BRPI0913012B1 - Quimera de ácido nucleico, métodos para detectar um anticorpo do vírus da dengue em uma amostra de um paciente, e para produzir partículas virais que expressam proteínas prm e e do vírus da dengue, uso de vírus codificado pela quimera e flavivírus ou partícula viral quiméricos - Google Patents
Quimera de ácido nucleico, métodos para detectar um anticorpo do vírus da dengue em uma amostra de um paciente, e para produzir partículas virais que expressam proteínas prm e e do vírus da dengue, uso de vírus codificado pela quimera e flavivírus ou partícula viral quiméricos Download PDFInfo
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Abstract
vírus do nilo ocidental/da dengue quiméricos. a presente invenção refere-se a vírus do nilo ocidental/dengue quiméricos compreendendo regiões que não de codificação, proteínas não estruturais, e uma proteína c de um vírus do nilo ocidental e proteínas prm e e de um vírus da dengue. também divulgados são métodos de usar os vírus quiméricos no diagnóstico de infecção viral por dengue, avaliação da eficácia da vacina contra o vírus da dengue candidata, e produção de proteínas prm e e da dengue.
Description
[001] Este reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. 61/049,342, depositado em 30 de abril de 2008, que é incorporado aqui em sua totalidade.
[002] A descrição se refere a flavivírus quiméricos, particularmen te construtos de vírus do Nilo Ocidental/vírus da Dengue quiméricos. Além disso, ela se refere a métodos de usar estas quimeras no diagnóstico de infecção por flavivírus e avaliar a eficácia da vacina contra o vírus da Dengue candidata.
[003] O vírus da Dengue (DENV) é a causa arboviral mais impor tante de morbidez e mortalidade por todo o mundo. Existem correntemente 2,5 bilhões de pessoas vivendo em regiões endêmicas de dengue com aproximadamente 100 milhões de casos anuais de dengue e centenas de milhares de casos de febre hemorrágica da dengue e sín- drome de choque da dengue (Gubler, Clin. Microbiol. Rev. 11:480-496, 1998). Nenhuma vacina está correntemente e comercialmente disponível contra qualquer um dos quatro sorotipos de DENV (DENV 1-4) grandemente porque a produção da vacina é impedida pelo fato de que anticorpos neutralizantes para um sorotipo não neutralizam efetivamente os sorotipos de DENV remanescentes (Halstead e O’Rourke, J. Exp. Med. 146:201-217, 1977). De fato, níveis baixos destes anti- corpos podem aumentar de fato o risco para doença mais severa durante infecção secundária devido a um fenômeno conhecido como intensificação mediada por anticorpo, que ocorre quando anticorpos contra um sorotipo de DENV ligam em uma maneira não neutralizante a partículas de DENV de um outro sorotipo. Esta ligação permite infecção aumentada de células portadores do receptor Fc, tais como ma- crófagos, que podem mudar o perfil de infecção do vírus ou causar uma liberação de quimiocinas levando à febre hemorrágica da dengue ou síndrome de choque da dengue (Halstead e O’Rourke, J. Exp. Med. 146:201-217, 1977).
[004] O vírus do Nilo Ocidental (WNV) é um membro do soro- complexo da encefalite japonesa no gênero Flavivirus, família Flaviviri- dae. Até meados dos anos 90, WNV causou explosões esporádicas de enfermidade na África, no Oriente Médio, e Ásia Ocidental. Entretanto, desde 1996, encefalite do WN tem sido relatada mais frequentemente na Europa, no Oriente Médio, Norte da África e África Ocidental, e Rússia. WNV emergiu no hemisfério ocidental em 1999 e tem tornado a causa principal de encefalite arboviral em seres humanos e equinos na América do Norte. Existem duas linhagens de WNV. A linhagem 1, da qual a cepa NY99 é um membro, é a cepa mais virulenta e é a cepa predominante que infecta seres humanos e cavalos (Jordan et al., Viral Immunol. 13:435-446, 2000). Não existe correntemente nenhuma vacina aprovada para WNV para proteger populações humanas em perigo de doença do WN.
[005] Divulgados aqui são flavivírus quiméricos incluindo regiões que não de codificação, proteínas não estruturais, e uma proteína C de WNV, e pelo menos uma porção de uma proteína prM e proteína E de DENV. Em algumas modalidades, a quimera inclui uma molécula de ácido nucleico primária incluindo uma região que não de codificação 5’, um ácido nucleico que codifica uma proteína C e proteínas não estruturais, e uma região que não de codificação 3’ de um vírus do Nilo Ocidental e uma molécula de ácido nucleico secundária operativamente ligada à molécula de ácido nucleico primária, que codifica pelo menos uma porção de uma proteína prM e proteína E de um vírus da Dengue. Em um exemplo particular, o flavivírus quimérico inclui se- quência(s) de nucleotídeo do vírus DEN2.
[006] Também divulgados são flavivírus quiméricos incluindo re giões que não de codificação e proteínas não estruturais de WNV e pelo menos uma porção de uma proteína C, proteína prM, e proteína E de DENV. Em algumas modalidades, a quimera inclui uma molécula de ácido nucleico primária incluindo uma região que não de codificação 5’, um ácido nucleico que codifica proteínas não estruturais, e uma região que não de codificação 3’ de um WNV e uma molécula de ácido nucleico secundária operativamente ligada à molécula de ácido nuclei- co primária, que codifica pelo menos uma porção de uma proteína C, uma proteína prM, e uma proteína E de um DENV.
[007] Em alguns exemplos, o flavivírus quimérico inclui pelo me nos uma substituição de ácido nucleico ou aminoácido que melhora características da quimera (tais como replicação aumentada em cultura celular ou infectividade ou transmissibilidade diminuída em mosquitos). Em exemplos particulares, a substituição de aminoácido está na proteína prM de DENV, proteína E de DENV, proteína NS2A de WNV, ou proteína NS4B de WNV. Em exemplos adicionais, o flavivírus quimérico inclui pelo menos uma substituição de nucleotídeo na região que não de codificação 5’ ou 3’.
[008] Em outros exemplos, o flavivírus quimérico inclui pelo me nos uma substituição de aminoácido na proteína E de DENV, em que a proteína E substituída exibe reatividade cruzada de anticorpo men- suravelmente reduzida.
[009] Também divulgados aqui são métodos de usar os flavivírus quiméricos no diagnóstico de infecção por flavivírus. Em uma modalidade particular, o método inclui detectar o anticorpo do vírus da Dengue em uma amostra, incluindo contatar uma amostra de um paciente com um flavivírus quimérico divulgado aqui e detectar a formação de um complexo de anticorpo-vírus. Em algumas modalidades os métodos de uso do flavivírus quimérico para avaliar a eficácia das vacinas contra o vírus da Dengue candidatas são divulgados. Também divulgados são métodos de produzir proteínas estruturais do vírus da Dengue utilizando os flavivírus quiméricos descritos aqui.
[010] O precedente e outras características da invenção tornar- se-ão mais evidentes a partir da descrição detalhada seguinte, que procede com referência às figuras anexas.
[011] A figura 1 é um diagrama esquemático de um flavivírus quimérico de WN/DEN2. A quimera contém a sequência de sinal de prM (entre os sítios de clivagem de NS2B-3 protease e sinalase, seta e triângulo, respectivamente), proteínas prM, e E do vírus 16681 de DEN2 na estrutura principal do vírus NY99 de WN. O alinhamento de sequência ampliado mostra o sítio de restrição SacII (sublinhado) que foi introduzido no clone de cDNA para criar o sítio de união para engendrar a quimera. As mutações introduzidas para criar o sítio SacII não mudam a sequência de aminoácido de DEN2.
[012] A figura 2 mostra o fenótipo de placa de semente do vírus de WN/DEN2 quimérico recuperada de células C6/36. A semente do vírus ampliada foi plaqueada em células Vero para visualizar as placas. A Fig. 2A mostra placas formadas pelo vírus de WN/DEN2 quimérico no dia 8 pós-infecção (p.i). A Fig. 2B mostra placas formadas pelo vírus 16681 de DEN2 no dia 8 p.i.
[013] A figura 3 mostra o fenótipo de placa de vírus de WN/DEN2 recuperado de células C6/36 ou células Vero no dia 5 p.i. nas passagens indicadas. (A) NY99 de WNV do tipo selvagem (LLC-MK2-1); (B) 16681 de DEN2 do tipo selvagem (C6-1); (C) WN/DEN2 (C6-1); (D) WN/DEN2 (C6-1/V-2); (E) WN/DEN2 (V-3); (F) WN/DEN2 (V-10).
[014] A figura 4 mostra curvas de crescimento em células Vero do NY99 de WNV do tipo selvagem (wt WNV), vírus 16681 de DEN2 do tipo selvagem (wt DENV-2), e passagens sucessivas de sementes de WN/DEN2 (semente C6-1, semente C6-1/V-2, semente V-3, e semente V-10 de WN/DEN2). Cada ponto representa um título médio de três frascos, com as barras de erro mostrando os títulos mais altos e mais baixos em cada ponto no tempo. ♦, WNV do tipo selvagem; ■, DEN2 do tipo selvagem; ▲, WN/DEN2; semente C6-1; x, WN/DEN2 semente C6-1/V-2; *, WN/DEN2 semente V-3; •, WN/DEN2 semente V-10.
[015] A figura 5 mostra curvas de crescimento em células C6/36 do NY99 de WNV do tipo selvagem (wt WNV), vírus 16681 de DEN2 do tipo selvagem (wt DENV-2), e passagens sucessivas de sementes de WN/DEN2 (semente C6-1, semente C6-1/V-2, semente V-3, e semente V-10 de WN/DEN2). ♦, WNV do tipo selvagem; ■, DEN2 do tipo selvagem; ▲, WN/DEN2; semente C6-1; x, WN/DEN2 semente C6- 1/V-2; *, WN/DEN2 semente V-3; •, WN/DEN2 semente V-10.
[016] A figura 6 mostra o fenótipo de placa de quimeras de WN/DEN2 engendradas para incluir mutantes de E-203, NS2A49, e/ou NS2A94. (A) semente C6-1 de WN/DEN2; (B) semente V-1 de E- N203D de WN/DEN2; (C) semente V-1 de NS2A-I49T/F94L de WN/DEN2; (D) N203D de WN/DEN2, semente V-1 de NS2A- I49T/F94L.
[017] A figura 7 mostra a taxa de infecção no intestino intermediá rio de WNV-NY99 do tipo selvagem, 16681 de DENV-2 do tipo selvagem, e semente C6-1 de WN/DEN2 em mosquitos Culex pipiens, Cu- lex quinquefasciatus, e Aedes aegypti. Barras abertas, DENV-2; barras sombreadas, WNV-NY99; barras sólidas, semente C6-1 de WN/D2.
[018] A figura 8 é um diagrama esquemático de um flavivírus quimérico de WN/DEN. A quimera contém a sequência de sinal de prM do vírus de DEN indicado (entre os sítios de clivagem de NS2B-3 protease e sinalase, seta e triângulo, respectivamente), e proteínas prM e E do vírus de DEN na estrutura principal do vírus NY99 de WN. O alinhamento de sequência ampliado mostra junção entre a proteína C de WNV e a sequência de sinal de prM de DENV nas quimeras de WN/DEN1, WN/DEN3, e WN/DEN4. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[019] Quaisquer sequências de ácido nucleico e aminoácido lis tadas aqui ou na listagem de sequência anexas são mostradas usando abreviações por letra padrão para bases de nucleotídeo, e código de três letras para aminoácidos, como definido em 37 C.F.R. § 1.822. Em pelo menos alguns casos, apenas uma fita de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas a fita complementar é entendida como incluída por qualquer referência à fita exibida.
[020] SEQ ID NOs: 1 e 2 mostram as sequências de ácido nu- cleico e aminoácido, respectivamente, de uma quimera do Nilo Oci- dental/Dengue-2 recombinante WN/DEN2. As posições de início e parada dos genes e proteínas particulares da quimera são mostradas na Tabela 1.
[021] SEQ ID NOs: 3 e 4 mostram as sequências de ácido nucleico e aminoácido, respectivamente, de uma quimera do Nilo Ociden- tal/Dengue-1 recombinante. As posições de início e parada dos genes e proteínas particulares desta quimera são mostradas na Tabela 1.
[022] SEQ ID NOs: 5 e 6 mostram as sequências de ácido nu- cleico e aminoácido, respectivamente, de uma quimera do Nilo Oci- dental/Dengue-3 recombinante. As posições de início e parada dos genes e proteínas particulares da quimera são mostradas na Tabela 2.
[023] SEQ ID NOs: 7 e 8 mostram as sequências de ácido nucleico e aminoácido, respectivamente, de uma quimera do Nilo Ociden- tal/Dengue-4 recombinante. As posições de início e parada dos genes e proteínas particulares desta quimera são mostradas na Tabela 1. Tabela 1. Posições de início e parada de NCRs, proteínas estruturais e proteínas não estruturais em quimeras de WN/DEN2, WN/DEN1, e WN/DEN4
abela 2. Posições de início e parada de NCRs, proteínas estruturais e proteínas não estruturais nas SEQ ID NOs: 5 e 6. (quimera de WN/DEN3) 
[024] SEQ ID NOs: 9 e 10 mostram as sequências de ácido nu- cleico e aminoácido, respectivamente, da junção de proteína C/prM em um vírus 16681 de DEN2 do tipo selvagem.
[025] SEQ ID NOs: 11 e 12 mostram as sequências de ácido nu- cleico e aminoácido, respectivamente, do vírus quimérico de WN/DEN2.
[026] SEQ ID NOs: 13 e 14 mostram as sequências de ácido nu- cleico e aminoácido, respectivamente, da junção de proteína C/prM em um vírus NY99 de WN do tipo selvagem.
[027] SEQ ID NOs: 15 e 16 mostram as sequências de ácido nu- cleico e aminoácido, respectivamente, do vírus quimérico de WN/DEN1.
[028] SEQ ID NOs: 17 e 18 mostram as sequências de ácido nu- cleico e aminoácido, respectivamente, do vírus quimérico de WN/DEN3.
[029] SEQ ID NOs: 19 e 20 mostram as sequências de ácido nu- cleico e aminoácido, respectivamente, do vírus quimérico de WN/DEN4.
[030] A falta de um modelo animal de DEN ideal é um principal obstáculo no desenvolvimento de vacina e terapêutico para DENV. Camundongos não inatos imunocompetentes não sucumbem à infecção por DENV do tipo selvagem, deste modo marcadores típicos de proteção, tais como letalidade e viremia, não são evidentes em ca- mundongos depois da inoculação de DENV do tipo selvagem. Camundongos transgênicos e inatos têm sido usados para modelos de camundongo com DENV, mas estes animais são usualmente de alto custo, difíceis para trabalhar, e não são realísticos para experimentos de alto rendimento ou dose múltipla. Muitos animais estão suscetíveis à infecção por WNV, e camundongos não inatos, tais como Swiss Webster e NIH Swiss, sucumbem à infecção por WNV do tipo selvagem. O nível de doença, letalidade, e viremia tem sido usado com êxito como marcadores de proteção na pesquisa de WNV usando modelos animais pequenos tais como, camundongos, hamsters, e aves. Assim, vírus de WN/DEN quiméricos divulgados aqui podem ser virulentos e/ou gerar viremia significante em camundongos, portanto eles podem ser usados como a dose de inoculação para avaliar a eficácia de vaci-nas candidatas contra DENV.
