JP4977811B2 - デング熱1、2、3および4型又は抗原性キメラデング熱ウイルス1、2、3および4の3’−utrにおいて30ヌクレオチド欠失を共通に含有するデング熱四価ワクチン - Google Patents
デング熱1、2、3および4型又は抗原性キメラデング熱ウイルス1、2、3および4の3’−utrにおいて30ヌクレオチド欠失を共通に含有するデング熱四価ワクチン Download PDFInfo
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Description
本発明は、1、2、3および4血清型デング熱ウイルス又は1、2、3および4血清型の抗原性キメラデング熱ウイルスのゲノムの3’非翻訳領域における共通30ヌクレオチド欠失(Δ30)を含有するデング熱ウイルス四価ワクチンに関する。
デング熱ウイルスは、フラビウイルス科フラビウイルス属に属する陽性センスRNAウイルスである。デング熱ウイルスは、世界の熱帯および亜熱帯地域全体に広範に分布し、媒介動物である蚊によりヒトに伝染する。デング熱ウイルスは、少なくとも8つの熱帯アジア諸国における小児の入院および死亡の主因である(WHO 1997 Dengue Haemorrhagic Fever: Diagnosis, Treatment, Prevention, and Control 2nd Edition, Geneva)。概算で年間5000万〜1億例のデング熱、ならびに500,000例のデング出血熱/デング熱ショック症候群(DHF/DSS)として既知のデング熱ウイルス感染のより重度の症例を引き起こす4つの血清型のデング熱ウイルス(DEN1、DEN2、DEN3およびDEN4)が存在する(Gubler, D.J. and Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53: 35-70)。この後者の疾患は、第1のデング熱ウイルス感染とは異なる血清型を有する第2のデング熱ウイルス感染を経験している小児および成人において、ならびに循環デング熱特異的母性抗体を未だ有する乳児の初感染において主に観察される(Burke, D.S. et al.
1988 Am J Trop Med Hyg 38: 172-180; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18: 997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56: 566-575)。デング熱ワクチンは、デング熱ウイルスにより引き起こされる疾患の症状を軽減するために必要とされるが、認可されたものはない。より重症な疾患と第2のデング熱ウイルス感染のためには、首尾よいワクチンが4つの血清型全てに対する免疫を同時に誘導しなければならない。免疫は主として、ビリオン構造タンパク質であるエンベロープ(E)糖タンパク質に対する中和抗体により媒介される。ある血清型による感染は、長期持続性ホモタイプ免疫および短期持続性へテロタイプ免疫を誘導する(Sabin, A. 1955 Am J Trop Med Hyg 4: 198-207)。したがって免疫感作の目標は、DEN1、DEN2、DEN3およびDEN4に対する長期持続性中和抗体応答を誘導することであり、これは生弱毒化ウイルスワクチンを用いることにより経済的に最良に達成され得る。世界の熱帯および亜熱帯地域に存在する別の蚊媒介性フラビウイルスである近縁の黄熱病ウイルスに対して生弱毒化ワクチンがすでに開発されているため、これは合理的な目標である(Monath, T.P. and Heinz, F.X. 1996 in: Fields Virology, Fields, D.M. et al. eds. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, pp. 961-1034)。
Infect Immun 31: 698-703; Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ
65: 189-195; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33: 684-698; Hoke, C.H.
Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43: 219-226; Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19: 3179-3188)により、又は化学的突然変異誘発(McKee, K.T. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36: 435-442)により開発されてきた。これらのアプローチを用いてデング熱ウイルスの4つの血清型の各々に関して弱毒化と免疫原性間の申し分ない平衡を達成し、さらに4つのデング熱ウイルスの各々が安全でかつ申し分ない免疫原性である四価ワクチンを処方することは非常に難しいことが判明した(Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19: 3179-3188; Bhamarapravati, N. and Sutee, Y. 2000 Vaccine 18: 44-47)。
1996 J Virol 70: 3930-3937)。DEN4ワクチン候補中に存在するこのΔ30突然変異がサルに対するその弱毒化の主要決定因子であるか否かを調べるために、さらなる研究が実行された。Δ30突然変異は実際にサルに対する弱毒化の主要決定因子であり、それはヒトに関する弱毒化と免疫原性間の申し分ない平衡を特定するということが判明した(Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13)。
3’−UTRからの30ヌクレオチドの除去により4型デング熱ウイルス(DEN4)において作製され、既に同定されているΔ30弱毒化突然変異は、1型デング熱ウイルス(DEN1)の野生型株も弱毒化し得る。Δ30突然変異を包含するDEN4の領域と相同である高度保存領域におけるDEN1 3’−UTRからの30ヌクレオチドの除去は、組換えウイルスDEN4Δ30と同様のレベルにアカゲザルに対する弱毒化組換えウイルスを産生した。これは、DEN4以外のデング熱ウイルス型へのΔ30突然変異の導入およびその弱毒化表現型を確立する。本研究により記載されたΔ30突然変異の有効な運搬能は、商品化可能な任意の血清型のデング熱ウイルスワクチンを弱毒化し、その安全性を改善するためのΔ30突然変異の有用性を確立する。各々Δ30突然変異により弱毒化された1、2、3および4型デング熱ウイルスを含有する四価デング熱ウイルスワクチンを、本発明者らは構想する。1、2および3型デング熱ウイルスの構造遺伝子がDEN4
Δ30の構造遺伝子を置換し、1、2および4型の構造遺伝子がDEN3Δ30の構造遺伝子を置換し、1,3および4型の構造遺伝子がDEN2Δ30の構造遺伝子を置換し、又は2、3および4型の構造遺伝子がDEN1Δ30の構造遺伝子を置換した組換え抗原性キメラウイルスを含有する四価デング熱ウイルスワクチンも本発明者らは構想する。いくつかの場合、このようなキメラデング熱ウイルスはΔ30突然変異によるだけでなく、それらのキメラ性によっても弱毒化される。各ウイルス構成成分におけるΔ30弱毒化突然変異の存在は、型間組換えによる野生型ウイルスへの逆戻りを妨げる。さらに欠失突然変異に固有な遺伝的安定性のため、Δ30突然変異は四価ワクチンの各構成成分間に共有される共通突然変異として用いるための優れた置換物の代表である。
序論
分子アプローチは、これにより、遺伝子的に安定な生育が弱化された四価デング熱ウイルスワクチンを開発するために用いられる。四価ワクチン、即ちDEN1、DEN2、DEN3およびDEN4の各構成成分は、弱毒化され、遺伝子的に安定であり、さらに免疫原性でなければならない。四価ワクチンは、4つのデング熱ウイルスの各々に対する同時防御を保証するために必要であり、それにより異型野生型デング熱ウイルスによる二次感染中のヒトにおいて起こるさらに重篤な疾病であるデング出血熱/デングショック症候群(DHF/DSS)を発症する可能性が排除される。デング熱ウイルスは自然界で遺伝子組換えを受け得るため(Worobey, M. et al. 1999 PNAS USA 96: 7352-7)、四価ワクチンは、弱毒化突然変異を欠くウイルスの生成を引き起こす可能性がある、4つのウイルス構成成分間の組換えを受けることが遺伝子的に不可能である必要がある。四価デング熱ウイルスワクチンを開発するための従来のアプローチは、別個の突然変異誘発性手法、例えば異種宿主由来の組織培養細胞における継代により4つのウイルス構成成分の各々を独立して得ることを基礎にしてきた。この戦略により、弱毒化ワクチン候補が得られた(Bhamarapravati, N. and Sutee, Y. 2000 Vaccine 18: 44-7)。しかしながら、これらの独立して得られた四価ワクチンの4つの構成成分間の遺伝子交換がワクチン接種者の体内で起こり、おそらくは有毒組換えウイルスが作製され得るという可能性がある。組換えから得られる有毒ポリオウイルスは、三価ポリオウイルスワクチンの投与後にワクチン接種者の体内で生成された(Guillot, S. et al. 2000 J Virol 74: 8434-43)。
