RU2811686C2 - Специфический в отношении млекопитающего арбовирус с дефектом роста - Google Patents
Специфический в отношении млекопитающего арбовирус с дефектом роста Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811686C2 RU2811686C2 RU2020113385A RU2020113385A RU2811686C2 RU 2811686 C2 RU2811686 C2 RU 2811686C2 RU 2020113385 A RU2020113385 A RU 2020113385A RU 2020113385 A RU2020113385 A RU 2020113385A RU 2811686 C2 RU2811686 C2 RU 2811686C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- arbovirus
- virus
- cell
- arg
- thr
- Prior art date
Links
- 230000012010 growth Effects 0.000 title abstract description 29
- 230000002950 deficient Effects 0.000 title abstract description 12
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 167
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 claims abstract description 123
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims abstract description 123
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 98
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 95
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 95
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 78
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 63
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 43
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 20
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 66
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 claims description 56
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 241000255925 Diptera Species 0.000 claims description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 12
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 claims description 4
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 claims description 4
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 127
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 35
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 105
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 35
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 33
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 26
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 25
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 25
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 23
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 14
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 13
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 12
- 208000009714 Severe Dengue Diseases 0.000 description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 11
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 10
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 10
- JUBDONGMHASUCN-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O JUBDONGMHASUCN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 9
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 9
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 9
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 9
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HHRODZSXDXMUHS-LURJTMIESA-N Gly-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)C[NH3+])C(=O)NCC([O-])=O HHRODZSXDXMUHS-LURJTMIESA-N 0.000 description 8
- NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CCCN=C(N)N NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 8
- LPGSNRSLPHRNBW-AVGNSLFASA-N Pro-His-Val Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C([O-])=O)NC(=O)[C@H]1[NH2+]CCC1)C1=CN=CN1 LPGSNRSLPHRNBW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 8
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 201000002950 dengue hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 8
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 8
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 8
- AUZAXCPWMDBWEE-HJGDQZAQSA-N Arg-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AUZAXCPWMDBWEE-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 7
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 7
- ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N Leu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 7
- OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N Met-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 7
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 7
- YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N Ser-Glu-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 7
- FRQRWAMUESPWMT-HSHDSVGOSA-N Thr-Trp-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N)O FRQRWAMUESPWMT-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 7
- 108010050343 histidyl-alanyl-glutamine Proteins 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 7
- TZDNWXDLYFIFPT-BJDJZHNGSA-N Ala-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O TZDNWXDLYFIFPT-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 6
- PHQXWZGXKAFWAZ-ZLIFDBKOSA-N Ala-Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 PHQXWZGXKAFWAZ-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 6
- JPOQZCHGOTWRTM-FQPOAREZSA-N Ala-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPOQZCHGOTWRTM-FQPOAREZSA-N 0.000 description 6
- UPKMBGAAEZGHOC-RWMBFGLXSA-N Arg-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O UPKMBGAAEZGHOC-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 6
- AGVNTAUPLWIQEN-ZPFDUUQYSA-N Arg-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AGVNTAUPLWIQEN-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 6
- JWCCFNZJIRZUCL-AVGNSLFASA-N Arg-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JWCCFNZJIRZUCL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 6
- NKTLGLBAGUJEGA-BIIVOSGPSA-N Asn-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O NKTLGLBAGUJEGA-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 6
- OPEPUCYIGFEGSW-WDSKDSINSA-N Asn-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OPEPUCYIGFEGSW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- NZJDBCYBYCUEDC-UBHSHLNASA-N Asp-Cys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NZJDBCYBYCUEDC-UBHSHLNASA-N 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 6
- VBPGTULCFGKGTF-ACZMJKKPSA-N Cys-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VBPGTULCFGKGTF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 6
- PHZYLYASFWHLHJ-FXQIFTODSA-N Gln-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PHZYLYASFWHLHJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- MAGNEQBFSBREJL-DCAQKATOSA-N Gln-Glu-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MAGNEQBFSBREJL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- NTBOEZICHOSJEE-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NTBOEZICHOSJEE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 6
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 6
- YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 6
- QIVPRLJQQVXCIY-HGNGGELXSA-N His-Ala-Gln Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QIVPRLJQQVXCIY-HGNGGELXSA-N 0.000 description 6
- MASWXTFJVNRZPT-NAKRPEOUSA-N Ile-Met-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N MASWXTFJVNRZPT-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 6
- WYUHAXJAMDTOAU-IAVJCBSLSA-N Ile-Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N WYUHAXJAMDTOAU-IAVJCBSLSA-N 0.000 description 6
- DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N Ile-Thr-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 6
- JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N Ile-Val-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 6
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 6
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 6
- CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 6
- CEGVMWAVGBRVFS-XGEHTFHBSA-N Met-Cys-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CEGVMWAVGBRVFS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 6
- VADLTGVIOIOKGM-BZSNNMDCSA-N Phe-His-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CN=CN1 VADLTGVIOIOKGM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 6
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 6
- JRQCDSNPRNGWRG-AVGNSLFASA-N Pro-His-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 JRQCDSNPRNGWRG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RXSWQCATLWVDLI-XGEHTFHBSA-N Ser-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RXSWQCATLWVDLI-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 6
- LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N 0.000 description 6
- RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N Thr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 6
- QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N Thr-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 6
- GJOBRAHDRIDAPT-NGTWOADLSA-N Thr-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N GJOBRAHDRIDAPT-NGTWOADLSA-N 0.000 description 6
- RWTFCAMQLFNPTK-UMPQAUOISA-N Trp-Val-Thr Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)=CNC2=C1 RWTFCAMQLFNPTK-UMPQAUOISA-N 0.000 description 6
- QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N Tyr-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 6
- FDKDGFGTHGJKNV-FHWLQOOXSA-N Tyr-Phe-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N FDKDGFGTHGJKNV-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 6
- ZLFHAAGHGQBQQN-AEJSXWLSSA-N Val-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ZLFHAAGHGQBQQN-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 6
- ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Pro Natural products CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 6
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 6
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 5
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 5
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N Arg-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- UISQLSIBJKEJSS-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UISQLSIBJKEJSS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241001502567 Chikungunya virus Species 0.000 description 4
- 241000204955 Colorado tick fever virus Species 0.000 description 4
- 241001154301 Equine encephalosis virus Species 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 4
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 4
- 241000713124 Rift Valley fever virus Species 0.000 description 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 201000009892 dengue shock syndrome Diseases 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 3
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 3
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 208000001455 Zika Virus Infection Diseases 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000009643 growth defect Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 108010059573 lysyl-lysyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N Ala-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- 208000009828 Arbovirus Infections Diseases 0.000 description 2
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N Arg-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- UPAGTDJAORYMEC-VHWLVUOQSA-N Asn-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N UPAGTDJAORYMEC-VHWLVUOQSA-N 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710158312 DNA-binding protein HU-beta Proteins 0.000 description 2
- 101800001632 Envelope protein E Proteins 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- XMWNHGKDDIFXQJ-NWLDYVSISA-N Gln-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O XMWNHGKDDIFXQJ-NWLDYVSISA-N 0.000 description 2
- WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N Glu-Ser-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QVXWAFZDWRLXTI-NWLDYVSISA-N Glu-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O QVXWAFZDWRLXTI-NWLDYVSISA-N 0.000 description 2
- BKMOHWJHXQLFEX-IRIUXVKKSA-N Glu-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O BKMOHWJHXQLFEX-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 2
- MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 2
- AKAPKBNIVNPIPO-KKUMJFAQSA-N His-His-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C1=CN=CN1 AKAPKBNIVNPIPO-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 2
- 201000009908 La Crosse encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- WOEDRPCHKPSFDT-MXAVVETBSA-N Lys-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCCCN)N WOEDRPCHKPSFDT-MXAVVETBSA-N 0.000 description 2
- ONPDTSFZAIWMDI-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ONPDTSFZAIWMDI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- -1 NS2B Proteins 0.000 description 2
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RNEFESSBTOQSAC-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-His Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O RNEFESSBTOQSAC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- 206010041896 St. Louis Encephalitis Diseases 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- 208000035332 Zika virus disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 2
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 2
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 229940031351 tetravalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000029302 virus maturation Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- SUQWGICKJIJKNO-IHRRRGAJSA-N (2s)-2-[[2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]hexanoyl]amino]acetyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SUQWGICKJIJKNO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000256111 Aedes <genus> Species 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000618849 Aedes africanus Species 0.000 description 1
- GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N Ala-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- XAXHGSOBFPIRFG-LSJOCFKGSA-N Ala-Pro-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O XAXHGSOBFPIRFG-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- OGUPCHKBOKJFMA-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N OGUPCHKBOKJFMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JAYIQMNQDMOBFY-KKUMJFAQSA-N Arg-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JAYIQMNQDMOBFY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- VENMDXUVHSKEIN-GUBZILKMSA-N Arg-Ser-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VENMDXUVHSKEIN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OQPAZKMGCWPERI-GUBZILKMSA-N Arg-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OQPAZKMGCWPERI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WOZDCBHUGJVJPL-AVGNSLFASA-N Arg-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N WOZDCBHUGJVJPL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 241001493160 California encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000256059 Culex pipiens Species 0.000 description 1
- VNLYIYOYUNGURO-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N VNLYIYOYUNGURO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- OWAFTBLVZNSIFO-SRVKXCTJSA-N Cys-His-His Chemical compound N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O OWAFTBLVZNSIFO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZGERHCJBLPQPGV-ACZMJKKPSA-N Cys-Ser-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)N ZGERHCJBLPQPGV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000012983 Dulbecco’s minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000012594 Earle’s Balanced Salt Solution Substances 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 208000015220 Febrile disease Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- MWLYSLMKFXWZPW-ZPFDUUQYSA-N Gln-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O MWLYSLMKFXWZPW-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- DYVMTEWCGAVKSE-HJGDQZAQSA-N Gln-Thr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O DYVMTEWCGAVKSE-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- OWVURWCRZZMAOZ-XHNCKOQMSA-N Glu-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OWVURWCRZZMAOZ-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- HILMIYALTUQTRC-XVKPBYJWSA-N Glu-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HILMIYALTUQTRC-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- UDEPRBFQTWGLCW-CIUDSAMLSA-N Glu-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UDEPRBFQTWGLCW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- LERGJIVJIIODPZ-ZANVPECISA-N Gly-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LERGJIVJIIODPZ-ZANVPECISA-N 0.000 description 1
- UUWOBINZFGTFMS-UWVGGRQHSA-N Gly-His-Met Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O UUWOBINZFGTFMS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N His-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ILUVWFTXAUYOBW-CUJWVEQBSA-N His-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O ILUVWFTXAUYOBW-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- 206010021138 Hypovolaemic shock Diseases 0.000 description 1
- ZDNNDIJTUHQCAM-MXAVVETBSA-N Ile-Ser-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N ZDNNDIJTUHQCAM-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 1
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical group NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N Leu-Gly-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QQXJROOJCMIHIV-AVGNSLFASA-N Leu-Val-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O QQXJROOJCMIHIV-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- QQYRCUXKLDGCQN-SRVKXCTJSA-N Lys-Cys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCCN)N QQYRCUXKLDGCQN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KZJQUYFDSCFSCO-DLOVCJGASA-N Lys-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KZJQUYFDSCFSCO-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- UROWNMBTQGGTHB-DCAQKATOSA-N Met-Leu-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UROWNMBTQGGTHB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N Met-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000005805 Murray valley encephalitis Diseases 0.000 description 1
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 229920002685 Polyoxyl 35CastorOil Polymers 0.000 description 1
- 201000009754 Powassan encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101800001127 Protein prM Proteins 0.000 description 1
- 206010037868 Rash maculo-papular Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241000606651 Rickettsiales Species 0.000 description 1
- 241000538730 Rocio Species 0.000 description 1
- KNZQGAUEYZJUSQ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N KNZQGAUEYZJUSQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VMVNCJDKFOQOHM-GUBZILKMSA-N Ser-Gln-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CO)N VMVNCJDKFOQOHM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KJMOINFQVCCSDX-XKBZYTNZSA-N Ser-Gln-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KJMOINFQVCCSDX-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N Ser-Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N Ser-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- PMTWIUBUQRGCSB-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PMTWIUBUQRGCSB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000748238 South American lineages Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- WFUAUEQXPVNAEF-ZJDVBMNYSA-N Thr-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CCCN=C(N)N WFUAUEQXPVNAEF-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- ZXIHABSKUITPTN-IXOXFDKPSA-N Thr-Lys-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N)O ZXIHABSKUITPTN-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- ZMYCLHFLHRVOEA-HEIBUPTGSA-N Thr-Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZMYCLHFLHRVOEA-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- JNKAYADBODLPMQ-HSHDSVGOSA-N Thr-Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)=CNC2=C1 JNKAYADBODLPMQ-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- HDQJVXVRGJUDML-UBHSHLNASA-N Trp-Cys-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N HDQJVXVRGJUDML-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BUPRFDPUIJNOLS-UFYCRDLUSA-N Tyr-Tyr-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O BUPRFDPUIJNOLS-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- KXUKIBHIVRYOIP-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KXUKIBHIVRYOIP-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- CPTQYHDSVGVGDZ-UKJIMTQDSA-N Val-Gln-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N CPTQYHDSVGVGDZ-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N Val-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- BZWUSZGQOILYEU-STECZYCISA-N Val-Ile-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BZWUSZGQOILYEU-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067674 Viral Nonstructural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000010094 Visna Diseases 0.000 description 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 description 1
- 201000004296 Zika fever Diseases 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000010855 food raising agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 229910021485 fumed silica Inorganic materials 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical class O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003317 industrial substance Substances 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N limonene Chemical compound CC(=C)C1CCC(C)=CC1 XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 208000012965 maculopapular rash Diseases 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 208000004141 microcephaly Diseases 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 229940051866 mouthwash Drugs 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000007968 orange flavor Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N oxirane;propane-1,2,3-triol Chemical compound C1CO1.OCC(O)CO QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 238000002962 plaque-reduction assay Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 208000018299 prostration Diseases 0.000 description 1
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 206010040560 shock Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000002254 stillbirth Diseases 0.000 description 1
- 231100000537 stillbirth Toxicity 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехологии, вируологии и медицине. Предложена частица арбовируса для выработки иммунного ответа к указанному арбовирусу, включающая в себя мутантный арбовирус, который реплицируется в клетках насекомого и не реплицируется в клетках млекопитающего, содержащий молекулярно измененный тетрапептидный сайт расщепления фурином в полипротеине-предшественнике и необязательно изменение в первом удлинении из аминокислот, вышележащих по отношению к указанному сайту, и/или изменение во втором удлинении из аминокислот, нижележащих по отношению к указанному сайту. Предложены: композиция для выработки иммунного ответа к указанному арбовирусу, содержащая частицу арбовируса и фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель или вспомогательное средство; клетка насекомого, включающая частицу арбовируса, для продуцирования указанной частицы; клетка млекопитающего для вызывания иммунного ответа, включающая в себя частицу указанного арбовируса. Арбовирус несет измененный сайт расщепления фурином, который приводит к усиленному расщеплению полипротеина-предшественника, такого как prE2 или prM. Вирус может продуцироваться в клетках насекомого. Вирус не образует потомство вируса в клетках млекопитающего. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 3 ил., 29 пр.