[031] Além disso, embora tanto DENV quanto WNV sejam flaviví- rus, DENV replica muito mais lentamente e a títulos mais baixos do que WNV em culturas celulares. Isto torna o desenvolvimento da produção de antígeno viral de diagnóstico e testes de diagnóstico para DENV mais difícil do que para WNV. Os vírus de WN/DEN quiméricos descritos aqui contêm estruturas antigênicas de DENV na superfície das partículas virais enquanto mantendo certas características de re- plicação de WNV (tais como replicação a título alto). As quimeras divulgadas assim podem ser usadas como um vírus substituto semelhante a DEN para testar a eficácia da vacina candidata contra DENV e para o desenvolvimento de diagnósticos de DENV mais rápidos ou mais eficazes. 1. Abreviações DEN: Dengue DENV: vírus da Dengue I. glicoproteína do envelope ELISA: ensaio imunossorvente ligado à enzima HMAF: fluido ascítico de camundongo hiperimune IFA: ensaio de anticorpo por imunofluorescência mAb: anticorpo monoclonal MOI: multiplicidade da infecção NCR: região que não de codificação pfu: unidade de formação de placa p.i.: pós-infecção prM: proteína de pré-membrana PRNT: teste de neutralização com redução em placa VD50: dose virulenta a 50 % WN: Nilo Ocidental WNV: vírus do Nilo Ocidental WN/DEN: quimera do vírus do Nilo Ocidental/da Dengue II. Termos
[032] A menos que de outro modo observado, termos técnicos são usados de acordo com uso convencional. Definições de termos comuns na biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 019-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-63202182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[033] De modo a facilitar a revisão das modalidades variadas da invenção, as explanações seguintes de termos específicos são fornecidas:
[034] Anticorpo: Uma proteína (ou complexo de proteína) que in clui um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina. Os ge nes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante capa, lambda, alfa, gama, delta, epsílon, e mi, assim como a miríade de genes de região variável de imunoglobulina. Cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mi, alfa, delta, ou epsílon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
[035] A unidade estrutural de imunoglobulina básica (anticorpo) é geralmente um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50 a 70 kDa). O término N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Os termos "cadeia leve variável" (VL) e "cadeia pesada variável" (VH) referem-se, respectivamente, a estas cadeias leves e pesadas.
[036] Como usado aqui, o termo "anticorpos" inclui imunoglobuli- nas intactas assim como vários fragmentos bem caracterizados. Por exemplo, Fabs, Fvs, e Fvs de cadeia única (SCFvs) que ligam-se à proteína alvo (ou epítopo dentro de uma proteína ou proteína de fusão) também seriam agentes de ligação específicos para esta proteína (ou epítopo). Estes fragmentos de anticorpo são definidos como segue: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação de antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo produzida pela digestão de anticorpo integral com a enzima papaína para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) Fab’, o fragmento de uma molécula de anticorpo obtida tratando-se o anticorpo integral com pepsina, seguido por redução, para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos Fab’ são obtidos por molécula de anticorpo; (3) (Fab’)2, o fragmento do anticorpo obtido tratando-se o anticorpo integral com a enzima pepsina sem redução subsequente; (4) F(ab’)2, um dímero de dois fragmentos Fab’ mantidos juntos por duas ligações de dissulfeto; (5) Fv, um fragmento geneticamente engendrado contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressadas como duas cadeias; e (6) anticorpo de cadeia única, uma molécula geneticamente engendrada contendo a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligadas por um ligador de polipeptídeo adequado como uma molécula de cadeia única geneticamente fundida. Métodos de fabricar estes fragmentos são rotineiros (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, Nova Iorque, 1999).
[037] Anticorpos para o uso nos métodos e dispositivos desta descrição podem ser monoclonais ou policlonais. Meramente por via de exemplo, anticorpos monoclonais podem ser preparados a partir de hibridomas de murino de acordo com o método clássico de Kohler e Milstein (Nature 256:495-97, 1975) ou métodos derivados deste. Procedimentos detalhados para a produção de anticorpo monoclonal são descritos em Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, Nova Iorque, 1999.
[038] Afinidade de ligação de anticorpo: A força da ligação entre um único sítio de ligação de anticorpo e um ligando (por exemplo, um antígeno ou epítopo). A afinidade de um sítio de ligação de anticorpo X por um ligando Y é representada pela constante de dissociação (Kd), que é a concentração de Y que é necessária para ocupar metade dos sítios de ligação de X presentes em uma solução. Uma Kd menor indica uma interação de afinidade mais forte ou mais alta entre X e Y e uma concentração mais baixa de ligando é necessária para ocupar os sítios. Em geral, a afinidade de ligação de anticorpo pode ser afetada pela alteração, modificação e/ou substituição de um ou mais aminoá- cidos no epítopo reconhecido pelo parátopo do anticorpo.
[039] Em um exemplo, a afinidade de ligação de anticorpo é me dida por titulação de ponto final em um ensaio de Ag-ELISA. A afinidade de ligação de anticorpo é substancialmente diminuída (ou mensu- ravelmente reduzida) pela modificação e/ou substituição de um ou mais aminoácidos no epítopo reconhecido pelo parátopo do anticorpo se o título de produto final de um anticorpo específico para o epítopo modificado/substituído difere em pelo menos 4 vezes, tal como pelo menos 10 vezes, pelo menos 100 vezes ou mais, quando comparado ao epítopo inalterado.
[040] Antígeno: Um composto, composição, ou substância que podem estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de célula T em um animal, incluindo composições que são injetadas ou absorvidas em um animal. Um antígeno reage com os produtos de imunidade humoral ou celular específica, incluindo aqueles induzidos por imunó- genos heterólogos. Em uma modalidade, um antígeno é um antígeno viral, tal como uma proteína E de flavivírus.
[041] Quimera: Uma molécula (por exemplo, gene, transcrito ou proteína) composta de partes que são de origem diferente (tais como pelo menos duas sequências de ácido nucleico ou aminoácido) que, embora tipicamente desunidas em seu estado nativo, são unidas ou ligadas para formar uma única molécula contínua. Uma quimera pode incluir sequências de nucleotídeo ou aminoácido que são unidas de extremidade à extremidade (por exemplo, o término amino de uma sequência é unido ao término carboxila de uma sequência secundária) ou pode incluir uma sequência de uma molécula que é embutida dentro daquela de uma outra molécula (por exemplo, o término amino e o término carboxila da quimera são de uma molécula, enquanto uma sequência interveniente vem de uma outra molécula).
[042] Uma quimera pode incluir uma proteína quimérica, por exemplo, uma proteína que é composta de sequências de aminoácido de mais do que uma proteína. Uma quimera também pode incluir uma sequência de ácido nucleico quimérico composta de sequências de ácido nucleico de mais do que uma fonte, tal como um ácido nucleico quimérico que codifica uma proteína quimérica. Em outros exemplos, uma quimera pode incluir um genoma quimérico, tal como um genoma de flavivírus, que é composto de sequências de dois ou mais flavivírus. Por exemplo, um genoma de flavivírus quimérico pode compreender sequências de ácido nucleico de mais do que um genoma de flaviví- rus, tal como um vírus do Nilo Ocidental e um vírus da Dengue. Em alguns exemplos, um flavivírus quimérico inclui sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas de um primeiro flaviví- rus e sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas de um segundo flavivírus. Em exemplos particulares, um flavivírus quimérico é composto de uma sequência de nucleotídeo que codifica as proteínas não estruturais e uma proteína C de um genoma do vírus do Nilo Ocidental ligado a uma sequência de nucleotídeo que codifica pelo menos uma porção de uma proteína prM e proteína E de um ge- noma do vírus da Dengue (tal como DEN1, DEN2, DEN3, ou DEN4).
[043] Substituição conservativa: Uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma sequência de proteína para um resíduo de aminoácido diferente tendo propriedades bioquímicas similares. Tipicamente, substituições conservativas têm pouco a nenhum impacto sobre a atividade de um polipeptídeo resultante. Por exemplo, idealmente, uma proteína de flavivírus (tal como uma proteína prM, E, ou não estrutural) incluindo uma ou mais substituições conservativas (por exemplo não mais do que 2, 5, 10, 20, 30, 40, ou 50 substituições) mantém a estrutura e função da proteína do tipo selvagem. Um poli- peptídeo pode ser produzido para conter uma ou mais substituições conservativas manipulando-se a sequência de nucleotídeo que codifi- ca este polipeptídeo usando, por exemplo, procedimentos padrão tais como mutagênese sítio-dirigida ou PCR. Em um exemplo, tais variantes podem ser facilmente selecionadas para o teste adicional infectando-se células com um vírus contendo uma proteína variante e determinando a capacidade para replicar (por exemplo como descrito no Exemplo 2), produzindo-se vírus contendo uma proteína variante e determinando suas propriedades de neurovirulência ou neuroinvasão (como descrito no Exemplo 6), ou testando-se a reatividade cruzada de anticorpo (como descrito no Exemplo 10).
[044] Glicoproteína do envelope (proteína E): Uma proteína estru tural de flavivírus que medeia a ligação de virions de flavivírus a receptores celulares em células hospedeiras. A proteína E de flavivírus é necessária para a fusão de membrana, e é o antígeno primário que induz imunidade protetiva à infecção por flavivírus. Proteína E de flavi- vírus afeta a classe do hospedeiro, tropismo de tecido e virulência viral. A proteína E de flavivírus contém três domínios estruturais e funcionais, DI a DIII. Em partículas virais maduras a proteína E forma ho- modímeros de cabeça a cauda que encontram-se planos e que formam uma treliça densa sobre a superfície viral.
[045] Anticorpo reativo cruzado de flavivírus: Um anticorpo que reconhece (isto é, especificamente liga-se a) um epítopo encontrado em um peptídeo de mais do que uma espécie de flavivírus. Anticorpos reativos cruzados de flavivírus são classificados como anticorpos reativos cruzados de complexo ou reativos cruzados de grupo. Anticorpos reativos cruzados de complexo reconhecem epítopos compartilhados por todos os vírus dentro de um complexo, tal como o complexo de vírus de JE ou o complexo de vírus de DEN. Anticorpos reativos cruzados de grupo reconhecem epítopos compartilhados por todos os membros do gênero Flavivirus.
[046] A reatividade cruzada de anticorpo é refinada ainda dentro de categorias reativas cruzadas de subcomplexo e subgrupo. Anticorpos reativos cruzados de subcomplexo reconhecem epítopos compartilhados pela maioria, mas nem todos, dos membros de um complexo de flavivírus particular (por exemplo, DEN-1, -2, e -3, mas não DEN-4), enquanto anticorpos reativos cruzados de subgrupo reconhecem epitopos compartilhados por flavivírus de vários complexos, mas nem todos os membros do grupo de flavivírus (por exemplo, todos os mem-bros dos complexos de vírus de DEN e vírus de JE, mas nem todos os membros do complexo de vírus transmitido por carrapato). Exemplos não limitantes, específicos de anticorpos reativos cruzados de flaviví- rus incluem os mAbs reativos cruzados de grupo 4G2 e 6B6C-1, o mAb reativo cruzado de sub-grupo 1B7-5, e o mAb reativo cruzado de sub-grupo de sub-complexo 10A1D-2. (ver, por exemplo, Roehrig et al., Virology 246:317-28, 1998; Crill e Chang, J. Virol. 78:13975-13986, 2004).
[047] Proteína não estrutural de flavivírus: Existem sete proteínas não estruturais (NS) de um flavivírus, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5, que são codificadas pela porção do genoma de flaviví- rus que é 3’ às proteínas estruturais. NS1 foi implicado na replicação do RNA e mostrou ser secretado a partir de células mamíferas infectadas (Post et al., Virus Res. 18:291-302, 1991; Mackenzie et al., Virology 220:232-240, 1996; Muylaert et al., Virology 222:159-168, 1996). NS1 pode evocar respostas imunes humorais fortes e é um candidato de vacina potencial (Shlesinger et al., J. Virol. 60:1153-1155, 1986; Qu et al., J. Gen. Virol. 74:89-97, 1993). NS2 é clivado em NS2A e NS2B, com a função de NS2A permanecendo desconhecida. NS2B forma um complexo com NS3 e funciona como um cofator para a NS3 protease, que cliva porções da poliproteína viral. NS3 também funciona como uma RNA helicase e é usado para desenrolar o RNA viral durante a replicação (Li et al., J. Virol. 73:3108-3116, 1999). Embora as funções exatas de NS4A e NS4B continuem a ser esclarecidas, elas são consideradas estar envolvidas na replicação do RNA e tráfergo do RNA (Lindenbach e Rice, Em: Fields Virology, Knipe e Howley, eds., Lippincott, Williams, e Wilkins, 991-1041, 2001). Finalmente, a proteína NS5 é uma RNA polimerase dependente do RNA envolvida na replicação do genoma (Rice et al., Science 229:726-733, 1985). NS5 também mostra atividade de metiltransferase comumente encontrada em enzimas de capeamento de RNA (Koonin, J. Gen. Virol. 74:733-740, 1993).
[048] Proteína estrutural de flavivírus: As proteínas de capsídeo (C), pré-membrana (prM), e envelope (E) de um flavivírus são as proteínas estruturais virais. Genomas de flavivírus consistem em RNAs de sentido positivo que são aproximadamente 11 kb em comprimento. O genoma tem um capuz em 5’, mas carece de uma cauda poliadenilada em 3’ (Wengler et al., Virology 89:423-437, 1978) e é traduzido em uma poliproteína. As proteínas estruturais (C, PrM, e E) estão na extremidade de terminal amino da poliproteína seguido pelas proteínas não estruturais (NS1-5). A poliproteína é clivada pelo vírus e proteases derivadas do hospedeiro em proteínas individuais. A proteína C forma o capsídeo viral enquanto as proteínas prM e E são embutidas no envelope adjacente (Russell et al., The Togaviruses: Biology, Structure, and Replication, Schlesinger, ed., Academic Press, 1980). A proteína E funciona na ligação aos receptores de célula hospedeira resultando em endocitose mediada por receptor. No pH baixo do endossomo, a proteína E sofre uma mudança conformacional causando a fusão entre o envelope viral e as membranas endossômicas. Acredita-se que a proteína prM estabilize a proteína E até que o vírus saia da célula infectada, tempo este em que prM é clivada à proteína M madura (Revisado em Lindenbach e Rice, Em: Fields Virology, Knipe e Howley, eds., Lippincott, Williams, e Wilkins, 991-1041, 2001).
[049] Resposta imune: uma resposta de uma célula do sistema imune, tal como uma célula B, célula T, macrófago ou polimorfonu- cleócito, a um estímulo tal como um antígeno. Uma resposta imune pode incluir qualquer célula do corpo envolvida em uma resposta de defesa do hospedeiro, por exemplo, uma célula epitelial que secreta um interferon ou uma citocina. Uma resposta imune inclui, mas não é limitada a, uma resposta imune inata ou inflamação.
[050] Isolado: um componente biológico "isolado" ou "purificado" (tal como um ácido nucleico, peptídeo, proteína, complexo de proteína, ou partícula) foi substancialmente separado, produzido além de, ou purificado longe de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente naturalmente ocorre, isto é, outro DNA cromossômico e extracromossômico e RNA, e proteínas. Ácidos nu- cleicos, peptídeos e proteínas que foram "isolados" ou "purificados" assim incluem ácidos nucleicos e proteínas purificados por métodos de purificação padrão. O termo também inclui ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como ácidos nucleicos ou proteínas quimicamente sintetizados. O termo "isolado" ou "purificado" não requer pureza absoluta; preferivelmente, ele é intencionado como um termo relativo. Assim, por exemplo, um componente biológico isolado é um em que o componente biológico é mais enriquecido do que o componente biológico é em seu ambiente natural dentro de uma célula, ou outro vaso de produção. Preferivelmente, uma preparação é purificada tal que o componente biológico representa pelo menos 50 %, tal como pelo menos 70 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou maior, do teor do componente biológico total da preparação.
