【0030】
【実施例18】キメラビリオンのタンパク質分析 DEN4v 2A(XhoI)、完全長4型デング熱ウ
イルスcDNA構築物、または、vTBE(ME)/D
EN4により生成されるタンパク質を分析するために、
6穴プレート内のコンフルエントなLLC−MK2細胞
を、MOI 1.0で各ウイルスに感染させた。感染の
6日後、前出のLai他、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA(1991)に述べられているよう
に、メチオニン非含有MEM(イーグル最小必須培地)
中の35Sメチオニン(ウェルあたり60μCi、比放射
能600Ci/mmole)で4時間にわたり、細胞を
標識した。1)TBEV特異的HMAF、2)DEN4
特異的HMAF、3)TBEV Eに対して作製された
ウサギ血清、または、4)DEN4 preM、E、N
S3、または、NS5タンパク質に特異なウサギ抗血清
を用いて、溶解物を免疫降させた。前出のLaemml
iにより説明される技術を用いて、変性条件下でPAG
Eにより免疫沈降物を分析した。 時間に対するタンパク質合成の分析 T25フラスコに入れたLLC−MK2またはC6/36
細胞単層に、MOI 1で、vTBE(ME)/DEN
4またはDEN4(v2A(XhoI))を感染させ
た。37℃で1時間の吸着の後、ウイルス接種物を取り
出し、新鮮培地を細胞に添加した。タンパク質合成の分
析のため、ウイルス吸着後さまざまな時間(0、4、
8、24、48時間)経過した被感染細胞を、メチオニ
ン非含有MEMとともに、20分間インキュベートし、
同じ培地中で2時間にわたり、35Sメチオニンで標識し
た。標識された細胞の溶解物をDEN4特異的HMAF
を用いて沈降させ、PAGEおよびオートラジオグラフ
ィにより分析した。
【0031】
【実施例19】キメラ構築物の増殖分析 親DEN4およびそのキメラウイルスは、サルLLC−
MK2および蚊C6/36細胞上のプラーク検定によ
り、調べられた。プラーク検定の技術は前出のBanc
roft他に説明されている。図19に示されている増
殖分析は、感染後のさまざまな日付に、DEN4または
TBE(ME)/DEN4に感染したLLC−MK2
よびC6/36培養中に存在するウイルスの量を計量す
ることにより、実施された。感染およびウイルス吸着の
後、培養を収穫し、各培養をプラーク検定によりサンプ
リングした。Log(pfu/mL)で表したウイルス
力価の変化は、時間に対する増殖曲線として与えられて
いる。
【0032】
【実施例20】ウイルスRNA合成の分析 ウイルスRNA合成の分析のために、被感染LLC−M
2またはC6/36細胞(約106個の細胞)をウイル
ス吸着後のさまざまな時間(0、4、8、24、48時
間)に収集し、0.5mLのリン酸緩衝生理食塩水(P
BS)pH7.5で洗浄し、ついで、0.3M NaA
c、pH5.2、5mM EDTA、1% SDSを含む
緩衝液中に溶解した。前出のManiatis他により
提供される技術を用いて、フェノール抽出により、総R
NAを細胞溶解物および培地から分離した。60℃で1
5分間、7.5%(wt/vol)ホルムアルデヒドを
含む 6×SSC(1×SSCは、0.15M NaClおよ
び0.015M クエン酸ナトリウム)中でのインキュ
ベーションにより、RNA試料は変性され、ニトロセル
ロースフィルターBA85(Schleicherおよ
びSchuell)に接合された。フィルターは80℃
で1時間焼かれ、6×SSC、3×Denhardt溶
液、25mMのNa2HPO4(pH6.5)、0.1%
SDS、25μg/mLのサケ精子DNAを含む溶液中
において、65℃で1時間、プレハイブリダイゼーショ
ンされた。ニックトランスレーションされた32P標識p
TBE(ME)/DEN4 DNAプローブ(50ng
/mL、比放射能3.4×108cpm/μg)を含む
同じ溶液中で、65℃で一晩、ハイブリダイゼーション
が続けられた。ハイブリダイゼーションの後、65℃
で、0.1%SDSを含む0.1×SSC中でフィルタ
ーを5回洗浄し、乾燥し、70℃でX線フィルムに曝し
た。また、RNAにハイブリダイズされた32P標識DN
Aの放射能が、液体シンチレーションカウンターで計測
された。pTBE(ME)/DEN4からインビトロで
作製されたRNA転写物が、陽性対照として用いられ
た。
【0033】
【実施例21】ワクチン試料の防御効力とキメラウイル
スの神経毒性の試験 vTBE(ME)/DEN4および親デング熱ウイルス
は、マウスに脳内(IC)、皮内(ID)、腹腔内(I
P)経路により接種することにより、神経毒性について
分析された。生後3日の乳児BALB/cマウスに、
0.02mLMEM/0.25%ヒト血清アルブミン中
にウイルス102pfuを加えて、IC注射で投与し
た。生後6週のBALB/c雌マウスに、(i)103
pfuのウイルスを上記のとおり希釈し、容積0.03
mLにしてIC接種により投与、または、(ii)0.1
0mLに希釈した103pfuのウイルスをIDまたは
IP接種した。マウスは、21日間、脳炎の徴候や死亡
