BRPI0209943B1 - desenvolvimento de mutações úteis para atenuar vírus da dengue e vírus da dengue quiméricos - Google Patents

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Abstract

"DESENVOLVIMENTO DE MUTAÇÕES ÚTEIS PARA ATENUAR VÍRUS DA DENGUE E VÍRUS DA DENGUE QUIMÉRICOS". A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um menu de mutações que é útil na afinação da atenuação de características de crescimento das vacinas de vírus da dengue.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] Um menu de mutações foi desenvolvido o qual é útil em sintonia fina de atenuação de características de crescimento de vacinas de vírus de dengue.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Vírus de dengue é um vírus RNA sentido-positivo pertencendo ao gênero flavivírus da família Flaviviridae. Vírus de dengue é amplamente distribuído por todas as regiões tropicais e semi-tropicais do mundo e é transmitido a humanos por vetores mosquitos. Vírus de dengue é uma causa líder de hospitalização e morte em crianças em pelo menos oito países Asiáticos tropicais (WHO, 1997. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment, prevention and control-2nd ed. Geneva:WHO). Existem quatro sorotipos de virus de dengue (DEN-1, DEN-2, DEN- 3, e DEN-4) que anualmente causam uma estimativa de 50-100 milhões de casos de febre de dengue e 500 000 da forma mais severa de infecção de virus de dengue, febre hemorrágica de dengue/síndrome de choque de dengue (DHF/DSS)(Gubler, D.J. & Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53: 35-70). DHF/DSS é visto predominantemente em crianças e adultos experimentando uma segunda infecção de vírus de dengue com um sorotipo diferente daquele de sua primeira infecção de vírus de dengue e em infecção primária de crianças que ainda têm anticorpo maternal específico-dengue circulante (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72). Uma vacina é necessária para diminuir a carga de doença causada por vírus de dengue, mas nenhuma está licenciada. Devido à associação de doença mais severa com infecção de vírus de dengue secundária, uma vacina bem sucedida tem de induzir imunidade para todos os quatro sorotipos. Imunidade é primariamente mediada por anticorpo neutralizante direcionado contra o envelope de glicoproteína E, uma proteína estrutural de virion. Infecção com um sorotipo induz imunidade homotípica de vida-longa e uma imunidade heterotípica de vida curta (Sabin, A. 1955 Amer J Trop Med Hyg 4:198- 207). Por isso, a meta de imunização é induzir uma resposta de anticorpo neutralizante de vida longa contra DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4, que pode ser melhor obtida economicamente usando-se vacinas de vírus atenuado vivo. Esta é uma meta razoável uma vez que uma vacina atenuada viva já foi desenvolvida para o vírus de febre amarela relacionado, um outro flavivírus transportado por mosquitos presente em regiões tropicais e semitropicais do mundo (Monath, T.P. & Heinz, F.X. 1996 em: Fields B.N. et al. eds. Fields Virology Philadelphia: Lippincott-Ravan Publishers, 961-1034).
[003] Vários candidatos a vacina de dengue atenuada viva foram desenvolvidos e avaliados em humanos ou primatas não-humanos. Os primeiros candidatos de vacina de dengue atenuada viva foram mutantes de faixa hospedeira desenvol-vidos por passagem serial de vírus de dengue tipo selvagem nos cérebros de camundongos e seleção de mutantes atenuados para humanos (Kimura, R. &Hotta, S. 1994 Japanese J Bacteriology 1:96-99; Sabin, A.B. &Schlesinger, R.W. 1945 Science 101:640; Wisseman, C.L. Jr. Et al. 1963 Am J Trop Med 12:620-623). Embora estes vírus de vacina candidatos tenham sido imunogênicos em humanos, seu crescimento pobre em cultura de células desencorajou ainda desenvolvimento. Adicionais candidatos a vacina de DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4 atenuada viva foram desenvolvidos por passagem serial em cultura de tecido (Angsubhakorn, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trop Med Public Health 25:554-9; Bancroft, W.H. et al. 1981 Infect Immun 31:698-703; Bhamarapravati, N. et al. 1987 Buli World Health Organ 65:189-95; Eckels, K. H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Hoke, C.H.Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43: 219-26; Kaπessa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-88) ou através de mutagênese química (McKee, K.T. Jr. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42). Foi provado ser difícil a obtenção de um satisfatório balanço entre atenuação e imunogenicidade para cada um dos quatro sorotipos de vírus de dengue usando estas abordagens e para formulação de uma vacina tetravalente que seja segura e satisfatoriamente imunogênica contra cada um dos quatro vírus de dengue (Kanesa-thasan, N et al. 2001 Vaccine 19:3179-88; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18 Suppl 2:44-7).
[004] Dois maiores avanços utilizando tecnologia de RNA recombinante tomaram recentemente possível o desenvolvi-mento de adicionais candidatos promissores de vacina de vírus de dengue atenuado vivo. Primeiro, foram desenvolvidos processos para recuperação de vírus de dengue infeccioso a partir de células transfectadas com transcritos de RNA derivados de um clone de cDNA de inteiro comprimento do genoma de vírus da dengue, tomando assim possível derivar-se vírus infecciosos transportando mutações atenuantes que foram introduzidas no clone de CDNA através de mutagênese de sítio direcionado (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-43). Segundo, é possível produzir-se vírus quiméricos antigênicos nos quais a região codificando proteína estrutural do clone de cDNA de inteiro comprimento de vírus de dengue é substituída por aquela de um diferente sorotipo de vírus de dengue ou de um flavivírus mais divergente (Bray, M. &Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6; Chen, W. et al. 1995 HJ Virol 69:5186-90-; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8; Pletnev, A.G. &Men, R. 1998 PNAS USA 95:1746-51). Estas técnicas foram usadas parra construção de vírus de dengue quiméricos inter-típicos que foram mostrados serem efetivos em proteção de macacos contra desafio de vírus de dengue homólogos (Bray, M. et al. 1996 J Virol 70:4162-6). À despeito destes avanços, existe uma necessidade de desenvolvimento de vacinas de vírus de dengue antigênicos atenuados que especifiquem um satisfatório balanço entre atenuação e imunogenicidade para humanos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] A invenção proporciona mutações que conferem sensibilidade à temperatura em células Vero ou células de fígado humano, restrição de hospedeiro- célula, adaptação de hospedeiro-célula para aperfeiçoada replicação de células Vero, ou atenuação em camundongos, cujas mutações são úteis em sintonização fina de características de atenuação e crescimento de vacinas de vírus de dengue.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[006] A Figura 1 mostra crescimento de wtDEN42A e candidato vacina, 2AΔ30, em células Vero e HuH-7. Células Vero (A) ou HuH-7 (B) foram infectadas com DEN4 2A ou 2AΔ30 em uma multiplicidade de infecções (MOI) de 10 ou 0,01. Monocamadas de células confluentes em frascos de culturas de tecido de 25mm foram lavadas e revestidas com um inoculum de 1,5 ml contendo o vírus indicado. Após uma incubação de duas horas a 37°C, células foram lavadas três vezes em PBS e 7ml de meios de cultura suplementados com FBS 2% foram adicionados. Uma alíquota de 1ml de meio de cultura de tecido foi removida, substituída com meio novo, e designada o ponto de tempo de hora 0. Nos pontos de tempo indicados após infecção, amostras de meios de cultura de tecido foram removidas e congeladas a - 70°C. O nível de replicação virai foi avaliado por titulação de placa em células Vero. Resumidamente, diluições de dez vezes seriais de amostras de meios de cultura de célula foram inoculadas em monocamadas de célula Vero confluentes em placas de 24 poços em duplicatas e revestidas com Opti-MEM contendo 0,8% metil celulose. Após cinco dias, placas foram visualizadas por coloração com imunoperoxidase como descrito no Exemplo 1.
[007] A Figura 2 mostra geração de vírus DEN4 sensível a temperatura (ts) através de mutagênese química com 5-flúor uracila (5-FU). O vírus DEN4 2A tipo selvagem foi derivado de um clone de cDNA de DEN4 linhagem 814669 (Dominica, 1981). Células Vero foram infectadas com DEN4 2A e revestidas com meios de cultura contendo 5-flúor uracila (5-FU) 1 mM o que resultou em uma redução de aproximadamente 100 vezes em replicação virai quando comparada a controles não- tratados. Progénie viral a partir das culturas tratadas com 5-FU 1mM foram submetidas a um ciclo simples de diluições terminais gerando 1248 vírus biologicamente clonados que foram selecionados para fenótipos ts através de avaliação de replicação de vírus a 35°C e 39°C em células Vero e HuH-7. Clones de vírus que demonstraram uma redução de 100 vezes ou mais em título a 39°C foram terminalmente diluídos duas vezes adicionais e amplificados em células Vero. Fenótipos dos vírus clonados biologicamente 3x sensíveis à temperatura foram confirmados através de avaliação de eficiência de formação de placa (EOP) nas células indicadas como descrito no Exemplo 1.
[008] A Figura 3 mostra fenótipos de tamanho de placa de vírus DNE4 mutante 5-FU representativos. Diluições seriais de dez vezes de DEN4 2A-13 (A), vírus mutantes 5-FU #569 e #1189 (B), e vírus mutantes 5-FU #1083 e #311 (C) foram inoculados sobre monocamadas de células Vero e HuH-7 confluentes em placas de 24 poços. Após incubação a 35°C por duas horas, monocamadas foram revestidas com meios de cultura de metil celulose 0,8%. Seguindo incubação a 35°C por cinco dias, placas foram visualizadas através de coloração com imunoperoxidase. Vírus que tiveram um tamanho de placa que foi < 1mm (aproximadamente < 50% do tamanho de wt DEN4 2A-13) na temperatura permissível de 35°C foram designados como tendo o fenótipo pequena-placa (sp). Vírus mutantes #569 e #1189 (B) foram sp em ambas células Vero e HuH-7, e #311 e #1083 (C) foram sp somente em células HuH-7.
[009] A Figura 4 mostra geração de vírus DEN4 recombi-nantes.(A), o clone cDNA p4 é representado o qual foi construído a partir de clone de cDNA 2A (derivado de DEN4 814669) através de mutagênese de sítio - direcionado. Sítios de enzima de restrição foram introduzidos ou removidos para facilitar subseqüente clonagem de recombinantes DEN4 transportando mutações atenuantes introduzidas. Sítios de enzima de restrição são mostrados e definem fragmentos do genoma que foram subclonados em vetores pUC-119 modificados para mutagênese de sítio direcionado para introdução de mutações identificadas nos vírus mutantes 5-FU. (B), Um esboço dos processos usados para geração de vírus rDEN4 é também representado e descrito no Exemplo 1.
[0010] A Figura 5 mostra seqüência de aminoácidos do gene rDEN4 NS5 (SEQ ID NO: 1). Oitenta pares de aminoácidos sublinhados foram mutagenizados para pares de alanina; 32 pares em negrito representam vírus mutantes que podem ser recuperados em células Vero ou C6/36; pares em tipo normal representam vírus mutantes que não podem ser recuperados em células Vero ou C6/36. Regiões em caixa indicam domínios funcionais putativos, incluindo um domínio metil transferase utilizando S-adenosil metionina (SAM), um domínio ligante importando-βadjacente a uma seqüência de localização nuclear (ligação importação-p + NLS) e um domínio RNA polimerase dependente de RNA (Polimerase).
[0011] A Figura 6 mostra tamanho de placa de 5-1A1 em células C6/36. Notar que 5-1A1 tem um fenótipo de placa pequena em células C6/36 em relação àquele do vírus tipo selvagem.
[0012] A Figura 7 mostra crescimento de rDEN4 tipo selvagem e 5-1A1 em células C6/36. Células foram inoculadas em triplicata com cada vírus em uma MOI de 0,01, e a quantidade de vírus presente nos sobrenadantes que foram colhidos nos dias indicados foi determinada através de enumeração de placa em células Vero. Os títulos são expressos como logioPFU/ml ± erro padrão.
[0013] A Figura 8 mostra alinhamento de nucleotídeos dos flavivírus contidos em mosquitos e em carrapatos. Seqüências de cDNA são mostradas em 5’ a 3’ e representam uma parte do UTR correspondente aos nucleotideos DEN4 de 10417 a 10649 (extremidade de genoma 3’). Numeração de nucleotideos representa a posição no alinhamento. Regiões deletadas ou trocadas são indicadas usando a numeração de nucleotideos de DEN4. Números de acesso de GenBank para virus transportados por mosquitos: DEN4 (SEQ ID NO: 2): AF326825, DEN1 (SEQ ID NO:3): U88535, DEN2 (SEQ ID NO: 4): AF038403, DEN3 (SEQ ID NO: 5): M93130, virus de Oeste do Nilo (WN)(SEQ ID NO: 6): M12294, virus de encefalite Japonesa (JE)(SEQ ID NO: 7): AF315119, vírus de febre amarela (YF)(SEQ ID NO: 8). U17067; números de acesso de GenBank para vírus transportados por carrapatos: virus Powassan (POW)(SDEQ ID NO: 9): L06436, vírus Louping 111 (LI)(SEQ ID NO: 10): Y07863, virus de encefalite transportado por carrapato (TBE)(SEQ ID NO: 11): U27495, e virus Langat (LGT)(SEQ ID NO: 12): AF253419.
[0014] A Figura 9 mostra mapa genético de plasmídeo p4. cDNA de dengue é mostrado como linha em negrito, com a região C-prM-E trocada durante construção de cDNAs de vírus de dengue quimérico indicada.
[0015] A Figura 10 mostra fenótipos de tamanho de placa de vírus rDEN4 codificando mutações de adaptação Vero. Diluições seriais de três vezes dos vírus indicados foram inoculadas sobre monocamadas de células Vero e C6/36 confluentes em placas de 6 poços. Após incubação a 37°C (Vero) ou 32°C (C6/36) por duas horas, monocamadas foram revestidas com meios de cultura de metil celulose 0,8%. Seguindo incubação por cinco dias, placas foram visualizadas por coloração com imunoperoxidase. Valores abaixo de cada cavidade são o tamanho de placa médio em mm +/- erro padrão. Para cada um dos poços infectados com vírus, 36 placas foram medidas sobre a imagem digital da placa de 6 poços sobre Adobe Photoshop em vista de 300%.
[0016] Figura 11 mostra curva de crescimento em células Vero de vírus rDEN4 codificando mutações de adaptação Vero simples. Células Vero foram infectadas com os vírus indicados em uma MOI de 0,01. Monocamadas de células confluentes em frascos de cultura de tecido de 25cm2 foram lavadas e revestidas com 1,5ml de inoculum contendo o vírus indicado. Após uma incubação de duas horas a 37°C, células foram lavadas três vezes em PBS e 5ml de meio de cultura suplementado com FBS 2% foram adicionados. Uma alíquota de 1ml de meio de cultura de tecido foi removida, substituída com meio novo, e designada o ponto de tempo hora 0. Nos pontos de tempo indicados após infecção, amostras de meio de cultura de tecido foram removidas, clarificadas, e congeladas a -70°C. O nível de replicação de vírus foi ensaiado por titulação de placa em células Vero. Resumidamente, diluições seriais de dez vezes de amostras de meios de cultura de célula foram inoculadas sobre monocamadas de células Vero confluentes em placas de 24 poços em duplicata e revestidas com Opti-MEM contendo metil celulose 0,8%. Após cinco dias, placas foram visualizadas através de coloração com imunoperoxidase como descrito no Exemplo 1. Limite de deteção (L.O.D.) é > 0,7 logioPFU/ml.
[0017] A Figura 12 mostra a curva de crescimento em células Vero de vírus rDEN4 codificando mutações de adaptação de célula Vero combinadas. Células Vero foram infectadas com os vírus indicados em uma MOI de 0,01. Monocamadas de células confluentes em frascos de cultura de tecido de 25cm2 foram lavadas e revestidas com 1,5ml de inoculum contendo o vírus indicado. Após uma incubação de duas horas a 37°C, células foram lavadas três vezes em PBS e 5ml de meio de cultura suplementado com FBS 2% foram adicionados. Uma alíquota de 1ml de meio de cultura de tecido foi removida, substituída com meio novo, e designada o ponto de tempo hora . Nos pontos de tempo indicados após infecção, amostras de meio de cultura de tecido foram removidas, clarificadas, e congeladas a -70°C. O nível de replicação de vírus foi avaliado por titulação de placa em células Vero. Limite de deteção (L.O.D.) é > 0,7logioPFU/ml.
BREVE DESCRIÇÃO DAS TABELAS
[0018] Tabela 1. Suscetibilidade de camundongos a infecção por DEA4 intracerebral e dependente de idade.
[0019] Tabela 2. Fenótipos sensíveis à temperatura (ts) e de atenuação de cérebro de camundongo (att) de vírus de DEN4 mutantes 5-FU.
[0020] Tabela 3. Diferenças de nucleotídeos e amino-ácidos dos vírus mutantes 5-FU que são ts em células Vero e HuH-7.
[0021] Tabela 4. Diferenças de nucleotídeos e amino-ácidos dos vírus mutantes 5-FU que são ts somente em células HuH-7.
[0022] Tabela 5. Mutações que são representadas em múltiplos vírus DEN4 mutantes 5-FU.
[0023] Tabela 6. Adição de mutação ts 4995 para rDEN4Δ30 confere um fenótipo ts e ainda atenua sua replicação em cérebro de camundongo novo.
[0024] Tabela 7. Fenótipos de atenuação em cérebro de rato (att) e sensível à temperatura (ts) de vírus mutantes DEN4 5-FU que exibem um fenótipo de placa pequena (sp).
[0025] Tabela 8. Vírus com ambos fenótipos ts e sp são mais restritos em replicação em cérebro de camundongo que aqueles com somente um fenótipo ts.
[0026] Tabela 9. Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos dos vírus DEN4 5-FU que produzem placas pequenas em células Vero e HuH-7.
[0027] Tabela 10. Diferenças de nucleotídeos e amino-ácidos dos vírus DEN4 mutantes 5-FU que produzem placas pequenas somente em células HuH-7.
[0028] Tabela 11. Mutações de adaptação de célula Vero putativas derivadas de conjunto inteiro de vírus mutantes 5-FU.
[0029] Tabela 12. Oligonucleotídeos mutagênicos usados para gerar vírus DEN4 recombinantes contendo mutações 5-FU simples.
[0030] Tabela 13. Fenótipos de atenuação de camundon-go e sp, ts de vírus mutantes rDEN4 codificando mutações simples identificadas em seis vírus mutantes 5-FU.
[0031] Tabela 14. Fenótipos de vírus mutantes rDEN4 codificando mutações simples identificadas em vírus mutantes 5-FU que são ts em células Vero e HuH-7.
[0032] Tabela 15. Fenótipos de atenuação em camundon-go e sp, ts de vírus mutantes rDEN4 codificando mutações simples identificadas em vírus mutantes 5-FU ts específicos de células HuH-7.
[0033] Tabela 16. Fenótipos de atenuação em cérebro de camundongo (att) e sensível a temperatura (ts) de adicionais vírus rDEN4 codificando mutações 5- FU simples
[0034] Tabela 17. Crescimento de wtDEN-4 2A-13 em camundongo SCID transplantado com células HuH-7.
[0035] Tabela 18. Combinação de mutações ts, NS3 4995 e NS5 7849, em rDEN4 resulta em um fenótipo ts aditivo.
[0036] Tabela 19. As mutações 5-FU são compatíveis com a mutação Δ30 para replicação no cérebro de camundongo novo.
[0037] Tabela 20. Fenótipos de atenuação em cérebro de camundongo e sensível a temperatura de vírus transportando mutações carga-agrupamento-para- alanina no gene NS5 de DEN4.
[0038] Tabela 21. Fenótipos de atenuação de SCID-HuH-7 de vírus transportando mutações carga-agrupamento-para-alanina no gene NS5 de DEN4.
[0039] Tabela 22. Combinação de mutações de carga-agrupamento- para-alanina emparelhadas em vírus mutante de par-duplo.
[0040] Tabela 23. Fenótipos de atenuação em cérebro de camundongo e sensível a temperatura de mutantes carga-agrupamento-para-alanina duplos do gene NS5 de rDEN4.
[0041] Tabela 24. Fenótipos de atenuação SCID-HuH-7 de mutantes carga-agrupamento-para-alanina duplos do gene NS5 de rDEN4.
[0042] Tabela 25. Fenótipos (sensitividade a temperatura, tamanho de placa e replicação em cérebro de camundongo e camundongo SCID-HuH-7) de wt DEN4 e vírus contendo as mutações Δ30 e 7129.
[0043] Tabela 26. O mutante de placa pequena 5-1A1 5-flúor uracila demonstra uma restrição infecção de intestino médio seguindo infecção oral de mosquitos Aedes aegypti.
[0044] Tabela 27. O mutante placa pequena 5-1A1 5-flúor uracila demonstra uma restrição de infecção seguindo inoculação intra-toráxica de mosquitos Toxorhynchites splendens.
[0045] Tabela 28. Primers de mutagênese para a supressão ou troca de seqüências em DEN4 mostrando diferen-ças conservadas a partir de flavivírus transportados por carrapatos.
[0046] Tabela 29. Título de vírus e tamanho de placa de vírus mutantes 3’ UTR em células Vero e C6/36.
[0047] Tabela 30. Infectividade de mutantes wt DEN4 e 3’ UTR para Toxorhynchites splendens via inoculação intra-toráxica.
[0048] Tabela 31. Infectividade de vírus mutantes de troca 3’ UTR para Aedes aegypti alimentado sobre uma refei-ção de sangue infeccioso.
[0049] Tabela 32. Mutações de adaptação de célula Vero putativas derivadas do conjunto de vírus mutantes 5-FU e outros vírus DEN4 passados em células Vero
[0050] Tabela 33. Análises de sequências de rDEN2/4Δ30 clone 27(p4)-2- 2A2.
[0051] Tabela 34. Análises de sequências de rDEN2Z 4Δ30 clone 27(p3)- 2-1A1.
[0052] Tabela 35. Vírus recombinante rDEN2/4Δ30 trans-portando mutações de adaptação Vero podem ser recuperados e titulados em células Vero.
[0053] Tabela 36. Mutações de adaptação de célula Vero putativas de vírus tipo 4 de dengue e o correspondente resíduo de aminoácido tipo selvagem em outros vírus de dengue.
[0054] Tabela 37. Mutações conhecidas atenuarem vírus tipo 4 de dengue e o correspondente resíduo de aminoácidos tipo selvagem em outros vírus de dengue.
BREVE DESCRIÇÃO DOS APÊNDICES
[0055] Apêndice 1. Seqüência de vírus tipo 4 de dengue recombinante linhagem 2A (seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 13 e seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO: 14).
[0056] Apêndice 2. Seqüência de vírus tipo 4 de dengue recombinante linhagem rDEN4 (seqüência de aminoácidos SEQ ID NO; 15 e seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO: 16).
[0057] Apêndice 3. Seqüência de vírus quimérico tipo 2 de dengue recombinante linhagem rDEN2/4Δ30 (seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 17 e seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO: 18).
[0058] Apêndice 4. Alinhamento de poliproteinas de virus de dengue. DEN4 (SEQ IUD NO: 19); DEN1-WP (SEQ ID NO: 20); DEN2-NGC (SEQ ID NIO: 21); DEN3-H87 (SEQ ID NO: 22).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA REALIZAÇÃO PREFERIDA
[0059] Para montagem de uma coleção de mutações úteis para incorporação em vacina de vírus do dengue vivos, técnicas de mutagênese dirigidas a sítio e aleatórias foram usadas para a introdução de mutações no genoma de vírus de dengue. Os vírus mutantes resultantes foram selecionados para vários fenótipos valiosos, incluindo sensitividade a temperatura em células Vero ou células de fígado humano, restrição de célula hospedeira em células mosquito ou células de fígado humano, adaptação de hospedeiro-célula para aperfeiçoada replicação em células Vero, e atenuação em camundongos. As bases genéticas para cada fenótipo observado foram determinadas por análise de seqüência direta do genoma do vírus. Mutações identificadas através desses esforços de seqüenciamento foram ainda avaliadas através de sua reintrodução, simplesmente, ou em combinação, em vírus de dengue recombinante e caracterização dos fenótipos resul-tantes. Desta maneira, um menu de mutações foi desenvolvido que é útil em sintonização fina de características de atenuação e crescimento de vacinas de vírus de dengue.
EXEMPLO 1 MUTAGÊNSE QUÍMICA DO VÍRUS DE DENGUE TIPO 4 FORNECE VÍRUS SENSÍVEIS À TEMPERATURA E VÍRUS MUTANTES ATENUADOS
[0060] Um candidato à vacina de vírus tipo 4 de dengue (DEN4) atenuado vivo recombinante, 2AΔ30, foi verificado previamente ser genericamente bem tolerado em humanos, mas exantema e uma elevação de enzimas de fígado no soro ocorreram em alguns vacinados. 2AΔ30, um vírus não sensível a temperatura (ts), contem uma supressão de 30 nucleotideos na região não-traduzida 3’ (UTR) do genoma virai. No presente estudo, mutagênese química de DEN4 foi utilizada para gerar mutações atenuantes que podem ser úteis para ainda atenuar a vacina candidata 2AΔ30 incompletamente atenuada. Vírus DEN4 2A tipo selvagem foi crescido em células Vero na presença de 5-flúor uracila, e, a partir de um painel de 1248 clones que foram isolados em células Vero, vinte vírus mutantes ts foram identificados os quais foram ts em células Vero e HuH-7 (n=13) ou somente em células HuH-7 (n=7). Cada uma das vinte mutações ts possuiu um fenótipo de atenuação (att) como indicado por replicação restrita nos cérebros de camundongos de sete dias de idade. A completa seqüência de nucleotídeos dos 20 vírus mutantes ts identificou substituições de nucleotídeos em genes estruturais e não-estruturais assim como na UTR 5’ e 3’ com mais de uma mudança ocorrendo, em geral, por vírus mutante. Uma mutação ts na proteína NS3 (posição de nucleotídeo 4995) foi introduzida em um vírus DEN4 recombinante possuindo a supressão Δ30 criando o vírus recombinante rDEN4Δ30-4995 que foi verificado ser ts e mais atenuado que rDEN4Δ30 nos cérebros de camundongos. Um menu de mutações atenuantes está sendo montado que pode ser útil em geração de vírus de vacina de dengue recombinantes satisfatoriamente atenuados e no aumento de nosso entendimento da patogênese de vírus de dengue.
[0061] Os vírus de dengue transportados por mosquitos (DEN) (sorotipos 1 a 4) são membros do gênero Flavivirus e contêm um genoma de RNA sentido positivo de fita simples de aproximadamente 10.600 nucleotídeos (nt)(Monath, T.P. & Heinz, F.X. 1996 em: Fields Virology B.N. Fields, et al. Eds.pp. 961-1034 Lippincott- Ravan Publishers, Philadelphia). A organização de genoma de vírus DEN é 5’-UTR- C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3’ (UTR-região não- traduzida, C-capsídeo, PrM-pré-membrana, E-envelope, NS-não-estrutural) (Chang, G.J. 1997 em: Dengue and dengue hemorrhagic fever D. J. Gubler & G. Kuno, eds. Pp. 175-198 CAB International, New York; Rice, C.M. 1996 em: Fields Virology B.N. Fields et al. Eds. Pp. 931-959 Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia). Um polipeptídeo virai simples é co-traducionalmente processado por proteases virais e celulares gerando três proteínas estruturais (C, M e E) e sete proteínas NS. A carga de doença associada com infecção de vírus DEN aumentou sobre as últimas décadas em países tropicais e semi-tropicais. Anualmente, existem estimados 50-100 milhões de casos de febre de dengue (DF) e 500 000 casos da mais séria e potencialmente letal febre hemorrágica de dengue/síndrome de choque de dengue (DHF/DSS)(Gubler, D.J. &Meltzer, M. 1999 Adv Vírus Res 53:35-70).
[0062] O sítio de replicação virai em humanos infectados com vírus DEN e a patogênese de DF e DHF/DSS ainda são incompletamente entendidos (Innis, B.L. 1995 em: Exotic viral infections J.S.Porterfield, ed. pp. 103-146 Chapman and Hall, London). Em humanos, vírus DEN infectam linfócitos (Kurane, I. et al. 1990 Arch Virol 110:91-101; Theo-filopoulos, A. N. et al. 1976 J Immunol 117:953-61), macrófagos (Halstead, S.B. et al. 1977 J Exp Med 146:218-29; Scott, R.M. et al. 1980 J Infect Dis 141:1-6), células dendríticas (Libraty, D.H. et al. 2001 J Virol 75:3501-8; Wu, S.J. et al. 2000 Nat Med 6:816-20), e hepatócitos (Lin, Y.L. et al. 2000 J Med Virol 60:425-31; Marianneau, P. et al. 1996 J Gen Virol 77:2547-54). O fígado está claramente envolvido em infecção de vírus DEN de humanos, como indicado pela ocorrência de elevações transientes em níveis em soro de alanina amino transferase (ALT) e aspartato aminotrans-ferase (AST) na maioria de pacientes infectados com vírus de dengue e através da presença de hepatomegalia em alguns pacientes (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Kuo, C.H. et al. 1992 Am J Trop Med Hyg 47:265-70; Mohan, B. et al. 2000 J Trop Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F.et al. 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259- 63). Hepatócitos antígeno-positivos de vírus DEN são vistos circundando áreas de necrose no fígado de casos fatais (Couvelard, A. et al. 1999 Hum Pathol 30:1106-10; Huerre, M.R. et al. 2001 Virchows Asrch 438:107-15), e seqüências de vírus de dengue foram identificadas em tais casos usando-se RT-PCR (Rosen, L. et al. 1999 Am J Trop Med Hyg 61:720-4). De potencial importância para a etiologia de infecção severa de vírus de dengue, três estudos demons-traram que os níveis médios de ALT/AST em soro foram significantemente elevados em pacientes com DHF/DSS versus aqueles com DF (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Mohan, B. et al. 2000 J Trop Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al. 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259-63).
