KR102611235B1 - 어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스에 대한 백신접종 조성물 및 방법 - Google Patents

어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스에 대한 백신접종 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본원에서의 구현예는 약 1세 내지 약 20세 연령의 어린이 또는 젊은 성인에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물, 방법, 및 용도에 관한 것이다. 일부 구현예는 단독으로 또는 다른 구축물과의 조합으로 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 백신 조성물에서 이용될 수 있는 뎅기 바이러스 키메라가 비제한적으로 포함될 수 있는 조성물에 관한 것이다. 소정 구현예에서, 조성물에는 어린이 및 젊은 성인에서 감염으로부터의 보호를 개선하기 위해 다양한 농도 또는 비로 하나를 초과하는 혈청형의 뎅기 바이러스 구축물, 예컨대 뎅기-1(DEN-1) 바이러스, 뎅기-2(DEN-2) 바이러스, 뎅기-3(DEN-3) 바이러스 및/또는 뎅기-4(DEN-4) 바이러스가 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, 제형물의 바이러스는 뎅기 바이러스 혈청형으로 제한된다. 다른 구현예는 단일, 이중 또는 다른 요법을 이용하는 키메라성 뎅기 구축물 및 살아있는 약독화된 뎅기 바이러스가 포함될 수 있는 뎅기 바이러스에 대한 면역원성 조성물의 투여 방법에 관한 것이다.

Description

어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스에 대한 백신접종 조성물 및 방법
관련 출원
본 PCT 출원은 2016년 4월 13일에 출원된 U.S. 가출원 일련 번호 62/322,167에 대한 35 USC § 119(e) 하의 이익을 청구하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본원에서 개시되는 구현예는 약 1세령 내지 약 20세령의 어린이 또는 젊은 성인에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물, 방법, 및 용도에 관한 것이다. 일부 구현예는 단독으로 또는 조합으로 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물에서 이용될 수 있는 키메라성 및 비-키메라성 플라비바이러스 바이러스 구축물이 비제한적으로 포함될 수 있는 조성물에 관한 것이다. 소정 구현예에서, 조성물에는 어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 감염으로부터의 보호를 개선하기 위해 다양한 농도 또는 비로 하나를 초과하는 혈청형의 뎅기 바이러스 구축물, 예컨대 뎅기-1(DEN-1) 바이러스, 뎅기-2(DEN-2) 바이러스, 뎅기-3(DEN-3) 바이러스 및/또는 뎅기-4(DEN-4) 바이러스가 포함될 수 있다. 다른 구현예는 단일, 이중 또는 다른 투여 요법을 이용하는 키메라성 뎅기 구축물 및 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스가 포함될 수 있는 백신 조성물의 투여 방법에 관한 것이다.
뎅기열은 뎅기 바이러스로부터의 감염에 의해 유도되는 모기-매개 질환이다. 뎅기 바이러스 감염은 급작스러운 고열, 두통, 관절통 및 근육통, 오심, 구토 및 피부 발진을 포함하는 쇠약화시키며 고통스러운 증상을 야기할 수 있다. 현재까지, 4개 혈청형의 뎅기 바이러스: 뎅기-1(DEN-1), 뎅기-2(DEN-2), 또는 뎅기-3(DEN-3)이 뎅기-4(DEN-4)와 함께 확인되었다. 다른 서브타입이 향후 발견될 수 있다(예컨대, DEN-5). 뎅기 바이러스 혈청형 1 내지 4는 또한 뎅기 출혈열(DHF) 및 뎅기 쇼크 증후군(DSS)을 유도할 수 있다. 가장 중증 사례에서, DHF 및 DSS는 치명적일 수 있다. 뎅기 바이러스는 매년 5천만 건 내지 1억 건의 쇠약화 뎅기열, 500,000건의 DHF/DSS, 및 20,000건을 초과하는 사망을 유도하며, 그 중 상당부가 어린이이다. 현재까지, 뎅기열에 대해 보호하기 위해 효과적인 백신 및 질환에 대한 약물 치료는 존재하지 않는다. 모기 제어 시도는 풍토병 지역에서 뎅기 발생을 예방하는 데 있어서 또는 질환의 추가적인 지리적 확산을 예방하는 데 있어서 효과적이지 못했다. 35억 명이 뎅기 바이러스로의 감염에 의해 위협받는 것으로 추산된다. 또한, 뎅기 바이러스는 풍토병 지역, 예컨대 아시아, 중앙 아메리카 및 남아메리카, 및 카리브해로의 여행자에서 열의 주요 원인이다. 추가적으로, DHF/DSS는 일부 아시아 및 라틴 아메리카 국가의 어린이에서 심각한 질병 및 사망의 주요 원인이다.
모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형은 전세계 열대 지역에 걸쳐 풍토성이며 세계적으로 열대 지역에서 인간에 대해 가장 심각한 모기-매개 바이러스 위협을 이룬다. 뎅기 바이러스는 주로 애데스 애집티(Aedes aegypti) 모기에 의해 인간에게 전파된다. 하나의 뎅기 바이러스 혈청형으로의 감염은 그 혈청형에 의한 재감염으로부터 평생 보호를 일으키지만, 다른 3개 뎅기 바이러스 혈청형 중 하나에 의한 이차 감염을 예방하지는 않는다. 사실 상, 하나의 뎅기 바이러스 혈청형으로의 이전 감염은 상이한 혈청형으로의 이차 감염 시 중증 질환(DHF/DSS)의 증가된 위험으로 이어진다. 특히 어린이 및 젊은 성인에서, 효과적인 백신의 개발은 이러한 세계적 질환의 예방 및 제어에 대한 중요한 접근을 나타낸다.
본원에서 개시되는 구현예는 키메라성 뎅기 바이러스 구축물의 조성물, 방법 및 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물에는 단독으로 또는 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스와의 조합으로 적어도 하나의 다른 뎅기 바이러스 혈청형으로부터의 구조 유전자를 포함하는 약독화된 뎅기 바이러스 골격을 갖는 키메라성 뎅기 바이러스 구축물이 포함될 수 있다. 다른 구현예는 적어도 하나의 추가적인 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 구조 요소를 함유하는 하나 이상의 키메라성 뎅기 바이러스와 조합된 적어도 하나의 살아있는, 약독화된 바이러스에 관한 것이다. 다른 구현예에는 개질된 DEN-2 골격(예컨대, P1(계대-1)에서 시작 골격으로서의 PDK-53 및 P2, P3...P8..P10 등에 대해 나타낸 바와 같은 계대 변이 및 선택을 이용하여 개질된 PDK-53) 및 DEN-1, DEN-2, DEN-3 또는 DEN-4의 하나 이상의 구조 성분을 갖는 키메라성 뎅기 바이러스 조성물이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에 도입되었을 때 조성물이 대상체에서 하나 이상의 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 면역원성 조성물이 생성될 수 있다. 따라서, 본원에서 고려되는 구축물이 생성되고 계대배양될 수 있으며, 각각의 계대는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물에서 사용하기 위해 고려되는 약독화된 뎅기 바이러스를 제공한다
본원에서 개시되는 구현예는 약 1세령 내지 약 45세령의 어린이 또는 젊은 성인에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물, 방법, 및 용도에 관한 것이다. 현재의 제형물은 어린 소아에 대해서 효과적이지 못하며 모든 연령군에 대한 뎅기 감염에 대해 사용하기 위한 뎅기 백신이 시급히 필요하다. 이러한 구현예에 따르면, 본원에서 개시되는 조성물 및 방법은 약 1세 내지 20세 연령, 약 1세 내지 15세 연령, 약 1세 내지 11세 연령 또는 약 2세 내지 약 9세 연령 또는 약 1세 내지 약 5세 연령의 어린이 연령에 대해 사용된다.
소정 구현예에서, 백신에서 사용되는 뎅기 바이러스 혈청형의 키메라성 뎅기 바이러스 구축물에는 서열번호 1, 3, 5 및 7에 의해 확인되는 핵산 서열 또는 서열번호 2, 4, 6 및 8로 나타내는 폴리펩타이드 서열을 갖는 계대 8(P8)의 살아있는, 약독화된 바이러스 또는 키메라성 바이러스가 포함될 수 있다. 본원에서 기재되는 임의의 살아있는, 약독화된 바이러스에 대한 임의의 계대가 나타내는 뎅기 바이러스 혈청형(예컨대, 혈청형 1 내지 4)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 면역원성 조성물에서 이용될 수 있음이 본원에서 고려된다. 이러한 구현예에 따르면, P-8의 단리된 살아있는, 약독화된 바이러스가 포함되는 면역원성 조성물은 선택되는 구축물에 따라 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 면역원성 반응을 유도하기 위해 대상체에 투여될 수 있다. 또한, 살아있는, 약독화된 바이러스는 하나 이상의 이러한 키메라성 바이러스와 조합될 수 있다. 이는 각각의 후속 세포 계대(예컨대, 아프리카 녹색 원숭이 Vero 세포 생산, 이후: Vero 세포 또는 다른 적절한 세포주)에서 단리되는/생성되는 각각의 살아있는, 약독화된 바이러스에 대해 고려된다. 뎅기 바이러스를 생산할 수 있는 임의의 세포주(예컨대, GMP 승인된 세포주)가 제조 규모로 임의의 바이러스 구축물을 계대배양하기 위해 또는 뎅기 바이러스에 대한 백신 또는 면역원성 조성물에서의 후속 이용을 위해 본원에서 적절히 고려되는 바에 따라 사용됨이 고려된다.
다른 구현예에서, 본원에서 고려되는 조성물은 다른 플라비바이러스, 예컨대 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 황열 바이러스 또는 임의의 다른 플라비바이러스 키메라성 구축물 및/또는 살아있는, 약독화된 바이러스에 대한 다른 면역원성 조성물과 조합될 수 있다. 소정 구현예에서, 단일 조성물이 여러 플라비바이러스에 대해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신 조성물이 뎅기 바이러스 구축물 및 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스로 제한되는 경우에도 본원에서 개시되는 조성물은 지카 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있을 수 있다.
소정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물에는 단독으로 또는 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 조성물과의 조합으로 하나 이상의 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및/또는 DEN-4에 대한 키메라성 뎅기 바이러스가 포함될 수 있다.
다른 구현예에서, 구축물에는 대상체에 도입되었을 때 바이러스의 약독화 또는 안전성에 영향을 미치지 않고 성장 또는 생산을 증가시키는 바이러스의 구조 또는 비-구조 영역 내 적응 돌연변이를 갖는 구축물이 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, 임의의 고려되는 키메라성 뎅기 바이러스 구축물에는 살아있는 약독화된 DEN-2 PDK 바이러스에 다른 뎅기 바이러스 혈청형의 하나 이상의 prM(프리멤브레인)의 구조 단백질 및 E(외피) 구조 단백질이 추가로 포함될 수 있는 골격으로서 이용되는 특이적 돌연변이를 갖는 살아있는, 약독화된 DEN-2 바이러스가 포함될 수 있다. 또한, DEN-2 골격에는 투여 시 대상체에서 사전결정된 조성물(예컨대, 키메라성 뎅기 바이러스 2/1, 2/3 또는 2/4)에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 추가적인 돌연변이 또는 돌연변이의 복귀가 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 구조 단백질 유전자에는 면역원성을 개선하기 위해 1개 또는 2개의 복귀를 갖는 DEN-2 골격 상의 DEN-1, DEN-2, DEN-3 또는 DEN-4의 prM 및 E 유전자가 포함될 수 있다. 예를 들어, 뎅기 구축물에는, 소정 구현예에서, DEN-2 골격이 면역 반응을 유도하기 위해 안전하고 효과적인 것으로 이전에 실증된 DEN-2 살아있는, 약독화된 바이러스로부터 야생형 DEN-2로의 하나 이상의 복귀(예컨대, 비-코딩 영역(NCR) 또는 비-구조 영역(NS1 등)에 또는 P1 또는 다른 이전에 계대배양된 바이러스에서는 확인되지 않는 추가적인 돌연변이)를 갖는 TDV-1-A, TDV-2-F, TDV-3-F, 및 TDV-4-F(실시예 섹션 참고)로 명명되는 구축물이 포함될 수 있다. 본 출원의 DEN-2 살아있는, 약독화된 바이러스는 원래 이용된 DEN-2 살아있는, 약독화된 바이러스의 개선된 버전이다. 본원에서 개시되는 일부 구현예의 키메라성 구축물에는 제2 뎅기 바이러스 혈청형의 하나 이상의 구조 단백질을 갖는 개질된 약독화된 DEN-2 PDK-53 골격이 포함될 수 있고, 여기서 구조 단백질에는 키메라성 구축물에 대한 면역원성 반응을 증가시키기 위한 추가적인 돌연변이가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 약독화된 DEN-2 PDK-53에 의해 획득되는 소정 돌연변이는 백신 안전성 및 약독화에 영향을 미치지 않고 증가된 면역원성, 증가된 성장, 증가된 플라크 크기를 생성할 수 있고, 살아있는 약독화된 바이러스의 성장 및/또는 복제에 영향을 미칠 수 있는 P1 구축물과 상이한 키메라성 구축물을 생성하기 위해 대조군 또는 또 다른 아미노산으로 다시 복귀될 수 있다.
다른 구현예에서, 살아있는, 약독화된 DEN-2 게놈은 DEN-2 바이러스 게놈의 하나 이상의 구조 단백질 유전자가 각각 DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4의 하나 이상의 구조 단백질 유전자에 의해 대체될 수 있는 뎅기 바이러스 혈청형 1(DEN-1), 뎅기 바이러스 혈청형 3(DEN-3), 및 뎅기 바이러스 혈청형 4(DEN-4)의 키메라성 구축물을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 구조 단백질에는 제3 뎅기 바이러스의 C, prM 또는 E 단백질이 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, 구조 단백질 유전자에는 DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4의 prM 및 E 유전자가 포함될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 이러한 키메라성 바이러스는 약독화된 DEN-2 모체의 약독화 표현형을 보유하면서 DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4의 표면 항원을 발현할 수 있다. 또한, 어린이 및 젊은 성인에서의 백신을 위해 사용되는 본원에서 개시되는 키메라성 구축물에는 약독화된 DEN-2 바이러스를 골격으로서 이용하며 DEN-1, DEN-3 및 DEN-4의 표면 항원을 발현하는 DEN-4, DEN-2, DEN-1, 및 DEN-3 의 키메라성 구축물이 포함될 수 있다.
소정 구현예에서, 본 발명의 조성물에는 본원에서 개시되는 단일 키메라성 뎅기 바이러스 구축물 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제가 포함될 수 있는 조성물이 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에서 개시되는 조성물에는 2개 이상의, 또는 3개 이상의 키메라성 뎅기 바이러스 구축물, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제가 포함될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 본원에서 고려되는 하나 이상의 뎅기 바이러스 키메라성 구축물은 하나 이상의, 살아있는 약독화된 뎅기 바이러스와 조합될 수 있다. 소정 구현예에서, 살아있는, 약독화된 바이러스는 살아있는, 약독화된 DEN-2 바이러스일 수 있으며, 여기서 NCR, NS1 영역 또는 다른 영역에서 야생형 아미노산으로의 복귀는 면역 반응을 증가시키거나, 바이러스 성장 또는 본원에서 개시되는 제형물에서 사용되는 개선된 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 구축물에 대한 다른 개선을 증가시킨다.
소정 구현예에서, 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스에는 4개의 TDV 구축물 바이러스의 공통적인 PDK-53 바이러스-특이적 유전 배경에 의해 공유될 수 있는, DENV-2의 뉴클레오타이드 5'NCR-57-T, NS1-53-Asp, 및 NS3-250-Val에 대한 돌연변이 또는 치환이 포함될 수 있다. 3개의 약독화 유전자위의 유전적 서열뿐만 아니라 이러한 백신 후보의 이전에 확립된 시험관내 및 생체내 약독화 표현형이 cGMP-제조된 TDV 씨드에 대해 주의깊게 모니터링되었다. 마스터 바이러스 씨드(MVS)뿐만 아니라 뎅기 바이러스 백신 조성물의 제조에서 사용되는 뎅기 바이러스의 다른 관련 계대를 생성하기 위해 이용되는 전략이 본원에서 개시된다. 이러한 MVS는 임상 물질 및 궁극적으로 상업적 백신 공급물질의 제조를 위해 이용될 수 있다.
소정 구현예에서, 면역원성 조성물에는 어린이 및 젊은 성인에서 적어도 3개 또는 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 3가 또는 4가 제형물이 포함될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물에는 각각의 4개 뎅기 바이러스 혈청형의 프리-마스터 바이러스 씨드, 마스터 바이러스 씨드(MVS), 워킹 바이러스 씨드(WVS) 및 벌크 바이러스 씨드(BVS) 구축물이 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물에는 서열번호 9(프리-마스터), 11(MVS), 13(WVS) 또는 15(BVS)로 나타내는 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 서열번호 1(프리-마스터), 3(MVS), 5(WVS) 또는 7(BVS)로 나타내는, 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형으로부터의 비구조 단백질 및 뎅기-1 바이러스 혈청형으로부터의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 가지는 뎅기-1/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드; 서열번호 17(프리-마스터), 19(MVS), 21(WVS) 또는 23(BVS)으로 나타내는, 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형으로부터의 비구조 단백질 및 뎅기-3 바이러스 혈청형으로부터의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 뎅기-3/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호 25(프리-마스터), 27(MVS), 29(WVS) 또는 31(BVS)로 나타내는, 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형으로부터의 비구조 단백질 및 뎅기-4 바이러스 혈청형으로부터의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 뎅기-4/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드가 포함될 수 있다. 일부 구현예는 어린이 또는 젊은 성인에서 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 야기할 수 있는 면역원성 조성물을 개시한다.
소정 구현예에서, 면역원성 조성물에는 조성물에서 개질된, 살아있는 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 농도 비가 하나 이상의 뎅기 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 log 플라크 형성 단위(PFU)보다 적어도 1/2 내지 1 log PFU가 더 낮을 수 있는 제형물이 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물에는 조성물에서 개질된, 살아있는 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 농도 비가 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 log 플라크 형성 단위(PFU)보다 적어도 1.5 또는 2 또는 3 초과의 log PFU가 더 낮은 제형물이 포함될 수 있다.
소정 구현예에서, 단독으로 또는 다른 바이러스 백신과의 조합으로 뎅기에 대한 면역원성 조성물은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 혼합물일 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 면역원성 조성물에는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 다양한 폴리펩타이드를 포함하거나 포함하지 않는 본원에서 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 플라비바이러스 폴리뉴클레오타이드가 포함될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드에는 서열번호 10(프리-마스터), 12(MVS), 14(WVS) 또는 16(BVS)으로 나타내는 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형에 대응하는 것; 서열번호 2(프리-마스터), 4(MVS), 6(WVS) 또는 8(BVS)로 나타내는 뎅기-1/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 폴리펩타이드; 서열번호 18(프리-마스터), 20(MVS), 22(WVS) 또는 24(BVS)로 나타내는 뎅기-3/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 26(프리-마스터), 28(MVS), 30(WVS) 또는 32(BVS)로 나타내는 뎅기-4/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 폴리펩타이드가 포함될 수 있다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 면역원성 조성물에는 4:4:5:5 log 플라크 형성 단위(PFU)의 농도비의 뎅기-1/뎅기-2 키메라, 대 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형, 대 뎅기-3/뎅기-2 키메라, 대 뎅기-4/뎅기-2 키메라를 포함하는 다양한 농도비의 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드가 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 뎅기-1/뎅기-2 키메라, 대 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형, 대 뎅기-3/뎅기-2 키메라, 대 뎅기-4/뎅기-2 키메라의 농도비는 약 5:4:5:5 log PFU일 수 있다. 본원에서 고려되는 다른 비에는 살아있는, 약독화된 뎅기-2 및/또는 뎅기-1 키메라성 바이러스가 적어도 하나의 뎅기-3 또는 뎅기-4 키메라 및/또는 뎅기-1에 비해 감소되는 조성물이 포함될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 4가 제형물 비는 약 5:3:5:5, 3:3:5:5, 또는 소정 예에서 더 낮은 살아있는, 약독화된 뎅기-2 또는 감소된 표시값을 갖거나 제형물에서 살아있는, 약독화된 뎅기-2 및 뎅기-1/뎅기-2 키메라를 둘 다 갖는 임의의 비일 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에서 개시되는 조성물은 본원에서 개시되는 하나 이상의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용가능한 부형제가 포함되는 약학적 조성물일 수 있다. 소정 구현예에서, 약학적 조성물에는 하나 이상의 뎅기 혈청형에 대한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 둘 다 갖는 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 및/또는 뎅기 키메라로 제조되는 면역원성 조성물이 포함될 수 있다.
다른 구현예에는 어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스 감염에 대해 사용되는 본 개시의 적어도 하나의 면역원성 조성물 및 적어도 하나의 용기를 갖는 키트가 포함될 수 있다.
소정 구현예에는 적어도 1개 내지 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 어린이 및 젊은 성인을 면역화하는 방법이 포함된다. 방법에는 대상체에 본원에서 개시되는 약학적 조성물의 하나 이상의 용량을 투여하는 단계가 포함될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 이러한 특징을 갖는 비에는 대상체에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하는 살아있는, 약독화된 바이러스 및/또는 키메라가 포함될 수 있다.
소정 구현예에서, 방법에는 폴리뉴클레오타이드에 부가하여 본원에서 개시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드가 포함되는 어린이 또는 젊은 성인에게 면역원성 조성물을 투여하는 단계가 포함될 수 있다. 방법에는 서열번호 10(프리-마스터), 12(MVS), 14(WVS) 또는 16(BVS)으로 나타내는 폴리펩타이드; 서열번호 2(프리-마스터), 4(MVS), 6(WVS) 또는 8(BVS)로 나타내는 폴리펩타이드; 서열번호 18(프리-마스터), 20(MVS), 22(WVS) 또는 24(BVS)에 의해 나타내는 폴리펩타이드; 및 서열번호 26(프리-마스터), 28(MVS), 30(WVS) 또는 32(BVS)로 나타내는 폴리펩타이드 중 하나 이상이 포함되는 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, 방법에는 약 1세 내지 약 20세 연령 범위의 대상체에 본원에서 개시되는 면역원성 조성물에서 나타내는 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형을 갖는 면역원성 조성물을 투여하는 단계 및 대상체에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 야기하는 단계(4가 제형물)가 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 방법에는 약 1세 내지 약 45세 연령 범위의 대상체에 본원에서 개시되는 면역원성 조성물을 투여하는 단계가 포함될 수 있다.