について観察され、生き延びた成体マウスは、感染の2
0日後に採血して接種されたウイルスに対する抗体反応
を評価した。生存マウスに対しては、第21日に、BL
−4封じ込め設備において、103LD50TBEV(S
ofjin株)をIP投与した。
【0034】
【実施例22】キメラウイルス突然変異体の構築および
配列決定 分子生物学の当業者に公知の標準的オリゴPCR操作手
順にしたがい、部位特異的突然変異誘発を用いて、TB
EV(ME)/DEN4構築物に突然変異を導入した
(下記のオリゴ配列参照)。得られた構築物は、実施例
17に開示された技術を用いて、LLC−MK2細胞内
にトランスフェクションされた。突然変異誘発された構
築物から回収した子孫ウイルスは、実施例19において
提供されている技術を用いてプラーク形態の変化につい
て評価された。キメラウイルスゲノムの予め定められた
領域内に改変を系統的に達成するために、完全長TBE
(ME)/DEN4cDNA構築物に戦略的突然変異を
導入した。6個の突然変異キメラが、トランスフェクシ
ョンされたLLC−MK2細胞から回収され、子孫ウイ
ルスが、マウス神経毒性を誘導する能力について分析さ
れた。さらに、他のウイルス増殖特性が、培養細胞にお
いて評価された。図23に示すように、PreM、E、
または、NS1グリコタンパク質における切断されたグ
リコシル化部位を含む4つのウイルス突然変異が、示さ
れた部位におけるグルコシル化欠損を示すものと予測さ
れた。変異*PreM/M-は、PreM/M遺伝子間接
合部において欠陥開裂配列を含んでいた。変異*Eは、
2つのアミノ酸置換を含み、これらの置換が選択された
理由は、これらのアミノ酸が蚊媒介フラビウイルス内に
のみ見られるからである。突然変異は、標準的オリゴP
CR起動手順にしたがい、部位特異的突然変異誘発によ
り、TBE(ME)/DEN4構築物に導入された。要
するに、正鎖オリゴおよびその相補的負鎖オリゴは、そ
れぞれ突然変異配列と唯一の制限酵素部位を含んでいる
が、PCRにおいて、それぞれ下流または上流プライマ
ー対のオリゴとともに用いられる。両方のPCR産物
は、共有される唯一の制限酵素部位において連結され
た。このようにして、突然変異された配列を含む、DN
A断片産物が作製され、完全長TBE(ME)/DEN
4 cDNAにおける対応する野生型DNA断片を置換
した。以下は特異的突然変異体キメラDNAおよび構築
に用いられたオリゴヌクレオチドのリストである。 (1)変異PreM/M−Glc: 5’GCGGCAACCCAGGTGCGTGTCGA
TCGTGGCACCTGTGTGATCCTGG+
(配列番号32) 5’CCAGGATCACACAGGTGCCACGA
TCGACACGCACCTGGGTTGCCGC−
(配列番号33) (2)変異E−Glc: 5’GGGGGATTACGTCGCTGCTCTAG
AGACTCACAGTGGAAGAAAA+(配列番
号34) 5’TTTTCTTCCACTGTGAGTCTCTA
GAGCAGCGACGTAATCCCCC−(配列番
号35) (3)変異NS1(1)−Glc: 5’TTCACCCCAGAAGCAAGGATCCG
CACATTTTTAATAGACGGAC+(配列番
号36) 5’GTCCGTCTATTAAAAATGTGCGG
ATCCTTGCTTCTGGGGTGAA−(配列番
号37) (4)変異NS1(2)−Glc: 5’TGGATAGAGAGCTCAAGGATCCA
GACTTGGCAGATAGAGA+(配列番号3
8) 5’TCTCTATCTGCCAAGTCTGGATC
CTTGAGCTCTCTATCCA−(配列番号3
9) (5)変異PreM/M: 5’GGATCAAGAACAAGACGCGTAGT
GCTGATCCCATCCCAC+(配列番号40) 5’GATGGGATCAGCACTACGCGTCT
TGTTCTTGATCCTTCTTG(配列番号4
1) (6)変異E: 5’AGAGACCAGAGCGATCGAGGCTG
GGGCAACGGGTGTGGATTTTTTGGA
AAA+(配列番号42) 5’GCCCCAGCCTCGATCGCTCTGGT
CTCTCTTACACACTTACGACGG−(配
列番号43) さらに、上流プライマーは(配列番号44) 5’GACCGACAAGGACAGTTCCAAAT
CGGA+および下流プライマーは(配列番号45) 5’CTTGAACTGTGAAGCCCAGAAAC
AGAGTGATTCCTCCAACAGCTATGC
A−
【0035】
【実施例23】マウスにおける神経毒性の分析 さらに、突然変異されたキメラウイルス調製物は、マウ
スにIC接種され、実施例21に提供されている技術を
用いて、DEN4、TBE(ME)/DEN4およびT
BE(CME)/DEN4と比較された。試験動物の半
数を死亡させるのに必要な致死量が、突然変異キメラウ
イルスの各々について比較された。生後6週間のBAL
B/cマウスの8匹ずつのグループに、さまざまな変異
キメラ、TBE(ME)/DEN4、TBE(CME)
/DEN4、またはDEN4を、1000、100、1
0、1、0.1pfuの投与量で、脳内接種した。被感
