KR101150584B1

KR101150584B1 - 웨스트 나일 바이러스 백신

Info

Publication number: KR101150584B1
Application number: KR1020057008744A
Authority: KR
Inventors: 주안 아로요; 찰리스 엠. 밀러; 토마스 피이. 모나쓰; 존 아브라함 카탈로니안
Original assignee: 사노피 파스테르 바이오로직스 씨오
Priority date: 2002-11-15
Filing date: 2003-11-13
Publication date: 2012-06-27
Also published as: RU2376374C2; WO2004045529A3; US20050053624A1; ZA200503871B; EP1575979B1; AU2003290985A1; JP2006506092A; ATE452900T1; BR0316346A; US7507415B2; RU2005118419A; BRPI0316346B1; MXPA05005140A; CA2505942A1; KR20050072143A; HK1083192A1; EP1575979A4; US20100086564A1; IL202978A0; US8088391B2

Abstract

본 발명은 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)에 대한 백신에 관한 것으로, 웨스트 나일 바이러스의 프리-멤브레인 단백질(pre-membrane protein)과 외피 단백질(envelope protein) 및 황열 바이러스의 캡시드와 비구조 단백질(non-structural protein)을 암호화하는 서열들을 포함하는 핵산분자(nucleic acid molecules) 및 상기 핵산분자에 의해 암호화된 키메라 플라비바이러스(chimeric flaviviruses)를 제공하여 웨스트 나일 바이러스의 감염을 예방 및 치료할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

웨스트 나일 바이러스, 황열 바이러스, 백신, 키메라 플라비바이러스

Description

웨스트 나일 바이러스 백신{WEST NILE VIRUS VACCINE}

본 발명은 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)에 대한 백신에 관한 것이다.

웨스트 나일(West Nile: WN) 바이러스는 북반구에서 최초로 발견된 이래로 북미를 횡단하여 급속히 전파되어 왔다. 첫번째 케이스는 1999년 뉴욕지역에서 진단되었고, 2002년까지 인간의 사망율은 150건 이상으로 증가되었으며, 상기 바이러스의 전파는 멀리 캘리포니아에 다다를 때까지 계속되었다. 감염된/죽은 새의 등장은 질병이 발생한 지리학상의 지역(geographical area)에 대규모의 감염된 모기가 존재한다는 것을 시사한다. 현재까지, 웨스트 나일 바이러스에 대한 효과적인 약물치료는 없었으며, 감시법 및 예방법은 인간 감염의 경우의 수에 커다란 영향을 주지 못했다. 따라서, 상기 바이러스가 남미 대륙으로 전파될 위험 뿐만 아니라 개발도상국에 널리 퍼질 위험 또한 매우 높다.

웨스트 나일 바이러스는 플라비바이러스과(flavivirus family)의 한 종류이다. 이러한 바이러스들은 작고, 외피에 싸여져 있으며, 전세계의 많은 의학 및 수의학 분야에서 관심의 대상이 되고 있는 양성가닥 RNA 바이러스(positive-strand RNA virus)이다. 웨스트 나일 바이러스 외에 플라비바이러스에 속하는 바이러스의 예로는 황열 바이러스(Yellow Fever virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese Encephalitis virus), 및 뎅기 바이러스(Dengue virus)가 있다.

플라비바이러스 단백질(Flavivirus protein)은 다단백질(polyprotein)을 생성하기 위해 하나의 긴 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 번역함으로써 생산되는데, 이 때 상기 다단백질은 성숙한 바이러스 단백질(mature viral protein)을 생성하기 위하여 기주의 단백질 분해효소와 바이러스의 단백질 분해효소의 결합에 의한 복잡한 일련의 번역후 단백질 가수분해 분열(post-translational proteolytic cleavages)을 겪게 된다(Amberg et al., J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Rice, "Flaviviridae," In Virology, Fields(ed.), Raven-Lippincott, New York, 1995, Volume I, p.937). 바이러스 구조 단백질(viral structural protein)은 C-prM-E 순의 다단백질 내에 배열되는데, 이 때 "C"는 캡시드(capsid)를, "prM(또는 pre-membrane)"은 바이러스 외피-경계막 단백질(viral envelope-bound M(membrane) protein)의 전구체를, 그리고 "E"는 외피 단백질(envelope protein)을 의미한다. 비구조 단백질(non-structural proteins)(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 및 NS5)은 다단백질의 C-말단 부위에 위치하는 반면, 이러한 단백질들은 다단백질의 N-말단 부위에 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 웨스트 나일 바이러스의 프리-멤브레인 단백질(pre-membrane protein)과 외피 단백질(envelope protein) 및 황열 바이러스의 캡시드와 비구조 단백질(non-structural protein)을 암호화하는 서열들을 포함하는 핵산분자(nucleic acid molecules)를 제공한다. 이러한 키메라들(chimeras)의 상기 웨스트 나일 바이러스의 프리-멤브레인 또는 외피 단백질들은 하나 또는 그 이상의 어테뉴에이팅 돌연변이(attenuating mutation)를 포함하는데, 예를 들면 외피 단백질의 107번, 316번, 및/또는 440번 위치에서 아미노산 치환이 될 수 있다. 구체적인 예로서, 107번 위치에서의 아미노산 치환은 류신이 페닐알라닌(또는 그의 보존성 아미노산(conservative amino acid))으로 될 수 있고; 316번 위치에서의 아미노산 치환은 알라닌이 발린(또는 그의 보존성 아미노산)으로 될 수 있으며; 440번 위치에서의 아미노산 치환은 리신이 아르기닌(또는 그의 보존성 아미노산)으로 될 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 개시된 핵산분자에 의해 암호화된 키메라 플라비바이러스(chimeric flaviviruses) 뿐만 아니라 그러한 키메라 플라비바이러스(chimeric flaviviruses)를 대상자에게 투여함으로써 웨스트 나일 바이러스에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 그러한 키메라 플라비바이러스의 예방접종 방법(vaccination method)으로서의 용도 및 그러한 방법으로의 사용을 위한 약물 제조방법으로의 용도를 포함한다. 상기에서 언급한 방법들은 웨스트 나일 바이러스에 감염된 대상자들 뿐만 아니라 웨스트 나일 바이러스에 감염되진 않았지만 발병 위험에 있는 대상자들에게도 적용 가능하다. 본 발명은 또한 상기에서 언급한 키메라 플라비바이러스의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 몇 가지 이점들을 제공한다. 예를 들면, 아래에서 좀 더 자세히 논의되겠지만, 본 발명 바이러스들의 어테뉴에이팅 돌연변이(attenuating mutation)는 뉴로비룰런스(neurovirulence)는 감소시키지만, 반대로 효과적인 면역 반응을 유도하는 바이러스의 능력에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명의 바이러스들은 웨스트 나일 바이러스 감염을 효과적이면서도 안전하게 예방 및 치료할 수 있는 길을 제공한다.

