ES2399420T3 - Desarrollo de mutaciones útiles para atenuar virus del dengue y virus del dengue quiméricos - Google Patents

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Abstract

Un virus del dengue que tiene un fenotipo en el que el genoma vírico se modifica por la introducción de unamutación tomada del grupo que consiste en las mutaciones de la tabla 37, en la que dicha mutación es unamutación de carga-agrupada-a-alanina 200, 201.

Description

Desarrollo de mutaciones útiles para atenuar virus del dengue y virus del dengue quiméricos
Campo de la invención
Se desarrolló un menú de mutaciones que es útil en el ajuste de las características de atenuación y crecimiento de 5 vacunas del virus del dengue.
Antecedentes de la invención
El virus del dengue es un virus de ARN de sentido positivo que pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. El virus del dengue está ampliamente distribuido en todas las regiones tropicales semitropicales del mundo y se transmite a los seres humanos por mosquitos vectores. El virus del dengue es una causa principal de 10 hospitalización y muerte en niños en al menos otro países asiáticos tropicales (WHO, 1997. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment prevention and control -2ª ed. Geneva: WHO). Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4) que anualmente provocan 50 -100 millones de casos estimados de fiebre por dengue y 500.000 casos de la forma más grave de la infección por el virus del dengue, fiebre hemorrágica por dengue/síndrome que choque por dengue (DHF/DSS) (Gubler, D.J. & Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53:35-70). La 15 DHF/DSS se ve predominantemente en niños y en adultos que experimentan una segunda infección por el virus del dengue con un serotipo diferente al de su primera infección por el virus del dengue y en una infección principal en lactantes que aún tienen anticuerpos maternos específicos del dengue en circulación (Burke, D.S. et al. 1988 Am JTrop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72). Se necesita una vacuna para disminuir el grado de enfermedad provocada por el virus del 20 dengue, pero no está disponible ninguna. Debido a la asociación de una enfermedad más grave con una infección por el virus del dengue secundaria, una vacuna exitosa debe inducir inmunidad para los cuatro serotipos. La inmunidad está mediada principalmente por un anticuerpo neutralizante dirigido contra la glucoproteína E de la envoltura, una proteína estructural viriónica. La infección con un serotipo induce inmunidad homotípica de larga duración y una inmunidad heterotípica de corta duración (Sabin, A. 1955 Amer J Trop Med Hyg 4:198-207). Por lo 25 tanto, el objetivo de la inmunización es inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes de larga duración contra DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4, que se puede lograr mejor económicamente usando vacunas de virus vivos atenuados. Este es un objetivo razonable puesto que ya se ha desarrollado una vacuna atenuada para el virus de la fiebre amarilla relacionado, otro flavivirus transmitido por mosquitos presente en regiones tropicales y semitropicales del mundo (Monath, T.P. & Heinz, F.X. 1996 en: Fields B.N. et al. eds. Fields Virology Philadelphia: Lippincott-Ravan
30 Publishers, 961-1034).
Se han desarrollado y evaluado diversos candidatos a vacunas del dengue vivo atenuado en seres humanos o en primates no humanos. Los primeros candidatos a vacunas del dengue vivo atenuado fueron mutantes de la gama de huéspedes desarrollados por el paso en serie de virus del dengue naturales en los cerebros de ratones y la selección de mutantes atenuados para seres humanos (Kimura, R. & Hotta, S. 1944 Japanese J Bacteriology 1:9635 99; Sabin, A.B. & Schlesinger, R.W. 1945 Science 101:640; Wisseman, C.L. Jr. et al. 1963 Am J Trop Med 12:620623). Aunque estos virus de vacunas candidatas fueron inmunógenos en seres humanos, su escaso crecimiento en cultivo celular evitó un desarrollo posterior. Se han desarrollado candidatos a vacunas de DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4 vivos atenuados adicionales por el paso en serie en cultivo de tejidos (Angsubhakorn, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trop Med Public Health 25:554-9; Bancroft, W.H. et al. 1981 Infect Immim 31:698-703; 40 Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ 65:189-95; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Hoke, C.H. Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43:219-26; Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:317988) o por mutagénesis química (McKee, K.T. Jr. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42). Se ha demostrado que es muy difícil lograr un equilibrio satisfactorio entre la atenuación y la inmunogenicidad para cada uno de los cuatro serotipos del virus del dengue usando estos enfoques y formular una vacuna tetravalente que sea segura e
45 inmunógena de forma satisfactoria contra cada uno de los cuatro virus del dengue (Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-88; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18 Supl 2: 44-7).
Recientemente, dos avances principales que utilizan tecnología de ADN recombinante han hecho posible el desarrollo de candidatos a vacunas del virus del dengue vivo atenuado prometedores adicionales. En primer lugar, se han desarrollado procedimientos para recuperar virus del dengue infecciosos a partir de células transfectadas con 50 transcritos de ARN derivados de un clon de ADNc de longitud completa del genoma del virus del dengue, haciendo posible de este modo derivar virus infecciosos que llevan mutaciones atenuantes que se han introducido en el clon de ADNc por mutagénesis dirigida a sitio (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-43). En segundo lugar, es posible producir virus quiméricos antigénicos en los que la región codificante de proteína estructural del clon de ADNc de longitud complete se reemplaza por la de un serotipo del virus del dengue diferente o de un flavivirus más divergente
55 (Bray, M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88: 10342-6; Chen, W. et al. 1995 J Virol 69:5186-90; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS USA 95:1746-51). Estas técnicas se han usado para construir virus del dengue quiméricos intertípicos que han demostrado que son eficaces en la protección de monos contra un desafío de virus del dengue homólogo (Bray, M. et al. 1996 J Virol 70:4162-6):
Los datos de secuencias del clon recombinante del virus del dengue de tipo 4, rDEN4del30 y rDEN4 se pueden recuperar de la base de datos de NCBI, número de referencia: AF326827 y AF326825, respectivamente. Los mutantes de deleción en la región no codificante 3' del virus del dengue de tipo 4 se describieron en Men, R. et al. 1996 J Virol 70: 3930-37. Además, un virus del dengue de tipo 4 recombinante como candidato a vacuna con una deleción en la 3' UTR (que abarca los nucleótidos de 173 a 142 del extremo 3' terminal) se describió por Durbin, A.P.
5 2000 Clin Infect Dis 31: 223.
A pesar de estos avances, existe una necesidad de desarrollar vacunas de virus del dengue atenuado antigénicas que especifiquen un equilibrio satisfactorio ente la atenuación y la inmunogenicidad para los seres humanos.
Sumario de la invención
Se describen mutaciones que confieren sensibilidad a la temperatura en células Vero o células de hígado humanas,
10 restricción huésped-célula en células de hígado humanas o de mosquito, adaptación huésped-célula para la replicación mejorada en células Vero, o la atenuación en ratones, mutaciones que son útiles en el ajuste de las características de atenuación y crecimiento de las vacunas del virus del dengue.
La invención proporciona en un primer aspecto un virus del dengue que tiene un fenotipo en el que el genoma vírico se modifica por la introducción de una mutación tomada del grupo que consiste en las mutaciones de la tabla 37, en
15 la que dicha mutación es una mutación de carga-agrupada-a-alanina 200, 201. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el virus del dengue de acuerdo con la presente invención y su uso para la preparación de una composición farmacéutica para producir anticuerpos neutralizantes contra el virus del dengue. Se proporciona además un procedimiento de preparación de un virus del dengue de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
20 La figura 1 muestra el crecimiento de DEN4 2A wt y del candidato a vacuna, 2AΔ30, en células Vero y HuH-7. Se infectaron células Vero (A) o HuH-7 (B) con DEN4 2A o 2AΔ30 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 o 0,01. Se lavaron monocapas de células confluentes en matraces de cultivo de tejidos de 25 mm y se recubrieron con un inóculo de 1,5 ml que contenía el virus indicado. Después de una incubación de dos horas a 37 ºC, se lavaron tres veces las células en PBS y se añadieron 7 ml de medio de cultivo complementado con FBS al 2 %. Se retiró una
25 alícuota de 1 ml de medio de cultivo de tejido, se reemplazó con medio recién preparado y se designó el punto temporal de 0 horas.
En los puntos temporales indicados post-infección, se retiraron muestras de medios de cultivo de tejido y se congelaron a -70 ºC. Se sometió a ensayo el nivel de replicación vírica por valoración de placa en células Vero. En resumen, se inocularon diluciones de diez veces en serie de muestras de medios de cultivo celular sobre monocapas
30 de células Vero confluentes en placas de 24 pocillos por duplicado y se recubrieron con Opti-MEM que contenía metilcelulosa al 0,8 %. Después de cinco días, se visualizaron las placas por tinción con inmunoperoxidasa como se describe en el ejemplo 1.
La figura 2 muestra la generación virus DEN4 sensibles a la temperatura (ts) por mutagénesis química de 5fluorouracilo (5-FU). Se derivó el virus DEN4 2A natural (wt) de un clon de ADNc de la cepa de DEN4 814669 35 (Dominica, 1981). Se infectaron células Vero con DEN4 2A y se recubrieron con medio de cultivo que contenía 5fluorouracilo (5-FU) 1 mM lo que dio como resultado una reducción de aproximadamente 100 veces la replicación vírica cuando se comparó con controles no tratados. La progenie vírica de los cultivos tratados con 5-FU 1 mM se sometió a una ronda individual de diluciones terminales que generaron 1.248 virus clonados biológicamente que se cribaron para determinar fenotipos ts evaluando la replicación del virus a 35 ºC y 39 ºC en células Vero y HuH-7. Los
40 clones de virus que demostraron una reducción de 100 veces o más en el valor a 39 ºC se diluyeron terminalmente dos veces adicionales y se amplificaron en células Vero. Los fenotipos sensibles a la temperatura de los virus clonados biológicamente se confirmaron evaluando la eficacia de la formación de placa (EOP) en las células indicadas como se describe en el ejemplo 1.
La figura 3 muestra fenotipos de tamaño de placa de virus DEN4 mutantes de 5-FU representativos. Se inocularon
45 diluciones de diez veces en serie de DEN4 2A-13 (A) natural, virus mutantes de 5-FU n.º 569 y n.º 1189 (B), y virus mutantes de 5-FU n. 1083 y n.º 311 (C) sobre monocapas de células Vero y HuH-7 confluentes en placas de 24 pocillos. Después de la incubación a 35 ºC durante dos horas, se recubrieron las monocapas con medio de cultivo de metilcelulosa al 0,8 %. Después de la incubación a 35 ºC durante cinco días, se visualizaron las placas por tinción con inmunoperoxidasa. Los virus que tenían un tamaño de placa que era ≤1 mm (aproximadamente ≤50 % el
50 tamaño de DEN4 2A-13 wt) a la temperatura permisiva de 35 ºC se designaron como con el fenotipo de placa pequeña (sp). Los virus mutantes n.º 569 y n.º 1189 (B) fueron sp en ambas células Vero y HuH-7, y n.º311 y n.º 1083 (C) fueron sp sólo en células HuH-7.
La figura 4 muestra la generación de virus DEN4 recombinantes. (A), Se representa el clon de ADNc p4 que se construyó a partir del clon de ADNs 2A (derivado de DEN4 814669) por mutagénesis dirigida a sitio. Se introdujeron 55 o se retiraron sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación posterior de recombinantes de DEN4 que llevan mutaciones atenuantes introducidas. Se muestran sitios de enzimas de restricción y definen fragmentos del genoma que se subclonaron en vectores pUC-119 modificados por mutagénesis dirigida a sitio para introducir mutaciones identificadas en los virus mutantes de 5-FU. (B), En el ejemplo 1 también se representa y se describe un
resumen de los procedimientos usados para generar virus rDEN4.
La figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos del gen rDEN4 NS5 (SEQ ID NO: 1). Se sometieron a mutagénesis ochenta pares de aminoácidos subrayados para determinar pares de alanina; 32 pares en negrita representan virus mutantes que se pudieron recuperar en células Vero o C6/36; los pares con tipo de letra normal representan virus
5 mutantes que no se pudieron recuperar en células Vero o bien C6/36. Las regiones encuadradas indican dominios funcionales putativos, incluyendo un dominio metiltransferasa que utiliza S-adenosilmetionina (SAM), un dominio de unión a importina-β adyacente a una secuencia de localización nuclear (importina-β -unión + NLS) y un dominio de ARN polimerasa dependiente de ARN (Polimerasa).
La figura 6 muestra el tamaño de placa de 5-1A1 mutante en células C6/36. Cabe destacar que 5-1A1 tiene un 10 fenotipo de placa pequeño en célula C6/36 con relación al del virus natural.
La figura 7 muestra el crecimiento de rDEN4 natural y 5-1A1 en células C6/36. Se inocularon las células por triplicado con cada virus a una MOI de 0,01, y la cantidad de virus presente en los sobrenadantes que se recogieron los días indicados se determinó por enumeración de placas en células Vero. Los valores se expresan como log10PFU/ml ± error estándar.
15 La figura 8 muestra la alineación de nucleótidos de la 3' UTR de flavivirus transmitidos por mosquitos y transmitidos por garrapatas. Las secuencias de ADNc se muestran de 5' a 3' y representan una porción de la UTR correspondiente a los nucleótidos de DEN4 de 10417 a 10649 (extremo del genoma 3'). La numeración de nucleótidos representa la posición en la alineación. Las regiones eliminadas o intercambiadas se indican usando la numeración de nucleótidos de DEN4. Números de referencia de GenBank para los virus transmitidos por mosquitos:
20 DEN4 (SEQ ID NO: 2): AF326825, DEN1 (SEQ ID NO: 3): U88535, DEN2 (SEQ ID NO: 4): AF038403, DEN3 (SEQ ID NO: 5): M93130, virus del Nilo occidental (WN) (SEQ ID NO: 6): M12294, virus de la encefalitis japonesa (JE) (SEQ ID NO: 7): AF315119, virus de la fiebre amarilla (YF) (SEQ ID NO: 8): U17067; números de referencia de GenBank para virus transmitidos por garrapatas: virus Powassan (POW) (SEQ ID NO: 9): L06436, virus de la encefalomielitis ovina (LI) (SEQ ED NO: 10): Y07863, virus de encefalitis que portan las garrapatas (TBE) (SEQ ID
25 NO: 11): U27495, y virus de Langat (LGT) (SEQ ID NO: 12): AF253419.
La figura 9 muestra el mapa genético del plásmido p4. El ADNc del dengue se muestra como una línea gruesa, con la región de C-prM-E intercambiada durante la construcción de los ADNc de virus del dengue quiméricos indicados.
La figura 10 muestra fenotipos de tamaño de placa de virus rDEN4 que codifican mutaciones de adaptación a Vero. Se inocularon diluciones de tres veces en serie de los virus indicados sobre monocapas de células Vero y C6/36
30 confluentes en placas de 6 pocillos. Después de la incubación a 37 ºC (Vero) o 32 ºC (C6/36) durante dos horas, se recubrieron las monocapas con medio de cultivo de metilcelulosa al 0,8 %. Después de la incubación durante cinco días, se visualizaron las placas por tinción con inmunoperoxidasa. Los valores debajo de cada pocillo son los promedios del tamaño de placa en mm ± error estándar. Para cada uno de los pocillos infectados con virus, se midieron 36 placas en imagen digital de la placa de 6 pocillos en Adobe Photoshop a una vista de 300 %.
35 La figura 11 muestra la curva de crecimiento en células Vero de virus rDEN4 que codifican mutaciones de adaptación a Vero individuales. Se infectaron células Vero con los virus indicados a una MOI de 0,01. Se lavaron monocapas de células confluentes en matraces de cultivo de tejido de 25 cm2 y se recubrieron con un inóculo de 1,5 ml que contenía el virus indicado. Después de una incubación de dos horas a 37 ºC, se lavaron tres veces las células en PBS y se añadieron 5 ml de medio de cultivo complementado con FBS al 2 %. Se retiró una alícuota de 1
40 ml de medio de cultivo de tejido, se reemplazó con medio recién preparado y se designó el punto temporal de 0 horas. En los puntos temporales indicados post-infección, se retiraron muestras de medios de cultivo de tejido, se aclararon y se congelaron a -70 ºC. Se sometió a ensayo el nivel de replicación de virus por valoración de placa en células Vero. En resumen, se inocularon diluciones de diez veces en serie de muestras de medios de cultivo celular sobre monocapas de células Vero confluentes en placas de 24 pocillos por duplicado y se recubrieron con Opti-MEM
45 que contenía metilcelulosa al 0,8 %. Después de cinco días, se visualizaron las placas por tinción con inmunoperoxidasa como se describe en el ejemplo 1. El límite de detección (L.O.D.) es ≥ 0,7 log10PFU/ml.
La figura 12 muestra la curva de crecimiento en células Vero de virus rDEN4 que codifican mutaciones de adaptación a células Vero combinadas. Se infectaron células Vero con los virus indicados a una MOI de 0,01. Se lavaron monocapas de células confluentes en matraces de cultivo de tejido de 25 cm2 y se recubrieron con un 50 inóculo de 1,5 ml que contenía el virus indicado. Después de una incubación de dos horas a 37 ºC, se lavaron tres veces las células en PBS y se añadieron 5 ml de medio de cultivo complementado con FBS al 2 %. Se retiró una alícuota de 1 ml de medio de cultivo de tejido, se reemplazó con medio recién preparado y se designó el punto temporal de 0 horas. En los puntos temporales indicados post-infección, se retiraron muestras de medios de cultivo de tejido, se aclararon y se congelaron a -70 ºC. Se sometió a ensayo el nivel de replicación de virus por valoración
55 de placa en células Vero. El límite de detección (L.O.D.) es ≥ 0,7 log10PFU/ml.
Breve descripción de las tablas
Tabla 1. La susceptibilidad de ratones a infección de DE4 intracerebral es dependiente de la edad.
Tabla 2. Fenotipos sensibles a la temperatura (ts) y de atenuación de cerebro de ratón (att) de virus DEN4 mutantes
de 5-FU. Tabla 3. Diferencias de nucleótidos y aminoácidos de los virus mutantes de 5-FU que son ts en ambas células Vero y HuH-7.
5 Tabla 4. Diferencias de nucleótidos y aminoácidos de los virus mutantes de 5-FU que son ts sólo en células HuH-7. Tabla 5. Mutaciones que se representan en virus DEN4 mutantes de 5-FU múltiples. Tabla 6. La adición de la mutación de ts 4995 a rDEN4Δ30 confiere un fenotipo ts y además atenúa su replicación
en cerebro de ratón lactante. Tabla 7. Fenotipos sensibles a la temperatura (ts) de atenuación de cerebro de ratón (att) de virus mutantes de 5-FU 10 DEN4 que presentan un fenotipo de placa pequeña (sp).
Tabla 8. Los virus con ambos fenotipos ts y sp son más limitados en replicación en el cerebro de ratón que los que sólo tienen un fenotipo ts. Tabla 9. Diferencias de nucleótidos y aminoácidos de los virus DEN4 mutantes de 5-FU que producen placas
pequeñas en ambas células Vero y HuH-7.
15 Tabla 10. Diferencias de nucleótidos y aminoácidos de los virus DEN4 mutantes de 5-FU que producen placas pequeñas sólo en células HuH-7. Tabla 11. Mutaciones de adaptación de células Vero putativas derivadas del conjunto completo de virus mutantes de
5-FU. Tabla 12. Oligonucleótidos mutagénicos usados para generar virus DEN4 recombinantes que contienen mutaciones 20 de 5-FU individuales.
Tabla 13. Fenotipos sp, ts y de atenuación de ratón de virus mutantes de rDEN4 que codifican mutaciones individuales identificadas en seis virus mutantes de 5-FU sp. Tabla 14. Fenotipos de virus mutantes de rDEN4 que codifican mutaciones individuales identificadas en 10 virus
mutantes de 5-FU que son ts en ambas células Vero y HuH-7.
25 Tabla 15. Fenotipos sp, ts y de atenuación de ratón de virus mutantes de rDEN4 que codifican mutaciones individuales identificadas en 3 virus mutantes de 5-FU ts específicos de células HuH-7. Tabla 16. Fenotipos sensibles a la temperatura (ts) y se atenuación de cerebro de ratón (att) de virus rDEN4
adicionales que codifican mutaciones de 5-FU individuales. Tabla 17. Crecimiento de DEN-4 2A-13 wt en ratones SCID trasplantados con células HuH-7.
30 Tabla 18. La combinación de mutaciones ts, NS3 4995 y NS5 7849, en rDEN4 da como resultado un fenotipo ts aditivo. Tabla 19. Las mutaciones de 5-FU son compatibles con la mutación Δ30 para la replicación en el cerebro de ratones
lactantes. Tabla 20. Fenotipos sensibles a la temperatura y de atenuación de cerebro de ratón de virus que llevan mutaciones 35 de carga-agrupada-a-alanina en el gen NS5 de DEN4.
Tabla 21. Fenotipos de atenuación de SCID-HuH-7 de virus que llevan mutaciones de carga-agrupada-a-alanina en el gen NS5 de DEN4. Tabla 22. Combinación de mutaciones de carga-agrupada-a-alanina emparejadas en virus mutantes de pares
dobles.
40 Tabla 23. Fenotipos sensibles a la temperatura y de atenuación de cerebro de ratón de mutantes de cargaagrupada-a-alanina doble del gen NS5 de rDEN4. Tabla 24. Fenotipos de atenuación de SCID-HuH-7 de mutantes de carga-agrupada-a-alanina doble del gen NS5 de
rDEN4. Tabla 25. Fenotipos (sensibilidad a la temperatura, tamaño de plaza y replicación en cerebro de ratón y ratones 45 SCID-HuH-7) de DEN4 wt y virus que contienen las mutaciones de Δ30 y 7129. Tabla 26. El mutante de placa pequeña 5-1A1 de 5-fluorouracilo demuestra una restricción de infección del intestino
medio tras infección oral de mosquitos Aedes aegypti.
Tabla 27. El mutante de placa pequeña 5-1A1 de 5-fluorouracilo demuestra una restricción de infección tras inoculación intratorácica de mosquitos Toxorhynchites splendens.
Tabla 28. Cebadores de mutagénesis para la deleción o intercambio de secuencias en DEN4 que muestran 5 diferencias conservadas de flavivirus transmitidos por garrapatas.
Tabla 29. Valor del virus y tamaño de placa de virus mutantes de 3' UTR en células Vero y C6/36.
Tabla 30. Infectividad de mutantes de DEN4 wt y 3' UTR para Toxorhynchites splendens por medio de inoculación intratorácica.
Tabla 31. Infectividad de virus mutantes de intercambio de 3' UTR para Aedes aegypti alimentado con sangre 10 ingerida infecciosa.
Tabla 32. Mutaciones de adaptación de células Vero putativas derivadas del conjunto de virus mutantes de 5-FU y otros virus DEN4 pasados en células Vero.
Tabla 33. Análisis de la secuencia del clon rDEN2/4Δ30 27(p4)-2-2A2.
Tabla 34. Análisis de la secuencia del clon rDEN2/4Δ30 27(p3)-2-1A1.
15 Tabla 35. El virus recombinante rDEN2/4Δ30 que lleva mutaciones de adaptación a Vero se puede recuperar y valorar en células Vero.
Tabla 36. Mutaciones de adaptación de células Vero putativas del virus de tipo 4 del dengue y el correspondiente residuo aminoacídico natural en otros virus del dengue.
Tabla 37. Mutaciones conocidas por atenuar el virus de tipo 4 del dengue y el correspondiente residuo aminoacídico 20 natural en otros virus del dengue.
Breve descripción de los apéndices
Apéndice 1. Secuencia de la cepa de virus de tipo 4 del dengue recombinante 2A (secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 14).
Apéndice 2. Secuencia de la cepa de virus de tipo 4 del dengue recombinante rDEN4 (secuencia de aminoácidos 25 SEQ ID NO: 15 y secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 16).
Apéndice 3. Secuencia de la cepa de virus quimérico de tipo 2 del dengue recombinante rDEN2/4Δ30 (secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17 y secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18).
Apéndice 4. Alineación de poliproteínas del virus del dengue. DEN4 (SEQ ID NO: 19); DEN1-WP (SEQ ID NO: 20); DEN2-NGC (SEQ ID NO: 21); DEN3-H87 (SEQ ID NO: 22).
30 Descripción detallada
Para montar una colección de mutaciones útiles para la incorporación en vacunas de virus del dengue vivo recombinante, se usaron técnicas de mutagénesis dirigida a sitio y aleatoria para introducir mutaciones en el genoma del virus del dengue. Se cribaron los virus mutantes resultantes para determinar los diversos fenotipos valiosos, incluyendo sensibilidad a la temperatura en células Vero o en células hepáticas humanas, restricción de células 35 huésped en células de mosquito o células hepáticas humanas, adaptación huésped-célula para una replicación mejorada en células Vero, y atenuación en ratones. La base genética para cada fenotipo observado se determinó por análisis de secuencias directo del genoma del virus. Las mutaciones identificadas a través de estos esfuerzos de secuenciación se han evaluado adicionalmente por su reintroducción, individualmente, o en combinación, en virus del dengue recombinante y la caracterización de los fenotipos resultantes. De esta manera, se desarrolló un menú
40 de mutaciones que es útil en el ajuste de las características de atenuación y crecimiento de vacunas del virus del dengue.
Ejemplo 1
La mutagénesis química del virus del dengue de tipo 4 proporciona virus mutantes sensibles a la temperatura y atenuados
45 Se descubrió previamente que un candidato a vacuna del virus del dengue de tipo 4 (DEN4) vivo atenuado recombinante, 2AΔ30, en general, era bien tolerado en los seres humanos, pero en algunos vacunados se produjo un sarpullido y una elevación de enzimas hepáticas en el suero. 2AΔ30, un virus no sensible a la temperatura (ts), contiene una deleción de 30 nucleótidos en la región no traducida (UTR) en 3' del genoma vírico. En el presente estudio, se ha utilizado la mutagénesis química de DEN4 para generar mutaciones atenuantes que pueden ser útiles para atenuar adicionalmente la vacuna del candidato 2AΔ30 atenuada de forma incompleta. Se hizo crecer el virus DEN4 2A natural en células Vero en presencia de 5-fluorouracilo, y, a partir de un panel de 1.248 clones que se aislaron en células Vero, se identificaron veinte virus mutantes ts que eran ts en ambas células Vero y HuH-7 (n = 13) o sólo en células HuH-7 (n = 7). Cada una de las veinte mutaciones ts poseía un fenotipo de atenuación (att)
5 como se indica por la replicación restringida en los cerebros de ratones de siete días de edad. La secuencia de nucleótidos completa de los 20 virus mutantes ts identificó sustituciones de nucleótidos en genes estructurales y no estructurales así como en la 5' y 3' UTR produciéndose más de un cambio, por virus mutante. Se introdujo una mutación ts en la proteína NS3 (posición de nucleótido 4.995) en un virus DEN4 recombinante que poseía la deleción de Δ30 creando el virus recombinante rDEN4Δ30-4995 que se descubrió que era ts y que estaba más atenuado que rDEN4Δ30 en los cerebros de los ratones. Se está montando un menú de mutaciones atenuantes que puede ser útil en la generación satisfactoria de virus para vacunes del dengue recombinante atenuado y en el incremento de la comprensión de la patogénesis del virus del dengue.
Los virus del dengue (DEN) transmitidos por mosquitos (serotipos de 1 a 4) son miembros del género Flavivirus y contienen un genoma de ARN en sentido positivo monocatenario de aproximadamente 10.600 nucleótidos (nt) 15 (Monath, T.P. & Heinz, F.X. 1996 en: Fields Virology B.N. Fields, et al Eds. pp. 961-1034 Lippincott-Ravan Publishers, Philadelphia). La organización del genoma de los virus DEN es 5'-UTR-C-prM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3' (UTR -región no traducida, C -cápside, PrM -pre-membrana, E -envoltura, NS -no estructural) (Chang, G.-J. 1997 en: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno, eds. p. 175-198 CAB International, New York; Rice, C.M. 1996 en: Fields Virology B.N. Fields et al. Eds. p. 931-959 Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia). Un polipéptido vírico individual se procesa cotraduccionalmente por proteasas víricas y celulares que generan tres proteínas estructurales (C, M y E) y siete proteínas NS. El grado de enfermedad asociado con la infección del virus DEN se ha incrementado durante las últimas décadas en países tropicales y semitropicales. Anualmente, existen 50-100 millones de casos estimados de fiebre por dengue (DF) y 500.000 casos de las más graves y potencialmente mortales fiebre hemorrágica por dengue / síndrome de choque por dengue (DHF/DSS)
25 (Gubler, DJ. & Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53:35-70).
El sitio de replicación vírica en seres humanos infectados por el virus DEN y la patogénesis de DF y DHF/DSS aún no se entienden completamente (Innis, B.L. 1995 en: Exotic viral infections J.S. Porterfield, ed. p. 103-146 Chapman and Hall, London). En seres humanos, el virus DEN infecta los linfocitos (Kurane, I. et al. 1990 Arch Virol 110:91-101; Theofilopoulos, A.N. et al. 1976 J Immunol 117:953-61), macrófagos (Halstead, S.B. et al. 1977 J Exp Med 146:21829; Scott, R.M. et al. 1980 J Infect Dis 141:1-6), células dendríticas (Libraty, D.H. et al 2001 J Virol 75:3501-8; Wu,
S.J. et al. 2000 Nat Med 6:816-20), y hepatocitos (Lin, Y.L. et al. 2000 J Med Virol 60:425-31; Marianneau, P. et al. 1996 J Gen Virol 77:2547-54). El hígado está claramente implicado en la infección por el virus DEN de los seres humanos, como se indica por la aparición de elevaciones transitorias en los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en suero en la mayoría de los pacientes infectados con el virus del
35 dengue y por la presencia de hepatomegalia en algunos pacientes (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:31321; Kuo, C.H. et al. 1992 Am J Trop Med Hyg 47:265-70; Mohan, B. et al. 2000 J Trop Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al. 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259-63). Se observan hepatocitos positivos en antígenos del virus DEN rodeando áreas de necrosis en el hígado de casos mortales (Couvelard, A. et al. 1999 Hum Pathol 30:1106-10; Huerre, M.R. et al. 2001 Virchows Arch 438:107-15), y se identificaron secuencias del virus del dengue en dichos casos usando RT-PCR (Rosen, L. et al. 1999 Am J Trop Med Hyg 61:720-4). De importancia potencial para la etiología de la infección por virus del dengue grave, tres estudios han demostrado que los niveles medios de ALT/AST en suero se incrementaron significativamente en pacientes con DHF/DSS frente a los pacientes con DF (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Mohan, B. et al. 2000 J Trop Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al. 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259-63).
45 En estos momentos, no está disponible una vacuna para los virus DEN. Puesto que la infección previa con un serotipo del virus del dengue puede incrementar el riesgo de DHF/DSS después de la infección con un serotipo diferente (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18:997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72), queda claro que una vacuna para el virus del dengue necesitará proteger contra cada uno de los cuatro serotipos del virus del dengue, concretamente DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4. Actualmente, se están llevando a cabo activamente varias estrategias en el desarrollo de una vacuna del virus DEN vivo atenuado tetravalente (Bancroft, W.H. et al. 1984 J Infect Dis 149:1005-10; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44-7; Guirakhoo, F. et al. 2000 J Virol 74:5477-85; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). Recientemente, se ha demostrado que un candidato a vacuna de DEN vivo atenuado, 2AΔ30, estaba atenuado y era inmunógeno en un grupo de 20 voluntarios humanos (véase el ejemplo 8). Este virus
55 DEN4 recombinante contiene una deleción de 30 nt en la 3'UTR que retira los nucleótidos 10.478-10.507 y estaba restringido en replicación en monos rhesus. Los niveles de viremia en seres humanos eran bajos o indetectables, y el virus recuperado de los vacunados conservó la mutación Δ30. Se informó de un sarpullido asintomático en un 50 % de los pacientes. La única anomalía de laboratorio observada fue un aumento transitorio, asintomático en el nivel de ALT en suero en 5 de los 20 vacunados. Todos los vacunados desarrollaron anticuerpos neutralizantes en suero contra el virus DEN4 (valor medio: 1:580). De forma importante, 2AΔ30 no se transmitió a los mosquitos alimentados de los vacunados y tiene propiedades de crecimiento restringidas en mosquitos (Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:414-9). La presencia de un sarpullido y de los niveles de ALT elevados sugiere que el candidato a vacuna 2AΔ30 es ligeramente menos atenuado en los seres humanos. Debido al conjunto global de propiedades deseables conferidas por la mutación Δ30, se construyen candidatos a vacuna que contienen los genes estructurales del virus del dengue de tipo 1, 2 y 3 y el esqueleto atenuado de DEN4 que lleva la mutación Δ30 estable genéticamente.
Aunque los hallazgos iniciales indican la utilidad del candidato a vacuna 2AΔ30, muchos intentos previos de
5 desarrollar vacunas del virus del dengue vivo atenuado han proporcionado candidatos a vacuna que estaban sobreatenuados o menos atenuados en seres humanos (Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 in: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80; McKee, K.T., Jr. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42). Por lo tanto, se desarrolló un menú de mutaciones puntuales que confería fenotipos
10 sensibles a la temperatura (ts) y de atenuación (att) sobre DEN4. Se prevé que estas mutaciones son útiles para atenuar virus DEN4 en diferentes grados y, por lo tanto, tienen un propósito en el ajuste del nivel de atenuación de candidatos a vacuna tales como 2AΔ30. Se prevé que la adición de dichas mutaciones a 2AΔ30 o a otros candidatos a vacuna del virus del dengue dé como resultado la generación de un candidato a vacuna que presenta un equilibrio satisfactorio entre la atenuación y la inmunogenicidad para seres humanos.
15 En el presente ejemplo, se ha utilizado la mutagénesis química de DEN4 para identificar mutaciones puntuales que confieren el fenotipo ts, puesto que dichos virus a menudo están atenuados en los seres humanos. Adicionalmente, debido a la presunta implicación del hígado en la infección por dengue natural y a los niveles de ALT elevados en un subconjunto de vacunados con 2AΔ30, también se evaluaron virus DEN4 mutagenizados para determinar el fenotipo ts en células de hígado HuH-7 derivadas de un hepatoma humano. Aquí, se describe la identificación de 20 virus
20 mutantes ts de DEN4 de los que cada uno se replica eficazmente en células Vero, el sustrato propuesto para la fabricación de la vacuna y de los que cada uno está atenuado en ratones. Finalmente, se demuestra la viabilidad de la modificación del fenotipo de atenuación del candidato a vacuna 2AΔ30 por la introducción de una mutación puntual en NS3.
Células y virus. Se mantuvieron células Vero WHO (células de riñón de mono verde africano) en MEM (Life
25 Technologies, Grand Island, NY) complementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS) (Summit Biotechnologies, Fort Collins, CO), L-glutamina 2 mM (Life Technologies) y 0,05 mg/ml de gentamicina (Life Technologies). Se mantuvieron células HuH-7 (células de hepatoma humano) (Nakabayashi, H. et al. 1982 Cancer Res 42:3858-63) en D-MEM/F-12 (Life Technologies) complementado con FBS al 10 %, L-glutamina 1 mM y 0,05 mg/ml de gentamicina. Se mantuvieron células C6/36 (células de mosquito Aedes albopictus) en MEM completo como se describe
30 anteriormente complementado con aminoácidos no esenciales 2 mM (Life Technologies).
Se derivó el virus DEN4 2A natural (wt) a partir de un clon de ADNc de la cepa DEN4 814669 (Dominica, 1981) (Men, R. et al. J Virol 70:3930-7). La secuencia del ADNc del virus DEN4 2A se presenta en el apéndice 1. El clon de ADNc 2A de longitud completa ha sufrido varias modificaciones posteriores para mejorar su capacidad para manipularse genéticamente. Como se describe previamente, se modificó un sitio de enzima de restricción Xhol 35 traduccionalmente inactivo próximo al extremo de la región E en el nucleótido 2348 para crear el clon 2A-Xhol (Bray,
M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). Se modificó adicionalmente la secuencia codificante vírica del clon de ADNc 2A-XhoI usando mutagénesis dirigida a sitio para crear el clon p4: se introdujo un sitio de restricción de BbvCI único cerca de la unión C-prM (nucleótidos 447 -452); se extirpó un sitio de restricción de Xbal extra por mutación del nucleótido 7730; y se creó un sitio de restricción de SacR único en la región NS5 (nucleótidos 9318 -9320). 40 Cada una de estas mutaciones modificadas es traduccionalmente inactiva y no cambia la secuencia de aminoácidos del polipéptido vírico. Además, se realizaron varias mutaciones en la región de vector del clon p4 para introducir o extirpar sitios de restricción adicionales. Se generó el clon de ADNc p4Δ30 introduciendo la mutación Δ30 en el clon p4. Esto se llevó a cabo reemplazando el fragmento Mlul -Kpnl de p4 (nucleótidos 10403 -10654) con el derivado del plásmido 2AΔ30 que contiene la deleción de 30 nucleótidos. Se usaron posteriormente los clones de ADNc p4 y
45 p4Δ30 para generar virus recombinantes rDEN4 (apéndice 2) y rDEN4Δ30, respectivamente. (El número de referencia de GenBank para rDEN4 es AF326825 y la referencia para rDEN4Δ30 es AF326827).
Mutagénesis química de DEN4. Se infectaron monocapas confluentes de células Vero con DEN4 2 A wt a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 y se incubó durante 2 horas a 32 ºC. Después se recubrieron las células infectadas con MEM complementado con FBS al 2 % y 5-fluorouracilo (5-FU) (Sigma, St. Louis, MO) a 50 concentraciones que varían de desde 10 mM hasta 0 nM. Después de la incubación a 32º C durante cinco días, se recogió el medio de cultivo celular, se aclaró por centrifugación y se congeló a -70º C. Después se sometieron a ensayo los sobrenadantes aclarados para determinar el valor del virus por valoración de placa en células Vero. Se prepararon diluciones de diez veces en serie del sobrenadante aclarado en Opti-MEM I (Life Technologies) y se inoculó sobre monocapas de células Vero confluentes en placas de 24 pocillos. Después de la incubación a 35 ºC 55 durante dos horas, se recubrieron monocapas con metilcelulosa al 0,8 % (EM Science, Gibbstown, NJ) en Opti-MEM I complementado con FBS al 2 %, gentamicina y L-glutamina. Después de la incubación a 35 ºC durante cinco días, se visualizaron las placas por tinción con inmunoperoxidasa. Se fijaron monocapas de células Vero en metanol al 80 % durante 30 minutos y se lavó durante 10 minutos con tampón de anticuerpo que consiste en leche en polvo desnatada al 3,5 % (p/v) (Nestle, Solon, OH) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después se incubaron 60 las células durante una hora a 37 ºC con una preparación de anticuerpo policlonal de conejo anti-DEN4 (PRNT50 de >1:2000) diluida a 1:1,000 en tampón de anticuerpo. Después de un lavado con tampón de anticuerpo, se incubaron las células durante una hora con IgG de cabra anti-conejo marcada con peroxidasa (KPL, Gaithersburg, MD) diluida
a 1:500 en tampón de anticuerpo. Se lavaron las monocapas con PBS, se dejó secar brevemente, se recubrió con sustrato de peroxidasa (KPL), y se contaron las placas.