成方法について記述する。これらの四価ワクチンは、ワクチンの各々の構成成分が同一Δ30弱毒欠失突然変異を保有するためにワクチン中に有毒野生型ウイルスを生成する可能性を排除する共通弱毒化突然変異を共有している点で独特である。さらに、rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3Δ30、rDEN4Δ30四価ワクチンは、Δ30突然変異の安定性と広範な抗原性とを組合わせた最初のワクチンである。Δ30欠失突然変異が各ウイルスの3’UTR中に存在するため、4つの構成成分ウイルスのタンパク質の全てが防御免疫応答を誘導するために利用可能である。したがって本方法は、各デング熱ウイルス血清型中に存在する構造および非構造タンパク質の全てに対する体液性および細胞性免疫応答を誘導する4つのウイルスのタンパク質各々の全能力を保った状態でDEN1、DEN2、DEN3およびDEN4ウイルスのタンパク質の各々を保持する弱毒化のメカニズムを提供する。
免疫原性デングキメラおよびデングキメラの調製方法が本明細書中で提供される。免疫原性デングキメラは、デング熱ウイルスによる感染を最小限にし、抑制し又は個体又は動物を免疫感作するための免疫原性組成物として薬学的に許容可能な担体中で、単独又は組合せて用いた場合に有用である。
イルスはDEN4である。別の実施形態では、構造タンパク質は第1の血清型のデング熱ウイルスのCタンパク質、第1の血清型のデング熱ウイルスのprMタンパク質、第1の血清型のデング熱ウイルスのEタンパク質又はそれらの任意の組合せであり得る。
1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
デング熱ウイルスは、蚊媒介性フラビウイルス病原体である。デング熱ウイルスゲノムは、5’非翻訳領域(5’UTR)、続いてのキャプシドタンパク質(C)コード領域、続いて前膜/膜タンパク質(prM)コード領域、続いてエンベロープタンパク質(E)コード領域、続いて非構造タンパク質(NS1−NS2A−NS2B−NS3−NS4A−NS4B−NS5)をコードする領域、最後に3’非翻訳領域(3’UTR)を含有す
る。ウイルス構造タンパク質はC、prMおよびEであり、非構造タンパク質はNS1〜NS5である。構造および非構造タンパク質は、単一ポリタンパク質として翻訳され、そして細胞質およびウイルスのプロテアーゼによりプロセシングを受ける。
本明細書中に記載されたデング熱ウイルスキメラは、免疫原性が所望される一血清型のデング熱ウイルスの少なくとも1つの構造タンパク質遺伝子を、当業者に既知の組換え工学処理技法を用いて、異なる血清型のデング熱ウイルスゲノムバックボーンに置換することにより、即ち一血清型のデング熱ウイルス遺伝子を除去し、そしてそれを異なる血清型のデング熱ウイルスの所望の対応する遺伝子で置き換えることにより産生され得る。又は、GenBankで提供される配列を用いて、デングタンパク質をコードする核酸分子が、既知
の核酸合成技法を用いて合成され、そして適切なベクター中に挿入され得る。したがって
弱毒化免疫原性ウイルスは、当業者に既知の組換え工学処理技法を用いて産生される。
好ましいキメラウイルスおよび核酸キメラは、免疫原性又はワクチンとして有用な生育減衰ウイルスを提供する。好ましい実施形態では、キメラは高免疫原性を示すが、一方、同時に危険な病原性又は致死作用を生じない。
本明細書中に記載されたウイルスキメラは、ヒト又は動物への免疫原性又はワクチンとしての投与のための薬学的に許容可能な担体又はビヒクルと、個別に又は一緒に組合わされる。「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能なビヒクル」という用語は、悪い生理学的応答を引き起こすことなく生きた動物又はヒト組織と接触して用いるのに適した、そして組成物の他の構成成分と好ましくない相互作用しない任意の組成物又は化合物、例えば水又は生理食塩水、ゲル、軟膏、溶媒、希釈剤、流体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセル等(これらに限定されない)を意味するために本明細書中で用いられる。
本明細書中に記載された免疫原性又はワクチン組成物は、ヒト、特にデング熱ウイルス感染が存在する地域に旅行する個体に、そしてそれらの地域の住人にも投与され得る。組成物の投与のための最適時間は、デング熱ウイルスへの初回接触の約1〜3ヶ月前である。しかしながら組成物は、疾患進行を改善するために初回感染後に、又は疾患を治療するために初回感染後にも投与され得る。
当業者に既知の種々のアジュバントが、本発明の免疫原性又はワクチン組成物中でキメラウイルスとともに投与され得る。このようなアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない:ポリマー、コポリマー、例えばポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、例えばブロックコポリマー、ポリマーp1005、フロイント完全アジュバント(動物用)、フロイント不完全アジュバント;モノオレイン酸ソルビタン、スクアレン、CRL−8300アジュバント、明礬、QS21、ムラミルジペプチド、CpGオリゴヌクレオチドモチーフおよびCpGオリゴヌクレオチドモチーフの組合せ、トレハロース、細菌抽出物、例えばマイコバクテリア抽出物、解毒化内毒素、膜脂質又はそれらの組合せ。
一血清型のデング熱ウイルスのおよび異なる血清型のデング熱ウイルスの核酸配列は、高感受性および特異性を有する試料又は検体中のデング熱ウイルスキメラの検出のための核酸プローブおよびプライマーを設計するために有用である。デング熱ウイルスに対応するプローブ又はプライマーは、ワクチンウイルスの存在を検出するために用いられ得る。核酸および対応するアミノ酸配列は、生物体および疾患を試験するための、そして疾患の療法及び治療を開発するための実験室ツールとして有用である。
989に記載されたような問題の配列と相補的な少なくとも5つのヌクレオチドを有するであろう単離核酸が、本明細書中で提供される。
5.0log10プラーク形成単位(PFU)の用量を摂取した20名のボランティアで、組換え生きた弱毒化デング熱−4ワクチン候補rDEN4Δ30の安全性を評価した(Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-413)。ワクチン候補は、ワクチンのすべてにおいて、安全で、十分な耐容性を示し、そして免疫原性であることが判明した。しかしながらワクチン接種者のうち5名はアラニンアミノトランスフェラーゼレベルの一過性上昇が表れ、3名は好中球減少が表れ、そして10名のワクチン接種者は無症候性斑状皮疹を発症し、このことは、このワクチン候補をさらに弱毒化することが必要であることを示唆する。
した(表1)。好中球減少は一過性で且つ軽症であった。ワクチン接種者の半数より多くが両用量で斑状皮疹を発症し、皮疹の発生率はワクチン接種用量と又はウイルス血症と相関しなかった(表1および表2)。ピーク力価もウイルス血症の開始も、3.0log10PFUおよび2.0log10PFU用量間で異なったが、しかしウイルス血症の両測定値は5.0log10PFUの用量に関するものよりこれらの用量の方が有意に低かった(表3)。ワクチン候補は、両用量でワクチン接種者の95%において免疫原性であり、中和抗体はワクチン接種後28日目と42日目との間に低下しなかった(表4)。HID50は未だ確定されなかったが、しかしそれは明らかに2.0log10PFU未満である。興味深いことに、ワクチンの用量の低減は、免疫原性、ウイルス血症、良性好中球減少又は皮疹発生率に一貫した作用を及ぼさなかった。したがって、投与したウイルスの用量を低減することによりrDEN4Δ30をさらに弱毒化することは必ずしも可能ではなく、その他のアプローチを開発する必要がある。
et al. 2002 Virology 300: 125-139; Blaney, J.E. et al. 2001 J. Virol. 75: 9731-9740)。Δ30欠失突然変異と組合せて、アカゲザルにおけるrDEN4Δ30の複製を
さらに制限するそれらの能力を評価するために、3つの突然変異が選択された。第一に、ベロおよびHuH−7細胞における温度感受性ならびに乳仔マウス脳における複製制限を付与するヌクレオチド4995でのNS3におけるミスセンス突然変異(Ser>Pro)を予めΔ30突然変異と組合せた(Blaney, J.E. et al. 2001 J. Virol. 75: 9731-9740)。その結果生じたウイルスrDEN4Δ30−4995は、野生型rDEN4ウイルスと比較した場合、rDEN4Δ30ウイルス(<5倍)より多くマウス脳複製において制限される(1,000倍)ことが判明した。第二に、これもベロおよびHuH−7細胞における温度感受性ならびに乳仔マウス脳における10,000倍複製制限を付与するヌクレオチド8092でのミスセンス突然変異(Glu>Gly)をここでΔ30突然変異と組合せた。第三に、ベロおよびHuH−7細胞における温度感受性、HuH−7細胞の小プラークサイズ化、ならびに乳仔マウス脳およびHuH−7細胞を移殖されたSCIDマウスにおける約1,000倍の複製制限を付与するヌクレオチド10634での3’UTRにおける置換をここでΔ30突然変異と組合せた(Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139)。