染マウスは、31日間、脳炎の徴候および死亡について
観察された。50%致死量(LD50)が各ウイルスに
ついて算出され、その値がマウス神経毒性の基盤として
用いられた。図24に示すように、親TBE(ME)/
DEN4ウイルスのLD50は約10pfuであった。
このレベルのLD50は、いくつかの変異ウイルスにつ
いても観察された。少なくとも2つの突然変異体、すな
わち*NS1(1)−Glc-および*PreM/M-のL
D50は、100pfuよりも大きく、これらの突然変
異体のマウス神経毒性は100倍以上減少したことを示
している。この発見は、キメラウイルスゲノムにおける
NS1(1)−Glc-またはPreM/M-突然変異
は、それぞれ、マウス神経毒性の弱毒化を提供すること
を示すものである。これらの突然変異ウイルスは、個別
にまたは組合わせて、ワクチン候補としての有用性のさ
らなる評価に有益であろう。
【0036】
【実施例24】霊長類における最適化キメラ構築物の試
その他の動物ではなく、ヒトよりも下位の霊長類は、周
辺経路により容易にデング熱ウイルスに感染することが
証明されている(Simmons他、Philipp.
J.Sci.第44巻1〜247頁、1931およびR
osen、Am.J.Trop.Med.Hyg.第7
巻:406〜410頁、1958)。サルの感染は、ヒ
トのデング熱ウイルス感染に最も近い実験系である。デ
ング感染に対するアカゲザルの反応は、4〜6日のウイ
ルス血症があるという点において、ヒトのそれと類似し
ている。これよりも低級な霊長類は臨床的デング徴候を
起こさない。サルにおけるデングその他のフラビウイル
ス研究の目的は、(1)さまざまなワクチン候補の免疫
原性を評価すること、(2)ウイルス血症の期間を日数
で、ピークウイルス力価をpfu/mLで計測して、デ
ングまたはキメラデング熱生菌ウイルスワクチン候補の
感染性および毒性(弱毒化表現型)を評価すること、
(3)同型デング熱ウイルスまたは同一のキメラウイル
ス特異性をもつその他のフラビウイルスによる投与に対
する上記ワクチンの防御効力を評価すること、である。 (1)接種:各アカゲザルに、イーグル最小必須培地/
0.25%ヒト血清アルブミンに希釈した合計3×10
6pfuのウイルスを接種する。通常、麻酔された動物
に2回の皮下投与を施す。 (2)血液採取:デング熱ウイルスまたはキメラデング
熱ウイルスの接種の後、3.0mLの血液試料を2週間
のあいだ毎日と、3週目、4週目、6週目、8週目に採
取する。 (3)デング熱ウイルスまたは他のフラビウイルスの投
与:ウイルス投与が、防御効力を評価するために適切で
あると考えられる場合、105pfu/1投与の非弱毒
化ウイルスを容積0.5mLにしてサルの上腕部に皮下
接種する。 (4)研究室内検定:血清試料を用いて以下を決定し
た。(a)直接的ウイルスプラーク検定によるウイルス
血症期間、(b)放射性免疫沈降およびELISAによ
るデングまたは他のフラビウイルス特異抗体の力価、
(c)プラーク縮減中和試験による中和抗体の力価。こ
れらすべての試験はワクチン開発技術の当業者には公知
である。以上、本発明を特別の実施例について説明した
が、当業者であれば、これらの実施例は例示のためのも
のに過ぎず本発明を限定するものではないことが理解さ
れよう。本発明の真の範囲は下記の請求の範囲に鑑みて
解釈されるべきである。
【0037】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、キメラデング熱ウイルスの作製に用い
られる完全長デング熱ウイルスcDNAの構造を示す。
【図2】図2は、RNA転写物を用いたトランスフェク
ション後の、ウイルス感染細胞のパーセンテージとウイ
ルスの力価[titer]を示す。
【図3】図3は、キメラデング熱ウイルスの血清型分析
を示す。
【図4】図4は、親またはキメラのデング熱ウイルスに
より生成された1型、2型、または4型ウイルスタンパ
ク質のポリアクリルアミドゲル分析を示す。
【図5】図5は、LLC−MK2細胞上のウイルスプラ
ークの形態観察を示す。
【図6】図6は、親2型NGCまたは4型デング熱ウイ
ルスまたは2型/4型キメラウイルスのマウス神経毒性
を示す。
【図7】図7は、感染性RNAの転写に用いられるクロ
ーン化された完全長デング熱ウイルスcDNAの末端配
列を示す。合計10646個のヌクレオチドの長さをも
つ完全長デング熱ウイルスcDNAは、図示のように、
SP6ポリメラーゼのためのプロモーター配列および唯
一のAsp718開裂部位に隣接してクローン化され
る。ここで、10448および10449の間の位置に
付加C残基が、10470および10471の間に付加
G残基が存在する。これらはもとの4型デング熱ウイル
ス配列にはなかったものである。RNA転写物の予測
5’末端および3’末端の近くの配列も示されている。
転写開始のGは、太字体で示される3’デング配列の前
に配置されていた。Asp718開裂配列GGTACC
は、太字体で示される3’デング配列の直後に位置して
いた。
【図8】図8は、完全長デングcDNAクローンおよび
制限エンドヌクレアーゼ消化パターンを示す。図には、
