CN103031279B - 重组黄病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于预防和治疗黄病毒感染的重组黄病毒疫苗。本发明的疫苗含有包含减毒突变的重组黄病毒。

Description

重组黄病毒疫苗
本申请是申请日为2006年04月24日、中国申请号为200680022652.9、发明名称为“重组黄病毒疫苗”的发明申请的分案申请。
发明背景
本发明涉及含有重组黄病毒的疫苗。
黄病毒是有包膜的正链RNA小病毒，它通常由受到感染的蚊和蜱传播。有些黄病毒，诸如黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、蜱媒脑炎病毒和西尼罗河病毒，对全球的公众健康正在造成威胁或者可能造成威胁。例如，黄热病病毒已成为撒哈拉沙漠以南非洲的某些丛林区域以及南美洲的一些地区的流行病的病因。尽管许多黄热病病毒感染是温和的，但这种病也可引起严重的、危及生命的疾病。该病病情的最初或急性期通常表现为高热、寒战、头痛、背痛、肌肉痛、食欲减退、恶心和呕吐。3至4天后，这些症状消失。在有些患者中，之后症状再次出现，因为疾病进入它的所谓毒性期。在此阶段，再次出现高热且可导致休克、出血（例如从口、鼻、眼和/或胃出血）、肾衰竭和肝衰竭。甚至，肝衰竭引起黄疸，即皮肤发黄和眼睛发白，由此得名“黄热病”。进入毒性期的患者大约有一半在10至14天内死亡。不过，从黄热病痊愈的人终身具有抵抗再次感染的免疫力。在过去的二十年间受黄热病病毒感染的人数有所上升，至今每年有大约200,000例黄热病病例，大约30,000例相关死亡。因此，黄热病病毒的再次出现成为公共健康的严重问题。
西尼罗河(WN)病毒广泛分布于非洲、印度次大陆、欧洲、乌克兰、俄罗斯、中亚和中东(Monath和Heinz,在Fields等人编的第3版Virology中,Lippincott-Raven,pp.961-1034,1995)。1999年，在美国发生了一次史无前例的由WN病毒引起的人和马的流行性脑炎(Enserik,Science286:1450-1451,1999)。从那时起，该病毒永久占领了美国，侵袭了美国的几乎全部领土。迄今发病率/死亡率方面的记录产生于2003年，报告了9862例病例，其中大约三分之一伴有神经学症状，还有264例死亡。人的疾病从温和的登革热样疾病到致命的脑膜脑炎变化，最严重的疾病发生在老年人中。迄今为止，没有针对西尼罗河病毒的有效药物治疗方法，而且监视和预防方法不能显著影响人类感染的病例数。病毒迁移进入南美洲以及在不发达国家流行的风险极高。开发安全有效的疫苗将有助于控制未来的流行。
黄病毒，包括黄热病病毒和西尼罗河病毒，有两个主要的生物学特性造成其在人和动物中诱发病状。这两个特性中的第一个是亲神经向性(neurotropism)，即病毒倾向于侵袭和感染宿主的神经组织。亲神经性黄病毒感染可导致脑和脊髓的发炎和损伤（即脑炎）、意识减退、麻痹和惊厥。黄病毒的这些生物学特性中的第二个是亲内脏向性(viscerotropism)，即病毒倾向于侵袭和感染重要的内脏器官，包括肝脏、肾脏和心脏。亲内脏性黄病毒感染可造成肝脏（肝炎）、肾脏（肾炎）和心肌（心肌炎）的发炎和损伤，导致这些器官的衰竭或功能障碍。
亲神经向性和亲内脏向性似乎是黄病毒的独特的和区别的特性。有些黄病毒主要是亲神经的（诸如西尼罗河病毒），有些主要是亲内脏的（例如黄热病病毒和登革热病毒），还有一些两种特性都展示（诸如基亚萨努森林病病毒）。不过，亲神经向性和亲内脏向性两者在所有黄病毒中都有某种程度的存在。在宿主内，有可能发生亲内脏向性与亲神经向性之间的相互作用，因为感染内脏发生在侵入中枢神经系统之前。因此，亲神经向性取决于病毒在神经外器官（内脏）中复制的能力。这种神经外复制引起了病毒血症，继而造成了侵入脑和脊髓。
黄病毒经完全加工产生的成熟病毒粒包含三种结构蛋白，衣壳(C)、膜(M)和包膜(E)。在受到感染的细胞内产生7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。病毒受体结合和融合结构域二者都存在于E蛋白内。此外，E蛋白还是黄病毒疫苗的理想组分，因为针对此蛋白质的抗体可中和病毒的传染性并给予宿主抵抗该疾病的保护作用。在受到感染的细胞内发现的不成熟黄病毒病毒粒包含前膜(pre-membrane,prM)蛋白，它是M蛋白的前体。黄病毒蛋白质如下产生：由单一的长可读框翻译产生多蛋白，随后经过多蛋白一系列复杂的翻译后蛋白水解切割，产生成熟的病毒蛋白质(Ambergetal.,J.Virol.73:8083-8094,1999;Rice,“Flaviviridae”,在Fields等人编的Virology中,Raven-Lippincott,NewYork,VolumeI,p.937,1995)。病毒结构蛋白以C-prM-E的次序排列在多蛋白的N端区域，而非结构蛋白则以上述次序位于C端区域。
活疫苗给予针对由病毒感染引起的疾病的最强的和持久的保护性免疫应答。就黄病毒而言，成功疫苗的开发需要改变毒力特征，使得疫苗病毒对人或动物的亲神经向性和亲内脏向性减弱。若干不同的方法已用于针对黄病毒的疫苗的开发。就黄热病病毒而言，已通过连续传代开发出了两种疫苗（黄热病17D和法国亲神经性疫苗）(Monath,“YellowFever”,在Plotkin和Orenstein的第3版Vaccines中,Saunders,Philadelphia,pp.815-879,1999)。黄热病17D疫苗是通过在鸡胚组织中连续传代而开发出来的，产生了亲神经向性和亲内脏向性显著减弱的病毒。法国亲神经性疫苗是通过在口脑组织中连续传代而开发出来的，导致失去亲内脏向性但保留亲神经向性。实际上，神经学方面意外事故（疫苗接种后脑炎）的高发病率与法国疫苗的使用有关。
减毒的另一条途径涉及嵌合黄病毒的构建，所述嵌合黄病毒包含两种（或更多种）不同黄病毒的组分。嵌合黄病毒制备成包含来自不同黄病毒的结构蛋白和非结构蛋白。例如，所谓的ChimeriVaxTM技术使用了黄热病17D病毒的衣壳蛋白和非结构蛋白来运送其它黄病毒的包膜蛋白（prM和E）(参阅例如Chambersetal.,J.Virol.73:3095-3101,1999)。实际上，此技术已用于开发针对登革热病毒、日本脑炎(JE)病毒、西尼罗河病毒和圣路易斯脑炎(SLE)病毒的候选疫苗株(参阅例如Pugachevetal.,在Levine等人编的第3版NewGenerationVaccines中,MarcelDekker,NewYork,Basel,pp.559-571,2004;Chambersetal.,J.Virol.73:3095-3101,1999;Guirakhooetal.,Virology257:363-372,1999;Monathetal.,Vaccine17:1869-1882,1999;Guirakhooetal.,J.Virol.74:5477-5485,2000;Arroyoetal.,TrendsMol.Med.7:350-354,2001;Guirakhooetal.,J.Virol.78:4761-4775,2004;Guirakhooetal.,J.Virol.78:9998-10008,2004;Monathetal.,J.Infect.Dis.188:1213-1230,2003;Arroyoetal.,J.Virol.78:12497-12507,2004;和Pugachevetal.,Am.J.Trop.Med.Hyg.71:639-645,2004)。这些是活的病毒疫苗，它们与YF17D疫苗相似，引发直接针对预期异源病毒的强烈的体液和细胞免疫应答。基于对ChimeriVaxTM-JE和登革热疫苗的广泛表征，已观察到ChimeriVaxTM疫苗的主要特征包括在底物细胞(substratecell)内复制达到高滴度（710pfu/ml或更高）的能力，在刚断奶的和未成年的小鼠中的神经毒力低（显著低于YF17D），在有关神经毒力和亲内脏向性的正规猴子测试中高度减毒，在体外和在体内的遗传和表型稳定性高，在蚊子中复制效率低（这对于防止在自然界中不受控制的扩散非常重要），及在施用单剂后在小鼠、猴和人中诱发强劲的保护性免疫力而没有严重的免疫后副作用。
在其它减毒途径中，已进行了黄病毒（包括嵌合黄病毒）的诱变。一些用于使野生型黄病毒病原体减毒的实验方法已有记载(参阅例如综述于Pugachevetal.,Int.J.Parasitol.33:567-582,2003)。例如，已发现包含黄热病病毒的衣壳蛋白和非结构蛋白及日本脑炎病毒、登革热病毒或西尼罗河病毒的膜蛋白和包膜蛋白的嵌合黄病毒的包膜蛋白的某些氨基酸的突变降低了亲内脏向性(参阅例如WO03/103571和WO2004/045529)。最初应用于野生型4型登革热病毒的另一途径涉及3’非翻译区内30个或更多个核苷酸的大段删除(3'UTR;Menetal.,J.Virol.70:3930-3937,1996;美国专利No.6,184,024B1)。这些删除之一，命名为删除德耳塔30、d30或Δ30，在野生型4型登革热和1型登革热病毒及4型登革热/WN嵌合病毒的背景中得到了进一步的研究(Durbinetal.,AJTMH65:405-413,2001;Whiteheadetal.,J.Virol.77:1653-1657,2003;Pletnevetal.,Virology314:190-195,2003;WO03/059384;WO03/092592;WO02/095075)。此外，发现在野生型蜱媒脑炎(TBE)和兰加特病毒(Langatvirus)中引入一些大段3'UTR删除（417-616个核苷酸长）在小鼠模型中高度减毒(Mandletal.,J.Virol.72:2132-2140,1998;Pletnev,Virology282:288-300,2001)。有关YF17D疫苗病毒的体外数据的发表量有限。具体而言，Bredenbeek及其合著者证明了3’UTR的所有三个重复序列(RS)元件的大段删除（长度为188个核苷酸；RS元件的位置如图1A所示）或保守序列元件2(CS2)的25个核苷酸的删除不会阻止病毒在BHK细胞内复制，而影响CS1或3'极远端主干和环的三处其它删除（长度为25-68个核苷酸）是致命的(Bredenbeeketal.,J.Gen.Virol.84:1261-1268,2003)。其它资料显示了在黄病毒（登革热）3’UTR的3’端主干-环大结构中引入突变导致了减毒作用，同时保持了病毒免疫宿主的能力(Markoffetal.,J.Virol.76:3318-3328,2002)。