[0063] Uma vacina para virus DEN atualmente não está licenciada. Uma vez que prévia infecção com um sorotipo de vírus de dengue pode aumentar o risco para DHF/DSS seguindo infecção com um sorotipo diferente (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B.et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72), é claro que uma vacina para vírus de dengue necessitará proteger contra cada um dos quatro sorotipos de vírus de dengue, DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4. Várias estratégias estão sendo atualmente ativamente perseguidas no desenvolvimento de uma vacina de vírus DEN tetravalente atenuado vivo (Bancroft, W.H. et al. 1984 J Infect Dis 149:1005-10; Bhamarapravavti, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44-7; Guirakhoo, F. et al. 2000 J Virol 74:5477-85; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). Recentemente, nós demonstramos que um candidato a vacina de DEN4 atenuado vivo, 2AΔ30, foi atenuado e imunogênico em um grupo de 20 voluntários humanos (ver Exemplo 8). Este vírus DEN4 recombinante contem uma supressão de 30 nt na UTR 3’ que remove nucleotideos 10478-10507 e foi restrito em replicação em macacos rhesus. Níveis de viremia em humanos foram baixos ou indetectáveis, e vírus recuperados dos vacinados retiveram a mutação Δ30. Um exantema assintomático foi reportado em 50% de pacientes. A única anormalidade de laboratório observada foi uma elevação transiente, assinto-mática, no nível de ALT em soro em 5 de 20 pacientes. Todos os vacinados desenvolveram anticorpo soro-neutralizante contra vírus DEN4 (título médio: 1:580). Importantemente, 2AΔ30 não foi transmitido a mosquitos alimentados sobre vacinados e tem restritas propriedades de crescimento em mosquitos (Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:414-9). A presença de um exantema e dos elevados níveis de ALT sugerem que o candidato a vacina 2AΔ30 é levemente sub-atenuado em humanos. Devido ao conjunto total de desejáveis propriedades conferidas pela mutação Δ30, candidatos a vacina quiméricos estão sendo construídos os quais contêm os genes estruturais de vírus de dengue tipo 1, 2, e 3 e a cadeia principal atenuada de DEN4 transportando a mutação Δ30 geneticamente estável.
[0064] Embora as verificações iniciais indiquem a utili-dade do candidato a vacina 2AΔ30, muitas tentativas anteriores para desenvolvimento de vacinas de vírus de dengue atenuado vivo proporcionaram candidatos a vacina que foram super- ou sub-atenuados em humanos (Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em: Dengue and dengue hemorrhagic fever D. J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80; McKee, K.T., Jr. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42). Por isso, foi desenvolvido urn menu de mutações ponto que conferem fenótipos sensível a temperatura (ts) e de atenuação (att) sobre DEN4. Estas mutações são pretendidas como sendo úteis para atenuar vírus DEN4 para diferentes graus e por isso como tendo propósito em sintonização fina de nível de atenuação de candidatos a vacina como 2AΔ30. Adição de tais mutações a 2AΔ30 ou a outros candidatos a vacina de vírus de dengue é imaginada resultando na geração de um candidato a vacina que exibe um satisfatório balanço entre atenuação e imunogenicidade para humanos.
[0065] No presente exemplo, mutagênese química de DEN4 foi utilizada para identificar mutações de ponto que conferem o fenótipo ts, uma vez que tais vírus freqüentemente são atenuados em humanos. Adicionalmente, devido ao reportado envolvimento do fígado em infecção de dengue natural e os elevados níveis de ALT em um subconjunto de vacinados com 2AΔ30, vírus DEN4 que sofreram mutagênese também foram avaliados para fenótipo ts em células de fígado HuH-7 derivadas de um hepatoma humano. Aqui, nós descrevemos a identificação de 20 virus mutantes ts DEN4 cada um dos quais replica eficientemente em células Vero, o substrato proposto para fabricação de vacina, e cada um dos quais é atenuado em camundongos. Finalmente, a exeqüibilidade de modificação de fenótipo de atenuação do candidato a vacina 2AΔ30 através de introdução de uma mutação de ponto em NS3 é demonstrada.
[0066] Células e vírus. Células Vero WHO (células de rim de macaco verde africano) foram mantidas em MEM (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com soro fetal bovino 10% (FBS)(Summit Biotechnologies, Fort Collins, CO), L-glutamina 2mM (Life Technologies), e 0,05 mg/ml de gentamicina (Life technologies). Células HuH-7 (células hepatoma humano)(Nakabayashi, H. et al. 1982 Cancer Res 42:3858-63) foram mantidas em D-MEM/F-12 (Life Technologies) suplementado com FBS 10%, L-glutamina 1 mM e gentamicina 0,05 mg/ml. Células C6/36 (células de mosquito Aedes albopictus) foram mantidas em MEM completo como descrito acima suplementado com aminoácidos não-essenciais 2mM (Life Technologies).
[0067] O vírus (wt)DEN4 2A tipo selvagem foi derivado de um clone cDNA de DEN4 linhagem 814669 (Dominica, 1981)(Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Seqüência do cDNA de vírus DEN4 2A é apresentada no Apêndice 1. O clone de 2A cDNA de inteiro comprimento sofreu várias subseqüentes modificações para aperfeiçoamento de sua habilidade para ser geneticamente manipulado. Como descrito anteriormente, um sítio de enzima de restrição Xhil traducionalmente- silencioso foi engenheirado próximo da extremidade da região E em nucleotídeo 2348 para criar clone 2A-Xhol (Bray, M. &Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). A seqüência codificante viral do clone 2A-Xhol cDNA foi ainda modificado usando-se mutagênese de sítio direcionado para criar clone p4: um sítio de restrição BbvCI único foi introduzido próximo da junção C-prM (nucleotídeos 447-452); um sítio de restrição Xbal foi removido por mutação de nucleotídeo 7730; e um sítio de restrição SaciI único foi criado na região NS5 (nucleotideos 9318-9320). Cada uma destas mutações engenheiradas é traducionalmente silenciosa e não altera a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo virai. Também, várias mutações foram feitas na região de vetor de clone p4 para introdução ou supressão de adicionais sítios de restrição. O clone cDNA p4Δ30 foi gerado pela introdução de mutação Δ30 em clone p4. Isto foi realizado por substituição de fragmento Mlul-Kpnl de p4 (nucleotideos 10403- 10654) com aquele derivado de plasm ideo 2AΔ30 contendo a supressão de 30 nucleotideos. Os clones de cDNA de p4 e p4Δ30 foram subseqüentemente usados para geração de vírus recombinantes rDEN4 (Apêndice 2) e rDEN4Δ30, respectivamente. (O número de acesso de GenBank parra rDEN4 é AF326825 e o acesso para rDEN4Δ30 é AF326827).
[0068] Mutagênese química de DEN4. Monocamadas confluen-tes de células Vero foram infectadas com wt DEN4 2A em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 e incubadas por 2 horas a 32°C. Células infectadas foram então revestidas com MEM suplementado com FBS 2% e 5-flúor uracila (5-FU)(Sigma, St. Louis, MO) em concentrações variando de 10mM a 10nM. Após incubação a 32°C por cinco dias, meio de cultura de célula foi colhido, clarificado por centrifugação, e congelado a -70°C. Sobrenadantes clarificados foram então ensaiados para título de vírus através de titulação de placa em células Vero. Diluições seriais de dez vezes do sobrenadante clarificado foram preparadas em Opti-MEM I (Life Technologies) e inoculadas sobre monocamadas de células Vero confluentes em placas de 24 poços. Após incubação a 35°C por duas horas, monocamadas foram revestidas com metil celulose 0,8% (EM Science, Gibbstown, NJ) em Opti-MEM I suplementado com FBS 2%, gentamicina e L-glutamina. Seguindo incubação a 35°C por cinco dias, placas foram visualizadas através de coloração com imunoperoxi-dase. Monocamadas de células Vero foram fixadas em metanol 80% por 30 minutos e lavadas por 10 minutos com tampão anticorpo que consiste em leite seco sem gordura 3,5% (peso/volume) (Nestlé, Sólon, OH) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Células foram então incubadas por uma hora a 37°C com uma preparação de anticorpo policlonal de coelho anti-DEN4 (PRNTso de >1:2000) diluída 1:1000 em tampão de anticorpo. Após uma lavagem com tampão de anticorpo, células foram incubadas por uma hora com IgG cabra-anti-coelho marcada com peroxidase (KPL, Gaithersburg, MD) diluída 1:500 em tampão anticorpo. Monocamadas foram lavadas com PBS, deixadas secar brevemente, revestidas com substrato peroxidase (KPL), e placas foram contadas.
[0069] Rendimentos de vírus em culturas tratadas com 5-FU 1mM foram reduzidos 100 vezes comparados a culturas não-tratadas, e os vírus presentes no sobrenadante da cultura tratada com 5-FU 1mM foram terminalmente diluídos para derivação de clones para caracterização fenotípica. Em resumo, placas de 96 poços de células Vero foram inoculadas com os vírus tratados com 5-FU em uma MOI que rendeu 10 ou menos poços positivos para vírus por placa. Após uma incubação de cinco dias ba 35°C, meios de cultura de células das placas de 96 poços foram temporariamente transferidos para placas de 96 poços carecendo de células, e as culturas positivas foram identificadas através de coloração com imunoperoxidase das monocamadas de células infectadas. Vírus de cada poço positiva foram transferidos para monocamadas de células Vero confluentes em placas de 12 poços para amplificação. Meio de cultura de células foi colhido das cavidades individuais cinco ou seis dias depois, clarificado por centrifugação, feito alíquotas em placas de polipropileno de 96 poços profundas (Beckman, Fullerton, CA) e congeladas a - 70°C. Um total de 1248 clones de vírus foram preparados a partir das culturas tratadas com 5-FU 1 mM. Dois clones de vírus wt, 2A-1 e 2A-13, foram gerados da mesma maneira a partir de culturas controles não-tratadas com 5-FU.
[0070] Seleção de clones para fenótipos ts e att. Os 1248 clones de vírus foram selecionados para fenótipo ts através de avaliação de replicação de vírus a 35°C e 39°C em células Vero e HuH-7. Monocamadas de células em placas de 96 poços foram inoculadas com diluições seriais de dez vezes de vírus em meios L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) suplementados co m FBS 2%, L-glutamina e gentamicina. Células foram incubadas nas temperaturas indicadas por cinco dias em banhos de água de temperatura controlada, e presença de vírus foi determinada através de coloração com imunoperoxidase como acima. Clones de vírus que demonstraram uma redução de 100 vezes ou mais em título a 39°C foram terminalmente diluídos duas vezes adicionais e amplificados em células Vero. A eficiência de formação de placa (EOP) em temperaturas permissíveis e restritivas de cada suspensão de vírus triplamente clonados biologicamente foi determinada como se segue. Titulação de placa em células Vero e HuH-7 foi realizada como descrito acima exceto que monocamadas infectadas com vírus foram revestidas com metil celulose 0,8% em meio L-15 suplementado com FBS 5%, gentamicina, e L- glutamina. Após incubação de placas ré-plicas por cinco dias a 35, 37, 38, ou 39°C em banhos de água de temperatura controlada, placas foram visualizadas através de formação de coloração com imunoperoxidase e contadas.
[0071] A replicação de vírus mutantes ts 5-FU DEN4 foi avaliada em camundongos novos Swiss Webster (Taconic Farms, Germantown, NY). Grupos de seis camundongos de uma semana de idade foram inoculados intracranialmente com 104 PFU de vírus diluídos em 30pl de Opti-MEM I. Cinco dias depois, camundongos foram sacrificados e cérebros foram removidos e individualmente homogeneizados em uma suspensão 10% de solução de sal balanceada de Hank tamponada com fosfato contendo sucrose 7,5%, glutamato de sódio 5 mM, cipro- floxacina 0,05mg/ml, clindamicina 0,06 mg/ml, e anflotericina B 0,0025mg/ml. Sobrenadantes clarificados foram congelados a -70°C e subseqüentemente título de vírus foi determinado por titulação em células Vero, e placas foram manchadas através do processo de imunoperoxidase descrito acima.
[0072] Análise de seqüèncias de qenomas virais. A se-qüência de nucleotideos dos virus DEN4 mutagenizados com 5-FU foi determinada. Resumidamente, RNA viral genômico foi isolado a partir de clones de virus com o mini kit QIAamp RNA viral (Qiagen, Valencia, CA) e transcrição reversa foi realizada usando-se o Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR (Life technologies) e primers hexâmeros randomicos. Advantage cDNA polymerase (Clontech, Paio Alto, CA) foi usada para geração de sobreposição de fragmentos de PCR de aproximadamente 2.000 nt que foram purificados por HighPure PCR Product Purification System (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN). Primers específicos de DEN foram usados em reações de seqüenciamento de ciclo terminador BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA) e reações foram analisadas em um analisador genético 3100 (Applied Biosystems). Primers foram projetados para sequenciar ambas fitas do produto de PCR a partir do qual seqüèncias consenso foram montadas.
[0073] A seqüência de nucleotideos das regiões 5’ e 3’ do genoma virai foram foi determinada como acima após circularização do genoma de RNA. O nucleosídeo capa 5’ do RNA virai foi cortado usado pirofosfatase ácida de tabaco (Epicentre Technologies, Madison, Wl) e o genoma foi circu-larizado através de RNA ligase (Epicentre Technologies)Um fragmento de RT-PCR foi gerado o qual sobrepôs a junção de ligação (extremidade 5’ e 3’) e foi seqüenciado como descri-to acima.
[0074] Geração de vírus DEN4 recombinantes. A mutação na posição nt 4995 em NS3 foi introduzida na construção de cDNA de p4 através de mutagênese de sítio direcionado (Kunkel, T.A. 1985 PNAS USA 82:488-92). O fragmento Stul- BstBI (nt 3619-5072) de p4 foi subclonado em um vetor pUC119 modificado. A mutação U>C em posição nt 4995 foi engenheirada por mutagênese de sítio direcionado no fragmento p4, clonada de volta na construção de cDNA de p4, e a presença da mutação foi confirmada através de análise de seqüências. A mutação Δ30 foi introduzida na UTR 3’ do clone cDNA de p4-4995 através de substituição de fragmento Mlul-Kpnl com aquele derivado do clone cDNA de p4Δ30, e a presença da supressão foi confirmada por análise de seqüências. Transcritos de RNA de inteiro comprimento foram preparados a partir dos clones de cDNA acima através de transcrição in vitro. Resumidamente, transcrição consistiu em uma mistura de reação de 50 pl contendo 1 pg de plasm ideo linearizado, 60 U SP6 polimerase (New England Biolabs (NEB), Beverly, MA), 1X tampão RNA polimerase (Tris-HCI 40 mM, pH 7,9, MgCl2 6mM, spermidine 2mM, ditiotreitol 10mM), análogo capa m7G(5’)ppp(5’)G 0,5 mM (NEB), 1 mM de cada trifosfato de nucleotideo, 1 U pirofosfatase (NEB), e 80 U inibidor RNAse (Roche, Indianápolis, IN). Esta mistura de reação foi incubada a 40°C por 90 minutos e os resultantes transcritos foram purificados usando-se mini kit Rneasy (Qiagen, Valencia, CA).
[0075] Para transfecção de células C6/36, transcritos de RNA foram combinados com reagente de transfecção lipossomal DOTAP (Roche) em solução salina tamponada com HEPES (pH 7,6) e adicionados a monocamadas de células em placas de 6 cavidades. Após incubação a 32°C por 12-18 horas, os meios de cultura de células foram removidos e substituídos com MEM suplementado com FBS 5%, L-glutamina, gentamicina e aminoácidos não-essenciais. Monocamadas de células foram incubadas por 5 a 7 dias adicionais e meios de cultura de células foram colhidos, clarificados por centrifugação, e ensaiados para a presença de vírus através de titulação de placa em células Vero. Vírus recuperados foram terminalmente diluídos duas vezes como descrito acima, e suspensões de vírus para ainda análises foram preparadas em células Vero.
[0076] Replicação in vitro (cultura de tecido) e in vivo de wt DEN4 e DEN4Δ30. O nível de replicação de ambos, wt DEN4 2A e o candidato a vacina, 2AΔ30, foi avaliado em células Vero (rim de macaco) e HuH-7 (hepatoma humano) (Figura 1), as últimas das quais foram recentemente verificadas suportarem eficientemente a replicação de vírus DEN2 (Lin, Y.L. et al. 2000 J Med Virol 60:425- 31). O padrão de replicação de wt DEN4 2A e 2AΔ30 foi similar em ambas linhas de células. Títulos virais de culturas infectadas com 2AΔ30 em uma MOI de 0,01 foram levemente reduzidos comparados a wtDEN4 2A em 72 horas, mas em pontos de tempo posteriores seus níveis de replicação foram equivalentes. A eficiente replicação de ambos vírus DEN4 em cada linha de célula indicou que estas linhas contínuas de células podem ser úteis parar caracterização do fenótipo ts do 1248 potenciais vírus mutantes.
[0077] O nível de replicação de vírus DEN4 administrados intra-cérebro a camundongos Swiss Webster foi primeiro determinado para avaliar se camundongos podem ser usados para avaliação e quantificação eficiente de fenótipo de atenuação de um grande conjunto de vírus mutantes. Uma vez que suscetibilidade de camundongos a infecção com DEN é dependente de idade (Cole, G.A & Wisseman, C.L.Jr. 1969 Am J Epidemiol 89:669-80; Cole, G.A. et al. 1973 J Comp Pathol 83:243-52), camundongos de 7 a 21 dias foram infectados com 2A-13 (um clone de vírus DEN4 tipo selvagem - ver abaixo), rDEN4 ou rDEN4Δ30, e após cinco dias o cérebro de cada camundongo foi removido, e o nível de replicação virai foi quantificado através de ensaio de placa (Tabela 1). Os resultados indicaram que os dois vírus wt DEN4 e o candidato a vacina rDEN4Δ30 replicaram para alto título (>6,OlogioPFU/g de cérebro) em camundongos de 7 dias e que os títulos virais médios foram similares entre os três vírus. Estes resultados demonstraram a exequibilidade do uso de camundongos de 7 dias para seleção de um grande conjunto de vírus mutantes, e o alto nível de replicação de tipo selvagem e candidato a vacina permite quantificar a magnitude da restrição de replicação especificada por uma mutação atenuante acima de uma faixa de 10.000 vezes.
[0078] Geração e caracterização in vitro de vírus mutantes 5-FU de DEN4. Um painel de 1.248 clones de vírus DEN4 foi gerado a partir de uma suspensão mutagenizada com 5-FU de wt DEN4 2A como descrito acima (Figura 2). Cada clone foi testado em células Vero e HuH-7 para o fenótipo ts a 39°C, e vírus mutantes ts putativos foram submetidos a dois rounds adicionais de clonagem biológica através de diluição terminal, e o fenótipo ts de cada população de vírus ainda clonado foi examinada em mais detalhes através de determinação de sua eficiência de revestimento (EOP)em temperatura permissiva (35°CV) e em várias temperaturas restritivas (Tabela 2). Um vírus (clone 2A-13) sem um fenótipo ts, que foi passado em uma maneira idêntica como os vírus mutantes ts, serviu como o vírus para o qual cada um dos vírus mutantes ts foi diretamente comparado para ambos fenótipos ts e att.
[0079] Treze vírus mutantes 5-FU foram identificados os quais têm um fenótipo ts em ambas células Vero e HuH-7, e sete vírus mutantes foram ts somente em células HuH-7 (Tabela 2). Vírus mutantes que foram ts em células Vero mas não em células HuH-7 não foram identificados. Sensitividade a temperatura foi definida como uma redução a > 2,5 ou > 3,5 logioPFU/ml em título de vírus em células Vero ou HuH-7, respectivamente, em uma temperatura indicada quando comparada à temperatura permissível de 35°C. DEN4 2A tipo selvagem foi verificado ter aproximadamente uma redução de 0,5 e 1,5 logio PFU/ml em título de vírus em células Vero ou HuH-7 a 39°C, respectivamente. A supressão Δ30 não confere um fenótipo ts em células Vero ou HuH-7 e exibiu somente uma leve redução em título de vírus (2,2 log-ioPFU/ml) a 39°C em células HuH-7, que foi menos que 10 vezes maior que a redução de wt DEN4 2A naquela temperatura. Vários vírus mutantes 5- FU tiveram uma redução maior que 10 000 em título de vírus a 39°C em células Vero e HuH-7. Uma completa interrupção em replicação virai a 39°C em células HuH-7 foi observada em cinco clones de vírus (#571, 605, 631, 967, e 992) que não foram ts em células Vero. Mutações que restringem seletivamente replicação em células de fígado HuH-7 podem ser particularmente úteis em controle de replicação de candidatos de vacina de vírus de dengue no fígado de vacinados.
[0080] Replicação de vírus mutantes 5-FU DEN4 em camun-donqos novos. O nível de replicação de cada um dos 20 vírus mutantes DEN4 em cérebro de camundongo foi determinado (Tabela 2). Os títulos obtidos foram comparados àqueles dos dois vírus wt, 2A-13 e rDEN4, os quais, cada um, replicaram para um nível de mais que 106 PFU/g de tecido de cérebro, e àqueles do mutante 2AΔ30, que conferiu somente uma limitada redução de 0,5logioPFU/g em título de vírus médio comparado aos controles wt. A redução observada no nível de replicação de rDEN4Δ30 foi consistente entre 11 experimentos separados. Interessantemente, o vírus rDEN4Δ30, que foi atenuado em ambos, macacos rhesus e humanos (Exemplo 8), foi somente levemente restrito em replicação em cérebro de camundongo. Níveis variáveis de restrição de replicação foram observados entre os vírus mutantes variando de uma redução de dez vezes (#473) a acima de 6.000 vezes (#686). Vírus mutantes com fenótipos ts em ambas células Vero e HuH-7, assim como em células HuH-7 sozinhas, foram verificados terem signi-ficantes fenótipos att. Cinco de 13 vírus mutantes 5-FU com fenótipos ts em ambas células Vero e HuH-7 e cinco de sete vírus mutantes com fenótipos ts em células HuH-7 sozinhas tiveram uma redução maior que 100 vezes em replicação de vírus. Ali pareceu não haver correlação direta entre a magnitude da redução em replicação em temperatura restritiva em cultura de tecido e o nível de atenuação in vivo. O nível similar de sensitividade de temperatura e replicação do rDEN4 wt e clone 2A-13 em cérebro de camundongo indicou que diferenças observadas em replicação entre os vírus mutantes ts e clone 2A-13 não foram simplesmente uma função de passagem em células Vero, mas reflete as diferenças de seqüências entre estes vírus.
[0081] Análises de seqüências de vírus mutantes 5-FU DEN4. Para determinar as bases genéticas dos fenótipos ts e att observados, a completa seqüência de nucleotídeos de cada mutante ts e de clone 2A-13 foi determinada e resumida na Tabela 3 (ts em células Vero e HuH-7) e Tabela 4 (ts em somente células HuH-7).
[0082] O único tipo de mutação identificado nos 20 vírus mutantes seqüenciados foi uma substituição de nucleotídeos (não ocorreram supressões ou inserções), e estas estavam presentes em cada uma das regiões codificantes exceto C e NS4A. Três vírus mutantes (#239, 489, e 773) contiveram somente uma mutação de ponto de sentido errado em NS3 em posição nt 4995 resultando em uma alteração de aminoácido (a.a.) Ser por Pro em posição de a.a. 1.632. Para #773, esta foi a única mutação presente (Tabela 3). As mutações não-codificantes em regiões codificantes não são consideradas serem significantes. Os 17 adicionais vírus mutantes tiveram múltiplas mutações (duas a cinco) em uma região codificante ou em uma UTR que potencialmente pode conferir os observados fenótipos ts ou att. Cinco dos 17 vírus mutantes com múltiplas mutações (#473, 718, 759, 816, e 938) também codificaram a mutação de ponto em posição nt 4995. A presença da mutação 4.995 foi verificada em somente vírus mutantes DEN4 com fenótipos ts em ambas células Vero e HuH-7.
[0083] A análise de seqüências indicou que 10 vírus mutantes que foram ts em células Vero e HuH-7 e três vírus mutantes que foram ts somente em células HuH-7 contiveram mutações em somente UTR 5’ e 3’ e/ou em uma proteína não- estrutural. Estas mutações são especialmente apropriadas para inclusão em candidatos a vacina de vírus de dengue quimérico onde os genes estruturais derivam de um sorotipo DEN1, DEN2, ou DEN3 e as restantes regiões codificantes e não-codificantes provêm de um vetor DEN4 atenuados. Mutações identificadas em vírus mutantes DEN4 5-FU que foram ts em somente células HuH-7 (Tabela 4) podem ser potencialmente usadas em candidatos a vacina, tal como rPEN4Δ30, para controlar seletivamente a replicação e patogênese de PEN4 no fígado. Estes resultados combinados das análises de seqüèncias de vírus mutantes 5-FU demonstram a utilidade de mutagênese química como um meio de introdução de mutações atenuantes no genoma de vírus de dengue.
[0084] A presença de uma mutação de ponto na posição nt 4995 em oito vírus mutantes separados foi descrita acima. Cinco adicionais mutações de ponto também foram represen-tadas em múltiplos vírus incluindo mudanças nt em posição 1.455 em E, 7.162, 7.163, e 7.564 em NS4B, e 10.275 na UTR 3’ (Tabela 5). A significância da ocorrência destas mutações “irmãs” em múltiplos vírus é discutida no Exemplo 6. Interessantemente, o vírus passado-paralelo, tipo selvagem, 2A-13, também conteve uma mutação simples na posição nt 7.163 em NS4B.
[0085] Introdução de uma mutação ts em rDEN4 e rDEN4A30. A presença de uma substituição de nucleotídeo simples (mutação U>C em posição nt 4.995 em NS3) em três vírus mutantes separados (clones 239, 489, e 773) indicou que esta mutação especificou os fenótipos ts e att em cada um dos três vírus mutantes. Esta mutação foi clonada em construção de cPNA de p4 e p4Δ30 e vírus recombinantes foram recuperados e designados rPEN4-4995 e rPEN4Δ30-4995, respectivamente. Estes vírus recombinantes foram testados para fenótipos ts e att como descrito acima (Tabela 6). Como esperado, introdução de mutação 4995 em rPEN4 wt resultou em um significante fenótipo ts a 39°C em ambas células, Vero e HuH-7. rPEN4-4995 cresceu para aproximadamente níveis tipo selvagem na temperatura permissível, 35°C, em ambos tipos de células, mas demonstrou uma redução maior que 10.000 vezes a 39°C (temperatura de interrupção) em ambas células Vero e HuH-7. A adição da mutação 4995 a rPEN4Δ30 rende um vírus recombinante, rPEN4Δ30-4995, que exibe o mesmo nível de sensitividade a temperatura como rPEN4-4995 (Tabela 6).
[0086] Os vírus rDEN4 codificando a mutação 4995 foram a seguir testados para replicação nos cérebros de camundongos jovens (Tabela 6). A mutação 4995 conferiu um fenótipo att sobre ambos rDEN4 e rDEN4Δ30. Houve uma redução de aproximadamente 1.000 vezes em replicação de vírus comparada àquela de vírus wt. A combinação de mutação de ponto 4995 e a supressão Δ30 não parecem resultar em uma redução aditiva de replicação de vírus. Estes resultados confirmaram que a mutação de ponto 4995 realmente especifica os fenótipos ts e att. Importantemente, a utilidade de modificação de cultura de tecido e fenótipos in vivo do candidato a vacina rDEN4Δ30 através de introdução de adicionais mutações também foi demonstrada.
[0087] Discussão. Aqui nós ensinamos como preparar uma vacina de vírus de dengue atenuado vivo, tetravalente usando rDEN4Δ30 como o componente DEN4 e três vírus quiméricos antigênicos expressando as proteínas estruturais (C, prM, e E) de DEN1, DEN2, e DEN3 do vetor rDEN4Δ30 atenuado (Exemplo 8). rDEN4Δ30 de vírus DEN4 contendo a mutação de supressão na UTR 3’ manifesta restrita replicação em humanos enquanto retendo imunogenicidade. Uma vez que rDEN4Δ30 retém um baixo nível de virulência residual para humanos à despeito desta replicação restrita, o presente estudo foi iniciado para gerar adicionais mutações atenuantes que são imaginadas como sendo úteis para ainda atenuar rDEN4Δ30 ou outros vírus de dengue e que são imaginadas como sendo incorporadas em qualquer um dos três vírus quiméricos antigênicos ou outros vírus de dengue quando necessário. Mutantes sensíveis a temperatura de vírus de dengue (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Eckels, K.H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80) assim como de outros vírus (Skiadopoulos, M.H. et al. 1998 J Virol 72:1762-8; Whitehead, S.S. et al. 1999 J Virol 73:871-7) manifestam replicação restrita in vitro. Nós geramos um painel de 20 vírus mutantes DEN4 ts, determinamos sua seqüência genômica, e avaliamos seus fenótipos de atenuação in vivo. Os 20 vírus mutantes DEN4 ts foram gerados através de crescimento na presença de 5-FU e foram primeiro selecionados para viabilidade em células Vero, o substrato planejado para uso na fabricação destas vacinas, para assegurar que vírus mutantes possam ser desenvolvidos eficientemente em um substrato apropriado.
[0088] Duas classes de vírus mutantes foram obtidas; aqueles ts em ambas células Vero de HuH-7 (n=13) ou aqueles ts somente em células HuH-7 (n=7). Os vírus exibiram uma faixa em seu nível de sensitividade de temperatura a partir de uma redução de 100 a 1.000.000 de vezes em replicação na temperatura restritiva de 39°C. Uma vez que nosso candidato a vacina DEN4 retém um baixo nível de virulência para o fígado e outras verificações suportam a habilidade de vírus de dengue infectar hepatócitos (Lin, Y.L. et al. 2000 J Med Virol 60:425-31; Marianneau, P. et al, 1997 J Virol 71:3244-9) e causa patologia de fígado (Couvelard, A. et al. 1999 Hum Pathol 30:1106-10; Huerre, M.R. et al., 2001 Virchows Arch 438:107-15), nós buscamos desenvolver mutações que podem seletivamente restringir replicação de vírus de dengue 4 em células de fígado. Na direção desta finalidade, nós identificamos sete vírus mutantes que têm um fenótipo ts específico de célula HuH-7. As mutações presentes nestes vírus são as primeiras reportadas em vírus que conferem replicação restrita em células de fígado e são imaginadas como sendo úteis em limitação de replicação de vírus e partenogênese no fígado de receptores de vacina. A contribuição de mutações individuais identificadas nos vírus ts específicos de células HuH-7 para os fenótipos observados é imaginado como sendo avaliado pela introdução das mutações individuais nos vírus DEN4 recombinantes.