5’端にSP6プロモーター、3’端にAsp718開
裂部位を含む完全長デングcDNAクローンが示されて
いる。ヌクレオチド5069のBstB1開裂部位によ
り、デングゲノムは5’および3’断片に分離される。
完全長クローン1Aの断片を、対応する5’−2、3’
−B、または3’−C断片で置換することにより、図示
されている他の完全長の組合せが得られる。
【図9】図9は、BglII,NsiI、およびAsp7
18で消化された完全長デングcDNAクローンの制限
エンドヌクレアーゼパターンを示し、消化物はアガロー
スゲル上での分離により分析された。Mは、キロ塩基対
の分子サイズマーカーとしてのλHindIII DNA断
片を示す。
【図10】図10は、感染RNAから回収されたデング
熱ウイルスが鋳型DNAのゲノム配列を含むことの実例
を示す。子孫デング熱ウイルスは、クローン2ADNA
(野生型対照(コントロール))から、または、デング
配列のヌクレオチド3473のPstI部位を含むクロ
ーン2A(P)DNAから転写されたRNAでトランス
フェクションしたLLC−MK2細胞から回収された。
回収されたウイルスから抽出されたゲノムRNAは、逆
転写に用いられ、cDNA産物は、適当なプライマーを
用いたPCRにより1343bpのDNA断片(ヌクレ
オチド3193〜4536)を製造するための鋳型とし
て用いられた。PCR産物のPstI消化が図示されて
いる。レーンMは、サイズマーカーとしての123のD
NAラダーを示す。
【図11】図11は、回収されたウイルスおよび親ウイ
ルスに感染した細胞からのデング熱ウイルスタンパク質
の比較を示す。回収されたデング熱ウイルスまたは親野
生型ウイルスに感染したLLC−MK2細胞からの溶解
物[ライゼート(lysates)]を35Sメチオニンで標識
したものを用意し、デング高度免疫マウス腹水を用いた
免疫沈降を行なった。沈殿物は、SDS−12%ポリア
クリルアミドゲル上の電気泳動により分離された。図示
のゲルレーンは、下記のものに感染した細胞からの溶解
物を含んでいる。(1)親デング熱ウイルス、(2)ク
ローン2ADNAから回収されたデング熱ウイルス、
(3)クローン2A(P)DNAから回収されたデング
熱ウイルス。レーン4はダミー[mock]感染細胞溶
解物からのものである。レーンMは、左側に示したキロ
ダルトンのタンパク質サイズマーカーを含む。Pre
M、E、NS、NS3を含むデング熱ウイルスタンパク
質に対応する標識バンドが図示されている。その他の標
識バンドの特定はしなかった。
【図12】図12は、野生型4型デング熱ウイルスと、
それに由来するアミノ酸置換突然変異体D4(D1126
E)のプラーク形態観察を示す。76cm2ビンに入れ
た集密な(コンフルエント(confluent)な)蚊C6/3
6細胞をデング熱ウイルスに感染させ、次に、アガロー
スのオーバーレイを加えた。感染の6日後、ニュートラ
ルレッドを用いて細胞を染色した。翌日、プラークサイ
ズを測定した。10個の別々のプラークから、野生型4
型デング熱ウイルスおよび置換突然変異体の平均プラー
クサイズを算出した。図示の突然変異ウイルスは、4型
デングポリペプチド配列の1126位置に、Gly
(G)を置換したGlu(E)を含んでいた。この位置
は、NS1−NS2A開裂配列の+1位置に対応する。
【図13】図13は、3’非コード配列中に欠失を含む
4型デング熱ウイルス突然変異のゲノム構造と特性を示
す。図示の線形マップは、4型デング熱ウイルスのヌク
レオチド384個の3’非コード配列を示す。この領域
には、少なくとも3つの配列要素が示されている。塗り
潰した四角形で示したのは、nt234からnt21
1、および、nt143からnt120の保存配列2
(CS−2)である。白抜きの四角形で示したのは、n
t105からnt82の保存配列1(CS−1)であ
り、最後の84個のヌクレオチド内にはステム・アンド
・ループ構造がある。各々特定の位置に長さ30〜20
2個のヌクレオチドの欠失突然変異を含む、7個のcD
NAクローンが構築され、これから誘導されたRNA転
写物を用いて、受容(permissive)LLC−MK2細胞
のトランスフェクションを行なった。CS−1配列を全
く欠いた突然変異D4(Δ3’、172〜83)cDN
Aは致死突然変異のようである。というのは、活性ウイ
ルスが試行を繰返しても検出されなかったからである。
活性欠失突然変異体は、残り6個のRNA転写物から回
収された。感染の6日後、野生型ウイルスとこれから誘
導された欠失突然変異体の増殖特性を、染色したLLC
−MK2細胞単層上のプラーク検定により比較した。同
一条件のもとで、野生型ウイルスは約0.3cmの大き
さのプラークを示した。逆番号付与システム(reverse
numbering system)を用いて、4型デング熱ウイルスの
ヌクレオチド位置を割り当てた。10646の最後のヌ
クレオチドには、この番号付与システムを用いてnt1
が割り当てられた。
【図14】図14は、野生型デング熱ウイルス、およ
び、これから誘導された、3’非コード領域に欠失を含
む突然変異体のプラーク形態観察を示す。プラーク検定