소정 구현예에서, 방법에는, 예를 들어 피하, 정맥내, 피내, 경피, 경구, 흡입을 통해, 질내, 국소, 비강내 또는 직장을 포함하는 임의의 허용가능한 수단에 의해 대상체에 본 개시의 4가 제형물의 하나 이상의 용량을 투여하는 단계가 포함될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 본원에서 개시되는 제형물은 대상체에 1개 용량 또는 2개 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 면역원성 제형물은 서로 약 90일 내에, 서로 약 60일 내에, 서로 약 30일 내에, 및 서로 약 30일 미만 내에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 면역원성 제형물은 0일 및 최초 투여로부터 약 3개월에 다시 어린이 또는 젊은 성인에게 투여될 수 있다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 4가 제형물은 하나 이상의 용량의 4가 조성물을 수여받은 어린이 및 젊은 성인의 적어도 60%에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 야기할 수 있다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 소정 구현예를 추가로 실증하기 위해 포함된다. 일부 구현예는 단독으로 또는 제시되는 특정 구현예의 상세한 설명과의 조합으로 하나 이상의 이러한 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 이전에 생성된 구축물 및 야생형 뎅기 바이러스에 비해 본 발명의 예시적인 키메라성 구축물, DEN-2/DEN-4를 반영하는 예시적인 차트를 나타낸다.
도 2는 살아있는, 약독화된 DEN-2 골격(추가적인 돌연변이 함유) 및 뎅기-2 구조 성분에 대해 치환된 구조 성분으로서의 제2 뎅기 바이러스 혈청형(예컨대, TDV-1 MVS)을 이용하여 다양한 반응을 비교하는 예시적인 히스토그램 그래프를 나타낸다. 상기 그래프는 TDV MVS의 플라크 크기를 예시한다. 야생형 뎅기 바이러스 및 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 대조군 및 비교를 위해 포함되었다. 상기 그래프는 대조군 뎅기 바이러스 키메라성 구축물에 비해 뎅기 바이러스 구축물의 개선된 생산을 예시한다.
도 3은 TDV MVS(본원에서 DENVax로 표시되는, 마스터 바이러스 씨드)의 온도 민감성을 나타내는 예시적인 히스토그램 그래프를 나타낸다. 야생형 뎅기 바이러스 및 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 MVS 등급과의 비교를 위해 포함되었다.
도 4는 대조군에 비해 C6/36 세포에서 TDV(또한 DENVax로 알려져 있음) MVS의 바이러스 성장을 나타내는 예시적인 히스토그램 그래프를 나타낸다. 야생형 뎅기 바이러스 및 연구-등급 백신 후보 바이러스가 TDV MVS(본원에서 DENVax로 표시됨)와의 비교를 위해 포함되었다.
도 5A 내지 5C는 신생 마우스에서 신경독력의 예시적인 그래프를 나타낸다. 104 pfu의 바이러스로 ic 유발접종된 CDC-ICR(n=72) 및 Taconic-ICR(n=32) 신생 마우스에서 wt DENV-2 16681 바이러스의 신경독력을 요약하는 몇몇 실험의 풀링된 결과(A). 104 pfu(B) 또는 103 pfu(C)의 용량으로 Taconic-ICR 마우스에서 평가된 TDV MVS(마스터 바이러스 씨드, 본원에서 DENVax로 표시됨)의 신경독력. 1개 실험(n=16) 또는 2개의 풀링된 실험(n=31 또는 32)에서 그룹 당 평가된 동물의 수를 나타낸다.
도 6은 TDV MVS, WVS, 및 BVS의 플라크 크기를 예시하는 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 9일 pi에 측정된 아가로스 오버레이 하에 Vero 또는 LLC-MK2 세포에서 바이러스 플라크의 평균 플라크 지름 ± SD(오차 막대). 야생형 DENV 및 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 대조군 및 비교를 위해 포함되었다.
도 7은 대규모 제조 후 상기 시험관내 약독화 마커의 TDV(본원에서 DENVax로 표시됨) MSV, WVS, 및 BVS의 보유를 확인하기 위해 2개의 인큐베이션 온도에서 C6/36 세포에서 이의 성장을 예시하는 예시적인 히스토그램 그래프를 나타낸다. 소정 야생형 뎅기 바이러스 및 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 비교를 위해 포함되었다.
도 8은 C6/36 세포에서 TDV MVS(마스터 바이러스 씨드, 본원에서 DENVax로 표시됨), WVS, 및 BVS의 제한된 성장을 도시하는 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 7일 pi에 C6/36 세포에서 복제된 바이러스의 평균 역가 ± SD(오차 막대). 소정 야생형 뎅기 바이러스 및 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 비교를 위해 포함되었다.
도 9A 내지 9B는 신생 ICR 마우스에서 TDV MVS(마스터 바이러스 씨드, 본원에서 DENVax로 표시됨)의 신경독력 데이터의 예시적인 그래프를 나타낸다. (A) 104 PFU 용량에서 바이러스의 IC 접종. (B) 103 PFU 용량에서 바이러스의 IC 접종.
도 10은 새로운 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스를 이전에 생성된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스와 비교하는 예시적인 차트를 나타낸다.
도 11a는 대표적인 단백질 도메인 및 돌연변이 부위를 포함하는, 본 개시의 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 및 뎅기-뎅기 키메라성 구축물(TDV로 표시됨)의 대표적인 다이어그램이다.
도 11b는 본 개시의 하나의 구현예에 따른, 하나의 4가 제형물의 대표적 제형물이다.
도 12a는 본 개시의 하나의 구현예에 따른, 임상 시험의 일부로서 수행되는 대상체에서의 투여 요법의 대표적 다이어그램이다.
도 12b는 본 개시의 하나의 구현예에 따른, 임상 시험의 일부로서 수행되는 대상체에서의 투여 요법의 대표적 다이어그램이다.
도 13a는 본 개시의 하나의 구현예에 따른, 중화 항체가 혈청양성 대상체에 대한 4가 제형물 투여 후 반응하는 미세중화 평가(MNT) 결과를 도시하는 대표적인 선 그래프이다.
도 13b는 본 개시의 하나의 구현예에 따른, 중화 항체가 뎅기-나이브 대상체에 대한 4가 제형물 투여 후 반응하는, 미세중화 평가(MNT) 결과를 도시하는 대표적인 선 그래프이다.
도 14는 본 개시의 하나의 구현예에 따른, 4가 제형물 투여 후 다양한 시점에서 모든 4개 뎅기 혈청형에 대해 혈청양성인 임상 시험 대상체의 백분율을 도시하는 대표적인 막대 그래프이다.
도 15는 본 개시의 하나의 구현예에 따른, 4가 제형물 투여 후 다양한 시점에서 모든 4개 뎅기 혈청형에 대해 혈청양성인 임상 시험 대상체의 백분율을 도시하는 대표적인 막대 그래프이다.
도 16은 본 개시의 하나의 구현예에 따른, 4가 제형물 투여 후 다양한 시점에서 모든 4개 뎅기 혈청형의 약학적 조성물을 수여받기 전에 나이브한 혈청양성 임상 시험 대상체의 백분율을 도시하는 대표적인 막대 그래프이다.
도 17은 본 개시의 하나의 구현예에 따른, 모든 4개 뎅기 혈청형의 약학적 조성물을 수여받은 후 여러 혈청형에 대한 혈청양성 임상 시험 대상체(어린이 및 성인)의 백분율을 도시하는 대표적인 막대 그래프이다.
정의
본원에서 이용되는 "하나" 또는 "하나의"는 하나 또는 하나를 초과하는 물품을 의미할 수 있다.
본원에서 명세서에서 이용되는 "대상체" 또는 "대상체들"에는 포유류, 예컨대 인간(예컨대 어린이 내지 성인) 또는 포유류, 길들인 동물 또는 야생동물, 예를 들어 개, 고양이, 다른 가정 애완동물(예컨대, 햄스터, 기니아픽, 마우스, 래트), 흰족제비, 토끼, 돼지, 말, 소, 프레리독, 야생 설치류, 또는 동물원 동물이 비제한적으로 포함될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "바이러스 키메라", "키메라성 바이러스", "플라비바이러스 키메라" 및 "키메라성 플라비바이러스"는 뎅기-2 바이러스의 일부 뉴클레오타이드 서열 및 뎅기-2 바이러스에서 유래되지 않거나 상이한 플라비바이러스로부터 유래되는 추가적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 구축물을 의미할 수 있다. "뎅기 키메라"는 적어도 2개의 상이한 뎅기 바이러스 혈청형을 포함하지만 상이한 플라비바이러스는 포함하지 않는다. 따라서, 다른 뎅기 바이러스 또는 플라비바이러스의 예에는 뎅기-1 바이러스, 뎅기-3 바이러스, 뎅기-4 바이러스, 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 황열 바이러스 및 이의 임의의 조합으로부터의 서열이 비제한적으로 포함될 수 있다.
본원에서 이용되는 "핵산 키메라"는 뎅기 바이러스(예컨대 뎅기-2 바이러스) 뉴클레오타이드 서열의 일부 및 상기 뎅기 바이러스와 동일한 기원이 아닌 추가 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 본 개시의 구축물을 의미할 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 본원에서 개시되는 임의의 키메라성 뎅기 또는 플라비바이러스 키메라는 핵산 키메라의 일례로서 인식될 수 있다.
본원에서 이용되는 "살아있는, 약독화된 바이러스"는 일부 속성에 감소된 병독성, 안전성, 유효성 또는 개선된 성장 등이 포함될 수 있는 백신 또는 다른 면역원성 조성물에서 사용되는 속성에 대해 돌연변이되거나 선택된, 야생형 바이러스를 의미할 수 있다.
본원에서 이용되는 "뎅기 바이러스 제형물" 또는 "면역원성 조성물(들)" 또는 "백신 제형물" 또는 이의 약학적 제형물에는 본원에서 개시되는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드의 다양한 조합이 포함될 수 있고, 이는 대상체에 투여될 수 있고 그 대상체에서 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 야기할 수 있다.
설명
하기 섹션에서, 다양한 구현예를 상세히 설명하기 위해 다양한 예시적인 조성물 및 방법이 기재된다. 당업자에게는 다양한 구현예의 실시가 본원에서 개요로 나타낸 전체 또는 심지어 일부의 특정한 상세사항의 채택을 필요로 하지 않고, 오히려 농도, 시간 및 다른 특정한 상세사항이 일상적인 실험을 통해 개질될 수 있음이 자명할 것이다. 일부 경우에서, 널리 공지된 방법 또는 성분은 설명에 포함되지 않았다.
본 개시의 구현예에 따르면, 당분야의 기술범위 내의 통상적인 분자 생물학, 단백질 화학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기법이 채택될 수 있다. 이러한 기법은 문헌에서 자세히 설명되어 있다. 예컨대, 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1986)]을 참고한다.
본원에서 개시되는 구현예는 대상체, 예컨대 약 1세령 내지 약 20세령의 어린이 또는 젊은 성인에서 1개 또는 최대 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물, 방법, 및 용도에 관한 것이다. 다른 구현예는 개별적으로 또는 동시적으로, 대상체에서 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물, 방법 및 용도에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 약독화된 뎅기 바이러스 및 핵산 키메라는 본원에서 개시되는 백신 조성물에서 생성되고 이용될 수 있다. 일부 구현예는 개질되거나 돌연변이된 뎅기 구축물 또는 키메라에 관한 것이다. 다른 구현예는 돌연변이가 바이러스에 대한 면역원성을 증가시키는 뎅기 바이러스의 구조 단백질의 아미노산 서열을 개질하기 위한 돌연변이의 도입에 관한 것이다.
모든 4개 혈청형의 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스가 세포 배양에서 야생형 바이러스를 계대배양함으로써 개발되었다. 이들은 플라비바이러스 및 특히 뎅기 바이러스 감염 및/또는 질환에 대한 면역화를 위해 가장 전망있는 살아있는, 약독화된 백신 후보의 일부이다. 이러한 백신 후보는 이의 뎅기 혈청형의 조합, 이들이 계대배양되는 세포주 및 이들이 계대배양되는 횟수에 의해 명명되었다. 따라서, PDK 세포에서 13회 계대배양된 뎅기 혈청형 1의 야생형 바이러스는 DEN-1 PDK-13 바이러스로서 명명된다. 다른 백신 후보는 DEN-2 PDK-53, DEN-3 PGMK-30/FRhL-3이다(예컨대, 일차 녹색 원숭이 신장 세포에서 30회 계대에 이어, 태아 붉은털원숭이 폐 세포에서 3회 계대 및 DEN-4 PDK-48). 이러한 4개 후보 백신 바이러스는 각각 야생형 모체 DEN-1 16007, DEN-2 16681, DEN-3 16562 및 DEN-4 1036 바이러스의 조직 배양 계대에 의해 유도되었다.
DEN-2 PDK-53 바이러스 백신 후보(이후, PDK-53)는 온도 민감성, 작은 플라크 크기, 모기 C6136 세포 배양에서 감소된 복제, 온전한 모기에서 감소된 복제, 젖먹이 마우스에 대한 신경독력 손실 및 원숭이에서 바이러스혈증의 감소된 발생률을 포함하는, 약독화와 연관된 몇몇 측정 가능한 생물학적 마커를 갖는다. 후보 PDK-53 백신에 대한 임상 시험은 인간에서 그 안전성 및 면역원성을 실증하였다. 또한, PDK-53 백신은 인간 백신 수신체에서 뎅기 바이러스-특이적 T-세포 기억 반응을 유도한다. 본원에서 일부 구현예는 어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 본원에서 개시되는 키메라성 구축물에서 이용되는 개선된 DEN-2 PDK-53을 기재한다.
뎅기-2 바이러스 골격 및 또 다른 뎅기 바이러스 혈청형의 적어도 하나의 구조 단백질을 갖는 면역원성 플라비바이러스 키메라가 뎅기 바이러스 키메라의 제조를 위해 이용될 수 있으며 뎅기 바이러스 키메라의 생산 방법이 기재된다. 면역원성 뎅기 바이러스 키메라는 단독으로 또는 조합으로, 하나 이상의 혈청형, 예컨대 뎅기 바이러스 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4에 의한 감염을 최소화하거나, 억제하거나, 개체를 면역화하기 위한 면역원성 조성물로서 약학적으로 허용가능한 담체에서 단독으로 또는 조합으로 제공된다. 조합되는 경우, 면역원성 뎅기 바이러스 키메라는 플라비바이러스의 하나를 초과하는 종 또는 균주에 의한 감염에 대해 동시적 보호를 부여하기 위한 다가 백신(예컨대, 2가, 3가 및 4가)으로서 이용될 수 있다. 소정 구현예에서, 뎅기 바이러스 키메라는 공지된 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 2가, 3가 또는 4가 백신으로서 사용되는 면역원성 조성물에서 조합될 수 있고, 상이한 플라비바이러스로부터의 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함함으로써 다른 병원성 플라비바이러스에 대한 면역성을 부여할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 비병독성, 면역원성 뎅기 바이러스 키메라는 약독화된 뎅기-2 바이러스(예컨대, PDK-53)의 비구조 단백질 유전자, 또는 이의 등가물, 및 대상체에서 면역원성이 유도되어야 하는 플라비바이러스의 하나 이상의 구조 단백질 유전자 또는 이의 면역원성 부분을 함유한다. 예를 들어, 일부 구현예는 바이러스 골격으로서 약독화된 뎅기-2 바이러스 PDK-53 게놈, 및 DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4 또는 그에 대해 보호되어야 하는 다른 플라비바이러스, 예컨대 상이한 플라비바이러스 또는 상이한 뎅기 바이러스 혈청형으로부터의 하나 이상의 대응하는 구조 단백질 유전자로 대체된, PDK-53 게놈의 캡시드, 프리멤브레인/멤브레인, 또는 외피, 또는 이의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 구조 단백질 유전자를 갖는 키메라에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 본원에서 개시되는 핵산 키메라는 약독화된 뎅기-2 바이러스의 기능적 특성을 가질 수 있고, 비병독성이지만, 다른 플라비바이러스에 부가하여 DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4의 구조 유전자 산물의 항원성 에피토프를 발현하며 면역원성이다(예컨대, 대상체에서 유전자 산물에 대한 면역 반응을 유도함). 이어서, 이러한 구축물은 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 면역원성 조성물을 생성하기 위해 사용되는 살아있는, 약독화된 바이러스 조성물을 생산하기 위해 1회 이상 53회 초과 계대까지 계대배양된다(예컨대, P1 내지 P10).
또 다른 구현예에서, 핵산 키메라는 비제한적으로 약독화된 뎅기-2 바이러스로부터의 비구조 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및 단독으로 또는 또 다른 플라비바이러스와의 조합으로 뎅기-4 바이러스로부터의 구조 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 키메라일 수 있다. 다른 구현예에서, 약독화된 뎅기-2 바이러스는 개선된 물리적 특성 또는 증가된 면역원성을 위해 선택된 야생형 아미노산에 대한 하나 이상의 복귀된 아미노산을 갖는 백신 균주 PDK-53일 수 있다(실시예 참고). 이러한 특정한 복귀는 어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스 감염에 대한 요법에서 살아있는, 약독화된 뎅기-2로서 또는 본원에서 기재되는 키메라성 구축물로서 사용되는 바람직한 속성을 부여한다. 일부 구현예에는 제2 뎅기 바이러스의 하나 이상의 C, prM 또는 E 단백질의 구조 단백질이 포함된다.
본원에서 개시되는 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에는, 예를 들어, 다른 표적화된 뎅기 바이러스 혈청형과의 간섭을 감소시키기 위해 PDK-53 뎅기-2 게놈에서의 치환, 결실 또는 삽입이 포함될 수 있다. 이러한 개질은 단독으로 또는 본원에서 개시되는 예시적 개질과의 조합으로 구조 및 비구조 단백질에서 수행될 수 있고 약독화된 바이러스를 계대배양하고 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개선된 조성물을 수득함으로써 생성될 수 있다.
본원에서 개시되는 소정 구현예는 재조합 기법을 이용하여, 예를 들어, 하나의 혈청형의 치환 서열을 또 다른 혈청형 골격에 삽입함으로써 키메라성 플라비바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 본원에서 다른 구현예는 추가적인 개선을 위해 확인된(예컨대, 안전하고 효과적인) 살아있는, 약독화된 키메라성 바이러스를 계대배양하고 바람직한 속성을 선택하는 것에 관한 것이다. 소정 구현예에서, 본원에서 이용되는 살아있는, 약독화된 뎅기-2에는 표 3에 나타낸 하나 이상의 돌연변이가 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 출원의 뎅기-뎅기 키메라에는 표 3에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 돌연변이가 포함될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 뎅기-뎅기 키메라에는 Den-2/Den-1, Den-2/Den-3 또는 Den-2/Den-4에 대해 표 3에 나타낸 바와 같은 각각의 키메라에 대한 모든 돌연변이가 포함될 수 있다. 표 3의 구축물로 나타내는 살아있는, 약독화된 바이러스가 포함되는 약학적 조성물이 고려된다. 예를 들어, 1가, 2가, 3가 또는 4가 조성물이 표 3에 제시된 바와 같은 뎅기-뎅기 키메라 및 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스를 이용하여 본원에서의 용도에 대해 고려된다.
소정 구현예에서, 본원에서 고려되는 살아있는, 약독화된 DEN-2 변이체는 약학적 조성물로 제형화될 수 있으며, 여기서 약학적 조성물은 단독으로 또는 뎅기-뎅기 키메라 또는 뎅기-플라비바이러스 키메라와의 조합으로 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 2가, 3가 또는 4가 조성물은 대상체로의 단회 적용에서 또는 다회 적용에서 투여될 수 있다.
플라비바이러스 키메라
뎅기 바이러스 유형 1 내지 4(DEN-1 내지 DEN-4)는 모기-매개 플라비바이러스 병원체이다. 플라비바이러스 게놈은 5'-비코딩 영역(5'-NC), 캡시드 단백질(C) 인코딩 영역, 프리멤브레인/멤브레인 단백질(prM) 인코딩 영역, 외피 단백질(E) 인코딩 영역, 비구조 단백질을 인코딩하는 영역(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) 및 3' 비코딩 영역(3'NC)을 함유한다. 플라비바이러스 구조 단백질에는 C, prM 및 E가 포함된다. 비구조 단백질에는 NS1 내지 NS5가 포함된다. 구조 및 비구조 단백질은 단일 폴리단백질로서 번역되며 세포성 및 바이러스성 프로테아제에 의해 가공된다.
플라비바이러스 키메라는 플라비바이러스과의 뎅기 바이러스 또는 바이러스 종의 하나의 유형, 또는 혈청형으로부터의 비-구조 단백질을 뎅기 바이러스 또는 다른 플라비바이러스의 상이한 유형, 또는 혈청형으로부터의 단백질 유전자, 예를 들어, 구조 단백질 유전자와 융합함으로써 형성되는 구축물일 수 있다. 다른 구현예에서, 플라비바이러스 키메라 구축물은 플라비바이러스과의 뎅기 바이러스 또는 바이러스 종의 하나의 유형, 또는 혈청형으로부터의 비-구조 단백질 유전자를 다른 뎅기 바이러스 혈청형 또는 다른 플라비바이러스로부터 선택되는 폴리펩타이드 또는 단백질의 합성을 유도하는 추가 뉴클레오타이드 서열과 융합함으로써 형성될 수 있다. 다른 구현예에서, 하나의 플라비바이러스로부터 또 다른 플라비바이러스로의 서열의 치환이 고려된다.
다른 구현예에서, 뎅기 키메라는 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스, 또는 이의 균등부의 비구조 단백질 유전자, 및 그에 대한 면역원성이 부여될 뎅기 바이러스 또는 다른 플라비바이러스의 하나 이상의 구조 단백질 유전자, 또는 이의 항원성 부분을 함유할 수 있다.
뎅기 키메라의 구축에서 사용하기 위한 다른 적합한 뎅기 바이러스는 야생형, 병독성 DEN-1 16007, DEN-2 16681, DEN-3 16562 및 DEN-4 1036 및 약독화된, 백신-균주 DEN-1 PDK-13, DEN-2 PDK-53, DEN-3 PMK-30/FRhL-3 및 DEN-4 PDK-48일 수 있다. DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4 야생형/약독화된 바이러스 페어 간의 유전적 차이는 바이러스 게놈에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 내 차이와 함께 고려된다.
일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 뎅기-2 바이러스에는 DEN-2 PDK-53-V 변이체가 포함될 수 있고, 여기서 게놈 뉴클레오타이드 위치 5270은 A에서 T로 돌연변이되며 폴리단백질의 아미노산 위치 1725 또는 NS3 단백질의 아미노산 위치 250은 뎅기-2 전장 서열의 발린 잔기를 함유한다. 상기 뉴클레오타이드 돌연변이가 없는 DEN-2 PDK-53 변이체, DEN-2 PDK-53-E는 상기 위치에서 PDK-53-V와 상이하다. DEN-2 PDK-53-E는 뉴클레오타이드 위치 5270에 A 및 폴리펩타이드 위치 1725, NS3 단백질 아미노산 위치 250에 글루타메이트를 갖는다. 일부 구현예에서, 개질된 PDK 53 뎅기-2에는 본원에서 고려되는 백신 조성물에서 사용되는 더 바람직한 속성을 수득하기 위해 원상태 서열로의 이러한 위치의 하나 이상의 복귀가 포함될 수 있다.