[051] Molécula de ácido nucleico: uma forma polimérica de nu- cleotídeos, que pode incluir tanto fitas senso quanto antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros mistos do acima. Um nucleotídeo se refere a um ribonucleotídeo, desoxinucleotí- deo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo "molécula de ácido nucleico" como usado aqui é sinônimo com "ácido nucleico" e "polinucleotídeo." Uma molécula de ácido nucleico é usualmente pelo menos 10 bases em comprimento, a menos que de outro modo especificado. O termo inclui formas de fita simples e dupla de DNA. Um polinucleotídeo pode incluir qualquer um ou tanto os nu- cleotídeos que ocorrem naturalmente quanto os modificados ligados entre si por ligações de nucleotídeo que ocorrem naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente.
[052] Proteína de pré-membrana (proteína prM): Uma proteína estrutural de flavivírus. A proteína prM é uma proteína de aproximadamente 25 kDa que é o precursor intracelular para a proteína de membrana (M). Acredita-se que prM estabilize a proteína E durante o transporte do virion imaturo à superfície celular. Quando o vírus sai da célula infectada, a proteína prM é clivada à proteína M madura, que é parte do envelope viral (Revisado em Lindenbach e Rice, Em: Fields Virology, Knipe e Howley, eds., Lippincott, Williams, e Wilkins, 9911041, 2001).
[053] Ácido nucleico recombinante: Uma molécula de ácido nu- cleico que não está ocorrendo naturalmente ou tem uma sequência que é fabricada por uma combinação artificial de dois segmentos separados diferentes de sequência. Esta combinação artificial é realizada por síntese química ou, mais comumente, pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética tais como aquelas descritas em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. O termo recombinante inclui ácidos nucleicos que foram alterados exclusivamente por adição, substituição, ou supressão de uma porção de uma molécula de ácido nucleico natural.
[054] Identidade de sequência: a similaridade entre duas sequên cias de ácido nucleico ou duas sequências de aminoácido é expressada em termos da similaridade entre as sequências, de outro modo referida como identidade de sequência. A identidade de sequência é frequentemente medida em termos de porcentagem de identidade (ou similaridade ou homologia); quanto mais alta a porcentagem, mais similar as duas sequências são.
[055] Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 2:482, 1981); Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443, 1970); Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444, 1988); Higgins e Sharp (Gene, 73:237-44, 1988); Higgins e Sharp (CABIOS, 5:151-53, 1989); Corpet et al. (Nuc. Acids Res., 16:10881-90, 1988); Huang et al. (Comp. Appls. Biosci., 8:155-65, 1992); e Pearson et al. (Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschul et al. (Nature Genet., 6:119-29, 1994) apresentam uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia.
[056] As ferramentas de alinhamento ALIGN (Myers e Miller, CA BIOS 4:11-17, 1989) ou LFASTA (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448, 1988) podem ser usadas para realizar comparações de sequência (Internet Program © 1996, W. R. Pearson e the University of Virginia, "fasta20u63" versão 2.0u63, data de liberação dezembro de 1996). ALIGN compara sequências inteiras contra uma outra, enquanto LFASTA compara regiões de similaridade local. Estas ferramentas de alinhamento e seus tutoriais respectivos estão disponíveis na Internet no NCSA website. Alternativamente, para comparações de sequências de aminoácido de mais do que cerca de 30 ami- noácidos, a função das "sequências Blast 2" pode ser empregada usando a matriz BLOSUM62 padrão ajustada a parâmetros padrão, (custo de existência de intervalo de 11, e um custo de intervalo por resíduo de 1). Quando do alinhamento de peptídeos curtos (menos do que em torno de 30 aminoácidos), o alinhamento deveria ser realizado usando a função de "sequências Blast 2", empregando a matriz PAM30 ajustada a parâmetros padrão (penalidades de intervalo aberto 9, de intervalo de extensão 1). O sistema de comparação de sequência BLAST está disponível, por exemplo, do NCBI web site; ver também Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-10, 1990; Gish e States, Nature Genet., 3:266-72, 1993; Madden et al., Meth. Enzymol., 266:131-41, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402, 1997; e Zhang e Madden, Genome Res., 7:649-56, 1997.
[057] Ortólogos (equivalentes a proteínas de outras espécies) de proteínas são em alguns exemplos caracterizados pela progressão de mais do que 75 % de identidade de sequência calculados sobre o alinhamento de tamanho natural com a sequência de aminoácido de proteína específica usando ALIGN ajustado a parâmetros padrão. Proteínas com similaridade ainda maior a uma sequência de referência mostrarão porcentagens de identidade crescentes quando avaliadas por este método, tal como pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência. Além disso, a identidade de sequência pode ser comparada sobre o tamanho natural de um ou ambos domínios de ligação das proteínas de fusão divulgadas.
[058] Quando significativamente menos do que a sequência intei ra está sendo comparada para identidade de sequência, sequências homólogas tipicamente possuirão pelo menos 80 % de identidade de sequência sobre janelas curtas de 10 a 20, e podem possuir identidades de sequência de pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou pelo menos 99 % dependendo de sua si- milaridade à sequência de referência. Identidade de sequência em tais janelas curtas pode ser determinada usando LFASTA; métodos são descritos no NCBI website. Uma pessoa de habilidade na técnica avaliará que estas faixas de identidade de sequência são fornecidas para orientação apenas; é inteiramente possível que homólogos fortemente significantes podem ser obtidos que caem fora das faixas fornecidas. Conceitos de homologia similares aplicam-se para ácidos nucleicos como são descritos para proteína. Uma indicação alternativa que duas moléculas de ácido nucleico são intimamente relacionadas é que as duas moléculas hibridizam uma a outra sob condições severas.
[059] Sequências de ácido nucleico que mostram um grau alto de identidade podem, no entanto, codificar sequências de aminoácido similares, devido à degeneração do código genético. É entendido que mudanças na sequência de ácido nucleico podem ser feitas usando esta degeneração para produzir sequências de ácido nucleico múltiplas que todas codificam substancialmente a mesma proteína.
[060] Paciente: organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui tanto mamíferos humanos quanto não humanos (tais como camundongos, ratos, coelhos, ovelha, cavalos, vacas, e primatas não humanos).
[061] Transformada: uma célula "transformada" é uma célula em que foi introduzida uma molécula de ácido nucleico por técnicas de biologia molecular. O termo abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico poderia ser introduzida em uma tal célula, incluindo transfecção com vetores virais, transformação com vetores plasmídicos, e introdução de DNA nu por eletroporação, lipo- fecção, e aceleração por pistola de partícula.
[062] Vacina: uma preparação de material imunogênico capaz de estimular uma resposta imune, administrada para a prevenção, melhora, ou tratamento de doença infecciosa ou outros tipos de doença. O material imunogênico pode incluir micro-organismos atenuados ou mortos (tais como bactérias ou vírus), ou proteínas antigênicas, peptí- deos ou DNA derivados deles. Uma vacina atenuada é um organismo virulento que foi modificado para produzir uma forma menos virulenta, mas, no entanto, mantém a capacidade para evocar anticorpos e imunidade mediada por célula contra a forma virulenta. Uma vacina morta é um micro-organismo previamente virulento que foi morto com produtos químicos ou calor, mas evoca anticorpos contra o micro-organismo virulento. Vacinas podem evocar tanto respostas profiláticas (preventivas) quanto terapêuticas. Métodos de administração variam de acordo com a vacina, mas podem incluir inoculação, ingestão, inalação ou outras formas de administração. Vacinas podem ser administradas com um adjuvante para estimular a resposta imune.
[063] A menos que de outro modo explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como co- mumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta descrição pertence. Os termos singulares "um/uma" e "o/a" incluem referentes no plural a menos que contexto claramente indique de outro modo. Similarmente, a palavra "ou" é intencionada a incluir "e" a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Ainda deve ser entendido que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados, e são fornecidos para descrição. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos. Todos os Nos de Acesso no GenBank mencionados aqui são incorporados por referência em sua totalidade. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prá-tica ou teste da presente descrição, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo explanações de termos, controlará. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos apenas e não são intencionados a serem limitantes. III. Vírus Quiméricos de WN/DEN
[064] Divulgados aqui são flavivírus quiméricos que incluem regi ões que não de codificação, proteínas não estruturais, e uma proteína C de WNV, e pelo menos uma porção de uma proteína prM e proteína E de DENV. Em algumas modalidades, a quimera inclui uma molécula de ácido nucleico primária incluindo uma região que não de codificação 5’, um ácido nucleico que codifica uma proteína C e proteínas não estruturais, e uma região que não de codificação 3’ de um genoma do vírus do Nilo Ocidental e uma molécula de ácido nucleico secundária operativamente ligada à molécula de ácido nucleico primária, que codifica pelo menos uma porção de uma proteína prM e proteína E de um genoma do vírus da Dengue. Em exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas prM e E do genoma de WNV são substituídas com moléculas tendo as sequências correspon-dentes do genoma de DENV. Em alguns exemplos, a sequência de sinal de prM da proteína C de WNV também é substituída com a sequência de sinal de prM do genoma de DENV correspondente.
[065] Também divulgados são flavivírus quiméricos incluindo re giões que não de codificação e proteínas não estruturais de WNV e pelo menos uma porção de uma proteína C, proteína prM, e proteína E de DENV. Em algumas modalidades, a quimera inclui uma molécula de ácido nucleico primária incluindo uma região que não de codificação 5’, um ácido nucleico que codifica proteínas não estruturais, e uma região que não de codificação 3’ de um genoma de WNV e uma molécula de ácido nucleico secundária operativamente ligada à molécula de ácido nucleico primária, que codifica pelo menos uma porção de uma proteína C, uma proteína prM, e uma proteína E de um genoma de DENV. Em um exemplo particular, o ácido nucleico que codifica as proteínas C, prM, e E do genoma de WNV é substituído com moléculas tendo as sequências correspondentes do genoma de DENV.
[066] Em alguns exemplos divulgados aqui, o genoma de WNV usado na quimera é derivado de uma cepa de WNV particular, tal como NY99 ou KEN-3829. Cepas de WNV adicionais são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Ebel et al. Emerg. Infect. Dis. 7:650-653, 2001; American Type Culture Collection (ATCC) catalog numbers VR- 82, VR-1267, VR-1507, VR-1510). Em exemplos particulares, o geno- ma de WNV é WN/IC-P991 (tal como Acesso no GenBank No AF196835 (incorporado por referência como incluído em GenBank em 27 de Abril de 2009) ou com mutações como descrito em Kinney et al., J. Gen. Virol. 87:3611-3622, 2006).
[067] Sequências de genoma de WNV estão publicamente dispo níveis. Por exemplo, os Acessos no GenBank Nos: AF196835, AY278441, AF202541, AF404754, AF260967, AY660002, AF481864, AY268133, AF404757, AY268132, AF260969, AF317203, AY262283, AY490240, AF260968, AY603654, D00246, M12294, EU068667, AY765264, e AY277251 divulgam sequências de ácido nucleico ge- nômicas de WNV, todas as quais são incorporadas por referência como incluído em GenBank em 27 de abril de 2009. Em outros exemplos, o genoma de WNV, ou as regiões que não de codificação, proteínas não estruturais, e/ou proteína C do genoma de WNV são pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idênticas a uma sequência de genoma de WNV publicamente disponível.
[068] Nas quimeras de flavivírus divulgadas, o genoma de DENV é de um vírus da Dengue 1 (DEN1), Dengue 2 (DEN2), Dengue 3 (DEN3), ou Dengue 4 (DEN4). Em alguns exemplos, a porção do ge- noma de DENV das quimeras divulgadas inclui sequências de um único genoma de DENV, enquanto em outros exemplos, a porção do ge- noma de DENV inclui sequências de dois ou mais genomas de DENV. O genoma de DENV pode ser uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa atenuada (ou vacina). Em alguns exemplos, o genoma de DENV é DEN2 (por exemplo, 16681 de cepa de DEN2 do tipo selvagem ou cepa PDK-53 de DEN-2 atenuado), DEN1 (por exemplo, cepa 16007 de DEN1 do tipo selvagem ou cepa PDK-13 de DEN1 atenuado), DEN3 (por exemplo, cepa 16562 de DEN3 do tipo selvagem ou PGMK- 30/FRhL-3 de DEN3 atenuado) ou DEN4 (por exemplo, 1036 de DEN4 do tipo selvagem ou PDK-48 de DEN4 atenuado). Cepas de DENV adicionais são conhecidas na técnica (ver por exemplo, Pat. U.S. Nos 5.939.254 e 6.793.488). Em exemplos particulares, o genoma de DENV é uma cepa do tipo selvagem (não atenuada), por exemplo, 16681 de DEN2 (tal como Acesso no GenBank No U87411, incorporado por referência como incluído em GenBank em 27 de abril de 2009).
[069] Sequências de DENV estão publicamente disponíveis. Por exemplo, Acesso no GenBank Nos.: NC_001477, AF180817, e U88536 divulgam sequências de ácido nucleico de DEN1; NC_001474 e U87411 divulgam sequências de ácido nucleico de DEN2; NC_001475, AY099336, e AF317645 divulgam sequências de ácido nucleico de DEN3; e NC_002640 e AF326825 divulgam sequências de ácido nucleico de DEN4, todas as quais são incorporadas por referência como incluído em GenBank em 27 de abril de 2009. Em exemplos adicionais, o genoma de DENV (ou a proteína prM e/ou E do genoma de DENV) são pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idênticos a uma sequência de DENV publicamente disponível.
[070] Em uma modalidade particular, o flavivírus quimérico inclui uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência incluindo as re- giões que não de codificação 5’ e 3’ do vírus e que codifica as proteínas não estruturais e proteína C de um genoma viral NY99 de WN, operativamente ligado a uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência que codifica a sequência de sinal de prM, a proteína prM e a proteína E do genoma do vírus 16681 de DEN2. Em um exemplo, o flavivírus quimérico é uma quimera de WN/DEN2 tendo a sequência de ácido nucleico e aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. Em exemplos adicionais, o vírus quimérico divulgado tem sequências de ácido nucleico e aminoácido pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idênticas ou mais às sequências divulgadas nas SEQ ID NOs: 1 e 2.
[071] Em outras modalidades, os flavivírus quiméricos divulgados aqui incluem uma molécula de ácido nucleico primária incluindo as regiões que não de codificação 5’ e 3’ e que codifica as proteínas não estruturais e proteína C de um genoma viral NY99 de WN operativamente ligado a uma molécula de ácido nucleico secundária que codifica as proteínas prM e E de um genoma do vírus da DEN1, DEN3, ou DEN4. Em alguns exemplos, a molécula de ácido nucleico secundária codifica a sequência de sinal de prM de um genoma do vírus da DEN1, DEN3, ou DEN4. Exemplos particulares de quimeras de WN/DEN1 (SEQ ID NOs: 3 e 4), WN/DEN3 (SEQ ID NOs: 5 e 6) e WN/DEN4 (SEQ ID NOs: 7 e 8) são divulgados aqui. Em exemplos adicionais, os vírus quiméricos divulgados são pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idênticos ou mais às sequências divulgadas nas SEQ ID NOs: 3 a 8.