Los rendimientos de virus en cultivos tratados con 5-FU 1 mM se redujeron 100 veces en comparación con cultivos no tratados, y el virus presente en el sobrenadante del cultivo tratado con 5-FU 1 mM se diluyó terminalmente parar 5 derivar clones para caracterización fenotípica. En resumen, se inocularon placas de 96 pocillos de células Vero con virus tratado con 5-FU a una MOI que proporcionó 10 o menos pocillos positivos para virus por placa. Después de una incubación de cinco días a 35 ºC, se transfirieron temporalmente medios de cultivo celular desde las placas de 96 pocillos a placas de 96 pocillos carentes de células, y se identificaron los cultivos positivos por tinción con inmunoperoxidasa de las monocapas de células infectadas. Se transfirió el virus de cada pocillo positivo a
10 monocapas de células Vero confluentes en placas de 12 pocillos para su amplificación. Se recogió el medio de cultivo celular de los pocillos individuales cinco o seis días después, se aclaró por centrifugación, se alicuotó a placas de polipropileno de 96 pocillos profundos (Beckman, Fullerton, CA) y se congeló a -70 ºC. Se prepararon un total de 1.248 clones de virus a partir de los cultivos tratados con 5-FU 1 mM. Se generaron dos clones de virus wt, 2A-1 y 2A-13, de la misma manera a partir de cultivos de control no tratados con 5-FU.
15 Cribado de clones para determinar fenotipos ts y att. Se cribaron 1.248 clones de virus para determinar el fenotipo ts evaluando la replicación del virus a 35 ºC y 39 ºC en células Vero y HuH-7. Se inocularon monocapas de células en placas de 96 pocillos con diluciones de diez veces en serie de virus en medio L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) complementado con FBS al 2 %, L-glutamina y gentamicina. Se incubaron células a las temperaturas indicadas durante cinco días en baños de agua de temperatura controlada, y se determinó la presencia
20 de virus por tinción con inmunoperoxidasa como se describe anteriormente. Los clones de virus que demostraron una reducción de 100 veces o más en el valor a 39 ºC se diluyeron terminalmente dos veces adicionales y se amplificaron en células Vero. La eficacia de la formación de placa (EOP) a temperaturas permisivas y restrictivas de cada suspensión de virus clonado biológicamente de forma triple se determinó como sigue. Se realizó la valoración de placa en células Vero y HuH-7 como se describe anteriormente excepto que se recubrieron monocapas
25 infectadas por virus con metilcelulosa al 0,8 % en medio L-15 complementado con FBS al 5 %, gentamicina y Lglutamina. Después de la incubación de las placas replicadas durante cinco días a 35, 37, 38 o 39 ºC en baños de agua de temperatura controlada, se visualizaron las placas por tinción con inmunoperoxidasa y se contaron.
Se evaluó la replicación de virus mutantes ts de 5-FU DEN4 en ratones lactantes Swiss Webster (Taconic Farms, Germantown, NY). Se inocularon por vía intracraneal grupos de seis ratones de una semana de edad con 104 PFU 30 de virus diluido en 30 μl de Opti-MEM I. Cinco días después, se sacrificaron los ratones y se retiraron los cerebros y se homogeneizaron individualmente en una suspensión al 10 % solución salina equilibrada de Hank tamponada con fosfato que contiene sacarosa al 7,5 %, glutamato de sodio 5 mM, 0,05 mg/ml de ciprofloxacina, 0,06 mg/ml de clindamicina y 0,0025 mg/ml de anfotericina B. Se congelaron los sobrenadantes aclarados a -70 ºC y posteriormente se determinó el valor del virus por valoración en células Vero, y se tiñeron las placas por el
35 procedimiento de inmunoperoxidasa descrito anteriormente.
Análisis de secuencia de genomas víricos. Se determinó la secuencia de nucleótidos de los virus DEN4 mutagenizados con 5-FU. En resumen, se aisló ARN vírico genómico de clones de virus con el mini kit de ARN vírico QIAamp (Qiagen, Valencia, CA) y se realizó la transcripción inversa usando el sistema de síntesis de primera hebra SuperScript por RT-PCR (Life Technologies) y cebadores hexámeros aleatorios. Se usó ADNc polimerasa 40 favorecida (Clontech, Palo Alto, CA) para generar fragmentos de PCR de recubrimiento de aproximadamente 2.000 nt que se purificaron por el sistema de purificación de producto de PCR HighPure (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Se usaron cebadores específicos de DEN en reacciones de secuenciación de ciclo terminador BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA) se analizaron las reacciones en un analizador genérico 3100 (Applied Biosystems). Se diseñaron cebadores para secuenciar ambas hebras del producto de PCR a partir de las que se montaron las
45 secuencias consenso.
Se determinó la secuencia de nucleótidos de las regiones 5' y 3' del genoma vírico como antes después de la circularización del genoma de ARN. Se escindió el nucleósido de casquete en 5' del ARN vírico usando pirofosfatasa ácida del tabaco (Epicentre Technologies, Madison, WI) y se circularizó el genoma por ARN ligasa (Epicentre Technologies). Se generó un fragmento de RT-PCR que recubrió la unión de ligadura (extremos 5' y 3') y se
50 secuenció como se describe anteriormente.
Generación de virus DEN4 recombinantes. Se introdujo la mutación en la posición de nt 4.995 en NS3 en la construcción de ADNc p4 por mutagénesis dirigida a sitio (Kunkel, T.A. 1985 PNAS USA 82:488-92). Se subclonó el fragmento Stul -BstBl (nt 3,619 -5,072) de p4 en un vector pUC119 modificado. Se modificó la mutación U > C en la posición de nt 4.995 por mutagénesis dirigida a sitio en el fragmento p4, se volvió a clonar en la construcción de 55 ADNc p4, y se confirmó la presencia de la mutación por análisis de secuencia. Se introdujo la mutación Δ30 en la 3' UTR del clon de ADNc p4-4995 reemplazando el fragmento Mlul -Kpnl con el derivado del clon de ADNc p4Δ30, y se confirmó la presencia de la deleción por análisis de secuencia. Se prepararon transcritos de ARN de longitud completa a partir de los clones de ADNc anteriores por transcripción in vitro. En resumen, la transcripción consistió en una mezcla de reacción de 50 μl que contenía 1 μg de plásmido linealizado, 60 U de SP6 polimerasa (New 60 England Biolabs (NEB), Beverly, MA), 1X de tampón de ARN polimerasa (Tris-HCl 40 mM, pH 7,9, MgCl2 6 mM, espermidina 2 mM, ditiotreitol 10 mM), análogo de casquete m7G(5')ppp(5')G 0,5 mM (NEB), cada nucleótido
trifosfato 1 mM, 1 U de pirofosfatasa (NEB) y 80 U de inhibidor de ARNse (Roche, Indianapolis, IN). Se incubó esta mezcla de reacción a 40 ºC durante 90 min y se purificaron los transcritos resultantes usando el mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA).
Para la transfección de células C6/36, se combinaron transcritos de ARN con reactivo de transfección liposómico
5 DOTAP (Roche) en solución salina tamponada con HEPES (pH 7,6) y se añadió a monocapas de células en placas de 6 pocillos. Después de la incubación a 32 ºC durante 12-18 horas, se retiraron los medios de cultivo celular y se reemplazaron con MEM complementado con FBS al 5 %, L-glutamina, gentamicina y aminoácidos no esenciales. Se incubaron monocapas de células durante de 5 a 7 días adicionales y se recogieron los medios de cultivo celular, se aclaró por centrifugación y se sometió a ensayo para determinar la presencia de virus por valoración de placa en
10 células Vero. Se diluyeron terminalmente dos veces los virus recuperados como se describe anteriormente, y se prepararon suspensiones de virus para un análisis adicional en células Vero.
Replicación in vitro (cultivo de tejido) e in vivo de DEN4 wt y DEN4Δ30. Se evaluó el nivel de replicación tanto de DEN4 2A wt como del candidato a vacuna, 2AΔ30, en células Vero (riñón de mono) y HuH-7 (hepatoma humano) (figura 1), de las que las últimas se ha descubierto que soportan eficazmente la replicación del virus DEN2 (Lin, Y.L.
15 et al. 2000 J Med Virol 60:425-31). El patrón de replicación de DEN4 2A wt y 2AΔ30 era similar en ambas líneas celulares. Los valores víricos de cultivos infectados con 2AΔ30 a una MOI de 0,01 se redujeron significativamente en comparación con DEN4 2A wt en 72 horas, pero a puntos temporales posteriores su nivel de replicación fue equivalente. La replicación eficaz de ambos virus DEN4 en cada línea celular indicó que estas líneas de células continuas serían útiles para la caracterización del fenotipo ts de los 1248 virus mutantes potenciales.
20 En primer lugar, se determinó el nivel de replicación del virus DEN4 administrado por vía intracerebral a ratones Swiss Webster para evaluar si se podrían usar los ratones para evaluar y cuantificar eficazmente el fenotipo de atenuación de un gran conjunto de virus mutantes. Puesto que la susceptibilidad de los ratones a la infección por DEN es dependiente de la edad (Cole, G.A. & Wisseman, C.L.Jr. 1969 Am J Epidemiol 89:669-80; Cole, G.A. et al. 1973 J Comp Pathol 83:243-52), se infectaron ratones de 7 a 21 días de edad con 2A-13 (un clon de virus natural
25 DEN4 -véase a continuación), rDEN4 o rDEN4Δ30, y después de cinco días, se retiró el cerebro de cada ratón y se cuantificó el nivel de replicación vírica por ensayo de placa (tabla 1). Los resultados indicaron que los dos virus DEN4 wt y el candidato a vacuna rDEN4Δ30 se replicaron a un valor alto (>6,0 log10PFU/g cerebro) en ratones de 7 días de edad y que los valores víricos medios eran similar entre los tres virus. Estos resultados demuestran la viabilidad del uso de ratones de 7 días de edad para cribar un gran conjunto de virus mutantes, y el alto nivel de
30 replicación del natural y del candidato a vacuna permite cuantificar la magnitud de la restricción de replicación especificada por una mutación atenuante sobre un intervalo de 10.000 veces.
Generación y caracterización in vitro de virus mutantes de 5-FU DEN4. Se generó un panel de 1.248 clones de virus DEN4 a partir de una suspensión mutagenizada con 5-FU de DEN4 2A wt como se describe anteriormente (figura 2). Se sometió a prueba cada clon en células Vero y HuH-7 para determinar el fenotipo ts a 39 ºC, los virus
35 mutantes ts putativos se sometieron a dos rondas adicionales de clonación biológica por dilución terminal, y se examinó con más detalle el fenotipo ts de cada población de virus clonados adicionalmente determinando su eficacia de plaqueo (EOP) a temperatura permisiva (35 ºC) y a varias temperaturas restrictivas (tabla 2). Un virus (clon 2A13) sin un fenotipo ts, que se pasó de forma idéntica a los virus mutantes ts, sirvió como el virus con el que se comparó directamente cada uno de los virus mutantes ts para determinar ambos fenotipos ts y att.
40 Se identificaron trece virus mutantes 5-FU que tiene un fenotipo ts en ambas células Vero y HuH-7, y siete virus mutantes eran ts sólo en células HuH-7 (tabla 2). Los virus mutantes que eran ts en células Vero pero no en células HuH-7 no se identificaron. Se definió la sensibilidad a la temperatura como una reducción de ≥2,5 o ≥3,5 log10PFU/ml en el valor del virus en células Vero o HuH-7, respectivamente, a una temperatura indicada en comparación con la temperatura permisiva de 35 ºC. Se encontró que el DEN4 2A natural tiene aproximadamente
45 una reducción de 0,5 y 1,5 log10PFU/ml en el valor del virus en células Vero o HuH-7 a 39 ºC, respectivamente. La deleción de Δ30 no confirió un fenotipo ts en células Vero ni HuH-7 y presentó sólo una ligera reducción en el valor del virus (2,2 log10PFU/ml) a 39 ºC en células HuH-7, lo que era menos de diez veces mayor que la reducción de DEN4 2A wt a esa temperatura. Varios virus mutantes 5-FU tuvieron una reducción mayor de 10.000 veces en el valor del virus a 39 ºC en ambas células Vero y HuH-7. Se observó una suspensión completa de la replicación vírica
50 a 39 ºC en células HuH-7 en cinco clones de virus (n.º 571, 605, 631, 967 y 992) que no eran ts en células Vero. Las mutaciones que restringen selectivamente la replicación en células de hígado HuH-7 pueden ser particularmente útiles en el control de la replicación de candidatos a vacuna del virus del dengue en el hígado de los vacunados.
Replicación de virus mutantes de 5-FU DEN4 en ratones lactantes. Se determinó el nivel de replicación de cada uno de los 20 virus mutantes de DEN4 ts en cerebro de ratón (tabla 2). Se compararon los valores obtenidos con los 55 de los dos virus wt, 2A-13 y rDEN4, que replicaron cada uno a un nivel mayor de 106 PFU/g de tejido de cerebro, y al del mutante 2AΔ30, que confirió sólo una reducción de 0,5 log10PFU/g limitada en el valor del virus medio en comparación con los controles wt. La reducción observada en el nivel de replicación de rDEN4Δ30 fue consistente entre los 11 experimentos por separado. De forma interesante, el virus rDEN4Δ30, que estaba atenuado tanto en monos rhesus como en seres humanos (ejemplo 8), sólo estaba ligeramente restringido en replicación en el cerebro 60 de ratón. Se observaron niveles variables de restricción de replicación entre los virus mutantes que varía desde una reducción de 10 veces (n.º 473) hasta más de 6.000 veces (n.º 686) . Se descubrió que los virus mutantes con
fenotipos ts en ambas células Vero y HuH-7, así como en células HuH-7 solas, tiene fenotipos de att significativos. Cinco de 13 virus mutantes de 5-FU con fenotipos ts en ambas células Vero y HuH-7 y cinco de siete virus mutantes con fenotipos ts en células HuH-7 solas tuvieron una reducción mayor de 100 veces en la replicación del virus. No parecía haber ninguna correlación directa entre la magnitud de la reducción en la replicación a temperatura
5 restrictiva en cultivo de tejido y el nivel de atenuación in vivo. El nivel similar de sensibilidad a la temperatura y replicación del rDEN4 wt y del clon 2A-13 en cerebro de ratón indicó que las diferencias observadas en la replicación entre los virus mutantes ts y el clon 2A-13 no era simplemente una función de paso en células Vero, sino que refleja las diferencias de secuencia entre estos virus.
Análisis de secuencia de virus mutantes de 5-FU DEN4. Para determinar la base genética de los fenotipos ts y att
10 observados, se determinó la secuencia de nucleótidos completa de cada mutante ts y del clon 2A-13 y se resumió en la tabla 3 (ts en células Vero y HuH-7) y en la tabla 4 (ts sólo en células HuH-7).
El único tipo de mutación identificada en los 20 virus mutantes secuenciados fue una sustitución nucleotídica (no se produjeron deleciones ni inserciones), y estaban presentes en cada una de las regiones codificantes excepto C y NS4A. Tres virus mutantes (n.º 239, 489 y 773) contenían sólo una única mutación puntual con pérdida de sentido 15 en NS3 en la posición de nt 4.995 lo que da como resultado un cambio de aminoácidos de Ser a Pro (a.a.) en la posición de a.a. 1.632. Para el n.º 773, esta fue la única mutación presente (tabla 3). Las mutaciones no codificantes en regiones codificantes no se consideran significativas. Los 17 virus mutantes adicionales tuvieron mutaciones múltiples (de dos a cinco) en una región codificantes o en una UTR que podía conferir potencialmente los fenotipos ts o att observados. Cinco de los 17 virus mutantes con mutaciones múltiples (n.º 473, 718, 759, 816 y 938) también
20 codificaron la mutación puntual en la posición de nt 4.995. La presencia de la mutación 4.995 sólo se encontró en virus mutantes de DEN4 con fenotipos ts en ambas células Vero y HuH-7.
El análisis de secuencia indicó que 10 virus mutantes que eran ts en células Vero y HuH-7 y tres virus mutantes que eran ts sólo en células HuH-7 contenían mutaciones sólo en la UTR 5' y 3' y/o en una proteína no estructural. Estas mutaciones son especialmente adecuadas para su inclusión en candidatos a vacuna del virus del dengue quimérico 25 en los que los genes estructurales derivan de un serotipo DEN1, DEN2 o DEN3 y las restantes regiones codificantes y no codificantes provienen de un vector de DEN4 atenuado. Las mutaciones identificadas en virus mutantes de 5-FU DEN4 que eran ts sólo en células HuH-7 (tabla 4) se pueden utilizar potencialmente en candidatos a vacuna, tales como rDEN4Δ30, para controlar de forma selectiva la replicación y la patogénesis de DEN4 en el hígado. Estos resultados combinados del análisis de secuencia de virus mutantes de 5-FU demuestran la utilidad de la
30 mutagénesis química como un medio de introducción de mutaciones atenuantes en el genoma del virus del dengue.
A continuación se describe la presencia de una mutación puntual en la posición de nt 4.995 en ocho virus mutantes por separado. También se representaron cinco mutaciones puntuales adicionales en múltiples virus incluyendo cambios de nt en la posición 1.455 en E, 7.162, 7.163 y 7.564 en NS4B, y 10.275 en la 3' UTR (tabla 5). La importancia de la aparición de estar mutaciones "hermanas" en virus múltiples se analiza en el ejemplo 6. De forma
35 interesante, el virus de paso paralelo natural, 2A-13, también contenía una única mutación en la posición de nt 7.163 en NS4B.
Introducción de una mutación ts en rDEN4 y rDEN4Δ30. La presencia de una única sustitución nucleotídica (mutación U > C en la posición de nt 4.995 en NS3) en tres virus mutantes separados (clones 239, 489 y 773) indicó que esta mutación especificó los fenotipos ts y att en cada uno de los tres virus mutantes. Se clonó esta mutación en 40 la construcción de ADNc de p4 y p4Δ30 y los virus recombinantes se recuperaron y se designaron rDEN4-4995 y rDEN4Δ30-4995, respectivamente. Estos virus recombinantes se sometieron a prueba para determinar los fenotipos ts y att como se describe anteriormente (tabla 6). Como se esperaba, la introducción de la mutación 4995 en rDEN4 wt dio como resultado un fenotipo ts significativo a 39 ºC en ambas células Vero y HuH-7. Se hizo creer rDEN4-4995 a cerca de niveles naturales a la temperatura permisiva, 35 ºC, en ambos tipos de células, pero demostró una
45 reducción mayor de 10.000 veces a 39 ºC (temperatura de suspensión) en ambas células Vero y HuH-7. La adición de la mutación 4995 a rDEN4Δ30 proporciona un virus recombinante, rDEN4Δ30-4995, que presenta el mismo nivel de sensibilidad a la temperatura que rDEN4-4995 (tabla 6).
Los virus rDEN4 que codifican la mutación 4995 se sometieron a prueba a continuación para determinar la replicación en los cerebros de ratones lactantes (tabla 6). La mutación 4995 confirió un fenotipo att tanto a rDEN4 50 como a rDEN4Δ30. Se produjo una reducción de aproximadamente 1.000 veces en la replicación del virus en comparación con el virus wt. La combinación de la mutación puntual 4995 y la deleción Δ30 no pareció dar como resultado una reducción aditiva de la replicación del virus. Estos resultados confirmaron que la mutación puntual 4995 de hecho especifica los fenotipos ts y att. De forma importante, también se demostró la utilidad de la modificación del cultivo de tejido y los fenotipos in vivo del candidato a vacuna rDEN4Δ30 por la introducción de
55 mutaciones adicionales.
Análisis. En el presente documento, se enseña cómo preparar una vacuna tetravalente del virus del dengue vivo atenuado usando rDEN4Δ30 como el componente de DEN4 y tres virus quiméricos antigénicos que expresan las proteínas estructurales (C, prM y E) de DEN 1, DEN2 y DEN3 del vector de rDEN4Δ30 atenuado (ejemplo 8). El virus DEN4 rDEN4Δ30 que contiene la mutación de deleción Δ30 en la 3' UTR manifiesta una replicación restringida 60 en seres humanos mientras que mantiene la inmunogenicidad. Puesto que el rDEN4Δ30 mantiene un nivel bajo de
virulencia residual para seres humanos a pesar de esta replicación restringida, se inició el presente estudio para generar mutaciones atenuantes adicionales que se prevé que sean útiles para atenuar adicionalmente rDEN4Δ30 u otros virus del dengue y que se prevé que se incorporen en cualquiera de los tres virus quiméricos antigénicos u otros virus del dengue, según se necesite. Los mutantes sensibles a la temperatura de virus del dengue
5 (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 in: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. p. 367-377 CAB International, New York; Eckels, K.H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80) así como de otros virus (Skiadopoulos, M.H. et al. 1998 J Virol 72:1762-8; Whitehead, S.S. et al. 1999 J Virol 73:871-7) manifiestan replicación restringida in vivo. Se ha generado un panel de 20 virus mutantes de DEN4 ts se ha determinado su secuencia genómica y se han evaluado sus fenotipos de atenuación in vivo. Los 20 virus mutantes de DEN4 ts se generaron por crecimiento en presencia de 5-FU y se seleccionaron en primer lugar para determinar su viabilidad en células Vero, el sustrato planeado para su uso en la fabricación de estas vacunas, para garantizar que los virus mutantes puedan crecer eficazmente en un sustrato adecuado.
Se obtuvieron dos clases de virus mutantes, los ts en ambas células Vero y HuH-7 (n = 13) o los ts sólo en células HuH-7 (n = 7). Los virus presentaron un intervalo en su nivel de sensibilidad a la temperatura de una reducción de 15 100 a 1.000.000 veces en replicación a la temperatura restrictiva de 39 ºC. Puesto que el candidato a vacuna de DEN4 retiene un nivel bajo de virulencia para el hígado y otros hallazgos apoyan la capacidad de los virus del dengue de infectar los hepatocitos (Lin, Y.L. et al. 2000 J Med Virol 60:425-31; Marianneau, P. et al. 1997 J Virol 71:3244-9) y provocar patología hepática (Couvelard, A. et al. 1999 Hum Pathol 30:1106-10; Ktierre, M.R. et al. 2001 Virchows Arch 438:107-15), se intenta desarrollar mutaciones que restrinjan selectivamente la replicación del virus del dengue 4 en células hepáticas. Con este fin, se han identificado siete virus mutantes que tienen un fenotipo ts específico de células HuH-7. Las mutaciones presentes en estos virus son las primeras informadas en los virus DEN que confieren replicación restringida en células hepáticas y se prevé que sean útiles en la limitación de la replicación vírica y la patogénesis en el hígado de receptores de vacuna. Se prevé que se evalúe la contribución de las mutaciones individuales identificadas en virus ts específicos de células HuH-7 a los fenotipos observados por
25 introducción de las mutaciones individuales en virus DEN4 recombinantes.
Las recientes evidencias han indicado que la magnitud de la viremia en pacientes infectados con DEN se correlaciona positivamente con la gravedad de la enfermedad, es decir, cuando mayor sea el valor de viremia más grave será la enfermedad (Murgue, B. et al. 2000 J Med Virol 60:432-8). et al. 2000 J Infect Dis 181:2-9). Esto indica que las mutaciones que restringen significativamente la replicación de candidatos a vacuna in vivo son la base de una vacuna segura y atenuada. La evaluación de candidatos a vacuna del virus para atenuación in vivo es complicada por la ausencia de un modelo animal adecuado que imite de forma precisa la enfermedad provocada por virus del dengue en seres humanos. En ausencia de un modelo de este tipo, se evaluó la replicación del panel de virus mutantes de 5-FU en los cerebros de ratones lactantes Swiss Webster como un medio para identificar un fenotipo de atenuación in vivo puesto que este animal se adapta bien para la evaluación de un gran conjunto de virus 35 mutantes. Cada uno de los 20 virus mutantes ts presentaron un fenotipo att que manifestó una reducción de 10 a
6.000 veces la replicación en comparación con el virus DEN4 wt (tabla 2). Esto indica que existe una correlación entre la presencia del fenotipo ts en cultivo de tejido y la atenuación del mutante in vivo lo que confirma la utilidad de la selección de virus con este marcador como candidatos a vacuna. Sin embargo, no existe correlación entre el nivel de sensibilidad a la temperatura y el nivel de restricción in vivo. Además, Sabin observó una disociación ente la neurovirulencia en el ratón y la atenuación en seres humanos generando una vacuna de virus vivo atenuado eficaz contra DEN por paso de virus en el cerebro de ratón. Esta investigación dio como resultado un virus DEN altamente neurotrópico para ratón que, paradójicamente estaba significativamente atenuado en seres humanos (Sabin, A.B. 1952 Am J Trop Med Hyg 1:30-50). A pesar de esto, se ha informado de la atenuación para el cerebro de ratón lactante para otros candidatos a vacuna del virus DEN vivo atenuado incluyendo la cepa de vacuna PDK-53 de 45 DEN2 que no es letal en ratones y la cepa de vacuna PR-159/S-1 DEN-2 que está significativamente atenuada en comparación con su tipo natural parental (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 in: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. pp. 367-377 CAB International, New York; Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Eckels, K.H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80). Se ha informado que la replicación en monos rhesus es predictiva de atenuación para seres humanos (Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:87(5-80). Recientemente, se han desarrollado modelos murinos de infección por virus DEN usando ratones SCID trasplantados con macrófagos humanos (Lin, Y.L. et al. 1998 J Virol 72:9729-37) o líneas celulares hepáticas (An, J. et al. 1999 Virology 263:70-7), pero estos ratones aún no se han usado para evaluar fenotipos att de virus para vacunas candidatas. Se prevé que los virus mutantes o virus recombinantes que llevan una o más de estas mutaciones descritas en el presente documento se someten a prueba para determinar la
55 replicación en monos rhesus (u otro modelo animal adecuado) como predictivo para la atenuación en seres humanos.
La mutagénesis química del virus DEN4 y el análisis de secuencias de los virus resultantes descritos aquí ha dado como resultado la identificación de un gran número de mutaciones puntuales dando como resultado sustituciones de aminoácidos en todos los genes excepto C y NS4A así como mutaciones puntuales en las UTR en 5' y 3' (tablas 3 y 4). Este enfoque de mutagénesis de genoma completo tiene el beneficio de identificar mutaciones dispersadas en todo el genoma que se preseleccionan para determinar la viabilidad en el sustrato de células Vero. Diez virus mutantes de 5-FU que eran ts en células Vero y HuH-7 y tres virus que eran selectivamente ts en células HuH-7 contenían sólo mutaciones fuera de los genes que codifican las proteínas estructurales, es decir, en la UTR en 5' y 3' o genes NS. Estas mutaciones junto con la deleción Δ30 en la 3' UTR se adaptan particularmente para la inclusión en vacunas quiméricas antigénicas que consisten en un vector de DEN4 atenuado que lleva los genes estructurales naturales (C, prM, E) de los otros serotipos del virus DEN. El uso de esta estrategia tiene varias ventajas. Cada virus quimérico antigénico que posee proteínas estructurales de un virus natural junto con mutaciones atenuantes en sus
5 UTR o genes NS debe mantener su infectividad para seres humanos, lo que está mediada en gran parte por la proteína E y, por lo tanto, cada componente de vacuna debe ser inmunógeno (Huang, C.Y. et al 2000 J Virol 74:3020-S). Esta maquinaria de replicación de las cepas de vacuna tetravalente compartiría las mismas mutaciones atenuantes en los genes NS o en la UTR lo que podría atenuar cada componente de vacuna hasta un grado similar y de este modo minimizar la interferencia o complementación ente los cuatro virus de vacuna. Además, se espera que la proteína E natural induzca de la forma más eficaz anticuerpos neutralizantes contra cada virus DEN individual.
El análisis de secuencia de virus del dengue (Blok, J. et al. 1992 Virology 187:573-90; Lee, E. et al. 1997 Virology 232:281-90; Puri, B. et al. 1997 J Gen Virol 78:2287-91) y de virus de fiebre amarilla (Dunster, L.M. et al. 1999 Virology 261:309-18; Holbrook, M.R. et al 2000 Virus Res 69:31-9) generados previamente por el paso en serie en cultivo de tejido tienen mutaciones en gran parte del genoma, un patrón que se ha observado en el presente estudio.
15 El análisis reciente de la cepa de vacuna PDK-53 de DEN2 ha identificado las mutaciones importantes implicadas en la atenuación que estaban situadas en regiones no estructurales incluyendo la 5' UTR, NS1 y NS3 (Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9). Se ha usado esta cepa de vacuna de DEN2 para generar un virus quimérico con genes C-prM-E de DEN1 (Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). En estudios separados, la secuencia de la cepa de vacuna DEN1 45AZ5 PDK-27 se determinó y se comparó con virus parentales, pero las mutaciones responsables de la atenuación aún no se han identificado (Puri, B. et al 1997 J Gen Virol 78:2287-91).
Se identificaron varias sustituciones de aminoácidos en más de un virus mutante de ts 5-FU (tabla 5). Lee et al han informado previamente del hallazgo de mutaciones repetidas en clones de virus DEN3 separados después del paso en serie en células Vero (Lee, E. et al 1997 Virology 232:281-90). También se descubrió una mutación (K > N) identificada en E en una posición de a.a. 202 en una serie de paso de DEN3 en el virus mutante de 5-FU n.º 1012 (K
25 > E). Se prevé que las mutaciones observadas en los virus mutantes hermanos de 5-FU representen cambios adaptivos que confieran un incremento en la eficacia de la replicación de DEN4 en células Vero. Se prevé que dichas mutaciones son beneficiosas para la inclusión en una vacuna del virus DEN vivo atenuado incrementando el rendimiento del virus de vacuna durante la fabricación. De forma interesante, se descubrieron tres sustituciones de aminoácidos distintas en NS4B de los virus mutantes hermanos de 5-FU. La función exacta de este gen es desconocida, pero estudios previos de vacunas de fiebre amarilla atenuadas (Jennings, A.D. et al. 1994 J Infect Dis 169:512-8; Wang, E. et al. 1995 J Gen Virol 76:2749-55) y vacunas de encefalitis japonesa (Ni, H. et al. 1995 J Gen Virol 76:409-13) han identificado mutaciones en NS4B asociadas con fenotipos de atenuación.
La mutación en la posición nt 4995 de NS3 (S1632P) estaba presente como la única mutación significativa en los tres virus mutantes de 5-FU (n.º 239, n.º 489 y n.º 773). Se introdujo esta mutación en un virus DEN4 recombinante y 35 se descubrió que confiere un fenotipo ts y att (tabla 6). Estas observaciones identifican claramente la mutación 4995 como una mutación atenuante. El análisis de una alineación de secuencia (Chang, G.-J. 1997 in: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno, eds. pp. 175-198 CAB International, New York) de los cuatro virus del dengue indicó que la Ser en la posición de a.a. 1632 se conserva en DEN1 y DEN2, mientras que DEN3 contiene una Asn en esta posición lo que indica que se predice que la mutación es útil en la modificación de los fenotipos de los otros serotipos del virus DEN. La proteína NS3 es de 618 a.a. de longitud y contiene actividades tanto de serina proteasa como de helicasa (Bazan, J.F. & Fletterick, R.J. 1989 Virology 171:637-9; Brinkworth, R.I. et al. 1999 J Gen Virol 80:1167-77; Valle, R.P. & Falgout, B. 1998 J Virol 72:624-32). La mutación 4995 da como resultado un cambio en la posición de a.a. 158 en NS3 que está situada en la región N terminal que contiene el dominio de proteasa. La posición de aminoácido 158 está situada a dos residuos de a.a. de una región conservada 45 de NS3 designada caja de homología cuatro. Este dominio se ha identificado en miembros de la familia de flavivirus y se cree que es un determinante crítico de la especificidad por sustrato de NS3 proteasa (Bazan, J.F. & Fletterick,
R.J. 1989 Virology 171:637-9; Brinkworth, R.I. et al. 1999 J Gen Virol 80:1167-77). Sin embargo, el mecanismo exacto que da como resultado el fenotipo asociado con la mutación 4995 aún no se ha identificado. La identificación de la mutación 4995 como una mutación atenuante permite una predicción de su utilidad para la atenuación adicional de rDEN4Δ30.
Se ha determinado la contribución de mutaciones de 5-FU individuales a los fenotipos observados por la introducción de las mutaciones en virus DEN4 recombinantes como se demostró en el presente documento para la mutación 4995 (véase el ejemplo 3). Además, la combinación de mutaciones individuales entre sí o con la mutación Δ30 es útil para modificar adicionalmente el fenotipo de atenuación de vacunas candidatas del virus DEN4. La introducción de
55 la mutación 4995 en rDEN4Δ30 descrita en el presente documento dio el mutante doble rDEN4Δ30-4995 ts y 1000 veces más atenuado para el cerebro de ratón que rDEN4Δ30. Esta observación ha demostrado la viabilidad de la modificación tanto de cultivo de tejido como de fenotipos in vivo de este y otros candidatos a vacuna del virus del dengue. Una vez se identifican las mutaciones responsables del fenotipo ts específico de células HuH-7 como se describe anteriormente y se introduce en el candidato a vacuna rDEN4Δ30, se prevé que se confirme que estas mutaciones atenúan el virus de la vacuna de rDEN4Δ30 para el hígado de seres humanos. Se prevé que se monte un menú de mutaciones atenuantes que se predice que es útil en la generación satisfactoria de virus para vacunas del dengue recombinante atenuado y en el incremento del conocimiento de la patogénesis del virus del dengue (véase el ejemplo 7).
Ejemplo 2
La mutagénesis química del virus DEN4 da como resultado virus mutantes de placa pequeña con fenotipos sensibles a la temperatura y de atenuación
Se han buscado mutaciones que restringen la replicación del virus del dengue para la generación de vacunas
5 recombinantes del virus del dengue vivo atenuado. Se hizo crecer previamente virus del dengue de tipo 4 (DEN4) en células Vero en presencia de 5-fluorouracilo, y la caracterización de 1.248 clones de paso de células Vero mutagenizados identificó 20 virus mutantes sensibles a la temperatura (ts) que estaban atenuados (att) en el cerebro de ratones lactantes (ejemplo 1). La presente investigación ha extendido estos estudios identificando adicionalmente 22 virus mutantes de DEN4 que tienen un fenotipo de tamaño de placa pequeño (sp) en células Vero y/o en la línea
10 celular del hígado, HuH-7. Cinco virus mutantes tienen un fenotipo sp en ambas células Vero y HuH-7, tres de ellos también son ts. Diecisiete virus mutantes tiene un fenotipo sp sólo en células HuH-7, trece de ellos también son ts. Se hizo crecer cada uno de los virus sp restringido en el cerebro de ratón lactante, presentando un amplio intervalo de reducción en la replicación (de 9 a 100.000 veces). Se determinó la secuencia de nucleótidos completa para los 22 virus mutantes sp de DEN4 y se encontraron sustituciones de nucleótidos en la región no traducida en 3' (UTR)
15 así como en todas las regiones codificantes excepto en NS4A. Se han identificado mutaciones idénticas en múltiples clones de virus lo que indica que están implicados en la adaptación de virus DEN4 al crecimiento eficaz en células Vero.
Los virus DEN provocan más enfermedad y muerte de seres humanos que cualquier otro arbovirus, y más de 2,5 mil millones de personas vivas en regiones con infección por dengue endémica (Gubler, D.J. 1998 Clin Microbiol Rev 20 11:480-96). Anualmente, existen 50-100 millones de casos estimados de fiebre por dengue (DF) y 500.000 casos de las más graves y potencialmente mortales fiebre hemorrágica por dengue / síndrome de choque por dengue (DHF/DSS) (Gubler, D.J. & Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53:35-70). La fiebre por dengue es una infección aguda caracterizada por fiebre, cefalea retro-orbital, mialgia y sarpullido. En el momento de la defervescencia durante DF, se puede producir una complicación más grave de l infección por virus DEN, DHF/DSS, que se caracteriza por un
25 segundo periodo febril, manifestaciones hemorrágicas, hepatomegalia, trombocitopenia y hemoconcentración, lo que puede dar lugar a choque potencialmente mortal (Gubler, D.J. 1998 Clin Microbiol Rev 11:480-96).
Los sitios de replicación del virus DEN en seres humanos y su importancia y relación con la patogénesis de DF y DHF/DSS aún no se comprenden perfectamente (Innis, B.L. 1995 en: Exotic Viral Infections J.S. Porterfield, ed. p. 103-146 Chapman and Hall, London). Además de la replicación en células linfoides, resulta evidente que el hígado 30 está implicado en la infección por DEN de los seres humanos. Se observan elevaciones transitorias en niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en suero en la mayoría de los pacientes infectados con el virus DEN y se observa hepatomegalia en algunos pacientes (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Kuo, C.H. et al. 1992 Am J Trop Med Hyg 47:265-70; Mohan, B. et al. 2000 J Trop Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al. 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259-63). Se observan hepatocitos positivos en 35 antígenos del virus DEN rodeando áreas de necrosis en el hígado de casos mortales (Couvelard, A. et al. 1999 Hum Pathol 30:1106-10; Huerre, M.R. et al. 2001 Virchows Arch 438:107-15), de los que se identificaron secuencias de virus del dengue usando RT-PCR (Rosen, L. et al. 1999 Am J Trop Med Hyg 61:720-4). De potencial importancia para la etiología de la infección por virus del dengue grave, tres estudios han demostrado que los niveles medios de ALT y AST en suero se incrementaron significativamente en pacientes con DHF/DSS en comparación con los de DF
40 (Kalayanarooj, S. et al. 1997 J Infect Dis 176:313-21; Mohan, B. et al. 2000 J Trop Pediatr 46:40-3; Wahid, S.F. et al. 2000 Southeast Asian J Trop Med Public Health 31:259-63). Como se esperaba, la elevación de enzimas hepáticas en suero se ha observado previamente en ensayos clínicos de candidatos a vacuna del virus DEN (ejemplo 8; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Edelman, R. et al. 1994 J Infect Dis 170:1448-55; Kanesathasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-3188; Vaughn, D.W. et al. 1996 Vaccine 14:329-36).
45 En base al incremento en el grado de enfermedad asociado con la infección por virus DEN durante las últimas décadas, se necesita una vacuna que confiera protección contra los cuatro serotipos del virus del dengue, pero en estos momentos no está disponible ninguna. Debido a un incremento del riesgo de DHF/DSS grave asociado con una infección secundaria con un serotipo de virus DEN heterólogo (Burke, D.S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38:172-80; Halstead, S.B. et al. 1977 J Exp Med 146:218-29; Thein, S. et al 1997 Am J Trop Med Hyg 56:566-72),
50 una vacuna eficaz debe conferir una protección simultánea contra cada uno de los cuatro serotipos del virus DEN. En estos momentos, se están llevando a cabo varios enfoques para desarrollar una vacuna tetravalente contra los virus del dengue (Bancroft, W.H. et al 1984 J Infect Dis 149:1005-10; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18:44-7; Butrapet, S. et al 2000 J Virol 74:3011-9; Guirakhoo, F. et al 2000 J Virol 74:5477-85; Huang, C.Y. et al 2000 J Virol 74:3020-8; Kanesa-thasan, N. et al 2001 Vaccine 19:3179-3188). Uno de estos enfoques, un candidato
55 a vacuna de DEN4 vivo atenuado, denominada 2AΔ30, fue tanto atenuada como inmunógena en un cohorte de 20 voluntarios (ejemplo 8). El virus 2AΔ30 recombinante contiene una deleción de 30 nt en la 3' UTR que retira los nucleótidos 10.478-10.507 y se descubrió que produce un nivel bajo o indetectable de viremia en vacunados a una dosis de 105 PFU/vacunado. Se informó de un sarpullido asintomático en un 50 % de los voluntarios y la única anomalía de laboratorio observada fue un incremento transitorio, asintomático en el nivel de ALT en suero en 5 de
60 los 20 vacunados. Todas las vacunas de 2AΔ30 desarrollaron anticuerpos neutralizantes contra el virus DEN4 (valor medio: 1:580), y 2AΔ30 no se transmitió a mosquitos que se alimentaron experimentalmente sobre vacunados (Troyer, J.M. et al 2001 Am J Trop Med Hyg 65:414-9). Debido a las propiedades deseables conferidas por la mutación Δ30, se construyen candidatos a vacuna quiméricos que contienen los genes estructurales del virus DEN de tipo 1, 2 y 3, en el antecedente de DEN4 atenuado que lleva la mutación Δ30 genéticamente estable. Las mutaciones atenuantes fuera de los genes estructurales son particularmente interesantes para su inclusión en candidatos a vacuna quiméricos antigénicos debido a que no afectarán a la infectividad o inmunogenicidad conferida
5 por el principal mediador de la inmunidad humoral para los virus DEN, la proteína de envoltura (E).