소정 구현예에서, 뎅기-뎅기 키메라에는 개질된 골격 및 다른 뎅기 바이러스 또는 다른 플라비바이러스로부터 삽입된 구조 유전자(prM-E 또는 C-prM-E)를 갖는 DEN-2 바이러스-특이적 감염성 클론이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 뎅기-2 골격 변이체는 뎅기-2 16681 균주(P), PDK-53-E(E), 또는 PDK-53-V(V)로부터 생성될 수 있다; 마지막 글자는 모체(P) 균주 또는 그 백신 유도체(V)로부터의 C-prM-E 구조 유전자 또는 모체(P) 또는 그 백신 유도체(V1)로부터의 prM-E 구조 유전자를 나타낸다. 예를 들어; DEN-2/1-VP는 NS3-250에 발린을 포함하는 약독화된 DEN-2 PDK-53V 골격 및 야생형 DEN-1 16007로부터의 C-prM-E 유전자를 포함하는 키메라를 표시하며; DEN-2/1-VV는 뎅기-1, DEN-1 PDK-13의 백신 균주를 갖는 DEN-2 PDK-53V 골격을 표시하고; DEN-2/1-VP1은 DEN-2 PDK-53V 골격 및 야생형 DEN-1 16007로부터의 prM-E 유전자를 표시하고; DEN-2/3-VP1은 DEN-2 PDK-53V 골격 및 야생형 DEN-3 16562로부터의 prM-E 유전자를 표시하고; DEN-2/4VP1은 DEN-2 PDK-53V 골격 및 야생형 DEN-4 1036으로부터의 prM-E 유전자를 표시한다. 본원에서 개시되는 다른 키메라를 유사한 명명에 의해 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 뎅기-뎅기 키메라는 PDK-53 게놈의 C, prM 및 E 단백질을 인코딩하는 구조 단백질 유전자, 또는 이의 조합이 뎅기-1, 뎅기-3 또는 뎅기-4 바이러스 및 선택적으로 그에 대해 보호될, 또 다른 플라비바이러스, 예컨대 상이한 플라비바이러스(예컨대 지카 또는 황열 또는 이의 조합) 또는 상이한 뎅기 바이러스 균주로부터의 대응하는 구조 단백질 유전자로 대체될 수 있는, 골격으로서 약독화된 뎅기-2 바이러스 PDK-53 게놈을 함유할 수 있다. 살아있는, 약독화된 뎅기-2 PDK-53 바이러스 균주는 뉴클레오타이드 위치 5270에 혼합된 유전형을 갖는다. 바이러스 집단의 상당부(대략 29%)는 NS3-250-Val 돌연변이가 아닌 야생형 DEN-2 16681 바이러스에 존재하는 돌연변이되지 않은 NS3-250-Glu를 인코딩한다. 두 유전적 변이체가 모두 비병독성이므로, 상기 돌연변이가 반드시 비병독성 키메라에 있지 않을 수도 있다.
소정 구현예에서, NS1-53에서의 단일 돌연변이, NS1-53 및 5'NC-57에서의 이중 돌연변이, NS1-53 및 NS3-250에서의 이중 돌연변이 및 NS1-53, 5'NC-57 및 NS3-250에서의 삼중 돌연변이는 DEN-2 바이러스의 약독화를 일으킨다. 따라서, 이러한 유전자위에서 이러한 비-보존적 아미노산 치환 또는 뉴클레오타이드 치환을 함유하는 임의의 뎅기-2 바이러스의 게놈은 본원에서 개시되는 개질된 PDK-53 바이러스의 유도를 위한 기본 서열로서 이용될 수 있다. 5' 비코딩 영역에서의 줄기/루프 구조의 줄기에서의 또 다른 돌연변이는 요망되는 경우, 추가적인 비병독성 표현형 안정성을 제공할 수 있다. 상기 영역에 대한 돌연변이는 바이러스 복제를 위해 중요한 잠재적인 이차 구조를 손상시킨다.
본원에서 개시되는 돌연변이는 관심 세포주(예컨대, Vero 세포)에서 계대배양되면 추가적인 특성을 갖는 선택된 클론을 비제한적으로 포함하는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 당업자에게는 본원에서 기재된 바와 같은 그리고 당분야에 널리 공지된 바와 같은 병독성 스크리닝 검정이 병독성 및 비병독성 골격 구조 간을 구별하기 위해 이용될 수 있음이 이해된다.
플라비바이러스 키메라의 구축
본원에서 개시되는 플라비바이러스 키메라는 그에 대한 면역성이 요망되는 하나의 플라비바이러스의 하나 이상의 구조 단백질 유전자를 PDK-53 뎅기-2 바이러스 게놈 골격 내로 스플라이싱함으로써, 또는 대응하는 PDK-53 유전자를 제거하고 이를 뎅기-1, 뎅기-3 또는 뎅기-4 바이러스 유전자 또는 당분야에 공지된 다른 유전자로 대체하기 위한 재조합 조작을 이용하여 당분야에 공지된 다른 방법에 의해 생산될 수 있다.
대안적으로, 서열 목록에서 제공되는 서열을 이용하여, 플라비바이러스 단백질을 일코딩하는 핵산 분자는 공지된 핵산 합성 기법을 이용하여 합성되고 적절한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본원에서 개시되는 살아있는, 약독화된 바이러스는 당업자에게 공지된 재조합 조작 기법을 이용하여 생산될 수 있다.
다른 플라비바이러스 또는 뎅기 바이러스 혈청형의 구조 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 적합한 키메라성 바이러스 또는 핵산 키메라는 이들을 비병독성을 시사하는 약독화의 상기 표현형 마커에 대해 스크리닝하고 면역원성에 대해 이들을 스크리닝함으로써 백신으로서의 유용성에 대해 평가될 수 있다. 항원성 및 면역원성은 당업자에게 공지된 일상적인 스크리닝 절차를 이용해서 플라비바이러스 항체 또는 면역반응성 혈청과의 시험관내 또는 생체내 반응성을 이용하여 평가될 수 있다.
뎅기 바이러스 백신
소정 구현예에서, 키메라성 바이러스 및 핵산 키메라는 면역원 또는 백신으로서 유용한 살아있는, 약독화된 바이러스를 제공할 수 있다. 일부 구현예에는 위험한 병원성 또는 치사 효과를 생성하지 않으면서 뎅기-4 바이러스에 대해 높은 면역원성을 나타내는 키메라가 포함된다.
단 하나의 혈청형의 뎅기 바이러스에 대해 백신접종된 어린이 및 젊은 성인에서 DHF/DSS의 발생을 감소시키기 위해, 모든 4개 혈청형의 바이러스에 대해 동시적 면역성을 제공하기 위한 4가 백신이 요구된다. 4가 백신은 다가 백신으로서의 투여를 위해 적합한 약학적 담체에서 본 출원의 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스를 본원에서 기재되는 뎅기-2/1, 뎅기-2/3, 및 뎅기-2/4 키메라 또는 다른 뎅기 바이러스 구축물과 조합함으로써 생산될 수 있다.
소정 구현예에서, 본 개시의 키메라성 바이러스 또는 핵산 키메라에는 약독화된 DEN-2 바이러스 골격 상에 야생형 또는 살아있는, 약독화된 바이러스의 구조 유전자가 포함될 수 있다. 예를 들어, 뎅기-2/뎅기-4 키메라는 야생형 DEN-4 1036 바이러스의 구조 단백질 유전자를 발현할 수 있다.
소정 방법에서, 본원에서 기재되는 키메라에서 이용되는 바이러스는 당분야에 공지된 기법을 이용하여 성장시킬 수 있다. 이어서 성장하는 배양의 생활성 및 표현형 특징을 평가하기 위해 바이러스 플라크 적정이 수행되고 플라크가 계수될 수 있다. 야생형 바이러스는 약독화된 후보 원료를 유도하기 위해 배양되는 세포주를 통해 계대배양될 수 있다.
소정 구현예에서, 키메라성 클론은 당업자에게 이용 가능한 다양한 뎅기 혈청형 클론으로부터 구축될 수 있다. 바이러스-특이적 cDNA 단편의 클로닝이 또한 달성될 수 있다. 구조 단백질 또는 비구조 단백질 유전자를 함유하는 cDNA 단편은 다양한 프라이머로 뎅기 바이러스 RNA로부터 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 증폭될 수 있다. 증폭된 단편은 다른 중간체 클론의 절단 부위 내로 클로닝될 수 있다. 이어서 중간체, 키메라성 뎅기 바이러스 클론이 삽입되는 뎅기 바이러스-특이적 cDNA의 정확성을 확인하기 위해 서열분석될 수 있다.
뎅기 혈청형 바이러스의 구조 단백질 및/또는 비구조 단백질 유전자 영역을 벡터 내로 삽입하여 구축되는 전체 게놈-길이 키메라성 플라스미드는 당업자에게 널리 공지된 재조합 기법을 이용하여 수득 가능하다.
뉴클레오타이드 및 아미노산 분석
DEN-2 16681 바이러스의 NS1-53-Gly이 현재까지 서열분석된 진드기-매개 바이러스를 포함하는 거의 모든 플라비바이러스에서 보존되어 있으므로, DEN-2 PDK-53 백신 바이러스에서 NS1-53 돌연변이는 상기 바이러스의 약독화된 표현형을 위해 중요하다. DEN-4 백신 바이러스는 또한 위치 253에서 NS1 단백질에 아미노산 돌연변이를 함유할 수 있다. DEN-4 PDK-48 백신 바이러스에서 Gln-에서-His으로의 돌연변이인 상기 유전자위는 뎅기 바이러스의 모든 4개 야생형 혈청형에서 Gln이다. 상기 Gln 잔기는 플라비바이러스속 내에서 뎅기 바이러스에 고유하다. NS1 단백질은 플라비바이러스-감염된 세포로부터 분비되는 당단백질이다. 이는 감염된 세포의 표면 상에 존재하며, 바이러스-감염된 개체의 혈청에는 NS1-특이적 항체가 존재한다. NS1 단백질로 면역화된 또는 NS1-특이적 항체로 수동 면역화된 동물의 보호가 보고되었다. NS1 단백질은 초기 바이러스 RNA 복제에 참여하는 것으로 나타난다.
소정 구현예에서, DEN-1, -2, -3 및 -4 약독화된 균주의 NS2A, NS2B, NS4A, 및 NS4B 단백질에서 발생한 돌연변이는 보존적 성질이다. DEN-2 및 DEN-4 백신 바이러스의 NS4A-75 및 NS4A-95 돌연변이는 각각 일반적으로 플라비바이러스 중에서가 아니라 뎅기 바이러스 중에서의 아미노산 보존 부위에서 발생하였다.
DEN-4, DEN-3 또는 DEN-1 바이러스를 인코딩하는 핵산 서열(예컨대, 구조 요소)은 벡터, 예컨대 플라스미드 내로 삽입되고, 살아있는 유기체에서(예컨대, 뎅기-2 골격 내로) 재조합적으로 발현되어 재조합 뎅기 바이러스 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 바이러스를 생산할 수 있다.
핵산 검출 방법
본원에서 기재되는 각각의 백신 바이러스에 대한 진단인 신속 유전 평가가 본 개시에 의해 제공된다. 본 개시의 상기 구현예는 바이러스혈증이 발생한 백신접종된 인간의 혈청으로부터 단리된 바이러스의 분석을 증강시킬 뿐만 아니라 후보 백신 바이러스로 면역화된 비인간 영장류에서 바이러스혈증의 특성규명을 증강시킨다.
이러한 서열에는 역전사효소/폴리머라제 연쇄 반응(RT/PCR)뿐만 아니라 후술되는 바와 같이, cDNA 앰플리콘을 증폭하기 위해 설계되는 전방 및 후방 앰플리머를 이용함으로써 바이러스 게놈 RNA 주형으로부터 증폭된 cDNA 앰플리콘의 검출을 보고하는 작용을 하는 진단 TaqMan 탐침이 포함될 수 있다. 소정 예에서, 앰플리머 중 하나는 앰플리머의 3'-말단 끝에서 백신 바이러스-특이적 돌연변이를 함유하도록 설계되었으며, 이는 바이러스 RNA 주형이 해당 특정 돌연변이를 함유하는 경우에만 표적 부위에서의 프라이머의 연장, 및 결과적으로 증폭이 일어날 것이므로, 평가를 효과적으로 백신 균주에 대해서 더욱 더 특이적으로 만든다.
자동화된 PCR-기반 핵산 서열 검출 시스템, 또는 핵산 검출을 위한 다른 공지된 기술이 이용될 수 있다. TaqMan 검정은 샘플 핵산 주형으로부터 PCR-생성된 앰플리콘의 자동화된, 실시간 가시화 및 정량화를 허용하는 고도로 특이적이고 민감한 검정이다. TaqMan은 특이적 서열의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 상기 검정에서, 전방 및 후방 프라이머는 각각 표적 돌연변이 부위의 상류 및 하류에 어닐링하도록 설계된다. 어느 하나의 앰플리콘보다 약 10℃ 더 높은 용융 온도를 갖도록 설계되고 백신 바이러스-특이적 뉴클레오타이드 돌연변이 또는 상보체(검출되고 있는 RT/PCR 앰플리콘 가닥에 따라)를 함유하는 특이적 검출 탐침이 상기 검정의 제3 프라이머 성분을 이룬다.
백신 바이러스 게놈 중 하나에서 돌연변이된 유전자위를 특이적으로 검출하도록 설계된 탐침은 탐침의 중간에 백신-특이적 뉴클레오타이드를 함유할 것이다. 상기 탐침은 바이러스 RNA 주형이 백신 바이러스-특이적인 경우, TaqMan 검정에서 검출 가능한 형광을 생성할 것이다. 그러나, 야생형 DEN 바이러스로부터의 게놈 RNA 주형은 단일 뉴클레오타이드 미스매치(모체 바이러스 DEN 바이러스의 경우) 또는 가능하게는 하나를 초과하는 미스매치(다른 야생형 DEN 바이러스에서 일어날 수 있음)로 인해 탐침 혼성화의 감소된 효율을 가질 것이며 유의미한 형광을 생성하지 않을 것이다. DNA 폴리머라제는 리포터 염료(TaqMan 대립유전자 구별 검정, Applied Biosystems)를 방출하기 위해 미스매치된 탐침을 절단하기보다 RT/PCR 앰플리콘 주형으로부터 미스매치된 탐침을 변위시킬 가능성이 더 높다.
진단 유전 평가를 위한 하나의 전략은 분자 표지(beacon)를 이용한다. 분자 표지 전략은 또한 앰플리콘의 RT/PCR 증폭을 위한 프라이머, 및 리포터 및 탐침 말단에 켄처 염료를 함유하는 탐침에 의한 앰플리콘 내 특이적 서열의 검출을 이용한다. 상기 검정에서, 탐침은 줄기-루프 구조를 형성한다. 분자 표지 검정은 TaqMan 검정에서 이용되는 것들과 상이한 켄처 및 리포터 염료를 채택한다.
약학적 조성물
본원에서의 구현예는 생체내 약학 투여에 적합한 생물학적으로 호환되는 형태로 대상체에 조성물의 투여를 제공한다. "생체내 투여에 적합한 생물학적으로 호환되는 형태"란 임의의 독성 효과를 활성 제제의 치료 효과가 능가하는 투여될 활성 제제(예컨대, 구현예의 약학적 제제)의 형태를 의미한다. 치료 조성물의 치료 활성량의 투여는 요망되는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 그리고 시기 동안 효과적인 양으로서 정의된다. 예를 들어, 화합물의 치료 활성량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 항체가 개체에서 요망되는 반응을 야기하는 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 투여량 요법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 화합물(예컨대, 구현예의 살아있는, 약독화된 바이러스)은 편리한 방식으로, 예를 들어, 피하, 정맥내, 경구 투여에 의해, 흡입에 의해, 피내, 경피 적용, 질내 적용, 국소 적용, 비강내 또는 직장 투여로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 보호 완충액(예컨대, 알부민 및 트레할로스, 폴록사머 407/트레할로스/알부민(FTA))에 함유될 수 있다. 하나의 구현예에서, 조성물은 경구 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 정맥내 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 조성물은 비강내, 예컨대 흡입 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 무바늘 시스템(예컨대, Pharmajet®) 또는 다른 피내 투여 시스템을 이용하여 피내 투여될 수 있다.
소정 구현예에서, 조성물은 적절한 담체 또는 희석제에서 어린이 또는 젊은 성인에게 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 백신은 안정화 제형물(예컨대 알부민 및 트레할로스; FTA, 또는 살아있는, 약독화된 바이러스를 안정화하기 위한 다른 제형물에서 어린이 또는 젊은 성인에게 투여될 수 있다. 본원에서 이용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"에는 또한 희석제, 예컨대 식염수 및 수성 완충 용액이 포함될 수 있다. 살아있는, 약독화된 바이러스 제형물을 그 불활성화를 방지하기 위한 물질과 조합하거나, 화합물을 이 물질과 공동-투여하는 것이 필요할 수 있다. 소정 구현예에서, 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스의 하나 이상의 제형물은 초기 용량으로 피하 또는 피내 투여에 이어 추가접종에 의해 어린이 또는 젊은 성인에게 투여될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물에서 그리고 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 이용 조건 하에, 이러한 제조물은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제 또는 다른 안정화 제형물(예컨대, 살아있는, 약독화된 플라비바이러스 또는 이의 키메라를 안정화하기 위해 사용되는 FTA 또는 다른 안정화 제형물)을 함유할 수 있다.
주사제 용도를 위해 적합한 약학적 조성물은 당분야에 공지된 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사제 용액 또는 분산액의 체외 제조를 위한 멸균 분말이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 멸균성일 수 있고 용이한 주사 가능성을 위해 유체일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 방지는 다양한 항균제 또는 항진균제 또는 다른 제제를 첨가함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형화 시, 용액은 투여량 제형물과 호환되는 방식으로 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 제형물은 다양한 투여량 형태로, 예컨대 상술된 주사제 용액 유형으로 쉽게 투여될 수 있다. 소정 예에서, 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 및/또는 키메라는 특정한 비, 예를 들어 5:4:5:5, 4:4:5:5, 또는 3가 또는 4가 제형물에서 뎅기-3 및/또는 뎅기-4 구축물이 제형물에서 나타내는 뎅기-1 및/또는 뎅기-2에 비해 pfu의 관점에서 적어도 1/2 log 더 큰 다른 비(예컨대 주어진 뎅기 바이러스 혈청형의 PFU)를 갖는 제형물로 전달될 수 있다. 소정 구현예에서, 뎅기-3 및 뎅기-4 살아있는, 약독화된 또는 키메라는 4가 제형물에서 뎅기-1 및/또는 뎅기-2의 pfu 농도보다 적어도 1 log가 더 크다. 일부 구현예에서, DEN2/4 키메라는 다른 뎅기 바이러스 혈청형, 예컨대 살아있는, 약독화된 뎅기-1 및/또는 살아있는, 약독화된 뎅기-2보다 높은 농도로 존재할 수 있다.
소정 구현예에서, 뎅기 제형물의 단회 용량 또는 다회 용량이 또한 약 1세 내지 약 20세 연령의 어린이 또는 젊은 성인에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 어린이 또는 젊은 성인은 단회 용량 제형물로 치료받을 수 있다. 다른 구현예에서, 어린이 또는 젊은 성인은 적어도 2회 용량의 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 제형물로 치료받을 수 있다. 소정 구현예에서, 어린이 또는 젊은 성인에게 0일에 뎅기-뎅기 제형물의 조성물 및 최초 투여의 약 3개월 내에 추가접종 용량이 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 어린이 및 젊은 성인은 뎅기 바이러스에 노출된 적이 없는 나이브 대상체(혈청음성)이다. 다른 구현예에서, 어린이 및 젊은 성인은 뎅기 바이러스 및/또는 뎅기 바이러스 감염에 이전에 노출될 수 있다(혈청양성). 이러한 구현예에 따르면, 혈청음성 어린이 및/또는 혈청음성 젊은 성인은 0일에 치료받은 후 뎅기 바이러스의 증가된 면역 반응을 생성하기 위해 최초 투여의 6개월 내, 5개월 내, 4개월 내, 3개월 또는 그 미만 내에 추가접종을 수여받을 수 있다. 소정 구현예에서, 어린이는 약 2세 내지 약 17세 연령의 어린이일 수 있다. 다른 구현예에서, 어린이는 2세 내지 17세 연령이다.
또 다른 구현예에서, 비강 용액 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제가 대상체에 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 제형물을 전달하기 위해 이용될 수 있다. 소정 제형물에는 부형제, 예를 들어, 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등이 포함될 수 있다.
약학적 조성물은 신체로부터의 신속한 제거에 대해 활성 성분을 보호하는 담체, 예컨대 경시 방출 제형물 또는 코팅과 함께 제조될 수 있다. 이러한 담체에는 제어 방출 제형물이 포함될 수 있고, 예컨대 비제한적으로 미세캡슐화된 전달 시스템, 및 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 폴리오르소에스테르, 폴리락트산 등이 알려져 있다.
소정 구현예에서, 살아있는, 약독화된 뎅기-뎅기 키메라, 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 또는 플라비바이러스 키메라의 용량 범위는 초기에 투여되는 약 102 내지 약 106 PFU일 수 있고, 선택적으로, 필요에 따라, 30일 내 또는 최대 12개월 후 적어도 두 번째 투여가 뒤따를 수 있다. 소정 구현예에서, 대상체는 본원에서 개시되는 1가, 2가, 3가 또는 4가 조성물의 이중 투여를 수여받을 수 있고, 여기서 조성물은 단일 조성 혼합물이거나 상이한 뎅기 바이러스 혈청형의 사전결정된 조성을 갖는다.