关于高致病性野生型TBE病毒的减毒记载的第二种方法利用了衣壳蛋白C内相对较大的删除，按照Kofler及其同事所述，他们在TBE病毒的C蛋白中引入了一系列删除并回收了若干可存活的突变体(Kofleretal.,J.Virol.76:3534-3543,2002)。具体而言，所述蛋白质中央疏水性结构域内16个氨基酸的删除（预测的螺旋I；参见图2A）急剧减少了病毒在BHK细胞中的复制并显著降低了在小鼠中的神经侵入力。用此TBE突变体进行的免疫保护小鼠免于高致病性TBE株Hypr（>100LD50）的攻击(Kofleretal.,J.Virol.76:3534-3543,2002)。
许多医学上重要的具有亲内脏特性的黄病毒目前还没有得到批准的疫苗，诸如西尼罗河病毒、登革热病毒和鄂木斯克出血热病毒等。
发明概述
如本文所述，本发明提供了包含一处或多处突变的重组黄病毒（例如黄热病病毒或嵌合黄病毒），所述突变使得已减毒的黄病毒的亲内脏向性有少许降低。本发明中包括的嵌合黄病毒的例子有包含第一种黄病毒（例如黄热病病毒，诸如黄热病病毒株17D）的衣壳蛋白和非结构蛋白及第二种黄病毒（例如选自日本脑炎病毒、1型登革热病毒、2型登革热病毒、3型登革热病毒、4型登革热病毒、墨累山谷脑炎病毒(MurrayValleyencephalitisvirus)、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗河病毒、库京病毒(Kunjinvirus)、罗氏脑炎病毒(Rocioencephalitisvirus)、伊利乌斯病毒(Ilheusvirus)、中欧脑炎病毒、西伯利亚脑炎病毒、俄罗斯春夏型脑炎病毒、基亚萨努森林病病毒(KyasanurForestDiseasevirus)、Alkhurma病毒(Alkhurmavirus)、鄂木斯克出血热病毒(OmskHemorrhagicfevervirus)、（羊）跳跃病病毒(Loupingillvirus)、波瓦生病毒(Powassanvirus)、纳基许病毒(Negishivirus)、阿布塞塔罗夫病毒(Absettarovvirus)、Hansalova病毒(Hansalovavirus)、阿波病毒(Apoivirus)和Hypr病毒(Hyprvirus)）的膜蛋白和包膜蛋白的嵌合黄病毒。就包含西尼罗河病毒膜蛋白和包膜蛋白的嵌合黄病毒而言，包膜蛋白可任选在第107、316和440位包膜氨基酸处包含取代。本发明的重组黄病毒的突变可以是例如一处或多处删除或取代。
本发明的突变可位于重组黄病毒的区域内，包括例如重组黄病毒的3’非翻译区，并且通常包含少于30个核苷酸。作为此类突变的例子，所述突变可以是使病毒3’非翻译区内的主干结构（例如病毒3’非翻译区的非保守区内的主干结构）或者预测的二级结构或整个结构的可能的可选元件不稳定的突变。如本文所述，作为具体的例子，突变可以是d7、dA、dB、dC和dD的任何一种或多种。在其它例子中，所述突变可包括保守序列2(CS2)的一个或多个核苷酸，因此可以是例如CS2d5或CS2d16。在其它例子中，突变型黄病毒经修改适合细胞培养底物(cellculturesubstrate)，导致它所包含的突变的自发修饰（例如删除，诸如例如将dC突变体中最初的5个核苷酸的删除增加到24个核苷酸的修饰；见下文）或者导致第二个位点的突变，所述突变不影响体内减毒。
本发明的突变还可引入衣壳序列内。这样的突变可包括例如衣壳蛋白的1-3个氨基酸的删除。作为此类突变的一个具体例子，该突变可以是衣壳蛋白螺旋I内的一处或多处删除（例如突变C2，如本文所述）。
在其它例子中，本发明的突变可以包括包膜氨基酸的一处或多处取代。在一个例子中，此类包膜突变是第138、176、177、244、264和280位包膜氨基酸中的一个或多个的取代或其组合。此类组合的具体例子包括第176、177及280位；第176、177、244、264及280位；和第138、176、177及280位。
本发明的重组黄病毒可包含只在上述区域之一中的突变，或者在这些区域中的两个或所有三个中的突变。此外，重组黄病毒可以在黄病毒包膜蛋白铰链区内包含一处或多处突变，和/或在黄病毒膜蛋白内包含突变。作为本发明重组黄病毒的具体例子，提及了包含C2突变并联合了d7、dB、dD和/或E#5（即E176、E177和E280）突变（见下文）的黄病毒，任选在ChimeriVaxTM-WN02的背景中（也参阅下文）。在本文的其它地方提供了包含众多突变的重组黄病毒的别的例子。
本发明还提供了在受试者（例如人或牲畜受试者）中预防或治疗黄病毒感染的方法，包括对受试者施用含有本文所述一种或多种重组黄病毒的疫苗，以及含有此类重组黄病毒的药用组合物。此外，本发明包括包含此类重组黄病毒的基因组（或其互补物）的核酸分子（例如RNA或DNA分子）。另外，本发明包括本文所述重组黄病毒在制备灭活疫苗中的用途。如本文所述，本发明还包括使黄病毒疫苗候选株减毒的方法，包括在黄病毒疫苗候选株中引入降低黄病毒疫苗候选株的亲内脏向性的一处或多处突变。
本发明有若干优点。用于本发明突变的病毒是活的、保持感染哺乳动物细胞的能力的减毒黄病毒。因为所述病毒是有感染力的，所以保证它们充分减毒是重要的，以便使其不会导致接种的受试者生病。本发明提供了用于微调候选黄病毒疫苗减毒的方法，由此使得能够产生安全的疫苗。本发明的重组黄病毒也是有优势的，因为它们与亲本和野生型毒株相比较为安全。这一特征对于它们作为活的减毒疫苗的使用和施用，以及它们的制备和作为灭活疫苗的用途而言是有利的。
根据下文详述、附图和权利要求书，本发明的其它特征和优点是显而易见的。
附图简述
图1A是黄热病病毒3’非翻译区的示意图，显示了在此区域内的结构域（重复序列(RS)、CS2、CS1和3’极远端主干-环结构），以及本发明突变的例子（例如dA、dB、dC、dD、d7、d14、CS2d5和CS2d16）。
图1B是黄热病病毒3’非翻译区从第三个RS元件中部至UTR末端的序列和二级结构的示意图(Proutskietal.,J.Gen.Virol.78:1543-1549,1999)。
图1C是用ZukerRNA折叠算法得到的最佳YF17D3'UTR二级结构预测的示意图。
图1D是3'UTR删除（显示dC删除；Zuker方法）对最佳YF17D结构的影响（与图1C进行比较）的示意图。
图1E是dC病毒中删除的大小从5个核苷酸（在P2水平）自发增加至24个核苷酸（在P5水平）对预测的二级结构的影响（与图1D和图1C比较）的示意图。删除的大小的增加导致结构类似最初的最佳YF17D结构。
图2A是蜱媒脑炎病毒衣壳蛋白序列以及Kofleretal.,J.Virol.76:3534-3543,2002报导的此蛋白质内删除的示意图。
图2B是YF17D衣壳蛋白序列的示意图，指出了通过计算机分析预测具有α螺旋二级结构的区域（α螺旋I-IV）以及疏水区。
图3是YFE蛋白同型二聚体的同源性模型的示意图，显示了野生型YF(Asibi)和疫苗株YF17D之间不同残基的位置。
图4是西尼罗河病毒膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的示意图，显示了用双质粒方法引入这些区域的不同突变组合。
图5是显示选定的ChimeriVaxTM-WN04变体及WN02大噬斑（减毒不足疫苗）和小噬斑对照的生长动力学的曲线图。
发明详述
本发明提供了可用于治疗方法诸如疫苗接种方法的重组黄病毒。本发明黄病毒的重点在于病毒基因组中存在减毒突变。这些突变可使病毒减毒，通过例如减弱病毒的亲内脏向性和/或亲神经向性。所述突变可存在于黄病毒基因组内包括3’非翻译区(3’UTR)、衣壳序列和/或包膜序列的区域。正如下文进一步论述的，本发明的突变可用于微调已包含一处或多处其它减毒突变的疫苗株的减毒作用。因此，例如，本发明的突变可通过导致噬斑测定法中噬斑大小减小和/或动物模型中病毒血症减少来加以鉴定（见下文）。因此，本发明的突变就此类病毒的减毒而言提供了更高水平的安全性。本发明的病毒和方法的详情提供如下。
可进行本发明突变的黄病毒的一个例子是黄热病病毒，例如YF17D疫苗株(Smithburnetal.,“YellowFeverVaccination”,WorldHealthOrg.,p.238,1956;Freestone,inPlotkinetal.(eds.),Vaccines,2ndedition,W.B.Saunders,Philadelphia,1995)。其它黄热病病毒株例如YF17DD(GenBank编号U17066)和YF17D-213(GenBank编号U17067)(dosSantosetal.,VirusRes.35:35-41,1995)、YF17D-204France(X15067,X15062)、YF17D-204,234US(Riceetal.,Science229:726-733,1985;Riceetal.,NewBiologist1:285-296,1989;C03700,K02749)及由Galleretal.,Vaccine16(9/10):1024-1028,1998记载的黄热病病毒株也可用于本发明。
可进行本发明突变的别的黄病毒包括其它的蚊媒黄病毒，诸如日本脑炎病毒（例如SA14-14-2）、登革热病毒（血清型1-4）、墨累山谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗河病毒、库京病毒、罗氏脑炎病毒和伊利乌斯病毒；蜱媒黄病毒，诸如中欧脑炎病毒、西伯利亚脑炎病毒、俄罗斯春夏型脑炎病毒、基亚萨努森林病病毒、Alkhurma病毒、鄂木斯克出血热病毒、跳跃病病毒、波瓦生病毒、纳基许病毒、阿布塞塔罗夫病毒、Hansalova病毒、阿波病毒和Hypr病毒；以及肝炎病毒属的病毒（例如丙型肝炎病毒）。所有这些病毒都具有一些感染内脏器官的倾向。这些病毒的亲内脏向性可能不一定引起极重要的内脏器官的功能障碍，但病毒在这些器官内的复制可引起病毒血症并由此造成入侵中枢神经系统。因而，在降低损伤内脏器官的风险之外，通过诱变减轻这些病毒的亲内脏向性可降低它们入侵脑并引起脑炎的能力。
除了上述病毒以及其它黄病毒之外，包含一处或多处上述突变类型的嵌合黄病毒也包括在本发明内。这些嵌合体可由如下的黄病毒组成，即第一种黄病毒（即主干黄病毒）中的一种（或多种）结构蛋白用第二种病毒（即待测试的或预定的病毒，诸如黄病毒；参阅例如美国专利No.6,696,281;美国专利No.6,184,024;美国专利No.6,676,936;和美国专利No.6,497,884）的一种（或多种）相应的结构蛋白取代。例如，所述嵌合体可由如下的黄病毒组成，即主干黄病毒（例如黄热病病毒）中的膜蛋白和包膜蛋白用第二种待测病毒（例如西尼罗河病毒、登革热病毒（血清型1、2、3或4）、日本脑炎病毒或其它病毒，诸如本文所提及的任一种病毒）的膜和包膜取代。嵌合病毒可由任何病毒组合构建而来，但通常情况下针对其寻找免疫性的病毒是插入的结构蛋白的来源。