Description
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
[0001] Настоящее изобретение в целом относится к арбовирусам, небольшой группе из нескольких вирусов с уникальным и необычным свойством репликации в клетках насекомого и в клетках человека. Настоящее изобретение относится к мутантным арбовирусам и к их применению в качестве иммуногенов. Согласно аспектам настоящее изобретение относится к измененному арбовирусу, который больше не репродуцируется в клетках млекопитающего-хозяина, но продолжает реплицироваться в клетках насекомого и может быть собран из них, но продолжает экспрессировать и представлять антигены арбовируса иммунной системе млекопитающих и в таковой.
[0002] Настоящее изобретение относится к группе арбовирусов. Основным свойством арбовируса является репликация в клетках млекопитающих и насекомых. Многие арбовирусы передаются млекопитающим клещами или комарами. Согласно одной схеме классификации арбовирусы включают в себя роды Flavivirus, Alphavirus и Orthobunyavirus. Согласно другой схеме классификации арбовирусы включают в себя семейства Bunyaviridae, Flaviviridae, Reoviridae и Togaviridae. Примеры арбовирусов включают в себя вирус африканской чумы свиней, вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки долины Рифт, вирус колорадской клещевой лихорадки, вирус энцефалоза лошадей, вирус чикунгуньи, вирус денге (DV), вирус Зика (ZV) и вирус Западного Нила.
[0003] Флавивирусы были частично изучены из-за патологии человека, см., например, Gubler & Kuno, eds.: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. Wallingford, CAB International, 1997; и Porterfield; Exotic Viral Infections. Chapman and Hall Medical, London, 1995.
[0004] Геномы флавивируса состоят из одной линейной одноцепочечной + смысловой РНК. + цепь РНК инфицирует соответствующие клетки-хозяева. Общий геном может варьировать от 10 до 11 т. п. н. 3'-Полиаденилирование отсутствует. 5'-конец имеет метилированный кэп.
[0005] Геномы флавивируса не содержат внутренних сайтов связывания рибосомы (IRES), которые обеспечивают сайт инициации трансляции для рибосом хозяина. Вместо этого флавивирус использует рибосомное сканирование, чтобы начать синтез белка.
[0006] Вирионы флавивируса могут представлять собой сферы диаметром от 40 до 65 нм. Под липидной оболочкой находится икосаэдрическая капсидная оболочка диаметром приблизительно 25-30 нм.
[0009] DV (типы 1-5), вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус клещевого энцефалита и вирус Западного Нила являются причиной значительной заболеваемости и смертности у людей.
[0008] Например, вирус желтой лихорадки способен вызывать эпидемии. В первом цикле вирус передается комарами Aedes africanus и другими Aedes (в Африке) или комарами Hemogogus (в Северной Америке и Южной Америке); обезьяны служат резервентами, и, как правило, зараженные люди - это те, кто попадает в дремучие леса и джунгли и подвергается воздействию этих переносчиков. Во втором цикле домашний комар Aedes aegypti, живущий в тесной связи с людьми, может передавать вирус непосредственно человеку, единственному хозяину в цикле.
[0009] Флавивирусы вызывают другие заболевания, такие как энцефалит долины Мюррея, энцефалит Росио и Повассан и, как это недавно наблюдали, в Северной Америке и Южной Америке, лихорадку Западного Нила и лихорадку Зика.
[0010] Некоторые флавивирусы, в том числе вирус энцефаломиелита овец, вызывающий неврологическое заболевание у овец, вирус Западного Нила, вызывающий энцефалит у лошадей, и вирус японского энцефалита, который также вызывает энцефалит у лошадей и мертворождение у свиней, являются ветеринарными патогенами, имеющими коммерческое значение.
[0011] Учитывая острую необходимость в лечении вызываемых арбовирусами заболеваний, необходим надежный способ изготовления безопасных и эффективных композиций для лечения вызываемых арбовирусами заболеваний. Теоретически, живые аттенуированные вакцины вызывают наиболее эффективный, долгосрочный специфический иммунитет, тогда как инактивированные вирусные вакцины, в том числе рекомбинантные субъединичные вакцины, обеспечивают более высокий уровень безопасности. Идеальной вакциной будет та, которая может обеспечить эффективность живой вакцины и безопасность субъединичной вакцины.
[0012] Эти цели были достигнуты при разработке масштабируемого способа изготовления специфических в отношении млекопитающего арбовирусов с ограниченным ростом. Представляющий интерес вирус с дефектом роста располагается в млекопитающем, экспрессирует арбовирусные антигены и вызывает иммунный ответ у инфицированных млекопитающих на арбовирусный(ые) антиген(ы), но не продуцирует потомство вируса в клетках млекопитающего, поэтому инфицированная клетка не способствует распространению клеточной инфекции и патологии у млекопитающего-хозяина. Размножение представляющего интерес вируса с ограниченным ростом не нарушается в клетках насекомого. Таким образом, представляющий интерес дисфункциональный вирус может быть экономично получен в линиях клеток насекомого.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
[0013] Настоящие изобретения относятся к материалам и способам получения арбовирусных частиц с ограниченным ростом, которые продолжают реплицироваться в клетках насекомого, но больше на реплицируются (или делают это на низких уровнях) в клетках млекопитающего (таких как клетки человека), так что инфицированные клетки млекопитающего не продуцируют потомство вируса. Представляющий интерес арбовирус инфицирует клетку млекопитающего-хозяина и может реплицироваться в этой клетке млекопитающего-хозяина с образованием белков арбовируса, которые распознаются иммунной системой млекопитающего-хозяина, например, с клеточными и/или гуморальными ответами, но не продуцирует и не выделяет частицы потомства арбовируса. Представляющий интерес дефектный вирус включает в себя все необходимые гены для обеспечения репликации вирусного генома и продуцирования арбовирусных белков, которые могут высвобождаться из инфицированной клетки или могут экспрессироваться на поверхности клетки-хозяина, но не продуцируют потомство вируса из инфицированной клетка млекопитающего-хозяина. Таким образом, представляющие интерес частицы арбовируса могут быть такими же иммуногенными, как и вирус дикого типа, но частицы не должны слишком способствовать или совсем не способствовать, заболеванию или патологии у инфицированного хозяина, поскольку представляющий интерес измененный арбовирус характеризуется уменьшенной, если вообще характеризуется таковой, репликацией в клетках млекопитающего.
[0014] Представляющий интерес арбовирус с ограниченным ростом легко не размножается в клетках млекопитающего или человека, что сокращает продуцирование и высвобождение вирусных частиц на 4 порядка или меньше, 5 порядков или меньше, 6 порядков или меньше, 7 порядков или меньше, 8 порядков или меньше, 9 порядков или меньше, или потомство арбовируса отсутствует по сравнению с уровнем или количеством потомства вируса, продуцируемого в клетке того же типа, инфицированной арбовирусом дикого типа того же вида или образца до обработки, что ограничивает рост.
[0015] С другой стороны, представляющий интерес арбовирус с ограниченным ростом или с дефектом роста легко размножается в клетках насекомого, таких как клетки членистоногих, с продуцированием аналогичного потомства арбовируса. Уровень потомства арбовируса, продуцируемого клеткой насекомого, может быть примерно равным или может превышать уровни или количества потомства вируса, продуцируемого подходящим контрольным арбовирусом дикого типа того же вида или образца, используемого для лечения, что ограничивает рост, в такой же клетке насекомого.
[0016] Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дефектный арбовирус характеризуется усиленной (то есть может расщеплять при более высокой скорости, может расщеплять более эффективно, или и то, и другое, по сравнению с арбовирусом дикого типа того же вида или образца, используемого для лечения, что ограничивает рост) активностью фурина. Расщепление фурином предшественника полипротеина может быть важным для созревания частиц потомства арбовируса. В некоторых арбовирусах расщепление фурином происходит в месте соединения pr и М. Следовательно, представляющий интерес дефектный арбовирус характеризуется усиленной активностью фурина в отношении белка или полипептида prM, в нем или около него. У некоторых арбовирусов расщепление фурином происходит в месте соединения E3 и E2. Следовательно, представляющий интерес дефектный арбовирус характеризуется повышенной активностью фурина в отношении белка-предшественника или полипептида Е2, в нем или около него.
[0017] Представляющий интерес арбовирус с ограниченным ростом включает в себя изменение в консенсусном тетрапептиде фурина, что может происходить в месте соединения, например, pr и M; изменение в 3'-5'-направлении консенсусного тетрапептида (в аминоконцевом направлении, например, в полипептиде pr); изменение в 5'-3'-направлении консенсусного тетрапептида (в карбоксиконцевом направлении, например, в белке М) или их комбинации.
[0018] Согласно вариантам осуществления арбовирус представляет собой вирус денге (DV), который содержит полипротеин prM.
[0019] Согласно вариантам осуществления одна или несколько аминокислотных замен в сайте расщепления фурином и/или около такового между pr и M дает в результате вирус с усиленным расщеплением фурином prM; который размножается в клетках насекомого и не размножается в клетках млекопитающего или человека.
[0020] Согласно вариантам осуществления усиленная активность фурина в DV получается с помощью одного или нескольких из: 1) изменения в удлинении из восьми аминокислот в 3'-5'-направлении (в направлении аминоконца) сайта распознавания фурином и расщепления фурином, начинающегося на аминокислоте 80 полипептида prM в DV, то есть аминокислоты 80-87 prM; 2) изменения в тетрапептидном сайте распознавания фурином; 3) изменения в удлинении из тридцати девяти аминокислот в 5'-3'-направлении (в направлении карбоксиконца) сайта распознавания фурином и расщепления фурином, то есть аминокислоты 92-130 prM; 4) изменения в 3'-5'-направлении аминокислоты 80; и 5) изменения в 5'-3'-направлении аминокислоты 130. Может присутствовать любая комбинация вышеперечисленного, например, 1), 2) и 3). Могут присутствовать изменения 1), 2) и 3).
[0021] Согласно вариантам осуществления сайт расщепления фурином DV в белке prM NH2-(88)Arg-Glu-Lys-Arg-COOH/ (SEQ ID NO: 1), при этом расщепление происходит после остатков Lys-Arg (и указывается с помощью «/» в сайте распознавания расщепления, обозначенном выше), изменяется по сайту Glu с усилениям расщепления фурином.
[0022] Согласно вариантам осуществления Glu замещается любой аминокислотой.
[0023] Согласно вариантам осуществления аминокислота, которая замещает Glu, представляет собой не кислотную, не нейтральную аминокислоту, такую как Gln, Asn, Gly, Lys, Arg, His, Thr, Ser, Tyr, Met или Cys. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не содержит серу. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не содержит гидроксильную группу в боковой цепи группы R. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой основную аминокислоту. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой Lys, Arg или His. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой Arg.
[0024] Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дефективный DV содержит одно или несколько изменений полипептидной последовательности в 3'-5'-направлении SEQ ID NO: 1, например, в восьми аминокислотах в 3'-5'-направлении остатков Arg-Glu. Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дефективный DV содержит одно или несколько изменений полипептидной последовательности в 5'-3'-направлении SEQ ID NO: 1, например, в тридцати девяти аминокислотах в 5'-3'-направлении остатков Lys-Arg. Изменение может происходить либо в сайте распознавания фурином, либо в сайте расщепления. Изменение может происходить в белке М. Изменение может быть расположено в первых 39 аминоконцевых аминокислотах мембранного белка. Изменение может происходить в полипептиде pr. Изменение может быть расположено в последних восьми карбоксиконцевых аминокислотах полипептида pr.
[0025] Такое изменение или комбинация изменений снижают или сводят на нет репликацию, созревание и высвобождение DV из инфицированных клеток млекопитающего. Следовательно, инфицированные клетки млекопитающего содержат и представляют антигены DV иммунной системе млекопитающего-хозяина, но инфицированные клетки млекопитающего не высвобождают инфекционные частицы потомства DV.
[0026] Однако такие изменения по сайту расщепления фурином или около такового не сводят на нет репликацию представляющего интерес DV в клетках насекомого, что тем самым обеспечивает способ и средства продуцирования частиц DV, содержащих измененный фуриновый сайт, раскрываемый в настоящем документе, для применения с целью инфицирования, но не репликации в клетках млекопитающего. Размножение в клетках насекомого является устойчивым, что обеспечивает высокие выходы вируса, а рост или продуцирование DV в клетках насекомого масштабируется для получения вирусных частиц в более крупных объемах, количествах и реакция.
[0027] Согласно вариантам осуществления арбовирус представляет собой вирус Зика (ZV), который содержит полипротеин prM.
[0028] Сайт расщепления фурином в ZV располагается после аминокислоты 93 prM. Согласно вариантам осуществления последовательность prM в 3'-5'-направлении сайта распознавания фурином ZV включительно, His-His-Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Arg-Arg/ (SEQ ID NO: 2), модифицируется по сериновому остатку тетрапептидного сайта распознавания фурином (расщепление происходит после четвертого Arg в приведенной выше последовательности) с обеспечением последовательности из пяти остатков аргинина для усиления расщепления фурином. Согласно вариантам осуществления остаток глутаминовой кислоты в этой области может быть изменен на гистидин для усиления расщепления фурином. Другие изменения могут быть выполнены в приведенной выше последовательности остатков. Изменение может быть выполнено в 3'-5'-направлении аминокислоты 82 и/или в 5'-3'-направлении аминокислоты 93.
[0029] Усиленная активность фурина в ZV может быть достигнута с помощью одного или нескольких из: (1) изменения одной или нескольких аминокислот в 3'-5'-направлении сайта расщепления фурином ZV, например, в последовательности из восьми остатков, начинающейся с аминокислотного остатка 82 от N-конца prM (т. e. аминокислотные остатки 82-89 prM), но может быть в 3'-5'-направлении аминокислоты 82; (2) изменения в тетрапептидном сайте расщепления фурином ZV и (3) изменения одного или нескольких аминокислотных остатков в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином, то есть от аминокислоты 94 и далее, например, в удлинении из 26 остатков аминокислот в 5'-3'-направлении тетрапептида. Может присутствовать любая комбинация из (1), (2) и (3).
[0030] Рост представляющего интерес ZV в клетках млекопитающего сводится к минимуму или практически отсутствует, в то время как рост такого дисфункционального ZV в клетках насекомого существенно не нарушается.
