BR122019026154B1 - vírus da dengue atenuado, composições farmacêuticas compreendendo dito vírus, kit, vacinas tetravalente, atenuada viva e inativada contra o vírus da dengue, e métodos para preparar um vírus da dengue e uma composição farmacêutica - Google Patents

vírus da dengue atenuado, composições farmacêuticas compreendendo dito vírus, kit, vacinas tetravalente, atenuada viva e inativada contra o vírus da dengue, e métodos para preparar um vírus da dengue e uma composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

A presente invenpao refere-se ao desenvolvimento de um menu de mutapoes que e util na afinapao da atenuapao de caractensticas de crescimento das vacinas de virus da dengue.

Description

[001] Dividido do PI0209943-8, depositado em 22/05/2002.
CAMPO DA INVENCAO
[002] Um menu de mutagoes foi desenvolvido o qual e util em sintonia fina de atenuagao de caracteristicas de crescimento de vacinas de virus de dengue.
ANTECEDENTES DA INVENCAO
[003] Virus de dengue e um virus RNA sentido-positivo pertencendo ao genera flavivirus da familia Flaviviridae. Virus de dengue e amplamente distribuido por todas as regides tropicais e semi-tropicais do mundo e e transmitido a humanos por vetores mosquitos. Virus de dengue e uma causa lider de hospital izagao e morte em criangas em pelo menos oito paises Asiaticos tropicais (WHO, 1997. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment, prevention and control-2nd ed. Geneva:WHO). Existem quatro sorotipos de virus de dengue (DEN-1, DEN-2, DEN3, e DEN-4) que anualmente causam uma estimativa de 50-100 milhoes de casos de febre de dengue e 500 000 da forma mais severa de infecgao de virus de dengue, febre hemorragica de dengue/sindrome de choque de dengue (DHF/DSS)(Gubler, D.J. & Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53: 35-70). DHF/DSS e visto predominantemente em criangas e adultos experimentando uma segunda infecgao de virus de dengue com um sorotipo diferente daquele de sua primeira infecgao de virus de dengue e em infecgao primaria de criangas que ainda tern anticorpo maternal especifico-dengue circulante (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trap Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trap Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trap Med Hyg 56:566-72). Uma vacina e necessaria para diminuir a carga de doenga causada por virus de dengue, mas nenhuma esta licenciada. Devido a associagao de doenga mais severa com infecgao de virus de dengue secundaria, uma vacina bem sucedida tern de induzir imunidade para todos os quatro sorotipos. Imunidade e primariamente mediada por anticorpo neutralizante direcionado contra o envelope de glicoproteina E, uma proteina estrutural de virion. Infecgao com um sorotipo induz imunidade homotipica de vida-longa e uma imunidade heterotipica de vida curta (Sabin, A. 1955 Amer J Trap Med Hyg 4:198207). Por isso, a meta de imunizagao e induzir uma resposta de anticorpo neutralizante de vida longa contra DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4, que pode ser melhor obtida economicamente usando-se vacinas de virus atenuado vivo. Esta e uma meta razoavel uma vez que uma vacina atenuada viva ja foi desenvolvida para o virus de febre amarela relacionado, um outro flavivirus transportado por mosquitos presente em regioes tropicals e semitropicais do mundo (Monath, T.P. & Heinz, F.X. 1996 em: Fields B.N. et al. eds. Fields Virology Philadelphia: Lippincott-Ravan Publishers, 961-1034).
[004] Varies candidates a vacina de dengue atenuada viva foram desenvolvidos e avaliados em humanos ou primatas nao-humanos. Os primeiros candidates de vacina de dengue atenuada viva foram mutantes de faixa hospedeira desenvol-vidos por passagem serial de virus de dengue tipo selvagem nos cerebros de camundongos e selegao de mutantes atenuados para humanos (Kimura, R. & Hotta, S. 1994 Japanese J Bacteriology 1:96-99; Sabin, A.B. & Schlesinger, R.W. 1945 Science 101:640; Wisseman, C.L. Jr. Et al. 1963 Am J Trap Med 12:620-623). Embora estes virus de vacina candidates tenham sido imunogenicos em humanos, seu crescimento pobre em cultura de celulas desencorajou ainda desenvolvimento. Adicionais candidates a vacina de DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4 atenuada viva foram desenvolvidos por passagem serial em cultura de tecido (Angsubhakorn, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trap Med Public Health 25:554-9; Bancroft, W.H. et al. 1981 Infect Immun 31:698-703; Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ 65:189-95; Eckels, K. H. et al. 1984 Am J Trap Med Hyg 33:684-9; Hoke, C.H.Jr. et al. 1990 Am J Trap Med Hyg 43: 219-26; Kanessa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-88) ou atraves de mutagenese quimica (McKee, K.T. Jr. et al. 1987 Am J Trap Med Hyg 36:435-42). Foi provado ser dificil a obtengao de um satisfatorio balango entre atenuagao e imunogenicidade para cada um dos quatro sorotipos de virus de dengue usando estas abordagens e para formulagao de uma vacina tetravalente que seja segura e satisfatoriamente imunogenica contra cada um dos quatro virus de dengue (Kanesa-thasan, N et al. 2001 Vaccine 19:3179-88; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18 Suppl 2:44-7).
[005] Dois maiores avangos utilizando tecnologia de RNA recombinante tornaram recentemente possivel o desenvolvi-mento de adicionais candidates promissores de vacina de virus de dengue atenuado vivo. Primeiro, foram desenvolvidos processes para recuperagao de virus de dengue infeccioso a partir de celulas transfectadas com transcritos de RNA derivados de um clone de cDNA de inteiro comprimento do genoma de virus da dengue, tornando assim possivel derivar-se virus infecciosos transportando mutagoes atenuantes que foram introduzidas no clone de CDNA atraves de mutagenese de sitio direcionado (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-43). Segundo, e possivel produzir-se virus quimericos antigenicos nos quais a regiao codificando proteina estrutural do clone de cDNA de inteiro comprimento de virus de dengue e substituida por aquela de um diferente sorotipo de virus de dengue ou de um flavivirus mais divergente (Bray, M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6; Chen, W. et al. 1995 HJ Virol 69:5186-90-; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS USA 95:1746-51). Estas tecnicas foram usadas parra construgao de virus de dengue quimericos inter-tipicos que foram mostrados serem efetivos em protegao de macacos contra desafio de virus de dengue homologos (Bray, M. et al. 1996 J Virol 70:4162-6). A despeito destes avangos, existe uma necessidade de desenvolvimento de vacinas de virus de dengue antigenicos atenuados que especifiquem um satisfatorio balango entre atenuagao e imunogenicidade para humanos.
SUMARIO DA INVENCAQ
[006] A invenção proporciona mutagoes que conferem sensibilidade a temperatura em celulas Vero ou celulas de figado humano, restrigao de hospedeirocelula, adaptagao de hospedeiro-celula para aperfeigoada replicagao de celulas Vero, ou atenuagao em camundongos, cujas mutagoes sao uteis em sintonizagao fina de caracteristicas de atenuagao e crescimento de vacinas de virus de dengue.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[007] A Figura 1 mostra crescimento de wtDEN42A e candidate vacina, 2AA30, em celulas Vero e HuH-7. Celulas Vero (A) ou HuH-7 (B) foram infectadas com DEN4 2A ou 2AA30 em uma multiplicidade de infecgoes (MOI) de 10 ou 0,01. Monocamadas de celulas confluentes em frascos de culturas de tecido de 25mm foram lavadas e revestidas com um inoculum de 1,5 ml contendo o virus indicado. Apos uma incubagao de duas horas a 37°C, celulas foram lavadas tres vezes em PBS e 7ml de meios de cultura suplementados com FBS 2% foram adicionados. Uma aliquota de 1ml de meio de cultura de tecido foi removida, substituida com meio novo, e designada o ponto de tempo de hora 0. Nos pontos de tempo indicados apos infeegao, amostras de meios de cultura de tecido foram removidas e congeladas a 70°C. O nivel de replicagao viral foi avaliado por titulagao de placa em celulas Vero. Resumidamente, diluigoes de dez vezes seriais de amostras de meios de cultura de celula foram inoculadas em monocamadas de celula Vero confluentes em placas de 24 pogos em duplicatas e revestidas com Opti-MEM contendo 0,8% metil celulose. Apos cinco dias, placas foram visualizadas por coloragao com imunoperoxidase como descrito no Exemplo 1.
[008] A Figura 2 mostra geragao de virus DEN4 sensfvel a temperatura (ts) atraves de mutagenese quimica com 5-fluor uracila (5-FU). O virus DEN4 2A tipo selvagem foi derivado de um clone de cDNA de DEN4 linhagem 814669 (Dominica, 1981). Celulas Vero foram infectadas com DEN4 2A e revestidas com meios de cultura contendo 5-fluor uracila (5-FU) 1 mM o que resultou em uma redugao de aproximadamente 100 vezes em replicagao viral quando comparada a controles naotratados. Progenie viral a partir das culturas tratadas com 5-FU 1mM foram submetidas a um ciclo simples de diluigdes terminals gerando 1248 virus biologicamente clonados que foram selecionados para fenotipos ts atraves de avaliagao de replicagao de virus a 35°C e 39°C em celulas Vero e HuH-7. Clones de virus que demonstraram uma redugao de 100 vezes ou mais em titulo a 39°C foram terminalmente diluidos duas vezes adicionais e amplificados em celulas Vero. Fenotipos dos virus clonados biologicamente 3x sensiveis a temperatura foram confirmados atraves de avaliagao de eficiencia de formagao de placa (EOP) nas celulas indicadas como descrito no Exemplo 1.
[009] A Figura 3 mostra fenotipos de tamanho de placa de virus DNE4 mutante 5-FU representatives. Diluigoes seriais de dez vezes de DEN4 2A-13 (A), virus mutantes 5-FU #569 e #1189 (B), e virus mutantes 5-FU #1083 e #311 (C) foram inoculados sobre monocamadas de celulas Vero e HuH-7 confluentes em placas de 24 pogos. Apos incubagao a 35°C por duas horas, monocamadas foram revestidas com meios de cultura de metil celulose 0,8%. Seguindo incubagao a 35°C por cinco dias, placas foram visualizadas atraves de coloragao com imunoperoxidase. Virus que tiveram um tamanho de placa que foi < 1mm (aproximadamente < 50% do tamanho de wt DEN4 2A-13) na temperatura permissivel de 35°C foram designados como tendo o fenotipo pequena-placa (sp). Virus mutantes #569 e #1189 (B) foram sp em ambas celulas Vero e HuH-7, e #311 e #1083 (C) foram sp somente em celulas HuH-7.
[0010] A Figura 4 mostra geragao de vfrus DEN4 recombi-nantes.(A), o clone cDNA p4 e representado o qual foi construfdo a partir de clone de cDNA 2A (derivado de DEN4 814669) atraves de mutagenese de sitio direcionado. Sitios de enzima de restrigao foram introduzidos ou removidos para facilitar subsequente clonagem de recombinantes DEN4 transportando mutagoes atenuantes introduzidas. Sitios de enzima de restrigao sao mostrados e definem fragmentos do genoma que foram subclonados em vetores pUC-119 modificados para mutagenese de sitio direcionado para introdugao de mutagoes identificadas nos virus mutantes 5-FU. (B), Um esbogo dos processes usados para geragao de virus rDEN4 e tambem representado e descrito no Exemplo 1.
[0011] A Figura 5 mostra sequencia de aminoacidos do gene rDEN4 NS5 (SEQ ID NO: 1). Oitenta pares de aminoacidos sublinhados foram mutagenizados para pares de alanina; 32 pares em negrito representam virus mutantes que podem ser recuperados em celulas Vera ou C6/36; pares em tipo normal representam vfrus mutantes que nao podem ser recuperados em celulas Vero ou C6/36. Regibes em caixa indicam dominios funcionais putativos, incluindo um domfnio metil transferase utilizando S-adenosil metionina (SAM), um domfnio ligante importando-0adjacente a uma sequencia de localizagao nuclear (ligagao importagao-0 + NLS) e um domfnio RNA polimerase dependente de RNA (Polimerase).
[0012] A Figura 6 mostra tamanho de placa de 5-1A1 em celulas C6/36. Notar que 5-1A1 tern um fenbtipo de placa pequena em celulas C6/36 em relagao aquele do vfrus tipo selvagem.
[0013] A Figura 7 mostra crescimento de rDEN4 tipo selvagem e 5-1A1 em celulas C6/36. Celulas foram inoculadas em triplicata com cada vfrus em uma MOI de 0,01, e a quantidade de vfrus presente nos sobrenadantes que foram colhidos nos dias indicados foi determinada atraves de enumeragao de placa em celulas Vero. Os titulos sao expresses como log-ioPFU/ml ± erro padrao.
[0014] A Figura 8 mostra alinhamento de nucleotfdeos dos flavivfrus contidos em mosquitos e em carrapatos. Sequencias de cDNA sao mostradas em 5’ a 3’ e representam uma parte do UTR correspondente aos nucleotfdeos DEN4 de 10417 a 10649 (extremidade de genoma 3’). Numeragao de nucleotfdeos representa a posigao no alinhamento. Regides deletadas ou trocadas sao indicadas usando a numeragao de nucleotfdeos de DEN4. Numeros de acesso de GenBank para virus transportados por mosquitos: DEN4 (SEQ ID NO: 2): AF326825, DEN1 (SEQ ID NO:3): U88535, DEN2 (SEQ ID NO: 4): AF038403, DEN3 (SEQ ID NO: 5): M93130, virus de Oeste do Nilo (WN)(SEQ ID NO: 6): M12294, virus de encefalite Japonesa (JE)(SEQ ID NO: 7): AF315119, virus de febre amarela (YF)(SEQ ID NO: 8). U17067; numeros de acesso de GenBank para virus transportados por carrapatos: virus Powassan (POW)(SDEQ ID NO: 9): L06436, virus Louping 111 (LI)(SEQ ID NO: 10): Y07863, virus de encefalite transportado por carrapato (TBE)(SEQ ID NO: 11): U27495, e virus Langat (LGT)(SEQ ID NO: 12): AF253419.
[0015] A Figura 9 mostra mapa genetico de plasmideo p4. cDNA de dengue e mostrado como linha em negrito, com a regiao C-prM-E trocada durante construgao de cDNAs de virus de dengue quimerico indicada.
[0016] A Figura 10 mostra fenotipos de tamanho de placa de virus rDEN4 codificando mutagoes de adaptagao Vero. Diluigdes serials de tres vezes dos virus indicados foram inoculadas sobre monocamadas de celulas Vero e C6/36 confluentes em placas de 6 pogos. Apos incubagao a 37°C (Vero) ou 32°C (C6/36) por duas horas, monocamadas foram revestidas com meios de cultura de metil celulose 0,8%. Seguindo incubagao por cinco dias, placas foram visualizadas por coloragao com imunoperoxidase. Valores abaixo de cada cavidade sao o tamanho de placa medio em mm +/erro padrao. Para cada um dos pogos infectados com virus, 36 placas foram medidas sobre a imagem digital da placa de 6 pogos sobre Adobe Photoshop em vista de 300%.
[0017] Figura 11 mostra curva de crescimento em celulas Vero de vfrus rDEN4 codificando mutagoes de adaptagao Vero simples. Celulas Vero foram infectadas com os vfrus indicados em uma MOI de 0,01. Monocamadas de celulas confluentes em frascos de cultura de tecido de 25cm2 foram lavadas e revestidas com 1,5ml de inoculum contendo o vfrus indicado. Apos uma incubagao de duas horas a 37°C, celulas foram lavadas tres vezes em PBS e 5ml de meio de cultura suplementado com FBS 2% foram adicionados. Uma alfquota de 1ml de meio de cultura de tecido foi removida, substituida com meio novo, e designada o ponto de tempo hora 0. Nos pontos de tempo indicados apos infecgao, amostras de meio de cultura de tecido foram removidas, clarificadas, e congeladas a -70°C. O nfvel de replicagao de vfrus foi ensaiado por titulagao de placa em celulas Vero. Resumidamente, diluigdes seriais de dez vezes de amostras de meios de cultura de celula foram inoculadas sobre monocamadas de celulas Vero confluentes em placas de 24 pogos em duplicata e revestidas com Opti-MEM contendo metil celulose 0,8%. Apos cinco dias, placas foram visualizadas atraves de coloragao com imunoperoxidase como descrito no Exemplo 1. Limite de detegao (L.O.D.) e > 0,7 log-ioPFU/ml.
[0018] A Figura 12 mostra a curva de crescimento em celulas Vero de vfrus rDEN4 codificando mutagoes de adaptagao de celula Vero combinadas. Celulas Vero foram infectadas com os vfrus indicados em uma MOI de 0,01. Monocamadas de celulas confluentes em frascos de cultura de tecido de 25cm2 foram lavadas e revestidas com 1,5ml de inoculum contendo o vfrus indicado. Apos uma incubagao de duas horas a 37°C, celulas foram lavadas tres vezes em PBS e 5ml de meio de cultura suplementado com FBS 2% foram adicionados. Uma alfquota de 1ml de meio de cultura de tecido foi removida, substituida com meio novo, e designada o ponto de tempo hora . Nos pontos de tempo indicados apos infecgao, amostras de meio de cultura de tecido foram removidas, clarificadas, e congeladas a -70°C. O nivel de replicagao de virus foi avaliado por titulagao de placa em celulas Vero. Limite de detegao (L.O.D.) e > 0,7logioPFU/ml.
BREVE DESCRIÇÃO DAS TABELAS
[0019] Tabela 1. Suscetibilidade de camundongos a infecgao por DEA4 intracerebral e dependente de idade.
[0020] Tabela 2. Fenotipos sensiveis a temperatura (ts) e de atenuagao de cerebro de camundongo (att) de virus de DEN4 mutantes 5-FU.
[0021] Tabela 3. Diferengas de nucleotideos e amino-acidos dos virus mutantes 5-FU que sao ts em celulas Vero e HuH-7.
[0022] Tabela 4. Diferengas de nucleotideos e amino-acidos dos virus mutantes 5-FU que sao ts somente em celulas HuH-7.
[0023] Tabela 5. Mutagoes que sao representadas em multiples virus DEN4 mutantes 5-FU.
[0024] Tabela 6. Adigao de mutagao ts 4995 para rDEN4A30 confere um fenotipo ts e ainda atenua sua replicagao em cerebro de camundongo novo.
[0025] Tabela 7. Fenotipos de atenuagao em cerebro de rato (att) e sensivel a temperatura (ts) de virus mutantes DEN4 5-FU que exibem um fenotipo de placa pequena (sp).
[0026] Tabela 8. Virus com ambos fenotipos ts e sp sao mais restritos em replicagao em cerebro de camundongo que aqueles com somente um fenotipo ts.
[0027] Tabela 9. Diferengas de nucleotideos e aminoacidos dos virus DEN4 5-FU que produzem placas pequenas em celulas Vero e HuH-7.
[0028] Tabela 10. Diferengas de nucleotideos e amino-acidos dos virus DEN4 mutantes 5-FU que produzem placas pequenas somente em celulas HuH-7.
[0029] Tabela 11. Mutagoes de adaptagao de celula Vero putativas derivadas de conjunto inteiro de virus mutantes 5-FU.
[0030] Tabela 12. Oligonucleotideos mutagenicos usados para gerar virus DEN4 recombinantes contendo mutagoes 5-FU simples.
[0031] Tabela 13. Fenotipos de atenuagao de camundon-go e sp, ts de virus mutantes rDEN4 codificando mutagoes simples identificadas em seis virus mutantes 5-FU.
[0032] Tabela 14. Fenotipos de virus mutantes rDEN4 codificando mutagoes simples identificadas em virus mutantes 5-FU que sao ts em celulas Vero e HuH-7.
[0033] Tabela 15. Fenotipos de atenuagao em camundon-go e sp, ts de virus mutantes rDEN4 codificando mutagoes simples identificadas em virus mutantes 5-FU ts especificos de celulas HuH-7.
[0034] Tabela 16. Fenotipos de atenuagao em cerebro de camundongo (att) e sensivel a temperatura (ts) de adicionais virus rDEN4 codificando mutagoes 5-FU simples
[0035] Tabela 17. Crescimento de wtDEN-4 2A-13 em camundongo SCID transplantado com celulas HuH-7.
[0036] Tabela 18. Combinagao de mutagoes ts, NS3 4995 e NS5 7849, em rDEN4 resulta em um fenotipo ts aditivo.
[0037] Tabela 19. As mutagoes 5-FU sao compativeis com a mutagao A30 para replicagao no cerebro de camundongo novo.
[0038] Tabela 20. Fenotipos de atenuagao em cerebro de camundongo e sensivel a temperatura de virus transportando mutagoes cargaagrupamento-para-alanina no gene NS5 de DEN4.
[0039] Tabela 21. Fenotipos de atenuagao de SCID-HuH-7 de virus transportando mutagoes carga-agrupamento-para-alanina no gene NS5 de DEN4.
[0040] Tabela 22. Combinagao de mutagoes de cargaagrupamento-para-alanina emparelhadas em virus mutante de par-duplo.
[0041] Tabela 23. Fenotipos de atenuagao em cerebro de camundongo e sensivel a temperatura de mutantes carga-agrupamento-para-alanina duplos do gene NS5 de rDEN4.
[0042] Tabela 24. Fenotipos de atenuagao SCID-HuH-7 de mutantes carga-agrupamento-para-alanina duplos do gene NS5 de rDEN4.
[0043] Tabela 25. Fenotipos (sensitividade a tempera-tura, tamanho de placa e replicagao em cerebro de camundongo e camundongo SCIDHuH-7) de wt DEN4 e vfrus contendo as mutagoes A30 e 7129.
[0044] Tabela 26. O mutante de placa pequena 5-1A1 5-fluor uracila demonstra uma restrigao infecgao de intestino medio seguindo infecgao oral de mosquitos Aedes aegypti.
[0045] Tabela 27. O mutante placa pequena 5-1A1 5-fluor uracila demonstra uma restrigao de infecgao seguindo inoculagao intra-toraxica de mosquitos Toxorhynchites splendens.
[0046] Tabela 28. Primers de mutagenese para a supressao ou troca de sequencias em DEN4 mostrando diferen-gas conservadas a partir de flavivirus transportados por carrapatos.
[0047] Tabela 29. Titulo de virus e tamanho de placa de virus mutantes 3’ UTR em celulas Vero e C6/36.
[0048] Tabela 30. Infectividade de mutantes wt DEN4 e 3’ UTR para Toxorhynchites splendens via inoculagao intra-toraxica.
[0049] Tabela 31. Infectividade de virus mutantes de troca 3 UTR para Aedes aegypti alimentado sobre uma refei-gao de sangue infeccioso.
[0050] Tabela 32. Mutagbes de adaptagao de celula Vero virus mutantes 5-FU e outros virus DEN4 Analises de sequencias de rDEN2/4A30
[0051] Tabela 33. Análises de sequências de rDEN2/4A30 clone 27(p4)-2-2A2.
[0052] Tabela 34. Análises de sequências de rDEN2/ 4A30 clone 27(p3)-2-1A1.
[0053] Tabela 35. Vírus recombinante rDEN2/4A30 trans portando mutações de adaptação Vero podem ser recuperados e titulados em células Vero.
[0054] Tabela 36. Mutagdes de adaptagao de celula Vero putativas de virus tipo 4 de dengue e o correspondente residue de aminoacido tipo selvagem em outros virus de dengue.
[0055] Tabela 37. Mutagbes conhecidas atenuarem virus tipo 4 de dengue e o correspondente residue de aminoacidos tipo selvagem em outros virus de dengue.
BREVE DESCRIÇÃO DOS APENDICES
[0056] Apendice 1. Sequencia de virus tipo 4 de dengue recombinante linhagem 2A (sequencia de aminoacidos SEQ ID NO: 13 e seqiiencia de nucleotideos SEQ ID NO: 14).
[0057] Apendice 2. Sequencia de virus tipo 4 de dengue recombinante linhagem rDEN4 (sequencia de aminoacidos SEQ ID NO; 15 e sequencia de nucleotideos SEQ ID NO: 16).
[0058] Apendice 3. Sequencia de virus quimerico tipo 2 de dengue recombinante linhagem rDEN2/4A30 (sequencia de aminoacidos SEQ ID NO: 17 e seqiiencia de nucleotfdeos SEQ ID NO: 18).
[0059] Apendice 4. Alinhamento de poliproteinas de virus de dengue. DEN4 (SEQ IUD NO: 19); DEN1-WP (SEQ ID NO: 20); DEN2-NGC (SEQ ID NIO: 21); DEN3-H87 (SEQ ID NO: 22).
DESCRICAO DETALHADA DA REALIZACAO PREFERI DA
[0060] Para montagem de uma colegao de mutagoes uteis para incorporagao em vacina de virus do dengue vivos, tecnicas de mutagenese dirigidas a sltio e aleatorias foram usadas para a introdugao de mutagoes no genoma de virus de dengue. Os virus mutantes resultantes foram selecionados para varies fenotipos valiosos, incluindo sensitividade a temperatura em celulas Vero ou celulas de ffgado humano, restrigao de celula hospedeira em celulas mosquito ou celulas de ffgado humano, adaptagao de hospedeiro-celula para aperfeigoada replicagao em celulas Vero, e atenuagao em camundongos. As bases geneticas para cada fenotipo observado foram determinadas por analise de sequencia direta do genoma do virus. Mutagoes identificadas atraves desses esforgos de seqiienciamento foram ainda avaliadas atraves de sua reintrodugao, simplesmente, ou em combinagao, em virus de dengue recombinante e caracterizagao dos fenotipos resul-tantes. Desta maneira, um menu de mutagoes foi desenvolvido que e util em sintonizagao fina de caracterfsticas de atenuagao e crescimento de vacinas de virus de dengue.
EXEMPLO 1 MUTAGENSE QUIMICA DO VIRUS DE DENGUE TIPO 4 FQRNECE VIRUS SENSIVEIS A TEMPERATURA E VIRUS MUTANTES ATENUADOS
[0061] Um candidato a vacina de virus tipo 4 de dengue (DEN4) atenuado vivo recombinante, 2AA30, foi verificado previamente ser genericamente bem tolerado em humanos, mas exantema e uma elevagao de enzimas de ffgado no soro ocorreram em alguns vacinados. 2AA30, um virus nao sensivel a temperatura (ts), contem uma supressao de 30 nucleotideos na regiao nao-traduzida 3’ (UTR) do genoma viral. No presente estudo, mutagenese qufmica de DEN4 foi utilizada para gerar mutagoes atenuantes que podem ser uteis para ainda atenuar a vacina candidata 2AA30 incompletamente atenuada. Virus DEN4 2A tipo selvagem foi crescido em celulas Vero na presenga de 5-fluor uracila, e, a partir de um painel de 1248 clones que foram isolados em celulas Vero, vinte virus mutantes ts foram identificados os quais foram ts em celulas Vero e HuH-7 (n=13) ou somente em celulas HuH-7 (n=7). Cada uma das vinte mutagoes ts possuiu um fenotipo de atenuagao (att) como indicado por replicagao restrita nos cerebros de camundongos de sete dias de idade. A completa sequencia de nucleotideos dos 20 virus mutantes ts identificou substituigoes de nucleotideos em genes estruturais e nao-estruturais assim como na UTR 5’ e 3’ com mais de uma mudanga ocorrendo, em geral, por virus mutante. Uma mutagao ts na proteina NS3 (posigao de nucleotideo 4995) foi introduzida em um virus DEN4 recombinante possuindo a supressao A30 criando o virus recombinante rDEN4A30-4995 que foi verificado ser ts e mais atenuado que rDEN4A30 nos cerebros de camundongos. Um menu de mutagoes atenuantes esta sendo montado que pode ser util em geragao de virus de vacina de dengue recombinantes satisfatoriamente atenuados e no aumento de nosso entendimento da patogenese de virus de dengue.
[0062] Os virus de dengue transportados por mosquitos (DEN) (sorotipos 1 a 4) sao membros do genera Flavivirus e contem um genoma de RNA sentido positive de fita simples de aproximadamente 10.600 nucleotideos (nt)(Monath, T.P. & Heinz, F.X. 1996 em: Fields Virology B.N. Fields, et al. Eds.pp. 961-1034 LippincottRavan Publishers, Philadelphia). A organizagao de genoma de virus DEN e 5’-UTRC-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3’ (UTR-regiao naotraduzida, C-capsideo, PrM-pre-membrana, E-envelope, NS-nao-estrutural) (Chang, G.J. 1997 em: Dengue and dengue hemorrhagic fever D. J. Gubler & G. Kuno, eds. Pp. 175-198 CAB International, New York; Rice, C.M. 1996 em: Fields Virology B.N. Fields et al. Eds. Pp. 931-959 Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia). Um polipeptideo viral simples e co-traducionalmente processado por proteases virais e celulares gerando tres proteinas estruturais (C, M e E) e sete proteinas NS. A carga de doenga associada com infecgao de virus DEN aumentou sobre as ultimas decadas em paises tropicals e semi-tropicais. Anualmente, existem estimados 50-100 milhoes de casos de febre de dengue (DF) e 500 000 casos da mais seria e potencialmente letal febre hemorragica de dengue/sindrome de choque de dengue (DHF/DSS)(Gubler, D.J. & Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53:35-70).
[0063] O sitio de replicagao viral em humanos infectados com virus DEN e a patogenese de DF e DHF/DSS ainda sao incompletamente entendidos (Innis, B.L. 1995 em: Exotic viral infections J.S.Porterfield, ed. pp. 103-146 Chapman and Hall, London). Em humanos, virus DEN infectam linfocitos (Kurane, I. et al. 1990 Arch Virol 110:91-101; Theo-filopoulos, A. N. et al. 1976 J Immunol 117:953-61), macrofagos (Halstead, S.B. et al. 1977 J Exp Med 146:218-29; Scott, R.M. et al. 1980 J Infect Dis 141:1-6), celulas dendriticas (Libraty, D.H. et al. 2001 J Virol 75:3501-8; Wu, S.J. et al. 2000 Nat Med 6:816-20), e hepatocitos (Lin, Y.L. et al. 2000 J Med Virol 60:425-31; Marianneau, P. et al. 1996 J Gen Virol 77:2547-54). O figado esta claramente envolvido em infecgao de virus DEN de humanos, como indicado pela ocorrencia de elevagdes transientes em niveis em soro de alanina amino transferase (ALT) e aspartato aminotrans-ferase (AST) na maioria de pacientes infectados com virus de dengue e atraves da presenga de hepatomegalia em alguns pacientes (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Kuo, C.H. et al. 1992 Am J Trap Med Hyg 47:265-70; Mohan, B. et al. 2000 J Trap Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F.et al. 2000 Southeast Asian J Trap Med Public Health 31:25963). Hepatocitos antigeno-positivos de virus DEN sao vistos circundando areas de necrose no ffgado de casos fatais (Couvelard, A. et al. 1999 Hum Pathol 30:1106-10; Huerre, M.R. et al. 2001 Virchows Asrch 438:107-15), e sequencias de virus de dengue foram identificadas em tais casos usando-se RT-PCR (Rosen, L. et al. 1999 Am J Trop Med Hyg 61:720-4). De potencial importancia para a etiologia de infecpao severa de virus de dengue, tres estudos demons-traram que os nlveis medios de ALT/AST em soro foram significantemente elevados em pacientes com DHF/DSS versus aqueles com DF (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Mohan, B. et al. 2000 J Trop Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al. 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259-63).
[0064] Uma vacina para virus DEN atualmente nao esta licenciada. Uma vez que previa infecpao com um sorotipo de virus de dengue pode aumentar o risco para DHF/DSS seguindo infecpao com um sorotipo diferente (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B.et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72), e claro que uma vacina para virus de dengue necessitara proteger contra cada um dos quatro sorotipos de virus de dengue, DEN1, DEN2, DEN3, e DEN4. Varias estrategias estao sendo atualmente ativamente perseguidas no desenvolvimento de uma vacina de virus DEN tetravalente atenuado vivo (Bancroft, W.H. et al. 1984 J Infect Dis 149:1005-10; Bhamarapravavti, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44-7; Guirakhoo, F. et al. 2000 J Virol 74:5477-85; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). Recentemente, nos demonstramos que um candidato a vacina de DEN4 atenuado vivo, 2AA30, foi atenuado e imunogenico em um grupo de 20 voluntaries humanos (ver Exemplo 8). Este virus DEN4 recombinante contem uma supressao de 30 nt na UTR 3’ que remove nucleotldeos 10478-10507 e foi restrito em replicapao em macacos rhesus. Nlveis de viremia em humanos foram baixos ou indetectaveis, e virus recuperados dos vacinados retiveram a mutapao A30. Um exantema assintomatico foi reportado em 50% de pacientes. A unica anormalidade de laboratorio observada foi uma elevagao transiente, assinto-matica, no nivel de ALT em soro em 5 de 20 pacientes. Todos os vacinados desenvolveram anticorpo soro-neutralizante contra virus DEN4 (titulo medio: 1:580). Importantemente, 2AA30 nao foi transmitido a mosquitos alimentados sobre vacinados e tern restritas propriedades de crescimento em mosquitos (Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trap Med Hyg 65:414-9). A presenga de um exantema e dos elevados niveis de ALT sugerem que o candidate a vacina 2AA30 e levemente sub-atenuado em humanos. Devido ao conjunto total de desejaveis propriedades conferidas pela mutagao A30, candidates a vacina quimericos estao sendo construidos os quais contem os genes estruturais de virus de dengue tipo 1, 2, e 3 e a cadeia principal atenuada de DEN4 transportando a mutagao A30 geneticamente estavel.