グされたため、予測どおり、0日目にDEN4に対して検出可能な中和抗体は見出されなかった(表7)。28日目に、rDEN4に感染したサルは、rDEN4Δ30ウイルスに感染したサル(1:181)より約2倍高い398という平均血清中和抗体力価(相互希釈)を有した。この結果ならびにrDEN4ウイルス感染サルにおけるウイルス血症の2倍高いレベルは、先に得られた結果と同様である(Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65: 405-413)。rDEN4Δ30−4995(1:78)、rDEN4Δ30−8092(1:61)およびrDEN4Δ30−10634(1:107)ウイルスに感染したサルは各々、rDEN4Δ30ウイルスに感染したサルと比較して、平均血清中和抗体力価低減を示した。検出可能なウイルス血症を有さなかった4匹のサルは、血清中和抗体力価を有したが、このことはそれらが実際に感染したことを示す。rDEN4Δ30ウイルスと比較した場合のrDEN4Δ30−10634ウイルスの平均ピークウイルス力価のわずかな増大にもかかわらず、rDEN4Δ30−10634ウイルスは、rDEN4Δ30ウイルスに感染したサルと比較してより低い平均血清中和抗体力価を有した。このことおよびより低い平均ウイルス血症日数/サルは、10634突然変異がサルにおけるrDEN4Δ30ウイルスの複製を弱毒化し得ることを示唆する。
び10634が、乳仔マウス脳、SCID−HuH−7マウスおよびアカゲザルにおけるrDEN4Δ30ワクチン候補をさらに弱毒化する、ということを示す。各修飾rDEN4Δ30ウイルス中に存在するさらなる偶発的突然変異(表4)のために、表現型を個々の4995、8092および10634点突然変異に直接的に帰することはできない。しかしながらこれらの3つの突然変異のうちの1つを保有する他のrDEN4ウイルスにおける同様のマウス弱毒化表現型の存在は、4995、8092および10634点突然変異が修飾rDEN4Δ30ウイルスのatt表現型に関与する、という主張を支持する。rDEN4Δ30−4995、rDEN4Δ30−8092およびrDEN4Δ30−10634ウイルスは防御的免疫を付与するのに十分な免疫原性を保持しながら、アカゲザルにおける複製低減を示したため、これらのウイルスはヒトのためのデング熱ワクチンとして意図される。
00−201、rDEN4−436−437[クローン2]、rDEN4Δ30−436−437)を、上記と同様にアカゲザルにおいて評価した。弱毒点突然変異を保有するウイルスの試験に関する場合と同様に、ウイルス血症が全てのサルにおいて感染後1日目に検出され、そして4日目に終結された(図4、表12)。ウイルス血症は感染したサルのほとんどにおいて検出された;rDEN4Δ30−200−201に感染した4匹のサルのうち1匹のみ、ならびにrDEN4Δ30−436−437に感染した4匹のサルのうちの1匹は、検出可能なウイルス血症を示さなかった。rDEN4に感染したサルは最高平均ピークウイルス力価を示した;そして各々の場合、Δ30突然変異を保有するウイルスはそれらの親ウイルスに比して平均ピークウイルス力価において約0.5logの低減を、ならびにウイルス血症平均日数/サルにおいて0.5〜2日の低減を示した。Δ30および荷電アミノ酸→アラニン突然変異を保有するウイルスに感染したサルは、rDEN4Δ30に感染したサルに比して平均ピークウイルス血症の2倍の低減を示した。これは、荷電アミノ酸→アラニン突然変異の付加がアカゲザルに関してrDEN4Δ30をさらに弱毒化する、ということを示唆する。
均ピークウイルス力価および3.0の平均ウイルス血症日数を有した(表13)。しかしながらrDEN4、rDEN4Δ30又は荷電アミノ酸→アラニン突然変異型ウイルスをあらかじめ接種したサルで、検出可能なウイルス血症を示したものはなかった。さらに血清中和抗体力価の4倍より大きい増大を示したサルもなかった。これらのデータはともに、Δ30および荷電アミノ酸→アラニン突然変異をともに保有するウイルスを含めたウイルスのいずれかによる感染がrDEN4による抗原誘発からアカゲザルを防御した、ということを示す。
7細胞において一連のts表現型を、ならびに乳仔マウス脳においてatt表現型を付与し、そしてSCID−HuH−7マウスにおいて弱毒化を増強し得るか又は変化しないままにしておく。これらの突然変異の付加は、中和抗体力価又は防御効力を低減することなく、アカゲザルにおいてrDEN4Δ30により生成されるウイルス血症を低減し得る、ということが最も重要である。したがってrDEN4Δ30へのこのような突然変異の付加は、ヒトにおいて弱毒化増強として意図される。さらにまた突然変異は、弱毒化の全体的レベルを変更しないが、しかしΔ30突然変異の非存在下でさえ突然変異がそれ自体で独立して弱毒化しているため、弱毒表現型を安定化するよう付加されるものとして意図される。構造遺伝子領域の外側で起こり、構造遺伝子キメラウイルスを弱毒化するために用いられ得るため、荷電アミノ酸→アラニン突然変異は特に有用である。さらにそれらは少なくとも3つのヌクレオチド変化を包含して、それらを野生型配列に戻る見込みがないようにする。
Δ30突然変異がDEN4血清型以外の野生型DENウイルスを十分に弱毒化し得るか否かを、先ず本発明者らは確定しようと試みた。これを実行するために、Δ30突然変異をDEN1に関するcDNA(Western Pacific)中に導入した。pRS424DEN1WP cDNAクローン(Puri, B. et al. 2000 Virus Genes 20: 57-63)をBamHIで切断(digest)し、これをPCRの鋳型とし、フォワードプライマー30(DEN1 nt10515〜10561および10592〜10607)およびM13リバースシーケンシングプライマー(DEN1ゲノム配列の3’末端を越えた101nt)とPfuポリメラーゼを用いたPCRを行った。その結果生じたPCR産物は292bpであり、Δ30突然変異を含有した。pRS424DEN1WP cDNAをApaIで部分的に切断し、次にSacIIで完全に切断して、ベクターをゲル単離し、PCR産物と混合し、それを用いて酵母YPH857株を形質転換して、トリプトファン欠乏プレート上で増殖させた(Polo, S. et al. 1997 J Virol 71: 5366-74)。PCRおよび制限酵素分析により、陽性酵母コロニーを確認した。2つの個々の酵母コロニーから単離したDNAを用いて、大腸菌(E.coli)STBL2株を形質転換した。RNA転写体を生成するのに適したプラスミドDNAを調製し、Δ30突然変異の存在を配列分析により立証した。
424DEN1WP cDNA由来)の複製、免疫原性および防御効力の評価を、以下のように実施した。上部肩領域の各側2箇所に1 ml用量中の5.0log10PFUのウイルスを分けてデング熱ウイルス血清陰性サルに皮下注射した。サルを毎日観察し、0〜10日目、ならびに28日目に血液を回収し、血清を−70℃で保存した。既に報告されているベロ細胞中でのプラーク検定により、血清試料中のウイルスの力価を確定した(Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13)。28日目血清試料に関するプラーク低減中和力価を既に報告されている方法で確定した(Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13)。5.0log10PFUの野生型rDEN1の単回投与を用いて28日目に全てのサルを抗原誘発し、血液を10日間回収した。ベロ細胞中でのプラーク検定により、抗原誘発後血清中のウイルス力価を確定した。全長野生型rDEN1を接種したサルは2〜3日間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価は2.1log10PFU/mlであり(表16)、rDEN1Δ30を接種したサルは1日未満の間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価は0.8log10PFU/mlであったが、このことは、Δ30突然変異がDEN1を弱毒化し得ることを示す。弱毒化ウイルスに関しては予測どおり、中和抗体力価により測定した場合の免疫応答は、野生型rDEN1を用いた接種と比較して、rDEN1Δ30の接種後の方が低かった(表16)が、依然として野生型DEN1ウイルス抗原誘発に対して動物を防御するには十分に高かった。野生型rDEN1ウイルスはウイルス抗原誘発後に回収したいかなる血清試料中にも検出されなかったが、このことは、全長野生型rDEN1又は組換えウイルスrDEN1Δ30による免疫感作後に、サルは完全に防御されたことを示す。Δ30突然変異により特定される弱毒化のレベルは、DEN1およびDEN4遺伝子のバックグラウンドの両方において比較可能であった(図5)。
スは6.0log10PFU/血清1mlより多く複製したが、一方、Δ30突然変異を有するrDEN4ウイルスの複製は約10分の1に低減された(Blaney, J.E.Jr. et al.