본 발명의 다른 특징 및 이점들은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위로부터 더욱 명백해질 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 웨스트 나일(West Nile(WN)) 바이러스 감염을 예방 및 치료하려는 용도로의 백신 및 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 방법은 프리-멤브레인 단백질(pre-membrane protein)과 외피 단백질이 웨스트 나일 바이러스의 것으로 대체된 황열 바이러스로 구성되는, 살아있고, 약화된 키메라 플라비바이러스(chimeric flavivirus)를 대상자에게 예방접종하는 것에 관계한다. 본 발명 키메라의 웨스트 나일 바이러스 단백질은 하나 또는 그 이상의 어테뉴에이팅 돌연변이(attenuating mutation)를 포함하는데, 이에 대해서는 아래에서 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 키메라 플라비바이러스(chimeric flaviviruses)를 구축하고 투여하는 일반적인 방법은, 예를 들면 미국 특허출원 일련번호 09/007,664, 09/121,587, 및 09/452,638; 국제출원 PCT/US98/03894(WO 98/37911) 및 PCT/US00/32821(WO 01/39812); 및 Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999에 상세히 기재되어 있으며, 이들은 각각 본 명세서에 전부 참고로 포함되어 있다. 하기에서 더욱 논의되는 바와 같이, 이 방법들은 본 발명의 용도를 위해 변형되는데, 하나 또는 그 이상의 어테뉴에이팅 돌연변이(attenuating mutation)를 삽입된 웨스트 나일 바이러스의 서열 안으로 도입하는 단계를 포함한다. 본 발명에서 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있는 방법들은 또한 PCT/US03/01319(WO 03/060088 A2)에 기재되어 있으며, 이 또한 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 키메라 바이러스(chimeric virus)의 한 예를 들면, 어테뉴에이팅 돌연변이(attenuating mutation)는 웨스트 나일 바이러스 외피 단백질의 107번, 316번, 또는 440번(또는 그것들의 조합) 위치 부위에 있다. 따라서, 상기 돌연변이는, 예를 들면 웨스트 나일 외피 단백질의 아미노산 102-112, 311-321, 및/또는 435-445 중의 하나 또는 그 이상에서 될 수 있다. 구체적인 예를 들면, 참고로서 웨스트 나일 바이러스 균주인 NY99-플라밍고 382-99(GenBank Accession Number AF196835)의 서열을 이용할 경우, 107번 위치의 리신은 페닐알라닌으로 대체될 수 있고, 316번 위치의 알라닌은 발린으로 대체될 수 있으며, 및/또는 440번 위치의 리신은 아르기닌으로 대체될 수 있다. 상기한 아미노산 외에, 다른 아미노산을 이용한 치환도 가능한데, 예를 들면 상기한 아미노산들로부터 보존성 변화(conservative change)를 통해 얻어진 아미노산을 이용할 수 있다.

보존성 치환(conservative substitutions)은 전형적으로 하기 군내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 및 류신; 아스파르트산, 글루탐산,아스파라긴, 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 구체적인 예를 들면, 본 발명의 키메라(chimera)는 상기한 각각의 구체적인 치환을 포함한다. 또한, 아래에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 추가적인 잔기(예를 들면, 138번, 176번, 및/또는 280번 위치)가 본 발명의 키메라 바이러스에서 변형될 수 있다.