一类可进行本发明突变的嵌合病毒的具体例子有人的黄热病疫苗株YF17D，其中的膜蛋白和包膜蛋白已用另一种黄病毒的膜蛋白和包膜蛋白取代，诸如西尼罗河病毒、登革热病毒（血清型1、2、3或4）、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒或任何其它黄病毒，诸如上文列举的病毒之一。以此方法构建的嵌合黄病毒已命名为所谓的“ChimeriVax”病毒。用ChimeriVaxTM技术构建并根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)的条款保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC,Manassas,Virginia,U.S.A.)、准予保藏日1998年1月6日的以下嵌合黄病毒可用于制备本发明的病毒：黄热病病毒17D/2型登革热病毒嵌合病毒(YF/DEN-2;ATCC编号ATCCVR-2593)和黄热病病毒17D/日本脑炎病毒SA14-14-2嵌合病毒(YF/JEA1.3;ATCC编号ATCCVR-2594)。制备可用于本发明的嵌合病毒的详情参见例如以下出版物：WO98/37911;WO01/39802;Chambersetal.,J.Virol.73:3095-3101,1999;WO03/103571;WO2004/045529;美国专利No.6,696,281;美国专利No.6,184,024;美国专利No.6,676,936;和美国专利No.6,497,884。
如上所述，本发明的新突变存在于黄病毒包括嵌合黄病毒的3’UTR、衣壳和/或包膜序列中。这些类型突变中的每一种，可以相互组合以及/或者与其它减毒突变结合，记载如下：
3’非翻译区突变
黄热病病毒疫苗株YF17D的3’UTR的构造如图1A所示，为所有ChimeriVaxTM病毒共有。它从3'末端开始依次包含(i)3'极远端主干-环结构，假定起负链RNA合成启动子的功能且在所有黄病毒中是保守的，(ii)两个保守序列元件CS1和CS2，与所有蚊媒黄病毒共享高度的核苷酸序列同源性，及(iii)对于西非黄热病病毒株，包括YF17D疫苗病毒而言独特的、位于3’UTR上游部分的三拷贝重复序列元件(RS)(Chambersetal.,Annu.Rev.Microbiol.44:649-688,1990)。3’UTR还包含许多预测的主干-环结构，诸如RS元件下游的非保守区内的结构，如图1B所示。
本发明的3’UTR突变通常是短的减毒删除，例如少于30个核苷酸（例如1个、2个、3个等，直到29个（例如2-25个、3-20个、4-15个、5-10个或6-8个核苷酸长））。在单独引入疫苗候选株或者与其它减毒突变联合时，本发明的新突变可导致额外水平的减毒作用，从而提供微调疫苗候选株减毒水平的方法。在有些实施例中，本发明的3’UTR短删除设计成使得3’UTR内一个或多个预测主干结构的二级结构和/或3'UTR的整体结构不稳定。除删除外，所述结构内的突变还可包括类似导致主干结构不稳定的取代。在某些实施例中，进行本发明突变的主干-环结构位于3’UTR的非保守区内或可耐受所述突变的保守区（例如CS2）内。例如，就黄热病病毒（例如YF17D）3’UTR而言，无论是完整的黄热病病毒或基于黄热病病毒的嵌合体的背景，主干失稳突变可存在于图1B所示的任何一个或多个主干结构中，图1B显示了四个此类删除的例子（dA、dB、dC和dD），下文有进一步的描述。这样，除这些具体的例子外，黄热病病毒内3’UTR突变的其它例子包括包含例如图1B所示以下1-2个、3-8个、4-7个或5-6个核苷酸的主干序列的突变（从5’向3’方向阅读）：TGGAG，CTCCA,GACAG，TTGTC,AGTTT，GGCTG，CAGCC,AACCTGG，TTCTGGG，CTACCACC,GGTGGTAG，GGGGTCT，AGACCCT，AGTGG和TTGACG。
除主干失稳突变外，本发明的突变还包括3’UTR内的其它短删除。例如，本发明包括落入Δ30突变范围内的某些突变，如上所述。因而，例如，本发明包括此区域内长度为1个、2个、3个等，直到29个（例如1-25个、2-20个、3-15个、4-14个、5-13个、6-12个、7-11个、8-10个或9个）核苷酸的任何可存活的突变。作为具体的例子，本发明包括删除d7，其中YF17D中的此区域删除了以下核苷酸：第345-351位核苷酸（AAGACGG；编号从3'UTR的第一个核苷酸开始，在病毒ORF的UGA终止密码子之后；图1A）。包括从此序列3’或5’端删除例如1个、2个、3个、4个或5个别的核苷酸的突变也包括在本发明内。在其它实施例中，保守序列CS1和CS2内的短删除包括在本发明内。这些突变可包括例如删除这些序列的1-29个、2-25个、3-20个、4-15个、5-10个或6-8个核苷酸。作为两个具体的例子（下文有进一步的描述），从YF17D特异的3'UTR的CS2中删除了第360-364位核苷酸(GGTTA;CS2d5;图1A)和/或第360-375位核苷酸(GGTTAGAGGAGACCCT;CS2d16;图1A)。包括从此序列3’或5’端删除例如1个、2个、3个、4个或5个别的核苷酸的突变也包括在本发明内。对于其它黄病毒3’UTR，可基于3’UTR的二级结构来构建相似的突变。已发表了关于其它黄病毒3'UTR的二级结构的预测，例如关于登革热病毒、库京病毒和TBE病毒(参阅例如Proutskietal.,VirusRes.64:107-123,1999)和HCV(参阅例如Kolykhalovetal.,J.Virol.70:3363-3371,1996)。此外，代表全部四种主要血清复合体（YF、JE、登革热和TBE）的许多黄病毒株的众多3'UTR核苷酸序列可从GenBank获取。别的病毒株的序列可通过病毒测序来测定。可用标准软件（例如mfold或RNAfold程序）容易的预测这些序列的二级结构以揭示可进行诱变的潜在主干-环结构。
如下文所进一步论述的，本发明的3’UTR突变可用于为已减毒疫苗候选株提供进一步的减毒。因此，可构建本文所述的一种或多种3’UTR突变（例如d7、dB、dC和/或dD）从而为YF17D黄热病病毒疫苗株提供更高的安全性水平。任选的，3’UTR突变可与一种或多种别的减毒突变一起包含在此病毒株中，诸如病毒包膜蛋白铰链区内（例如第48-61、127-131和196-283位包膜氨基酸的任何一个或多个，例如第279位氨基酸的取代，或者黄热病病毒中与1型登革热病毒的第204、252、253、257、258和261位氨基酸对应的一个或多个包膜氨基酸的取代(参阅例如WO03/103571)；黄病毒包膜蛋白的铰链区位于结构域I与II之间；参阅例如Reyetal.,Nature375:291-298,1995）、黄热病病毒膜蛋白内的氨基酸（例如膜蛋白的膜螺旋部分，例如与西尼罗河病毒膜蛋白第66位对应的氨基酸）、或本文所述任何衣壳蛋白或包膜蛋白突变（例如与西尼罗河病毒第138、176、177、244、264、280、313、316、380和440位氨基酸对应的位置处的氨基酸取代，单独的或者组合的）的减毒突变。
实际上，有可能将3’UTR内特异的突变或删除与衣壳基因内（如下文所述）、prM基因内（例如YF-日本脑炎嵌合体的M5或M60、或YF-WN嵌合体的M66或周围氨基酸处(参见PCT/US2005/037369及下文)）、或E蛋白内已知使黄病毒减毒的位点处的一种或多种突变或删除组合。E基因包含功能性结构域，其中的氨基酸改变可影响功能并从而降低毒性，如HurrelbrinkandMcMinn,Adv.VirusDis.60:1-42,2003所述。可以与本申请所述3’UTR删除/突变一起在插入突变后可产生适当减毒疫苗的E蛋白功能区包括：a)结构域III外表面上推定的受体结合区，b)结构域I与II之间的分子铰链区，它决定了内体(endosome)中E蛋白的酸依赖性构象改变并降低了病毒内在化效率；c)prM/M蛋白与E蛋白的界面，暴露于内体中低pH值后从二聚体向三聚体重排后E蛋白中构成与prM/M的介面的区域；d)结构域II的融合结构域的顶端，它涉及内在化活动过程中与内体膜的融合；及e)主干-锚区，它还在功能上涉及酸诱导融合活动过程中E蛋白的构象变化。
3’UTR突变还可包含在嵌合黄病毒疫苗候选株内。在一个实施例中（下文有进一步描述），一个或多个本文所述的3’UTR突变包含在含有黄热病病毒(YF17D)的衣壳蛋白和非结构蛋白及西尼罗河病毒(NY99)的膜蛋白和包膜蛋白的疫苗候选株（在此称为ChimeriVaxTM-WN02）中，它的包膜蛋白已包含减毒突变（第107、316和440位的取代；WO2004/045529；也可参阅下文）。因而，本发明包括还包含例如d7、dB、dC、dD或本文所述的任何其它3’UTR突变（任选的，与一个或多个衣壳或别的包膜突变组合，如本文所述）的ChimeriVaxTM-WN-02。在其它实施例中，膜蛋白和包膜蛋白来自另一种黄病毒，诸如日本脑炎病毒（例如SA14-14-2)、登革热病毒（1型、2型、3型或4型登革热病毒）、或本文所述其它黄病毒。
如同上文所述的黄热病病毒疫苗，3’UTR突变可任选与一个或多个别的减毒突变一起包含在嵌合黄病毒内，诸如病毒包膜蛋白铰链区内（例如与黄热病病毒第48-61、127-131和196-283位氨基酸对应的任何一个或多个氨基酸处，例如第279位氨基酸，或者包膜蛋白内与1型登革热病毒第204、252、253、257、258和261位氨基酸对应的一个或多个氨基酸的取代(参阅例如WO03/103571)）、膜蛋白内的氨基酸（例如膜蛋白的膜螺旋部分，例如与西尼罗河病毒膜蛋白第66位对应的氨基酸）、或本文所述任何衣壳蛋白或包膜蛋白突变（例如与西尼罗河病毒第138、176、177、244、264和280位氨基酸对应的位置处的氨基酸取代，单独的或者组合的）的减毒突变。包含不同类型减毒突变组合的高度减毒疫苗的具体例子记载在下文中。这些代表了其中衣壳蛋白中的C2删除与3'UTR中的d7、dB或dD删除联合，或者与包膜蛋白内的氨基酸变化（E176、E177和E280氨基酸改变）的E#5组合联合的嵌合黄热病病毒-西尼罗河病毒变体。
衣壳突变
正如下文进一步论述的，我们发现衣壳蛋白内的短删除突变也可用于为已减毒的疫苗候选株提供进一步的减毒作用。因而，本发明包括衣壳蛋白内包含短删除（例如1个、2个、3个或4个氨基酸的删除）的黄病毒（包括嵌合黄病毒，诸如已包含其它减毒突变的疫苗候选株）。此类突变的例子，就YF17D病毒衣壳蛋白而言，包括影响蛋白质螺旋I的可存活删除（见图2A）。此类突变的具体例子是突变C2，它包括从螺旋I中删除氨基酸PSR（图2A）。可测试此区域内其它短突变的生存力和减毒作用，它们也包括在本发明内。其它黄病毒的衣壳蛋白序列已经发表，例如关于TBE病毒、WN病毒、库京病毒、JE病毒和登革热病毒(例如Pletnevetal.,Virology174:250-263,1990)。