[0089] Evidência recente indicou que a magnitude da viremia em pacientes infectados com DEN correlaciona-se positivamente com seriedade de doença, isto é, quanto maior o título de viremia mais séria a doença (Murgue, B. et al. 2000 J Med Virol 60:432-8; Vaughn, D. W. et al. 2000 J Infect Dis 181:2-9). Isto indica que mutações que restringem significantemente replicação de candidatos a vacina in vivo são a fundação de uma vacina segura e atenuada. Avaliação de candidatos de vacina de vírus DEN para atenuação in vivo é complicada pela falta de um apropriado modelo animal que imita precisamente a doença causada por vírus de dengue em humanos. Na ausência de um tal modelo, a replicação do painel de vírus mutantes 5-FU nos cérebros de camundongos jovens Swiss Webster foi avaliada como um meio para identificar um fenótipo de atenuação in vivo uma vez que este modelo animal é bem adaptado para a avaliação de um grande conjunto de vírus mutantes. Cada um dos 20 vírus mutantes ts exibiu um fenótipo att manifestando uma redução de 10- 6000 vezes em replicação no cérebro de camundongo como comparado a vírus wt DEN4 (Tabela 2). Isto indica que há uma correlação entre a presença do fenótipo ts em cultura de tecido e atenuação do mutante in vivo confirmando a utilidade de seleção de vírus com este marcador como candidatos de vacina. Entretanto, não houve correlação entre o nível de sensitividade de temperatura e o nível de restrição in vivo. Além disso, Sabin observou uma dissociação entre neurovirulência em camundongo e atenuação em humanos através de geração de uma vacina de vírus vivo efetiva contra DEN através de passagem de vírus em cérebro de camundongo. Esta pesquisa realmente resultou em um vírus DEN camundongo-altamente neurotrófico que, paradoxalmente foi significantemente atenuado em atenuado em humanos (Sabin, A.B. 1952 Am J Trop Med Hyg 1:30-50). A despeito disto, atenuação para o cérebro de camundongo jovem foi reportada para outros candidatos a vacina de vírus DEN atenuado - vivo incluindo a linhagem de vacina PDK-53 DEN2 que é não-letal em camundongos e linhagem de vacina PR-159/S-1 DEN-2 que foi significantemente atenuado comparado a seu vírus tipo selvagem parente (Bhamarapravati, N. &Yoksan, S. 1997 em : Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Eckels, K.H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80). Replicação em macacos rhesus foi reportada ser anunciadora de atenuação para humanos (Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80). Recentemente, modelos murinos de infecção de virus de dengue foram desenvolvidos usando-se camundongos SCID transplantados com macrófagos humanos (Lin, Y.L. et al. 1998 J Virol 72:9729-37) ou linhas de células de fígado (Na, J. et al. 1999 Virology 263:70-7), mas estes camundongos ainda não foram usados para avaliação de fenótipos att de vírus vacina candidatos. Vírus mutantes ou vírus recombinantes transportando uma ou mais destas mutações aqui descritas são imaginados como sendo testados para replicação em macacos rhesus (ou outro modelo animal apropriado) como anunciadores para atenuação em humanos.
[0090] A mutagênese química de vírus DEN4 e análise de seqüências de vírus resultantes aqui descritas resultaram na identificação de um grande número de mutações de ponto resultando em substituições de aminoácidos em todos os genes exceto C e NS4A assim como mutações de ponto na UTR 5’ e 3’ (Tabelas 3 e 4). Esta abordagem de mutagênese de genoma-inteiro tem o benefício de identificar mutações dispersas por todo o inteiro genoma que são pré-selecionadas para viabilidade no substrato de células Vero. Dez vírus mutantes 5-FU que foram ts em células Vero e HuH-7 e três vírus que foram seletivamente ts em células HuH-7 contiveram somente mutações fora dos genes codificando as proteínas estru-turais, isto é, nos genes NS ou UTR 5’ e 3’. Estas mutações junto com a supressão Δ30 na UTR 3’ são particularmente apropriadas para inclusão em vacinas quiméricas, antigênicas, que consistem em um vetor DEN4 atenuado transportando os genes estruturais tipo selvagem (C, prM, E) dos outros sorotipos de vírus DEN. O uso desta estratégia tem várias vantagens. Cada vírus quimérico antigênico que possui proteínas estruturais a partir de um vírus tipo selvagem junto com mutações atenuantes em suas UTRs ou genes NS deve manter sua infectividade para humanos, que é grandemente mediada pela proteína E, e, por isso, cada componente de vacina deve ser imunogênico (Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). A maquinaria replicativa das linhagens de vacina tetravalente pode compartilhar as mesmas mutações atenuantes nos genes NS ou na UTR as quais devem atenuar cada componente de vacina para um grau similar e pelo que minimizar interferência ou complementação entre os quatro vírus vacina. Em adição, proteína E tipo selvagem pode ser esperada induzir mais eficientemente anticorpos neutralizantes contra cada vírus DEN individual.
[0091] Análise de seqüências de vírus de dengue (Blok, J. et al. 1992 Virology 187:573-90; Lee, E. et al. 1997 Virology 232:281-90; Puri, B. et al. 10997 J Gen Virol 78:2287-91) e vírus de febre amarela (Dunster, L.M. et al. 1999 Virology 261:309-18; Holbrook, M.R. et al. 2000 vírus Res 69:31-9) gerados previamente através de passagem serial em cultura de tecido têm mutações por todo o genoma, um padrão que nós observamos no presente estudo. Análises recentes da linhagem de vacina PDK-53 DEN2 identificaram as importantes mutações envolvidas em atenuação que foram localizadas em regiões não-estruturais incluindo a UTR 5’, NS1 e NS3 (Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9). Esta linhagem de vacina DEN2 tem sido usada para formação de um vírus quimérico com genes C-prM-E de DEN1 (Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). Em estudos separados, a seqüência da vacina DEN1 linhagem 45AZ5 PDK-27 foi determinada e comparada a vírus parentes, mas as mutações responsáveis por atenuação ainda não foram identificadas (Puri, B. et al. 1997 J Gen Virol 78:2287-91).
[0092] Várias substituições de aminoácidos foram identi-ficadas em mais de um vírus mutante 5-FU ts (Tabela 5). Lee et al. reportaram anteriormente verificação de repetidas mutações em clones de vírus DEN3 separados após passagem serial em células Vero (Lee, E. et al. 1997 Virology 232:281-90). Uma mutação (K>N) identificada em E em posição a.a. 202 em uma série de passagem de DEN3 simples também foi encontrada em nosso vírus mutante 5-FU #1012 (K>E). Mutações observadas nos vírus mutantes irmãs 5-FU são imaginadas como representando mudanças adaptativas que conferem uma aumen-tada eficiência de replicação de DEN4 em células Vero. Tais mutações são imaginadas como sendo benéficas para inclusão em uma vacina de vírus DEN atenuado-vivo através de aumento de rendimento de vírus vacina durante fabricação. Interessantemente, três substituições de aminoácidos distin-tas foram verificadas em NS4B dos vírus mutantes irmãs 5-FU. A exata função deste gene é desconhecida, mas estudos anteriores de vacinas de febre amarela atenuadas vivas (Jennings, A.D. et al. 1994 J Infect Dis 169:512-8; Wang, E. et al. 1995 J Gen Virol 76:409-13) identificaram mutações em NS4B associadas com fenótipos de atenuação.
[0093] A mutação na posição nt 4995 de NS3 (S1632P) estava presente como a única mutação significante identi-ficada em três vírus mutantes 5-FU (#239, #489, e #773). Esta mutação foi introduzida em um vírus DEN4 recombinante e verificada conferir um fenótipo ts e att (Tabela 6). Estas observações identificam claramente a mutação 4995 co mo uma mutação atenuante. Análise de um alinhamento de seqüências (Chang, G.-J. 1997 em: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno, eds. pp. 175-198 CAB International, New York) dos quatro vírus de dengue indicou que a Ser em posição de a.a. 1632 está conservada em DEN1 e DEN2, enquanto DEN3 contem uma Asn nesta posição indicando que a mutação é prevista ser útil em modificação de fenótipos dos outros sorotipos de vírus DEN. A proteína NS3 é 618 a.a. de comprimento e contem ambas atividades serina protease e helicase (Bazan, J.F. &Fletterick, R.J. 1989 Virology 171:637-9; Brinkworth, R.l. et al. 1999 J Gen Virol 80:1167-77; Valle, R.P. & Falgout, B. J Virol 72:624-32). A mutação 4995 resulta em uma alteração em posição a.a. 158 em NS3 que está localizada na região terminal-N contendo o domínio protease. Posição de aminoácido 158 está localizada dois resíduos de a. a. afastada de uma região conservada de NS3 designada homologia caixa quatro. Este domínio foi identificado em membros da família flavivírus e é acreditado ser um determinante crítico da especificidade de substrato protease de NS3 (Bazan, J.F. & Fletterick, R.J. 1989 Virology 171:637-9; Brinkworth, R.l. et al. 1999 J Gen Virol 80:1167-77). Entretanto, o exato mecanismo que resulta no fenótipo associado com a mutação 4995 ainda não foi identificado. A identificação da mutação 4995 como uma mutação atenuante permite uma previsão de sua utilidade para ainda atenuação de rDEN4Δ30.
[0094] Nós determinamos a contribuição de mutações 5-FU individuais para os fenótipos observados através de introdução das mutações nos vírus DEN4 recombinantes como foi aqui demonstrado para a mutação 4995 (ver exemplo 3). Em adição, combinação de mutações individuais umas com as outras ou com a mutação Δ30 é útil para ainda modificar o fenótipo de atenuação de vacinas candidatas de vírus DEN4. A introdução da mutação 4995 em rDEN4Δ30 aqui descrito tornou o mutante duplo rDEN4Δ30-4995 ts e 1.000 vezes mais atenuado para o cérebro de camundongo que rDEN4Δ30. Esta observação demonstrou a exequibilidade de modificação de ambos, cultura de tecido e fenótipos in vivo destes e outros candidatos a vacina de vírus de dengue. Uma vez as mutações responsáveis pelo fenótipo ts específico de célula HuH-7 sejam identifi-cadas como descrito acima e introduzidas no candidato a vacina rDEN4Δ30, nós imaginamos confirmar que estas mutações atenuam vírus vacina rDEN4Δ30 parra o fígado de humanos. Um menu de mutações atenuantes é imaginado como sendo montado o que é previsto ser útil em geração de vírus vacina de dengue recombinantes satisfatoriamente atenuados e em aumento do nosso entendimento da patogênese de vírus de dengue (ver Exemplo 7).
EXEMPLO 2 Mutagênese química de vírus DEN4 resulta em vírus mutantes de placa pequena com fenótipos de atenuação e sensível a temperatura
[0095] Mutações que restringem replicação de vírus de dengue foram procuradas para a geração de vacinas de vírus de dengue atenuados vivos recombinantes. Vírus de dengue tipo 4 (DEN4) foi previamente desenvolvido em células Vero na presença de 5-flúor uracila, e a caracterização de 1.248 clones passados em célula Vero, mutagenizados identificou 20 vírus mutantes sensíveis a temperatura (ts) que foram atenuados (att) em cérebro de camundongo jovem (Exemplo 1). A presente investigação estendeu estes estudos através de identificação de adicionais 22 vírus mutantes DEN4 que têm fenótipo tipo placa pequena (sp) em células Vero e/ou a linha de células de fígado, HuH-7. Cinco vírus mutantes têm um fenótipo sp em ambas células Vero e HuH-7, três dos quais também são ts. Dezessete vírus mutantes têm um fenótipo sp somente em células HuH-7, treze dos quais também são ts. Cada um dos vírus sp foi de crescimento restrito no cérebro de camundongo jovem, exibindo uma ampla faixa de redução em replicação (9 a 100.000 vezes). Seqüência de nucleotídeos completa foi determinada para os 22 vírus mutantes sp DEN4, e substituições de nucleotídeos foram encontradas na região não-traduzida 3’ (UTR) assim como em todas as regiões codificantes exceto NS4A. Mutações idênticas foram identi-ficadas em múltiplos clones de vírus indicando que eles estão envolvidos na adaptação de vírus DEN4 a eficiente crescimento em células Vero.
[0096] Os vírus DEN podem causar mais doença e morte de humanos que qualquer outro arbovirus, e mais de 2,5 bilhões de pessoas vivem em regiões com infecção endêmica de dengue (Gubler, D.J. 1998 Clin Microbiol Ver 11:480-96). Anual-mente, há uma estimativa de 50-100 milhões de casos de febre de dengue (DF) e 500.000 casos da mais séria e potencialmente letal febre hemorrágica de dengue/síndrome de choque de dengue (DHF/DSS)(Gubler, D.J. &Meltzer, M. 1999 Adv Vírus Res 53:35-70). Febre de dengue é uma infecção aguda caracterizada por febre, dor de cabeça retro-orbital, mialgia, e exantema. No momento de fervescência durante DF, uma complicação mais severa de infecção de vírus DEN, DHF/DSS, pode ocorrer que é caracterizada por um segundo período febril, manifestações hemorrágicas, hepatomegalia, trombocitopenia, e hemoconcentração, que pode conduzir a choque potencialmente ameaçador de vida (Gubler, D.J. 1998 Clin Microbiol Ver 11:480-96).
[0097] Os sítios de replicação de vírus DEN em humanos e sua importância e relação à patogênese de DF e DHF/DSS ainda são incompletamente entendidos (Innis, B.L. 1995 em: Exotic Viral Infections J.S. Porterfield, ed. pp. 103- 146 Chapman and Hall, London). Em adição a replicação em células linfóides, tornou-se evidente que o fígado está envolvido em infecção DEN de humanos. Elevações transientes em níveis de aspartato amino transferase (AST) e alanina amino transfe-rase (ALT) em soro são observadas na maioria de pacientes infectados com vírus Den e hepatomegalia é observada em alguns pacientes (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Kuo, C.H. et al. 1992 Am J Trop Med Hyg 47:265-70; Mohan, B. et al. J Trop Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259-63). Hepatócitos antígeno- positivo de vírus DEN são vistos cir-cundando áreas de necrose no fígado de casos fatais (Coulevard, A. et al., 1999 Hum Pathol 30:1106-10; Herre, M.R. et al. 2001 Virchows Arch 438:107-15), a partir dos quais seqüências de vírus de dengue foram identificadas usando-se RT-PCR (Rosen, L. et al. 1999 Am J Trop Med Hyg 61:720- 4). De potencial importância para a etiologia de infecção de vírus de dengue severa, três estudos demonstraram que os níveis médios de ALT e AST em soro foram significantemente aumentados em pacientes com DHF/DSS comparados com aqueles com DF (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Mohan, B. et al. 2000 J Trop Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al. 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259-63). Como esperado, elevação de enzimas do fígado em soro foi observada em experimentos clínicos de candidatos de vacina de vírus DEN (Exemplo 8; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Edelman, R. et al. 1994 J Infect Dis 170:1448-55; Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179- 3188; Vaughn, D.W. etal. 1996 Vaccine 14:329-36).
[0098] Baseado na crescente carga de doença associada com infecção de vírus DEN nas várias décadas passadas, uma vacina que confira proteção contra os quatro sorotipos de vírus de dengue é necessária, mas nenhuma é presentemente licenciada. Devido ao aumentado risco de severa DHF/DSS associada com infecção secundária com um sorotipo de vírus DEN heterólogo (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B. et al. 1977 J Exp Med 146:218-29; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72), uma vacina efetiva tem de conferir simultânea proteção contra cada um dos quatro sorotipos de vírus DEN. Várias abordagens são atualmente perseguidas para o desenvolvimento de uma vacina tetravalente contra os vírus de dengue (Bancroft, W.H. et al. 1984 J Infect Dis 149:1005-10; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44-7; Butrapet, s. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Guirakhoo, F. et al. 2000 J Virol 74:5477-85; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8; Kanesa-thassan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-3188). Uma tal abordagem, um candidato a vacina DEN4 atenuado-vivo, chamado 2AΔ30, foi atenuado e imunogênico em uma coorte de 20 voluntários (Exemplo 8). O vírus 2AΔ30 recombinante contem uma supressão de 30 nt na UTR 3’ que remove nucleotideos 10478-10507 e foi verificada produzir um nível baixo ou indetectável de viremia em vacinados em uma dose de 105 PFU/vacinado. Um exantema assintomático foi reportado em 50% de voluntários, e a única anormalidade de laboratório observada foi um aumento transiente, assintomático, no nível de ALT em soro em 5 dos 20 vacinados. Todos os vacinados com 2AΔ30 desenvolveram anticorpos neutralizantes no soro contra vírus DEN4 (título médio: 1:580), e 2AΔ30 não foi trans-mitido a mosquitos que se alimentaram experimentalmente sobre os vacinados (Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:414-9). Devido às desejáveis propriedades conferidas pela mutação Δ30, candidatos a vacina quiméricos estão sendo construídos os quais contêm os genes estruturais de vírus DEN tipo 1, 2, e 3, no fundo DEN4 atenuado transportando a mutação Δ30 geneticamente estável. Mutações atenuantes fora dos genes estruturais são particularmente atraentes para inclusão em candidatos de vacina quiméricos antigênicos porque elas não afetarão a infectividade ou imunogenicidade conferida pelo principal mediador de imunidade humoral para vírus DEN, a proteína envelope (E).
[0099] A presença de exantema e elevados níveis de ALT sugere que o candidato a vacina 2AΔ30 pode ser levemente sub-atenuado em humanos. Similarmente, muitas tentativas anteriores para desenvolvimento de vacinas de vírus dengue atenuado vivo renderam candidatos a vacina que foram super- ou sub- atenuados em humanos, alguns dos quais também indu-ziram elevação de níveis de ALT e AST em soro (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em : Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Eckels, K.H. et al. Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80; Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179- 3188; McKee, K.T., Jr. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42). Por isso, nós desenvolvemos um menu de mutações de ponto conferindo fenótipos sensível a temperatura (ts), placa pequena (sp), e atenuação (att) capaz de atenuar vírus DEN4 em um grau variável (Exemplo 1). Nós anteriormente descrevemos 20 vírus mutantes que exibem um fenótipo ts, mas não sp em células Vero ou células de fígado HuH-7 e que mostram replicação atenuada em cérebro de camundongo (Exemplo 1). Adição de tais mutações a 2AΔ30 ou outros candidatos a vacina de vírus de dengue é imaginada como rendendo candidatos a vacina que exibem um balanço mais satisfatório entre atenuação e imunogenicidade.
[00100] No presente Exemplo, nós estendemos nossa análise do painel de 1248 clones de vírus DEN4 gerado previamente por mutagênese com 5-flúor uracila (5-FU)(Exemplo 1), através de identificação de um conjunto de 22 vírus mutantes sp, alguns dos quais também têm um fenótipo ts. Vírus mutantes de placa pequena foram procurados uma vez que tais vírus são freqüentemente atenuados em humanos (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Crowe, J.E. Jr. et al. 1994 Vaccine 12:783-790; Crowe, J.E. jr. et al. 1994 Vaccine 12:691-699; Eckels, K.H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80; Murphy, B.R. & Chanock, R.M. 2001 em: Fields Virology D.M. Knipe, et al., Eds. Vol. 1, pp. 435- 468 Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia; Takemoto, K.K. 1966 Prog Med Virol 8:314-48). Devido à infecção natural com vírus de dengue e vacinação com 2AΔ30 poder ser associada com toxidez no fígado em humanos, nós identificamos vírus mutantes com restrita replicação em células de fígado humano. Da mesma maneira, vírus foram selecionados para tamanho de placa e sensitividade de temperatura na linha de células de hepatoma humano, HuH-7, assim como células Vero. Aqui nós descrevemos o fenótipo ts, seqüência de nucleotídeos, propriedades de crescimento em camundongo jovem de 22 clones de vírus mutantes DEN4 sp.
[00101] Células e vírus. Células Vero WHO (células de rim de macaco verde africano) e células HuH-7 (células hepatoma humano)(Nakabayashi, H. et al. 1982 Cancer Res 42:3858-63) foram mantidas como descrito no Exemplo 1. Vírus DEN4 2A é um vírus tipo selvagem derivado de clone cDNA de DEN4 linhagem 814669 (Dominica, 1981 )(Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-43; Mackow, E. et al. 1987 Virology 159:217-28). A seqüência de nucleotídeos de DEN4 2A, o parente dos virus mutantes 5-FU, foi previamente cedido com o número de acesso GenBank AF375822 (Exemplo 1). O candidato a vacina DEN4, 2AΔ30, (Exemplo 8) contem uma supressão de 30 nt na região não-traduzida (UTR) 3’ que remove nucleotideos 10.478-10.507 (men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Os clones de cDNA p4, um derivado modificado do clone de cDNA de DEN4 2A, e p4Δ30 foram usados para gerar vírus atenuado e tipo selvagem recombinante, rDEN4 e rDEN4Δ30, respectivamente (Exemplo 8). Números de acesso GenBank foram previamente cedidos como se segue (vírus: número de acesso)): DEN4 linhagem 814669: AF326573; 2AΔ30: AF326826; rDEN4: AF326825; rDEN4Δ30: AF326827.
[00102] Formação e clonagem biológica de vírus mutantes com um fenótipo sp. A formação de 1.248 clones de vírus a partir de uma reunião de DEN4 2A mutagenizado com 5-flúor uracila foi previamente descrita (Exemplo 1). Em resumo, monocamadas de células Vero foram infectadas com DEN4 2A em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 e revestidas com MEM suplementado com FBS 2% e 5-flúor uracila 1 mM (5-FU)(Sigma, St. Louis, MO), que reduziu replicação de DEN4 2A 100 vezes. Células Vero em placas de 96 poços foram inoculadas com a suspensão de vírus tratados com 5-FU, e clones de vírus foram colhidos das placas recebendo vírus terminalmente diluídos. Um total de 1248 clones de vírus foi gerado a partir das culturas tratadas com 5-FU 1mM. Dois clones de vírus, 2A-1 e 2A-13, foram gerados na mesma maneira a partir de culturas controles não tratadas com 5-FU e serviram como vírus controles passados-paralelos com um fenótipo tipo selvagem.
[00103] Avaliação de tamanho de placa in vitro e sensiti-vidade de temperatura. Os 1248 clones de vírus mutagenizados com 5-FU foram selecionados para sensitividade a temperatura através de avaliação de replicação de vírus a 35°C (temperatura permissível) e 39°C (temperatura restritiva) em células Vero e HuH-7. Monocamadas de células em placas de 96 poços foram inoculadas com diluições seriais de dez vezes de vírus e placas réplicas foram incubadas a 35°C e 39°C por cinco dias em banhos de água de temperatura controlada. Replicação de vírus foi determinada através de coloração com imunoperoxidase como descrito anteriormente (Exemplo 1). Uma coleção de 193 clones de vírus 5-FU demonstrou uma redução de 100 vezes ou maior em título a 39°C em qualquer linha de células, e estes vírus ts presumidos ainda foram caracterizados. A eficiência de formação de placa (EOP) em temperaturas permissível e restritiva e o tamanho de placa de cada um dos 193 clones de vírus foram determinados como se segue. Diluições seriais de dez vezes de suspensão de vírus foram inoculadas sobre monocamadas de células Vero e HuH-7 confluentes em placas de 24 poços em réplicas. Após incubação a 35°C por duas horas, monocamadas foram revestidas com metil celulose 0,8% (EM Scince, Gibbstown, NJ) em meio L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) suplementado com FBS 2%, gentamicina, e L-glutamina. Após incubação de placas réplicas por cinco dias a 35, 37, 38 ou 39°C em banhos de água de temperatura controlada, placas foram visualizadas por coloração com imunoperoxidase e contadas como descrito anteriormente. Tamanho de placa de cada um dos 193 vírus foi avaliado na temperatura permissível (35°C) e comparado com aquele de vírus controle passado-paralelo DEN4 2A-13 com um tamanho de placa tipo selvagem. Vírus mutantes incubados na temperatura permissível de 35°C que tiveram um tamanho de placa de < 1mm ou <0,4mm (aproximadamente <50% do tamanho de DEN4 2A-13 tipo selvagem) em células Vero ou HuH-7, respectivamente, foram designados como tendo um fenótipo sp. O nível de sensitividade a temperatura e tamanho de placa de cada vírus foi confirmado em pelo menos dois experimentos separados. Setenta e cinco vírus que foram confirmados terem um fenótipo ts e/ou sp putativo foram biologicamente clonados duas vezes adicionais e fenótipos foram reavalia-dos. Vinte e dois dos 75 vírus terminalmente diluídos foram verificados possuírem um fenótipo sp. Dezesseis dos 22 vírus mutantes também foram verificados terem um fenótipo ts como definido por uma redução de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em título de vírus em células Vero ou HuH-7, respectivamente, em temperatura restritiva comparado à temperatura permissiva de 35°C como descrito anteriormente (Exemplo 1). Vinte do 75 vírus diluídos terminalmente foram verificados possuir um fenótipo ts sem um fenótipo sp e foram previamente descritos (Exemplo 1). Os restantes dos 75 vírus não satisfazem qualquer critério para um vírus mutante ts ou sp.
[00104] Avaliação de vírus mutantes sp para replicação restrita em camundongos jovens. Experimentos animais foram realizados de acordo com as regulamentações e diretrizes de National Institutes of Health, Bethesda, MD. Crescimento de vírus mutantes 5-FU DEN4 foi determinado em camundongos jovens Swiss Webster (Taconic Farms, Germantown, NY). Grupos de seis camundongos de sete dias foram inoculados intra-cérebro com 104PFU de vírus em 30pJ de Opti-MEM I (Invitrogen) e o cérebro de cada camundongo foi removido cinco dias depois e analisados individualmente como descrito anteriormente (Exemplo 1). Sobrenadantes clarificados de suspensões 10% de cérebro de camundongo foram congelados a -70°C, e o título de vírus foi determinado através de ensaio de placa em células Vero.
[00105] Determinação da seqüência qenômica completa dos vírus mutantes sp. A seqüência de nucleotídeos dos vírus DEN4 mutagenizados com 5- FU foi determinada como descrito no Exemplo 8. Em resumo, RNA genômico foi isolado de clones de vírus e cDNA foi preparado por transcrição reversa e serviu como molde parra a geração de sobreposição de fragmentos de PCR. Um painel de primers foi projetado para sequenciar ambas fitas do produto de PCR a partir das quais seqüências consensos foram montadas e analisadas. A seqüência de nucleotídeos das regiões 5’ e 3’ do genoma de vírus foi determinada após circularização do genoma de RNA como descrito no Exemplo 8.
[00106] Identificação de vírus mutantes DEN4 com 5-flúor uracila com um fenótipo sp. A formação de um painel de 1.248 clones de vírus a partir de uma suspensão de vírus DEN4 2A tipo selvagem mutagenizados por 5-FU foi descrita anterior-mente (Exemplo 1). No presente estudo vinte e dois vírus mutantes com um fenótipo sp foram identificados. O tamanho de placa de vírus mutantes representativos é ilustrado na Figura 3. O tamanho de placa de vírus DEN4 2A-13 (um vírus passado-paralelo com um fenótipo tipo selvagem derivado de culturas controles não tratadas com 5-FU) foi consisten-temente menor em células HuH-7 que aquele observado em células Vero (Figura 3A). Vírus mutantes #569 e #1189 (Figura 3B) foram sp em ambas células Vero e HuH-7. Em contraste, clones de vírus mutantes com 5-FU #311 e #1083 (Figura 3C) foram sp em somente células HuH-7, sugerindo um defeito específico de célula de fígado em replicação dentro deste grupo fenotípico. Como indicado na Tabela 7, cinco vírus mutantes foram verificados terem um fenótipo sp em ambas células Vero e HuH-7 enquanto 17 vírus tiveram um fenótipo sp em somente células HuH-7. Cada clone de vírus mutante com 5-FU foi comparado para um fenótipo sp ou ts com três vírus controles, 2A-13, rDEN4 tipo selvagem e rDEN4Δ30. Os vírus recombinantes, rDEN4 e rDEN4Δ30, cada um teve um tamanho de placa em células Vero e HuH-7 similar àquele de DEN4 2A-13 indicando que a mutação Δ30 não confere um fenótipo sp (Tabela 7).
[00107] Maioria dos vírus mutantes com 5-FU sp também teve um fenótipo ts em células Vero e/ou HuH-7 (Tabela 7) uma vez que vírus mutantes foram inicialmente selecionados para sensitividade a temperatura. Sensitividade a temperatura foi definida como uma redução 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em título de vírus em células Vero ou HuH-7, respectivamente, em temperatura restritiva comparada à temperatura permissível de 35°C como definido anteriormente (Exemplo 1). Três vírus mutantes (#574, #1269 e #1189) foram sp e ts em ambas células Vero e HuH-7, enquanto nove vírus mutantes (#506-326 na Tabela 7) foram verificados serem ts em ambos tipos de células mas sp somente em células HuH-7. Quatro vírus (#1104, 952, 738, e 1083) foram verificados ter um fenótipo tipo selvagem em células Vero mas foram ambos sp e ts em células HuH-7. Estes quatro vírus mutantes cada um teve uma redução de 6.000- a 600.000 vezes em título de vírus a 39°C em células HuH-7 com somente uma redução de 6 a 40 vezes a 39°C em células Vero. Finalmente, vírus mutantes sp foram identi-ficados os quais não têm um fenótipo ts em qualquer linha de células; dois destes vírus (#569 e #761) foram sp em ambas células Vero e HuH-7 e quatro vírus (#1096-1012) foram sp somente em células HuH-7(Tabela 7). Como descrito anteriormente, a mutação Δ30 não confere sensitividade a temperatura em qualquer linha de células (Exemplo 1).
[00108] Os vírus mutantes 5-FU sp têm restrita replicação em cérebro de camundongo jovem. Os 22 vírus mutantes 5-FU DEN4 foram avaliados para sua habilidade em replicar no cérebro de camundongos jovens de uma semana. Como um marcador para atenuação in vivo, seu nível de replicação foi comparado com aquele dos vírus controles passados em paralelo com um fenótipo tipo selvagem, 2A-13 (Tabela 7). Dezenove de 22 vírus mutantes sp tiveram uma redução maior que 100 vezes em replicação de vírus no cérebro de camundongos jovens comparados a 2A-13 e nove vírus tiveram uma redução maior que 10.000 vezes.