본 발명의 백신은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 방법으로 일정량 투여될 수 있다. 예를 들면, 백신은 상기 키메라 바이러스(chimeric virus)로 감염된 세포 배양액(cell culture)으로부터 얻은 분비액(fluid)의 형태로 제제화하여 투여될 수 있다. 상기의 살아있고, 약화된 키메라 바이러스(attenuated chimeric virus)는 예를 들면, 피하, 근육내, 또는 피부내 경로를 통해 투여하기 위해, 0.1 내지 10 ml의 도스 부피(dose volume) 내에 10²~ 10⁸, 예를 들면 10⁶~10⁷의 감염성 단위(infectious units)(예를 들면, 플라크-형성 단위(pfu) 또는 조직 배양 감염량(tissue culture infectious doses))을 함유하는 살균 수용액의 형태로 제제화 될 수 있다. 키메라의 적절한 투여량의 선택은 본 발명의 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있으며, 이러한 투여량은 수많은 요소들, 예를 들면, 상기 키메라를 투여하려는 대상자의 크기 및 일반적인 건강상태에 따라 다양하게 변화될 수 있다. 대상자는 한 번 접종될 수 있으며, 필요한 경우 후속의 면역조치를 행할 수 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 백신은 웨스트 나일 바이러스의 감염 위험에 있는 대상자에게 제1차 예방제로 투여될 수 있다. 백신은 또한 감염 바이러스에 대한 면역 반응을 촉진시킴으로써 웨스트 나일 바이러스에 감염된 대상자를 치료하기 위한 제2차 약제로도 사용될 수 있다. 또한, 비록 필요하지 않더라도, 상기 키메라 웨스트 나일 바이러스 백신의 면역원성(immunogenicity)을 강화하기 위해 보조제가 사용될 수 있다. 적절한 보조제의 선택은 본 발명의 당업자에 의해 손쉽게 수행될 수 있다.

본 발명은 부분적으로는 하기의 실험결과에 기초한다.

실험 결과

웨스트 나일/황열 키메라 백신(West Nile/Yellow Fever chimeric vaccine)의 안전 프로파일(safety profile)을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 상기 외피 단백질 내의 어테뉴에이팅 점 돌연변이(attenuating point mutation)가 뉴로비룰런스(neurovirulence)를 감소시키는지의 여부를 조사하였다. 하기에서 더욱 상세히 기재하는 바와 같이, 본 발명자들은 웨스트 나일 바이러스의 마우스 뉴로인베이시브니스(the mouse neuroinvasiveness)가 결여되어 있고, 마우스와 원숭이 모델 모두에서 황열 백신 균주인 YF 17D 보다 덜 뉴로비룰런트(neurovirulent)한 YF/WN 키메라를 구축하였다. 하기의 내용은 외피 단백질 변이유발(envelope protein mutagenesis), 및 마우스와 레서스(rhesus) 모델에서의 상기 바이러스 및 관련 바이러스들의 안전성, 면역원성, 및 유효성 평가에 대한 설명이다.

재료 및 방법

YF/WN 키메라 구조체 및 분자적 과정(YF/WN chimeric constructs and molecular procedures)

키메라 플라비바이러스는 ChimeriVax^TM 기술을 이용하여 구축되었는데, 상기 기술은 이전에 미국 특허출원 일련번호 09/007,664, 09/121,587, 및 09/452,638; 국제출원 PCT/US98/03894(WO 98/37911) 및 PCT/US0032821(WO 01/39802); 및 Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999)에 기재된 투-플라스미드 시스템(two-plasmid system)의 이용을 수반한다. 상기의 투-플라스미드 시스템(two-plasmid system)은 대장균 내에서 플라스미드 안전성을 제공하며, 복제된 황열 백본(YF backbone)을 조작하여 YF prM 및 E 유전자들을 플라비바이러스 타겟(flavivirus target)의 그것들로 대체하는 것을 용이하게 하는 적절한 방법을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 웨스트 나일(WN) 바이러스의 prM 유전자 및 E 유전자는 진뱅크 등록번호 AF196835의 서열인 WNV 플라밍고 분리서열(flamingo isolate) 383-99로부터 복제되었다. 바이러스 prME cDNA는 RT-PCR(XL-PCR Kit, Perkin Elmer)에 의해 준비하였다. WN prM 유전자의 5' 말단(5' end)은 Pwo 중합효소(Roche)을 이용한 오버랩-신장 PCR(overlap-extension PCR)에 의해 YF 17D 캡시드 유전자의 3' 말단에서 정확히 복제되었다. 웨스트 나일 바이러스의 prME 부위를 YF 17D 백본(backbone) 속으로 복제하는데 있어서 이러한 투-플라스미드 시스템을 이용하는 것은, 이미 Arroyo et al., Trends in Molecular Medicine 7(8):350-354, 2001에서 개시된 바 있다. 유일한 제한부위 Bsp EI 및 Eag I를 제조하기 위해, 침묵 돌연변이(silent mutation)가 prM 및 E 서열 안으로 도입되었다. 이러한 효소들로 상기 두 개의 플라스미드를 절단함으로써 DNA 단편들이 생성되었고, 상기 단편들은 완전장 키메라 cDNA(full-length chimeric cDNA)를 생산하기 위해 겔 정제된 후 생체외에서 연결되었다. 상기 cDNA는 SP6 중합효소(Epicentre)에 의한 생체외 전사(in vitro transcription)를 용이하게 하기 위해 Xho I를 이용하여 선형화(linearization) 되었다. 그 RNA 산물은 바이러스의 RNA 번역 및 복제가 가능한 진핵세포주 속으로 도입되었다.

야생형 WN prME를 코딩하는 오리지날 키메라의 변이체를 생산하기 위해, 다양한 E 유전자 코돈 안으로 점 돌연변이(point mutations)가 도입되었다. 표 1은 돌연변이의 타겟 위치 및 하기의 YF/WN 키메라를 제조하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 염기서열을 보여준다. 점 돌연변이는 그 결과 얻어진 바이러스의 외피 단백질을 시퀀싱함으로써 확인되었다. 시퀀싱을 위한 바이러스 cDNA 템플릿(template)을 바이러스 상등액(Trizol LS, Invitrogen)으로부터 추출된 RNA로부터 준비한 후, 합성 프라이머(Invitrogen)와 CEQ 2000 시퀀서(Beckman)를 이용하여 RT-PCR 및 시퀀싱을 수행하였다.