[0031] Дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения описываются и станут очевидными из следующего подробного описания настоящего изобретения и графических материалов.
Краткое описание графических материалов
[0032] На фиг. 1 изображен график выживания, включающий в себя данные, полученные от мышей, которые получали до заражения DV дикого типа забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) в качестве контроля или представляющий интерес мутант DV (D2-89R).
[0033] На фиг. 2 изображен график выживания, включающий в себя данные, полученные от мышей, которые получали до заражения SV дикого типа забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) в качестве контроля или представляющий интерес мутант SV (M2).
[0034] На фиг. 3 изображен график безопасности, включающий в себя данные, полученные от мышей, которые получали либо SV дикого типа, либо мутант SV M2.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
[0035] Применяемый в настоящем документе термин «дисфункция» или его грамматические формы указывают на усиление свойства или функции, возникающее в результате перемены или изменения, по сравнению с уровнем функции или наличием этого свойства, наблюдаемым до перемены или изменения или без перемены или изменения. Например, сайт фермента, который является измененным и дисфункциональным, может быть тем сайтом, который всегда распознается ферментом или расщепляется родственным ферментом с большей скоростью, более эффективно и т. д., в результате чего повышаются уровни или количество продукта ферментативной реакции. Например, согласно вариантам осуществления дисфункциональный сайт расщепления фурином расщепляется со скоростью или величиной, которая выше или больше, чем наблюдаемая для недисфункционального сайта расщепления фурином. Следовательно, результатом является снижение количества или уровня prM в инфицированной клетке. Синонимом дисфункции является термин «дефектный» или его грамматические формы.
[0036] Термин «усиленный» или его грамматические версии означает показатель или уровень, превышающий исходный или эталонный уровень или показатель. Исходный уровень может быть определен путем выборки ряда единиц и получения среднего значения или путем получения производного среднего значения популяции из литературы. Согласно вариантам осуществления усиленный уровень представляет собой любой уровень выше уровня, обнаруженного в контрольном образце. Следовательно, в биоанализе, химическом анализе и т. п., например, два образца могут быть проанализированы одновременно, экспериментальный образец с предположением усиленного показателя и контроль, который может представлять собой образец из известного дикого типа, нормального, неизмененного, немутантного и подобного представителя популяции, при этом более высокий показатель выявляют в экспериментальном образце, например, большее количество продукта, более быстрые кинетические показатели, более крупный продукт и т. д. Согласно вариантам осуществления исходный уровень представляет собой уровень, который находится в единице дикого типа. Согласно вариантам осуществления «усиленный» включает в себя повышенный уровень ферментативной активности. Согласно вариантам осуществления «усиленный» включает в себя повышенный уровень каталитической активности. Согласно вариантам осуществления «усиленный» включает в себя повышенный уровень литической активности. Согласно вариантам осуществления «усиленный» включает в себя повышенный уровень расщепления полипептида фурином. Согласно вариантам осуществления усиленная активность фурина может быть выявлена путем сравнения количеств prM в образцах из клеток, инфицированных представляющим интерес мутантом и из клеток, инфицированных вирусом дикого типа. Согласно вариантам осуществления усиленная активность фурина может быть выявлена с помощью пониженных уровней prM или повышенных уровней pr или M при сравнении с мутантом и диким типом.
[0037] Термин «изменение» или его грамматические формы представляют собой видоизменение или модификацию аминокислотной последовательности дикого типа в одном или нескольких остатках. Таким образом, измененный полипептид может включать в себя аллель. Видоизменение может представлять собой аминокислотную замену, делецию или вставку, которые могут предусматривать две или более аминокислот в сайте последовательности дикого типа. Изменение дает представляющий интерес дисфункциональный вирус.
[0038] Термин «удлинение» или его грамматические формы означают последовательные нуклеотиды нуклеиновой кислоты или последовательные аминокислоты белка. Последовательные нуклеотиды нуклеиновой кислоты (удлинение нуклеотидов) полимеризуются в виде линейного олигонуклеотида. Последовательные аминокислоты белка (удлинение аминокислот) полимеризуются в виде линейного олигопептида.
[0039] Термин «размножение» или его грамматические формы включают в себя процессы, при которых вирус инфицирует совместимую клетку-хозяина; реплицируется в этой инфицированной клетке с продуцированием потомства вируса, и инфицированная клетка высвобождает потомство вируса в межклеточное пространство. Синонимы включают в себя «репродуцироваться», «реплицироваться», «расти» и т. д.
[0040] Термин «иммуногенный» или его грамматические формы включают в себя создание или индуцирование иммунного ответа у хозяина. Таким образом, термин «иммуногенный» предусматривает согласно вариантам осуществления наличие эпитопа или детерминанты. Согласно вариантам осуществления, например, иммуногенная композиция представляет собой композицию, несущую эпитоп или детерминанту, которая при введении в хозяина вызывает иммунный ответ иммунной системы хозяина на этот эпитоп или эту детерминанту. Иммунный ответ представляет собой ответ, который может в некоторой степени «удалить» иммуногенную композицию из хозяина, при этом термин «удаление» может включать в себя фактическое разрушение композиции, то есть денатурацию или расщепление композиции; секвестирование композиции так, что композиция содержится в структуре, делающей композицию инертной; детоксикацию композиции; нейтрализацию композиции; придание композиции биологической инертности; обеспечение безопасности композиции для хозяина и внутри хозяина и т. д. Термин «иммуногенный» не означает и не гарантирует иммунологическую защиту ни одному подвергшемуся воздействию хозяину. Иммунный ответ может быть гуморальным, клеточным и т. п. или может представлять собой их комбинации.
[0041] Фразы «не реплицируется в клетках человека или млекопитающего», «не размножается в клетках человека или млекопитающего», «не растет в клетках человека или млекопитающего», «не репродуцируется в клетках человека или млекопитающего», «ограниченно растет в клетках человека или млекопитающего», «характеризуется ограниченным ростом», «характеризуется дефектом роста», эквиваленты этих фраз, грамматические формы этих фраз и т. п. являются синонимами или синонимичными терминами или фразами, описываемыми в настоящем документе, и означают клетку человека или млекопитающего, инфицированную представляющим интерес мутантным вирусом, который продуцирует потомство арбовируса на 4 порядка или меньше, 5 порядков или меньше, 6 порядков или меньше, 7 порядков или меньше, 8 порядков или меньше, 9 порядков или меньше, или не продуцирует его по сравнению с уровнем или количеством потомства вируса, продуцируемого тем же типом клетки, инфицированной арбовирусом дикого типа того же вида, штамма, линии и т. д.; подобной клеткой инфицированной недисфункциональным вирусом, описываемым в настоящем документе; или соответствующим и приемлемым отрицательным контролем.
[0042] Фразы «реплицируются в клетках насекомого», «размножаются в клетках насекомого», «растут в клетках насекомого», «репродуцируются в клетках насекомого», «не характеризуются ограниченным ростом в клетках насекомого», «не характеризуются дефектом роста», «не характеризуются ограниченным ростом», эквиваленты этих фраз, грамматические формы этих фраз и т. п. являются синонимами или синонимичными терминами или фразами, описываемыми в настоящем документе, и означают клетку насекомого, инфицированную представляющим интерес мутантным вирусом, который продуцирует примерно столько же или больше потомства арбовируса по сравнению с уровнем или количеством потомства вируса, продуцируемого клеткой насекомого того же типа, инфицированной арбовирусом дикого типа того же вида, штамма, линии и т. д.; подобной клеткой, инфицированной недисфункциональным вирусом, описываемыми в настоящем документе; или соответствующим и приемлемым отрицательным контролем.
[0043] Термин «приблизительно» представляет собой аппроксимацию относительно определенного значения, так что существует величина изменчивости, которая отражается, например, в ошибке или отклонении, что обеспечивает диапазон относительно этого определенного значения, при этом границы диапазона представляют собой значение, на 10% меньшее определенного значения, включая определенное значение и значение, на 10% превышающее определенное значение. Следовательно, при использовании в настоящем документе упоминание приблизительно 50, подразумевает, что значение может варьировать от 45 до 55. Синонимичные термины включают в себя выражения «по сути» и «практически».
[0044] Термин «масштабируемый» или его грамматические формы означают способ, применяемый при испытании или в лабораторном масштабе, который можно перевести в более крупные масштаб или презентацию, например, способ, применяемый для коммерческого производства продуктов питания, напитков, потребительских товаров, промышленных химикатов и т. д., при этом реакционные сосуды могут иметь объем в сотни или тысячи литров. Следовательно, в контексте настоящего изобретения культуры клеток насекомых могут осуществляться в 10-кратных, 100-кратных или 1000-кратных и т. д. объемах в литрах, количествах, реакциях и т. д. или больше.
[0045] Термин «дикий тип» или его грамматические формы относятся к встречающемуся в природе арбовирусу, который обычно является наиболее распространенной или преобладающей формой, признаком, геном, белком, фенотипом и т. д. в популяции. Согласно вариантам осуществления синонимом является термин «тип» или «эталон» арбовируса. Популяционный признак может быть определен более чем одним аллелем одного локуса или полигенами. Следовательно, поскольку аллели или полигены дают один и тот же признак или практически один и тот же признак, то аллели или набор полигенов рассматривают в настоящем документе как эквивалентные. Арбовирус дикого типа не содержит дисфункционального сайта фурина, что приводит к усиленному расщеплению фурином, поскольку он присутствует в представляющем интерес измененном арбовирусе. Согласно вариантам осуществления в настоящем документе проводят сравнение, чтобы продемонстрировать свойства представляющего интерес модифицированного арбовируса относительно нормального арбовируса или арбовируса дикого типа, который не содержит представляющего интерес дисфункционального сайта расщепления фурином. Согласно вариантам осуществления представляющий интерес арбовирус характеризуется свойством, которое является нормальным или приблизительно таким же, как свойство эталонного арбовируса, например, рост в клетках насекомого. Например, согласно вариантам осуществления эталонным DV является серотип 2, штамм из Новой Гвинеи, доступный в ATCC (номер доступа VR-1584). Следовательно, ссылка в настоящем документе на prM DV и нумерацию его аминокислот может относиться к prM VR-1584 или к prM и к нумерации его аминокислот формы дикого типа мутанта DV. Согласно вариантам осуществления эталонный ZV доступен из ATCC под номером доступа VR-1838. Следовательно, ссылка в настоящем документе на prM ZV и нумерацию его аминокислот может относиться к prM VR-1838 или к форме дикого типа мутанта ZV. Представляющий интерес арбовирус, как и арбовирус дикого типа, размножается в клетках насекомого. Тем не менее, что касается нумерации аминокислот в настоящем документе, из-за врожденной изменчивости популяции, полиморфизма или изменчивости в популяции нумерация для одних штамма, линии, вида и т. д. может не соответствовать непосредственно нумерации для других штамма, вида, линии и т. д. Следовательно, нумерация в настоящем документе не является абсолютной в отношении положения какого-либо полипептида, сайта расщепления и т. д., поскольку нумерация может варьировать даже в пределах линии, штамма, вида и т. д. из-за встречающейся в природе вариации. Поэтому, нумерация, используемая в настоящем документе, относится к конкретной клетке, вирусу и т. д., и ее не следует истолковывать как абсолютно типичную для всех арбовирусов с такой же нумерацией во всех арбовирусах, что и в настоящем документе. Вместо этого различные признаки предоставляют ориентиры для идентификации сайтов и позволяют специалисту применять на практике заявленный объект с любым арбовирусом в качестве разрабатываемого решения. Например, консенсусный тетрапептид фурина в месте соединения pr и M, в 5'-3'-направлении или на карбокси-конце pr, в 3'-5'-направлении или на амино-конце M являются ориентирами, которые можно использовать для ориентации манипуляции и изменения белков. Следовательно, согласно варианту осуществления в нумерации учитывается количество аминокислот тетрапептида, чтобы определить, существует ли изменчивость в размере pr и M, и если да, то для обеспечения надлежащей системы отсчета производится регулировка или коррекция между тем, что представляют в настоящем документе, и тем, что применяет специалист в другом арбовирусе.
[0046] Термин «prM» представляет собой белок или полипептид DV длиной 166 аминокислот в серотипах 1-4 DV, расщепляющийся после аминокислоты 91 фурином с получением полипептида pr и белка М. Аминокислотная последовательность prM дикого типа prM штамма NGC DV2 представляет собой FHLTTRNGEP HMIVSRQEKG KSLLFKTEDG VNMCTLMAMD LGELCEDTIT YNCPLLRQNE PEDIDCWCNS TSTWVTYGTC TTTGEHRREK RSVALVPHVG MGLETRTETW MSSEGAWKHA QRIETWILRH PGFTIMAAIL AYTIGTTYFQ RVLIFILLTA VAPSMT (SEQ ID NO: 8). Как известно, природная вариация может давать штамм дикого типа с наличием изменений одной или нескольких аминокислот из последовательности, представленной под SEQ ID NO: 8, без нарушения или усиления расщепления prM фурином и без снижения размножения в клетках млекопитающего. Измененная представляющая интерес SEQ ID NO: 8 характеризуется усиленным расщеплением фурином и не значительным размножением вируса в клетках насекомого или отсутствием размножения этого вируса в клетках млекопитающего.
[0047] Термин «prM» представляет собой белок или полипептид ZV длиной 168 аминокислот, расщепляющийся после аминокислоты 93 фурином с получением полипептида pr и белка М. Аминокислотная последовательность prM дикого типа представляет собой AEITRRGSAY YMYLDRSDAG KAISFATTLG VNKCHVQIMD LGHMCDATMS YECPMLDEGV EPDDVDCWCN TTSTWVVYGT CHHKKGEARR SRRAVTLPSH STRKLQTRSQ TWLESREYTK HLIKVENWIF RNPGFALVAV AIAWLLGSST SQKVIYLVMI LLIAPAYS (SEQ ID NO: 9). Как известно, природная вариация может давать штамм дикого типа с наличием изменений одной или нескольких аминокислот из последовательности, представленной под SEQ ID NO: 9, без нарушения или усиления расщепления prM фурином и без снижения размножения в клетках млекопитающего. Измененная представляющая интерес SEQ ID NO: 9 характеризуется усиленным расщеплением фурином и размножением вируса в клетках насекомого, но отсутствием размножения этого вируса в клетках млекопитающего.
[0048] Применяемые в настоящем документе термины «сайт расщепления фурином», «сайт распознавания фурином» и «сайт распознавания фурином и расщепления фурином» являются взаимозаменяемыми и эквивалентными, поскольку известно, что, как правило, фурин распознает консенсусный тетрапептид Arg-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 16), при этом X представляет собой любую аминокислоту (также последовательности в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении этого тетрапептида могут включать в себя сайт расщепления фурином), и расщепляет пептидную связь после карбокси-конца или на стороне карбокси-конца тетрапептида. Как правило, в арбовирусах сайт расщепления фурином находится в месте соединения двух полипептидов в полипротеине-предшественнике, таком как предшественник prM и E2 (prE2). У некоторых арбовирусов сайт расщепления фурином находится в месте соединения pr и M. У других арбовирусов, с другой геномной организацией и не содержащих prM, например, у некоторых альфавирусов, сайт расщепления фурином находится в месте соединения E3 и E2.