如同上文所述的3’UTR突变，可将衣壳蛋白突变引入黄热病病毒疫苗株（例如YF17D）内，任选与任何一个或多个以下突变组合：如本文所述的3’UTR突变（例如d7、dB、dC、dD或其变体）；病毒包膜蛋白铰链区内的减毒突变（例如第48-61、127-131和196-283位包膜氨基酸的任何一个或多个，例如第279位氨基酸，或者黄热病病毒内与1型登革热病毒的第204、252、253、257、258和261位氨基酸对应的一个或多个氨基酸的取代(参阅例如WO03/103571)）、黄热病病毒膜蛋白内的氨基酸（例如膜蛋白的膜螺旋部分，例如与西尼罗河病毒膜蛋白第66位对应的氨基酸）、或本文所述任何包膜蛋白突变（例如与西尼罗河病毒第138、176、177、244、264和280位对应的位置处的氨基酸取代，单独的或者组合的）的减毒突变。
类似的，可将衣壳蛋白突变引入嵌合黄病毒内。在一个实施例中（下文有进一步记载），本文所述的一个或多个衣壳突变包含在疫苗候选株（在此称为ChimeriVaxTM-WN02）内，所述疫苗候选株包含黄热病病毒(YF17D)的衣壳蛋白和非结构蛋白及西尼罗河病毒(NY99)的膜蛋白和包膜蛋白，其包膜蛋白已包含减毒突变（第107、316和440位的取代；WO2004/045529；也参阅下文）。因而，本发明包括还包含例如C2突变（任选与一个或多个3’UTR和/或别的包膜突变联合，如本文所述，例如C2删除与3'UTR内d7、dB或dD删除或者与包膜蛋白内氨基酸变化的E#5组合的已构建和已表征组合）的ChimeriVaxTM-WN-02。在其它实施例中，膜蛋白和包膜蛋白来自另一种黄病毒，诸如日本脑炎病毒（例如SA14-14-2）、登革热病毒（1型、2型、3型或4型登革热病毒）或本文所述其它黄病毒。在其它实施例中，如上所述，将此类突变引入天然的（非嵌合的）黄病毒。
此外，3’UTR突变可任选包含在具有一处或多处别的减毒突变的嵌合黄病毒中，诸如病毒包膜蛋白铰链区中的减毒突变（例如与黄热病病毒第48-61、127-131和196-283位包膜氨基酸例如第279位氨基酸对应的的任何一个或多个氨基酸的取代，或者包膜蛋白中与1型登革热病毒第204、252、253、257、258和261位氨基酸对应的一个或多个氨基酸的取代(参阅例如WO03/103571)）、膜蛋白中氨基酸的减毒突变（例如膜蛋白的膜螺旋部分，例如与西尼罗河病毒膜蛋白第66位对应的氨基酸）、或本文所述任何包膜蛋白突变（例如与西尼罗河病毒第138、176、177、244、264、280、313、316、380和440位氨基酸对应的位置处的氨基酸取代，单独的或者组合的）。
包膜突变
如本文别处所述，某些包膜突变已有记载说对于黄病毒，诸如黄热病病毒（例如YF17D）和嵌合黄病毒是减毒的。这些包括铰链区突变（例如与黄热病病毒第48-61、127-131、170、173、200、299、305、380和196-283位氨基酸对应的位置处的取代和结构域II疏水性口袋衬里的残基的取代(Hurrelbrinketal.,Adv.VirusRes.60:1-42,2003;Modisetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:6986-6991,2003;见图3)，包括黄热病病毒情况下的第52和200位残基、日本脑炎病毒的第279位氨基酸（在基于黄热病病毒的嵌合体的背景中）、和1型登革热病毒的第204、252、253、257、258和261位氨基酸(参阅例如WO03/103571)），以及西尼罗河病毒包膜蛋白第107、316和440位氨基酸的取代(参阅例如WO2004/045529)。
如下文所进一步论述的，在实施例中，我们发现黄病毒包膜序列中的突变（例如取代）还可提供微调已减毒黄病毒的减毒作用的手段。因此，本发明包括包含可用于微调候选疫苗减毒作用的一个或多个包膜蛋白突变的黄病毒（例如黄热病病毒或嵌合黄病毒，如本文所述）。此类突变的例子包括与西尼罗河病毒第138、176、177、244、264和280位氨基酸对应的位置处的取代，及这些突变的组合（例如第176、177及280位；第176、177、244、264及280位；和第138、176、177及280位）。如本文所述，诸如这些使已减毒疫苗候选株的减毒作用有少许下降的包膜突变可包含在黄热病病毒疫苗（例如基于YF17D的疫苗）或嵌合黄病毒的等同位置。任选的，这些突变可以与本文所述的一个或多个其它包膜、衣壳、膜和/或3’UTR突变一起包含在内。
有关衣壳基因和3'UTR记载的所有突变都可与这些包膜突变（与据显示影响减毒作用的一个包膜残基或多个残基）组合以产生具有减毒表型的病毒，即它的亲内脏向性比每种未组合的亲本病毒的要低（即在宿主中诱发较低的病毒血症）。例如，C2突变体（表2）可与E#7（表4）或dC、dD等组合。3'UTR删除（表1）可与C2或E#7病毒组合。
可以与本发明的3’UTR、衣壳蛋白和包膜蛋白突变一起包含在内的突变
除一处或多处上述减毒突变外，本发明的黄病毒可包含其它减毒突变。尽管上文提及了与本发明所包括的三类突变中每一种的组合，但此部分对这些突变进行了更详细的描述。
包含本发明突变的黄病毒（包括嵌合黄病毒）可以包含的突变的例子包括包膜蛋白铰链区内的突变或某些膜蛋白突变。具体而言，已发现某些包膜蛋白铰链区突变降低了亲内脏向性。包膜蛋白的多肽链折叠成三个独特的结构域：中央结构域（结构域I）、二聚化结构域（结构域II）和免疫球蛋白样模块结构域（结构域III）。铰链区位于结构域I与II之间，在病毒经受体介导的胞吞作用摄入后，在暴露于酸性pH时，经过构象变化（因此命名为“铰链”），导致包膜蛋白三聚体的形成，其涉及病毒与内体膜的融合。在构象变化前，蛋白质以二聚体的形式存在。
许多包膜氨基酸存在于铰链区内，包括例如黄热病病毒的第48-61、127-131和196-283位氨基酸(Hurrelbrinketal.,Adv.VirusRes.60:1-42,2003;Reyetal.,Nature375:291-298,1995)。任何这些氨基酸或紧密周围的氨基酸（及其它黄病毒包膜蛋白内的相应氨基酸）的减毒突变都可存在于本发明的病毒内。特别感兴趣的是铰链区疏水性口袋内的氨基酸(Modis等，于2003年5月20日印刷之前网上发表，10.1073/pnas.0832193100.PNAS|June10,2003|vol.100|no.12|6986-6991)。作为具体的例子，在包含插入黄热病病毒载体的1型登革热病毒序列的嵌合黄病毒铰链区疏水性口袋内的第204位包膜蛋白氨基酸的取代（1型登革热病毒内从K变成R）导致减毒作用。此取代导致包膜蛋白的结构改变，使得野生型蛋白质内一个包膜单体与另一个之间的分子间氢键遭到破坏并以单体内新的分子内相互作用取代。因而，可以用别的取代来增加疏水性口袋内的分子内相互作用，导致减毒作用。可以与本发明的突变组合、在疏水性口袋内构建的此类突变/取代的例子包括E202K、E204K、E252V、E253L、E257E、E258G和E261H的取代。
除上述3’UTR、衣壳和/或包膜突变外，本发明的黄病毒还可包含膜蛋白内的一处或多处减毒突变，例如在与西尼罗河病毒膜蛋白第66位氨基酸对应的氨基酸处和/或在预测的膜螺旋内的其它氨基酸处（例如在与西尼罗河病毒第40-75位氨基酸对应的任何一个或多个氨基酸处）。作为具体的例子，在西尼罗河病毒膜蛋白的情况中，膜蛋白的第66位氨基酸（在野生型西尼罗河病毒中是亮氨酸）可以用另一种氨基酸，诸如脯氨酸取代。除脯氨酸外，可以用其它疏水性氨基酸，诸如异亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸，或者小氨基酸，诸如丙氨酸或甘氨酸来取代膜蛋白第66位野生型氨基酸。作为其它例子，西尼罗河病毒第60、61、62、63和/或64位（或其它黄病毒中的相应位置）氨基酸可以取代，单独的或者相互组合、与第66位突变组合、和/或与其它突变组合。这些位置的取代的例子包括：第60位精氨酸变成甘氨酸、第61位缬氨酸变成丙氨酸、第62位缬氨酸变成谷氨酸或甲硫氨酸、第63位苯丙氨酸变成丝氨酸、及第64位缬氨酸变成异亮氨酸。另一个例子包括ChimeriVaxTM-JE病毒中JE特异的膜蛋白的第60位由精氨酸变成半胱氨酸的突变，发现此突变在大规模制备期间提高了疫苗的遗传稳定性。我们还首次提供了M蛋白的胞外域具有重要功能意义的证据，因为ChimeriVaxTM-JE的M5残基处谷氨酰胺变成脯氨酸的变化提高了感染的pH阈值（参阅申请PCT/US2005/037369）。
除上述一处或多处膜蛋白突变外，本发明的病毒还可包含一处或多处别的突变。例如，在西尼罗河病毒的情况中，所述别的突变可以在西尼罗河病毒包膜蛋白第107位（例如L变成F）、第316位（例如A变成V）或第440位（例如K变成R）（或其组合）的区域内。因而，所述突变可以在例如西尼罗河病毒包膜蛋白的第102-112位、第138位（例如E变成K）、第176位（例如Y变成V）、第177位（例如T变成A）、第244位（例如E变成G）、第264位（例如Q变成H）、第280位（例如K变成M）、第311-321位和/或435-445位的一个或多个氨基酸处。作为具体的例子，用西尼罗河病毒株NY99-flamingo382-99的序列(GenBank编号AF196835)作为参照，第107位赖氨酸可以用苯丙氨酸取代，第316位丙氨酸可以用缬氨酸取代，和/或第440位赖氨酸可以用精氨酸取代。在其它黄病毒内同样可以构建相应的突变。
此外，本发明的病毒还可以包含可能减毒或可能不减毒、但在其它方面对疫苗有益（例如对于疫苗制备而言）的任何其它突变，例如在病毒繁殖过程中可自然积累且是合乎需要的UTR内的核苷酸变化或者结构蛋白或非结构蛋白内的氨基酸变化。例如，我们最近观察到在无血清条件下的大规模制备过程中在ChimeriVaxTM-JE疫苗内积累的第60位残基R变成C的氨基酸变化。这种变化不影响免疫原性或减毒作用，但它通过提高其生长速率和阻止变成包膜蛋白内野生型残基(E107)的不合乎需要的逆转的积累而使病毒稳定。
可以使用标准方法在本发明的病毒内构建突变，诸如定点诱变。上文描述的突变有删除和取代，但本发明中同样可使用其它类型的突变，诸如插入。此外，如上所述，突变可单独存在或者存在于一处或多处别的突变的背景中。此外，除上述具体氨基酸外，还可以用其它氨基酸进行取代，诸如会导致上述氨基酸的保守变化的氨基酸。保守取代典型的包括以下各组内的取代：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；及苯丙氨酸和酪氨酸。此外，保守的和非保守的两种变化都可选择，基于计算机预测（使用蛋白质结构建模软件）的它们引起的E蛋白X射线结构变化来分析它们的减毒效果。