La presencia de sarpullido a niveles de ALT elevados sugiere que el candidato a vacuna 2AΔ30 puede estar ligeramente menos atenuado en seres humanos. De forma similar, muchos intentos previos de desarrollar vacunas para el virus del dengue vivo atenuado han proporcionado candidatos a vacuna que estaban sobreatenuados o menos atenuados en seres humanos, de los que algunos también indujeron una elevación en los niveles de ALT y 10 AST en suero (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 en: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever DJ. Gubler & G. Kuno eds. p. 367-377 CAB International, New York; Eckels, K.H. et al 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; Innis, B.L. et al 1988 J Infect Dis 158:876-80; Kanesa-thasan, N. et al 2001 Vaccine 19:3179-3188; McKee, K.T., Jr. et al 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42). Por lo tanto, se ha desarrollado un menú de mutaciones puntuales que confieren fenotipos sensibles a la temperatura (ts), de placa pequeña (sp) y de atenuación (att) que pueden atenuar virus
15 DEN4 hasta un grado variable (ejemplo 1). Se han descrito previamente 20 virus mutantes que presentan un fenotipo ts, pero no sp, en células Vero o en células de hígado HuH-7 y que muestran una replicación atenuada en cerebro de ratón (ejemplo 1). Se prevé que la adición de dichas mutaciones a 2AΔ30 o a otros candidatos a vacuna del virus del dengue proporcione candidatos a vacuna que presenten un equilibrio más satisfactorio entre atenuación e inmunogenicidad.
20 En el presente ejemplo, se ha extendido el análisis del panel de 1.248 clones de virus DEN4 generados previamente por mutagénesis con 5-fluorouracilo (5-FU) (ejemplo 1), identificando un conjunto de 22 virus mutantes sp, de los que algunos tienen un fenotipo ts. Se buscan virus mutantes de placa pequeña puesto que dichos virus a menudo están atenuados en seres humanos (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 en: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. p. 367-377 CAB International, New York; Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9;
25 Crowe, J.E Jr. et al. 1994 Vaccine 12:783-790; Crowe, J.E.Jr. et al. 1994 Vaccine 12:691-699; Eckels, K.H. et al. 1980 Infect Immun 27:175-80; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80; Murphy, B.R. & Chanock, R.M. 2001 en: Fields Virology D.M. Knipe, et al. Eds. Vol. 1, pp. 435-468 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia; Takemoto, K.K. 1966 Prog Med Virol 8:314-48). Debido a que la infección natural con virus del dengue y la vacunación con 2AΔ30 puede estar asociada con la hepatotoxicidad en seres humanos, se identificaron virus mutantes con una replicación
30 restringida en células de hígado humano. En consecuencia, se cribaron los virus para determinar el tamaño de placa y la sensibilidad a la temperatura en la línea celular de hepatoma humana, HuH-7, así como en células Vero. Aquí se describe el fenotipo ts, la secuencia de nucleótidos y las propiedades de crecimiento en ratones lactantes de 22 clones de virus mutantes de DEN4 sp.
Células y virus. Se mantuvieron células Vero WHO (células de mono verde africano) y células HuH-7 (células de
35 hepatoma humano) (Nakabayashi, H. et al. 1982 Cancer Res 42:3858-63) como se describe en el ejemplo 1. El virus DEN4 2A es un virus natural derivado de un clon de ADNc de la cepa de DEN4 814669 (Dominica, 1981) (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-43; Mackow, E. et al. 1987 Virology 159:217-28). A la secuencia de nucleótidos de DEN4 2A, el progenitor de los virus mutantes de 5-FU, se le asignó previamente el número de referencia de GenBank AF375822 (ejemplo 1). El candidato a vacuna deDEN4, 2AΔ30, (ejemplo 8) contiene una deleción de 30 nt
40 en la región no traducida (UTR) en 3' que retira los nucleótidos 10.478-10.507 (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:39307). Se usaron los clones p4 de ADNc, un derivado modificado del clon de ADNc de DEN4 2A, y p4Δ30 para generar virus naturales recombinantes y atenuados, rDEN4 y rDEN4Δ30, respectivamente (ejemplo 8). Los números de referencia de GenBank se asignaron previamente como sigue (virus: número de referencia): cepa de DEN4 814669: AF326573; 2AΔ30: AF326826; rDEN4: AF326825; rDEN4Δ30: AF326827.
45 Generación y clonación biológica de virus mutantes con un fenotipo sp. Se ha descrito previamente la generación de 1.248 clones de virus de un conjunto de DEN4 2A mutagenizado con 5-fluorouracilo (ejemplo 1). En resumen, se infectaron monocapas de células Vero con DEN4 2A a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 y se recubrieron con MEM complementado con FBS al 2 % y 5-fluorouracilo 1 mM (5-FU) (Sigma, St. Louis, MO), lo que redujo la replicación de DEN4 2A 100 veces. Se inocularon células Vero en placas de 96 pocillos con la suspensión
50 de virus tratado con 5-FU y se recogieron los clones de virus de las placas que recibieron virus diluidos de forma terminal. Se generaron un total de 1.248 clones de virus a partir de los cultivos tratados con 5-FU 1 mM. Se generaron dos clones de virus, 2A-1 y 2A-13, de la misma manera a partir de los cultivos de control no tratados con 5-FU y sirvieron como virus de control de paso paralelo con un fenotipo natural.
Evaluación del tamaño de placa in vitro y de la sensibilidad a la temperatura. Se cribaron los 1.248 clones de
55 virus mutagenizados con 5-FU para determinar la sensibilidad a la temperatura evaluando la replicación del virus a 35 ºC (temperatura permisiva) y 39 ºC (temperatura restringida) en células Vero y HuH-7. Se inocularon monocapas de células en placas de 96 pocillos con diluciones de diez veces en serie de virus y se incubaron placas replicadas a 35 ºC y 39 ºC durante cinco días en baños de agua temperatura de temperatura controlada. Se determinó la replicación del virus por tinción con inmunoperoxidasa como se describe previamente (ejemplo 1). Una colección de
60 193 clones de virus de 5-FU demostró una reducción de 100 veces o más en el valor a 39 ºC en cada línea celular, y se caracterizaron adicionalmente estos virus ts presuntos. Se determinó la eficacia de la formación de placas (EOP) a las temperaturas permisiva y restringida y el tamaño de placa de cada uno de los 193 clones de virus como sigue.
Se inocularon diluciones de diez veces en serie sobre monocapas de células Vero y células HuH-7 confluentes en placas de 24 pocillos de replicación. Después de la incubación a 35 ºC durante dos horas, se recubrieron monocapas con metilcelulosa al 0,8 % (EM Science, Gibbstown, NJ) en medio L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) complementado con FBS al 2 %, gentamicina y L-glutamina. Después de la incubación de las 5 placas replicadas durante cinco días a 35, 37, 38 o 39 ºC en baños de agua de temperatura controlada, se visualizaron las placas por tinción con inmunoperoxidasa y se contaron como se describe previamente. Se evaluó el tamaño de placa de cada uno de los 193 virus a la temperatura permisiva (35 ºC) se comparó con el del virus de control de paso paralelo de DEN4 2A-13 con un tamaño de placa natural. Los virus mutantes incubados a la temperatura permisiva de 35 ºC que tenían un tamaño de placa ≤ 1 mm o ≤ 0,4 mm (aproximadamente ≤ 50 % del tamaño de DEN4 2A-13 natural) en células Vero o HuH-7, respectivamente, se les asignó que tenían un fenotipo sp. Se confirmó el nivel de sensibilidad a la temperatura y tamaño de placa al menos en dos experimentos separados. Setenta y cinco virus que se confirmó que tenían un fenotipo ts y/o sp putativo se clonaron biológicamente dos veces más y se reevaluaron los fenotipos. Se descubrió de veintidós de los 75 virus diluidos de forma terminal tenían un fenotipo sp. También se descubrió que dieciséis de los 22 virus mutantes sp tenían un fenotipo ts como se define por
15 una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor del virus en células Vero o HuH-7, respectivamente, a la temperatura restringida en comparación con la temperatura permisiva de 35 ºC como se describe previamente (ejemplo 1). Se descubrió que veinte de los 75 virus diluidos de forma terminal tenían un fenotipo ts sin un fenotipo sp y se describieron previamente (ejemplo 1). El resto de los 75 virus no cumplieron los criterios para un virus mutante ts ni sp.
Evaluación de virus mutantes sp para replicación restringida en ratones lactantes. Se llevaron a cabo experimentos con animales de acuerdo con las regulaciones y directrices del National Institutes of Health, Bethesda, MD. Se determinó el crecimiento de virus mutantes de 5-FU DEN4 en ratones lactantes Swiss Webster (Taconic Farms, Germantown, NY). Se inocularon grupos de seis ratones de siete días de edad por vía intracerebral con 104 PFU de virus en 30 μl de Opti-MEM I (Invitrogen) y se retiró el cerebro de cada ratón cinco días después y se analizó
25 de forma individual como se describe previamente (ejemplo 1). Los sobrenadantes aclarados de suspensiones al 10 % de cerebro de ratón se congelaron a -70 ºC, y se determinó el valor del virus por ensayo de placas en células Vero.
Determinación de la secuencia genómica completa de los virus mutantes sp. Se determinó la secuencia de nucleótidos de los virus DEN4 mutagenizados con 5-FU como se describe en el ejemplo 8. En resumen, se aisló ARN genómico a partir de clones de virus y se preparó el ADNc por transcripción inversa y sirvió como plantilla para la generación de fragmentos de PCR de recubrimiento. Se diseñó un panel de cebadores para secuenciar ambas hebras del producto de PCR a partir de las que se montaron y analizaron las secuencias consenso. Se determinó la secuencia de nucleótidos de las regiones 5' y 3' del genoma del virus después de la circularización del genoma de ARN como se describe en el ejemplo 8.
35 Identificación de virus mutantes de 5-fluorouracilo DEN4 con un fenotipo sp. Se ha descrito previamente la generación de un panel de 1.248 clones de virus a partir de una suspensión de virus DEN4 2A natural mutagenizado por 5-FU (ejemplo 1). En el presente estudio, se identificaron veintidós virus mutantes con un fenotipo sp. El tamaño de placa de virus mutantes representativos se ilustra en la figura 3. El tamaño de placa del virus DEN4 2A-13 (un virus de paso paralelo con un fenotipo natural derivado de cultivos de control no tratados con 5-FU) era consecuentemente más pequeño en células HuH-7 que lo observado en células Vero (figura 3 A). Los virus mutantes n.º 569 y n.º 1189 (figura 3B) eran sp en ambas células Vero y HuH-7. Por el contrario, los clones de virus mutantes de 5-FU n.º 311 y n.º 1083 (figura 3C) eran sp sólo en células HuH-7, lo que sugiere un defecto específico de células del hígado en la replicación dentro de este grupo fenotípico. Como se indica en la tabla 7, se descubrió que cinco virus mutantes tenían un fenotipo sp en ambas células Vero y HuH-7 mientras que 17 virus tenían un
45 fenotipo sp sólo en células HuH-7. Se comparó cada clon virus mutante de 5-FU para determinar el fenotipo sp o ts con tres virus de control, 2A-13, rDEN4 natural y rDEN4Δ30. Los virus recombinantes, rDEN4 y rDEN4Δ30, tenían cada uno un tamaño de placa en células Vero y HuH-7 similar al de DEN4 2A-13 lo que indica que la mutación Δ30 no confiere un fenotipo sp (tabla 7).
La mayoría de los virus mutantes de 5-FU sp también tenían un fenotipo ts en células Vero y/o HuH-7 (tabla 7) puesto que se cribaron inicialmente los virus mutantes para determinar su sensibilidad a la temperatura. Se definió la sensibilidad a la temperatura como una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor del virus en células Vero o HuH-7, respectivamente, a una temperatura restringida en comparación con la temperatura permisiva de 35 ºC como se define previamente (ejemplo 1). Tres virus mutantes (n.º 574, n.º 1269 y n.º 1189) eran sp y ts en ambas células Vero y HuH-7, mientras que se descubrió que nueve virus mutantes (n.º 506-326 en la tabla 7) eran ts en ambos
55 tipos de células pero sp sólo en células HuH-7. Se descubrió que cuatro virus (n.º 1104, 952, 738 y 1083) tenían un fenotipo natural en células Vero pero eran tanto sp como ts en células HuH-7. Estos cuatro virus mutantes tenían cada uno una reducción de 6.000 a 600.000 veces en el valor del virus a 39 ºC en células HuH-7 con una reducción sólo de 6 a 40 veces a 39 ºC en células Vero. Finalmente, se identificaron virus mutantes sp que no tenían un fenotipo ts en ninguna línea celular; dos de estos virus (n.º 569 y n.º 761) eran sp en ambas células Vero y HuH-7 y cuatro virus (n.º 1096-1012) eran sp sólo en células HuH-7 (tabla 7). Como se describe previamente, la mutación Δ30 no confiere sensibilidad a la temperatura en ninguna línea celular (ejemplo 1).
Los virus mutantes de 5-FU sp tienen una replicación restringida en el cerebro de ratones lactantes. Se
evaluaron los 22 virus mutantes de DEN4 5-FU sp para determinar su capacidad para replicarse en el cerebro de ratones lactantes de una semana de edad. Como marcador para la atenuación in vivo, se comparó su nivel de replicación con el del virus de control de paso paralelo con un fenotipo natural, 2A-13 (tabla 7). Diecinueve de los 22 virus mutantes sp tenían una reducción de más de 100 veces en la replicación del virus en el cerebro de ratones
5 lactantes en comparación con 2A-13 y nueve virus tenían una reducción de más de 10.000 veces.
Los cinco virus mutantes que eran sp en ambas células Vero y HuH-7 tenían una restricción de 5.000 veces a
100.000 veces en la replicación en comparación con 2A-13. Dos de estos virus mutantes, n.º 569 y n.º 761, no eran ts en ninguna línea celular pero tenían una reducción en el valor del virus de más de 10.000 veces en el cerebro de ratón, lo que indica que el fenotipo sp en ambas células Vero y HuH-7 es un marcador sustituto importante para la 10 replicación atenuada en el cerebro de ratones lactantes. Los virus mutantes de 5-FU que eran sp sólo en células HuH-7 tenían un intervalo más variable de replicación en el cerebro de ratón. Tres virus tenían una reducción media en el valor del virus de menos de 10 veces cuando se compararon con un virus 2A-13. Sin embargo, 8 de 13 virus que eran ts en células Vero y/o HuH-7 pero sp sólo en células HuH-7 tenían una reducción de más de 5.000 veces en la replicación del virus. Los resultados del análisis de replicación in vivo de los 20 virus mutantes de 5-FU ts
15 descritos previamente (ejemplo 1) y los 22 virus mutantes sp se resumen en la tabla 8. Se descubrió que los virus mutantes con fenotipo tanto sp como ts tenían un nivel de atenuación significativamente mayor en el cerebro de ratones lactantes cuando se comparó con virus con sólo un fenotipo ts.
Análisis de secuencia de los virus mutantes de 5-FU sp. Para iniciar un análisis de la base genética del fenotipo ts, sp o att de los 22 virus mutantes sp, se determinó la secuencia de nucleótidos completa de cada genoma de virus 20 y se resumió en la tabla 9 (sp en células Vero y HuH-7) y en la tabla 10 (sp sólo en células HuH-7). Todas las mutaciones identificadas eran sustituciones de nucleótidos, ya que no se observaron deleciones o inserciones. Las mutaciones puntuales se distribuyeron en todo el genoma, incluyendo la 3' UTR así como en todas las regiones codificantes. Debido a que se descubrió que todos los virus mutantes de 5-FU tenían al menos dos mutaciones (de dos a seis), los fenotipos observados no se pudieron atribuir directamente a una mutación específica. La mayoría de
25 los virus sp también contenían mutaciones puntuales traduccionalmente inactivas (de ninguna a cuatro) en las regiones codificantes estructurales o no estructurales. Sin embargo, no se espera que estas mutaciones inactivas contribuyan a los fenotipos observados. Se descubrió que seis de los 22 virus mutantes sp (tablas 9 y 10) tenían mutación sólo en los genes NS y/o la 3' UTR, lo que indica que el fenotipo sp se puede conferir por mutaciones fuera de los genes estructurales.
30 Presencia de mutaciones idénticas en virus mutantes de 5-FU múltiples. El análisis de los datos de las secuencias de nucleótidos completas para los virus mutantes de 5-FU identificó varias mutaciones repetidas que estaban presentes en dos o más virus. Dichas mutaciones también se identificaron previamente durante el análisis de veinte virus mutantes de 5-FU con un fenotipo ts pero no sp (ejemplo 1). Debido a que estas mutaciones se produjeron en virus junto con mutaciones adicionales, la contribución de las mutaciones repetidas a los fenotipos sp,
35 ts y att observados sigue siendo empírica. La tabla 11 enumera las mutaciones repetidas encontradas entre los 20 virus mutantes ts (no sp) descritos previamente (ejemplo 1) y los 22 virus mutantes sp descritos aquí. Se identificaron mutaciones repetidas en los siguientes genes: dos en E, dos en NS3, cinco en NS4B, una en NS5 y dos en la 3' UTR. De manera interesante, dentro de una región de treinta nucleótidos de NS4B (nt 7153-7182), había cinco sustituciones de nucleótidos diferentes que se encontraron en dieciséis virus. También en el nt 7.546 en NS4B,
40 se descubrió una sustitución de aminoácidos (Ala → Val) en 10 virus mutantes de 5-FU diferentes. La importancia de estas mutaciones repetidas en NS4B así como en otras regiones genómicas de DEN4 sigue siendo empírica, pero una explicación razonable para este fenómeno es que estas mutaciones están implicadas en la adaptación del DEN4 para el crecimiento eficaz en células Vero, como se analiza adicionalmente en el ejemplo 6.
Análisis. Como parte de una estrategia de vacuna genética molecular, se han desarrollado mutaciones atenuantes
45 que se prevé que sean útiles en el desarrollo de una vacuna de virus del dengue tetravalente vivo atenuado. Específicamente, se generaron mutaciones que restringen la replicación del virus de vacuna en células de hígado humano puesto que existía una virulencia residual del candidato a vacuna rDEN4Δ30 para el hígado de seres humanos. Se buscaron virus mutantes con un fenotipo sp en ambas células Vero y células de hígado humano HuH7, para identificar virus mutantes de la gama de huéspedes que estaban específicamente restringidos en replicación
50 en células HuH-7 (sp en HuH-7 pero no en Vero). Se prevé que estas mutaciones son útiles en la limitación de la replicación de una vacuna de candidato en el hígado de vacunados mientras preservan tanto una replicación eficaz en células Vero como la inmunogenicidad in vivo.
Varias observaciones del presente estudio indican que las mutaciones sp confieren un fenotipo att in vivo. Esto no es sorprendente puesto que se ha informado de la atenuación en el cerebro de ratones lactantes para candidatos a 55 vacuna del virus DEN vivo que poseen fenotipos sp, incluyendo las cepas de vacuna DEN2 PDK-53 y DEN2 PR-159/S-1 (Bhamarapravati, N. & Yoksan, S. 1997 en: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever D.J. Gubler & G. Kuno eds. p. 367-377 CAB International, New York; Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9; Eckels, K.H. et al 1980 Infect Immim 27:175-80; Innis, B.L. et al. 1988 J Infect Dis 158:876-80). Cada uno de los 22 virus mutantes de 5-FU DEN4 con un fenotipo sp (de los que alguno también era ts) en células Vero o bien HuH-7 manifestó una replicación 60 restringida en cerebros de ratones. Seis virus mutantes de 5-FU con un fenotipo sp en ausencia de un fenotipo ts estaban más atenuados en los cerebros de ratones lactantes que los virus mutantes con sólo un fenotipo ts (ejemplo 1), lo que indica que el fenotipo sp especifica un mayor nivel de atenuación para el cerebro de ratón que el fenotipo
ts. Los virus mutantes con un fenotipo tanto ts como sp tenían una reducción aún mayor en la replicación, lo que indica además que la atenuación conferida por los fenotipos ts y sp puede ser aditiva. De forma importante, diecisiete de los 22 virus mutantes sp eras virus mutantes sp de gama de huéspedes, siendo sp sólo en células HuH-7. Puesto que se prevé que dichas mutaciones son útiles en la restricción de la replicación de un virus DEN4 en
5 células de hígado humano, se usó un análisis de secuencias de nucleótidos para determinar la base genética del fenotipo sp.
El análisis de la secuencia genómica completa de los 22 virus DEN4 sp reveló sustituciones en la 3' UTR así como mutaciones codificantes en todos los genes excepto NS4A. En primer lugar, cabe destacar que estaban presentes varias mutaciones específicas en dos o más de los 22 virus mutantes de DEN4 sp y que muchas de estas mismas 10 mutaciones también se identificaron previamente entre el conjunto de los 20 virus mutantes de DEN4 ts (ejemplo 1). Puesto que los flavivirus puede acumular mutaciones rápidamente durante el paso en el cultivo de tejido (Dunster,
L.M. et al. 1999 Virology 261:309-18; Mandl, C.W. et al. 2001 J Virol 75:5627-37), muchas de estas mutaciones sobre-representadas, denominadas previamente mutaciones de adaptación de células Vero putativas (ejemplo 1), es probable que promuevan la replicación eficaz en células Vero y se seleccionan involuntariamente durante la
15 clonación biológica de los virus mutantes. El efecto de estas mutaciones en la replicación del virus DEN en células Vero, el sustrato propuesto para la fabricación de vacuna, se analiza en el ejemplo 6.
Se prevé que las mutaciones sp identificadas entre los virus mutantes de 5-FU son útiles en varios enfoques diferentes para el desarrollo de cepas de vacuna del virus DEN.
Como se describe anteriormente para la generación de virus quiméricos antigénicos, se prevé que una o más
20 mutaciones atenuantes sp se añaden al antecedente genético de DEN4Δ30 atenuado para complementar el fenotipo att de la mutación Δ30. Un segundo enfoque es introducir una mutación atenuante sp, con o sin Δ30, en clones de ADNc infecciosos de los otros tres serotipos de DEN. La capacidad de transferir mutaciones entre virus relacionados genéticamente y mantener fenotipos att similares se ha demostrado previamente (Skiadopoulos, M.H. et al. 1999 Virology 260:125-35). Se prevé que estas diferentes estrategias son útiles como enfoques separados o
25 complementarios para la construcción de una vacuna de virus DEN tetravalente, destacando la importancia de la identificación de un gran panel de mutaciones att dentro de los virus DEN.
Ejemplo 3
Virus DEN4 recombinantes que contienen mutaciones identificadas en virus mutantes de 5-FU muestran una replicación restringida en el cerebro de ratones lactantes y en ratones SCID trasplantados con células de
30 hígado humano
En los ejemplos 1 y 2 se presentan los datos resumen la generación, caracterización y análisis de secuencia de 42 virus DEN4 mutantes atenuados. Para tres de los virus mutantes (n.º 239, 489 y 773) con una única mutación con pérdida de sentido en la posición de nt 4995 en NS3, queda claro que la mutación identificada especificaba los fenotipos ts y att. Esta conclusión se confirmó en el ejemplo 1 por cultivo de tejido y en la caracterización in vivo de 35 rDEN4-4995, un virus recombinante en el que se había introducido la mutación 4995 por mutagénesis dirigida a sitio. En este análisis, rDEN4-4995 mostró el mismo nivel de sensibilidad a la temperatura y atenuación que los virus mutantes de 5-FU n.1 239, 489 y 773. Queda(n) por identificar la(s) mutación/mutaciones individual(es) en los restantes virus mutantes de 5-FU que especifican los fenotipos observados, puesto que la mayoría de estos virus poseen más de una sustitución de nucleótidos. Se ha llevado a cabo un análisis para identificar las mutaciones en un
40 subconjunto de los otros 39 virus mutantes que especifican los fenotipos ts, sp y att por la introducción de cada mutación en el ADNc (p4) de DEN4 wt y la evaluación de los fenotipos de los virus DEN4 recombinantes resultantes que llevan las mutaciones individuales. Estudios previos de un candidato a vacuna del virus DEN2 (Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74:3011-9) así como otras vacunas de virus (Whitehead, S.S. et al. 1999 J Virol 73:871-7) han demostrado la utilidad de este enfoque para la identificación de la base genética de atenuación.
45 Como se describe en los ejemplos 1 y 2, se identificaron 19 virus mutantes de 5-FU que se descubrió que contenían mutaciones codificantes sólo en los genes NS y/o sustituciones de nucleótidos en la UTR 5' o 3' lo que facilitaría la generación de virus quiméricos antigénicos. En el presente ejemplo, se identificó la base genética de los fenotipos sp, ts y att de cerebro de ratón observados para estos 19 virus usando genética inversa para generar virus DEN4 recombinantes (rDEN4) que contienen mutaciones individuales identificadas en el panel de virus mutantes de DEN4.
50 Además, se evaluaron los 19 virus mutantes de 5-FU para determinar la replicación en un modelo de animal pequeño novedoso para la replicación del virus DEN4, ratones SCID trasplantados con células HuH-7 (SCID-HuH-7), y se identificó la base genética de los virus att usando virus rDEN4 mutantes. También se presentan hallazgos que describen la generación y caracterización de un virus recombinante que contiene dos de las mutaciones atenuantes identificadas así como la combinación de mutaciones de 5-FU seleccionadas con la mutación Δ30.
55 Generación de virus rDEN4 que contienen mutaciones de 5-FU. Los procedimientos usados para la generación de virus rDEN4 se resumen en la figura 4 y son similares a los descritos en el ejemplo 1. En resumen, se digirió ADNc p4 con las enzimas de restricción apropiadas y se subclonaron los fragmentos resultantes en un vector pUC119 modificado. Para la mutagénesis de Kunkel, se realizaron preparaciones de ADN monocatenario de los vectores pUC-NS y se diseñaron cebadores para introducir de forma individual mutaciones que estaban presentes en los virus mutantes de 5-FU. Las secuencias de los 41 oligonucleótidos mutagénicos usando para generar los virus recombinantes de mutación única se presentan en la tabla 12. Se diseñaron cenadores para introducir conjuntamente o extirpar conjuntamente un sitio de enzima de restricción traduccionalmente inactivo en el ADNc, lo que facilita en gran medida el cribado y la identificación de clones de ADNc que poseen la secuencia mutante. Se
5 volvieron a clonar en p4 fragmentos que contenían las mutaciones introducidas, y el análisis de secuencia de nucleótidos confirmó la presencia de los cambios de nucleótidos. Se generó un total de 33 virus rDEN4 que contenían cada una de las mutaciones individuales presentes en los 19 virus mutantes de 5-FU que contenían sólo mutaciones codificantes en los genes NS y/o sustituciones de nucleótidos en la UTR 5' o 3'. Se generaron 8 virus rDEN4 adicionales a partir de mutaciones identificadas en el panel restante de 42 virus mutantes de 5-FU.
10 También se generó un clon de ADNc que combinaba las mutaciones identificadas en la posición de nt 4995 en NS3 y 7849 en NS5. Se introdujo la mutación 7849 en el clon de ADNc p4-4995 reemplazando el fragmento Xmal -Pstl con el derivado del clon de ADNc p4-7849. Se confirmó la presencia de ambas mutaciones por análisis de secuencia. Se introdujo la mutación Δ30 en la 3' UTR de los clones de ADNc mutantes individuales reemplazando el fragmento MluI -Kpnl con el derivado del clon de ADNc p4Δ30, y se confirmó la presencia de la deleción por análisis
15 de secuencia.
Se recuperaron los virus recombinantes por transfección de células Vero o C6/36 con transcritos de ARN derivados de los clones de ADNc mutantes como se describe en el ejemplo 1. Se diluyeron de forma terminal dos veces los virus recuperados y se prepararon reservas de virus de trabajo en células Vero. Se recuperó cada uno de los clones de ADNc mutantes después de la transfección como se esperaba puesto que los virus mutantes de 5-FU que
20 contienen estas mutaciones eran viables.
Caracterización de fenotipos ts y att de los virus rDEN4 que contienen mutaciones introducidas. De los 19 virus mutantes de 5-FU con mutaciones sólo en los genes NS y/o la UTR 5' o 3', seis tenían un fenotipo sp (tabla 13), diez tenían un fenotipo ts en células Vero y HuH-7 (tabla 14), y tres tenían un fenotipo ts sólo en células HuH-7 (tabla 15). Para los seis virus mutantes de 5-FU sp, n.º 738, 922, 1081, 1083, 1136 y 1189, diecisiete mutaciones
25 identificadas por análisis de secuencia dieron como resultado un cambio codificante o un cambio de nucleótidos en la UTR y se modificó cada uno en un clon de ADNc de DEN4 individual. Se recuperó con éxito el virus que contenía cada mutación definida y se propagó y se sometió a prueba para determinar su eficacia en la formación de placa en células Vero y HuH-7 a varias temperaturas, fenotipo de tamaño de placa y propiedades de crecimiento en ratones lactantes usando propagación descritos previamente en los ejemplos 1 y 2.
30 La tabla 13 enumera los fenotipos de los seis virus progenitores mutantes de 5-FU sp los de los 17 virus rDEN4 que codifican mutaciones únicas presentes en el virus progenitor. Por ejemplo, el mutante de 5-FU n.º1189 (progenitor), que era ts y sp en ambas líneas celulares y que tenía una reducción de casi 10.000 veces en la replicación en el cerebro de ratones lactantes, contenía 4 mutaciones codificantes en la posición de nt 3303 en NS1, 4812 y 5097 en NS3, y 7182 en NS4B. El análisis de los cuarto virus rDEN4 que contenían cada una de estas mutaciones indicó que
35 rDEN4-5097 tenía un fenotipo ts, sp y att mientras que rDEN4-3303, rDEN4-4812 y rDEN4-7182 no tenían fenotipos perceptibles, lo que indica que la mutación en el nt 5097 era responsable del fenotipo observado en el progenitor 5-FU, n.º 1189. Por tanto, el análisis de las contribuciones relativas de las cuatro mutaciones presentes en el mutante de 5-FU n.º 1189 a su fenotipo de atenuación proporciona el marco para un análisis similar de los virus mutantes de 5-FU restantes. Este análisis demuestra específicamente los procedimientos usados para identificar mutaciones que
40 contribuyen al fenotipo observado. Los fenotipos ts, sp y att de los virus progenitores de 5-FU n.º 738, 922, 1081 y 1083, se atribuyeron de forma similar a las mutaciones individuales 3540, 4306, 2650 y 10634, respectivamente. Sin embargo, dos mutaciones separadas (3771 y 4891) contribuyeron a los fenotipos del virus mutante de 5-FU n.º 1136.
La tabla 14 enumera la base genética del ts y la atenuación del cerebro de ratón para los diez virus mutantes de 5
45 FU con fenotipos ts en ambas células Vero y HuH-7. Como se describe en el ejemplo 1, se descubrió que la mutación 4995 que es la única mutación presente en tres virus mutantes de 5-FU, n.º 239, n.º 489 y n.º 773, confería un fenotipo ts y att, lo que confirma la base genética para los fenotipos presentados por estos virus. En tres experimentos separados, se descubrió que el virus rDEN4-4995 tenía una disminución de aproximadamente 1.000 veces en la replicación en los cerebros de ratones lactantes cuando se comparó con la del virus natural (tabla 6 y
50 14). La mutación 4995 también está presente en virus mutantes de 5-FU n.º 473, n.º 759 y n.º 816, de los que cada uno tiene mutaciones adicionales. Los fenotipos ts y att observados en estos virus se pueden atribuir a la mutación 4995 puesto que las mutaciones adicionales no mostraron fenotipos perceptibles. De forma interesante, el virus mutante de 5-FU n.º 938 tiene la mutación 4995 y una mutación adicional en el nt 3442 en NS1, confiriendo independientemente ambas mutaciones una replicación restringida en el cerebro de ratón. Se descubrió que cada
55 uno de los tres virus progenitores de 5-FU restantes en la tabla 14, n.º 173, n.º 509, y n.º 1033, contenía una mutación única responsable del fenotipo att: 7849, 8092 y 4907, respectivamente.
Tres virus mutantes de 5-FU, n.º 686, n.º 992 y n.º 1175 con fenotipos ts específicos de células HuH-7 se enumeran en la tabla 15. Se descubrió que las mutaciones en NS3 (5695) y NS5 (10186) conferían los fenotipos observados para virus progenitores n.º 992 y n.º 1175. De forma interesante, se descubrió que dos mutaciones en NS2A, 3575 y 60 4062, daban como resultado un incremento sinérgico en el nivel de atenuación. Ambas mutaciones individuales tenían una disminución de aproximadamente 100 veces en la replicación del virus en el cerebro mientras que el virus
progenitor con ambas mutaciones tenía una reducción de casi 10.000 veces. La tabla 16 enumera dos mutaciones adicionales con un fenotipo att, 4896 y 6259 en NS3.
Replicación de virus DEN4 en ratones SCID trasplantados con células HuH-7. Puesto que los virus DEN se replican mal en el hígado de ratones y los correspondientes estudios no son prácticos para llevar a cabo en primates 5 no humanos, se desarrolló un modelo animal que evalúa el nivel de replicación in vivo de virus DEN en células de hígado, basado en un informe reciente que examina la replicación del virus DEN en ratones SCID trasplantados con una línea celular continua de células tumorales de hígado humano (An, J. et al. 1999 Virology 263:70-7). Los ratones SCID trasplantados con líneas celulares continuas humanas, células primarias o tejidos organizados se han usado de forma similar para estudiar la replicación de otros virus que carecen de un modelo de animal pequeño adecuado
10 (Mosier, D.E. 2000 Virology 271:215-9). En este estudio, se trasplantaron ratones SCID con células HuH-7 puesto que el virus DEN4 se replicó eficazmente en estas células en cultivo de tejido y puesto que estas eran las células usadas para definir el fenotipo de gama de huéspedes. Se prevé que estos estudios traten la utilidad de examinar la infección por virus DEN en modelos de xenoinjerto en ratón SCID para el desarrollo de vacunas (An, J. et al. 1999 Virology 263:70-7; Lin, Y.L. et al. 1998 J Virol 72:9729-37).
15 Para examinar adicionalmente las propiedades de crecimiento in vivo de los 19 virus DEN4 mutantes de 5-FU con mutaciones sólo en los genes NS y/o la 3' UTR y los correspondientes virus mutantes rDEN4 seleccionados, se evaluó la replicación en ratones SCID trasplantados con células HuH-7 (SCID-HuH-7). Para el análisis de la replicación del virus DEN4 en ratones SCID-HuH-7, se inyectaron por vía intraperitoneal ratones SCID de cuatro a seis semanas de edad (Tac:Icr:Ha(ICR)-Prkdcscid) (Taconic Farms) con 107 células HuH-7 suspendidas en 200 μl de
20 solución salina tamponada con fosfato (PBS). En la preparación para el trasplante, se propagaron células HuH-7 en cultivo celular como se describe anteriormente y se recogieron por tripsinización a una confluencia de aproximadamente un 80 %. Se lavaron dos veces las células en PBS, se contaron, se resuspendieron en un volumen apropiado de PBS y se inyectaron en el peritoneo de los ratones. Se detectaron tumores en el peritoneo de cinco a seis semanas después del trasplante, y sólo se usaron los ratones con tumores evidentes para la
25 inoculación. Se infectaron ratones por inoculación directa en el tumor con 104 PFU de virus en 50 μl de Opti-MEM I. Se monitorizaron los ratones diariamente durante siete días y se obtuvo suero para valoración de virus por corte en la cola el día 6 y 7. Se recogieron aproximadamente 400 μl de sangre en un tubo separador de suero (Sarstedt, Alemania), se centrifugó y se alicuotó el suero y se almacenó a -70 ºC. Se determinó el valor del virus por ensayo de placa en células Vero. Siete días después de la infección, la mayoría de los ratones desarrollaron morbilidad y todos
30 los ratones se sacrificaron. Se extirparon los tumores y se pesaron para confirmar la uniformidad de los grupos experimentales.
Los experimentos preliminares indicaron que los ratones SCID-HuH-7 inoculados con DEN4 2A-13 directamente en el tumor desarrollaron viremia con niveles máximos (de hasta 8,0 log10PFU/ml de suero) logrados el día 5 (tabla 17). También se pudo detectar el virus en homogeneizados de cerebro, hígado y tumor.
35 Se comparó el nivel de viremia en ratones SCID-HuH-7 infectados con virus mutantes de 5-FU o rDEN4 progenitores con el del virus de control de paso paralelo, 2A-13, o rDEN4, respectivamente. Los resultados de 4 experimentos separados indicaron que el candidato a vacuna, rDEN4Δ30, tenía una reducción de casi 10 veces en la replicación del virus en comparación con el rDEN4 natural (tabla 13) lo que refleja la atenuación evidente del candidato a vacuna rDEN4Δ30 en seres humanos (ejemplo 8). Los resultados en las tablas de 13 a 15 indican que tres virus
40 mutantes de 5-FU tenían una reducción de 100 veces en viremia en los ratones SCID-HuH-7 en comparación con el virus 2A-13: n.º 1081, n.º 1083 y n.º 1189. El fenotipo común ente estos virus fue un fenotipo sp en células HuH-7. El análisis de la base genética del fenotipo att en estos virus mutantes de 5-FU progenitores identificó tres mutaciones individuales en NS1, NS3, y la 3' UTR que conferían una reducción de al menos 100 veces en viremia. Específicamente, rDEN4-2650 (NS1), rDEN4-5097 (NS3) y rDEN4-10634 (3' UTR) manifestaron una reducción de
45 2,2, 3,6, y 4,3 log10PFU/ml en el valor máximo de viremia en comparación con rDEN4, respectivamente. Estas mutaciones también conferían el fenotipo att en el cerebro de ratones lactantes. El virus mutante de 5-FU n.º 738 y n.º 509 tenía una reducción en viremia en los ratones SCID-HuH-7 en comparación con el 2A-13 natural de 1,9 y 1,5 log10PFU/ml, respectivamente, y se prevé que la base genética se evalúe en una base empírica.
Este análisis de la base genética de los fenotipos especificados por las mutaciones en los virus mutantes de 5-FU
50 que manifestaron una replicación restringida en ratones SCID-HuH-7 indicó que (1) tres mutaciones separadas conferían el fenotipo att; (2) estas mutaciones estaban situadas en dos proteínas, NS1 y NS3, y en la 3' UTR; (3) estas tres mutaciones eran totalmente responsables de cada uno de los fenotipos de cultivo celular (ts o sp) e in vivo (atenuación en cerebro de ratón y ratones SCID-HuH-7) de los virus progenitores; y (4) dos de las tres mutaciones especifican el fenotipo sp de gama de huéspedes (sp sólo en HuH-7) y por lo tanto se prevé que es útil en un virus
55 de vacuna. Aunque se desconoce la relevancia de dichos modelos de trasplante en SCID para la replicación de virus y la enfermedad en seres humanos, se prevé que la identificación de tres mutaciones novedosas que restringen la replicación del virus DEN4 en ratones SCID-HuH-7 facilita un examen de la correlación entre el fenotipo att en ratones SCID-HuH-7 con el de monos rhesus o seres humanos. Se prevé que dichas mutaciones, específicamente las mutaciones sp de gama de huéspedes, son útiles junto con Δ30 u otra mutación para disminuir la virulencia
60 residual de rDEN4Δ30 u otro virus del dengue para el hígado humano, y se prevé que se lleven a cabo estudios para construir dichos virus rDEN4 y evaluarlos en monos y humanos (ejemplo 8).