[0049] Применяемые в настоящем документе термины «X порядков или ниже», «X порядков или меньше» или «X порядков или менее», при этом X представляет собой рациональное число, относится к логарифмической шкале для описания количества вирусных частиц. Как известно, шкала является нелинейной и основана на порядке величины с основанием 10. Логарифмическая шкала находит применение при наличии большого диапазона значений параметра. Следовательно, фраза «4 порядка» отражает разность между двумя значениями 104, то есть одно значение на 10000 единиц меньше или больше другого значения, «5 порядков» отражает разность между двумя значениями 105, то есть одно значение на 100000 единиц меньше или больше другого значения и т. д. Фраза, включающая выражения «ниже», «меньше» или «менее», относится к количеству, которое ниже значения, меньше числа и т. д., или в контексте настоящего документа к меньшему числу вирусных частиц. Следовательно, фраза «на 4 порядка или меньше» означает, что разность между двумя значениями составляет 104, 104,5, 105 и т. д., что означает, что число вирусных частиц, полученных в одном образце, в 10000 меньше, в приблизительно 31600 меньше или в приблизительно 100000 меньше, чем в другом образце, и в контексте настоящего документа означает, что один образец содержит вирусных частиц в 10000 меньше, чем другой образец.
[0050] Задача настоящего изобретения заключается в манипулировании геномом арбовируса для получения специфического для клеток млекопитающего арбовируса с дефектом роста, при этом клетки млекопитающего, инфицированные таким арбовирусом, не высвобождают зрелое потомство вируса, но продолжают экспрессировать эпитопы и детерминанты арбовируса, которые могут распознаваться млекопитающим-хозяином, например, детерминанты, экспрессируемые, например, белками М и Е. Клеточные и/или гуморальные ответы на арбовирус могут генерироваться у млекопитающего-хозяина. Представляющий интерес арбовирус, по сути, напоминает вирус дикого типа и, таким образом, представляет иммунной системе млекопитающего-хозяина разнообразие арбовирусных эпитопов, которые можно найти в арбовирусе, в арбовирусе дикого типа. Представляющий интерес арбовирус просто не может реплицироваться в клетке млекопитающего-хозяина и, следовательно, не может способствовать инфекции других клеток млекопитающего-хозяина и патологии или заболеванию у хозяина.
[0051] Следовательно, настоящее изобретение относится к дефективному или дисфункциональному арбовирусу, который содержит и экспрессирует большинство структурных белков, если не все, или по меньшей мере большинство полипептидов, которые включают в себя детерминанты или эпитопы антител, или к иммунным клеткам, вырабатываемым инфицированным хозяином на арбовирус. Таким образом, например, для флавивируса, предпочтительно, чтобы большинство белков pr, M и/или E экспрессировалось таким образом, поскольку они содержат иммуногенные сайты вируса дикого типа. Белок С может быть меньше целевого для иммунной системы хозяина, но может присутствовать.
[0052] Все известные арбовирусы требуют расщепления фурином полипротеина-предшественника для правильного созревания вируса и высвобождения из клетки-хозяина, такого как расщепление prE2 на E3 и E2 в некоторых альфавирусах и расщепление prM на pr и M в некоторых флавивирусах, для правильного созревания вируса и последующего высвобождения потомства вируса из инфицированной клетки.
[0053] Представляющий интерес мутантный арбовирус содержит измененный или дисфункциональный сайт расщепления фурином, например, в prE2 или в prM, и необязательно изменения в вышележащем и/или нижележащем направлении консенсусного сайта расщепления фурином, что приводит в результате к усиленному расщеплению фурином, например, prE2 или prM, с продуцированием вируса, который продолжает реплицироваться в клетках насекомого, но больше не реплицируется или реплицируется очень плохо в клетках млекопитающего (которое, конечно, включает в себя человека). Следовательно, изменение в сайте расщепления фурином и/или около такового, например, prE2 или prM, в арбовирусе дает вирус с ограниченным ростом, который продолжает расти в клетках насекомого, но больше не растет или плохо растет в клетках человека или млекопитающего, при этом рост указывает на то, что потомство вируса высвобождается инфицированной клеткой.
[0054] В целом, во время созревания начальной частицы флавивируса в аппарате Гольджи незрелые частицы представляют собой шипы, содержащие тримеры белков prM и E, которые во время прохождения через аппарат Гольджи, возможно, вследствие изменения рН, перестраиваются с образованием гладкой поверхности частицы. Эта перестройка или трансформация шипов экспонирует сайт расщепления фурином в prM. prM расщепляется фурином, и некоторые из фрагментов pr, возможно, на основании pH в аппарате Гольджи, остаются связанными с частицей. Предполагают, что фрагмент pr предотвращает слияние мембран. Когда начальная частица высвобождается из аппарата Гольджи во внеклеточную среду, pr высвобождается из начальной частицы с образованием зрелой частицы, которая может сливаться с клеточной мембраной для высвобождения из клетки. Некоторые развивающиеся частицы могут не созреть. Тем не менее, вирусный белок связан с внутриклеточными мембранами и может быть предназначен для включения в клеточную мембрану, где вирусные белки экспрессируются на клеточной поверхности. Вирусные частицы и компоненты могут высвобождаться в среду после гибели и лизиса клеток.
[0055] Без привлечения теории следует отметить, что представляющий интерес мутантный вирусный геном, содержащий измененный сайт расщепления фурином в prM, обеспечивающий усиленное расщепление prM, может обеспечивать расщепление prM до того, как развивающаяся вирусная частица попадет в аппарат Гольджи, вероятно, при других условиях pH, в результате чего pr не связывается с поверхностью частицы, когда частица входит и находится в аппарате Гольджи. Следовательно, без pr для предотвращения слияния с мембраной вирусная частица не может должным образом созревать при прохождении через аппарат Гольджи и улавливаться в аппарате Гольджи. Из-за преждевременного расщепления prM перед входом в аппарат Гольджи представляющая интерес частица арбовируса не содержит pr и, следовательно, не может быть должным образом обработана в аппарате Гольджи, в результате чего вирусная частица связывается, сливается с мембранами аппарата Гольджи и не высвобождается из мембран аппарата Гольджи, а, следовательно, не может быть высвобождена из клетки.
[0056] Однако этот процесс не изменяется в клетках насекомого, где время и/или эффективность расщепления фурином, например, prE2 или prM, не способствует или не препятствует надлежащему созреванию частиц арбовируса и высвобождению их из клетки насекомого-хозяина. Таким образом, инфицированные клетки насекомого продуцируют потомство арбовируса на уровнях, сравнимых с уровнями насекомого, инфицированного вирусом дикого типа, таких же или превышающих таковые.
[0057] Консенсусный тетрапептид фурина (R-X-K/R-R (SEQ ID NO: 16)) представляющего интерес арбовируса располагается, например, в месте соединения E3 и E2, и в месте соединения полипептида pr и белка M. Аминокислоты тетрапептида изменяют с помощью замены аминокислот, сайт-направленного мутагенеза нуклеиновой кислоты, кодирующей эту аминокислоту, и т. д., применяя известные способы, такие как конструирование тетрапептида с содержанием, например, Arg в качестве второго или X сайта. Измененный сайт фурина помещают, например, в нуклеиновую кислоту полной длины, например, с помощью гомологичной рекомбинации, применяя известные способы. Манипулирование нуклеиновой кислотой может быть осуществлено для кДНК, которая затем транскрибируется с образованием вирусной РНК, содержащей измененную последовательность, кодирующую сайт расщепления фурином, как описывается в настоящем документе, и с применением способов, известных в уровне техники. Вирусные нуклеиновые кислоты могут быть упакованы в частицы, например, путем электропорации вирусной РНК в соответствующие клетки-хозяева. Трансфицированные клетки культивируют, контролируют на предмет продуцирования вирусных частиц и получают вирусные частицы, несущие РНК, содержащую измененную область, кодирующую сайт расщепления фурином. Известны ДНК, РНК, векторы, клетки-хозяева и т. п., и некоторые реагенты коммерчески доступны, также, см., например, Polo et al., Zeng et al., Khromykh et al. J Virol 75(10)4633-4640, 2001; Gehrke et al., J Virol 77(6)8924-8933, 2003; и Shustov et al., J Virol 81(21)11737-11748, 2007. Затем вирусные частицы используют для инфицирования соответствующих клеток и культивируют, как известно в уровне техники. Продуцирование вируса потомства контролируют с использованием описанных в настоящем документе способов, чтобы определить, влияет ли изменение на репликацию вируса в клетках млекопитающего, но не в клетках насекомого, и в какой степени изменяется размножение в этих двух типах клеток.
[0058] Настоящее изобретение отчасти относится к флавивирусам, некоторые из которых содержат полипротеин prM.
[0059] Согласно вариантам осуществления настоящее изобретение относится к DV (такому как любой из серотипов 1-5).
[0060] Геном DV состоит из одной линейной однонитевой + смысловой РНК. Весь геном может варьировать от 10 до 11 т. п. н. 3'-Полиаденилирование отсутствует. 5'-Конец имеет метилированный кэп. Геном DV не содержит внутренние сайты связывания рибосомы (IRES), которые обеспечивают сайт инициация трансляции для рибосом хозяина. Вместо этого DV использует рибосомное сканирование, чтобы начать синтез белка.
[0061] Вирионы денге представляют собой сферы диаметром от 40 до 65 нм. Под липидной оболочкой находится икосаэдрическая капсидная оболочка диаметром приблизительно 25-30 нм.
[0062] Лихорадка денге является острым инфекционным заболеванием, характеризующимся двухфазной лихорадкой, головной болью, болью в различных частях тела, прострацией, сыпью, лимфаденопатией и лейкопенией (Holstead, 1980, Immunological parameters of togavirus disease syndromes, p. 107-173, in Schlesinger (ed.), “The Togaviruses,” Academic Press, Inc., NY; и Sabin, 1959, Dengue, p. 361-373, in Rivers & Horsfall (eds.), “Viral and Rickettsial Infections of Man,” JB Lippincott Co., Philadelphia). DV переносят комары. Заражение одним серотипом вируса денге может обеспечить пожизненный иммунитет к этому подтипу, но не перекрестно-защитный иммунитет к другим серотипам.
[0063] Геморрагическая лихорадка денге (DHF) представляет собой тяжелое лихорадочное заболевание, характеризующееся аномалиями гемостаза и повышенной проницаемостью сосудов, что в некоторых случаях приводит к синдрому гиповолемического шока, синдрому шока денге (DSS) (WHO: 1975. Technical Guides for Diagnosis, Treatment, Surveillance, Prevention and Control of Dengue Hemorrhagic Fever, Geneva, CH). Механизм DHF/DSS может варьировать в разных случаях. Основные факторы, способствующие DHF/DSS, могут включать в себя вирусную вирулентность, состояние здоровья больного и вторичную инфекцию различных серотипов DV.
[0064] В настоящее время существует пять серотипов DV - 1, 2, 3, 4 и 5. Иммунитет к одному серотипу обычно не обеспечивает иммунитет к другому серотипу.
[0065] Усугубляющим является то, что люди не всегда одинаково реагируют на отдельные серотипы. Таким образом, человек, инфицированный одновременно по меньшей мере двумя серотипами DV, вероятно, выработает иммунный ответ только против одного серотипа. Более того, последующие инфекции, как правило, серотипа, отличного от такового при первичной или предыдущей инфекции, но также и в тех случаях, когда первая или предшествующая инфекция являются доброкачественными, легкими или бессимптомными, могут привести к более тяжелому заболеванию и патологии.
[0066] Причины доминирования, селективности или интерференции серотипов неизвестны. Может случиться так, что in situ репликация, рост, созревание и высвобождение вируса из клетки-хозяина или представление антигена могут направлять иммунный ответ хозяина на конкретный серотип.
[0067] В любом случае, менее чем предсказуемый ответ хозяина, интерференция серотипов и бессимптомные инфекции создают многочисленные препятствия при разработке эффективной поливалентной вакцины.
[0068] Имеющиеся поливалентные живые вакцины не способны генерировать эквивалентный иммунитет ко всем серотипам, даже когда относительные количества каждого серотипа в вакцине варьируют в попытке компенсировать искаженные иммунные ответы.
[0069] В практике осуществления представляющего интерес объекта настоящего изобретения конструировали различные геномы DV с различными аминокислотными заменами в остатке Glu сайта расщепления фурином prM; в 3'-5'-направлении консенсусного тетрапептида, например, в удлинении из 8 аминокислот в 3'-5'-направлении рядом с консенсусом, то есть аминокислоты 88-91; в 5'-3'-направлении консенсусного тетрапептида, например, в удлинении из 39 аминокислотах в 5'-3'-направлении рядом с консенсусом из аминокислот 88-91, то есть аминокислоты 92-130 (то есть в пределах аминокислот 80-130 включительно prM), или их комбинация. Аминокислотное(ые) изменение(ия) усиливает(ют) расщепление prM фурином. При введении в клетки-хозяева млекопитающего происходила репликация и происходила экспрессия с образованием вирусных частиц. Однако зрелые частицы, предназначенные для перемещения из клетки-хозяина, не были получены. Таким образом, представляющая интерес частица инфицирует клетку млекопитающего один раз, мутантный вирусный геном реплицируется и экспрессируется в клетке-хозяине млекопитающего, но частицы зрелого потомства вируса не высвобождаются инфицированными клетками-хозяевами млекопитающего или человека.
[0070] Согласно вариантам осуществления тетрапептидный сайт расщепления фурином DV в белке prM NH2-(88)Arg-Glu-Lys-Arg-COOH (SEQ ID NO: 1), при этом расщепление происходит в 5'-3'-направлении остатков Lys-Arg, изменяется в сайте Glu для усиления расщепления фурином.
[0071] Согласно вариантам осуществления Glu замещается любой аминокислотой. Замещающая аминокислота может представлять собой не кислотную, не нейтральную аминокислоту, такую как Gln, Asn, Gly, Lys, Arg, His, Thr, Ser, Tyr, Met или Cys. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не содержит серу. Следовательно, замещающая аминокислота представляет собой не кислотную, не нейтральную аминокислоту, отличную от Met или Cys. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не содержит гидроксильную группу R. Следовательно, согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не является Tyr, Ser или Thr. Согласно вариантам осуществления замещающая мутантная аминокислота является основной аминокислотой. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой Lys, Arg или His. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой Arg.