本发明的病毒（包括嵌合体）可使用本领域标准方法来制备。例如，可以将与病毒基因组对应的RNA分子引入原代细胞、鸡胚或二倍体细胞系，然后可以从中（或从其上清液中）纯化后代病毒。可用于产生病毒的另一种方法使用异倍体细胞，诸如Vero细胞(Yasumuraetal.,NihonRinsho21:1201-1215,1963)。在该方法中，将与病毒基因组对应的核酸分子（例如RNA分子）引入异倍体细胞，从细胞已培养好的培养液中收获病毒，用核酸酶（例如降解DNA和RNA二者的内切核酸酶，诸如BenzonaseTM；美国专利No.5,173,418）处理收获的病毒，将经核酸酶处理的病毒浓缩（例如通过用截留分子量为例如500kDa的滤器进行超滤），然后将浓缩的病毒进行配制，供接种用途。该方法的详情见WO03/060088A2，在此收入作为参考。
本发明的病毒可作为初级预防剂(primaryprophylacticagent)施加于有感染风险的人群，或者可作为二级制剂(secondaryagent)用于治疗受到感染的患者。因为所述病毒是减毒的，它们特别适合施用于“有风险的个体”，诸如老年人、儿童或HIV感染者。所述疫苗还可用于兽医学领域，例如对马进行针对西尼罗河病毒感染的疫苗接种或鸟类（例如宝贵的、濒危的或驯养的鸟类，分别为诸如火烈鸟、秃头鹰和鹅）的接种。此外，本发明的疫苗可含有包含特定突变的病毒，诸如嵌合病毒，混有缺少所述突变的病毒。
本发明病毒的配制可使用本领域标准方法来进行。许多用于疫苗制备的药学可接受溶液是众所周知的且很容易经过本领域技术人员修改后用于本发明(参阅例如Remington’sPharmaceuticalSciences(第18版)，编者A.Gennaro,1990,MackPublishingCo.,Easton,PA)。在两个具体的例子中，病毒在含7.5%乳糖和2.5%人血清清蛋白的极限必需培养基Earle氏盐(MEME)中或含10%山梨醇的MEME中配制。可是，病毒可简单的在生理学可接受溶液中稀释，诸如无菌盐水或无菌缓冲盐水。在另一个例子中，病毒可例如以与黄热病17D疫苗相同的方式进行施用和配制，例如作为经感染鸡胚组织的澄清悬浮液或从感染了嵌合病毒的细胞培养物收获的液体。
本发明的疫苗可使用本领域众所周知的方法来施用，疫苗待施用的适当量可以由本领域技术人员容易的确定。确定什么是病毒待施用的适当量可通过考虑诸如以下因素来确定，例如待施用病毒的受试者的身材大小和整体健康状况。例如，本发明的病毒可配制成无菌水溶液，在体积为0.1至1.0ml的一剂里含有102至108个、例如103至107个感染单位（例如噬斑形成单位或组织培养感染剂量），通过例如肌肉内、皮下或皮内路径施用。此外，因为黄病毒可能能够经粘膜路径，诸如口腔路径感染人宿主(Gresikova等，“Tick-borneEncephalitis”，在Monath编的TheArboviruses,EcologyandEpidemiology中,CRCPress,BocaRaton,Florida,1988,VolumeIV，177-203)，所以病毒也可通过粘膜路径施用。此外，本发明的疫苗可以单剂施用，或者任选的是，施用可包括使用引发剂量(primingdose)，随后在例如2-6个月后施用加强剂量(boosterdose)，由本领域技术人员适当确定。
任选的，施用本发明的病毒时可使用本领域技术人员知道的佐剂。可用于增强病毒免疫原性的佐剂包括例如脂质体配制剂、合成佐剂诸如（例如QS21）、胞壁酰二肽、单磷酰脂质A(monophosphoryllipidA)、聚膦嗪、CpG寡核苷酸、或似乎通过激活细胞表面上或细胞内核膜表面上Toll样受体(TLR)分子起作用的其它分子。尽管这些佐剂典型的用于增强对灭活疫苗的免疫应答，它们也可以与活疫苗一起使用。TLR的激动剂或拮抗剂二者都可用于活疫苗的情况。在病毒经粘膜路径，例如口服路径递送的情况下，粘膜佐剂诸如大肠杆菌热不稳定毒素(LT)或LT的突变体衍生物可用作佐剂。此外，可以将编码具有佐剂活性的细胞因子的基因插入病毒。这样，可以将编码细胞因子诸如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13或IL-5的基因与外源抗原基因一起插入以产生导致免疫应答增强的疫苗，或者调节免疫性以更加特异性的定向于细胞、体液或粘膜应答。
在登革热病毒和/或包含登革热病毒的膜蛋白和包膜蛋白的嵌合黄病毒的情况中，针对它们的最佳接种可包括针对全部四种登革热血清型的免疫原性的诱导，本发明的病毒可用于配制四价疫苗。如本文所述，用于此类四价配制剂的任一或所有病毒可包含降低亲内脏向性的一处或多处突变。所述病毒可以在配制过程的任何时间点混合以形成四价制剂，或者可序贯施用。在四价疫苗的情况中，可使用等同量的每种病毒。或者，所施用疫苗中存在的每种不同病毒的量可以不同(WO03/101397A2)。
本发明的黄病毒还可用于递送异源基因产物，诸如疫苗抗原或其它治疗剂(参阅例如WO02/102828;美国专利No.6,589,531;和WO02/072835)。
本发明部分基于以下实验结果。
实验结果和实施例
背景和概述
在本发明的一个实施例中，在本文中称为ChimeriVaxTM-WN02的嵌合黄病毒疫苗候选株内构建诸如上述的突变，所述嵌合黄病毒疫苗候选株包含黄热病病毒(YF17D)的衣壳和非结构蛋白及西尼罗河病毒(NY99)的前膜和包膜蛋白，下文有进一步的记载。此疫苗候选株已经过临床前和I期临床研究的测试。尽管它表现出在小鼠和恒河猴(rhesusmonkey)中高度减毒且有免疫原性，它与对照黄热病(YF)17D疫苗相比根据接种后病毒血症的判断在猕猴(cynomolgusmonkey)中和在I期试验的若干人类志愿者(N=45)中诱发了更活跃的复制。即使它在I期试验中耐受良好且有高度免疫原性，根据病毒血症水平，我们通过特异诱变的手段进行研究以进一步提高ChimeriVaxTM-WN02的安全特性，目的是达到与ChimeriVaxTM-WN02变体相比在小型动物（仓鼠）中的病毒血症有轻微降低。采用了三种诱变方法，分别论述于以下实施例中。在第一种方法中，将小段核苷酸删除引入了病毒的3’-非翻译区(3’UTR)。在第二种方法中，将氨基酸删除引入了衣壳蛋白。在第三种方法中，将特定的减毒氨基酸取代引入了病毒的包膜蛋白。正如下文及本文其它地方所进一步论述的，这些类型的突变可以彼此组合（及与其它减毒的或其它方面的有益突变组合）来构建本发明的病毒。
ChimeriVaxTM-WN02
最初的YF17D/WN嵌合体包含来自WN病毒NY99株的野生型prM-E基因序列，命名为ChimeriVaxTM-WN01，是使用标准双质粒系统构建的(Arroyoetal.,J.Virol.78:12497-12507,2004)。将质粒pYF5’3’IV/SA14-14-2（包含用于ChimeriVaxTM-JE疫苗病毒的cDNA的5’和3’部分）和pYFM5.2/SA14-14-2（包含ChimeriVaxTM-JEcDNA的大段中间部分）中的JE特异性prM-E基因序列用NY99WN亲本的相应cDNA序列取代。ChimeriVaxTM-WN01病毒如下获取，通过体外连接来自所得pYWN5'3'N1Δ3和pYWN5.2/5质粒的片段，获得全长DNA模板，随后体外转录并用所得RNA转录物转染Vero细胞。新的嵌合病毒显示出与WNNY99和YF17D相比对小鼠和恒河猴显著减毒，尽管它保留了对成年小鼠的轻微神经毒力。通过在包膜(E)蛋白的残基E107、E316和E440（见下文表3）处引入三个SA14-14-2JE疫苗特异性氨基酸变化，使其进一步减毒。包含这些突变的两个新质粒命名为pYWN5'3'NF3Δ2和pYWN5.2316/440#2。基于命名为ChimeriVaxTM-WN02的所得三联突变体在小鼠和猴中的测试结果，得出结论，它得到了充分减毒，从而可在I期临床试验中进一步测试。所述试验在健康成年人中进行（对于105pfu的接种剂量，N=30；而对于103pfu的剂量，N=15）。出乎意料的是，在两个剂量组的接种志愿者中都有数人发生病毒血症，在统计学上显著高于YF-Vax对照（直到高3.5倍）。这说明，尽管所述疫苗耐受良好且有免疫性，仍可进一步开发以获得更加减毒的ChimeriVaxTM-WN疫苗变体。高病毒血症水平可能指示外周器官中病毒的过度复制，而且可能呈现部分接种者发生出血症状的风险，与经典的黄热病相似，或者由于穿过血脑屏障而发生脑炎的危险，基于对致脑炎黄病毒的了解高病毒血症可对此起促进作用。
因而，ChimeriVaxTM-WN02疫苗唯一的次最佳参数略微高于在一部分人类志愿者中观察到的预期接种后病毒血症，这可能指示外周器官中的过度复制（亲内脏向性）。因为起始ChimeriVaxTM-WN02病毒已经是高度减毒的疫苗候选株，而非有毒力的野生型分离株，所以我们试图鉴定不会使疫苗过度减毒的新突变。我们寻找在适当的动物模型（在下文所述实验中我们使用了仓鼠）中及随后在人中阻止高病毒血症发生但不显著降低功效的突变。
新的ChimeriVaxTM-WN04候选株的产生和表征所涉及的实验步骤包括：
－构建含有期望突变的质粒DNA。具体而言，将所有突变如下引入最初的ChimeriVaxTM-WN02质粒pYWN5'3'NF3Δ2和pYWN5.2316/440#2，利用简单的或交叠的PCR技术进行标准的寡核苷酸指导的诱变，随后将所得PCR产物连接入这些质粒并通过在大肠杆菌中克隆及对个别克隆测序来选择突变质粒。
－体外连接适当的pYWN5'3'和pYWN5.2系列质粒的EagI-BspEI大片段以获得全长cDNA模板，随后用XhoI线性化。
－用SP6RNA聚合酶进行全长DNA模板的体外转录以产生合成的、有感染性的RNA。
－通过用脂转染胺试剂(lipofectamine)或电穿孔转染Vero细胞产生突变型ChimeriVaxTM-WN04病毒并收获第一代(P1)病毒样本，随后在无血清培养基中进行后续传代以获取P2病毒原种。
－通过监测细胞病理效应(CPE)、细胞上清液的噬斑测定法、及灵敏T-PCR对病毒RNA的检测来证实突变型病毒的生存力。
－通过P2水平病毒基因组RNA的共有测序来证实期望突变的存在（并通过对传代至P5水平的病毒进行测序来初步分析遗传稳定性）。
－通过Vero细胞中P2病毒的标准滴定来分析噬斑形态和生长特性。
－通过测量第1-9天的接种后病毒血症来分析接种105pfu/剂P2病毒样品的叙利亚仓鼠内的亲内脏向性；通过在第30天用标准50%噬斑减少中和测试(PRNT50)测量WN病毒特异性中和抗体的血清滴度来分析免疫原性。