La combinación de dos mutaciones de 5-FU da como resultado un fenotipo ts aditivo. La capacidad de combinar mutaciones individuales en virus rDEN4 como medio para modular el fenotipo del virus mutante doble resultante es una ventaja principal de uso de tecnología de ADNc recombinante para generar o modificar candidatos a vacuna del virus del dengue. Se prevé que la adición de mutaciones ts y att múltiples a virus de vacunas 5 recombinantes mejora la estabilidad fenotípica del recombinante doble debido a la disminución de la posibilidad de co-reversión de las dos mutaciones a la virulencia natural (Crowe, J.E.Jr. et al. 1994a Vaccine 12:783-790; Skiadopoulos, M.H. et al. 1998 J Virol 72:1762-8; Subbarao, E.K. et al. 1995 J Virol 69:5969-5977; Whitehead, S.S. et al 1999 J Virol 73:871-7). Las mutaciones identificadas en la posición de nt 4995 en NS3 y 7849 en NS5 se combinaron de un clon de ADNc p4 individual y se recuperó un virus recombinante, designado como rDEN4-49957849, y se evaluó para determinar sus fenotipos ts y att (tabla 18). El rDEN4-4995-7849 era más ts que cualquier virus recombinante que contenía las mutaciones individuales (tabla 18), lo que indica el efecto aditivo de las dos mutaciones ts. El virus rDEN4-4995-7849 tenía una reducción de más de 10.000 veces en replicación en los cerebros de ratones lactantes. La reducción en la replicación del virus mutante doble sólo estaba ligeramente incrementada sobre la del rDEN4-7849, sin embargo, sería difícil de detectar una diferencia en el nivel de replicación
15 entre rDEN4-4995-7849 y rDEN4-7849 puesto que el nivel de replicación de ambos virus estaba próximo al límite inferior de detección (2,0 log10PFU/g cerebro).
La combinación de mutaciones de 5-FU seleccionadas con la mutación Δ30 confiere un incremento de la atenuación de rDEN4Δ30 para los cerebros de ratones lactantes. Para definir el efecto de la adición de mutaciones individuales al antecedente de rDEN4Δ30 atenuado, se han construido cinco combinaciones: rDEN4Δ30-2650, rDEN4Δ30-4995, rDEN4Δ30-5097, rDEN4Δ30-8092 y rDEN4Δ30-10634. Se prevé que la adición de dichas mutaciones con pérdida de sentido con varios fenotipos ts, sp y att sirve para disminuir la reactogenicidad de rDEN4Δ30 mientras mantiene inmunogenicidad suficiente.
Se introdujo la mutación Δ30 en la 3' UTR de los clones de ADNc mutantes individuales reemplazando el fragmento MluI -Kpnl con el derivado del clon de ADNc p4Δ30, y se confirmó la presencia de la deleción por análisis de 25 secuencia. Se recuperaron los virus recombinantes por transfección en células C6/36 para cada virus rDEN4. Sin embargo, después de la dilución terminal y el paso, se descubrió que el virus rDEN4Δ30-5097 no crece hasta un valor suficiente en células Vero por lo que no se continuó con su estudio. Este es un ejemplo de un ADNc en el que la mutación de 5-FU y la mutación Δ30 no son compatibles para una replicación eficaz en cultivo celular. Para comenzar el procedimiento de evaluación de los fenotipos in vivo de los otros cuatro virus que se replicaron eficazmente en cultivo celular, los virus rDEN4 que contenían mutaciones individuales y las correspondientes combinaciones de rDEN4Δ30 se sometieron a prueba juntos para determinar los niveles de replicación en el cerebro de ratones lactantes. Los resultados en la tabla 19 indican que la adición de cada una de las mutaciones confiere un incremento en el nivel de atenuación en el crecimiento sobre el virus rDEN4Δ30, similar al nivel conferido por la mutación de 5-FU individual. No se observó efecto sinérgico en la atenuación entre las mutaciones con pérdida de
35 sentido y Δ30. Estos resultados indican que las mutaciones con pérdida de sentido en los nucleótidos 2650, 4995, 8092 y 10634 son compatibles con Δ30 para el crecimiento en el cultivo celular e in vivo y pueden atenuar adicionalmente el virus rDEN4Δ30 en el cerebro de ratón. Se prevé que otros estudios en ratones SCID-HuH-7, monos rhesus y seres humanos establezcan el efecto de la combinación de mutaciones individuales y Δ30 sobre la atenuación y la inmunogenicidad (ejemplo 8).
Identificando las mutaciones específicas en los virus mutantes de 5-FU que confieren los fenotipos observados, se prevé montar un menú de mutaciones ts, sp y att definidas (véase el ejemplo 7). Se prevé que se seleccionen numerosas combinaciones de dos o más de estas mutaciones con o sin la mutación Δ30. Se prevé que dichas mutaciones y sus combinaciones son útiles para la construcción de virus recombinantes con varios niveles de atenuación in vivo, facilitando así la generación de vacunas candidatas con niveles de atenuación, inmunogenicidad
45 y estabilidad genética aceptables.
Ejemplo 4
Generación de virus mutantes de DEN4 con fenotipos sensibles a la temperatura y de atenuación en ratón a través de mutagénesis de carga-agrupada-a-alanina
Los ejemplos previos describían la creación de un panel de virus mutantes de DEN4 con fenotipos ts, sp, y att obtenidos a través de mutagénesis con 5-FU. Como se indica en estos ejemplos, se prevé que las mutaciones atenuantes identificadas en los virus mutantes de 5-FU tienen varios usos incluyendo (1) ajuste del nivel de atenuación de candidatos a vacuna del virus del dengue existentes y (2) generación de nuevos candidatos a vacuna por combinación de dos o más de estas mutaciones atenuantes. En el presente ejemplo, se creó un segundo panel de virus mutantes a través de la mutagénesis carga-agrupada-a-alanina del gen NS5 de DEN4 y se examinaron los
55 virus mutantes resultantes para determinar los fenotipos ts, sp, y att como se describe en los ejemplos 1 y 2. Los virus mutantes de carga-agrupada-a-alanina recuperados demostraron una gama de fenotipos incluyendo ts en células Vero solas, ts en células HuH-7 solas, ts en ambos tipos de células, att en cerebros de ratones lactantes, y att en ratones SCID-HuH-7.
Ya se ha descrito la utilidad de los virus mutantes que expresan estos fenotipos, sin embargo, los virus mutantes de carga-agrupada-a-alanina poseen algunas características deseables adicionales. En primer lugar, se prevé que las mutaciones relevantes se diseñen para su uso en genes que codifican las proteínas no estructurales de DEN4, y por lo tanto se prevé que son útiles para atenuar recombinantes quiméricos antigénicos de DEN1, DEN2 y DEN3 que poseen un antecedente de vector de DEN4. En segundo lugar, normalmente se especifica el fenotipo por tres o más cambios de nucleótidos, haciendo que la probabilidad de reversión de la secuencia mutante a la secuencia natural
5 sea menor que para una mutación puntual individual, tal como las mutaciones identificadas en el panel de los virus mutantes de 5-FU. Finalmente, se prevé que las mutaciones atenuantes de carga-agrupada-a-alanina se puedan combinar fácilmente entre ellas o con otras mutaciones atenuantes para modificar el fenotipo de atenuación de los candidatos a vacuna de DEN4 o de los virus recombinantes quiméricos antigénicos de DEN1, DEN2 y DEN3 que poseen un antecedente de vector de DEN4.
10 Mutagénesis de carga-agrupada-a-alanina. El p4 ADNc, a partir del que se generaron los virus mutantes y naturales recombinantes, se ha descrito en los ejemplos 1, 2 y 3 y en la figura 4. La mutagénesis de cargaagrupada-a-alanina (Muylaert, I.R. et al. 1997 J Virol 71:291-8), en la que se reemplazan pares de aminoácidos cargados con residuos de alanina, se usó para mutagenizar de forma individual la secuencia codificante para 80 pares de aminoácidos cargados contiguos en el gen NS5 de DEN4. Se derivaron subclones adecuados para
15 mutagénesis a partir del plásmido de DEN4 de longitud completa (p4) por digestión con XmaI/Pstl (pNS5A), PstI/SacII (pNS5B) o SacII/MluI (pNS5C) en las posiciones de nucleótidos indicadas en la figura 4. Después se subclonaron estos fragmentos y se llevó a cabo una mutagénesis de Kunkel como se describe en los ejemplos 1 y 3. Para crear cada mutación, se diseñaron oligonucleótidos para cambiar la secuencia de pares de codones individuales a GCAGCX (SEQ ED NO: 69), reemplazándolos de este modo con dos codones de alanina (GCX) y
20 además creando un sitio de restricción Bbvl (GCAGC) (SEQ ID NO: 70). Se añadió el sitio Bbvl para facilitar el cribado de ADNc y virus recombinantes para determinar la presencia de la secuencia mutante. Se volvieron a clonar fragmentos de enzimas de restricción que llevaban mutaciones de alanina en el plásmido p4 de longitud completa como se describe en los ejemplos 1 y 3.
La evaluación inicial del fenotipo de los 32 virus mutantes de carga-agrupada-a-alanina reveló una gama en la
25 restricción de replicación en el cerebro de ratones lactantes y ratones SCID-HuH-7. Para determinar si se pudo potenciar la atenuación combinando mutagénesis, se crearon virus mutantes dobles que llevaban dos pares de mutaciones de carga-agrupada-a-alanina intercambiando fragmentos apropiados que llevan un par de mutaciones en un ADNc de p4 mutagenizado previamente que lleva un segundo par de mutaciones en un fragmento diferente usando técnicas de clonación convencionales.
30 Transcripción y transfección. Se sintetizaron in vitro transcritos con casquete en 5' a partir de plantillas de ADNc mutagenizado usando ARN polimerasa de SP6 AmpliCap (Epicentre, Madison, WI). Se añadieron mezclas de transfección, que consistían en 1 μl de transcrito en 60 μl de HEPES/solución salina más 12 μl de dioleoiltrimetilamonio-propano (DOTAP) (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN), junto con 1 ml de medio libre de suero de producción de virus (VP-SFM) a monocapas subconfluentes de células Vero en placas de 6 pocillos. Se
35 incubaron monocapas transfectadas a 35 ºC durante aproximadamente 18 h, se retiró el medio de cultivo celular y se reemplazó con 2 ml de VP-SFM, y se incubaron las monocapas de células a 35 ºC. Después de 5 a 6 días, se recogió el medio de cultivo y se determinó la presencia de virus por valoración en células Vero seguido de tinción con inmunoperoxidasa como se describe previamente Se amplificó el virus recuperado por un paso adicional en células Vero, y se combinaron las suspensiones de virus con estabilizador SPG (sacarosa-fosfato-glutamato)
40 (concentración final: sacarosa 218 mM, ácido L-glutámico 6 mM, fosfato de potasio, monobásico 3,8 mM, y fosfato de potasio, bibásico 7,2 mM, pH 7,2), se alicuotó, se congeló sobre hielo seco y se almacenó a -70 ºC.
Se usaron las construcciones de ADNc que no proporcionaron virus después de la transfección de células Vero para transfectar células C6/36 como sigue. Se añadieron mezclas de transfección, como se describe anteriormente, junto con 1 ml de MEM que contenía suero fetal bovino (FBS), L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 2 mM y 0,05
45 mg/ml de gentamicina, a monocapas de células C6/36. Se incubaron monocapas de células transfectadas a 32 ºC durante 18 h, se retiró el medio de cultivo celular y se reemplazó con 2 ml de medio recién preparado, y se incubaron las monocapas de células a 32 ºC. Después de 5 a 6 días, se usaron los medios de cultivo celular a continuación para infectar células Vero y se incubaron durante 5-6 días, tiempo en el que se recogieron los medios de cultivo celular, se congelaron y se valoraron como se describe anteriormente.
50 Se clonaron biológicamente los virus recuperados por dos rondas de dilución terminal en células Vero seguido de una amplificación adicional en células Vero. En resumen, inicialmente se diluyó el virus hasta una concentración de aproximadamente 20 PFU/ml en VP-SFM y después se sometió a una serie de diluciones de dos veces en una placa de 96 pocillos. Se usaron diluciones de virus para infectar monocapas de células Vero en una placa de 96 pocillos y se incubó durante de 5 a 6 días a 35 ºC. Después de la incubación, se retiraron los medios de cultivo celular y se
55 almacenaron temporalmente a 4 ºC, y se identificaron las monocapas de células positivas para virus por tinción con inmunoperoxidasa. Se logró la dilución terminal cuando ≤ 25 % de las monocapas de células eran positivas para virus. Se sometió el medio de cultivo celular de una monocapa positiva a dilución terminal a una ronda adicional de dilución terminal. Después de la segunda dilución terminal, se amplificó el virus en células Vero (matraz de 75 cm2), se recogió y se congeló como se describe previamente.
60 Ensayos para determinar la sensibilidad a la temperatura y la atenuación en ratón. Se llevó a cabo un ensayo del nivel de sensibilidad a la temperatura de los virus mutantes de carga-agrupada-a-alanina en células Vero y HuH7 y de su nivel de replicación en el cerebro de ratones lactantes como se describe en el ejemplo 1 y se llevó a cabo un ensayo del nivel de replicación en ratones SCID-HuH-7 como se describe en el ejemplo 3.
Los virus mutantes de carga-agrupada-a-alanina son viables y muestran fenotipos sensibles a la temperatura y de atenuación en ratón. De 80 construcciones de ADNc de DEN4 de longitud completa que 5 contenían un único par de mutaciones de carga-a-alanina, se recuperó el virus de 32 en células Vero o bien C6/36 (figura 5). El nivel de sensibilidad a la temperatura de rDEN4 wt, rDEN4Δ30 y los 32 virus mutantes se resumen en la tabla 20. Un virus mutante (645-646) era ts en células Vero pero no en HuH-7 y 7 virus mutantes eran ts en células HuH-7 pero no en Vero. Dichos mutantes con sensibilidad a la temperatura dependiente de la célula huésped se denominan mutantes de gama de huéspedes sensibles a la temperatura (tshr). Trece virus mutantes eran ts en 10 ambos tipos de células y 11 virus mutantes no eran ts en ningún tipo de célula. Por tanto, un total de 21 virus mutantes eran ts mostrando 8 virus mutantes una especificidad tshr. Ninguno de los virus mutantes mostró un fenotipo de placa pequeña a la temperatura permisiva. Los virus mutantes mostraron un amplio intervalo (de 0 a
10.000 veces) de replicación restringida en el cerebro de ratones lactantes (tabla 20). Se atenuaron catorce virus mutantes en el cerebro de ratones lactantes, definidos de forma arbitraria como una reducción de ≥ 1,5 log10-unidad
15 en el valor del virus. No existió correlación entre la atenuación en el cerebro de ratón y la sensibilidad a la temperatura en células Vero (correlación por rangos de Kendall: P = 0,77) o bien células HuH-7 (correlación por rangos de Kendall: P = 0,06).
Trece virus mutantes que mostraron un fenotipo att en el cerebro de ratones lactantes o bien en los que el par de aminoácidos cargados no mutado estaba altamente conservado entre los cuatro serotipos de DEN (véase el ejemplo 20 7) se sometieron a ensayo para determinar att en ratones SCID-HuH-7 (tabla 21). Tres de estos virus mutantes mostraron una disminución de > 100 veces en la replicación con relación a DEN4 natural. En términos generales, la reducción logarítmica media del tipo natural en ratones lactantes no mostró una correlación significativa con la reducción logarítmica media en ratones SCID-HuH-7 (correlación por rangos de Spearman, N = 13, P = 0,06). Sin embargo, el virus mutante 200-201 era inusual porque mostró un alto nivel de restricción en ratones SCID-HuH-7
25 pero poca restricción en el cerebro de ratones lactantes. Cuando se retiró el virus 200-201 del análisis, la restricción de la replicación en ratones lactantes y SCID-HuH-7 mostró una correlación significativa (correlación por rangos de Spearman, N = 12, P = 0,02).
La combinación de mutaciones de carga-agrupada-a-alanina presentes en dos virus en un virus puede potenciar sus fenotipos ts y att. Se combinaron seis mutaciones emparejadas en catorce virus mutantes de pares 30 dobles, de los que se pudieron recuperar seis en células Vero o C6/36 (tabla 22). Todas las mutaciones emparejadas individuales usadas en los virus mutantes de pares dobles eran ts en células HuH-7, ninguno era ts en células Vero, y para todas las combinaciones al menos un par de mutación confirió un fenotipo att en el cerebro de ratones lactantes. La evaluación de cuatro de los virus mutantes de pares dobles (tabla 23) reveló que combinando pares de mutaciones de carga-agrupada-a-alanina dio como resultado de forma invariable la adquisición de un
35 fenotipo ts en células Vero (4 de 4 virus) y a menudo dio como resultado una disminución en la temperatura de suspensión en células HuH-7 (3 de cada 4 virus). En la mitad de los virus sometidos a ensayo, la combinación de pares de mutaciones de carga-agrupada-a-alanina dieron como resultado una potenciación de la restricción de la replicación (10 veces más que cada mutación de componente) en el cerebro de ratones lactantes (tabla 23) y en células SCID-HuH-7 (tabla 24).
40 Sumario. La principal utilidad de las mutaciones de carga-agrupada-a-alanina proviene de su diseño: están situadas en la región del gen no estructural de DEN4 y por lo tanto se prevé que son útiles para atenuar el propio DEN4 así como virus quiméricos antigénicos que poseen la región de gen NS de DEN4. Además, se predice que son fenotípicamente más estables que los virus mutantes con sustitución de nucleótidos individual tales como los virus mutantes de 5-FU. Finalmente, se prevé que las combinaciones de mutaciones se crean para ajustar la atenuación y
45 para estabilizar adicionalmente los fenotipos.
Ejemplo 5
Identificación y caracterización de virus mutantes de DEN4 restringidos en replicación en mosquitos
SECCION 1. Identificación de virus que muestran una restricción de la replicación en mosquitos.
En los ejemplos 1 y 4, se generaron virus mutantes de DEN4 a través de mutagénesis con 5-FU y mutagénesis de
50 carga-agrupada-a-alanina, respectivamente, para identificar mutaciones que confieren fenotipos ts, sp y att. Otro fenotipo altamente deseable de una vacuna del virus del dengue es el crecimiento restringido en el huésped del mosquito. Un candidato a vacuna del virus del dengue no debe ser transmisible desde seres humanos a mosquitos para evitar tanto la introducción de un virus del dengue en un entorno en el que no es actualmente endémico como para evitar la posible pérdida del fenotipo de atenuación durante la replicación prolongada en un huésped de
55 mosquito individual. La pérdida del fenotipo de atenuación también se puede producir después de la transmisión sostenida entre seres humanos u mosquitos. Recientemente, se observó la pérdida de atenuación de una vacuna de poliovirus vivo atenuado después de la transmisión sostenida entre seres humanos (CDC 2000 MMWR 49:1094).
En el presente ejemplo, se sometió a ensayo un panel de 1248 virus mutantes de DEN4 generados a través de mutagénesis con 5-FU y 32 virus mutantes de DEN4 generados a través de mutagénesis de carga-agrupada-aalanina para determinar el crecimiento restringido en células de mosquito. Este es un ensayo preliminar útil para la restricción in vivo, puesto que la restricción en células de mosquito cultivadas a menudo, aunque no siempre, está asociada con una infectividad mala para mosquitos (Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74:3020-8). Se dirigieron virus
5 mutantes que mostraron restricción en células de mosquito y un crecimiento fuerte en células Vero (el sustrato para el desarrollo de la vacuna, como se analiza en el ejemplo 6) para caracterización adicional.
Generación y caracterización del mutante 5-1A1. Se ha descrito la generación y caracterización del panel de 1248 virus mutantes de 5-FU y del panel de 32 virus mutantes de carga-agrupada-a-alanina en los ejemplos 1, 2 y 4. Se mantuvieron células Vero y C6/36 como se describe en el ejemplo 1.
10 Se valoró cada uno de los 1248 virus mutantes de 5-FU y 32 virus mutantes de carga-agrupada-a-alanina en monocapas de células C6/36 en placas de 24 pocillos a 32 ºC y CO2 al 5 %. Después de 5 días, se sometieron a inmunotinción las placas con anticuerpo policlonal anti-DEN4 de ratón y se contaron como se describe en los ejemplos anteriores. Se sometieron a ensayo los virus mutantes para determinar uno de los fenotipos, lo que indica el crecimiento restringido en células de mosquito: sp en células C6/36 con relación a células Vero o bien una
15 disminución de > 3,5 log10 PFU/ml en el valor entre células Vero y C6/36 a la temperatura permisiva para cada tipo de células. Dos virus mutantes, uno generado por mutagénesis con 5-FU (n.º 5) y uno generado por mutagénesis de carga-agrupada-a-alanina (rDEN4-356,357), mostraron una reducción en el tamaño de placa en células C6/36. Después de tres diluciones terminales, el mutante de 5-FU n.º 5, designado como 5-1A1, mantuvo el fenotipo de tamaño de placa reducido. Adicionalmente, el virus recombinante rDEN4-7546, sometido a prueba para determinar
20 la adaptación a las células Vero (analizado en detalle en el ejemplo 6) también mostró una reducción en el tamaño de placa en C6/36 (figura 10).
Se determinaron las cinéticas del crecimiento en muticiclos tanto de 5-1A1 como del rDEN4 natural recombinante en células C6/36 como se describe en el ejemplo 1. En resumen, se infectaron células por triplicado a una multiplicidad de infección de 0,01 y se recogieron células a intervalos de 24 h. Se ultracongelaron las muestras y se valoraron en
25 un único ensayo en monocapas de células Vero.
Infección oral de mosquitos. Aedes aegypti es uno de los vectores primarios del virus del dengue (Gubler, D.J. 1998 Clin Microbiol Rev 11:480-96). Se crió esta especie a 26 ºC y a una humedad relativa del 80 % (HR) con un ciclo de luz de 16 h. Se dejó que los adultos tuvieran acceso continuo a una almohadilla de algodón impregnada con una solución de sacarosa al 10 %. A hembras de Ae. aegypti de cinco a diez días de edad que se habían privado de 30 una fuente de azúcar durante 48 h se las alimentó con sangre ingerida que consistía en volúmenes iguales de eritrocitos humanos lavados, solución de sacarosa al 10 % y suspensión del virus del dengue. Se preparó de inmediato la sangre ingerida infectada antes de alimentar y ofrecer a los mosquitos en un alimentador con camisa de agua cubierto con Parafilm estirado y precalentado hasta 38 ºC (Rutledge, L.C. et al. 1964 Mosquito News 24:407419). Se transfirieron los mosquitos que tomaron sangre ingerida completa en 45 min, a un nuevo recipiente por
35 aspirador y se mantuvieron como se describe anteriormente. Después de 21 días, se almacenaron los mosquitos a 20 ºC hasta su disección.
Inoculación intratorácica de los mosquitos. El mosquito no hematófago, grande Toxorhynchites splendens es un huésped sensible para determinar la infectividad del virus del dengue. Se crió esta especie a 24 ºC y HR del 75 % con un ciclo de luz de 12 h. Se alimentaron las larvas y las crisálidas de Aedes larvae con el tamaño apropiado; se 40 dejó que los adultos tuvieran acceso continuo a una almohadilla de algodón impregnada con una solución de sacarosa al 10 %. Se inmovilizaron grupos de T. splendens adultos de uno a diez días de edad de ambos sexos por inmersión de su recipiente en un baño de agua helada y se inocularon por vía intratorácica con virus no diluido y diluciones de diez veces en serie del virus en 1X PBS. Se inoculó el virus en una dosis de 0,22 μl usando un aparato microinyector de Harvard (Medical Systems Corp, Greenvale NY) y una aguja de vidrio calibrada (la técnica es una
45 modificación del procedimiento descrito en Rosen y Gubler, 1974).
Detección de antígeno vírico en tejidos del cuerpo y de la cabeza por ensayo de inmunofluorescencia (IFA). Se realizaron preparaciones de la cabeza y del intestino medio de Aedes aegypti y preparaciones de la cabeza de Toxorhynchites splendens sobre portaobjetos de vidrio como se describe en Sumanochitrapon et al. (Sumanochitrapon, W. et al. 1998 Am J Trop Med Hyg 58:283-6). Se fijaron los portaobjetos en acetona durante 20 50 min, y se situaron a 4 ºC hasta que se procesaron por IFA. Se diluyó el anticuerpo primario, líquido ascítico de ratón hiperinmunitario específico para DEN-4 (HMAF), a 1/100 en PBS-Tween 20 (0,05 %). Se incubaron los portaobjetos a 37 ºC en una cámara húmeda durante 30 min, y posteriormente se aclararon en PBS-Tween 20. Se diluyó el anticuerpo secundario, IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC (KPL, Gaithersburg, MD), a 1/200 en PBS-Tween 20 con Evan's Blue al 0,002 %. Se observaron los portaobjetos en un microscopio Olympus BX60. Se
55 determinó la dosis infecciosa requerida para infectar al 50 % de los mosquitos (DI50) por el procedimiento de Reed y Muench (Reed, LJ. & Muench, H. 1938 Am J Hyg 27:493-497). Para infecciones por Aedes aegypti, se calcularon dos valores de OID50 (dosis infecciosa oral 50) para cada virus: la OID50 requerida para producir una infección en el intestino medio, con o sin diseminación a la cabeza, y la OID50 requerida para producir infección por diseminación. Para Tx. splendens, se calculó un valor de MID50 (dosis infecciosa de mosquito 50).
60 Análisis estadístico. Se comparó el porcentaje de mosquitos infectados por diferentes virus usando un análisis por regresión logístico (Statview, Abacus Inc.).
Las mutaciones que restringen el crecimiento de DEN4 en células de mosquito pero no en células Vero son poco comunes. De 1280 virus mutantes sometidos a ensayo inicialmente, sólo dos n.º 5 y rDEN4-356,357, mostraron una reducción en el tamaño de placa en células C6/36 y tamaño de placa normal en células Vero. Se
5 detectó un virus adicional, rDEN4-7546 (descrito en el ejemplo 6), con una reducción en el tamaño de placa en C6/36 en posteriores ensayos. Se clonó el virus mutante n.º 5 por tres diluciones terminales sucesivas y se designó como 5-1A1; ya se habían diluido de forma terminal dos veces rDEN4-7546 y rDEN4-356.357 cuando se sometieron a prueba en células C6/36. Se ha caracterizado exhaustivamente el virus 5-1A1 y sus fenotipos se describen con detalle en la siguiente sección. Se prevé que rDEN4-356,357 y rDEN4-7546 se caracterizan de forma similar.
10 Tamaño de placa y cinética de crecimiento de 5-1A1. Se replicó 5-1A1 a 6,7 log10PFU/ml en células Vero con un tamaño de placa normal y se replicó a 7,6 log10PFU/ml en células C6/36 con un tamaño de placa pequeño (figura 6, tabla 25). En comparación, se replicó el DEN4 natural usado como control concurrente a 7,3 log10PFU/ml en células Vero, 8,3 log10PFU/ml en células C6/36, y mostró un tamaño de placa normal en ambos tipos de células (figura 6, tabla 25). Se comparó la cinética de crecimiento de 5-1A1 con la de DEN4 natural infectando células C6/36 a una
15 MOI de 0,01 y monitorizando la producción de virus infeccioso. La cinética y magnitud de replicación de 5-1A1 en células C6/36 era comparable a la de DEN4 natural (figura 7).
5-1A1 está restringido en su capacidad para infectar mosquitos. Se evaluó el 5-1A1 para determinar su capacidad para infectar mosquitos Aedes aegypti a través de sangre ingerida artificial (tabla 26). En este ensayo, se miden por separado la capacidad para infectar el intestino medio del mosquito y la capacidad de que una infección 20 de intestino medio se disemine a la cabeza. La dosis infecciosa oral 50 (OID50) de DEN4 natural para el intestino medio era de 3,3 log10 PFU; la OID50 de DEN4 natural para una infección diseminada era de 3,9 log10 PFU. Por el contrario, el 5-1A1 nunca infectó un 50 % de los mosquitos ala dosis usada. Para calcular la OID50 para infecciones de intestino medio por 5-1A1, se asumió que a una dosis 10 veces mayor, el 100 % de los 25 mosquitos habrían resultado infectados. Usando esta suposición, la estimación conservadora de OID50 para infecciones de intestino
25 medio por 5-1A1 era > 3,9 log10PFU. Debido a que 5-1A1 sólo produjo 3 infecciones diseminadas, no se intentó calcular una OID50 para esta categoría. El 5-1A1 estaba significativamente restringido en su capacidad para infectar el intestino medio con relación al DEN4 natural (regresión logística, N = 150, P < 0,001). Adicionalmente, el 5-1A1 produjo infecciones muy poco diseminadas, pero debido al bajo número, este resultado no era susceptible de análisis.
30 El 5-1A1 también estaba significativamente restringido en su capacidad para infectar mosquitos Tx. splendens después de inoculación intratorácica (tabla 27). La MID50 de DEN4 natural era de 2,3 log10 PFU mientras que se estimó que la MID50 de 5-1A1 era > 3,0 log10 PFU (regresión logística, N = 36, P < 0,01).
El 5-1A1 no muestra un fenotipo ts o att. Se sometió a prueba el 5-1A1 para determinar su sensibilidad a la temperatura en células Vero y HuH-7 y para determinar su atenuación en cerebros de ratones lactantes como se
35 describe en el ejemplo 1. El virus mutante no era sensible a la temperatura, como se define en el ejemplo 1, y no estaba atenuado en el cerebro de ratones lactantes (tabla 25).
Identificación y confirmación de la mutación responsable del fenotipo de 5-1A1. Se determinó la secuencia de nucleótidos del genoma completo de 5-1A1 como se describe en el ejemplo 1. La secuenciación de 5-1A1 reveló tres cambio de la secuencia natural: dos mutaciones puntuales traduccionalmente inactivas en las posiciones 7359 y
40 9047, y una mutación puntual codificante (C a U) en la posición 7129 en el gen NS4B que dio como resultado una sustitución de prolina a leucina.
Para confirmar formalmente el efecto de la mutación C7129U, se insertó la mutación en el p4 ADNc, que se ha descrito en los ejemplos 1, 2, y 3 y en la figura 4, usando mutagénesis de Kunkel como se describe en los ejemplos 1 y 3. Se transcribió el ADNc mutagenizado y se transfectó como se describe en el ejemplo 3, y el virus resultante, 45 después de dos diluciones terminales, se designó como rDEN4-7129-1A. Al igual que 5-1A1, rDEN4-7129-1A mostró un tamaño de placa y un valor normales en células Vero y un tamaño de placa reducido y un valor normal en células C6/36 (tabla 25). El rDEN4-7129-1A no era ts en células Vero ni HuH-7 y no era att en el cerebro de ratones lactantes. Adicionalmente, rDEN4-7129-1A no mostró el fenotipo att de SCID-HuH-7 descrito en el ejemplo 3 (tabla 25). Se prevé que la capacidad de rDEN4-7129-1A para infectar mosquitos se someta a prueba tanto para Ae.
50 aegypti como para Tx. splendens.
Para someter a prueba la compatibilidad de la mutación C7129U y la deleción de Δ30, se insertó la mutación C7129U en rDEN4Δ30 usando técnicas descritas previamente. Se prevé que el virus resultante, designado como rDEN4Δ30-7129, se someta a prueba para determinar los fenotipos enumerados en la tabla 25.
En resumen, tres virus mutantes, 5-1A1, rDEN4-356,357 y rDEN4-7546, mostraron una combinación particular de
55 fenotipos caracterizada por un tamaño de placa normal y replicación a valores altos en células Vero y un tamaño de placa pequeño pero crecimiento no restringido en células de mosquito. Se caracterizó adicionalmente 5-1A1 y careció de sensibilidad a la temperatura tanto en células Vero como HuH-7 y mostró niveles de replicación normales en el cerebro de ratones y en ratones SCID-HuH-7 y una infectividad restringida para ambos mosquitos Ae. aegypti y Tx. splendens. En comparación con el rDEN4 natural, el mutante 5-1A1 tenía una mutación codificante: una mutación puntual (C a U) en el nucleótido 7129 en NS4B dando como resultado un reemplazo de Pro por Leu. Debido a que 5-1A1 contiene sólo una única mutación con pérdida de sentido, el fenotipo de este virus mutante se puede atribuir al efecto de la mutación en la posición 712,9. Estos resultados indican que la mutación 7129 es
5 responsable del fenotipo de infectividad disminuida para mosquitos y se predice que es útil para la replicación restringida de candidatos a vacuna en mosquitos. Para confirmar formalmente esto, se ha insertado la mutación 7129 en un virus DEN4 recombinante. El virus resultante, designado como rDEN4-7129-1A, muestra una ausencia de fenotipos ts y att similar a 5-1A1. Se prevé que se someta a prueba para determinar la infectividad de mosquitos.
La mutación 7129 es una mutación puntual valiosa para incluir en un candidato a vacuna de DEN4 y en cada uno de
10 los candidatos a vacuna quiméricos antigénicos del virus del dengue puesto que su actividad biológica es específica de huésped, es decir, está restringida en replicación en mosquitos pero no en mamíferos. Además, como se analiza en el ejemplo 6, también se ha demostrado que la mutación 7129 potencia la replicación en células Vero. Por tanto, se prevé que su inserción en un candidato a vacuna potencie la producción de vacuna en el cultivo de tejido sin afectar a las propiedades biológicas especificadas por otras mutaciones atenuantes. También se prevé proporcionar
15 una garantía útil contra la transmisión por mosquito de una vacuna para el virus del dengue.
SECCIÓN II. Diseño de mutaciones para restringir la replicación en mosquitos
En la sección 1 del ejemplo 5, se cribó un gran panel de virus mutantes que llevan ambas mutaciones aleatorias (generadas con 5-fluorouracilo) y mutaciones específicas (generadas a través de mutagénesis de carga-agrupada-aalanina) para el crecimiento restringido en células C6/36, una medida representativa para la restricción en 20 mosquitos. Sin embargo, en ningún caso eran mutaciones diseñadas para el propósito específico de restringir la replicación en mosquitos. En esta sección, se identificaron secuencias de nucleótidos en la 3' UTR que muestran diferencias conservadas entre los flavivirus transmitidos por mosquito y los transmitidos por garrapatas. Después, se alteraron esas secuencias en el p4 ADNc de DEN4 delecionándolas por completo o bien intercambiándolas con la secuencia homóloga del virus de Langat transmitido por garrapatas. Se sometieron a ensayo los virus resultantes
25 para determinar el tamaño de placa reducida en ambas células Vero y C6/36 y para determinar la infectividad para Ae. aegypti y Tx. splendens.
Identificación y modificación de secuencias de 3' UTR particulares que muestran diferencias conservadas entre vectores. Varios estudios (Olsthoorn, R.C. & Bol, J.F. 2001 SNA 7:1370-7; Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-202) han identificado diferencias conservadas en las secuencias de nucleótidos de la 3' UTR de
30 flavivirus transmitidos por mosquitos y transmitidos por garrapatas. Dichas diferencias se concentran en la región de núcleo terminal en 3', los aproximadamente 400 nucleótidos terminales en 3'. Se ha sugerido que estas secuencias pueden tener una función específica de vector (Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-202). Aunque aún no se ha identificado dicha función, no obstante, puede ser posible alterar la infectividad del vector delecionando o de otro modo alterando estos nucleótidos.
35 Para identificar secuencias diana para este tipo de alteración, se construyó una alineación de las secuencias de nucleótidos de 3' UTR de siete flavivirus transmitidos por mosquitos y cuatro flavivirus transmitidos por garrapatas (figura 8). A partir de esta alineación, se identificaron varias secuencias que mostraron diferencias conservadas entre los flavivirus transmitidos por mosquitos y flavivirus transmitidos por garrapatas. Después se diseñaron cebadores para alterar estas secuencias en el p4 ADNc de DEN4 natural (figura 4) en una de dos maneras: 1) deleción de los
40 nucleótidos (Δ) o 2) reemplazo de los nucleótidos con la secuencia homóloga del flavivirus Langat transmitido por garrapatas (intercambio "swap"). Se eligió el Langat como plantilla para nucleótidos intercambiados porque está atenuado de forma natural (Pletnev, A.G. 2001 Virology 282:288-300), y por lo tanto, es poco probable que potencie la virulencia del virus rDEN4 derivado del ADNc modificado. Las secuencias de DEN4 alteradas y los cebadores de mutagénesis usados para realizar esto se enumeran en la tabla 28. Los nucleótidos 10508-10530 corresponden a la
45 región CS2 identificada en estudios previos (Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25:1194-202).
Se llevaron a cabo la mutagénesis de p4, transcripción y transfección como se describe previamente en la sección I de este ejemplo. Se recuperaron los cinco virus modificados y se sometieron todos a dos rondas de dilución terminal como se describe previamente.
Evaluación de fenotipos: cultivo celular. Se valoraron los virus en células Vero y C6/36 como se describe
50 previamente, y se enumeran los resultados en la tabla 29. Todos los virus se replicaron a >5,0 log10 PFU/ml; uno de ellos (rDEN4Δ10508-10530) se replicó a > 8,0 log10 PFU/ml. Sólo uno de los virus (rDEN4Δ10535-10544) era de placa pequeña en células C6/36; este virus mostró un tamaño de placa natural en células Vero. De forma interesante, otro virus (rDEN4swap 10508-10539) mostró un tamaño de placa natural en células C6/36 pero era sp en células Vero.
55 Evaluación de fenotipos: infectividad por mosquito. Hasta la fecha, se ha sometido a prueba uno de los cinco virus para determinar su infectividad por medio de inoculación intratorácica en Tx. splendens, usando procedimientos descritos previamente. El virus rDEN4Δ10508-10530 estaba restringido de forma espectacular en su infectividad con relación al tipo natural (tabla 30). Se infectaron tan pocos mosquitos que no fue posible calcular una MID50 para este virus.
Se ha sometido a prueba uno de los cinco mosquitos para determinar la infectividad de Ae. aegypti alimentado con sangre ingerida infecciosa usando procedimientos descritos previamente. El rDEN4swap10535-10544 (tabla 31) provocó significativamente menos infecciones de intestino medio que el rDEN4 natural, pero el porcentaje de infecciones diseminadas no difirió entre rDEN4swap10535-10544 y rDEN4 natural. Se prevé que todos los virus se
5 sometan a prueba para determinar la infectividad por mosquito usando ambos procedimientos.
Sumario. En este ejemplo se han explicado dos estrategias diferentes para evitar la transmisión por mosquito de una vacuna del dengue. En primer lugar, se ha demostrado que varias mutaciones de sustitución pequeñas, incluyendo dos mutaciones puntuales y una sustitución de carga-a-alanina emparejada, restringen la replicación de DEN4 en células C6/36 de mosquito en cultivo celular, y se ha demostrado que una de estas mutaciones (C7129U) 10 restringe la capacidad del virus DEN4 para infectar mosquitos. En segundo lugar, se ha creado una variedad de mutaciones de deleción y sustitución en regiones de la 3' UTR de DEN4 que muestran diferencias conservadas entre los flavivirus transmitidos por mosquitos y transmitidos por garrapatas. Uno de estos virus es sp en células C6/36 y al menos dos de estos virus muestran algún grado de restricción de la infectividad por mosquito. Por diseño, las secuencias de nucleótidos en las que se realizan estas mutaciones están altamente conservadas entre los cuatro
15 serotipos del dengue y entre los flavivirus transmitidos por mosquitos en general, lo que indica que son transportables a otros candidatos a vacuna para flavivirus transmitidos por mosquitos. Todas las mutaciones analizadas en este ejemplo entran dentro de los genes estructurales y de este modo se prevé que son útiles en la construcción de candidatos a vacuna quiméricos antigénicos.