2002 Virology 300: 125-139)。rDEN1Δ30の複製を、SCID−HuH−7マウスにおいてwtrDEN1の複製と比較した(表17)。rDEN1Δ30は、そのwtrDEN1親の約100分の1のレベルに複製した。この結果は、DENウイルスの弱毒化株の評価のためのSCID−HuH−7マウスモデルの使用の正当性をさらに立証し、結果はアカゲザルで観察されたものと密接に相関する。
ることに成功した。その結果生じたウイルスrDEN1Δ30は、サルおよびSCID−HuH−7マウスにおいて組換えウイルスrDEN4Δ30と同様のレベルに弱毒化され、それにより異なるDENウイルスバックグラウンドにおいて、Δ30突然変異により特定される弱毒表現型の保存が確立されることが示された。近年の臨床試験におけるrDEN4Δ30の有望な結果に基づいて(Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:
405-13)、rDEN1Δ30はヒトにおいて適切に弱毒化される、と予測される。四価ワクチンを完成させるために、Δ30突然変異を保有する弱毒化rDEN2およびrDEN3組換えウイルスを調製することが考えられる。(下記の実施例3および4参照)。Δ30突然変異が別のDEN血清型に運搬可能である表現型を特定するという実証は、四価ワクチンの開発に関して重要な意味を有する。これは、Δ30突然変異がDEN2およびDEN3野生型ウイルスに対して対応する作用を有すると予測される、ということを示す。
rDEN1Δ30の評価は、それが十分に弱毒化される、ということを示した。この結果に基づいて、DEN2ワクチン候補の作製に本発明者らの技術を広げようと試みた。これを実行するために、Δ30突然変異をDEN2のcDNA中に導入した。トンガ王国における1974年のデング熱流行(トンガ/74)からのDEN2ウイルス単離物(Gubler, D.J. et al. 1978 Am J Trop Med Hyg 27: 581-589)を、wtDEN2を代表するものとして選択した。DEN2(トンガ/74)のゲノムを全部シーケンシングして、全長cDNAクローンの構築のためのコンセンサス配列として役立てた(付録1)。DEN2(トンガ/74)のcDNA断片を、図6Aに示したゲノムの逆転写により生成した。各断片をプラスミドベクター中にサブクローニングして、それがウイルスについて決定されたコンセンサス配列と一致することを確認するためにシーケンシングした。これは、ゲノムに広がる7つのクローン化cDNA断片を生じた。クローン化断片を以下のように修飾した:ゲノムの5’末端を示す断片XをSP6プロモーターに隣接させた;断片Lを、ゲノムヌクレオチド2353に翻訳的サイレントSpeI制限部位を含有するよう修飾した;断片Rを、これもゲノムヌクレオチド2353に翻訳的サイレントSpeI制限部位を含有するよう、最終的な全長クローンを安定化するよう修飾し、翻訳停止コドンがウイルスポリタンパク質を合成するために用いられたもの以外の全てのリーディングフレーム中に存在することを保証するように、ヌクレオチド2362〜2364および2397の2つのさらなる翻訳的サイレント突然変異を作製した。;断片Aのヌクレオチド3582の天然SpeI制限部位を除去するよう、そしてヌクレオチド4497の天然KpnI制限部位を除去するよう修飾した;断片Cを、ヌクレオチド9374の天然KpnI制限部位を除去するよう修飾した;そしてゲノムの3’末端を表す断片YをKpnI制限部位に隣接させた。各断片を、DEN4 cDNAクローンp4のAscIおよびKpnI制限部位間に増分的に付加して(Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13)、rDEN4およびrDEN4Δ30を生成するために首尾よく用いられた同一ベクターバックグラウンドで全長DEN2 cDNAクローン(p2)を生成した。cDNAクローンp2をシーケンシングして、ウイルスゲノム領域が、上記の翻訳的サイレント修飾を除いて、DEN2(トンガ/74)コンセンサス配列と一致することを確証した。Δ30突然変異を断片Y中に導入して、断片YΔ30を生成した。p2Δ30を作製するために、p2の断片Y領域を断片YΔ30で置換した(図6A、B)。
入し、7日目に細胞培養上清を回収した。
トランスフェクション回収物を継代接種して、最終的にベロ細胞中で希釈して、ウイルスのゲノム配列を確定した。rDEN2ウイルスのベロ細胞トランスフェクション回収物を最終的にベロ細胞中で1回希釈し、そして個々のウイルスクローンをベロ細胞中で1回継代した。rDEN4 NS4B 7100〜7200領域で同定された任意の相同ベロ細胞適応突然変異がこれらのウイルスクローン中に存在するか否かを査定するために、7つの個々の最終希釈クローンをこの領域全体でシーケンシングした。7つのrDEN2ウイルスの各々は、ヌクレオチド7169にこの領域における単一ヌクレオチド置換(U>C)を含有して、Val>Alaアミノ酸変化を生じた。このヌクレオチドはrDEN4で同定された7162突然変異に対応し(Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139)、これは、既知のベロ細胞適応表現型を有するが、このことは、この突然変異がrDEN2ウイルスにおいて複製増強表現型を付与し得る、ということを示唆する。1つのrDEN2ウイルスクローンを完全にシーケンシングして、7169突然変異のほかに、ミスセンス突然変異(Glu>Ala)を残基3051のNS5に見出した(表20)。
チド7169での同一突然変異を獲得したため、この突然変異はベロ細胞におけるrDEN2およびrDEN2Δ30の増殖適応と関連すると推論された。7169突然変異はベロ細胞中で直接rDEN2Δ30を回収させ得る、と予測して、該突然変異をrDEN2Δ 30 cDNAプラスミド中に導入して、p2Δ30−7169を作製した。p2Δ30−7169、ならびにp2およびp2Δ30から合成された転写体を、上記のようにリポソーム媒介性トランスフェクションを用いてベロ細胞又はC6/36蚊細胞中に導入した。ウイルスrDEN2Δ30−7169を、ベロおよびC6/36細胞の両方においてp2Δ30−7169cDNAから回収したが、一方、rDEN2Δ30は、C6/36細胞のみにおいてp2Δ30 cDNAクローンから回収した(表21)。7169突然変異は、ベロ細胞中のrDEN2Δ30の回収のために必要且つ十分である。
ルスの複製をSCID−HuH−7マウスにおいて評価した。既に、SCID−HuH−7マウスにおけるワクチン候補の弱毒化は感染のアカゲザルモデルにおける弱毒化の予測に役立つことが実証されている(実施例1および2)。この実験で試験した組換えウイルスをC6/36細胞中で回収した。DEN2トンガ/74ウイルス単離物、rDEN2、ならびに2つの別個のp2Δ30 cDNAクローンから得た2つの別個のrDEN2Δ30ウイルス(クローン20Aおよび21A)をC6/36細胞中で2回最終希釈した後、C6/36細胞中でワーキングストックを生成した。これらのウイルスは、いかなるベロ細胞適応突然変異も含有すべきでない。DEN2トンガ/74ウイルスはSCID−HuH−7マウスの血清中で6.2log10PFU/mlの平均ウイルス力価に複製し、そしてrDEN2ウイルスは類似レベルの5.6log10PFU/mlに複製した(表22)。両rDEN2Δ30ウイルスは、rDEN2ウイルスと比較して複製に際して100倍以上制限された。これらの結果は、Δ30突然変異が、rDEN4およびrDEN1ウイルスに関して観察されたものと同様に、rDEN2ウイルスの複製に及ぼす弱毒化作用を有する、ということを示す。