[0072] Согласно вариантам осуществления изменяют аминокислоту в 3'-5'-направлении консенсусного тетрапептида. Например, изменяют аминокислоту в удлинении из восьми аминокислот непосредственно в 3'-5'-направлении консенсусом (или на аминоконцевой стороне) сайта расщепления фурином для усиления расщепления фурином prM («измененный сайт в 3'-5'-направлении»). Таким образом, изменение может происходить в аминокислотах 80-87 полипептида prM.
[0073] Согласно вариантам осуществления изменяют аминокислоту в 5'-3'-направлении консенсусного тетрапептида. Например, изменяют аминокислоту в удлинении из тридцати девяти аминокислот непосредственно в 5'-3'-направлении консенсуса (или на карбоксиконцевой стороне) сайта расщепления фурином для усиления расщепления фурином prM («измененный сайт в 5'-3'-направлении»). Изменение может происходить в аминокислотах 92-130 полипептида M.
[0074] Представляющий интерес DV содержит по меньшей мере один из: (1) измененного тетрапептидного сайта расщепления фурином; (2) измененного сайта в 3'-5'-направлении и (3) измененного в 5'-3'-направлении сайта. Представляющий интерес DV может включать в себя комбинацию любых двух из (1), (2) и (3). Представляющий интерес DV может включать в себя все три изменения.
[0075] Согласно вариантам осуществления арбовирус представляет собой ZV, который включает в себя полипротеин prM.
[0076] Геном ZV состоит из одной однонитевой положительной смысловой РНК из 10794 оснований (хотя некоторые изоляты имеют другой размер [например, Baronti et al., Genome Announc 2(3)1-2, 2014]). Помимо структурных и неструктурных генов имеются 3' и 5' некодирующие концы.
[0077] ZV характеризуется незначительными уровнями полиморфизма. Например, распознают по меньшей мере два подтипа - африканскую линию вируса и азиатскую/южно-американскую линию вируса. Эти две линии можно различать серологически, то есть существует вероятность вариации белков оболочки.
[0078] Симптомы лихорадки Зика могут включать в себя лихорадку, покраснение глаз, боль в суставах, головную боль и макулопапулезную сыпь и обычно длятся менее семи суток. Хотя первоначальная инфекция не считается фатальной для нормальных взрослых, инфекция во время беременности может вызвать пороки развития и аномалии у развивающегося эмбриона и/или плода, такие как микроцефалия. Инфекции у взрослых были связаны с синдромом Гийена-Барре.
[0079] ZV преимущественно переносится комарами. После крупной вспышки лихорадки Зика в Бразилии в 2015 году ZV распространился через Латинскую Америку и Карибский бассейн, а теперь и в Соединенные Штаты Америки.
[0080] Жизненный цикл ZV начинается с прикрепления вириона к поверхности клетки-хозяина и последующего попадания в клетку путем опосредованного рецептором эндоцитоза. Как понимают в настоящее время, подкисление эндосомального везикула запускает конформационные изменения в вирионе, слияние вирусной и клеточной мембран и разборку частиц. Как только геном высвобождается в цитоплазму, положительная смысловая РНК транслируется в один полипротеин, который процессируется протеазами вируса и хозяина в 10 генных продуктов: три структурных белка, коровый белок (С), премембранный белок (prM), белок оболочки (E) и семь неструктурных (NS) белков - NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5.
[0081] Сайт расщепления фурином ZV расположен после аминокислоты 93 в prM. Согласно вариантам осуществления последовательность белка prM в 3'-5'-направлении тетрапептидного сайта расщепления фурином включительно, His-His-Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Arg-Arg/ (SEQ ID NO: 2), при этом расщепление происходит после концевого Arg и обозначается косой чертой, при этом сериновый остаток заменяется Arg (тетрапептидного сайта, Arg-Ser-Arg-Arg (SEQ ID NO: 10)), с обеспечением последовательности из пяти аргининовых остатков для усиления расщепления фурином. Кроме того, остаток глутаминовой кислоты в 3'-5'-направлении удлинения может быть изменен, например, на гистидин, для усиления расщепления фурином. Другие изменения остатков в 3'-5'-направлении удлинения усиливают расщепление фурином. Изменения в 5'-3'-направлении тетрапептидного удлинения усиливают расщепление фурином. Например, изменения могут касаться любой или всех из 26 аминокислот удлинения в 5'-3'-направлении тетрапептида, что усиливает расщепление фурином.
[0082] Усиленной активности фурина достигают с помощью одного или нескольких из: (1) изменения одной или нескольких аминокислот в 3'-5'-направлении сайта расщепления фурином, например, в последовательности из восьми остатков, начинающейся с аминокислотного остатка 82 от N-конца prM ZV (т. e. аминокислотные остатки 82-89 prM); (2) изменения в сайте расщепления фурином и (3) изменения одного или нескольких аминокислотных остатков в 5'-3'-направлении (от аминокислоты 94 и далее) сайта расщепления фурином, например, в последовательности из 26 остатков в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином. Может присутствовать любая комбинация из (1), (2) и (3).
[0083] У вируса желтой лихорадки, вируса калифорнийского энцефалита, вируса лихорадки долины Рифт, вируса клещевого энцефалита, вируса Западного Нила, вируса энцефалоза лошадей, вируса колорадской клещевой лихорадки, вируса чикунгуньи, вируса африканской чумы свиней и других арбовирусов консенсусный тетрапептидный сайт распознавания фурином располагают на основе известной консенсусной последовательности распознавания фурином и в ней осуществляют аминокислотные замены для идентификации мутантов, которые больше не размножаются или плохо размножаются в клетках млекопитающего. Аминокислотные изменения, такие как, замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., также могут быть выполнены в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении консенсусного сайта расщепления фурином.
[0084] Известны получение, выращивание и поддержание вируса в клеточных линия и в животных. Известно получение мутантов арбовируса путем изменения кодирующих последовательностей с использованием молекулярных методик. Известны различные тесты для определения роста вируса в клетках, продуцирования потомства вируса из клеток и другие анализы, применимые в осуществлении настоящего изобретения, и их выбор является конструктивным выбором.
[0085] Еще одна цель настоящего изобретения заключается в разработке масштабируемой системы для получения композиции представляющего интерес иммуногенного арбовируса. Эту цель достигали путем получения представляющего интерес арбовируса, который экспрессирует дисфункциональный сайт расщепления фурином, который расщепляется на повышенных уровнях фурином, в линиях клеток насекомого, таких как линии клеток членистоногих, например, линии клеток клещей или комаров, при этом материалы и способы для крупномасштабного получения вируса клетками насекомого известны и доступны. Линии клеток членистоногих коммерчески доступны, например, линии клеток шелкопряда и линии клеток комара.
[0086] Представляющий интерес арбовирус растет беспрепятственно в клетках насекомого. Таким образом, представляющий интерес арбовирус, несущий дисфункциональный сайт расщепления фурином, растет, реплицируется, созревает и может быть высвобожден клеткой насекомого-хозяина в окружающую среду в приблизительно той же степени или при том же уровне, что и арбовирус дикого типа. Таким образом, представляющий интерес арбовирус может продуцировать потомство вируса до той же степени или при более высоких уровнях, чем арбовирус, который не содержит представляющий интерес дисфункциональный сайт расщепления фурином в клетках насекомого.
[0087] Степень продуцирования потомства вируса (или размножения) может быть оценена, например, в анализе бляшкообразования или анализе гемагглютининов, известном в уровне техники и изложенном в настоящем документе. Легким и чувствительным способом оценки продуцирования вируса является подсчет флуоресцентно меченных клеток в проточном цитометре, как описано в Drayman & Oppenheim, “Rapid Titration of Viruses by Flow Cytometry,” Curr Prot Cell Biol 26.11.1-26.11.7, 2011. Следовательно, серийно разведенные инфицированные клетки получают с отделением, если необходимо, клетки собирают, фиксируют и подвергают воздействию одного или нескольких реагентов на основе антител по меньшей мере с одним Ab, направленным на вирусный белок, и по меньшей мере с одним флуоресцентно меченным Ab, а затем, например, с помощью проточного цитометра, считывают по меньшей мере приблизительно 10000 клеток, чтобы определить количество флуоресцентно меченных клеток, экспрессирующих этот вирусный белок. Таким образом, представляющий интерес арбовирус может продуцировать приблизительно те же или большие уровень или количество потомства вируса по сравнению с количеством потомства вируса, продуцируемого клетками, инфицированными эталонным арбовирусом (таким как для DV серотип 2, новогвинейский штамм, № в ATCC VR-1584), в клетках C6/36 (№ доступа в ATCC CRL-1660), или вирусом дикого типа тех же штамма или линии, не включающим в себя представляющий интерес мутантный вирус, обладающий усиленной активностью фурина или демонстрирующий усиленное расщепление фурином, или prM.
[0088] Представляющий интерес арбовирус не созревает надлежащим образом в клетках млекопитающего, и частицы не высвобождаются клеткой млекопитающего-хозяина (или не размножаются), но вместо этого незрелые частицы улавливаются и накапливаются в клетке млекопитающего-хозяина. Таким образом, представляющий интерес арбовирус практически не продуцирует потомство вируса в клетках человека или млекопитающего. Представляющий интерес арбовирус продуцирует меньше потомства вируса по сравнению с арбовирусом дикого типа, например, на 4 порядка или меньше, 5 порядков или меньше, 6 порядков или меньше, 7 порядков или меньше, 8 порядков или меньше, 9 порядков или меньше, или не продуцирует потомство по сравнению с количеством потомства, производимого, например, при использовании клеток HT1080 (№ доступа в ATCC CCL-121).
[0089] Представляющий интерес мутантный вирус, который не размножается в клетках млекопитающего, является желательным, поскольку заболевание или патология сводятся к минимуму или предотвращаются. Однако очень низкое высвобождение или отсутствие высвобождения потомства вируса не является важным или необходимым. Дисфункциональный вирус, который при инфицировании в клетке млекопитающего, продуцирующий, например, на 4 порядка или меньше, 5 порядков или меньше, 6 порядков или меньше потомства вируса по сравнению с подобной клеткой, инфицированной вирусом дикого типа, может быть применен в качестве иммуногена несмотря на высвобождение низких или небольших количеств потомства вируса, потому что иммунная система хозяина в конечном итоге выведет вирус и клетки, экспрессирующие вирусный антиген.
[0090] Вирус, содержащий представляющий интерес измененный и дисфункциональный сайт фурина, является инфекционным, но не может продуцировать или не продуцирует инфекционные вирионы потомства при заражении клеток млекопитающего. Таким образом, нереплицирующаяся частица представляет собой частицу, которая инфицирует клетку млекопитающего-хозяина, такую как клетка человека, но эта клетка-хозяин не дает или не высвобождает частицы потомства вируса, образующиеся в результате этой инфекции. Но эта инфицированная клетка-хозяин млекопитающего экспрессирует эпитопы арбовируса в инфицированной клетке и на таковой.
[0091] Уникальный характер представляющего интерес дефектного вируса обеспечивает источник эффективных и безопасных арбовирусных иммуногенных композиций, и большое количество вируса может быть эффективно получено путем выращивания представляющего интерес вируса в клетках насекомого. Представляющий интерес дисфункциональный вирус может продуцировать приблизительно такое же количество потомства вируса, что и эталонный вирус, при инфицировании в том же типе клетки насекомого. Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дисфункциональный вирус продуцирует больше вируса из клетки насекомого, чем эталонный вирус, инфицирующий этот тип клетки насекомого. Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дисфункциональный вирус продуцирует меньше вируса, чем эталонный вирус. Высокоиммуногенный дисфункциональный вирусный штамм имитирует процесс естественной инфекции арбовируса и позволяет млекопитающему-хозяину генерировать и вырабатывать длительный и широкий иммунитет против арбовируса без патологии или с минимальной патологией Таким образом, представляющий интерес измененный арбовирус представляет собой вирус, который содержит генетический материал для экспрессии как можно большего количества или всех эпитопов, экспрессируемых белками prM, M и E дикого типа и, возможно, также C арбовируса дикого типа.
[0092] Представляющий интерес арбовирус может инфицировать многие, если не все восприимчивые клетки после соответствующего титрования. Степень инфекционности может быть оценена с использованием стандартного и известного анализа. Например, клетки Vero в шести-луночном планшете инфицируют арбовирусом при серийном разведении и клетки перемешивают на шейкерной платформе при 37°C. Жидкость клеточной культуры собирают через 48 часов. Количество вируса, высвобождаемого в культуральную среду, может быть определено с использованием известных способов, таких как те, что описаны в настоящем документе.
[0093] Например, чтобы приготовить частично очищенные частицы арбовируса, культуральную жидкость очищают, например, центрифугированием при 16000 × g в микроцентрифуге в течение 15 минут при 4°C, и частицы осаждают из надосадочной жидкости ультрацентрифугированием при 40000 оборотах в минуту в течение 2 часов при 4°C в роторе AH650 центрифуги Sorvall OTD55B. Гранулы повторно суспендируют в 50 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS) и оставляют растворяться на протяжении ночи при 4°C.
[0094] Для определения титра арбовируса, например, клетки почки детеныша хомяка (ВНК)-21 на предметных стеклах с восьмью луночными камерами инфицируют 50 мкл серийных 10-кратных разведений жидкости клеточной культуры или повторно суспендированного осажденного центрифугированием материала в течение 2 часов при 37°С. Затем жидкость заменяют 1 мл минимальной питательной среды Дульбекко, дополненной 2% фетальной бычьей сыворотки. Клетки инкубируют в течение 24 часов при 37°С в инкубаторе с CO2, а затем подвергают иммунофлуоресцентному (IF) анализу с использованием специфического в отношении арбовируса Ab или mAb (коммерчески доступного или полученного, как известно в уровне техники), HMAF, как описано ниже, или поликлональной антисыворотки с требуемой специфичностью, реагента, который образует сэндвич со специфическим в отношении вируса реагентом, который несет выявляемый репортер, и с использованием соответствующих контролей.
[0095] Титры вируса (в инфекционных единицах (IU) на миллилитр), присутствующего в собранных культуральных жидкостях (CF), также определяли путем инфицирования, например, эпителиальных клеток почки резуса (например, клеток LLC-MK2 (ATCC)), с последующим непрямым иммунофлуоресцентным анализом (IF) со специфическими в отношении арбовируса реагентами и мечеными реагентами, например, гипериммунной асцитической жидкостью мыши (HMAF), содержащей mAb.