Ejemplo 6
20 Mutaciones de adaptación que potencian la replicación de virus DEN4 y quiméricos de DEN4 en células Vero.
Las células Vero son un sustrato altamente caracterizado que debe ser adecuado para la fabricación de vacunas de flavivirus vivos atenuados, tales como el virus del dengue y el virus de encefalitis transmitido por garrapatas. Además, también se pueden usar células Vero para hacer crecer flavivirus hasta un valor alto para la preparación de 25 una vacuna de virus inactivado. No se han identificado secuencias óptimas para el crecimiento eficaz de virus del dengue en células Vero, pero es bien conocido que los flavivirus acumulan mutaciones durante el paso en varios cultivos celulares (Dunster, L.M. et al. 1999 Virology 261:309-18; Theiler, M. & Smith, H.H. 1937 J Exp Med 65:787800). La inclusión de secuencias específicas en virus vivos atenuados que potencien su replicación en células Vero y el incremento en el número de dosis de vacuna producido por sustrato unitario facilitaría enormemente su 30 fabricación. De forma similar, la inclusión de secuencias que promueven el crecimiento en células Vero en virus naturales usados para la preparación de una vacuna de virus inactivado también facilitaría enormemente la fabricación de la vacuna. El presente ejemplo identifica mutaciones que se producen después del paso del virus DEN4 y de los virus quiméricos de DEN2/4 en células Vero. Los datos derivados de cinco fuentes proporcionaron información para este análisis haciendo posible generar una lista de secuencias promotoras del crecimiento en
35 células Vero.
Presencia de mutaciones idénticas en virus mutantes de 5-FU múltiples. En primer lugar, como se describe en los ejemplos 1 y 2, se secuenciaron completamente los genomas de 42 clones de virus del dengue aislados de una reserva de virus mutagenizada con 5-FU. Si las mutaciones que potencian la replicación se produjeron durante el paso de estos 42 virus mutantes en células Vero, entonces dichas mutaciones se deberían revelar por sí mismas por 40 representación en más de un clon. El análisis de las 42 secuencias reveló la aparición de mutaciones con pérdida de sentido específicas en regiones codificantes o sustituciones de nucleótidos en UTR en clones múltiples que no están presenten en el genoma del virus progenitor 2A (tablas 11 y 32). Estas mutaciones, de las que muchas se producen dentro de una sección de 400 nucleótidos de la región codificante de NS4B, representan mutaciones de adaptación de células Vero. Se descubrió que una mutación, tal como la mutación 4995, presente en ocho virus especifica
45 ambos fenotipos ts y att (ejemplos 1 y 3). Por el contrario, la mutación 7163, presente en seis virus, no especifica un fenotipo ts ni att (tabla 13) y por tanto es un ejemplo de una mutación promotora del crecimiento en células Vero.
Presencia de mutaciones de adaptación en células Vero en otros virus DEN4 y virus quiméricos antigénicos de DEN2/4. En segundo lugar, se hizo crecer el virus del dengue 2A-13 que se usó como control natural de paso paralelo durante los experimentos con 5-FU descritos en el ejemplo 1 y se clonó en células Vero en ausencia de 550 FU de manera idéntica a la de los virus tratados con 5-FU. El análisis de secuencias de este virus no tratado con 5-FU, designado como 2A-13-1A1, reveló que el genoma del virus contenía una mutación en el nucleótido 7163 (ejemplo 1 y tabla 32), idéntica a la mutación con pérdida de sentido identificada previamente en 6 de los virus mutantes de 5-FU (tablas 11 y 32). Esto indica que el crecimiento y el paso del virus DEN4 en células Vero es suficiente para adquirir esta mutación específica, es decir, no se requiere una mutagénesis con 5-FU. Por tanto, la
55 información de dos fuentes separadas indica que la mutación 7163 apareció en virus de paso de células Vero separados, fortaleciendo de este modo la interpretación de que esta mutación es promotora del crecimiento.
En tercer lugar, después del paso de 2AΔ30 y rDEN4Δ30 en células Vero, el análisis de secuencias reveló la presencia de una mutación en los nucleótidos 7153 y 7163, respectivamente. También se identificaron previamente estas dos mutaciones entro los virus tratados con 5-FU (tabla 32). De nuevo, aparecieron mutaciones idénticas 60 después del paso independiente del virus en células Vero, corroborando la hipótesis de que estas mutaciones
confieren una ventaja en el crecimiento en células Vero.
En cuarto lugar, se generó un candidato a vacuna del virus del dengue quimérico antigénico que expresó las proteínas estructurales C, prM, y E de DEN2 en un antecedente genético natural de DEN4 o un antecedente genético de Δ30 atenuado. Para construir este virus, se reemplazó la región C, prM y E del plásmido p4 de ADNc 5 natural por una región similar de la cepa del virus DEN2 NGC (figura 10). Específicamente, se reemplazaron nucleótidos entre los sitios de restricción Bgfll (nt 88) y Xhol (nt 2345) de p4 por los derivados del virus de tipo 2 del dengue. Se transfectaron transcritos de ARN del plásmido p4-D2 resultante en células Vero y se recuperó el virus rDEN2/4. Se recuperó una versión atenuada adicional de este virus quimérico que contenía la mutación Δ30, rDEN2/4Δ30, en células de mosquito C6/36 después de la transfección de células con transcritos de ARN derivados 10 p4Δ30-D2. Sin embargo, no se puedo recuperar directamente rDEN2/4Δ30 en células Vero. El virus mutante rDEN2/4Δ30 recuperado en células C6/36 se replicó a niveles muy bajos en células Vero (<1,0 log10PFU/ml) pero creció a un valor alto en células C6/36 (>6,0 log10PFU/ml). La secuencia genómica del virus derivado de C6/36 coincidió con la secuencia de ADNc prevista y se muestra en el apéndice 3. No obstante, cuando el rDEN2/4Δ30 derivado de C6/36 se pasó en serie de 3 a 4 veces en células Vero, apareció una población de virus adaptada para 15 el crecimiento en células Vero. Se clonó el virus de preparación adaptada a células Vero y se amplificó en células Vero hasta un valor >6,0 log10PFU/ml. Se determinó la secuencia genómica para 2 clones de virus independientes y se comparó con la secuencia de ADNc prevista (tabla 33 y 34). Cada virus clonado contiene una mutación en un gen no estructural que coincide estrechamente en su ubicación o secuencia con una mutación identificada previamente entre el panel de virus mutagenizados con 5-FU. Las otras mutaciones en estos dos clones también podrían conferir
20 una ventaja de crecimiento en células Vero. De forma importante, las mutaciones identificadas en las tablas 33 y 34 se requieren totalmente para la replicación en células Vero, y no sería posible producir el candidato a vacuna rDEN2/4Δ30 en células Vero sin las mutaciones promotoras del crecimiento identificadas en las tablas 33 y 34.
En quinto lugar, el análisis de secuencia de la cepa del virus natural 4 del dengue 814669 (número de referencia de GenBank AF326573) después del paso en células Vero identificó una mutación en la región de NS5 en el nucleótido
25 7630 que se había identificado previamente entre el panel de virus mutagenizados con 5-FU (tabla 32). Se introdujo esta mutación en el nucleótido 7630 en el virus recombinante rDEN4 por mutagénesis dirigida a sitio como se describe en la tabla 16. El virus resultante, rDEN4-7630, no era sensible a la temperatura cuando se sometió a prueba a 39 ºC, lo que indica que la mutación 7630 no contribuye a la sensibilidad a la temperatura.
Caracterización de virus quiméricos rDEN2/4Δ30 que contienen mutaciones de adaptación de células Vero
30 únicas y múltiples. La generación del virus quimérico rDEN2/4Δ30 proporcionó una oportunidad única para evaluar la capacidad de mutaciones individuales de promover un incremento en el crecimiento en células Vero. Debido a que rDEN2/4Δ30 se replica a un valor muy bajo en células Vero, aún se puede generar eficazmente en células de mosquito C6/36, en primer lugar, se generaron virus recombinantes que llevan mutaciones de adaptación a células Vero putativas en células C6/36 y después se determinaron los valores de virus en ambas células C6/36 y Vero.
35 Como se muestra en la tabla 35, la adición de una única mutación al rDEN2/4Δ30 dio como resultado un incremento de más de 1000 veces en el valor en células Vero, confirmando el fenotipo de adaptación en células Vero conferido por estas mutaciones. Sin embargo, la combinación de dos mutaciones separadas en un único virus no incrementó el valor en células Vero más allá del nivel observado para virus que llevan una única mutación de adaptación. La inclusión de la mutación 7182 o bien 7630 en el ADNc de rDEN2/4Δ30 permitió que el virus se recuperara
40 directamente en células Vero, eludiendo la necesidad de recuperar el virus en células C6/36.
Caracterización de las propiedades de crecimiento de virus rDEN4 que contienen mutaciones de adaptación a células Vero únicas y múltiples definidas. Para confirmar la capacidad de mutaciones de adaptación en células Vero para potenciar el crecimiento de virus DEN4, se usó mutagénesis dirigida a sitio para generar virus rDEN4 que codifican mutaciones individuales seleccionadas como se describe en los ejemplos 1 y 3. Se introdujeron 45 individualmente cinco mutaciones en NS4B (7153, 7162, 7163, 7182, y 7546) de la lista de mutaciones repetidas en los virus mutantes de 5-FU (tabla 32) en el clon de ADNc p4. Además, se evaluó el virus rDEN4-7129 restringido para mosquito para determinar el crecimiento potenciado en células Vero puesto que la ubicación de esta mutación está en la misma región de NS4B. Se recuperó cada virus, incluyendo el rDEN4 natural, se diluyó de forma terminal, y se propagó en células C6/36 para evitar la introducción de mutaciones de adaptación en células Vero adicionales,
50 sin embargo, debido a su crecimiento restringido en células C6/36, el rDEN4-7129 sólo se propagó en células Vero.
Se evaluó el tamaño de placa para cada virus rDEN4 mutante en células Vero y células C6/36 y se comparó con el rDEN4 natural. Se inocularon placas de seis pocillos de cada célula con diluciones de virus y se visualizaron las placas cinco días después. Se ilustran las placas representativas en la figura 10 y se demuestra que la presencia de una mutación de adaptación en células Vero confiere de hecho un incremento en la expansión célula a células del 55 virus y el crecimiento específicamente en células Vero. En células C6/36, el tamaño de placa promedio era de 0,50 mm tanto para el rDEN4 natural como para cada virus mutante (excepto para rDEN4-7546 y rDEN4-7129 que eran más pequeños que el tipo natural, véase el ejemplo 5). Sin embargo, los virus rDEN4 que expresan mutación 7162, 7163, 7182 y 7129 tenían un incremento de más de dos veces en el tamaño de placa en células Vero en comparación con el virus rDEN4 natural. Se observó un incremento más pequeño pero consistente en el tamaño de
60 placa para rDEN4-7153 y rDEN4-7546.
Se evaluó la cinética del crecimiento y el rendimiento de virus en células Vero para el mismo panel de virus rDEN4.
Se infectaron células Vero a un MOI de 0,01 y se retiraron diariamente muestras durante 10 días, se valoró sobre células Vero, y se visualizaron las placas. Los resultados en la figura 11 indican que la presencia de una mutación de adaptación en células Vero incrementó la cinética del crecimiento del virus, pero sólo tenía un efecto mínimo sobre el rendimiento de virus máximo. El día cuatro postinfección, el rDEN4 natural creció hasta 5,2 log10PFU/ml mientras
5 que el nivel de replicación en células infectadas con rDEN4-7129 era 100 veces mayor. El resto de los virus rDEN4 mutantes tenía un incremento en el rendimiento el día cuatro que variaba desde 0,9 (rDEN4-7153) hasta 1,6 (rDEN47162 y -7163) log10PFU/ml. De forma interesante, la cinética potenciada del crecimiento del virus se correlacionó con el incremento en el tamaño de placa en células Vero. Se alcanzó el rendimiento de virus máximo el día 6 postinfección para rDEN4-7129, -7162, -7163 y -7182 mientras que el rDEN4 natural no alcanzó el valor máximo hasta el día 10. Sin embargo, el rendimiento de virus máximo sólo fue ligeramente mayor en virus rDEN4 que expresan mutaciones de adaptación en células Vero.
En un esfuerzo por potenciar adicionalmente la replicación de rDEN4, en especial el rendimiento del virus máximo, se introdujeron combinaciones de mutaciones de adaptación en células Vero seleccionadas en el antecedente de rDEN4. Se generaron tres virus con mutaciones duales: rDEN4-7153-7163, rDEN4-7153-7182 y rDEN4-7546-7630 y
15 se sometieron a infección de evolución temporal en células Vero como se describe anteriormente junto con rDEN4 y rDEN4-7162 como control positivo (figura 12). Los virus que expresan mutaciones combinadas crecieron de manera casi idéntica a rDEN4-7162 lo que indica que estas combinaciones seleccionadas no potenciaron la cinética o el rendimiento del virus máximo. Se prevé que otras combinaciones de estas y otras mutaciones de adaptación en células Vero incrementen el rendimiento del virus máximo.
Análisis. Algunas de las mutaciones promotoras del crecimiento enumeradas en la tabla 32 también se encuentran en regiones homólogas de DEN1, DEN2, y DEN3 y se prevé que sirven para promover la replicación de estos virus en células Vero. Específicamente, se prevé que las mutaciones promotoras del crecimiento indicadas en la tabla 32 que están presentes en un virus DEN4 son útiles para la importación en regiones homólogas de otros flavivirus, tales como DEN1, DEN2 y DEN3. Los ejemplos de dichas regiones conservadas se muestran en el apéndice 4 y se
25 enumeran en la tabla 36. Los nucleótidos para ambas mutaciones 7129 y 7182 se conservan en los cuatro serotipos del virus del dengue. También es interesante destacar que la mutación 7129 no sólo incrementa el crecimiento en células Vero (figura 10), sino que también forma placas pequeñas en células de mosquito (figura 6, tabla 25). Lee et al. pasaron previamente virus DEN3 en células Vero y realizaron un análisis de secuencia limitado sólo de las regiones de genes estructurales de los virus resultantes (Lee, E. et al. 1997 Virology 232:281-90). A partir de este análisis, se montó un menú de mutaciones de adaptación en Vero. Aunque ninguna de estas mutaciones corresponde a las mutaciones de adaptación en identificadas en este ejemplo, una única mutación en la posición de aminoácido 202 en DEN3 corresponde a la mutación 1542 identificada en el virus mutante de 5-FU n.º 1012. El presente ejemplo enfatiza sobre la importancia en este tipo de estudio de la determinación de la secuencia de todo el genoma vírico.
35 Se prevé que los virus optimizados para el crecimiento en células Vero tengan utilidad en las siguientes áreas. En primer lugar, se prevé que aumente el rendimiento de un virus para una vacuna atenuada en células Vero. El candidato a vacuna vivo atenuado es convenientemente un virus DEN4 u otro virus del dengue o un virus quimérico antigénico DEN1/4, DEN2/4 o DEN3/4, o un virus quimérico de otro flavivirus basado en el antecedente de DEN4. Se prevé que el incremento en el rendimiento del virus de vacuna disminuya el coste de la fabricación de la vacuna. En segundo lugar, se prevé que las mutaciones de adaptación en células Vero que son mutaciones atenuantes, tales como la mutación 4995, son estables durante el paso múltiple y la amplificación del virus en cultivos de células Vero que se requiere para la producción de un gran número de dosis de vacuna. En tercer lugar, las mutaciones de adaptación en células Vero se requieren de hecho para el crecimiento del candidato a vacuna rDEN2/4Δ30 en células Vero. En cuarto lugar, se prevé que el incremento en el rendimiento de un virus natural del DEN o un virus
45 atenuado hace que sea económicamente factible fabricar una vacuna de virus inactivado. En quinto lugar, se prevé que la presencia de las mutaciones promotoras del crecimiento en células Vero en el vector de DEN4 de los virus quiméricos antigénicos rDENl/4, rDEN2/4 y rDEN3/4 u otros virus quiméricos de flavivirus basados en DEN4 permita que los virus crezcan hasta un valor alto y de este modo sean útiles en la fabricación de una vacuna de virus inactivado. En sexto lugar, se prevé que la inserción de mutaciones promotoras del crecimiento en células Vero en ADNc, tales como as rDEN2/4Δ30 permita la recuperación del virus directamente en células Vero, para lo que existen bancos de células fundamentales cualificados para la fabricación, mejor que en células C6/36 para las que no están disponibles bancos de células cualificados. Y en séptimo lugar, se prevé que la inserción de las mutaciones 7129 y 7182 en virus naturales DEN1, DEN2 o DEN3 incremente su capacidad para replicar eficazmente y recuperarse del ADNc en células Vero.
55 Ejemplo 7
Montaje de una lista de mutaciones atenuantes
Los datos presentados en estos ejemplos permiten el montaje de una lista de mutaciones atenuantes que se resume en la tabla 37. Esta lista contiene mutaciones individuales identificadas en las tablas 13 -16, 20 y 21 que se conocen por especificar independientemente un fenotipo de atenuación. La mutación 7129 también está incluida puesto que se deriva del 5-1A1 que se muestra atenuado en in mosquitos. Se prevé el uso de varias combinaciones de mutaciones de esta lista para generar virus con conjuntos de propiedades deseables tales como el crecimiento restringido en el hígado o en el cerebro como se enseña en el ejemplo 3 (tabla 18) y ejemplo 4 (tablas 23 y 24). Estas mutaciones también son combinables con otras mutaciones atenuantes descritas previamente, tales como la mutación Δ30, como se enseña en el ejemplo 1 (tabla 6) y ejemplo 3 (tabla 19) para producir virus recombinantes que están atenuados y son inmunógenos de forma satisfactoria. También se prevé que las mutaciones enumeradas
5 en la tabla 37 se combinen con otras mutaciones atenuantes descritas previamente, tales como otras mutaciones de deleción u otras mutaciones puntuales (Blok, J. et al 1992 Virology 187:573-90; Butrapet, S. et al 2000 J Virol 74:3011-9; Men, R. et al 1996 J Virol 70:3930-7; Puri, B. et al 1997 J Gen Virol 78:2287-91).
Recientemente se ha descrito la posibilidad de importar una mutación atenuante presente en un paramixovirus en una región homóloga de un segundo paramixovirus (Durbin, A.P. et al 1999 Virology 261:319-30; Skiadopoulos, M.H. 10 et al 1999 Virology 260:125-35). Una importación de este tipo confiere un fenotipo att al segundo virus o, de forma alternativa, atenúa adicionalmente el virus para el crecimiento in vivo. De forma similar, se prevé la importación de una mutación atenuante presente en un flavivirus a una región homóloga de un segundo flavivirus que conferiría un fenotipo att al segundo flavivirus o, de forma alternativa, atenuaría adicionalmente el virus para el crecimiento in vivo. Específicamente, se prevé que las mutaciones atenuantes indicadas en la tabla 37 son útiles para la importación en
15 regiones homólogas de otros flavivirus. Los ejemplos de dichas regiones homólogas se indican en el apéndice 4 para las mutaciones enumeradas en la tabla 37.
Ejemplo 8
Evaluación de la vacuna del virus del dengue en seres humanos y monos rhesus
El presente ejemplo evalúa la atenuación para seres humanos y monos rhesus (como modelo animal) de un mutante
20 de DEN-4 que lleva una deleción de 30 nucleótidos (Δ30) que se introdujo en su región no traducida en 3' por mutagénesis dirigida a sitio y que se descubrió previamente que estaba atenuada para monos rhesus (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7), como representativa de la evaluación de cualquier vacuna del virus del dengue para su atenuación en seres humanos y monos rhesus (como modelo animal).
Virus y células. La cepa del virus DEN-4 natural (wt) 814669 (Dominica, 1981), aislada originalmente en células de
25 Aedes pseudoscutellaris (AP61), se purificó por placa previamente en células LLC-MK2 y se amplificó en células C6/36 como se describe (Mackow, E. et al. 1987 Virology 159:217-28). Para purificación adicional, se pasó 2 veces la suspensión de C6/36 en células Vero (WHO) mantenidas en MEM-E (Life Technologies, Grand Island, NY) complementado con FBS al 10 %. Se hicieron crecer virus derivados de la transfección de ARN o usados para el desarrollo de lotes clínicos en células Vero (WHO) mantenidas en medio libre de suero, VP-SFM (Life
30 Technologies).
Construcción de mutantes de deleción de DEN-4. Se introdujo previamente una deleción de 30 nucleótidos (nt) en la región no traducida en 3' del clon de ADNc 2A de la cepa de DEN-4 wt 814669 como se describe (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Esta deleción retira los nucleótidos 10478 -10507, y se designó originalmente como 3'd 172-143, lo que significa la ubicación de la deleción con relación al extremo 3' del genoma vírico. En el presente 35 ejemplo, esta deleción se denomina Δ30. El clon de ADNc 2A de longitud completa ha sufrido varias modificaciones posteriores para mejorar su capacidad para manipularse genéticamente. Como se describe previamente, se modificó un sitio de enzima de restricción Xhol traduccionalmente inactivo próximo al extremo de la región E en el nucleótido 2348 para crear el clon 2A-Xhol (Bray, M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). En este ejemplo, se modificó adicionalmente la secuencia codificante vírica del clon de ADNc 2A-XhoI usando mutagénesis dirigida a sitio para 40 crear el clon p4: se introdujo un sitio de restricción de BbvCI único cerca de la unión C-prM (nucleótidos 447 -452); se extirpó un sitio de restricción de Xbal extra por mutación del nucleótido 7730; y se creó un sitio de restricción de SacII único en la región NS5 (nucleótidos 9318 -9320). Cada una de estas mutaciones modificadas es traduccionalmente inactiva y no cambia la secuencia de aminoácidos del polipéptido vírico. Además, se realizaron varias mutaciones en la región de vector del clon p4 para introducir o extirpar sitios de restricción adicionales. Se
45 generó el clon de ADNc p4Δ30 introduciendo la mutación Δ30 en el clon p4. Esto se llevó a cabo reemplazando el fragmento Mlul -Kpnl de p4 (nucleótidos 10403 -10654) con el derivado del plásmido 2AΔ30 que contiene la deleción de 30 nucleótidos. Se usaron posteriormente los clones de ADNc p4 y p4Δ30 para generar virus recombinantes rDEN4 y rDEN4Δ30, respectivamente.
Generación de virus. Se sintetizaron transcritos de ARN de longitud completa a partir de clones de ADNc 2A y
50 2AΔ30 usando ARN polimerasa de SP6 como se describe previamente (Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88:5139-43; Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Se modificó la reacción para generar transcritos de ARN de longitud completa a partir de clones de ADNc p4 y p4Δ30 consistió en una mezcla de reacción de 50 μl que contenía 1 μg de plásmido linealizado, 60 U de SP6 polimerasa (New England Biolabs (NEB), Beverly, MA), 1X de tampón de ARN polimerasa (Tris-HCl 40 mM, pH 7,9, MgCl2 6 mM, espermidina 2 mM, ditiotreitol 10 mM), análogo de casquete m7G(5')ppp(5')G
55 0,5 mM (NEB), cada nucleótido trifosfato 1 mM, 1 U de pirofosfatasa (NEB) y 80 U de inhibidor de ARNse (Roche, Indianapolis, IN). Se incubó esta mezcla de reacción a 40 ºC durante 90 min y se purificaron los transcritos resultantes usando el mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Para la transfección de células Vero, se mezclaron transcritos purificados (1 μg) con 12 μl de reactivo de liposomas DOTAP (Roche) en solución salina que contenía tampón HEPES 20 mM (pH 7,6) y se añadió a cultivos de monocapas de células en una placa de 6 pocillos.
60 Después de 5-17 días, se recogió el medio de cultivo de tejido, se aclaró por centrifugación y se amplificó el virus en células Vero. Se confirmó la presencia de virus por valoración de placas. Cabe destacar que durante el transcurso de la transfección y amplificación de 2AΔ30 para crear el lote de vacuna, el virus sufrió un total de 6 pasos completos en células Vero. Los virus restantes, rDEN4 y rDEN4Δ30 se pasaron 5 veces en células Vero para generar la suspensión de virus usada para el análisis de secuencias y estudios en monos rhesus.
5 Producción de vacuna. Se remitió una alícuota de fluido del cultivo de tejido aclarado que contenía el candidato a vacuna 2AΔ30 a DynCorp (Rockville, MD) para la amplificación de virus en células Vero y la producción de un lote de vacuna. Para la producción de vacuna, se recogió sobrenadante del cultivo de tejido infectado de 2AΔ30, se añadió tampón SPG (concentración final: sacarosa 218 mM, ácido L-glutámico 6 mM, fosfato de potasio 3,8 mM, monobásico, y fosfato de potasio 7,2 mM, dibásico, pH 7,2), y se aclaró la suspensión de virus por centrifugación a
10 baja velocidad. Para degradar el ADN de células Vero residual, se trató la suspensión de vacuna con endonucleasa Benzonasa (American International Chemical, Naticlc, MA), 100 U/ml y se incubó durante 1 h a 37 ºC, seguido de centrifugación a alta velocidad (17.000 x g, 16 h). Se aclaró con cuidado el sedimento de virus resultante con MEM-E, se resuspendió en SPG que contenía MEM-E, se sometió a sonicación, se distribuyó en ampollas selladas con calor y se almacenó congelado a -70 ºC. Una prueba de seguridad del recipiente final confirmó la esterilidad
15 microbiana, la pureza del cultivo de tejido y la seguridad animal. El lote de vacuna de 2AΔ30 (designado como DEN4-9) tiene un valor de 7,48 log10PFU/ml, con una dosis individual de of 5,0 log10PFU/ml que contiene <1 pg/ml de ADN de células Vero y <0,001 U/ml de endonucleasa Benzonasa.
Secuencia de clones de ADNc y genomas víricos. Se determinó la secuencia de nucleótidos de la región de genoma vírico de los plásmidos de ADNc 2A y p4 en un analizador genético 310 (Applied Biosystems, Foster City, 20 CA) usando cebadores específicos de vector y específicos de DEN-4 en reacciones de secuenciación de ciclo terminador in BigDye (Applied Biosystems). También se determinó la secuencia de nucleótidos de los genomas de la cepa de DEN-4 wt progenitora 814669 y de virus recombinantes 2A wt, 2AΔ30 (lote de vacuna), rDEN4 y rDEN4Δ30. Se extrajo ARN vírico de las preparaciones de virus y muestras de suero usando el mini kit de ARN vírico de QIAamp (Qiagen). Se realizó una transcripción inversa (RT) usando hexámeros aleatorios y el sistema de síntesis de 25 primera hebra SuperScript para RT-PCR (Life Technologies). Se generaron fragmentos de PCR de recubrimiento de aproximadamente 2000 pares de bases usando cebadores específicos de DEN-4 optimizados y ADNc polimerasa Advantage (ClonTech, Palo Alto, CA). Se secuenciaron directamente ambas hebras de fragmentos de PCR purificados usando reacciones de terminador con tinción como se describe anteriormente y se montaron los resultados en una secuencia consenso. Para determinar la secuencia de nucleótidos de las regiones 5' y 3' de ARN 30 vírico, se retiró el nucleósido de casquete en 5' del ARN vírico con pirofosfatasa ácida del tabaco (Epicentre, Madison, WI) seguido de circularización del ARN usando ARN ligasa (Epicentre). Se realizó una RT-PCR como se describe y secuenció un fragmento de ADNc que abarca la unión de ligadura usando cebadores específicos de DEN
4. Los números de referencia de GenBank se han asignado como sigue (virus: número de referencia): 814669: AF326573, 2AΔ30: AF326826, rDEN4: AF326825, y rDEN4Δ30: AF326827.
35 Receptores de vacuna humanos. Se reclutaron 20 voluntarios adultos sanos por Johns Hopkins School of Hygiene y Public Health Center for Immunization Research (CIR) situada en Baltimore, Maryland. Se revisó y se aprobó el protocolo clínico por Joint Committee for Clinical Investigation de Johns University School of Medicine y se obtuvo el consentimiento informado de cada voluntario. Los voluntarios participaron en el estudio si cumplían los siguientes criterios de inclusión: 18-45 años de edad; ningún antecedente de enfermedad crónica; un examen físico normal;
40 anticuerpos del virus de inmunodeficiencia humana negativos, antígeno de superficie de hepatitis B negativo, y anticuerpo de hepatitis C negativo; sin sangre oculta en heces; y valores normales para el hemograma completo (CBC) con recuento de plaquetas, hematocritos diferencial, creatinina en suero, aspartato amino transferasa (AST) en suero, alanina amino transferasa (ALT), fosfatasa alcalina, bilirrubina, tiempo de protrombina (PT), tiempo de tromboplastina parcial (PTT), y análisis de orina. Se requiere que las mujeres voluntarias tengan una prueba de
45 embarazo de orina negativa antes de la vacunación y el día de la vacunación estén de acuerdo en usar anticoncepción o abstenerse de mantener relaciones sexuales durante la duración del estudio. Los voluntarios también carecían de pruebas serológicas de infección por flavivirus anterior como se define por la valoración de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación < 1:10 para DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, virus de encefalitis de St. Louis, virus de encefalitis japonesa, o virus de la fiebre amarilla y valoración de neutralización de reducción de placa
50 < 1:10 para DEN-4 y virus de la fiebre amarilla.
Estudios en seres humanos. Se inmunizaron los voluntarios en tres cohortes sucesivos de cuatro, seis y diez voluntarios para evaluar la seguridad de la vacuna. En este estudio, se definió una enfermedad como sigue: infección por virus del dengue asociada c un recuento de plaquetas de < 90.000/mm3; ALT suero > 4 veces normal; temperatura oral >38 ºC durante > 2 días sucesivos; o cefalea y/o mialgia que dura > 2 días sucesivos. Se definió la
55 enfermedad sistémica como la aparición de fiebre >38 ºC durante > 2 días consecutivos, 2 cualesquiera de los siguientes durante al menos dos días del estudio consecutivos: cefalea, malestar, anorexia y mialgia/artralgia. Se llevaron a cabo los ensayos entre octubre y abril, un momento de prevalencia de mosquito bajo, para reducir el riesgo de transmisión del virus de vacuna de los voluntarios a la comunidad.
El día de la vacunación, se diluyó el candidato a vacuna 2AΔ30 hasta 5,3 log10PFU/ml en solución salina estéril para
60 inyección, USP, y se inyectó por vía subcutánea cada voluntario con 0,5 ml que contenían 5,0 log10PFU de vacuna en la región deltoidea izquierda. A los voluntarios se les dio un diario particular en el que tenían que registrar su temperatura dos veces al día durante los días 0-5 postvacunación. Los voluntarios volvieron a la clínica cada día para examen por un médico y se revisaron sus diarios. Se evaluó el sitio de inyección para determinar eritema, endurecimiento y sensibilidad. Diariamente se evaluaron señales y síntomas clínicos tales como cefalea, sarpullido, petequias, linfadenopatía, hepatomegalia, sensibilidad abdominal, anorexia, nauseas, fatiga, mialgia, artralgia, dolor ocular y fotofobia. Se graduaron los síntomas como leve (sin necesidad de tratamiento o un cambio en la actividad),
5 moderado (tratamiento necesario o cambio en la actividad destacado, pero aún se puede continuar con la actividad diaria) o grave (confinado en cama). Se extrajo sangre para CBC con diferencial y para cuantificación de virus los días 0, 2 y 4. Se admitió a los voluntarios en la unidad hospitalaria en el CIR el sexto día después de la inmunización. El médico del estudio evaluó todos los voluntarios cada día por examen físico y entrevista. Los voluntarios tenían su presión sanguínea, pulso y temperatura registrados cuatro veces al día. Se extrajo sangre cada día para CEC con diferencial y para cuantificación de virus y cada dos días para medida de ALT. Se confinó a los voluntarios en la unidad hospitalaria hasta el alta hospitalaria el día 15 del estudio. Los días 28 y 42 del estudio, los voluntarios volvieron para un examen físico y se extrajo sangre para cuantificación de virus (día 28) y para medida de anticuerpos en suero (día 28 y 42).
Cuantificación y amplificación de virus. Se obtuvo el suero para la detección de viremia y valoración de virus en
15 especímenes positivos. Con estos propósitos, se recogieron 8,5 ml de sangre en un tubo separador de suero y se incubó a temperatura ambiente durante menos de 30 min. Se decantó el suero en alícuotas de 0,5 ml, se congelaron rápidamente en un baño de hielo seco/etanol y se almacenaron a -70 ºC. Se descongelaron las alícuotas de suero y se inocularon diluciones de 10 veces en serie sobre cultivos de monocapas de células en placas de 24 pocillos. después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se recubrieron las monocapas con metilcelulosa al 0,8 % en OptiMEM (Life Technologies) complementado con suero fetal bovino (FBS) al 5 %. Después de la incubación a 37 ºC durante cuatro días, se visualizaron las placas por tinción con inmunoperoxidasa. En resumen, se fijaron monocapas de células en metanol al 80 % durante 30 min y se aclaró con tampón de anticuerpo (leche desnatada al 5 % en solución salina tamponada con fosfato). Se diluyeron anticuerpos de DEN-4 policlonales de conejo a 1:1000 en tampón de anticuerpo y se añadieron a cada pocillo seguido de una incubación de una h a 37 ºC.
25 Se retiró el anticuerpo primario y se lavaron dos veces las monocapas de células con tampón de anticuerpo. Se diluyó IgG de cabra anti-conejo marcada con peroxidasa (KPL, Gaithersburg, MD) a 1:500 en tampón de anticuerpo y se añadió a cada pocillo con una incubación de una hora a 37 ºC. Se retiró el anticuerpo secundario y se lavaron dos veces los pocillos con solución salina tamponada con fosfato. Se añadió sustrato de peroxidasa (4 cloro-1-naftol en H2O2) a cada pocillo y se contaron las placas visibles.
Para la amplificación de virus en muestras de suero, se inoculó directamente una alícuota de 0,3 ml de suero sobre un único pocillo de una placa de 6 pocillos de monocapas de células Vero y se incubó a 37 ºC durante 7 días. Después se sometió a ensayo el fluido del cultivo celular para determinar los virus por ensayo de placa como se describe anteriormente.
Serología. Se realizaron ensayos de inhibición de hemaglutinación (HAI) como se describe previamente (Clarke,
35 D.H. & Casals, J. 1958 Am J Trop Med Hyg 7:561-73). Se determinaron valores de neutralización de reducción de placa (PRNT) por una modificación de la técnica descrita por Russell (Russell, P.K. et al. 1967 J Immunol 99:28590). En resumen, se inactivaron por calor los sueros de prueba (56 ºC durante 30 min) y se realizaron diluciones de 2 veces en serie comenzando a 1:10 en OptiMEM complementado con seroalbúmina humana al 0,25 %. Se añadió virus rDEN4Δ30, diluido hasta una concentración final de 1000 PFU/ml en el mismo diluyente, a volúmenes iguales del suero diluido y se mezcló bien. Se incubó la mezcla de virus/suero a 37 ºC durante 30 min. Se retiró el medio de cultivo de células de un 90 % de cultivos de monocapas confluentes de células Vero en placas de 24 pocillos y se transfirieron 50 μl de mezcla de virus/cuero mixture sobre monocapas de células por duplicado. Se incubaron las monocapas de células durante 60 min a 37 ºC y se recubrieron con metilcelulosa al 0,8 % en OptiMEM complementado con FBS al 2 %. Se incubaron muestras a 37 ºC durante 4 días, después de los cual se visualizaron
45 las placas por tinción con inmunoperoxidasa como se describe anteriormente, y se calculó el valor de neutralización de reducción de placa al 60 %.
Estudios en monos rhesus. Se realizó la evaluación de la replicación y la inmunogenicidad del virus wt 814669, y los virus recombinantes 2A wt, 2AΔ30 (lote de vacuna), rDEN4 y rDEN4Δ30 en monos rhesus jóvenes como se describe previamente (Men R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). En resumen, se inyectaron por vía subcutánea monos seronegativos al virus del dengue con 5,0 log10 PFU de virus diluido en medio L-15 (Quality Biological, Gaithersburg, MD) que contenía tampón SPG. Se dividió una dosis de 1 ml entre dos inyecciones en cada lado de la zona superior del hombro. Se observaron diariamente los monos y se extrajo sangre los días 0-10 y 28, y se procesó para obtener el suero, que se almacenó congelado a -70 ºC. Se determinó el valor de virus en muestras de suero por ensayo de placa en células Vero como se describe anteriormente. Se determinaron los valores de anticuerpos neutralizantes
55 para las muestras de suero del día 28 como se describe anteriormente. Se expuso un grupo de monos inoculados con 2AΔ30 (n = 4) o bien virus wt 814669 (n = 8) el día 42 con una única dosis de 5,0 log10 PFU/ml de virus wt 814669 y se recogió sangre durante 10 días. La cría y el cuidado de los monos rhesus se hizo de acuerdo con las directrices de National Institutes of Health para el uso humano de animales de laboratorio.
Construcción y caracterización de virus de tipo natural de DEN-4 y mutantes de deleción. En primer lugar, se determinaron las secuencias de aminoácidos deducidos y de nucleótidos del virus 814669 wt descrito previamente, el virus DEN-4 2A wt derivado de él (designado como 2A wt), y el candidato a vacuna 2AΔ30 derivado del virus 2A wt. El análisis de secuencias mostró que el virus 814669 wt usado en este estudio tuvo 2 mutaciones con pérdida de sentido aparentemente acumuladas (nucleótidos 5826 y 7630) y 3 mutaciones inactivadas durante su paso y amplificación puesto que estas mutaciones no se describen en los informes publicados previamente de la secuencia vírica (número de referencia de GenBank M14931) y no estaban presentes en el ADNc de 2A derivado del virus. La comparación de secuencias entre virus 2A wt y el lote de vacuna 2AΔ30 reveló que 2AΔ30 acumuló 2 mutaciones
5 con pérdida de sentido (nucleótidos 7153 y 8308) y también confirmó la presencia de la mutación Δ30 (nucleótidos 10478 -10507) así como una deleción adicional del nucleótido 10475, que se produjo durante la construcción original de la mutación Δ30 (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7). Este análisis de secuencias reveló una divergencia de secuencias significativa entre el virus 814669 wt derivado biológicamente y su derivado 2A wt recombinante y entre el virus 2A wt y 2AΔ30. Puesto que los virus 2A wt y 2AΔ30 difieren en nucleótidos distintos de la mutación de deleción, el fenotipo de atenuación informado previamente para 2AΔ30 (Men, R. et al. 1996 J Virol 70:3930-7) no se pudo atribuir formalmente sólo a la mutación Δ30 y se puede especificar por las mutaciones en los nucleótidos 7153, 8308, 10475, o la deleción Δ30.
Para determinar si la mutación Δ30 es responsable de la atenuación observada de 2AΔ30, se produjeron un segundo par de virus, uno con y uno sin la mutación Δ30, para su evaluación en monos. Se derivó una nueva 15 construcción de vector de ADNc de DEN-4, designada como p4, a partir del clon de ADNc 2A-Xhol y se introdujeron mutaciones traduccionalmente inactivas para añadir o extirpar varios sitios de enzimas de restricción. Se añaden estos sitios para facilitar la manipulación genética futura de este ADNc wt de DEN-4 por la introducción de otras mutaciones atenuantes si es necesario. La secuencia de la región genómica del plásmido de ADNc p4 era idéntica a la del virus wt 2A excepto porque el sitio de restricción modificado cambia y una mutación puntual en el nucleótido 2440 que se introdujo durante la mutagénesis original del plásmido de ADNc 2A para crear el sitio Xhol (Bray, M. & Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88:10342-6). Se introdujeron conjuntamente la mutación Δ30 y la deleción vecina en el nucleótido 10475 en el plásmido p4 reemplazando un fragmento de restricción corto con uno derivado del clon de ADNc de 2AΔ30. Los transcritos de ARN derivados del clon de ADNc p4 y de su derivado Δ30 proporcionaron cada uno virus (designado como rDEN4 wt y rDEN4Δ30, respectivamente) después de la transfección de células Vero. El
25 análisis de secuencia del virus rDEN4 reveló que durante el paso y la amplificación en células Vero se acumularon 2 mutaciones con pérdida de sentido (nucleótidos 4353 y 6195), una mutación inactiva (nucleótido 10157), y una mutación puntual en la región no traducida en 3' (nucleótido 10452). Además de contener la Δ30 y la deleción acompañante en el nucleótido 10475, rDEN4Δ30 también había cumulado una mutación con pérdida de sentido (nucleótido 7163) y una mutación inactiva (nucleótido 7295).