[표 1]

약화된 돌연변이 황열/웨스트 나일 바이러스를 제조하기 위한 부위-돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 위한 프라이머. 새로운 아미노산을 도입한 뉴클레오티드의 변화는 굵은 글씨로 표시된다. 도입된 침묵 제한부위는 밑줄로 표시된다. 별표로 표시된 프라이머는 단편들을 서브 클로닝하는데 사용된 클로닝 프라이머이다. 하나는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 반면 다른 하나는 그렇지 않다.

바이러스 및 세포주(Viruses and cell lines)

Vero E6 세포주(ATCC, CIDVR UNASS Medical Center Worcester, MA) 속으로의 RNA 형질전환(계대 1 바이러스(passage 1 virus), P1)에 의해 키메라 YF/WN(예를 들면, ChimeriVax^TM-West Nile) 바이러스를 제조하였다. RMS(research master seeds)는 Vero E6 세포 내에서의 추가적인 증폭(0.001 MOI에서 계대(passage) 2 또는 3)에 의해 준비되었다. Vero E6 세포는 MEM(Invitrogen), 10% FBS(Hyclone)에서 유지되었다. 백신 제조를 위한 PMS(preMaster Seeds)의 준비는 무혈청 Vero(SF-Vero) 세포주(ATCC, Baxter/ImmunoOrth, Austria) 속으로의 RNA 형질전환에 의해 시작되었으며, 그 후 P2 PMS 또는 preMaster Seed를 생산하기 위해 동일한 SF-Vero 세포주 내에 증폭계대(amplication passage)를 하였다. 상기 SF-Vero 세포주는 무혈청, 무단백질 배지인 VT-Media(Baxter/Immuno, Austria)에서 증식되고 유지되었다. 사용된 야생형 WN 바이러스는, 마스터 바이러스 뱅크(Master Virus Bank)를 생산하기 위해 Vero E6 세포 내에 2번의 추가 계대를 한 CDC, Fort Collins, CO(CDC stock designation B82332W)로부터 얻은 NY-99 균주(NY 99-35262-11 플라밍고 분리주(flamingo isolate))였다. YF-17D는 그 동결건조 산물의 재형성 후 또는 Vero E6 세포(ATCC, Acambis Inc., Cambridge, MA) 내에 한 번의 계대(passage) 후 본 발명에서 사용된 시판 백신(YF-VAX®, Aventis Pasteur, Swiftwater, PA)이다.

어른쥐 및 새끼쥐(adult and suckling mice)에서의 마우스 뉴로인베이시브니스(neuroinvasiveness) 및 뉴로비룰런스(neurovirulence); 면역원성 및 접종 역가(challenge titer) 탐지 방법(접종 과정, 플라크 분석, PRNT)

마우스는 뉴로인베이전 테스트(neuroinvasion tests)를 위하여 또는 접종(challenge) 동안 야생형 WN 바이러스로 IP(intraperitoneally) 접종되었다. IP 접종량(inoculation volume)은 100-200 μl로 25G 시린지로 투여되었다. 어른쥐 및 새끼쥐는 뉴로비룰런스 테스팅(neurovirulence testing)을 위해 IC(intracerebrally) 접종되었다. IC 투여를 위해, 20 μl의 접종량(inoculation volume)이 쥐 뇌의 전두엽의 오른편에 투여되었다. 바이러스는 M199에서 HEPES 버퍼(Invitrogen) 및 20% FBS(Hyclone)로 희석되었다. Vero cells 에서의 플라크 분석(plaque assay)은 바이러스 이노큘리(virus inoculi)의 역가(titer)를 검증하기 위해 수행되었다(Monath et al., J. Virol. 74(4):1742-1751, 2000).

마우스는 웨스트 나일 바이러스 접종 후 뉴로인베이전(neuroinvasion), 뉴로비룰런스(neurovirulence), 또는 생존율을 결정하기 위해 21일의 기간동안 관찰되었다. 질병율(morbidity) 및 사망율(mortality)은 관찰한 후 점수를 기록하였으며, 생존한 쥐는 안락사시켰다.

중화항체가(neutralizing antibody titer)를 결정하기 위해, 마우스를 안와후 경로(retroorbital route)를 통해 내출혈시킨 후, 원심분리에 의해 혈청을 분리하였다. 혈청 내 중화항체가를 측정하기 위해 PRNT(plaque reduction neutralization assays)를 사용하였다.

레서스 뉴로비룰런스 조사(Rhesus neurovirulence study)

WHO 가이드라인에 기재된 바와 같이, YF/WN 키메라의 안전성을 결정하기 위하여, 황열 백신(YF vaccines)의 뉴로비룰런스(neurovirulence)를 결정하기 위한 레서스 원숭이에 대한 테스트를 실시하였다(Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000). 동물들을 IC 접종한 후, 플라크 분석 기술(plaque assay technique)을 이용하여 바이러스혈증 레벨(viremia levels)을 측정하기 위해 날마다 혈액샘플을 채취하였다. 열 또는 떨림과 같은 질병 관련 증후의 신호를 보기 위해 날마다 동물들을 관찰하였다. 동물들은 감염 후 30일째에 안락사시킨 다음, 조직병리학 실험을 위해 뇌조직 및 척수삭 조직(spinal chord tissue)을 제거하였다. 신경병리학(neuropathology)은 WHO 시스템(WHO defined system)에 의해 채점되었으며, 그 수치는 YF 17D 백신 표준(vaccine standard) 수치와 비교하여 상대적으로 분석되었다.