[00109] Os cinco vírus mutantes que foram sp em ambas células Vero e HuH-7 foram 5.000 a 100.000 vezes restritos em replicação comparados a 2A-13. Dois destes vírus mutantes, #569 e #761, não foram ts em qualquer linha de célula mas tiveram uma redução em título de vírus de mais que 10.000 vezes em cérebro de camundongo, indicando que o fenótipo sp em ambas linhas de células Vero e HuH-7 é um importante marcador substituto para replicação atenuada em cérebro de camundongo jovem. Vírus mutantes 5-FU que foram sp somente em células HuH-7 tiveram uma faixa mais variável de replicação em cérebro de camundongo. Três vírus tiveram uma redução média em título de vírus de menos que 10 vezes comparados a vírus 2A-13. Entretanto, 8 de 13 vírus que foram ts em células Vero ou HuH-7 mas sp somente em células HuH-7 tiveram uma redução maior que 5.000 vezes em replicação de vírus. Os resultados das análises de replicação in vivo dos 20 vírus mutantes 5-FU ts descritos anteriormente (Exemplo 1) e os 22 vírus mutantes sp são resumidos na Tabela 8. Vírus mutantes com ambos fenótipos sp e ts foram verificados terem um nível de atenuação significantemente maior no cérebro de camundongos jovens quando comparados a vírus com somente um fenótipo ts.
[00110] Análise de seqüèncias dos vírus mutantes com 5-FU sp. Para iniciar uma análise das bases genéticas do fenótipo ts, sp ou att dos 22 vírus mutantes sp, a completa seqüência de nucleotideos de cada genoma de vírus foi determinada e é resumida na Tabela 9 (sp em células Vero e HuH-7) e Tabela 10 (sp somente em células HuH-7). Todas as mutações identificadas foram substituições de nucleotideos, na medida em que supressões ou inserções não foram observadas. Mutações de ponto foram distribuídas por todo o genoma, incluindo a UTR 3’ assim como em todas as regiões codificantes. Devido a todos os vírus mutantes com 5-FU terem pelo menos duas mutações (duas a seis), os fenótipos observados não podem ser diretamente atribuídos a uma mutação específica. A maioria de vírus sp também conteve mutações de ponto traducionalmente silenciosas (nenhuma a quatro) nas regiões codificantes estruturais ou não-estruturais. Entretanto, estas mutações silenciosas não são esperadas contribuírem para os fenótipos observados. Seis dos 22 vírus mutantes sp (Tabelas 9 e 10) foram verificados terem mutações somente nos genes NS e/ou a UTR 3’, indicando que o fenótipo sp pode ser conferido por mutações fora dos genes estruturais.
[00111] Presença de mutações idênticas em múltiplos vírus mutantes 5- FU. Análises dos dados de seqüência de núcleo-tídeos completa para os vírus mutantes 5-FU identificaram várias mutações repetidas que estavam presentes em dois ou mais vírus. Tais mutações também foram identificadas previamente durante nossa análise de vinte vírus mutantes 5-FU com um fenótipo ts mas não sp (Exemplo 1). Porque estas mutações ocorreram em vírus junto com adicionais mutações, a contribuição das repetidas mutações para os fenótipos sp, ts, e att observados permanece empírica. A Tabela 11 lista as repetidas mutações encontradas entre os 20 vírus mutantes (não sp) descritos anteriormente (Exemplo 1) e os 22 vírus mutantes sp aqui descritos. Mutações repetidas foram identificadas nos seguintes genes: duas em E, duas em NS3, cinco em NS4B, uma em NS5, e duas na UTR 3’. Interessan-temente, dentro de uma região de trinta nucleotídeos de NS4B (nt 7153-7182), existiram cinco diferentes substituições de nucleotídeos que foram verificadas existirem em dezesseis vírus. Também em nt 7.546 em NS4B, uma substituição de aminoácido (Ala Vai) foi encontrada em 10 diferentes vírus mutantes 5-FU. A significância destas mutações repetidas em NS4B assim como em outras regiões genômicas de DEN4 permanece empírica, mas uma razoável explicação para este fenômeno é que estas mutações estão envolvidas em adaptação de vírus DEN4 para eficiente crescimento em células Vero, como ainda discutido no Exemplo 6.
[00112] Discussão. Como parte de uma estratégia de vacina genética molecular, nós desenvolvemos mutações atenuantes que são imaginadas como sendo úteis no desenvolvimento de uma vacina de vírus de dengue tetravalente atenuado vivo. Especificamente, mutações que restringem replicação do vírus vacina em células de fígado humano foram geradas uma vez que há alguma virulência residual do candidato a vacina rDEN4Δ30 para o fígado de humanos. Vírus mutantes com um fenótipo sp foram buscados em ambas células Vero e HuH-7 de fígado humano, de modo a identificar-se vírus mutantes faixa-hospedeiro que foram especificamente restritos em replicação em células HuH-7 (sp em HuH-7 mas não em Vero). Tais mutações são imaginadas como sendo úteis em limitação de replicação de uma vacina candidata no fígado de vacinados enquanto preservando ambos, eficiente replicação em células Vero e imunogenicidade in vivo.
[00113] Várias observações a partir do presente estudo indicam que mutações sp conferem um fenótipo att in vivo. Isto não é surpreendente uma vez que atenuação em cérebro de camundongo jovem foi reportada para candidatos a vacina de vírus DEN vivos possuindo fenótipos sp, incluindo as linhagens de vacina DEN2 PDK-53 e DEN2 PR-159/S-1 (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, new York; Butrapet, S. et al. 2000 j Virol 74:3011-9; Eckels, K. H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80; Innis, B. L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80). Cada um dos 22 vírus mutantes 5-FU DEN4 com um fenótipo sp (alguns dos quais também foram ts) tanto em células Vero como HuH-7 manifestaram replicação restrita nos cérebros de camun-dongos. Seis vírus mutantes 5-FU com um fenótipo sp na ausência de um fenótipo ts foram mais atenuados nos cérebros de camundongos jovens que vírus mutantes com somente um fenótipo ts (Exemplo 1), indicando que o fenótipo sp especifica um maior nível de atenuação para cérebro de camundongo que o fenótipo ts. Vírus mutantes com ambos fenótipos ts e sp tiveram uma redução mesmo maior em replicação, ainda indicando que a atenuação conferida pelos fenótipos ts e sp pode ser aditiva. Importantemente, dezessete dos 22 vírus mutantes sp foram vírus mutantes sp hospedeiro-faixa, sendo sp somente em células HuH-7. Uma vez que tais mutações são imaginadas como sendo úteis em res-trição de replicação de um vírus DEN4 em células de fígado humano, nós usamos análises de seqüências de nucleotídeos para determinar as bases genéticas do fenótipo sp.
[00114] Análises da completa seqüência genômica dos 22 vírus DEN4 sp revelaram substituições na UTR 3’ assim como mutações codificantes em todos os genes exceto NS4A. Foi primeiro notado que várias mutações específicas estavam presentes em dois ou mais dos 22 vírus mutantes DEN4 sp e que muitas destas mesmas mutações também foram previamente identificadas entre o conjunto de 20 vírus mutantes DEN4 ts (Exemplo 1). Uma vez que flavivírus podem rapidamente acumular mutações durante passagem em cultura de tecido (Dunster, L.M. et al. 1999 Virology 261:309-18; Mandi, C.W. et al. 2001 J Virol 75:5627-37), muitas destas mutações super-expressadas, referidas anteriormente como mutações de adaptação de célula Vero putativas (Exemplo 1), provável-mente promovem eficiente replicação em células Vero e foram selecionadas não-intencionalmente durante a clonagem bio-lógica dos vírus mutantes. O efeito destas mutações sobre replicação de vírus DEN em células Vero, o substrato pro-posto para fabricação de vacina, é discutido no Exemplo 6.
[00115] As mutações sp identificadas entre os vírus mutantes 5-FU são imaginadas como sendo úteis em várias diferentes abordagens para o desenvolvimento de linhagens de vacinas de vírus DEN. Como descrito acima para a formação de vírus quiméricos antigênicos, uma ou mais mutações atenuantes sp são imaginadas como sendo adicionadas ao fundo genético de DEN4Δ30 para suplementar o fenótipo att da mutação Δ30. Uma segunda abordagem é para introduzir uma mutação atenuante sp, com ou sem Δ30, em clones de cDNA infecciosos dos outros três sorotipos de DEN. A habilidade de transferir mutações entre vírus geneticamente relacionados e manutenção de similares fenótipos att foi previamente demonstrada (Skiadopoulos, M.H. et al. 1999 Virology 260:125-35). Estas estratégias distintas são imaginadas como sendo úteis como abordagens separadas ou complementares para a construção de uma vacina de vírus DEN tetravalente, sublinhando a importância da identificação de um grande painel de mutações att dentro de vírus DEN.
EXEMPLO 3 Vírus DEN4 recombinantes contendo mutações identificadas em vírus mutantes 5-FU mostram replicação restrita em cérebro de camundongo jovem e em camundongo SCID transplantado com células de fígado humano
[00116] Foram apresentados dados nos Exemplos 1 e 2 gue resumem a geração, caracterização e análise de següências de 42 vírus DEN4 mutantes atenuados. Para três dos vírus mutantes (#239, 489, e 773) com uma mutação sentido-errado simples na posição nt 4995 em NS3, foi claro gue a mutação identificada especificou os fenótipos ts e att. Esta conclusão foi confirmada no Exemplo 1 por cultura de tecido e caracterização in vivo de rDEN4-4995, um vírus recombinante no gual a mutação 4995 foi introduzida por mutagênese de sítio direcionado. Nesta análise, rDEN4-4995 exibiu o mesmo nível de sensitividade a temperatura e atenuação como vírus mutantes 5-FU #239, 489, e 773. A mutação(ões) individual nos vírus mutantes 5-FU restantes gue especifica os fenótipos observados permanece a ser identificada, uma vez gue maioria destes vírus possui mais de uma substituição de nucleotídeo. Nós conduzimos uma análise para identificar as mutações em um subconjunto dos outros 39 vírus mutantes gue especificam os fenótipos ts, sp, e att através de introdução de cada mutação no wt DEN4 CDNA (p4) e avaliação dos fenótipos dos resultantes vírus DEN4 recombinantes transportando as mutações individuais. Estudos prévios de um candidato a vacina de vírus DEN2 (Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9) assim como outras vacinas de vírus (Whitehead, S.S. et al. 1999 J Virol 73:871-7) demonstraram a utilidade desta abordagem para a identificação das bases genéticas de atenuação.
[00117] Como descrito nos Exemplos 1 e 2, 19 vírus mutantes 5-FU foram identificados os guais foram verificados conterem mutações codificantes somente nos genes NS e/ou substituições de nucleotideos na UTR 5’ ou 3’ gue podem facilitar a geração de vírus quiméricos antigênicos. No presente exemplo, as bases genéticas dos fenótipos att de cérebro de camundongo e sp, ts foram identificadas para estes 19 vírus usando genética reversa para gerar vírus DEN4 (rDEN4) recombinantes contendo mutações individuais identificadas no painel de vírus mutantes DEN4. Em adição, os 19 vírus mutantes 5-FU foram avaliados para replicação em um novo modelo animal pequeno para replicação de vírus DEN4, camundongos SCID transplantados com células HuH-7 (SCID-HuH-7) e as bases genéticas dos vírus att foram identificadas usando-se vírus rDEN4 mutantes. São também apresentadas verificações descrevendo a geração e caracterização de um vírus recombinante contendo duas das mutações atenuantes identificadas assim como uma combinação de selecionadas mutações com 5-FU com a mutação Δ30.
[00118] Geração de vírus rDEN4 contendo mutações com 5-FU. Os processos usados para a geração de vírus rDEN4 são esboçados na Figura 4 e são similares àqueles descritos no Exemplo 1. Em resumo, o cDNA de p4 foi digerido com as apropriadas enzimas de restrição e os fragmentos resultantes foram subclonados em um vetor pUC119 modificado. Para mutagênese Kunkel, preparações de DNA de fita simples dos vetores pUC-NS foram feitas, e primers foram projetados para introduzir individualmente mutações que estavam presentes nos vírus mutantes 5-FU. As seqüências dos 41 oligo-nucleotídeos mutagênicos usados para geração de vírus recombinantes de mutação simples são apresentadas na Tabela 12. Primers foram projetados para co-introdução ou co-separar um sítio de enzima de restrição traducionalmente silencioso no cDNA, o que facilita grandemente a seleção e identificação de clones de cDNA possuindo a seqüência mutante. Fragmentos contendo as mutações introduzidas foram clonados de volta em p4, e análises de seqüências de nucleotídeos confirmaram a presença das alterações de nucleotídeos. Um total de 33 vírus rDEN4 foram gerados os quais contiveram cada um as mutações individuais presentes nos 19 vírus mutantes 5-FU contendo somente mutações codificantes nos genes NS e/ou substituições de nucleotídeos na UTR 5’ ou 3’. 8 vírus rDEN4 adicionais foram gerados de mutações identificadas no restante painel de 42 vírus mutantes de 5-FU.
[00119] Um clone de cDNA também foi gerado o qual combinou as mutações identificadas em posição nt 4995 em NS3 e 7849 em NS5. A mutação 7849 foi introduzida no clone de cDNA de p4-4995 através de substituição de fragmento Xmal-Pstl com aquele derivado do clone de cDNA de p4-7849. A presença de ambas mutações foi confirmada por análise de seqüência. A mutação Δ30 foi introduzida na UTR 3’ dos clones de cDNA mutantes individuais através de substituição de fragmento Mlul-Kpnl com aquele derivado do clone cDNA de p4Δ30, e a presença da supressão foi confirmada por análise de seqüências.
[00120] Vírus recombinantes foram recuperados por trans-fecção de células Vero ou C6/36 com transcritos de RNA derivados dos clones de cDNA mutantes como descrito no Exemplo 1. Vírus recuperados foram diluídos terminalmente duas vezes e estoques de trabalho de vírus foram preparados em células Vero. Cada um dos clones de cDNA mutantes foi recuperado após transfecção como esperado uma vez que os vírus mutantes 5-FU contendo estas mutações foram viáveis.
[00121] Caracterização de fenótipos ts e att dos vírus rDEN4 contendo mutações introduzidas. Dos 19 vírus mutantes 5-FU com mutações somente em genes NS e/ou a UTR 5’ ou 3’, seis tiveram um fenótipo sp (Tabela 13), dez tiveram um fenótipo ts em células Vero e HuH-7 (Tabela 14), e três tiveram um fenótipo ts somente em células HuH-7 (Tabela 15). Para os seis vírus mutantes 5-FU sp, #738, 922, 1081, 1083, 1136, e 1189, dezessete mutações identificadas por análises de seqüência resultaram em uma alteração codificante ou uma alteração de nucleotídeos na UTR e cada um foi engenheirado em um clone cDNA de DEN4 individual. Vírus contendo cada uma das mutações definidas foram recuperados com sucesso e propagados e foram testados para eficiência de formação de placa em células Vero e HuH-7 em várias temperaturas, fenótipo de tamanho de placa, e propriedades de crescimento em camundongos jovens usando-se métodos previamente descritos nos Exemplos 1 e 2.
[00122] A Tabela 13 lista os fenótipos dos seis vírus parentes mutantes 5- FU sp e aqueles dos 17 vírus rDEN4 codificando mutações simples presentes no vírus parente. Por exemplo, #1189 mutante 5-FU (parente), que foi ts e sp em ambas linhas de células e tiveram uma redução de quase 10 000 vezes em replicação em cérebro de camundongo jovem, conteve 4 mutações codificantes em posição nt 3303 em NS1, 4812 e 5097 em NS3, e 7182 em NS4B. Análises dos quatro vírus rDEN4 contendo cada uma destas mutações indicaram que rDEN4-5097 teve um fenótipo ts, sp, e att enquanto rDEN4-3303, rDEN4-4812, e rDEN4-7182 não tiveram fenótipos discerníveis, indicando que a mutação em nt 5097 foi responsável pelo fenótipo observado no #1189, parente 5-FU. Assim, análise das contribuições relativas das quatro mutações presentes no #1189 mutante 5-Fu para seu fenótipo de atenuação provê a estrutura para uma análise similar dos restantes vírus mutantes 5-FU. Esta análise demonstra especificamente os processos usados para identificação de mutações contribuindo para o fenótipo observado. Os feno-tipos ts, sp, e att de vírus parentes 5-FU #738, 922, 1081, e 1083, foram similarmente atribuídos a mutações simples 3540, 4306, 2650, e 10634, respectivamente. Entretanto, duas mutações separadas (3771 e 4891) contribuíram para os fenótipos de vírus mutante 5-FU #1136.
[00123] A Tabela 14 lista as bases genéticas da atenuação em cérebro de camundongo e ts para os dez vírus mutantes 5-FU com fenótipos ts em ambas células Vero e HuH-7. Como descrito no Exemplo 1, a mutação 4995 que é a única mutação presente em três vírus mutantes 5-FU, #239, #489, e #773, foi verificada conferir um fenótipo ts e att, confirmando as bases genéticas para os fenótipos exibidos por estes vírus. Em três experimentos separados, o vírus rDEN4-4995 foi verificado ter uma diminuição de aproximadamente 1.000 vezes em replicação nos cérebros de camundongos jovens quando comparado àquela de vírus tipo selvagem (Tabelas 6 e 14). A mutação 4995 também está presente em vírus mutantes 5-FU #473, #759, e #816, cada um dos quais tem adicionais mutações. Os fenótipos ts e att observados nestes vírus podem ser atribuídos à mutação 4995 uma vez que as mutações adicionais não mostram fenótipos discerníveis. Interessan-temente, vírus mutante 5-FU #938 tem a mutação 4995 e uma mutação adicional em nt 3442 em NS1 com ambas mutações independentemente conferindo replicação restrita em cérebro de camundongo. Os restantes três vírus parentes 5-FU na Tabela 14, #173, #509, e #1033, foram verificados, cada um, conterem uma mutação simples responsável pelo fenótipo att: 7849, 8092, e 4907, respectivamente.
[00124] Três vírus mutantes 5-FU, #686, #992, e #1175 com fenótipos ts específicos de célula HuH-7 são listados na Tabela 15. Mutações em NS3 (5695) e NS5 (10186) foram verificadas conferirem os fenótipos observados para vírus parentes #992 e #1175. Interessantemente, duas mutações em NS2A, 3575 e 4062, foram verificadas resultarem em um aumento sinergístico no nível de atenuação. Ambas mutações individuais tiveram uma diminuição de aproximadamente 100 vezes em replicação de vírus no cérebro enquanto os vírus parentes com ambas mutações tiveram uma redução de quase 10.000 vezes. A Tabela 16 lista duas mutações adicionais com um fenótipo att, 4896 e 6259 em NS3.
[00125] Replicação de vírus DEN4 em camundongos SCID transplantados com células HuH-7. Uma vez que vírus DEN replicam pobremente no fígado de camundongos e estudos correspondentes são impraticáveis de serem conduzidos em primatas não-humanos, um modelo animal que avalie o nível in vivo de replicação de vírus DEN em células de fígado foi desenvolvido baseado em um relatório recente examinando a replicação de vírus DEN em camundongos SCID transplantados com uma linha de células contínua de células de tumor de fígado humano (An, J. et al. 1999 Virology 263:70-7). Camundongos SCID transplantados com linhas de células contínuas humanas, células primárias, ou tecidos organizados foram similarmente usados para estudar-se a replicação de outros vírus que carecem de modelo animal pequeno (Mosier, D.E. 2000 Virology 271:215-9). Em nosso estudo, camundongos SCID foram transplantados com células HuH-7 uma vez que vírus DEN4 replicaram eficientemente nestas células em cultura de tecido e uma vez que estas foram as células usadas para definição de fenótipo hospedeiro- faixa. Estes estudos são imaginados como endereçando a utilidade de exame de infecção de vírus DEN em modelos de xeno-enxerto-camundongo SCID para desenvolvimento de vacina (Na, J. et al. 1999 Virology 263:70-7; Lin, Y.L. et al. 1998 J Virol 72:9729-37).
[00126] Para ainda examinar as propriedades de crescimento in vivo dos 19 vírus DEN4 mutantes 5-FU com mutações somente nos genes NS e/ou a UTR 3’ e vírus mutantes rDEN4 correspondentes selecionados, replicação foi avaliada em camundongos SCID transplantados com células HuH-7 (SCID-HuH-7). Para análises de replicação de vírus DEN4 em camundongos SCID-HuH-7, camundongos SCID de quatro a seis semanas (Tac:lcr:Ha(ICR))-Prkdcscid)(Taconic Farms) foram injetados intraperitonealmente com 107 células HuH-7 suspensas em 200 pl de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em preparação para transplante, células HuH-7 foram propagadas em cultura de células como descrito acima e colhidas por tripsinização em aproximadamente 80% de confluência. Células foram lavadas duas vezes em PBS, contadas, re-suspensas em um volume apropriado de PBS, e injetadas no peritôneo de camundongos. Tumores foram detectados no peritôneo cinco a seis semanas após transplante, e somente camundongos com tumores aparentes foram usados para inoculação. Camundongos foram infectados por inoculação direta no tumor com 104 PFU de vírus em 50 pl de Opti-MEM I. Camundongos foram monitorados diariamente por sete dias e soro para titulação de vírus foi obtido por entalhe de cauda no dia 6 e 7. Aproximadamente 400 pl de sangue foram coletados em um tubo separador de sangue (Sarstedt, Germany), centrifugados, e soro foi feito em alíquotas e estocado a -70°C. O título de vírus foi determinado por ensaio de placa em células Vero. Sete dias após infecção, maioria de camundongos desenvolveu morbidez e todos os camundongos foram sacrificados. Tumores foram excisados e pesados para confirmar uniformidade dos grupos experimentais.
[00127] Experimentos preliminares indicaram que camun-dongos SCID- HuH-7 inoculados com DEN4 2A-13 diretamente no tumor desenvolveram viremia com níveis máximos (até 8,0 logioPFU/ml soro) obtidos no dia 5 (Tabela 17). Vírus também podem ser detectados no cérebro, fígado e homogenatos de tumor.
[00128] O nível de viremia em camundongos SCID-HuH-7 infectados com vírus mutantes rDEN4 ou 5-FU parenteral foi comparado com aquele do vírus controle passado em paralelo, 2A-13, ou rDEDN4, respectivamente. Resultados de 4 experi-mentos separados indicaram que o candidato a vacina, rDEN4Δ30, teve uma redução de quase 10 vezes em replicação de vírus comparado a rDEN4 tipo selvagem (Tabela 13) o que reflete a aparente atenuação do candidato a vacina rDEN4Δ30 em humanos (Exemplo 8). Resultados nas Tabelas 13 a 15 indicam que tr~es vírus mutantes 5-FU tiveram uma redução maior que 100 vezes em viremia nos camundongos SCID-HuH-7 comparados a vírus 2A-13 tipo selvagem: #1081, #1083, e #1189. O fenótipo comum entre estes vírus foi um fenótipo sp em células HuH-7. Análises das bases genéticas do fenótipo att nestes vírus mutantes 5-FU parentes identificaram três mutações individuais em NS1, NS3, e a UTR 3’ que conferiram pelo menos uma redução de 100 vezes em viremia. Especifi-camente, rDEN4-2650 (NS1), rDEN4-5097 (NS3), e rDEN4-10634 (UTR 3’) manifestaram uma redução de 2,2, 3,6, e 4,3 logioPFU/ml em título de pico de viremia comparado a rDEN4, respectivamente. Estas mutações também conferiram o fenótipo att em cérebro de camundongos jovens. Vírus mutantes 5-FU #738 e #509 tiveram uma redução em viremia no camundongo SCID-HuH-7 comparado a 2A-13 tipo selvagem de 1,9 a 1,5 logioPFU/ml, respectivamente, e as bases genéticas para estes fenótipos são imaginadas como sendo avaliadas em uma base empírica.
[00129] Esta análise das bases genéticas dos fenótipos especificados pelas mutações nos vírus mutantes 5-FU que manifestaram replicação restrita em camundongos SCID-HuH-7 indicaram que (1) três mutações separadas conferiram o fenótipo att; (2) estas mutações foram localizadas em duas proteínas, NS1 e NS3, e na UTR 3’; (3) estas três mutações foram inteiramente responsáveis por cada uma dos fenótipos de culturas de células (ts ou sp) e in vivo (atenuação em cérebro de camundongo e camundongo SCID-HuH-7) dos vírus parentes; e (4) duas das três mutações especificam o fenótipo sp hospedeiro-faixa (sp somente sobre HuH-7) e por isso são imaginadas como sendo úteis em um vírus vacina. Embora a relevância de tais modelos de transplante-SCID para replicação de vírus e doença em humanos seja desconhecida, a identificação de três novas mutações que restringem replicação de vírus DEN4 em camundongo SCID-HuH-7 é imagi-nada como facilitando um exame da correlação entre o fenótipo att em camundongos SCID- HuH-7 com aquele em macacos rhesus ou humanos. Tais mutações, especificamente as muta-ções sp hospedeiro-faixa, são imaginadas como sendo úteis em conjunção com a mutação Δ30 ou outra para diminuir a virulência residual de rDEN4Δ30 ou outro vírus de dengue o fígado humano, e estudos são imaginados como sendo conduzidos para construção de tais vírus rDEN4 e avaliam os mesmos em macacos e humanos (Exemplo 8).
[00130] Combinação de duas mutações 5-FU em um fenótipo ts aditivo. A habilidade de combinar mutações individuais em vírus rDEN4 como um meio para modular o fenótipo do resultante vírus mutante duplo é uma maior vantagem de uso de tecnologia de cDNA recombinante para gerar ou modificar candidatos a vacina de virus de dengue. Adição de múltiplas mutações ts e att a vírus vacina recombinante é imaginada como aperfeiçoando a estabilidade fenotipica do recombinante duplo devido à diminuída possibilidade de co-reversão das duas mutações para virulência tipo selvagem (Crowe, J.E.Jr. et al. 1994a Vaccine 12:783-790; Skiadopoulos, M. H. et al. 1998 J Virol 72:1762-8; Subbarao, E.K. et al. 1995 J Virol 69:5969-5977; Whitehead, S.S. et al. 1999 J Virol 73:871-7). As mutações identificadas em posição nt 4995 em NS3 e 7849 em NS5 foram combinadas em um único clone de cDNA p4 e um vírus recombinante, designado rDEN4-4995-7849, foi recuperado e avaliado para seus fenótipos ts e att (Tabela 18). rDEN4-4995-7849 foi mais ts que qualquer vírus recombinante contendo as mutações individuais (Tabela 18), indicando o efeito aditivo das duas mutações ts. O vírus rDEN4-4995-7849 teve uma redução em replicação de mais que 10 000 vezes nos cérebros de camundongos jovens. A redução em replicação do vírus mutante duplo foi somente levemente aumentada acima daquela de rDEN4-7849, entretanto, uma diferença no nível de replicação entre rDEN4-4995-7849 e rDEN4-7849 pode ser de difícil deteção uma vez que o nível de replicação de ambos vírus foi próximo do limite inferior de deteção (2,OlogioPFU/g de cérebro).
[00131] Combinação de mutações 5-FU selecionadas com a mutação Δ30 confere aumentada atenuação de rDEN4A30 para os cérebros de camundongos jovens. Para definir o efeito de adição de mutações individuais ao fundo de rDEN4Δ30 atenuado, cinco combinações foram construídas: rDEN4Δ30-2650, rDEN4Δ30-4995, rDEN4Δ30-5097, rDEN4Δ30-8092 e rDEN4Δ30-10634. Adição de tais mutações de sentido errado com vários fenótipos ts, sp, e att é imaginada como servindo para diminuir a genicidade de reação de rDEN4Δ30 enquanto mantendo suficiente imunogenicidade.
[00132] A mutação Δ30 foi introduzida na UTR 3’ dos clones cDNA mutantes individuais através de substituição de frag-mento Mlul-Kpnl com aquele derivado do clone CDNA p4Δ30, e a presença da supressão foi confirmada por análise de seqüência. Vírus recombinantes foram recuperados por transfecção em células C6/36 para cada vírus rDEN4. Entre-tanto, com diluição terminal e passagem, o vírus rDEN4Δ30 foi verificado não crescer a um título suficiente em células Vero e não foi ainda perseguido. Isto é um exemplo de um cDNA onde a mutação 5-FU e a mutação Δ30 não são compatíveis para eficiente replicação em cultura de células. Para iniciar o processo de avaliação de fenótipos in vivo dos outros quatro vírus que replicaram eficientemente em cultura de células, vírus rDEN4 contendo as mutações individuais e as correspondentes combinações rDEN4Δ30 foram testados juntos para níveis de replicação em cérebro de camundongo jovem. Os resultados na Tabela 19 indicam que adição de cada uma das mutações confere um aumentado nível de atenuação em crescimento sobre o vírus rDEN4Δ30, similar ao nível conferido pela mutação 5-FU individual. Nenhum efeito siner-gístico em atenuação foi observado entre as mutações em sentido errado e Δ30. Estes resultados indicam que as mutações em sentido trocado em nucleotideos 2650, 4995, 8092 e 10634 são compatíveis com Δ30 para crescimento em cultura de células e in vivo e ainda podem atenuar o vírus rDEN4Δ30 em cérebro de camundongo. Ainda estudos em camundongos SCID-HuH-7, macacos rhesus, e humanos são imaginados como estabelecendo o efeito da combinação de mutações individuais e Δ30 sobre atenuação e imunogenicidade (Exemplo 8).
[00133] Através de identificação de específicas mutações nos vírus mutantes 5-FU que conferem os fenótipos obser-vados, um menu de definidas mutações ts, sp, e att é imaginado como sendo montado (ver exemplo 7). Numerosas combinações de duas ou mais destas mutações são imaginadas como sendo selecionadas com ou sem a mutação Δ30. Tais mutações e suas combinações são imaginadas como sendo úteis para a construção de vírus recombinantes com vários níveis de atenuação in vivo, assim facilitando a geração de vacinas candidatas com aceitáveis níveis de atenuação, imunogeni-cidade, e estabilidade genética.
EXEMPLO 4 Geração de vírus mutantes DEN4 com fenótipos de sensitividade à temperatura e atenuação em camundongo através de mutagênese de carga- agrupamento-para-alanina
[00134] Os exemplos anteriores descreveram a criação de um painel de vírus mutantes DEN4 com fenótipos ts, sp e att obtidos através de mutagênese com 5-FU. Como indicado nestes Exemplos, as mutações atenuantes identificadas nos vírus mutantes 5-FU são imaginadas como tendo vários usos incluindo (1) sintonia fina de nível de atenuação de candidatos a vacina de vírus de dengue existentes e (2) geração de novos candidatos a vacina através de combinação de duas ou mais destas mutações atenuantes. No exemplo atual, nós criamos um segundo painel de vírus mutantes através de mutagênese de carga-agrupamento-para-alanina do gene NS5 de DEN4 e examinamos os resultantes vírus mutantes para fenótipos ts, sp, e att como descrito nos exemplos 1 e 2. Os vírus mutantes de carga-agrupamento- para-alanina recuperados demonstraram uma faixa de fenótipos incluindo ts em células Vero sozinhas, ts em células HuH-7 sozinhas, ts em ambos os tipos de células, att em cérebros de camundongos jovens, e att em camundongo SCID-HuH- 7.