El virus 814669 wt progenitor y los virus recombinantes 2A wt, 2AΔ30, rDEN4 y rDEN4Δ30 se replicaron cada uno en células Vero hasta un valor que excedía 7,0 log10PFU/ml, y su replicación no es sensible a la temperatura a 39 ºC.
Replicación de virus, inmunogenicidad y eficacia en monos. Se inocularon grupos de monos rhesus con 814669 DEN-4 wt, 2A wt, rDEN4, 2AΔ30 y rDEN4Δ30 para evaluar el nivel de restricción de replicación especificado por la 35 mutación Δ30. Se recogieron diariamente muestras de suero y se determinó el valor de virus presente en el suero por enumeración de placa sobre cultivos de monocapas de células Vero. Los monos inoculados con virus 814669 wt
o sus homólogos recombinantes, 2A wt o rDEN4, fueron virémicos durante de 3 a 4 días con un valor de virus máximo medio de casi 2 log10PFU/ml. Los monos inoculados con virus 2AΔ30 o rDEN4Δ30 tenían una frecuencia más baja de viremia (83 % y 50 %, respectivamente), fueron virémicos sólo durante aproximadamente 1 día, y el valor máximo medio fue 10 veces más bajo. Los monos inoculados con virus DEN-4 814669, 2A wt, o rDEN4 desarrollaron niveles altos de anticuerpos neutralizantes, con valores medios de entre 442 y 532, consistente con su supuesto fenotipo natural. Los monos inoculados con 2AΔ30 o rDEN4Δ30 desarrollaron un nivel más bajo de anticuerpo neutralizante, con valores medios de 198 y 223, respectivamente. La disminución en el valor de anticuerpo neutralizante en respuesta a 2AΔ30 y rDEN4Δ30 es consistente con el fenotipo de atenuación de estos
45 virus. Los monos inoculados con el virus 2AΔ30 (n = 4) o bien 814669 wt (n = 8) se expusieron después de 42 días con el virus wt 814669. No se detectó el virus del dengue en ninguna muestra de suero recogida durante hasta 10 días después de la exposición al virus, lo que indica que estos monos estaban completamente protegidos después de la inmunización con virus wt o bien con el candidato a vacuna 2AΔ30.
Puesto que cada DEN-4 814669, 2A wt y rDEN4 manifiesta el mismo nivel de replicación e inmunogenicidad en monos, es razonable concluir que las diferencias de secuencia identificadas entre estos presuntos virus naturales que aparecieron durante el paso en cultivo de tejido o durante la construcción de plásmido no afectan significativamente a su nivel de replicación in vivo. De forma similar, el nivel comparable de atenuación de 2AΔ30 y rDEN4Δ30 indica que las mutaciones compartidas por estos virus, concretamente, la mutación Δ30 y su mutación de deleción 10475 acompañante, probablemente son responsables de la atenuación de estos virus en lugar de sus
55 diferencias de secuencia incidental.
Respuesta clínica a la inmunización con 2AΔ30. Se administró por vía subcutánea el candidato a vacuna 2AΔ30 a una dosis de 105 PFU a 20 voluntarios seronegativos. Se infectó cada uno de los vacunados y el virus fue bien tolerado por todos los vacunados. Se detectó viremia en un 70 % de los vacunados, sólo estaba presente a un valor bajo y no se extendió más allá del día 11.
Ninguno de los 20 vacunados informó de inflamación o edema en el sitio de inyección. Se notó un eritema leve (1-3 mm) alrededor del sitio de inyección en el examen de 8 voluntarios 30 minutos después de la vacunación que se resolvió al día siguiente en 7 de estos voluntarios y al tercer día en el voluntario restante. Se notó una sensibilidad leve a la presión en el sitio de vacunación en 2 voluntarios y duró un máximo de 48 horas. Durante el examen físico, se notó que diez voluntarios (50 %) tenían un sarpullido macular eritematoso similar al dengue leve (distribución truncada) que se produjo con la mayor frecuencia el día 10. Ninguno de los voluntarios notó el sarpullido por él
5 mismo y fue asintomático en cada caso. El sarpullido sólo se observó en vacunados con viremia detectable. Los voluntarios no desarrollaron enfermedad sistémica. Siete voluntarios notaron una cefalea ocasional que se describió como leve, durante menos de 2 horas, y no estuvo presente en ningún voluntario en los dos días consecutivos. Un voluntario informó de fiebre de 38,6 ºC y 38,2 ºC sin cefalea, resfriado, dolor ocular, fotofobia, anorexia, mialgia o artralgia acompañante como paciente ambulatorio la noche del día 3 y del día 5, respectivamente. Sin embargo, este voluntario estaba afebril cuando se evaluó por el personal del estudio la mañana de los días 3, 4, 5 y 6. Todas las demás medidas de temperatura registradas por el voluntario o el personal del estudio fueron normales. Aunque no se realizaron pruebas de torniquete, se notó que dos voluntarios tenían petequias en el sitio del manguito del esfigmomanómetro después de que se realizara una medida de la presión sanguínea (una el día 6, la otra los días 7 y 10). Ambos voluntarios tenían recuentos plaquetarios normales en ese momento y a lo largo de todo el estudio.
15 No se observaron anomalías hematológicas significativas en ningún vacunado. Tres vacunados con supuesta neutropenia étnica benigna manifestaron un recuento neutrófilo absoluto (ANC) inferior a 1500/mm3. Estos tres voluntarios tenían valores de referencia de ANC que eran significativamente más bajos que los 17 voluntarios restantes y que no disminuyeron de manera desproporcionada para los otros voluntarios. Dos de los tres voluntarios que se volvieron neutropénicos nunca tuvieron viremia. Se observó un incremento leve en los niveles de ALT en 4 voluntarios, y se observó un incremento más significativo en el nivel de ALT (de hasta 238 IU/L) en un voluntario. Estas elevaciones en ALT fueron transitorias, no estaban asociadas con hepatomegalia, y eran completamente asintomáticas encada uno de los 5 voluntarios. Los valores de ALT elevados se volvieron normales el día 26 después de la vacunación. También se observó que el voluntario con el valor de ALT alto tenía una elevación media acompañante en AST el día 14 (104 IU/L) que también volvió al valor de referencia el día 26 después de la
25 vacunación. Este voluntario no tenía un incremento asociado en los niveles de LDH, bilirrubina, o fosfatasa alcalina.
Respuesta serológica de seres humanos a la inmunización con 2AΔ30. Cada uno de los vacunados desarrolló un incremento significativo en el valor de anticuerpo neutralizante en suero contra DEN-4 el día 28. El nivel de anticuerpo neutralizante en suero era similar en vacunados virémicos (1:662) y no virémicos (1:426). Los valores de anticuerpos neutralizantes de DEN-4 de ambos grupos no habían cambiado significativamente el día 42.
Estabilidad genética de la mutación Δ30. La RT-PCR y el análisis de secuencia de ARN vírico aislado de muestras de suero (n = 6) recogidas de los voluntarios de 6 a 10 días después de la vacunación confirmó la presencia de la mutación Δ30 y la deleción vecina en el nucleótido 10475.
Ejemplo 9
Composiciones farmacéuticas
35 Se usan vacunas del virus del dengue vivo atenuado, usando el virus replicado de la invención, para la prevención o el tratamiento de infección por virus del dengue. Adicionalmente, se proporcionan vacunas del virus del dengue inactivado inactivando el virus de la invención usando procedimientos conocidos, tales como, pero sin limitación, tratamiento con formalina o β-propiolactona. Los virus vivos atenuados o inactivados que contienen las mutaciones descritas anteriormente forman la base de una vacuna mejorada para la prevención o el tratamiento de infección por dengue en seres humanos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden como se define en las reivindicaciones virus del dengue vivos atenuados o inactivados, comprendiendo además opcionalmente soluciones acuosas, suspensiones y emulsiones o no acuosas estériles. La composición puede comprender además agentes auxiliares o excipientes, como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Berkow et al. eds. 1987 The Merck Manual, 15ª
45 edición, Merck and Co., Rahway, N.J.; Goodman et al. eds. 1990 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8ª edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.; Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3ª edición, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. 1987; Osol, A. ed. 1980 Remington's Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Co, Easton, Pa. p. 1324-1341; Katzung, ed. 1992 Basic and Clinical Pharmacology, quinta edición, Appleton and Lange, Norwalk, Conn.
Una composición de vacuna de virus de la presente invención y como se define en las reivindicaciones puede comprender desde aproximadamente 102 -109 unidades de formación de placas (PFU)/ml, o cualquier intervalo o valor en el mismo, en el que el virus está atenuado. Una composición de vacuna que comprende un virus inactivado puede comprender una cantidad de virus correspondiente a de aproximadamente 0,1 a 50 μg de proteína E/ml, o cualquier intervalo o valor en el mismo.
55 Los agentes se pueden administrar usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Los agentes descritos se pueden formular y administrar sistémicamente. Las vías adecuadas pueden incluir administración oral, rectal, transmucosa o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramuscular, subcutánea, intramedular, así como inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, intranasal o intraocular, sólo por nombrar unas pocas. Para inyección, los agentes de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución salina, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con Tris, solución salina tamponada con Hank, medios de crecimiento tales como medio esencial mínimo de Eagle (MEM).
5 Cuando una composición de vacuna de la presente invención se va a usar para la administración a un individuo, puede comprender además sales, tampones, coadyuvantes u otras sustancias que sean deseables para mejorar la eficacia de la composición. Los coadyuvantes útiles con la invención incluyen, pero sin limitación: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite-en-agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de
10 muramilo o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo (a) MF59 (publicación internacional n.º WO 90/14837), que contiene escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 %, y Span 85 al 0,5 % (que contiene opcionalmente varias cantidades de MTP-PE, aunque no se requiere) formulado en partículas de submicrómetros usando un microfluidizador tal como un microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA),
(b) SAF, que contiene escualeno al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, polímero bloqueado plurónico L121 al 5 %, y thr-MDP
15 microfluidizado en una emulsión de submicrómetros o bien sometido a agitación con vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, y (c) sistema coadyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 %, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); (3) se pueden usar coadyuvantes de saponina, tales como
20 Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partícula generada de los mismos tales como ISCOM (complejos de inmunoestimulación); (4) coadyuvante de Freund completo (CFA) y coadyuvante de Freund incompleto (IFA); (5) citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2, etc.), factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (6) coadyuvantes mucosales tales como los derivados de la toxina del cólera (CT), toxina de tos ferina (PT), toxina termolábil de E. coli (LT), y mutantes de los mismos
25 (véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales n.º WO 95/17211, WO 93/13202, y WO 97/02348); y (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para potenciar la eficacia de la composición.
Los compuestos farmacológicamente activos de la presente invención se pueden procesar de acuerdo con procedimientos convencionales de farmacia galénica para producir agentes medicinales para su uso en la administración a pacientes, por ejemplo, mamíferos incluyendo seres humanos.
30 Los compuesto de la presente invención se pueden emplear en mezcla con excipientes convencionales, es decir, sustancias vehículo orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para aplicación parenteral, enteral (por ejemplo, oral) o tópica, que no reaccionan de forma perjudicial con los compuestos activos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, agua, soluciones salinas, alcohol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o
35 almidón, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite perfumado, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos de pentaeritritol, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influenciar la presión osmótica, tampones, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionan de forma
40 perjudicial con los compuestos activos. También se pueden combinar cuando se desee con otros agentes activos, por ejemplo, vitaminas.
Para aplicación parenteral, son particularmente adecuados soluciones estériles, inyectables, preferentemente soluciones oleosas o acuosas, así como suspensiones, emulsiones o implantes, incluyendo supositorios. Las ampollas son dosificaciones unitarias convenientes.
45 Para aplicación enteral, son particularmente adecuados comprimidos, grageas, líquidos, gotas, supositorios o cápsulas. Se puede usar un jarabe, elixir o similar en el que se emplee un vehículo edulcorado.
Para aplicación tópica, se emplean como formas no pulverizables, formas de viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un vehículo compatible con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica preferentemente mayor que la del agua. Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, 50 pomadas, polvos, linimentos, bálsamos, aerosoles, etc., que, si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares, por ejemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales para influenciar la presión osmótica, etc. Para aplicación tópica, también son adecuadas preparaciones de aerosol pulverizables en las que el ingrediente activo, preferentemente en combinación con un material vehículo inerte sólido o líquido, se envasa en un frasco comprimible o en mezcla con un propulsor volátil presurizado, normalmente gaseoso, por ejemplo, un
55 freón.
La vacuna también puede contener cantidades variables pero pequeñas de endotoxina, formaldehído libre, y conservante, que se ha descubierto que son seguras y que no contribuyen a la reactogenicidad de las vacunas para los seres humanos.
Ejemplo 10
Propósitos farmacéuticos
La administración de la composición de vacuna puede ser para un propósito "profiláctico" o bien "terapéutico". Cuando se proporcionan profilácticamente, las composiciones se proporcionan antes de que se manifieste cualquier 5 síntoma de infección vírica por dengue. La administración profiláctica de la composición sirve para evitar o atenuar cualquier infección posterior. Cuando se proporciona terapéuticamente, las vacuna de virus vivo atenuado o inactivado se proporciona tras la deleción de un síntoma de infección real. La administración terapéutica del/de los compuesto(s) sirve para atenuar cualquier infección real. Véase, por ejemplo, Berkow et al. eds. 1987 The Merck Manual, 15ª edición, Merck and Co., Rahway, N.J.; Goodman et al. eds. 1990 Goodman and Gilman's The
10 Pharmacological Basis of Therapeutics, 8ª edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.; Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3ª edición, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. 1987; Katzung, ed. 1992 Basic and Clinical Pharmacology, quinta edición, Appleton and Lange, Norwalk, Conn.
Por tanto se puede proporcionar una composición de vacuna de virus vivo atenuado o inactivado de la presente
15 invención antes del inicio de la infección (para evitar o atenuar una infección anticipada) o bien después del inicio de una infección real.
Las vacunas de la invención se pueden formular de acuerdo con procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en las que los virus vivos atenuados o inactivados se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un vehículo
20 "farmacológicamente aceptable" si se puede tolerar su administración por un paciente receptor. Los vehículos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, en Osol, A. ed. 1980 Remington's Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Co, Easton, Pa. p. 1324-1341.
Para propósitos de administración, se puede administrar una composición de vacuna de la presente invención a un receptor humano en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dicho que un agente de este tipo se administra en una
25 "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Una composición de vacuna de la presente invención es fisiológicamente significativa si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor que genera una respuesta inmunitaria de huésped contra al menos un serotipo del dengue, estimula la producción de anticuerpos neutralizantes o da lugar a la protección contra la exposición.
30 La "protección" proporcionada no tiene que ser absoluta, es decir, la infección por dengue no se tiene que evitar o erradicar totalmente, si existe una mejora estadísticamente significativa en comparación con una población de control o conjunto de pacientes. La protección se puede limitar para mitigar la gravedad o la rapidez del inicio de los síntomas de la infección por virus del dengue.
Ejemplo 11
35 Administración farmacéutica
Una vacuna de la presente invención puede conferir resistencia a uno o más serotipos del dengue por inmunización. En la inmunización, una composición de vacuna de virus vivo atenuado o inactivado se va a administrar profilácticamente, de acuerdo con la presente descripción. En una realización y como se define en las reivindicaciones, se proporciona una composición de vacuna de virus vivo atenuado o inactivado para administrarse
40 terapéuticamente.
Por tanto, la presente invención incluye usos para evitar o atenuar la infección por al menos un serotipo del dengue. Como se usa en el presente documento, se dice que una vacuna evita o atenúa una enfermedad si su administración da como resultado la atenuación total o parcial (es decir, la supresión) de un síntoma o afección de la enfermedad, o bien la inmunidad total o parcial del individuo para la enfermedad.
45 Se puede administrar al menos un virus del dengue vivo atenuado o inactivado, o composición del mismo, de la presente invención por cualquier medio que logre el propósito deseado, usando una composición farmacéutica como se describe previamente.
Por ejemplo, la administración de una composición de este tipo puede ser por varias vías parenterales tales como vías subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, oral o transdérmica. La 50 administración parenteral puede ser por inyección en bolo o por perfusión gradual con el tiempo. Un modo preferido de uso de una composición farmacéutica de la presente invención es por aplicación intramuscular, intradérmica o subcutánea. Véase, por ejemplo, Berlcow et al. eds. 1987 The Merck Manual, 15ª edición, Merck y Co., Rahway, N.J.; Goodman et al. eds. 1990 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8ª edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.; Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and 55 Therapeutics, 3ª edición, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. 1987; Osol, A. ed. 1980 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, Pa. pp. 1324-1341; Katzung, ed. 192 Basic y
Clinical Pharmacology, quinta edición, Appleton y Lange, Norwalk, Conn.
Un régimen típico para evitar, suprimir o tratar una patología relacionado con el virus del dengue puede comprender la administración de una cantidad eficaz de una composición de vacuna como se describe en el presente documento, administrada como un tratamiento individual, o repetido como dosis de potenciación o de refuerzo,
5 durante un periodo de hasta y que incluye entre una semana y aproximadamente 24 meses, o cualquier intervalo o valor en el mismo.
Se apreciará que las cantidades reales del compuesto activo en un caso específico variarán de acuerdo con el compuesto específico que vaya a utilizar, las composiciones formuladas, el modo de aplicación y el sitio y organismo particular que se vaya a tratar. Las dosificaciones para un huésped dado se pueden determinar usando
10 consideraciones convencionales, por ejemplo, por comparación habitual de las actividades diferenciales del sujeto, compuestos y de un agente conocido, por ejemplo, por medio de un protocolo farmacológico convencional, apropiado.
La dosificación de una vacuna de virus vivo atenuado para un sujeto mamífero (por ejemplo, humano) puede ser desde aproximadamente 103 -107 unidades formadores de placa (PFU)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo.
15 La dosis de vacuna inactivada puede variar desde aproximadamente 0,1 hasta 50 μg de proteína E. Sin embargo, la dosificación debe ser una cantidad segura y eficaz como se determina por procedimientos convencionales, usando vacunas existentes como punto de partida.
Las composiciones, si se desea, pueden presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender, por
20 ejemplo, lámina de metal o de plástico, tal como un envase alveolado. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado por instrucciones para su administración.
Tabla 1. La susceptibilidad de ratones a infección por DEN4 intracerebral es dependiente de la edad a
Virus Valoración de virus media (log10PFU/g cerebro) ± EE tras inoculación a la edad indicada (días)
7 14 21
2A-13 >6,0 4,0 ±0,2 3,1 ±0,2 rDEN4 >6,0 3,3 ±0,4 3,3 ±0,2 rDEN4Δ30 >6,0 3,6 ±0,2 2,8 ±0,3
a Se inocularon grupos de 4 o 5 ratones Swiss Webster por vía intracerebral con 105 PFU de virus en un inóculo de 30 μl. Después de 5 días, se retiraron los cerebros, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. EE = Error estándar.
TABLA 2 Fenotipos sensible a la temperatura (ts) y de atenuación en cerebro de ratón (att) de virus DEN4 mutantes de 5-FU.
Valoración de virus media (log10PFU/ml) a la temp. indicada (ºC) Virus replicación en ratones lactantes b
Valoración media
Fenotipo Virus Células Vero Células HuH-7
± EEReducción log10 Δa (log10PFU/g media de wt d
35 373839 35 37 38 39Δ n
cerebro) wt (no ts) 2A-13 7,8 7,7 7,6 7,3 0,5 7,8 7,7 7,4 6,4 1,4 66 6,6± 0,1º rDEN4 6,5 6,4 6,4 6,0 0,5 7,1 6,7 6,0 5,5 1,6 66 6,1 ±0,1º -
rDEN4Δ30 6,3 6,1 6,1 5,7 0,6 6,9 6,3 5,9 4,7 2,2 64 5:6 ±0,1º 0,5
ts en células 695 6,2 6,0 5,2 2,6e 3,6 6,5 5,5 3,8 <1.6 >4,9 6 3,0 ±0,2 3,2
Vero y HuH-7 816 6,8 6,4 5,8 3,9 2,9 7,5 6,2 5,5 3,1 4,4 6 3,3 ±0,4 2,9 773 7,4 6,6 6,0 3,1 4,3 7,7 6,1 5,2 3,1 4,6 12 3,7 ±0,1 2,6 489 7,3 6,6 6,1 3,3 4,0 7,3 6,7 5,4 3,0 4,3 6 4,5 ±0,5 2,3 173 7,0 6,1 3,2 2,9 4,1 7,0 3,2 3,0 2,1 4,9 18 4,7 ±0,4 2,2 509 6,2 5,8 5,5 3,4 2,8 6,5 6,1 4,5 <1,6 >4,9 6 4,9 ±0,3 1,9 938 7,1 6,5 5,6 3,1 4,0 7,2 6,4 5,6 3,1 4,1 6 5,1 ±0,2 1,7 1033 6,7 6,0 5,9 4,1 2,6 6,9 5,6 4,7 <1,6 >5,3 12 4,7 ±0,2 1,7 239 7,6 6,8 5,6 3,3 4,3 7,6 6,7 4,7 2,5 5,1 12 4,7 ± 0,3 1,5 793 6,5 5,8 5,3 4,0 2,5 7,2 6,8 5,6 <1,6 >5,6 6 5,4 ±0,3 1,4 759 7,2 6,9 6,4 4,7 2,5 7,5 6,8 6,3 3,1 4,4 12 5,1 ±0,1 1,4 718 6,1 5,9 5,3 3,5 2,6 7,0 6,5 5,7 1,7 5,3 12 5,0 ±0,3 1,4
473 6,7 6,3 5,4 2,0 4,7 7,2 6,7 3,7 1,9 5,3 12 5,1 ±0,3 1,2
ts sólo en 686 7,0 6,7 6,7 6,4 0,6 7,3 6,8 6,4 2,2 5,1 12 2,7 ±0,2 3,8
células HuH-7 967 6,8 6,4 6,4 5,1 1,7 6,8 6,4 5,4 <1,6 >5,2 6 3,6 ±0,2 2,9 992 7,3 7,1 6,8 5,9 1,4 7,4 6,9 5,0 <1,6 >5,8 6 3,8±0,1 2,7 571 6,9 7,0 6,4 4,6 2,3 7,0 6,3 5,2 <1,6 >5,4 6 4,4 ±0,4 2,4 605 7,6 7,5 7,1 6,9 0,7 7,8 7,2 6,8 <1,6 >6,2 12 4,5 ±0,4 2,1 631 7,1 6,9 6,8 5,0 2,1 7,3 7,1 6,5 <1,6 >5,7 12 4,8 ±0,3 1,9 1175 7,4 7,1 6,9 5,3 2,1 7,6 6,5 4,7 3,3 4,3 12 4,7 ±0,2 1,7
a Reducción en el valor (log10PFU/ml) a 39 ºC en comparación con el valor a la temperatura permisiva (35 ºC). b Se inocularon grupos de 6 ratones lactantes i.c. con 104 PFU de virus en un inóculo de 30 μl. Se retiraron los cerebros 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. c Promedio de 11 experimentos con un total de 64 a 66 ratones por grupo. d Determinado comparando valores víricos medios de ratones inoculados con virus mutante y el control wt 2A-13 en el mismo experimento (n= 6 o 12). e Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor en células Vero o células HuH-7, respectivamente, a la temp. indicada cuando se compara con el valor a la temp. permisiva (35 ºC).
Tabla 3. Diferencias de nucleótidos y aminoácidos de los virus mutantes de 5-FU que son ts en ambas células Vero y HuH-7.
Mutaciones en región codificante que no dan
Mutaciones en UTR o región codificante que dan como resultado
como resultado una sustitución de
una sustitución de aminoácidos
Virus aminoácidos
Posición de Gen/ Cambio de Cambio de Posición de Cambio de nucleótido región nucleótido aminoácidos b nucleótido Gen nucleótido
173 a 7163 NS4B A > C L2354F 10217 NS5 A > U 7849 NS5 A > U N2583I 8872 NS5 A > G K2924R
239 a 4995 NS3 U >C S1632P 7511 NS4B G > A 10070 NS5 U > C
473 a 4480 NS2B U > C VI460A 7589 NS5 G > A 4995 NS3 U > C S1632P 10070 NS5 U > C
489 a 4995 NS3 U> C S1632P 2232 E U > C 3737 NS2A C > U
509 a 4266 NS2B A > G S1389G ninguna 8092 NS5 A> G E2664G
695 40 5'UTR U > C n/a 1391 E A > G 1455 E G > U V452F 6106 NS3 A > G E2002G 7546 NS4B C > U A2482V
718 2280 E U > C F727L ninguna 4059 NS2A A > G 11320V 4995 NS3 U > C S1632P 7630 NS5 A > G K2510R 8281 NS5 U > C L2727S
759 a 4995 NS3 U > C S1632P ninguna 8020 NS5 A > U N2640I
773 a 4995 NS3 U > C S1632P ninguna
793 1776 E G > A A559T 5771 NS3 U > C 2596 NS1 G > A R832K 7793 NS5 U > A 2677 NS1 A > G D859G 4387 NS2B C > U S1429F
816 a 4995 NS3 U > C S1632P 6632 NS4A G > A 7174 NS4B C > U A2358V 6695 NS4A G > A
93 8 a 3442 NS1 A > G E1114G 747 prM U > C 4995 NS3 U > C S1632P 4196 NS2b U > C 10275 3’UTR A > U n/a 6155 NS3 G > A
1033 a 4907 NS3 A > U L1602F 548 prM C > U 8730 NS5 A > C N2877H 9977 NS5 G > A M3292I
a Se indican los virus que contienen mutación/mutaciones que dan como resultado una sustitución de a.a. sólo en un gen NS y/o sustituciones de nucleótidos en las UTR; es decir, no están presentes sustituciones de a.a. en las proteínas estructurales (C-prM-E).
b La posición aminoacídica en la poliproteína de DEN4 comienza con el residuo metionina de la proteína C (nt 102104) como residuo n.º 1. Aminoácido natural a la izquierda de la posición aminoacídica; aminoácido mutante a la derecha.
41 Tabla 4. Diferencias de nucleótidos y aminoácidos de los virus mutantes de 5-FU que son ts sólo en células HuH-7.
Mutaciones en región codificante que noMutaciones en UTR o región codificante que dan como dan como resultado una sustitución deresultado una sustitución de aminoácidos
Virus aminoácidos Posición de Gen / Cambio de Cambio de Posición de Cambio de nucleótido región nucleótido aminoácido b nucleótido Gen nucleótido
571 586 prM U>C VI62 A 6413 NS4A U>C 7163 NS4B A > U L2354F 7947 NS5 G> A G2616R
605 1455 E G>U V452F ninguna 7546 NS4B C>U A2482V
631 595 prM A > G K165R 1175 E G> A 6259 NS3 U>C V2053A 5174 NS3 A>G 7546 NS4B c>u A2482V
686 a 3575 NS2A G> A Ml 1581 4604 NS3 A> G 4062 NS2A A> G T1321A 7937 NS5 A> G 7163 NS4B A>U L2354F
967 2094 E G > C A665P 4616 NS3 C>U 2416 E u>c V772A 7162 NS4B u>c L2354S 7881 NS5 G> A G2594S
992 a 5695 NS3 A> G D1865G 3542 NS2A A>G 7162 NS4B U>C L2354S
1175 a 7153 NS4B U>C V2351A 6167 NS3 U>C 10186 NS5 U>C I3362T 10184 NS5 G> A 10275 3'UTR A>U n/a
a Se indican los virus que contienen mutación/mutaciones dando como resultado una sustitución de a. a. sólo en un gen NS y/o sustituciones de nucleótidos en las UTR; es decir, no están presentes sustituciones de a. a. en las proteínas estructurales. b La posición aminoacídica en la poliproteína de DEN4 comienza con el residuo metionina de la proteína C (nt 102104) como residuo n.º 1. Aminoácido natural a la izquierda de la posición aminoacídica; aminoácido mutante a la derecha.
TABLA 5. Mutaciones que están representadas en virus DEN4 mutantes de 5-FU múltiples.
Posición de Cambio de Cambio de Número de virus con mutaciones
Gen/ región
nucleótido nucleótido aminoácido “hermanas”
1455 E G>U val > phe 2 4995 NS3 U>C ser > pro 8 7162 NS4B U>C leu > ser 2 7163 NS4B A > U o C leu > phe 3 7546 NS4B C>U ala > val 3 10275 3'UTR A>U n/a a 2
a no aplicable
Tabla 6. La adición de mutación ts 4995 a rDEN4Δ30 confiere un fenotipo ts y atenúa adicionalmente su replicación en el cerebro de ratones lactantes.
Valoración de virus media (log10PFU/ml) a la temp. indicada ( ºC) Replicación en ratones lactantes b Virus
Células Vero Células HuH-7
Valoración de virus media ± Reducción log10 media de EE (log10PFU/g cerebro) wt c
3537 3839Δ a 35 373839 Δ
2A-13 7,1 7,1 6,9 6,8 0,3 7,4 7,3 6,7 6,4 1,0 6,5 ±0,1 rDEN4 7,0 6,8 6,6 6,4 0,6 7,5 7,3 6,7 6,4 1,1 6,1 ± 0,2 -rDEN4Δ30 7,0 6,7 6,2 6,2 0,8 7,5 7,0 6,5 5,1 2,4 5,9 ±0,1 0,2 rDEN4-4995 5,7 4,9 3,6 <1,6 >4,1 6,4 5,7 4,0 <1,6 >4,8 3,2 ±0,2 2,9 rDEN4Δ30-4995 5,9 4,9 3,9 <1,6 d >4,3 6,4 5,6 4,4 <1,6 >4,8 3,0 ±0,3 3,1
a Reducción en el valor (log10PFU/ml) a 39 ºC en comparación con el valor a la temperatura permisiva (35 ºC).
b Se inocularon grupos de 6 ratones lactantes i.c. con 104 PFU de virus en un inóculo de 30 μl. Se retiraron los cerebros 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. El límite de detección es de 2,0 log10PFU/g cerebro. c Determinado comparando valores víricos medios de ratones inoculados con virus de muestra y control de rDEN4.
d Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor en células Vero o células HuH-7, respectivamente, a la temperatura indicada cuando se compara con la temperatura permisiva.
Tabla 7. Fenotipos sensible a la temperatura (ts) y de atenuación en cerebro de ratón (att) de virus mutantes de DEN4 de 5-FU que presentan un fenotipo de placa pequeña (sp). Fenotipo Valoración de virus media (log10PFU/ml) a la temp. indicada ( ºC) Replicación en ratones lactantes b
Valoración de virus
sp ts Virus Células Vero Células HuH-7 Reducción log10
media ± EE Vero HuH-7 Vero HuH-7 35 37 38 39 Δ a 35 37 38 39 Δ n (log10PFU/g cerebro) media de wt d
— — — — 2A-13 7,9 7,5 7,7 7,2 0,7 7,9 7,7 7,3 6,9 1,0 66 6,6 ± 0,1 c — — — — — rDEN4 7,9 7,6 7,7 7,3 0,6 8,1 7,6 7,5 6,7 1,4 66 6,1 ± 0,1 c — — — — — rDEN4Δ30 7,3 6,6 6,6 6,1 1,2 7,3 7,2 6,9 5,9 1,4 64 5,6 ± 0,1 c 0,5
+ + + + 574 6,6 x 5,5 3,8 <1,6 e ≥5,0 6,6 x 4,9 5,0 <1,6 ≥5,0 6 2,1 ± 0,1 5,1 + + + 1.269 5,3 x 4,8 3,9 <1,6 ≥3,7 4,0 x 2,4 2,0 <1,6 ≥2,4 6 2,7 ± 0,2 4,1 + + + + 1.189 6,3 x 5,2 4,5 3,8 2,5 5,5 x 3,7 2,3 <1,6 ≥3,9 12 3,2 ± 0,4 3,7
+ + — — 569 5,8 x 5,6 5,6 3,7 2,1 6,2 x 6,0 5,7 5,0 1,2 12 1,9 ±0,1 4,6 + + — — 761 5,0 x 4,7 4,2 2,7 2,3 5,6 x 5,3. 4,5 2,6 3,0 12 2,0 ±0,1 4,2
+ + + 506 7,0 6,8 5,6 2,6 4,4 6,7 x 4,3 <1,6 2,0 4,7 6 2,2 ± 0,1 4,7 — + + + 1.136 5,1 4,2 2,6 <1,6 ≥3,5 5,7 x 3,0 3,0 <1,6 ≥4,1 6 2,9 ± 0,3 4,5 — + + + 1.029 6,9 5,8 5,8 2,9 4,0 7,0 x 5,8 5,2 2,5 4,5 6 2,2 ± 0,1 4,2 — + + + 1.081 6,9 5,8 4,7 3,9 3,0 5,8 x 4,1 3,3 1,9 3,9 12 2,6 ± 0,2 3,9 — + + + 529 6,9 6,5 5,9 4,0 2,9 7,1 x 5,3 4,4 <1,6 ≥5,5 6 3,1 ± 0,7 3,8 — + + + 1.114 6,7 6,4 6,2 2,5 4,2 5,7 x 3,0 2,9 1,9 3,8 6 2,7 ± 0,3 3,7 — + + + 922 7,3 7,2 6,8 3,8 3,5 7,4 x 5,3 4,1 3,0 4,4 12 3,5 ± 0,1 2,9 — + + + 311 6,9 5,9 4,3 1,5 5,4 7,1 x 5,4 3,6 <1,6 ≥5,5 12 6,1 ± 0,3 0,9 — + + + 326 6,6 5,7 4,5 3,1 3,5 7,0 x 5,5 4,1 2,0 5,0 6 6,0 ±0,1 0,9
+ — + 1.104 7,1 6,8 6,8 6,1 1,0 7,2 x 6,4 5,8 2,8 4,4 6 2,2 ± 0,1 4,7 — + — + 952 7,1 7,0 6,7 5,6 1,5 7,3 x 6,3 5,6 3,0 4,3 6 2,4 ±0,3 4,5 — + — + 738 6,5 6,0 5,9 5,7 0,8 6,9 x 6,1 5,0 3,1 3,8 12 4,4 ± 0,4 2,3 — + — + 1.083 7,4 7,3 7,4 5,8 1,6 7,4 x 6,6 4,5 <1,6 ≥5,8 12 4,5 ± 0,4 2,0
— + — — 1.096 7,5 7,1 6,9 5,5 2,0 7,5 x 6,6 5,6 4,8 2,7 6 2,9 ± 0,2 3,5 — + — — 1.021 7,0 6,9 6,6 6,3 0,7 6,9 x 5,7 4,4 4,0 2,9 6 3,9 ± 0,6 2,6 — + — — 1.023 6,6 6,4 6,0 5,8 0,8 6,1 x 5,6 4,7 3,3 2,8 12 4,2 ± 0,3 2,3 — + — — 1.012 7,5 7,1 7,0 5,7 1,8 7,4 x 6,8 6,8 5,6 1,8 6 6,1 ± 0,1 0,8
a Reducción en el valor de virus medio (log10PFU/ml) a 39 ºC en comparación con la temperatura permisiva (35 ºC). b Se inocularon grupos de 6 ratones lactantes i.c. con 104 PFU de virus. Se retiraron los cerebros 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. c Promedio de 11 experimentos con un total de 64 a 66 ratones por grupo. d Determinado comparando valores víricos medios de ratones inoculados con virus mutante y control de virus natural (wt) 2A-13 concurrente (n = 6 o 12). e Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor en células Vero o células HuH-7, respectivamente, a la temperatura indicada cuando se compara con la temperatura permisiva (35 ºC). x Tamaño de placa pequeña a 35 ºC; las placas pequeñas tienen un diámetro de <1,0 mm en comparación con el diámetro de placa natural de 1,5 -2,0 mm en células Vero, o un diámetro de <0,4 mm en comparación con el diámetro de placa natural de 0,75 a 1,0 mm en células HuH-7.
Tabla 8. Los virus con ambos fenotipos ts y sp son más restrictivos en replicación en el cerebro de ratón que los que sólo tienen un fenotipo ts.
Fenotipo de cultivo celular Número de virus Reducción log10 media en valor de virus del control
b,c
ts a
20 2,1 ±0,2
sp
6 3,0 ±0,6
ts / sp
16 3,5 ±0,3
a Se describieron previamente 20 virus mutantes ts sin un fenotipo sp fenotipo (ejemplo 1). b Determinado comparando valores víricos medios de grupos de ratones inoculados con virus mutante y virus de control de paso paralelo de 2A-13 concurrente. c Diferencia significativa entre el grupo ts y el grupo ts /sp, prueba de Tukey-Kramer (P < 0,05)
Tabla 9. Diferencias de nucleótidos y aminoácidos de los virus DEN4 mutantes de 5-FU que producen placas pequeñas en ambas células Vero y HuH-7.
Virus 569
Mutaciones en UTR o en regiones codificantes que dan como resultado una sustitución de aminoácidos Posición de nucleótido Gen/ región Cambio de nucleótido Cambio de amino ácido b 826 prM G > A R242K 832 prM C > U P244L 7546 NS4B C > U A2482V Mutaciones en regiones codificantes que no dan como resultado una sustitución de aminoácidos Posición de nucleótido Gen Cambio de nucleótido 1946 E C>U
10275 10279
3’ UTR 3’ UTR A > U A > U n/a n/a
574
1455 1963 3880 7546 7615 10413 E E NS2A NS4B NS5 3'UTR G > U U > C A > G C > U A > G A > G V452F V621A K1260R A2482V N2505S n/a 1349 E C > U
761
424 2280 7131 7486 C E NS4B NS4B U > C U > C A > G A > G I108T F727L T2344A N2462S ninguna
1189 a
3303 NS1 A > G R1068G 6719 NS4A U >C
4812
NS3 G > A V1571I
5097
NS3 G > A D1666N
7182
NS4B G > A G2361S
1269
2112 3256 E NS1 U > C G > A F671L G1052E 542 prM C>U
3993
NS2A U > C F1298L
7183
NS4B G > U G2361V
a El virus contiene mutaciones con pérdida de sentido sólo en los genes no estructurales.
b La posición aminoacídica en la poliproteína de DEN4 comienza con el residuo metionina de la proteína C (nt 102-104). Aminoácido natural a la izquierda de la posición aminoacídica; aminoácido mutante a la derecha.
Tabla 10. Diferencias de nucleótidos y aminoácidos de los virus DEN4 mutantes de 5-FU que producen placas pequeñas sólo en células HuH-7.