は、蚊C6/36細胞に対して実施された。75cm2
ビンに入れたコンフルエントな蚊C6/36細胞を、野
生型4型デング熱ウイルスまたは活性欠失突然変異体ウ
イルスに、適当な多重度で感染させた。実施例に述べる
ように、感染の6日後に、被感染細胞をニュートラルレ
ッドで染色した。翌日、プラークサイズを測定した。各
突然変異体について、10個の別々のプラークの平均プ
ラークサイズを算出した。パネルAは、非感染細胞単層
(ダミー)、4型デング熱ウイルス欠失突然変異体(Δ
3’、172〜113)、(Δ3’、172〜14
3)、親・野生型ウイルスを示す。
【図15】図15は、野生型ウイルスと、欠失突然変異
体(Δ3’、243〜183)、(Δ3’、303〜1
83)、(Δ3’、384〜183)を示す。逆番号付
与システムを用いて4型デング配列の欠失位置を割り当
てた。
【図16】図16は、NS1−NS2A接合部の表を示
す。
【図17】図17は、キメラTBEV/DEN4構築物
における遺伝子間接合部を示す。制限酵素で開裂したT
BEVcDNA断片を、下線を付した配列により示され
る適当な部位において、DEN4 cDNAに挿入し
た。TBEVのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配
列は太字で示されている。ヌクレオチド番号付与システ
ムは、Pletnev他によりVirology第17
4巻250〜263頁(1990)に開示されたもので
ある。
【図18】図18は、親DEN4およびキメラTBE
(ME)/DEN4ウイルスにより産生されたウイルス
タンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の写真であ
る。vTBE(ME)/DEN4またはDEN4ウイル
スに感染したサル細胞、または、非感染のサル細胞の溶
解物を35Sメチオニンで標識し、TBEVのHMAF
(1)、またはDEN4のHMAF(2)、またはDE
N4のNS3(3)、NS5(4)、preM(5)、
E(6)に特異的なウサギ血清を用いた免疫沈殿を行な
い、SDS−12%ポリアクリルアミドゲル上で分析し
た。タンパク質マーカーの分子量はキロダルトンで示
す。DEN4タンパク質の位置は右端に沿って示されて
いる。
【図19】図19は、LLC−MK2およびC6/36
細胞上のvTBE(ME)/DEN4およびDEN4に
ついての増殖曲線を示す。細胞は、細胞当り0.01p
fuのMOIで、図示の時点(感染後日数)において細
胞を収穫し、プラーク検定によりウイルス力価を判定し
た。
【図20】図20は、被感染組織培養細胞から分離した
RNAの試料をブロットしたニトロセルロースフィルタ
ーの写真のコピーである。フィルターは、32Pで標識し
たpTBE(ME)/DEN4ニックトランスレーショ
ンDNAをプローブとして検査された。
【図21】図21は、感染後のさまざまな時点におけ
る、vTBE(ME)/DEN4およびDEN4に感染
したLLC−MK2またはC6/36細胞からの細胞溶
解物タンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の写真で
ある。
【図22】図22は、マウスにおけるvTBE(ME)
/DEN4の防御効力および神経毒性を判定するための
研究の結果を示す。
【図23】図23は、神経毒性に対する突然変異の効果
を評価するために、TBE(ME)/DEN4構築物に
組み込んだいくつかの突然変異例のリストである。
【図24】図24は、図23に示した突然変異を含む構
築物から回収したTBE(ME)/DEN4キメラを用
いた神経毒性研究の結果をまとめたものである。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The United States of America <120> Chimeric and/or Growth-Restricted Flaviviruses <130> P-9751 <141> 2002-03-04 <150> US 07/761,222 <151> 1991-09-19 <150> US 07/761,224 <151> 1991-09-19 <160> 45 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 1 aaggctatgc cacgcaaa 18 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 2 gccctggccg gccttcacct gtgatttgac cat 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 3 gccctggccg gcctgcacct gtgatttgac cat 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 4 gccctggccg gccagcacct gtgatttgac cat 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 