[00135] A utilidade de vírus mutantes expressando estes fenótipos já foi descrita, entretanto, vírus mutantes de carga-agrupamento-para-alanina possuem algumas características desejáveis adicionais. Primeiro, as mutações relevantes são imaginadas como sendo projetados para uso nos genes codificando as proteínas não-estruturais de DEN4, e por isso são imaginadas serem úteis para atenuação de recombinantes quiméricos antigênicos de DEN3 possuindo um fundo de vetor DEN4. Segundo, o fenótipo é usualmente especificado por três ou mais mudanças de nucleotídeos, tornando a probabilidade de reversão da seqüência mutante para aquela da seqüência de tipo selvagem menos que para uma mutação de ponto simples, tais como mutações identificadas no painel de vírus mutantes 5-FU. Finalmente, mutações atenuantes carga-agrupamento-para-alanina são imaginadas como sendo facilmente combináveis entre elas mesmas com outras mutações atenuantes para modificação de fenótipo de atenuação de candidatos de vacina DEN4 ou de vírus recombinantes quiméricos antigênicos DEN1, DEN2, e DEN3 possuindo um fundo de vetor DEN4.
[00136] Mutagênese de carga-agrupamento-para-alanina. O p4 cDNA, a partir do qual vírus mutantes e tipo selvagem recombinantes foram gerados, foi descrito nos Exemplos 1, 2 e 3 e na Figura 4. Mutagênese de carga-agrupamento- para-alanina (Muylaert, I.R. et al. 1997 J Virol 71:291-8), onde pares de aminoácidos carregados são substituídos com resíduos de alanina, foi usada para mutagenizar individualmente a seqüência codificante para 80 pares de aminoácidos carre-gados contíguos no gene NS5 de DEN4. Subclones apropriados para mutagênese foram derivados do plasm ideo DEN4 de inteiro comprimento (p4) através de digestão com Xmal/Pstl (pNS5A), Pstl/Sacll (pNS5B) ou Sacll/MIul (pNS5C) nas posições de nucleotídeos indicadas nas Figuras 4. Estes fragmentos foram então subclonados e mutagênese Kunkel foi conduzida como descrito em Exemplos 1 e 3. Para criar cada mutação, oligonucleotídeos foram designados para alteração de seqüência de pares individuais de códons para GCAGCX (SEQ ID NO: 69), pelo que substituindo os mesmos com dois códons alanina (GCX) e também criando um sítio de restrição Bbvl (GCAGC) (SEQ ID NO: 70). O sítio Bbvl foi adicionado para facilitar seleção de cDNAs e vírus recombinantes para a presença da seqüência mutante. Fragmentos de enzima de restrição transportando as mutações alanina foram clonados de volta no plasmídeo p4 de inteiro-comprimento como descrito nos Exemplos 1 e 3.
[00137] Avaliação inicial do fenótipo dos 32 vírus mutantes carga- agrupamento-para-alanina revelou uma faixa em restrição de replicação em cérebro de camundongo jovem e camundongos SCID-HuH-7. Para determinar se atenuação pode ser aperfeiçoada através de mutações combinantes, vírus mutantes duplos transportando dois pares de mutações carga-agrupamento-para-alanina foram criados por troca de apropriados fragmentos carreando um par de mutações em um cDNA de p4 previamente mutagenizado carreando um segundo par de mutações em um diferente fragmento usando técnicas conven-cionais de clonagem.
[00138] Transcrição e Transfecção. Transcritos capeados-5’ foram sintetizados in vitro a partir de moldes de CDNA mutagenizado usando AmpliCap SP6 RNA polymerase (Epicentre, Madison, Wl). Misturas de transfecção, consistindo em 1 pig de transcrito em 60 pl de HEPES/salina plus 12 pl de dioleoil trimetil amónio propano (DOTAP)(Roche Diagnostics Corp., Indianápolis, IN), foram adicionados junto com 1ml de meio isento de soro de produção de Vírus (VP-SFM) para monocamadas subconfluentes de células Vero em placas de 6 cavidades. Monocamadas transfectadas foram incubadas a 35°C por aproximadamente 18 horas, meio de cultura de células foi removido e substituído com 2ml de VP-SFM, e monocamadas de células foram incubadas a 35°C. Após 5 a 6 dias, meio de cultura de células foi coletado, e a presença de vírus foi determinada por titulação em células Vero seguida por formação de mancha com imuno peroxidase como descrito anteriormente. Vírus recuperados foram amplificados por uma adicional passagem em células Vero, e suspensões de vírus foram combinadas com estabilizador SPG (sucrose-fosfato-glutamato) (concentração final: 218 mM sucrose, 6 mM ácido L- glutâmico, 3,8 mM fosfato de potássio, monobásico, e 7,2mM fosfato de potássio, dibásico, pH 7,2), feitas alíquotas, congeladas sobre gelo seco, e estocadas a - 70°C.
[00139] Construções de cDNA não rendendo vírus após transfecção de células Vero foram usadas para transfectar células C6/36 como se segue. Misturas de transfecção, como descritas acima, foram adicionadas, junto com 1ml de MEM contendo soro fetal bovino 10% (FBS), L-glutamina 2mM, aminoácidos não- essenciais 2mM, e gentamicina 0,05 mg/ml, a monocamadas de células C6/36. Monocamadas de células transfectadas foram incubadas a 32°C por 18 horas, meio de cultura de células foi removido e substituído com 2ml de meio novo, e monocamadas de células foram incubadas a 32°C. Após 5 a 6 dias, meios de cultura de células foram então usados para infetar células Vero e incubados por 5-6 dias, em cujo tempo meios de cultura de células foram coletados, congelados e titulados como descrito acima.
[00140] Vírus recuperados foram clonados biologicamente através de dois rounds de diluição terminal em células Vero seguidos por uma adicional amplificação em células Vero. Em resumo, vírus foi inicialmente diluído para uma concentração de aproximadamente 20 PFU/ml em VP-SFM e então submetidos a uma série de diluições duas vezes através de uma placa de 96 cavidades. Diluições de vírus foram usadas para infectar monocamadas de células Vero em uma placa de 96 cavidades e incubadas por 5 a 6 dias a 35°C. Seguindo incubação, meios de cultura foram removidos e temporariamente estocados a 4°C, e as monocamadas de células positivas-vírus foram identificadas através de formação de mancha de imuno peroxidase. Diluição terminal foi obtida quando < 25°C de monocamadas de células foram positivas para vírus. Meio de cultura de células a partir de uma monocamada positiva na diluição terminal foi submetido a um round adicional de diluição terminal. Seguindo a segunda diluição terminal, vírus foi amplificado em células Vero (frasco de 75cm2), coletado e congelado como descrito anteriormente.
[00141] Ensaios para sensitividade a temperatura e atenuação em camundongo. Ensaio do nível de sensitividade a temperatura dos vírus mutantes carga-cluster-para-alanina em células Vero e HuH-7 e seu nível de replicação no cérebro de camundongos jovens foram conduzidos como descrito no Exemplo 1 e ensaio do nível de replicação em camundongos SCID-HuH-7 foi conduzido como descrito no Exemplo 3.
[00142] Vírus mutantes carga-agrupamento-para-alanina são viáveis e mostram fenótipos de atenuação em camundongo e sensitividade a temperatura. De 80 construções de cDNA de DEN4 de inteiro comprimento contendo um par simples de mutações carga-para-alanina, vírus foram recuperados de 32 em células Vero ou C6/36 (Figura 5). O nível de sensitividade a temperatura de wt rDEN4, rDEN4Δ30, e os 32 vírus mutantes é resumido na Tabela 20. Um vírus mutante (645-646) foi ts em células Vero mas não em células HuH-7 e 7 vírus mutantes foram ts em células HuH-7 mas não em células Vero. Tais mutantes cuja sensitividade a temperatura é dependente de hospedeiro-célula são referidos como mutantes hospedeiro-faixa, sensíveis a temperatura (tshr). Treze vírus mutantes foram ts em ambos tipos de células, e 11 vírus mutantes não foram ts em gualguer tipo de célula. Assim um total de 21 vírus mutantes foram ts com 8 vírus mutantes exibindo uma especificidade tshr. Nenhum dos vírus mutantes mostrou um fenótipo de placa peguena em temperatura permissível. Vírus mutantes mostraram uma ampla faixa (0 a 10.000 vezes) de replicação restrita em cérebro de camundongo jovem (Tabela 20). Quatorze vírus mutantes foram atenuados em cérebro de camundongo jovem, arbitrariamente definido como uma redução de > 1,5 logw-unidades em título de vírus. Não houve correlação entre atenuação em cérebro de camundongo e sensitividade de temperatura em células Vero (correlação Kendall Rank: P=0,77) ou células HuH-7(correlação Kendall Rank: P=0,06).
[00143] Treze vírus mutantes que tanto mostraram um fenótipo att em cérebro de camundongo jovem ou cujo par de aminoácidos carregado não-mutado foi altamente conservado entre os quatro sorotipos de DEN (ver Exemplo 7) foram ensaiados para att em camundongos SCID-HuH-7 (Tabela 21). Três destes vírus mutantes mostraram diminuição >100 vezes em replicação em relação a DEN4 tipo selvagem. No total, redução log média a partir de tipo selvagem em camundongos jovens não mostra significante correlação com redução log média em camundongos SCID-HuH-7 (correlação de classificação Spearman, N=13, P=0,06). Entretanto, vírus mutantes 200-201 foram incomuns em que mostraram um alto nível de restrição em camundongos SCID-HuH-7 mas pequena restrição em cérebro de camundongo jovem. Quando vírus 200-201 foi removido da análise, restrição de replicação em camundongos jovens e SCID-HuH-7 mostrou uma significante correlação (correlação de classificação Spearman, N=12, P=0,02).
[00144] Combinação de mutações carga-agrupamento-para-alanina presentes em dois vírus em um vírus pode aperfeiçoar seus fenótipos ts e att. Seis mutações emparelhadas foram combi-nadas em quatorze vírus mutantes par-duplo, dos quais seis podem ser recuperadas em células Vero ou C6/36 (Tabela 22). Todas as mutações emparelhadas individuais usadas em vírus mutantes de par-duplo foram ts sobre células HuH-7, nenhuma foi ts em células Vero, e para todas as combinações pelo menos um par de mutações conferiu um fenótipo att em cérebro de camundongo jovem. Avaliação de quatro do vírus mutantes de par-duplo (Tabela 23) revelou que combinação de pares de mutação carga-agrupamento-para-alanina resultou na aquisição de um fenótipo ts em células Vero (4 de 4 vírus) e freqüentemente resultou em uma temperatura de interrupção diminuída em células HuH-7 (3 de 4 vírus). Em metade dos vírus ensaiados, combinação de pares de mutações carga-agrupamento-para-alanina resultou em aperfeiçoada restrição de replicação (10 vezes maior que qualquer mutação componente ) em cérebro de camundongo jovem (Tabela 23) e em camundongos SCID-HuH-7 (Tabela 24).
[00145] Resumo. A maior utilidade de mutações carga-agrupamento-para- alanina origina-se de seu desenho: elas são localizadas na região de gene não- estrutural de DEN4 e por isso são imaginadas como sendo úteis para atenuação do próprio DEN4 assim como vírus quiméricos antigênicos possuindo a região de gene NS de DEN4. Além disso, elas são previstas serem fenotipicamente mais estáveis que os vírus mutantes de substituição de nucleotídeo simples tais como os vírus mutantes 5-FU. Finalmente, combinações de mutações são imaginadas como sendo criadas de modo a sintonizar fino atenuação e para ainda estabilizar fenótipos de atenuiação.
EXEMPLO 5 Identificação e caracterização de vírus mutantes DEN4 restritos em replicação em mosquitos SEÇÃO 1. Identificação de vírus mostrando restrição de replicação em mosquitos
[00146] Em exemplos 1 e 4, vírus mutantes DEN4 foram gerados através de mutagênese com 5-FU e mutagênese de carga-agrupamento-para-alanina, respectivamente, de modo a identi-ficar-se mutações que conferem fenótipos ts, sp e att. Um outro fenótipo altamente desejável de uma vacina de vírus de dengue é crescimento restrito no mosquito hospedeiro. Um candidato de vacina de vírus de dengue não deve ser transmissível de humanos para mosquitos de modo a prevenir ambas, a introdução de um vírus de dengue em um ambiente no qual ele correntemente não é endêmico e para prevenir a possível perda do fenótipo de atenuação durante prolongada replicação em um hospedeiro mosquito individual. Perda do fenótipo de atenuação também pode ocorrer seguindo trans-missão sustentada entre humanos e mosquitos. Recentemente, perda de atenuação de uma vacina de vírus de pólio atenuado vivo foi vista seguindo transmissão sustentada entre humanos (CDC 2000 MMWR 49:1094).
[00147] No presente exemplo, um painel de 1248 vírus mutantes DEN4 gerados através de mutagênese com 5-FU e 32 vírus mutantes DEN4 gerados através de mutagênese de carga-agrupamento-para-alanina foram ensaiados para crescimento restrito em células de mosquitos. Este é um ensaio preliminar útil para restrição in vivo, uma vez que restrição em células de mosquito cultivadas é freqüentemente, embora nem sempre, associada com pobre infectividade para mosquitos (Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). Vírus mutantes que mostraram restrição em células de mosquitos e crescimento robusto em células Vero (o substrato para desenvolvimento de vacina, como discutido no Exemplo 6) foram alvejados para ainda caracterização.
[00148] Geração e caracterização do mutante 5-1A1. A geração e isolamento do painel de 1248 vírus mutantes 5-FU e o painel de 32 vírus mutantes carga-agrupamento-para-alanina foram descritas nos Exemplos 1, 2, e 4. Células Vero e C6/36 foram mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00149] Cada um dos 1248 vírus mutantes 5-FU e 32 vírus mutantes carga-agrupamento-para-alanina foi titulado em monoca-madas de células C6/36 em placas de 24 cavidades a 32°C e CO2 5%. Após 5 dias, placas foram imuno- coloridas com anticorpo policlonal coelho anti-DEN4 e contados como descrito nos Exemplos anteriores. Vírus mutantes foram ensaiados para um de dois fenótipos indicando crescimento restrito em células de mosquitos: tanto sp em células C6/36 em relação a células Vero como uma diminuição de >3,5 logio PFU/ml em título entre células Vero e C6/36 na temperatura permissível para cada tipo de célula. Dois vírus mutantes, um gerado por mutagênese com 5-FU (#5) e um gerado por mutagênese de carga-agrupamento-para-alanina (rDEN4-356,357), mostraram reduzido tamanho de placa em células C6/36. Após três diluições terminais, o mutante 5-FU #5, designado 5-1A1, manteve o fenótipo de tamanho de placa reduzido. Adicio-nalmente, vírus recombinante rDEN4-7546, testado para adapta-ção em célula Vero (discutido em detalhes no Exemplo 6) tam-bém mostrou reduzido tamanho de placa em C6/36 (Figura 10).
[00150] As cinéticas de crescimento multiciclos de ambos 5-1A1 e o rDEN4 tipo selvagem recombinante em células C6/36 foram determinadas como descrito no Exemplo 1. Resumida-mente, células foram infectadas em triplicate em uma multiplicidade de infecção de 0,01 e amostras foram colhidas em intervalos de 24 horas. Amostras foram congeladas instantaneamente e tituladas em um ensaio simples em monocamadas de células Vero.
[00151] Infecção oral de mosquitos. Aedes aegypti é um dos vetores primários de vírus de dengue (Gubler, D.J. 1998 Clin Microbiol Ver 11:480-96). Esta espécie foi criada a 26°C e 80% de umidade relativa (RH) com um ciclo de luz diária de 16 horas. Adultos foram deixados em acesso contínuo a uma almofada de algodão encharcada com uma solução de sucrose 10%. Aedes aegypti fêmeas de cinco a dez dias que foram privadas de uma fonte de açúcar por 48 horas foram alimentadas com uma refeição de sangue consistindo em volumes iguais de células vermelhas de sangue humano lavadas, solução de sucrose 10%, e suspensão de vírus de dengue. A refeição de sangue infectada foi preparada imediatamente antes de alimentação e oferecida a mosquitos em um alimentador encamisado com água coberto em parafilme estirado e pré-aquecido a 38°C (Rutledge, L. C. et al. 1964 Mosquito News 24:407-419). Mosquitos que tomaram uma refeição de sangue completa dentro de 45 minutos foram transferidos para um novo recipiente por aspirador e mantidos como descrito acima. Após 21 dias, mosquitos foram estocados a 20°C até dissecação.
[00152] Inoculação intra-toráxica de mosquitos. O mosquito Toxorhynchites splendens grande, não-hematófago, é um hospedeiro sensível para determinação de infectividade de vírus de dengue. Esta espécie foi criada a 24°C e 75% de RH com um ciclo de luz do dia de 12 horas. Larvas e pupas foram alimentadas sobre larvas de Aedes de tamanho apropriado; adultos foram deixados ter acesso contínuo a uma almofada de algodão encharcada em uma solução de sucrose 10%. Grupos de T. splendens adultos de um a dez dias foram imobilizados por imersão de seus recipientes em um banho de água gelada e inoculados intra- toraxicamente com vírus não-diluído e diluições seriais de dez vezes de vírus em 1X PBS. Vírus foi inoculado em uma dose de 0,22(11 usando um microinjetor de Harvard Appasratus (Medicai Systems Corp, Greenvale NY) e uma agulha de vidro calibrada (esta técnica é uma modificação do processo descrito em Rosen and Gubler, 1974).
[00153] Deteção de antígeno virai em corpo e tecidos de cabeça através de ensaio de imunofluorescência (IFA). Preparações de intestino médio e cabeça de Aedes aegypti e preparações de cabeça de Toxorrhynchites splendens foram feitas sobre lâminas de vidro como descrito em Sumanochitraon et al. (Sumanochitrapon, W. et al. 1998 Am J Trop Med Hyg 58:283-6). Lâminas foram fixadas em acetona por 20 minutos, e colocadas a 4°C até processadas por IFA. O anticorpo primário, fluido de áscites de camundongo hiper-imune específico para DEN4 (HMAF), foi diluído 1/100 em PBS-Tween 20 (0,05%). Lâminas foram incubadas a 37°C em uma câmara úmida por 30 minutos, e subseqüentemente rinsadas em PBS-Tween 20. O anticorpo secundário, IgG anti-camundongo cabra conjugada FITC (KPL, Gaithersburg, MD), foi diluído 1/200 em PBS-Teen 20 com azul de Evan 0,002%. Lâminas foram vistas sobre um microscópio Olympus BX60. A dose infecciosa requerida para infectar 50% dos mosquitos (IDso) foi determinada pelo processo de Reed and Muench (Reed, L.J. &Muench, H. 1938 Am J Hyg 27:493-497). Para infecções de Aedes aegypti, dois valores de OIDso dose infecciosa oral 50) foram calculados para cada vírus: a OIDso requerida para produzir uma infecção no intestino médio, com ou sem disseminação para a cabeça, e a OIDso requerida para produção de infecção disseminada. Para Tx. Splendens um valor MIDso (dose infecciosa de mosquito 50) foi calculado.
[00154] Análise estatística. A porcentagem de mosquitos infectados por diferentes vírus foi comparada usando-se análise de regressão logística (Statview, Abacus Inc.).
[00155] Mutações restringindo crescimento de DEN4 em células de mosquitos mas não células Vero são raras. De 1280 vírus mutantes ensaiados inicialmente, somente dois, #5 e rDEN4-356,357, mostraram tamanho de placa reduzido em células C6/36 e tamanho de placa normal em células Vero. Um vírus adicional, rDEN4-7546 (descrito no Exemplo 6), com reduzido tamanho de placa em C6/36 foi detectado em ensaios subseqüentes. Vírus mutantes #5 foram clonados através de três diluições terminais sucessivas e designados 5-1A1; rDEN4-7546 e rDEN4-356,357 já foram diluídos terminalmente duas vezes quando foram testados em células C6/36. Vírus 5-1A1 foram extensivamente caracterizados e seus fenótipos são descritos em detalhes na seção seguinte. RDEN4-356,357 e rDEN4- 7546 são imaginados como sendo caracterizados em uma maneira similar.
[00156] Tamanho de placa e cinéticas de crescimento de 5-1A1. 5-1A1 replicou para 6,7logioPFU/ml em células Vero com tamanho de placa normal e replicou para 7,6logioPFU/ml em células C6/36 com tamanho de placa pequeno (Figura 6, Tabela 25). Em comparação, DEN tipo selvagem usado como um controle simultâneo replicou para 7,3logio PFU/ml em células Vero, 8,3logioPFU/ml em células C6/36, e mostrou tamanho de placa normal em ambos tipos de células (Figura 6, Tabela 25). As cinéticas de crescimento de 5-1A1 foram comparadas àquelas de DEN4 tipo selvagem através de infecção de células C6/36 em uma MOI de 0,01 e monitorando a produção de vírus infeccioso. As cinéticas e magnitude de replicação de 5-1A1 em células C6/36 foram comparáveis àquelas de DEN4 tipo selvagem (Figura 7).
[00157] 5-1A1 é restrito em sua habilidade de infectar mosquitos. 5-1A1 foi avaliado para sua habilidade de infectar mosquitos Aedes aegypti através de uma refeição de sangue artificial (Tabela 26). Neste ensaio a habilidade de infectar o intestino médio do mosquito e a habilidade para uma infecção de intestino médio disseminar para a cabeça são medidas separadamente. A dose infecciosa oral 50 (OIDso) de DEN4 tipo selvagem para o intestino médio foi 3,3logioPFU; a OIDso de DEN4 tipo selvagem para uma infecção disseminada foi 3,9logioPFU. Em contraste, 5-1A1 nunca infectou 50% de mosquitos nas doses usadas. De modo a calcular-se a OIDso para infecções de intestino médio por 5-1A1, foi assumido que em uma dose 10 vezes maior, 100% de 25 mosquitos tornaram-se infectados. Usando esta assunção, a estimativa conservadora da OIDso para infecções de intestino médio por 5-1A1 foi > 3,9 logio PFU. Devido 5-1A1 produzir somente 3 infecções disseminadas, nós não tentamos calcular uma OIDso para esta categoria. 5-1A1 foi significantemente restrito em sua habilidade de infectar o intestino médio em relação a DEN4 tipo selvagem (regressão logística, N=150, P<0,001). Adicionalmente, 5-1A1 produziu muito poucas infecções disseminadas, mas devido a baixos números este resultado não foi suscetível a análise estatística.
[00158] 5-1A1 também foi significantemente restrito em sua habilidade de infectar Tx. Splendens seguindo inoculação intra-toráxica (Tabela 27). A MIDso de DEN4 tipo selvagem foi 2,3 logw PFU enquanto a MIDso de 5-1A1 foi estimada ser > 3,0 logw PFU (regressão logística, N=36, P<0,01).
[00159] 5-1A1 não mostra um fenótipo ts ou att. 5-1A1 foi testado para sensitividade a temperatura em células Vero e HuH-7 para a atenuação em cérebros de camundongo jovem como descrito no Exemplo 1. O vírus mutante não foi sensível a temperatura, como definido no Exemplo 1, e não foi atenuado em cérebro de camundongo jovem (Tabela 25).
[00160] Identificação e confirmação da mutação responsável pelo fenótipo de 5-1A1. A seqüência de nucleotideos do inteiro genoma de 5-1A1 foi determinada como descrito no Exemplo 1. Seqüenciamento de 5-1A1 revelou três mudanças a partir da seqüência tipo selvagem:duas mutações de ponto translacionalmente silenciosas nas posições 7359 e 9047, e uma mutação de ponto codificante (C para U) na posição 7129 no gene NS4B que resultou em uma substituição de prolina para leucina.
[00161] Para confirmar formalmente o efeito da mutação C7129U, a mutação foi inserida no cDNA p4, que foi descrito nos Exemplos 1,2, e 3 e na Figura 4, usando mutagênese Kunkel como descrito nos Exemplos 1 e 3. O cDNA mutagenizado foi transcrito e transfectado como descrito no Exemplo 3, e o vírus resultante, após duas diluições terminais, foi designado rDEN4-7129-1A. Como 5- 1A1, rDEN4-7129-1A mostrou tamanho de placa normal e título em células Vero e reduzido tamanho de placa e título normal em células C6/36 (Tabela 25). rDEN4- 7129-1A não foi ts sobre células Vero ou HuH-7 e não foi att em cérebro de camundongo jovem. Adicionalmente, rDEN4-7129-1A não mostra o fenótipo att SCID-HuH-7 descrito no Exemplo 3 (Tabela 25). A habilidade de rDEN4-7129-1A infectar mosquitos é imaginada como sendo testada em ambos Ae.Aegypti e Tx.Splendens.
[00162] Para testar a compatibilidade da mutação C7129U e a supressão Δ30, a mutação C7129U foi inserida em rDEN4Δ30 usando técnicas descritas anteriormente. O vírus resultante, designado rDEN4Δ30-7129, é imaginado como sendo testado para os fenótipos listados na Tabela 25.
[00163] Em resumo, três vírus mutantes, 5-1A1, rDEN4-356,357 e rDEN4- 7546, mostraram uma particular combinação de fenótipos caracterizados por tamanho de placa normal e replicação para altos títulos em células Vero e tamanho de placa pequeno mas crescimento irrestrito em células de mosquitos. 5-1A1 foi ainda caracterizado e careceu de sensitividade à temperatura em células Vero ou HuH-7 e mostrou níveis normais de replicação em cérebro de camundongo e em camundongo SCID-HuH-7 e restrita infecti-vidade para ambos mosquitos Ae.Aegypti e Tx.Splendens. Em comparação a rDEN4 tipo selvagem, o mutante 5-1A1 teve uma mutação codificante: uma mutação de ponto (C para U) em nucleotídeo 7129 em NS4B resultando em uma substituição de pro com Leu. Porque 5-1A1 contem somente uma mutação sentido trocado simples, o fenótipo deste vírus mutante pode ser atribuído ao efeito da mutação na posição 7129. Estes resultados indicam que a mutação 7129 é responsável pelo fenótipo de diminuída infectividade para mosquitos e é prevista ser útil para restringir replicação de candidatos a vacina em mosquitos. Para confirmar isto formalmente, nós inserimos a mutação 7129 em um vírus DEN4 recombinante. O vírus resultante, designado rDEN4-7129-1A, uma ausência de fenótipos ts e att similar a 5-1A1. Ele é imaginado como sendo testado para infectividade de mosquito.
[00164] A mutação 7129 é uma mutação de ponto valiosa para incluir em um candidato a vacina de DEN4 e em cada um dos candidatos a vacina quimérica antigênica de vírus de dengue uma vez que sua atividade biológica é específica de hospedeiro, isto é, ela é restrita em replicação em mosquitos mas não em mamíferos. Além disso, como discutido no Exemplo 3, a mutação 7129 também foi mostrada aperfeiçoar replicação em células Vero. Assim, sua inserção em um candidato a vacina é imaginada co mo aperfeiçoando produção de vacina em cultura de tecido sem afetar as propriedades biológicas especificadas por outras mutações atenuantes. É também imaginada como provendo uma salva-guarda útil contra transmissão a mosquito de uma vacina de vírus de dengue.
SEÇÃO II. Desenho de mutações para restrição de replicação em mosquitos
[00165] Na Seção 1 de exemplo 5, nós selecionamos um grande painel de vírus mutantes carreando mutações randô-micas (geradas com 5-flúor uracila) e mutações específicas (geradas através de mutagênese de carga-agrupamento-para- alanina) para crescimento restrito em células C6/36, uma medida substituta para restrição em mosquitos. Entretanto, em nenhum caso mutações foram projetadas para o específico propósito de restringir replicação em mosquitos. Nesta seção, nós identificamos seqüências de nucleotídeos na UTR 3’ que mostram diferenças conservadas entre os flavivírus transmitidos por carrapatos e transmitidos por mosquitos. Nós então alteramos aquelas seqüências no p4 CDNA DEN4 através de supressão deles ou trocando-os com a seqüência homóloga do vírus Langat transmitido por carrapato. Os vírus resultantes foram ensaiados para tamanho de placa reduzido e título em células Vero e C6/36 e para infectividade para Ae. Aegypti e Tx. Splendens.
[00166] Identificação e modificação de seqüências de UTR 3’ particulares mostrando diferenças conservadas entre vetores. Vários estudos (Olsthoorn, R.C. & Boi, J.F. 2001 RNA 7:1370-7; Protski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25: 1194-202) identificaram diferenças conservadas nas seqüências de ácidos nucléicos da UTR 3’ de flavivírus transmitidos por carrapatos e transmitidos por mosquitos. Tais diferenças são concentradas na região de centro terminal 3’, os aproxima-damente 400 nucleotídeos terminal 3’. Foi sugerido que estas seqüências podem ter uma função específica de vetor (Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-202). Embora uma tal função não tenha sido identificada, não obstante pode ser possível interromper infectividade de vetor através de supressão ou de outro modo alterando estes nucleotídeos.
[00167] Para identificar seqüências alvos para este tipo de alteração, nós construímos um alinhamento das seqüências de nucleotídeos de UTR 3’ de sete flavivírus transmitidos por mosquito e quatro flavivírus transmitidos por carrapatos (Figura 8). A partir deste alinhamento, nós identificamos várias seqüências que mostraram diferenças conservadas entre flavivírus transmitidos por mosquitos e flavivírus trans-mitidos por carrapatos. Nós então projetamos primers para alteração destas seqüèncias em wt DEN4 CDNA p4 (Figura 4) em uma de duas maneiras: 1) supressão dos nucleotideos (Δ) ou 2) substituição dos nucleotideos com a seqüência homóloga de Langat flavivírus transmitido por carrapato (swap). Langat foi escolhido como o molde para nucleotideos trocados porque ele é naturalmente atenuado (Pletnev, A.G. 2001 Virology 282:288-300), e por isso improvável de aperfeiçoar a virulência de vírus rDEN4 derivados do cDNA modificado. As seqüèncias de DEN4 alteradas e os primers de mutagênese usados para assim fazer são listadas na Tabela 28. Nucleotideos 10508-10530 correspondem à região CS2 identificada em estudos prévios (Protski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-202).