임의의 특정 어린이 또는 젊은 성인 또는 임의의 특정 연령의 어린이에 있어서, 특정한 투여량 요법이 개체 필요에 따라 조정될 수 있음이 자명할 것이다. 일부 구현예에서, 투여량 요법은 청소년 대상체, 예컨대 약 20세 연령 이하, 또는 약 18세 연령 이하 또는 약 15세 연령 이하 또는 약 12세 연령 이하 또는 약 9세 연령 이하 또는 약 6세 연령 이하, 또는 약 3세 연령 이하 또는 약 1.5세 연령 이하의 어린이를 수용하도록 조정된다. 소정 구현예에서, 어린이는 2세 내지 17세 연령일 수 있다. 다른 구현예에서, 어린이는 4세 내지 16세 연령일 수 있다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 면역원성 조성물은 하나 이상의 용량으로 어린이 또는 젊은 성인에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 면역원성 조성물은 비제한적으로 동일하거나 상이한 해부학적 위치에서 투여되는 약 6개월 내, 약 120일 내, 약 90일 내, 약 80일 내, 약 70일 내, 약 60일 내, 약 50일 내, 약 40일 내, 약 30일 내, 약 20일 내, 약 10일 내, 약 5일 내, 또는 같은 날에 또는 그 미만에 수 시간 내 또는 수 분 내, 또는 동시를 포함하는, 사전결정된 시기 내에 단회 용량으로, 또는 2개 이상의 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 면역원성 조성물은 서로 약 90일 내, 서로 약 60일 내, 서로 약 30일 내, 및 서로 약 30일 미만으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 조성물은 대상체에 피하 또는 피내 투여될 수 있다. 2개 이상의 해부학적 부위에서의 투여에는 2개 이상의 해부학적 부위에서 동일한 방식에 의해서 또는 2개의 별도 해부학적 부위가 포함되는 2개의 상이한 방식에 의해서를 포함하는 임의의 투여 조합이 포함될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 2개 이상의 해부학적 부위에는 상이한 사지 또는 신체의 상이한 영역이 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, 백신 조성물의 2개 용량이, 예를 들어, 0일에 모든 뎅기 혈청형에 대해 보호하기 위해(예컨대, 교차 보호), 동일하거나 여러 해부학적 위치에서 대상체에 연속 도입될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 면역원성 조성물에는 비제한적으로 대상체에 투여되는 모든 4개 혈청형(예컨대, 4가 제형물)에 대한 면역원성 반응을 유도하는 단회 용량이 포함될 수 있고, 이는 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 소정 구현예에서, 대상체는 단회 용량이 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 적절한 면역 반응을 유도할 수 있는 단회 용량 조성물을 수여받을 수 있다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물에는 다른 플라비바이러스(예컨대, 지카 바이러스, 일본 뇌염, 웨스트 나일, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 황열 또는 다른 바이러스)에 대한 다른 면역원성 제제와의 조합으로, 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 혈청형이 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 뎅기 바이러스에 대한 백신이 다른 관련된 바이러스 감염, 예를 들어, 지카 바이러스 감염을 감소시키기 위해 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시되는 약학적 조성물은 뎅기 바이러스에 대한 면역원성 조성물을 뎅기 바이러스에 대한 이러한 약학적 조성물을 수여받는 어린이 또는 젊은 성인에서 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형(예컨대 뎅기 바이러스의 하나 이상의 구조 또는 비-구조 성분)에 대해 CD8+ T 세포-반응 또는 다른 면역 반응을 추가접종하기 위한 제제와 조합함으로써 어린이 또는 젊은 성인에서 표적 제형물의 면역 반응을 증가시키기 위해 이용될 수 있다.
국소 투여는 세린 프로테아제 억제제의 치료 유효량을 함유하는 국소 적용된 크림, 겔, 린스 등을 통해 달성된다. 경피 투여는 세린 프로테아제 억제제가 피부를 침투하고 혈류에 들어가도록 할 수 있는 크림, 린스, 겔 등의 적용에 의해 달성된다. 또한, 삼투압 펌프가 투여를 위해 이용될 수 있다. 필요한 투여량은 치료받는 특정 상태, 투여 방법 및 신체로부터 분자의 제거 속도에 따라 변할 것이다.
다른 구현예는 비제한적으로 하나 이상의 살아있는 약독화된 바이러스를 살아있는, 약독화된 바이러스(예컨대 플라비바이러스)의 불활성화를 감소시킬 수 있는 조성물과 조합하는 것을 포함하는, 살아있는, 약독화된 바이러스의 불활성화를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 조성물에는 비제한적으로 하나 이상의 단백질 제제; 하나 이상의 당류 또는 폴리올 제제; 및 선택적으로, 하나 이상의 EO-PO 블록 공중합체가 포함될 수 있고, 여기서 조성물은 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화를 감소시키거나 안정화할 수 있다.
소정 구현예에서, 본원에서 고려되는 조성물은 부분적으로 또는 전반적으로 탈수되거나 수화될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에서 약학적 또는 비-약학적 조성물에서의 용도가 고려되는 안정화 단백질 제제에는 비제한적으로 락트알부민, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA), 소 혈청 알부민(BSA), 다른 혈청 알부민 또는 알부민 유전자 패밀리 구성원이 포함될 수 있다. 당류 또는 폴리올 제제에는 비제한적으로 단당류, 이당류, 당 알코올, 트레할로스, 수크로스, 말토스, 이소말토스, 셀리바이오스, 겐티오바이오스, 라미나리보스, 자일로바이오스, 만노바이오스, 락토스, 프룩토스, 소르비톨, 만니톨, 락티톨, 자일리톨, 에리트리톨, 라피노스, 아밀제, 사이클로덱스트린, 키토산, 또는 셀룰로스가 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, 계면활성제 제제에는 비제한적으로 비이온성 계면활성제, 예컨대 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리(프로필렌 옥사이드)의 공중합체(EO-PO 블록 공중합체), 폴리(비닐 피롤로이돈), 알킬 폴리글루코사이드(예컨대 수크로스 모노스테아레이트, 라우릴 디글루코사이드, 또는 소르비탄 모노라우레에이트, 옥틸 글루코사이드 및 데실 말토사이드), 지방 알코올(세틸 알코올 또는 올레일 알코올), 또는 코카마이드(코카마이드 MEA, 코카마이드 DEA 및 코카마이드 TEA)가 포함될 수 있다.
다른 구현예에서, 계면활성제에는 비제한적으로 폴록사머 407(예컨대 Pluronic F127®), 폴록사머 407 대신 또는 이에 부가하여 폴록사머 335, 338 또는 238, 또는 F127®과 유사한 특징을 갖는 다른 EO-PO 블록 공중합체가 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신 조성물에는 비제한적으로 혈청 알부민인 하나 이상의 단백질 제제; 트레할로스인 하나 이상의 당류 제제; 및 하나 이상의 계면활성제 중합체 제제, 예컨대 EO-PO 블록 공중합체, 폴록사머 407 또는 보다 구체적으로, Pluronic F127®이 포함될 수 있다.
다른 구현예에서, 살아있는 바이러스를 안정화하기 위한 제형물에는 하나 이상의 살아있는 플라비바이러스, 하나 이상의 탄수화물 제제, 및 하나 이상의 아미노산 또는 이의 염, 에스테르 또는 아마이드 유도체가 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에서 사용되는 제형물은 상업적 용도를 위한 살아있는, 약독화된 플라비바이러스를 안정화한다. 일부 구현예에서, 조성물에는 완충액이 추가로 포함된다. 이러한 구현예에 따르면, 완충액에는 비제한적으로 포스페이트 완충 식염수(PBS)가 포함될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 완충액에는 나트륨 클로라이드(NaCl), 모노나트륨 및/또는 디나트륨 포스페이트(Na2HPO4), 칼륨 클로라이드(KCl), 및 칼륨 포스페이트(KH2PO4) 중 적어도 하나가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물의 완충액에는 25 mM 내지 200 mM 농도로 나트륨 클로라이드가 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에서 개시되는 조성물에는 요소 및/또는 MSG 다른 적합한 제제가 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 살아있는, 약독화된 플라비바이러스, 예컨대 뎅기 바이러스는 비제한적으로 0.1% 내지 0.2%(w/v) 농도를 갖는 재조합 HSA; 및/또는 약 4.0% 내지 약 6.0%(w/v) 농도를 갖는 수크로스; 및/또는 약 2% 내지 4%(w/v) 농도를 갖는 만니톨 농도; 및/또는 약 8.0 mM 내지 약 22.0 mM 농도를 갖는 알라닌; 및/또는 약 1.0 mM 내지 약 5.0 mM 농도를 갖는 메티오닌; 및/또는 약 8.0 mM 내지 12.0 mM 농도를 갖는 MSG; 및/또는 약 0.1% 내지 약 0.3%(w/v) 농도를 갖는 요소가 포함되는 제형물에서 안정화될 수 있다. 소정 구현예에서, 조성물에는 재조합 HSA, 트레할로스, 만니톨, 알라닌, 메티오닌, MSG 및 요소가 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 안정화 조성물에는 약 0.1% 내지 약 0.2%(w/v) 농도의 HSA; 약 4% 내지 약 6%(w/v)의 트레할로스 농도; 약 2% 내지 약 4%(w/v)의 만니톨 농도가 포함될 수 있고; 여기서 알라닌 농도는 8 mM 내지 22 mM이고; 메티오닌 농도는 1 mM 내지 5 mM이고; MSG 농도는 8 mM 내지 12 mM이고; 및 요소 농도는 0.1% 내지 0.3%(w/v)이다. 살아있는 약독화된 바이러스를 안정화하기 위한 소정 제형물에는 비제한적으로 재조합 HSA, 수크로스, 알라닌 및 요소가 포함될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, HSA 농도는 약 0.1% 내지 약 0.2%(w/v)일 수 있고; 수크로스 농도는 약 4% 내지 약 6%(w/v)일 수 있고; 알라닌 농도는 약 8.0 mM 내지 약 22 mM일 수 있고; 및 요소 농도는 약 0.1% 내지 약 0.3%(w/v)일 수 있다. 다른 안정화 제형물에는 재조합 HSA, 수크로스, 메티오닌 및 요소가 포함될 수 있다. 재조합 HSA 농도는 약 0.1% 내지 0.2%(w/v)일 수 있고; 수크로스 농도는 약 4.0% 내지 약 6.0%(w/v)일 수 있고; 메티오닌 농도는 약 1.0 mM 내지 약 5.0 mM일 수 있고; 및 요소 농도는 약 0.1% 내지 약 0.3%(w/v)일 수 있다. 다른 구현예에서, 안정화 제형물에는 재조합 HSA, 수크로스, 아르기닌 및 요소가 포함될 수 있고, 여기서 재조합 HSA 농도는 0.1% 내지 0.2%(w/v)일 수 있고; 수크로스 농도는 4% 내지 6%(w/v)일 수 있고; 아르기닌 농도는 10 mM 내지 50 mM일 수 있고; 및 요소 농도는 0.1% 내지 0.3%(w/v)일 수 있다. 다른 안정화 제형물에는 재조합 HSA, 트레할로스, 아르기닌 및 요소가 포함될 수 있고, 여기서 재조합 HSA 농도는 약 0.1% 내지 0.2%(w/v)이고; 트레할로스 농도는 약 4% 내지 6%(w/v)이고; 아르기닌 농도는 약 10 mM 내지 50 mM이고; 및 요소 농도는 약 0.1% 내지 0.3%(w/v)이다. 다른 구현예에서, 안정화 조성물에는 재조합 HSA, 트레할로스, MSG 및 요소가 포함될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 재조합 HSA 농도는 약 0.1% 내지 약 0.2%(w/v)일 수 있고; 트레할로스 농도는 약 4.0% 내지 약 6.0%(w/v)일 수 있고; MSG 농도는 8 mM 내지 12 mM이고; 및 요소 농도는 0.1% 내지 0.3%(w/v)이다.
본원에서 일부 구현예는 수송 또는 다른 이유를 위한 부분적으로 또는 전반적으로 탈수된 살아있는, 약독화된 바이러스 조성물에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 조성물은 20% 이상; 30% 이상; 40% 이상; 50% 이상; 60% 이상; 70% 이상; 80% 이상; 또는 90% 이상 탈수될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 바이러스 백신 조성물은 탈수되고 어린이 또는 젊은 성인에게 약학적으로 허용가능한 조성물을 투여하기 전에 임의의 공지된 안정화 조성물에서 재수화될 수 있다.
소정 구현예에서, 대상체는 포유류, 예컨대 인간 또는 수의과 및/또는 길들인 동물 또는 가축 또는 야생 동물일 수 있다. 소정 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 청소년 대상체, 예컨대 20세 연령 이하인 인간 어린이를 면역화하기 위해 효과적일 수 있다. 어린이에서 이용되는 현재의 뎅기 바이러스 백신/면역원성 조성물(예컨대 뎅기/황열 키메라)에 관한 당분야의 상태는 9세 연령 이하 어린이에 있어서 낮은 유효성 및/또는 면역원성을 보고하지만, 본원에서 개시되는 면역원성 조성물은 약 1세 내지 약 17세 또는 약 1세 내지 약 9세 연령, 또는 그 이상인 어린이에서 효과적인 면역 반응을 생성할 수 있다. 본원에서 개시되는 면역원성 조성물은 당분야의 상태에 비해 더 우수한 유효성 및 면역원성을 실증한다.
하나의 예시적인 방법에서, 나타낸 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형을 갖는 본원에서 개시되는 면역원성 조성물(예컨대, 4가 제형물)이 대상체에 투여될 수 있고, 여기서 면역원성 조성물은 대상체에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 야기할 수 있다. 소정 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물에는 본원에서 개시되는 다양한 뎅기 바이러스 혈청형 구축물 또는 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드의 조합이 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물에는 서열번호 9(프리-마스터), 11(MVS), 13(WVS) 또는 15(BVS)로 나타내는 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드; 서열번호 1(프리-마스터), 3(MVS), 5(WVS) 또는 7(BVS)로 나타내는, 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형으로부터의 비구조 단백질 및 뎅기-1 바이러스 혈청형으로부터의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 뎅기-1/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드; 서열번호 17(프리-마스터), 19(MVS), 21(WVS) 또는 23(BVS)으로 나타내는, 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형으로부터의 비구조 단백질 및 뎅기-3 바이러스 혈청형으로부터의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 뎅기-3/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호 25(프리-마스터), 27(MVS), 29(WVS) 또는 31(BVS)로 나타내는, 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형으로부터의 비구조 단백질 및 뎅기-4 바이러스 혈청형으로부터의 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 뎅기-4/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드가 포함될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 이들이 인코딩하는 다양한 폴리펩타이드와 함께 또는 이것이 없이 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 면역원성 조성물에는 서열번호 10(프리-마스터), 12(MVS), 14(WVS) 또는 16(BVS)으로 나타내는 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형에 대응하는 하나 이상의 폴리펩타이드; 서열번호 2(프리-마스터), 4(MVS), 6(WVS) 또는 8(BVS)로 나타내는 뎅기-1/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 하나 이상의 폴리펩타이드; 서열번호 18(프리-마스터), 20(MVS), 22(WVS) 또는 24(BVS)로 나타내는 뎅기-3/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 하나 이상의 폴리펩타이드; 및/또는 서열번호 26(프리-마스터), 28(MVS), 30(WVS) 또는 32(BVS)로 나타내는 뎅기-4/뎅기-2 키메라성 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 하나 이상의 폴리펩타이드가 포함될 수 있다.
본원에서 개시되는 다양한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드(예컨대, TDV-1, TDV-2, TDV-3 및 TDV-4)의 농도는 거의 동일할 수 있거나, 소정 뎅기 바이러스 혈청형은 필요성 또는 하나 이상의 혈청형의 발생에 따라, 다른 것보다 면역원성 조성물에서 더 많이 제시될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 다양한 농도 또는 비는 도 11a 내지 11b에 예시된 바와 같이, 서로에 비해 log PFU 농도로서 표현될 수 있다. 농도는, 예를 들어, TDV-1 대 TDV-2 대 TDV-3 대 TDV-4의 비에 기반하여 본원에서 개시되는 면역원성 조성물의 다양한 4가 제형물에 적용될 수 있다. 농도에는, 예를 들어, 본 개시에 기반하여 당업자에 의해 쉽게 인식될 바와 같이, 제형물에서 제시되는 혈청형의 수, 사전결정된 반응 및 요망되는 효과에 따라, 비제한적으로 임의의 뎅기 바이러스 혈청형의 3:3:3:3, 4:4:4:4, 5:5:5:5, 5:1:5:5, 3:2:3:3, 4:2:4:4, 5:3:5:5, 4:3:4:4, 5:4:5:5, 4:4:5:5, 또는 임의의 농도 비의 log PFU 농도가 포함될 수 있다.
소정 구현예에서, 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스의 농도는 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 보다 균형잡힌 면역 반응을 유도하고 바이러스 간섭을 감소시키기 위해 면역원성 조성물에서 하나 이상의 다른 뎅기 바이러스 혈청형보다 0.5 1, 1.5 2, 2.5 3 또는 4 log PFU 더 낮을 수 있다. 현재 뎅기 바이러스 백신/면역원성 조성물에 관한 당분야의 상태는 뎅기-2 바이러스에 대해 더 낮은 유효성 및/또는 면역원성을 보고하지만, 본원에서 개시되는 면역원성 조성물은 살아있는, 약독화된 뎅기-2 바이러스가 다른 뎅기 바이러스 혈청형보다 적어도 1 log PFU 더 낮을 수 있더라도, 대상체의 60% 초과 그리고 소정 경우에서 약 85%에서(예컨대, 도 15 내지 16 참고) 뎅기-2를 포함하여 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 효과적인 면역 반응을 생성할 수 있는 제형물을 제공한다. 본 개시의 면역원성 조성물은 20세 연령 이하의 대상체에 대해 당분야의 상태에 비해 더 우수한 유효성 및 면역원성을 실증하며 임의의 연령에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 보다 균형잡힌 면역 반응을 제공한다. 소정 구현예에서, 살아있는, 약독화 백신의 하나 이상의 용량의 투여 후 경시적으로 소정 제형물의 유효성을 분석하기 위해 혈청전환율이 평가될 수 있다.
소정 구현예에서, 뎅기 바이러스에 대한 면역원성 조성물에는 약 1.0×103 내지 약 5×105 PFU의 농도를 갖는 뎅기-1/뎅기-2 키메라; 약 1.0×103 내지 약 5×105 PFU의 농도를 갖는 살아있는, 약독화된 뎅기-2; 약 5.0×103 내지 약 5×105 PFU의 농도를 갖는 뎅기-3/뎅기-2 키메라; 및/또는 약 1.0×104 내지 약 5×106 PFU의 농도를 갖는 뎅기-4/뎅기-2 키메라 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 4가 제형물에는 3가 또는 4가 제형물에서 뎅기-1/뎅기-2 키메라 및 살아있는, 약독화된 뎅기-2보다 적어도 1/2 내지 1 log 더 큰 농도의 뎅기-3/뎅기-2 키메라가 포함될 수 있지만, 뎅기-4/뎅기-2는 3가 또는 4가 제형물에서 뎅기-1/뎅기-2 키메라 및 살아있는, 약독화된 뎅기-2보다 적어도 1/2 내지 1 log 더 큰 농도일 수 있다. 소정 구현예에서, 뎅기-3/뎅기-2 및 뎅기-4/뎅기-2 키메라의 농도는 동일할 수 있거나 뎅기-4/뎅기-2 키메라 농도는 본원에서 고려되는 2가, 3가 또는 4가 제형물에서의 뎅기-3/뎅기-4보다 더 클 수 있다. 일부 구현예에서 본원에서 개시되는 조성물 및 방법에 의해 치료받는 대상체는, 예를 들어 대상체의 위치 및 여행 계획에 따라, 1년 2회, 1년 1회, 18개월마다 또는 유사한 요법으로 치료받을 수 있다. 소정 구현예에서, 뎅기 바이러스에 대한 면역원성 조성물에는 약 2.0×104 PFU의 농도를 갖는 뎅기-1/뎅기-2 키메라; 약 5.0×103 PFU의 농도를 갖는 살아있는, 약독화된 뎅기-2; 약 1×105 PFU의 농도를 갖는 뎅기-3/뎅기-2 키메라; 및/또는 약 3.0×105 PFU의 농도를 갖는 뎅기-4/뎅기-2 키메라 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 조성물을 수여받는 어린이 또는 젊은 성인은 뎅기 감염 또는 다른 플라비바이러스 감염에 관련된 임의의 징후 또는 증상의 발생에 대해 일정 시기에 걸쳐 평가될 수 있다. 예를 들어, 어린이 또는 젊은 성인은 뎅기열 또는 뎅기 감염에 관련되는 다른 증상 또는 징후의 개시에 대해 평가될 수 있다.
치료 방법
본 개시의 하나의 구현예에서, 방법은 본원에서 고려되는 살아있는, 약독화된 및/또는 키메라성 바이러스 구축물의 1가, 2가, 3가 또는 4가 제형물을 이용하여 뎅기 바이러스 혈청형(들)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 제공된다.
본 개시의 구현예는 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위에 제한을 부여하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 반대로, 본원에서의 기재의 독서 후, 본 개시의 정신 또는 첨부되는 청구범위의 범위로부터 벗어나지 않고 당업자에게 스스로 제시될 수 있는 다양한 다른 구현예, 개질, 및 이의 균등부에 의지해야 할 수 있음이 명확히 이해되어야 한다.
실시예
하기 실시예는 본원에서 제시되는 소정 구현예를 실증하기 위해 포함된다. 당업자에게는 후속 실시예에서 개시되는 기법이 본원에서 개시되는 실시에서 잘 기능하는 것으로 발견된 기법을 나타내며, 이에 따라 그 실시를 위해 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시의 견지에서, 여러 변화가 개시되는 특정 구현예에서 수행되고 여전히 본원에서의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1
일부 예시적인 방법에서, 본원에서 "마스터 바이러스(MVS)"로서 언급되는 것을 생성하기 위해 이용되는 조성물이 개시된다. 이러한 조성물은 하나 이상의 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스, 예컨대 DEN-1, DEN-2, DEN-3, 및 DEN-4로부터 유도될 수 있다. 소정 방법에서, 조성물은 비제한적으로 TDV-1, TDV-2, TDV-3, 및 TDV-4(예컨대 DENVax로서 이전에 명명됨)로 언급되는 본원에서 개시되는 특정 구축물이 포함되는 하나 이상의 살아있는 약독화된 뎅기 바이러스로부터 유도될 수 있다. 다른 예시적인 방법에서, 이러한 조성물을 생성하고 특성규명하기 위해 이용되는 전략이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 4가 뎅기 바이러스 제형물 및 이러한 제형물의 유전적 및 표현형 특성규명이 제공된다. 이러한 구축물은 1세 내지 20세 연령의 어린이 또는 젊은 성인을 치료하기 위해 사용되는 면역원성 조성물을 생성하기 위해 이용될 수 있다.