[072] Os flavivírus quiméricos divulgados podem ser facilmente produzidos por replicação em células hospedeiras em cultura. Métodos de produzir vírus são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo, Fields Virology, Knipe e Howley, eds., Lippincott, Williams, e Wilkins, 2001; Flint et al., Principles of Virology, ASM Press, 2000). Linhagens de célula hospedeira são preferivelmente fáceis para infectar com vírus ou transfectar com RNA genômico viral, capaz de manter estavel- mente RNA estranho com uma sequência não arranjada, e têm os componentes celulares necessários para a transcrição, tradução, modificação pós-tradução, montagem do vírus, e secreção eficientes da partícula de proteína ou vírus. Preferivelmente, células são aqueles tendo requerimentos de componente médio simples que podem ser adaptados para crescer em cultura em suspensão. Em alguns exemplos, a linhagem de célula hospedeira é uma linhagem de célula mamífera que pode ser adaptada para crescer em meio com baixo teor de soro ou livre de soro. Linhagens de célula hospedeira adequadas incluem Vero (macaco), C6/36 (mosquito), BHK21 (hamster), LLC-MK2 (macaco) SK6 (suíno), L292 (camundongo), HeLa (ser humano), HEK (ser humano), células 2fTGH (ser humano), HepG2 (ser humano), e PDK (cachorro). Linhagens de célula adequadas podem ser obtidas da American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA.
[073] Em alguns exemplos, os vírus de WN/DEN quiméricos di vulgados replicam em cultura celular mais rapidamente que vírus da DEN. Por exemplo, placas formadas por vírus quiméricos de WN/DEN podem formar em culturas celulares (tais como células C6/36 ou Vero) mais rápido do que os vírus da DEN (tal como pelo menos um dia, dois dias, três dias, quatro dias, ou cinco dias pós-infecção mais rápida). Em outros exemplos, vírus quiméricos de WN/DEN podem formar placas maiores do que vírus da DEN. Por exemplo, placas formadas por vírus de WN/DEN quiméricos divulgados aqui podem formar placas que são pelo menos 25 % maiores até cerca de 10 vezes maiores do que vírus da DEN (tal como pelo menos 50 % maior, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, ou até 10 vezes maior). IV. Quimeras de WN/DEN e Variantes Destas
[074] A descrição também fornece quimeras de flavivírus tendo uma ou mais substituição, inserção ou supressão de ácido nucleico ou aminoácido, ou uma combinação destes, tal que a quimera resultante tem características melhoradas. Em alguns exemplos, a característica melhorada da quimera incluindo uma ou mais substituição, inserção, e/ou supressão inclui, mas não é limitada a, título viral aumentado, taxa de reprodução aumentada, tamanho de placa aumentado, ou estabilidade aumentada em cultura celular se comparado a um vírus do tipo selvagem. Nos exemplos adicionais, a característica melhorada da quimera que compreende uma ou mais substituição, inserção, e/ou supressão, inclui a infectividade ou virulência aumentada em uma cobaia (tal como camundongos ou primatas não humanos) ou infectivi- dade ou transmissibilidade diminuída em mosquitos quando comparado a um vírus do tipo selvagem.
[075] A manipulação da sequência de nucleotídeos dos flavivírus quiméricos divulgados usando procedimentos padrão, incluindo, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou PCR e mutagênese de iniciador M13, pode ser usada para produzir as variantes com características melhoradas (tais como título viral aumentado em estabilidade de cultura celular). Os detalhes destas técnicas são bem conhecidos. Por exemplo, protocolos são fornecidos em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. As modificações mais simples envolvem a substituição de um ou mais aminoácidos aos aminoácidos tendo propriedades físico-químicas e/ou estruturais similares. Estas assim chamadas substituições conservativas são prováveis ter um impacto mínimo sobre a atividade e/ou estrutura da proteína resultante. As substituições conservativas geralmente mantêm (a) a estrutura da estrutura de polipeptídeo principal na área da substituição, por exemplo, como uma configuração de folha ou helicoidal, (b) a car- ga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o tamanho da cadeia lateral. Os exemplos das substituições conservativas são mos- trados abaixo.
[076] As substituições que em geral são esperadas produzir mai- ores mudanças nas propriedades das proteínas serão não- conservativas, por exemplo, as mudanças em que (a) um resíduo hi- drofílico, por exemplo, serila ou treonila, são substituídos por (ou através de) um resíduo hidrofílico, por exemplo, leucila, isoleucila, fenilala- nila, valila ou alanila; (b) uma cisteína ou prolina são substituídas por (ou através de) qualquer outro resíduo; (c) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila, ou histadila, é substituído por (ou através de) um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamila ou aspartila; ou (d) um resíduo tendo uma cadeia lateral grande, por exemplo, fenilalanina, é substituído por (ou através de) aquele não tendo uma cadeia lateral, por exemplo, glicina.
[077] Além da mutagênese alvo para produzir as variantes das quimeras de WN/DENV divulgadas, as mutações de ocorrência natural podem resultar na passagem em cultura celular que resulta em variantes, algumas com características desejáveis. As substituições, inserções, ou anulações do ácido nucleico e do aminoácido, que resultam em vírus quiméricos durante as passagens da cultura celular são prontamente determinadas pela análise de sequência do vírus amplificado das placas isoladas da semente viral, e podem ser engendradas em clones infecciosos para gerar variantes da quimera de WN/DENV que têm características melhoradas (tais como reprodução para título alto ou produção de placas grandes uniformes em células). As mutações consistentes identificadas a partir de sementes múltiplas ou placas isoladas são uma indicação de uma substituição desejável da quimera no tipo da célula. Estudos anteriores têm identificado com sucesso as substituições que ocorreram em cultura celular e engendrado estas em construções de vírus quiméricos diferentes para produzir vírus quiméricos com características melhoradas (Huang et al., J. Virol. 77:1143611447, 2003; Huang et al., J. Virol. 12:7300-7310, 2005).
[078] Em algumas modalidades, o flavivírus quimérico codifica um polipeptídeo que inclui uma ou mais substituição (ou inserção ou supressão) de aminoácido de um ou mais resíduos de proteína prM ou E do vírus da Dengue, tal que a quimera tem características melhoradas. Em outros exemplos, o flavivírus quimérico codifica um polipeptí- deo que inclui uma ou mais substituição (ou inserção ou supressão) de aminoácido de um ou mais resíduos de um WNV não estrutural e/ou proteína C, tal que a quimera resultante tem características melhora- das. Nos exemplos adicionais, o flavivírus quimérico inclui uma ou mais substituição, inserção, ou supressão do ácido nucleico no WNV 5’ e/ou região que não de codificação 3’, tal que a quimera tem características melhoradas.
[079] Os exemplos de uma quimera que codifica pelo menos uma substituição que melhora a característica do vírus quimérico são aqueles que codificam um polipeptídeo tendo uma ou mais substituição de aminoácido em uma proteína E de DENV. Em modalidades particulares, a substituição inclui, mas não é limitada a, pelo menos uma substituição na proteína E das posições 64, 122, 186, ou 203 do aminoácido da proteína E de DENV e DEN2, ou uma combinação de duas ou mais destas. Deve ser entendido que as substituições nas posições de ami- noácidos da proteína E equivalentes em DEN1, DEN3, ou DEN4 também são consideradas. Além disso, as substituições na posição equivalente são consideradas mesmo em situações onde o aminoácido tipo selvagem é diferente do aminoácido no DEN2 do tipo selvagem (por exemplo, proteína E de DEN2 inclui Lys na posição 64, enquanto o aminoácido equivalente em proteína E de DEN4 é Ser64). Em al-guns exemplos, a substituição de aminoácido altera um resíduo carregado positivamente (tal como Lys, Arg, ou His; por exemplo, Lys64 ou Lys122) para um resíduo não carregado (por exemplo, Met, Ser, Thr, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, ou Val) ou para um resíduo carregado negativamente (por exemplo, Asp ou Glu). A substituição particular (expressa como em DEN2) pode incluir K64M, K64S, K64T, K122L, K122I, K122T, e/ou K122E. Em outros exemplos, a substituição de aminoáci- do altera um resíduo polar (tal como Ser ou Thr; por exemplo, Ser186 de DEN2) para um resíduo carregado negativamente (por exemplo, Asp ou Glu) ou um resíduo hidrofílico (tal como fenilalanina). Em ou-tros exemplos, a substituição de aminoácido inclui uma substituição na posição de aminoácido 203 da proteína E (expressa como em DEN2), por exemplo, N203D. Em exemplos particulares, o flavivírus quimérico divulgado codifica uma proteína E de DEN2 incluindo K122I, S186F, N203D, ou uma combinação de duas ou mais destas.
[080] Em algumas modalidades, o flavivírus quimérico divulgado codifica pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína prM de DENV que melhora as características do vírus. Em um exemplo, a substituição inclui uma substituição na posição de aminoácido 149 da proteína prM de DEN2. Deve ser entendido que as substituições nas posições de aminoácido da proteína prM equivalentes em DEN1, DEN3, ou DEN4 também são consideradas. Além disso, as substituições na posição equivalente são consideradas mesmo em situações onde o aminoácido tipo selvagem é diferente do aminoácido no DEN2 do tipo selvagem (por exemplo, a proteína prM de DEN2 inclui Phe na posição 149, enquanto o aminoácido equivalente é Thr em DEN1 e DEN3 e é Ile em DEN4). Em um exemplo particular, a substituição de aminoácido altera o Phe149 do prM de DEN2 a um aminoácido não carregado (por exemplo, Met, Thr, Gly, ou Ile), tal como um resíduo de aminoácido que é encontrado na posição equivalente no complexo de encefalite japonesa (por exemplo, WNV, vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite de St. Louis, ou vírus da encefalite de Murray Valley).
[081] Em modalidades adicionais, o flavivírus quimérico divulgado pode codificar pelo menos uma substituição de aminoácido em cada uma das proteínas prM e E de DENV. Em outros exemplos, o flavivírus quimérico pode codificar duas ou mais substituições de aminoácido na proteína prM ou na proteína E de DEN. Por exemplo, o flavivírus quimérico pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína E de DEN (tal como Lys64, Lys122, Ser186, e/ou Asn203) e pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína prM de DEN (tal como Phe149).
[082] Em outros exemplos, o flavivírus quimérico divulgado codi fica pelo menos uma substituição, inserção, ou supressão do aminoá- cido em pelo menos uma proteína não estrutural (por exemplo, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, ou NS5) ou proteína C do WNV que melhora as características do vírus. Por exemplo, o flavivírus quimérico pode codificar uma ou mais substituições de aminoácidos em proteína não estrutural NS2A o que pode aumentar o título, taxa de reprodução, ou tamanho de placa do vírus, ou pode estabilizar o crescimento das quimeras em cultura celular divulgadas. Em alguns exemplos, a substituição de aminoácido pode incluir as substituições em um ou mais de Val23 de NS2A (tal como V23M ou V23C), Ile49 de NS2A (tal como I49T), e Phe94 (tal como F94L). Outras quimeras variantes podem codificar uma ou mais substituições em proteínas não estruturais NS1, NS3, e/ou NS4A. Estas variantes podem alterar as características do vírus, por exemplo, aumentando a sensibilidade à temperatura ou diminuir a infectividade em mosquitos. Em exemplos particulares, a substituição pode incluir Gly53 de NS1 (por exemplo, G53D). Em outros exemplos a substituição pode incluir posições de aminoácidos 249 e/ou 251 de NS3 (tais como P249T, P249H, E251V, ou E251Q). Ainda em outros exemplos, a quimera de flavivírus pode codificar uma ou mais substituição em proteína não estrutural NS4B (tal como Thr241 de NS4B, por exemplo, T241I).
[083] Em algumas modalidades, as quimeras divulgadas podem incluir pelo menos uma substituição, inserção, ou supressão de nucle- otídeos em 5’ e/ou região que não de codificação 3’ da estrutura principal do WNV, tal que a substituição, inserção, ou supressão melhora as características do vírus tais como a taxa de reprodução, título do vírus, tamanho de placa, estabilidade em cultura celular, ou infectivi- dade em mamíferos ou mosquitos. Em um exemplo, a quimera inclui a inserção de um microRNA (miRNA, tal como miR-14 (Mead and Tu, BMC Genomics 9:244, 2008)) na 5’ ou região que não de codificação 3’ para diminuir a reprodução do vírus em mosquitos. Em outros exemplos, a substituição, inserção, e/ou supressão do ácido nucleico pode diminuir a reprodução do vírus em mosquitos ou camundongos.
[084] Em exemplos adicionais, as quimeras incluem uma combi nação de duas ou mais substituições de ácido nucleico nas regiões que não de codificação, nas sequências de ácido nucleico que codificam C, prM, E, ou proteínas não estruturais, ou qualquer combinação destes. Por exemplo, a quimera pode incluir uma, duas, três, ou mais substituições nas proteínas prM ou E de DEN. A quimera também pode incluir uma, duas, três, ou mais substituições na proteína C de WNV, proteínas não estruturais, ou regiões que não de codificação. Em exemplos particulares, o flavivírus quimérico codifica uma proteína E de DEN2 incluindo N203D e uma proteína NS2A incluindo I49T e F94L. Em outros exemplos, o flavivírus quimérico codifica uma proteína E de DEN2 incluindo K122I, S186F, e N203D, uma proteína NS2A de WNV incluindo I49T e F94L, e uma proteína NS4B de WNV incluindo T241I.
[085] A descrição também fornece quimeras de WN/DEN que co difica pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína E, em que a reatividade cruzada de anticorpo da proteína E é reduzida de maneira mensurável. Em alguns exemplos, a quimera codifica pelo menos uma substituição de aminoácido, por exemplo, na posição de aminoácido da proteína E de DEN2 101, 106, 107, 108, 135, ou uma combinação de duas ou mais destas. Deve ser entendido que as substituições nas posições de aminoácido de proteína E equivalentes em DEN1, DEN3, ou DEN4 também são consideradas. Além disso, as substituições na posição equivalente são consideradas mesmo em situações onde o aminoácido tipo selvagem é diferente do aminoácido no DEN2 do tipo selvagem. As substituições particulares de aminoáci- dos incluem, mas não são limitados a, W101F, G106A, G106L, L107F, F108W, F108M, F108V, F108L, L135W, ou L135K. Os exemplos adicionais das substituições de aminoácidos que reduzem a reatividade cruzada de anticorpo de proteína E de flavivíruss são conhecidos na técnica (ver por exemplo, o WO06/025990; aqui incorporado por referência). As quimeras que incluem as mutações que reduzem a reativi- dade cruzada de anticorpo da proteína E também podem incluir uma ou mais mutações adicionais nas proteínas estruturais, proteínas não estruturais, ou NCRs, tais como aquelas descritas acima.
[086] Os métodos para avaliar as características dos vírus quimé ricos de WN/DEN descritos acima incluindo as sequências variantes são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos de avaliar o título do vírus, taxa de reprodução, tamanho de placa, e estabilidade em cultura podem ser avaliados como descrito no Exemplo 2. Ver também, Obijeski et al., J. Gen. Virol. 22:21-33, 1974; Beaty et al., Diagnostic Procedimentos for Viral, Ricksettial, and Chlamydial Infections, pp. 189-212, Lennette et al. (eds.), 7a Edição, American Public Health Association, 1995; Virology Methods Manual, Mahy and Kangro (eds.), Academic Press, 1996; Huang et al., J. Virol. 77:11436-11447, 2003; Huang et al., J. Virol. 79:7300-7310, 2005. Os métodos para avaliar a infectividade em mamíferos (tais como camundongos) ou mosquitos podem ser realizados como descrito abaixo (tal como Exemplos 4, 6, e 7).