20、脚注bおよびd参照)。rDEN2およびrDEN2Δ30はともに、ベロ細胞適応突然変異としてrDEN4で同定された7162突然変異に対応する、ヌクレオチド7169のNS4Bにおける突然変異を獲得していた。7169突然変異の存在下では、Δ30突然変異はrDEN2Δ30の複製を1.0log10PFU/ml低減した(表23)。前に、C6/36細胞中で増殖させた、7169突然変異を欠くウイルスを用いた場合には、Δ30突然変異はrDEN2Δ30の複製を約2.5log10PFU/ml低減させることが示された(表22)。これらの結果は、DEN2におけるベロ細胞増殖適応はまた、HuH−7肝細胞におけるわずかの増殖利点を付与し得る、ということを示す。それにもかかわらず、Δ30突然変異により付与された弱毒化はこれらのベロ細胞増殖適応化ウイルスでは依然として認められる。
免疫原性および防御効力の評価を、以下のように実施した。上部肩領域の各側2箇所に1
ml用量中の5.0log10PFUのウイルスを分けてデング熱ウイルス血清陰性サルに皮下注射した。サルを毎日観察し、0〜10日目、ならびに28日目に血液を回収し、血清を−70℃で保存した。本実施例で用いられるウイルスはベロ細胞で継代し、組換えウイルスは表20に示す突然変異を含有した(脚注bおよびd参照)。既に知られているベロ細胞中でのプラーク検定により、血清試料中のウイルスの力価を確定した(Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13)。28日目血清試料に関するプラーク低減中和力価を既に報告されている方法で確定した(Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13)。5.0log10PFUのwtDEN2(トンガ/74)の単回投与を用いて28日目に全てのサルを抗原誘発し、血液を10日間回収した。ベロ細胞中でのプラーク検定により、抗原誘発後血清中のウイルス力価を確定した。wtDEN2(トンガ/74)又はrDEN2を接種したサルは4〜5日間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価はそれぞれ2.1又は1.9log10PFU/mlであった。
DEN2およびrDEN2Δ30の感染性を、実施例5に詳述した方法を用いて評価した。しかしながら摂取された3.3〜3.5log10pfuの用量では、これら3つのウイルスはいかなる蚊にも感染せず、このことは、DEN2(トンガ/74)がネッタイシマカに対して貧感染性であることを示す。rDEN1を用いた場合と同様に、感染性のこの欠如に関する遺伝的基礎は未だ明らかにされていない。蚊の中腸に関する限定感染性という重要な特性は、それがワクチン接種者から媒介動物である蚊へのウイルスの伝達を大いに制限するのに役立つため、ワクチン候補においては非常に望ましい。
rDEN1Δ30が十分に弱毒化されたため、DEN3ワクチン候補の作製に本発明者らの技術を広げようと試みた。これを実行するために、rDEN2Δ30を作製するために用いた方法と同様に、DEN3のcDNA中にΔ30突然変異を導入した。田園地帯であるスレマン(中央インドネシア)における1978年のデング熱流行からのDEN3ウイルス単離物(スレマン/78)(Gubler, D.J. et al. 1981 Am J Trop Med Hyg 30: 1094-1099)を、wtDEN3を代表するものとして選択した。DEN3(スレマン/78)のゲノムを全部シーケンシングして、全長cDNAクローンの構築のためのコンセンサス配列として役立てた(付録2)。DEN3(スレマン/78)のcDNA断片を図8Aに示したゲノムの逆転写により生成した。各断片をプラスミドベクター中にサブクローニングして、シーケンシングし、ウイルスにおいて確定されているコンセンサス配列と一致するかを確かめた。これは、ゲノムに広がる6つのクローン化cDNA断片を生じた。クローン化断片を以下のように修飾した:ゲノムの5’末端を示す断片5を、AscI制限部位の後のSP6プロモーターに隣接させた;断片1Lを、ゲノムヌクレオチド2345に翻訳的サイレントSpeI制限部位を含有するよう修飾した;断片1Rを、これもゲノムヌクレオチド2345に翻訳的サイレントSpeI制限部位を含有するよう、そして最終的な全長クローンを安定化するよう修飾し、ヌクレオチド2354〜2356、2360〜2362および2399の3つのさらなる翻訳的サイレント突然変異を作製して、翻訳停止コドンがウイルスポリタンパク質を合成するために用いられたもの以外の全てのリーディングフレーム中に存在する、ということを保証した;断片3を、ヌクレオチド9007の天然KpnI制限部位を除去するよう修飾した;そしてゲノムの3’末端を表す断片4をKpnI制限部位に隣接させた。各断片を、DEN4 cDNAクローンp4のAscIおよびKpnI制限部位間に増分的に付加して(Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13)、rDEN4およびrDEN2を生成するために首尾よく用いられた同一ベクターバックグラウンドで全長DEN3 cDNAクローンを生成した。しかしながら断片1Lおよび1Rが同一cDNA分子に導入された場合、安定な全長クローンは大腸菌中で回収され得なかった。この不安定性を克服するために、正および逆オープンリーディングフレームの各々に重複した終止コドンを含有する合成DNAリンカー(図8A)を、断片1Lが付加されて全長cDNA構築物が完成するのと同時にSpeI制限部位に導入した。リンカー配列を含有するその結果生じたp3クローンは大腸菌中で安定であったが、これは、リンカー配列がこの領域に存在する有害要素を全て妨げるのに十分であった、ということを示す。cDNAクローンp3をシーケンシングすると、ウイルスゲノムは、上記のリンカー配列および翻訳的サイレント修飾(付録2−除去されたリンカー配列とともに示される)を除いて、DEN3(スレマン/78)コンセンサス配列と一致することが判明した。Δ30突然変異を断片4中に導入して、断片4Δ30を生成し
た。p3Δ30を作製するために、p3の断片4領域を断片4Δ30で置換した(図8A、B)。
けるウイルス収率を改良するために、ヌクレオチド7162でrDEN4で前に同定されたベロ細胞適応突然変異をp3およびp3Δ30の相同NS4B領域に導入して、p3−7164およびp3Δ30−7164を作製した。この突然変異は、アミノ酸2357位でのValからAlaへの置換を生じる。rDEN2Δ30に関して実証されたように、この突然変異は、ベロ細胞中でのウイルスの直接回収を可能にし(表27)、そしてrDEN3Δ30に関して同一作用を有すると予測される。
クチン候補中の弱毒化突然変異は、低安定性点突然変異を基礎にしている(Butrapet, S.