[0065] Embora as verificagdes iniciais indiquem a utili-dade do candidate a vacina 2AA30, muitas tentativas anteriores para desenvolvimento de vacinas de virus de dengue atenuado vivo proporcionaram candidates a vacina que foram superou sub-atenuados em humanos (Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trap Med Hyg 33:684-9; Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em: Dengue and dengue hemorrhagic fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80; McKee, K.T., Jr. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42). Por isso, foi desenvolvido um menu de mutagoes ponto que conferem fenotipos sensivel a temperatura (ts) e de atenuagao (att) sobre DEN4. Estas mutagoes sao pretendidas como sendo uteis para atenuar virus DEN4 para diferentes graus e por isso como tendo proposito em sintonizagao fina de nivel de atenuagao de candidates a vacina como 2AA30. Adigao de tais mutagoes a 2AA30 ou a outros candidates a vacina de virus de dengue e imaginada resultando na geragao de um candidate a vacina que exibe um satisfaterio balango entre atenuagao e imunogenicidade para humanos.
[0066] No presente exemplo, mutagenese quimica de DEN4 foi utilizada para identificar mutagoes de ponto que conferem o fenotipo ts, uma vez que tais virus frequentemente sao atenuados em humanos. Adicionalmente, devido ao reportado envolvimento do ffgado em infecgao de dengue natural e os elevados niveis de ALT em um subconjunto de vacinados com 2AA30, virus DEN4 que sofreram mutagenese tambem foram avaliados para fenotipo ts em celulas de figado HuH-7 derivadas de um hepatoma humano. Aqui, nos descrevemos a identificagao de 20 virus mutantes ts DEN4 cada um dos quais replica eficientemente em celulas Vero, o substrata proposto para fabricagao de vacina, e cada um dos quais e atenuado em camundongos. Finalmente, a exequibilidade de modificagao de fenotipo de atenuagao do candidate a vacina 2AA30 atraves de introdugao de uma mutagao de ponto em NS3 e demonstrada.
[0067] Celulas e virus. Celulas Vero WHO (celulas de rim de macaco verde africano) foram mantidas em MEM (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com soro fetal bovino 10% (FBS)(Summit Biotechnologies, Fort Collins, CO), L-glutamina 2mM (Life Technologies), e 0,05 mg/ml de gentamicina (Life technologies). Celulas HuH-7 (celulas hepatoma humano)(Nakabayashi, H. et al. 1982 Cancer Res 42:3858-63) foram mantidas em D-MEM/F-12 (Life Technologies) suplementado com FBS 10%, L-glutamina 1 mM e gentamicina 0,05 mg/ml. Celulas C6/36 (celulas de mosquito Aedes albopictus) foram mantidas em MEM completo como descrito acima suplementado com aminoacidos nao-essenciais 2mM (Life Technologies).
[0068] O virus (wt)DEN4 2A tipo selvagem foi derivado de um clone cDNA de DEN4 linhagem 814669 (Dominica, 1981)(Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Sequencia do cDNA de virus DEN4 2A e apresentada no Apendice 1. O clone de 2A cDNA de inteiro comprimento sofreu varias subsequentes modificagoes para aperfeigoamento de sua habilidade para ser geneticamente manipulado. Como descrito anteriormente, um sftio de enzima de restrigao Xhil traducionalmentesilencioso foi engenheirado proximo da extremidade da regiao E em nucleotideo 2348 para criar clone 2A-Xhol (Bray, M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). A sequencia codificante viral do clone 2A-Xhol cDNA foi ainda modificado usando-se mutagenese de sftio direcionado para criar clone p4: um sftio de restrigao BbvCI unico foi introduzido proximo da jungao C-prM (nucleotfdeos 447-452); um sftio de restrigao Xbal foi removido por mutagao de nucleotideo 7730; e um sftio de restrigao Sacll unico foi criado na regiao NS5 (nucleotfdeos 9318-9320). Cada uma destas mutagoes engenhei-radas e traducionalmente silenciosa e nao altera a sequencia de aminoacidos do polipeptfdeo viral. Tambem, varias mutagoes foram feitas na regiao de vetor de clone p4 para introdugao ou supressao de adicionais sftios de restrigao. O clone cDNA p4A30 foi gerado pela introdugao de mutagao A30 em clone p4. Isto foi realizado por substituigao de fragmento Mlul-Kpnl de p4 (nucleotfdeos 1040310654) com aquele derivado de plasmfdeo 2AA30 contendo a supressao de 30 nucleotfdeos. Os clones de cDNA de p4 e p4A30 foram subseqiientemente usados para geragao de virus recombinantes rDEN4 (Apendice 2) e rDEN4A30, respectivamente. (O numero de acesso de GenBank parra rDEN4 e AF326825 e o acesso para rDEN4A30 e AF326827).
[0069] Mutagenese qufmica de DEN4. Monocamadas confluen-tes de celulas Vero foram infectadas com wt DEN4 2A em uma multiplicidade de infecgao (MOI) de 0,01 e incubadas por 2 horas a 32°C. Celulas infectadas foram entao revestidas com MEM suplementado com FBS 2% e 5-fluor uracila (5-FU)(Sigma, St. Louis, MO) em concentragoes variando de 10mM a 10nM. Apos incubagao a 32°C por cinco dias, meio de cultura de celula foi colhido, clarificado por centrifugagao, e congelado a -70°C. Sobrenadantes clarificados foram entao ensaiados para titulo de virus atraves de titulagao de placa em celulas Vero. Diluigoes serials de dez vezes do sobrenadante clarificado foram preparadas em Opti-MEM I (Life Technologies) e inoculadas sobre monocamadas de celulas Vero confluentes em placas de 24 pogos. Apos incubagao a 35°C por duas horas, monocamadas foram revestidas com metil celulose 0,8% (EM Science, Gibbstown, NJ) em Opti-MEM I suplementado com FBS 2%, gentamicina e L-glutamina. Seguindo incubagao a 35°C por cinco dias, placas foram visualizadas atraves de coloragao com imunoperoxi-dase. Monocamadas de celulas Vero foram fixadas em metanol 80% por 30 minutos e lavadas por 10 minutos com tampao anticorpo que consiste em leite seco sem gordura 3,5% (peso/volume) (Nestle, Solon, OH) em solugao salina tamponada com fosfato (PBS). Celulas foram entao incubadas por uma hora a 37°C com uma preparagao de anticorpo policlonal de coelho anti-DEN4 (PRNT50 de >1:2000) diluida 1:1000 em tampao de anticorpo. Apos uma lavagem com tampao de anticorpo, celulas foram incubadas por uma hora com IgG cabra-anti-coelho marcada com peroxidase (KPL, Gaithersburg, MD) diluida 1:500 em tampao anticorpo. Monocamadas foram lavadas com PBS, deixadas secar brevemente, revestidas com substrata peroxidase (KPL), e placas foram contadas.
[0070] Rendimentos de virus em culturas tratadas com 5-FU 1mM foram reduzidos 100 vezes comparados a culturas nao-tratadas, e os virus presentes no sobrenadante da cultura tratada com 5-FU 1mM foram terminalmente diluidos para derivagao de clones para caracterizagao fenotipica. Em resumo, placas de 96 pogos de celulas Vero foram inoculadas com os virus tratados com 5-FU em uma MOI que rendeu 10 ou menos pogos positives para virus por placa. Apos uma incubagao de cinco dias ba 35°C, meios de cultura de celulas das placas de 96 pogos foram temporariamente transferidos para placas de 96 pogos carecendo de celulas, e as culturas positivas foram identificadas atraves de coloragao com imunoperoxidase das monocamadas de celulas infectadas. Virus de cada pogo positiva foram transferidos para monocamadas de celulas Vero confluentes em placas de 12 pogos para amplificagao. Meio de cultura de celulas foi colhido das cavidades individuals cinco ou seis dias depois, clarificado por centrifugagao, feito al [quotas em placas de polipropileno de 96 pogos profundas (Beckman, Fullerton, CA) e congeladas a 70°C. Um total de 1248 clones de virus foram preparados a partir das culturas tratadas com 5-FU 1 mM. Dois clones de virus wt, 2A-1 e 2A-13, foram gerados da mesma maneira a partir de culturas controles nao-tratadas com 5-FU.
[0071] Selecao de clones para fenotipos ts e att. Os 1248 clones de virus foram selecionados para fenotipo ts atraves de avaliagao de replicagao de virus a 35°C e 39°C em celulas Vero e HuH-7. Monocamadas de celulas em placas de 96 pogos foram inoculadas com diluigoes serials de dez vezes de virus em meios L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) suplementados co m FBS 2%, L-glutamina e gentamicina. Celulas foram incubadas nas temperatures indicadas por cinco dias em banhos de agua de temperatura controlada, e presenga de virus foi determinada atraves de coloragao com imunoperoxidase como acima. Clones de virus que demonstraram uma redugao de 100 vezes ou mais em titulo a 39°C foram terminalmente diluidos duas vezes adicionais e amplificados em celulas Vero. A eficiencia de formagao de placa (EOP) em temperaturas permissiveis e restritivas de cada suspensao de virus triplamente clonados biologicamente foi determinada como se segue. Titulagao de placa em celulas Vero e HuH-7 foi realizada como descrito acima exceto que monocamadas infectadas com virus foram revestidas com metil celulose 0,8% em meio L-15 suplementado com FBS 5%, gentamicina, e Lglutamina. Apos incubagao de placas re-plicas por cinco dias a 35, 37, 38, ou 39°C em banhos de agua de temperatura controlada, placas foram visualizadas atraves de formagao de coloragao com imunoperoxidase e contadas.
[0072] A replicagao de virus mutantes ts 5-FU DEN4 foi avaliada em camundongos novos Swiss Webster (Taconic Farms, Germantown, NY). Grupos de seis camundongos de uma semana de idade foram inoculados intracranialmente com 104 PFU de virus diluidos em 30pl de Opti-MEM I. Cinco dias depois, camundongos foram sacrificados e cerebros foram removidos e individualmente homogeneizados em uma suspensao 10% de solupao de sal balanceada de Hank tamponada com fosfato contendo sucrose 7,5%, glutamato de sodio 5 mM, ciprofloxacina 0,05mg/ml, clindamicina 0,06 mg/ml, e anflotericina B 0,0025mg/ml. Sobrenadantes clarificados foram congelados a -70°C e subsequentemente tftulo de virus foi determinado por titulagao em celulas Vero, e placas foram manchadas atraves do processo de imunoperoxidase descrito acima.
[0073] Analise de sequencias de qenomas virais. A se-quencia de nucleotideos dos vfrus DEN4 mutagenizados com 5-FU foi determinada. Resumidamente, RNA viral genomico foi isolado a partir de clones de vfrus com o mini kit QIAamp RNA viral (Qiagen, Valencia, CA) e transcripao reversa foi realizada usando-se o Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR (Life technologies) e primers hexameros randomicos. Advantage cDNA polymerase (Clontech, Palo Alto, CA) foi usada para geragao de sobreposigao de fragmentos de PCR de aproximadamente 2.000 nt que foram purificados por HighPure PCR Product Purification System (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Primers especfficos de DEN foram usados em reagoes de sequenciamento de ciclo terminador BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA) e reagoes foram analisadas em um analisador genetico 3100 (Applied Biosystems). Primers foram projetados para sequenciar ambas fitas do produto de PCR a partir do qual sequencias consenso foram montadas.
[0074] A sequencia de nucleotideos das regioes 5’ e 3’ do genoma viral foram foi determinada como acima apos circularizaQao do genoma de RNA. O nucleosideo capa 5’ do RNA viral foi cortado usado pirofosfatase acida de tabaco (Epicentre Technologies, Madison, Wl) e o genoma foi circu-larizado atraves de RNA ligase (Epicentre Technologies)Um fragmento de RT-PCR foi gerado o qual sobrepos a jungao de ligagao (extremidade 5’ e 3’) e foi sequenciado como descri-to acima.
[0075] Geracao de virus DEN4 recombinantes. A mutagao na posigao nt 4995 em NS3 foi introduzida na construgao de cDNA de p4 atraves de mutagenese de sftio direcionado (Kunkel, T.A. 1985 PNAS USA 82:488-92). O fragmento StulBstBI (nt 3619-5072) de p4 foi subclonado em um vetor pUC119 modificado. A mutagao U>C em posigao nt 4995 foi engenheirada por mutagenese de sftio direcionado no fragmento p4, clonada de volta na construgao de cDNA de p4, e a presenga da mutagao foi confirmada atraves de analise de seqiiencias. A mutagao A30 foi introduzida na UTR 3’ do clone cDNA de p4-4995 atraves de substituigao de fragmento Mlul-Kpnl com aquele derivado do clone cDNA de p4A30, e a presenga da supressao foi confirmada por analise de sequencias. Transcritos de RNA de inteiro comprimento foram preparados a partir dos clones de cDNA acima atraves de transcrigao in vitro. Resumidamente, transcrigao consistiu em uma mistura de reagao de 50 jil contendo 1 pg de plasmideo linearizado, 60 U SP6 polimerase (New England Biolabs (NEB), Beverly, MA), 1X tampao RNA polimerase (Tris-HCI 40 mM, pH 7,9, MgCh 6mM, spermidine 2mM, ditiotreitol 10mM), analogo capa m7G(5’)ppp(5’)G 0,5 mM (NEB), 1 mM de cada trifosfato de nucleotideo, 1 U pirofosfatase (NEB), e 80 U inibidor RNAse (Roche, Indianapolis, IN). Esta mistura de reagao foi incubada a 40°C por 90 minutos e os resultantes transcritos foram purificados usando-se mini kit Rneasy (Qiagen, Valencia, CA).
[0076] Para transfecgao de celulas C6/36, transcritos de RNA foram combinados com reagente de transfecgao lipossomal DOTAP (Roche) em solugao salina tamponada com HEPES (pH 7,6) e adicionados a monocamadas de celulas em placas de 6 cavidades. Apos incubagao a 32°C por 12-18 horas, os meios de cultura de celulas foram removidos e substituidos com MEM suplementado com FBS 5%, L-glutamina, gentamicina e aminoacidos nao-essenciais. Monocamadas de celulas foram incubadas por 5 a 7 dias adicionais e meios de cultura de celulas foram colhidos, clarificados por centrifugagao, e ensaiados para a presenga de virus atraves de titulagao de placa em celulas Vero. Virus recuperados foram terminalmente diluidos duas vezes como descrito acima, e suspensoes de virus para ainda analises foram preparadas em celulas Vero.
[0077] Replicagao in vitro (cultura de tecido) e in vivo de wt DEN4 e DEN4A30. O nivel de replicagao de ambos, wt DEN4 2A e o candidato a vacina, 2AA30, foi avaliado em celulas Vero (rim de macaco) e HuH-7 (hepatoma humano) (Figura 1), as ultimas das quais foram recentemente verificadas suportarem eficientemente a replicagao de virus DEN2 (Lin, Y.L. et al. 2000 J Med Virol 60:42531). O padrao de replicagao de wt DEN4 2A e 2AA30 foi similar em ambas linhas de celulas. Titulos virais de culturas infectadas com 2AA30 em uma MOI de 0,01 foram levemente reduzidos comparados a wtDEN4 2A em 72 horas, mas em pontos de tempo posteriores seus niveis de replicagao foram equivalentes. A eficiente replicagao de ambos virus DEN4 em cada linha de celula indicou que estas linhas continuas de celulas podem ser uteis parar caracterizagao do fenotipo ts do 1248 potenciais virus mutantes.
[0078] O nivel de replicagao de virus DEN4 administrados intra-cerebro a camundongos Swiss Webster foi primeiro determinado para avaliar se camundongos podem ser usados para avaliagao e quantificagao eficiente de fenotipo de atenuagao de um grande conjunto de virus mutantes. Uma vez que suscetibilidade de camundongos a infecgao com DEN e dependente de idade (Cole, G.A & Wisseman, C.L.Jr. 1969 Am J Epidemiol 89:669-80; Cole, G.A. et al. 1973 J Comp Pathol 83:243-52), camundongos de 7 a 21 dias foram infectados com 2A-13 (um clone de virus DEN4 tipo selvagem ver abaixo), rDEN4 ou rDEN4A30, e apos cinco dias o cerebro de cada camundongo foi removido, e o nivel de replicagao viral foi quantificado atraves de ensaio de placa (Tabela 1). Os resultados indicaram que os dois virus wt DEN4 e o candidate a vacina rDEN4A30 replicaram para alto tftulo (>6,OlogioPFU/g de cerebro) em camundongos de 7 dias e que os titulos virais medios foram similares entre os tres vfrus. Estes resultados demonstraram a exequibilidade do uso de camundongos de 7 dias para selegao de um grande conjunto de vfrus mutantes, e o alto nivel de replicagao de tipo selvagem e candidate a vacina permite quantificar a magnitude da restrigao de replicagao especificada por uma mutagao atenuante acima de uma faixa de 10.000 vezes.
[0079] Geracao e caracterizacao in vitro de vfrus mutantes 5-FU de DEN4. Um painel de 1.248 clones de vfrus DEN4 foi gerado a partir de uma suspensao mutagenizada com 5-FU de wt DEN4 2A como descrito acima (Figura 2). Cada clone foi testado em celulas Vero e HuH-7 para o fenotipo ts a 39°C, e vfrus mutantes ts putativos foram submetidos a dois rounds adicionais de clonagem biologica atraves de diluigao terminal, e o fenotipo ts de cada populagao de vfrus ainda clonado foi examinada em mais detalhes atraves de determinagao de sua eficiencia de revestimento (EOP)em temperatura permissiva (35°CV) e em varias temperaturas restritivas (Tabela 2). Um vfrus (clone 2A-13) sem um fenotipo ts, que foi passado em uma maneira identica como os vfrus mutantes ts, serviu como o vfrus para o qual cada um dos vfrus mutantes ts foi diretamente comparado para ambos fenotipos ts e att.
[0080] Treze vfrus mutantes 5-FU foram identificados os quais tern um fenotipo ts em ambas celulas Vero e HuH-7, e sete vfrus mutantes foram ts somente em celulas HuH-7 (Tabela 2). Vfrus mutantes que foram ts em celulas Vero mas nao em celulas HuH-7 nao foram identificados. Sensitividade a temperatura foi definida como uma redugao a > 2,5 ou > 3,5 logioPFU/ml em tftulo de vfrus em celulas Vero ou HuH-7, respectivamente, em uma temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel de 35°C. DEN4 2A tipo selvagem foi verificado ter aproximadamente uma redugao de 0,5 e 1,5 logio PFU/ml em tftulo de vfrus em celulas Vero ou HuH-7 a 39°C, respectivamente. A supressao A30 nao confere um fenotipo ts em celulas Vero ou HuH-7 e exibiu somente uma leve redugao em titulo de virus (2,2 logioPFU/ml) a 39°C em celulas HuH-7, que foi menos que 10 vezes maior que a redugao de wt DEN4 2A naquela temperatura. Varies virus mutantes 5FU tiveram uma redugao maior que 10 000 em titulo de virus a 39°C em celulas Vero e HuH-7. Uma completa interrupgao em replicagao viral a 39°C em celulas HuH-7 foi observada em cinco clones de virus (#571, 605, 631, 967, e 992) que nao foram ts em celulas Vero. Mutagoes que restringem seletivamente replicagao em celulas de ffgado HuH-7 podem ser particularmente uteis em controle de replicagao de candidates de vacina de virus de dengue no ffgado de vacinados.
[0081] Replicacao de virus mutantes 5-FU DEN4 em camun-donqos novos. O nivel de replicagao de cada um dos 20 virus mutantes DEN4 em cerebro de camundongo foi determinado (Tabela 2). Os titulos obtidos foram comparados aqueles dos dois virus wt, 2A-13 e rDEN4, os quais, cada um, replicaram para um nivel de mais que 106 PFU/g de tecido de cerebro, e aqueles do mutante 2AA30, que conferiu somente uma limitada redugao de 0,5logioPFU/g em titulo de virus medio comparado aos controles wt. A redugao observada no nivel de replicagao de rDEN4A30 foi consistente entre 11 experimentos separados. Interessantemente, o virus rDEN4A30, que foi atenuado em ambos, macacos rhesus e humanos (Exemplo 8), foi somente levemente restrito em replicagao em cerebro de camundongo. Niveis variaveis de restrigao de replicagao foram observados entre os virus mutantes variando de uma redugao de dez vezes (#473) a acima de 6.000 vezes (#686). Virus mutantes com fenotipos ts em ambas celulas Vero e HuH-7, assim como em celulas HuH-7 sozinhas, foram verificados terem signi-ficantes fenotipos att. Cinco de 13 virus mutantes 5-FU com fenotipos ts em ambas celulas Vero e HuH-7 e cinco de sete virus mutantes com fenotipos ts em celulas HuH-7 sozinhas tiveram uma redugao maior que 100 vezes em replicagao de virus. Ali pareceu nao haver correlagao direta entre a magnitude da redugao em replicagao em temperatura restritiva em cultura de tecido e o nivel de atenuagao in vivo. O nivel similar de sensitividade de temperatura e replicagao do rDEN4 wt e clone 2A-13 em cerebro de camundongo indicou que diferengas observadas em replicagao entre os virus mutantes ts e clone 2A-13 nao foram simplesmente uma fungao de passagem em celulas Vero, mas reflete as diferengas de sequencias entre estes virus.
[0082] Analises de sequencias de virus mutantes 5-FU DEN4. Para determinar as bases geneticas dos fenotipos ts e att observados, a completa sequencia de nucleotideos de cada mutante ts e de clone 2A-13 foi determinada e resumida na Tabela 3 (ts em celulas Vero e HuH-7) e Tabela 4 (ts em somente celulas HuH-7).
[0083] O unico tipo de mutagao identificado nos 20 virus mutantes sequenciados foi uma substituigao de nucleotideos (nao ocorreram supressoes ou insergdes), e estas estavam presentes em cada uma das regides codificantes exceto C e NS4A. Tres virus mutantes (#239, 489, e 773) contiveram somente uma mutagao de ponto de sentido errado em NS3 em posigao nt 4995 resultando em uma alteragao de aminoacido (a.a.) Ser por Pro em posigao de a.a. 1.632. Para #773, esta foi a unica mutagao presente (Tabela 3). As mutagoes nao-codificantes em regides codificantes nao sao consideradas serem significantes. Os 17 adicionais virus mutantes tiveram multiplas mutagoes (duas a cinco) em uma regiao codificante ou em uma UTR que potencialmente pode conferir os observados fenotipos ts ou att. Cinco dos 17 virus mutantes com multiplas mutagoes (#473, 718, 759, 816, e 938) tambem codificaram a mutagao de ponto em posigao nt 4995. A presenga da mutagao 4.995 foi verificada em somente virus mutantes DEN4 com fenotipos ts em ambas celulas Vero e HuH-7.
[0084] A analise de sequencias indicou que 10 virus mutantes que foram ts em celulas Vero e HuH-7 e tres virus mutantes que foram ts somente em celulas HuH-7 contiveram mutagoes em somente UTR 5’ e 3’ e/ou em uma proteina naoestrutural. Estas mutagoes sao especialmente apropriadas para inclusao em candidates a vacina de virus de dengue quimerico onde os genes estruturais derivam de um sorotipo DEN1, PEN2, ou DEN3 e as restantes regioes codificantes e nao-codificantes provem de um vetor DEN4 atenuados. Mutagoes identificadas em virus mutantes DEN4 5-FU que foram ts em somente celulas HuH-7 (Tabela 4) podem ser potencialmente usadas em candidates a vacina, tai como rDEN4A30, para controlar seletivamente a replicagao e patogenese de DEN4 no figado. Estes resultados combinados das analises de sequencias de virus mutantes 5-FU demonstram a utilidade de mutagenese qufmica como um meio de introdugao de mutagoes atenuantes no genoma de virus de dengue.
[0085] A presenga de uma mutagao de ponto na posigao nt 4995 em oito virus mutantes separados foi descrita acima. Cinco adicionais mutagoes de ponto tambem foram represen-tadas em multiples virus incluindo mudangas nt em posigao 1.455 em E, 7.162, 7.163, e 7.564 em NS4B, e 10.275 na UTR 3’ (Tabela 5). A significancia da ocorrencia destas mutagoes “irmas” em multiplos virus e discutida no Exemplo 6. Interessantemente, o virus passado-paralelo, tipo selvagem, 2A-13, tambem conteve uma mutagao simples na posigao nt 7.163 em NS4B.
[0086] Introducao de uma mutacao ts em rDEN4 e rDEN4A30. A presenga de uma substituigao de nucleotideo simples (mutagao U>C em posigao nt 4.995 em NS3) em tres virus mutantes separados (clones 239, 489, e 773) indicou que esta mutagao especificou os fenotipos ts e att em cada um dos tres virus mutantes. Esta mutagao foi clonada em construgao de cPNA de p4 e p4A30 e virus recombinantes foram recuperados e designados rPEN4-4995 e rPEN4A30-4995, respectivamente. Estes virus recombinantes foram testados para fenotipos ts e att como descrito acima (Tabela 6). Como esperado, introdugao de mutagao 4995 em rPEN4 wt resultou em um significante fenotipo ts a 39°C em ambas celulas, Vero e HuH-7. rDEN4-4995 cresceu para aproximadamente niveis tipo selvagem na temperatura permissivel, 35°C, em ambos tipos de celulas, mas demonstrou uma redugao maior que 10.000 vezes a 39°C (temperatura de interrupgao) em ambas celulas Vero e HuH-7. A adigao da mutagao 4995 a rDEN4A30 rende um virus recombinante, rDEN4A30-4995, que exibe o mesmo nivel de sensitividade a temperatura como rDEN4-4995 (Tabela 6).
[0087] Os virus rDEN4 codificando a mutagao 4995 foram a seguir testados para replicagao nos cerebros de camundongos jovens (Tabela 6). A mutagao 4995 conferiu um fenotipo att sobre ambos rDEN4 e rDEN4A30. Houve uma redugao de aproximadamente 1.000 vezes em replicagao de virus comparada aquela de virus wt. A combinagao de mutagao de ponto 4995 e a supressao A30 nao parecem resultar em uma redugao aditiva de replicagao de virus. Estes resultados confirmaram que a mutagao de ponto 4995 realmente especifica os fenotipos ts e att. Importantemente, a utilidade de modificagao de cultura de tecido e fenotipos in vivo do candidato a vacina rDEN4A30 atraves de introdugao de adicionais mutagoes tambem foi demonstrada.
[0088] Discussao. Aqui nos ensinamos como preparar uma vacina de virus de dengue atenuado vivo, tetravalente usando rDEN4A30 como o componente DEN4 e tres virus quimericos antigenicos expressando as proteinas estruturais (C, prM, e E) de DEN1, DEN2, e DEN3 do vetor rDEN4A30 atenuado (Exemplo 8). rDEN4A30 de virus DEN4 contendo a mutagao de supressao na UTR 3’ manifesta restrita replicagao em humanos enquanto retendo imunogenicidade. Uma vez que rDEN4A30 retem um baixo nivel de virulencia residual para humanos a despeito desta replicagao restrita, o presente estudo foi iniciado para gerar adicionais mutagoes atenuantes que sao imaginadas como sendo uteis para ainda atenuar rDEN4A30 ou outros virus de dengue e que sao imaginadas como sendo incorporadas em qualquer um dos tres virus quimericos antigenicos ou outros virus de dengue quando necessario. Mutantes sensiveis a temperatura de virus de dengue (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Eckels, K.H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80) assim como de outros virus (Skiadopoulos, M.H. et al. 1998 J Virol 72:1762-8; Whitehead, S.S. et al. 1999 J Virol 73:871-7) manifestam replicagao restrita in vitro. Nos geramos um painel de 20 virus mutantes DEN4 ts, determinamos sua sequencia gendmica, e avaliamos seus fenotipos de atenuagao in vivo. Os 20 virus mutantes DEN4 ts foram gerados atraves de crescimento na presenga de 5-FU e foram primeiro selecionados para viabilidade em celulas Vero, o substrato planejado para uso na fabricagao destas vacinas, para assegurar que virus mutantes possam ser desenvolvidos eficientemente em um substrato apropriado.
[0089] Duas classes de virus mutantes foram obtidas; aqueles ts em ambas celulas Vero de HuH-7 (n=13) ou aqueles ts somente em celulas HuH-7 (n=7). Os virus exibiram uma faixa em seu nivel de sensitividade de temperatura a partir de uma redugao de 100 a 1.000.000 de vezes em replicagao na temperatura restritiva de 39°C. Uma vez que nosso candidato a vacina DEN4 retem um baixo nivel de virulencia para o flgado e outras verificagdes suportam a habilidade de virus de dengue infectar hepatocitos (Lin, Y.L. et al. 2000 J Med Virol 60:425-31; Marianneau, P. et al, 1997 J Virol 71:3244-9) e causa patologia de flgado (Couvelard, A. et al. 1999 Hum Pathol 30:1106-10; Huerre, M.R. et al., 2001 Virchows Arch 438:107-15), nos buscamos desenvolver mutagoes que podem seletivamente restringir replicagao de virus de dengue 4 em celulas de flgado. Na diregao desta finalidade, nos identificamos sete virus mutantes que tern um fenotipo ts especifico de celula HuH-7. As mutagoes presentes nestes virus sao as primeiras reportadas em virus que conferem replicagao restrita em celulas de flgado e sao imaginadas como sendo uteis em limitagao de replicagao de virus e partenogenese no ffgado de receptores de vacina. A contribuigao de mutagoes individuals identificadas nos virus ts especificos de celulas HuH-7 para os fenotipos observados e imaginado como sendo avaliado pela introdugao das mutagoes individuals nos vfrus DEN4 recombinantes.
[0090] Evidencia recente indicou que a magnitude da viremia em pacientes infectados com DEN correlaciona-se positivamente com seriedade de doenga, isto e, quanto maior o tftulo de viremia mais seria a doenga (Murgue, B. et al. 2000 J Med Virol 60:432-8; Vaughn, D. W. et al. 2000 J Infect Dis 181:2-9). Isto indica que mutagoes que restringem significantemente replicagao de candidatos a vacina in vivo sao a fundagao de uma vacina segura e atenuada. Avaliagao de candidatos de vacina de vfrus DEN para atenuagao in vivo e complicada pela falta de um apropriado modelo animal que imita precisamente a doenga causada por vfrus de dengue em humanos. Na ausencia de um tai modelo, a replicagao do painel de vfrus mutantes 5-FU nos cerebros de camundongos jovens Swiss Webster foi avaliada como um meio para identificar um fenotipo de atenuagao in vivo uma vez que este modelo animal e bem adaptado para a avaliagao de um grande conjunto de vfrus mutantes. Cada um dos 20 vfrus mutantes ts exibiu um fenotipo att manifestando uma redugao de 106000 vezes em replicagao no cerebro de camundongo como comparado a vfrus wt DEN4 (Tabela 2). Isto indica que ha uma correlagao entre a presenga do fenotipo ts em cultura de tecido e atenuagao do mutante in vivo confirmando a utilidade de selegao de vfrus com este marcador como candidatos de vacina. Entretanto, nao houve correlagao entre o nfvel de sensitividade de temperatura e o nfvel de restrigao in vivo. Alem disso, Sabin observou uma dissociagao entre neurovirulencia em camundongo e atenuagao em humanos atraves de geragao de uma vacina de vfrus vivo efetiva contra DEN atraves de passagem de vfrus em cerebro de camundongo. Esta pesquisa realmente resultou em um vfrus DEN camundongo-altamente neurotrofico que, paradoxalmente foi significantemente atenuado em atenuado em humanos (Sabin, A.B. 1952 Am J Trop Med Hyg 1:30-50). A despeito disto, atenuagao para o cerebro de camundongo jovem foi reportada para outros candidates a vacina de virus DEN atenuado vivo incluindo a linhagem de vacina PDK-53 DEN2 que e nao-letal em camundongos e linhagem de vacina PR-159/S-1 DEN-2 que foi significantemente atenuado comparado a seu virus tipo selvagem parente (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em : Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Eckels, K.H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80). Replicagao em macacos rhesus foi reportada ser anunciadora de atenuagao para humanos (Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80). Recentemente, modelos murinos de infeegao de virus de dengue foram desenvolvidos usando-se camundongos SCID transplantados com macrofagos humanos (Lin, Y.L. et al. 1998 J Virol 72:9729-37) ou linhas de celulas de ffgado (Na, J. et al. 1999 Virology 263:70-7), mas estes camundongos ainda nao foram usados para avaliagao de fenotipos att de virus vacina candidates. Virus mutantes ou virus recombinantes transportando uma ou mais destas mutagoes aqui descritas sao imaginados como sendo testados para replicagao em macacos rhesus (ou outro modelo animal apropriado) como anunciadores para atenuagao em humanos.