Mutaciones en regiones codificantes que Mutaciones en UTR o en regiones codificantes que dan no dan como resultado una sustitucióncomo resultado una sustitución de aminoácidos de aminoácidosVirus
Posición de nucleótido
Gen/ región Cambio de nucleótido Cambio de aminoácido b Posición de nucleótido Gen Cambio de nucleótido
311
1519 2305 4896 E E NS3 A> G G> A G>U N473S R735K A1599S 6761 10070 NS4A NS5 C>U U>C
326
1587 7546 E NS4B C>U C>U P496S A2482V 1523 6080 10070 E NS3 NS5 G> A U>C U>C
506
1455 1902 7546 10275 E E NS4B 3'UTR G > U G> A C>U A>U V452F V601M A2482V n/a 3887 5789 NS2A NS3 A> G G> C
529
777 4641 7153 8245 10279 prM NS3 NS4B NS5 3' UTR U>C A > G U>C U>C A> C S226P 11514V V2351A 12715T n/a ninguna
738a
3540 7162 NS2A NS4B G> A U>C E1147K L2354S ninguna
922a
4306 5872 7163 10279 NS2B NS3 NS4B 3'UTR A> G C>U A>U A> C N1402S T19241 L2354F n/a 7736 NS5 G> A
952
1449 1455 7546 7957 9543 E E NS4B NS5 NS5 G>U G > U C>U U>C A>G V450L V452F A2482V V2619A 13148V ninguna
1012
1542 7162 10542 E NS4B 3'UTR A> G U>C A>G K481E L2354S n/a 953 1205 4425 E E NS2B A>G G> A U>C
1021
2314 3205 4029 7163 10275 10279 E NS1 NS2A NS4B 3'UTR 3'UTR U>C C>U U>C A>C A>U A>U I738T A1035V C1310R L2354F n/a n/a 665 5750 9959 prM NS3 NS5 C > A C>U C>U
1023
2283 7182 E NS4B G> A G> A G728R G2361S 1001 1958 3873 8486 E E NS2a NS5 C>U A>G U>C C>U
a Virus que contienen mutaciones con pérdida de sentido sólo en los genes no estructurales y/o mutaciones en las UTR. b La posición aminoacídica en la poliproteína de DEN4 comienza con el residuo metionina de la proteína C (nt 102-104). Aminoácido natural a la izquierda de la posición aminoacídica; aminoácido mutante a la derecha.
Mutaciones en regiones codificantes
Mutaciones en UTR o en regiones codificantes que dan
que no dan como resultado una
como resultado una sustitución de aminoácidos
sustitución de aminoácidos
Virus

TABLA 10. Continuación
Posición de nucleótido
Gen/ región Cambio de nucleótido Cambio de aminoácido b Posición de nucleótido Gen Cambio de nucleótido
1029
850 3087 4891 prM NS1 NS3 C>U A> G U>C A250V T996A I1597T 3867 NS2a C > U
1081 a
2650 7163 NS1 NS4B A> G A>U N850S L2354F 6326 9146 NS3 NS5 C > U C > U
1083 a
3702 7153 10634 NS2A NS4B 3'UTR G> A U>C U>C A1201T V2351A n/a 3353 6155 NS1 NS3 A > G G > A
1096
892 7163 8659 prM NS4B NS5 G> A A>C C>U R264Q L2354F P2853L 665 4427 prM NS2b C > A G > A
1104
1692 5779 7546 E NS3 NS4B G> A C>U C>U V531M A1893V A2482V ninguna
1114
709 3693 4614 7546 9942 prM NS2A NS3 NS4B NS5 A> G A> G U>C C>U A> G K203R 11198V F1505L A2482V T3281A 1076 1182 5690 E E NS3 U > C C > U C > U
1136 a
3771 4891 10275 NS2A NS3 3'UTR A> G U>C A> U R1224G I1597T n/a 5621 NS3 A > G
a Virus que contienen mutaciones con pérdida de sentido sólo en los genes no estructurales y/o mutaciones en las UTR. b La posición aminoacídica en la poliproteína de DEN4 comienza con el residuo metionina de la proteína C (nt 102-104). Aminoácido natural a la izquierda de la posición aminoacídica; aminoácido mutante a la derecha.
Tabla 11. Mutaciones de adaptación de células Vero putativas derivadas del conjunto completo de virus mutantes de 5-FU.
Posición de nucleótido
Gen / región (a. a. #)b Cambio de nucleótido Virus mutantes de 5-FU Cambio de aminoácido No. de virus con la mutación
1455
E (452) G>U Val > Phe 5
2280
E(727) U>C Phe > Leu 2
4891
NS3 (1597) U>C Ile > Thr 2
4995
NS3 (1599) U>C Ser > Pro 8
7153
NS4B (2351) U>C Val > Ala 3
7162
NS4B (2354) U>C Leu > Ser 4
7163
NS4B (2354) A > U o C Leu > Phe 7
7182
NS4B (2361) G> A Gly > Ser 2
7546
NS4B (2482) C>U Ala > Val 10
7630
NS5 (2510) A> G Lys > Arg 1
10275
3'UTR A>U n/a a 6
10279
3'UTR A>C n/a 4
a no aplicableb La posición aminoacídica en la poliproteína de DEN4 comienza con el residuo metionina de la proteína C (nt 102104) como residuo n.º 1.

Tabla 12. Oligonucleótidos mutagénicos usados para generar virus DEN4 recombinantes que contienen mutaciones de 5-FU individuales.
SEQ ID NO.
Virus recombinante(rDEN4-) Cambio denucleótido Cambio deaminoácido Gen Clon pUC sitio RE a Oligonucleótido b
23
40 U > C n/a 5'UTR pUC-NheI BsaWl CAGTTCCAAAcCGGAAGCTTG
24
2650 A > G Asn > Ser NS1 pUC-NS1 BsiWl CCAACGAGCTAtcgTAcGTTCTCTGGG
25
3303 A > G Arg > Gly NS1 pUC-NS1 Styl GATTGTGACCATgGcGGCCCATCTTTG
26
3442 A > G Glu > Gly NS1 pUC-NS1 Blpl GGAGATTAGGCCgcTGAGcGgtAAAGAAGAG
27
3540 G > A Glu > Lys NS2A. pUC-NS1 Bsml GTTTGTGGAAaAATGtcTGAGGAGAA
28
3575 G > A Met > Ile NS2A pUC-NS1 Sspl CTAGGAAACACATaATATTAGTTGTGG
29
3702 G > A Ala > Thr NS2A pUC-NS2A Bgll CAGATCCACCTAaCCATaATGGCAGTG
30
3771 A > G Arg > Gly NS2A pUC-NS2A Aval GGAAACTCACcTCggGAGAGACAGC
31
4059 A > G Ile > Val NS2A pUC-NS2A BstEIl TTGGGTAGAggTcACcGCACTCATCC
32
4062 A > G Thr> Ala NS2A pUC-NS2A BsrBl GTAGAAATAgCcGCtCTCATCCTAG
33
4266 A > G Ser > Gly NS2B pUC-NS2A SnaBl GGCGGCTTACGTaATGgGaGGTAGCTCAGC
34
4306 A > G Asn > Ser NS2B pUC-NS2A AlwNI CTAGAGAAGGCaGCttctGTGCAGTGG
35
4480 U > C Val > Ala NS2B pUC-NS2A Mscl CCTTGGCcATTCCAGcaACAATGAC
36
4812 G > A Val > lie NS3 pUC-NS2A Apol GACGTTCAaaTttTaGCCATAGAACC
37
4891 U > C Ile > Thr NS3 pUC-NS2A Kasl CTGGAGAAAcaGGcGCcGTAACATTAG
38
4896 G > U Ala > Ser NS3 pUC-NS2A BstEll GAAATTGGAtCgGTAACcTTAGATTTC
39
4907 A > U Leu > Phe NS3 pUC-NS2A Acll GGAGCAGTAACgTTtGATTTCAAACCC
40
4995 U > C Ser > Pro NS3 pUC-NS2A BsaJl GTTACCAAAcCtGGgGATTACGTC
41
5097 G > A Asp > Asn NS3 pUC-NS3 BspHI GATTAACTATcATGaACTTACACCC
42
5695 A > G Asp > Gly NS3 pUC-NS3 Banl GGAAAACCTTTGgcACcGAGTATCC
43
5872 C > U Thr > Ile NS3 pUC-NS3 BsrFl TCCAGTGAtaCCgGCtAGCGCTGCTC
44
6106 A > G Glu > Gly NS3 pUC-NS3 Mscl GCCTCAGAGGtGgcCAAAGGAAG
45
6259 U > C Val > Ala NS3 pUC-NS3 Bglll ACATGGAGGcaGAgATcTGGACTAGA
46
7153 U > C Val > Ala NS4B pUC-NS4A Mscl AAAGCATGgCcAAGGATGCTGTC
(continuación)
SEQ ID NO.
Virusrecombinante(rDEN4-) Cambio denucleótido Cambio deaminoácido Gen Clon pUC sitio RE a Oligonucleótido b
47
7162 U > C Leu > Ser NS4B pUC-NS4A BlpI GCATAATGGACgctAAGCATGACTAAGG
48
7163 A > C Leu > Phe NS4B pUC-NS4A ApaLl TTATTGCATAgTGcACgAAAAGCATG
49
7174 C > U Ala > Val NS4B pUC-NS4A BsaAI GGGCCTATTATTaCgTAATGGAC
50
7182 G > A Gly > Ser NS4B pUC-NS4A n/a CTGCAATCCTGGtgaTATTATTGC
51
7546 C > U Ala > Val NS4B pUC-NS5A AclI CTCATAAAGAAcGttCAAACCCT
52
7630 A > G Lys > Arg NS5 pUC-NS5A HgaI CATTAGACAGAcgcGAGTTTGAAG
53
7849 A > U Asn > Ile NS5 pUC-NS5A HgaI TGGCGACgCTCAAGAtaGTGACTGAAG
54
8020 A > U Asn > Ile NS5 pUC-NS5A ClaI GAGTCATCaTCgAtaCCAACAATAG
55
8092 A > G Glu > Gly NS5 pUC-NS5A EcoRI CTTCAAAACCTGgcTTCTGCATCAAAG
56
8281 U > C Leu > Ser NS5 pUC-NS5B XmnI CAAAGATGTTGagcAACAGGTTCACAAC
57
8730 A > C Asn > His NS5 pUC-NS5B AvaI GGAAAGAAGAAAcAcCCgAGACTGTGC
58
8872 A > G Lys > Arg NS5 pUC-NS5B PvuI GGGAACTGGTcGAtcgAGAAAGGGC
59
9977 G > A Met > Ile NS5 pUC-NS5C SfcI CCAGTGGATtACtACaGAAGATATGCTC
60
10186 U > C He > Thr NS5 pUC-NS5C AgeI CAGGAACCTGAcCGGtAAAGAGGAATACG
61
10275 A > U n/a 3'UTR pUC-NS5C n/a CTGTAATTACCAACAtCAAACACCAAAG
62
10279 A > C n/a 3'UTR pUC-NS5C n/a CCAACAACAAcCACCAAAGGCTATTG
63
10634 U > C n/a 3'UTR pUC-3'UTR n/a GGATTGGTGTTGTcGATCCAACAGG
a Se modificaron cebadores que introdujeron (subrayados) o extirparon (línea sombreada) sitios de enzima de restricción traduccionalmente inactivos.
b Las letras minúsculas indican cambios de nt y las letras en negrita indican el sitio de la mutación de 5-FU, que en algunos oligonucleótidos difiere del cambio de sustitución denucleótido original para crear un sitio de enzima de restricción único. El cambio preserva el codón para la sustitución de aminoácidos.
Tabla 13. Fenotipos sp, ts y de atenuación en ratón de virus mutantes de rDEN4 que codifican mutaciones individuales identificadas en seis virus mutantes sp de 5-FU. Valoración de virus media (log10PFU/ml) a la
Replicación en ratones lactantes b Replicación en ratones HuH-7-SCID d
temp. indicada ( ºC)
Gen/ región
virus Valor de virus
que Células Vero Células HuH-7 Valoración de
mutante Reducción log10-máximo medio ± Reducción log10
contiene
virus media ± EE
de 5-FU
n unidad media del n EEunidad media del
mutación
(log10PFU/g
35 39 Δ a 35 39 Δ valor para wt c (log10 PFU/ml valor para wt c
cerebro)
suero)
2A-13 7,67,10,57,86,61,2306,5±0,1-296,8 ± 0,2
rDEN4 7,66,80,88,06,71,3545,8 ±0,1-326,3 ± 0,2-
rDEN4Δ30 7,6 6,9 0,7 7,7 5,6 2,1 30 5,6±0,1 0,2 18 5,4 ± 0,2 0,9
738 progenitor6,55,1 0,8x6,93,1e 3,8124,4 ± 0,42,395,4 ± 0,71,9rDEN4-3540 NS2A 6,91,87,43,73,7124,1 ±0,31,756,1 ± 0,3(+)0,1rDEN4-7162 NS4B 7,2 0,4 7,4 6,6 0,8 8 5,6 ±0,3 0,3 5 6,8 ± 0,6 0,3
922 progenitor7,33,83,5x 7,4 3,04,4123,5 ± 0,12,966,2 ± 0,20,4rDEN4-4306NS2Bx 5,02,22,8x 5,6 <1,6>4,0121,7 ± 0,14,155,2 ±0,61,1rDEN4-5872NS35,72,53,2x 6,5<1,6>4,9124,5 ± 0,31,356,2 ±0,50,1rDEN4-7163NS4B7,87,20,68,07,40,666,2 ± 0,2(+)0,165,8 ±0,6(+)0,2rDEN4-10279 3'UTR 6,9 5,7 1,2 7,7 5,7 2,0 6 4,8 ± 0,2 0,7 4 6,7 ± 0,2 0,4
1081 progenitor6,93,93,0x 5,8 1,93,9122,6 ±0,23,944,2 ± 0,52,4rDEN4-2650 NS15,13,02,1x 5,52,82,712 3,0 ±0,32,864,7 ± 0,52,2rDEN4-7163 NS4B 7,8 7,2 0,6 8,0 7,4 0,6 6 6,2 ±0,2 (+)0,1 6 5,8 ± 0,6 (+)0,2
1083 progenitor7,45,81,6x 7,4<1,6≥5,8124,5 ±0,42,094,4 ± 0,32,9rDEN4-3702 NS2A6,85,61,27,64,72,9184,9 ±0,30,976,3 ± 0,30,2rDEN4-7153 NS4B7,77,20,58,06,91,165,7 ±0,10,245,9 ± 0,70,1rDEN4-10634 3'UTR 4,9 1,6 3,3 x 5,7 <1,6 ≥4,1 12 2,4 ±0,3 3,4 7 3,3 ± 0,4 3,6
(continuación) Valoración de virus media (log10PFU/ml) a la
Replicación en ratones lactantes b Replicación en ratones HuH-7-SCID d
temp. indicada ( ºC)
Gen/ región
virus Valor de virus
que Células Vero Células HuH-7 Valoración de
mutante Virus Reducción log10-máximo medio ± Reducción log10
contiene
virus media ± EE
de 5-FU
n unidad media del n EEunidad media del
mutación
(log10PFU/g
35 39 Δ a 35 39 Δ valor para wt c (log10 PFU/ml valor para wt c
cerebro)
suero)
1136 progenitor5,1<1,6>3,5x 5,7 <1,6≥4,162,9 ±0,34,574,5 ±0,41,2rDEN4-3771 NS2A7,04,62,4x 7,6 3,73,9122,6 ±0,43,246,4 ±0,2(+)0,1rDEN4-4891 NS37,1<1,6>5,5x 7,4<1,6>5,8122,5 ±0,33,566,0 ±0,50,3rDEN4-10275 3’UTR 6,9 5,8 1,1 7,1 5,2 1,9 6 5,0 ±0,3 0,5 4 6,7 ±0,3 0,4
1189 progenitorx 6,33,82,5x 5,5<1,6≥3,9123,2 ±0,43,7132,3 ±0,33,8rDEN4-3303 NS16,14,81,36,63,92,785,7 ±0,40,246,3 ±0,30,8rDEN4-4812 NS37,06,30,77,16,30,8124,8 ±0,21,056,1 ±0,5(+)0,5rDEN4-5097 NS3x 5,0<1,6>3,4x 4,6<1,6>3,0121,8 ± 0,14,081,9 ±0,14,3rDEN4-7182 NS4B 7,7 6,9 0,8 7,8 6,8 1,0 6 6,2 ±0,1 (+)0,1 6 6,3 ±0,3 (+)0-7
a Reducción en el valor de virus medio (log10PFU/ml) a 39 ºC en comparación con la temperatura permisiva (35 ºC).
b Se inocularon grupos de 6 ratones lactantes i.c. con 104 PFU de virus. Se retiraron los cerebros 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero.
c Comparación de valores de virus medios de ratones inoculados con virus mutante y control de DEN4 concurrente. La negrita denota reducción de ≥50 o ≥100 vecesen replicación en ratones lactantes o SCID-HuH-7, respectivamente.
d Se inocularon grupos de ratones HuH-7-SCID directamente en el tumor con 104 PFU de virus. Se recogió el suero el día 6 y 7 y se valoró en células Vero.
e Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor en células Vero o células HuH-7, respectivamente, a la temp. indicada cuando se compara con temp. permisiva (35 ºC).
x Tamaño de placa pequeña a 35 ºC; las placas pequeñas tienen un diámetro de <1,0 mm en comparación con el diámetro de placa natural de 1,5 -2,0 mm en célulasVero, o un diámetro de <0,4 mm en comparación con el diámetro de placa natural de 0,75 a 1,0 mm en células HuH-7.
Tabla 14. Fenotipos de virus mutantes de rDEN4 que codifican mutaciones individuales identificadas en 10 virus mutantes de 5-FU que son ts en ambas células Vero y HuH-7.Replicación en ratones HuH-7
virus Mutación Valoración de virus media (log10PFU/ml) a la temp. indicada ( ºC) Replicación en ratones de 7 días b Gen/
SCID d mutantes rDEN4
región Células Vero Células HuH-7 Reducción log10 media de Reducción log10 media de
de 5-FU (posición nt)
n n
35 37 39 39 Δa 35 37 38 39 Δ wt c (log10PFU/g cerebro) wt c (log10PFU/ml suero)
239, 489progenitor NS3 7,66,85,63,3 e4,37,66,74,72,55,1302,16 0,3 773 5,7 4,9 3,6 <1,6 >4,1 6,4 5,7 4,0 <1,6 >4,8 6 2,9
4995 f
473 progenitor6,76,35,42,04,77,26,73,71,95,3121,28 (+)0,3 4480NS2B6,76,36,05,71,07,67,26,05,22,460,74995f NS3 5,7 4,9 3,6 <1,6 >4,1 6,4 5,7 4,0 <1,6 >4,8 6 2,9
759 progenitor7,26,96,44,72,57,56,86,33,14,4121,45 (+)0,4 4995f NS35,74,93,6<1,6>4,16,45,74,0<1,6>4,862,98020 NS5 7,1 6,6 6,7 5,9 1,2 7,4 7,1 6,1 5,4 2,0 6 0,5
816 progenitor6,86,45,83,92,97,56,25,53,14,462,96 0,4 4995f NS35,74,93,6<1,6>4,16,45,74,0<1,6>4,862,97174 NS4B 6,9 7,1 6,9 6,1 0,8 7,5 7,2 7,1 5,6 1,9 6 0,6
938 progenitor7,16,55,63,14,07,26,45,63,14,161,76 0,5 3442NS15,13,64,32,13,05,94,93,9<1,64,364,14995fNS35,74,93,6<1,6>4,16,45,74,0<1,6>4,862,910275 3'UTR 6,9 6,4 6,4 5,8 1,1 7,1 6,8 7,1 5,2 1,9 6 0,5
173 progenitor7,0 6,13,22,94,17,03,23,02,14,9182,26 1,1 7163NS4B7,87,77,6120,68,07,77,57,40,66(+)0,17849NS57,06,73,72,14,97,75,53,62,45,363,18872 NS5 7,0 6,3 6,4 4,4 2,6 7,4 6,4 5,1 2,9 4,5 6 0,1
509 progenitor6,25,85,53,42,86,56,14,5<1,6>4,961,96 1,5 4266NS2B5,96,16,15,20,76,76,15,75,31,461,08092 NS5 5,0x 4,6 4,6 <1,6 >3,4 5,6x 4,8 4,4 <1,6 >4,0 12 4,0
1033 progenitor6,76,05,94,12,66,95,64,7<1,6>5,3121,75 0,7 4907NS36,76,05,84,02,77,16,16,82,34,8121,88730NS57,06,76,66,70,37,67,07,26,61,0120,69977 NS5 5,6 5,5 4,6 4,1 1,5 6,4 6,1 6,2 4,6 1,8 6 0,7
a Reducción en el valor de virus medio (log10PFU/ml) a 39 ºC en comparación con la temperatura permisiva (35 ºC).
b Se inocularon grupos de 6 ratones lactantes i.c. con 104 PFU de virus. Se retiraron los cerebros 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero.
c Comparación de valores de virus medios de ratones inoculados con virus mutante y control de DEN4 concurrente. La negrita denota reducción de ≥50-o ≥100 veces en replicación
en ratones lactantes o SCID-HuH-7, respectivamente.
5 d Se inocularon grupos de ratones HuH-7-SCID directamente en el tumor con 104PFU de virus. Se recogió el suero el día 6 y 7 y se valoró en células Vero.
e Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor en células Vero o células HuH-7, respectivamente, a la temp. indicada cuando se compara con
temp. permisiva (35 ºC).
f Los datos representan los resultados de un único virus rDEN4-4995.
x Tamaño de placa pequeña a 35 ºC; las placas pequeñas tienen un diámetro de <1,0 mm en comparación con el diámetro de placa natural de 1,5 -2,0 mm en células Vero, o un10 diámetro de <0,4 mm en comparación con el diámetro de placa natural de 0,75 a 1,0 mm en células HuH-7.
Tabla 15. Fenotipos sp, ts y atenuación en ratón fenotipos de virus mutantes de rDEN4 que codifican mutaciones individuales identificadas en 3 virus mutantes de 5-FU ts específicos de células HuH-7. Valoración de virus media (log10PFU/ml) a la temp. indicada ( ºC) Replicación en 7-día ratones b Replicación en ratones HuHvirus 7-SC1D b Mutación rDEN4Gen/
mutantes Células Vero Células HuH-7 Reducción log10 media Reducción log10 media de
(posición nt) región
de 5-FU
n de wtc (log10PFU/g n wtc (log10PFU/ml suero)
Δa cerebro) 10 686 progenitor7,06,76,76,40,67,36,86,42,25,1123,86 1,23575NS2A6,96,97,17,00,17,96,86,94,93,0122,3nde4062NS2A6,86,66,34,72,16,96,87,0<1,6>5,3122,2nd7163 NS4B 7,8 7,7 7,6 7,2 0,6 8,0 7,7 7,5 7,4 0,6 6 (+)0,1 nd
35373939 35 37 38 39 Δ
992 progenitor7,37,16,85,91,47,46,95,0<1,6>5,862,77 1,35695NS35,64,74,73,81,86,35,13,7<1,6>4,762,8nd7162 NS4B 7,2 7,3 6,6 6,8 0,4 7,4 7,3 7,3 6,6 0,8 8 0,3 nd
1175 progenitor7,47,16,95,32,17,66,54,73,34,3121,75 1,07153NS4B7,77,77,67,20,58,07,87,56,91,160,2nd10186NS54,33,72,4<1,6>2,75,1<1,6<1,6<1,6>3,563,4nd10275 3'UTR 6,9 6,4 6,4 5,8 1,1 7,1 6,8 7,1 5,2 1,9 6 0,5 nd
a Reducción en el valor (log10PFU/ml) a 39 ºC en comparación con la temperatura permisiva (35'C).
b Se inocularon grupos de 6 ratones lactantes i.c. con 104 PFU de virus. Se retiraron los cerebros 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. c Determinado comparando valores víricos medios de ratones inoculados con virus mutante y control wt de 2A-13 o rDEN4 wt concurrente. d Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor en células Vero o HuH-7, respectivamente, a la temp. indicada
cuando se compara con temp. permisiva (35 ºC).
Tabla 16. Fenotipos sensible a la temperatura (ts) y de atenuación en cerebro de ratón (att) de virus rDEN4 adicionales que codifican mutaciones de 5-FU individuales.
virus Virus Gen/región Valoración de virus media (log10PFU/ml) a la temp. indicada ( ºC) Replicación en ratones lactantes b mutantque contiene
Células Vero Células HuH-7 Valoración de virus Reducción log10 -unidad
e de 5-mutación
FU Δa n media ±EEmedia del valor para wtc
3537 38 39 3537 38 39 Δ
(log10PFU/gcerebro) 695 rDEN4-40 5'UTR 7,4 7,2 6,7 6,2 1,2 7,6 7,5 7,1 5,8 1,8 ndf nd 718 rDEN4-4059 NS2A 7,0 6,7 6,4 6,2 0,8 7,7 7,1 7,0 6,6 1,1 nd nd 311 rDEN4-4896 NS3 7,0 6,1 5,9 4,2 2,8 6,9X 6,0 5,6 3,3 3,6 6 4,1 ±0,4 2,0** 695 rDEN4-6106 NS3 6,8 6,3 5,9 3,9 2,9 7,1 6,0 5,2 3,4 3,7 nd nd 631 rDEN4-6259 NS3 7,0 6,1 5,8 5,0 2,0 7,5 6,6 5,7 4,2 3,3 6 2,2 ±0,2 3,9** 695e rDEN4-7546 NS4B 7,5 7,6 7,4 6,6 0,9 7,7 7,6 7,3 5,7 2,0 nd nd 718 rDEN4-7630 NS5 7,0 6,9 6,9 6,4 0,6 7,4 7,4 7,2 6,8 0,6 6 5,0 ±0,3 0,5 718 rDEN4-8281 NS5 6,4 6,6 6,7 5,4 1,0 7,6 7,6 7,0 5,1 2,5 6 5,0 ±0,5 1,1
a Reducción en el valor (log10PFU/ml) a 39 ºC en comparación con el valor a la temperatura permisiva (35 ºC). b Se inocularon 6 ratones i.c. con 104 PFU de virus en un inóculo de 30 μl. Se retiraron los cerebros 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. El límite de detección es de 2,0 log10PFU/g. c Determinado comparando valores víricos medios de ratones inoculados con virus de muestra y control de rDEN4 wt. d Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor en células Vero o células HuH-7, respectivamente, a la temperatura indicada cuando se compara con la temperatura permisiva (35 ºC). e La mutación 7546 también está presente en otros nueve virus mutantes de 5-FU. x Tamaño de placa pequeña a 35 ºC; las placas pequeñas tienen un diámetro de <0,4 mm en comparación con diámetro de placa wt de 0,75 a 1,0 mm en células HuH-7. f no determinado ** El fenotipo att se define como una reducción de >1,5 log10PFU/g en comparación con el virus wt.
Tabla 17. Crecimiento de 2A-13 de DEN4 wt en ratones SCID trasplantados con células HuH-7.a Valor de virus
Dosis N.º de
log10PFU/ml suero log10PFU/g tejido
(log10PFU/ml) ratón
día 3 día 5 Cerebro Hígado Tumor
4
87 2,7 5,9 2,0 6,9 8,0
88
2,0 5,9 3,8 3,3 8,0
89
<1,7 6,2 2,7 3,6 8,0
90
1,7 3,5 3,2 3,0 7,0
5
84 <1,7 7,2 3,2 4,0 7,0
85
1,7 6,6 3,6 6,3 5,8
6
91 4,4 8,3 6,0 7,3 8,0
92
4,2 7,7 3,3 6,9 7,3
93
4,0 6,6 3,3 5,7 8,4
94
4,3 8,1 5,8 7,8 7,5
a Se inyectaron ratones SCID i.p. con 107 células de hepatoma humano HuH-7. Aproximadamente 8 semanas después, se inocularon grupos de ratones SCID-HuH-7 que llevaban tumor con virus directamente en el tumor. Se recogieron suero y tejidos el día 5, se procesaron y se valoraron en células Vero.
Tabla 18. La combinación de mutaciones ts, NS3 4995 y NS5 7849, en rDEN4 da como resultado un fenotipo ts aditivo. Virus Valoración de virus media (log10PFU/ml) a la temp. indicada ( ºC) Replicación en ratones lactantes b
Células Vero Células HuH-7 Valoración de virus media ± Reducción log10 media EE de wtc
35 37 38 39 Δa 35 37 38 39 Δ (log10PFU/g cerebro)
2A-13 wt 7,1 7,1 6,9 6,8 0,3 7,4 7,3 6,7 6,4 1,0 6,9 ± 0,09 rDEN4 wt 7,0 6,8 6,6 6,4 0,6 7,5 7,3 6,7 6,4 1,1 6,5 ± 0,11 -rDEN4Δ30 7,0 6,7 6,2 6,2 0,8 7,5 7,0 6,5 5,1 2,4 5,9 ±0,21 0,6
rDEN4-4995 5,7 4,9 3,6 <1,6d >4,1 6,4 5,7 4,0 <1,6 >4,8 3,4 ±0,10 3,1 rDEN4-7849 7,0 6,7 3,7 2,1 4,9 7,7 5,5 3,6 2,4 5,3 2,6 ± 0,29 3,9 rDEN4-4995-7849 5,9 2,8 <1,6 <1,6 >4,3 5,6 2,4 <1,6 <1,6 >4,0 2,3 ±0,20 4,2
a Reducción en el valor (log10PFU/ml) a 39 ºC en comparación con el valor a la temperatura permisiva (35 ºC). b Se inocularon grupos de 6 ratones lactantes i.c. con 104 PFU de virus. Se retiraron los cerebros 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. El límite de detección es de 2,0 log10PFU/g. c Determinado comparando valores víricos medios de ratones inoculados con virus de muestra y control wt de rDEN4. d Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor en células Vero o células HuH-7, respectivamente, a la temperatura indicada cuando se compara con la temperatura permisiva.

Tabla 19. Las mutaciones de 5-FU son compatibles con la mutación Δ30 para replicación en el cerebro de ratones lactantes.
Virus
N.º de ratones/ grupo Valoración de virus media ± EE (log10PFU/g cerebro)a Reducción log10-unidad media de wtb
rDEN4
12 6,0 ±0,1 —
rDEN4Δ30
12 5,3 ±0,1 0,7
rDEN4-2650c
12 3,7 ±0,2 2,3
rDEN4Δ30-2650 12 3,9 ±0,1 2,1 rDEN4-4995d 6 3,5 ±0,2 2,5 rDEN4Δ30-4995 6 2,7 ±0,4 3,3 rDEN4-8092d 12 2,0 ±0,1 4,0 rDEN4Δ30-8092 6 3,2 ±0,2 2,8 rDEN4-10634c 12 3,8 ±0,1 2,2 rDEN4Δ30-10634 12 3,6± 0,1 2,4 a Se inocularon grupos de 6 ratones lactantes i.c. con 104 PFU de virus. Se retiraron los cerebros 5 días
después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. b Comparación de valores de virus medios de ratones inoculados con virus mutante y control de rDEN4. c La mutación restringe el crecimiento tanto en el cerebro de ratón como en ratones HuH-7-SCED. d La mutación restringe el crecimiento sólo en el cerebro de ratón. La mutación 8092 no se ha sometido a
prueba en ratones SCID-HuH7.
Tabla 20. Fenotipos sensible a la temperatura y de atenuación en cerebro de ratón de virus que llevan mutaciones de carga-agrupada-a-alanina en el gen NS5 deDEN4.
Valoración de virus media (log10 PFU/ml a la temperatura indicada ( ºC)b
Replicación en ratones lactantes d
Células Vero Células HuH-7 Valoración media ±Reducción log media
Par AA N.º nt
Mutación a EE de wte
cambiado cambiado
35 37 38 39 Δc 35 37 38 39 Δ n (log10PFU/gcerebro)
wt (rDEN4) n/a 0 8,1 8,1 7,9 7,6 0,5 8,3 8,0 7,5 7,5 0,8 48 6,0 ±0,16 deleción (rDEN4Δ30) n/a 30 6,3 6,1 6,1 5,7 0,6 6,9 6,3 5,9 4,7 2,2 42 5,4 ±0,22 0,6
21-22 DR 4 7,2 6,8 6,7 6,1 1,1 7,6 7,1 7,0 4,7 2,9 6 5,0 ±0,50 0,6 22-23 RK 4 7,0 7,8 6,9 3,7 3,3 7,6 7,6 6,5 <1,7 >5,9 6 2,6 ±0,19 2,9 23-24 KE 3 6,7 6,6 6,0 6,5 0,2 7,1 7,3 5,6 <1,7 >5,4 18 4,7 ± 0,09 1,5 26-27 EE 3 7,8 7,6 6,8 4,0 3,8 8,4 8,2 7,3 4,9 3,5 6 5,7 ±0,30 +0,1 46-47 KD 3 7,4 7,4 7,3 7,0 0,4 7,8 7,8 7,3 6,8 1,0 6 5,4 ± 0,42 0,5 157-158 EE 3 6,5 7,2 5,1 5,1 1,4 7,6 7,4 5,9 <1,7 >5,9 6 2,8 ±0,31 2,7 200-201 KH 4 5,3 4,6 5,3 4,1 1,2 5,6 4,9 3,7 <1,7 >3,9 12 5,5 ± 0,45 0,8 246-247 RH 5 6,9 5,8 5,7 5,4 1,5 6,4 6,1 6,1 5,5 0,9 6 6,1 ±0,17 +0,5 253-254 EK 4 7,1 6,9 6,8 7,0 0,1 7,9 7,5 7,6 6,8 1,1 6 6,2 ±0,13 +0,6 356-357 KE 3 7,7 7,6 7,0 7,0 0,7 8,0 7,3 6,4 <1,7 >6,3 6 3,5 ±0,58 2,0 387-388 KK 5 7,7 6,1 7,0 <1,7 >6,0 7,0 6,3 7,0 <1,7 >5,3 6 3,1 ±0,33 2,4 388-389 KK 5 5,1 4,5 <1,7 <1,7 >3,4 6,1 5,0 <1,7 <1,7 >4,4 6 5,0 ±0,23 1,4 396-397 RE 4 7,0 7,3 6,5 5,5 1,5 7,5 7,6 7,5 <1,7 >5,8 18 5,4 ±0,35 1,1 397-398 EE 2 7,0 7,1 7,0 3,0 4,0 8,0 7,6 7,0 <1,7 >6,3 6 6,0 ±0,22 0,8 436-437 DK 4 4,5 3,3 3,0 2,0 2,5 5,7 4,5 <1,7 <1,7 >4,0 12 2,3 ±0,14 3,9 500-501 RE 3 6,6 6,3 5,7 2,3 4,3 7,1-6,5 <1,7 <1,7 >5,4 6 6,9 ± 0,49 +0,7 520-521 EE 3 5,6 4,7 4,3 <1,7 >3,9 6,7 5,7 <1,7 <1,7 >5,0 6 5,2 ±0,48 0,2 523-524 DK 4 6,6 6,3 6,3 5,8 0,8 7,1 6,6 <1,7 <1,7 >5,4 6 4,2 ± 0,47 1,3 524-525 KK 5 7,1 6,9 6,9 6,6 0,5 7,8 7,4 7,0 5,3 2,5 6 3,4 ±0,54 2,1 525-526 KD 4 7,8 7,1 7,6 6,8 1,0 7,9 7,7 8,0 6,9 1,0 6 3,7 ± 0,64 1,8 596-597 KD 3 4,6 4,0 2,6 <1,7 >2,9 "5,7 4,9 4,0 <1,7 >4,0 6 5,9 ±0,14 0,5 641-642 KE 4 7,3 6,9 6,9 5,2 2,1 7,8 7,5 7,2 6,9 0,9 6 4,7 ± 0,45 1,2 642-643 ER 3 6,8 6,1 4,0 3,3 3,5 7,5 7,1 6,6 3,0 4,5 12 2,6 ±0,15 3,6 645-646 EK 4 6,3 5,3 5,9 3,1 3,2 6,4 5,8 5,5 4,5 1,9 6 5,4 ±0,51 0,2 649-650 KE 3 6,9 6,8 6,9 6,3 0,6 7,1 7,3 7,5 7,0 0,1 12 6,4 ± 0,20 +0,2 654-655 DR 4 6,3 5,7 <1,7 <1,7 >4,6 7,0 7,1 4,6 <1,7 >5,3 12 1,8 ± 0,10 4,0
(continuación) Valoración de virus media (log10 PFU/ml a la temperatura indicada ( ºC)b Replicación en ratones lactantes d
Células Vero Células HuH-7 Valoración media ±Reducción log media
Par AA N.º nt
Mutación a EE de wte
cambiado cambiado
35 37 38 39 Δc 35 37 38 39 Δ n (log10PFU/g
cerebro) 750-751 RE 3 7,1 7,1 6,9 5,7 1,4 7,8 6,9 6,5 5,6 2,2 6 6,0 ±0,18 0,7 808-809 E D 3 4,6 4,1 <1,7 <1,7 >2,9 5,2 <1,7 <1,7 <1,7 >3,5 6 1,8 ±0,05 3,1 820-821 ED 2 6,3 6,3 5,6 <1,7 >4,6 6,9 6,0 5,7 <1,7 >5,2 6 5n5±0,33 1,2 827-828 D K 4 6,9 6,3 6,3 5,9 1,0 7,5 6,9 5,0 <1,7 >5,8 6 3,6 ±0,76 2,3 877-878 KE 3 7,6 7,3 7,0 7,0 0,6 7,9 7,9 7,3 5,8 2,1 12 4,4 ±0,65 1,8 878-879 EE 3 7,6 7,3 7,3 7,1 0,5 8,1 8,1 7,9 6,6 1,5 12 2,4 ±0,10 3,8
a Posiciones del par aminoacídico mutado a un par de alanina; la numeración comienza en el extremo amino de la proteína NS5. b Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10PFU/ml en el valor en células Vero o HuH-7, respectivamente, a las temperaturas indicadas cuando se compara con la temperatura permisiva (35 ºC). c Reducción en el valor (log10 PFU/ml) a 39 ºC en comparación con la temperatura permisiva (35 ºC). d Se inocularon grupos de seis ratones i.c. con 4,0 log10 PFU de virus en un inóculo de 30 μl. Se retiró el cerebro 5 días después, se homogeneizó y se valoró en células Vero. e Determinado comparando valores víricos medios en ratones inoculados con virus de muestra y controles wt concurrentes (n = 6). El fenotipo de atenuación se define como una reducción de ≥1,5 log10 PFU/g en comparación con el virus wt; las reducciones de ≥1,5 se enumeran en negrilla.
Tabla 21. Fenotipos de atenuación de SCID-HuH-7 de virus que llevan mutaciones de carga-agrupada-aalanina en el gen NS5 de DEN4.
Replicación en ratones SCID-HuH-7 b
Mutación a wt
AA cambiado na n 21 Valor de virus máximo medio ±EE (log10PFU/ml suero) 5,4 ±0,4 Reducción log media de wtc -
Δ30
na 4 3,7 ± 0,6 2,5
23-24
KE 19 4,7 ±0,5 1,3
157-158
EE 6 4,6 ± 0,6 1,3
200-201
KH 12 3,7 ±0,2 2,6
356-357
KE 10 6,3 ± 0,7 (-) 1,1
396-397
RE 12 4,4 ±1,3 1,2
397-398
EE 6 6,0 ±0,5 (-) 0,1
436-437
DK 6 3,6 ±0,2 2,6
500-501
RE 8 5,1 ±0,4 1,1
523-524
DK 5 5,3 ±0,7 0,6
750-751
RE 8 5,1 ±0,4 1,1
808-809
ED 8 3,2 ±0,4 3,0
827-828
DK 5 2,9 ±0,2 1,6
878-879
EE 5 4,4 ± 0,7 1,5
a Posiciones del par aminoacídico cambiado a un par de alaninas; la numeración comienza en el extremo amino de la proteína NS5.b Se inocularon grupos de ratones SCID-HuH-7 directamente en el tumor con 104 PFU de virus. Se recogió el suero los días 6 y 7 y se valoró en células Vero. c Comparación de valores de virus medios de ratones inoculados con virus mutante y control de DEN4 concurrente. La negrita denota una reducción de ≥ 100 veces en la replicación. Un signo (-) indica un incremento en la replicación con relación a wt.
Tabla 22. Combinación de mutaciones de carga-agrupada-a-alanina emparejadas en virus mutantes de pares dobles.