레서스 면역원성 및 접종(Rhesus immunogenicity and challenge)

노미널(nominal) 4 log10 PFU를 함유하는 0.5 ml 용량의 백신을 레서스 원숭이에게 피하 경로를 통해 한 번 접종하였다. 바이러스 혈증은 0일째부터 10일째 사이에 날마다 채취한 혈청 샘플을 이용하여 Vero cells에서 희석된 혈청의 플라크 분석에 의해 측정하였다(Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000). 중화 항체 레벨은 PRNT(plaque reduction neutralization titer assays)에 의해 측정하였다(Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000). 동물들은 예방접종 후 64일째에 야생형 WN 바이러스 NY99로 접종(challenge)되었다.

유전적 안전성(생체내 및 생체외 계대) 및 시퀀싱(Genetic stability(in vivo and in vitro passage) and sequencing)

E 단백질 내에 어테뉴에이팅 돌연변이(attenuating mutation)가 없는 YF/WN _wt (예를 들면, ChimeriVax^TM-WN₀₁) 구조체는 Vero cells에 여섯번 계대(passage)되었고, 그 후 IC 경로에 의해 새끼쥐에 여섯번 계대(passage) 되었다. E 단백질 내에 3번의 어테뉴에이팅 돌연변이가 도입된 YF/WN_FVR (예를 들어, ChimeriVax^TM-WN₀₂) preMaster Seed 및 RMS(Research Master Seed) 구조체들은 각각 무혈청, 무단백질 SF-Vero cell substrate 내에 10번, 12번씩 계대되었다. 모든 계대(passage)는 처음에는 0.01 MOI로 실시되었고, 셋째날에 수확되었으며, 바이러스 유효성(virus potency)을 측정하기 위해 적정(titration) 없이 계속되었다. 각 계대(passage)에서 사용된 바이러스가(virus titers)는 어른쥐 또는 새끼쥐의 접종 IC(inoculations IC)에 의해 측정되었다. 그 다음 바이러스 RNA를 서열분석하였다.

결과

YF 17D(YF-VAX®)에 대한 YF/WN _wt 의 바이러스 표현형(Virulence phenotype of YF/WN _wt relative to YF 17D)

처음의 웨스트 나일 바이러스 키메라는 WN NY99 야생형 균주(예를 들어, YF/WN_wt또는 ChimeriVax^TM-WN₀₁)의 외피 단백질 유전자 및 프리멤브레인(premembrane) 단백질 유전자를 암호화한다. 이 키메라 바이러스는 ICR 마우스에 10⁶ pfu 용량의 IP 접종 후에는 뇌염을 일으키는 능력이 결여되어 있다(표 2). 뇌염은 마비 및 죽음에 이르게 하는 운동 행동(motor behavior)의 변화를 날마다 관찰함으로써 평가하였다. 어른쥐에서 뉴로인베이전(neuroinvasion)을 나타내지 않는 YF/WN _wt 는 다른 이들에 의해 YF 17D를 이용하여 접종된 마우스에서 또한 관찰된 바 있다(Ryman et al., Virology 230(2): 376-380, 1997). 대조적으로, WN NY99 야생형 바이러스는 1-4 pfu의 극소량을 IP 경로에 의해 접종하더라도 마우스에게 치명적이다(Beasley et al., Virology 296: 17-23, 2002). 여기에서 YF/WN _wr 의 IC LD₅₀은 10³~10⁵pfu로 측정되었다.

YF/WN _wr 의 뉴로비룰런스 표현형(neurovirulence phenotype)은 ICR 마우스 IC LD₅₀이 10¹~10²pfu 정도로 YF 17D 바이러스의 것보다 더 낮다. 그러나, YF/WN _wr 는 생후 21일된 마우스에서 분명한 종점(endpoint)을 보이지 않는다(표 3).

[표 2]

¹Harlan-Sprague ICR 계통 3-4주령된 암컷 마우스가 사용되었음.

²AST=평균생존시간(Average Survival Time).

YF/WN _wt P2는 Vero cells에 대한 2세대 계대 바이러스(second-generation passage virus)를 나타낸다. 웨스트 나일 바이러스 균주는 일반적으로 IP 접종 후 뉴로인베이시브(neuroinvasive)하다.

[표 3]

¹IC(intracerebrally) 경로를 통해 전달된 실제 용량(actual dose)은 표시된 역적정 계산(back titration calculations)에 대해 20㎕인 것으로 가정되었다.

다부위 변이유발 접근(Multi-site mutagenesis approches)