[0096] Как гуморальные на основе антител, так и клеточные иммунные ответы участвуют в защите инфекции DV и восстановлении после нее. Представляющий интерес арбовирус индуцирует обе группы иммунного ответа. Частицы состоят из белков prM, M и/или E, и, таким образом, представляющие интерес частицы представляют собой иммуногены широкого спектра действия и имитируют заражение вирусом дикого типа. Но представляющие интерес частицы инфицируют клетки-хозяева млекопитающего, и в этих клетках дополнительный белок prM, M и/или E экспрессируется в клетке-хозяине или клеткой-хозяином. Белки prM, M и/или E либо могут высвобождаться из этих клеток, обеспечивая дополнительные антигенные стимулы для хозяина, либо могут экспрессироваться на поверхности инфицированных клеток-хозяев с обеспечением еще одного пути антигенного стимула для хозяина. Представляющий интерес арбовирус необязательно может экспрессировать неструктурные белки, такие как NS1. Предыдущие сообщения показали, что эти вирусные белки NS могут индуцировать защитный иммунный ответ (Heinz & Roehrig, 1990, in, “Immunochemistry of Viruses, Vol II,” Amsterdam-NY-Oxford, Elsevier, p. 289-305; Heinz, 1986, Adv Virus Res 31:103-168; Bray & Lai, 1991, Virol, 185:505-508; Henchal et al., 1988, J Gen Virol 69:2101-2107; и Schlesinger et al., 1986, J Virol 60:1153-1155).
[0097] Соответствующие модели для тестирования эффективности представляющей интерес фармацевтической композиции включают в себя животные модели, которые моделируют арбовирусную инфекцию. Например, был описан протокол, используемый для иммунизации мышей и последующего заражения арбовирусом (Bray et al., 1989, J Virol 63:2853-2856). Вкратце, по 10 самок мышей BALB/c в каждой группе иммунизируют в возрасте 3 недель (день 1) и снова в день 14 путем внутрибрюшинной (ip) инокуляции вируса, такого как DV. Контрольные животные получают забуференный фосфатом солевой раствор (PBS). У всех животных берут кровь в день 0 и в день 21. В случае DV мышей заражают в день 22 путем внутрицеребральной инъекции дозы, в 100 раз превышающей 50% смертельную дозу (LD50), вируса. После заражения мышей наблюдают в течение 21 суток на наличие признаков патологии, а мышей с симптомами (энцефалит, паралич или смерть) регистрируют ежедневно. Сыворотку крови также собирают у выживших для сравнения с сыворотками крови перед заражением.
[0098] Определяют дозу каждого вируса. Серореактивность иммунизированных мышей к отдельным белкам арбовируса анализируют, например, с помощью ELISA или радиоиммунопреципитации меченых антигенов арбовируса с использованием коммерчески доступных наборов для мечения и антител. Анализ уменьшения образования бляшек может быть использован для измерения титров специфических в отношении арбовирусов нейтрализующих антител в сыворотке крови мыши. Например, приблизительно 0,5 мл образца сыворотки крови, который будет использоваться в анализе, сначала инактивируют нагреванием путем инкубации в течение 30 минут при 56°С. Готовят четырехкратные разведения сыворотки крови в конечном объеме 0,3 мл, начиная с разведения 1:10, с использованием среды М199 с 2% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) в качестве разбавителя. К каждой аликвоте 0,3 мл разбавленной сыворотки крови добавляют равный объем среды, содержащий 150-180 образующих бляшки единиц (PFU) вируса. Вирус и сыворотку крови смешивают и инкубируют в течение 30 минут при 37°С. В каждом анализе также предусматривают контроль без сыворотки крови и контроль, состоящий из специфического в отношении каждого арбовируса Ab, например, в двух разведениях. Смеси вируса/сыворотки крови и контроля высевают на слившиеся монослои, например, клеток LLC-MK2, в шестилуночные планшеты Costar (Corning Inc., Corning, NY) по 0,2 мл/лунка. Для каждого образца инфицируют дублирующие лунки. Адсорбцию вируса осуществляют в течение 1 часа при комнатной температуре с покачиванием вручную каждые 15 минут. Затем лунки покрывают средой, содержащей 1% агарозы (SeaKem LE; BioWhittaker, Rockland, ME) в сбалансированном солевом растворе Эрла плюс 10% FBS с добавлением незаменимых витаминов и аминокислот (Invitrogen) при 6 мл/лунка. Планшеты инкубируют в течение 7 суток при 37°С в 5% CO2. Затем лунки покрывают 4% раствором нейтрального красного (4 мл раствора нейтрального красного, добавленного к 96 мл PBS), содержащим 1% агарозы. Планшеты инкубируют в течение 24 часов при 37°С. Среднее число бляшек используют для расчета 50% снижения уровня количества бляшек.
[0099] Согласно вариантам осуществления представляющая интерес композиция вируса представляет собой композицию, которая является поливалентной, то есть двухвалентной, трехвалентной, четырехвалентной и т. д., и представляет собой композицию, которая иммунизирует хозяина к множеству серотипов арбовируса, как правило, одного вируса, но может включать в себя антигены от множества видов вирусов, например, включающих в себя множество представляющих интерес мутантных вирусов. Интерференция или доминирование одного серотипа над одним или несколькими другими серотипами не наблюдается. Это может быть потому, что иммуногенность не зависит от продуцирования вируса и от постоянной репликации нового вируса.
[00100] Представляющий интерес арбовирус включают в фармацевтические композиции, подходящие для введения в качестве иммуногена, как известно в уровни техники области иммунологии. Такие композиции обычно содержат активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель. Применяемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» подразумевает включение любых растворителей, дисперсионных сред, покрытий, противобактериальных и противогрибковых средств, изотонических и задерживающих абсорбцию средств и т п., совместимых с фармацевтическим введением. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ известно в уровне техники и является разрабатываемым решением. Их применение в композициях предполагается за исключением случаев, когда какие-либо обычные среда или средство несовместимы с активным соединением. Дополнительные фармакологически активные соединения, такие как адъювант, также могут быть включены в композиции.
[00101] Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением для применения, раскрываемого в настоящем документе, составляют совместимой с предполагаемым путем введения. Примеры путей введения включают в себя парентеральное, например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, чрескожное (в том числе, например, местное), трансмукозальное и ректальное введение.
[00102] Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать в себя следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; противобактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие средства, такие как EDTA; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; и средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно регулировать кислотами или основаниями, такими как HCl или NaOH. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с множественными дозами, сделанные из стекла или пластика.
[00103] Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают в себя стерильные водные растворы (при этом растворимые в воде) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Для внутривенного введения подходящие носители включают в себя физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL® (BASF; Parsippany, NJ) или забуференный фосфатом солевой раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы ее можно было вводить через шприц. Композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных противобактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты и т. п. Может быть предпочтительным включение в композицию изотонических средств, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит и сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута включением в композицию средства, которое задерживает абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина.
[00104] Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей фильтрационной стерилизацией. Как правило, дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов способы приготовления включают в себя вакуумную сушку и сушку вымораживанием, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора.
[00105] Пероральные композиции, как правило, включают в себя инертный разбавитель или пищевой носитель. Композиция может быть заключена в желатиновые капсулы или спрессована в таблетки, которые могут быть покрыты оболочкой или обработаны, например, для обеспечения энтеросолюбильной композиции, состава с отсроченным высвобождением и т. д. С целью перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено со вспомогательными средствами и может использоваться в форме таблеток, пастилок или капсул. Пероральные композиции также могут быть приготовлены с использованием жидкого носителя для получения сиропа, эликсира или жидкого состава или для применения в качестве жидкости для полоскания рта, при этом соединение в жидком носителе применяют перорально, полощут им рот и выплевывают или проглатывают.
[00106] Фармацевтически совместимые связующие средства и/или адъювантные материалы могут быть включены как часть композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений аналогичной природы: связующее, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное средство, такое как крахмал или лактоза; разрыхлитель, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или Sterotes; усилитель скольжения, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Представляющие интерес частицы могут быть инкапсулированы в формы, которые выживут при прохождении через желудочную среду. Такие формы обычно известны как составы с энтеросолюбильным покрытием.
[00107] Для введения путем ингаляции соединение может быть доставлено в форме, например, аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера или дозатора, который содержит подходящий пропеллент, например, газ, такой как диоксид углерода, или небулайзера, или распылителя. Состав может быть жидким, сухим, таким как тонкоизмельченный порошок, и т.д.
[00108] Системное введение также может осуществляться трансмукозальным или чрескожным способом. Для трансмукозального или чрескожного введения в составе используют усилители проницаемости, подходящие для проникновения через барьер. Такие усилители проницаемости, как правило, известны в области техники и включают в себя, например, средства для трансмукозального введения, поверхностно-активные вещества, соли желчных кислот и производные фузидиевой кислоты. Трансмукозальное введение может быть достигнуто путем использования назальных спреев или клизм. Для чрескожного введения активные соединения могут быть составлены в виде мазей, бальзамов, пен, гелей или кремов, как правило, известных в уровне техники. Композиция может быть доставлена с использованием пластыря, наносимого на кожу.
[00109] В форме суппозитория представляющая интерес композиция может включать в себя традиционную основу для суппозитория, такую как масло какао и другие глицериды.
[00110] Согласно вариантам осуществления активное соединение готовят с носителями, которые защищают соединение от быстрого выведения из организма, например, в составе с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота.
[00111] Способы приготовления таких составов будут очевидны специалистам в данной области. Материалы могут быть получены из коммерческих источников, таких как Johnson & Johnson и Encapsula Nano Sciences (Brentwood, TN).
[00112] Липосомные суспензии (включающие в себя липосомы, на которые нацелены моноклональные антитела и другие такие нацеливающиеся молекулы) также можно использовать в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области, например, как описано в патенте США № 4522811.
[00113] Может быть выгодно составлять пероральные или парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозировки. Используемый в настоящем документе термин «стандартная лекарственная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъекта, подлежащего лечению; при этом каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.
[00114] Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, упаковку, набор или дозатор вместе с инструкциями по введению.
[00115] Другой способ введения предусматривает добавление представляющего интерес соединения в пищевой продукт или напиток или вместе с ним, в качестве пищевой добавки или добавки, или в виде лекарственной формы, принимаемой на профилактической основе, подобной витамину.
[00116] Дозировки, например, предпочтительный путь введения и количества, определяют на основании эмпирических данных, полученных из доклинических и клинических исследований, с применением способом, известных в уровне техники. Для повторных введений в течение нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов заболевания. Однако могут быть применимы другие режимы дозировки. Ход терапии контролируют с помощью традиционных методов и анализов. Типичный режим введения дозы раскрыт в WO 94/04188. Описание единичных лекарственных форм в соответствии с настоящим изобретением продиктовано уникальными характеристиками и может напрямую зависеть от таковых активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, а также ограничений, присущих области приготовления такого активного соединения для лечения индивидуумов. Следовательно, количество вирусных частиц, вводимых взрослому человеку, можно экстраполировать из терапевтических количеств, доставляемых модельным животным, таким как мыши, крысы, обезьяны и т. д. Например, основываясь на исследованиях на мышах, можно вводить приблизительно 106 частиц (или IU), приблизительно 107 частиц, приблизительно 108 частиц, приблизительно 109 частиц или больше на дозу или разделенными дозами. Количество или дозы могут быть скорректированы по мере появления эмпирических данных, как известно в уровне техники.
[00117] Представляющий интерес вирус может быть применен для выработки эффективного иммунного ответа у индивидуума, при этом термин «эффективный» включает в себя минимизацию, уменьшение или предотвращение симптомов или патологии у индивидуума. Поскольку иммунный ответ хозяина является определяющим при получении терапевтического ответа, который может быть классифицирован у любого индивидуума, как и для любого лекарственного средства, вирус или представляющий интерес объект могут быть или могут не быть терапевтическими и могут давать или могут не давать желаемый ответ у реципиента вируса. Введение дозы, путь и способ представления вируса, применение адъюванта и других иммунологических факторов могут решить проблему отсутствия иммунного ответа или умеренного иммунного ответа у индивидуума.
[00118] Это явление проявляется на уровне популяции, и не каждый реципиент в популяции представляющего интерес вируса будет вызывать терапевтический иммунный ответ, и число респондеров в любой популяции может отличаться от такового в другой популяции.
[00119] Применимость представляющего интерес дисфункционального вируса не обусловлена более высоким процентом респондеров в популяции, более высоким уровнем иммунологической защиты в популяции, коммерческой жизнеспособностью, коммерческим успехом и т. д., но только в том случае, если у одного индивидуума представляющий интерес дисфункциональный вирус генерирует терапевтический иммунный ответ, который уменьшает или предотвращает симптомы или заболевание.
[00120] Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано в следующих неограничивающих примерах.
Пример 1
[00121] Вирион DV состоит из 6% РНК, 66% белка, 9% углевода и 17% липида (Russell et al., Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses, in, Schlesinger eds., “The Togaviruses: Biology, Structure, Replication,” New York, Academic, 1980, p. 503-529; и Trent & Naeve, Biochemistry and Replication, in Monath, ed., “St. Louis Encephalitis,” Washington, DC, American Public Health Association, 1980, p. 159-199). Электронно-плотный нуклеокапсид состоит из белка С (капсида) и геномной РНК. Белок оболочки Е и белок мембраны (М) внедряются в липидный бислой с помощью C-концевых гидрофобных якорей. Однако незрелые частицы, обнаруженные во внутриклеточных везикулах, содержат исключительно непроцессированный пре-М (prM) и являются менее инфекционными, чем высвобожденные вирионы (Morens, Clin Infect Dis, 1994, 19:500-512).
[00122] Геном DV является однородным и представляет собой одноцепочечную положительную смысловую молекулу РНК размером приблизительно 10-11 т. п. н., содержащую одну ORF, составляющую приблизительно 95% генома (Chambers et al., Ann Rev Microbiol, 1990, 44:649-688). Геномные РНК полной длины, по-видимому, являются единственными специфическими для вируса молекулами РНК (мРНК) в инфицированных DV клетках. При заражении вирусная РНК транслируется в полипротеин из приблизительно 3400 аминокислот, который процессируется в 10 генных продуктов: три структурных белка, C, prM и E; и семь неструктурных (NS) белков - 1, 2А, 2В, 3, 4А, 4В и 5 (Bhamarapravati & Yokan, Live attenuated tetravalent vaccine, in Gubler & Kuno, eds., “Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever,” Wallingford, CAB International, 1997, pp 367-377; и Falgout & Markoff, 1995, The family flaviviridae and its diseases, p. 47-66, in, Porterfield, ed., “Exotic Viral Infections,” Chapman and Hall Medical, London, United Kingdom).
Пример 2
[00123] Мутантные DV создавали из инфекционного клона кДНК полной длины штамма DV2 New Guinea C (№ в ATCC VR-1584). Фрагменты мутантной ДНК создавали с помощью ПЦР и вводили в клон полной длины с помощью гомологичной рекомбинации, как описано (Zeng et al., J Virol. 1998 Sep;72(9):7510-22). Мутации подтверждали путем секвенирования ДНК. Мутантные РНК DV синтезировали с помощью in vitro транскрипции, как описано в Polo et al., J Virol. 1997;71(7):5366-74.