프리-마스터 TDV 바이러스의 생산 및 분석
소정 절차를 수행하여 프리-마스터 뎅기 바이러스 씨드, 예컨대 뎅기 바이러스(예컨대, TDV)의 연속 증폭 및 정제를 생성하였다. 먼저, TDV 바이러스를 전장 재조합 TDV cDNA로부터 전사된 바이러스 RNA의 생산-인증된 세포(예컨대, Vero 세포)로의 전달감염에 의해 재유도하여 P1(계대 1) 바이러스 씨드를 생성하였다. 이어서 각각의 뎅기-1 내지 뎅기-4로부터의 4개 P1 바이러스를 증폭하고 플라크 정제하여 후보 프리-마스터 백신 P7 씨드를 수득하였다(표 1 참고). 소정 평가를 수행하여 뎅기 바이러스의 계대를 분석하였다. 예를 들어, 전장 게놈 서열분석으로 모든 4개의 P2(계대 2) 씨드 바이러스가 이의 동종성 선조체인 연구-유도, 연구-등급 후보 백신 바이러스와 유전적으로 동일함을 실증하였다. 원래 플라크 표현형이 또한 P2 바이러스에서 보유되었다. 6개의 플라크 정제된 바이러스(P3 A 내지 F)를 P2 씨드로부터 각 혈청형의 뎅기 바이러스(예컨대, TDV1 내지 TDV4)에 대해 단리하였고, 각각의 단리된 플라크를 2번 더 직접 플라크 정제하였다. 각각의 바이러스의 세 번째 플라크 정제(P5)를 Vero 세포에서 2회 증폭하여(P6 A 내지 F 및 P7 A 내지 F) 잠재적인 프리-마스터 P7 TDV 씨드를 생산하였다(표 1).
WCB-Vero 세포에서 TDV 바이러스의 cGMP 재유도의 실시예
계대 씨드 생산/정제 특성규명
P1 전사된 바이러스 RNA로 WCB-Vero를 전달감염시킴 플라크 적정
P2 P1 바이러스를 증폭함 전체 게놈 서열
P3 P2 플라크 검정으로부터 6개 플라크(A 내지 F)/혈청형을 골라냄 플라크 정제
P4 P3 플라크 검정으로부터 플라크 A 내지 F를 골라냄 플라크 정제
P5 P4 플라크 검정으로부터 플라크 A 내지 F를 골라냄 플라크 정제
P6 P5 A 내지 F 플라크를 증폭함 플라크 적정
P7 프리-마스터 씨드: P6 A 내지 F를 증폭함 전체 게놈 서열, TaqMAMA, 플라크 표현형
P8* MVS: 선택된 P7 바이러스 씨드를 증폭함 전체 유전자 및 표현형 특성규명
P9 WVS: P8 마스터 씨드 바이러스를 증폭함 전체 게놈 서열, TaqMAMA
P10 BVS: P9 워킹 씨드 바이러스를 증폭함 전체 게놈 서열, TaqMAMA
* 하나의 최적 P7 씨드(A, B, C, D, E, 또는 F)를 유전자 및 플라크 분석에 기반하여 선택하여 P8 MVS를 제조함
일부 평가, 예컨대 P7 씨드의 게놈 서열 및 플라크 표현형 분석 및 P2 씨드와의 비교를 추가 수행하여 P7 TDV 씨드를 특성규명하였다(표 2). P7 바이러스의 플라크 표현형은 P2 씨드의 표현형과 일반적으로 유사하였다. 일부 예시적인 실험에서, 바이러스 역가를 모니터링하였다. 바이러스 역가는 5개 바이러스를 제외하고, 대부분의 P7 씨드에 있어서 6.0 log pfu/㎖ 초과에 도달하였다. Vero 세포에서 10회 이상의 연속 계대 후 60개를 초과하는 후보 백신 바이러스 씨드의 게놈 서열분석으로 DENV-2 PDK-53 유전 벡터의 3개의 주요한 약독화 결정기의 NS1-53 및 NS3-250에서 복귀 사례가 확인되지 않아, 이러한 2개 유전자위가 후보 백신 바이러스 씨드에서 상당히 안정함을 제시하였다. 민감한 미스매치 증폭 검정(TaqMAMA)을 개발하여 실시간 RT-PCR에 의해 5'NCR-57 유전자위에서 복귀율을 정확히 측정하였다. 일부 연구에서, 모든 24개 P7 씨드의 5'NCR-57 복귀율을 TaqMAMA에 의해 측정하였다. 검정에서 각각의 바이러스에 대한 입력 바이러스 RNA의 농도에 따라, TaqMAMA의 민감성 한계는 0.01% 내지 0.07% 복귀 범위였으며, 이는 공통 게놈 서열 분석에 의해 검출 가능한 10% 내지 30%의 복귀 민감성 한계보다 훨씬 더 민감하다. 생성된 데이터는 24개 중 15개의 P7 바이러스가 최소 또는 검출 불가능한 복귀(0.07% 미만)를 가졌고, 1개 바이러스(TDV-3-D)가 거의 100% 복귀를 가졌고, 8개 바이러스(예컨대 TDV-1, 1개의 TDV-2, 2개의 TDV-3, 및 4개의 TDV-4)가 0.08% 내지 12.85% 범위의 부분적인 복귀를 가졌음을 예시한다(표 2). 전장 게놈 서열분석을 24개 중 16개 P7 바이러스에 대해 수행하였으며, TaqMAMA에 의해 측정되는 5'NCR57 복귀 수준은 낮았다. 모든 서열분석된 바이러스는 다른 2개의 TDV 약독화 결정기(NS1-53, NS3-250)를 유지하였고, 모두 원래의, 조작된 재조합 cDNA 클론에 존재하지 않는 추가적인 돌연변이를 획득하였다(표 2). 하나의 예시적인 표적 백신 조성물에서, TDV-1-A, TDV-2-F, TDV-3-F, 및 TDV-4-F는 이의 유전형 및 플라크 표현형이 원래 설계된 백신 재조합체의 표현형과 가장 밀접하게 유사하였으므로, 각각의 혈청형에 대한 표적 프리-마스터 씨드로서 선택하였다. TDV-1-A, TDV-2-F, 및 TDV-4-F는 2개의 비-동일한 돌연변이를 가졌고, TDV-3-F는 하나의 돌연변이를 가졌다. 증거는 이러한 4개의 프리-마스터 씨드에서 관찰되는 이러한 추가적인 돌연변이가 그 바이러스에 대한 안전성 우려 또는 면역원성 변형을 유도하지 않음을 제시한다. 이러한 프리-마스터 씨드를 추가 증폭하여 MVS(마스터 씨드, P8로서 명명됨, 표 1)를 생성하였다.
본원에서 제공되는 예시적인 방법은 백신-인증된 Vero 세포를 전달감염하기 위한 순수한 원천으로서 클로닝된 cDNA 플라스미드로부터 정제된 시험관내 전사된 바이러스 RNA를 이용하여 백신 바이러스를 생성하였다. 제조된 백신 씨드가 최적 순도 및 유전적 안정성을 가짐을 보장하도록 연속 플라크 정제 및 전체-게놈 서열 분석을 제조 절차 내로 도입하였다. 6개의 클로닝된 바이러스를 각각의 혈청형의 TDV에 대한 잠재적인 프리-마스터 씨드로서 제조하였다. TaqMAMA 및 전체 게놈 서열분석을 포함하는 게놈 분석뿐만 아니라 바이러스 플라크 표현형의 특성규명을 통해, 프리-마스터 씨드를 선택하여 각각의 혈청형(혈청형 1 내지 4)에 대한 마스터 바이러스 씨드 생산을 진행하였다. 선택된 프리-마스터 씨드는 5'NCR-57 유전자위에서의 복귀가 검출 불가능하였고(0.01% 미만 또는 0.07% 미만), 이의 게놈에 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 가지며 이전에 관찰된 소형 플라크 표현형을 보유하였다.
프리-마스터(P7) 씨드의 특성규명
바이러스 클론a TaqMAMAb Log10 pfu/㎖ 플라크c 게놈에서 확인된 돌연변이d
TDV-1 A ** 6.85 P2 NS2A-116 I-L, NS2B-92 E-D, 1개 침묵화
B * 6.93 P2 nde
C * 6.93 D nd
D ** 7.02 D C-67 K-A; 1개 침묵화
E 0.57% 7.28 P2 nd
F ** 7.18 P2 E473 T-M; 1개 침묵화
TDV-2 A 0.03% 6.33 P2 NS1-341 K-N
B * 6.33 P2 E-305 K-T, 2개 침묵화
C * 5.84 L NS4A-18 T-A, 4개 침묵화
D 0.08% 6.20 P2 NS2B-99 I-L, 1개 3'NCR
E 0.03% 6.31 P2 prM-52 K-E, NS5-412 I-V, 2개 침묵화
F ** 6.15 P2 prM-52 K-E, NS5-412 I-V
TDV-3 A * 6.00 P2 NS5-200 K-N, 1개 침묵화, 1개 3'NCR
B 0.05% 6.27 P2 NS2A-33 I-T, NS2A-59 M-T
C 0.30% 6.25 P2 nd
D 100.00% 6.27 P2 nd
E 0.31% 6.00 P2 nd
F ** 6.30 P2 E-223 T-S, 1개 침묵화
TDV-4 A 0.47% 5.60 P2 E323 K-R/K, NS2B-21 L-F/L, NS2B-39 T-S, 1개 침묵화
B * 5.65 D NS2A-126 A-V; NS4A-5 N-D;NS5-383 K-R, 1개 침묵화
C 4.50% 5.90 P2 nd
D 12.85% 5.97 D nd
E 0.52% 6.85 S prM-85 E-D, NS2B-45 T-A, NS5-320 M-T, NS5-551 E-G, 2개 침묵화
F 0.02% 6.93 S NS2A-66 D-G, NS4A-21 A-V, 4개 침묵화
a MVS의 추가 개발을 위해 선택된 클로닝된 바이러스(연속 플라크 정제에 의해)가 진한 글씨체로 명명함.
b *: 복귀율 < 0.07%(검출 한계). **: 복귀율 < 0.01%(검출 한계)
c 플라크 표현형: P2: P2 바이러스와 유사함; L = P2 바이러스보다 큼, D = 유사한 크기지만, 플라크 투명도가 다소 상이하게 나타남; S = P2보다 작음.
d 조작된 TDV cDNA 클론과 상이한 치환. 아미노산 돌연변이를 바이러스 단백질의 잔기 위치 및 변화(wt-돌연변이)와 함께 기재함. 각각의 씨드의 구조 및 비-구조 유전자에서 침묵화 돌연변이의 총수를 기재함. 비-코딩 영역(NCR)에서의 돌연변이도 표시함.
e nd = 수행하지 않음. 이러한 클론은 다른 클론보다 높은 5'NCR-57 복귀율(TaqMAMA에 의해)을 가져서, 추가 서열 분석에서 배제함.
실시예 2
또 다른 예시적인 방법에서, 마스터 바이러스 씨드, 워킹 바이러스 씨드 및 벌크 바이러스 씨드의 조성물뿐만 아니라 이의 유전적 및 표현형 특성규명이 기재된다. 이러한 조성물은 임상 물질 및 궁극적으로 상업적 백신 공급물질의 제조를 위해 제공된다. 백신 씨드 조성물이 임상 시험 물질의 제조를 위한 최적 안전성 및 유전적 안정성을 가짐을 보장하도록 연속 플라크 정제 및 전체-게놈 서열 분석을 제조 공정 내에 포함시켰다.
MVS, WVS, 및 BVS에 대한 생산 및 제조 품질 제어
일부 연구에서, 인증된 Vero 세포에서 프리-마스터 P7 씨드를 증폭함으로써 4개 TDV의 MVS를 생산하였다. 다른 연구에서, MVS를 이용하여 세포 공장에서 다량의 WVS를 제조하였다. 추가로, TDV의 BVS 스톡을 WVS로부터 증폭하고 인간 임상 시험을 위해 이용하였다. 정체, 감염 역가, 멸균성, 미코플라즈마, 그리고 시험관내 및 생체내 외래성 제제에 대한 전체 MVS, WVS 및 BVS의 평가를 포함하여, 일부 예시적인 방법에서 출시 제품에 대한 품질 제어를 수행하였다. 모든 씨드는 혈청형-특이적 RT-PCR 검정을 이용하는 바이러스 정체 평가를 통과하였고, 그 혈청형에 대응하는 양성 증폭 및 이종성 혈청형에 대해 음성을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). MVS, WVS, 또는 BVS 스톡에서 검출 가능한 미코플라즈마 또는 외래성 제제는 검출되지 않았다.
하나의 예시적인 방법에서, 나타낸 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형을 갖는 본원에서 개시되는 면역원성 조성물(예컨대, 4가)은 어린이 또는 젊은 성인에게 투여할 수 있었고, 여기서 면역원성 조성물은 어린이 또는 젊은 성인에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 야기할 수 있다.
MVS, WVS, 및 BVS의 유전적 분석
소정의 예시적인 방법에서, 선택된 프리-MVS로부터 MVS의 생성 후, 상기 선택된 (P7) 균주를 생산하고 각각의 바이러스 RNA를 다시 서열분석하였다. 전장 게놈 서열분석은 TDV-1에 대한 MVS가 그 프리-마스터 씨드와 동일한 반면, WVS 및 후속 BVS는 E-483 및 NS4B-108에서 2개의 추가적인 치환을 획득함을 드러내었다(표 2 및 3 참고). E-483에서의 Ala 치환은 MVS에서 일부 유전형을 나타내었으나, BVS에서는 우성 유전형이 되었다. TDV-2 및 TDV-3은 이들 각각의 프리-마스터 씨드와 동일하였다(표 2 및 3). TDV-2 MVS는 그 프리-마스터 씨드와 동일하였고, WVS 및 BVS는 NS4A-36 및 NS4B-111에 2개의 추가적인 돌연변이를 가졌다. 두 돌연변이 모두 WVS에서는 부분적이었고, BVS에서는 주요 유전형이었다. TDV-3의 MVS도 프리-마스터 씨드와 동일하였으나, WVS 및 BVS는 NS4A-23에 추가적인 아미노산 치환을 함유하였다. TDV-4 MVS는 MVS의 생산 동안 유전자위 NS2A-99에서 추가적인 아미노산 돌연변이(Lys에서 Lys/Arg 혼합 유전자형으로)를 획득하였다(표 3). 그 WVS 및 BVS는 NS2A-99 Lys/Arg 혼합 유전형을 보유하였고, BVS는 추가적인 NS4B-238 Ser/Phe 혼합 표현형을 가졌다. 공통 서열 결과도, MVS, WVS 뿐만 아니라 BV가 5'NCR-57, NS1-53, 및 NS3-250 유전자위에서 약독화의 3개 유전적 결정기를 보유함을 확인시켜주었다. TaqMAMA에 의한 가장 덜 안정한 약독화 유전자위의 분석은 MVS 가운데 0.7% 미만 내지 0.13%, WVS 가운데 0.07% 미만, 및 BVS 가운데 0.07% 미만 내지 0.21%의 5'NCR-57 복귀율을 실증하였다. 5'NCR-57 유전자위에서의 3% 복귀는 백신 로트의 허용성을 위한 최대 허용율로 간주되었다(표 3).
전체-게놈 서열 분석은 추가적인 아미노산 돌연변이가 TDV-4 MVS에서 발생한 반면, 다른 3개의 TDV MVS 로트는 이의 프리-마스터 씨드의 공통 게놈 서열을 보유함을 드러내었다. P1 씨드부터 프리-마스터(P7) 씨드까지, 주어진 씨드에서는 1개 또는 2개의 비-동일 돌연변이만이 발생하였다. P1부터 MVS(P8) 씨드까지, 임의의 주어진 TDV 씨드에서는 2개 내지 7개 뉴클레오타이드 치환이 확인된 반면, 이러한 치환 3개 중 2개만 아미노산 변화를 일으켰다. MVS에서의 모든 침묵화 돌연변이는 바이러스 복제에 영향을 미칠 수 있는 5' 또는 3'NCR 내에 있지 않았다. TDV-2의 prM-52 Lys-Glu에서의 변화 및 TDV-4의 NS2A-66 Asp-Gly에서의 치환만 보존적 변화가 아니다. TDV-4의 NS2A-66 돌연변이는 DENV-2 PDK-53의 비구조 골격 부분에 있다. NS2A-66 유전자위는 DENV-2의 다양한 균주 가운데 보통 Asp이지만, 이는 DENV-4에 있어서는 보통 Gly이다. TDV-4에서 Asp에서 Gly으로의 변화는 Vero 세포에서 TDV-4의 적합성에 관련될 수 있다. TDV-2 prM-52 돌연변이는 성숙한 바이러스 입자로부터 절단 제거되는 prM의 C-말단 부분에 존재한다. 일부 예시적인 방법에서, 표현형 특성규명을 수행하여 MVS 씨드에서의 모든 돌연변이가 백신의 약독화 표현형을 유의미하게 변형시키지 않음을 확인하였다.
TDV 바이러스는 제조 공정 동안 높은 유전적 안정성을 실증하였다. 5'NCR, NS1-53, 및 NS3-250에 위치하는 3개의 정의된 DENV-2 PDK-53 약독화 유전자위는 프리-마스터 균주에서부터 벌크 백신 제조까지의 TDV의 연속 계대 시 공통 게놈 서열에서 안정하게 유지되었다. 5'NCR-57 유전자위의 고민감성 TaqMAMA는 뎅기 바이러스 혈청형의 MVS, WVS(P9/워킹), 및 BVS(백신에 대한 벌크 바이러스 씨드)에서 최소 또는 검출 불가능한 복귀를 실증하였다. TDV BVS 제조물(P10-등가물)의 5'NCR-57 복귀율은 Vero 세포에서 10회-연속 계대 후 연구-등급 백신 후보에서 발생한 5'NCR-57 복귀율(4% 내지 74% 복귀)보다 상당히 더 낮았다. 본원에서 제공되는 TDV 씨드의 대규모 제조를 위한 전략은 후보 백신 바이러스에서 약독화 마커를 보유한 유전적으로 안정한 백신 씨드를 생성하였다.
모든 TDV 바이러스 구축물은 안정화 완충액, 예를 들어, FTA, 폴록사머 407 F127®(0.01% 내지 약 3.0% w/v) 및 약 5% 내지 약 50%(w/v) 트레할로스, 2 및 약 0.01% 내지 약 3.0% 알부민(예컨대 rHSA)에서 보관할 수 있다.
안전성 및 생체내 면역원성
본 실시예에서, 예시적인 조성물이 피하 주사 후 안전하며 본질적으로 면역학적으로 불활성임을 실증한다. 4개의 상이한 예시적인 조성물을 하기와 같이 마우스에서의 평가를 위해 선택하였다(데이터는 나타내지 않음).
제형물 1: 15% 트레할로스, 2% F-127, 1% rHSA
제형물 2: 15% 트레할로스, 2% F-127, 1% rHSA, 1 mM CaCl2/0.5 mM MgSO4
제형물 3: 15% 트레할로스, 2% F-127, 1% rHSA, 0.5% 키토산
제형물 4: 22.5% 트레할로스, 3% F-127, 1.5% rHSA
제형물 5: PBS
TDV MVS의 플라크 표현형
하나의 예시적인 방법에서, TDV MVS의 플라크 표현형을 Vero 세포에서 야생형 뎅기 바이러스 및 이의 동종성 연구-등급 키메라성 바이러스와 비교하였다(도 2). TDV-1, -2, 및 -3의 모든 MVS는 이의 야생형 상동체보다 유의미하게 더 작고 Vero 세포에서 이의 동종성 연구-등급 바이러스와 매우 유사한(0.4-mm 차이 이내) 플라크를 생성하였다. TDV-4 MVS는 또한 야생형 DENV-4보다 유의미하게 더 작았지만, 원래의 실험실 유도된 D2/4-V 키메라보다 약간 더 컸다(0.9 mm 차이).
도 2는 대조군 야생형 바이러스 및 연구-등급 백신 후보 바이러스와 대비되는 TDV MVS의 플라크 크기를 예시하는 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 아가로스 오버레이 하에 Vero 세포에서 바이러스 플라크의 평균 플라크 지름(mm) ± SD(오차 막대)를 9일 pi에 측정하였다. 검은색 막대로 나타내는 야생형 DEN 바이러스, 및 흰색 막대로 나타내는 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 대조군 및 회색 막대로 나타내는 TDV 마스터 백신 씨드와의 비교를 위해 포함되었다.
TDV MVS 의 온도 민감성
또 다른 예시적인 방법에서, TDV MVS에 대해 온도 민감성을 Vero 세포에서 평가하고 이의 동종성 야생형 및 원래의 연구-등급 키메라성 백신 바이러스와 비교하였다. 야생형(WT) DENV-3 16562는 온도 민감성이 아니었다. wt 뎅기 바이러스 혈청형 1 및 뎅기 바이러스 혈청형-4는 39℃에서 온건하게 온도 민감성이었다(역가는 37℃에서보다 39℃에서 대략 1.0 log10 pfu/㎖ 더 낮았음, 도 3). WT 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681은 평가된 WT 뎅기 바이러스에서 가장 온도 민감성이었고, 39℃에서 100-배의 역가 감소를 일으켰다. TDV-1, -2, 및 -3은 이의 원래의 동종성 연구-등급 키메라성 백신 바이러스와 마찬가지로 온도 민감성이었다(도 2). 이러한 TDV 균주에 있어서 39℃에서의 역가는 2.0 내지 3.0 log10 pfu/㎖ 감소되었다. TDV-4도 온도 민감성으로, 역가에서 5-배 감소를 실증하였다. 그러나, 원래의 연구-등급 D2/4-V는 역가에서 약 10-배 감소를 실증하였다. 최종 안정화된 TDV-4 MVS는 폴록사머 407, F127®(및 이러한 제형물을 안정화하기 위한 다른 제제(FTA 또는 2가 제형물, 알부민 및 트레할로스))을 함유하였고, 이는 이전에 뎅기 바이러스의 열적 안정성을 증강시킴을 실증하였다. TDV-4 MVS에서 F127®의 존재는 Vero 배양 검정에서 바이러스의 덜 현저한 온도 민감성에 기여했을 수 있다. 별도 실험에서, F127®의 부재 하에 MVS-유래 TDV-4 균주의 온도 민감성을 추가 평가하였다. 균주로부터 폴록사머 407, F127®을 제거하기 위해, 바이러스 RNA를 TDV-4 벌크 바이러스 제조물로부터 단리하였고 Vero 세포 내로 전달감염시켰다. 상기 TDV-4 바이러스는 폴록사머 407, F127®의 부재 하에 3일 감염 후 D2/4 V 연구 균주와 마찬가지로 온도 민감성인 것으로 나타났다(역가가 1.5 log10 pfu/㎖ 감소됨)(도 3).
도 3은 TDV MVS의 온도 민감성을 예시하는 예시적인 히스토그램을 예시한다. 야생형 뎅기 바이러스 및 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 비교를 위해 포함되었다. TDV-4 MVS는 상기 검정에서 바이러스의 온도 민감성 결과를 차폐할 수 있는 추가적인 폴록사머 407, F127®을 함유한다. F127®의 부재 하에 대리물 TDV-4를 분석하는 별도의 실험이 또한 포함되었다. 37℃ 또는 39℃에서 Vero 세포에서 복제된 바이러스의 평균 역가 ± SD(오차 막대).