Par de mutación 1
Par de mutación 2 Recuperado
23-24
200-201 Sí
23-24
356-357 Sí
23-24
396-397 Sí
23-24
523-524 Sí
23-24
827-828 No
157-158
200-201 No
157-158
356-357 No
157-158
396-397 No
157-158
523-524 Sí
157-158
827-828 No
827-828
200-201 No
827-828
356-357 No
827-828
396-397 Sí
827-828
523-524 No
Tabla 23. Fenotipos sensible a la temperatura y de atenuación en cerebro de ratón de mutantes de carga-agrupada-a-alanina dobles del gen NS5 de rDEN4.
Replicación en ratones lactantesd
Valoración de virus media (log10 PFU/ml) a la temperatura indicada ( ºC)b Par AA N.º nt
Valoración de virus
Mutación a cargado cambiado Células Vero Células HuH-7 n media ± EEReducción logmedia de wte
35 37 38 39 ΔC 35 37 38 39 Δ (log10PFU/g cerebro)
wtn/a08,18,17,90,58,38,07,57,50,848 6,0 ±0,16Δ30 n/a 30 6,3 6,1 6,1 0,6 6,9 6,3 5,9 4,7 2,2 42 5,4 ± 0,22 0,6
23-24K E36,76,66,06,50,27,17,35,6<1,7>5,4184,7± 0,091,5200-201K H45,34,65,34,11,25,64,93,7<1,7>3,9125,5 ±0,450,823-24; 200-201 K E,K H 7 7,1 6,5 6,6 <1,7 >5,4 7,8 7,3 <1,7 <1,7 >6,1 6 5,8±0,16 0,6
23-24K E36,76,66,06,50,27,17,3 5,6<1,7>5,4184,7 ±0,091,5356-357K E37,7 7,6 7,0 7,0 0,7 8,0 7,3 6,4 <1,7 >6,3 6 3,5 ±0,58 2,0 23-24; 356-357 K E, K E 6
23-24K E36,76,66,06,50,27,17,35,6<1,7>5,4184,7 ± 0,091,5396-397R E47,07,36,55,51,57,57,67,5<1,7>5,8185,4 ±0,351,123-24; 396-397 K E, R E 7 6,3 4,9 <1,7 <1,7 >4,6 7,1 6,0 5,6 <1,7 >5,4 6 3,7 ±0,44 2,7
157-158E E36,57,25,15,11,47,67,45,9<1,7>5,962,8 ±0,312,7396-397R E47,0 7,3 6,5 5,5 1,5 7,5 7,6 7,5 <1,7 >5,8 185,4 ±0,351,1157-158; 396-397 E E, R E 7 6 2,0 ±0,12 4,8
157-158E E36,57,25,15,11,47,67,45,9<1,7>5,962,8 ±0,312,7523-524D K46,66,36,35,80,87,16,6<1,7<1,7>5,46 4,2 ± 0,47 1,3 157-158; 523-524 E E, D K 7 5,6 3,9 <1,7 <1,7 >3,9 6,3 4,1 <1,7 <1,7 >4,6
396-397R E47,0 7,3 6,55,5 1,57,57,67,5<1,7>5,864,8 ±0,541,6827-828D K46,96,36,35,91,07,56,95,0<1,7>5,863,6 ±0,762,3396-397;827-828 R E, D K 8 7,0 6,5 6,0 <1,7 5,3 >6,7 5,7 <1,7 <1,7 >5,0 6 4,7 ±0,10 1,2
a Posiciones del par aminoacídico mutado a un par de alanina; la numeración comienza en el extremo amino de la proteína NS5. b Los valores subrayados indican una reducción de 2,5 o 3,5 log10 PFU/ml en el valor en células Vero o HuH-7 respectivamente, a las temperaturas indicadas cuando se compara con
la temperatura permisiva (35 ºC). c Reducción en el valor (log10PFU/ml) a 39 ºC en comparación con la temperatura permisiva (35 ºC). d Se inocularon grupos de seis ratones lactantes i.c. con 4,0 log10PFU de virus en un inóculo de 30 μl. Se retiraron los cerebros 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. e Determinado comparando valores víricos medios en ratones inoculados con virus de muestra y controles wt concurrentes (n = 6); las reducciones > 1,5 se enumeran en negrilla.
Tabla 24. Fenotipos de atenuación en SCID-HuH-7 de mutantes de carga-agrupada-a-alanina doble del gen NS5 de rDEN4. Replicación en SCED-HuH-7 ratonesb
Mutación a Par AA cargado Valor de virus máximo medio Reducción log n
±EE (log10PFU/ml suero) media de wtc
wt
n/a 21 5,4 ± 0,4 -
Δ30
n/a 4 3,7 ±0,6 2,5
23-24
K E 19 4,7±0,5 1,3
200-201
K H 12 3,7±0,2 2,6
23-24; 200-201
K E, K H 13 3,4±0,1 2,9
23-24
K E 19 4,7±0,5 1,3
356-357
K E 10 6,3±0,7 (+) 1,1
23-24; 356-357
K E, K E 4 3,6±0,3 2,3
23-24
K E 19 4,7±0,5 1,3
396-397
R E 12 4,4±1,3 1,2
23-24; 396-397
K E, R E 10 3,4±0,5 3,3
157-158
E E 6 4,6±0,6 1,3
396-397
R E 12 4,4± 1,3 1,2
157-158; 396-397
E E, R E 6 2,2±0,2 3,6
157-158
E E 6 4,6±0,6 1,3
523-524
D K 5 5,3±0,7 0,6
157-158;523-524
E E, D K 3 5,1±0,6 0,8
396-397
R E 12 4,4± 1,3 1,2
827-828
D K 5 2,9±0,2 1,6
396-397;827-828
R E, D K 4 4,1±0,7 0,4
a Posiciones del par aminoacídico mutado a un par de alanina; la numeración comienza en el extremo amino de la proteína NS5.b Se inocularon grupos de ratones SCID-HuH-7 directamente en el tumor con 104 PFU de virus. Se recogió el suero los días 6 y 7 y se valoró en células Vero.c Comparación de valores de virus medios de ratones inoculados con virus mutante y control de DEN4 concurrente. La negrita denota una reducción de ≥ 100 veces en la replicación. Un signo (+) indica un incremento en la replicación con relación a wt.
Tabla 25. Fenotipos (sensibilidad a la temperatura, tamaño de placa y replicación en cerebro de ratón y ratones SCID-HuH-7) de wt DEN4 y virus que contienen las
mutaciones Δ30 y 7129.
ID de virus Mutación a Valoración de virus media (log10 PFU/ml) a la temperatura Replicación en cerebro de ratones Replicación en ratones SCID-HuH-7 e indicadalactantes c (ºC)
n Valoración de virus Reducción logValor de virus máximo Reducción logmedia ±EE media de wtd medio ±EE media de wtd
VERO HUH-7 C6/36
(log10PFU/g cerebro) n (log10PFU/ml suero) f3539 35 39Δ 32
Δb
1-TD-1Awt136,80,586,81,28,3 366,1 ±0,21-215,4 ±0,4p4Δ30 Δ30 6,6 6,5 0,1 7,4 6,4 1,0 42 5,4 ±0,22 0,6 4 3,7 ±0,6 2,5
5-1A1C7129U6,76,50,27,561,57,6*66,2 ±0,300,0rDEN4-7129-lAC7129U7,37,0 0,3 7,6 6,3 1,3 7,5*6 7,2 ±0,12 (-)0,4 4 5,4 ± 0,8 (-) 0,8 rDEN4Δ30-7129 C7129U + Δ30 7,0 7,1*
a Posición e identidad de los nucleótidos mutados. b Reducción en el valor (log10 PFU/ml) a 39 ºC en comparación con la temperatura permisiva (35 ºC). c Se inocularon grupos de seis ratones lactantes i.c. con 4,0 log10 PFU de virus en un inóculo de 30 μl. Se retiró el cerebro 5 días después, se homogeneizaron y se valoraron en células Vero. d Determinado comparando valores víricos medios en ratones inoculados con virus de muestra y controles wt concurrentes (n = 6). El fenotipo de atenuación se define como una reducción de ≥50 o ≥ 100 veces en la replicación en ratones lactantes o SCID-HuH-7, respectivamente. Un signo (-) indica un incremento en la replicación con relación al control wt. e Se inocularon grupos de ratones SCID-HuH-7 directamente en el tumor con 104 PFU de virus. Se recogió el suero los días 6 y 7 y se valoró en células Vero.
Tamaño de placa pequeño. *
Tabla 26. El mutante de placa pequeña 5-1A1 de 5-fluorouracilo demuestra una restricción de la infección en el intestino medio después de infección oral de mosquitos Aedes aegytpi.
Virus
Dosis N.º de infección sólo de Infección N.º total
probado
ingerida (log10PFU) a mosquitos probados intestino medio b diseminada c infectados d,e
wtDEN4
4,5 19 1 (5 %) 17 (89 %) 18 (95 %)
(2A-13)
3,5 26 9 (35 %) 7 (27 %) 16 (62 %)
2,5
28 1 (4 %) 0 1 (4 %)
OID50 = 3,9
OID50 = 3,3
5-1A1
3,5 34 4 (12 %) 2 (6 %) 6 (18 %)
2,5
9 0 1 (11 %) 1 (11 %)
1,5
23 0 0 0
OID50 ≥ 3,9
a Cantidad de virus ingerido, asumiendo 2 μl de sangre ingerida. b Número (porcentaje) de mosquitos con antígeno del virus del dengue detectable en tejido de intestino medio, pero sin antígeno del virus del dengue detectable en la cabeza; los mosquitos se sometieron a ensayo 21 días después de la alimentación, y el antígeno del virus del dengue se identificó por IFA. c Número (porcentaje) de mosquitos con antígeno del virus del dengue detectable en tejido tanto de intestino medio como de la cabeza. d Número total (porcentaje) de mosquitos con antígeno del virus del dengue detectable. e La proporción de infecciones totales provocadas por el DEN4 natural era significativamente mayor que la proporción provocada por 5-1A1 (regresión logística, N = 426, P < 0,0001). Se produjo muy poca infección por diseminación provocada por 5-1A1 para permitir un análisis estadístico.
Tabla 27. El mutante de placa pequeña 5-1A1 de 5-fluorouracili demuestra una restricción de la infección después de inoculación intratorácica de mosquitos Toxorhynchites splendens.
Virus probado
Dosis ingerida (log10PFU)a N.º mosquitos probados N.º ( %) infectados c
wtDEN4
4,0 5 5 (100)
(2A-13)
3,0 4 4 (100)
2,0
4 1(25)
MID50= 2,3 log10PFU
5-1A1
3,0 9 0
2,0
7 1(14)
1,0
7 0
MID50 > 3,0 log10PFU
a Cantidad de virus inoculado en un inóculo de 0,22 μl.
b Número (porcentaje) de mosquitos con antígeno del virus del dengue detectable en tejido de la cabeza; los mosquitos se sometieron a ensayo 14 días después de la inoculación, y el antígeno del virus del dengue se identificó por IFA.
c La proporción de infecciones provocadas por DEN4 natural fue significativamente mayor que la proporción provocada por 5-1A1 (regresión logística, N = 36, P < 0,01).
Tabla 28. Cebadores de mutagénesis para la deleción o intercambio de secuencias en DEN4 que muestran diferencias conservadas de flavivirus transmitidos por garrapatas.Nucleótidos de DEN4 1 Tipo de mutación 2 Cebador de mutagénesis 3 SEQ ID NO
10508-10530 Δ CTGGTGGAAGCCCAACACAAAAAC 64 10508-10530 intercambio CTGGTGGAAGGAAGAGAGAAATTGGCAACTCCCCAACACAAAAAC 65 10535-10544 Δ AGACCCCCCCAAGCATATTGAC 66 10535-10544 intercambio AGACCCCCCCAATATTTCCTCCTCCTATAGCATATTGAC 67 10541-10544 A CCCAACACAAAGCATATTGAC 68
1 Nucleótidos numerados de 5' a 3', en sentido opuesto de la Figura 5.32 Δ: deleción de nucleótidos de DEN4 especificados; intercambio: intercambio de nucleótidos de DEN4 especificados con secuencia homóloga de Langat3 no se realizó mutación de intercambio para los nucleótidos 10541-10544

Tabla 29. Valor de virus y tamaño de placa de virus mutantes en 3' UTR en células Vero y C6/36.
Virus
Vero C6/36
rDEN4Δ10508-10530
Valor (log10PFU/ml) 8,1 Tamaño de placa 1 wt Valor (log10PFU/ml) 7,5 Tamaño de placa wt
rDEN4swap10508-10530 rDEN4Δ10535-10544 rDEN4swap10535-10544 rDEN4Δ10541-10544
5,4 5,8 7,0 6 4 sp wt wt wt 6,6 7,0 7,3 >7,0 wt sp wt wt
1 El tamaño de placa se designa como equivalente al natural (wt) o <50 % del natural (sp) sobre el tipo de célula designada.
Tabla 30. Infectividad de DEN4 wt y mutantes en 3' UTR para Toxorhynchites splendens por inoculación intratorácica. Virus Dosis N.º de mosquitos % infectados b MID50 (log10PFU)
(log10PFU)a probados
rDEN4 wt
3,3 2,3 1,3 0,3 6 7 6 6 83 57 0 0 2,3
rDEN4Δ10508-10530
4,4 3,4 2,4 8 9 4 0 11 0
a Cantidad de virus inoculado en un inóculo de 0,22 μl. b Porcentaje de mosquitos con antígeno del virus del dengue detectable en tejido de la cabeza; los mosquitos se sometieron a ensayo 14 días después de la inoculación, y el antígeno del virus del dengue se identificó por IFA
Tabla 31. Infectividad de virus mutantes de intercambio en 3' UTR para Aedes aegypti alimentados con sangre
ingerida infecciosa.
Virus probado Dosis ingerida N.º mosquitos N.º total de infectados b,c Infecciones diseminadas c,d (log10PFU) a probados
rDEN4
3,8 2,8 1,8 18 15 15 11 (61 %) 5 (33 %) 0 4 (22 %) 1 (6 %) 0
OID50 = 3,4
OID50 = ≥4,2
rDEN4swap 10535-10544
3,8 2,8 25 25 5 (20 %) 0 2 (8 %) 0
1,8
20 0 0
OID50 = ≥ 4,2
a Cantidad de virus ingerido, asumiendo 2 μl de sangre ingerida. b Número (%) de mosquitos con antígeno del virus del dengue detectable en el tejido del intestino medio; los mosquitos se sometieron a ensayo 14 d después de alimentación y el antígeno del virus del dengue se identificó por IFA. c A un dosis de 3,8 log10PFU, rDEN4swap 10535-10544 infectó significativamente menos mosquitos en el intestino medio que rDEN4 wt (prueba exacta de Fisher, N = 43, P< 0,01), aunque las infecciones diseminadas no eran significativamente diferentes (prueba exacta de Fisher, N = 43, P=0,38). d Número (%) de mosquitos con antígeno del virus del dengue detectable en el tejido de la cabeza.
Tabla 32. Mutaciones de adaptación de células Vero putativas del conjunto de virus mutantes de 5-FU y otros virus DEN4 pasados en células Vero.
Virus mutantes de 5-FU Otros virus DEN pasados en células VeroPosición de Gen / regiónnucleótido (nº a.a.)b Cambio de Cambio de N. de virus con la
Virus Cambio de nucleótido Cambio de aminoácido
nucleótido aminoácido mutación
1455 E(452) G>U val > phe 5 22801,2,3
E(727) U>C phe > leu 2 48912,3 NS3 (1597) U>C ile > thr 2
49951,2 NS3 (1599) U>C ser > pro 8
7153 NS4B (2351) U>C val > ala 3 2AΔ30 U>C val > ala 7162 NS4B (2354) U>C leu > ser 4 2A-1 U>C leu > ser 7163 NS4B (2354) A > U o C leu > phe 7 rDEN4Δ30 A > U leu > phe 2A-13-1A1 A > U leu > phe
71821,2,3
NS4B (2361) G> A gly > ser 2
7546 NS4B (2482) C>U ala > val 10 76303 NS5 (2510) A> G lys > arg 1 814669 A>G lys > arg 10275 3'UTR A>U n/ac 6 10279 3'UTR A>C n/a 4
a La conservación con DEN1, DEN2 o DEN3 se designa por superíndice. La ausencia de conservación se designa sin superíndice.b La posición aminoacídica en la poliproteína de DEN4 comienza con el residuo metionina de la proteína C (nt 102-104) como residuo n.º 1.c no aplicable

Tabla 33. Análisis de secuencia del clon de rDEN2/4Δ30 27(p4)-2-2A2.
Mutación
Nucleótido
Gen
Nucleótido Aminoácido
743
ancla M G> A Gly > Glu
1493
E C>U Ser > Phe
7544*
NS4B C>U Ala > Val
* Igual que la posición del nucleótido de DEN4 7546
Tabla 34. Análisis de secuencia del clon de rDEN2/4Δ30 27(p3)-2-1A2.
Mutación
Nucleótido
tiene
Nucleótido Aminoácido
1345
E U>C Tyr > His
4885*
NS3 G> A Glu > Lys
8297
NS5 G> A Arg > Lys
*Codón adyacente a la mutación de 5-FU 4891
Tabla 35. El virus recombinante rDEN2/4Δ30 que lleva mutaciones de adaptación a Vero se puede recuperar y valorar en células Vero.
Valor de virus en la línea celular indicada 1 (log10PFU/ml)
Valor de virus tras recuperación Virus C6/36 Vero en células Vero (log10PFU/ml) rDEN2/4Δ30 wt 5,2 1,7 <0,7 rDEN2/4A3 0-7153 5,4 5,2 <0,7 rDEN2/4 A3 0-7162 5,4 5,3 nd2 rDEN2/4Δ30-7182 4,7 4,9 2,3 rDEN2/4Δ30-7630 5,3 4,8 1,3 rDEN2/4Δ30-7153-7163 5,1 4,7 nd rDEN2/4Δ30-7153-7182 4,1 3,2 nd
rDEN2/4Δ30-7546-7630 5,2 5,2 nd 1 El virus recuperado después de la transfección de células de mosquito C6/36 se diluyó de forma terminal una vez en células C6/36 y se valoró simultáneamente en células C6/36 y células Vero.2 no determinado
Tabla 36. Mutaciones de adaptación a células Vero putativas del virus del dengue de tipo 4 y el residuo de aminoácidos natural correspondiente en otros virus del dengue. Aminoácido virus del dengue wt indicado b Posición de
Residuo mutante
Mutación aminoácido a DEN4 DEN1 DEN2 DEN3
1455
452 F V I A A
2280
727 L Fc F F F
4891
1597 T I V I I
4995
1632 P S S S N
7129
2343 L P P P P
7153
2351 A V F F L
7162
2354 S L V V V
7163
2354 F L V V V
7182
2361 S G G G G
7546
2482 V A L T V
7630
2510 R K S S K
a La posición de aminoácido se da para la poliproteína de DEN4
b DEN4 = rDEN4 (GenBank AF326825); DEN1 = = Western pacific (GenBank DVU88535); DEN2 = New Guinea C (GenBank AF038403); DEN3 = H87 (GenBank M93130)
c Los nucleótidos subrayados se comparten entre DEN4 y uno o más tipos de DEN adicionales.
Tabla 37. Mutaciones conocidas por atenuar el virus del dengue de tipo 4 y el residuo de aminoácido natural
correspondiente en otros virus del dengue. Posición de Residuo Aminoácido virus del dengue wt indicado b Mutación aminoácido a mutante DEN4 DEN1 DEN2 DEN3 Nd
2650 850S NN N 3442 1114G EE E E 3540 1147K EE E E 3575 1158I ML A M 3771 1224G RR K R 4062 1321A TL A T 4306 1402S NE D D 4891 1597T IV I I 4896 1599S AA A A 4907 1602F LL L L 4995 1632P SS S N 5097 1666N DD D D 5695 1865G DD D D 6259 2053A VV V V 7129c 2343L PP P P 7849 2583I NK N K 8092 2664G EQ Q Q 10186 3362T II I I 10634 3'UTR ----
22, 23 2509, 2510 AA RK KS KS RK 23,24 2510, 2511 AA KE SE SE KE 157,158 2644, 2645 AA EE EE EA EE 200, 201 2687, 2688 AA KH KH KY KH 356, 357 2843, 2844 AA KE KE KE KE 387,388 2874, 2875 AA KK RN KK RN 436, 437 2923, 2924 AA DK HR DK DK 524,525 3011, 3012 AA KK KI KK KI 525, 526 3012, 3013 AA KD IP KE IP 642, 643 3129, 3130 AA ER ER IA KK 654, 655 3141, 3142 AA DR ER ER ER 808, 809 3295, 3296 AA ED ED ED ED 827,828 3314, 3315 AA DK DK DK DK 877, 878 3364, 3365 AA KE NE NE NE 878, 879 3365, 3366 AA EE EN EE EE
Mutaciones de carga-agrupada-a-alaninaMutaciones de 5-FU
a La posición de aminoácido se da para la poliproteína de DEN4
b DEN4 = rDEN4 (GenBank AF326825); DEN1 = Western pacific (GenBank U88535); DEN2 = New Guinea C (GenBank AF038403); DEN3 = H87 (GenBank M93130)
c Esta mutación da como resultado disminución de la replicación de DEN4 en mosquitos.
d Los nucleótidos subrayados se comparten ente DEN4 y uno o más tipos de DEN adicionales.
Apéndice 1
Secuencia de la cepa del virus del dengue de tipo 4 recombinante 2A
LOCUS AF375 822 10649 pb ARNss lineal VRL 19-SEP-2001 DEFINICIÓN Clon recombinante del virus del dengue de tipo 4 2A, genoma completo.
5 REFERENCIA AF375822 VERSIÓN AF375822,1 GI:14269097 PALABRAS CLAVE . FUENTE Virus del dengue de tipo 4. ORGANISMO Virus del dengue de tipo 4
10 Virus; virus de hebra positiva de ARNss, sin fase de ADN; Flaviviridae;
Flavivirus; Grupo del virus del dengue. REFERENCIA 1 (bases de 1 a 10649) AUTORES Blaney,J.E. Jr., Johnson,D.H., Firestone,C.Y., Hanson,C.T., Murphy,B.R. y Whitehead,S.S. TÍTULO Chemical Mutagenesis of Dengue Virus Type 4 Yields Mutant Viruses Which Are Temperature
15 Sensitive in Vero Cells or Human Liver Cells and Attenuated in Mice REVISTA J. Virol. 75 (20), 9731-9740 (2001) MEDLINE 21443968 PUBMED 11559806 REFERENCIA 2 (bases de 1 a 1064 9)
20 AUTORES Blaney,J.E. Jr., Johnson, D. H., Firestone,C.Y., Hanson,C.T., Murphy,B.R. y Whitehead,S.S. TÍTULO Remisión directa REVISTA Remitida (02-MAYO-2001) LID, NIAID, 7 Center Drive, Bethesda, MD20892, EE. UU. CARACTERÍSTICAS Ubicación/Clasificación
fuente 1..10649
25 /organismo=“Virus del dengue de tipo 4" /virión /db_xref="taxón:11070"
mat_péptido 102..440 /nota=“anchC" 30 /producto=“proteína de la cápside anclada"
mat_péptido 102..398 /nota=“virC" /producto=“proteína de la cápside del virión"
CDS 102..10265
35 /codón_inicio=1 /producto=“precursor de poliproteína" /proteína_id="AAK5 8017,1" /db_xref="GI:14269098"
/traducción = ”MNQRKKWRPPFNMLKRERNRVSTPQGLVKRFSTGLFSGKGPLR
40 MVLAFITFLRVLSIPPTAGILKRWGQLKKNKAIKILIGFRKEIGRMLNILNGRKRSTI TLLCLIPTVMAFSLSTRDGEPLMIVAKHERGRPLLFKTTEGINKCTLIAMDLGEMCED TVTYKCPLLVNTEPEDIDCWCNLTSTWVMYGTCTQSGERRREKRSVALTPHSGMGLET
mat_péptido 441..938
/nota=“prM" /producto=“proteína precursora de la membrana" mat_péptido 714..938 /nota=“M" 5 /producto=“proteína de la membrana"
mat_péptido 939..2423 /nota=“E" /producto=“proteína de la envoltura"
mat_péptido 2424..3479 10 /producto=“proteína de NS1" mat_péptido 3480..4133 /producto=“proteína de NS2A" mat_péptido 4134..4523 /producto=“proteína de NS2B" 15 mat_péptido 4524..6377 /producto=“proteína de NS3" mat_péptido 6378..6758 /producto=“proteína de NS4A" mat_péptido 6759..6827 20 /producto=“proteína de 2K" mat_péptido 6828..7562 /producto=“proteína de NS4B" mat_péptido 7563..10262 /producto=“proteína de NS5"
25 RECUENTO BASES 3302 a 2212 C 2800 g 2335 t ORIGEN
Apéndice 2
Secuencia de cepa del virus del dengue de tipo 4 recombinante rDEN4
5 LOCUS AF326825 10649 pb ARN VRL 03-JAN-2001 DEFINICIÓN Clon recombinante del virus del dengue de tipo 4 rDEN4, secuencia completa. REFERENCIA AF326825 VERSIÓN AF326825,1 GI:12018169 PALABRAS CLAVE
10 FUENTE Virus del dengue de tipo 4.
ORGANISMO Virus del dengue de tipo 4 Virus; virus de hebra positiva de ARNss, sin fase de ADN; Flaviviridae; Flavivirus; Grupo del virus del dengue.
REFERENCIA 1 (bases de 1 a 10649) 15 AUTORES Durbin,A.P., Karron,R.A., Sun,W., Vaughn,D.W., Reynolds,M.J., Perreault,J.R., Men,R.H., Lai,C.J., Elkins,W.R., Chanock,R.M., Murphy,B.R. y Whitehead, S.S. TÍTULO A live attenuated dengue virus type 4 vaccine candidate with a 30 nucleotide deletion in the 3 ' untranslated region is highly attenuated and immunogenic in humans REVISTA No publicado
20 REFERENCIA 2 (bases de 1 a 10649) AUTORES Whitehead,S.S. TÍTULO Remisión directa REVISTA Remitido(08-DIC-2000) LID, NIAID, 7 Center Drive, Bethesda, MD 20892,EE. UU. CARACTERÍSTICAS Ubicación/Clasificación
25 fuente 1..10649 /organismo=“Virus del dengue de tipo 4" /db_xref=“taxón:11070" /clon=“rDEN4"
mat_péptido 102 . . 440 30 /producto=“proteína de la cápside anclada (anchC)" mat_péptido 102..398 /producto= "proteína de la cápside del virión (virC)" CDS 102..10265 /codón_inicio=1
35 /producto= "precursor de poliproteína" /proteína_id="AAG45435,1" /db_xref="GI:12018170" mat_péptido 441..938
/producto=“proteína del precursor de la membrana (prM)"
mat_péptido 714..938
/producto=“proteína de la membrana (M)"
mat_péptido 939..2423
/producto=“proteína de la envoltura (E)"
mat_péptido 2424.. 3479 /producto=“proteína de NS1" mat_péptido 3480..4133 /producto=“proteína de NS2A" 5 mat_péptido 4134..4523 /producto=“proteína de NS2B" mat_péptido 4524 . . 6377 /producto=“proteína de NS3" mat_péptido 6378..6758 10 /producto=“proteína de NS4A" mat_péptido 6759..6827 /producto=“proteína de 2K " mat_péptido 6828..7562 /producto=“proteína de NS4B" 15 mat_péptido 7563..10262 /producto=“proteína de NS5"
Secuencia de rDEN4
Apéndice 3
Secuencia de la cepa del virus quimérico del dengue de tipo 2 recombinante rDEN2/4Δ30
LOCUS Pendiente de remisión DEFINICIÓN Clon recombinante del virus del dengue de tipo 2 rDEN2/4Δ30, secuencia completa.
5 REFERENCIA Pendiente de remisión VERSIÓN PALABRAS CLAVE . FUENTE virus del dengue de tipo 2 NGC. ORGANISMO virus del dengue de tipo 2
10 Virus; virus de hebra positiva de ARNss, sin fase de ADN; Flaviviridae ;
Flavivirus; Grupo del virus del dengue. REFERENCIA 1 (bases de 1 a 10616) AUTORES. TÍTULO
15 REVISTA No publicado CARACTERÍSTICAS Ubicación/Clasificación fuente 1..10616 /organismo=“Virus del dengue de tipo 2" /clon=“rDEN2/4A3 0" 20 mat_péptido 97.. 438 /producto=“proteína de la cápside anclada (anchC)" mat_péptido 91..396 /producto=“proteína de la cápside del virión (virC)" CDS 97..10263 25 /codón_inicio=1 /producto="precursor de poliproteína"
/traducción = MNNQRKKARNTPFNMLKRERNRVSTVQQLTKRFSLGMLQGRGPLK
mat_péptido
439..936
/producto=“proteína del precursor de la membrana (prM)"
mat_péptido
712..936
5
/producto=“proteína de membrana (M)"
mat_péptido
937.. 2421
/producto=“proteína de envoltura (E)"
mat_péptido
2422..3477
/producto=“proteína de NS1"
10
mat_péptido 3478..4131
/producto=“proteína de NS2A"
mat_péptido
4132..4521
/producto=“proteína de NS2B"
mat_péptido
4522..6375
15
/producto=“proteína de NS3"
mat_péptido
6376..6756
/producto=“proteína de NS4A"
mat_péptido
6757..6825
/producto=“proteína de 2K"
20
mat_péptido 6826..7560
/producto=“proteína de NS4B"
mat_péptido
7561..10260
/producto="proteína de NS5"
Secuencia de rDEN2/4Δ30
Apéndice 4
Alineación de poliproteínas del virus del dengue
* Identidad de residuo . Similitud de residuo LISTADO DE SECUENCIAS
<1I0> El Gobierno de los Estados Unidos de América representado por la Secretaría de salud y servicios humanos Whitehead, Stephen S. Murphy, Brian R.
5 Hanley, Kathryn A. Blaney, Joseph E. Jr.
<120> DESARROLLO DE MUTACIONES ÚTILES PARA ATENUAR VIRUS DEL DENGUE Y VIRUS DEL DENGUE Y QUIMÉRICOS
<130> NIH214,001PCT 10
<150> US 60/293049
<151> 2001-05-22
<160> 70 15
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 900 20 <212> PRT
<213> Virus del dengue 4
<400> 1
<210> 2
<211> 233
<212> ADN
<213> Virus del dengue 4
<400> 2
<210> 3 10 <211> 228
<212> ADN
<213> Virus del dengue 1
<400> 3
<210> 4
<211> 230
<212> ADN
<213> Virus del dengue 2 20 <400> 4
<210> 5
<211> 227
<212> ADN
<213> Virus del dengue 3
<400> 5
<210> 6
<211> 227
<212> ADN
<213> Virus del Nilo occidental
<400> 6
<210> 7
<211> 229
<212> ADN
<213> Virus de la encefalitis japonesa
<400> 7
<210> 8
<211> 241
<212> ADN
<213> Virus de la fiebre amarilla
<400> 8
<210> 9
<211> 249
<212> ADN
<213> Virus Powassan
<400> 9
<210> 10
<211> 250
<212> ADN
<213> Virus de la encefalomielitis ovina
<400> 10 <210> 11
<211> 250
<212> ADN
<213> Virus de la encefalitis transmitido por garrapatas
<400> 11
<210> 12
<211> 247 10 <212> ADN
<213> Virus de Langat
<400> 12
<210> 13 15 <211> 3387
<212> PRT
<213> Cepa del virus del dengue 4 2A
<400> 13
<210> 14
<211> 10649
<212> ADN
<213> Cepa del virus del dengue 4 2A
<400> 14
<210> 15
<211> 3387
<212 > PRT
<213 > Cepa del virus del dengue 4 recombinante rDEN4
<400> 15
<210> 16
<211> 10649
<212> ADN
<213> Cepa del virus del dengue 4 recombinante rDEN4
<400> 16
<210> 17
<211> 3388
<212> PRT
<213> Dengue recombinante rDEN2/4d30
<400> 17
<210> 18
<211> 10616
<212> ADN
<213> Virus del dengue recombinante rDEN2/4d30
<400> 18
<210> 19
<211> 3387
<212> PRT
<213> Virus del dengue 4
<400> 19
<210> 20
<211> 3392
<212> PRT
<213 > Cepa del virus del dengue 1 WP
<400> 20
<210> 21
<211> 3391
<212> PRT
<213> Cepa del virus del dengue 2 NGC
<400> 21
<210> 22
<211> 3390
<212> PRT
<213> Cepa del virus del dengue 3 H87
<400> 22
<210> 23 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 23 cagttccaaa ccggaagctt g
21
<210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 24 ccaacgagct atcgtacgtt ctctggg
27
<210> 25 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 25 gattgtgacc atggcggccc atctttg
27
<210> 26 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 26 ggagattagg ccgctgagcg gtaaagaaga g
31
<210> 27 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 27 gtttgtggaa aaatgtctga ggagaa
26
<210> 28 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 28 ctaggaaaca cataatatta gttgtgg
27
<210> 29 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 29 cagatccacc taaccataat ggcagtg
27
<210> 30 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 30 ggaaactcac ctcgggagag acagc
25
<210> 31 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 31 ttgggtagag gtcaccgcac tcatcc
26
<210> 32 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 32 gtagaaatag ccgctctcat cctag
25
<210> 33 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 33 ggcggcttac gtaatgggag gtagctcagc
30
<210> 34 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 34 ctagagaagg cagcttctgt gcagtgg
27
<210> 35 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 35 ccttggccat tccagcaaca atgac
25
<210> 36 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 36 gacgttcaaa ttttagccat agaacc
26
<210> 37 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 37 ctggagaaac gggcgccgta acattag
27
<210> 38 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 38 gaaattggat cggtaacctt agatttc
27
<210> 39 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 39 ggagcagtaa cgtttgattt caaaccc
27
<210> 40 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 40 gttaccaaac ctggggatta cgtc
24
<210> 41 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 41 gattaactat catgaactta caccc
25
<210> 42 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 42 ggaaaacctt tggcaccgag tatcc
25
<210> 43 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 43 tccagtgata ccggctagcg ctgctc
26
<210> 44 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 44 gcctcagagg tggccaaagg aag
23
<210> 45 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 45 acatggaggc agagatctgg actaga
2 6
<210> 46 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 46 aaagcatggc caaggatgct gtc
23
<210> 47 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 47 gcataatgga cgctaagcat gactaagg
28
<210> 48 <21I> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 48 ttattgcata gtgcacgaaa agcatg
26
<210> 49 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 49 gggcctatta ttacgtaatg gac
23
<210> 50 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 50 ctgcaatcct ggtgatatta ttgc
24
<210> 51 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 51 ctcataaaga acgttcaaac cct
23
<210> 52 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 52 cattagacag acgcgagttt gaag
24
<210> 53 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 53 tggcgacgct caagatagtg actgaag
27
<210> 54 <211> 25 <212> ADN <213 > Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 54 gagtcatcat cgataccaac aatag
25
<210> 55 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 55 cttcaaaacc tggcttctgc atcaaag
27
<210> 56 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 56 caaagatgtt gagcaacagg ttcacaac
28
<210> 57 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 57 ggaaagaaga aacacccgag actgtgc
27
<210> 58 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 58 gggaactggt cgatcgagaa agggc
25
<210> 59 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 59 ccagtggatt actacagaag atatgctc
28
<210> 60 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 60 caggaacctg accggtaaag aggaatacg
29
<210> 61 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 61 ctgtaattac caacatcaaa caccaaag
28
<210> 62 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 52 ccaacaacaa ccaccaaagg ctattg
26
<210> S3 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido
<400> 63 ggattggtgt tgtcgatcca acagg
25
<210> 64 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220 > <223> Cebador
<400 > 64 ctggtggaag cccaacacaa aaac
24
<210> 65
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220 >
<223> Cebador
<400> 65 ctggtggaag gaagagagaa attggcaact ccccaacaca aaaac
<210> 66
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 66 agaccccccc aagcatattg ac 22
<210> 67
<211> 39
<212 > ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 67 agaccccccc aatatttcct cctcctatag catattgac 39
<210> 68
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 68 cccaacacaa agcatattga c 21
<210> 69
<211> 6
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido
<221> caract_misc
<222> (1) ... (6)
<223> n = A, T, C oG
<400> 69 gcagcn
<210> 70
<211> 5
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido <400> 70 gcagc

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un virus del dengue que tiene un fenotipo en el que el genoma vírico se modifica por la introducción de una mutación tomada del grupo que consiste en las mutaciones de la tabla 37, en la que dicha mutación es una mutación de carga-agrupada-a-alanina 200, 201.
  2. 2.
    El virus del dengue de la reivindicación 1, que comprende además la mutación delta30.
  3. 3.
    El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 1.
  4. 4.
    El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 2.
  5. 5.
    El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 3.
  6. 6.
    El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus del dengue de tipo 4.
  7. 7.
    El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que el virus del dengue es un virus quimérico.
  8. 8.
    El virus quimérico de la reivindicación 7 que tiene un esqueleto de dengue 1, un esqueleto de dengue 2, un esqueleto de dengue 3 o un esqueleto de dengue 4.
  9. 9.
    Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  10. 10.
    Un kit que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 en un envase o dispositivo dispensador e instrucciones para su administración.
  11. 11.
    Uso de un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehículo farmacológicamente aceptable para la preparación de una composición farmacéutica para producir anticuerpos neutralizantes contra el virus del dengue, en el que dicha composición se va a administrar a un sujeto.
  12. 12.
    El uso de la reivindicación 11, en el que dicha administración es por inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular.
  13. 13.
    Una vacuna tetravalente que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones1 a 8.
  14. 14.
    Una vacuna de virus vivo atenuado que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones1 a 8.
  15. 15.
    La vacuna de virus vivo atenuado de la reivindicación 14 en forma de dosificación unitaria que tiene desde aproximadamente 102-109 unidades formadoras de placa (PFU)/ml.
  16. 16.
    Una vacuna inactivada que comprende un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones1 a 8.
  17. 17.
    La vacuna inactivada de la reivindicación 16 en forma de dosificación unitaria que tiene desde aproximadamente 0,1 hasta 50 μg de proteína E/ml.
  18. 18.
    Una molécula de ADNc que codifica un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  19. 19.
    Una molécula de ARN que codifica un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  20. 20.
    Un procedimiento de preparación de un virus del dengue que comprende
    (a)
    sintetizar ARN genómico vírico de longitud completa in vitro usando una molécula de ADNc que codifica un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;
    (b)
    transfectar células cultivadas con el ARN genómico vírico para producir virus; y
    (c)
    aislar el virus de las células cultivadas.
  21. 21.
    Un procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica que comprende combinar un vehículo farmacológicamente aceptable y un virus del dengue de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
  22. 8.
  23. 22.
    El virus del dengue de la reivindicación 1, en el que las mutaciones de carga-agrupada-a-alanina son en los aminoácidos 2687 y 2688 del polipéptido codificado por el gen NS5 del virus del dengue de tipo 4.
    ,01 ,01
    DEN4 2A
    Mutagénesis de 5-FU 1 mM en células Vero Disminución de 100 veces en el valor vírico Dilución terminal 1x
    1.248 clones de virus viables en células Vero
    Cribado para fenotipo ts
    Células Vero Células HuH-7 (riñón de mono) (hepatoma humano)
    Dilución terminal 2x Confirmación de fenotipos
    ts en ambas células: 13 clones de virus ts sólo en HuH-7: 7 clones de virus
    Figura 2
ES02739358T 2001-05-22 2002-05-22 Desarrollo de mutaciones útiles para atenuar virus del dengue y virus del dengue quiméricos Expired - Lifetime ES2399420T3 (es)

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