[0091] A mutagenese quimica de virus DEN4 e analise de sequencias de virus resultantes aqui descritas resultaram na identificagao de um grande numero de mutagoes de ponto resultando em substituigoes de aminoacidos em todos os genes exceto C e NS4A assim como mutagoes de ponto na UTR 5’ e 3’ (Tabelas 3 e 4). Esta abordagem de mutagenese de genoma-inteiro tern o beneficio de identificar mutagoes dispersas por todo o inteiro genoma que sao pre-selecionadas para viabilidade no substrata de celulas Vero. Dez virus mutantes 5-FU que foram ts em celulas Vero e HuH-7 e tres virus que foram seletivamente ts em celulas HuH-7 contiveram somente mutagoes fora dos genes codificando as proteinas estru-turais, isto e, nos genes NS ou UTR 5’ e 3’. Estas mutagoes junto com a supressao A30 na UTR 3’ sao particularmente apropriadas para inclusao em vacinas quimericas, antigenicas, que consistem em um vetor DEN4 atenuado transportando os genes estruturais tipo selvagem (C, prM, E) dos outros sorotipos de virus DEN. O uso desta estrategia tern varias vantagens. Cada virus quimerico antigenico que possui proteinas estruturais a partir de um virus tipo selvagem junto com mutagoes atenuantes em suas UTRs ou genes NS deve manter sua infectividade para humanos, que e grandemente mediada pela proteina E, e, por isso, cada componente de vacina deve ser imunogenico (Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). A maquinaria replicativa das linhagens de vacina tetravalente pode compartilhar as mesmas mutagoes atenuantes nos genes NS ou na UTR as quais devem atenuar cada componente de vacina para um grau similar e pelo que minimizar interferencia ou complementagao entre os quatro virus vacina. Em adigao, proteina E tipo selvagem pode ser esperada induzir mais eficientemente anticorpos neutralizantes contra cada virus DEN individual.
[0092] Analise de sequencias de vfrus de dengue (Blok, J. et al. 1992 Virology 187:573-90; Lee, E. et al. 1997 Virology 232:281-90; Puri, B. et al. 10997 J Gen Virol 78:2287-91) e vfrus de febre amarela (Dunster, L.M. et al. 1999 Virology 261:309-18; Holbrook, M.R. et al. 2000 vfrus Res 69:31-9) gerados previamente atraves de passagem serial em cultura de tecido tern mutagoes por todo o genoma, um padrao que nos observamos no presente estudo. Analises recentes da linhagem de vacina PDK-53 DEN2 identificaram as importantes mutagoes envolvidas em atenuagao que foram localizadas em regioes nao-estruturais incluindo a UTR 5’, NS1 e NS3 (Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9). Esta linhagem de vacina DEN2 tern sido usada para formagao de um vfrus quimerico com genes C-prM-E de DEN1 (Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). Em estudos separados, a sequencia da vacina DEN1 linhagem 45AZ5 PDK-27 foi determinada e comparada a virus parentes, mas as mutagoes responsaveis por atenuagao ainda nao foram identificadas (Puri, B. et al. 1997 J Gen Virol 78:2287-91).
[0093] Varias substituigoes de aminoacidos foram identi-ficadas em mais de um virus mutante 5-FU ts (Tabela 5). Lee et al. reportaram anteriormente verificagao de repetidas mutagoes em clones de virus DEN3 separados apos passagem serial em celulas Vero (Lee, E. et al. 1997 Virology 232:281-90). Uma mutagao (K>N) identificada em E em posigao a.a. 202 em uma serie de passagem de DEN3 simples tambem foi encontrada em nosso virus mutante 5-FU #1012 (K>E). Mutagoes observadas nos virus mutantes irmas 5-FU sao imaginadas como representando mudangas adaptativas que conferem uma aumen-tada eficiencia de replicagao de DEN4 em celulas Vero. Tais mutagoes sao imaginadas como sendo beneficas para inclusao em uma vacina de virus DEN atenuado-vivo atraves de aumento de rendimento de virus vacina durante fabricagao. Interessantemente, tres substituigoes de aminoacidos distin-tas foram verificadas em NS4B dos virus mutantes irmas 5-FU. A exata fungao deste gene e desconhecida, mas estudos anteriores de vacinas de febre amarela atenuadas vivas (Jennings, A.D. et al. 1994 J Infect Dis 169:512-8; Wang, E. et al. 1995 J Gen Virol 76:409-13) identificaram mutagoes em NS4B associadas com fenotipos de atenuagao.
[0094] A mutagao na posigao nt 4995 de NS3 (S1632P) estava presente como a unica mutagao significante identi-ficada em tres virus mutantes 5-FU (#239, #489, e #773). Esta mutagao foi introduzida em um virus DEN4 recombinante e verificada conferir um fenotipo ts e att (Tabela 6). Estas observagoes identificam claramente a mutagao 4995 co mo uma mutagao atenuante. Analise de um alinhamento de sequencias (Chang, G.-J. 1997 em: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno, eds. pp. 175-198 CAB International, New York) dos quatro virus de dengue indicou que a Ser em posigao de a.a. 1632 esta conservada em DEN1 e DEN2, enquanto DEN3 contem uma Asn nesta posigao indicando que a mutagao e prevista ser util em modificagao de fenotipos dos outros sorotipos de virus DEN. A proteina NS3 e 618 a.a. de comprimento e contem ambas atividades serina protease e helicase (Bazan, J.F. & Fletterick, R.J. 1989 Virology 171:637-9; Brinkworth, R.l. et al. 1999 J Gen Virol 80:1167-77; Valle, R.P. & Falgout, B. J Virol 72:624-32). A mutagao 4995 resulta em uma alteragao em posigao a.a. 158 em NS3 que esta localizada na regiao terminal-N contendo o dominio protease. Posigao de aminoacido 158 esta localizada dois residues de a. a. afastada de uma regiao conservada de NS3 designada homologia caixa quatro. Este dominio foi identificado em membros da famllia flavivlrus e e acreditado ser um determinante crltico da especificidade de substrate protease de NS3 (Bazan, J.F. & Fletterick, R.J. 1989 Virology 171:637-9; Brinkworth, R.l. et al. 1999 J Gen Virol 80:1167-77). Entretanto, o exato mecanismo que resulta no fenotipo associado com a mutagao 4995 ainda nao foi identificado. A identificagao da mutagao 4995 como uma mutagao atenuante permite uma previsao de sua utilidade para ainda atenuagao de rDEN4A30.
[0095] Nos determinamos a contribuigao de mutagoes 5-FU individuals para os fenotipos observados atraves de introdugao das mutagoes nos virus DEN4 recombinantes como foi aqui demonstrado para a mutagao 4995 (ver exemplo 3). Em adigao, combinagao de mutagoes individuals umas com as outras ou com a mutagao A30 e util para ainda modificar o fenotipo de atenuagao de vacinas candidatas de virus DEN4. A introdugao da mutagao 4995 em rDEN4A30 aqui descrito tornou o mutante duplo rDEN4A30-4995 ts e 1.000 vezes mais atenuado para o cerebro de camundongo que rDEN4A30. Esta observagao demonstrou a exequibilidade de modificagao de ambos, cultura de tecido e fenotipos in vivo destes e outros candidates a vacina de virus de dengue. Uma vez as mutagoes responsaveis pelo fenotipo ts especifico de celula HuH-7 sejam identifi-cadas como descrito acima e introduzidas no candidate a vacina rDEN4A30, nos imaginamos confirmar que estas mutagoes atenuam vfrus vacina rDEN4A30 parra o ffgado de humanos. Um menu de mutagoes atenuantes e imaginado como sendo montado o que e previsto ser util em geragao de vfrus vacina de dengue recombinantes satisfatoriamente atenuados e em aumento do nosso entendimento da patogenese de vfrus de dengue (ver Exemplo 7).
EXEMPLO 2 Mutagenese qufmica de vfrus DEN4 resulta em vfrus mutantes de placa pequena com fenotipos de atenuacao e sensivel a temperatura
[0096] Mutagoes que restringem replicagao de vfrus de dengue foram procuradas para a geragao de vacinas de vfrus de dengue atenuados vivos recombinantes. Vfrus de dengue tipo 4 (DEN4) foi previamente desenvolvido em celulas Vero na presenga de 5-fluor uracila, e a caracterizagao de 1.248 clones passados em celula Vero, mutagenizados identificou 20 vfrus mutantes sensfveis a temperatura (ts) que foram atenuados (att) em cerebro de camundongo jovem (Exemplo 1). A presente investigagao estendeu estes estudos atraves de identificagao de adicionais 22 vfrus mutantes DEN4 que tern fenotipo tipo placa pequena (sp) em celulas Vero e/ou a linha de celulas de ffgado, HuH-7. Cinco vfrus mutantes tern um fenotipo sp em ambas celulas Vero e HuH-7, tres dos quais tambem sao ts. Dezessete vfrus mutantes tern um fenotipo sp somente em celulas HuH-7, treze dos quais tambem sao ts. Cada um dos vfrus sp foi de crescimento restrito no cerebro de camundongo jovem, exibindo uma ampla faixa de redugao em replicagao (9 a 100.000 vezes). Sequencia de nucleotideos completa foi determinada para os 22 vfrus mutantes sp DEN4, e substituigoes de nucleotideos foram encontradas na regiao nao-traduzida 3’ (UTR) assim como em todas as regibes codificantes exceto NS4A. Mutagoes identicas foram identi-ficadas em multiples clones de virus indicando que eles estao envolvidos na adaptagao de virus DEN4 a eficiente crescimento em celulas Vero.
[0097] Os virus DEN podem causar mais doenga e morte de humanos que qualquer outro arbovirus, e mais de 2,5 bilhoes de pessoas vivem em regibes com infecgao endemica de dengue (Gubler, D.J. 1998 Clin Microbiol Ver 11:480-96). Anual-mente, ha uma estimativa de 50-100 milhbes de casos de febre de dengue (DF) e 500.000 casos da mais seria e potencialmente letal febre hemorragica de dengue/sindrome de cheque de dengue (DHF/DSS)(Gubler, D.J. & Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53:35-70). Febre de dengue e uma infecgao aguda caracterizada por febre, dor de cabega retro-orbital, mialgia, e exantema. No momento de fervescencia durante DF, uma complicagao mais severa de infecgao de virus DEN, DHF/DSS, pode ocorrer que e caracterizada por um segundo periodo febril, manifestagbes hemorragicas, hepatomegalia, trombocitopenia, e hemoconcentragao, que pode conduzir a choque potencialmente ameagador de vida (Gubler, D.J. 1998 Clin Microbiol Ver 11:480-96).
[0098] Os sitios de replicagao de virus DEN em humanos e sua importancia e relagao a patogenese de DF e DHF/DSS ainda sao incompletamente entendidos (Innis, B.L. 1995 em: Exotic Viral Infections J.S. Porterfield, ed. pp. IOS146 Chapman and Hall, London). Em adigao a replicagao em celulas linfoides, tornou-se evidente que o figado esta envolvido em infecgao DEN de humanos. Elevagoes transientes em niveis de aspartato amino transferase (AST) e alanina amino transfe-rase (ALT) em soro sao observadas na maioria de pacientes infectados com virus Den e hepatomegalia e observada em alguns pacientes (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Kuo, C.H. et al. 1992 Am J Trap Med Hyg 47:265-70; Mohan, B. et al. J Trap Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al 2000 Southeast Asian J Trap Med Public Health 31:259-63). Hepatocitos antigenopositivo de virus DEN sao vistos cir-cundando areas de necrose no figado de casos fatais (Coulevard, A. et aL, 1999 Hum Pathol 30:1106-10; Herre, M.R. et al. 2001 Virchows Arch 438:107-15), a partir dos quais sequencias de vfrus de dengue foram identificadas usando-se RT-PCR (Rosen, L. et al. 1999 Am J Trap Med Hyg 61:7204). De potencial importancia para a etiologia de infecgao de vfrus de dengue severa, tres estudos demonstraram que os nfveis medios de ALT e AST em soro foram significantemente aumentados em pacientes com DHF/DSS comparados com aqueles com DF (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Mohan, B. et al. 2000 J Trap Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al. 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259-63). Como esperado, elevagao de enzimas do ffgado em soro foi observada em experimentos clfnicos de candidatos de vacina de vfrus DEN (Exemplo 8; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Edelman, R. et al. 1994 J Infect Dis 170:1448-55; Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:31793188; Vaughn, D.W. et al. 1996 Vaccine 14:329-36).
[0099] Baseado na crescente carga de doenga associada com infecgao de vfrus DEN nas varias decadas passadas, uma vacina que confira protegao contra os quatro sorotipos de vfrus de dengue e necessaria, mas nenhuma e presentemente licenciada. Devido ao aumentado risco de severa DHF/DSS associada com infecgao secundaria com um sorotipo de vfrus DEN heterologo (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B. et al. 1977 J Exp Med 146:218-29; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72), uma vacina efetiva tern de conferir simultanea protegao contra cada um dos quatro sorotipos de vfrus DEN. Varias abordagens sao atualmente perseguidas para o desenvolvimento de uma vacina tetravalente contra os vfrus de dengue (Bancroft, W.H. et al. 1984 J Infect Dis 149:1005-10; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44-7; Butrapet, s. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Guirakhoo, F. et al. 2000 J Virol 74:5477-85; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8; Kanesa-thassan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-3188). Uma tai abordagem, um candidate a vacina DEN4 atenuado-vivo, chamado 2AA30, foi atenuado e imunogenico em uma coorte de 20 voluntaries (Exemplo 8). O virus 2AA30 recombinante contem uma supressao de 30 nt na UTR 3’ que remove nucleotfdeos 10478-10507 e foi verificada produzir um nivel baixo ou indetectavel de viremia em vacinados em uma dose de 105 PFU/vacinado. Um exantema assintomatico foi reportado em 50% de voluntaries, e a unica anormalidade de laboratorio observada foi um aumento transiente, assintomatico, no nivel de ALT em soro em 5 dos 20 vacinados. Todos os vacinados com 2AA30 desenvolveram anticorpos neutralizantes no soro contra virus DEN4 (titulo medio: 1:580), e 2AA30 nao foi trans-mitido a mosquitos que se alimentaram experimentalmente sobre os vacinados (Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:414-9). Devido as desejaveis propriedades conferidas pela mutagao A30, candidates a vacina quimericos estao sendo construidos os quais contem os genes estruturais de virus DEN tipo 1, 2, e 3, no fundo DEN4 atenuado transportando a mutagao A30 geneticamente estavel. Mutagoes atenuantes fora dos genes estruturais sao particularmente atraentes para inclusao em candidates de vacina quimericos antigenicos porque elas nao afetarao a infectividade ou imunogenicidade conferida pelo principal mediador de imunidade humoral para virus DEN, a proteina envelope (E).
[00100] A presenga de exantema e elevados niveis de ALT sugere que o candidate a vacina 2AA30 pode ser levemente sub-atenuado em humanos. Similarmente, muitas tentativas anteriores para desenvolvimento de vacinas de virus dengue atenuado vivo renderam candidates a vacina que foram superou subatenuados em humanos, alguns dos quais tambem indu-ziram elevagao de niveis de ALT e AST em soro (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em : Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Eckels, K.H. et al. Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80; Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:31793188; McKee, K.T., Jr. et al. 1987 Am J Trap Med Hyg 36:435-42). Por isso, nos desenvolvemos um menu de mutagoes de ponto conferindo fenotipos senslvel a temperatura (ts), placa pequena (sp), e atenuagao (att) capaz de atenuar virus DEN4 em um grau variavel (Exemplo 1). Nos anteriormente descrevemos 20 virus mutantes que exibem um fenotipo ts, mas nao sp em celulas Vero ou celulas de flgado HuH-7 e que mostram replicagao atenuada em cerebro de camundongo (Exemplo 1). Adigao de tais mutagoes a 2AA30 ou outros candidates a vacina de virus de dengue e imaginada como rendendo candidates a vacina que exibem um balango mais satisfatorio entre atenuagao e imunogenicidade.
[00101] No presente Exemplo, nos estendemos nossa analise do painel de 1248 clones de virus DEN4 gerado previamente por mutagenese com 5-fluor uracila (5-FU)(Exemplo 1), atraves de identificagao de um conjunto de 22 virus mutantes sp, alguns dos quais tambem tern um fenotipo ts. Virus mutantes de placa pequena foram procurados uma vez que tais virus sao frequentemente atenuados em humanos (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Crowe, J.E. Jr. et al. 1994 Vaccine 12:783-790; Crowe, J.E. jr. et al. 1994 Vaccine 12:691-699; Eckels, K.H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80; Murphy, B.R. & Chanock, R.M. 2001 em: Fields Virology D.M. Knipe, et al., Eds. Vol. 1, pp. 435468 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia; Takemoto, K.K. 1966 Prog Med Virol 8:314-48). Devido a infecgao natural com virus de dengue e vacinagao com 2AA30 poder ser associada com toxidez no flgado em humanos, nos identificamos virus mutantes com restrita replicagao em celulas de figado humano. Da mesma maneira, virus foram selecionados para tamanho de placa e sensitividade de temperatura na linha de celulas de hepatoma humano, HuH-7, assim como celulas Vero. Aqui nos descrevemos o fenotipo ts, sequencia de nucleotideos, propriedades de crescimento em camundongo jovem de 22 clones de vfrus mutantes DEN4 sp.
[00102] Celulas e virus. Celulas Vero WHO (celulas de rim de macaco verde africano) e celulas HuH-7 (celulas hepatoma humano)(Nakabayashi, H. et al. 1982 Cancer Res 42:3858-63) foram mantidas como descrito no Exemplo 1. Virus DEN4 2A e um vfrus tipo selvagem derivado de clone cDNA de DEN4 linhagem 814669 (Dominica, 1981)(Lai, C.J. etal. 1991 PNAS USA 88:5139-43; Mackow, E. et al. 1987 Virology 159:217-28). A sequencia de nucleotideos de DEN4 2A, o parente dos virus mutantes 5-FU, foi previamente cedido com o numero de acesso GenBank AF375822 (Exemplo 1). O candidato a vacina DEN4, 2AA30, (Exemplo 8) contem uma supressao de 30 nt na regiao nao-traduzida (UTR) 3’ que remove nucleotideos 10.478-10.507 (men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Os clones de cDNA p4, um derivado modificado do clone de cDNA de DEN4 2A, e p4A30 foram usados para gerar virus atenuado e tipo selvagem recombinante, rDEN4 e rDEN4A30, respectivamente (Exemplo 8). Numeros de acesso GenBank foram previamente cedidos como se segue (virus: numero de acesso)): DEN4 linhagem 814669: AF326573; 2AA30: AF326826; rDEN4: AF326825; rDEN4A30: AF326827.
[00103] Formacao e clonaqem bioloqica de virus mutantes com um fenotipo sp. A formagao de 1.248 clones de virus a partir de uma reuniao de DEN4 2A mutagenizado com 5-fluor uracila foi previamente descrita (Exemplo 1). Em resumo, monocamadas de celulas Vero foram infectadas com DEN4 2A em uma multiplicidade de infecgao (MOI) de 0,01 e revestidas com MEM suplementado com FBS 2% e 5-fluor uracila 1 mM (5-FU)(Sigma, St. Louis, MO), que reduziu replicagao de DEN4 2A 100 vezes. Celulas Vero em placas de 96 pogos foram inoculadas com a suspensao de virus tratados com 5-FU, e clones de virus foram colhidos das placas recebendo virus terminalmente diluidos. Um total de 1248 clones de virus foi gerado a partir das culturas tratadas com 5-FU 1mM. Dois clones de virus, 2A-1 e 2A-13, foram gerados na mesma maneira a partir de culturas controles nao tratadas com 5-FU e serviram como virus controles passados-paralelos com um fenotipo tipo selvagem.
[00104] Avaliacao de tamanho de placa in vitro e sensiti-vidade de temperatura. Os 1248 clones de virus mutagenizados com 5-FU foram selecionados para sensitividade a temperatura atraves de avaliagao de replicagao de virus a 35°C (temperatura permissivel) e 39°C (temperatura restritiva) em celulas Vero e HuH-7. Monocamadas de celulas em placas de 96 pogos foram inoculadas com diluigoes serials de dez vezes de virus e placas replicas foram incubadas a 35°C e 39°C por cinco dias em banhos de agua de temperatura controlada. Replicagao de virus foi determinada atraves de coloragao com imunoperoxidase como descrito anteriormente (Exemplo 1). Uma colegao de 193 clones de virus 5-FU demonstrou uma redugao de 100 vezes ou maior em titulo a 39°C em qualquer linha de celulas, e estes virus ts presumidos ainda foram caracterizados. A eficiencia de formagao de placa (EOP) em temperaturas permissivel e restritiva e o tamanho de placa de cada um dos 193 clones de virus foram determinados como se segue. Diluigoes serials de dez vezes de suspensao de virus foram inoculadas sobre monocamadas de celulas Vero e HuH-7 confluentes em placas de 24 pogos em replicas. Apos incubagao a 35°C por duas horas, monocamadas foram revestidas com metil celulose 0,8% (EM Scince, Gibbstown, NJ) em meio L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) suplementado com FBS 2%, gentamicina, e L-glutamina. Apos incubagao de placas replicas por cinco dias a 35, 37, 38 ou 39°C em banhos de agua de temperatura controlada, placas foram visualizadas por coloragao com imunoperoxidase e contadas como descrito anteriormente. Tamanho de placa de cada um dos 193 virus foi avaliado na temperatura permissivel (35°C) e comparado com aquele de virus controle passado-paralelo DEN4 2A-13 com um tamanho de placa tipo selvagem. Virus mutantes incubados na temperatura permissivel de 35°C que tiveram um tamanho de placa de < 1mm ou <0,4mm (aproximadamente <50% do tamanho de DEN4 2A-13 tipo selvagem) em celulas Vero ou HuH-7, respectivamente, foram designados como tendo um fenotipo sp. O nivel de sensitividade a temperatura e tamanho de placa de cada virus foi confirmado em pelo menos dois experimentos separados. Setenta e cinco virus que foram confirmados terem um fenotipo ts e/ou sp putativo foram biologicamente clonados duas vezes adicionais e fenotipos foram reavalia-dos. Vinte e dois dos 75 virus terminalmente diluidos foram verificados possuirem um fenotipo sp. Dezesseis dos 22 virus mutantes tambem foram verificados terem um fenotipo ts como definido por uma redugao de 2,5 ou 3,5 log-io PFU/ml em titulo de virus em celulas Vero ou HuH-7, respectivamente, em temperatura restritiva comparado a temperatura permissiva de 35°C como descrito anteriormente (Exemplo 1). Vinte do 75 virus diluidos terminalmente foram verificados possuir um fenotipo ts sem um fenotipo sp e foram previamente descritos (Exemplo 1). Os restantes dos 75 virus nao satisfazem qualquer criterio para um virus mutante ts ou sp.
[00105] Avaliacao de virus mutantes sp para replicacao restrita em camundongos iovens. Experimentos animais foram realizados de acordo com as regulamentagdes e diretrizes de National Institutes of Health, Bethesda, MD. Crescimento de virus mutantes 5-FU DEN4 foi determinado em camundongos jovens Swiss Webster (Taconic Farms, Germantown, NY). Grupos de seis camundongos de sete dias foram inoculados intra-cerebro com 104PFU de virus em 30JJJ de Opti-MEM I (Invitrogen) e o cerebro de cada camundongo foi removido cinco dias depois e analisados individualmente como descrito anteriormente (Exemplo 1). Sobrenadantes clarificados de suspensoes 10% de cerebro de camundongo foram congelados a -70°C, e o titulo de virus foi determinado atraves de ensaio de placa em celulas Vero.
[00106] Determinacao da sequencia qendmica completa dos virus mutantes sp. A sequencia de nucleotideos dos virus DEN4 mutagenizados com 5FU foi determinada como descrito no Exemplo 8. Em resumo, RNA genomico foi isolado de clones de virus e cDNA foi preparado por transcrigao reversa e serviu como molde parra a geragao de sobreposigao de fragmentos de PCR. Um painel de primers foi projetado para sequenciar ambas fitas do produto de PCR a partir das quais sequencias consensos foram montadas e analisadas. A sequencia de nucleotideos das regioes 5’ e 3’ do genoma de virus foi determinada apos circularizagao do genoma de RNA como descrito no Exemplo 8.
[00107] Identificacao de virus mutantes DEN4 com 5-fluor uracila com um fenotipo sp. A formagao de um painel de 1.248 clones de virus a partir de uma suspensao de virus DEN4 2A tipo selvagem mutagenizados por 5-FU foi descrita anterior-mente (Exemplo 1). No presente estudo vinte e dois virus mutantes com um fenotipo sp foram identificados. O tamanho de placa de virus mutantes representatives e ilustrado na Figura 3. O tamanho de placa de virus DEN4 2A-13 (um virus passado-paralelo com um fenotipo tipo selvagem derivado de culturas controles nao tratadas com 5-FU) foi consisten-temente menor em celulas HuH-7 que aquele observado em celulas Vero (Figura 3A). Virus mutantes #569 e #1189 (Figura 3B) foram sp em ambas celulas Vero e HuH-7. Em contraste, clones de virus mutantes com 5-FU #311 e #1083 (Figura 3C) foram sp em somente celulas HuH-7, sugerindo um defeito especifico de celula de ffgado em replicagao dentro deste grupo fenotipico. Como indicado na Tabela 7, cinco virus mutantes foram verificados terem um fenotipo sp em ambas celulas Vero e HuH-7 enquanto 17 virus tiveram um fenotipo sp em somente celulas HuH-7. Cada clone de virus mutante com 5-FU foi comparado para um fenotipo sp ou ts com tres virus controles, 2A-13, rDEN4 tipo selvagem e rDEN4A30. Os virus recombinantes, rDEN4 e rDEN4A30, cada um teve um tamanho de placa em celulas Vero e HuH-7 similar aquele de DEN4 2A-13 indicando que a mutagao A30 nao confere um fenotipo sp (Tabela 7).
[00108] Maioria dos virus mutantes com 5-FU sp tambem teve um fenotipo ts em celulas Vero e/ou HuH-7 (Tabela 7) uma vez que virus mutantes foram inicialmente selecionados para sensitividade a temperatura. Sensitividade a temperatura foi definida como uma redugao 2,5 ou 3,5 logic PFU/ml em titulo de virus em celulas Vero ou HuH-7, respectivamente, em temperatura restritiva comparada a temperatura permissivel de 35°C como definido anteriormente (Exemplo 1). Tres virus mutantes (#574, #1269 e #1189) foram sp e ts em ambas celulas Vero e HuH-7, enquanto nove virus mutantes (#506-326 na Tabela 7) foram verificados serem ts em ambos tipos de celulas mas sp somente em celulas HuH-7. Quatro virus (#1104, 952, 738, e 1083) foram verificados ter um fenotipo tipo selvagem em celulas Vero mas foram ambos sp e ts em celulas HuH-7. Estes quatro virus mutantes cada um teve uma redugao de 6.000a 600.000 vezes em titulo de virus a 39°C em celulas HuH-7 com somente uma redugao de 6 a 40 vezes a 39°C em celulas Vero. Finalmente, virus mutantes sp foram identi-ficados os quais nao tern um fenotipo ts em qualquer linha de celulas; dois destes virus (#569 e #761) foram sp em ambas celulas Vero e HuH-7 e quatro virus (#1096-1012) foram sp somente em celulas HuH-7(Tabela 7). Como descrito anteriormente, a mutagao A30 nao confere sensitividade a temperatura em qualquer linha de celulas (Exemplo 1).
[00109] Os virus mutantes 5-FU so tern restrita replicacao em cerebro de camundongo jovem. Os 22 virus mutantes 5-FU DEN4 foram avaliados para sua habilidade em replicar no cerebro de camundongos jovens de uma semana. Como um marcador para atenuagao in vivo, seu nivel de replicagao foi comparado com aquele dos virus controles passados em paralelo com um fenotipo tipo selvagem, 2A-13 (Tabela 7). Dezenove de 22 virus mutantes sp tiveram uma redugao maior que 100 vezes em replicagao de virus no cerebro de camundongos jovens comparados a 2A-13 e nove virus tiveram uma redugao maior que 10.000 vezes.
[00110] Os cinco virus mutantes que foram sp em ambas celulas Vero e HuH-7 foram 5.000 a 100.000 vezes restritos em replicagao comparados a 2A-13. Dois destes virus mutantes, #569 e #761, nao foram ts em qualquer linha de celula mas tiveram uma redugao em titulo de virus de mais que 10.000 vezes em cerebro de camundongo, indicando que o fenotipo sp em ambas linhas de celulas Vero e HuH-7 e um importante marcador substitute para replicagao atenuada em cerebro de camundongo jovem. Virus mutantes 5-FU que foram sp somente em celulas HuH-7 tiveram uma faixa mais variavel de replicagao em cerebro de camundongo. Tres virus tiveram uma redugao media em titulo de virus de menos que 10 vezes comparados a virus 2A-13. Entretanto, 8 de 13 virus que foram ts em celulas Vero ou HuH-7 mas sp somente em celulas HuH-7 tiveram uma redugao maior que 5.000 vezes em replicagao de virus. Os resultados das analises de replicagao in vivo dos 20 virus mutantes 5-FU ts descritos anteriormente (Exemplo 1) e os 22 virus mutantes sp sao resumidos na Tabela 8. Virus mutantes com ambos fenotipos sp e ts foram verificados terem um nivel de atenuagao significantemente maior no cerebro de camundongos jovens quando comparados a virus com somente um fenotipo ts.
[00111] Analise de sequencias dos virus mutantes com 5-FU sp. Para iniciar uma analise das bases geneticas do fenotipo ts, sp ou att dos 22 virus mutantes sp, a completa sequencia de nucleotideos de cada genoma de virus foi determinada e e resumida na Tabela 9 (sp em celulas Vero e HuH-7) e Tabela 10 (sp somente em celulas HuH-7). Todas as mutagbes identificadas foram substituigoes de nucleotideos, na medida em que supressoes ou insergoes nao foram observadas. Mutagbes de ponto foram distribuidas por todo o genoma, incluindo a UTR 3’ assim como em todas as regibes codificantes. Devido a todos os virus mutantes com 5-FU terem pelo menos duas mutagbes (duas a seis), os fenotipos observados nao podem ser diretamente atribuidos a uma mutagao especffica. A maioria de virus sp tambem conteve mutagoes de ponto traducionalmente silenciosas (nenhuma a quatro) nas regides codificantes estruturais ou nao-estruturais. Entretanto, estas mutagoes silenciosas nao sao esperadas contribufrem para os fenotipos observados. Seis dos 22 virus mutantes sp (Tabelas 9 e 10) foram verificados terem mutagoes somente nos genes NS e/ou a UTR 3’, indicando que o fenotipo sp pode ser conferido por mutagoes fora dos genes estruturais.
[00112] Presenca de mutacoes identicas em multiplos virus mutantes 5FU. Analises dos dados de sequencia de nucleo-tfdeos completa para os virus mutantes 5-FU identificaram varias mutagoes repetidas que estavam presentes em dois ou mais virus. Tais mutagoes tambem foram identificadas previamente durante nossa analise de vinte vfrus mutantes 5-FU com um fenotipo ts mas nao sp (Exemplo 1). Porque estas mutagoes ocorreram em vfrus junto com adicionais mutagoes, a contribuigao das repetidas mutagoes para os fenotipos sp, ts, e att observados permanece empirica. A Tabela 11 lista as repetidas mutagoes encontradas entre os 20 vfrus mutantes (nao sp) descritos anteriormente (Exemplo 1) e os 22 vfrus mutantes sp aqui descritos. Mutagoes repetidas foram identificadas nos seguintes genes: duas em E, duas em NS3, cinco em NS4B, uma em NS5, e duas na UTR 3’. Interessan-temente, dentro de uma regiao de trinta nucleotideos de NS4B (nt 7153-7182), existiram cinco diferentes substituigoes de nucleotideos que foram verificadas existirem em dezesseis vfrus. Tambem em nt 7.546 em NS4B, uma substituigao de aminoacido (Ala Vai) foi encontrada em 10 diferentes vfrus mutantes 5-FU. A significancia destas mutagoes repetidas em NS4B assim como em outras regioes genomicas de DEN4 permanece empirica, mas uma razoavel explicagao para este fenomeno e que estas mutagoes estao envolvidas em adaptagao de virus DEN4 para eficiente crescimento em celulas Vero, como ainda discutido no Exemplo 6.