모기 C6/36 세포에서 TDV MVS 복제
일부 예시적인 방법에서, 연구-등급 키메라성 백신 바이러스가 이러한 모기 세포에서 골격 DENV-2 PDK53 바이러스의 약독화 표현형을 보유한다는 지식과 함께, TDV MVS를 C6/36 세포에서 성장시켜 이의 시험관내 약독화 표현형의 보유를 확인하였다. wt 뎅기 바이러스에 비해, TDV-1, TDV-2 및 TDV-4 MVS는 6일 감염 후(pi) C6/36 세포에서 유의미한 성장 감소(적어도 3 log10 pfu/㎖ 감소)를 나타내었다(도 4). TDV-3 MSV는 또한 wt DENV-3 16562에 비해 감소된 성장을 나타내었으나, 감소는 현저하지 않았다(1 내지 2 log10 pfu/㎖ 감소). 그러나, TDV-3 씨드 로트의 C6/36 역가는 원래의 연구-등급 키메라성 D2/3-V 백신 바이러스의 C6/36 역가와 유사하였다(1 log10 pfu/㎖ 차이 이내).
도 4는 wt 뎅기 바이러스(검은색 막대) 및 연구-등급 백신 바이러스(흰색 막대)에 비해 C6/36 세포에서 TDV MVS(회색 막대)의 제한된 성장을 도시하는 예시적인 히스토그램을 예시한다. 6일 pi에 C6/36 세포에서 복제된 바이러스의 평균 역가 ± SD(오차 막대).
전체 모기에서 바이러스 감염율, 전염율, 및 전파율
일부 예시적인 방법에서, TDV의 감염율 및 전염율을 이의 모체 wt 뎅기 바이러스와 비교하였다. 소정의 예시적인 실험에서, 경구 감염 실험을 Ae. 애집티 모기에서 수행하였다. 감염성 혈액 식사를 역-적정하여 바이러스 역가를 측정하고 각각의 혈청형에 있어서 모체 뎅기 바이러스 및 TDV 간 혈액 식사에서 유사한 바이러스 역가(1 log10 pfu/㎖ 미만 차이)를 갖는 실험만 표 4에서 비교를 위해 포함시켰다. TDV-1, TDV-2, 및 연구-등급 D2 PDK-53-VV45R은 경구 섭식을 통해 모기를 감염시키지 않았고, 이는 이의 모체 바이러스, DENV-1 16007(44% 감염) 및 DENV-2 16681(43.3% 감염)과 유의미하게 상이하다(p < 0.0001). TDV-1 및 -2에 의해 모기가 감염되지 않았으므로, 이러한 2개 백신 바이러스에 대한 전염 우려는 거의 내지 전혀 없었다. TDV-4는 경구 섭식을 통해 일부 모기를 감염시켰지만(55마리 중 2마리), 감염율은 그 모체 야생형 바이러스, DENV-4 1036(50마리 중 8마리)보다 유의미하게 더 낮았다(p < 0.05). TDV-3은 5.2±0.02 log10 pfu/㎖의 혈액 식사 바이러스 역가를 갖는 2개 실험에서 어떠한 모기도 감염시키지 않았고(표 4), 6.0 log10 pfu/㎖의 혈액 식사 바이러스 역가를 갖는 별도 실험에서, 30마리 중 1마리 모기만 감염되었다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 야생형 뎅기 바이러스-3 16562도 5.2 log10 pfu/㎖에서 매우 낮은 감염율(8%)을 가졌고, 그 비율은 6.2 log10 pfu/㎖로 더 높은 혈액 식사 바이러스 역가를 갖는 별도 실험에서 증가하지 않았다(3%, 30마리 중 1마리 모기가 양성, 데이터는 나타내지 않음). 야생형(WT) 뎅기 바이러스-3 및 뎅기 바이러스-4는 야생형 뎅기 바이러스-1 및 뎅기 바이러스-2보다 유의미하게 더 낮은 감염율을 가졌지만, 감염된 모기에서의 평균 바이러스 역가는 유사하였다(3.1 내지 3.9 log10 pfu/모기). 대조적으로, 2마리의 감염된 모기로부터의 TDV-4 역가는 둘 다 최소였으며(0.7 log10 pfu/모기), 이는 야생형 뎅기 바이러스 혈청형-4 1036에 의해 감염된 모기로부터의 역가(3.9 ± 1.5 pfu/모기)보다 1000-배 더 낮았다.
감염된 모기에 있어서, 중장 밖으로의 전염은 바이러스가 다리에 존재하는지 여부를 결정함으로써 평가될 수 있었다. 4개의 모체 DENV는 36.3% 내지 62.5% 범위의 전염율을 생성하였으며, 다리로부터 이의 평균 바이러스 역가(log10 pfu)는 0.9±0.3 내지 2.2±0.7이었다(음성 샘플 제외). 2마리의 TDV-4 감염된 모기 중 어느 것도 다리에 바이러스 전염을 일으키지 않았다(표 4). 전염된 바이러스는 다리에서 검출 가능했지만, 4개의 wt 뎅기 바이러스 중 어느 것도 경구 감염된 모기의 침에서 검출 가능하지 않아, 경구 섭식 조건이 이러한 DENV의 전파율을 측정하기 위해 충분히 민감하지 않을 수 있음을 제시하였다. 따라서, 다른 예시적인 방법에서, 직접적인 IT 접종에 의한 고엄격성 인공 모기 감염을 후속 수행하였다(표 4). TDV-4를 제외하고, 모든 바이러스(wt 및 TDV)가 IT 접종된 Ae. 애집티의 100% 감염을 달성하였다. TDV-4 접종물은 다른 3개의 바이러스 접종물보다 약간 더 낮은 바이러스 역가를 가졌지만, 여전히 접종된 모기의 70%를 성공적으로 감염시킨다. IT 접종에 의해 달성되는 높은 신체 감염율에도 불구하고, 모든 4개 TDV 바이러스는 wt 뎅기 바이러스(43% 내지 87%, 표 4)에 비해 유의미하게 더 낮거나(p < 0.005) 검출 불가능한 전파율(0% 내지 10%)을 나타내었다. TDV 바이러스는 경구 섭식 후 감염 및 전염을 거의 내지 전혀 실증하지 않았고, 고엄격성 IT는 Ae. 애집티에서 이러한 TDV 바이러스의 최소 전파능을 확인시켜주었다.
전체 모기에서 바이러스 감염율, 전염율, 및 전파율
바이러스 경구 섭식 IT 접종
혈액 식사 a 감염 b 신체 역가 c 전염 e 접종 감염 b 신체 역가 c 침 f
평균±SD % (P/N) 평균±SD p d %(P/N) f pfu /용량 % (P/N) 평균±SD % (P/N) p d
DENV-1 16007 6.6 44.0%(11/25) 3.6 ± 1.5 36.3%(4/11) 53.9 100%(30/30) 4.7 ± 0.48 43%(13/30)
TDV-1 6.9 0%(0/30) NA <0.0001 NA 67.8 100%(30/30) 3.4 ± 0.39 10%(3/30) <0.005
DENV-2 16681 6.6 43.3%(13/30) 3.1 ± 1.5 38.5%(5/13) 67.8 100%(30/30) 5.2 ± 0.34 87%(26/30)
D2 PDK53-VV45R 6.4 0%(0/30) NA <0.0001 NA 56.4 100%(30/30) 4.0 ± 0.20 0%(0/30) <0.0001
TDV-2 6.4 0%(0/30) NA <0.0001 NA 52.7 100%(30/30) 3.5 ± 0.27 7%(2/30) <0.0001
DENV-3 16562 5.2 8%(2/25) 3.8 ± 0.2 50%(1/23) 34.0 100%(30/30) 4.2 ± 0.50 67%(20/30)
TDV-3 5.2 ± 0.02 0%(0/50) NA 0.108 NA 37.3 100%(30/30) 3.3 ± 0.36 3%(1/30) <0.0001
DENV-4 1036 5.8 ± 0.5 16%(8/50) 3.9 ± 1.5 62.5%(5/8) 69.4 100%(30/30) 5.2 ± 0.45 70%(21/30)
TDV-4 5.4 ± 0.4 3.6%(2/55) 0.7 ± 0.0 0.033 0%(0/2) 11.8 70%(21/30) 1.1 ± 0.46 0%(0/21) <0.0001
a 역 적정에 의해 혈액 식사에서 하나를 초과하는 실험으로부터 유래되는 경우 바이러스 역가 또는 평균±표준 편차(log10 pfu/㎖)
b 모기 신체에서 검출된 바이러스의 비율. P/N = 양성/총 모기
c 모기 신체에서 평균 바이러스 역가 ± 표준 편차(log10 pfu/모기), 양성 샘플만 계산에 포함됨
d Fisher 정확성 확률에 의한 wt DENV 및 TDV 간 차이의 통계 분석
e 양성 감염 모기의 다리에서 검출된 바이러스의 비율
f 양성 감염 모기의 침에서 검출된 바이러스의 비율. 전파 효율을 측정하기 위해 이용됨
벡터 적격성은 살아있는-약독화된 플라비바이러스 백신 바이러스에 대해 중요한 안전성 성분이다. 이전에, 연구-등급 DENV-2 PDK-53-VV45R 바이러스 및 wt 복귀 돌연변이 유도체가 Ae. 애집티에서 평가되었고, NS1-53-Asp 약독화 돌연변이가 손상된 복제에 대한 우성 결정기인 것으로 확인되었다. DENV-2 PDK-53 백신의 다른 2개의 주요 약독화 유전자위인 뉴클레오타이드 5'NCR-57-T 및 NS3-250-Val도 모기에서 복제에 대해 일부 억제 효과를 나타내었고, 이에 따라 모기 벡터 적격성을 위해 추가적인, 중복 제약을 제공하였다. 본원에서 기재되는 일부 예시적인 방법을 이용하여 모든 4개 TDV 균주에 대한 모기 경구 및 IT 감염 및 복제를 평가하였다. TDV-1, -2, 및 -3은 경구 감염을 통해 어떠한 Ae. 애집티 모기도 감염시키지 않았다(표 4). TDV-4는 wt DENV-4 감염된 모기에서보다 낮은 모기 신체에서의 복제 평균 역가를 가지며, wt DENV-4에서보다 유의미하게 더 낮은 수준인 3.6%의 경구 노출된 모기만 감염시켰다. 놀랍게도, TDV-4가 감염된 모기의 다리에서 검출되어, TDV-4가 경구 감염 후 모기 중장으로부터 전염될 수 없음을 제시하였다. TDV-1, -2, 및 -4에 대한 감염율은 모두 이의 야생형 대응물보다 유의미하게 더 낮았지만, TDV-3 및 WT DENV-3 16562 간 차이는 두 바이러스 모두에 대한 매우 낮은 감염율로 인해 유의미하지 않았다. TDV를 조작하기 위해 이용된 모체 야생형 뎅기 바이러스 균주는 동일한 태국의 Mae Sot 지방으로부터 수집된 Ae. 애집티에서 평가된 DENV의 다른 야생형 균주에 비해, 경구 감염에 의해 더 낮은 감염율 및 전염율을 갖는 것으로 나타났다. 황열(YF) 17D 백신-기반 ChimeriVax-DEN 백신의 조작을 위해 이용된 wt DENV-1 PUO359, DENV-2 PUO218, DENV-3 PaH881/88, 및 DENV-4 1288은 47% 내지 77% 범위의 감염율을 가졌다. 대조적으로, YF 17D 백신은 Ae. 애집티를 감염시킬 수 없다. ChimeriVax 균주는 이러한 고감염성 wt DENV로부터의 prM-E를 함유하였으나, ChimeriVax는 이의 YF 17D 복제 골격의 모기 약독화 표현형을 보유한다. 본원에서 제공되는 결과는 또한 DENV-2 PDK-53 골격의 모기 약독화가 TDV 균주에서 유지됨을 시사하였다. 또한, 본원에서 기재되는 조성물에 포함되는 구축물에서 더 낮은 모기-감염성을 갖는 wt 뎅기 바이러스 균주의 이용은 추가적인 안전성 특성을 제공한다.
하나의 예시적인 방법에서, 경구 감염 결과는 TDV가 최소 모기 감염성 및 전염능을 가졌음을 예시한다. 또한, 보다 민감하고 엄격한 IT 감염 실험을 수행하여 TDV가 Ae. 애집티에 의해 전파될 가능성을 추가 분석하였다. IT 결과는 모든 4개 TDV 바이러스가 이의 wt 대응물에 비해 검출 불가능하거나 최소의 모기 전파 가능성을 가짐을 실증하였다. TDV 전파는 이론적으로 (1) 벡터가 모기 중장을 감염시키기 위해 충분한 바이러스혈증 역가를 가지는 백신접종자에 섭취되며, (2) 바이러스가 중장 상피에서 복제할 수 있고 이후 중장 밖으로 전염될 수 있고, 및 (3) 전염된 바이러스가 침샘에서 복제하고 전파를 위해 침에 충분한 바이러스를 내뱉을 수 있는 경우에만 일어날 수 있다. 모기를 감염시키기 위해 요구되는 인간 바이러스혈증의 역치는 적절히 확립되지는 않았으나, 천연 wt DENV 감염 후 인간 바이러스혈증은 106 내지 108 모기 감염 용량50(MID50)/㎖일 수 있다. 상기 MID50은 희석된 인간 혈장을 이용한 모기의 직접적인 IT 접종에 기반하였다. 비인간 영장류에서 TDV의 분석은 TDV 면역화 후 바이러스혈증 역가가 매우 낮고(2.4 log10 pfu/㎖ 미만) 2일 내지 7일 동안 지속됨을 시사하였다. TDV의 낮은 바이러스혈증 수준 및 낮은 모기 감염능, 전염능, 및 전파능으로, 이러한 백신 바이러스는 자연에서 모기에 의해 전파되거나 바이러스혈증을 유도할 수 없을 것이다.
따라서, 임의의 혈청형(P1 내지 P10)의 임의의 계대가 조성물에서 이용되어 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 안전하고 효과적인 백신을 생성할 수 있음이 제안된다.
젖먹이 마우스에서의 신경독력
원래의 연구-등급 백신 바이러스는 DVBD/CDC에서 내부 유지되는 신생 ICR 마우스에서의 신경독력에 대해 고도로 약독화되었다. 모든 이러한 마우스는 104 pfu의 각각의 백신 바이러스로의 ic(뇌내) 유발접종에서 생존하였다. 반면에, wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681 바이러스는 다양한 실험에서 이러한 CDC-ICR 마우스에서 62.5% 내지 100% 사망률을 일으켰다. 일부 실험에서, Taconic Labs으로부터 입수된 상업적 ICR 마우스(Taconic-ICR)를 이용하여 신생 마우스에서 신경독력을 연구하였다. 신생 Taconic-ICR 마우스는 이전의 CDC-ICR 마우스에 비해 뎅기 바이러스 혈청형-2 감염에 상당히 더 감수성인 것으로 관찰되었다. 도 5a는 CDC-ICR 콜로니 및 104 pfu의 바이러스로 ic 유발접종된 Taconic-ICR 신생 마우스에서 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681의 신경독력을 요약한다. Taconic-ICR 마우스(32마리 마우스에서 100% 사망률, 평균 생존 시간 8.3 ± 0.5일)는 이전의 CDC-ICR 마우스(72마리 마우스에서 91% 치사율, 평균 생존 시간 14.6 ± 2.3일)에 비해 ic 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681 유발접종에 더 감수성이었다.
다른 예시적인 방법에서, TDV MVS의 신경독력을 평가하기 위해, Taconic-ICR 마우스를 처음에 1개(n=16) 또는 2개(n=31 내지 32)의 실험에서 대략 104 pfu 용량의 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681, D2 PDK-53 VV45R, D2/3-V, 또는 TDV 1-4 바이러스로 ic(뇌내) 유발접종하였다(도 5b). 상기 용량에서, D2/3-V 연구 등급 바이러스뿐만 아니라 TDV-1, 및 TDV-3 MVS는 완전 약독화된 신경독력 표현형을 나타내었다(질병 또는 사망률 없음). 예상된 바와 같이, wt 뎅기 바이러스 혈청형-2는 평균 마우스 생존 시간(AST) 8.3 ± 0.8일을 가지며, "치명적"인 것으로 나타났다. 이러한 뎅기 바이러스 혈청형-2-민감성 Taconic-ICR 마우스에서, D2 PDK-53-VV45R 연구 등급 바이러스는 81.3% 사망률을 일으켰다. TDV-2 MVS 및 TDV-4 MVS는 각각 9.8 ± 1.7, 10.2 ± 1.4, 및 11.3 ± 0.4일의 값을 가지며, Taconic-ICR에서 한결같이 치명적이었다.
일부 예시적인 방법에서, wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681 바이러스의 신경독력을 10-배 더 낮은 용량으로(103 pfu, 도 5c), D2 PDK-53 VV45R, TDV-2 MVS 및 TDV-4 MVS뿐만 아니라 D2/4-V 연구 등급 바이러스의 신경독력과 비교하였다. wt 뎅기 바이러스 혈청형-2는 상기 더 낮은 유발접종 용량에서, 9.0 ± 1.4일의 AST를 가지며, 한결같이 치명적인 신경병독성 표현형을 보유하였다. 다른 4개 바이러스는 중간 신경독력 표현형을 나타내었고, 신경독력 정도는 혈청형-특이적이었다. D2 PDK-53-VV45R 바이러스 및 그 TDV-2 MVS 인지체는 유의미한 약독화를 나타내었다(각각 13.1 ± 3.8일의 AST를 갖는 32.3% 생존 및 10.5 ± 3.4일의 AST를 갖는 31.2% 생존). TDV-4 MVS 및 연구 등급 D2/4-V 바이러스는 둘 다 신경독력에 대해 고도로 약독화되었다(각각 18.8 ± 5.8일의 AST를 갖는 81.3% 생존 및 100% 생존). 결과는 TDV-1 및 -3의 MVS가 신경독력의 완전 약독화를 나타낸 반면, TDV-2 및 -4 MVS 로트는 이의 동종성 연구-등급 바이러스 백신 후보와 밀접하게 유사한 약독한 표현형을 보유함을 제시하였다.
도 5a 내지 5c는 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 및 상이한 약독화된 뎅기 바이러스를 포함하는 다양한 조성물로 평가된 신생 마우스에서의 신경독력을 예시하는 예시적 그래프를 나타낸다. 104 pfu의 바이러스로 ic 유발접종된 CDC-ICR(n=72) 및 Taconic-ICR(n=32) 신생 마우스에서 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681 바이러스의 신경독력을 요약하는 여러 실험의 풀링 결과(a). 104 pfu(b) 또는 103 pfu(c)의 용량으로 Taconic-ICR 마우스에서 평가된 TDV MVS의 신경독력. 1개 실험(n=16) 또는 2개의 풀링된 실험(n=31 또는 32)에서 그룹 당 평가된 동물의 수를 나타낸다.
WVS, 및 BVS의 플라크 표현형
소정 연구를 수행하여 WVS 및 BVS의 플라크 표현형을 Vero 세포에서 MVS, wt 뎅기 바이러스 및 이의 상동성 실험실 유도된, 연구-등급 키메라와 비교하였다(도 6). 평균 플라크 크기를 각각의 백신 바이러스에 대한 10개의 플라크로부터, 그러나 감소된 수의 wt DENV-1, -3, 및 -4로부터 계산하였다. TDV-1, -2, 및 -3의 모든 MVS 바이러스는 Vero 세포에서 이의 wt 상동체보다 유의미하게 더 작고 이의 상동성 연구-등급 바이러스와 매우 유사한(0.4-mm 차이 이내) 플라크를 생성하였다. TDV-4 MVS는 또한 wt DENV-4보다 유의미하게 더 작았으나, 원래의 실험실 유도된 D2/4-V 키메라보다 약간(0.9 mm) 더 컸다. TDV-2를 제외하고, TDV-1, -3, -4의 WVS 및 BVS는 모두 이의 wt 상동체로부터 생성된 것보다 유의미하게 더 작은 플라크 크기를 보유하였다. TDV-2 WVS 및 BVS는 Vero 세포에서 wt DENV-2 바이러스의 플라크와 유사한 플라크를 생성하였으나, LLC-MK2 세포에서 평가된 경우, 모든 TDV-2 제조된 씨드는 wt DENV-2의 플라크보다 다소 더 작고(1.4 ± 0.4) 실험실 유도된 D2 PDK-53-VV45R과 유사한(1.0 ± 0.3) 플라크를 생성하였다(도 6).
작은 플라크 표현형, 온도 민감성, 모기 세포에서의 감소된 복제, 모기에 의한 감소된 감염/전염/전파 및 신생 ICR 마우스에서의 감소된 신경독력을 포함하는 바이러스 약독화의 표현형 마커의 평가를 MVS 스톡 조성물에 대해 평가하였다. 결과는 모든 TDV가 원래의 연구-등급 백신 바이러스와 유사한 예상되는 약독화 표현형을 보유함을 시사하였다. 약독화에 관여되는 돌연변이가 모든 MVS, WVS 및 BV에서 보존되므로, 약독화된 표현형이 인간 임상 평가를 위해 제조되는 물질에서 보유될 것으로 예상될 수 있다.
도 6은 TDV MVS, WVS, 및 BVS의 플라크 크기를 예시하는 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 9일 pi에 측정되는 아가로스 오버레이 하에 Vero 또는 LLC-MK2 세포에서 바이러스 플라크의 평균 플라크 지름 ± SD(오차 막대). 야생형 DENV 및 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 대조군 및 비교를 위해 포함되었다.
모기 C6/36 세포에서 바이러스 복제
이전 연구는 연구-등급 PDK-53-기반 키메라성 백신 바이러스가 C6/36 세포에서 골격 DENV-2 PDK53 바이러스의 약독화 표현형을 보유함을 실증하였다. 일부 예시적인 방법에서, TDV MSV, WVS, 및 BVS를 C6/36 세포에서 성장시켜 대규모 제조 후 이의 상기 시험관내 약독화 마커의 보유를 확인하였다. 야생형 뎅기 바이러스에 비해, TDV-3을 제외하고, 제조된 씨드는 6일 pi에 C6/36 세포에서 현저한 성장 감소를 나타내었다(적어도 3 log10 PFU/㎖ 감소)(도 7). TDV-3 씨드는 또한 wt DENV-3 16562에 비해 감소된 성장을 나타내었으나, 감소는 현저하지 않았다(1 내지 2 log10 PFU/㎖ 감소). 그러나, TDV-3 씨드 로트의 역가는 원래의 연구-등급 키메라성 D2/3-V 백신 바이러스와 유사하였다(1 log10 PFU/㎖ 차이 이내).