[087] A redução na reatividade cruzada de anticorpo pode ser determinada comparando-se a afinidade de ligação de anticorpo de um anticorpo para a proteína E tipo selvagem com afinidade de ligação de anticorpo para uma proteína E incluindo uma ou mais substituições de aminoácidos. Uma redução em afinidade de ligação de anticorpo indica uma redução na reatividade cruzada de anticorpo. As afinidades de ligação de anticorpos podem ser determinadas através de muitos métodos bem conhecidos na técnica, tais como titulação de ponto final em um ensaio Ag-ELISA, ligação de competição em um ensaio ELISA, um rádio-imunoensaio de fase sólida, e a técnica de ressonância de plasmon de superfície Biacore® (Malmqvist, Biochem. Soc. Trans. 27:335-40, 1999; e Drake et al., Anal. Biochem. 328:35-43, 2004). Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo policlonal ou um mAb. Um exemplo não limitante específico de um anticorpo policlonal é um fluido ascítico hiperimune de murinos anti-DEN2 policlonal. Os exemplos não limitantes específicos de mAbs incluem 4G2 (ATCC No HB-112), 6B6C-1, 1B7-5, 1A1D-2, 1A5D-1, 1B4C-2, F4540, D1-11, 9F10, D2811, 2H3, 9A3D-8, 3H5, 1F1, 8A1, ou 1H10 (ver, por exemplo, Roehrig et al., Virology 246:317-28, 1998; Crill and Chang, J. Virol. 78:13975-13986, 2004). A reatividade cruzada de anticorpo pode ser avaliada como descrito no Exemplo 10. V. Preparação dos Vírus e Partículas Virais
[088] Os métodos de cultura celular, reprodução viral, titulação de placa, e purificação de vírus ou partícula viral são bem conhecidos na técnica. Ver por exemplo Obijeski et al., J. Gen. Virol. 22:21-33, 1974; Beaty et al., Diagnostic Procedures for Viral, Ricksettial, and Chlamydial Infections, pp. 189-212, Lennette et al. (eds.), 7a Edição, American Public Health Association, 1995; Virology Methods Manual, Mahy and Kangro (eds.), Academic Press, 1996.
[089] Os vírus quiméricos da presente invenção podem ser feitos usando métodos padrão conhecidos e reconhecidos na técnica. Por exemplo, uma molécula de RNA que corresponde ao genoma de um vírus, ou de um vírus quimérico, pode ser introduzida nas células primárias, embriões de filhotes de aves, ou linhas celulares diploides, a partir das quais (ou os sobrenadantes a partir dos quais) o vírus pro- gênie pode então ser purificado. Outro método que pode ser usado para produzir os vírus utiliza células heteroploides, tais como células Vero (Yasumura et al., Nihon Rinsho 21:1201-1215, 1963). Neste método, uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma molécula de RNA) que corresponde ao genoma de um vírus ou vírus quimérico é introduzida nas células heteroploides, o vírus é colhido do meio em que as células foram submetidas à cultura, e o vírus colhido é tratado com uma nuclease (por exemplo, uma endonuclease que degrada tanto o DNA quanto o RNA, tal como Benzonase; Pat. U.S. No 5.173.418). O vírus tratado com nuclease é depois concentrado (por exemplo, através do uso da ultrafiltração usando um filtro tendo um corte de peso molecular de, por exemplo, 500 kDa (por exemplo, um cassete de ultrafiltro Pellicon-2 Mini)), diafiltrado contra MEME sem vermelho de fenol ou FBS, formulado pela adição de lactose, e filtrado em um recipiente estéril. Os detalhes de um método de produção viral são fornecidos na WO 03/060088. As partículas virais podem ser purificadas como aqui divulgado (ver, por exemplo, a seção VIII), por exemplo, através da ultracentrifugação através de um gradiente de sacarose e colchão de sacarose. VI. Detecção dos Anticorpos de Flavivírus
[090] A presente descrição também fornece um método de detec tar um anticorpo reativo de flavivírus em uma amostra (tal como uma amostra de um paciente, por exemplo, uma amostra de sangue), incluindo contatar a amostra com um vírus quimérico desta descrição sob condições através das quais um complexo anticorpo/polipeptídeo pode ser formado; e detectar a formação do complexo, deste modo detectando o anticorpo de flavivírus em uma amostra. Uma vantagem das quimeras de WN/DEN divulgadas é que estas crescem mais rápido e para títulos mais altos e produzem placas maiores do que a do DENV do tipo selvagem. Portanto, a descrição fornece os métodos de detectar um anticorpo reativo de DENV em uma amostra que são mais rápidos e mais específicos do que os métodos utilizando DENV do tipo selvagem. Por exemplo, a especificidade do ensaio (por exemplo, para distinguir entre os sorotipos de DENV) pode ser melhorada através do uso das quimeras divulgadas que incluem as substituições de aminoá- cidos na proteína E que reduz a reatividade cruzada de anticorpo.
[091] O método de detectar o anticorpo que reage ao flavivírus em uma amostra pode ser realizado, por exemplo, contatando-se uma amostra de fluido ou tecido de um paciente com um vírus quimérico desta descrição e detectando a ligação de pelo menos um polipeptídeo codificado pelo vírus para o anticorpo. Uma amostra fluida deste método pode incluir qualquer fluido biológico que pode conter o anticorpo, tal como fluido cérebro-espinal, sangue, plasma biliar, soro, saliva e urina. Outros exemplos possíveis dos fluidos corporais incluem esputo, muco e semelhantes.
[092] Em um exemplo, a presença de um anticorpo do vírus da dengue pode ser detectada em uma amostra de um paciente utilizando um flavivírus quimérico divulgado em um ensaio de teste de neutralização de redução de placa (PRNT) (ver por exemplo, o Exemplo 9). No ensaio de PRNT, uma amostra é contatada com um vírus codificado por um flavivírus quimérico aqui divulgado (tal como um vírus de WN/DEN2). Uma cultura celular adequada (tal como células Vero, C6/36, ou BHK) é inoculada com a mistura de vírus-amostra para infectar as células. A cultura celular é incubada sob condições suficientes para permitir a formação de placas e o número de placas formadas em uma cultura inoculada com a mistura de vírus quimérico-amostra é comparada com o número de placas formadas em uma cultura de controle (tal como células inoculadas com o vírus sozinho). Uma redução no número de placas na cultura celular inoculada com a mistura de vírus quimérico-amostra quando comparado à cultura de controle (por exemplo, uma diminuição de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 99 % se comparado com a amostra de controle) indica a presença de um anticorpo que neutraliza o DENV na amostra.
[093] Os imunoensaios enzimáticos tais como IFA, ELISA e imu- nomanchamento podem ser prontamente adaptados para efetuar a detecção dos anticorpos de flavivírus em uma amostra de acordo com os métodos desta divulgação. Um método ELISA eficaz para a detecção dos anticorpos pode, por exemplo, ser como segue: 1) ligar o vírus quimérico ou partículas virais a um substrato; 2) contatar o ligado vírus quimérico com uma amostra de fluido ou tecido contendo o anticorpo; 3) contatar o acima com um anticorpo secundário ligado a uma porção detectável que é reativa com o anticorpo ligado (por exemplo, enzima peroxidase de rábano-silvestre ou enzima fosfatase alcalina); 4) contatar o acima com o substrato para a enzima; 5) contatar o acima com um reagente de cor; e 6) observar/medir a mudança ou desenvolvimento da cor.
[094] A porção detectável permite a detecção visual de um preci pitado ou uma mudança na cor, detecção visual através de um microscópio (tal como um depósito cromogênico ou fluorescência), ou detecção automatizada por espectrometria, medição radiométrica ou similares. Os exemplos de porções detectáveis incluem fluoresceína, isotio- cianato de fluoresceína, rodamina, Cy5, e Cy3 (para microscopia de fluorescência e/ou o imunoensaio com base em microesfera), peroxidase de rábano-silvestre (para microscopia leve ou eletrônica e detecção bioquímica), biotina-estreptavidina (para microscopia leve ou eletrônica) e alcalino fosfatase (para a detecção bioquímica por mudança de cor).
[095] Outra técnica imunológica que pode ser útil na detecção dos anticorpos de flavivírus usa mAbs para a detecção de anticorpos especificamente reativos com polipeptídeos de flavivírus em um ensaio de inibição de competição. Resumidamente, uma amostra é contatada com um flavivírus quimérico ou partícula viral desta invenção que é ligada a um substrato (por exemplo, uma placa de 96 poços). A amostra em excesso é completamente lavada. Um mAb rotulado (por exemplo, ligada por enzima, fluorescente, radioativa, etc.) é depois comunicado com quaisquer complexos de polipeptídeo-anticorpo previamente formados e a quantidade de ligação de mAb é medida. A quantidade da inibição de ligação de mAb é medida com relação a um controle (nenhum anticorpo), permitindo a detecção e medição de anticorpos na amostra. O grau de inibição da ligação de mAb pode ser um ensaio muito específico para detectar uma variedade ou cepa de flavi- vírus particulares, quando fundamentado na especificidade de ligação de mAb para uma variedade ou cepa particulares de flavivírus. Os mAbs também podem ser usados para a detecção direta do flavivírus em células, por exemplo, por IFA de acordo com os métodos-padrão.
[096] Como outro exemplo, um teste de microaglutinação pode ser usado para detectar a presença de anticorpos de flavivírus em uma amostra. Resumidamente, as contas de látex, células vermelhas do sangue ou outras partículas aglutináveis são revestidas com um flavi- vírus quimérico ou partículas virais desta divulgação e misturadas com uma amostra, tal que os anticorpos na amostra que são especificamente reativos com a reticulação de antígeno com o antígeno, causando aglutinação. Os complexos de antígeno-anticorpo aglutinados formam um precipitado, visível ao olho nu ou mensurável por um es- pectrofotômetro.
[097] Ainda em outro exemplo, um imunoensaio com base em microesfera pode ser usado para detectar a presença de anticorpos de flavivírus em uma amostra. Resumidamente, as contas de microesfe- ras são revestidas com um flavivírus quimérico ou partícula viral desta divulgação e misturadas com uma amostra, tal que os anticorpos na amostra que são especificamente reativos com um antígeno codificado pelo vírus ligam o antígeno. Os complexos de vírus-anticorpo ligados a conta são deixados reagir com anticorpos antiespécies rotulados com corantes fluorescentes (tais como IgM anti-humana de cabra rotulada com FITC), e são medidos usando um leitor de microesferas (tal como um Luminex instrument). VII. Avaliação da Eficácia da Vacina Candidata
[098] Os flavivírus quiméricos aqui divulgados podem ser usados em métodos para avaliar a eficácia das vacinas candidatas, tais como os candidatos à vacina contra DENV. Várias vacinas contra DENV candidatas foram previamente desenvolvidas, tais como cepas de vacina atenuadas (por exemplo, PDK-53 de DEN2, PDK-13 de DEN1, PGMK-30/FRhL-3 de DEN3, e PDK-48 de DEN4) e construtos de DENV quiméricos (ver por exemplo a Patente U.S. No 7.094.411). Entretanto, correntemente não há nenhum modelo de camundongo ideal para a avaliação das vacinas contra DENV candidatas, porque camundongos imunocompetentes não inatos não sucumbem à inocula-ção de DENV do tipo selvagem e não geram viremia suficiente para medir um efeito de proteção de uma vacina candidata.
[099] A eficácia das vacinas contra DENV candidatas pode ser testada inoculando-se cobaias (por exemplo, camundongos ou primatas não humanos (tais como macacos reso)) com uma vacina candidata, seguido por inoculação com uma cepa de DENV virulenta. As quimeras de WN/DENV divulgadas podem ser virulentas e/ou geram uma viremia significante em camundongos não imunizados, portanto estas podem ser usadas como a dose de inoculação em cobaias previamente inoculadas.
[0100] Em uma modalidade particular, um conjunto de cobaias (tais como camundongos) é inoculado com uma vacina contra DENV candidata (por exemplo, cepa PDK-53 de DENV2). A administração do vírus da cepa da vacina candidata pode ser realizada através de quaisquer meios adequados, incluindo tanto a injeção parenteral (tal como injeção intraperitoneal, subcutânea, ou intramuscular), através da injeção in ovo em aves, oralmente, e através da aplicação tópica do vírus (tipicamente carregada na formulação farmacêutica) a uma superfície de via aérea. A aplicação tópica do vírus a uma superfície de via aérea pode ser realizada através da administração intranasal (por exemplo, através do uso de um conta-gotas, haste de algodão, ou inalador que deposita uma formulação farmacêutica de maneira intranasal) ou através da administração por inalação, tal como criando-se partículas respiráveis de uma formulação farmacêutica (incluindo tanto partículas sólidas quanto partículas líquidas) contendo o vírus como uma suspensão aerossol, e depois fazendo com que o paciente inale as partículas respiráveis. Em um exemplo particular, as cobaias são inoculadas de maneira intraperitoneal com um vírus de vacina em um veículo tal como salina de fosfato tamponado. As inoculações múltiplas (tais como reforços) podem ser realizadas, separadas por um período de tempo adequado, tal como pelo menos duas semanas, quatro semanas, oito semanas, doze semanas, ou mais.
[0101] As cobaias que foram vacinadas no teste são provocadas com uma dose virulenta ou letal (tal como uma dose letal determinada como no Exemplo 8) de uma quimera de flavivírus aqui divulgada (por exemplo, uma quimera de WN/DEN, tal como aquela codificada por uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 ou 7) seguindo um período de tempo adequado para permitir a imunidade com base na vacinação se desenvolver (tal como pelo menos duas semanas, quatro semanas, oito semanas, doze semanas, ou mais). A dose de inoculação pode ser administrada através de qualquer via adequada incluindo aquelas acima, e é opcionalmente administrada pela mesma via ou por uma via diferente como a dose de vacinação. Depois da dose de inoculação, as cobaias são monitoradas quanto o desenvolvimento da morbidez (tal como febre, erupções na pele, vômito, perda de apetite, pele áspe- ra, dorso curvado, letargia, movimento desequilibrado ou irritável, de-sidratação, perda de peso, ou sinais de paralisia) ou mortalidade. Além disso, o sangue é coletado das cobaias depois da inoculação para a medição dos níveis de viremia. Uma diminuição nos níveis de viremia, nos sinais de morbidez e/ou mortalidade comparados a um conjunto de controle que não foi inoculado com a vacina candidata (por exemplo, uma diminuição de pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou 99 % em uma população vacinada com o teste comparada com uma população de controle) indica a eficácia da vacina candidata. VIII. Produção de Partículas Virais Purificadas Contendo Proteínas prM e E da Dengue
[0102] As quimeras aqui divulgadas também podem ser usadas para rapidamente produzir as quantidades de partículas virais contendo as proteínas prM (ou M) e E de DENV, como tipo selvagem e cepas de DENV atenuadas geralmente não reproduzem eficazmente em cultura.
[0103] Os métodos de purificação de proteína são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3a edição, Springer, 1994). Os exemplos dos métodos de purificação de proteína incluem purificação por imunoafinidade, ul- tracentrifugação em um gradiente, cromatografia de troca de íons e filtração em gel.
[0104] Em um exemplo, é divulgado um método de produzir as partículas virais contendo as proteínas E e prM (ou M) do vírus da Dengue. O método inclui produzir os flavivírus quiméricos aqui divulgados em um sistema de cultura celular, tal como células Vero, C6/36, LLC-MK2, ou BHK. As células são infectadas com uma quimera de WN/DEN e incubadas por um tempo suficiente para o vírus ser produzido (por exemplo, pelo menos 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 8 dias, ou 10 dias). Um sobrenadante, tal como o meio de cultura celular, contendo o vírus quimérico é coletado e condensado através da precipitação em PEG. As partículas virais são depois purificadas através da ultracentrifugação em um gradiente (tal como gradiente de sacarose ou glicerol/tartarato de potássio). Ver por exemplo, Obijeski et al., J. Gen. Virol. 22:21-33, 1974. Em um exemplo particular, as células Vero ou C6/36 são infectadas com as quimeras de WN/DEN2 divulgadas e a partícula viral com a proteína prM e/ou de DEN2 E é purificada.