[00168] Mutagênese de p4, transcrição e transfecção são conduzidas como descrito anteriormente na Seção I deste exemplo. Todos os cinco vírus engenheirados foram recupe-rados, e todos foram submetidos a dois rounds de diluição terminal como descrito anteriormente.
[00169] Avaliação de fenótipos: cultura de células. Vírus foram titulados em células Vero e C6/36 como descrito anteriormente, e os resultados são listados na Tabela 29. Todos os vírus replicaram para >5,0 logio PFU/ml; um deles (rDEN4Δ10508-10530) replicou para > 8,0 logio PFU/ml. Somente um dos vírus (rDEN4Δ10535-10544) foi placa pequena em células C6/36; este vírus mostrou tamanho de placa tipo selvagem em células Vero. Interessantemente, um outro vírus (rDEN4swap10508-10539) mostrou tamanho de placa tipo selvagem em células C6/36 mas foi sp em células Vero.
[00170] Avaliação de fenótipos: infectividade de mosquitos. Atualmente um dos cinco vírus foi testado para infectividade via inoculação intra-toráxica em Tx. Splendens, usando processos descritos anteriormente. Vírus rDEN4Δ10508-10530 foi dramaticamente restrito em infectividade em relação ao tipo selvagem (Tabela 30). Poucos mosquitos foram infectados de modo que não foi possível calcular-se uma MlDso para este vírus.
[00171] Um dos cinco vírus foi testado para infectividade de Ae.Aegyptis alimentado sobre uma refeição de sangue infecciosa usando processos descritos anteriormente. rDEN4swap10535-10544 (Tabela 31) causou significantemente menos infecções no intestino que rDEN4 tipo selvagem, mas a porcentagem de infecções disseminadas não difere entre rDEN4swap10535-10544 e rDEN4 tipo selvagem. Todos os vírus são imaginados co mo sendo testados para infectividade de mosquitos usando ambos processos.
[00172] Resumo. Neste exemplo nós esboçamos duas estra-tégias diferentes para prevenção de transmissão para mosquito de uma vacina de dengue. Primeiro, várias pequenas mutações de substituição, incluindo duas mutações de ponto e uma substituição de carga-para-alanina emparelhada, foram mostradas restringirem a replicação de DEN4 em células C6/36 de mosquito em cultura de células, e uma destas mutações (C7129U) foi mostrada restringir a habilidade de vírus DEN4 infectar mosquitos. Segundo, nós criamos uma variedade de mutações de supressão e substituição em regiões da UTR 3’ de DEN4 que mostram conservadas diferenças entre flavivírus transmitidos por mosquito e transmitidos por carrapato. Um destes vírus é sp em células C6/36 e pelo menos dois destes vírus mostram algum grau de restrição de infectividade de mosquito. Por desenho, as seqüências de nucleotídeos nas quais estas mutações foram feitas são altamente conservadas entre os quatro sorotipos de dengue e entre flavivírus transmitidos por mosquitos em geral, indicando que elas são portadoras para outros candidatos a vacina para flavivírus transportados por mosquitos. Todas as mutações discutidas neste exemplo estão fora de genes estruturais e são imaginadas como sendo úteis em construção de candidatos a vacina quimérica-antigênica.
EXEMPLO 6 Mutações de adaptação que aperfeiçoam a replicação de DEN4 e vírus quiméricos DEN4 em células Vero
[00173] Células Vero são um substrato altamente carac-terizado que pode ser apropriado para a fabricação de vacinas de flavivírus atenuados vivos, tais como vírus de dengue e vírus de encefalite transportados por carrapatos. Em adição, células Vero também podem ser usadas para crescimento de flavivírus para alto título para a preparação de uma vacina de vírus inativado. Seqüências ótimas para o eficiente crescimento de vírus de dengue em células Vero ainda não foram identificadas, mas é bem conhecido que flavivírus acumulam mutações durante passagem em várias culturas de células (Dunster, L.M. et al. 1999 Virology 261:309- 18; Theiler, M. &Smith, H.H. 1937 J Exp Med 65:787-800). Inclusão de seqüências específicas em vírus atenuados vivos que aperfeiçoam sua replicação em células Vero e aumentam o número de doses de vacina produzida por substrato unitário pode facilitar grandemente sua fabricação. Simi-larmente, inclusão de seqüências promovendo cresci mento de célula Vero em vírus tipo selvagem usados para a preparação de uma vacina de vírus inativado pode também facilitar grandemente a fabricação da vacina. O presente exemplo identifica mutações que ocorrem seguindo passagem de vírus DEN4 e vírus quiméricos DEN2/4 em células Vero. Dados derivados de cinco fontes proveram informação para esta análise tornando possível gerar-se uma lista de seqüências promovendo crescimento de células Vero.
[00174] Presença de mutações idênticas em múltiplos vírus mutantes 5- FU. Primeiro, como descrito nos Exemplos 1 e 2, os genomas de 42 clones de vírus de dengue isolados de um estoque de vírus mutagenizados com 5-FU foram completamente seqüenciados. Se mutações que aperfeiçoam replicação ocorreram durante a passagem destes 42 vírus mutantes em células Vero, então tais mutações devem se revelar através de representação em mais de um clone. Análises das 42 seqüèncias revelaram a ocorrência de mutações de sentido trocado específicas em regiões codificantes ou substituições de nucleotideos em UTRs em múltiplos clones que não estão presentes no genoma de vírus parente 2A (Tabelas 11 e 32). Estas mutações, muitas das quais ocorrem dentro de uma seção de 400 nucleotideos da região codificante de NS4B, representam mutações de adaptação-célula Vero. Uma mutação, tal como a mutação 4995, presente em oito vírus foi verificada especificar ambos fenótipos ts e att (Exemplos 1 e 3). Em contraste, a mutação 7163, presente em seis vírus, não especifica um fenótipo ts ou att (Tabela 13) e assim é um exemplo de uma mutação promovendo crescimento de célula Vero específica.
[00175] Presença de mutações de adaptação de célula Vero em outros vírus DEN4 e vírus quiméricos antiqênicos DEN2/4. Segundo, o vírus de dengue 2A- 13 que foi usado como um controle tipo selvagem passado em paralelo durante os experimentos 5-FU descritos no Exemplo 1 foram crescidos e clonados em células Vero na ausência de 5-FU em uma maneira idêntica àquela dos vírus tratados com 5-FU. Análises de seqüèncias destes vírus não-tratados com 5-FU, designados 2A- 13-1A1, revelaram que o genoma de vírus conteve uma mutação em nucleotídeo 7163 (Exemplo 1 e Tabela 32), idêntica à mutação de sentido trocado previamente identifi-cada em 6 dos vírus mutantes 5-FU (Tabelas 11 e 32). Isto indica que crescimento e passagem de vírus DEN4 em células Vero é suficiente para adquirir esta específica mutação, isto é, mutagênese com 5-FU não é requerida. Assim, informação a partir de duas fontes separadas indica que a mutação 7163 apareceu em vírus passados em célula Vero separados, pelo que reforçando a interpretação de que esta mutação está promovendo crescimento.
[00176] Terceiro, seguindo passagem do 2AΔ30 e rDEN4Δ30 em células Vero, análises de seqüèncias revelaram a presença de uma mutação em nucleotideos 7153 e 7163, respectivamente. Estas duas mutações também foram previamente identificadas entre os vírus tratados com 5-FU (Tabela 32). Novamente, mutações idênticas apareceram seguindo independente passagem de vírus em células Vero, corroborando a hipótese de que estas mutações conferem uma vantagem de crescimento em células Vero.
[00177] Quarto, um candidato a vacina de vírus de dengue quimérico antigênico foi gerado que expressou as proteínas estruturais C, prM, e E a partir de DEN2 sobre um fundo genético tipo selvagem de DEN4 ou um fundo genético Δ30 atenuado. Para construir este vírus, a região C, prM e E de cDNA tipo selvagem de plasmídeo p4 foi substituída com uma região similar de vírus DE2 linhagem NGC (Figura 10). Especificamente, nucleotídeos entre sítios de restrição Bglll (nt 88) e Xhol (nt 2345) de p4 foram substituídos com aqueles derivados de vírus tipo 2 de dengue. Transcritos RNA sintetizados do resultante plasmídeo p4-D2 foram transfec- tados em células Vero e vírus rDEN2/4 foi recuperado. Ainda uma versão atenuada deste vírus quimérico contendo a mutação Δ30, rDEN2/4Δ30, foi recuperada em células C6/36 de mosquito seguindo transfecção de células com transcritos de RNA derivados de p4Δ30-D2. Entretanto, rDEN2/4Δ30 não pode ser recuperado diretamente em células Vero. O vírus mutante rDEN2/4Δ30 recuperado em células C6/36 replicou para níveis muito baixos em células Vero (<1,0 logio PFU/ml) mas cresceu para alto título em células C6/36 (>6,0 logw PFU/ml). Seqüência genômica do vírus derivado de C6/36 ajustou-se à seqüência de cDNA prevista e é mostrada em Apêndice 3. Não obstante, quando rDEN2/4Δ30 derivado de C6/36 foi passado serialmente 3 a 4 vezes em células Vero, uma população de vírus adaptada para crescimento em células Vero emergiu. Vírus desta preparação adaptada a células Vero foram clonados e amplificados em células Vero para um título de >6,0 logw PFU/ml. A seqüência genômica foi determinada para 2 clones de vírus independentes e comparada à seqüência de CDNA prevista (Tabela 33 e 34). Cada vírus clonado contem uma mutação em um gene não-estrutural que coincide de perto em localização ou seqüência com uma mutação previamente identificada entre o painel de vírus mutagenizados com 5-FU. As outras mutações nestes dois clones também podem conferir uma vantagem de crescimento em células Vero. Importante- mente, as mutações identificadas nas Tabelas 33 e 34 são absolutamente requeridas para replicação em células Vero, e pode não ser possível produzir-se o candidato a vacina rDEN2/4Δ30 em células Vero sem as mutações promotoras de crescimento identificadas nas Tabelas 33 e 34.
[00178] Quinto, análises de seqüências dos vírus tipo selvagem de dengue 4 linhagem 814669 (no. de acesso GenBank AF326573) seguindo passagem em células Vero identificaram uma mutação na região NS5 em nucleotídeo 7630 que foi previamente identificada entre o painel de vírus mutagenizados com 5-FU (Tabela 32). Esta mutação em nucleotídeo 7630 foi introduzida em vírus rDEN4 recombinante por mutagênese de sítio direcionado como descrito na Tabela 16. O vírus resultante, rDEN4-7630, não foi sensível a temperatura quando testado a 39°C, indicando que mutação 7630 não contribui para sensitividade a temperatura.
[00179] Caracterização de vírus quiméricos rDEN2/4Δ30 contendo mutações de adaptação a célula Vero simples e múltiplas. A geração de vírus quimérico rDEN2/4Δ30 proporcionou uma oportunidade única para avaliação de capa-cidade de mutações individuais para promoção de aumentado crescimento em células Vero. Porque rDEN2/4Δ30 replica para título muito baixo em células Vero, ainda pode ser eficientemente gerado em células C6/36 de mosquito, vírus recombinante transportando mutações adaptando célula Vero putativas foram primeiro geradas em células C6/36 e então títulos de vírus foram determinados em ambas células C6/36 e Vero. Como mostrado na Tabela 35, adição de uma mutação simples a rDEN2/4Δ30 resultou em um aumento maior que 1000 vezes em título em células Vero, confirmando o fenótipo de adaptação a células Vero conferido por estas mutações. Entretanto, a combinação de duas mutações separadas em um único vírus não aumenta o título em células Vero além do nível observado para vírus transportando uma mutação de adaptação simples. Inclusão de mutação 7182 ou 7630 no CDNA de rDEN2/4Δ30 permitiu que o vírus seja recuperado diretamente em células Vero, evitando a necessidade de recuperar o vírus em células C6/36.
[00180] Caracterização das propriedades de crescimento de vírus rDEN4 contendo mutações de adaptação a célula Vero definidas simples e múltiplas. Para confirmar a habilidade de mutações de adaptação a células Vero para aperfeiçoamento de crescimento de vírus DEN4, mutagênese direcionada a sítio foi usada para gerar vírus rDEN4 codificando mutações individuais selecionadas como descrito nos Exemplos 1 e 3. Cinco mutações em NS4B (7153, 7162, 7163, 7182, e 7546) a partir da lista de mutações repetidas nos vírus mutante 5-FU (Tabela 32) foram introduzidas simplesmente no clone de CDNA de p4. Em adição, o vírus rDEN4-7129 restrito em mosquito foi avaliado para crescimento aperfeiçoado em células Vero uma vez que a localização desta mutação está na mesma região de NS4B. cada vírus, incluindo rDEN4 tipo selvagem, foi recuperado, terminalmente diluído, e propagado em células C6/36 para prevenir introdução de adicionais mutações de adaptação a célula Vero, entretanto, devido seu restrito crescimento em células C6/36, rDEN4-7129 foi propagado somente em células Vero.
[00181] Tamanho de placa foi avaliado para cada vírus rDEN4 mutante em células Vero e células C6/36 e comparado a rDEN4 tipo selvagem. Placas de seis poços de cada célula foram inoculadas com diluições de vírus e placas foram visualizadas cinco dias depois. Placas representativas são ilustradas na Figura 10 e demonstram que a presença de uma mutação de adaptação a células Vero realmente confere aumentado espalhamento de vírus de célula para célula e crescimento especificamente em células Vero. Em células C6/36, tamanho de placa médio foi aproximadamente 0,50 mm para rDEN4 tipo selvagem e cada vírus mutante (exceto para rDEN4-7546 e rDEN4-7129 que foram menores que o tipo selvagem; ver Exemplo 5). Entretanto, vírus rDEN4 expres-sando mutação 7162, 7163, 7182, e 7129 tiveram um aumento maior que duas vezes em tamanho de placa em células Vero comparados a vírus rDEN4 tipo selvagem. Um menor porém consistente aumento em tamanho de placa foi observado para rDEN4-7153 e rDEN4-7546.
[00182] Cinéticas de crescimento e rendimento de vírus em células Vero foram avaliados para o mesmo painel de vírus rDEN4. Células Vero foram infectadas em uma MOI de 0,01 e amostras foram removidas diariamente por 10 dias, tituladas sobre células Vero, e placas foram visualizadas. Os resultados na Figura 11 indicam que a presença de uma mutação de adaptação de célula Vero aumentou as cinéticas de crescimento de vírus, mas teve somente um efeito marginal sobre o pico de rendimento de vírus. No dia quatro pós-infecção, rDEN4 tipo selvagem cresceu para 5,2 logw PFU/ml enquanto o nível de replicação em células infectadas com rDEN4-7129 foi 100 vezes maior. O resto dos vírus rDEN4 mutantes teve um rendimento aumentado no dia 4 variando de 0,9 (rDEN4-7153) a 1,6 (rDEN4-7162 e 7163) logw PFU/ml. Interessantemente, cinéticas aperfeiçoadas de crescimento de vírus correlacionaram-se com aumentado tamanho de placa em células Vero. O pico de rendimento de vírus foi atingido pelo dia 6 pós-infecção para rDEN4-7129, -7162, e -7182 enquanto rDEN4 tipo selvagem não atinge pico de título até dia 10. Entretanto, o rendimento de vírus de pico foi somente levemente superior em vírus rDEN4 expressando mutações de adaptação a células Vero.
[00183] Em um esforço para ainda aperfeiçoar replicação de rDEN4, especialmente o rendimento de vírus de pico, combinações de selecionada mutações de adaptação a células Vero foram introduzidas no fundo de rDEN4. Três vírus com mutações duais foram gerados: rDEN4-7153-7163,rDEN4-7153-7182, e rDEN4-7546-7630 e testados em uma infecção de curso de tempo em células Vero como descrito acima junto com rDEN4 e rDEN4-7162 como um controle positivo (Figura 12). Os vírus expressando mutações combinadas cresceram em uma maneira aproximadamente idêntica a rDEN4-7162 indicando que estas combinações selecionadas não aperfeiçoam as cinéticas ou pico de rendimento de vírus. Combinações adicionais destas e outras mutações de adaptação a células Vero são imaginadas como aumentando pico de rendimento de vírus.
[00184] Discussão. Algumas das mutações promotoras de crescimento listadas na Tabela 32 também são verificadas em regiões homólogas de DEN1, DEN2, e DEN3 e são imaginadas como servindo para promover a replicação destes vírus em células Vero. Especificamente, as mutações promotoras de crescimento indicadas na Tabela 32 que estão presentes em um vírus DEN4 são imaginadas como sendo úteis para importação em regiões homólogas de outros flavivírus, tais co mo DEN1, DEN2 e DEN3. Exemplos de tais regiões conservadas são mostrados em Apêndice 4 e são listadas na Tabela 36. Os nucleotídeos para ambas mutações 7129 e 7182 são conservados em todos os quatro sorotipos de vírus de dengue. É também interessante notar que mutação 7129 não somente aumenta crescimento em células Vero (Figura 10) mas ele também forma placas pequenas em células de mosquitos (Figura 6, Tabela 25). Lee et al., previamente passaram vírus DEN3 em células Vero e realizaram limitada análise de seqüências de somente regiões de gene estrutural dos resultantes vírus (Lee, E. et al., 1997 Virology 232:281-90). A partir desta análise um menu de mutações de adaptação a células Vero foi montado. Embora nenhuma destas mutações corresponda às mutações de adaptação a Vero identificadas neste Exemplo, uma mutação simples em posição de aminoácido 202 em DEN3 corresponde a mutação 1542 identificada em vírus mutante 5-FU #1012. O Exemplo atual enfatiza a importância deste tipo de estudo de determinação de seqüência do inteiro genoma virai.
[00185] Os vírus de crescimento otimizado em células Vero são imaginados como tendo utilidade nas seguintes áreas. Primeiro, o rendimento de um vírus vacina atenuado vivo em células Vero é previsto ser aumentado. O candidato a vacina atenuado vivo é convenientemente um vírus DEN4 ou outro vírus de dengue ou um vírus quimérico antigênico DEN1/4, DEN2/4 ou DEN3/4, ou um vírus quimérico de um outro flavivírus sobre o fundo de DEN4. O aumentado rendimento de vírus vacina é imaginado como diminuindo o custo de fabricação de vacina. Segundo, mutações de adaptação de célula Vero que são mutações atenuantes, tal co mo a mutação 4995, são imaginadas como sendo estáveis durante a passagem múltipla e amplificação de vírus em culturas de células Vero que são requeridas para produção de um grande número de doses de vacina. Terceiro, mutações de adaptação a células Vero são realmente requeridas para o crescimento do candidato a vacina rDEN2/4Δ30 em células Vero. Quarto, o aumento em rendimento de um DEN tipo selvagem ou um vírus atenuado é imaginado como tornando economicamente exeqüível fabricar-se uma vacina de vírus inativado. Quinto, a presença das mutações promotoras de crescimento em células Vero no vetor DEN4 dos vírus quiméricos rDEN1/4, rDEN2/4, e rDEN3/4 ou outros vírus quiméricos flavivírus baseado em DEN4 é imaginada como permitindo ao vírus crescimento para um alto título e pelo que sendo útil na fabricação de uma vacina de vírus inativado. Sexto, a inserção de mutações promotoras de crescimento em células Vero em cDNAs como rDEN2/4Δ30 é imaginada como permitindo recuperação de vírus diretamente em células Vero, para as quais existem qualifi-cados bancos de células mestres para fabricação, antes que em células C6/36 para as quais qualificados bancos de células não são disponíveis. E sétimo, inserção das mutações 7129 e 7182 em vírus wt DEN1, DEN2, ou DEN3 é imaginada como aumentando sua habilidade para replicar eficientemente e serem recuperados de CDNA em células Vero.
EXEMPLO 7 Montagem de uma lista de mutações atenuantes
[00186] Os dados apresentados nestes exemplos permitem a montagem de uma lista de mutações atenuantes que é resumida na Tabela 37. Esta lista contem mutações individuais identificadas nas Tabelas 13-16, 20, e 21 que são conhecidas especificarem independentemente um fenótipo de atenuação. Mutação 7129 é também incluída uma vez que ela é derivada de vírus 5-1A1 mostrado ser atenuado em mosquitos. Nós imaginamos uso de várias combinações de mutações a partir desta lista para gerar vírus com conjuntos de desejáveis propriedades tais co mo crescimento restrito no fígado ou no cérebro como ensinado no exemplo 3 (Tabela 18) e Exemplo 14 (Tabelas 23 e 24). Estas mutações também são combináveis com outras mutações atenuantes descritas anteriormente tal co mo a mutação Δ30, como ensinado no Exemplo 1 (Tabela 6) e Exemplo 3 (Tabela 19) para produção de vírus recombinantes que são satisfatoriamente atenuados e imunogênicos. Mutações listadas na Tabela 37 também são imaginadas como sendo combinadas com outras mutações atenuantes descritas anteriormente tais como outras mutações de supressão ou outras mutações de ponto (Blok, J. et al. 1992 Virology 187:573-90; Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7; Puri, B. etal. 1997 J Gen Virol 78:2287-91).
[00187] A possibilidade de importação de uma mutação atenuante presente em um paramixovírus em uma região homóloga de um segundo paramixovírus foi recentemente descrita (Durbin, A.P. et al. 1999 Virology 261:319- 30; Skiadopoulos, M.H. etal. 1999 Virology 260:125-35). Uma tal importação confere um fenótipo att ao segundo vírus ou, alternativamente, ainda atenua o vírus para crescimento in vivo. Similarmente nós imaginamos importação de uma mutação atenuante presente em um flavivírus para uma região homóloga de um segundo flavivírus o que pode conferir um fenótipo att ao segundo flavivírus ou, alternativamente, pode ainda ate-nuar o vírus para crescimento in vivo. Especificamente, as mutações atenuantes indicadas na Tabela 37 são imaginadas co- mo sendo úteis para importação em regiões homólogas de outros flavivírus. Exemplos de tais regiões homólogas são indicados no Apêndice 4 para as mutações listadas na Tabela 37.
EXEMPLO 8 Avaliação de vacina de vírus de dengue em humanos e macacos rhesus
[00188] O presente exemplo avalia a atenuação para humanos e macacos rhesus (como um modelo animal) de um mutante DEN-4 transportando uma supressão de 30 nucleotídeos (Δ30) que foi introduzida em sua região não-traduzida 3’ através de muta-gênese de sítio direcionado e que foi verificado previamente ser atenuado para macacos rhesus (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7), como representativa para a avaliação de qualquer vacina de vírus de dengue para atenuação em humanos e macacos rhesus (como um modelo animal).
[00189] Vírus e células. O vírus wt DEN-4 tipo selvagem linhagem 814669 (Dominica, 1981), originalmente isolado em células de Aedes pseudoscutellaris (AP61), foi previamente purificado em placa em células LLC-MK2 e amplificado em células C6/36 como descrito (Mackow, E. et al. 1987 Virology 159:217-28). Para ainda amplificação, a suspensão de C6/36 foi passada 2 vezes em células Vero (WHO) mantidas em MEM-E (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com FBS 10%. Vírus derivados de transfecção de RNA ou usados para desenvolvimento de lote clínico foram crescidos em células Vero (WHO) mantidas em meios isentos de soro, VP-SFM (Life technologies).
[00190] Construção de mutantes de supressão de DEN-4. Uma supressão de 30 nucleotídeos (nt) foi previamente4 introduzida na região não-traduzida 3’ do clone CDNA 2A de wt DEN-4 linhagem 814669 co mo descrito (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Esta supressão remove nucleotídeos 10478-10507, e foi originalmente designada 3’d 172-143, significando a localização da supressão em relação à extremidade 3’ do genoma viral. No exemplo atual, esta supressão é referida como Δ30. O clone de cDNA 2A de inteiro comprimento sofreu várias modificações subseqüentes para aperfeiçoamento de sua habilidade de ser geneticamente manipulado. Co mo descrito previamente, um sítio de enzima de restrição Xhol translacionalmente silencioso foi engenheirado próximo da extremidade da região E em nucleotídeo 2348 para criar clone 2A-Xhol (Bray, M. &Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). Neste exemplo, a seqüência codificante virai do clone cDNA de 2A-Xhol foi ainda modificada usando-se mutagênese de direcionada a sítio para criar clone p4: um único sítio de restrição BbvCI foi introduzido próximo da junção C-prM (nucleotídeos 447-452); um sítio de restrição Xbal extra foi removido por mutação de nucleotídeo 7730; e um único sítio de restrição Sacll foi criado na região NS5 (nucleotídeos 9318-9320). Cada uma destas mutações engenheiradas é traducionalmente silenciosa e não altera a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo virai. Também, várias mutações foram feitas na região de vetor de clone p4 para introdução ou remoção de adicionais sítios de restrição. O clone cDNA de p4Δ30 foi gerado por introdução de mutação Δ30 em clone p4. Isto foi realizado através de substituição de fragmento Mlul-Kpnl de p4 (nucleotídeos 10403-10654) com aquele derivado de plasmídeo 2AΔ30 contendo a supressão de 30 nucleotídeos. Os clones cDNA de p4 e p4Δ30 foram subseqüentemente usados para geração de vírus recombinantes rDEN4 e rDEN4Δ30, respec-tivamente.
[00191] Geração de vírus. Transcritos de RNA de inteiro comprimento foram sintetizados a partir de clones cDNA de 2A e 2AΔ30 usando SP6 RNA polimerase como descrito anterior-mente (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139- 43; Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). A reação para gerar transcritos de RNA de inteiro comprimento a partir de clones cDNA de p4 e p4Δ30 foi modificada e consistiu em uma mistura de reação de 50p.l contendo 1ug de plasmídeo linearizado, 60 U de SP6 polimerase (New England Biolabs (NEB), Beverly, MA), 1X tampão RNA polimerase (Tris-HCI 40mM, pH 7,9, MgCl2 6 mM, spermidine 2mM, ditiotreitol 10mM), m7G(5’)ppp(5’)G cap analog 0,5 mM (NEB), 1mM de cada nucleotideo trifosfato, 1 II pirofosfato (NEB), e 80 U inibidor RNAse (Roche, Indianápolis, IN). Esta mistura de reação foi incubada a 40°C por 90 minutos e os resultantes transcritos foram purificados usando-se Rneasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Para transfecção de células Vero, transcritos purificados (1pg) foram misturados com 12pl de reagente DOTAP lipossome (Roche) em solução salina contendo tampão HEPES 20mM (pH 7,6) e adicionados a culturas de monocamadas de células em uma placa de 6 cavidades. Após 5-17 dias, meio de cultura de tecido foi colhido, clarificado por centrifugação, e vírus foi amplificado em células Vero. A presença de vírus foi confirmada por titulação de placa. Deve ser notado que durante o curso de transfecção e amplificação de 2AΔ30 para criação de lote de vacina, o vírus sofreu um total de 6 passagens inteiramente em células Vero. Os vírus restantes, rDEN4 e rDEN4Δ30 foram passados 5 vezes em células Vero para geração de suspensão de vírus usada para análises de seqüèncias e estudos em macacos rhesus.
[00192] Produção de vacina. Uma alíquota de fluido de cultura de tecido clarificado contendo candidato a vacina 2AΔ30 foi submetida a DynCorp (Rockville, MD) para amplificação de vírus em células Vero e produção de um lote de vacinas. Para produção de vacina, o sobrenadante de cultura de tecido impregnado com 2AΔ30 foi colhido, tampão SPG adicionado (concentração final: 218 mM sucrose, ácido L-glutâmico 6mM, fosfato de potássio 3,8 mM, monobásico, e fosfato de potássio 7,2mM, dibásico, pH 7,2). E a suspensão de vírus foi clarificada por centrifugação em baixa velocidade. Para degradar DNA de célula Vero residual, a suspensão de vacina foi tratada com Benzonase endonuclease (American International Chemical, Natick, MA), 100U/ml e incubada por 1 hora a 37°C, seguido por centrifugação em alta velocidade (17000 x g, 16 horas). O precipitado resultante de vírus foi gentilmente rinsada com MEM-E, re-suspenso em MEM-E contendo SPG, sonificado, distribuído em ampolas termo-seladas, e estocadas congeladas a -70°C. Testes de segurança de recipiente finais confirmaram esterilidade microbial, pureza de cultura de tecido, e segurança animal. O lote de vacine 2AΔ30 (designado DEN4-9) tem um título de 7,48 logw PFU/ml, com uma dose simples de 5,0 logw PFU/ml contendo <1pg/ml de DNA de célula Vero e <0,001 U/ml de Benzonase endonuclease.
[00193] Seqüência de clones de cDNA e genomas virais. A seqüência de nucleotídeos da região de genoma viral de cDNA de plasmídeos 2A e p4 foi determinada sobre um analisador genético 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando primers específico de vetor e específico de DEN-4 em reações de sequenciamento de ciclo com terminadores Big Dyeem(Applied Biosystems). A seqüência de nucleotídeos dos genomas do parente wt DEN-4 linhagem 814669 e de vírus recombinantes 2A wt, 2AΔ30 (lote de vacina), rDEN4, e rDEN4Δ30 também foi determinada. RNA virai foi extraído das preparações de vírus e amostras de soro usando o QIAamp Viral RNA mini kit (Qiagen). Transcrição reversa (RT) foi realizada usando hexâmeros randomicos e o Superscript First-Strand Synthesis System para RT-PCR (Life Technologies). Sobreposição de fragmentos de PCR de aproximadamente 2000 pares de bases foi gerada usando-se primers específicos DEN-4 otimizados e Advantage cDNA polymerase (ClonTech, Paio Alto, CA). Ambas fitas de fragmentos de PCR purificados foram seqüenciadas diretamente usando-se reações terminadoras com corante como descrito acima e resultados foram montados em uma seqüência consenso. Para determinar a seqüência de nucleotídeos das regiões 5’ e 3’ de RNA virai, o nucleosídeo capa 5’ do RNA virai foi removido com pirofosfatase ácida de tabaco (Epicentre, Madison, Wl) seguido por circularização do RNA usando RNA ligase (Epicentre). RT-PCR foi realizada como descrito e um fragmento de c foram cedidos como se segue (vírus: número de acesso): 814669: AF326573, 2AΔ30: AF326826, rDEN4: AF326825, e rDEN4Δ30: AF326827.