외피 단백질 내의 아미노산들은 변화되는데, 이는 이러한 변화가 YF/WN 키메라의 병원성(virulence)을 감소시키는지의 여부를 결정하기 위함이다. 병원성의 변화는 마우스 모델에서 평가되었으며, 원래의 키메라 YF/WN _wt 의 병원성과 비교되었다. YF/WN _wt 의 외피(E) 유전자 위치107, 138, 176, 및 280번에 맵핑(mapping)되는 아미노산 잔기는 각각 아미노산 잔기 F, K, V, 및 M을 암호화하기 위해 모두 단일의 구조체(singular construct) 내에서 돌연변이 되었다. 새로운 키메라 바이러스는 YF/WN_FKVM으로 확인되었다. 그 다음 FKVM군 내의 각 아미노산 잔기가 뉴로비룰런스(neurovirulence)에 대해 맡은 개개의 역할을 평가하기 위해 단독으로 돌연변이 되도록 키메라들이 구축되었다(표 4). 또한, 316번 및 440번 아미노산 잔기에서의 돌연변이는 각각 V 및 R로 변이되었는데, 이는 이러한 부위들에 맵핑(mapping)되는 E 단백질에서의 돌연변이는 E 단백질 세번째 도메인(E protein third domain)의 생활사에서 기능을 할 수 있다(Rey et al., Nature 375(6529): 291-298, 1995; Allison et al., J. Virol. 75(9): 4268-4275, 2001)는 이전의 데이터에 기초한 것이다. E 단백질 내에 변이된 아미노산을 갖는 키메라의 뉴로비룰런스(neuroviurlence)에 대한 관찰 결과는 107번, 316번, 및 440번 위치의 잔기가 WN 바이러스의 뉴로비룰런스(neuroviurlence)에 기여하는 가장 중요한 아미노산임을 시사한다. 이러한 정보에 기초하여, 다부위 YF/WN_FVR 구조체(multi-site YF/WN_FVRconstruct)를 제조하였으며, 이를 본 발명자들의 백신 후보로 선택하였다. 모든 다부위 키메라(multi-site chimeras)는 무혈청 SF Vero cells에서 10⁷pfu/mL 역가로 성장하였다.

[표 4]

¹IC 접종된 마우스는 Taconic ICR 3-4 주령된 암컷이다. P2 및 P3는 각각 Vero cells에 대한 2세대 및 3세대 계대 바이러스(virus passage)를 가리킨다.

마우스와 레서스 원숭이에서의 뉴로비룰런스 연구(Neuroviurlence studies in mice and rhesus monkeys)

YF/WN_wt의 외피 단백질 유전자 내에 하나 또는 다부위(multi-site)의 돌연변이를 갖는 바이러스의 마우스 뉴로비룰런스(mouse neurovirulence)는 IC 경로에 의해 10⁴~10⁵pfu의 바이러스량(virus doses)으로 접종된 생후 21일째된 마우스에서 측정되었다. 이러한 평가 결과, 잔기 107번 및 280번(표 4) 그리고 316/440의 결합(표 5)이, 마우스 사망율 및 상대적인 평균 생존시간(average survival time: AST)에 의해 측정된 것과 같이 좀 더 우세한 어테뉴에이팅 돌연변이(attenuating mutation)인 것으로 확인되었다. 각각 107번, 316번, 및 440번 잔기에서 돌연변이 F, V, 및 R의 결합을 갖는 본 발명자들의 백신 후보로 선택된 키메라는, 어른쥐에서 무독성을 나타낸다(표 6). 그러나, 일부 뉴로비룰런스(neurovirulence)가 생후 2일째된 새끼쥐에서 관찰되었는데, 이는 인간에 대해 안전한 ChimeriVax^TM-JE 백신과 유사한 반응이다(Monath et al., Vaccine 20: 1004-1018, 2002).

웨스트 나일 키메라의 레서스 원숭이 뉴로비룰런스 표현형(neurovirulence phenotype)은 YF/WN_wt 구조체로 측정되었으며, YF 17D 백신의 것과 비교되었다. 레서스 원숭이는 IC 경로에 의해 YF/WN_wt로 접종되었으며, YF 17D 백신 접종의 경우와 비교되었다. 상기 키메라는 YF 17D에 유사한 바이러스혈증 역가(viremia titers) 및 지속기간(duration)을 유발하였다. 이 바이러스는 YF 백신에 비해 덜 뉴로비룰런트(neurovirulent)하며, 이러한 사실은 상기 YF/WN 키메라가 YF 17D 백신만큼 안전하다는 것을 의미한다.

[표 5]

¹IC 접종된 마우스는 Taconic ICR 3-4주령된 암컷이다. 3번의 각 실험결과를 나타내었다.

[표 6]

¹IC 접종된 마우스는 Taconic ICR 3-4주령된 암컷이다.

마우스 및 레서스 원숭이에서의 면역원성 연구(Immunogenicity studies in mice and rhesus monkeys)

본 발명자들은 YF/WN _wt 키메라의 면역원성과 YF/WN_FVR 구조체의 면역원성을 비교하였는데, 상기 YF/WN_FVR 구조체는 107, 316, 및 440번 외피 잔기에서 돌연변이를 갖는다. 마우스는 피하(SC) 경로를 통해 2~5 log₁₀ pfu 범위의 백신 용량(vaccine doses)으로 접종되었다. 혈청은 면역반응 후 4주째에 채취되었으며, 중화항체(neutralizing antibody)를 위해 적정되었다. 도 1의 데이터는 상기 YF/WN _wt 구조체의 부위-목적 감쇠(site-targeted attenuation)가 덜 면역성을 생기게 하는 바이러스(less immunogenic virus)로 바뀌게 함을 보여준다. 야생형 WN NY99 바이러스로 면역된 마우스의 IP 접종(intraperitoneal challenge)은 상기 구조체의 백신 가능성(vaccine potency) 대 효능(efficacy)의 상관관계를 밝혀내었다. YF/WN 키메라 중 하나의 10⁵pfu/ml로 면역된 모드 마우스는 병원성 바이러스의 감염으로부터 보호되었다.