[00124] Кинетические показатели роста мутантных DV показывали различие роста вируса между инфицированными клетками Vero (№ в ATCC CCL-81) (человека) и инфицированными клетками C6/36 (CRL-1660) (комара). prM DV2 дикого типа (DENV2) (SEQ ID NO: 3) и четыре мутанта, в которых Glu (E из DENV2) сайта распознавания фурином меняли на Arg (R) (D2-89R, SEQ ID NO: 4), Val (V) (D2-89V, SEQ ID NO: 5), Ser (S) (D2-89S, SEQ ID NO: 6) или Gly (G) (D2-89G, SEQ ID NO: 7), тестировали на предмет роста в клетках Vero человека и в клетках C6/36 комара.
[00125] Мутант D2-89R, в котором Glu меняли на R, размножался в клетках насекомого и не демонстрировал репликации в клетках человека.
Пример 3
[00126] Мутантов создавали со вторым серотипом DV из инфекционного клона кДНК полной длины штамма DV1 Western Pacific 74 (№ в Genbank U88536). Фрагменты мутантной ДНК создавали с помощью ПЦР и вводили в клон полной длины с помощью гомологичной рекомбинации, как описано (Markoff et al., J Virol. 2002;76(7):3318-28). Мутации подтверждали путем секвенирования ДНК. Мутантные РНК DV синтезировали с помощью in vitro транскрипции, как описано у Polo et al.
[00127] Кинетические показатели роста мутантных DV показывали различие роста вируса между инфицированными клетками Vero (№ в ATCC CCL-81) (человека) и инфицированными клетками C6/36 (CRL-1660) (комара).
Пример 4
[00128] Получали мутанта DV1, как описано в примерах 2 и 3, содержащего следующую последовательность:
CSQTGEHRRRKRSVALAPHVGLGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRH (SEQ ID NO: 17).
[00129] Эта последовательность начинается с аминокислоты 80 полипептида prM DV1, и в консенсусном тетрапептиде фурина D меняли на R. Расщепление происходит между R и S в указанной выше последовательности.
[00130] Кинетические показатели роста мутантного DV1 показывали различие роста вируса между инфицированными клетками Vero (№ в ATCC CCL-81) (человека) и инфицированными клетками C6/36 (CRL-1660) (комара)
Пример 5
[00131] Анализ вестерн-блоттинга с применением известного способа с коммерчески доступным mAb DV prM и сравнением интенсивности полос и размера полос для вывода молекулярной массы показывал, что эффективность расщепления фурином мутантных DV усиливалась как в клетках Vero (CCL-81), так и в клетках C6/36 (CRL-1660).
Пример 6
[00132] Рост мутантных DV в клетках млекопитающих исследовали путем непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. В способе Polo et al. использовали mAb 4G2 из ATCC (HB-112).
[00133] Положительную флуоресценцию наблюдали от 1 суток до 3 суток после заражения с увеличением яркости и увеличением количества положительных клеток для положительных контролей с использованием родительского вируса DV2. С другой стороны, при инфицировании мутантом D2-89R интенсивность и количество флуоресцирующих клеток постепенно уменьшались в течение этого периода времени. Никаких новых колоний не формировалось от 1 до 3 суток после заражения.
[00134] Таким образом, мутант D2-89R инициировал только один цикл инфицирования в клетках человека и не продуцировал инфекционные частицы потомства вируса.
Пример 7
[00135] Для подтверждения того, что рост мутанта D2-89R ограничен в клетках человека, клетки фибробласты кожи (CRL-2522, ATCC) инфицировали in vitro с помощью DV2 или D2-89R и оценивали наличие антигенов вирусной оболочки по иммунофлуоресценции в различные моменты времени (часы) после инфицирования (hpi), как описывается в настоящем документе. DV2 размножался и продуцировал потомство вируса в клетках CRL-2522, тогда как мутант D2-89R нет.
[00136] Постепенное усиление продуцирования вирусных частиц с течением времени, указывающее на активную репликацию вируса в инфицированных клетках, наблюдали для клеток, инфицированных вирусом DV2 дикого типа.
[00137] С другой стороны, клетки, инфицированные мутантным D2-89R, не продуцировали никакого вирусного потомства.
Пример 8
[00138] Для оценки защитной эффективности специфического в отношении клеток млекопитающего ограничения роста представляющего интерес мутанта DV против заражения DV группы 6-недельных мышей AG129 (N = 6/группа) получали однократную внутрибрюшинную иммунизацию 105 инфекционными единицами (IU) мутанта D2-89R. Мышам контрольной группы вводили внутрибрюшинной инъекцией 50 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS).
[00139] Две группы мышей не демонстрировали какой-либо видимой разницы в подвижности и поведения после иммунизации.
[00140] Через десять суток после иммунизации мышам, которым вводили инъекцией D2-89R, и контрольным мышам AG129, которым вводили PBS, вводили внутрибрюшинной инъекцией 105 образующих бляшки единиц (PFU) (что составляет стократную инокуляцию LD50) DV2.
[00141] У контрольных мышей, которым вводили инъекцией PBS, инокулированных DV2, развивалась виремия. Напротив, однократная иммунизация мутантом D2-89R обеспечивала полную защиту от заражения DV2 без обнаруживаемой виремии (< 100 копий/мл) в любой момент времени (N = 10).
[00142] Более того, все мыши, подвергшиеся воздействию D2-89R, были здоровы на протяжении всего эксперимента, тогда как все мыши, подвергшиеся воздействию только PBS, умерли после заражения DV2, см. фиг. 1.
Пример 9
[00143] Для оценки безопасности мутантов DV использовали мышей AG129, поскольку мыши AG129 могут быть смертельно инфицированы DV2 с помощью всего лишь 1 PFU вируса.
[00144] Группа из 6 взрослых мышей AG129 получала 106 IU мутанта D2-89R внутрибрюшинно. Для контрольных групп равным количествам мышей на группу вводили внутрибрюшинной инъекцией 101, 102 и 103 PFU DV2. Вирусную нагрузку после инъекции DV2 и D2-89R количественно определяли с помощью ОТ-ПЦР.
[00145] У инфицированных DV2 групп мышей развивалась выявляемая виремия, и все погибали после инфицирования.
[00146] С другой стороны, мыши, подвергшиеся воздействию мутанта D2-89R, не имели выявляемой виремии, и все оставались живыми на протяжении эксперимента (15 суток) без каких-либо признаков болезни и изменения массы.
Пример 10
[00147] Электронно-плотный нуклеокапсид ZV состоит из белка С (капсида) и геномной РНК. Белок оболочки Е и белок мембраны (М) внедряются в липидный бислой (Russell et al., Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses, in Schlesinger, ed., The Togaviruses: Biology, Structure, Replication. New York: Academic; 1980:503-529; и Trent & Naeve, Biochemistry and Replication, in Monath, ed. St. Louis Encephalitis. Washington, DC: American Public Health Association; 1980 p. 159-199).
[00148] Геном ZV представляет собой однонитевую положительную смысловую молекулу РНК приблизительно 10-11 т. п. н., содержащую одну ORF, составляющую примерно 95% генома (Chambers et al., Ann Rev Microbiol 1990, 44:649-688). При инфицировании инфекционная вирусная РНК транслируется и процессируется в структурные белки и неструктурные белки (Bhamarapravati & Yokan: Live attenuated tetravalent vaccine, in Gubler & Kuno, eds., Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. Wallingford, CAB International, 1997, pp 367-377; и Falgout & Markoff, 1995, The family flaviviridae and its diseases, p. 47-66. in: JS Porterfield (ed.), Exotic Viral Infections. Chapman and Hall Medical, London, United Kingdom).
Пример 11
[00149] Инфекционный клон кДНК полного размера ZV MR766 из ATCC подвергали точечным мутациям, чтобы вызвать ограничение роста в клетках млекопитающего. Мутации подтверждали секвенированием ДНК. Мутантные геномные РНК ZV синтезировали путем транскрипции in vitro и клетки комара С6/36 трансфицировали мутантными вирусными РНК с помощью TransIT®-mRNA (Mirus Bio, Madison, WI), следуя инструкциям производителя. Мутантные ZV собирали через 7 суток после трансфекции. Кинетические показатели роста вируса определяли как в клетках млекопитающего (Vero), так и в клетках C6/36.
[00150] В геноме ZV индуцировали точечную мутацию, чтобы изменить последовательность вблизи сайта расщепления фурином следующим образом:
дикий тип: HHKKGEARRSRRAVTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHIKVENWIFRN (SEQ ID NO: 11);
мутант: HHKKGEARRRRRAVTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHIKVENWIFRN (SEQ ID NO: 12).
[00151] Единственное изменение серина на аргинин привело к снижению размножения в клетках Vero, тогда как размножение в клетках комара оставалось относительно неизменным по сравнению с контролем.
Пример 12
[00152] Следовали процедуре примера 11. Применяли ту же замену Ser на Arg, а также замену Glu (E) (между G и A) на His (H) для получения мутанта с двумя точечными мутациями.
[00153] Размножение в клетках человека было снижено до уровня, меньшего, чем наблюдалось у мутанта из примера 11, без влияния на репликацию в клетках насекомого.
Пример 13
[00154] Следовали процедуре примера 11. Первые 12 аминокислот последовательности, представленной в примере 11, заменяли на TTTGEHRRRKRS (SEQ ID NO: 13).
[00155] Размножение в клетках человека было снижено до уровня, меньшего, чем наблюдалось у мутанта из примера 11, без влияния на репликацию в клетках насекомого.
Пример 14
[00156] Следовали процедуре примера 11. Первые 22 аминокислоты последовательности, представленной в примере 11, заменяли на TTTGEHRRRKRSVALVPHVGMG (SEQ ID NO: 14).
[00157] Размножение в клетках человека было снижено до уровня, меньшего, чем наблюдалось у мутанта из примера 11, без влияния на репликацию в клетках насекомого.
Пример 15
[00158] Следовали процедуре примера 11. Первые 37 аминокислот последовательности, представленной в примере 11, заменяли на TTTGEHRRRKRSVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAW (SEQ ID NO: 15) для формирования мутанта ZV M2.
[00159] Размножение в клетках человека было снижено до уровня, меньшего, чем наблюдалось у мутанта из примера 11, без влияния на репликацию в клетках насекомого.
Пример 16
[00160] Для оценки защитной эффективности специфического для клеток млекопитающего ограничения роста представляющего интерес мутанта SV против заражения SV группы 6-недельных мышей AG129 (N = 6/группа) получали однократную внутрибрюшинную иммунизацию 105 инфекционными единицами (IU) мутанта M2 из примера 15. Контрольным мышам вводили внутрибрюшинной инъекцией 50 мкл PBS.
[00161] Две группы мышей не демонстрировали какой-либо видимой разницы в подвижности и поведения после иммунизации.
[00162] Через четырнадцать суток после иммунизации мышам, которым вводили инъекцией M2, и контрольным мышам AG129, которым вводили PBS, вводили внутрибрюшинной инъекцией 105 образующих бляшки единиц (PFU) (что составляет стократную инокуляцию LD50) SV дикого типа.
[00163] У контрольных мышей, которым вводили инъекцией PBS, инокулированных SV, развивалась виремия. Напротив, однократная иммунизация мутантом M2 обеспечивала полную защиту от заражения SV без обнаруживаемой виремии (< 100 копий/мл) в любой момент времени (N = 10).
[00164] Более того, все мыши, подвергшиеся воздействию M2, были здоровы на протяжении всего эксперимента, тогда как все мыши, подвергшиеся воздействию только PBS, умерли после заражения SV, см. фиг. 2.
Пример 17
[00165] Для оценки безопасности специфического для клеток млекопитающего ограничения роста у представляющего интерес мутанта SV группы 6-недельных мышей AG129 (N = 6/группа) получали однократную внутрибрюшинную иммунизацию 105 инфекционными единицами (IU) мутанта M2 или ZV дикого типа.
[00166] Мыши, подвергшиеся воздействию M2, были здоровы на протяжении всего эксперимента, тогда как все мыши, подвергшиеся воздействию только PBS, умерли после заражения SV, см. фиг. 3.
Пример 18
[00167] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса желтой лихорадки.
[00168] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.
[00169] Идентифицировали мутанта вируса желтой лихорадки, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.
Пример 19
[00170] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса калифорнийского энцефалита.
[00171] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.
[00172] Идентифицировали мутанта вируса калифорнийского энцефалита, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.
Пример 20
[00173] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса лихорадки долины Рифт.
[00174] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.
[00175] Идентифицировали мутанта вируса лихорадки долины Рифт, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.
Пример 21
[00176] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса клещевого энцефалита.
[00177] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.
[00178] Идентифицировали мутанта вируса клещевого энцефалита, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.
Пример 22
[00179] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса Западного Нила.
[00180] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.
[00181] Идентифицировали мутанта вируса Западного Нила, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.
Пример 23
[00182] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса энцефалоза лошадей.
[00183] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.
[00184] Идентифицировали мутанта вируса энцефалоза лошадей, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.
Пример 24
[00185] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса колорадской клещевой лихорадки.
[00186] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.
[00187] Идентифицировали мутанта вируса колорадской клещевой лихорадки, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.
Пример 25
[00188] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса чикунгуньи.
[00189] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.
[00190] Идентифицировали мутанта вируса чикунгуньи, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.
Пример 26
[00191] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса африканской чумы свиней.
[00192] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.
[00193] Идентифицировали мутанта вируса африканской чумы свиней, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.
Пример 27
[00194] Взрослых макаков резусов распределяли на экспериментальную и контрольную группы по 4-6 животных на группу. Животные экспериментальной группы получали различные дозы (105-1010 IU) мутанта D2-89R из примера 2. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем PBS.
[00195] Животных содержали в течение 4 недель, на протяжении которых животных тестировали на предмет циркулирующего антитела против вируса денге, вирусной нагрузки и клеточной иммунофлуоресценции для выявления наличия, степени и количества вируса и ответа на него хозяина, а также для мониторинга любых симптомов инфекции вируса денге, таких как лихорадка и потеря массы.
[00196] Затем животных заражали DV2 дикого типа и проводили мониторинг на наличие симптомов, таких как лихорадка и потеря массы, а также серологических параметров, таких как вирусная нагрузка и антитело против денге.
[00197] У контрольных животных проявляются симптомы инфекции вируса денге, тогда как у обезьян, которые получали представляющий интерес мутант, симптомы отсутствуют.
Пример 28
[00198] Взрослых макаков резусов распределяли на экспериментальную и контрольную группы по 4-6 животных на группу. Животные экспериментальной группы получали различные дозы (105-1010 IU) мутанта DV1 из примера 4. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем PBS.