5 ttctgatgtg ccctgttcgg ccgtcacctg tga 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 6 ttctgatgtg ccctgccagg ccgtcacctg tga 33 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 7 caaaaggggg cccaagacta gaggttacag gagacc 36 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 8 caaaaggggg cccaacaaaa acagcatatt gacgctggg 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 9caaaaggggg cccaacagag atcctgctgc
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Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 15 gcctccatgg ccatatgctc agc 23 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 16 gctccggggt gtaagtccat t 21 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 17 gaccgacaag gacagttcca aatcgga 27 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 18 ctttttggaa ccattggtga ct 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 19 gtccggccgt cacctgtgat t 21 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 20 tcacggtgca cacatttgga aaac 24 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 21 ccggtttata gatctcggtg cacacatttg gaaaac 36 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 22 ctccattgtc tgcatgcacc attgagcgga caagccc 37 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 23 cttaggagaa cggatcctgg ggatggccgg gaaggccatt ctg 43 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 24 ggcaaaagaa ggtctgcagt agactggaca ggttgg 36 <210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 25 gaaggaagct catggacatg gtcggattcc tcgagttcag gcccaaccag gc 52 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 26 cctggcctgg ttgggccgaa ctcgaggaat ccgaccatgt 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Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 32 gcggcaaccc aggtgcgtgt cgatcgtggc acctgtgtga tcctgg 46 <210> 33 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 33 ccaggatcac acaggtgcca cgatcgacac gcacctgggt tgccgc 46 <210> 34 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 34 gggggattac gtcgctgctc tagagactca cagtggaaga aaa 43 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 35 ttttcttcca ctgtgagtct ctagagcagc gacgtaatcc ccc 43 <210> 36 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 36 ttcaccccag aagcaaggat ccgcacattt ttaatagacg gac 43 