레서스 원숭이에서, 하나, 둘 또는 세 개의 어테뉴에이팅 돌연변이(attenuating mutations)을 갖는 백신 후보, YF/WN₁₀₇F, YF/WN,₃₁₆V₄₄₀R, 또는 YF/WN_FVR의 면역원성은 동일하였다. 상기 동물이 10⁴pfu 백신용량을 수여받았을 때 상대항체가(relative antibody titer)에서는 커다란 차이가 없었다. 야생형 WN NY99 바이러스를 이용한 후면역 접종(post immunization challenge)에 의해 결정된 효능 연구(efficacy studies)는, 레서스 모델에서 테스트된 WN 백신 후보에서 대조군의 동물에 비교하여 100% 유효하다는 것을 명백히 보여주었다(표 7).

[표 7]

a GMT, 기하 평균가(geometric mean titer); 종점(endpoint)이 결정되지 않은 경우, 분석 한계가(assay limit titer)가 계산에 사용되었음(예를 들어, 640보다 클 경우에는 640으로, 40보다 작을 경우에는 40으로); b NT = 테스트되지 않음; c 동물들은 웨스트 나일 감염 관련 증후를 보인 후 안락사시킴.

레서스 마카크(rhesus macaques)에서의 예방접종후 바이러스혈증(post-vaccination viremia)은 YF 17D 백신에 의해 유발된 것과 비교하여 비슷한 지속기간(duration)을 보였으나, 크기면에서는 더 작았고, 상기 키메라에서의 유일한 어테뉴에이팅 돌연변이(unique attenuating mutations)의 수와 직선의 상관관계를 보였다(표 8). 그럼에도 불구하고, 비스세로트로피즘(viscerotropism)(또는 예바접종후 바이러스혈증(post-vaccination viremia))에 기초한 안전성 평가는 상기 마카크 모델(macaque model)에서 테스트된 백신 후보들 중 어떤 것도 YF 17D보다 안전하다는 것을 보여주었다.

[표 8]

^*0일째(접종전)에는 분석결과 어떠한 바이러스도 탐지되지 않았다.

^a분석결과 한계보다 낮음(Assay lower limit).

5.38 log₁₀ pfu의 WN NY99로 면역된 레서스 마카크의 후 IC 접종(post IC challenge)은 탐지할만한 바이러스혈증(viremia)을 생산하지 않았으며, YF/WN 구조체들(YF/WN constructs)로 예방접종된 동물들에서는 어떠한 질병의 임상소견 또는 사망율이 관찰되지 않았다. WNV 복제로 인한 상당한 바이러스혈증(viremia)은 YF 17D 예방접종체(vacinees)에서 탐지되었다. 이러한 군의 동물들에게서 탐지되는 바이러스혈증의 수준은 평균 3.5일의 지속기간(duration) 동안 평균 2.25±0.62 log₁₀pfu 역가를 갖는다. 이러한 바이러스혈증 수준은 평균 4.5일의 지속기간 동안 평균 2.33±0.47의 log₁₀pfu 역가를 갖는 예방접종하지 않은 대조군(non-vaccinated control group)(n=2)에서의 관찰결과와 비슷하다. YF 17D로 예방접종된 4마리의 레서스 마카크(rhesus macaques) 중 2마리가 WN NY99 균주를 이용한 IC 접종에 의해 살아남았다. 생존한 동물들은 접종 후(post challenge) 식욕을 잃었으며, 온도 증가와 함께 혼수상태(lethargy)의 증후를 보여주었다. WNV NY99 균주를 이용한 접종 후 안락사된 동물들은 열 및 떨림을 포함하는 증후를 나타내었다.

유전적 안전성(Genetic stability)

YF/WN _wt 또는 YF/WN_FVR 키메라를 이용한 생체외 및 생체내 기질-계대(substrate-passage) 연구는 상기 구조체들(constructs)이 정치배양(stationary cultures)에서 자랄 때 그 유전적 안전성을 결정하기 위해 수행되었다. 여섯번의 생체외 Vero E6 세포 계대 후, 여섯번의 생체내 YF/WN _wt 의 ICR 어른쥐 뇌 계대(brain passage)가 수행되었으며, 그 결과 본 발명자들은 이 키메라의 외피 유전자(prM, E) 부위에 바람직하지 못한 돌연변이는 없다는 것을 발견하였다. 시스테인을 세린으로 변화시키는 위치 E336에서의 E 단백질 내의 이형 돌연변이(heterozygous mutations)는 Vero E6 cells에서 YF/WN_FVR 바이러스의 열번의 생체외 계대 후 확인되었다. 분리 연구(separate study)에서, YF/WN_FVR SF-Vero cells의 생체외 계대(in vitro passage)는 위치 E 313에서의 돌연변이 선택의 결과를 초래하는데, 이는 상기 위치의 아미노산을 글리신에서 아르기닌으로 변화시킨다. Vero cells에서 상기 바이러스의 모든 연속계대 동안, 바이러스의 뉴로비룰런스(neurovirulence)와 관계된 타겟 잔기 107F, 316V, 또는 440R에서는 어떤 복귀/변이도 탐지되지 않았다.