[00113] Discussao. Como parte de uma estrategia de vacina genetica molecular, nos desenvolvemos mutagoes atenuantes que sao imaginadas como sendo uteis no desenvolvimento de uma vacina de virus de dengue tetravalente atenuado vivo. Especificamente, mutagoes que restringem replicagao do virus vacina em celulas de figado humano foram geradas uma vez que ha alguma virulencia residual do candidate a vacina rDEN4A30 para o figado de humanos. Virus mutantes com um fenotipo sp foram buscados em ambas celulas Vero e HuH-7 de figado humano, de modo a identificar-se virus mutantes faixa-hospedeiro que foram especificamente restritos em replicagao em celulas HuH-7 (sp em HuH-7 mas nao em Vero). Tais mutagoes sao imaginadas como sendo uteis em limitagao de replicagao de uma vacina candidata no figado de vacinados enquanto preservando ambos, eficiente replicagao em celulas Vero e imunogenicidade in vivo.
[00114] Varias observagoes a partir do presente estudo indicam que mutagoes sp conferem um fenotipo att in vivo. Isto nao e surpreendente uma vez que atenuagao em cerebro de camundongo jovem foi reportada para candidates a vacina de vfrus DEN vivos possuindo fenotipos sp, incluindo as linhagens de vacina DEN2 PDK-53 e DEN2 PR-159/S-1 (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 em: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, new York; Butrapet, S. et al. 2000 j Virol 74:3011-9; Eckels, K. H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80; Innis, B. L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80). Cada um dos 22 virus mutantes 5-FU DEN4 com um fenotipo sp (alguns dos quais tambem foram ts) tanto em celulas Vero como HuH-7 manifestaram replicagao restrita nos cerebros de camun-dongos. Seis virus mutantes 5-FU com um fenotipo sp na ausencia de um fenotipo ts foram mais atenuados nos cerebros de camundongos jovens que virus mutantes com somente um fenotipo ts (Exemplo 1), indicando que o fenotipo sp especifica um maior nivel de atenuagao para cerebro de camundongo que o fenotipo ts. Virus mutantes com ambos fenotipos ts e sp tiveram uma redugao mesmo maior em replicagao, ainda indicando que a atenuagao conferida pelos fenotipos ts e sp pode ser aditiva. Importantemente, dezessete dos 22 virus mutantes sp foram virus mutantes sp hospedeiro-faixa, sendo sp somente em celulas HuH-7. Uma vez que tais mutagoes sao imaginadas como sendo uteis em res-trigao de replicagao de um virus DEN4 em celulas de figado humano, nos usamos analises de sequencias de nucleotideos para determinar as bases geneticas do fenotipo sp.
[00115] Analises da completa sequencia genomica dos 22 virus DEN4 sp revelaram substituigoes na UTR 3’ assim como mutagbes codificantes em todos os genes exceto NS4A. Foi primeiro notado que varias mutagbes especificas estavam presentes em dois ou mais dos 22 virus mutantes DEN4 sp e que muitas destas mesmas mutagbes tambem foram previamente identificadas entre o conjunto de 20 virus mutantes DEN4 ts (Exemplo 1). Uma vez que flavivirus podem rapidamente acumular mutagbes durante passagem em cultura de tecido (Dunster, L.M. et al. 1999 Virology 261:309-18; Mandi, C.W. et al. 2001 J Virol 75:5627-37), muitas destas mutagbes super-expressadas, referidas anteriormente como mutagbes de adaptagao de celula Vero putativas (Exemplo 1), provavel-mente promovem eficiente replicagao em celulas Vero e foram selecionadas nao-intencionalmente durante a clonagem bio-logica dos virus mutantes. O efeito destas mutagbes sobre replicagao de virus DEN em celulas Vero, o substrato pro-posto para fabricagao de vacina, e discutido no Exemplo 6.
[00116] As mutagbes sp identificadas entre os virus mutantes 5-FU sao imaginadas como sendo uteis em varias diferentes abordagens para o desenvolvimento de linhagens de vacinas de virus DEN. Como descrito acima para a formagao de virus quimericos antigenicos, uma ou mais mutagbes atenuantes sp sao imaginadas como sendo adicionadas ao fundo genetico de DEN4A30 para suplementar o fenotipo att da mutagao A30. Uma segunda abordagem e para introduzir uma mutagao atenuante sp, com ou sem A30, em clones de cDNA infecciosos dos outros tres sorotipos de DEN. A habilidade de transferir mutagoes entre virus geneticamente relacionados e manutengao de similares fenotipos att foi previamente demonstrada (Skiadopoulos, M.H. et al. 1999 Virology 260:125-35). Estas estrategias distintas sao imaginadas como sendo uteis como abordagens separadas ou complementares para a construgao de uma vacina de virus DEN tetravalente, sublinhando a importancia da identificagao de um grande painel de mutagoes att dentro de virus DEN.
EXEMPLO 3 Virus DEN4 recombinantes contendo mutacoes identificadas em virus mutantes 5-FU mostram replicagao restrita em cerebro de camundongo jovem e em camundongo SCID transplantado com celulas de figado humano
[00117] Foram apresentados dados nos Exemplos 1 e 2 que resumem a geragao, caracterizagao e analise de sequencias de 42 virus DEN4 mutantes atenuados. Para tres dos virus mutantes (#239, 489, e 773) com uma mutagao sentido-errado simples na posigao nt 4995 em NS3, foi claro que a mutagao identificada especificou os fenotipos ts e att. Esta conclusao foi confirmada no Exemplo 1 por cultura de tecido e caracterizagao in vivo de rDEN4-4995, um virus recombinante no qual a mutagao 4995 foi introduzida por mutagenese de sitio direcionado. Nesta analise, rDEN4-4995 exibiu o mesmo nivel de sensitividade a temperatura e atenuagao como virus mutantes 5-FU #239, 489, e 773. A mutagao(oes) individual nos virus mutantes 5-FU restantes que especifica os fenotipos observados permanece a ser identificada, uma vez que maioria destes virus possui mais de uma substituigao de nucleotideo. Nos conduzimos uma analise para identificar as mutagoes em um subconjunto dos outros 39 virus mutantes que especificam os fenotipos ts, sp, e att atraves de introdugao de cada mutagao no wt DEN4 CDNA (p4) e avaliagao dos fenotipos dos resultantes virus DEN4 recombinantes transportando as mutagoes individuais. Estudos previos de um candidate a vacina de virus DEN2 (Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9) assim como outras vacinas de virus (Whitehead, S.S. et al. 1999 J Virol 73:871-7) demonstraram a utilidade desta abordagem para a identificagao das bases geneticas de atenuagao.
[00118] Como descrito nos Exemplos 1 e 2, 19 virus mutantes 5-FU foram identificados os quais foram verificados conterem mutagoes codificantes somente nos genes NS e/ou substituigoes de nucleotideos na UTR 5’ ou 3’ que podem facilitar a geragao de virus quimericos antigenicos. No presente exemplo, as bases geneticas dos fenotipos att de cerebro de camundongo e sp, ts foram identificadas para estes 19 virus usando genetica reversa para gerar virus DEN4 (rDEN4) recombinantes contendo mutagoes individuais identificadas no painel de virus mutantes DEN4. Em adigao, os 19 virus mutantes 5-FU foram avaliados para replicagao em um novo modelo animal pequeno para replicagao de virus DEN4, camundongos SCID transplantados com celulas HuH-7 (SCID-HuH-7) e as bases geneticas dos virus att foram identificadas usando-se virus rDEN4 mutantes. Sao tambem apresentadas verificagoes descrevendo a geragao e caracterizagao de um virus recombinante contendo duas das mutagoes atenuantes identificadas assim como uma combinagao de selecionadas mutagoes com 5-FU com a mutagao A30.
[00119] Geragao de virus rDEN4 contendo mutagoes com 5-FU. Os processes usados para a geragao de virus rDEN4 sao esbogados na Figura 4 e sao similares aqueles descritos no Exemplo 1. Em resumo, o cDNA de p4 foi digerido com as apropriadas enzimas de restrigao e os fragmentos resultantes foram subclonados em um vetor pUC119 modificado. Para mutagenese Kunkel, preparagoes de DNA de fita simples dos vetores pUC-NS foram feitas, e primers foram projetados para introduzir individualmente mutagoes que estavam presentes nos virus mutantes 5-FU. As sequencias dos 41 oligo-nucleotideos mutagenicos usados para geragao de virus recombinantes de mutagao simples sao apresentadas na Tabela 12. Primers foram projetados para co-introdugao ou co-separar um sitio de enzima de restrigao traducionalmente silencioso no cDNA, o que facilita grandemente a selegao e identificagao de clones de cDNA possuindo a sequencia mutante. Fragmentos contendo as mutagoes introduzidas foram clonados de volta em p4, e analises de sequencias de nucleotideos confirmaram a presenga das alteragoes de nucleotideos. Um total de 33 virus rDEN4 foram gerados os quais contiveram cada um as mutagoes individuals presentes nos 19 virus mutantes 5-FU contendo somente mutagoes codificantes nos genes NS e/ou substituigoes de nucleotideos na UTR 5’ ou 3’. 8 virus rDEN4 adicionais foram gerados de mutagoes identificadas no restante painel de 42 virus mutantes de 5-FU.
[00120] Um clone de cDNA tambem foi gerado o qual combinou as mutagoes identificadas em posigao nt 4995 em NS3 e 7849 em NS5. A mutagao 7849 foi introduzida no clone de cDNA de p4-4995 atraves de substituigao de fragmento Xmal-Pstl com aquele derivado do clone de cDNA de p4-7849. A presenga de ambas mutagoes foi confirmada por analise de sequencia. A mutagao A30 foi introduzida na UTR 3’ dos clones de cDNA mutantes individuals atraves de substituigao de fragmento Mlul-Kpnl com aquele derivado do clone cDNA de p4A30, e a presenga da supressao foi confirmada por analise de sequencias.
[00121] Virus recombinantes foram recuperados por trans-fecgao de celulas Vero ou C6/36 com transcritos de RNA derivados dos clones de cDNA mutantes como descrito no Exemplo 1. Virus recuperados foram diluidos terminalmente duas vezes e estoques de trabalho de virus foram preparados em celulas Vero. Cada um dos clones de cDNA mutantes foi recuperado apos transfecgao como esperado uma vez que os vfrus mutantes 5-FU contendo estas mutagoes foram viaveis.
[00122] Caracterizacao de fenotipos ts e att dos virus rDEN4 contendo mutacoes introduzidas. Dos 19 vfrus mutantes 5-FU com mutagoes somente em genes NS e/ou a UTR 5’ ou 3’, seis tiveram um fenotipo sp (Tabela 13), dez tiveram um fenotipo ts em celulas Vero e HuH-7 (Tabela 14), e tres tiveram um fenotipo ts somente em celulas HuH-7 (Tabela 15). Para os seis vfrus mutantes 5-FU sp, #738, 922, 1081, 1083, 1136, e 1189, dezessete mutagoes identificadas por analises de sequencia resultaram em uma alteragao codificante ou uma alteragao de nucleotideos na UTR e cada um foi engenheirado em um clone cDNA de DEN4 individual. Virus contendo cada uma das mutagoes definidas foram recuperados com sucesso e propagados e foram testados para eficiencia de formagao de placa em celulas Vero e HuH-7 em varias temperaturas, fenotipo de tamanho de placa, e propriedades de crescimento em camundongos jovens usando-se metodos previamente descritos nos Exemplos 1 e 2.
[00123] A Tabela 13 lista os fenotipos dos seis vfrus parentes mutantes 5FU sp e aqueles dos 17 vfrus rDEN4 codificando mutagoes simples presentes no vfrus parente. Por exemplo, #1189 mutante 5-FU (parente), que foi ts e sp em ambas linhas de celulas e tiveram uma redugao de quase 10 000 vezes em replicagao em cerebro de camundongo jovem, conteve 4 mutagoes codificantes em posigao nt 3303 em NS1, 4812 e 5097 em NS3, e 7182 em NS4B. Analises dos quatro vfrus rDEN4 contendo cada uma destas mutagoes indicaram que rDEN4-5097 teve um fenotipo ts, sp, e att enquanto rDEN4-3303, rDEN4-4812, e rDEN4-7182 nao tiveram fenotipos discerniveis, indicando que a mutagao em nt 5097 foi responsavel pelo fenotipo observado no #1189, parente 5-FU. Assim, analise das contribuigoes relativas das quatro mutagoes presentes no #1189 mutante 5-Fu para seu fenotipo de atenuagao prove a estrutura para uma analise similar dos restantes vfrus mutantes 5-FU. Esta analise demonstra especificamente os processes usados para identificagao de mutagoes contribuindo para o fenotipo observado. Os feno-tipos ts, sp, e att de virus parentes 5-FU #738, 922, 1081, e 1083, foram similarmente atribuidos a mutagoes simples 3540, 4306, 2650, e 10634, respectivamente. Entretanto, duas mutagoes separadas (3771 e 4891) contribuiram para os fenotipos de virus mutante 5-FU #1136.
[00124] A Tabela 14 lista as bases geneticas da atenuagao em cerebro de camundongo e ts para os dez virus mutantes 5-FU com fenotipos ts em ambas celulas Vero e HuH-7. Como descrito no Exemplo 1, a mutagao 4995 que e a unica mutagao presente em tres virus mutantes 5-FU, #239, #489, e #773, foi verificada conferir um fenotipo ts e att, confirmando as bases geneticas para os fenotipos exibidos por estes virus. Em tres experimentos separados, o virus rDEN4-4995 foi verificado ter uma diminuigao de aproximadamente 1.000 vezes em replicagao nos cerebros de camundongos jovens quando comparado aquela de virus tipo selvagem (Tabelas 6 e 14). A mutagao 4995 tambem esta presente em virus mutantes 5-FU #473, #759, e #816, cada um dos quais tern adicionais mutagoes. Os fenotipos ts e att observados nestes virus podem ser atribuidos a mutagao 4995 uma vez que as mutagoes adicionais nao mostram fenotipos discerniveis. Interessan-temente, virus mutante 5-FU #938 tern a mutagao 4995 e uma mutagao adicional em nt 3442 em NS1 com ambas mutagoes independentemente conferindo replicagao restrita em cerebro de camundongo. Os restantes tres virus parentes 5-FU na Tabela 14, #173, #509, e #1033, foram verificados, cada um, conterem uma mutagao simples responsavel pelo fenotipo att: 7849, 8092, e 4907, respectivamente.
[00125] Tres virus mutantes 5-FU, #686, #992, e #1175 com fenotipos ts especificos de celula HuH-7 sao listados na Tabela 15. Mutagoes em NS3 (5695) e NS5 (10186) foram verificadas conferirem os fenotipos observados para virus parentes #992 e #1175. Interessantemente, duas mutagoes em NS2A, 3575 e 4062, foram verificadas resultarem em um aumento sinergistico no nivel de atenuagao. Ambas mutagoes individuals tiveram uma diminuigao de aproximadamente 100 vezes em replicagao de virus no cerebro enquanto os virus parentes com ambas mutagoes tiveram uma redugao de quase 10.000 vezes. A Tabela 16 lista duas mutagoes adicionais com um fenotipo att, 4896 e 6259 em NS3.
[00126] Replicagao de virus DEN4 em camundongos SCID transplantados com celulas HuH-7. Uma vez que virus DEN replicam pobremente no figado de camundongos e estudos correspondentes sao impraticaveis de serem conduzidos em primatas nao-humanos, um modelo animal que avalie o nivel in vivo de replicagao de virus DEN em celulas de flgado foi desenvolvido baseado em um relatorio recente examinando a replicagao de virus DEN em camundongos SCID transplantados com uma linha de celulas continua de celulas de tumor de figado humano (An, J. et al. 1999 Virology 263:70-7). Camundongos SCID transplantados com linhas de celulas continuas humanas, celulas primarias, ou tecidos organizados foram similarmente usados para estudar-se a replicagao de outros virus que carecem de modelo animal pequeno (Mosier, D.E. 2000 Virology 271:215-9). Em nosso estudo, camundongos SCID foram transplantados com celulas HuH-7 uma vez que virus DEN4 replicaram eficientemente nestas celulas em cultura de tecido e uma vez que estas foram as celulas usadas para definigao de fenotipo hospedeirofaixa. Estes estudos sao imaginados como enderegando a utilidade de exame de infecgao de virus DEN em modelos de xeno-enxerto-camundongo SCID para desenvolvimento de vacina (Na, J. et al. 1999 Virology 263:70-7; Lin, Y.L. et al. 1998 J Virol 72:9729-37).
[00127] Para ainda examinar as propriedades de crescimento in vivo dos 19 virus DEN4 mutantes 5-FU com mutagoes somente nos genes NS e/ou a UTR 3’ e virus mutantes rDEN4 correspondentes selecionados, replicagao foi avaliada em camundongos SCID transplantados com celulas HuH-7 (SCID-HuH-7). Para analises de replicagao de virus DEN4 em camundongos SCID-HuH-7, camundongos SCID de quatro a seis semanas (Tac:lcr:Ha(ICR))-Prkdcscid)(Taconic Farms) foram injetados intraperitonealmente com 107 celulas HuH-7 suspensas em 200 pl de solugao salina tamponada com fosfato (PBS). Em preparagao para transplants, celulas HuH-7 foram propagadas em cultura de celulas como descrito acima e colhidas por tripsinizagao em aproximadamente 80% de confluencia. Celulas foram lavadas duas vezes em PBS, contadas, re-suspensas em um volume apropriado de PBS, e injetadas no peritoneo de camundongos. Tumores foram detectados no peritoneo cinco a seis semanas apos transplants, e somente camundongos com tumores aparentes foram usados para inoculagao. Camundongos foram infectados por inoculagao direta no tumor com 104 PFU de virus em 50 pl de Opti-MEM I. Camundongos foram monitorados diariamente por sete dias e soro para titulagao de virus foi obtido por entalhe de cauda no dia 6 e 7. Aproximadamente 400 pl de sangue foram coletados em um tubo separador de sangue (Sarstedt, Germany), centrifugados, e soro foi feito em aliquotas e estocado a -70°C. O tftulo de virus foi determinado por ensaio de placa em celulas Vero. Sete dias apos infecgao, maioria de camundongos desenvolveu morbidez e todos os camundongos foram sacrificados. Tumores foram excisados e pesados para confirmar uniformidade dos grupos experimentais.
[00128] Experimentos preliminares indicaram que camun-dongos SCIDHuH-7 inoculados com DEN4 2A-13 diretamente no tumor desenvolveram viremia com niveis maximos (ate 8,0 logioPFU/ml soro) obtidos no dia 5 (Tabela 17). Virus tambem podem ser detectados no cerebro, figado e homogenates de tumor.
[00129] O nivel de viremia em camundongos SCID-HuH-7 infectados com virus mutantes rDEN4 ou 5-FU parenteral foi comparado com aquele do virus controle passado em paralelo, 2A-13, ou rDEDN4, respectivamente. Resultados de 4 experi-mentos separados indicaram que o candidato a vacina, rDEN4A30, teve uma redugao de quase 10 vezes em replicagao de virus comparado a rDEN4 tipo selvagem (Tabela 13) o que reflete a aparente atenuagao do candidato a vacina rDEN4A30 em humanos (Exemplo 8). Resultados nas Tabelas 13 a 15 indicam que tr~es virus mutantes 5-FU tiveram uma redugao maior que 100 vezes em viremia nos camundongos SCID-HuH-7 comparados a virus 2A-13 tipo selvagem: #1081, #1083, e #1189. O fenotipo comum entre estes vfrus foi um fenotipo sp em celulas HuH-7. Analises das bases geneticas do fenotipo att nestes vfrus mutantes 5-FU parentes identificaram tres mutagoes individuais em NS1, NS3, e a UTR 3’ que conferiram pelo menos uma redugao de 100 vezes em viremia. Especifi-camente, rDEN4-2650 (NS1), rDEN4-5097 (NS3), e rDEN4-10634 (UTR 3’) manifestaram uma redugao de 2,2, 3,6, e 4,3 logioPFU/ml em titulo de pico de viremia comparado a rDEN4, respectivamente. Estas mutagoes tambem conferiram o fenotipo att em cerebro de camundongos jovens. Vfrus mutantes 5-FU #738 e #509 tiveram uma redugao em viremia no camundongo SCID-HuH-7 comparado a 2A-13 tipo selvagem de 1,9 a 1,5 logioPFU/ml, respectivamente, e as bases geneticas para estes fenotipos sao imaginadas como sendo avaliadas em uma base empfrica.
[00130] Esta analise das bases geneticas dos fenotipos especificados pelas mutagoes nos vfrus mutantes 5-FU que manifestaram replicagao restrita em camundongos SCID-HuH-7 indicaram que (1) tres mutagoes separadas conferiram o fenotipo att; (2) estas mutagoes foram localizadas em duas proteinas, NS1 e NS3, e na UTR 3’; (3) estas tres mutagoes foram inteiramente responsaveis por cada uma dos fenotipos de culturas de celulas (ts ou sp) e in vivo (atenuagao em cerebro de camundongo e camundongo SCID-HuH-7) dos vfrus parentes; e (4) duas das tres mutagoes especificam o fenotipo sp hospedeiro-faixa (sp somente sobre HuH-7) e por isso sao imaginadas como sendo uteis em um vfrus vacina. Embora a relevancia de tais modelos de transplante-SCID para replicagao de vfrus e doenga em humanos seja desconhecida, a identificagao de tres novas mutagoes que restringem replicagao de virus DEN4 em camundongo SCID-HuH-7 e imagi-nada como facilitando um exame da correlagao entre o fenotipo att em camundongos SCIDHuH-7 com aquele em macacos rhesus ou humanos. Tais mutagoes, especificamente as muta-gdes sp hospedeiro-faixa, sao imaginadas como sendo uteis em conjungao com a mutagao A30 ou outra para diminuir a virulencia residual de rDEN4A30 ou outro virus de dengue o figado humano, e estudos sao imaginados como sendo conduzidos para construgao de tais virus rDEN4 e avaliam os mesmos em macacos e humanos (Exemplo 8).
[00131] Combinacao de duas mutacoes 5-FU em um fenotipo ts aditivo. A habilidade de combinar mutagoes individuals em virus rDEN4 como um meio para modular o fenotipo do resultante virus mutante duplo e uma maior vantagem de uso de tecnologia de cDNA recombinante para gerar ou modificar candidates a vacina de virus de dengue. Adigao de multiplas mutagoes ts e att a virus vacina recombinante e imaginada como aperfeigoando a estabilidade fenotipica do recombinante duplo devido a diminuida possibilidade de co-reversao das duas mutagoes para virulencia tipo selvagem (Crowe, J.E.Jr. et al. 1994a Vaccine 12:783-790; Skiadopoulos, M. H. et al. 1998 J Virol 72:1762-8; Subbarao, E.K. et al. 1995 J Virol 69:5969-5977; Whitehead, S.S. et al. 1999 J Virol 73:871-7). As mutagoes identificadas em posigao nt 4995 em NS3 e 7849 em NS5 foram combinadas em um unico clone de cDNA p4 e um virus recombinante, designado rDEN4-4995-7849, foi recuperado e avaliado para seus fenotipos ts e att (Tabela 18). rDEN4-4995-7849 foi mais ts que qualquer virus recombinante contendo as mutagoes individuals (Tabela 18), indicando o efeito aditivo das duas mutagoes ts. O virus rDEN4-4995-7849 teve uma redugao em replicagao de mais que 10 000 vezes nos cerebros de camundongos jovens. A redugao em replicagao do virus mutante duplo foi somente levemente aumentada acima daquela de rDEN4-7849, entretanto, uma diferenga no nivel de replicagao entre rDEN4-4995-7849 e rDEN4-7849 pode ser de dificil detegao uma vez que o nfvel de replicagao de ambos virus foi proximo do limite inferior de detegao (2,OlogioPFU/g de cerebro).
[00132] Combinacao de mutagoes 5-FU selecionadas com a mutagao A30 confere aumentada atenuagao de rDEN4A30 para os cerebros de camundongos jovens. Para definir o efeito de adigao de mutagoes individuals ao fundo de rDEN4A30 atenuado, cinco oombinagoes foram construfdas: rDEN4A30-2650, rDEN4A30-4995, rDEN4A30-5097, rDEN4A30-8092 e rDEN4A30-10634. Adigao de tais mutagoes de sentido errado com varios fenotipos ts, sp, e att e imaginada como servindo para diminuir a genicidade de reagao de rDEN4A30 enquanto mantendo suficiente imunogenicidade.
[00133] A mutagao A30 foi introduzida na UTR 3’ dos clones cDNA mutantes individuals atraves de substituigao de frag-mento Mlul-Kpnl com aquele derivado do clone CDNA p4A30, e a presenga da supressao foi confirmada por analise de sequencia. Virus recombinantes foram recuperados por transfecgao em celulas C6/36 para cada virus rDEN4. Entre-tanto, com diluigao terminal e passagem, o virus rDEN4A30 foi verificado nao crescer a um tftulo suficiente em celulas Vero e nao foi ainda perseguido. Isto e um exemplo de um cDNA onde a mutagao 5-FU e a mutagao A30 nao sao compativeis para eficiente replicagao em cultura de celulas. Para iniciar o processo de avaliagao de fenotipos in vivo dos outros quatro virus que replicaram eficientemente em cultura de celulas, virus rDEN4 contendo as mutagoes individuals e as correspondentes oombinagoes rDEN4A30 foram testados juntos para niveis de replicagao em cerebro de camundongo jovem. Os resultados na Tabela 19 indicam que adigao de cada uma das mutagoes confere um aumentado nivel de atenuagao em crescimento sobre o virus rDEN4A30, similar ao nivel conferido pela mutagao 5-FU individual. Nenhum efeito siner-gistico em atenuagao foi observado entre as mutagoes em sentido errado e A30. Estes resultados indicam que as mutagoes em sentido trocado em nucleotideos 2650, 4995, 8092 e 10634 sao compativeis com A30 para crescimento em cultura de celulas e in vivo e ainda podem atenuar o virus rDEN4A30 em cerebro de camundongo. Ainda estudos em camundongos SCID-HuH-7, macacos rhesus, e humanos sao imaginados como estabelecendo o efeito da combinapao de mutagoes individuais e A30 sobre atenuagao e imunogenicidade (Exemplo 8).
[00134] Atraves de identificagao de especificas mutagoes nos virus mutantes 5-FU que conferem os fenotipos obser-vados, um menu de definidas mutagoes ts, sp, e att e imaginado como sendo montado (ver exemplo 7). Numerosas combinagdes de duas ou mais destas mutagoes sao imaginadas como sendo selecionadas com ou sem a mutagao A30. Tais mutagoes e suas combinagoes sao imaginadas como sendo uteis para a construgao de virus recombinantes com varios niveis de atenuagao in vivo, assim facilitando a geragao de vacinas candidatas com aceitaveis niveis de atenuagao, imunogeni-cidade, e estabilidade genetica.
EXEMPLO 4 Geracao de virus mutantes DEN4 com fenotipos de sensitividade a temperatura e atenuacao em camundongo atraves de mutagenese de carqaagrupamento-para-alanina
[00135] Os exemplos anteriores descreveram a criagao de um painel de virus mutantes DEN4 com fenotipos ts, sp e att obtidos atraves de mutagenese com 5-FU. Como indicado nestes Exemplos, as mutagoes atenuantes identificadas nos virus mutantes 5-FU sao imaginadas como tendo varios usos incluindo (1) sintonia fina de nivel de atenuagao de candidates a vacina de virus de dengue existentes e (2) geragao de novos candidatos a vacina atraves de combinapao de duas ou mais destas mutagoes atenuantes. No exemplo atual, nos criamos um segundo painel de virus mutantes atraves de mutagenese de carga-agrupamento-para-alanina do gene NS5 de DEN4 e examinamos os resultantes virus mutantes para fenotipos ts, sp, e att como descrito nos exemplos 1 e 2. Os virus mutantes de carga-agrupamentopara-alanina recuperados demonstraram uma faixa de fenotipos incluindo ts em celulas Vero sozinhas, ts em celulas HuH-7 sozinhas, ts em ambos os tipos de celulas, att em cerebros de camundongos jovens, e att em camundongo SCID-HuH7.
[00136] A utilidade de virus mutantes expressando estes fenotipos ja foi descrita, entretanto, virus mutantes de carga-agrupamento-para-alanina possuem algumas caracteristicas desejaveis adicionais. Primeiro, as mutagoes relevantes sao imaginadas como sendo projetados para uso nos genes codificando as proteinas nao-estruturais de DEN4, e por isso sao imaginadas serem uteis para atenuagao de recombinantes quimericos antigenicos de DEN3 possuindo um fundo de vetor DEN4. Segundo, o fenotipo e usualmente especificado por tres ou mais mudangas de nucleotideos, tornando a probabilidade de reversao da sequencia mutante para aquela da sequencia de tipo selvagem menos que para uma mutagao de ponto simples, tais como mutagoes identificadas no painel de virus mutantes 5-FU. Finalmente, mutagoes atenuantes carga-agrupamento-para-alanina sao imaginadas como sendo facilmente combinaveis entre elas mesmas com outras mutagoes atenuantes para modificagao de fenotipo de atenuagao de candidates de vacina DEN4 ou de virus recombinantes quimericos antigenicos DEN1, DEN2, e DEN3 possuindo um fundo de vetor DEN4.
[00137] Mutagenese de carga-agrupamento-para-alanina. O p4 cDNA, a partir do qual virus mutantes e tipo selvagem recombinantes foram gerados, foi descrito nos Exemplos 1, 2 e 3 e na Figura 4. Mutagenese de carga-agrupamentopara-alanina (Muylaert, I.R. et al. 1997 J Virol 71:291-8), onde pares de aminoacidos carregados sao substituidos com residues de alanina, foi usada para mutagenizar individualmente a sequencia codificante para 80 pares de aminoacidos carre-gados contiguos no gene NS5 de DEN4. Subclones apropriados para mutagenese foram derivados do plasmfdeo DEN4 de inteiro comprimento (p4) atraves de digestao com Xmal/Pstl (pNS5A), Pstl/Sacll (pNS5B) ou Sacll/Mlul (pNS5C) nas posigoes de nucleotideos indicadas nas Figuras 4. Estes fragmentos foram entao subclonados e mutagenese Kunkel foi conduzida como descrito em Exemplos 1 e 3. Para criar cada mutagao, oligonucleotideos foram designados para alteragao de sequencia de pares individuals de codons para GCAGCX (SEQ ID NO: 69), pelo que substituindo os mesmos com dois codons alanina (GCX) e tambem criando um sitio de restrigao Bbvl (GCAGC) (SEQ ID NO: 70). O sitio Bbvl foi adicionado para facilitar selegao de cDNAs e virus recombinantes para a presenga da sequencia mutante. Fragmentos de enzima de restrigao transportando as mutagoes alanina foram clonados de volta no plasmideo p4 de inteiro-comprimento como descrito nos Exemplos 1 e 3.
[00138] Avaliagao inicial do fenotipo dos 32 virus mutantes cargaagrupamento-para-alanina revelou uma faixa em restrigao de replicagao em cerebro de camundongo jovem e camundongos SCID-HuH-7. Para determinar se atenuagao pode ser aperfeigoada atraves de mutagoes combinantes, virus mutantes duplos transportando dois pares de mutagoes carga-agrupamento-para-alanina foram criados por troca de apropriados fragmentos carreando um par de mutagoes em um cDNA de p4 previamente mutagenizado carreando um segundo par de mutagoes em um diferente fragmento usando tecnicas conven-cionais de clonagem.
[00139] Transcricao e Transfeccao. Transcritos capeados-5’ foram sintetizados in vitro a partir de moldes de CDNA mutagenizado usando AmpliCap SP6 RNA polymerase (Epicentre, Madison, Wl). Misturas de transfecgao, consistindo em 1 pg de transcrito em 60 pl de HEPES/salina plus 12 pl de dioleoil trimetil amonio propano (DOTAP)(Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN), foram adicionados junto com 1ml de meio isento de soro de produgao de Virus (VP-SFM) para monocamadas subconfluentes de celulas Vero em placas de 6 cavidades. Monocamadas transfectadas foram incubadas a 35°C por aproximadamente 18 horas, meio de cultura de celulas foi removido e substituido com 2ml de VP-SFM, e monocamadas de celulas foram incubadas a 35°C. Apos 5 a 6 dias, meio de cultura de celulas foi coletado, e a presenga de virus foi determinada por titulagao em celulas Vero seguida por formagao de mancha com imuno peroxidase como descrito anteriormente. Virus recuperados foram amplificados por uma adicional passagem em celulas Vero, e suspensoes de virus foram combinadas com estabilizador SPG (sucrose-fosfato-glutamato) (concentragao final: 218 mM sucrose, 6 mM acido Lglutamico, 3,8 mM fosfato de potassio, monobasico, e 7,2mM fosfato de potassio, dibasico, pH 7,2), feitas aliquotas, congeladas sobre gelo seco, e estocadas a 70°C.