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 37 gtccgtctat 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equence: synthetic oligonucleotie <400> 41 gatgggatca gcactacgcg tcttgttctt gatccttctt g 41 <210> 42 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 42 agagaccaga gcgatcgagg ctggggcaac gggtgtggat tttttggaaa a 51 <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 43 gccccagcct cgatcgctct ggtctctctt acacacttac gacgg 45 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 44 gaccgacaag gacagttcca aatcgga 27 <210> 45 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotie <400> 45 cttgaactgt gaagcccaga aacagagtga ttcctccaac agctatgca 49
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) //(C12N 1/21 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:01) (72)発明者 プレトネフ,アリグザンダー ジー. アメリカ合衆国,20814,メリーランド, ベセスダ,モントローズ アベニュー, #102 10423番地 (72)発明者 メン,ルーエ アメリカ合衆国,20895,メリーランド, ケジントン,コネチカット アベニュー, ノースウエスト 11344番地 Fターム(参考) 4B024 AA01 BA32 CA04 CA07 DA02 DA06 EA04 GA11 4B065 AA26X AA95Y AB01 BA02 CA45 4C085 AA03 BA61 CC08 DD62

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 安定な、完全長の、感染性4型デング熱
    ウイルスRNAをコード化する、単離された組換えDN
    A構築物。
  2. 【請求項2】 さらにベクターを含むことを特徴とする
    請求の範囲第1項に記載の単離された組換えDNA構築
    物。
  3. 【請求項3】 前記ベクターはプラスミドであることを
    特徴とする請求の範囲第2項に記載の分離された組換え
    DNA構築物。
  4. 【請求項4】 前記DNA構築物の発現を可能とするよ
    うに、請求の範囲第2項による組換えDNA構築物で安
    定的に形質転換された宿主細胞。
  5. 【請求項5】 前記細胞は原核細胞であることを特徴と
    する請求の範囲第4項に記載の宿主細胞。
  6. 【請求項6】 少なくとも1つの突然変異をさらに含む
    ことを特徴とする請求の範囲第1項に記載のDNA構築
    物。
  7. 【請求項7】 あるサブタイプのデングからの構造タン
    パク質と、異なるサブタイプのデングからの非構造タン
    パク質とを作動可能にコード化する核酸領域を有するゲ
    ノムをもち、前記ゲノムはさらに、プレメンブレンタン
    パク質、エンベロープタンパク質、またはNS1(1)
    タンパク質のグリコシル化を減少させる1つ又はそれ以
    上の突然変異、プレメンブレンタンパク質のメンブレン
    タンパク質への開裂を減少させる1つ又はそれ以上の突
    然変異、ポリタンパク質NS1−NS2A開裂部位のつ
    ぎの+1位置の部位である、グリシンをコード化する部
    位における1つ又はそれ以上の置換、3’非コード末端
    の最も3’寄りのヌクレオチドを第1番とした、ヌクレ
    オチド113番および384番までの間(113番およ
    び384番を含む)の少なくともヌクレオチド30個か
    らなる1つ又はそれ以上の欠失、NS1のC末端開裂部
    位における8個のアミノ酸の1つ又はそれ以上をコード
    化する配列における1つ又はそれ以上の突然変異からな
    る群から選択される当然変異を含むことを特徴とするキ
    メラウイルス。
  8. 【請求項8】 デング熱に対するワクチンにおいて、請
    求の範囲第7項の前記キメラウイルスと、薬学的に許容
    可能な担体とを含み、前記ワクチンは、デング熱ウイル
    スに対して脊椎動物に防御免疫反応を起こすことのでき
    ることを特徴とするワクチン。
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