如下文所述，我们在ChimeriVaxTM-WN02病毒的3'UTR或衣壳(C)蛋白内引入了删除，试图在此已验证的高度减毒疫苗候选株中达到很轻微的减毒效果。通过3'UTR内5-16个核苷酸长的小段删除或蛋白C内3个氨基酸的删除达到了此目的。3'UTR内的一些删除是基于YF17D病毒3′UTR的预测二级结构设计的短（5-6个核苷酸）删除(Proutskietal.,J.Gen.Virol.78:1543-1549,1999)。目的是特异性的使位于3'UTR中部、任何保守序列元件之外的一些特定计算机预测主干-环结构不稳定。在第三种方法中，我们在ChimeriVaxTM-WN02的E蛋白内引入了别的SA14-14-2减毒突变，这与我们用于从ChimeriVaxTM-WN01开发出ChimeriVaxTM-WN02的方法相同。在仓鼠模型中监测了这些修饰的效果。鉴定得出ChimeriVaxTM-WN04变体在仓鼠中导致亲内脏向性有期望的少许减弱。
通过在3'UTR内引入特异性删除构建ChimeriVaxTM-WN04-3'UTR候选株
如上所述，图1A显示了所有ChimeriVaxTM病毒所共享的YF17D特异性3'UTR的构成。它从3’端开始依次包含(i)对于所有黄病毒保守的3’-极远端主干-环结构，(ii)两个保守序列元件CS1和CS2，及(iii)位于3’UTR上游部分的三拷贝重复序列元件(RS)(Chambersetal.,Annu.Rev.Microbiol.44:649-688,1990)。此区域内的删除的一个有价值特征是它们的稳定性，因为病毒复制过程中的自发逆转实质上是不可能的。我们在ChimeriVaxTM-WN02病毒（使用质粒pYWN5'3'NF3Δ2)中引入的、产生新的ChimeriVaxTM-WN04-3'UTR候选株的11处删除如图1A所示，包括：
－去除三个RS元件的dRS删除（YF17D3'UTR的第18-164位核苷酸ATAACCGGG...-...TCCACAC；从病毒ORF的TGA终止密码子之后的第一个3'UTR核苷酸开始编号）；
－四处5-6个核苷酸的小段删除：存在于RS与CS2之间的dA（第229-234位核苷酸，GCAGTG）、dB（第256-260位核苷酸，CAGGT）、dC（第293-297位核苷酸，CCAGA）和dD（第308-312位核苷酸，CGGAG），设计用于使图2B所示的个别计算机预测主干-环/伪结(pseudoknot)结构不稳定(Proutskietal.,J.Gen.Virol.78:1543-1549,1999)；
－105个核苷酸的大段删除，d105（第218-321位核苷酸，TAAGCT...-...CCGCTA），它去除了RS与CS2之间的大部分核苷酸（相似的删除得到野生型DEN4的耐受但显著减少了在体外和在体内的复制(Menetal.,J.Virol.70:3930-3937,1996)，因此我们预计它对于ChimeriVaxTM-WN02会是过度减毒的）;
－30个核苷酸的删除，d30（第322-351位核苷酸，CCACCC...-...GACGG），位于CS2的上游，模仿最初记载使野生型DEN4病毒减毒的Δ30突变(Menetal.,J.Virol.70:3930-3937,1996;美国专利No.6,184,024B1）；
-两处较小的删除，d7（第345-351位核苷酸，AAGACGG）和d14（第338-351位核苷酸，TGGTAGAAAGACGG），位于Δ30区内，对此进行测试是因为我们预计上述d30突变可在体外和/或在体内使ChimeriVaxTM-WN02过度减毒；
－CS2区内的两处5个和16个核苷酸的小段删除，命名为CS2d5（第360-364位核苷酸，GGTTA）和CS2d16（第360-375位核苷酸，GGTTAGAGGAGACCCT）。
通过对P1和P2代期间CPE的仔细显微镜观察来监测突变型病毒的生存力，以及随后传代至P5来评估可生存突变体的遗传稳定性并确定任何第二位点突变是否会恢复表观不能活的突变体的生存力。这些观察结果得到了RT-PCR和Vero细胞内的噬斑测定法的证实。噬斑测定法还产生了关于突变型病毒滴度（其指示Vero细胞内的生长特性）和关于噬斑形态变化（其由引入的删除所致）的重要信息。在P2和P5水平对可存活病毒基因组的相关部分进行了测序。这些实验的结果总结于表1中。
根据表1中的数据，我们得出结论：
1)尽管dRS删除是大段删除，但它在体外没有造成显著的减毒作用，因为突变型病毒产生大且清楚的噬斑，与ChimeriVaxTM-WN02LP对照（大噬斑对照；参阅表1的脚注1）的噬斑相似，而且生长至6x106PFU/ml的相对高滴度。此结果是预料中的，因为相似的删除对YF17D病毒体外复制几乎没有影响(Bredenbeeketal.,J.Gen.Virol.84:1261-1268,2003)，而且相似的大段删除不降低ChimeriVaxTM-JE病毒在乳鼠中的神经毒力。
2)根据噬斑形态的判断，小段删除dA、dB、dC和dD在体外引起了显著的减毒作用。全部四种突变型病毒的噬斑大小减小了；dD病毒的噬斑是不透明的（LP和SPWN02两种对照的噬斑都是透明的）。病毒在P2代生长至超过106PFU/ml的相对高滴度，这对于制备而言是合乎需要的特征（表1；除了dA突变体的滴度之外，它因为在此实验中形成的噬斑太小不能计数所以不能确定）。这些结果表明预测的主干-环/假结结构（图1B）确实存在且对于黄病毒复制是重要的。与耐受CS2上游此区域内的大段删除的野生型DEN4病毒(Menetal.,J.Virol.70:3930-3937,1996)相反，涵盖小段删除所靶向的所有结构元件的大段d105删除对于ChimeriVaxTM-WN02病毒是过度减毒的（致死的）。
3)紧邻于CS2之前的区域内与Δ30突变(Menetal.,J.Virol.70:3930-3937,1996;美国专利No.6,184,024B1)相似的d30删除以及较短删除d14是致死的。此区域内得到ChimeriVaxTM-WN02耐受的唯一突变是小段d7删除。它具有减毒作用，因为它在形态上使噬斑缩小。
4)小段CS2d5和CS2d16删除在体外具有中等减毒效果，因为包含所述删除的突变体形成中型大小的不透明噬斑。预计这些突变影响包含第10,708位核苷酸处XbaI限制性位点序列的预测主干-环结构，如图1B所示。
在这些实验中，我们首次证明了3'UTR保守元件之外的小段删除可提供一定程度的减毒作用。此外，我们首次证明了特异性的使个别预测主干-环/假结结构不稳定导致减毒。另外，在包括YF17D病毒在内的黄病毒的3'UTR内存在许多预测的主干-环/假结结构，为获得一序列的减毒效果提供了多种多样的机会。这些结构或结构之间的区域目前可作为本领域技术人员可引入的小段删除的靶向位置。根据我们的发现，目前可预计任何这些结构的诱变都可提供一定程度的减毒作用。从一序列效果中进行挑选可以选择到具有期望减毒程度的突变体。
表1.ChimeriVaxTM-WN04-3'UTR删除突变体的体外特征
突变 突变体的生存力 P2滴度，PFU/ml 噬斑形态
dRS 能生存 6x106 大且透明
dA 能生存 N/D2 微小
dB 能生存 6.3x106 比SP对照小
dC 能生存 1.5x106 微小
dD 能生存 6.6x106 中型，不透明
CS2d5 能生存 1.2x107 中型，不透明
CS2d16 能生存 5.3x106 中型，不透明
d7 能生存 5.2x106 比SP对照小
d14 不能生存 N/A 无噬斑
d30 不能生存 N/A 无噬斑
d105 不能生存 N/A 无噬斑
WN02LP对照1 大且透明
WN02SP对照1 小且透明
1LP和SP对照病毒（只用于在噬斑测定法中比较噬斑形态）事先通过噬斑纯化分离自制备的ChimeriVaxTM-WN02P5病毒样品，所述样品是大噬斑(LP)群和小噬斑(SP)群；SP变体看起来归因于M66Leu变成Pro这一氨基酸变化的积累。
2N/D–在感染后第5天为了精确计数进行中性红染色时由于噬斑太小而未测定。
应提及的是包括YF17D病毒在内的黄病毒的3’UTR的真正二级结构是未知的，因为没有有效的方法从实验上证实它们在完整病毒背景中的存在，因此已发表的预测，例如Proutski及其同事关于YF17D的预测（图1B），可能是不正确的。可以预测在相对较长的RNA分子中形成许多可选择的结构(Zukeretal.,N.A.R.19:2707-2714,2001)，而且有可能的是不同的结构（在正链或负链内）在病毒生活周期的不同阶段形成和起作用。真实的结构可受到各种各样假结形成(Olsthoornetal.,RNA7:1370-1377,2001)和远距离RNA相互作用（例如RNA环化和其它相互作用(Alvarezetal.,J.Virol.79:6631-6643,2005)）以及可能的与宿主和病毒蛋白质的RNA相互作用的影响。为了对已发表的理论计算机预测结果进行进一步的复杂的说明，经常使用手工操作，诸如局部序列的初始折叠及随后将最初预测结构施加于更长RNA序列的结构中，在初始折叠步骤中人为使用N，及主观选择优选的结构元件(例如Mutebietal.,J.Virol.78:9652-9665,2004)。为此，我们使用常用的Zuker预测算法来折叠YF17D的3’UTRRNA序列。预测的最佳结构如图1C所示，它与图1B所示的Proutsky预测不同。重要的是图1A和1B中的小段删除dA、dB、dC、dD、d7和d14通常使预测的天然YF17D最佳（图1C）和次最佳结构不稳定。图1D显示了所述改变了的最佳结构的一个例子（对于dC突变体）。相反，CS2d5和CS2d16删除（图1A和1B）没有显著改变最佳天然结构，表明这些删除可能通过改变CS2本身序列而非3’UTR结构或者通过改变有些次最佳结构，使病毒减毒（对于ChimeriVaxTM-WN的减毒作用在仓鼠模型中得到证实）。因此，即使有些删除是基于Proutski结构预测设计的（图1B），它们的真正效果可能归因于使不同结构元件而非图1B中的预测主干-环不稳定。
为了分析遗传稳定性，将dC突变体在无血清Vero细胞中从P2传代至P5水平并对P5病毒测序后，发现5个核苷酸的删除自发增加到了24个核苷酸的长度（第277-300位核苷酸，TCTGGGACCTCCCACCCCA被删除）。（其它删除（dRS、d7、CS2d5、CS2d16、dA、dB和dD）在同样的遗传稳定性传代中是稳定的。）删除的大小增加的效果是预测的二级结构变得与最初的最佳YF17D结构相似（图1E；与图1C比较）。这种自发变化看起来是一种细胞培养的适应性改变。P2和P5两种变体在仓鼠中都是高度减毒和有免疫原性的（参见表5的脚注4）。因此，dC突变体的P5变体可能具有合乎需要的疫苗表型。通过在YF17D特异的衣壳蛋白C中引入特定删除进行的ChimeriVaxTM-WN04-C候选株的构建