[00140] Construgoes de cDNA nao rendendo virus apos transfecgao de celulas Vero foram usadas para transfectar celulas C6/36 como se segue. Misturas de transfecgao, como descritas acima, foram adicionadas, junto com 1ml de MEM contendo soro fetal bovino 10% (FBS), L-glutamina 2mM, aminoacidos naoessenciais 2mM, e gentamicina 0,05 mg/ml, a monocamadas de celulas C6/36. Monocamadas de celulas transfectadas foram incubadas a 32°C por 18 horas, meio de cultura de celulas foi removido e substituido com 2ml de meio novo, e monocamadas de celulas foram incubadas a 32°C. Apos 5 a 6 dias, meios de cultura de celulas foram entao usados para infetar celulas Vero e incubados por 5-6 dias, em cujo tempo meios de cultura de celulas foram coletados, congelados e titulados como descrito acima.
[00141] Virus recuperados foram clonados biologicamente atraves de dois rounds de diluigao terminal em celulas Vero seguidos por uma adicional amplificagao em celulas Vero. Em resumo, virus foi inicialmente diluido para uma concentragao de aproximadamente 20 PFU/ml em VP-SFM e entao submetidos a uma serie de diluigoes duas vezes atraves de uma placa de 96 cavidades. Diluigoes de virus foram usadas para infectar monocamadas de celulas Vero em uma placa de 96 cavidades e incubadas por 5 a 6 dias a 35°C. Seguindo incubagao, meios de cultura foram removidos e temporariamente estocados a 4°C, e as monocamadas de celulas positivas-vfrus foram identificadas atraves de formagao de mancha de imuno peroxidase. Diluigao terminal foi obtida quando < 25°C de monocamadas de celulas foram positivas para virus. Meio de cultura de celulas a partir de uma monocamada positiva na diluigao terminal foi submetido a um round adicional de diluigao terminal. Seguindo a segunda diluigao terminal, virus foi amplificado em celulas Vero (frasco de 75cm2), coletado e congelado como descrito anteriormente.
[00142] Ensaios para sensitividade a temperatura e atenuacao em camundongo. Ensaio do nivel de sensitividade a temperatura dos virus mutantes carga-cluster-para-alanina em celulas Vero e HuH-7 e seu nivel de replicagao no cerebro de camundongos jovens foram conduzidos como descrito no Exemplo 1 e ensaio do nivel de replicagao em camundongos SCID-HuH-7 foi conduzido como descrito no Exemplo 3.
[00143] Virus mutantes carga-agrupamento-para-alanina sao viaveis e mostram fenotipos de atenuacao em camundongo e sensitividade a temperature. De 80 construgoes de cDNA de DEN4 de inteiro comprimento contendo um par simples de mutagoes carga-para-alanina, virus foram recuperados de 32 em celulas Vero ou C6/36 (Figura 5). O nivel de sensitividade a temperatura de wt rDEN4, rDEN4A30, e os 32 virus mutantes e resumido na Tabela 20. Um virus mutante (645-646) foi ts em celulas Vero mas nao em celulas HuH-7 e 7 virus mutantes foram ts em celulas HuH-7 mas nao em celulas Vero. Tais mutantes cuja sensitividade a temperatura e dependente de hospedeiro-celula sao referidos como mutantes hospedeiro-faixa, sensiveis a temperatura (tshr). Treze virus mutantes foram ts em ambos tipos de celulas, e 11 virus mutantes nao foram ts em qualquer tipo de celula. Assim um total de 21 virus mutantes foram ts com 8 virus mutantes exibindo uma especificidade tshr. Nenhum dos virus mutantes mostrou um fenotipo de placa pequena em temperatura permissivel. Virus mutantes mostraram uma ampla faixa (0 a 10.000 vezes) de replicagao restrita em cerebro de camundongo jovem (Tabela 20). Quatorze virus mutantes foram atenuados em cerebro de camundongo jovem, arbitrariamente definido como uma redugao de > 1,5 logw-unidades em titulo de virus. Nao houve correlagao entre atenuagao em cerebro de camundongo e sensitividade de temperatura em celulas Vero (correlagao Kendall Rank: P=0,77) ou celulas HuH-7(correlagao Kendall Rank: P=0,06).
[00144] Treze virus mutantes que tanto mostraram um fenotipo att em cerebro de camundongo jovem ou cujo par de aminoacidos carregado nao-mutado foi altamente conservado entre os quatro sorotipos de DEN (ver Exemplo 7) foram ensaiados para att em camundongos SCID-HuH-7 (Tabela 21). Tres destes virus mutantes mostraram diminuigao >100 vezes em replicagao em relagao a DEN4 tipo selvagem. No total, redugao log media a partir de tipo selvagem em camundongos jovens nao mostra significante correlagao com redugao log media em camundongos SCID-HuH-7 (correlagao de classificagao Spearman, N=13, P=0,06). Entretanto, virus mutantes 200-201 foram incomuns em que mostraram um alto nivel de restrigao em camundongos SCID-HuH-7 mas pequena restrigao em cerebro de camundongo jovem. Quando virus 200-201 foi removido da analise, restrigao de replicagao em camundongos jovens e SCID-HuH-7 mostrou uma significante correlagao (correlagao de classificagao Spearman, N=12, P=0,02).
[00145] Combinacao de mutacoes carqa-aqrupamento-para-alanina presentes em dois virus em um virus pode aoerfeicoar seus fenotipos ts e att. Seis mutagoes emparelhadas foram combi-nadas em quatorze virus mutantes par-duplo, dos quais seis podem ser recuperadas em celulas Vero ou C6/36 (Tabela 22). Todas as mutagoes emparelhadas individuais usadas em virus mutantes de par-duplo foram ts sobre celulas HuH-7, nenhuma foi ts em celulas Vero, e para todas as combinagoes pelo menos um par de mutagoes conferiu um fenotipo att em cerebro de camundongo jovem. Avaliagao de quatro do virus mutantes de par-duplo (Tabela 23) revelou que combinagao de pares de mutagao carga-agrupamento-para-alanina resultou na aquisigao de um fenotipo ts em celulas Vero (4 de 4 virus) e frequentemente resultou em uma temperatura de interrupgao diminuida em celulas HuH-7 (3 de 4 virus). Em metade dos virus ensaiados, combinagao de pares de mutagoes carga-agrupamento-para-alanina resultou em aperfeigoada restrigao de replicagao (10 vezes maior que qualquer mutagao componente ) em cerebro de camundongo jovem (Tabela 23) e em camundongos SCID-HuH-7 (Tabela 24).
[00146] Resumo. A maior utilidade de mutagoes carga-agrupamento-paraalanina origina-se de seu desenho: elas sao localizadas na regiao de gene naoestrutural de DEN4 e por isso sao imaginadas como sendo uteis para atenuagao do proprio DEN4 assim como virus quimericos antigenicos possuindo a regiao de gene NS de DEN4. Alem disso, elas sao previstas serem fenotipicamente mais estaveis que os virus mutantes de substituigao de nucleotideo simples tais como os virus mutantes 5-FU. Finalmente, oombinagoes de mutagoes sao imaginadas como sendo criadas de modo a sintonizar fino atenuagao e para ainda estabilizar fenotipos de atenuiagao.
EXEMPLO 5 Identificacao e caracterizacao de virus mutantes DEN4 restritos em replicacao em mosquitos SECAO 1. Identificacao de vfrus mostrando restricao de replicacao em mosquitos
[00147] Em exemplos 1 e 4, vfrus mutantes DEN4 foram gerados atraves de mutagenese com 5-FU e mutagenese de carga-agrupamento-para-alanina, respectivamente, de modo a identi-ficar-se mutagoes que conferem fenotipos ts, sp e att. Um outro fenotipo altamente desejavel de uma vacina de vfrus de dengue e crescimento restrito no mosquito hospedeiro. Um candidate de vacina de vfrus de dengue nao deve ser transmissfvel de humanos para mosquitos de modo a prevenir ambas, a introdugao de um virus de dengue em um ambiente no qual ele correntemente nao e endemico e para prevenir a possivel perda do fenotipo de atenuagao durante prolongada replicagao em um hospedeiro mosquito individual. Perda do fenotipo de atenuagao tambem pode ocorrer seguindo trans-missao sustentada entre humanos e mosquitos. Recentemente, perda de atenuagao de uma vacina de virus de polio atenuado vivo foi vista seguindo transmissao sustentada entre humanos (CDC 2000 MMWR 49:1094).
[00148] No presente exemplo, um painel de 1248 virus mutantes DEN4 gerados atraves de mutagenese com 5-FU e 32 virus mutantes DEN4 gerados atraves de mutagenese de carga-agrupamento-para-alanina foram ensaiados para crescimento restrito em celulas de mosquitos. Este e um ensaio preliminar util para restrigao in vivo, uma vez que restrigao em celulas de mosquito cultivadas e frequentemente, embora nem sempre, associada com pobre infectividade para mosquitos (Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). Virus mutantes que mostraram restrigao em celulas de mosquitos e crescimento robusto em celulas Vero (o substrato para desenvolvimento de vacina, como discutido no Exemplo 6) foram alvejados para ainda caracterizagao.
[00149] Geracao e caracterizacao do mutante 5-1A1. A geragao e isolamento do painel de 1248 virus mutantes 5-FU e o painel de 32 virus mutantes carga-agrupamento-para-alanina foram descritas nos Exemplos 1, 2, e 4. Celulas Vero e C6/36 foram mantidas como descrito no Exemplo 1.
[00150] Cada um dos 1248 virus mutantes 5-FU e 32 virus mutantes carga-agrupamento-para-alanina foi titulado em monoca-madas de celulas C6/36 em placas de 24 cavidades a 32°C e CO2 5%. Apos 5 dias, placas foram imunocoloridas com anticorpo policlonal coelho anti-DEN4 e contados como descrito nos Exemplos anteriores. Virus mutantes foram ensaiados para um de dois fenotipos indicando crescimento restrito em celulas de mosquitos: tanto sp em celulas C6/36 em relagao a celulas Vero como uma diminuigao de >3,5 log-io PFU/ml em tftulo entre celulas Vero e C6/36 na temperatura permissivel para cada tipo de celula. Dois virus mutantes, um gerado por mutagenese com 5-FU (#5) e um gerado por mutagenese de carga-agrupamento-para-alanina (rDEN4-356,357), mostraram reduzido tamanho de placa em celulas 06/36. Apos tres diluigoes terminals, o mutante 5-FU #5, designado 5-1A1, manteve o fenotipo de tamanho de placa reduzido. Adicio-nalmente, virus recombinante rDEN4-7546, testado para adapta-gao em celula Vero (discutido em detalhes no Exemplo 6) tam-bem mostrou reduzido tamanho de placa em C6/36 (Figura 10).
[00151] As cineticas de crescimento multiciclos de ambos 5-1A1 e o rDEN4 tipo selvagem recombinante em celulas C6/36 foram determinadas como descrito no Exemplo 1. Resumida-mente, celulas foram infectadas em triplicata em uma multiplicidade de infecgao de 0,01 e amostras foram colhidas em intervalos de 24 horas. Amostras foram congeladas instantaneamente e tituladas em um ensaio simples em monocamadas de celulas Vero.
[00152] Infeccao oral de mosquitos. Aedes aegypti e um dos vetores primaries de virus de dengue (Gubler, D.J. 1998 Clin Microbiol Ver 11:480-96). Esta especie foi criada a 26°C e 80% de umidade relativa (RH) com um ciclo de luz diaria de 16 horas. Adultos foram deixados em acesso continue a uma almofada de algodao encharcada com uma solugao de sucrose 10%. Aedes aegypti femeas de cinco a dez dias que foram privadas de uma fonte de agucar por 48 horas foram alimentadas com uma refeigao de sangue consistindo em volumes iguais de celulas vermelhas de sangue humano lavadas, solugao de sucrose 10%, e suspensao de virus de dengue. A refeigao de sangue infectada foi preparada imediatamente antes de alimentagao e oferecida a mosquitos em um alimentador encamisado com agua coberto em parafilme estirado e pre-aquecido a 38°C (Rutledge, L. C. et al. 1964 Mosquito News 24:407-419). Mosquitos que tomaram uma refeigao de sangue completa dentro de 45 minutos foram transferidos para um novo recipiente por aspirador e mantidos como descrito acima. Apos 21 dias, mosquitos foram estocados a 20°C ate dissecagao.
[00153] Inoculacao intra-toraxica de mosquitos. O mosquito Toxorhynchites splendens grande, nao-hematofago, e um hospedeiro sensivel para determinagao de infectividade de virus de dengue. Esta especie foi criada a 24°C e 75% de RH com um ciclo de luz do dia de 12 horas. Larvas e pupas foram alimentadas sobre larvas de Aedes de tamanho apropriado; adultos foram deixados ter acesso continue a uma almofada de algodao encharcada em uma solugao de sucrose 10%. Grupos de T. splendens adultos de um a dez dias foram imobilizados por imersao de seus recipientes em um banho de agua gelada e inoculados intratoraxicamente com virus nao-diluido e diluigoes seriais de dez vezes de virus em 1X PBS. Virus foi inoculado em uma dose de 0,22pl usando um microinjetor de Harvard Appasratus (Medical Systems Corp, Greenvale NY) e uma agulha de vidro calibrada (esta tecnica e uma modificagao do processo descrito em Rosen and Gubler, 1974).
[00154] Detecao de antiqeno viral em corpo e tecidos de cabeca atraves de ensaio de imunofluorescencia (IFA). Preparagoes de intestino medio e cabega de Aedes aegypti e preparagoes de cabega de Toxorrhynchites splendens foram feitas sobre laminas de vidro como descrito em Sumanochitraon et al. (Sumanochitrapon, W. et al. 1998 Am J Trop Med Hyg 58:283-6). Laminas foram fixadas em acetona por 20 minutos, e colocadas a 4°C ate processadas por I FA. O anticorpo primario, fluido de ascites de camundongo hiper-imune especifico para DEN4 (HMAF), foi diluido 1/100 em PBS-Tween 20 (0,05%). Laminas foram incubadas a 37°C em uma camara umida por 30 minutos, e subsequentemente rinsadas em PBS-Tween 20. O anticorpo secundario, IgG anti-camundongo cabra conjugada FITC (KPL, Gaithersburg, MD), foi diluido 1/200 em PBS-Teen 20 com azul de Evan 0,002%. Laminas foram vistas sobre um microscopic Olympus BX60. A dose infecciosa requerida para infectar 50% dos mosquitos (ID50) foi determinada pelo processo de Reed and Muench (Reed, L.J. & Muench, H. 1938 Am J Hyg 27:493-497). Para infecgoes de Aedes aegypti, dois valores de OID50 dose infecciosa oral 50) foram calculados para cada virus: a OID50 requerida para produzir uma infecgao no intestino medio, com ou sem disseminagao para a cabega, e a OID50 requerida para produgao de infecgao disseminada. Para Tx. Splendens um valor MID50 (dose infecciosa de mosquito 50) foi calculado.
[00155] Analise estatistica. A porcentagem de mosquitos infectados por diferentes virus foi comparada usando-se analise de regressao logistica (Statview, Abacus Inc.).
[00156] Mutacoes restrinqindo crescimento de DEN4 em celulas de mosquitos mas nao celulas Vero sao raras. De 1280 virus mutantes ensaiados inicialmente, somente dois, #5 e rDEN4-356,357, mostraram tamanho de placa reduzido em celulas C6/36 e tamanho de placa normal em celulas Vero. Um virus adicional, rDEN4-7546 (descrito no Exemplo 6), com reduzido tamanho de placa em C6/36 foi detectado em ensaios subseqiientes. Virus mutantes #5 foram clonados atraves de tres diluigoes terminals sucessivas e designados 5-1A1; rDEN4-7546 e rDEN4-356,357 ja foram diluidos terminalmente duas vezes quando foram testados em celulas C6/36. Virus 5-1A1 foram extensivamente caracterizados e seus fenotipos sao descritos em detalhes na segao seguinte. RDEN4-356.357 e rDEN47546 sao imaginados como sendo caracterizados em uma maneira similar.
[00157] Tamanho de placa e cineticas de crescimento de 5-1A1. 5-1A1 replicou para 6,7logioPFU/ml em celulas Vero com tamanho de placa normal e replicou para 7,6logioPFU/ml em celulas C6/36 com tamanho de placa pequeno (Figura 6, Tabela 25). Em comparagao, DEN tipo selvagem usado como um controle simultaneo replicou para 7,3logio PFU/ml em celulas Vero, 8,3logioPFU/ml em celulas C6/36, e mostrou tamanho de placa normal em ambos tipos de celulas (Figura 6, Tabela 25). As cineticas de crescimento de 5-1A1 foram comparadas aquelas de DEN4 tipo selvagem atraves de infecgao de celulas C6/36 em uma MOI de 0,01 e monitorando a produgao de virus infeccioso. As cineticas e magnitude de replicagao de 5-1A1 em celulas C6/36 foram comparaveis aquelas de DEN4 tipo selvagem (Figura 7).
[00158] 5-1A1 e restrito em sua habilidade de infectar mosquitos. 5-1A1 foi avaliado para sua habilidade de infectar mosquitos Aedes aegypti atraves de uma refeigao de sangue artificial (Tabela 26). Neste ensaio a habilidade de infectar o intestino medio do mosquito e a habilidade para uma infecgao de intestino medio disseminar para a cabega sao medidas separadamente. A dose infecciosa oral 50 (OIDso) de DEN4 tipo selvagem para o intestino medio foi 3,3logioPFU; a OID50 de DEN4 tipo selvagem para uma infecgao disseminada foi 3,9logioPFU. Em contraste, 5-1A1 nunca infectou 50% de mosquitos nas doses usadas. De modo a calcular-se a OID50 para infecgoes de intestino medio por 5-1A1, foi assumido que em uma dose 10 vezes maior, 100% de 25 mosquitos tornaram-se infectados. Usando esta assungao, a estimativa conservadora da OID50 para infecgoes de intestino medio por 5-1A1 foi > 3,9 log-io PFU. Devido 5-1A1 produzir somente 3 infecgoes disseminadas, nos nao tentamos calcular uma OID50 para esta categoria. 5-1A1 foi significantemente restrito em sua habilidade de infectar o intestino medio em relagao a DEN4 tipo selvagem (regressao logistica, N=150, P<0,001). Adicionalmente, 5-1A1 produziu muito poucas infecgoes disseminadas, mas devido a baixos numeros este resultado nao foi suscetivel a analise estatistica.
[00159] 5-1A1 tambem foi significantemente restrito em sua habilidade de infectar Tx. Splendens seguindo inoculagao intra-toraxica (Tabela 27). A MID50 de DEN4 tipo selvagem foi 2,3 log-10 PFU enquanto a MID50 de 5-1A1 foi estimada ser > 3,0 logio PFU (regressao logistica, N=36, P<0,01).
[00160] 5-1A1 nao mostra um fenotipo ts ou att. 5-1A1 foi testado para sensitividade a temperatura em celulas Vero e HuH-7 para a atenuagao em cerebros de camundongo jovem como descrito no Exemplo 1. O virus mutante nao foi sensivel a temperatura, como definido no Exemplo 1, e nao foi atenuado em cerebro de camundongo jovem (Tabela 25).
[00161] Identificacao e confirmacao da mutacao responsavel pelo fenotipo de 5-1A1. A sequencia de nucleotfdeos do inteiro genoma de 5-1A1 foi determinada como descrito no Exemplo 1. Sequenciamento de 5-1A1 revelou tres mudangas a partir da sequencia tipo selvagem:duas mutagoes de ponto translacionalmente silenciosas nas posigoes 7359 e 9047, e uma mutagao de ponto codificante (C para U) na posigao 7129 no gene NS4B que resultou em uma substituigao de prolina para leucina.
[00162] Para confirmar formalmente o efeito da mutagao C7129U, a mutagao foi inserida no cDNA p4, que foi descrito nos Exemplos 1,2, e 3 e na Figura 4, usando mutagenese Kunkel como descrito nos Exemplos 1 e 3. O cDNA mutagenizado foi transcrito e transfectado como descrito no Exemplo 3, e o vfrus resultante, apos duas diluigoes terminals, foi designado rDEN4-7129-1A. Como 51A1, rDEN4-7129-1A mostrou tamanho de placa normal e titulo em celulas Vero e reduzido tamanho de placa e titulo normal em celulas C6/36 (Tabela 25). rDEN47129-1A nao foi ts sobre celulas Vero ou HuH-7 e nao foi att em cerebro de camundongo jovem. Adicionalmente, rDEN4-7129-1A nao mostra o fenotipo att SCID-HuH-7 descrito no Exemplo 3 (Tabela 25). A habilidade de rDEN4-7129-1A infectar mosquitos e imaginada como sendo testada em ambos Ae.Aegypti e Tx.Splendens.
[00163] Para testar a compatibilidade da mutagao C7129U e a supressao A30, a mutagao C7129U foi inserida em rDEN4A30 usando tecnicas descritas anteriormente. O virus resultante, designado rDEN4A30-7129, e imaginado como sendo testado para os fenotipos listados na Tabela 25.
[00164] Em resumo, tres virus mutantes, 5-1A1, rDEN4-356,357 e rDEN47546, mostraram uma particular combinagao de fenotipos caracterizados por tamanho de placa normal e replicagao para altos titulos em celulas Vero e tamanho de placa pequeno mas crescimento irrestrito em celulas de mosquitos. 5-1A1 foi ainda caracterizado e careceu de sensitividade a temperatura em celulas Vero ou HuH-7 e mostrou niveis normals de replicagao em cerebro de camundongo e em camundongo SCID-HuH-7 e restrita infecti-vidade para ambos mosquitos Ae.Aegypti e Tx.Splendens. Em comparagao a rDEN4 tipo selvagem, o mutante 5-1A1 teve uma mutagao codificante: uma mutagao de ponto (C para U) em nucleotideo 7129 em NS4B resultando em uma substituigao de pro com Leu. Porque 5-1A1 contem somente uma mutagao sentido trocado simples, o fenotipo deste virus mutante pode ser atribuido ao efeito da mutagao na posigao 7129. Estes resultados indicam que a mutagao 7129 e responsavel pelo fenotipo de diminuida infectividade para mosquitos e e prevista ser util para restringir replicagao de candidates a vacina em mosquitos. Para confirmar isto formalmente, nos inserimos a mutagao 7129 em um virus DEN4 recombinante. O virus resultante, designado rDEN4-7129-1A, uma ausencia de fenotipos ts e att similar a 5-1A1. Ele e imaginado como sendo testado para infectividade de mosquito.
[00165] A mutagao 7129 e uma mutagao de ponto valiosa para incluir em um candidato a vacina de DEN4 e em cada um dos candidates a vacina quimerica antigenica de virus de dengue uma vez que sua atividade biologica e especifica de hospedeiro, isto e, ela e restrita em replicagao em mosquitos mas nao em mamiferos. Alem disso, como discutido no Exemplo 3, a mutagao 7129 tambem foi mostrada aperfeigoar replicagao em celulas Vero. Assim, sua insergao em um candidato a vacina e imaginada co mo aperfeigoando produgao de vacina em cultura de tecido sem afetar as propriedades biologicas especificadas por outras mutagoes atenuantes. E tambem imaginada como provendo uma salva-guarda util contra transmissao a mosquito de uma vacina de virus de dengue.
SECAQ II. Desenho de mutacoes para restricao de replicacao em mosquitos
[00166] Na Segao 1 de exemplo 5, nos selecionamos um grande painel de virus mutantes carreando mutagoes rando-micas (geradas com 5-fluor uracila) e mutagoes especificas (geradas atraves de mutagenese de carga-agrupamento-paraalanina) para crescimento restrito em celulas C6/36, uma medida substituta para restrigao em mosquitos. Entretanto, em nenhum caso mutagoes foram projetadas para o especifico proposito de restringir replicagao em mosquitos. Nesta segao, nos identificamos sequencias de nucleotideos na UTR 3’ que mostram diferengas conservadas entre os flavivirus transmitidos por carrapatos e transmitidos por mosquitos. Nos entao alteramos aquelas sequencias no p4 CDNA DEN4 atraves de supressao deles ou trocando-os com a sequencia homologa do virus Langat transmitido por carrapato. Os virus resultantes foram ensaiados para tamanho de placa reduzido e tftulo em celulas Vero e C6/36 e para infectividade para Ae. Aegypti e Tx. Splendens.
[00167] Identificacao e modificacao de sequencias de UTR 3’ particulares mostrando diferencas conservadas entre vetores. Varies estudos (Olsthoorn, R.C. & Bol, J.F. 2001 RNA 7:1370-7; Protski, V. etal. 1997 Nucleic Acids Res 25: 1194-202) identificaram diferengas conservadas nas sequencias de acidos nucleicos da UTR 3’ de flavivirus transmitidos por carrapatos e transmitidos por mosquitos. Tais diferengas sao concentradas na regiao de centra terminal 3’, os aproxima-damente 400 nucleotideos terminal 3’. Foi sugerido que estas sequencias podem ter uma fungao especifica de vetor (Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-202). Embora uma tai fungao nao tenha sido identificada, nao obstante pode ser possivel interromper infectividade de vetor atraves de supressao ou de outro modo alterando estes nucleotfdeos.
[00168] Para identificar sequencias alvos para este tipo de alteragao, nos construimos um alinhamento das sequencias de nucleotfdeos de UTR 3’ de sete flavivirus transmitidos por mosquito e quatro flavivirus transmitidos por carrapatos (Figura 8). A partir deste alinhamento, nos identificamos varias sequencias que mostraram diferengas conservadas entre flavivirus transmitidos por mosquitos e flavivirus trans-mitidos por carrapatos. Nos entao projetamos primers para alteragao destas sequencias em wt DEN4 CDNA p4 (Figura 4) em uma de duas maneiras: 1) supressao dos nucleotfdeos (A) ou 2) substituigao dos nucleotfdeos com a sequencia homologa de Langat flavivirus transmitido por carrapato (swap). Langat foi escolhido como o molde para nucleotfdeos trocados porque ele e naturalmente atenuado (Pletnev, A.G. 2001 Virology 282:288-300), e por isso improvavel de aperfeigoar a virulencia de vfrus rDEN4 derivados do cDNA modificado. As sequencias de DEN4 alteradas e os primers de mutagenese usados para assim fazer sao listadas na Tabela 28. Nucleotfdeos 10508-10530 correspondem a regiao CS2 identificada em estudos previos (Protski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-202).
[00169] Mutagenese de p4, transcrigao e transfecgao sao conduzidas como descrito anteriormente na Segao I deste exemplo. Todos os cinco vfrus engenheirados foram recupe-rados, e todos foram submetidos a dois rounds de diluigao terminal como descrito anteriormente.
[00170] Avaliacao de fenotipos: cultura de celulas. Vfrus foram titulados em celulas Vero e C6/36 como descrito anteriormente, e os resultados sao listados na Tabela 29. Todos os vfrus replicaram para >5,0 logio PFU/ml; um deles (rDEN4A10508-10530) replicou para > 8,0 logw PFU/ml. Somente um dos vfrus (rDEN4A10535-10544) foi placa pequena em celulas C6/36; este vfrus mostrou tamanho de placa tipo selvagem em celulas Vero. Interessantemente, um outro virus (rDEN4swap10508-10539) mostrou tamanho de placa tipo selvagem em celulas C6/36 mas foi sp em celulas Vero.
[00171] Avaliacao de fenotipos: infectividade de mosquitos. Atualmente um dos cinco virus foi testado para infectividade via inoculagao intra-toraxica em Tx. Splendens, usando processos descritos anteriormente. Virus rDEN4A10508-10530 foi dramaticamente restrito em infectividade em relagao ao tipo selvagem (Tabela 30). Poucos mosquitos foram infectados de modo que nao foi possivel calcular-se uma MID50 para este virus.
[00172] Um dos cinco virus foi testado para infectividade de Ae.Aegyptis alimentado sobre uma refeigao de sangue infecciosa usando processos descritos anteriormente. rDEN4swap10535-10544 (Tabela 31) causou significantemente menos infecgoes no intestino que rDEN4 tipo selvagem, mas a porcentagem de infecgoes disseminadas nao difere entre rDEN4swap10535-10544 e rDEN4 tipo selvagem. Todos os virus sao imaginados co mo sendo testados para infectividade de mosquitos usando ambos processos.
[00173] Resumo. Neste exemplo nos esbogamos duas estra-tegias diferentes para prevengao de transmissao para mosquito de uma vacina de dengue. Primeiro, varias pequenas mutagoes de substituigao, incluindo duas mutagoes de ponto e uma substituigao de carga-para-alanina emparelhada, foram mostradas restringirem a replicagao de DEN4 em celulas C6/36 de mosquito em cultura de celulas, e uma destas mutagoes (C7129U) foi mostrada restringir a habilidade de virus DEN4 infectar mosquitos. Segundo, nos criamos uma variedade de mutagoes de supressao e substituigao em regioes da UTR 3’ de DEN4 que mostram conservadas diferengas entre flavivirus transmitidos por mosquito e transmitidos por carrapato. Um destes virus e sp em celulas C6/36 e pelo menos dois destes virus mostram algum grau de restrigao de infectividade de mosquito. Por desenho, as sequencias de nucleotideos nas quais estas mutagoes foram feitas sao altamente conservadas entre os quatro sorotipos de dengue e entre flavivirus transmitidos por mosquitos em geral, indicando que elas sao portadoras para outros candidatos a vacina para flavivirus transportados por mosquitos. Todas as mutagoes discutidas neste exemplo estao fora de genes estruturais e sao imaginadas como sendo uteis em construgao de candidatos a vacina quimerica-antigenica.
EXEMPLO 6 Mutacoes de adaptacao que aperfeicoam a replicacao de DEN4 e virus quimericos DEN4 em celulas Vero
[00174] Celulas Vero sao um substrata altamente carac-terizado que pode ser apropriado para a fabricagao de vacinas de flavivirus atenuados vivos, tais como virus de dengue e virus de encefalite transportados por carrapatos. Em adigao, celulas Vero tambem podem ser usadas para crescimento de flavivirus para alto tftulo para a preparagao de uma vacina de virus inativado. Sequencias otimas para o eficiente crescimento de virus de dengue em celulas Vero ainda nao foram identificadas, mas e bem conhecido que flavivirus acumulam mutagoes durante passagem em varias culturas de celulas (Dunster, L.M. et al. 1999 Virology 261:30918; Theiler, M. & Smith, H.H. 1937 J Exp Med 65:787-800). Inclusao de sequencias especificas em virus atenuados vivos que aperfeigoam sua replicagao em celulas Vero e aumentam o numero de doses de vacina produzida por substrata unitario pode facilitar grandemente sua fabricagao. Simi-larmente, inclusao de sequencias promovendo cresci mento de celula Vero em virus tipo selvagem usados para a preparagao de uma vacina de virus inativado pode tambem facilitar grandemente a fabricagao da vacina. O presente exemplo identifica mutagoes que ocorrem seguindo passagem de virus DEN4 e virus quimericos DEN2/4 em celulas Vero. Dados derivados de cinco fontes proveram informagao para esta analise tornando possivel gerar-se uma lista de sequencias promovendo crescimento de celulas Vero.
[00175] Presenca de mutacoes identicas em multiplos virus mutantes 5FU. Primeiro, como descrito nos Exemplos 1 e 2, os genomas de 42 clones de virus de dengue isolados de um estoque de virus mutagenizados com 5-FU foram completamente sequenciados. Se mutagoes que aperfeigoam replicagao ocorreram durante a passagem destes 42 virus mutantes em celulas Vero, entao tais mutagoes devem se revelar atraves de representagao em mais de um clone. Analises das 42 sequencias revelaram a ocorrencia de mutagoes de sentido trocado especlficas em regioes codificantes ou substituigoes de nucleotldeos em UTRs em multiplos clones que nao estao presentes no genoma de virus parente 2A (Tabelas 11 e 32). Estas mutagoes, muitas das quais ocorrem dentro de uma segao de 400 nucleotldeos da regiao codificante de NS4B, representam mutagoes de adaptagao-celula Vero. Uma mutagao, tai como a mutagao 4995, presente em oito virus foi verificada especificar ambos fenotipos ts e att (Exemplos 1 e 3). Em contraste, a mutagao 7163, presente em seis virus, nao especifica um fenotipo ts ou att (Tabela 13) e assim e um exemplo de uma mutagao promovendo crescimento de celula Vero especifica.