[00199] Животных содержали в течение 4 недель, на протяжении которых животных тестировали на предмет циркулирующего антитела против вируса денге, вирусной нагрузки и клеточной иммунофлуоресценции для выявления наличия, степени и количества вируса и ответа на него хозяина, а также для мониторинга любых симптомов инфекции вируса денге, таких как лихорадка и потеря массы.
[00200] Затем животных заражали DV1 дикого типа и проводили мониторинг на наличие симптомов, таких как лихорадка и потеря массы, а также серологических параметров, таких как вирусная нагрузка и антитело против денге.
[00201] У контрольных животных проявляются симптомы инфекции вируса денге, тогда как у обезьян, которые получали представляющий интерес мутант, симптомы отсутствуют.
Пример 29
[00202] Взрослых макаков резусов распределяли на две экспериментальные и две контрольные группы по 4-6 животных на группу. Животные экспериментальной группы получали различные дозы (105-1010 IU) мутанта вируса Зика из примера 14. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем PBS.
[00203] Животных содержали в течение 4 недель, на протяжении которых животных тестировали на предмет циркулирующего антитела против вируса Зика, вирусной нагрузки и клеточной иммунофлуоресценции для выявления наличия, степени, количества вируса и ответа на него хозяина, а также для мониторинга любых симптомов инфекции вируса Зика, таких как лихорадка, виремия, сыпь и потеря массы.
[00204] Затем животных заражали ZV дикого типа. Пару экспериментальной группы и контрольной группы заражали африканским штаммом ZV дикого типа, а другую пару экспериментальной группы и контрольной группы заражали азиатским штаммом ZV дикого типа. Проводили мониторинг животных на предмет симптомов, таких как, лихорадка, сыпь и потеря массы, а также серологических параметров, таких как вирусная нагрузка и антитело против вируса Зика.
[00205] У контрольных животных проявляются симптомы инфекции вируса Зика, тогда как у обезьян, которые получали представляющий интерес мутант, симптомы отсутствуют.
Пример 30
[00206] Взрослых макаков резусов распределяли на две экспериментальные и две контрольные группы по 4-6 животных на группу. Животные экспериментальной группы получали различные дозы (105-1010 IU) мутанта вируса Зика из примера 15. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем PBS.
[00207] Животных содержали в течение 4 недель, на протяжении которых животных тестировали на предмет циркулирующего антитела против вируса Зика, вирусной нагрузки и клеточной иммунофлуоресценции для выявления наличия, степени, количества вируса и ответа на него хозяина, а также для мониторинга любых симптомов инфекции вируса Зика, таких как лихорадка, виремия, сыпь и потеря массы.
[00208] Затем животных заражали ZV дикого типа. Пару экспериментальной группы и контрольной группы заражали африканским штаммом ZV дикого типа, а другую пару экспериментальной группы и контрольной группы заражали азиатским штаммом ZV дикого типа. Проводили мониторинг животных на предмет симптомов, таких как, лихорадка, сыпь и потеря массы, а также серологических параметров, таких как вирусная нагрузка и антитело против вируса Зика.
[00209] У контрольных животных проявляются симптомы инфекции вируса Зика, тогда как у обезьян, которые получали представляющий интерес мутант, симптомы отсутствуют.
[00210] Все ссылочные материалы, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном своем объеме.
[00211] Следует учитывать, что различные изменения и модификации описанных в настоящем документе предпочтительных вариантов осуществления будут очевидны для специалистов в данной области. Такие изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от сути и объема настоящего изобретения и без уменьшения его предполагаемых преимуществ. Поэтому предполагается, что такие изменения и модификации будут охватываться прилагаемой формулой изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ТЕНДЖЕН БИОМЕДИКАЛ КОМПАНИ
<120> СПЕЦИФИЧЕСКИЙ В ОТНОШЕНИИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО АРБОВИРУС С ДЕФЕКТОМ
РОСТА
<130> 14520201
<150> US 62/556,892
<151> 2017-11-09
<160> 17
<170> Патентная версия 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> вирус денге
<220>
<221> иной признак
<223> Сайт расщепления фурином DV в белке prM
<400> 1
Arg Glu Lys Arg
1
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> вирус Зика
<220>
<221> иной признак
<223> последовательность prM перед сайтом распознавания фурина ZV
включительно
<400> 2
His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 166
<212> PRT
<213> вирус денге
<220>
<221> иной признак
<223> prM DV2 (DENV2) дикого типа
<400> 3
Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn
20 25 30
Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr
35 40 45
Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile
50 55 60
Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val
85 90 95
Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser
100 105 110
Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu
115 120 125
Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile
130 135 140
Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala
145 150 155 160
Val Ala Pro Ser Met Thr
165
<210> 4
<211> 166
<212> PRT
<213> вирус денге
<220>
<221> иной признак
<223> Мутантный DENV2 (D2-89R)
<400> 4
Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn
20 25 30
Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr
35 40 45
Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile
50 55 60
Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu Val
85 90 95
Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser
100 105 110
Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu
115 120 125
Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile
130 135 140
Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala
145 150 155 160
Val Ala Pro Ser Met Thr
165
<210> 5
<211> 166
<212> PRT
<213> вирус денге
<220>
<221> иной признак
<223> Мутантный DENV2 (D2-89V)
<400> 5
Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn
20 25 30
Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr
35 40 45
Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile
50 55 60
Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Val Lys Arg Ser Val Ala Leu Val
85 90 95
Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser
100 105 110
Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu
115 120 125
Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile
130 135 140
Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala
145 150 155 160
Val Ala Pro Ser Met Thr
165
<210> 6
<211> 166
<212> PRT
<213> вирус денге
<220>
<221> иной признак
<223> Мутантный DENV2 (D2-89S)
<400> 6
Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn
20 25 30
Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr
35 40 45
Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile
50 55 60
Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Ser Lys Arg Ser Val Ala Leu Val
85 90 95
Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser
100 105 110
Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu
115 120 125
Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile
130 135 140
Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala
145 150 155 160
Val Ala Pro Ser Met Thr
165
<210> 7
<211> 166
<212> PRT
<213> вирус денге
<220>
<221> иной признак
<223> Мутантный DENV2 (D2-89G)
<400> 7
Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn
20 25 30
Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr
35 40 45
Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile
50 55 60
Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Gly Lys Arg Ser Val Ala Leu Val
85 90 95
Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser
100 105 110
Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu
115 120 125
Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile
130 135 140
Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala
145 150 155 160
Val Ala Pro Ser Met Thr
165
<210> 8
<211> 166
<212> PRT
<213> вирус денге
<220>
<221> иной признак
<223> аминокислотная последовательность prM дикого типа штамма NGC
DV2
<400> 8
Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn
20 25 30
Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr
35 40 45
Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile
50 55 60
Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val
85 90 95
Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser
100 105 110
Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu
115 120 125
Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile
130 135 140
Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala
145 150 155 160
Val Ala Pro Ser Met Thr
165
<210> 9
<211> 168
<212> PRT
<213> вирус Зика
<220>
<221> иной признак
<223> аминокислотная последовательность prM дикого типа
<400> 9
Ala Glu Ile Thr Arg Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg
1 5 10 15
Ser Asp Ala Gly Lys Ala Ile Ser Phe Ala Thr Thr Leu Gly Val Asn
20 25 30
Lys Cys His Val Gln Ile Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp Ala Thr
35 40 45
Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp
50 55 60
Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr
85 90 95
Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp
100 105 110
Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Lys Val Glu Asn Trp
115 120 125
Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ile Ala Trp
130 135 140
Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile
145 150 155 160
Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser
165
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> вирус Зика
<220>
<221> иной признак
<223> сайт тетрапептида
<400> 10
Arg Ser Arg Arg
1
<210> 11
<211> 50
<212> PRT
<213> вирус Зика
<220>
<221> иной признак
<223> Дикий тип
<400> 11
His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu
1 5 10 15
Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu
20 25 30
Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Ile Lys Val Glu Asn Trp Ile Phe
35 40 45
Arg Asn
50
<210> 12
<211> 50
<212> PRT
<213> вирус Зика
<220>
<221> иной признак
<223> Мутант
<400> 12
His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Arg Arg Arg Ala Val Thr Leu
1 5 10 15
Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu
20 25 30
Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Ile Lys Val Glu Asn Trp Ile Phe
35 40 45
Arg Asn
50
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> вирус Зика
<220>
<221> иной признак
<223> Мутант
<400> 13
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> вирус Зика
<220>
<221> иной признак
<223> Мутант
<400> 14
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu Val
1 5 10 15
Pro His Val Gly Met Gly
20
<210> 15
<211> 37
<212> PRT
<213> вирус Зика
<220>
<221> иной признак
<223> ZV M2 Мутант
<400> 15
Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu Val
1 5 10 15
Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser
20 25 30
Ser Glu Gly Ala Trp
35
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: консенсусный тетрапептид
<220>
<221> иной признак
<222> (2)..(2)
<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе
аминокислоту
<220>
<221> иной признак
<222> (3)..(3)
<223> X представляет собой K или R
<400> 16
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 17
<211> 51
<212> PRT
<213> вирус денге
<220>
<221> иной признак
<223> Мутант DV1
<400> 17
Cys Ser Gln Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu
1 5 10 15
Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met
20 25 30
Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile
35 40 45
Leu Arg His
50
<---
Claims (21)
1. Частица арбовируса для выработки иммунного ответа к указанному арбовирусу, включающая в себя мутантный арбовирус, который реплицируется в клетках насекомого и не реплицируется в клетках млекопитающего, содержащий молекулярно измененный тетрапептидный сайт расщепления фурином в полипротеине-предшественнике и необязательно изменение в первом удлинении из аминокислот, вышележащих по отношению к указанному сайту, и/или изменение во втором удлинении из аминокислот, нижележащих по отношению к указанному сайту.
2. Частица по п. 1, в которой указанный сайт включает в себя консенсусную последовательность Arg-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 16).
3. Частица по п. 2, в которой X включает в себя Arg.
4. Частица по п. 2, в которой указанное первое удлинение содержит восемь аминокислот рядом с указанным сайтом.
5. Частица по п. 2, включающая в себя указанное изменение в указанном первом удлинении.
6. Частица по п. 2, включающая в себя указанное изменение в указанном втором удлинении.
7. Частица по п. 1, в которой указанный полипротеин включает в себя prM.
8. Частица по п. 1, в которой указанный полипротеин включает в себя prE2.
9. Частица по п. 1, включающая в себя вирус денге (DV).
10. Частица по п. 1, включающая в себя вирус Зика (ZV).
11. Частица по п. 1, включающая в себя указанное изменение в указанном первом удлинении из аминокислот, вышележащих по отношению к указанному сайту, и/или указанное изменение в указанном втором удлинении из аминокислот, нижележащих по отношению к указанному сайту.
12. Композиция для выработки иммунного ответа к указанному арбовирусу, содержащая частицу по п. 1 и фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель или вспомогательное средство.
13. Клетка насекомого, включающая частицу по п. 1, для продуцирования указанной частицы.
14. Клетка по п. 13, при этом указанное насекомое включает в себя членистоногое.
15. Клетка по п. 13, при этом указанное насекомое включает в себя клеща или комара.
16. Клетка млекопитающего для вызывания иммунного ответа, включающая в себя частицу по п. 1.
17. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка экспрессирует антиген DV.
18. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка экспрессирует антиген DV на поверхности указанной клетки.
19. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка экспрессирует антиген ZV.
20. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка экспрессирует антиген ZV на поверхности указанной клетки.
21. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка млекопитающего включает клетку человека.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762556892P | 2017-09-11 | 2017-09-11 | |
US62/556,892 | 2017-09-11 | ||
PCT/US2018/050341 WO2019051445A1 (en) | 2017-09-11 | 2018-09-11 | DEFINING GROWTH ARBOVIRUS SPECIFIC TO A MAMMAL |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020113385A RU2020113385A (ru) | 2021-10-18 |
RU2020113385A3 RU2020113385A3 (ru) | 2021-12-08 |
RU2811686C2 true RU2811686C2 (ru) | 2024-01-16 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KEELAPANG, POONSOOK, et al. "Alterations of pr-M cleavage and virus export in pr-M ;function chimeric dengue viruses." Journal of virology 78.5 (2004): 2367-2381. https://www.researchgate.net/publication/8693582_Alterations_of_pr-M_Cleavage_and_Virus_Export_in_pr-M_Junction_Chimeric_Dengue_Viruses). Konishi, Eiji, et al, Generation and characterization of a mammalian cell line continuously expressing Japanese encephalitis virus subviral particles., Journal of virology 75.5 (2001): 2204-2212, 31.03.2001, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC114804/. КИБИРЕВ В. К. и др. ФУРИН И ЕГО БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ, The Ukrainian Biochemical Journal N 6 ноябрь-декабрь 2007, реферат, http://ubj.biochemistry.org.ua/index.php/ru/journal-archive/2007/6-hfghs/4478-sp-763. ДУЕВА Е. В., Разработка низкомолекулярных ингибиторов репродукции переносимых клещами флавивирусов, диссертация, Москва - 2016, стр. 19, http://www.chem.msu.ru/rus/theses/2016/2016-10-17-dueva/fulltext.pdf. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7050031B2 (ja) | ワクチンにおけるデングウイルスキメラおよび組成物 | |
Kinney et al. | Construction of infectious cDNA clones for dengue 2 virus: strain 16681 and its attenuated vaccine derivative, strain PDK-53 | |
JP5538729B2 (ja) | 偽感染性フラビウイルスおよびそれらの使用 | |
JP3681358B2 (ja) | キメラおよび/または増殖制限されたフラビウイルス | |
US20180340011A1 (en) | Flavivirus Vaccine | |
Chang et al. | Recent advancement in flavivirus vaccine development | |
KR101150584B1 (ko) | 웨스트 나일 바이러스 백신 | |
KR20180137514A (ko) | 어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스에 대한 백신접종 조성물 및 방법 | |
JP2003523189A (ja) | 無毒性の免疫原性フラビウイルスキメラ | |
JP2013247958A (ja) | 西ナイルウイルスにより引き起こされる疾患を予防するために生ウイルスワクチン中に用いるための西ナイルウイルスおよびデングウイルスキメラの構築 | |
EP2550292B1 (en) | Flavivirus host range mutations and uses thereof | |
RU2811686C2 (ru) | Специфический в отношении млекопитающего арбовирус с дефектом роста | |
US12098393B2 (en) | Mammal-specific growth-defective arbovirus | |
CN111343998B (zh) | 哺乳动物特异性的生长缺陷的虫媒病毒 | |
CA2400182C (en) | Full-length infectious cdna clones of tick borne flavivirus | |
Ma | Advances in dengue virus vaccines and therapeutic monoclonal antibodies | |
Jayadev et al. | Genomics in Pathogenicity and Diversity of Flaviviruses |