[0105] As partículas virais purificadas contendo proteínas prM e E de DENV são adequadas para o uso no lugar das proteínas preparadas através de outros meios (tal como expressão recombinante em células mamíferas, levedura, ou E. coli). Por exemplo, as partículas virais purificadas dos vírus quiméricos divulgados com proteínas prM e/ou E de DENV podem ser usadas em métodos de detectar anticorpos contra estas proteínas (tais como testes ou ensaios de diagnósticos para determinar a resposta a uma vacina candidata). Por exemplo, as partículas virais purificadas podem ser imobilizadas em um suporte sólido e utilizadas em métodos de imunodetecção tais como ELISA, ensaios de inibição de competição, teste de microaglutinação, ou mi- croesfera com base em imunoensaios. Além disso, as partículas virais purificadas são adequadas para o uso em ensaios de PRNT para a detecção de anticorpos de DENV neutralizantes.
[0106] Além disso, devido aos vírus quiméricos de WN/DEN divul gados crescerem mais rapidamente em cultura e aos títulos mais altos do que os vírus de DEN, as partículas virais purificadas contendo proteínas prM e/ou E de DENV são úteis para a produção de antígenos de DENV. Os usos para estes antígenos incluem a produção e teste dos candidatos de vacina e o uso das partículas para outros estudos da dobra de proteína, estrutura tridimensional, e mapeamento de epi- topo. IX. Infectividade e Transmissibilidade do Mosquito
[0107] O mosquito Aedes aegypti é o vetor principal para o DENV, enquanto os mosquitos Culex quinquefasciatus e Culex pipiens são os vetores naturais para o WNV. Os flavivírus quiméricos divulgados podem ter infectividade e/ou transmissibilidade reduzida ou eliminada em um ou mais vetores do mosquito. Os métodos para determinar se um vírus pode infectar ou ser transmitido por uma espécie ou cepa de mosquito são conhecidos àqueles versados na técnica.
[0108] Por via de exemplo, para determinar se os vírus quiméricos divulgados podem infectar A. aegypti, C. quinquefasciatus, C. pipiens, ou outras espécies de mosquitos, os mosquitos podem ser alimentados com farinha de sangue contendo vírus (tal como uma mistura 1:1 de sobrenadante celular das células infectadas e sangue de bezerro ou de ovelha desfibrinado) ou através da inoculação intratorácica com um meio contendo vírus (tal como cerca de 105 a 107 pfu).
[0109] Os mosquitos infectados ou de controle são anestesiados com frio e dissecados. Os intestinos intermediários e/ou partes frontais são coletados e fixados em acetona (partes frontais) ou paraformaldeí- do a 4 % (intestinos intermediários) e tingidos através de ensaio de imunofluorescência com um anticorpo da proteína E de pan-flavivírus, tal como 4G2, ou anticorpos específicos de sorotipo, tais como 3H5 (DEN2), 1F1 (DEN1), 8A3 (DEN3), ou 1H10 (DEN4). Um anticorpo conjugado com fluoresceína (tal como anticorpo IgG anticamundongo de cabra) é usado para a detecção secundária. Os ensaios de imunofluo- rescência de tecidos são lidos usando um microscópio fluorescente.
[0110] A imunofluorescência da proteína E diminuída em mosqui tos infectados com o vírus quimérico de WN/DEN quando comparada às amostras de controle (aquelas infectadas com DENV ou WNV) indica que o vírus quimérico tem infectividade e/ou transmissibilidade diminuída em uma espécie de mosquito particular se comparado ao DENV ou WNV do tipo selvagem. Um aumento na imunofluorescência de proteína E em mosquitos infectados com o vírus de WN/DEN quimérico se comparado às amostras de controle (tais como aquelas infectadas com DENV ou WNV) pode indicar que o vírus quimérico tem infectividade e/ou transmissibilidade aumentada em uma espécie de mosquito particular se comparado ao DENV ou WNV do tipo selvagem.
[0111] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar certas características e/ou formas de realização particulares. Estes exemplos não devem ser interpretados para limitar invenção às características ou formas de realização particulares descritas. EXEMPLOS Exemplo 1
[0112] Construção de Vírus Quimérico de WN/DEN2
[0113] Este exemplo descreve a construção de um vírus do Nilo Ocidental/Dengue-2 quimérico consistindo nos genes prM e E de DEN2 em uma estrutura principal de WNV.
[0114] Um clone infeccioso NY99 de WNV (designado como clone WN/IC-P991) em um sistema de plasmídeo duplo foi usado. pWN-AB- Asc continha nucleotídeos 1 a 2495 e pWN-CG continha nucleotídeos 2495-11029 (descrito em Kinney et al., J. Gen. Virol. 87:3611-3622, 2006). Mutagênese sítio-dirigida de pWN-AB-Asc foi realizada usando o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange® Multi (Stratagene, La Jolla, CA) para criar um sítio de SacII nos nucleotídeos 412-418 e um sítio de BspEI nos nucleotídeos 2424-2429 do genoma de WNV. Usando mutagênese sítio-dirigida similar, estes sítios foram engendrados em um clone infeccioso 16681 de DEN2 (D2/IC-30P-A; Kinney et al., Virology 230:300-308, 1997) para gerar o clone D2IC-30P-NBX. Digestão com restrição com SacII e BspEI foi usada para separar os genes prM e E (pb 398-2430) tanto dos clones infecciosos 16681 de DEN2 quanto WNV. Os genes prM (incluindo a sequência de sinal de prM de DEN2 no final do gene C, que serve como uma âncora para a proteína C durante o processamento de poliproteína) e E de 16681 de DEN2 foram ligados no plasmídeo pWN-AB-Asc, substituindo os genes prM e E de WNV com os equivalentes de DENV, para criar pWN/D2-AB.
[0115] cDNA genômico de tamanho natural foi preparado clivando- se pWN/D2-AB e pWN-CG no sítio NgoMIV natural localizado no pb 2495 do genoma de WNV. Os dois plasmídeos depois foram ligados juntos no sítio NgoMIV e transcritos usando o kit AmpliScribe® T7 (Epicentre Technologies, Madison, WI). A figura 1 mostra um diagrama esquemático da quimera de WN/DEN2 (WN/D2) e a junção entre a proteína C de WN e a sequência de sinal de prM de DEN2 e proteína prM.
[0116] A transcrição in vitro foi realizada a 37° C durante 2 a 3 ho ras e células C6/36 ou Vero foram transfectadas com o RNA transcrito por eletroporação. Vírus infeccioso foi coletado 4 a 7 dias após a trans- fecção. Vírus foi designado como semente de C6/36-0 quando recuperado de células C6/36 transfectadas, e como Vero-0 quando recuperado de células Vero transfectadas. As sementes de C6/36-0 e Vero-0 foram usadas para infectar células C6/36 e Vero, respectivamente, para obter as sementes de trabalho C6-1 e V-1.
[0117] Para verificar a exatidão do genoma das quimeras recupe radas, RNA viral foi extraído do vírus C6-1 usando o kit QIAamp® (Qiagen Inc, Valencia, CA) e produtos de cDNA foram gerados usando o sistema de RT-PCR de Um-Tubo Titan® (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Produtos de PCR foram diretamente sequenciados para confirmar a sequência de genoma do vírus de WN/DEN2 quimérico (SEQ ID NO: 1). Exemplo 2 Replicação e Titulação do Vírus Quimérico de WN/DEN2 em Células
[0118] Este exemplo descreve a replicação de um vírus quimérico de WN/DEN2 em linhagens de célula C6/36 e Vero. Métodos
[0119] Três frascos T75 de células C6/36 e Vero foram infectados em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,001 com cada um dos vírus seguintes: WN NY99, DEN2 16681, ou vírus de WN/DEN2 (produzido como descrito no Exemplo 1). Vírus em 3 mL de meio Ye-Lah (10 g de extrato de levedura e 50 g de hidrolisado de lactalbumina por 1000 mL de água) contendo 2 % de soro de bezerro fetal (células C6/36) ou 3 mL de DMEM Modificado de Iscove (por exemplo, Gibco- Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 2 % de soro de bezerro fetal (células Vero) foram adicionados à monocamada quando as células foram 95 a 100 % confluentes. Seguinte à infecção, frascos foram incubados a 28° C e 37° C para células C6/36 e Vero, respectivamente. Frascos foram agitados a cada 15 minutos durante 1,5 hora para a adsorção viral. Depois de 1,5 hora, 27 mL de meio de crescimento foram adicionados a cada frasco e os frascos foram incubados a 28° C para células C6/36 ou 37° C para células Vero durante 10 dias. A cada 2 dias, uma alíquota de 300 μL foi removida de cada frasco e combinada com 300 μL de DMEM de Iscove contendo 35 % de soro de bezerro fetal. Todas as alíquotas foram armazenadas a -80° C até que elas pudessem ser tituladas por ensaio de placa em células Vero. Depois da titulação de placa de cada alíquota, a cinética do crescimento viral em cada tipo de célula foi estabelecida, e também usada para determinar o dia de colheita de semente apropriado quando da produção de sementes de quimera. Quando da produção de sementes de vírus quimérico, as condições de cultura foram proporcionalmente aumentadas conforme um índice fixado a vasos de cultura de tecido maiores.
[0120] Amostras de vírus foram tituladas por ensaio de placa em células Vero. Diluições seriais de 10 vezes de todas as amostras de vírus foram feitas em diluente BA-1. 100 μL de cada diluição foram adicionados a um poço de uma placa de cultura tecidual de 6 poços contendo uma monocamada confluente de células Vero. A seguir da inoculação, as placas foram incubadas a 37° C em uma atmosfera de 5 % de CO2 durante 1,5 hora para permitir a adsorção viral. As placas foram agitadas a cada 10 minutos para garantir que a monocamada não secasse totalmente. Depois da adsorção viral todos os poços foram cobertos com 4 mL de cobertura de agarose a 0,8 % contendo uma solução salina balanceada e meio Ye-Lah. As placas foram incubadas a 37° C em uma atmosfera de 5 % de CO2 durante os tempos indicados. A seguir da incubação, poços foram cobertos com 2 mL adicionais de cobertura de agarose que também contém 1,5 % de vermelho neutro para visualizar as placas. As placas foram lidas e as placas foram calculadas no dia seguinte.
[0121] Isolamento de placa e passagem serial da quimera em cé lulas Vero foram realizados. Uma das placas grandes da semente V-1 (como V-2) foi isolada da placa de titulação, e usada para infectar um frasco de células Vero frescas. O meio de cultura colhido deste frasco foi designado como semente V-3, e foi serialmente passado através de células Vero sete vezes mais para obter as sementes V-4 a V-10. Adicionalmente, as placas produzidas da semente de trabalho C6-1 na placa de titulação de placa Vero também mostrou uma porção pequena de placas maiores entre as placas de tamanho minúsculo. Uma placa grande foi isolada da placa (como C6-1/V-1) e usada para infectar um frasco de células Vero frescas para obter a semente C6-1/V-2.
[0122] Testes de PRNT foram realizados incubando-se vírus com diluições seriais de um fluido ascítico de camundongo hiperimune com WNV (HMAF; M28548), um anticorpo monoclonal específico de proteína E de WNV (MAb3.67G), um HMAF de DEN2 (VS0090), ou um anticorpo monoclonal específico de proteína E de DENV-2 (MAb3H5) a 4° C durante a noite. No dia seguinte, amostras foram adicionadas às células Vero em placas de cultura de 6 poços e seguido por procedimento de cobertura como no método de titulação de placa descrito acima. O título de neutralização foi determinado como a maior diluição de anticorpo que diminuiu placas em pelo menos 50 % comparado aos resultados de retrotitulação do vírus de entrada no mesmo ensaio.
[0123] Resultados
[0124] O vírus quimérico de WN/DEN2 replicou eficientemente e alcançou títulos altos em células C6/36 (8,6 log10 pfu/mL para a semente C6-1). A formação de placa também foi avaliada em células Vero. Títulos da semente de trabalho depois de uma passagem em células Vero (semente V-1) foram cerca de 4 a 5 log10 pfu/mL. Comparado ao tamanho de placa dos vírus D2 16681 e WN NY 99 parentais em células Vero, o vírus de WN/DEN2 quimérico formou placas que foram muito maiores do que o vírus D2 16681 no dia 8 pós-infecção (p.i.) (Figura 2), mas ainda menores do que o vírus WN NY99 de crescimento rápido, que lisaria a folha de célula integral no dia 8 após a infecção.
[0125] Placas foram visualizadas e medidas no dia 5 p.i. depois da passagem em células C6 ou Vero (Figura 3). Vírus NY99 do Nilo Ocidental do tipo selvagem (NY99 de WNV) e vírus 16681 de DEN-2 foram incluídos no mesmo experimento para comparação. NY99 de WNV produziu placas grandes no dia 5 p.i., enquanto nenhuma placa foi visível para 16681 de DEN-2 neste ponto no tempo. O tamanho de placa aumentou a seguir das passagens adicionais em células Vero (Tabela 3).
[0126] Sequência de genoma total foi obtida para a semente de trabalho C6-1 assim como as sementes de passagem Vero seriais, V3, V-10, e C6-1/V2. A sequência de consenso da semente C6-1 não mostrou nenhuma mutação comparado aos vírus do Nilo Ocidental e DEN-2 precursor dos quais ela foi derivada. A semente C6-1/V-2 con- tinha duas mutações silenciosas (nucleotídeo 3291 da SEQ ID NO: 1 C>T e 8469 da SEQ ID NO: 1 A>G) e uma mutação de sentido equívoco (nucleotídeo 1558 da SEQ ID NO: 1; A>G), resultando em uma mudança de aminoácido de N a D na posição 203 da proteína E de DEN2 (aminoácido 488 da SEQ ID NO: 2; E-N203D). A passagem de V-3 teve duas mutações silenciosas (nucleotídeo 1566 da SEQ ID NO: 1 T>C e nucleotídeo 2973 da SEQ ID NO: 1 T>C) e três mutações de sentido equívoco, nucleotídeo 1558 da SEQ ID NO: 1 (A>G), nucleotí- deo 3638 da SEQ ID NO: 1 (T>C), e nucleotídeo 3772 da SEQ ID NO: 1 (T>C). Estas mutações de sentido equívoco resultaram em substituições de aminoácido na proteína E de DEN2 E-N203D (aminoácido 488 da SEQ ID NO: 2) e na proteína NS2A de WNV, NS2A-I49T (aminoá- cido 1181 da SEQ ID NO: 2) e NS2A-F94L (aminoácido 1226 da SEQ ID NO: 2). A semente V-10 mostrou 4 mutações silenciosas (nucleotí- deo 1566 da SEQ ID NO: 1 T>C, nucleotídeo 2973 da SEQ ID NO: 1 T>C, nucleotídeo 3600 da SEQ ID NO: 1 T>mistura de T/C, e nucleotí- deo 6181 da SEQ ID NO: 1 C>mistura de C/T) e 6 mutações de sentido equívoco (nucleotídeos 1316 A>T/A, 1508 C>T, 1558 A>G 3638 T>C, 3772 T>C, e 7604 C>T, todos numerados como na SEQ ID NO: 1). As mudanças de aminoácido resultantes são mostradas na Tabela 3. Dois dos locos de mutação de sentido equívoco tiveram nucleotí- deos mistos, resultando em um genótipo misto de E-K122I/K (aminoá- cido 407 da SEQ ID NO: 2) e NS4B-T241T/I (aminoácido 2503 da SEQ ID NO: 2).