[00176] Presenca de mutacoes de adaptacao de celula Vero em outros virus DEN4 e virus quimericos antigenicos DEN2/4. Segundo, o virus de dengue 2A13 que foi usado como um controle tipo selvagem passado em paralelo durante os experimentos 5-FU descritos no Exemplo 1 foram crescidos e clonados em celulas Vero na ausencia de 5-FU em uma maneira identica aquela dos virus tratados com 5-FU. Analises de sequencias destes virus nao-tratados com 5-FU, designados 2A13-1A1, revelaram que o genoma de virus conteve uma mutagao em nucleotideo 7163 (Exemplo 1 e Tabela 32), identica a mutagao de sentido trocado previamente identifi-cada em 6 dos virus mutantes 5-FU (Tabelas 11 e 32). Isto indica que crescimento e passagem de virus DEN4 em celulas Vero e suficiente para adquirir esta especifica mutagao, isto e, mutagenese com 5-FU nao e requerida. Assim, informagao a partir de duas fontes separadas indica que a mutagao 7163 apareceu em virus passados em celula Vero separados, pelo que reforgando a interpretagao de que esta mutagao esta promovendo crescimento.
[00177] Terceiro, seguindo passagem do 2AA30 e rDEN4A30 em celulas Vero, analises de sequencias revelaram a presenga de uma mutagao em nucleotideos 7153 e 7163, respectivamente. Estas duas mutagoes tambem foram previamente identificadas entre os virus tratados com 5-FU (Tabela 32). Novamente, mutagoes identicas apareceram seguindo independente passagem de virus em celulas Vero, corroborando a hipotese de que estas mutagbes conferem uma vantagem de crescimento em celulas Vero.
[00178] Quarto, um candidato a vacina de virus de dengue quimerico antigenico foi gerado que expressou as proteinas estruturais C, prM, e E a partir de DEN2 sobre um fundo genetico tipo selvagem de DEN4 ou um fundo genetico A30 atenuado. Para construir este virus, a regiao C, prM e E de cDNA tipo selvagem de plasmideo p4 foi substituida com uma regiao similar de virus DE2 linhagem NGC (Figura 10). Especificamente, nucleotideos entre sitios de restrigao Bglll (nt 88) e Xhol (nt 2345) de p4 foram substituidos com aqueles derivados de virus tipo 2 de dengue. Transcritos RNA sintetizados do resultante plasmideo p4-D2 foram transfectados em celulas Vero e virus rDEN2/4 foi recuperado. Ainda uma versao atenuada deste virus quimerico contendo a mutagao A30, rDEN2/4A30, foi recuperada em celulas C6/36 de mosquito seguindo transfecgao de celulas com transcritos de RNA derivados de p4A30-D2. Entretanto, rDEN2/4A30 nao pode ser recuperado diretamente em celulas Vero. O virus mutante rDEN2/4A30 recuperado em celulas C6/36 replicou para niveis muito baixos em celulas Vero (<1,0 logio PFU/ml) mas cresceu para alto titulo em celulas C6/36 (>6,0 logio PFU/ml). Sequencia genbmica do virus derivado de C6/36 ajustou-se a sequencia de cDNA prevista e e mostrada em Apendice 3. Nao obstante, quando rDEN2/4A30 derivado de C6/36 foi passado serialmente 3 a 4 vezes em celulas Vero, uma populagao de virus adaptada para crescimento em celulas Vero emergiu. Virus desta preparagao adaptada a celulas Vero foram clonados e amplificados em celulas Vero para um tftulo de >6,0 logio PFU/ml. A sequencia genomica foi determinada para 2 clones de vfrus independentes e comparada a sequencia de CDNA prevista (Tabela 33 e 34). Cada vfrus clonado contem uma mutagao em um gene nao-estrutural que coincide de perto em local izagao ou sequencia com uma mutagao previamente identificada entre o painel de vfrus mutagenizados com 5-FU. As outras mutagoes nestes dois clones tambem podem conferir uma vantagem de crescimento em celulas Vero. Importantemente, as mutagoes identificadas nas Tabelas 33 e 34 sao absolutamente requeridas para replicagao em celulas Vero, e pode nao ser possivel produzir-se o candidate a vacina rDEN2/4A30 em celulas Vero sem as mutagoes promotoras de crescimento identificadas nas Tabelas 33 e 34.
[00179] Quinto, analises de sequencias dos vfrus tipo selvagem de dengue 4 linhagem 814669 (no. de acesso GenBank AF326573) seguindo passagem em celulas Vero identificaram uma mutagao na regiao NS5 em nucleotideo 7630 que foi previamente identificada entre o painel de vfrus mutagenizados com 5-FU (Tabela 32). Esta mutagao em nucleotideo 7630 foi introduzida em vfrus rDEN4 recombinante por mutagenese de sitio direcionado como descrito na Tabela 16. O vfrus resultante, rDEN4-7630, nao foi sensfvel a temperatura quando testado a 39°C, indicando que mutagao 7630 nao contribui para sensitividade a temperatura.
[00180] Caracterizagao de vfrus quimericos rDEN2/4A30 contendo mutagoes de adaptagao a celula Vero simples e multiplas. A geragao de vfrus quimerico rDEN2/4A30 proporcionou uma oportunidade unica para avaliagao de capa-cidade de mutagoes individuals para promogao de aumentado crescimento em celulas Vero. Porque rDEN2/4A30 replica para tftulo muito baixo em celulas Vero, ainda pode ser eficientemente gerado em celulas C6/36 de mosquito, vfrus recombinante transportando mutacoes adaptando celula Vero putativas foram primeiro geradas em celulas C6/36 e entao tftulos de virus foram determinados em ambas celulas C6/36 e Vero. Como mostrado na Tabela 35, adigao de uma mutagao simples a rDEN2/4A30 resultou em um aumento maior que 1000 vezes em titulo em celulas Vero, confirmando o fenotipo de adaptagao a celulas Vero conferido por estas mutagoes. Entretanto, a combinagao de duas mutagoes separadas em um unico virus nao aumenta o titulo em celulas Vero alem do nivel observado para virus transportando uma mutagao de adaptagao simples. Inclusao de mutagao 7182 ou 7630 no CDNA de rDEN2/4A30 permitiu que o virus seja recuperado diretamente em celulas Vero, evitando a necessidade de recuperar o virus em celulas C6/36.
[00181] Caracterizacao das propriedades de crescimento de virus rDEN4 contendo mutacoes de adaptacao a celula Vero definidas simples e multiplas. Para confirmar a habilidade de mutagoes de adaptagao a celulas Vero para aperfeigoamento de crescimento de virus DEN4, mutagenese direcionada a sftio foi usada para gerar virus rDEN4 codificando mutagoes individuais selecionadas como descrito nos Exemplos 1 e 3. Cinco mutagoes em NS4B (7153, 7162, 7163, 7182, e 7546) a partir da lista de mutagoes repetidas nos virus mutante 5-FU (Tabela 32) foram introduzidas simplesmente no clone de CDNA de p4. Em adigao, o virus rDEN4-7129 restrito em mosquito foi avaliado para crescimento aperfeigoado em celulas Vero uma vez que a localizagao desta mutagao esta na mesma regiao de NS4B. cada virus, incluindo rDEN4 tipo selvagem, foi recuperado, terminalmente diluido, e propagado em celulas C6/36 para prevenir introdugao de adicionais mutagoes de adaptagao a celula Vero, entretanto, devido seu restrito crescimento em celulas C6/36, rDEN4-7129 foi propagado somente em celulas Vero.
[00182] Tamanho de placa foi avaliado para cada virus rDEN4 mutante em celulas Vero e celulas C6/36 e comparado a rDEN4 tipo selvagem. Placas de seis pogos de cada celula foram inoculadas com diluigoes de virus e placas foram visualizadas cinco dias depois. Placas representativas sao ilustradas na Figura 10 e demonstram que a presenga de uma mutagao de adaptagao a celulas Vero realmente confere aumentado espalhamento de virus de celula para celula e crescimento especificamente em celulas Vero. Em celulas C6/36, tamanho de placa medio foi aproximadamente 0,50 mm para rDEN4 tipo selvagem e cada virus mutante (exceto para rDEN4-7546 e rDEN4-7129 que foram menores que o tipo selvagem; ver Exemplo 5). Entretanto, virus rDEN4 expres-sando mutagao 7162, 7163, 7182, e 7129 tiveram um aumento maior que duas vezes em tamanho de placa em celulas Vero comparados a virus rDEN4 tipo selvagem. Um menor porem consistente aumento em tamanho de placa foi observado para rDEN4-7153 e rDEN4-7546.
[00183] Cineticas de crescimento e rendimento de virus em celulas Vero foram avaliados para o mesmo painel de virus rDEN4. Celulas Vero foram infectadas em uma MOI de 0,01 e amostras foram removidas diariamente por 10 dias, tituladas sobre celulas Vero, e placas foram visualizadas. Os resultados na Figura 11 indicam que a presenga de uma mutagao de adaptagao de celula Vero aumentou as cineticas de crescimento de virus, mas teve somente um efeito marginal sobre o pico de rendimento de virus. No dia quatro pos-infecgao, rDEN4 tipo selvagem cresceu para 5,2 logio PFU/ml enquanto o nivel de replicagao em celulas infectadas com rDEN4-7129 foi 100 vezes maior. O resto dos virus rDEN4 mutantes teve um rendimento aumentado no dia 4 variando de 0,9 (rDEN4-7153) a 1,6 (rDEN4-7162 e 7163) logio PFU/ml. Interessantemente, cineticas aperfeigoadas de crescimento de virus correlacionaram-se com aumentado tamanho de placa em celulas Vero. O pico de rendimento de virus foi atingido pelo dia 6 pos-infecgao para rDEN4-7129, -7162, e -7182 enquanto rDEN4 tipo selvagem nao atinge pico de tftulo ate dia 10. Entretanto, o rendimento de virus de pico foi somente levemente superior em virus rDEN4 expressando mutagoes de adaptagao a celulas Vero.
[00184] Em um esforgo para ainda aperfeigoar replicagao de rDEN4, especialmente o rendimento de virus de pico, combinagoes de selecionada mutagoes de adaptagao a celulas Vero foram introduzidas no fundo de rDEN4. Tres virus com mutagoes duals foram gerados: rDEN4-7153-7163,rDEN4-7153-7182, e rDEN4-7546-7630 e testados em uma infecgao de curso de tempo em celulas Vero como descrito acima junto com rDEN4 e rDEN4-7162 como um controle positive (Figura 12). Os virus expressando mutagoes combinadas cresceram em uma maneira aproximadamente identica a rDEN4-7162 indicando que estas combinagoes selecionadas nao aperfeigoam as cineticas ou pico de rendimento de virus. Combinagoes adicionais destas e outras mutagoes de adaptagao a celulas Vero sao imaginadas como aumentando pico de rendimento de virus.
[00185] Discussao. Algumas das mutagoes promotoras de crescimento listadas na Tabela 32 tambem sao verificadas em regides homoIogas de DEN1, DEN2, e DEN3 e sao imaginadas como servindo para promover a replicagao destes virus em celulas Vero. Especificamente, as mutagoes promotoras de crescimento indicadas na Tabela 32 que estao presentes em um virus DEN4 sao imaginadas como sendo uteis para importagao em regides homoIogas de outros flavivirus, tais co mo DEN1, DEN2 e DEN3. Exemplos de tais regides conservadas sao mostrados em Apendice 4 e sao listadas na Tabela 36. Os nucleotideos para ambas mutagoes 7129 e 7182 sao conservados em todos os quatro sorotipos de virus de dengue. E tambem interessante notar que mutagao 7129 nao somente aumenta crescimento em celulas Vero (Figura 10) mas ele tambem forma placas pequenas em celulas de mosquitos (Figura 6, Tabela 25). Lee et al., previamente passaram virus DEN3 em celulas Vero e realizaram limitada analise de sequencias de somente regides de gene estrutural dos resultantes virus (Lee, E. et al., 1997 Virology 232:281-90). A partir desta analise um menu de mutagoes de adaptagao a celulas Vero foi montado. Embora nenhuma destas mutagoes corresponda as mutagoes de adaptagao a Vero identificadas neste Exemplo, uma mutagao simples em posigao de aminoacido 202 em DEN3 corresponde a mutagao 1542 identificada em virus mutante 5-FU #1012. O Exemplo atual enfatiza a importancia deste tipo de estudo de detemninagao de sequencia do inteiro genoma viral.
[00186] Os virus de crescimento otimizado em celulas Vero sao imaginados como tendo utilidade nas seguintes areas. Primeiro, o rendimento de um virus vacina atenuado vivo em celulas Vero e previsto ser aumentado. O candidato a vacina atenuado vivo e convenientemente um virus DEN4 ou outro virus de dengue ou um virus quimerico antigenico DEN1/4, DEN2/4 ou DEN3/4, ou um virus quimerico de um outro flavivirus sobre o fundo de DEN4. O aumentado rendimento de virus vacina e imaginado como diminuindo o custo de fabricagao de vacina. Segundo, mutagoes de adaptagao de celula Vero que sao mutagoes atenuantes, tai co mo a mutagao 4995, sao imaginadas como sendo estaveis durante a passagem multipla e amplificagao de virus em culturas de celulas Vero que sao requeridas para produgao de um grande numero de doses de vacina. Terceiro, mutagoes de adaptagao a celulas Vero sao realmente requeridas para o crescimento do candidato a vacina rDEN2/4A30 em celulas Vero. Quarto, o aumento em rendimento de um DEN tipo selvagem ou um virus atenuado e imaginado como tornando economicamente exequlvel fabricar-se uma vacina de virus inativado. Quinto, a presenga das mutagoes promotoras de crescimento em celulas Vero no vetor DEN4 dos virus quimericos rDEN1/4, rDEN2/4, e rDEN3/4 ou outros virus quimericos flavivirus baseado em DEN4 e imaginada como permitindo ao virus crescimento para um alto tftulo e pelo que sendo util na fabricagao de uma vacina de virus inativado. Sexto, a insergao de mutagoes promotoras de crescimento em celulas Vero em cDNAs como rDEN2/4A30 e imaginada como permitindo recuperagao de virus diretamente em celulas Vero, para as quais existem qualifi-cados bancos de celulas mestres para fabricagao, antes que em celulas 06/36 para as quais qualificados bancos de celulas nao sao disponiveis. E setimo, insergao das mutacoes 7129 e 7182 em vfrus wt DEN1, DEN2, ou DEN3 e imaginada como aumentando sua habilidade para replicar eficientemente e serem recuperados de CDNA em celulas Vero.
EXEMPLO 7 Montaqem de uma lista de mutacoes atenuantes
[00187] Os dados apresentados nestes exemplos permitem a montagem de uma lista de mutacoes atenuantes que e resumida na Tabela 37. Esta lista contem mutacoes individuais identificadas nas Tabelas 13-16, 20, e 21 que sao conhecidas especificarem independentemente um fenotipo de atenuagao. Mutagao 7129 e tambem incluida uma vez que ela e derivada de virus 5-1A1 mostrado ser atenuado em mosquitos. Nos imaginamos uso de varias combinagoes de mutagoes a partir desta lista para gerar vfrus com conjuntos de desejaveis propriedades tais co mo crescimento restrito no ffgado ou no cerebro como ensinado no exemplo 3 (Tabela 18) e Exemplo 14 (Tabelas 23 e 24). Estas mutagoes tambem sao combinaveis com outras mutagoes atenuantes descritas anteriormente tai co mo a mutagao A30, como ensinado no Exemplo 1 (Tabela 6) e Exemplo 3 (Tabela 19) para produgao de virus recombinantes que sao satisfatoriamente atenuados e imunogenicos. Mutagoes listadas na Tabela 37 tambem sao imaginadas como sendo combinadas com outras mutagoes atenuantes descritas anteriormente tais como outras mutagoes de supressao ou outras mutagoes de ponto (Blok, J. et al. 1992 Virology 187:573-90; Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7; Puri, B. et al. 1997 J Gen Virol 78:2287-91).
[00188] A possibilidade de importagao de uma mutagao atenuante presente em um paramixovirus em uma regiao homologa de um segundo paramixovfrus foi recentemente descrita (Durbin, A.P. et al. 1999 Virology 261:31930; Skiadopoulos, M.H. et al. 1999 Virology 260:125-35). Uma tai importagao confere um fenotipo att ao segundo virus ou, alternativamente, ainda atenua o virus para crescimento in vivo. Similarmente nos imaginamos importagao de uma mutagao atenuante presente em um flavivirus para uma regiao homologa de um segundo flavivirus o que pode conferir um fenotipo att ao segundo flavivirus ou, alternativamente, pode ainda ate-nuar o virus para crescimento in vivo. Especificamente, as mutagoes atenuantes indicadas na Tabela 37 sao imaginadas como sendo uteis para importagao em regioes homoIogas de outros flavivirus. Exemplos de tais regides homdlogas sao indicados no Apendice 4 para as mutagoes listadas na Tabela 37.
EXEMPLO 8 Avaliacao de vacina de virus de dengue em humanos e macacos rhesus
[00189] O presente exemplo avalia a atenuagao para humanos e macacos rhesus (como um modelo animal) de um mutante DEN-4 transportando uma supressao de 30 nucleotideos (A30) que foi introduzida em sua regiao nao-traduzida 3’ atraves de muta-genese de sitio direcionado e que foi verificado previamente ser atenuado para macacos rhesus (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7), como representativa para a avaliagao de qualquer vacina de virus de dengue para atenuagao em humanos e macacos rhesus (como um modelo animal).
[00190] Virus e celulas. O virus wt DEN-4 tipo selvagem linhagem 814669 (Dominica, 1981), originalmente isolado em celulas de Aedes pseudoscutellaris (AP61), foi previamente purificado em placa em celulas LLC-MK2 e amplificado em celulas C6/36 como descrito (Mackow, E. et al. 1987 Virology 159:217-28). Para ainda amplificagao, a suspensao de 06/36 foi passada 2 vezes em celulas Vero (WHO) mantidas em MEM-E (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com FBS 10%. Virus derivados de transfecgao de RNA ou usados para desenvolvimento de lote clinico foram crescidos em celulas Vero (WHO) mantidas em meios isentos de soro, VP-SFM (Life technologies).
[00191] Construcao de mutantes de supressao de DEN-4. Uma supressao de 30 nucleotideos (nt) foi previamente4 introduzida na regiao nao-traduzida 3’ do clone CDNA 2A de wt DEN-4 linhagem 814669 co mo descrito (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Esta supressao remove nucleotideos 10478-10507, e foi originalmente designada 3’d 172-143, significando a localizagao da supressao em relagao a extremidade 3’ do genoma viral. No exemplo atual, esta supressao e referida como A30. O clone de cDNA 2A de inteiro comprimento sofreu varias modificagoes subseqiientes para aperfeigoamento de sua habilidade de ser geneticamente manipulado. Co mo descrito previamente, um sitio de enzima de restrigao Xhol translacionalmente silencioso foi engenheirado proximo da extremidade da regiao E em nucleotideo 2348 para char clone 2A-Xhol (Bray, M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). Neste exemplo, a sequencia codificante viral do clone cDNA de 2A-Xhol foi ainda modificada usando-se mutagenese de direcionada a sitio para criar clone p4: um unico sitio de restrigao BbvCI foi introduzido proximo da jungao C-prM (nucleotideos 447-452); um sitio de restrigao Xbal extra foi removido por mutagao de nucleotideo 7730; e um unico sitio de restrigao Sacll foi chado na regiao NS5 (nucleotideos 9318-9320). Cada uma destas mutagoes engenheiradas e traducionalmente silenciosa e nao altera a sequencia de aminoacidos do polipeptideo viral. Tambem, varias mutagoes foram feitas na regiao de vetor de clone p4 para introdugao ou remogao de adicionais sitios de restrigao. O clone cDNA de p4A30 foi gerado por introdugao de mutagao A30 em clone p4. Isto foi realizado atraves de substituigao de fragmento Mlul-Kpnl de p4 (nucleotideos 10403-10654) com aquele derivado de plasmideo 2AA30 contendo a supressao de 30 nucleotideos. Os clones cDNA de p4 e p4A30 foram subsequentemente usados para geragao de virus recombinantes rDEN4 e rDEN4A30, respec-tivamente.
[00192] Geracao de vfrus. Transcritos de RNA de inteiro comprimento foram sintetizados a partir de clones cDNA de 2A e 2AA30 usando SP6 RNA polimerase como descrito anterior-mente (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:513943; Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). A reagao para gerar transcritos de RNA de inteiro comprimento a partir de clones cDNA de p4 e p4A30 foi modificada e consistiu em uma mistura de reagao de 50pl contendo 1ug de plasmfdeo linearizado, 60 U de SP6 polimerase (New England Biolabs (NEB), Beverly, MA), 1X tampao RNA polimerase (Tris-HCI 40mM, pH 7,9, MgCh 6 mM, spermidine 2mM, ditiotreitol 10mM), m7G(5’)ppp(5’)G cap analog 0,5 mM (NEB), 1mM de cada nucleotideo trifosfato, 1 U pirofosfato (NEB), e 80 U inibidor RNAse (Roche, Indianapolis, IN). Esta mistura de reagao foi incubada a 40°C por 90 minutos e os resultantes transcritos foram purificados usando-se Rneasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Para transfecgao de celulas Vero, transcritos purificados (1p,g) foram misturados com 12pl de reagente DOTAP lipossome (Roche) em solugao salina contendo tampao HEPES 20mM (pH 7,6) e adicionados a culturas de monocamadas de celulas em uma placa de 6 cavidades. Apos 5-17 dias, meio de cultura de tecido foi colhido, clarificado por centrifugagao, e vfrus foi amplificado em celulas Vero. A presenga de vfrus foi confirmada por titulagao de placa. Deve ser notado que durante o curso de transfecgao e amplificagao de 2AA30 para criagao de lote de vacina, o vfrus sofreu um total de 6 passagens inteiramente em celulas Vero. Os vfrus restantes, rDEN4 e rDEN4A30 foram passados 5 vezes em celulas Vero para geragao de suspensao de vfrus usada para analises de sequencias e estudos em macacos rhesus.
[00193] Producao de vacina. Uma aliquota de fluido de cultura de tecido clarificado contendo candidate a vacina 2AA30 foi submetida a DynCorp (Rockville, MD) para amplificagao de vfrus em celulas Vero e produgao de um lote de vacinas. Para produgao de vacina, o sobrenadante de cultura de tecido impregnado com 2AA30 foi colhido, tampao SPG adicionado (concentragao final: 218 mM sucrose, acido L-glutamico 6mM, fosfato de potassio 3,8 mM, monobasico, e fosfato de potassio 7,2mM, dibasico, pH 7,2). E a suspensao de virus foi clarificada por centrifugagao em baixa velocidade. Para degradar DNA de celula Vero residual, a suspensao de vacina foi tratada com Benzonase endonuclease (American International Chemical, Natick, MA), 100U/ml e incubada por 1 hora a 37°C, seguido por centrifugagao em alta velocidade (17000 x g, 16 horas). O precipitado resultante de virus foi gentilmente rinsada com MEM-E, re-suspenso em MEM-E contendo SPG, sonificado, distribuido em ampolas termo-seladas, e estocadas congeladas a -70°C. Testes de seguranga de recipiente finals confirmaram esterilidade microbial, pureza de cultura de tecido, e seguranga animal. O lote de vacine 2AA30 (designado DEN4-9) tern um titulo de 7,48 logio PFU/ml, com uma dose simples de 5,0 logio PFU/ml contendo <1pg/ml de DNA de celula Vero e <0,001 U/ml de Benzonase endonuclease.
[00194] Sequencia de clones de cDNA e genomas virais. A sequencia de nucleotideos da regiao de genoma viral de cDNA de plasmideos 2A e p4 foi determinada sobre um analisador genetico 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando primers especifico de vetor e especifico de DEN-4 em reagoes de sequenciamento de ciclo com terminadores Big Dyeem(Applied Biosystems). A sequencia de nucleotideos dos genomas do parente wt DEN-4 linhagem 814669 e de virus recombinantes 2A wt, 2AA30 (lote de vacina), rDEN4, e rDEN4A30 tambem foi determinada. RNA viral foi extraido das preparagoes de virus e amostras de soro usando o QIAamp Viral RNA mini kit (Qiagen). Transcrigao reversa (RT) foi realizada usando hexameros randomicos e o Superscript First-Strand Synthesis System para RT-PCR (Life Technologies). Sobreposigao de fragmentos de PCR de aproximadamente 2000 pares de bases foi gerada usando-se primers especificos DEN-4 otimizados e Advantage cDNA polymerase (ClonTech, Palo Alto, CA). Ambas fitas de fragmentos de PCR purificados foram sequenciadas diretamente usando-se reagoes terminadoras com corante como descrito acima e resultados foram montados em uma sequencia consenso. Para determinar a sequencia de nucleotideos das regioes 5’ e 3’ de RNA viral, o nucleosideo capa 5’ do RNA viral foi removido com pirofosfatase acida de tabaco (Epicentre, Madison, Wl) seguido por circularizagao do RNA usando RNA ligase (Epicentre). RT-PCR foi realizada como descrito e um fragmento de c foram cedidos como se segue (virus: numero de acesso): 814669: AF326573, 2AA30: AF326826, rDEN4: AF326825, e rDEN4A30: AF326827.
[00195] Receptores de vacina humanos. 20 voluntaries adul-tos saudaveis foram recrutados pelo Johns Hopkins School of Hygiene and Public Health Center for Immunization Research (CIR) localizado em Baltimore, Maryland. O protocolo clinico foi revisto e aprovado pelo Joint Committee for Clinical Investigation do Johns Hopkins University School of Medicine e consentimento informado foi obtido de cada voluntario. Voluntaries foram arrolados no estudo se eles satisfizeram os seguintes criterios de inclusao: 18-45 anos de idade; nenhuma historia de doengas cronicas; um exame fisico normal; anticorpo para virus de imunodeficiencia humana negative, antfgeno de superficie de hepatite B negative, e anticorpo de hepatite C negative; nenhum sangue oculto em fezes; e valores normals para completa contagem de celulas de sangue (CBC) com diferencial, hematocrito, contagem de plaqueta, creatinina em soro, aspartato amino transferase em soro (AST), alanina amino transferase (ALT), fosfatase alcalina, bilirrubina, tempo de protrombina (PT), tempo de trombo-plastina parcial (PTT), e analise de urina. Voluntaries femeas foram requeridos terem teste de gravidez de urina negative antes de teste de vacinagao e no dia de vacinagao e a concordar em usar contraceptive ou abstinencia de intercurso sexual pela duragao do estudo. Voluntaries tambem careceram de evidencia sorologica de anterior infecgao com flavivirus como definido por tftulo de anticorpo de inibigao de hemaglutinagao <1:10 para virus de encefalite St.Louis DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, vfrus de encefalite Japone, ou vfrus de febre amarela e um titulo de neutralizagao de redugao de placa <1:10 para vfrus de febre amarela e DEN-4.
[00196] Estudos em humanos. Voluntaries foram imunizados em tres coortes sucessivas de quatro, seis e dez voluntaries para avaliagao de seguranga da vacina. Neste estudo, uma doenga foi definida como o seguinte: infeegao de vfrus da dengue associada com uma contagem de plaqueta de <90 000/mm3; ALT em soro >4 vezes o normal; temperatura oral > 38°C por >2 dias sucessivos; ou dor de cabega e/ou mialgia demorando >2 dias sucessivos. Doenga sistemica foi definida como a ocorrencia de febre >38°C por >2 dias consecutivos, ou quaisquer 2 do seguinte por pelo menos dois dias consecutivos do estudo: dor de cabega, enxaqueca, anorexia, e mialgia/artralgia. Os experimentos foram conduzidos entre outubro e abril, um tempo de baixa prevalencia de mosquito, para reduzir o risco de transmissao de vfrus de vacina de um dos voluntaries para a comunidade.
[00197] No dia de vacinagao, candidate a vacina 2AA30 foi diluido para 5,3 logio PFU/ml em solugao salina esteril para injegao, USP, e cada voluntario foi injetado subcutaneamente com 0,5ml contendo 5,0 logio PFU de vacina na regiao deltoide esquerda. Voluntaries receberam um cartao diario domestico no qual eles anotaram sua temperatura duas vezes ao dia para dias 0-5 apos vacinagao. Os voluntaries retornaram para a clfnica a cada dia para exame por um medico e seus cartdes diarios foram revistos. O sftio de injegao foi avaliado para eritema, induragao, e sensibi-lidade. Sinais cl inicos e sintomas tais como dor de cabega, exantema, petechiae, linfoadenopatia, hepatomegalia, sensi-bilidade abdominal, anorexia, nausea, fadiga, mialgia, artralgia, dor de olho, e fotofobia foram avaliados diariamente. Sintomas foram graduados como suaves (nenhuma neces-sidade de tratamento ou uma mudanga em atividade), moderados (necessario tratamento ou alteragao em atividade notada, ainda capaz de continua atividade diaria), ou severos (confinados ao leito). Sangue foi retirado para CBC com diferencial e para quantificagao de virus nos dias 0, 2 e 4. Voluntaries foram admitidos para a unidade de doentes internos no CIR no sexto dia apos imunizagao. O medico de estudo avaliou todos os voluntaries cada dia atraves de exame fisico e entrevista. Os voluntaries tiveram sua pressao sanguinea, pulso, e temperatura anotados quatro vezes por dia. Sangue foi retirado cada dia para CBC com diferencial e para quantificagao de virus e cada outro dia para medigao de ALT. Voluntaries foram confinados para a unidade de doentes internos ate dispensa no dia de estudo 15. Nos dias de estudo 28 e 42, voluntaries retornaram para exame fisico e sangue foi retirado para quantificagao de virus (dia 28) e para medigao de anticorpos em soro (dia 28 e 42).
[00198] Quantificacao e am pl if icacao de virus. Soro foi obtido para detegao de viremia e titulagao de virus em especimes positives. Para estes propositos 8,5ml de sangue foram coletados em um tubo separador de soro e incubados em temperatura ambiente por menos que 30 minutos. Soro foi decantado em aliquotas de 0,5ml, rapidamente congelado em um banho de gelo seco/etanol e estocados a -70°C. Aliquotas de soro foram descongeladas e diluigoes serials de 10 vezes foram inoculadas sobre culturas de monocamadas de celulas Vero em placas de 24 pogos. Apos incubagao de uma hora em temperatura ambiente, as monocamadas foram revestidas com metil celulose 0,8% em OptiMEM (Life Technologies) suplemen-tado com soro fetal bovino 5% (FBS). Seguindo incubagao a 37°C por quatro dias, placas de virus foram visualizadas por manchamento com imunoperoxidase. Resumidamente, monocamadas de celulas foram fixadas em metanol 80% por 30 minutos e rinsadas com tampao anticorpo (leite sem gordura 5% em solugao salina tamponada com fosfato). Anticorpos DEN-4 policlonais de coelho foram diluidos 1:1000 em tampao de anticorpo e adicionados a cada pogo seguido por uma hora de incubagao a 37°C. Anticorpos primaries foram removidos e as monocamadas de celulas foram lavadas duas vezes com tampao anticorpo. IgG cabra-anti-coelho rotulada com peroxidase (KPL, Gaithersburg, MD) foi diluida 1:500 em tampao de anticorpo e adicionada a cada pogo seguida por uma hora de incubagao a 37°C. Anticorpo secundario foi removido e os pogos foram lavados duas vezes com solugao salina tamponada com fosfato. Substrate peroxidase (4-cloro-1naftol em H2O2) foi adicionado a cada cavidade e placas visiveis foram contadas.
[00199] Para amplificagao de virus em amostras de soro, uma alfquota de 0,m3ml de soro foi diretamente inoculada em uma cavidade simples de uma placa de 6 cavidades de monocamadas de celulas Vero e incubados a 37°C por 7 dias. Fluido de cultura de celulas foi entao ensaiado para vfrus atraves de ensaio de placa como descrito acima.
[00200] Soroloqia. Ensaios de inibigao de hemoaglutinagao (HAI) foram realizados como previamente descrito (Clarke, D.H. & Casals, J. 1958 Am J Trop Med Hyg 7:561-73). Tftulos de neutralizagao de redugao de placa (PRNT) foram determinados atraves de uma modificagao da tecnica descrita por Russell (Russell, P.K. et al. 1967 J Immunol 99:285-90). Em resumo, soros de testes foram inativados termicamente (56°C por 30 minutos) e diluigoes serials de 2 vezes iniciando em 1:10 foram feitas em OptiMEM suplementado com albumina de soro humano 0,25%. Vfrus rDEN4A30, dilufdos para uma concentragao final de 1000 PFU/ml no mesmo diluente, foram adicionados para iguais volumes do soro dilufdo e bem misturados. A mistura de vfrus/soro foi incubada a 37°C por 30 minutos. Meio de cultura de celulas foi removido de culturas de monocamadas confluentes 90% de celulas Vero sobre placas de 24 cavidades e 50gl de mistura de vfrus/soro foram transferidos sobre monocamadas de celulas em duplicatas. Monocamadas de celulas foram incubadas por 60 minutos a 37°C e revestidas com metil celulose 0,8% em OptiMEM suplementado com FBS 2%. Amostras foram incubadas a 37°C por 4 dias apos o que placas foram visualizadas por coloragao com imunoperoxidase como descrito acima, e uma redugao de placa de 60% em titulo de neutralizagao foi calculada.