et al. 2000 J Virol 74: 3011-9; Puri, B. et al. 1997 J Gen Virol 78: 2287-91)。第三に、Δ30突然変異は四価ワクチンの4つのウイルスの各々に共通であるため、4つのワクチン血清型のいずれかの間の組換えは弱毒化突然変異の損失又は野生型表現型への復帰変異を引き起こさない。三価ポリオワクチンの構成成分間の組換えが観察されており(Guillot, S. et al. 2000 J Virol 74: 8434-43)、天然組換えデング熱ウイルスが記載されている(Worobey, M. et al. 1999 PNAS USA 96: 7352-7)が、これらは、2つの異なるウイルス間の遺伝子要素を交換するこのフラビウイルスの能力を示す。明らかに遺伝子交換は、組換えcDNA技術を用いて異なるDENウイルス血清型間で容易に達成される(Bray, M. and Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88: 10342-6)。第四に、野生型構造タンパク質を有するウイルスは変更された構造タンパク質を有するウイルスより感染性であると思われる(Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74: 3020-80)。これは、最終ワクチン中の4つのウイルス構成成分の各々の少量の使用を可能にし、低コスト製造に寄与する。低コスト製造は、デング熱ウイルスワクチンの最終的有用性を明示するに際しての不可欠な要素である。
ウイルスの構造タンパク質により誘導される抗体応答、主にエンベロープ(E)タンパク質に対する中和抗体応答により、デング熱ウイルスの4つの血清型を明らかにする。これらの構造タンパク質としては、E糖タンパク質、膜タンパク質(M)およびキャプシド(C)タンパク質が挙げられる。成熟ウイルス粒子は、脂質二分子膜を取り囲む十分に組織化された外部タンパク質殻、ならびに十分明らかにされていない内部ヌクレオキャプシドコアから成る(Kuhn, R.J. et al. 2002 Cell 108: 717-25)。E糖タンパク質は主要防御抗原であり、デング熱ウイルス感染に対する防御を付与するウイルス中和抗体を容易に誘導する。したがって有効なデング熱ワクチンは、4つの血清型、即ちDEN1、DEN2、DEN3およびDEN4全てのEタンパク質を最小限含有しなければならず、それにより広範な免疫を誘導して、ヘテロ型野生型デング熱ウイルスによる二次感染中にヒトにおいて起こるより重篤な疾病であるDHF/DSSの発症の可能性を排除する。前に報告された戦略(Bray, M. and Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88: 10342-6)を基礎にして、組換えcDNA技術を用いて、各血清型の構造タンパク質を保有する一組の型間キメラデング熱ウイルスから成る生弱毒化四価デング熱ウイルスワクチンを開発する。
Trop Med Hyg 65: 405-13)において、鋳型として用いた。リポソーム媒介性トランスフェクションを用いてベロ細胞中に転写体を導入し、組換えデング熱ウイルスを7日目に回収した。その結果生じたウイルスのゲノムを、既に報告されている回収ウイルスから単離したウイルスRNAの配列を分析する方法により確証した(Durbin, A.P et al. 2001 Am
J Trop Med Hyg 65: 405-13)。組織培養中でのウイルス継代から生じた偶発的突然変異を全てのウイルスにおいて同定し、表29に列挙する。注目すべきことに、各ウイルスが前に同定されたrDEN4の突然変異に対応するNS4Bにおけるミスセンス突然変異を含有し、これは、ベロ細胞中での複製への適応性に関連していた(rDEN4およびキメラウイルス間のヌクレオチド位置の相関に関しては表30参照)。ウイルスは全て、ベロ細胞中で6.0log10PFU/mlを超える力価に複製したが、このことは、キメラウイルスが、Δ30突然変異を含有するものでさえ、細胞培養中で効率的に複製することを示し、これはワクチンの製造に不可欠な特性である。
2を接種したサルは、約5日間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価は2.1log10PFU/mlであったが、一方、キメラDEN2ウイルスのいずれかを接種したサルは1.2日又はそれ以下の間ウイルス血症を示し、1.0log10PFU/ml未満の平均ピーク力価を有した。ウイルス血症の大きさおよび持続時間のこの低減は、DEN2のCME又はMEタンパク質を含有するキメラウイルスが親DEN2 NGCウイルスより弱毒化された、ということを明らかに示す。野生型DEN2を摂取した動物も、DEN2/4キメラウイルスを摂取した動物も病気にならなかった。サルにおける弱毒化ウイルスの複製低減に伴って、接種サルの免疫応答の低下が起こる。これは、表31に示されており、野生型ウイルスを接種した動物において達成された力価と比較した場合に、キメラウイルスによる接種後に中和抗体のレベルが約5分の1に低減した。CMEキメラウイルスへのΔ30突然変異の付加はウイルスをさらに弱毒化し、したがってrDEN2/4Δ30(CME)はサルにおいて検出可能レベルに複製せず、検出可能免疫応答を誘導しなかった。このウイルスは過剰弱毒化されたと思われ、そして同様の結果がヒトで観察された場合は、このウイルスはワクチンとして用いるのに適していない。しかしながらMEキメラウイルスへのΔ30突然変異の付加は、このキメラウイルスをさらに弱毒化せず、その結果生じたrDEN2/4Δ30(ME)ウイルスは、ワクチンとして用いるために十分に弱毒化され、免疫原性であると思われる。
ウイルス弱毒化の評価のための感受性モデルである。各キメラDEN2/4ウイルスをSCID−HuH−7マウスの群に接種し、血清中のウイルスのレベルを測定した(表32)。キメラウイルスは、親ウイルス(rDEN4およびDEN2−NGC)よりも20〜150倍低いレベルに複製した。CMEキメラウイルスは、相当するMEキメラウイルスよりわずかに弱毒化され、Δ30突然変異は0.5log10の複製低減を示した。Δ30突然変異により発揮された弱毒化のこのレベルは、rDEN4Δ30に関して前に観察されたものと同様であった。
異なる属を実験的に感染させた。ウイルス含有乾燥血液を摂取させることにより、ネッタイシマカを感染させた。中腸および頭部組織の両方におけるウイルス抗原の存在を評価することにより、局所組織(中腸)に関して感染性を確定し、そして中腸バリアを超えた組織(頭部)中で播種し、複製するウイルスの能力も測定することができた。頭部中のウイルスの存在は、中腸中で複製し、次に頭部の唾液腺に播種する摂取ウイルスの能力、ならびに唾液腺中で複製するウイルスの生得能力により限定される。トキソリンキテススプレンデンス(Toxothynchites splendens)中へのウイルスの胸腔内接種は、蚊の中腸バリアを迂回する。親ウイルスrDEN4およびDEN2−NGCはネッタイシマカおよびトキソリンキテススプレンデンス(T. splendens)に容易に感染し(表33)、DEN2−NGCはT. splendensにおいてより感染性であると思われた。rDEN2/4キメラウイルスも各々、両方の蚊の型で試験した。多くの場合、いくつかのウイルスの非常に低い感染性のために、検出可能な感染を達成するのに十分な力価で非希釈ウイルスストックをネッタイシマカに接種することはできなかった。それにもかかわらず、rDEN2/4キメラウイルスが中腸および頭部に関して低感染性である、ということは明らかである。約4.0log10PFUの最大用量で投与される親ウイルスrDEN4およびDEN2−NGCは、それぞれ中腸標本の74%および94%、そして頭部標本の32%および71%で検出可能であった。キメラウイルス間で、rDEN2/4Δ30(CME)に関して観察されるように、最高レベルの感染性は、26%の感染中腸試料および6%頭部試料のみを生じた。より許容的なトキソリンキテススプレンデンスでは、rDEN2/4キメラウイルスは一般に親ウイルスより低感染性で、CMEキメラウイルスはMEウイルスより低感染性であった。Δ30突然変異は、rDEN2/4キメラウイルスに関して、既に観察されたもの(Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 414-419)と同様のトキソリンキテススプレンデンスにおけるウイルス感染性に及ぼす識別可能な作用を有さない、ということがDEN4に関して報告されている。
)を生じた。ベロ細胞中でのDENワクチン候補のウイルス収率増大の一手段としてのベロ細胞適応突然変異を評価するために(Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139)、選定突然変異をこのキメラウイルス中に導入した。したがって適応突然変異を保有するrDEN2/4Δ30(CME)ウイルスを回収し、最終希釈して、ベロ細胞中のウイルス収率が増大され得るか否かを測定するためにC6/36細胞中で増殖させた。
異を保有するCMEキメラウイルスはアカゲザルにおいて過剰弱毒化され、ヒトでは限定免疫原性を提供するに過ぎない可能性があるため、MEキメラウイルスのみが利用され得る、ということを示す。
インドネシアのスレマン地域での1978年のデング熱流行からのウイルス単離物であるDEN3(スレマン/78)由来の対応する遺伝子で、CME又はME遺伝子が置換されたDEN4 cDNAに基づいたキメラウイルスが生成されている(Gubler, D.J. et al. 1981 Am J Trop Med Hyg 30: 1094-1099)(付録2)。DEN2キメラウイルスに関して実施例5に記載したように、rDEN4又はrDEN4Δ30に関するcDNAのBglII/XhoI領域をDEN3(スレマン/78)由来の同様の領域で置き換えることにより、DEN3に関するCMEキメラウイルスを生成した(図11A)。同様に、MEキメラウイルスを作製するために、rDEN4又はrDEN4Δ30のいずれかに関するcDNAのPstI/XhoI領域をDEN3(スレマン/78)由来の同様の領域で置き換えた。その結果生じた接合部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図11Bに示す。その結果生じたウイルスのゲノムを、既に報告されている方法(Durbin, A.P et al.