[0127] A mutação E-N203D foi encontrada em duas sementes (C6-1/V-2 e V-3) que foram descendentes de sementes virais separadas derivadas de experimentos independentes. Isto indica que esta mutação particular pode ser crítica para a quimera adaptando-se às culturas de célula Vero. Esta mutação também pode aumentar levemente o tamanho de placa da quimera em células Vero, suportando ainda seu efeito sobre o crescimento viral em Vero. Além disso, as duas mutações de NS2A na semente V-3, NS2A-I49T e NS2A-F49L, também aumentaram significativamente o crescimento viral em células Vero, resultando em placas maiores comparado à semente C6-1/V-2. A mutação de E-K122I (que elimina a carga positiva no aminoácido 122 de proteína E) também pode ser uma mutação de adaptação de célula Vero para DEN2. Tabela 3. Tamanho de placa e sequência de passagens sucessivas de WN/DEN2
* média ± desvio padrão N/A: não aplicável
[0128] A cinética do crescimento dos vírus do tipo selvagem e quiméricos foi testada tanto em células Vero quanto C6/36. Células Vero foram infectadas com WN/DEN2 quimérico, WNV NY99, ou DENV-2 16681 na mesma multiplicidade de infecção (MOI) e o título foi determinado por 10 dias (Figura 4). WNV NY99 do tipo selvagem alcançou seu título máximo (8,8 log10 pfu/mL) por dia 2 e o título caiu rapidamente em dias subsequentes. A semente V-10 de WN/DEN2 também alcançou seu título máximo pelo dia 2 (6,3 log10 pfu/mL), mas apenas diminuiu levemente em título pelo dia 10. Sementes V-3 e C6- 1/V-2 de WN/DEN2 chegaram aos seus títulos máximos (5,5 log10 pfu/mL e 5,6 log10 pfu/mL, respectivamente) pelo dia 4 e depois permaneceram razoavelmente constantes (com um leve aumento global) através do dia 10. C6-1 de WN/DEN2 cresceu mais lentamente, alcançando seu título máximo no dia 6 (84,8 log10 pfu/mL). DENV-2 16681 também alcançou seu título máximo (5,5 log10 pfu/mL) no dia 6 e permaneceu razoavelmente constante por todos os dias remanescentes.
[0129] A replicação viral em células C6/36 mostrou que os vírus de WN/DEN2 quiméricos todos alcançaram títulos de pico de aproximadamente 8,5 log10 pfu/mL (figura 5), similares àquele de DENV-2 16681. WNV NY99 alcançou um título de pico de 9,6 log10 pfu/mL. Exceto para a semente V-10, todos os vírus quiméricos alcançaram títulos de pico no dia 6 p.i., similar a WNV NY99. A semente V-10 alcançou título de pico no dia 8, e teve um perfil de crescimento muito similar àquele de DENV-2 16681.
[0130] Testes de neutralização com redução de placa (PRNT) fo ram realizados em WNV NY99, DENV-2 16681, WN/DEN2 C6-1, WN/DEN2 C6-1/V-2, WN/DEN2 V-3, e WN/DEN2 V-10 para determinar seu perfil antigênico (Tabela 4). Embora, o ponto final de alguns dos títulos de PRNT não fosse determinado, todas as quimeras tiveram um padrão de neutralização similar ao wt DENV-2 16681 por todos os 4 anticorpos testados. O PRNT tradicional do vírus DENV-2 16681 usualmente consome cerca de 8 a 10 dias devido ao crescimento lento e placas minúsculas produzidas pelo vírus. Por outro lado, todas as sementes de WN/D2 testadas mostraram placas pelo dia 5 p.i., resultando em PRNT mais rápido. Os padrões de PRNT similares àqueles de wt DENV-2 e a capacidade de formação de placa rápida tornam as quimeras de WN/D2 adequadas como um vírus de DENV-2 substituto no diagnóstico por PRNT. Tabela 4. Ensaio de PRNT de vírus quiméricos de WN/DEN2
* Maior diluição de anticorpo que placas diminuídas em pelo menos 50 %. Exemplo 3
[0131] Características de Quimeras de WN/DEN2 com Mutações Específicas
[0132] Este exemplo descreve as características in vitro de quime ras de WN/DEN2 contendo mutações específicas introduzidas. Métodos
[0133] Para modificar ainda o vírus de WN/DEN2 quimérico para adaptar a culturas de célula mamífera, construções quiméricas WN/D2-E203 (contendo E-N203D; aminoácido 488 da SEQ ID NO: 2), WN/D2-2A (contendo NS2A-I49T e NS2A-F94L; aminoácidos 1181 e 1226 da SEQ ID NO: 2, respectivamente), e WN/D2-E-2A (contendo E- N203D, NS2A-I49T e NS2A-F94L) foram fabricadas. Fragmentos de cDNA contendo a mutação E-N203D, ou mutações NS2A-I49T e NS2A-F94L foram ampliados em RT-PCR a partir da semente C6-1/V- 2 ou semente V-3 (descrita no Exemplo 2), respectivamente. O fragmento com E-N203D foi clonado no 5’-plasmídeo contendo cDNA de WN/DEN2 quimérico de nt 1-2445 (pWN/D2-AB) para obter novo plasmídeo mutante, pWN/D2-AB-E203. O fragmento mutante NS2A (incluindo a mutação silenciosa no nucleotídeo 2973 da SEQ ID NO: 1 T>C) foi clonado no plasmídeo de wt 3’-WN contendo cDNA de WNV nt 2440-10996 (pWN-CG) para obter pWN-CG-2A mutante. WN/D2- E203 foi construído ligando-se pWN/D2-AB-E203 com wt pWN-CG por junção de NgoMIV (nt 2495 de WNV). WN/D2-2A foi construído ligando-se wt pWN/D2-AB com pWN-CG-2A por junção de NgoMIV. WN/D2-E2A foi fabricado ligando-se pWN-AB-E203 com wt pWN-CG- 2A por junção de NgoMIV. Cada vírus quimérico foi recuperado de células Vero transfectada e a semente de trabalho (V-1) de cada vírus foi fabricada depois de uma passagem da semente de transfecção a células Vero. Resultados
[0134] O sequenciamento de genoma total da semente V-1 con firmou que nenhuma mutação de sentido equívoco adicional acumulou durante a replicação em células Vero. Apenas uma mutação silenciosa em nt 2973 da SEQ ID No 1: (T>C) foi encontrada tanto em vírus WN/D2-2A quanto WN/D2-E2A; esta mutação foi introduzida durante a clonagem de plasmídeo pWN-CG-2A usado no processo de derivar estas quimeras.
[0135] Ensaios de placa usando cada quimera mostraram que to das as placas maiores produzidas em células Vero do que a semente C6-1 de WN/D2 original (figura 6). Placas produzidas por estas quimeras podem ser facilmente visualizadas pelo dia 4 p.i. Houve um fenóti- po de placa misto na semente WN/D2-2A, que pode indicar que este vírus ainda estava desenvolvendo-se em células Vero. Entretanto, ambas as quimeras com a mutação E-N203D pareceram ser muito estáveis em células Vero. Exemplo 4
[0136] Determinação da Infectividade de Mosquito de Quimera de WN/DEN2
[0137] Este exemplo descreve a determinação da capacidade de quimera de WN/DEN2 para infectar vetores de mosquito com DENV e WNV. Métodos
[0138] Farinhas de sangue infecciosas foram fabricadas usando vírus recentemente preparados com um título aproximado de 107 pfu/mL em uma razão de 1:1 com sangue de carneiro desfibrinado. Os mosquitos Aedes aegypti, Culex pipiens, ou Culex quinquefasciatus foram deixados alimentar em farinhas de sangue infecciosas fornecidas em um alimentador de membrana HEMOTEK. Mosquitos alimentados com sangue foram mantidos a 28° C durante 10 dias. Intestinos intermediários e partes frontais foram dissecados, fixados em lâminas, e tingidos por intermédio de imunofluorescência usando o anticorpo monoclonal pan-flaviviral 4G2. Resultados
[0139] O mosquito Aedes aegypti é o principal vetor para DENV, enquanto Culex quinquefasciatus e Culex pipiens são os vetores naturais para WNV. A quimera C6-1 de WN/DEN2 (que carece de quaisquer mutações de adaptação de célula Vero) infecta o intestino intermediário de Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti em um padrão mais similar àquele de WNV do tipo selvagem do que o vírus da DEN2 do tipo selvagem (figura 7), sugerindo que os genes não estruturais de WNV no vírus de quimera têm efeitos significantes na infecção destes mosquitos. Entretanto, o vírus C6-1 de WN/DEN2 teve taxa de infecção baixa similar como o DENV-2 no intestino intermediário de Culex pipiens, sugerindo que os genes estruturais de DENV2 na quimera estavam controlando a infecção em Culex pipiens. Exemplo 5
[0140] Construção de Vírus Quiméricos de WN/DEN Adicionais
[0141] Este exemplo descreve a construção de vírus quiméricos contendo a estrutura principal de WNV e proteína prM e E de DEN1, DEN3, ou DEN4.
[0142] Os genes prM (incluindo a sequência de sinal de prM de DEN4) e E de DEN4, foram ligados no plasmídeo pWN-AB-Asc, substituindo os genes prM e E de WNV com os equivalentes de DENV, para criar pWN/D4-AB. Duas quimeras foram construídas, uma com componentes de WNV do tipo selvagem e uma incluindo as mutações de WNV NS2A I49T e F94L. cDNA genômico de tamanho natural foi preparado clivando-se pWN/D4-AB e pWN-CG (ou WN-CG-2A) no sítio de NgoMIV natural localizado no pb 2495 do genoma de WNV. Os dois plasmídeos depois foram ligados juntos no sítio de NgoMIV e transcritos usando o kit AmpliScribe® T7 (Epicentre Technologies, Madison, WI). A figura 8 mostra um diagrama esquemático da quimera de WN/DEN4 (WN/D4) e a junção entre a proteína C de WN e a sequência de sinal de prM de DEN4 e proteína prM. As sequências de ácido nucleico e aminoácido de uma quimera de WN/DEN4 são fornecidas nas SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente. A quimera de WN/DEN4 tendo as mutações de NS2A tiveram substituições de ami- noácido nos aminoácidos 1181 e 1226 da SEQ ID NO: 8, respectivamente.
[0143] Quimeras de WN/DEN1 e WN/DEN3 são criadas como acima e a junção entre a proteína C de WN e a sequência de sinal de prM de DEN e proteína prM é mostrada na figura 8. As sequências de ácido nucleico e aminoácido de uma quimera de WN/DEN1 são fornecidas nas SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente. A quimera de WN/DEN1 tendo as mutações de NS2A tiveram substituições de ami- noácido nos aminoácidos 1181 e 1226 da SEQ ID NO: 4, respectivamente. As sequências de ácido nucleico e aminoácido de uma quimera de WN/DEN3 são fornecidas nas SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente. A quimera de WN/DEN3 tendo as mutações de NS2A tiveram substituições de aminoácido nos aminoácidos 1179 e 1224 da SEQ ID NO: 6, respectivamente. Exemplo 6
[0144] Avaliação da Cinética de Neurovirulência e Neuroinvasão de Vírus Quimérico
[0145] Este exemplo descreve métodos para avaliar a cinética de neurovirulência e neuroinvasão de vírus quiméricos de WN/DEN (tais como os produzidos nos Exemplos 1 ou 5) em camundongos. Neurovirulência
[0146] Grupos de 10 camundongos (tais como camundongos Swiss Webster, NIH Swiss, ou ICR) são inoculados intracranianamente com diluições de dez vezes de WNV e vírus quimérico de WN/DEN de 0,1 pfu a 1000 pfu. Um grupo de 10 camundongos é inoculado com 1000 pfu de DENV. O vírus é diluído em 30 μL de solução salina tam- ponada com fosfato (PBS) e é administrado por intermédio de inoculação intracraniana. Camundongos são monitorados diariamente durante 4 semanas para determinar a dose virulenta. Camundongos apresentando sinais de doença (tal como pele áspera, dorso encurvado, letargia, movimento desequilibrado ou irritável, desidratação, perda de peso de 10 %, ou sinais de paralisia) são submetidos à eutanásia. Os resultados são usados para calcular a dose virulenta de 50 % (VD50) da quimera de WNV/DENV. Uma VD50 diminuída comparada ao vírus da DEN do tipo selvagem indica neurovirulência mais alta do que o DENV do tipo selvagem. Viremia/Neuroinvasão
[0147] Grupos de 12 camundongos (tais como os camundongos Swiss Webster, NIH Swiss, ou ICR) são inoculados com 1000 pfu de WNV, DENV, e quimera de WN/DEN. O vírus é inoculado intraperito- nealmente em 100 μl de PBS. Nos dias 1, 3, 5 e 7 p.i., camundongos de cada grupo são sacrificados e amostras de sangue e cérebro são coletadas de cada camundongo. Os cérebros são homogeneizados em DMEM e tanto os títulos do sangue quanto do cérebro são determinados por ensaio de placa em células Vero, como descrito no Exemplo 2. Um número aumentado de pfu quando comparado a uma amostra de controle (tal como um DENV ou WNV) indica neuroinvasão ou virulência aumentadas. Um número diminuído de pfu comparado a uma amostra de controle (tal como um DENV ou WNV) indica neuroin- vasão ou virulência diminuídas. Quimeras com neuroinvasão mais alta são avaliadas ainda em camundongos de 12 semanas de idade quanto ao desenvolvimento de uma dose de DENV substituto para o estudo de inoculação de virulência como descrito no Exemplo 8. Exemplo 7
[0148] Determinação da Resposta do Anticorpo a Quimeras de WN/DEN
[0149] Este exemplo descreve métodos para a determinação de respostas de anticorpo em camundongos ou outros animais inoculados com quimeras de WN/DEN. Anticorpos para proteínas prM e E de DENV e proteínas não estruturais de WNV, particularmente NS1, são medidos. Este exemplo também descreve um método para avaliar a eficácia protetiva da resposta imune a proteínas não estruturais de WNV.
[0150] Antes da inoculação do vírus, amostras de sangue de soro pré-imune são coletadas de todos os camundongos cortando-se a veia da cauda. Grupos de 10 camundongos (tais como os camundongos Swiss Webster, NIH Swiss, ou ICR) são inoculados intraperitoneal- mente com 100 μL de PBS contendo diluições seriais de dez vezes de WNV ou vírus quimérico de WN/DEN variando de 0,1 a 1000 pfu. Um grupo de 10 camundongos é inoculado com 1000 pfu de DENV. Os camundongos são monitorados diariamente durante quatro semanas e os camundongos apresentando sinais de doença serão submetidos à eutanásia. Quatro semanas depois da inoculação primária do vírus, o sangue é coletado de todos os camundongos sobreviventes cortando- se a veia da cauda. Espera-se que apenas grupos de dose baixa de camundongos inoculados com WNV e WN/DEN, e camundongos inoculados com 1000 pfu de DENV sobrevivam. Amostras de soro do sangue coletado são inativadas por calor a 56° C durante 30 minutos e os anticorpos no soro são determinados por ensaios ELISA e/ou PRNT.
[0151] Dois dias depois da coleta do sangue, todos os camundon gos são inoculados com uma dose letal de WNV NY99 (1000 pfu). O vírus é liberado em 100 μl de PBS por intermédio de inoculação intraperitoneal. Os camundongos são monitorados diariamente e os camundongos moribundos são submetidos à eutanásia por superexposição ao gás CO2. O sangue é coletado de camundongos que sobrevivem mais do que 21 dias depois da inoculação de WNV e os anticorpos no soro são determinados por ELISA e/ou PRNT. Respostas do anticorpo e razões de sobrevivência nos grupos que são primeiro inoculados com vírus de WN/DEN quimérico são usadas para avaliar a eficácia protetiva da resposta imune provocada por proteínas não estruturais de WNV a partir do vírus de WN/DEN quimérico. A resposta de anticorpo e/ou a razão de sobrevivência aumentadas em animais inoculados com vírus quimérico de WN/DEN e inoculados com WNV indica que uma resposta e imunidade protetiva do anticorpo são o resultado de proteína C de WNV ou proteínas não estruturais. Exemplo 8
[0152] Determinação da Dose Letal de WN/DEN e Avaliação da Eficácia da Vacina de DENV
[0153] Este exemplo descreve os métodos para usar os vírus qui méricos de WN/DEN para avaliar a eficácia das vacinas contra DENV candidatas.