[00201] Estudos em macacos rhesus. Avaliagao da replicagao e imunogenicidade de virus wt 814669, e virus recombinantes 2A wt, 2AA30 (lote vacina), rDEN4, e rDEN4A30 em macacos rhesus juvenis foi realizada como descrito anteriormente (Men R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Em resumo, macacos soronegativos para virus dengue foram injetados subcuta-neamente com 5,0 logio PFU de vfrus diluido em meio L-15 (Quality Biological, Gaithersburg, MD) contendo tampao SPG. Uma dose de 1ml foi dividida entre duas injegoes em cada lado da area de ombro superior. Macacos foram observados diariamente e sangue foi coletado nos dias 0-10 e 28, e processado para soro, que foi estocado congelado a -70°C. Titulo de vfrus em amostras de soro foi determinado atraves de ensaio de placa sobre celulas Vero como descrito acima. Titulos de anticorpos neutralizantes foram determinados para as amostras de soro de dia 28 como descrito acima. Um grupo de macacos inoculados com 2AA30 (n=4) ou vfrus wt 814 669 (n=8) foi desafiado no dia 42 com uma dose simples de 5,0 logioPFU/ml vfrus wt 814669 e sangue foi coletado por 10 dias. Administragao e cuidados de macacos rhesus estavam de acordo com as diretrizes de National Institutes of Health para o uso humano de animais de laboratorio.
[00202] Construcao e caracterizacao de vfrus mutante de supressao e tipo selvaqem de DEN-4. As sequencias de aminoacidos deduzidas e nucleotfdeos do vfrus wt 814669 previamente descritas, o vfrus wt 2A DEN-4 derivado do mesmo (designado 2A wt), e o candidate a vacina 2AA30 derivado de vfrus wt 2A foram primeiro determinadas. Analise de sequencias mostraram que o vfrus wt 814669 usado neste estudo aparentemente acumulou 2 mutagoes sentido trocado (nucleotfdeos 5826 e 7630) e 3 mutagoes silenciosas durante sua passagem e amplificagao uma vez que estas mutagoes nao foram descritas em relatorios publicados anteriormente da sequencia viral (numero de acesso GenBank M14931) e nao estavam presente no CDNA 2A derivado do virus. Comparagao de sequencia entre virus 2A wt e lote de vacina 2AA30 revelou que 2AA30 acumulou 2 mutagoes sentido trocado (nucleotideos 7153 e 8308) e tambem confirmou a presenga da mutagao A30 (nucleotideos 10478-10507) assim como uma adicional supressao de nucleotideo 10475, que ocorreu durante a construgao original da mutagao A30 (Men, R. et al. J Virol 70:3930-7). Esta analise de sequencias revelou significante divergencia de sequencias entre o virus wt 814669 derivado biologicamente e seu derivado 2A wt recombinante e entre os virus 2A wt e 2AA30. Uma vez que os virus 2A wt e 2AA30 diferiram em nucleotideos outros que nao a mutagao de supressao, o fenotipo de atenuagao previamente reportado para 2AA30 (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7) nao pode ser formalmente atribuldo unicamente a mutagao A30 e pode ter sido especificado pelas mutagoes nos nucleotideos 7153, 8308, 10475, ou a supressao A30.
[00203] Para determinar se a mutagao A30 foi responsavel pela atenuagao observada de 2AA30, um segundo par de virus, um com e um sem a mutagao A30, foi produzido para avaliagao em macacos. Uma nova construgao vetor cDNA de DEN-4, designada p4, foi derivada do clone cDNA de 2A-Xhol e mutagoes translacionalmente silenciosas foram introduzidas para adicionar ou eliminar varies sitios de enzima de restrigao. Estes sltios foram adicionados para facilitar a futura manipulagao genetica deste cDNA de wt DEN-4 atraves da introdugao de outras mutagoes atenuantes se necessario. A sequencia da regiao gendmica do plasmideo cDNA p4 foi identica aquela do virus 2A wt exceto para as mudangas de sltio de restrigao engenheirados e uma mutagao de ponto em nucleotideo 2440 que foi introduzida durante a mutagenese original do plasmideo CDNA 2A para criar o sltio Xhol (Bray, M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). A mutagao A30 e a supressao vizinha em nucleotideo 10475 foram co-introduzidas no plasmideo p4 atraves de substituigao de um curto fragmento de restrigao com um derivado do clone de cDNA de 2AA30. Transcritos de RNA derivados do clone cDNA de p4 e de seu derivado A30 cada um rendeu virus (designado rDEN4 wt e eDEN4A30, respectivamente) seguindo transfecgao de celulas Vero. Analises de sequencias dos virus rDEN4 revelaram que durante sua passagem e amplificagao em celulas Vero ele acumulou 2 mutagoes de sentido trocado (nucleotideos 4353 e 6195), uma mutagao silenciosa (nucleotideo 10157), e uma mutagao de ponto na regiao naotraduzida 3’ (nucleotideo 10452). Em adigao a center A30 e a supressao acompanhante em nucleotideo 10475, rDEN4A30 tambem acumulou uma mutagao de sentido trocado (nucleotideo 7163) e uma mutagao silenciosa (nucleotideo 7295).
[00204] Virus wt 814669 parente e virus recombinantes 2A wt, 2AA30, rDEN4, e rDEN4A30 cada um replica em celulas Vero ara um tftulo excedendo 7,0 logio PFU/ml, e sua replicagao nao e sensitiva a temperatura a 39°C.
[00205] Replicacao de virus, imunoqenicidade, e eficacia em macacos. Grupos de macacos rhesus foram inoculados com wt DEN-4 814669, 2A wt, rDEN4, 2AA30 e rDEN4A30 para avaliar-se o nivel de restrigao especificado pela mutagao A30. Amostras de soro foram coletadas diariamente e tftulo de virus presente no soro foi determinado atraves de enumeragao de placas sobre culturas de monocamadas de celulas Vero. Macacos inoculados com virus wt 814669 ou suas contrapartes recombinantes, 2A wt ou rDEN4, foram viremicos para 3 a 4 dias com um pico de tftulo de virus medio de aproximadamente 2 logio PFU/ml. Macacos inoculados com virus 2AA30ou rDEN4A30 tiveram uma menor frequencia de viremia (83% e 50%, respectivamente), foram viremicos por somente cerca de 1 dia, e o pico de tftulo medio foi 10 vezes menor. Macacos inoculados com virus DEN-4 814669, 2A wt, ou rDEN4 desenvolveram altos niveis de anticorpos neutralizantes, com tftulos medios entre 442 e 532, consistentes com seu fenotipo tipo selvagem presumido. Macacos inoculados com 2AA30 ou rDEN4A30 desenvolveram um menor nivel de anticorpos neutralizantes, com tftulos medios de 198 e 223, respectivamente. A diminuigao em titulo de anticorpos neutrali-zantes em resposta a 2AA30 e rDEN4A30 e consistente com o fenotipo de atenuagao destes virus. Macacos inoculados com virus 2AA30 (n=4) ou wt 814669 (n=8) foram desafiados apos 42 dias com virus wt 814669. Vfrus de dengue nao foi detectado em qualquer amostra de soro coletada por ate 10 dias seguindo desafio com vfrus, indicando que estes macacos foram completamente protegidos seguindo imunizagao com vfrus wt ou candidate a vacina 2AA30.
[00206] Uma vez que DEN-4 814669, 2A wt, e rDEN4 cada um manifesta o mesmo nivel de replicagao e imunogenicidade em macacos rhesus, e razoavel concluir-se que as diferengas de sequencias identificadas entre estes pressupostos vfrus tipo selvagem que surgem durante passagem em cultura de tecido ou durante construgao de plasmideo nao afetam significantemente seu nivel de replicagao in vivo. Similarmente, o comparavel nfvel de atenuagao de 2AA30 e rDEN4A30 indica que as mutagoes compartilhadas por estes vfrus, por exemplo, a mutagao A30 e sua acompanhante mutagao de supressao 10475, sao provavelmente responsaveis pela atenuagao destes vfrus antes que suas incidentals diferengas de sequencia.
[00207] Resposta clfnica a imunizacao com 2AA30. O candi-dato a vacina 2AA30 foi administrado subcutaneamente em uma dose de 105 PFU a 20 voluntaries soronegativos. Cada um dos vacinados foi infectado e o vfrus foi bem tolerado por todos os vacinados. Viremia foi detectada em 70% dos vacinados, estava presente somente em baixo titulo, e nao se estende alem do dia 11.
[00208] Nenhum dos 20 vacinados reportou dor ou intumes-cimento no sftio de injegao. Eritema suave (1-3mm) ao redor de sftio de injegao foi notado com exame de 8 voluntaries 30 minutos apos vacinagao que resolveu no dia seguinte em 7 daqueles voluntaries e pelo terceiro dia nos voluntaries restantes. Dor suave para pressao no sftio de vacinagao foi notada em 2 voluntaries e demorou no maximo 48 horas. Durante exame fisico, dez voluntaries (50%) foram notados terem um exantema macular eritematoso semelhante a dengue muito suave (distribuigao truncal) que ocorreu com maiores freqiiencias no dia 10. Nenhum dos voluntaries notou por si proprio o exantema, e ele foi assintomatico em cada exemplo. Exantema foi visto somente em vacinados com detectavel viremia. Voluntaries nao desenvolveram doenga sistemica. Sete voluntaries notaram uma ocasional dor de cabega que foi descrita como suave, demorando menos que 2 horas, e nao estava presente em qualquer voluntario em dois dias consecutivos. Um voluntario reportou febre de 38,6°C e 38,2°C sem acompanhantes, dor de cabega, calafrios, dor de olho, fotofobia, anorexia, mialgia, ou artralgia como um paciente externo na noite do dia 3 e dia 5, respectivamente. Entretanto, este voluntario estava sem febre quando avaliado pelo pessoal de estudo na manha de dias 3, 4, 5 e 6. Todas as outras medigoes de temperatura anotadas pelos voluntaries ou pessoal de estudo foram normals. Embora testes torniquete nao tenham sido realizados, dois voluntarios foram notados terem petequia no sltio de manguito de pressao de sangue apos uma medigao de pressao de sangue ser realizada (uma no dia 6, a outra nos dias 7 e 10). Ambos voluntarios tiveram contagens de plaquetas normals naquele momento e por todo o estudo.
[00209] Anormalidades hematologicas significantes nao foram vistas em qualquer vacinado. Tres vacinados com presu-mida neutropenia etnica benigna manifestaram uma contagem de neutrofilos absoluta (ANC) abaixo de 1500/mm3. Estes tres voluntarios tiveram ANCs de linha base que foram significantemente menores que os restantes 17 voluntarios e que nao diminuiu desproporcionalmente para os outros voluntarios. Dois dos tres voluntarios que se tornaram neutropenicos nunca tiveram viremia detectavel. Um suave aumento em niveis de ALT foi notado em 4 voluntarios, e um aumento mais significante em nivel de ALT (ate 238 IU/L)) foi notado em um voluntario. Estas elevagoes de ALT foram transientes, nao foram associadas com hepatomegalia, e foram completamente assintomaticas em cada um dos cinco volun-tarios. Elevados valores de ALT retornaram para normal pelo dia 26 apos vacinagao. O voluntario com p alto valor de Alt foi tambem notado ter uma acompanhante elevagao suave em AST no dia 14 (104 IU/L) que tambem retornou para linha base no dia 26 apos vacinagao. Este voluntario nao teve um aumento associado em niveis de LDH, bilirrubina, ou de fosfatase alcalina.
[00210] Resposta soroloqica de humanos a imunizacao com 2AA30. Cada um dos vinte vacinados desenvolveu um significante aumento em tftulo de anticorpos neutralizantes em soro contra DEN-4 no dia 28. O nfvel de anticorpos neutralizantes em soro foi similar em vacinados viremicos (1:662) e nao-viremicos (1:426). Os titulos de anticorpos neutralizantes DEN-4 de ambos os grupos nao se alteraram significantemente no dia 42.
[00211] Estabilidade qenetica da mutacao A30. Analises de RT-PCR e de sequencias de RNA viral isolado de amostras de soro (n=6) coletadas de voluntaries 6 a 10 dias apos vacinagao confirmaram a presenga da mutagao A30 e supressao vizinha em nucleotideo 10475.
EXEMPLO 9 Composicoes Farmaceuticas
[00212] Vacinas de vfrus de dengue atenuados vivos, usando vfrus replicados da invenção, sao usadas para prevengao ou tratamento de infecgao com vfrus de dengue. Adicionalmente, vacinas de vfrus de dengue inativados sao providas atraves de inativagao de vfrus da invenção usando-se processes conhecidos, tais como, mas nao limitado a, tratamento com formalina ou betapropiolactona. Virus inativados ou atenuados vivos contendo as mutagoes descritas acima formam as bases de uma vacina aperfeigoada para a prevengao ou tratamento de infecgao de dengue em humanos.
[00213] Composipoes farmaceuticas da presente invenpao compreendem vfrus de dengue inativados ou atenuados vivos, opcionalmente ainda compreendendo solupdes, suspensoes, e emulsdes aquosas ou nao-aquosas estereis. A composipao ainda pode compreender agentes ou excipientes auxiliares, como conhecido na tecnica. Ver, por exemplo, Berkow et al. Eds. 1987 The Merck Manual, 15th edition, Merck and Co., Rahway, N.J.; Goodman et al. eds. 1990 Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.; Avery’s Drug Treatment: Principles and Pratice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. 1987; Osol, A. ed. 1980 Remington’s Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Co., Easton, Pa. pp.1324-1341; Katzung, ed. 1992 Basic and Clinical Pharmacology Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, Conn.
[00214] Uma composipao de vacina de virus da presente invenpao pode compreender de cerca de 102-109 unidades de formapao de placa (PFU)Zml, ou qualquer media ou valor ali, onde o vfrus e atenuado. Uma composipao de vacina compreendendo um vfrus inativado pode compreender uma quantidade de vfrus correspondendo a cerca de 0,1 a 50|ig de proteina E/ml, ou qualquer faixa ou valor ali.
[00215] Os agentes podem ser administrados usando-se tecnicas bem conhecidas por aqueles versados na tecnica. Preferivelmente, agentes sao formulados e administrados sistemicamente. Rotas apropriadas podem incluir adminis-trapao oral, retal, transmucosal ou intestinal; liberapao parenteral, incluindo injepoes intramusculares, subcutaneas, intra-medulares, assim como injepoes intratecal, intraven-tricular direta, intravenosa, intraperitoneal, intradermica, intranasal ou intraocular, justo para citar algumas. Para injepao, os agentes da invenpao podem ser formulados em solupoes aquosas, preferivelmente em tampoes fisiolo-gicamente compatfveis tais como solugao salina, solugao salina tamponada com fosfato, solugao salina tamponada com Tris, solugao salina tamponada com Hank, meios de crescimento como meio essencial minimo Eagle (MEM) e semelhantes.
[00216] Quando uma composigao de vacina da presente invenção e usada para administragao a um individuo, ela ainda pode compreender sais, tampdes, adjuvantes, ou outras substancias que sao desejaveis para aperfeigoamento de eficacia da composigao. Adjuvantes uteis com a invenção incluem, mas nao sao limitados a: (1) sais de aluminio (alumen), tais como hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulagdes de emulsao 6leo-em-agua (com ou sem outros especificos agentes imuno-estimulantes tais como peptideos muramil ou componen-tes de parede de celula bacterial), como, por exemplo, (a) MF59 (International Publication No. WO 90/14837), contendo Squaleno 5%, Tween 80 0,5%, e Span 85 0,5% (opcionalmente contendo varias quantidades de MTP-PE, embora nao requerido) formulado em particulas submicron usando-se um microflui-dizador como microflu id izador Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo Squaleno 10%, Tween 80 0,4%, polimero bloqueado plurdnico L121 5%, e thr-MDP tanto microfluidizado em uma emulsao sub-micron ou feito vortice para gerar uma emulsao de maior tamanho de particula, e (c) sistema adjuvante Ribi (RAS) (Ribi Immunochem, Hanilton, MT) contendo Squaleno 2%, Tween 80 0,2%, e um ou mais componentes de parede de celula bacterial do grupo consistindo em mono fosforil lipideo A (MPL), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto de parede de celula (CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox); (3) adjuvantes saponina, tais como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) podem ser usados ou particula gerada dos mesmos como ISCOMs (complexes imunoestimulantes); (4) adjuvante de Freunds completo (CFA) e adjuvante de Freunds incomplete (IFA); (5) citocinas, tais como interleucinas (IL-1, IL-2, etc.), fator de estimulagao de macrofago (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF), etc.; (6) adjuvantes mucosais tais como aqueles derivados de toxina de colera (CT), toxina pertussis (PT), toxina termo-instavel de E. coli (LT), e seus mutantes (ver, por exemplo, publicagoes internacionais Nos. WO 95/17211, WO 93/13202, e WO 97/02348; e (7) outras substancias que atuam como agentes imunoestimulantes para aperfeigoamento de eficacia da composigao.
[00217] Os compostos farmacologicamente ativos desta invenção podem ser processados de acordo com processos convencionais de farmacia galenica para produgao de agentes medicinais para administragao a pacientes, por exemplo, mamiferos incluindo humanos.
[00218] Os compostos desta invenção podem ser empregados em mistura com excipientes convencionais, por exemplo, substancias de veiculos organicos ou inorganicas farmaceu-ticamente aceitaveis apropriadas para aplicagao parenteral, enteral (por exemplo, oral) ou topica, que nao reagem prejudicialmente com os compostos ativos. Veiculos farmaceuticamente aceitaveis incluem mas nao sao limitados a agua, solugoes de sal, alcoois, goma arabica, oleos vegetais, alcoois benzilicos, polietileno glicois, gelatina, carboidratos tais como lactose, amilose ou amido, estearato de magnesio, talco, acido silicico, parafina viscosa, oleo perfume, monoglicerfdeos e diglicerideos de acido graxo, esteres de acido graxo de pentaeritritol, hidroxi metil celulose, polivinil pirrolidona, etc. As preparagdes farmaceuticas podem ser esterilizadas e se desejado mistu-radas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, preservatives, estabilizadores, agentes umectantes, emulsi-ficantes, sais para influenciar pressao osmotica, tampoes, corantes, aromatizantes e/ou substancias aromaticas e semelhantes que nao reajam prejudicialmente com os compostos ativos. Elas tambem podem ser combinadas onde desejado com outros agentes ativos, por exemplo, vitaminas.
[00219] Para aplicagao parenteral, particularmente apro-priadas sao solugoes estereis, injetaveis, preferivelmente solugoes oleosas ou aquosas, assim como suspensoes, emulsdes, ou implantes, incluindo supositorios. Ampolas sao convenientes dosagens unitarias.
[00220] Para aplicagao enteral, sao particularmente apro-priados comprimidos, drageas, liquidos, gotas, supositorios ou capsulas. Um xarope, elixir, ou semelhante pode ser usado onde um veiculo adogante e empregado.
[00221] Para aplicagao topica, sao empregadas formas nao-espargiveis, viscosas a semi-solidas ou formas solidas compreendendo um carreador compativel com aplicagao topica e tendo uma viscosidade dinamica preferivelmente maior que agua. Formulagbes apropriadas incluem mas nao sao limitadas a solugoes, suspensoes, emulsdes, cremes, pomadas, pos, linimentos, salvas, aerossois, etc., que sao, se desejado, esterilizados ou misturados com agentes auxiliares, por exemplo, preservatives, estabilizantes, agentes umectantes, tampoes ou sais para influenciar pressao osmdtica, etc. Para aplicagao topica, tambem sao apropriadas preparagoes de aerossol espargiveis onde o ingrediente ativo, prefenvel-mente em combinagao com um material carreador inerte sdlido ou Kquido, e embalado em uma garrafa de apertar ou em mistura com um propelente normalmente gasoso, volatil, pressurizado, por exemplo, um freon.
[00222] A vacina tambem pode conter quantidades pequenas mas variaveis de endotoxina, formaldeido livre, e preser-vativo, que foram verificados seguros e nao contribuindo para a reagao de genicidade das vacinas para humanos.
EXEMPLO 10 Propositos Farmaceuticos
[00223] A administragao da composigao de vacina pode ser para um proposito “profilatico” ou “terapeutico”. Quando provida profilaticamente, as composigdes sao providas antes de qualquer sintoma de infeegao viral de dengue se manifestar. A administragao profilatica da composigao serve para prevenir ou atenuar qualquer subsequente infeegao. Quando provida terapeuticamente, a vacina viral inativada ou atenuada viva e provida com a detegao de um sintoma de real infecgao. A administragao terapeutica do composto(s) serve para atenuar qualquer real infecgao. Ver, por exemplo, Berkow et al. eds. 1987 The Merck Manua, 15th edition, Merck and Co., Rahway, N.J.; Goodman et al. 1990 Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.; Avery’s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. 1987; Katzung, . 1992 Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton an Lange, Norwalk, Conn.
[00224] Uma composigao de vacina inativada ou atenuada viva da presente invenção pode assim ser provida tanto antes do inicio de infecgao(de modo a evitar ou atenuar uma infecgao antecipada) como apos o inicio de uma real infecgao.
[00225] As vacinas da invenção podem ser formuladas de acordo com processos conhecidos para preparagao de composi-goes farmaceuticamente uteis, pelo que virus inativados ou atenuados vivos sao combinados em uma mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitavel. Uma composigao e dita ser um “veiculo farmacologicamente aceitavel” se sua administragao pode ser tolerada por um paciente receptor. Veiculos apropriados sao bem conhecidos por aqueles versados na tecnica, por exemplo, em Osol, A. ed. 1980 Remington’s Sciences Mack Publishing Co., Easton, Pa. Pp. 1324-1341.
[00226] Para propositos de administragao, uma composigao de vacina da presente invenção e administrada a um receptor humano em uma quantidade terapeuticamente efetiva. Um tai agente e dito ser administrado em uma “quantidade terapeuti-camente efetiva” se a quantidade administrada e fisiologi-camente significante. Uma composigao de vacina da presente invenção e fisiologicamente significante se sua presenga resulta em uma alteragao detectavel na fisiologia de um paciente receptor que gera uma resposta imuno de hospedeiro contra pelo menos um sorotipo de dengue, estimula a produgao de anticorpos neutralizantes, ou conduz a protepao contra desafio.
[00227] A “protegao” provida nao precisa ser absoluta, isto e, a infecgao de dengue nao precisa ser totalmente prevenida ou radicada, se ha um aperfeigoamento estatisti-camente significante comparado com uma populagao ou conjunto e pacientes controle. Protegao pode ser limitada a mitigagao de severidade ou rapidez de infcio de sintomas da infecgao de virus de dengue.
EXEMPLO 11 Administrapao Farmaceutica
[00228] Uma vacina da presente invenção pode conferir resistencia a um ou mais sorotipos de dengue atraves de imunizagao. Em imunizagao, uma composigao de vacina inativada ou atenuada viva e administrada profilaticamente, de acordo com um processo da presente invenção. Em uma outra realizagao uma composigao de vacina inativada ou atenuada viva administrada terapeuticamente, de acordo com um pro-cesso diferente da presente invenção.
[00229] A presente invenção assim inclui processos para prevengao ou atenuagao de infecgao por pelo menos um sorotipo de dengue. Como aqui usado, uma vacina e dita prevenir ou atenuar uma doenga se sua administragao resulta na atenuagao total ou parcial (isto e, supressao)) de um sintoma ou condigao da doenga, ou na imunidade total ou parcial do individuo para a doenga.
[00230] Pelo menos um virus de dengue inativado ou atenuado vivo, ou sua composigao, da presente invenção pode ser administrado por quaisquer meios que obtenham o proposito pretendido, usando uma composigao farmaceutica como descrito anteriormente.
[00231] Por exemplo, administragao de uma tai composigao pode ser atraves de varias rotas parenterais tais como rotas subcutaneas, intravenosas, intradermicas, intramusculares, intraperitoneais, intranasais, orais ou transdermicas. Admi-nistragao parenteral pode ser atraves de injepao de bolus ou atraves de perfusao gradual com o tempo. Um modo preferido de uso de uma composigao farmaceutica da presente invenção e atraves de aplicagao intramuscular, intradermica ou subcutanea. Ver, por exemplo, Berkow et al. eds. 1987 The Merck Manual 15th edition, Merck and Co., Rahway, N.J.; Goodman et al. eds. 1990 Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.; Avery’s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. 1987; Osol, A. ed. 1980 Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. Easton, Pa. Pp. 1324-1341; Katzung, ed. 192 Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, Conn.
[00232] Um tipico regime para prevengao, supressao, ou tratamento de uma patologia relacionada com virus de dengue, compreende administragao de uma quantidade efetiva de uma composigao vacina como aqui descrita, administrada como um tratamento simples, ou repetida como dosagens de aperfei-goamento ou reforgo, sobre um periodo de ate e incluindo entre uma semana e cerca de 24 meses, ou qualquer faixa ou valor ali.
[00233] Sera apreciado que as reais quantidades preferidas de composto ativo em um caso especifico irao variar de acordo com o especifico composto sendo utilizado, as composigoes formuladas, o modo de aplicagao, e o particular situs e organismo sendo tratados. Dosagens para um dado hospedeiro podem ser determinadas usando-se consideragoes convencionais, por exemplo, atraves de comparagao costumeira das atividades diferenciais dos compostos objetos e de um agente conhecido, por exemplo, atraves de um protocolo farmacologico convencional, apropriado.
[00234] A dosagem de uma vacina de virus atenuado vivo para um mamifero (por exemplo, humano) pode ser de cerca de 103-107 unidades formadoras de placa (PFU)/kg, ou qualquer faixa ou valor ali. A dose de vacina inativada pode variar de cerca de 0,1 a 50pg de proteina E. Entretanto, a dosagem deve ser uma quantidade segura e efetiva como determinada atraves de processes convencionais, usando vacinas exis-tentes como um ponto de partida.
[00235] As composigoes podem, se desejado, ser apresen-tadas em uma embalagem ou dispositivo dispensador que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitaria de ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender folha de metal ou plastico, tai como uma embalagem de bolha. A embalagem ou dispositivo dispensador pode ser acompanhada por instrugoes para administragao. TABELA 1 Suscetibilidade de camundongo a infecpao de DEN4 intra-cerebral e dependente de Idadea
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a Grupos de 4 ou 5 camundongos Swiss Webster foram inoculados intra-cerebralmente com 105 PFU de virus em 30p,l de inoculum. Apos 5 dias, cerebros foram removidos, homogeneizados e titulados em celulas Vero. SE = erro padrao. TABELA 2 Fenotipos de atenuacao em cerebro de camundongo (att) e sensitivo a temperatura (ts) de virus DEN4 mutantes de 5-FU
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a redugao de titulo (logio PFU/ml) a 39°C comparada a titulo em temperatura permissivel. b Grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c.com 104 PFU de virus em 30gl de inoculum. Cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. c media de 11 experimentos com um total de 64 e 66 camundongos por grupo. d determinado por comparagao de tftulos virais medios de camundongos inoculados com vfrus mutante e o controle 2A13 wt no mesmo experimento (n=6 ou 12). e valores sublinhados indicam uma redugao de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em tftulo em celulas Vero ou celulas HuH, respectivamente, na temp indicada quando comparado a tftulo em temperatura permissivel (35°C. TABELA 3 Diferencas de nucleotfdeos e aminoacidos dos vfrus mutantes com 5-FU que sao ts em ambas celulas Vero e HuH-7
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a virus que contem mutagoes resultando em uma substituigao de aminoacidos em somente um gene NS e/ou substituigoes de nucleotideos nas UTRs sao indicadas; isto e, nenhuma substituigao de aminoacido esta presente nas proteinas estruturais (C-prM-E) b posigao de aminoacido em poliproteina DEN4 iniciando com o residue metionina da proteina C (nt 102-104) como residuo #1. Aminoacido tipo selvagem sobre esquerda de posigao de aminoacido; aminoacido mutante na direita. TABELA 4 Diferencas de nucleotideos e aminoacidos dos virus mutantes de 5-FU que sao ts somente em celulas HuH-7
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a vfrus que contem mutagao resultando em substituigao de aminoacido em somente um gene NS e/ou substitutes de nucleotldeos nas UTRs sao indicadas; isto e, nenhuma substituigao de aminoacido esta presente nas proteinas estruturais b posigao de aminoacido em poliproteina DEN4 iniciando com o residue metionina da proteina C (nt 102-104) como residuo #1. Aminoacido tipo selvagem na esquerda de posigao de aminoacido; aminoacido mutante a direita. TABELA 5 Mutacoes que sao representadas em multiplos virus DEN4 mutantes com 5-FU
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a nao aplicavel TABELA 6 Adicao de mutacao ts 4995 ou rDEN4A30 confere um fenotipo ts e ainda atenua sua replicacao em cerebro de camundongo Iovem
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a redugao em titulo (logio PFU/ml) a 39°C comparada a titulo na temperatura permissivel (35°). b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vfrus em 30ul de inoculum. Cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. O limite de detegao e 2,0 logio PFU/g de cerebro. c determinado por comparagao de tftulos virais medios de camundongos inoculados com vfrus amostra e controle rDEN4. d valores sublinhados indicam uma redugao de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em tftulo em celulas Vero ou celulas HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel. TABELA 7 Fenotipos de atenuacao em cerebro de camundongo (att) e sensitive a temperatura (ts) de virus mutantes DEN4 com 5-FU gue exibem um fenotipo de placa pequena (sp)
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TABELA 7 (continuagao)
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a reduQao em titulo de virus medio (logio PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissivel (35°C). b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104PFU de virus. Cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. c media de 11 experimentos com um total de 64 a 66 camundongos por grupo. d determinado por compara^ao de titulos virais medios de camundongos inoculados com virus mutante e simultaneo controle virus tipo selvagem (wt) 2A-13 (n=6 ou 12). e valores sublinhados indicam uma redugao de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em titulo em celulas Vero ou celulas HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel (35°C). x tamanho de placa pequeno a 35°C; placas pequenas tern um diametro de <1,0mm comparado a diametro de placa tipo selvagem de 1,5-2,0mm em celulas Vero, ou um diametro de <0,4mm comparado a diametro de tipo selvagem de 0,75 a 1,0mm em celulas HuH-7. TABELA 8 Virus com ambos fenotipos ts e sp sao mais restritos em replicacao em cerebro de camundongo que aqueles com somente um fenotipo ts
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a 20 virus mutantes ts sem um fenotipo sp foram previamente descritos (exemplo 1). b determinado por comparagao de titulos virais medios de grupos de camundongos inoculados com virus mutante e simultaneo virus controle passado em paralelo 2A-13. c diferenga significante entre grupo ts e grupo ts/sp, teste de TukeyKramer (P<0,05) TABELA 9 Diferengas de nucleotideos e aminoacidos dos virus DEN4 mutantes com 5-FU que produzem placas pequenas em ambas celulas Vero e HuH-7
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a vfrus contem mutagoes de sentido trocado somente em genes naoestruturais. b posigao de aminoacido em poliproteina DEN4 iniciando com o residuo metionina da protefna C (nt 102-104) Aminoacido tipo selvagem na esquerda de posigao de aminoacido; aminoacido mutante a direita. TABELA 10 Diferencas de nucleotldeos e aminoacidos dos virus mutantes 5-FU que produzem placas pequenas somente em celulas HuH-7
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a virus que contem mutagoes de sentido trocado somente nos genes estruturais e/ou mutagoes nas UTRs. b posigao de aminoacido em poliproteina DEN4 iniciando com o residuo metionina da proteina C (nt 102-104) Aminoacido tipo selvagem na esquerda de posigao de aminoacido; aminoacido mutante a direita. TABELA 10 (continuagao)
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a virus que contem mutacoes de sentido trocado somente nos genes estruturais e/ou mutagoes nas UTRs. b posigao de aminoacido em poliproteina DEN4 iniciando com o resfduo metionina da proteina C (nt 102-104) Aminoacido tipo selvagem na esquerda de posigao de aminoacido; aminoacido mutante a direita. TABELA 11 Mutacoes de adaptacao a celulas Vero putativas derivadas do inteiro conjunto de virus mutantes 5-FU
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a nao-aplicavel b posigao de aminoacido em poliprotefna DEN4 iniciando com o resfduo metionina da proteina C (nt102-104) como residue #1. Tabela 12 Oliqonucleotideos mutaqenicos usados para qerar virus DEN4 recombinante contendo mutacoes 5-FU simples.