[00194] Receptores de vacina humanos. 20 voluntários adul-tos saudáveis foram recrutados pelo Johns Hopkins School of Hygiene and Public Health Center for Immunization Research (CIR) localizado em Baltimore, Maryland. O protocolo clínico foi revisto e aprovado pelo Joint Committee for Clinical Investigation do Johns Hopkins University School of Medicine e consentimento informado foi obtido de cada voluntário. Voluntários foram arrolados no estudo se eles satisfizeram os seguintes critérios de inclusão: 18-45 anos de idade; nenhuma história de doenças crônicas; um exame físico normal; anticorpo para vírus de imunodeficiência humana negativo, antígeno de superfície de hepatite B negativo, e anticorpo de hepatite C negativo; nenhum sangue oculto em fezes; e valores normais para completa contagem de células de sangue (CBC) com diferencial, hematócrito, contagem de plaqueta, creatinina em soro, aspartato amino transferase em soro (AST), alanina amino transferase (ALT), fosfatase alcalina, bilirrubina, tempo de protrombina (PT), tempo de trombo-plastina parcial (PTT), e análise de urina. Voluntários fêmeas foram requeridos terem teste de gravidez de urina negativo antes de teste de vacinação e no dia de vacinação e a concordar em usar contraceptive ou abstinência de intercurso sexual pela duração do estudo. Voluntários também careceram de evidência sorológica de anterior infecção com flavivírus como definido por título de anticorpo de inibição de hemaglutinação <1:10 para vírus de encefalite St.Louis DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, vírus de encefalite Japone, ou vírus de febre amarela e um título de neutralização de redução de placa <1:10 para vírus de febre amarela e DEN-4.
[00195] Estudos em humanos. Voluntários foram imunizados em três coortes sucessivas de quatro, seis e dez voluntários para avaliação de segurança da vacina. Neste estudo, uma doença foi definida como o seguinte: infecção de vírus da dengue associada com uma contagem de plaqueta de <90 000/mm3; ALT em soro >4 vezes o normal; temperatura oral > 38°C por >2 dias sucessivos; ou dor de cabeça e/ou mialgia demorando >2 dias sucessivos. Doença sistêmica foi definida como a ocorrência de febre >38°C por >2 dias consecutivos, ou quaisquer 2 do seguinte por pelo menos dois dias consecutivos do estudo: dor de cabeça, enxaqueca, anorexia, e mialgia/artralgia. Os experimentos foram conduzidos entre outubro e abril, um tempo de baixa prevalência de mosquito, para reduzir o risco de transmissão de vírus de vacina de um dos voluntários para a comunidade.
[00196] No dia de vacinação, candidato a vacina 2AΔ30 foi diluído para 5,3 logw PFU/ml em solução salina estéril para injeção, USP, e cada voluntário foi injetado subcutaneamente com 0,5ml contendo 5,0 logio PFU de vacina na região deltoide esquerda. Voluntários receberam um cartão diário doméstico no qual eles anotaram sua temperatura duas vezes ao dia para dias 0-5 após vacinação. Os voluntários retornaram para a clínica a cada dia para exame por um médico e seus cartões diários foram revistos. O sítio de injeção foi avaliado para eritema, induração, e sensibi-lidade. Sinais clínicos e sintomas tais como dor de cabeça, exantema, petechiae, linfoadenopatia, hepatomegalia, sensi-bilidade abdominal, anorexia, náusea, fadiga, mialgia, artralgia, dor de olho, e fotofobia foram avaliados diária- mente. Sintomas foram graduados como suaves (nenhuma neces-sidade de tratamento ou uma mudança em atividade), moderados (necessário tratamento ou alteração em atividade notada, ainda capaz de continua atividade diária), ou severos (confinados ao leito). Sangue foi retirado para CBC com diferencial e para quantificação de vírus nos dias 0, 2 e 4. Voluntários foram admitidos para a unidade de doentes internos no CIR no sexto dia após imunização. O médico de estudo avaliou todos os voluntários cada dia através de exame físico e entrevista. Os voluntários tiveram sua pressão sanguínea, pulso, e temperatura anotados quatro vezes por dia. Sangue foi retirado cada dia para CBC com diferencial e para quantificação de vírus e cada outro dia para medição de ALT. Voluntários foram confinados para a unidade de doentes internos até dispensa no dia de estudo 15. Nos dias de estudo 28 e 42, voluntários retornaram para exame físico e sangue foi retirado para quantificação de vírus (dia 28) e para medição de anticorpos em soro (dia 28 e 42).
[00197] Quantificação e amplificação de vírus. Soro foi obtido para deteção de viremia e titulação de vírus em espécimes positivos. Para estes propósitos 8,5ml de sangue foram coletados em um tubo separador de soro e incubados em temperatura ambiente por menos que 30 minutos. Soro foi decantado em alíquotas de 0,5ml, rapidamente congelado em um banho de gelo seco/etanol e estocados a -70°C. Alíquotas de soro foram descongeladas e diluições seriais de 10 vezes foram inoculadas sobre culturas de monocamadas de células Vero em placas de 24 poços. Após incubação de uma hora em temperatura ambiente, as monocamadas foram revestidas com metil celulose 0,8% em OptiMEM (Life Technologies) suplemen-tado com soro fetal bovino 5% (FBS). Seguindo incubação a 37°C por quatro dias, placas de vírus foram visualizadas por manchamento com imunoperoxidase. Resumidamente, monocamadas de células foram fixadas em metanol 80% por 30 minutos e rinsadas com tampão anticorpo (leite sem gordura 5% em solução salina tamponada com fosfato). Anticorpos DEN-4 policlonais de coelho foram diluídos 1:1000 em tampão de anticorpo e adicionados a cada poço seguido por uma hora de incubação a 37°C. Anticorpos primários foram removidos e as monocamadas de células foram lavadas duas vezes com tampão anticorpo. IgG cabra-anti-coelho rotulada com peroxidase (KPL, Gaithersburg, MD) foi diluída 1:500 em tampão de anticorpo e adicionada a cada poço seguida por uma hora de incubação a 37°C. Anticorpo secundário foi removido e os poços foram lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato. Substrato peroxidase (4-cloro-1- naftol em H2O2) foi adicionado a cada cavidade e placas visíveis foram contadas.
[00198] Para amplificação de vírus em amostras de soro, uma alíquota de 0,m3ml de soro foi diretamente inoculada em uma cavidade simples de uma placa de 6 cavidades de monocamadas de células Vero e incubados a 37°C por 7 dias. Fluido de cultura de células foi então ensaiado para vírus através de ensaio de placa como descrito acima.
[00199] Soroloqia. Ensaios de inibição de hemoaglutinação (HAI) foram realizados como previamente descrito (Clarke, D.H. &Casals, J. 1958 Am J Trop Med Hyg 7:561-73). Títulos de neutralização de redução de placa (PRNT) foram determinados através de uma modificação da técnica descrita por Russell (Russell, P.K. et al. 1967 J Immunol 99:285-90). Em resumo, soros de testes foram inativados termicamente (56°C por 30 minutos) e diluições seriais de 2 vezes iniciando em 1:10 foram feitas em OptiMEM suplementado com albumina de soro humano 0,25%. Vírus rDEN4Δ30, diluídos para uma concentração final de 1000 PFU/ml no mesmo diluente, foram adicionados para iguais volumes do soro diluído e bem misturados. A mistura de vírus/soro foi incubada a 37°C por 30 minutos. Meio de cultura de células foi removido de culturas de monocamadas confluentes 90% de células Vero sobre placas de 24 cavidades e 50pl de mistura de vírus/soro foram transferidos sobre monocamadas de células em duplicatas. Monocamadas de células foram incubadas por 60 minutos a 37°C e revestidas com metil celulose 0,8% em OptiMEM suplementado com FBS 2%. Amostras foram incubadas a 37°C por 4 dias após o que placas foram visualizadas por coloração com imunoperoxidase como descrito acima, e uma redução de placa de 60% em título de neutralização foi calculada.
[00200] Estudos em macacos rhesus. Avaliação da replicação e imunogenicidade de vírus wt 814669, e vírus recombinantes 2A wt, 2AΔ30 (lote vacina), rDEN4, e rDEN4Δ30 em macacos rhesus juvenis foi realizada como descrito anteriormente (Men R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Em resumo, macacos soronegativos para vírus dengue foram injetados subcuta-neamente com 5,0 logw PFU de vírus diluído em meio L-15 (Quality Biological, Gaithersburg, MD) contendo tampão SPG. Uma dose de 1ml foi dividida entre duas injeções em cada lado da área de ombro superior. Macacos foram observados diariamente e sangue foi coletado nos dias 0-10 e 28, e processado para soro, que foi estocado congelado a -70°C. Título de vírus em amostras de soro foi determinado através de ensaio de placa sobre células Vero como descrito acima. Títulos de anticorpos neutralizantes foram determinados para as amostras de soro de dia 28 como descrito acima. Um grupo de macacos inoculados com 2AΔ30 (n=4) ou vírus wt 814 669 (n=8) foi desafiado no dia 42 com uma dose simples de 5,0 logwPFU/ml vírus wt 814669 e sangue foi coletado por 10 dias. Administração e cuidados de macacos rhesus estavam de acordo com as diretrizes de National Institutes of Health para o uso humano de animais de laboratório.
[00201] Construção e caracterização de vírus mutante de supressão e tipo selvagem de DEN-4. As seqüências de aminoácidos deduzidas e nucleotídeos do vírus wt 814669 previamente descritas, o vírus wt 2A DEN-4 derivado do mesmo (designado 2A wt), e o candidato a vacina 2AΔ30 derivado de vírus wt 2A foram primeiro determinadas. Análise de seqüências mostraram que o vírus wt 814669 usado neste estudo aparentemente acumulou 2 mutações sentido trocado (nucleotídeos 5826 e 7630) e 3 mutações silenciosas durante sua passagem e amplificação uma vez que estas mutações não foram descritas em relatórios publicados anteriormente da seqüência virai (número de acesso GenBank M14931) e não estavam presente no CDNA 2A derivado do vírus. Comparação de seqüência entre vírus 2A wt e lote de vacina 2AΔ30 revelou que 2AΔ30 acumulou 2 mutações sentido trocado (nucleotídeos 7153 e 8308) e também confirmou a presença da mutação Δ30 (nucleotídeos 10478-10507) assim como uma adicional supressão de nucleotídeo 10475, que ocorreu durante a construção original da mutação Δ30 (Men, R. et al. J Virol 70:3930-7). Esta análise de seqüèncias revelou significante divergência de seqüèncias entre o vírus wt 814669 derivado biologicamente e seu derivado 2A wt recombinante e entre os vírus 2A wt e 2AΔ30. Uma vez que os vírus 2A wt e 2AΔ30 diferiram em nucleotideos outros que não a mutação de supressão, o fenótipo de atenuação previamente reportado para 2AΔ30 (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7) não pode ser formalmente atribuído unicamente à mutação Δ30 e pode ter sido especificado pelas mutações nos nucleotideos 7153, 8308, 10475, ou a supressão Δ30.
[00202] Para determinar se a mutação Δ30 foi responsável pela atenuação observada de 2AΔ30, um segundo par de vírus, um com e um sem a mutação Δ30, foi produzido para avaliação em macacos. Uma nova construção vetor cDNA de DEN-4, designada p4, foi derivada do clone cDNA de 2A-Xhol e mutações translacionalmente silenciosas foram introduzidas para adicionar ou eliminar vários sítios de enzima de restrição. Estes sítios foram adicionados para facilitar a futura manipulação genética deste cDNA de wt DEN-4 através da introdução de outras mutações atenuantes se necessário. A seqüência da região genômica do plasm ideo cDNA p4 foi idêntica àquela do vírus 2A wt exceto para as mudanças de sítio de restrição engenheirados e uma mutação de ponto em nucleotídeo 2440 que foi introduzida durante a mutagênese original do plasmídeo CDNA 2A para criar o sítio Xhol (Bray, M. &Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). A mutação Δ30 e a supressão vizinha em nucleotídeo 10475 foram co-introduzidas no plasmídeo p4 através de substituição de um curto fragmento de restrição com um derivado do clone de cDNA de 2AΔ30. Transcritos de RNA derivados do clone cDNA de p4 e de seu derivado Δ30 cada um rendeu vírus (designado rDEN4 wt e eDEN4Δ30, respectivamente) seguindo transfecção de células Vero. Análises de seqüèncias dos vírus rDEN4 revelaram que durante sua passagem e amplificação em células Vero ele acumulou 2 mutações de sentido trocado (nucleotídeos 4353 e 6195), uma mutação silenciosa (nucleotídeo 10157), e uma mutação de ponto na região não- traduzida 3’ (nucleotídeo 10452). Em adição a conter Δ30 e a supressão acompanhante em nucleotídeo 10475, rDEN4Δ30 também acumulou uma mutação de sentido trocado (nucleotídeo 7163) e uma mutação silenciosa (nucleotídeo 7295).
[00203] Vírus wt 814669 parente e vírus recombinantes 2A wt, 2AΔ30, rDEN4, e rDEN4Δ30 cada um replica em células Vero ara um título excedendo 7,0 logw PFU/ml, e sua replicação não é sensitiva a temperatura a 39°C.
[00204] Replicação de vírus, imunogenicidade, e eficácia em macacos. Grupos de macacos rhesus foram inoculados com wt DEN-4 814669, 2A wt, rDEN4, 2AΔ30 e rDEN4Δ30 para avaliar-se o nível de restrição especificado pela mutação Δ30. Amostras de soro foram coletadas diariamente e título de vírus presente no soro foi determinado através de enumeração de placas sobre culturas de monocamadas de células Vero. Macacos inoculados com vírus wt 814669 ou suas contrapartes recombinantes, 2A wt ou rDEN4, foram virêmicos para 3 a 4 dias com um pico de título de vírus médio de aproximadamente 2 logw PFU/ml. Macacos inoculados com vírus 2AΔ30ou rDEN4Δ30 tiveram uma menor freqüência de viremia (83% e 50%, respectivamente), foram virêmicos por somente cerca de 1 dia, e o pico de título médio foi 10 vezes menor. Macacos inoculados com vírus DEN-4 814669, 2A wt, ou rDEN4 desenvolveram altos níveis de anticorpos neutralizantes, com títulos médios entre 442 e 532, consistentes com seu fenótipo tipo selvagem presumido. Macacos inoculados com 2AΔ30 ou rDEN4Δ30 desenvolveram um menor nível de anticorpos neutralizantes, com títulos médios de 198 e 223, respectivamente. A diminuição em título de anticorpos neutrali-zantes em resposta a 2AΔ30 e rDEN4Δ30 é consistente com o fenótipo de atenuação destes vírus. Macacos inoculados com vírus 2AΔ30 (n=4) ou wt 814669 (n=8) foram desafiados após 42 dias com vírus wt 814669. Vírus de dengue não foi detectado em qualquer amostra de soro coletada por até 10 dias seguindo desafio com vírus, indicando que estes macacos foram completamente protegidos seguindo imunização com vírus wt ou candidato a vacina 2AΔ30.
[00205] Uma vez que DEN-4 814669, 2A wt, e rDEN4 cada um manifesta o mesmo nível de replicação e imunogenicidade em macacos rhesus, é razoável concluir-se que as diferenças de seqüências identificadas entre estes pressupostos vírus tipo selvagem que surgem durante passagem em cultura de tecido ou durante construção de plasm ideo não afetam significantemente seu nível de replicação in vivo. Similarmente, o comparável nível de atenuação de 2AΔ30 e rDEN4Δ30 indica que as mutações compartilhadas por estes vírus, por exemplo, a mutação Δ30 e sua acompanhante mutação de supressão 10475, são provavelmente responsáveis pela atenuação destes vírus antes que suas incidentais diferenças de seqüência.
[00206] Resposta clínica a imunização com 2AΔ30. O candi-dato a vacina 2AΔ30 foi administrado subcutaneamente em uma dose de 105 PFU a 20 voluntários soronegativos. Cada um dos vacinados foi infectado e o vírus foi bem tolerado por todos os vacinados. Viremia foi detectada em 70% dos vacinados, estava presente somente em baixo título, e não se estende além do dia 11.
[00207] Nenhum dos 20 vacinados reportou dor ou intumes-cimento no sítio de injeção. Eritema suave (1-3mm) ao redor de sítio de injeção foi notado com exame de 8 voluntários 30 minutos após vacinação que resolveu no dia seguinte em 7 daqueles voluntários e pelo terceiro dia nos voluntários restantes. Dor suave para pressão no sítio de vacinação foi notada em 2 voluntários e demorou no máximo 48 horas. Durante exame físico, dez voluntários (50%) foram notados terem um exantema macular eritematoso semelhante a dengue muito suave (distribuição truncai) que ocorreu com maiores freqüências no dia 10. Nenhum dos voluntários notou por si próprio o exantema, e ele foi assintomático em cada exemplo. Exantema foi visto somente em vacinados com detectável viremia. Voluntários não desenvolveram doença sistêmica. Sete voluntários notaram uma ocasional dor de cabeça que foi descrita como suave, demorando menos que 2 horas, e não estava presente em qualquer voluntário em dois dias consecutivos. Um voluntário reportou febre de 38,6°C e 38,2°C sem acompanhantes, dor de cabeça, calafrios, dor de olho, fotofobia, anorexia, mialgia, ou artralgia como um paciente externo na noite do dia 3 e dia 5, respectivamente. Entretanto, este voluntário estava sem febre quando avaliado pelo pessoal de estudo na manhã de dias 3, 4, 5 e 6. Todas as outras medições de temperatura anotadas pelos voluntários ou pessoal de estudo foram normais. Embora testes torniquete não tenham sido realizados, dois voluntários foram notados terem petéquia no sítio de manguito de pressão de sangue após uma medição de pressão de sangue ser realizada (uma no dia 6, a outra nos dias 7 e 10). Ambos voluntários tiveram contagens de plaquetas normais naquele momento e por todo o estudo.
[00208] Anormalidades hematológicas significantes não foram vistas em qualquer vacinado. Três vacinados com presu-mida neutropenia étnica benigna manifestaram uma contagem de neutrófilos absoluta (ANC) abaixo de 1500/mm3. Estes três voluntários tiveram ANCs de linha base que foram significantemente menores que os restantes 17 voluntários e que não diminuiu desproporcionalmente para os outros voluntários. Dois dos três voluntários que se tornaram neutropênicos nunca tiveram viremia detectável. Um suave aumento em níveis de ALT foi notado em 4 voluntários, e um aumento mais significante em nível de ALT (até 238 IU/L)) foi notado em um voluntário. Estas elevações de ALT foram transientes, não foram associadas com hepatomegalia, e foram completamente assintomáticas em cada um dos cinco volun-tários. Elevados valores de ALT retornaram para normal pelo dia 26 após vacinação. O voluntário com p alto valor de Alt foi também notado ter uma acompanhante elevação suave em AST no dia 14 (104 IU/L) que também retornou para linha base no dia 26 após vacinação. Este voluntário não teve um aumento associado em níveis de LDH, bilirrubina, ou de fosfatase alcalina.
[00209] Resposta sorolóqica de humanos a imunização com 2AΔ30. Cada um dos vinte vacinados desenvolveu um significante aumento em título de anticorpos neutralizantes em soro contra DEN-4 no dia 28. O nível de anticorpos neutralizantes em soro foi similar em vacinados virêmicos (1:662) e não-virêmicos (1:426). Os títulos de anticorpos neutralizantes DEN-4 de ambos os grupos não se alteraram significantemente no dia 42.
[00210] Estabilidade genética da mutação Δ30. Análises de RT-PCR e de seqüências de RNA virai isolado de amostras de soro (n=6) coletadas de voluntários 6 a 10 dias após vacinação confirmaram a presença da mutação Δ30 e supressão vizinha em nucleotídeo 10475.
EXEMPLO 9 Composições Farmacêuticas
[00211] Vacinas de vírus de dengue atenuados vivos, usando vírus replicados da invenção, são usadas para prevenção ou tratamento de infecção com vírus de dengue. Adicionalmente, vacinas de vírus de dengue inativados são providas através de inativação de vírus da invenção usando-se processos conhecidos, tais como, mas não limitado a, tratamento com formalina ou beta- propiolactona. Vírus inativados ou atenuados vivos contendo as mutações descritas acima formam as bases de uma vacina aperfeiçoada para a prevenção ou tratamento de infecção de dengue em humanos.
[00212] Composições farmacêuticas da presente invenção compreendem vírus de dengue inativados ou atenuados vivos, opcionalmente ainda compreendendo soluções, suspensões, e emulsões aquosas ou não-aquosas estéreis. A composição ainda pode compreender agentes ou excipientes auxiliares, como conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Berkow et al. Eds. 1987 The Merck Manual, 15th edition, Merck and Co., Rahway, N.J.; Goodman et al. eds. 1990 Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.; Avery’s Drug Treatment: Principles and Pratice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. 1987; Osol, A. ed. 1980 Remington’s Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Co., Easton, Pa. pp. 1324-1341; Katzung, ed. 1992 Basic and Clinical Pharmacology Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, Conn.
[00213] Uma composição de vacina de vírus da presente invenção pode compreender de cerca de 102-109unidades de formação de placa (PFU)Zml, ou qualquer média ou valor ali, onde o vírus é atenuado. Uma composição de vacina compreendendo um vírus inativado pode compreender uma quantidade de vírus correspondendo a cerca de 0,1 a 50pg de proteína E/ml, ou qualquer faixa ou valor ali.
[00214] Os agentes podem ser administrados usando-se técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Preferivelmente, agentes são formulados e administrados sistemicamente. Rotas apropriadas podem incluir adminis-tração oral, retal, transmucosal ou intestinal; liberação parenteral, incluindo injeções intramusculares, subcutâneas, intra-medulares, assim como injeções intra- tecal, intraven-tricular direta, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, intranasal ou intraocular, justo para citar algumas. Para injeção, os agentes da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiolo-gicamente compatíveis tais como solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com Tris, solução salina tamponada com Hank, meios de crescimento como meio essencial mínimo Eagle (MEM) e semelhantes.
[00215] Quando uma composição de vacina da presente invenção é usada para administração a um indivíduo, ela ainda pode compreender sais, tampões, adjuvantes, ou outras substâncias que são desejáveis para aperfeiçoamento de eficácia da composição. Adjuvantes úteis com a invenção incluem, mas não são limitados a: (1) sais de alumínio (alúmen), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros específicos agentes imuno-estimulantes tais como peptídeos muramil ou componen-tes de parede de célula bacterial), como, por exemplo, (a) MF59 (International Publication No. WO 90/14837), contendo Squaleno 5%, Tween 80 0,5%, e Span 85 0,5% (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE, embora não requerido) formulado em partículas sub- micron usando-se um microflui-dizador como microfluidizador Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo Squaleno 10%, Tween 80 0,4%, polímero bloqueado plurônico L121 5%, e thr-MDP tanto microfluidizado em uma emulsão sub-micron ou feito vórtice para gerar uma emulsão de maior tamanho de partícula, e (c) sistema adjuvante Ribi (RAS) (Ribi Immunochem, Hanilton, MT) contendo Squaleno 2%, Tween 80 0,2%, e um ou mais componentes de parede de célula bacterial do grupo consistindo em mono fosforil lipídeo A (MPL), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto de parede de célula (CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox); (3) adjuvantes saponina, tais como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) podem ser usados ou partícula gerada dos mesmos como ISCOMs (complexos imunoestimulantes); (4) adjuvante de Freunds completo (CFA) e adjuvante de Freunds incompleto (IFA); (5) citocinas, tais como interleucinas (IL-1, IL-2, etc.), fator de estimulação de macrófago (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF), etc.; (6) adjuvantes mucosais tais como aqueles derivados de toxina de cólera (CT), toxina pertussis (PT), toxina termo-instável de E. coli (LT), e seus mutantes (ver, por exemplo, publicações internacionais Nos. WO 95/17211, WO 93/13202, e WO 97/02348; e (7) outras substâncias que atuam como agentes imunoestimulantes para aperfeiçoamento de eficácia da composição.
[00216] Os compostos farmacologicamente ativos desta invenção podem ser processados de acordo com processos convencionais de farmácia galênica para produção de agentes medicinais para administração a pacientes, por exemplo, mamíferos incluindo humanos.
[00217] Os compostos desta invenção podem ser empregados em mistura com excipientes convencionais, por exemplo, substâncias de veículos orgânicos ou inorgânicas farmaceu-ticamente aceitáveis apropriadas para aplicação parenteral, enteral (por exemplo, oral) ou tópica, que não reagem prejudicialmente com os compostos ativos. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem mas não são limitados a água, soluções de sal, álcoois, goma arábica, óleos vegetais, álcoois benzílicos, polietileno glicóis, gelatina, carboidratos tais como lactose, amilose ou amido, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, óleo perfume, monoglicerídeos e diglicerídeos de ácido graxo, ésteres de ácido graxo de pentaeritritol, hidróxi metil celulose, polivinil pirrolidona, etc. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e se desejado mistu-radas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, preservativos, estabilizadores, agentes umectantes, emulsi-ficantes, sais para influenciar pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e semelhantes que não reajam prejudicialmente com os compostos ativos. Elas também podem ser combinadas onde desejado com outros agentes ativos, por exemplo, vitaminas.
[00218] Para aplicação parenteral, particularmente apro-priadas são soluções estéreis, injetáveis, preferivelmente soluções oleosas ou aquosas, assim como suspensões, emulsões, ou implantes, incluindo supositórios. Ampolas são convenientes dosagens unitárias.
[00219] Para aplicação enteral, são particularmente apro-priados comprimidos, drágeas, líquidos, gotas, supositórios ou cápsulas. Um xarope, elixir, ou semelhante pode ser usado onde um veículo adoçante é empregado.
[00220] Para aplicação tópica, são empregadas formas não-espargíveis, viscosas a semi-sólidas ou formas sólidas compreendendo um carreador compatível com aplicação tópica e tendo uma viscosidade dinâmica preferivelmente maior que água. Formulações apropriadas incluem mas não são limitadas a soluções, suspensões, emulsões, cremes, pomadas, pós, linimentos, salvas, aerossóis, etc., que são, se desejado, esterilizados ou misturados com agentes auxiliares, por exemplo, preservativos, estabilizantes, agentes umectantes, tampões ou sais para influenciar pressão osmótica, etc. Para aplicação tópica, também são apropriadas preparações de aerossol espargíveis onde o ingrediente ativo, preferível-mente em combinação com um material carreador inerte sólido ou líquido, é embalado em uma garrafa de apertar ou em mistura com um propelente normalmente gasoso, volátil, pressurizado, por exemplo, um freon.
[00221] A vacina também pode conter quantidades pequenas mas variáveis de endotoxina, formaldeído livre, e preser-vativo, que foram verificados seguros e não contribuindo para a reação de genicidade das vacinas para humanos.
EXEMPLO 10 Propósitos Farmacêuticos
[00222] A administração da composição de vacina pode ser para um propósito “profilático” ou “terapêutico”. Quando provida profilaticamente, as composições são providas antes de qualquer sintoma de infecção viral de dengue se manifestar. A administração profilática da composição serve para prevenir ou atenuar qualquer subseqüente infecção. Quando provida terapeuticamente, a vacina virai inativada ou atenuada viva é provida com a deteção de um sintoma de real infecção. A administração terapêutica do composto(s) serve para atenuar qualquer real infecção. Ver, por exemplo, Berkow et al. eds. 1987 The Merck Manua, 15th edition, Merck and Co., Rahway, N.J.; Goodman et al. 1990 Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.; Avery’s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. 1987; Katzung, . 1992 Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton an Lange, Norwalk, Conn.
[00223] Uma composição de vacina inativada ou atenuada viva da presente invenção pode assim ser provida tanto antes do início de infecção(de modo a evitar ou atenuar uma infecção antecipada) como após o início de uma real infecção.
[00224] As vacinas da invenção podem ser formuladas de acordo com processos conhecidos para preparação de composi-ções farmaceuticamente úteis, pelo que vírus inativados ou atenuados vivos são combinados em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma composição é dita ser um “veículo farmacologicamente aceitável” se sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor. Veículos apropriados são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, em Osol, A. ed. 1980 Remington’s Sciences Mack Publishing Co., Easton, Pa. Pp. 1324-1341.
[00225] Para propósitos de administração, uma composição de vacina da presente invenção é administrada a um receptor humano em uma quantidade terapeuticamente efetiva. Um tal agente é dito ser administrado em uma “quantidade terapeuti-camente efetiva” se a quantidade administrada é fisiologi-camente significante. Uma composição de vacina da presente invenção é fisiologicamente significante se sua presença resulta em uma alteração detectável na fisiologia de um paciente receptor que gera uma resposta imuno de hospedeiro contra pelo menos um sorotipo de dengue, estimula a produção de anticorpos neutralizantes, ou conduz a proteção contra desafio.
[00226] A “proteção” provida não precisa ser absoluta, isto é, a infecção de dengue não precisa ser totalmente prevenida ou radicada, se há um aperfeiçoamento estatisti-camente significante comparado com uma população ou conjunto e pacientes controle. Proteção pode ser limitada a mitigação de severidade ou rapidez de início de sintomas da infecção de vírus de dengue.
EXEMPLO 11 Administração Farmacêutica
[00227] Uma vacina da presente invenção pode conferir resistência a um ou mais sorotipos de dengue através de imunização. Em imunização, uma composição de vacina inativada ou atenuada viva é administrada profilaticamente, de acordo com um processo da presente invenção. Em uma outra realização uma composição de vacina inativada ou atenuada viva administrada terapeuticamente, de acordo com um pro-cesso diferente da presente invenção.
[00228] A presente invenção assim inclui processos para prevenção ou atenuação de infecção por pelo menos um sorotipo de dengue. Como aqui usado, uma vacina é dita prevenir ou atenuar uma doença se sua administração resulta na atenuação total ou parcial (isto é, supressão)) de um sintoma ou condição da doença, ou na imunidade total ou parcial do indivíduo para a doença.
[00229] Pelo menos um vírus de dengue inativado ou atenuado vivo, ou sua composição, da presente invenção pode ser administrado por quaisquer meios que obtenham o propósito pretendido, usando uma composição farmacêutica como descrito anteriormente.