[0154] A dose letal do vírus quimérico de WN/DEN é determinada em camundongos inoculando-se camundongos com 12 semanas de idade (tais como camundongos Swiss Webster, NIH Swiss, ou ICR; 8 animais por grupo) com PBS como um controle, ou 10, 100, 1000, ou 10.000 vezes a VD50 calculada a partir da experiência de neuroinvasão (descrita no Exemplo 6) ou 104, 105, 106, ou 107 pfu, qualquer que seja a mais baixa. Os camundongos são inoculados de maneira intraperitoneal com vírus em 100 μl de PBS. Os camundongos são monitorados quanto a sinais de doença clínica diariamente e os camundongos moribundos são submetidos à eutanásia através da longa exposição ao gás CO2. A VD50 (dose a qual causa doença em 50 % dos camundongos inoculados) é calculada e a dose letal é geralmente de 10 a 1000 x VD50. Usualmente 100 x VD50 é usada. Alternativamente, o sangue pode ser coletado depois da inoculação do vírus para determinar os níveis de viremia de cada grupo. As doses quiméricas virais que causam alta viremia se comparado a um do grupo de controle de DENV tipo selvagem (tal como 100 vezes, 1000 vezes, 10000 vezes ou superior) podem ser usadas para o estudo de eficácia da vacina.
[0155] Para avaliar eficácia da vacina contra DENV candidata, grupos de camundongos com 4 semanas de idade (tais como camundongos Swiss Webster, NIH Swiss, ou ICR) são inoculados de maneira intraperitoneal com do uma cepa de vacina contra DENV, DENV, ou PBS tipo selvagem. Os camundongos em cada grupo são inoculados de maneira intraperitoneal com 105 pfu de vírus em 100 μl de PBS. Imunizações idênticas são dadas de quatro a seis semanas antes. Aos camundongos são dados vírus quiméricos de WN/DEN em uma dose letal (100 x VD50) ou uma dose que causa alta viremia se comparado ao DENV do tipo selvagem quando estes têm 12 semanas de idade. Os camundongos são sangrados para determinar o nível de viremia e são diariamente monitorados quanto a sinais de morbidez após a inoculação letal por vírus. Os camundongos com o primeiro sinal de morbidez, tais como pele áspera, dorso curvado, letargia, movimento desequilibrado ou irritável, desidratação, perda de peso em 10 %, ou sinais de paralisia são imediatamente submetidos à eutanásia através da longa exposição ao gás CO2.
[0156] O sangue também é coletado antes da imunização secun dária, da inoculação letal por WN/DEN, e dos camundongos que sobreviveram de 21 a 28 dias após a inoculação letal. Os anticorpos para as proteínas de DEN ou WNV no soro são determinados por PRNT. A eficácia de proteção da vacina é avaliada comparando-se os níveis de viremia ou as razões de sobrevivência dos grupos vacinados com o grupo de controle não imunizado. A sobrevivência aumentada, o nível de viremia diminuído, ou a produção de anticorpo anti-DENV aumentada dos camundongos inoculados com uma vacina candidata quando comparado a um grupo controle indica uma vacina contra DENV candidata adequada para outros testes. Nenhum aumento na sobrevivência ou nenhuma diminuição no nível de viremia comparado a um grupo de controle não imunizado indica baixa eficácia de proteção pela vacina contra DENV candidata. Exemplo 9 Ensaios de Anticorpo de Neutralização
[0157] Este exemplo descreve os métodos de avaliar a resposta do anticorpo de neutralização para a infecção por DENV ou quimeras virais de WN/DEN usando um ensaio de neutralização de redução de placa (PRNT) ou ensaio de neutralização com base na imunomarcação.
[0158] As amostras de soro são testadas quanto os anticorpos neutralizantes através de PRNT de diluição do soro. 60 a 100 pfu da quimera do vírus WN/DEN ou de DENV do tipo selvagem são incubados com diluições sequenciais 2 vezes dos espécimes de soro inativa- dos por calor (56° C por 30 minutos) durante a noite a 4° C. As misturas de vírus-soro são inoculadas em placas de cultura de tecido contendo uma monocamada confluente de células Vero. Após a inoculação, as placas são incubadas a 37° C em uma atmosfera de CO2 a 5 % por 1,5 hora para permitir a adsorção viral. As placas são agitadas a cada 10 minutos para garantir que a monocamada celular não seque. Depois da adsorção viral, as células são cobertas com agarose a 0,8 % contendo uma solução salina balanceada e meio de Ye-Lah (10 g de extrato de levedura e 50 g de hidrolisado de lactalbumina por 1000 mL de água). As placas são incubadas a 37° C em uma atmosfera de CO2 a 5 % por de 1 a 7 dias. Após esta incubação, os poços são cobertos com outro revestimento de agarose contendo vermelho neutro a 1,5 % para visualizar as placas. As placas são calculadas nos próximos 1 a 3 dias.
[0159] Uma redução no número de placas na cultura celular inocu lada com a mistura de vírus-soro quando comparada à cultura de controle (células incubadas com o vírus sozinho) indica a presença de um anticorpo que neutraliza o DENV no soro. O título de anticorpo de neutralização é identificado como a mais alta diluição de soro que reduz o número de placas de vírus no teste em 50 % ou mais.
[0160] Além do ensaio de PRNT, o anticorpo de neutralização também pode ser medido através de um ensaio de neutralização com base em imunomarcação. O método é idêntico ao ensaio de PRNT, até a etapa de absorção de vírus-anticorpo na monocamada da célula em uma placa de cultura celular (placa de 6 poços, 24 poços, 48 poços, ou 96 poços) na incubadora de CO2 a 37° C. Ao invés do meio de Ye-Lah com cobertura de agarose, o meio de cultura líquido ou meio misturado com cobertura de Avicel é adicionado às placas após a absorção do vírus. O meio ou a cobertura de Avicel são removidos depois dos períodos de incubação desejados (por exemplo, de 2 a 5 di as), e as células são fixadas com acetona. Os anticorpos de DENV são adicionados às placas de células por 1 hora a 37° C. As placas são lavadas 3 vezes para remover os anticorpos não ligados, e o anticorpo secundário químico ou fluorescente conjugado é adicionado à placa e incubado por de 30 a 60 minutos a 37° C. Os focos do vírus imunomarcados nas placas cobertas com Avicel podem ser visualizados e calculados. No caso do uso de um meio líquido na experiência, o antígeno viral produzido nas células infectadas pode ser medido através da leitura de placa. Exemplo 10 Reatividade Cruzada do Anticorpo de Flavivírus quiméricos
[0161] Este exemplo descreve os métodos para determinar a re dução da reatividade cruzada de anticorpo para a proteína E de DENVs incluindo uma ou mais substituições de aminoácido.
[0162] A proteína E de DENV (do tipo selvagem ou incluindo uma ou mais substituições de aminoácido) é expressa através da infecção das células com uma quimera do vírus WN/DEN que codifica uma proteína E de DENV, ou através da produção recombinante da proteína E de DENVs (por exemplo, através da expressão em células mamífera, levedura, ou E. coli). O antígeno da proteína E da quimera de WN/DENV ou suas variantes contendo diferentes substituições de aminoácido expressas nas células infectadas por quimera C6/36 é analisado com um painel de mAbs de anti-flavivírus por IFA para determinar o ponto reatividade final de mAb das variantes das proteínas E. Resumidamente, as células infectadas são fixadas por acetona nas lâminas óticas do microscópio ou câmaras laterais. Os mAbs diluídos em série são adicionados aos diferentes poços da lâmina e incubados a 37° C por 1 hora e o mAb não ligado é depois lavado com PBS. O IgG anti-camundongo de cabra ou coelho secundário conjugado com FITC é adicionado e incubado a 37° por 30 minutos para ligar ao mAb do camundongo nos poços, e os conjugados não ligados são retirados pela lavagem com PBS. Os poços positivos são detectados através do microscópio fluorescente.
[0163] Alternativamente, as partículas do vírus WN/DENV purifica das são capturadas na forma nativa através de um anticorpo policlonal anti-DEN de coelho revestido em placas de ELISA. A proteína E e suas variantes nas partículas do vírus são analisadas por ELISA com um painel de mAbs do anti-flavivírus de camundongo para determinar o ponto reatividade final do mAb das partículas virais variantes, seguindo o protocolo da Roehrig et al. (Virology 246:317-28, 1998). O painel de mAb pode incluir 4G2 (ATCC No HB-112), 6B6C-1, 1B7-5, 1A1D-2, 1A5D-1, 1B4C-2, F4540, D1-11, 9F-10, D2811, 2H3, 9A3D-8, 3H5, 1F1, 8A1, e/ou 1H10.
[0164] As quimeras de WN/DEN incluindo as variantes da proteína E que têm reatividade cruzada de anticorpo reduzida podem ser usadas para o diagnóstico da infecção secundária por flavivírus com um sorotipo de DENV particular (i.e. DEN1, DEN2, DEN3, ou DEN4), tal como em um ensaio de PRNT. Estas quimeras também podem ser incluídas em um painel de diagnóstico de flavivírus, o que pode reduzir os resultados falso-positivos e aumentar a velocidade e precisão dos diagnósticos de flavivírus.
[0165] Devido às muitas modalidades possíveis às quais os princí pios da divulgação podem ser aplicados, deve ser reconhecido que as modalidades ilustradas são apenas exemplos e não devem ser tomadas como limitando o escopo da invenção. Preferivelmente, o escopo da invenção é definido pelas seguintes reivindicações. Portanto, é reivindicado como a invenção tudo o que venha estar dentro do escopo e espírito destas reivindicações.
Claims (16)
1. Quimera de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende: uma primeira molécula de ácido nucleico compreendendo uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica uma proteína C e proteínas não estruturais, e uma região 3’ não codificante de um genoma do vírus do Nilo Ocidental; e uma segunda molécula de ácido nucleico operativamente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, que codifica uma proteína prM e proteína E de um genoma do vírus da Dengue, em que a quimera de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7.
2. Quimera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a segunda molécula de ácido nucleico codifica pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína E, em que a substituição aumenta o título viral, taxa de replicação, tamanho de placa, ou estabilidade em cultura celular em comparação com um vírus de tipo selvagem.
3. Quimera, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína E compreende uma substituição na posição de aminoácido 64, correspondendo à posição de aminoácido 349 da SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, na posição de aminoácido 122 correspondendo à posição de aminoácido 407 de SEQ ID NO: 2, 4 ou 8 ou correspondendo à de aminoácido 405 de SEQ ID NO : 6, na posição de aminoácido 186 correspondente à posição de aminoácido de 471 da SEQ ID NO: 2, 4 ou 8 ou correspondendo à posição de aminoácido 469 de SEQ ID NO: 6, na posição de aminoácido 203 correspondendo à posição de aminoácido 488 de SEQ ID NO: 2, 4 ou 8 ou correspondendo à posição de amino- ácido 486 da SEQ ID NO: 6, ou uma combinação de duas ou mais das mesmas.
4. Quimera, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína E é uma ou mais de K122I, S186F, e N203D.
5. Quimera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a segunda molécula de ácido nucleico codifica pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína prM, em que a substituição aumenta o título viral, taxa de replicação, tamanho de placa ou estabilidade em cultura celular em comparação com um vírus de tipo selvagem.
6. Quimera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico codifica pelo menos uma substituição de aminoácido em uma ou mais das proteínas não estruturais ou na proteína C, em que a substituição aumenta o título viral, taxa de replicação, tamanho de placa, ou estabilidade em cultura celular, ou diminui a infectividade em mosquitos em comparação com um vírus de tipo selvagem.
7. Quimera, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácido é uma substituição selecionada do grupo consistindo na posição 49 da proteína não estrutural 2A (NS2A), correspondendo à posição de aminoácido 1181 de SEQ ID NO: 2, 4 ou 8 ou correspondendo à posição de aminoácido 1179 de SEQ ID NO: 6, na posição de aminoácido 94 de NS2A correspondendo à posição de aminoácido 1226 de SEQ ID NO: 2, 4, ou 8 ou correspondendo à posição de aminoácido 1224 de SEQ ID NO: 6, na posição de aminoácido 241 da proteína não estrutural 4B (NS4B) correspondente à posição de aminoácido 2503 de SEQ ID NO: 2, 4 ou 8 ou correspondendo à posição de aminoácido 2501 de SEQ ID NO: 6, e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
8. Quimera, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácido é uma ou mais dentre NS2A I49T, NS2A F94L, e NS4B T241I.
9. Quimera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico compreende pelo menos uma substituição de ácido nucleico na região 5’ não codifi- cante ou na região 3’ não codificante do genoma do vírus do Nilo Ocidental, em que a substituição aumenta o título viral, taxa de replicação, tamanho de placa, ou estabilidade em cultura celular, ou diminui a in- fectividade em mosquitos em comparação com um vírus de tipo selvagem.
10. Quimera, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a segunda molécula de ácido nucleico codifica pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína E, em que a proteína E substituída exibe reatividade cruzada de anticorpo mensu- ravelmente reduzida em comparação com a proteína E do tipo selvagem.
11. Quimera, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma substituição de aminoácido na proteína E compreende uma substituição na posição de aminoácido 101, correspondente à posição de aminoácido 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, na posição de aminoácido 106 correspondente à posição de aminoácido 391 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, na posição de aminoáci- do 107 correspondente à posição de aminoácido 392 da SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, na posição do aminoácido 108 correspondente à posição do aminoácido 393 da SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, na posição do amino- ácido 135 correspondente à posição do aminoácido 420 da SEQ ID NO: 2, 4 ou 8 ou correspondente à posição de aminoácido 418 da SEQ ID NO: 6, ou uma combinação de duas ou mais das mesmas.
12. Quimera, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- da pelo fato de que apresenta uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, e 8.
13. Método para detectar um anticorpo do vírus da Dengue em uma amostra de um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: contatar a amostra com um vírus codificado pela quimera como definida na reivindicação 1, para formar uma mistura de vírus- amostra; inocular uma cultura celular de monocamada suscetível com a mistura de vírus-amostra; incubar a cultura celular sob condições suficientes para permitir a replicação do vírus; contar as placas, contar os focos imunotingidos, ou medir o nível de antígeno viral na cultura; e comparar o número de placas, o número de focos, ou o nível de antígeno viral a uma cultura de controle, em que uma diminuição no número de placas, número de focos, ou nível de antígeno viral quando comparado à cultura de controle indica que o anticorpo do vírus da Dengue está presente na amostra.
14. Método para produzir partículas virais que expressam proteínas prM, M, e E do vírus da Dengue, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: cultivar um vírus codificado pela quimera como definida na reivindicação 1, em uma célula, em que partículas virais compreendendo uma ou mais proteínas prM, M, ou E da Dengue são produzidas; coletar um sobrenadante da cultura celular contendo a quimera; e purificar as partículas virais do sobrenadante.
15. Uso de vírus codificado pela quimera, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para avaliar a eficácia de uma vacina candidata contra o vírus da Dengue.
16. Flavivírus ou partícula viral quiméricos, caracterizado pelo fato de que compreende a quimera de ácido nucleico, como definida na reivindicação 1.
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