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TABELA 12 (continuagao)
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a primers foram engenheirados os quais introduziram (sublinhado) ou removeram (linha tracejada) sitos de enzima de restrigao translacionalmente silenciosos. b letras em caixa baixa indicam mudangas de nt e letras em negrito indicam o sitio da mutagao 5-FU, que em alguns oligonucleotideos difere da mudanga de substituigao de nucleotideo original de modo a criar um sitio de enzima de restrigao unico. A mudanga preserva o codon para a substituigao de aminoacido. TABELA 13 Fenotipos de atenuacao em camundongo e sp, ts de virus mutantes rDEN4 codificando mutacoes simples em seis virus mutantes 5-FU sp
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TABELA 13 (continuagao)
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a redugao em tftulo medio de virus (logio PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissivel (35°C). b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de virus. Cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. c comparagao de tftulos medios de camundongos inoculados com vfrus mutante e simultaneo controle DEN4. Negrito representa >50ou >100 vezes de diminuigao em replicagao em camundongos jovens ou SCID-HuH-7, respectivamente. d grupos de camundongos HuH-7-SCID foram inoculados diretamente no tumor com 104 PFU de vfrus. Soro foi coletado nos dias 6 e 7 e titulado em celulas Vero. e valores sublinhados indicam uma reduQao de 2,5 a 3,5 logio PFU/ml em tftulo em celulas Vero ou HuH, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel (35°C). x tamanho de placa pequeno a 35°C; placas pequenas tern um diametro de <1,0 mm comparado a diametro de placa tipo selvagem de 1,5-2,0mm em celulas Vero, ou um diametro de <0,4mm comparado a diametro de placa tipo selvagem de 0,75 a 1,0 mm em celulas HuH-7. TABELA 14 Fenotipos de virus mutantes rDEN4 codificando mutacoes simples identificadas em 10 virus mutantes 5-FU que sao ts em ambas celulas Vero e HuH-7
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TABELA 14 (continuagao)
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a redugao em titulo medio de virus (logio PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissivel (35°C) b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.e. com 104 PFU de virus. Cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. c comparagao de tftulos medios de virus de camundongos inoculados com virus mutantes e simultaneo controle DEN4. Negrito representa diminuigao de > 50ou >100 vezes. Em replicagao em camundongos jovens ou SCID-HuH-7, respectivamente. d grupos de camundongos HuH-7-SCID foram inoculados diretamente no tumor com 104 PFU de virus. Soro foi coletado nos dias 6 e 7 e titulado em celulas Vero. e valores sublinhados indicam uma redugao de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em tftulo em celulas Vero ou HuH, respectivamente,na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel (35°C). f dados representam os resultados de um vfrus rDEN-4-4995 simples. x tamanho de placa pequeno a 35°C; placas pequenas tern um diametro de <1,0 mm comparado a diametro de placa tipo selvagem de 1,5-2,0mm em celulas Vero, ou um diametro de <0,4mm comparado a diametro de placa tipo selvagem de 0,75 a 1,0 mm em celulas HuH-7. TABELA 15 Fenotipos de atenuacao em camundongo, sp e ts de virus mutantes rDEN 4 codificando mutacoes simples identificadas em 3 virus mutantes 5-FU ts especificos de celula HuH-7
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a redugao em tftulo medio de vfrus (logio PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissivel (35°C) b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vfrus. Cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. c determinado por comparagao de tftulos medios virais de camundongos inoculados com vfrus mutantes e simultaneo controle 2A-13 ou rDEN4 wt. d valores sublinhados indicam uma redugao de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em tftulo em celulas Vero ou HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel (35°C). TABELA 16 Fenotipos sensitivo a temperatura (ts) e de atenuacao em cerebro de camundongo (att) de adicionais virus rDEN4 codificando mutacoes 5-FU simples.
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a redugao em titulo medio de vfrus (logio PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissivel (35°C) b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vfrus. Cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. Limite de detegao e 2,0 Iog10 PFU/g. c determinado por comparagao de tftulos medios virais de camundongos inoculados com vfrus amostra e controle rDEN4 wt. d valores sublinhados indicam uma redugao de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em tftulo em celulas Vero ou HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel (35°C). e a mutagao 7546 tambem esta presente em nove outros vfrus mutantes 5-FU. x tamanho de placa pequeno a 35°C; placas pequenas tern um diametro de <0,4mm comparado a diametro de placa wt de 0,75 a 1,0mm em celulas HuH-7. f nao determinado. ** o fenotipo att e definido como uma redugao de >1,5 logio PFU/g comparada a vfrus wt. TABELA 17 Crescimento de DEN-4-2A-13 em camundongos SCID transplantados com celulas HuH-7
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a camundongos SCID foram injetados i.p. com 107 celulas de hepatoma humano HuH-7. Aproximadamente 8 semanas depois, grupos de camundongos SCID-HuH-7 transportando tumor foram inoculados com virus diretamente no tumor. Soro e tecidos foram coletados no dia 5, processados, e titulados em celulas Vero. Tabela 18 Combinacao de mutacoes ts, NS3 4995, e NS5 7849, em rDEN4 resulta em um fenotipo ts aditivo
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a redugao em titulo medio de vfrus (logio PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissivel (35°C) b grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vfrus. Cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. Limite de detegao e 2,0 Iog10 PFU/g. c determinado por comparagao de tftulos medios virais de camundongos inoculados com vfrus amostra e controle rDEN4 wt. d valores sublinhados indicam uma redugao de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em tftulo em celulas Vero ou HuH-7, respectivamente,na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel. TABELA 19 As mutagoes 5-FU sao compativeis com a mutacao A30 para replicacao no cerebro de camundongo jovem
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a Grupos de 6 camundongos jovens foram inoculados i.c. com 104 PFU de vfrus. Cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. b Comparagao de titulos medios de virus de camundongos inoculados com virus mutante e controle rDEN4. c Mutagao restringe crescimento em ambos, cerebro de camundongo e camundongo SCID-HuH-7. d Mutagao restringe crescimento somente em cerebro de camundongo. A mutagao 8092 nao foi testada em camundongo SCID-HuH-7. TABELA 20 Fenotipos sensitivo a temperatura e de atenuacao em cerebro de camundongo de vfrus transportando mutacoes carga-agrupamento-para alanina no gene NS5 de DEN4.
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TABELA 20 (continuagao)
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a Posigoes do par de aminoacidos mutados para um par de alanina; numeragao comega no terminus amino da proteina NS5. b valores sublinhados indicam uma redugao de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em tftulo em celulas Vero ou HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel. c redugao em titulo (logio PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissivel (35°C). d Grupos de seis camundongos foram inoculados i.c. com 4,0 logio PFU em 30ul de inoculum. Os cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. e Determinado por comparagao de tftulos medios virais em camundongos inoculados com virus amostra e simultaneos controles wt (n=6). O fenotipo de atenuagao e definido como uma redugao de > 1,5 logio PFU/g comparada a virus wt; redugoes de >1,5 sao listadas em negrito. TABELA 21 Fenotipos de atenuagao em SCID-HuH-7 de virus transportando mutagoes oarqa-aqrupamento-para-alanina no gene NS5 de DEN4
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a Posigoes do par de aminoaoidos mutados para um par de alanina; numeragao oomega no terminus amino da proteina NS5. b Grupos de oamundongos SCID-HuH-7 foram diretamente inoeulados no tumor oom 104 PFU de virus. c Comparagao de titulos medios de virus de camundongos inoculados com virus mutantes e simultaneo controle DEN4. Negrito represents uma diminuigao de >100 vezes em replicagao. Um sinal (-) indica um aumento em replicagao em relagao a wt. TABELA 22 Combinapao de mutacoes carga-agrupamento-para-alanina emparelhadas em vfrus mutantes par-duplo
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TABELA 23 Fenotipos sensitivo a temperatura e de atenuacao em cerebro de camundongo de mutantes carga-agrupamento-para-alanina duplos do gene NS5 de rDEN4
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TABELA 23 (continuagao)
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a Posigoes do par de aminoacidos mutados para um par de alanina; numeragao comega no terminus amino da proteina NS5 b Valores sublinhados indicam uma redugao de 2,5 ou 3,5 logio PFU/ml em tftulo em celulas Vero ou HuH-7, respectivamente, na temperatura indicada quando comparada a temperatura permissivel (35°C). c Redugao em tftulo (logio PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissivel (35°C). d Grupos de seis camundongos foram inoculados i.c. com 4,0 logio PFU em 30ul de inoculum. Os cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. e Determinado por comparagao de titulos virais medios em camundongos inoculados com virus amostra e simultaneos controles wt (n=6); redugoes >1,5 sao listadas em negrito. TABELA 24 Fenotipos de atenuacao em SCID-HuH-7 de mutantes carga-agrupamento-paraalanina duplos do gene NS5 de rDEN4
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a Posigoes do par de aminoacidos mutados para um par de alanina; numeragao comega no terminus amino da proteina NS5. b Grupos de camundongos SCID-HuH-7 foram inoculados diretamente no tumor com 104 PFU de virus. Soro foi coletado nos dias 6 e 7 e titulado em celulas Vero. c Comparagao de tftulos de vfrus medios de camundongos inoculados com vfrus mutante e simultaneo controle. Negrito representa uma diminuigao de >100 vezes em replicagao. Um sinal (+) indica um aumento em replicagao em relagao a wt. TABELA 25 Fenotipos (sensitividade a temperatura, tamanho de placa e replicacao em cerebro de camundongo e camundongo SCID-HuH7) de DEN4 wt e vfrus contendo as mutacoes A30 e 7129
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a posigao e identidade dos nucleotideos alterados. b Redugao em titulo (logio PFU/ml) a 39°C comparada a temperatura permissivel (35°C). c Grupos de seis camundongos foram inoculados i.e. com 4,0 logio PFU em 30ul de inoculum. Os cerebros foram removidos 5 dias depois, homogeneizados, e titulados em celulas Vero. d Determinado por comparagao de tftulos virais medios em camundongos inoculados com virus amostra e simultaneos controles wt (n=6). O fenotipo de atenuagao e definido como uma diminuigao de > 50ou >100 vezes em replicagao em camundongos jovens ou SCID-HuH-7, respectivamente. Um sinal (-) indica um aumento em replicagao em relagao ao controle wt. e Grupos de camundongos SCID-HuH-7 foram inoculados diretamente no tumor com 104 PFU de virus. Soro foi coletado nos dias 6 e 7 e titulado em celulas Vero. * tamanho de placa pequeno. TABELA 26 O mutante de placa pequena 5-1A1 5-fluor uracila demonstra uma restricao de infeccao de intestino medio seguindo infeccao oral de mosquitos Aedes aeqypti
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a Quantidade de virus ingerida, assumindo uma refeigao de sangue de 2p,l. b Numero (porcentagem) de mosquitos com antigeno de virus de dengue detectavel em tecido de intestino medio, mas nenhum antigeno de virus de dengue detectavel na cabega; mosquitos foram ensaiados 21 dias apos alimentagao, e antigeno de virus de dengue foi identificado por IFA. c Numero (porcentagem) de mosquitos com antigeno de virus de dengue de-tectavel em ambos tecidos, de intestino medio e cabega. d Numero total (porcentagem) de mosquitos com antigeno de virus de dengue. e A proporgao de infecgoes totais causadas por DEN4 tipo selvagem foi significantemente maior que a proporgao causada por 5-1A1 (regressao logistica, N=426, P<0,0001). Existiu pouca infeegao disseminada causada por 5-1A1 para permitir analise estatistica. TABELA 27 O mutante de placa pequena 5-1A1 5-fluor uracila demonstra uma restricao de infeccao seguindo inoculacao intra-toraxica de mosquitos Toxorhynchites splendens
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a Quantidade de virus inoculada em um inoculum de 0,22pL b Numero (porcentagem) de mosquitos com antigeno de virus de dengue detectavel em tecido de cabega; mosquitos foram ensaiados 14 dias apos inoculagao, e antigeno de virus de dengue foi identificado por I FA. c A proporgao de infecgoes causadas por DEN4 tipo selvagem foi significantemente maior que a proporgao causada por 5-1A1 (regressao logistica, N=36, P<0,01). TABELA 28 Primers de mutagenese para a supressao ou troca de sequencias em DEN4 mostrando diferencas conservadas de flavivirus transportados por carrapato Nucleotideos de
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TABELA 29 Tftulo de vfrus e tamanho de placa de vfrus mutantes UTR 3’ em celulas Vero e C6/36
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1 Tamanho de placa e designado como equivalente a tipo selvagem (wt) ou <50% de tipo selvagem (sp) sobre o tipo de celula designado. TABELA 30 Infectividade de DEN4wt e mutantes UTR 3’ para Toxorhvnchites splendensvia inoculacao intra-toraxica
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a Quantidade de virus inoculada em um inoculum de 0,22|j,l. b Porcentagem de mosquitos com antigeno de virus de dengue detectavel em tecido de cabega; mosquitos foram ensaiados 14 dias apos inoculagao, e antigeno de virus de dengue foi identificado por I FA. TABELA 31 Infectividade de virus mutantes trocados UTR 3’ para Aedes aegypti alimentados sobre uma refeicao de sangue infecciosa
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a Quantidade de virus ingerida, assumindo uma refeigao de sangue de 2pi. b Numero (porcentagem) de mosquitos com antigeno de vfrus de dengue detectavel no tecido de intestino medio; mosquitos foram ensaiados 14d apos alimentagao e antigeno de virus de dengue foi identificado por I FA. c Em uma dose de 3,8 logio PFU, rDEN4trocado10535-10544 infectou significantemente menos mosquitos no intestino medio que rDEN4 wt (teste exato de Fish, N=43, P<0,01), embora infecgoes disseminadas nao fossem significantemente diferentes (teste exato de Fisher, N=43, P=0,38). d Numero (%) de mosquitos com antigeno de virus de dengue detectavel no tecido de cabega. TABELA 32 Mutacoes de adaptacao a celulas Vero putativas derivadas do coniunto de vfrus mutantes 5-FU e outros virus DEN4 passados em celulas Vero Posipao de nucleotideo Gene/regiao (a.a.#)b Vfrus mutantes 5-FU Outros vfrus DEN passados em celulas Vero
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a Conservagao com DEN1, DEN2, ou DEN3 e designado por sobrescrito. Falta de conservagao e designada por ausencia de sobrescrito b Posigao de aminoacido em poliproteina DEN4 iniciado com o restduo metionina da protefna C (nt 102-104) como residue #1. cnao aplicavel. TABELA 33 Analise de sequencias de rPEN2/4A30 clone 27(p4)-2-2A2
Figure img0066
Mesma como posigao de nucleotideo de DEN4 7546 TABELA 34 Analise de sequencias de rDEN2/4A30 clone 27(p3)-1-1A1.
Figure img0067
* Codon adjacente a mutagao 5-FU 4891 TABELA 35 Virus recombinante rDEN2/4A30 transportando mutacoes de adaptacao Vero podem ser recuperados e titulados sobre celulas Vero
Figure img0068
TABELA 36 Mutagoes de adaptacao a celulas Vero putativas de virus de dengue tipo 4 e o correspondente residuo de aminoacido tipo selvagem em outros virus de dengue
Figure img0069
a Posigao de aminoacido e dada para a poliproteina de DEN4. b DEN4= rDEN4 (GenBank AF326825); DEN1= Western pacific (GenBank DVU88535); DEN2=New Guinea C (GenBank AF038403); DEN3=H87 (GenBank M93130). c Sublinhados sao compartilhados entre DEN4 e um ou mais tipos de DEN adicionais. TABELA 37 Mutacoes conhecidas atenuarem virus de dengue tipo 4 e o correspondente residuo de aminoacido tipo selvagem em outros vfrus de dengue.
Figure img0070
Figure img0071
a Posigao de aminoacido e dada para a poliprotefna de DEN4. b DEN4= rDEN4 (GenBank AF326825); DEN1= Western pacific (GenBank DVU88535); DEN2=New Guinea C (GenBank AF038403); DEN3=H87 (GenBank M93130). c Esta mutagao resulta em replicagao reduzida de den4 em mosquitos. d Nucleotideos sublinhados sao compartilhados entre DEN4 e um ou mais tipos de DEN adicionais. APENDICE 1 Sequencia de cepa de virus de dengue tipo 4 recombinante 2A LOCUS AF375822 10649 bp ss-RNA linear VRL 19-SEP-2001 DEFINIQ&O Clone 2A recombinante do tipo 4 de virus de dengue, genoma completo. Acesso AF375822 versao AF375822.1 GI: 14269097 Palavras Chave Fonte virus de dengue Tipo 4. Organismo virus de dengue Tipo 4 Virus; virus de fita positiva ssRNA, sem estagio DNA; Flaviridae; Flavivirus; grupo de virus de dengue. REFERfiNCIA 1 (bases 1 a 1064) AUTORES Blaney, J.E. Jr., Johnson, D.H., Firestone, C.Y., Hanson, C.T., Murphy, B.R. e Whitehead, S.S. TITULO Mutagenese Quimica de Virus de Dengue Tipo 4 Produz Virus Mutantes que Sao Sensiveis a Temperatura em Celulas Vero ou Celulas de Figado Humano e Atenuadas em Camundongos Jornal J. Virol. 75 (20), 9731-9740 (2001) MEDLINE 21443968 PUBMED 11559806 REFERENCIA 2 (bases 1 a 10649) AUTORES Blaney, J.E. Jr., Johnson, D.H., Firestone, C.Y., Hanson, C.T., Murphy, B.R. e Whitehead, S.S. TITULO Submissao Direta JORNAL Submetido (2/5/2001) LID, NIAID, 7 Center Drive, Betesda, MD 20892, E.U.A. CARACTERISTICAS LocalizaQao/Qualificadores fonte 1..10649 /oragnismo="Virus de Dengue Tipo 4" /Virion /db_xref="taxon:11070" mat_peptideo 102..440 /note:"anchC" /produto_"proteina de capsideo ancaorada" mat_peptideo 102..398 /nota="virC /produto="proteina de capsideo de virion" CDS 102..10265 Icodon_iniciar=l /produto="precursor de poliproteina" /proteina_id="AAK58017.1" /db_xref="GI:14222269098" /transla<?ao=
Figure img0072
Figure img0073
mat_peptideo 441..938 /nota="prM" /produto="proteina precursora de membrana" mat_peptideo 714..938 /nota^'M" /produto=”proteina de membrana" mat—peptideo 939..2423 /nota="E” /produto="proteina envelope mat-peptideo 2424. .3479 /produto="proteina NS1" mat_peptideo 3480..4133 /produto="proteina NS 2 A” mat—peptideo 4134..4523 /produto="proteina NS2B” mat_peptideo 4524..6377 /produto="proteina NS 3" mat_peptideo 6378..6758 /produto="Proteina NS4A mat_peptideo 6759..6827 /produto="proteina 2K" mat_peptideo 6828..7562 /produto="proteina NS4B” mat_'peptideo 7563..10262 /produto="Proteina NS 5" Contagem de bases 3302 a 2212 c 2800 g 2335 t Origem
Figure img0074
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APENDICE 2 Sequencia de cepa de vfrus de dengue tipo 4 recombinante rDEN4 LOCUS AF326825 10649 bp RNA VRL 03-JAN-2001 DEFINIQAO Vfrus de Dengue Tipo 4clone de RDEN4 recombinante de vfrus de Dengue tipo 4, sequencia completa ACESSO AF326825 VERSAO AF326825.1 GI:12018169 PALAVRA CHAVE FONTE Vfrus de Dengue tipo 4 Vfrus de Dengue tipo 4; Vfrus de uma fita positiva ssRNA, sem estagio de DNA Flaviviridae; Flavivirus; grupo de vfrus de Dengue Submetido (08-DEC-200) LID, NIAID, 7 Center Drive, Bethesda, MD 20892 EUA. FONTE 1..10649 /organismo-'virus de dengue tipo4" Zdb_xref="taxon:1107" /clone-YD EN4" mat_peptfdeo 102..440 /produto-'proteina de capsfdeo (anchC) ancorado mat_peptfdeo 102..398 /produto-'protefna de capsfdeo de vfrus (virC)" CDS 102..10265 /codon_iniciar=1 /produto-'precursor de poliprotefna" proteinaJd=’’AAG45435.1" /db xref="GI:12018170" I trans 1 at ion= ”
Figure img0079
Figure img0080
mat_peptideo 441..938 Zproduto-'proteina de precursor de membrana (prM)" mat_peptideo 714..938 Zproduto-'proteina de membrana (M)" mat_peptideo 939.2423 /produto-’proteina de envelope (E)” mat_peptideo 2424..3479 Zproduto-'proteina NS1" mat_peptideo 3480..4133 Zproduto-'proteina NS2A" mat_peptideo 4134..4523 Zproduto-'proteina NS2B" mat_peptideo 4524-6377 Zproduto-'proteina NS3" mat_peptideo 6378-6758 Zproduto-'proteina NS4A" mat_peptideo 6759-6827 Zproduto-'proteina 2K" mat_peptideo 6828-7562 Zproduto-'proteina NS4B" mat_peptideo 7563-10262 Zproduto=proteina NS5" sequencia de rDEN4
Figure img0081
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APENDICE 3 Sequencia de cepa de virus quimerico de dengue tipo 2 recombinante rDEN2/4A30 LOCUS Submissao pendente DEFINIQAO clone recombinante de virus de dengue tipo 2 rDEN2/4A30, sequencia completa ACESSO Submissao pendente VERQAO PALAVRAS CHAVE FONTE virus de dengue tipo 2 NGC ORGANISMO virus de dengue tipo 2 Virus; de fita positiva de ssRNA, sem estagio de DNA Flaviviridae; Flavivirus; grupo de virus de dengue. REFERENCE 1 (BASES 1 A 10616) AUTORES TlTULO JORNAL nao publicado CARACTERISTICAS local/qualificadores FONTE 1..10616 Zorganismo-'virus de dengue tipo 2" Zclone=" rDEN2/4A30" mat_peptideo 97..438 Zproduto-'proteina de capsideo ancorado (anchC) mat_peptideo 97..396 Zproduto-'proteina de capsideo de virion (virC) CDS 97.. 10263 Zdocon_iniciar=1 Zproduto-'precursor de poliproteina" /tradugao=
Figure img0085
Figure img0086
mat_peptideo 439..936 /produto=nproteina precursora de membrana (prM) ’’ mat_peptideo 712..936 /produto="proteina de membrana (M)" mat_peptideo 937..2421 /produto=’’proteina de envelope (E) ’’ mat_peptideo 2422..3477 /produto=’’proteina NS1" mat_peptideo 3478..4131 /produto="proteina NS2A" mat_peptideo 4132..4521 /produto=’’proteina NS2B" mat_peptideo 6757..6825 /produto=’’proteina 2K" mat_peptideo 6826..7560 /produto=’’proteina NS4B" mat_peptideo 7561..10260 /produto="proteina NS5" sequencia de Rden2/A30
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APENDICE 4 Alinhamento de poliproteinas de virus de dengue
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*identidade de resíduo .similaridade de resíduo
[00236] Embora a presente invenção tenha sido descrita com alguns detalhes com a finalidade de clareza e entendimento, aquele versado na técnica compreenderá que várias alterações na fórmula e detalhes podem ser feitos sem se desviar do real escopo da invenção. Todas as figuras, tabelas e apêndices, bem como patentes, pedidos e publicações referidos acima estão aqui incorporadas a título de referência.

Claims (14)

1. Vfrus da dengue atenuado CARACTERIZADO pelo fato de que o genoma viral e modificado pela introdugao de uma mutagao carga-agrupamentopara-alanina nos aminoacidos 2687 e 2688 (K2687A; H/Y2688A), que corresponde aos nucleotideos 8160-8165 do isolado prototipico DEN4 Dominica 1981 (SEQ ID NO: 16).
2. Virus da dengue atenuado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende uma delegao de cerca de 30 nucleotideos da regiao nao traduzida 3’ correspondente a estrutura haste-alga TL2, em que os nucleotideos correspondem aos nucleotideos 1047810507 do virus da dengue tipo 4 (SEQ ID NO: 14).
3. Virus da dengue atenuado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o virus da dengue e um virus da dengue tipo 1, virus da dengue tipo 2, virus da dengue tipo 3 ou virus da dengue tipo 4.
4. Virus da dengue atenuado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o virus da dengue e um virus quimerico compreendendo proteinas estruturais de um primeiro virus da dengue e proteinas nao estruturais de um segundo virus da dengue.
5. Virus da dengue atenuado, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o virus quimerico tern proteinas nao estruturais de um virus da dengue tipo 1, um virus da dengue tipo 2, um virus da dengue tipo 3 ou um virus da dengue tipo 4.
6. Composigao farmaceutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um veiculo farmacologicamente aceitavel e um virus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 5.
7. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma composigao farmaceutica, conforme definida na reivindicação 6, em um dispositive de acondicionamento ou dispensador e instrugdes para administragao.
8. Vacina de virus da dengue tetravalente CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vefculo farmacologicamente aceitavel e pelo menos um vfrus da dengue, conforme definido em qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 5, em que a vacina tetravalente compreende um vfrus da dengue tipo 1, um vfrus da dengue tipo 2, um vfrus da dengue tipo 3 e um vfrus da dengue tipo 4.
9. Vacina de vfrus da dengue atenuado vivo CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um veiculo farmacologicamente aceitavel e um vfrus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 5.
10. Vacina de vfrus da dengue atenuado vivo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIDA pelo fato de que esta na forma de dosagem unitaria tendo de cerca de 102 a 109 unidades formadoras de placas (PFU)/mL.
11. Vacina de vfrus da dengue inativado CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um veiculo farmacologicamente aceitavel e um vfrus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 5.
12. Vacina de vfrus da dengue inativado, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que esta na forma de dosagem unitaria tendo de cerca de 0,1 a 50 pg de proteina E/mL.
13. Metodo para preparar um vfrus da dengue CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) sintetizar in vitro o RNA genomico viral de comprimento total usando uma molecula de cDNA que codifica um vfrus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 5; (b) transfectar as celulas cultivadas com o RNA genomico viral para produzir vfrus; e (c) isolar o vfrus das celulas cultivadas.
14. Metodo para preparar uma composicao farmaceutica CARACTERIZADO pelo fato de que e pela combinagao de um veiculo farmacologicamente aceitavel e um virus da dengue conforme definido em qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 5.
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1554301T3 (da) 2002-05-03 2011-01-24 Us Health Dengue-vaccine med en fælles udeladelse af 30 nukleotider i Dengue-typerne 1's og 2's3'UTR
US7851194B2 (en) * 2004-06-14 2010-12-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services West Nile viruses with mutations in the 3′ terminal stem and loop secondary structure for use as live virus vaccines
AU2006239954A1 (en) 2005-04-24 2006-11-02 Acambis Inc. Recombinant flavivirus vaccines
CN101238144B (zh) 2005-06-17 2012-09-05 赛诺菲巴斯德有限公司 登革血清型1减毒株
WO2006134443A1 (en) 2005-06-17 2006-12-21 Sanofi Pasteur Dengue serotype 2 attenuated strain
CU23578A1 (es) * 2005-09-16 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Proteína de la cápsida del virus dengue inductora de respuesta protectora y composición vacunal
FR2906724B1 (fr) 2006-10-04 2009-03-20 Sanofi Pasteur Sa Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue.
US20100316670A1 (en) * 2007-06-14 2010-12-16 Blaney Joseph E Chimeric sle/dengue type 4 antigenic viruses
CA2716399C (en) 2008-03-05 2020-07-21 Pierre Chouvenc Process for stabilizing an adjuvant containing vaccine composition
WO2009152147A2 (en) * 2008-06-09 2009-12-17 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Compositions and methods for dengue virus (dv) treatment and vaccination
EP2143440A1 (fr) 2008-07-09 2010-01-13 Sanofi Pasteur Agent stabilisant et composition vaccinale comprenant un ou plusieurs flavivirus vivants atténués
PE20110992A1 (es) 2009-02-17 2012-02-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica que comprende un antigeno del virus del dengue
WO2010130748A1 (en) * 2009-05-12 2010-11-18 Tibotec Pharmaceuticals Method for identifying inhibitors against dengue virus
EP2438198A4 (en) 2009-06-01 2014-05-14 Inviragen Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DELIVERY OF VACCINES AGAINST DENGUE VIRUS
US8968996B2 (en) 2009-06-01 2015-03-03 Takeda Vaccines, Inc. Compositions and methods for rapid immunization against dengue virus
WO2010144961A1 (en) * 2009-06-17 2010-12-23 Stephen Woodford Determining haemodynamic performance
CA2770888C (en) 2009-08-31 2020-04-14 Gen-Probe Incorporated Dengue virus assay
EP2353609A1 (en) 2010-02-04 2011-08-10 Sanofi Pasteur Immunization compositions and methods
US10308689B2 (en) 2010-06-24 2019-06-04 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Dengue virus (DV) polypeptide sequences, T cell epitopes and methods and uses thereof
US8895028B2 (en) 2012-07-20 2014-11-25 Arbovax, Inc. Methods and compositions for dengue virus 3 (DV3) infectious clone
MY168959A (en) 2012-07-24 2019-01-28 Sanofi Pasteur Vaccine compositions for the prevention of dengue virus infection
AU2014281713A1 (en) 2013-06-21 2015-11-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Dengue virus vaccine compositions and methods of use thereof
CA2938590C (en) 2014-02-11 2023-10-17 Visterra, Inc. Antibody molecules to dengue virus and uses thereof
WO2016037187A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 The Research Foundation For The State University Of New York Recoded arbovirus and vaccines
US10449243B2 (en) 2014-12-22 2019-10-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Dengue virus vaccine compositions and methods of use thereof
US10920288B2 (en) * 2015-01-16 2021-02-16 Takeda Vaccines, Inc. Detection of particle-contained reverse transcriptase activity
WO2017023839A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Immune enhancing recombinant dengue protein
WO2017109698A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic formulation
AU2017230112A1 (en) 2016-03-11 2018-10-04 The Johns Hopkins University Live attenuated Zika virus vaccine
TWI763660B (zh) 2016-03-25 2022-05-11 美商威特拉公司 登革病毒的抗體分子之配方設計
BR112018071176A2 (pt) 2016-04-14 2019-02-12 National University Of Singapore método rápido de produção de vacinas vivas atenuadas
WO2018129160A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Live attenuated flavivirus vaccines and methods of using and making same
AU2018346724A1 (en) 2017-10-05 2020-05-14 Sanofi Pasteur Compositions for booster vaccination against dengu
CN117752780A (zh) 2017-12-07 2024-03-26 默沙东有限责任公司 登革病毒疫苗组合物的制剂

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
US5494671A (en) 1990-08-27 1996-02-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services C-terminally truncated dengue and Japanese encephalitis virus envelope proteins
GB9513371D0 (en) 1995-06-30 1995-09-06 Biocine Spa Immunogenic detoxified mutant toxins
IT1253009B (it) 1991-12-31 1995-07-10 Sclavo Ricerca S R L Mutanti immunogenici detossificati della tossina colerica e della tossina lt, loro preparazione ed uso per la preparazione di vaccini
GB9326174D0 (en) 1993-12-22 1994-02-23 Biocine Sclavo Mucosal adjuvant
US6074865A (en) * 1995-07-20 2000-06-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Recombinant dengue virus DNA fragment
US6455509B1 (en) * 1996-06-04 2002-09-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Dengue nucleic acid vaccines that induce neutralizing antibodies
US6537557B1 (en) * 1999-03-26 2003-03-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Attenuated dengue-4 virus vaccine
KR100721745B1 (ko) * 1999-03-26 2007-05-25 왈터 리드 아미 인스티튜트 오브 리써치 다가 뎅기 바이러스 백신

Also Published As

Publication number Publication date
US10500264B2 (en) 2019-12-10
BR122019026154B8 (pt) 2021-07-27
EP2290108A2 (en) 2011-03-02
CA2448329A1 (en) 2002-11-28
EP2290109A2 (en) 2011-03-02
CA2755964A1 (en) 2002-11-28
DK2290108T3 (da) 2014-10-20
CA3060687A1 (en) 2002-11-28
BR0209943A (pt) 2004-03-30
ES2523168T3 (es) 2014-11-21
USRE45053E1 (en) 2014-07-29
ES2533085T3 (es) 2015-04-07
DK2292802T3 (en) 2015-03-09
BRPI0209943B1 (pt) 2020-10-13
US20050010043A1 (en) 2005-01-13
USRE45123E1 (en) 2014-09-09
DK2290109T3 (da) 2014-11-10
EP1402075A4 (en) 2005-05-11
BRPI0209943B8 (pt) 2021-05-25
CA3114957A1 (en) 2002-11-28
CA3060687C (en) 2021-05-04
USRE45016E1 (en) 2014-07-15
US11318196B2 (en) 2022-05-03
EP1402075B1 (en) 2012-11-14
AU2002312011B2 (en) 2008-04-24
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