도 8은 C6/36 세포에서 TDV MVS, WVS, 및 BVS의 제한된 성장을 도시하는 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 7일 pi에 C6/36 세포에서 복제된 바이러스의 평균 역가 ± SD(오차 막대). wt 뎅기 바이러스 및 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 비교를 위해 포함되었다.
젖먹이 마우스에서의 신경독력
추가적인 실험을 수행하여 신생 ICR 마우스에서 신경독력을 분석하였다. 104 PFU의 뇌내 용량에서, wt DENV-2 16681 및 D2 PDK-53-VV45R에 대한 생존율은 ICR 마우스에서 각각 0% 및 18.8%였으나(도 9a), CDC ICR 마우스에서는 wt DENV-2 16681에 대해 약 20% 및 D2 PDK-53-VV45R에 대해 100%였다. 상기 연구에서, TDV-1 및 TDV-3 MVS는 104 PFU의 용량에서 마우스에 대해 약독화되었으나(100% 생존), TDV-2 및 TDV-4의 MVS는 104 PFU 초과 용량에서 100% 사망률을 유도하였다(도 5a). 그러나, 103 PFU의 바이러스 용량으로 평가된 경우, TDV-2(31.3% 생존) 및 TDV-4(81.3% 생존)는 야생형 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681(0% 생존)에 비해 감소된 신경독력을 나타내었고, 이의 생존율은 각각 연구-등급 백신 후보 D2 PKD-53-VV45R(32.3%) 및 D2/4-V(100%)의 생존율과 유사하였다(도 9b). 본 연구에서, 야생형 DENV-1, -3, 또는 -4는 비교를 위해 포함되지 않았으나, 이전 연구는 야생형 DENV-1 16007이 ic 경로에 의해 CDC-ICR 마우스에서 약독화된 반면, 야생형 DENV-3 16562 및 DENV-4 1036이 둘 다 CDC-ICR 마우스에 있어서 고도로 병독성임(0% 생존)을 실증하였다. 이러한 3개의 야생형 DENV는 보다 감수성인 Taconic ICR 마우스에서 유사하거나 더 큰 병독성을 나타낼 수 있다. 따라서, 이의 상동체 TDV MVS와의 비교를 위해 이러한 야생형 뎅기 바이러스를 포함시키는 것은 정보를 제공하지 않는 것으로 간주되었다. 본 연구는 모든 4개 TDV MVS 및 원래의 실험실 유도된 후보 백신 바이러스가 야생형cDENV-2 16681과 필적하는 마우스 약독화 표현형을 나타냄을 시사하였다.
도 9a 내지 9b는 신생 ICR 마우스에서 TDV MVS의 신경독력 데이터의 예시적인 그래프를 나타낸다. (a) 104 PFU의 용량에서 바이러스의 IC 접종. (b) 103 PFU의 용량에서 바이러스의 IC 접종
TDV의 모든 씨드 로트를 정체, 멸균성, 및 바람직하지 못한 제제의 부재에 대해 평가하였다. 전체-게놈 서열 분석은 하나의 추가적인 아미노산 돌연변이가 TDV-4 MVS에서 발생한 반면, 다른 3개의 TDV MVS는 이의 프리-마스터 씨드의 공통 게놈 서열을 보유함을 드러내었다. WVS 로트에서, TDV-3은 추가적인 아미노산 돌연변이를 획득하였고 다른 3개 혈청형은 이의 프리-마스터 씨드에 비해 2개의 추가적인 아미노산 치환을 축적하였다. 모든 4개 BVS 로트의 게놈 서열은 이의 WVS 로트와 동일하였다. P2 씨드부터 프리-마스터(P7) 씨드까지 전반적으로, 1개 또는 2개의 비-침묵화 돌연변이만이 주어진 씨드에서 발생하였다. 프리-마스터 및 BCS(P10) 씨드 간에, 1개 내지 2개 뉴클레오타이드 치환만 관찰되었고, 잔기 E-483에서 보존된 글리신 및 알라닌을 생성하는 단일 뉴클레오타이드 변화를 제외하고, 이들은 모두 NS2A, 4A, 또는 4B에서 발생하였다. P2부터 BVS(P10) 씨드까지, 총 3개 내지 8개 뉴클레오타이드 치환이 임의의 주어진 TDV 씨드에서 확인되었고, 4개 중 2개의 이러한 치환만 아미노산 변화를 일으켰다. BVS에서의 침묵화 돌연변이는 어느 것도 바이러스 복제에 영향을 미칠 수 있는 5'- 또는 3'-NCR 내에 없었다. 이러한 결과는 TDV 바이러스가 제조 동안 유전적으로 고도로 안정하였음을 제시한다. 5'NCR, NS1-53, 및 NS3-250에 위치하는 3개의 정의된 DENV-2 PDK-53 약독화 유전자위는 BVS 스톡을 생성하기 위한 TDV의 연속 계대 시 공통 게놈 서열에서 변화하지 않고 유지되었다. 5'-NCR-57 유전자위의 고민감성 TaqMAMA는 TDV의 MVS, WVS, 및 BVS에서 최소 또는 검출 불가능한 복귀를 나타내었다. TDV-2 BVS에서 0.21%의 최고 복귀율이 확인되었다. P10-동등 BVS의 복귀율(0.07% 미만 내지 0.21%)은 Vero 세포에서 연속 계대 후 다른 백신 후보에서 발생한 복귀율보다 유의미하게 더 낮았다(P10 즈음 4% 내지 74% 복귀). 이는 TDV 씨드의 대규모 제조를 위한 상기 전략이 후보 백신 바이러스에서 유전적 안정성 유지 및 약독화 마커의 보유에 관해 성공적임을 제시한다.
본원에서 개시되는 MVS 스톡은 WVS 및 BVS 로트의 향후 제조를 위해 이용될 것이므로, 소형 플라크 표현형, 온도 민감성, 모기 세포에서의 감소된 복제, 전체 모기에서의 감소된 감염/전염/전파, 및 신생 ICR 마우스에서 감소된 신경독력을 포함하는 전체 패널의 바이러스 약독화 표현형 평가를 모든 MVS 또는 이의 동등한 대리물 스톡에 대해 수행하였다. WVS 및 BVS 스톡에 있어서, 플라크 크기, 모기 세포에서의 감염성을 또한 수행하여 이의 약독화를 확인하였다. 결과는 4개 혈청형의 TDV의 모든 MVS 스톡이 원래의 실험실-유도된 백신 바이러스와 유사한, 예상되는 약독화 표현형, 예컨대 소형 플라크, C6/36 세포에서 감소된 복제, 및 감소된 마우스 신경독력을 보유함을 시사하였다(도 6, 8, 및 9). TDV-4를 제외하고, TDV의 모든 다른 3개의 MVS 스톡은 도 3 및 7에 예시된 바와 같이 39℃에서 TS였다.
WVS 및 BVS 스톡에 있어서, 2개의 약독화 표현형, 소형 플라크 및 C6/36 세포에서 제한된 복제를 분석하고 학인하였다. MVS 및 BVS 간에 유전적 변화는 거의 없으므로, 이들은 MVS와 같은 약독화 표현형을 보유할 것으로 예상되었다. 상기 보고에 기재된 실험에 부가하여, Ag129 마우스 및 비인간 영장류에서 제조된 TDV의 안전성 및 면역원성을 평가하였다.
cGMP 하에 TDV MVS, WVS, 및 BVS 스톡의 제조를 실증하기 위한 예시적인 방법이 본원에서 제공된다. BVS 스톡을 이용하여 인간 임상 시험 평가에서 현재 4가 TDV를 제형화하였다. 제조된 MVS의 유전적 안정성 및 안전성을 최적화하기 위한 고유한 제조 전략이 일부 예시적인 방법에서 제공되었다. TDV의 주요 약독화 유전자위는 이전에 잘 특성규명되었고 고도로 민감하고 정량화 가능한 SNP 검정, TaqMAMA가 게놈 서열을 통합하고, MVS를 제조하기 위한 최적 프리-마스터 씨드를 확인하기 위해 TaqMaMa가 개발되었다. MVS의 유전적 및 표현형 특성규명을 완전 분석하여, 이러한 바이러스가 백신의 안전성을 위해 바람직한 약독화를 보유함을 확인하였다. 이는 프리-마스터로부터 BVS 스톡까지의 모든 제조 동안 모든 주요 약독화 유전자 유전자위에 대해 효율적으로 분석될 수 있는 유일한 살아있는, 약독화된 바이러스 백신일 수 있다. 본원에서 제공되는 결과는 백신 안전성에서 전략적으로 설계된 살아있는-약독화된 백신의 이점을 예시하였다.
실시예 3
또 다른 예시적인 방법에서, 구축물에는 뎅기-2 혈청형의 비구조 단백질 도메인 및 임의의 하나의 뎅기-1(TDV-1), 뎅기-3(TDV-3) 또는 뎅기-4(TDV-4) 혈청형으로부터의 구조 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 구축물에 부가하여, 살아있는, 약독화된 뎅기-2 혈청형(TDV-2)에 기반하는 개질된 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스가 포함될 수 있다. 또한, 본원에서 개시되는 면역원성 조성물에서의 개별 구축물은 서로에 대비하여 log PFU의 PFU에 기반하는 비 또는 농도로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 도 11b에 예시된 바와 같이, TDV-1이 약 2×104 PFU의 농도로 존재하고, TDV-2가 약 5×104 PFU의 농도로 존재하고, TDV-3이 약 1×105 PFU의 농도로 존재하고, 및 TDV-4가 약 3×105 PFU의 농도로 존재하도록 제형화될 수 있다. 면역원성 제형물에서 상이한 뎅기 혈청형 구축물의 상대 농도도 PFU의 log 수치에 기반하는 비로서, 예컨대 도 11b에 예시된 바와 같이, 약 4:4:5:5의, TDV-1:TDV-2:TDV-3:TDV-4의 비에 대응하여 표현될 수 있다. 일부 구현예에서, 비는 약 5:4:5:5뿐만 아니라 하나 이상의 살아있는, 약독화된 뎅기 바이러스 혈청형이 다른 뎅기 바이러스 혈청형과 대비되는 경우 더 높거나 더 낮은 다른 사전결정된 비일 수 있다. 하나의 예에서, TDV-2의 상대 농도는 TDV-1, TDV-3, 및 TDV-4에 비해 감소될 수 있고, 이는 모든 4개 뎅기 혈청형에 대해 대상체에 투여되는 경우 더 우수한 균형잡힌 반응을 갖는 면역원성 조성물을 생성할 수 있다. 예를 들어, TDV-1, TDV-2, TDV-3, 및 TDV-4는 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형(살아있는, 약독화된 뎅기-2 및 뎅기 바이러스 -1, -3 및 -4의 키메라)에 대한 중화 항체를 유도할 수 있고, 골격으로서의 뎅기-2의 이용은 뎅기 비구조 단백질에 대해 다기능성 및 교차-반응성 CB8+ T-세포 반응을 유도할 수 있다.
또 다른 예시적인 방법에서, 어린이(역사적으로 뎅기 바이러스에 대해 효과적으로 면역화하기 어려운 집단이며 이전 백신은 특히 상기 9세 이하의 어린이 집단에서 작용하지 못했음)에서 본원에서 개시되는 뎅기 면역원성 조성물의 유효성 및 관용성을 평가하기 위해, 2 파트 무작위화, 이중 맹검, 위약-대조 임상 시험을 수행하였다. 파트 1은 연령-역순 방식으로 수행하였으며, 여기서 21세 내지 45세의 대상체(n = 38), 12세 내지 20세의 대상체(n = 36), 6세 내지 11세의 대상체(n = 38) 및 1.5세 내지 5세의 대상체(n = 36)에 모든 4개 구축물, TDV-1, TDV-2, TDV-3 및 TDV-4를 함유하는 뎅기 백신 조성물의 용량을 투여하였다(도 12a). 파트 II는 파트 I의 연장으로서 1.5세 내지 11세의 건강한 어린이 대상체(n = 211)에서 수행하였다(도 12b). 백신 용량을 0일에 투여하였고, 조직 샘플(예컨대, 혈액 샘플)을 0일 및 시험에 걸쳐 다양한 시점에 대상체로부터 채취하여 바이러스혈증, 면역원성 및 전반적인 안전성에 대해 평가하였다(도 12a 내지 12b). 파트 I에 있어서, 무작위화된 용량의 백신 및 위약을 약 2:1 백신 대 위약 비로 투여하였다. 파트 II에 있어서, 무작위화된 용량의 백신 및 위약을 약 3:1 백신 대 위약 비로 투여하였다. 면역원성 조성물에서, TDV-1은 약 2×104 PFU의 농도로 존재하였고, TDV-2는 약 5×104 PFU의 농도로 존재하였고, TDV-3은 약 1×105 PFU의 농도로 존재하였고, TDV-4는 약 3×105 PFU의 농도로 존재하였다.
또 다른 방법에서, 어린이에서 본원에서 개시되는 뎅기에 대한 면역원성 조성물의 관용성을 조사하기 위해, 유해 사례(AE)의 발생율을 조사하였다(데이터는 나타내지 않음). 주사 부위에서 TDV 및 위약 투여 간 통증, 간지러움, 및 발적의 발생율뿐만 아니라 부종을 결정하였다(자가-보고됨). 다양한 AE를 TDV(n = 249) 또는 위약(n = 111)의 최초 투여 후 14일 내에, 및 TDV(n = 249) 또는 위약(n = 111)의 두 번째 투여 후 14일 내에 조사하였다. 전반적으로, 연구 대상체 중에서 보고되는 심각한 백신-관련 AE는 존재하지 않았고, 혈액 화학 또는 혈액학에서 유의미한 변화가 존재하지 않아, 본 개시의 뎅기 백신 조성물이 어린이 가운데 잘 관용됨을 시사하였다(데이터는 나타내지 않음).
또 다른 예시적인 방법에서, 어린이에서 본 개시의 면역원성 조성물의 유효성을 평가하기 위해, TDV 백신 조성물이 주사된 후 대상체에 의해 생성되는 중화 항체의 존재를 미세중화 평가를 이용하여 최대 720일까지의 주사-후 다양한 시점에서 측정하였다. 도 13a 내지 13b에 예시된 바와 같이, TDV 백신 투여는 대상체의 초기 면역 상태와 무관하게, 720일에 걸쳐 지속되는 중화 항체 반응을 야기하였다(도 13a에 예시되는 기준선에서 혈청양성; 도 13b에서 예시되는 기준선에서 뎅기-나이브). Denv-1 항체를 채운 검은색 다이아몬드로 표시되는 짧은 단속선에 의해 나타내며; Denv-2 항체 수준을 채운 검은색 사각형으로 표시되는 진한 실선에 의해 나타내고; Denv-3 항체 수준을 채운 검은색 삼각형으로 표시되는 긴 단속선에 의해 나타내고; 및 Denv-4 항체 수준을 X로 표시되는 점선에 의해 나타낸다. 용량은 0일 내지 90일에 대응하여 상향 표시하는 채운 화살표에 의해 나타낸다.
또 다른 실시예에서, 뎅기 면역원성 조성물이 초기 면역 상태와 무관하게 어린이에서 4가 반응을 야기할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 연구 대상체의 혈청양성도를 최대 720일까지의 주사-후 다양한 시점에서 TDV 백신 조성물이 주사된 후 측정하였다. 도 14에 예시된 바와 같이, 약 60% 초과의 연구 대상체는 모든 뎅기 혈청형에 대해 평가된 모든 주사-후 시점에서 혈청양성이었다. 약 80% 초과의 대상체는 3개 이상의 뎅기 혈청형에 대해 평가되는 모든 주사-후 시점에서 혈청양성이었다. 그리고 거의 100%의 대상체는 2개 이상의 뎅기 혈청형에 대해 평가되는 모든 주사-후 시점에서 혈청양성이었다. 0일, 28일, 90일 및 120일에 대한 데이터는 임상 시험의 파트 I 및 II로부터 수득한 반면(n = 249), 180일, 360일 및 720일에 대한 데이터는 임상 시험의 파트 I로부터 수득하였다(n = 90). 혈청양성도는 MNT50 역가 10 이상인 것으로 결정되었다.
또 다른 예시적인 방법에서, 평가를 수행하여 본원에서 개시되는 뎅기에 대한 면역원성 조성물이 기준선에서 혈청음성인(뎅기-나이브) 어린이에서 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 야기할 수 있는지 여부를 결정하였다. 도 15에서 예시되는 바와 같이, 약 40% 초과의 연구 대상체는 모든 뎅기 혈청형에 대해 평가된 모든 주사-후 시점에서 혈청양성이었다. 약 60% 초과의 대상체는 3개 이상의 뎅기 혈청형에 대해 평가된 모든 주사-후 시점에서 혈청양성이었다. 그리고 거의 100%의 대상체는 2개 이상의 뎅기 혈청형에 대해 평가된 모든 주사-후 시점에서 혈청양성이었다. 0일, 28일, 90일 및 120일에 대한 데이터는 임상 시험의 파트 I 및 II로부터 수득한 반면(n = 133), 180일, 360일 및 720일에 대한 데이터는 임상 시험의 파트 I로부터 수득하였다(n = 40). 혈청양성도는 MNT50 역가 10 이상인 것으로 결정되었다. 본원에서 개시되는 4가 조성물은 투여 후 720일에 걸쳐 지속될 수 있는 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있음이 주지된다.
실시예 4
하나의 방법에서, 참가자들이 등록하였다; 1794명이 0개월 및 3개월에 피하 주사되는 2개의 TDV 용량(n=200; 그룹 1); 0개월에 1개 용량(n=398; 그룹 2); 0개월에 1개 용량 및 12개월에 추가접종(n=998; 그룹 3); 또는 위약(n=198; 그룹 4)을 수여받았다. TDV는 모든 DENV에 대해 중화 항체를 야기하였고, 이는 1개월에 피크를 형성하고 6개월에 기준선 초과로 상승된 채 유지되었다. 각각 그룹 1 내지 4에서 6개월 GMT(95% CI)는 DENV-1에 대해 489(321, 746), 434(306, 615), 532(384, 738), 62(32, 120); DENV-2에 대해 1565(1145, 2140), 1638(1286, 2088), 1288(1031, 1610), 86(44, 169); DENV-3에 대해 160(104, 248), 151(106, 214), 173(124, 240), 40(23, 71); 및 DENV-4에 대해 117(79, 175), 110(80, 149), 93(69, 125), 24(15, 38)였다. 처음에 혈청음성인 참가자 중에서, 2개 TDV 용량은 1개 용량에 비해 더 높은 평균 GMT 및 DENV-3 및 -4에 대해 혈청전환율, 및 6개월에 4가 혈청전환율은 1개 TDV 용량 후 67.6% 대비 85.0%였다.
연구 설계 및 참가자
이들 연구는 파나마, 필리핀 및 도미니카 공화국에서의 3개 병원/클리닉에서 수행된 다기관, 무작위화, 이중-맹검, 위약-대조 연구였다. 2세 내지 17세 연령의 건강한 참가자가 등록하였고 적격성에 대해 평가된 후 0개월 및 3개월에 2개 용량(그룹 1); 0개월에 1개 용량(그룹 2); 0개월에 1개 용량 및 12개월에 추가접종(그룹 3); 또는 위약(그룹 4)으로 TDV를 수여받도록 1:2:5:1의 비로 무작위화하였다. 3상 개발에서 상기 투여 요법의 잠재적 용도를 뒷받침하기 위해 1:2:5:1의 무작위화 비를 선택하여 추가접종을 포함하거나 포함하지 않는 1개 용량 일정에 대한 데이터를 제공하였다. TDV의 이전 연구는 2개 용량 일정(0개월-3개월)의 안전성 및 면역원성을 확립하였고, 상기 그룹(그룹 1)을 더 큰 1개 용량 그룹(그룹 2 및 그룹 3)과의 비교를 위해 이용하였다.
절차
TDV의 혈청형 조성물은 동결건조된 제형물에서, 각각 2.5×104, 6.3×103, 3.2×104 및 4.0×105 플라크 형성 단위(PFU)의 TDV-1, TDV-2, TDV-3 및 TDV-4였다. 위약은 포스페이트-완충 식염수였고; TDV는 투여 시 주사용수에서 재구성되었고, 0.5 mL의 TDV 또는 위약을 피하 주사하였다(예컨대 델토이드 영역). 샘플은 안정화 제형물에서 미리 동결건조하였다.
중화 항체의 측정을 위한 혈액 샘플을 연구 치료 투여 전 0개월 및 3개월에, 그리고 1개월 및 6개월에 면역원성 하위세트에서 참가자로부터 수집하고, 중앙에서 분석하였다.
하나의 종결점은 미세 중화 평가[MNT50]를 이용하여 1개월, 3개월 및 6개월에 각각의 4개 DENV 혈청형에 대한 중화 항체의 기하 평균 역가(GMT)에 의해 예시되는 면역원성이었다. 2차 면역원성 종결점은 1개월, 3개월, 및 6개월에 각각의 4개 DENV 혈청형에 대한 혈청양성도 비율이었다(여기서 MNT50에 의한 혈청양성도는 상호 중화 역가 10 이상으로서 정의되었다). 면역원성 종결점을 프로토콜 세트(PPS) 별로 요약하였고, 여기에는 주요한 프로토콜 위반을 갖지 않고 유효한 투여-전 및 -후 혈액 샘플이 이용 가능한 면역원성 하위세트로부터의 모든 참가자가 포함되었다.
통계 분석
상기 시험은 일차적으로 서술적으로 설계되었으며, 공식 귀무 가설의 평가에 기반하지 않았다. 따라서, 샘플 크기는 공식 통계파워 계산에 기반하여 결정되지 않았다. 1800명 참가자의 계획된 샘플 크기(면역원성 하위세트에 600명)는 단일 용량의 투여 후 면역 반응의 지속성 및 추가접종 용량의 효과의 평가를 위해 합리적인 수의 참가자를 제공하고, 대략 20000명의 참가자에서 3상 유효성 시험을 뒷받침하기 위해 적절한 안전성 데이터베이스를 제공하는 것으로 가정되었다.
뎅기 중화 항체의 혈청양성도 비율 및 GMT를 기준선 및 1개월, 3개월 및 6개월에 개별적으로 각각의 4개 TDV 혈청형에 대한 95% 신뢰도 구간(CI)으로 계산하였다. 적어도 2가, 3가, 및 4가 혈청양성도를 갖는 참가자의 백분율을 각각의 연구 방문에 그룹 별로 요약하였다. 이러한 데이터를 또한 기준선 뎅기 혈청상태에 의해 나타내었다; 혈청양성도는 1개 이상의 DENV 혈청형(들)에 대해 MNT50의 역수 10 이상으로서 정의되었다. 안전성 데이터를 서술적으로 요약하였고, 구해진 AE를 연령 별로 나타내었다(6세 미만 및 6세 이상).