我们使用ProteinPredict和Protean方法进行的YF17DC蛋白质结构的计算机分析预测出它的一般构成与TBE的（图2B）没有实质性不同。我们推断ChimeriVaxTM-WN02内蛋白质中的大段删除将最有可能造成过度减毒。因此，我们引入了如图2B所示的3-4个氨基酸的5处小段删除（删除的残基以方框标示）。将删除引入已涵盖完整C蛋白基因的ChimeriVaxTM-WN02质粒pYWN5'3′NF3Δ2。头三处删除（C1-3；每个长3个氨基酸）位于Kofleretal.,J.Virol.76:3534-3543,2002中关于TBE记载的相同的大体区域。不过，我们确定了突变的位置以便测试特定结构特征的重要性：C1删除位于中央疏水区段和预测的螺旋I二者的上游，C2只影响螺旋I，而C3预计会干扰螺旋I和中央疏水区段二者。此外，C4删除（长4个氨基酸）设计成靶向羧基末端的预测的螺旋III，蛋白质带正电荷的部分，而C5删除（3个氨基酸）位于螺旋III与IV之间（它还消除了位于胞内形式蛋白质的C末端的NS2b/NS3-病毒蛋白酶切割位点；引入它是为了确定任何第二个位点的突变是否可补偿预计的多蛋白加工缺陷）。
WN04-C突变体的体外表征结果总结于表2中。只有C1和C2突变体能生存，而C3-C5删除是致死的。尽管C5突变的强有害效果并不令人惊讶，但有趣的是羧基末端，蛋白质带正电荷的部分的小段删除（C4）是致死的，表明此区域内的序列/结构改变是病毒所不能忍受的。最令人惊讶的是观察到C3删除也是致死的，因为它位于TBE病毒背景中耐受大段删除的相同的大体区域内。通过测序证实了C1和C2变体中删除的存在。P2和P5水平病毒内完整结构蛋白区的测序结果如表2所示。虽然C1变体在残基M14和E313处积累变化（它们在P5代表现为异质性，但在P2代则不是（认为E313处的变化是先前在ChimeriVaxTM-WN02中观察到积累的无血清病毒生长条件的适应）），但C2变体看起来在遗传上是稳定的。后一种病毒在P2和P5都包含残基M71处的异质性，但传代过程中突变体与非突变体的比率(~80%)没有变化。根据噬斑形态的判断，C1变体与ChimeriVaxTM-WN02相比没有减毒，而C2变体看起来是减毒了，因为它形成了小噬斑，表明了螺旋I的重要性。两种突变体都在Vero细胞中生长至高滴度（约107PFU/ml）。没有先前公布的资料显示这样的小段删除可使黄病毒减毒或者具有实用价值。在我们的研究中能生存的C1和C2突变体的成功产生为证明YF17D病毒或ChimeriVaxTM疫苗病毒可耐受中央疏水区上游和α-螺旋I起始处的小段删除提供了证据。
表2.ChimeriVaxTM-WN04-C突变体的体外表征
1WN02对照病毒（只在噬斑测定法中用于比较噬斑形态）是用ChimeriVaxTM-WN02体外RNA转录物转染细胞获得的P1样本。
2用一致的方法对完整结构蛋白区（C-prM-E基因）测序以证实预期删除并检查任何其它氨基酸变化/异质性的存在。
通过在包膜(E)蛋白中引入另外的SA14-14-2特异的改变进行的ChimeriVaxTM-WN04-E候选株的构建
野生型JE病毒(Nakayama)和SA14-14-2疫苗株中不同的E蛋白残基以及WNNY99中相应位置的残基如表3所示。如上所述，ChimeriVaxTM-WN02疫苗变体的期望程度减毒最初是通过将三个SA14-14-2特异的残基E107、E316和E440引入原先构建好的、包含野生型NY99株特异的prM-E基因的YF17D/WN嵌合体（WN01病毒）中达到的。ChimeriVaxTM-WN02（和WN01）还包含SA14-14-2和NY99两种病毒中一致的E227丝氨酸残基。
表3.为降低ChimeriVaxTM-WN021的亲内脏向性将在ChimeriVaxTM-WN04内组合的包膜蛋白E内的SA14-14-2JE疫苗特异的残基
1已存在于ChimeriVaxTM-WN02内的1SA-14-14-2特异的残基以粗体标示；注意，残基E227在SA14-14-2与WNNY99中是相同的（丝氨酸），因此不需要通过特异的诱变来改变。
2氨基酸编号依照WN病毒E蛋白的编号方式。
先前在选择WN02疫苗候选株过程中构建的所有质粒(Arroyoetal.,J.Virol.78:12497-12507,2004)和我们最近构建的那些质粒（两个基础pYWN5'3'和pYWN5.2构建体）如图4所示。嵌合病毒E蛋白内SA14-14-2突变的期望集合是通过将来自适当的pYWN5'3'和pYWN5.2质粒的特定成对DNA片段经由E基因内EagI限制性位点体外连接而获得的，例如ChimeriVaxTM-WN02是通过pYWN5'3'NF3Δ2和pYWN5.2316/440#2连接产生的。有些组合先前已在小鼠和猴中进行了测试，由此选择了WN02候选株供进一步在人中进行测试(Arroyoetal.,J.Virol.78:12497-12507,2004)。我们掺入两个新的pYWN5'3'质粒的M66突变（M蛋白的第66位残基亮氨酸变成脯氨酸）是大规模制备过程中ChimeriVaxTM-WN02疫苗内积累的细胞培养适应性改变。它减小了病毒噬斑大小，但对小鼠的神经毒力没有影响(Arroyoetal.,J.Virol.78:12497-12507,2004)。根据我们最近来自I期人体试验及另外的猴实验的结果，它降低了病毒对灵长类动物的亲内脏向性并由此看起来是对疫苗性能有益的突变，提高了安全性。因为目前的ChimeriVaxTM-WN02疫苗是大噬斑与小噬斑的混合物，在有些人中引起了稍高于预期的病毒血症，所以进行了额外的工作来降低亲内脏向性。例如，最近对小噬斑变体进行了噬斑纯化，目前正在猴中进行测试。具有先前未测试的突变组合的新构建变体记载如下。
表4.新的ChimeriVaxTM-WN04-E变体：引入的突变和病毒的体外表征
1所有病毒都是通过转染Vero细胞获得的；在病毒名称中，“A”表示全长DNA模板制备（3片段连接）中的变异，而“R”表示重复转染获得的病毒；划上阴影的病毒选择用于在仓鼠中进行进一步测试。
2WN02SA14-14-2特异的残基：E107、227、316和440；M66改变是已知减小WN02病毒噬斑大小的细胞培养适应性改变。
3L+S，大噬斑与小噬斑的表观混合物（在1R病毒内）；S，小噬斑；<L+S，噬斑看起来是大噬斑与小噬斑的混合物，但总体大小稍小于1R病毒(L+S)。
4通过一致的方法对完整结构蛋白区（C-prM-E基因）测序以证实预期的突变（逐个证实，除非另有说明）；列出了检测到的其它氨基酸变化/异质性。
有关新ChimeriVaxTM-WN04-E构建体的生存力和体外表征的数据总结于表4中。病毒11，其中我们尝试联合所有10个SA14-14-2特异的残基，看来是不能生存的，因为它在感染后不诱导CPE，后续传代过程中在噬斑测定法中不形成噬斑，而且它的基因组RNA不能通过灵敏的RT-PCR反应在细胞上清液中检测到。表4中所列出的包含5至9个SA14-14-2变化的其它新病毒是能生存的（所有的3、4、5、6和7号样本）。其中的大多数看来轻微减毒，因为它们的噬斑稍微小于WN02对照（病毒1R）的噬斑，尽管它们生长到超过106-107pfu/ml的相对高滴度；唯一的例外是病毒4，它由于同时添加E138和M66突变使它看来是过度减毒的（微小的噬斑和很低的滴度）。
通过一致的测序证实了病毒3、5和7中的预期SA14-14-2变化。病毒6是奇怪的，因为它的6R样本在P2测序时缺少预期突变之一：它在残基E244处具有野生型谷氨酸代替甘氨酸（它还缺少为了形成SphI限制性位点而特意在E244三联体下游引入的两个沉默核苷酸变化）。另一样本，6A，在残基E244处具有缬氨酸，不同于野生型WN和SA14-14-2序列（它具有预期的SphI位点）。病毒序列中的这些变化是未预料到的，因为用于产生6R、6A和11体外RNA转录物的pYWN5.2/8mut质粒制品中的整个病毒特异区经过测序的证实。有可能E244SA14-14-2特异的变化（在单独的或者联合一些其它变化诸如E264时）对于ChimeriVaxTM-WN是致死的，这可解释为何病毒11不能恢复。恢复生存力的6R和6A样本中检测到的此残基的修饰可归因于病毒复制过程中病毒聚合酶的错配（最可能是病毒6A的情况）、pYWN5.2/8mut质粒在细菌中的不稳定性、或质粒测序未揭示的另一细菌克隆的轻微污染。已测序的P2病毒是相对均一的，除了有些病毒开始显示出一些另外的突变的积累之外，其中的一些是可预期的（例如E313由G向R的变化，它是ChimeriVaxTM-WN的不影响生物学表型的已知无血清细胞培养适应性改变）。在传代至P5水平的过程中积累了更多的不同突变。根据这些观察结果，P2水平的病毒3、5、6A和7（表4中划阴影部分）选择用来在仓鼠中进行有关亲内脏向性/免疫原性的进一步测试。
ChimeriVaxTM-WN04变体在仓鼠中进行的亲内脏向性和免疫原性分析
用小鼠作为灵敏的小型动物模型来证明ChimeriVaxTM-WN疫苗候选株神经毒力的下降（这是减毒的重要指标）及它的高免疫原性(Arroyoetal.,J.Virol.78:12497-12507,2004)。不过，此模型不能用于预测在猴和人类中的亲内脏向性水平（这是减毒的另一个重要标志），因为嵌合体在小鼠中不诱发可检测的病毒血症。有些黄病毒在仓鼠内诱发高水平的病毒血症，正如最近关于野生型WN病毒所显示的(Teshetal.,Emerg.Inf.Dis.8:1392-1397,2002)。我们最近使用ChimeriVaxTM-WN02疫苗（大噬斑与小噬斑病毒的混合物）及经噬斑纯化的LP和SP变体进行的研究证明了这些病毒在雌性叙利亚仓鼠内引起的病毒血症与在人类志愿者和猕猴中观察到的病毒血症之间有很好的相关性。具体而言，对人而言减毒较少的LP变体在仓鼠内诱发了可容易检测到的病毒血症，而减毒更多的SP病毒则诱发了很低或检测不到的病毒血症。我们利用这种新的小型动物模型来研究上述WN04突变是否降低亲内脏向性，而不妨碍有效的抗WN免疫应答的发生。
所有规程都是在AcambisIACUC批准的方案下依照NIH有关实验室动物人道处理的要求进行的。给四周龄雌性叙利亚仓鼠皮下(SC)接种105pfu的选定ChimeriVaxTM-WN04候选株以及WN02LP和SP对照病毒或者约104pfu的YF17D，随后在个别动物内测量第1、3、5、7和9天的病毒血症（动物在麻醉状态下采血并用噬斑测定法测定所收获血清中的病毒滴度）及通过标准50%噬斑减少中和测试(PRNT50)测量第30天的抗体应答。结果如表5所示。