[00230] Por exemplo, administração de uma tal composição pode ser através de várias rotas parenterais tais como rotas subcutâneas, intravenosas, intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intranasais, orais ou transdérmicas. Admi-nistração parenteral pode ser através de injeção de bolus ou através de perfusão gradual com o tempo. Um modo preferido de uso de uma composição farmacêutica da presente invenção é através de aplicação intramuscular, intradérmica ou subcutânea. Ver, por exemplo, Berkow et al. eds. 1987 The Merck Manual 15th edition, Merck and Co., Rahway, N.J.; Goodman et al. eds. 1990 Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.; Avery’s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. 1987; Osol, A. ed. 1980 Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. Easton, Pa. Pp. 1324-1341; Katzung, ed. 192 Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, Conn.
[00231] Um típico regime para prevenção, supressão, ou tratamento de uma patologia relacionada com vírus de dengue, compreende administração de uma quantidade efetiva de uma composição vacina como aqui descrita, administrada como um tratamento simples, ou repetida como dosagens de aperfei-çoamento ou reforço, sobre um período de até e incluindo entre uma semana e cerca de 24 meses, ou qualquer faixa ou valor ali.
[00232] Será apreciado que as reais quantidades preferidas de composto ativo em um caso específico irão variar de acordo com o específico composto sendo utilizado, as composições formuladas, o modo de aplicação, e o particular situs e organismo sendo tratados. Dosagens para um dado hospedeiro podem ser determinadas usando-se considerações convencionais, por exemplo, através de comparação costumeira das atividades diferenciais dos compostos objetos e de um agente conhecido, por exemplo, através de um protocolo farmacológico convencional, apropriado.
[00233] A dosagem de uma vacina de vírus atenuado vivo para um mamífero (por exemplo, humano) pode ser de cerca de 103-107 unidades formadoras de placa (PFU)Zkg, ou qualquer faixa ou valor ali. A dose de vacina inativada pode variar de cerca de 0,1 a 50pg de proteína E. Entretanto, a dosagem deve ser uma quantidade segura e efetiva como determinada através de processos convencionais, usando vacinas exis-tentes como um ponto de partida.
[00234] As composições podem, se desejado, ser apresen-tadas em uma embalagem ou dispositivo dispensador que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária de ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender folha de metal ou plástico, tal como uma embalagem de bolha. A embalagem ou dispositivo dispensador pode ser acompanhada por instruções para administração. TABELA 1 Suscetibilidade de camundongo a infecção de DEN4 intra-cerebral é dependente de idadea
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a Grupos de 4 ou 5 camundongos Swiss Webster foram inoculados intra-cerebralmente com 105 PFU de vírus em 30|LIIde inoculum. Após 5 dias, cérebros foram removidos, homogeneizados e titulados em células Vero. SE = erro padrão. TABELA 2 Fenótipos de atenuação em cérebro de camundongo (att) e sensitivo a temperatura (ts) de vírus DEN4 mutantes de 5-FU
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a redução de título (logw PFU/ml) a 39°C comparada a título em temperatura permissível. b Grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c.com 104 PFU de vírus em 30pl de inoculum. Cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. c média de 11 experimentos com um total de 64 e 66 camundongos por grupo. d determinado por comparação de títulos virais médios de camundongos inoculados com vírus mutante e o controle 2A- 13 wt no mesmo experimento (n=6 ou 12). e valores sublinhados indicam uma redução de 2,5 ou 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou células HuH, respectivamente, na temp indicada quando comparado a título em temperatura permissível (35°C. TABELA 3 Diferenças de nucleotideos e aminoácidos dos vírus mutantes com 5-FU que são ts em ambas células Vero e HuH-7
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a vírus que contêm mutações resultando em uma substituição de amino- ácidos em somente um gene NS e/ou substituições de nucleotídeos nas UTRs são indicadas; isto é, nenhuma substituição de aminoácido está presente nas proteínas estruturais (C-prM-E) b posição de aminoácido em poliproteína DEN4 iniciando com o resíduo metionina da proteína C (nt 102-104) como resíduo #1. Aminoácido tipo selvagem sobre esquerda de posição de aminoácido; aminoácido mutante na direita. TABELA 4 Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos dos vírus mutantes de 5-FU que são ts somente em células HuH-7
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a vírus que contêm mutação resultando em substituição de aminoácido em somente um gene NS e/ou substituições de nucleotídeos nas UTRs são indicadas; isto é, nenhuma substituição de aminoácido está presente nas proteínas estruturais b posição de aminoácido em poliproteína DEN4 iniciando com o resíduo metionina da proteína C (nt 102-104) como resíduo #1. Aminoácido tipo selvagem na esquerda de posição de aminoácido; aminoácido mutante à direita. TABELA 5 Mutações que são representadas em múltiplos vírus DEN4 mutantes com 5-FU
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a não aplicável TABELA 6 Adição de mutação ts 4995 ou rPEN4A30 confere um fenótipo ts e ainda atenua sua replicação em cérebro de camundongo jovem
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a redução em título (logw PFU/ml) a 39°C comparada a título na temperatura permissível (35°). b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vírus em 30ul de inoculum. Cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. O limite de deteção é 2,0 logw PFU/g de cérebro. c determinado por comparação de títulos virais médios de camundongos inoculados com vírus amostra e controle rDEN4. d valores sublinhados indicam uma redução de 2,5 ou 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou células HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada à temperatura permissível. TABELA 7 Fenótipos de atenuação em cérebro de camundongo (att) e sensitivo à temperatura (ts) de vírus mutantes DEN4 com 5-FU que exibem um fenótipo de placa pequena (sp)
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TABELA 7 (continuação)
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a.redução em título de vírus médio (logw PFU/ml) a 39°C comparada à temperatura permissível (35°C). b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104PFU de vírus. Cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. c média de 11 experimentos com um total de 64 a 66 camundongos por grupo. d determinado por comparação de títulos virais médios de camundongos inoculados com vírus mutante e simultâneo controle vírus tipo selvagem (wt) 2A-13 (n=6 ou 12). e valores sublinhados indicam uma redução de 2,5 ou 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou células HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada à temperatura permissível (35°C). x tamanho de placa pequeno a 35°C; placas pequenas têm um diâmetro de <1,0mm comparado a diâmetro de placa tipo selvagem de 1,5-2,0mm em células Vero, ou um diâmetro de <0,4mm comparado a diâmetro de tipo selvagem de 0,75 a 1,0mm em células HuH-7. TABELA 8 Vírus com ambos fenótipos ts e sp são mais restritos em replicação em cérebro de camundongo que aqueles com somente um fenótipo ts
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a 20 vírus mutantes ts sem um fenótipo sp foram previamente descritos (exemplo 1). b determinado por comparação de títulos virais médios de grupos de camundongos inoculados com vírus mutante e simultâneo vírus controle passado em paralelo 2A-13. c diferença significante entre grupo ts e grupo ts/sp, teste de Tukey- Kramer (P<0,05) TABELA 9 Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos dos vírus DEN4 mutantes com 5-FU que produzem placas pequenas em ambas células Vero e HuH-7
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a vírus contêm mutações de sentido trocado somente em genes não- estruturais. b posição de aminoácido em poliproteína DEN4 iniciando com o resíduo metionina da proteína C (nt 102-104) Aminoácido tipo selvagem na esquerda de posição de aminoácido; aminoácido mutante à direita. TABELA 10 Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos dos vírus mutantes 5-FU que produzem placas pequenas somente em células HuH-7
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a vírus que contêm mutações de sentido trocado somente nos genes estruturais e/ou mutações nas UTRs. bposição de aminoácido em poliproteína DEN4 iniciando com o resíduo me- tionina da proteína C (nt 102-104) Aminoácido tipo selvagem na esquerda de posição de aminoácido; aminoácido mutante à direita. TABELA 10 (continuação)
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a vírus que contêm mutações de sentido trocado somente nos genes estruturais e/ou mutações nas UTRs. b posição de aminoácido em poliproteína DEN4 iniciando com o resíduo me- tionina da proteína C (nt 102-104) Aminoácido tipo selvagem na esquerda de posição de aminoácido; aminoácido mutante à direita. TABELA 11 Mutações de adaptação à células Vero putativas derivadas do inteiro conjunto de vírus mutantes 5-FU
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a não-aplicável b posição de aminoácido em poliproteína DEN4 iniciando com o resíduo metionina da proteína C (nt102-104) como resíduo #1. Tabela 12 Oligonucleotídeos mutagênicos usados para gerar vírus DEN4 recombinante contendo mutações 5-FU simples.
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TABELA 12 (continuação)
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a primers foram engeπheirados os quais introduziram (sublinhado) ou removeram (linha tracejada) sitos de enzima de restrição translacionalmente silenciosos. b letras em caixa baixa indicam mudanças de nt e letras em negrito indicam o sítio da mutação 5-FU, que em alguns oligonucleotídeos difere da mudança de substituição de nucleotídeo original de modo a criar um sítio de enzima de restrição único. A mudança preserva o códon para a substituição de aminoácido. TABELA 13 Fenótipos de atenuação em camundongo e sp, ts de vírus mutantes rDEN4 codificando mutações simples em seis vírus mutantes 5-FU sp
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TABELA 13 (continuação)
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aredução em título médio de vírus (logw PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissível (35°C). b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vírus. Cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. c comparação de títulos médios de camundongos inoculados com vírus mutante e simultâneo controle DEN4. Negrito representa >50- ou >100 vezes de diminuição em replicação em camundongos jovens ou SCID-HuH-7, respectivamente. d grupos de camundongos HuH-7-SCID foram inoculados diretamente no tumor com 104 PFU de vírus. Soro foi coletado nos dias 6 e 7 e titulado em células Vero. evalores sublinhados indicam uma redução de 2,5 a 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou HuH, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissível (35°C). x tamanho de placa pequeno a 35°C; placas pequenas têm um diâmetro de <1,0 mm comparado a diâmetro de placa tipo selvagem de 1,5-2,0mm em células Vero, ou um diâmetro de <0,4mm comparado a diâmetro de placa tipo selvagem de 0,75 a 1,0 mm em células HuH-7. TABELA 14 Fenótipos de vírus mutantes rDEN4 codificando mutações simples identificadas em 10 vírus mutantes 5-FU que são ts em ambas células Vero e HuH-7
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TABELA 14 (continuação)
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a redução em título médio de vírus (logw PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissível (35°C) b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vírus. Cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. c comparação de títulos médios de vírus de camundongos inoculados com vírus mutantes e simultâneo controle DEN4. Negrito representa diminuição de > 50- ou >100 vezes. Em replicação em camundongos jovens ou SCID-HuH-7, respectivamente. d grupos de camundongos HuH-7-SCID foram inoculados diretamente no tumor com 104 PFU de vírus. Soro foi coletado nos dias 6 e 7 e titulado em células Vero. e valores sublinhados indicam uma redução de 2,5 ou 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou HuH, respectivamente,na temperatura indicada quando comparada à temperatura permissível (35°C). f dados representam os resultados de um vírus rDEN-4-4995 simples. x tamanho de placa pequeno a 35°C; placas pequenas têm um diâmetro de <1,0 mm comparado a diâmetro de placa tipo selvagem de 1,5-2,0mm em células Vero, ou um diâmetro de <0,4mm comparado a diâmetro de placa tipo selvagem de 0,75 a 1,0 mm em células HuH-7. TABELA 15 Fenótipos de atenuação em camundongo, sp e ts de vírus mutantes rDEN 4 codificando mutações simples identificadas em 3 vírus mutantes 5-FU ts específicos de célula HuH-7
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aredução em título médio de vírus (logw PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissível (35°C) b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vírus. Cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. c determinado por comparação de títulos médios virais de camundongos inoculados com vírus mutantes e simultâneo controle 2A-13 ou rDEN4 wt. d valores sublinhados indicam uma redução de 2,5 ou 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada à temperatura permissível (35°C). TABELA 16 Fenótipos sensitivo a temperatura (ts) e de atenuação em cérebro de camundongo (att) de adicionais vírus rDEN4 codificando mutações 5-FU simples.
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a redução em título médio de vírus (logw PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissível (35°C) b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vírus. Cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. Limite de deteção é 2,0 Iog10 PFU/g. c determinado por comparação de títulos médios virais de camundongos inoculados com vírus amostra e controle rDEN4 wt. d valores sublinhados indicam uma redução de 2,5 ou 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada à temperatura permissível (35°C). e a mutação 7546 também está presente em nove outros vírus mutantes 5-FU. x tamanho de placa pequeno a 35°C; placas pequenas têm um diâmetro de <0,4mm comparado a diâmetro de placa wt de 0,75 a 1,0mm em células HuH-7. f não determinado. ** o fenótipo att é definido como uma redução de >1,5 logw PFU/g comparada a vírus wt. TABELA 17 Crescimento de DEN-4-2A-13 em camundongos SCID transplantados com células HuH-7
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camundongos SCID foram injetados i.p. com 107 células de hepatoma humano HuH-7. Aproximadamente 8 semanas depois, grupos de camundongos SCID-HuH-7 transportando tumor foram inoculados com vírus diretamente no tumor. Soro e tecidos foram coletados no dia 5, processados, e titulados em células Vero. Tabela 18 Combinação de mutações ts, NS3 4995, e NS5 7849, em rDEN4 resulta em um fenótipo ts aditivo
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a redução em título médio de vírus (logw PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissível (35°C) b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vírus. Cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. Limite de deteção é 2,0 Iog10 PFU/g. c determinado por comparação de títulos médios virais de camundongos inoculados com vírus amostra e controle rDEN4 wt. d valores sublinhados indicam uma redução de 2,5 ou 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou HuH-7, respectivamente,na temperatura indicada quando comparada à temperatura permissível. TABELA 19 As mutações 5-FU são compatíveis com a mutação Δ30 para replicação no cérebro de camundongo jovem
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a Grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vírus. Cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. b Comparação de títulos médios de vírus de camundongos inoculados com vírus mutante e controle rDEN4. cMutação restringe crescimento em ambos, cérebro de camundongo e camundongo SCID-HuH-7. d Mutação restringe crescimento somente em cérebro de camundongo. A mutação 8092 não foi testada em camundongo SCID-HuH-7. TABELA 20 Fenótipos sensitivo a temperatura e de atenuação em cérebro de camundongo de vírus transportando mutações carqa-aqrupamento-para alanina no gene NS5 de DEN4.
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TABELA 20 (continuação)
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a Posições do par de aminoácidos mutados para um par de alanina; numeração começa no terminus amino da proteína NS5. bvalores sublinhados indicam uma redução de 2,5 ou 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada à temperatura permissível. c redução em título (logw PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissível (35°C). d Grupos de seis camundongos foram inoculados i.c. com 4,0 logw PFU em 30ul de inoculum. Os cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. e Determinado por comparação de títulos médios virais em camundongos inoculados com vírus amostra e simultâneos controles wt (n=6). O fenótipo de atenuação é definido como uma redução de > 1,5 logw PFU/g comparada a vírus wt; reduções de >1,5 são listadas em negrito. TABELA 21 Fenótipos de atenuação em SCID-HuH-7 de vírus transportando mutações carga-agrupamento-para-alanina no gene NS5 de DEN4
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a Posições do par de aminoácidos mutados para um par de alanina; numeração começa no terminus amino da proteína NS5. b Grupos de camundongos SCID-HuH-7 foram diretamente inoculados no tumor com 104 PFU de vírus. cComparação de títulos médios de vírus de camundongos inoculados com vírus mutantes e simultâneo controle DEN4. Negrito representa uma diminuição de >100 vezes em replicação. Um sinal (-) indica um aumento em replicação em relação a wt. TABELA 22 Combinação de mutações carga-agrupamento-para-alanina emparelhadas em vírus mutantes par-duplo
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TABELA 23 Fenótipos sensitivo a temperatura e de atenuação em cérebro de camundongo de mutantes carga-agrupamento-para-alanina duplos do gene NS5 de rDEN4
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TABELA 23 (continuação)
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a Posições do par de aminoácidos mutados para um par de alanina; numeração começa no terminus amino da proteína NS5 bValores sublinhados indicam uma redução de 2,5 ou 3,5 logw PFU/ml em título em células Vero ou HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada à temperatura permissível (35°C). c Redução em título (logw PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissível (35°C). d Grupos de seis camundongos foram inoculados i.c. com 4,0 logw PFU em 30ul de inoculum. Os cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. e Determinado por comparação de títulos virais médios em camundongos inoculados com vírus amostra e simultâneos controles wt (n=6); reduções >1,5 são listadas em negrito. TABELA 24 Fenótipos de atenuação em SCID-HuH-7 de mutantes carga-agrupamento-para-alanina duplos do gene NS5 de rDEN4
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a Posições do par de aminoácidos mutados para um par de alanina; numeração começa no terminus amino da proteína NS5. bGrupos de camundongos SCID-HuH-7 foram inoculados diretamente no tumor com 104 PFU de vírus. Soro foi coletado nos dias 6 e 7 e titulado em células Vero. cComparação de títulos de vírus médios de camundongos inoculados com vírus mutante e simultâneo controle. Negrito representa uma diminuição de >100 vezes em replicação. Um sinal (+) indica um aumento em replicação em relação a wt. TABELA 25 Fenótipos (sensitividade a temperatura, tamanho de placa e replicação em cérebro de camundongo e camundongo SCID-HuH-7) de DEN4 wt e vírus contendo as mutações Δ30 e 7129
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a.posição e identidade dos nucleotídeos alterados. b Redução em título (logw PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissível (35°C). c Grupos de seis camundongos foram inoculados i.c. com 4,0 logw PFU em 30ul de inoculum. Os cérebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em células Vero. d Determinado por comparação de títulos virais médios em camundongos inoculados com vírus amostra e simultâneos controles wt (n=6). O fenótipo de atenuação é definido como uma diminuição de > 50- ou >100 vezes em replicação em camundongos jovens ou SCID-HuH-7, respectivamente. Um sinal (-) indica um aumento em replicação em relação ao controle wt. e Grupos de camundongos SCID-HuH-7 foram inoculados diretamente no tumor com 104 PFU de vírus. Soro foi coletado nos dias 6 e 7 e titulado em células Vero. * tamanho de placa pequeno. TABELA 26 O mutante de placa pequena 5-1A1 5-flúor uracila demonstra uma restrição de infecção de intestino médio seguindo infecção oral de mosquitos Aedes aegypti
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a Quantidade de vírus ingerida, assumindo uma refeição de sangue de 2p.l. b Número (porcentagem) de mosquitos com antígeno de vírus de dengue de- tectável em tecido de intestino médio, mas nenhum antígeno de vírus de dengue detectável na cabeça; mosquitos foram ensaiados 21 dias após alimentação, e antígeno de vírus de dengue foi identificado por IFA. c Número (porcentagem) de mosquitos com antígeno de vírus de dengue detectável em ambos tecidos, de intestino médio e cabeça. d Número total (porcentagem) de mosquitos com antígeno de vírus de dengue. e A proporção de infecções totais causadas por DEN4 tipo selvagem foi significantemente maior que a proporção causada por 5-1A1 (regressão logística, N=426, P<0,0001). Existiu pouca infecção disseminada causada por 5-1A1 para permitir análise estatística. TABELA 27 O mutante de placa pequena 5-1A1 5-flúor uracila demonstra uma restrição de infecção seguindo inoculação intra-toráxica de mosquitos Toxorhynchites splendens
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a Quantidade de vírus inoculada em um inoculum de 0,22|il. b Número (porcentagem) de mosquitos com antígeno de vírus de dengue detectável em tecido de cabeça; mosquitos foram ensaiados 14 dias após inoculação, e antígeno de vírus de dengue foi identificado por IFA. c A proporção de infecções causadas por DEN4 tipo selvagem foi significantemente maior que a proporção causada por 5-1A1 (regressão logística, N=36, P<0,01). TABELA 28 Primers de mutagênese para a supressão ou troca de seqüências em DEN4 mostrando diferenças conservadas de flavivírus transportados por carrapato
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TABELA 29 Título de vírus e tamanho de placa de vírus mutantes UTR 3’ em células Vero e C6/36
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1 Tamanho de placa é designado como equivalente a tipo selvagem (wt) ou <50% de tipo selvagem (sp) sobre o tipo de célula designado. TABELA 30 Infectividade de DEN4wt e mutantes UTR 3’ para Toxorhynchites splendensvia inoculação intra-toráxica
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a.Quantidade de vírus inoculada em um inoculum de 0,22p.l. b Porcentagem de mosquitos com antígeno de vírus de dengue de- tectável em tecido de cabeça; mosquitos foram ensaiados 14 dias após inoculação, e antígeno de vírus de dengue foi identificado por IFA. TABELA 31 Infectividade de vírus mutantes trocados UTR 3’ para Aedes aegypti alimentados sobre uma refeição de sangue infecciosa
Figure img0063
a.Quantidade de vírus ingerida, assumindo uma refeição de sangue de 2p. b Número (porcentagem) de mosquitos com antígeno de vírus de dengue detectável no tecido de intestino médio; mosquitos foram ensaiados 14d após alimentação e antígeno de vírus de dengue foi identificado por IFA. c Em uma dose de 3,8 logw PFU, rDEN4trocado10535-10544 infectou significantemente menos mosquitos no intestino médio que rDEN4 wt (teste exato de Fish, N=43, P<0,01), embora infecções disseminadas não fossem significantemente diferentes (teste exato de Fisher, N=43, P=0,38). d Número (%) de mosquitos com antígeno de vírus de dengue detectável no tecido de cabeça. TABELA 32 Mutações de adaptação a células Vero putativas derivadas do conjunto de vírus mutantes 5-FU e outros vírus DEN4 passados em células Vero
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a.Conservação com DEN1, DEN2, ou DEN3 é designado por sobrescrito. Falta de conservação é designada por ausência de sobrescrito b Posição de aminoácido em poliproteína DEN4 iniciado com o resíduo metionina da proteína C (nt 102-104) como resíduo #1. cnão aplicável. TABELA 33 Análise de seqüèncias de rPEN2/4A30 clone 27(p4)-2-2A2
Figure img0066
* Mesma como posição de nucleotídeo de DEN4 7546 TABELA 34 Análise de seqüèncias de rDEN2/4A30 clone 27(p3)-1-1A1.
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* Códon adjacente a mutação 5-FU 4891 TABELA 35 Vírus recombinante rDEN2/4A30 transportando mutações de adaptação Vero podem ser recuperados e titulados sobre células Vero
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1 Vírus recuperado seguindo transfecção de células C6/36 de mosquitos foi terminalmente diluído uma vez em células C6/36 e simultaneamente titulado em células C6/36 e células Vero. 2 Não determinado. TABELA 36 Mutações de adaptação a células Vero putativas de vírus de dengue tipo 4 e o correspondente resíduo de aminoácido tipo selvagem em outros vírus de dengue
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a Posição de aminoácido é dada para a poliproteína de DEN4. b DEN4= rDEN4 (GenBank AF326825); DEN1= Western pacific (GenBank DVU88535); DEN2=New Guinea C (GenBank AF038403); DEN3=H87 (GenBank M93130). c Sublinhados são compartilhados entre DEN4 e um ou mais tipos de DEN adicionais. TABELA 37 Mutações conhecidas atenuarem vírus de dengue tipo 4eo correspondente resíduo de aminoácido tipo selvagem em outros vírus de dengue.
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Figure img0071
a.Posição de aminoácido é dada para a poliproteína de DEN4. b DEN4= rDEN4 (GenBank AF326825); DEN1= Western pacific (GenBank DVU88535); DEN2=New Guinea C (GenBank AF038403); DEN3=H87 (GenBank M93130). c Esta mutação resulta em replicação reduzida de den4 em mosquitos. d Nucleotídeos sublinhados são compartilhados entre DEN4 e um ou mais tipos de DEN adicionais. APÊNDICE 1 Seqüência de cepa de virus de dengue tipo 4 recombinante 2A LOCUS AF375822 10649 bp ss-RNA linear VRL 19-SEP-2001 DEFINIÇÃO Clone 2A recombinante do tipo 4 de virus de dengue, genoma completo. Acesso AF375822 versão AF375822.1 GI: 14269097 Palavras Chave Fonte virus de dengue Tipo 4. Organismo virus de dengue Tipo 4 Virus; virus de fita ppositiva ssRNA, sem estágio DNA; Flaviridae; Flavivírus; grupo de virus de dengue. REFERÊNCIA 1 (bases 1 a 1064) AUTORES Blaney, J.E. Jr., Johnson, D.H., Firestone, C.Y., Hanson, C.T., Murphy, B.R. e Whitehead, S.S. TÍTULO Mutagênese Química de Vírus de Dengue Tipo 4 Produz Vírus Mutantes que São Sensíveis á Temperatura em Células Vero ou Células de Fígado Humano e Atenuadas em Camundongos Jornal J. Virol. 75 (20), 9731-9740 (2001) MEDLINE 21443968 PUBMED 11559806 REFERÊNCIA 2 (bases 1 a 10649) AUTORES Blaney, J.E. Jr., Johnson, D.H., Firestone, C.Y., Hanson, C.T., Murphy, B.R. e Whitehead, S.S. TÍTULO Submissão Direta JORNAL Submetido (2/5/2001) LID, NIAID, 7 Center Drive, Betesdá, MD 20892, E.U.A. CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores
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Contagem de bases 3302 a 2212 c 2800 g 2335 t Origem
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APENDICE2 Seqüência de cepa de vírus de dengue tipo 4 recombinante rDEN4 LOCUS AF326825 10649 bp RNA VRL 03-JAN-2001 DEFINIÇÃO Vírus de Dengue Tipo 4clone de RDEN4 recombinante de vírus de Dengue tipo 4, sequência completa ACESSO AF326825 VERSÃO AF326825.1 Gl: 12018169 PALAVRA CHAVE ORGANISMO Vírus de Dengue tipo 4; Vírus de uma fita positiva ssRNA, sem estágio de DNA Flaviviridae; Flavivírus; grupo de vírus de Dengue REFERENCIA 1 (bases 1 a 10649) AUTORES Durbin, A.P., Karron, R.A., Sun, W., Vaughn, D.W., Reynolds, M.J., Perreault, J.R., Men,R.H., Lai,C.J., Elkins,W.R., Chanock, R.M., Murphy,B.R. and Whitehead,S.S. TÍTULO Candidato a vacina de vírus de Dengue tipo 4 atenudo vivo com supressão de nucleotídeo na região não traduzida 3' é altamente atenuada e imunogênica em seres humanos JORNAL não publicado REFERÊNCIA 2 (bases 1 a 10649) AUTORES Whitehead, S.S. TÍTULO Submissão direta JORNAL Submetido (08-DEC-200) LID, NIAID, 7 Center Drive, Bethesda, MD 20892 EUA. CARACTERÍSTICAS local / qualificadores
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APENDICE 3 Seqüência de cepa de vírus quimérico de dengue tipo 2 recombinante rDEN2/4Δ30 LOCUS Submissão pendente DEFINIÇÃO clone recombinante de virus de dengue tipo 2 rDEN2/4Δ30, sequência completa ACESSO Submissão pendente VERÇÃO PALAVRAS CHAVE FONTE vírus de dengue tipo 2 NGC ORGANISMO vírus de dengue tipo 2 Vírus; de fita positiva de ssRNA, sem estágio de DNA Flaviviridae;  Flavivírus; grupo de vírus de dengue. REFERÊNCIA 1 (BASES 1 A 10616) AUTORES TÍTULO JORNAL não publicado CARACTERÍSTICAS local/qualificadores
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APÊNDICE 4 Alinhamento de poliproteinas de virus de dengue
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*identidade de resíduo similaridade de resíduo
[00235] Embora a presente invenção tenha sido descrita com alguns detalhes com a finalidade de clareza e entendimento, aquele versado na técnica compreenderá que várias alterações na fórmula e detalhes podem ser feitos sem se desviar do real escopo da invenção. Todas as figuras, tabelas e apêndices, bem como patentes, pedidos e publicações referidos acima estão aqui incorporadas a título de referência.

Claims (14)

1. Vírus da dengue atenuado CARACTERIZADO pelo fato de que o genoma virai é modificado pela introdução de uma mutação carga-agrupamento- para-alanina nos aminoácidos 2923 e 2924 (D/H2923A; K/R2924A), que corresponde aos nucleotideos 8868-8873 do isolado prototípico DEN4 Dominica 1981 (SEQ ID NO: 16).
2. Vírus da dengue atenuado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende uma deleção de cerca de 30 nucleotideos da região não traduzida 3’ correspondente à estrutura haste-alça TL2, em que os nucleotideos correspondem aos nucleotideos 10478- 10507 do vírus da dengue tipo 4 (SEQ ID NO: 14).
3. Vírus da dengue atenuado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus da dengue é um vírus da dengue tipo 1, vírus da dengue tipo 2, vírus da dengue tipo 3 ou vírus da dengue tipo 4.
4. Vírus da dengue atenuado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus da dengue é um vírus quimérico compreendendo proteínas estruturais de um primeiro vírus da dengue e proteínas não estruturais de um segundo vírus da dengue.
5. Vírus da dengue atenuado, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus quimérico tem proteínas não estruturais de um vírus da dengue tipo 1, um vírus da dengue tipo 2, um vírus da dengue tipo 3 ou um vírus da dengue tipo 4.
6. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um veículo farmacologicamente aceitável e um vírus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 6, em um dispositivo de acondicionamento ou dispensador e instruções para administração.
8. Vacina de vírus da dengue tetravalente CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um veículo farmacologicamente aceitável e pelo menos um vírus da dengue, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a vacina tetravalente compreende um vírus da dengue tipo 1, um vírus da dengue tipo 2, um vírus da dengue tipo 3 e um vírus da dengue tipo 4.
9. Vacina de vírus da dengue atenuado vivo CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um veículo farmacologicamente aceitável e um vírus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
10. Vacina de vírus da dengue atenuado vivo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIDA pelo fato de que está na forma de dosagem unitária tendo de 102a 109 unidades formadoras de placas (PFU)ZmL.
11. Vacina de vírus da dengue inativado CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um veículo farmacologicamente aceitável e um vírus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
12. Vacina de vírus da dengue inativado, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que está na forma de dosagem unitária tendo de 0,1 a 50 pg de proteína E/mL.
13. Método para preparar um vírus da dengue CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) sintetizar in vitroo RNA genômico virai de comprimento total usando uma molécula de cDNA que codifica um vírus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5; (b) transfectar as células cultivadas com o RNA genômico virai para produzir vírus; e (c) isolar o vírus das células cultivadas.
14. Método para preparar uma composição farmacêutica, CARACTERIZADO pelo fato de que é pela combinação de um veículo farmacologicamente aceitável e um vírus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
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