2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13)で、回収したウイルスから単離されたウイルスRNAの配列分析により決定した。組織培養中でのウイルス継代から生じた偶発的突然変異を全てのウイルスにおいて同定し、表34に列挙する。注目すべきことに、各ウイルスがrDEN4からの前に同定された突然変異に対応するNS4Bにおけるミスセンス突然変異を含有し、そしてベロ細胞中での増殖の適応性と関係していた(rDEN4およびキメラウイルス間のヌクレオチド位置の相関に関しては表30参照)。ウイルスは全て、ベロ細胞中で5.7log10PFU/mlを超える力価に複製したが、このことは、キメラウイルスが、Δ30突然変異を含有するものでさえ、細胞培養中で効率的に複製することを示し、これはワクチンの製造に不可欠な特性である。
ウイルス弱毒化の評価のための感受性モデルである。各キメラDEN3/4ウイルスをSCID−HuH−7マウスの群に接種し、血清中のウイルスのレベルを確定した(表35)。キメラウイルスrDEN3/4(CME)は弱毒化されなかったが、一方、残りのキメラウイルスは、親ウイルス(rDEN4およびDEN3−スレマン/78)のいずれよりも40〜400倍低いレベルに複製した。CMEキメラウイルスでは、Δ30突然変異は顕著な複製の2.7log10低減を示した。Δ30突然変異により付与された弱毒化のこのレベルは、rDEN4Δ30に関して前に観察されたものよりずっと大きかった。rDEN3/4(ME)ウイルスはいずれの親ウイルスに比しても複製が100分の1に低減したが、このことは、MEキメラ化がそれ自体弱毒性であったことを示す。rDEN3/4(ME)へのΔ30突然変異の付加は、さらなる弱毒化を生じなかった。
び免疫原性の評価を、実施例5に記載したように実施した。サルにおけるこの安全性および免疫原性試験の結果を表36に示す。rDEN3/4(CME)および野生型DEN(スレマン/78)を接種したサルは、それぞれ約2日間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価は1.6〜1.8log10PFU/mlであったが、このことは、DEN3のCME構造遺伝子のキメラ化が、DEN2キメラ化に関して観察されたものとは異なるパターンであるウイルス複製の弱毒化をもたらさなかった、ということを示す(表31)。しかしながらME構造遺伝子のキメラ化はサルにおける検出不可能なウイルス血症を伴う弱毒化ウイルスを生じたが、しかし全てのサルが抗体陽転(seroconvert)し、血清抗体レベルは10倍以上増大した。弱毒化ウイルスに関して予測されるように、免疫応答は、中和抗体力価により測定した場合、wtDEN3(スレマン78)による接種と比較してキメラウイルスのいずれかでの接種後により低かったが、wtDEN3ウイルス抗原誘発に対して動物を防御するには依然として十分に高かった(表37)。rDEN3/4(CME)へのΔ30突然変異の付加が、結果的に生じるウイルスrDEN3/4Δ30(CME)をさらに弱毒化し得たことは明らかである。
有乾燥血液を摂取させることにより、ネッタイシマカを感染させた(表38)。親ウイルスrDEN4およびDEN3(スレマン/78)はネッタイシマカに容易に感染した。各々のrDEN3/4キメラウイルスも試験した。多くの場合、いくつかのウイルスの非常に低い感染性のために、検出可能な感染を達成するのに十分な力価の非希釈ウイルスストックでネッタイシマカを感染させることはできなかった。約2.8〜2.9log10PFUの用量では、rDEN4、DEN3(スレマン/78)およびrDEN3/4(CME)は等しく感染性であり、そして等しい効率で頭部に播種された。残りのキメラウイルスに関しては、感染は3.4log10PFUの用量でも検出可能でなかったが、このことは、rDEN3/4(ME)およびrDEN3/4Δ30(CME)の複製がネッタイシマカにおいて制限されることを示す。rDEN3/4(CME)およびrDEN3/4Δ30(CME)の感染性を比較することにより、Δ30突然変異が蚊に関してキメラウイルスをさらに弱毒化し得る、ということは明らかである。
プエルトリコでの1994年のデング熱流行からのウイルス単離物であるDEN1(プエルトリコ/94)由来の対応する遺伝子で、CME又はME遺伝子が置換されたDEN4 cDNAに基づいたキメラウイルスが生成されている(付録3および4)。DEN2キメラウイルスに関して実施例4に記載したように、rDEN4又はrDEN4Δ30のいずれかに関するcDNAのBglII/XhoI領域をDEN1(プエルトリコ/94)由来の同様の領域で置き換えることにより、DEN1に関するCMEキメラウイルスを生成した(図12A)。同様に、MEキメラウイルスを作製するために、rDEN4又はrDEN4Δ30のいずれかにおけるcDNAのPstI/XhoI領域をDEN1(プエルトリコ/94)由来の同様の領域で置き換えた。その結果生じた接合部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図12Bに示す。
ウイルス弱毒化の評価のための感受性モデルである。各キメラDEN1/4ウイルスをSCID−HuH−7マウスの群に接種し、血清中のウイルスのレベルを確定した(表40)。キメラウイルスは、親ウイルス、rDEN4およびDEN1(プエルトリコ/94)のいずれよりも15〜250倍低いレベルに複製した。CMEキメラウイルスは相当するMEキメラウイルスより多く弱毒化され、Δ30突然変異は0.8log10の複製の低減を示した。CMEキメラウイルスにおいてΔ30突然変異により発現したこの弱毒化のレベルは、rDEN4Δ30に関して前に観察されたものと同様であった。しかしながらMEキメラウイルスにおけるΔ30突然変異の弱毒作用は識別不可能である。
せずに形態および詳細における種々の変更がなされ得る、と当業者は認識する。上記で言及した図、表、付録、特許、特許出願および出版物は全て、参照により本明細書中で援用される。
Claims (40)
- a)血清型が1型であるデング熱ウイルスに対して免疫原性である第1の弱毒化ウイルス、
b)血清型が2型であるデング熱ウイルスに対して免疫原性である第2の弱毒化ウイルス、
c)血清型が3型であるデング熱ウイルスに対して免疫原性である第3の弱毒化ウイルス、および
d)血清型が4型であるデング熱ウイルスに対して免疫原性である第4の弱毒化ウイルスを含む、四価の免疫原性組成物であって、
a)、b)、c)、およびd)の各々は、
i)第1のデング熱ウイルスからの構造タンパク質Eを少なくともコードする第1のヌクレオチド、
ii)第1のデング熱ウイルスまたは第2のデング熱ウイルスからの非構造タンパク質をコードする第2のヌクレオチド、および
iii)TL2ステム−ループ構造に対応する30ヌクレオチドの欠失を含む3’非翻訳領域
を含む核酸によってコードされる弱毒化ウイルスからなり、
iii)3’非翻訳領域およびii)非構造タンパク質をコードする第2のヌクレオチドは共に、第1のデング熱ウイルスまたは第2のデング熱ウイルスのいずれかに由来し、
a)〜d)に規定される弱毒化ウイルスにおいて、iii)に規定される欠失は、デング熱1型、2型または4型ゲノムの3’非翻訳領域からの30ヌクレオチドの欠失であり、a)〜d)に規定される弱毒化ウイルスの少なくとも1つにおいて、iii)に規定される欠失は、ヌクレオチド10562〜10591間または10541〜10570間のTL2ステム−ループ構造にそれぞれ対応する、デング熱1型または2型ゲノムの3’非翻訳領域からの30ヌクレオチドの欠失である、免疫原性組成物。 - 前記弱毒化ウイルスが、ベロ細胞又はヒト肝細胞株HuH−7における温度感受性、蚊細胞又はヒト肝細胞株HuH−7における宿主細胞制限、ベロ細胞における複製改善のための宿主細胞適応、又はマウス又はサルにおける弱毒化のいずれかの表現型を有する突然変異体を産生する突然変異をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- 前記a)、b)およびd)に規定される弱毒化ウイルスの少なくとも1つにおいて、前記第1のデング熱ウイルスの血清型が前記第2のデング熱ウイルスの血清型と同じである請求項1又は2記載の組成物。
- 前記a)に規定される弱毒化ウイルスにおいて、前記第2のデング熱ウイルスの血清型が1型である請求項3記載の組成物。
- 前記欠失がヌクレオチド10562〜10591間のTL2ステム−ループ構造に対応する前記デング熱1型ゲノムの3'非翻訳領域からの30ヌクレオチドの欠失である請求項
4記載の組成物。 - 前記b)に規定される弱毒化ウイルスにおいて、前記第2のデング熱ウイルスの血清型が2型である請求項3記載の組成物。
- 前記欠失がヌクレオチド10541〜10570間のTL2ステム−ループ構造に対応する前記デング熱2型ゲノムの3'非翻訳領域からの30ヌクレオチドの欠失である請求項
6記載の組成物。 - 前記d)に規定される弱毒化ウイルスにおいて、前記第2のデング熱ウイルスの血清型が4型である請求項3記載の組成物。
- 前記欠失がヌクレオチド10478〜10507間のTL2ステム−ループ構造に対応する前記デング熱4型ゲノムの3'非翻訳領域からの30ヌクレオチドの欠失である請求項
8記載の組成物。 - 前記a)〜d)に規定される弱毒化ウイルスの少なくとも1つにおいて、前記第1のデング熱ウイルスの血清型が前記第2のデング熱ウイルスの血清型と異なり、そして該弱毒化ウイルスがキメラウイルスである請求項1又は2記載の組成物。
- 前記欠失を有する前記第2のデング熱ウイルスの血清型が1型である請求項10記載の組成物。
- 前記第1のデング熱ウイルスの血清型が2型である請求項11記載の組成物。
- 前記第1のデング熱ウイルスの血清型が3型である請求項11記載の組成物。
- 前記第1のデング熱ウイルスの血清型が4型である請求項11記載の組成物。
- 前記第1のヌクレオチド配列が前記第1のデング熱ウイルスの少なくとも2つの構造タンパク質をコードする請求項11〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記構造タンパク質がprMおよびEタンパク質である請求項15記載の組成物。
- 前記欠失がヌクレオチド10562〜10591間のTL2ステム−ループ構造に対応する前記デング熱1型ゲノムの3'非翻訳領域からの30ヌクレオチドの欠失である請求項
11〜16のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記欠失を有する前記第2のデング熱ウイルスの血清型が2型である請求項10記載の組成物。
- 前記第1のデング熱ウイルスの血清型が1型である請求項18記載の組成物。
- 前記第1のデング熱ウイルスの血清型が3型である請求項18記載の組成物。
- 前記第1のデング熱ウイルスの血清型が4型である請求項18記載の組成物。
- 前記第1のヌクレオチド配列が前記第1のデング熱ウイルスの少なくとも2つの構造タンパク質をコードする請求項18〜21のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記構造タンパク質がprMおよびEタンパク質である請求項22記載の組成物。
- 前記欠失がヌクレオチド10541〜10570間のTL2ステム−ループ構造に対応する前記デング熱2型ゲノムの3'非翻訳領域からの30ヌクレオチドの欠失である請求項
18〜23のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記欠失を有する第2のデング熱ウイルスの血清型が4型である請求項10記載の組成物。
- 前記第1のデング熱ウイルスの血清型が1型である請求項25記載の組成物。