表5.雌性叙利亚仓鼠在SC接种后对ChimeriVaxTM-WN04变体的病毒血症和抗体应答
1接种体积：100μl；接种剂量：ChimeriVaxTM-WN04病毒及WN02LP和SP对照为105pfu，而YF17D(YF-VAX)为大约104pfu；模拟接种动物接受100μl稀释培养基(MEM,50%FBS)。
2检测水平：25PFU/ml。
3在第30天通过PRNT50测定针对以下病毒的中和抗体滴度：接种ChimeriVaxTM-WN变体的所有组为ChimeriVaxTM-WN02、或YF-VAX组为YF17D，或模拟接种组为以上两种病毒。
4在分开的仓鼠实验中测试了dC突变体的第5代(P5)样本，其中删除自发增加到24个核苷酸（见上文）。病毒保持高度减毒（病毒血症平均峰值为25pfu/ml，平均持续时间为3.5天）且有免疫原性（第33天的PRNT50GMT为452）。对CS2d5和CS2d16P2病毒也进行了测试，发现了相似的高度减毒和免疫原性（病毒血症平均峰值(pfu/ml)/病毒血症平均持续时间(天)/第33天的PRNT50GMT分别为137/2.75/127和343/2.25/905）。在免疫后大约10个月用野生型WN进行攻击测试时，与WN02小噬斑对照相反，用这些WN04变体包括dCP5在内免疫过的所有动物都得到了牢固保护。
ChimeriVaxTM-WN02LP对照（减毒不足的疫苗变体）在5只接种的仓鼠中诱发了从1,650到2,925PFU/ml范围（平均为2,285PFU/ml）的高峰值病毒血症。这些动物在第30天具有5,120到10,240范围（GMT6,760）的最高WN中和抗体滴度。WN02SP对照在5只动物的4只中未诱发可检测到的病毒血症；1只仓鼠在第3天检测到的低水平病毒血症是该测定法的检测极限值25PFU/ml。WN特异性抗体应答在这些动物内非常低。它在2只仓鼠内检测不到（滴度<10）；其它3只具有40-320的低抗体滴度。有趣的是，接种YF-VAX未导致可检测到的病毒血症但产生了高YF特异性中和抗体应答（320-10,240PRNT50滴度；GMT2,150）。正如所预期的，模拟接种动物在第30天没有WN或YF特异性中和抗体。
为了达到对灵长类动物的亲内脏向性有微小降低，我们理想的希望在仓鼠模型中鉴定一套ChimeriVaxTM-WN04变体，它们引起的病毒血症范围会比LP病毒所引起的低，但同时诱发比SP病毒高的免疫应答。在11种测试的ChimeriVaxTM-WN04病毒中，根据接种后病毒血症水平的判断，大多数看来与LP病毒相比在体内至少有一定程度的减毒（表5）（平均病毒血症滴度峰值在<25至1,460pfu/ml范围内）。在减毒较少的变体中有C蛋白删除突变体C1、3'UTR删除突变体dRS、及WN04-E变体#3和#5。这些病毒诱发了高度中和抗体应答（GMT1,110-2,560）。一种病毒，WN04-E变体#6A，根据很低的病毒血症和弱抗体应答二者证明是明显过度减毒的。无疑，后一种病毒可排除在进一步于猴/人类中进行测试的范围之外。具有特别有利特性的ChimeriVaxTM-WN04候选株是衣壳蛋白删除突变体C2、3'UTR小段删除突变体d7、dB、dC和dD、及E#7变体。这些病毒在仓鼠中引起病毒血症中等至剧烈的减少（平均病毒血症滴度峰值在<25至680PFU/ml范围内），却不妨碍强烈的免疫应答（中和抗体GMT370-2,940）。
为了证明保护效力，在免疫后第62天对所有动物腹膜内注射4x105PFU有毒力的野生型WN病毒（NY382/99株）进行攻击测试。根据没有出现攻击后病毒血症（在第1、3、5、7和9天收获的血清中测量）、体重减轻、症状或死亡的判断，具有高滴度WN中和抗体（在第30天）的所有动物，特别是WN04-C1、C2、dRS、d7、dB、dC、dD、E#3、E#5、E#7和WN02LP对照组内的（见表5），都得到了完全保护。其它组的至少有些动物，特别是E#6A,、WN02SP对照、YF-VAX和模拟组，它们不具有高度WN中和抗体滴度，根据至少一项上述参数的判断，没有得到保护。所有YF-VAX和模拟免疫动物中在第1-5天都存在高病毒血症（病毒血症滴度峰值高达9.75x105pfu/ml）。大多数这些动物生病，体重减轻，而且YF-VAX组中有2只动物死亡。E#6组的2只动物和WN02SP组的1只动物在第1-2天显示出低水平的病毒血症。ChimeriVaxTM-WN04变体内的突变对病毒在肝细胞内生长的影响
为了获得WN04突变造成的亲内脏向性降低的别的证据，我们分析了一些最有希望的ChimeriVaxTM-WN04变体（根据上文呈现的数据选择的，例如在仓鼠中的病毒血症低和免疫原性高；见表5）在人肝细胞瘤细胞系HepG2中的生长动力学。因为YF病毒是亲肝性(hepatotropic)病毒，我们希望见到WN04变体与ChimeriVaxTM-WN02LP病毒（减毒不足的疫苗）相比复制的减少。以0.005PFU/ml的MOI感染HepG2细胞单层，每天收获等分试样的含病毒上清液（至第10天），然后通过在Vero细胞中进行的噬斑测定法来测定病毒滴度。此实验所包括的减毒WN04变体有3'UTR删除突变体d7、dB、dC和dD，衣壳蛋白删除突变体C2（以及减毒较少的突变体C1作为另外的对照），及包膜蛋白突变体E#7。除C1突变体外，所有其它WN04病毒的复制效率不及WN02LP病毒（图5），但它们中的大多数（除dD外）的生长比WN02SP变体（认为它是对于人类过度减毒的疫苗变体）好。这表明有些WN04突变可降低疫苗在人体中的亲肝脏向性，这是非常合乎需要的特征。此实验进一步显示了与WN02LP相比展示出最明显的复制减少的E#7、d7、dC和dD候选株的好处，其中dD突变体可能是亲肝脏向性最低的。
ChimeriVaxTM-WN04双重突变体；在仓鼠中进行的趋内脏向性和免疫原性分析
不同类型减毒突变的组合应导致另外的减毒作用及更可靠的疫苗表型，更不可能恢复致病性。为此，构建了四种双重突变型ChimeriVaxTM-WN04变体，其中将C2删除与d7、dB或dD3'UTR删除联合或与包膜蛋白内的E#5突变组合（另外的E176、177和280位SA14-14-2特异的变化）联合。用于体外转录的DNA模板是用先前为WN04单一突变体构建的5'3'和5.2质粒的适当部分通过标准两片段或三片段连接获得的。用SP6RNA聚合酶转录这些DNA模板，并在用RNA转录物电穿孔Vero细胞后回收病毒。在Vero细胞内滴定P2病毒。所有四种双重突变体均因其在细胞培养中产生微小噬斑（小于WN02LP和SP对照的）而表现为得到强减毒。C2+E5突变体具有1.3x107pfu/ml的高滴度，而其它3种病毒（C2+d7、C2+dB和C2+dD）具有4.2-6.1x105pfu/ml的中间滴度（表6）。
表6.ChimeriVaxTM-WN04双重突变体的体外表征
病毒 P2滴度，PFU/ml 第5天的噬斑形态
C2+E5P2 1.3x107 微小（平均约0.5mm）
C2+d7P2 4.2x105 微小
C2+dB P2 6.1x105 微小
C2+dD P2 6.1x105 微小
WN02LP对照 9x106 大/小，透明
WN02SP对照 5.8x107 小，透明
为了评估减毒作用和免疫原性，给四周龄叙利亚仓鼠皮下(SC)接种105pfu的双重突变体，以及WN02LP和SP对照病毒，或稀释剂（伪装品）。在第1-10天测量病毒血症，在第35天通过PRNT50测定抗体应答。结果如表7显示。四种双重突变体是有复制能力的，在大多数动物内引起了可检测到的低水平病毒血症，除了C2+d7只在一只动物内检测到病毒血症之外。这些病毒与WN02LP病毒相比显著的更减毒（平均峰值病毒血症约7,000pfu/ml），而且与相应的单一突变体相比看来更减毒（例如比较平均峰值病毒血症滴度与表5中的那些数值）。尽管不是在每一只动物内都检测到病毒血症，但所有仓鼠都产生了高水平的中和抗体应答。C2+E5、C2+d7、C2+dB和C2+dD的PRNT50GMT数值分别是1:640、1:840、1:1,280和1:640。
表7.雌性叙利亚仓鼠在SC接种后针对ChimeriVaxTM-WN04双重突变体变体的病毒血症和抗体应答
1病毒血症检测极限50pfu/ml；第8-10天也测试了，未检测到病毒血症。2因为不是所有动物都达到了产生50%中和的血清稀释度，所以此数值可能显著高于所显示的。
为了证实保护作用，在第36天以2x105pfu/剂给动物腹膜内注射高度致死的野生型WN病毒，NY385/99株（比上文实验中所使用的NY382/99更致病）以进行攻击测试。用WN04双重突变体、以及WN02LP对照免疫的动物得到了完全保护，因为不存在指示疾病的攻击后病毒血症（在第2、4和6天测量）和体重减轻。相反，WN02SP和伪装品所免疫的对照动物则未得到保护。它们产生了病毒血症（WN02SP和伪装品免疫动物的峰值滴度分别为250-3,000和>2,000pfu/ml），表现出疾病的症状且体重减轻。WN02SP组的5只动物和伪装品组的5只动物中分别有1只和4只死亡。WN02SP组存活的2只动物和伪装品组存活的1只动物瘫痪。
如此，通过使用黄病毒减毒的三种不同方法的独特修饰，及单独或联合引入不同类型的减毒突变，我们成功的生成了与先前的ChimeriVaxTM-WN02疫苗相比更减毒但不是过度减毒的多种ChimeriVaxTM-WN04候选株。

Claims (6)

1.包含YF17D株黄热病病毒的嵌合黄病毒，其中该黄热病病毒中的膜蛋白和包膜蛋白用NY99株西尼罗河病毒的膜蛋白和包膜蛋白替换，其中该嵌合黄病毒包含下述突变：
(a)包膜蛋白中的L107F、A316V和K440R取代；
(b)衣壳蛋白第40-42位氨基酸的删除(C2)；和
(c)选自下组的突变：
(i)该嵌合黄病毒3’非翻译区(3’UTR)中选自下组的删除：第256-260
位核苷酸的删除(dB)、第308-312位核苷酸的删除(dD)、或第345-351位核苷酸的删除(d7)，其中核苷酸编号始于病毒可读框(ORF)UGA终止密码子后的3’UTR的第一个核苷酸，或
(ii)包膜蛋白中的Y176V、T177A和K280M取代。
2.权利要求1的嵌合黄病毒，其中所述嵌合黄病毒的西尼罗河病毒包膜蛋白进一步包含第138位包膜氨基酸中的取代。
3.含有权利要求1或2的嵌合黄病毒和药学可接受载体或稀释剂的药用组合物。
4.权利要求3的组合物在制备用于预防或治疗受试者中的黄病毒感染的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述黄病毒感染是西尼罗河病毒感染。
6.包含权利要求1或2的嵌合黄病毒的基因组的核酸分子。
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