도 1은 YF/WN _wt 또는 YF/WN_FVR로 접종된 ICR 마우스로부터 얻어진 상반 중화 항체가(reciprocal neutralizing antibody titer, PRNT₅₀)를 보여주는 그래프이다. YF/WN _wt 에 대한 각 중화항체가(neutralizing antibody titer)를 보여준다. 흰색 기호는 WNV NY-99 균주를 이용한 IP 접종(IP challenge)에서 죽은 마우스를 표시한다. 100%의 생존율은 10³ pfu 용량의 YF/WN _wt 및 10⁵ pfu의 YF/WN_FVR로 접종된 군에서 얻어졌다. 10³ pfu의 YF/WN_FVR로 접종된 군에서는 오직 40%의 마우스만이 생존하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 이제까지 개발된 바 없는, 웨스트 나일 바이러스의 프리-멤브레인 단백질(pre-membrane protein)과 외피 단백질(envelope protein) 및 황열 바이러스의 캡시드와 비구조 단백질(non-structural protein)을 암호화하는 서열들을 포함하는 핵산분자(nucleic acid molecules) 및 상기 핵산분자에 의해 암호화된 키메라 플라비바이러스(chimeric flaviviruses)를 세계 최초로 제공하여 웨스트 나일 바이러스의 감염을 효과적으로 예방 및 치료하는 뛰어난 효과가 있으므로 의약산업상 매우 유용하다.

Claims

웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)의 프리-멤브레인 단백질(pre-membrane protein)과 외피 단백질(envelope protein) 및 황열 바이러스(Yellow Fever virus)의 캡시드(capsid)와 비구조 단백질(non-structural protein)을 암호화하는 서열을 포함하며, 여기서 상기 외피 단백질은 107번 위치에 어테뉴에이팅 돌연변이(attenuating mutation)를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자(nucleic acid molecule).
웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)의 프리-멤브레인 단백질(pre-membrane protein)과 외피 단백질(envelope protein) 및 황열 바이러스(Yellow Fever virus)의 캡시드(capsid)와 비구조 단백질(non-structural protein)을 암호화하는 서열을 포함하며, 여기서 상기 외피 단백질은 316번 및 440번 위치에 어테뉴에이팅 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)의 프리-멤브레인 단백질(pre-membrane protein)과 외피 단백질(envelope protein) 및 황열 바이러스(Yellow Fever virus)의 캡시드(capsid)와 비구조 단백질(non-structural protein)을 암호화하는 서열을 포함하며, 여기서 상기 외피 단백질은 107번, 316번, 및 440번 위치에 어테뉴에이팅 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 107번 위치에서의 아미노산 어테뉴에이팅 돌연변이는 류신을 페닐알라닌 또는 그의 보존성 아미노산(conservative amino acid)으로 치환하는 것임을 특징으로 하는 핵산분자.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 107번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 류신을 페닐알라닌으로 치환하는 것임을 특징으로 하는 핵산분자.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 316번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 알라닌을 발린, 또는 그의 보존성 아미노산으로 치환하는 것임을 특징으로 하는 핵산분자.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 316번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 알라닌을 발린으로 치환하는 것임을 특징으로 하는 핵산분자.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 440번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 리신을 아르기닌 또는 그의 보존성 아미노산으로 치환하는 것임을 특징으로 하는 핵산분자.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 316번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 알라닌을 글리신, 발린, 이소류신, 또는 류신으로 치환하는 것이고, 및 상기 440번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 리신을 아르기닌으로 치환하는 것임을 특징으로 하는 핵산분자.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 316번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 알라닌을 발린으로 치환하는 것이고, 및 상기 440번위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 리신을 아르기닌으로 치환하는 것임을 특징으로 하는 핵산분자.
제3항에 있어서, 상기 107번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 류신을 페닐알라닌 또는 티로신으로 치환하는 것이고; 상기 316번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 알라닌을 글리신, 발린, 이소류신, 또는 류신으로 치환하는 것이고; 및 상기 440번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 리신을 아르기닌으로 치환하는 것임을 특징으로 하는 핵산분자.
제3항에 있어서, 상기 107번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 류신을 페닐알라닌으로 치환하는 것이고; 상기 316번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 알라닌을 발린으로 치환하는 것이고; 및 상기 440번 위치에서의 어테뉴에이팅 돌연변이는 리신을 아르기닌으로 치환하는 것임을 특징으로 하는 핵산분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 핵산분자에 의해 암호화된 키메라 플라비바이러스(chimeric flavivirus).
제13항의 키메라 플라비바이러스를 포함하는 웨스트 나일 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약물.
제14항에 있어서, 상기 약물은 웨스트 나일 바이러스에 대한 백신인 것을 특징으로 하는 약물.
삭제
제13항에 있어서, 상기 키메라 플라비바이러스는 대상자 내에서 웨스트 나일 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약물의 제조용인 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제13항에 있어서, 상기 키메라 플라비바이러스는 대상자 내에서 웨스트 나일 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 용도로 사용되는 키메라 플라비바이러스.
제17항에 있어서, 상기 대상자는 웨스트 나일 바이러스에 감염되진 않았으나 발병 위험이 있는 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제17항에 있어서, 상기 대상자는 웨스트 나일 바이러스에 의해서 감염된 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제17항에 있어서, 상기 대상자는 인간인 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제13항의 키메라 플라비바이러스(chimeric flavivirus)를 포함하는, 대상자(subject) 내에서 웨스트 나일 바이러스에 대한 면역반응을 유도하기 위한 조성물.
제22항에 있어서, 상기 대상자는 웨스트 나일 바이러스에 감염되진 않았으나 발병 위험이 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제22항에 있어서, 상기 대상자는 웨스트 나일 바이러스에 의해서 감염된 것을 특징으로 하는 조성물.
제22항에 있어서, 상기 대상자는 인간인 것을 특징으로 하는 조성물.
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제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 핵산분자를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 키메라 플라비바이러스 백신(chimeric flavivirus vaccine)의 제조방법.
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