- 前記第1のデング熱ウイルスの血清型が2型である請求項25記載の組成物。
- 前記第1のデング熱ウイルスの血清型が3型である請求項25記載の組成物。
- 前記第1のヌクレオチド配列が前記第1のデング熱ウイルスの少なくとも2つの構造タンパク質をコードする請求項25〜28のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記構造タンパク質がprMおよびEタンパク質である請求項29記載の組成物。
- 前記欠失がヌクレオチド10478〜10507間のTL2ステム−ループ構造に対応する前記デング熱4型ゲノムの3'非翻訳領域からの30ヌクレオチドの欠失である請求項
25〜30のいずれか1項に記載の組成物。 - 免疫応答の誘導に用いるための請求項1〜31のいずれか1項に記載の組成物。
- 被験者において免疫応答を誘導するための、請求項1〜31のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記被験者がヒトである請求項33記載の組成物。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載の組成物を含む四価ワクチン。
- デング熱ウイルスにより引き起こされる疾患の予防に用いられるための請求項35記載のワクチン。
- 被験者におけるデング熱ウイルスにより引き起こされる疾患を予防するための、請求項35記載のワクチン。
- 前記被験者がヒトである請求項37記載のワクチン。
- 請求項16、23又は30記載の組成物に含まれるキメラウイルスのキャプシドタンパク質および前膜タンパク質を分離する切断部位をコードする核酸と相補的な18〜24ヌクレオチド又は該ヌクレオチドの相補鎖を有し、前記核酸は配列番号18、24または30によって示される、前記核酸と選択的にハイブリダイズするプローブ又はプライマー。
- ベロ細胞又はヒト肝細胞株HuH−7における温度感受性、蚊細胞又はヒト肝細胞株HuH−7における宿主細胞制限、ベロ細胞における複製改善のための宿主細胞適応、又はマウス又はサルにおける弱毒化からなる群から選択される突然変異を任意に含む弱毒化ウイルスを含む組成物であって、該弱毒化ウイルスは以下のものからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物:
(1)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30、
(2)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30、
(3)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30、
(4)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30、
(5)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30、
(6)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30、
(7)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30、
(8)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30、
(9)rDEN1Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30、
(10)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30、
(11)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30、
(12)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30、
(13)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30、
(14)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30、
(15)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30、
(16)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30、
(17)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30、
(18)rDEN1Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30、(19)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30、
(20)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30、
(21)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30、
(22)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30、
(23)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30、
(24)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30、
(25)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30、
(26)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30、
(27)rDEN1Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30、
(28)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30、
(29)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30、
(30)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30、
(31)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30、
(32)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30、
(33)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30、
(34)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30、
(35)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30、
(36)rDEN1/2Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30、
(37)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30、
(38)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30、
(39)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30、
(40)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30、
(41)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30、
(42)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30、
(43)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30、
(44)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30、
(45)rDEN1/2Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30、
(46)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30、
(47)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30、
(48)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30、
(49)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30、
(50)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30、
(51)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30、
(52)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30、
(53)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30、
(54)rDEN1/2Δ30、rDEN2/4Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30、
(55)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30、
(56)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30、
(57)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30、
(58)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30、
(59)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/1Δ30、
(60)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4/2Δ30、
(61)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4Δ30、
(62)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/1Δ30、
(63)rDEN1/4Δ30、rDEN2Δ30、rDEN3/4Δ30、rDEN4/2Δ30、
(64)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4Δ30、
(65)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/1Δ30、
(66)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/1Δ30、rDEN4/2Δ30、
(67)rDEN1/4Δ30、rDEN2/1Δ30、rDEN3/2Δ30、rDEN4Δ30、
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