6개월에, 1743명의 참가자가 계획된 요법을 수여받았다. 연구 참가자의 평균 연령은 7.3세였다(데이터는 나타내지 않음). PPS(면역원성 하위세트)에 대한 인구학적 데이터는 더 작은 비율이 안전성 세트에서보다 PPS에서 2세 내지 5세였음을 제외하고, 일반적으로 안전성 세트의 데이터를 반영하였다. PPS에서의 기준선에서 임의의 DENV에 대한 참가자 혈청양성 비율은 연구 그룹 간에 유사하였다(전반적으로 54.7%; 51.2% 내지 57.4% 범위). TDV는 백신접종된 참가자에서 모든 4개 뎅기 혈청형에 대해 중화 항체를 야기하였다. 최고 수준의 뎅기 중화 항체가 DENV-2에 대해 관찰되었고(도 2), DENV-1이 뒤따랐으며, DENV-3 및 DENV-4에 대해 더 낮은 수준이 관찰되었다. 각각의 혈청형에 대한 GMT는 1개월에 피크를 형성하였고, 6개월(180일)에 기준선으로부터 상승된 채 유지되었다. 그룹 1 내지 4에서 6개월 GMT(95% CI)는 각각 DENV-1: 489(321, 746), 434(306, 615), 532(384, 738), 62(32, 120); DENV-2: 1565(1145, 2140), 1638(1286, 2088), 1288(1031, 1610), 86(44, 169); DENV-3: 160(104, 248), 151(106, 214), 173(124, 240), 40(23, 71); 및 DENV-4: 117(79, 175), 110(80, 149), 93(69, 125), 24(15, 38)였다. 기준선에서 혈청음성인 참가자에서, 2개 용량 일정은 그룹 2 및 3에서 참가자에게 제공된 단일 용량에 비해 6개월에 더 높은 DEN-3 및 DEN-4 GMT를 야기하였으나(그룹 1), CI는 중복되었다(데이터는 나타내지 않음). 기준선에서 혈청양성인 참가자에서, GMT 반응은 모든 TDV 그룹에서 유사하였다(데이터는 나타내지 않음).
TDV-백신접종된 참가자 중에서 개별 DENV에 대한 혈청양성도 비율은 1개월 경 모든 연구 그룹에서 87.3% 내지 100%까지 증가하였고, 6개월에 각각의 DENV에 대해 높게 유지되었다(85.0% 내지 100%; 도 3, 왼쪽 패널). 기준선에서 혈청음성인 개체에서, 2개 용량 일정은 1개 용량 일정에 비해(DENV-3에 있어서 85.7% 및 85.3% 및 DENV-4에 있어서 81.4% 및 69.3% - 데이터는 나타내지 않음) 6개월에 DENV-3(97.5%) 및 DENV-4(87.5%)에 대해 더 높은 혈청양성도 비율을 야기하였다. 그러나, 95% CI는 중복되었다.
기준선에서, 전반적으로 44.7%의 참가자가 DENV에 대해 4가 혈청양성도를 가졌다. 1개월 경, 각각의 연구 그룹에서 80% 초과의 TDV-백신접종된 참가자가 4가 혈청양성도를 가졌고, 96% 이상이 적어도 3가 혈청양성도를 가졌다(데이터는 나타내지 않음). 다가 혈청양성도 비율이 6개월에 유지되었으며, 6-개월 비율은 2개 TDV 용량 후 약간 더 높았다(데이터는 나타내지 않음). 기준선-혈청음성 참가자에서, 6-개월 4가 혈청양성도 비율은 1개 용량을 수여받은 참가자들(그룹 2 및 3에 있어서 70% 및 65.3%)에서보다 2개 용량을 수여받은 참가자들(그룹 1에 있어서 85%)에서 더 높았지만, 95% CI는 중복되었다.
전반적으로, 1402명의 참가자가 1개 TDV 용량을 수여받았고, 194명이 2개 용량을 수여받았다. 32명의 참가자에 의해 보고된 40건의 SAE(즉, 안전성 세트의 1.8%) 중 어느 것도 연구 백신 또는 절차와 관련되지 않았다. 3건의 SAE는 연구 중단으로 이어졌다(식품 착색제에 대한 알러지 반응, 면역 저혈소판 자반, 및 급성 사구체신염). 연구 백신 또는 절차와 관련되지 않은 1건의 사망이 6개월 분석 컷오프 후 발생하였다(폐렴, 폐 결핵 및 패혈성 쇼크로 인해). 2건의 임신이 연구로부터의 중단으로 이어졌으나, 참가자는 이후 정상 출산하였고 이들의 아이는 건강하였다.
TDV 및 위약 간에 구하지 않은 AE 비율에서 주요한 차이가 제1 대 제2 용량 후에 나타나지 않았거나, 기준선에서의 혈청양성도와 관련되지 않았고, 대부분 연구 백신접종과 관련되지 않았다(표 3). 전반적으로, 면역원성 하위세트에서 562명 중 15명의 참가자(2.7%)가 백신과 관련된 구하지 않은 AE를 보고하였다. 구하지 않은 AE는 186명 중 161명(86.6%)의 참가자에서 경도였다. 기준선-혈청양성 참가자 가운데, 위약을 수여받은 47명 중 1명(2.1%) 및 252명 중 2명(0.8%) 대비, 각각 제1 및 제2 TDV 주사 후 250명 중 5명(2.0%) 및 45명 중 0명(0%)이 백신접종-관련된 구하지 않은 AE를 보고하였다. 처음에 혈청음성도 참가자 가운데, 위약을 수여받은 43명 중 0명(0%) 및 203명 중 2명(1.0%) 대비, 각각 제1 및 제2 TDV 주사 후 202명 중 4명(2.0%) 및 42명 중 1명(2.4%)이 백신-관련된 구하지 않은 AE를 보고하였다.
백신접종 후 혈청양성도는 이것이 백신접종에 대한 측정 가능한 반응 증거를 제공한다는 점에서, 백신 성능의 중요한 척도일 수 있다. 보호의 상관성 부재 하에, 당연히 어떠한 반응 크기가 보호를 위해 요구되는지는 말할 수는 없다. 그러나, 체액성 및 세포성 면역성을 생성하고 대부분의 개체, 심지어 뎅기에 대한 사전 노출이 없는 개체에서 모든 뎅기 혈청형에 대해 측정 가능한 혈청전환을 실증하는 백신은 이것이 대규모 백신 유효성 시험에서의 평가를 위해 적합하며 어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스에 대해 유효한 백신일 수 있음을 제시한다. 상기 시험을 위해 선택된 투여 일정은 가장 큰 비율의 최초 혈청음성 대상체에서 다가 반응을 생성할 것이다.
상기 예시적인 대규모 연구에서, 2상 코호트가 2개의 뎅기 풍토병-영역(아시아 및 라틴 아메리카)에서 유도되었고 TDV로 백신접종될 실제-세계 집단과 유사하다. 1개 대 3개월 차이로 주어지는 2개 TDV 용량을 평가하기 위한 상기 제1 연구에서, 유도된 체액성 면역원성은 최초 투여 6개월 후 강력히 유지되며, 최초 혈청음성 백신접종자에서 약간의 감소만을 가졌으나, 제2 용량의 투여는 이러한 감소를 경감시키고(예컨대 DENV-4) 백신접종에 대해 면역학적으로 반응하는 대상체의 비율을 증가시키는(예컨대 DENV-3) 것을 보조함을 실증하였다. 1596명의 TDV-백신접종된 참가자 가운데 6개월에 걸쳐 새로운 안전성 우려사항은 출현하지 않았다. TDV는 백신접종 시 뎅기 혈청상태와 무관하게, 2세 연령부터 어린이 및 청소년에서 안전하고 잘 관용되는 것으로 확인되었다.
플라비바이러스 키메라의 다른 백신이 몇몇 지역에서 라이센스를 받았지만, 이들은 9세 미만의 어린이에 대해서는 승인되지 않았다. 이러한 플라비바이러스 키메라는 DENV-1 및 -2에 대해 35% 내지 50% 혈청형-특이적 보호, 및 뎅기-나이브 수신체에서 더 낮은 유효성을 유도하였다. 따라서, 사전 뎅기 노출 및 감염 혈청형과 무관하게, 모든 연령의 수신체, 특히 9세 미만의 수신체에서 모든 4개 DENV 혈청형에 대해 안전하고 유효한 백신에 대한 필요성이 남아있다. TDV의 유망한 2상 결과는 백신접종 시 뎅기 혈청양성도와 무관하게, 넓은 연령 범위에 걸쳐(특히 어린 소아에서) TDV 이용의 용도를 뒷받침하기 위해 설계된 연구에서 2개 용량 일정의 3상 평가의 개시를 뒷받침한다.
물질 및 방법
바이러스 및 세포
DENV-1 16007, DENV-2 16681, DENV-3 16562, 및 DENV-4 1034는 야생형(wt) DENV 대조군으로 작용하였으며, 이들은 4개의 재조합 TDV 백신 후보에 대한 모체 유전형 바이러스였다. D2/1-V, D2 PDK-53-VV45R, D2/3-V, 및 D2/4-V로 명명된, TDV 선조체 연구-등급 바이러스를 이전에 제조하고 특성규명하였다. 백신 생산을 위한 마스터 및 워킹 세포 은행의 제조를 위해 이용되는 Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장) 세포는 백신 제조를 위해 세계 보건 기구(WHO)에 의해 특성규명된 미국 조직 배양 수집처(ATCC) CCL81 세포주(WCB-Vero 세포)로부터 유래되었다.
cDNA 클론으로부터 살아있는 재조합 TDV 바이러스의 유도
cGMP 제조 조건 하에 후보 백신 바이러스를 재유도하기 위해, 이전에 조작된 DENV 감염성 cDNA 클론, pD2-PDK-53-VV45R, pD2/1-V, pD2/4-V, 및 전체 게놈-길이 바이러스 cDNA를 함유하는 시험관내 결찰된 pD2/3-V를 이용해서 이전에 기재된 바와 같이 시험관내 전사에 의해 신선 바이러스 RNA 전사체를 제조하였다. 간략하게, XbaI-선형화된 DENV 게놈 cDNA를 프로티나제 K로 처리하고, 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올에서 침전시켜 임의의 잔류 단백질을 제거한 후, 전사 전에 RNase-비함유 Tris-EDTA 완충액에서 현탁하였다. 시험관내 전사를 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 AmpliScribe T7 고수율 전사 키트(Epicentre Technologies)를 이용하여 수행하였다. RNA A-캡 유사체, m7G(5')ppp(5')A(New England BioLabs)를 2-hr 전사 반응 동안 포함시켜 RNA 전사체에 5'-말단 A-캡을 부가하였다. 이어서 샘플을 DNase I로 처리하여 주형 cDNA를 소화시킨 후, 저 pH 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 잔류 DNA 및 단백질을 제거하였다. RNase-비함유수에 현탁된 정제된 RNA 전사체를 20 ㎕ 분취물로 분배하고, 세포 전달감염을 위해 준비될 때까지 -80℃에서 보관하였다. RNA 추출물의 온전성 및 농도를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 각각의 20 ㎕ 분취물은 전기천공에 의해 0.4 내지 1×107 생산-인증된 Vero 세포의 전달감염을 허용하기 충분한 게놈-길이 바이러스 RNA를 함유하는 것으로 추정되었다.
각각의 RNA 전사체의 WCB-Vero 세포로의 전달감염을 Shantha Biotechnics의 cGMP 설비에서 수행하였다. TDV RNA 전사체를 해동하고, 400 ㎕의 Vero 세포 현탁액(1×107 세포/㎖)와 혼합하고, Gene Pulser Xcell 토털 시스템(BioRad Laboratories)에 의한 전기천공을 위해 사전-냉각된 멸균 전기천공 큐벳(4-㎜ 갭)으로 옮겼다. 각각의 샘플을 250 V/∞ Ohms/500 μF에서 1회 펄스처리하고, 실온에서 10분 내지 15분 동안 인큐베이션하고, 30 ㎖의 세포 성장 배지(10% FBS 함유 MEM)를 함유하는 75-㎠ 플라스크로 옮기고, 6일 내지 11일 동안 36℃ ± 1℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배양 배지를 수확하고, 원심분리에 의해 청정화하고, 안정화하고, -60℃ 미만에서 소량 분취물로 보관하였다. 전달감염으로 생성되는 후보 백신 스톡(계대 수준 1에 대해 P1로 명명됨)의 바이러스 역가를 Vero 세포에서 플라크 적정 검정에 의해 결정하고 TDV 씨드의 추가 증식을 위해 이용하였다.
TDV 바이러스 씨드의 제조
P1 바이러스 씨드를 이용하여 제조된 로트의 최적 유전적 안정성 및 안전성을 확보하도록 설계된 전략을 통해 TDV 프리-마스터, 마스터, 워킹, 및 벌크 바이러스 씨드 로트를 증식시켰다. 상기 전략에는 3 연속 플라크 정제뿐만 아니라 연속된 씨드 생산을 위해 최적 클론 바이러스 집단을 선택하기 위한 다양한 계대 수준에서의 바이러스의 유전적 분석이 포함되었다(표 1). 간략하게, 전달감염된 세포로부터 수확된 P1 씨드를 0.001의 MOI에서 Vero 세포의 감염에 의해 1회 증폭시켜 P2 씨드를 생성하였다. P2 씨드 스톡의 분취물을 플라크 형태 및 전체 바이러스 게놈 서열분석에 의해 평가하였다. 유전적으로 확인된 P2 스톡을 아래에서 플라크 적정 섹션에 기재된 바와 같은 오버레이 배지로 Vero 세포 단층 상에 플레이트접종하여 잘-단리된 플라크를 생성하였다. 뉴트럴 레드로의 가시화 후, 각각의 4개 혈청형의 백신 바이러스로부터 6개의 개별 플라크를 단리하고(플라크 클론 A 내지 F) 0.5 ㎖의 배양 배지 내로 혼합하였다(계대 P3). 각각의 6개 플라크 현탁액으로 2회의 추가적인 플라크 정제를 거쳐, 각각 계대 P4 및 P5에서 2회- 및 3회-플라크 정제된 바이러스 씨드를 생성하였다 P5 바이러스를 2회의 순차적인 Vero 계대배양을 통해 증폭하여 P7 씨드 스톡을 생산하였다.
이전에 개시된 바와 같이, 스팟 서열분석 및/또는 Taqman-기반 미스매치 증폭 돌연변이 검정(TaqMAMA)을 이용하는 3개의 주요 TDV 약독화 유전자위의 유전적 분석, 및 플라크 표현형 분석을 수행하여 모든 24개 P7 씨드를 스크리닝하였다. 이어서 적절한 초기 특징을 보유하는 씨드를 전체 게놈 서열분석에 의해 추가 특성규명하였다. 이러한 분석 결과, 각각의 TDV 혈청형의 6개 중 하나(클론 A 내지 F)의 P7 씨드를 DENV-2 PDK-53 약독화 돌연변이의 존재, 최소 게놈 서열 변형, 및 예상되는 플라크 표현형에 기반하여, 프리-마스터 씨드로 선택하였다. 각각의 선택된 프리-마스터 씨드를 Vero 세포의 여러 175 ㎠ 플라스크에서 0.001의 MOI로 바이러스의 1회 계대배양에 의해 마스터 바이러스 씨드(MVS 또는 P8)로 증식시켰다. TDV-4 MVS를 제외하고, 마스터 바이러스 씨드를 8일 내지 10일 감염 후(pi) 수확하였다. MVS 스톡을 6일 내지 10일 감염 후(pi) 수확하고, 원심분리에 의해 청정화하고, 수크로스/포스페이트/글루타메이트 용액(각각 최종 농도 7.5% 수크로스, 3.4 mM 칼륨 디하이드로겐 포스페이트, 7.2 mM 디칼륨 하이드로겐 포스페이트, 5.4 mM 모노나트륨 글루타메이트) 및 0.95% 내지 1.90% FBS(최종 농도)의 첨가에 의해 안정화하였다. TDV-4 MVS를 상이하게 제조하여 그 수율을 최적화하였다. 간략하게, 여러 플라스크의 세포를 DENV 바이러스 열 안정성을 증강시키는 것으로 실증된 0.1% F-127™, 폴록사머 407(다른 EO-PO 블록 공중합체가 평가되었고 본원에서 치환할 수 있음, 허여된 특허를 참고한다)의 존재 하에 0.001의 MOI로 TDV-4 프리-마스터 씨드로 감염시켰다. 감염성 배지를 6일 내지 10일 pi에 수확하고, 17% FBS(최종 농도)로 안정화하고, 풀링하고, 냉동하였다. 모든 4개 TDV MVS 스톡을 -60℃ 미만에서 1 ㎖ 분취물로 보관하였다.
TDV 워킹 바이러스 씨드(WVS)를 0.001의 MOI로 MVS의 Vero 세포 배양에서 1회 계대배양에 의해 제조하였다. 절차는 이들이 다층 세포 공장(6360 ㎠)에서 배양된 것을 제외하고, MVS의 생산과 유사하였다. WVS 스톡을 10 μM 및 0.45 μM 필터를 통해 여과하고, MVS를 위해 이용된 동일한 안정화기로 안정화하고, 30 ㎖ PETG 병 또는 2.0 ㎖ 크리오바이알 내로 분취하고, -60℃ 미만에서 보관하였다.
소정 방법에서, 0.001의 MOI를 달성하도록 90 ㎖의 희석된 MVS로 융합성 Vero 세포의 여러 세포 공장(각각 6360 ㎠)을 감염시켜 벌크 바이러스 씨드(BVS)를 생산하였다. WVS 접종물의 희석을 위해 이용된 배지는 혈청 없이 0.1% F-127™을 함유하였다. 1.5 hr 흡착 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 800 ㎖의 무-혈청 DMEM 배지를 각각의 세포 공장으로 첨가하고, 공장을 5(±0.5)% CO2에서 36(±1)℃에서 인큐베이션하였다. 4일 동안 인큐베이션 후, 배지의 소량 분취물을 멸균성 평가를 위해 수집하였다. 바이러스를 5일 내지 10일 pi에 수확하고, 즉시 0.45 ㎛ 포어 크기 필터를 통한 여과에 의해 청정화하고, 1 ℓ의 각각의 청정화된 바이러스 풀을 500 ㎖의 3× FTA 완충액(PBS, pH 7.4 중 최종 농도 15% 트레할로스, 1.0% Pluronic® F-127™ 폴록사머 407, 0.1% 인간 알부민 USP)의 첨가에 의해 안정화하였다. 안정화된 바이러스를 1-ℓ PETG 병 내로 분배하고, 후속 풀링 및 품질 제어 평가를 위해 -60℃ 미만에서 냉동 보관하였다. 105 PFU/㎖ 초과의 바이러스 역가 및 허용가능한 수준의 잔류 DNA를 포함하는 모든 안정화된 바이러스 수확물을 32℃에서 수조 내에서 급속 해동한 후, 무균 풀링하고 혼합하였다. 각각의 풀링된 1가 BVS를 표지된 PETG 용기 내로 분배하고, 추가 이용 시까지 -60℃ 미만에서 보관하였다.
제조 제품 품질 제어
MVS, WVS, 및 BVS 씨드를 정체, 멸균성, 및 검출 가능한 외래성 제제에 대해 평가하였다. 각각의 백신 스톡의 정체를 TDV 혈청형-특이적 프라이머를 이용하여 RT-PCR에 의해 확인하였다. 증폭된 cDNA 단편은 각각의 4개 TDV 혈청형의 확인을 허용하는 E/NS1 키메라성 접합 부위를 함유하였다. 각각의 씨드를 모든 4개의 혈청형-특이적 RT-PCR 반응에서 평가하여 바이러스 정체 및 이종성 TDV 혈청형으로의 교차 감염 부재를 확인하였다. 멸균성 평가를 USP 71(미국 약전, 섹션 71)에 따라 수행하였다. 미코플라즈마 평가를 수행하였다.
바이러스 오염에 대한 하기 시험관내 및 생체내 평가를 모두 씨드의 제조 동안 수집된 청정화되지 않고, 안정화되지 않은 TDV 수확물을 이용하여 수행하였다. 수확된 감염성 배지를 먼저 1 hr 동안 36 ± 1℃에서 DENV 토끼 폴리클로날 항혈청(Inviragen)으로 중화하여 DENV를 불활성화하였다. 시험관내 평가를 위해, 중화된 씨드를 25 ㎠ 플라스크에서 3개의 표시자 세포주, MRC5, VERO 및 MA104 내로 접종하였다. Echo 바이러스(CPE 대조군) 또는 홍역 바이러스(혈구흡착 대조군)를 각각 양성 CPE 또는 혈구흡착 대조군으로서 이용하였다. 모든 세포를 총 14일 동안 CPE에 대해 매일 모니터링하였다. 14일 말기에, 배양 상청액을 제거하고, 10 ㎖의 기니아픽 적혈구(RBC) 용액(포스페이트 완충 식염수 내 0.5% 기니아픽 RBC 3 ㎖, 세포 성장 배지로 10 ㎖로 만듦)으로 대체하였다. 이어서 플라스크를 30분 동안 5 ± 3℃에서 인큐베이션한 후, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 단층을 PBS로 세척하고, 혈구흡착에 대한 임의의 별-모양 RBC 덩어리의 존재에 대해 10× 확대 하에 관찰하였다.
외인성 제제에 대한 생체내 평가를 젖먹이 마우스, 이유-후 마우스 및 기니아픽에서 수행하였다. 젖먹이 마우스에 복강내(ip) 주사를 통해 0.1 ㎖ 또는 0.01 ㎖의 DENV-항혈청 중화된 씨드 샘플을 접종하였다(각각의 투여군에서 10마리 마우스). 유사하게, 10마리의 이유-후 마우스 각각에 0.5 ㎖ 또는 0.03 ㎖의 샘플을 ip 접종하였다. 기니아픽(5마리/그룹)에 각각 5.0　㎖을 ip 접종하였다. 젖먹이 마우스를 접종 후 총 14일 동안 유병률 및 사망률에 대해 매일 관찰하였다. 이유-후 마우스를 총 28일 동안 관찰하였고, 기니아픽을 접종 후 총 42일 동안 관찰하였다. 평가 물품은 80% 이상의 접종된 동물이 관찰 기간에 걸쳐 건강하게 유지된 경우, 허용성 기준을 충족하였다.
오염물질에 대한 생체내 평가를 또한 발육란에서 수행하고 진행하였다. 모든 샘플에 있어서, 10마리의 발육 계란(9일령)에 각각 양수 내로 0.5 ㎖의 DENV 항혈청-중화된 샘플을 접종하고, 3일 동안 35℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 10개 계란으로부터 양수를 수확하고, 풀링하고, 10개의 신선 발육란(10일령 내지 11일령; 0.5 ㎖/계란)의 양수 내로 계대배양하고, 추가 3일 동안 35℃에서 인큐베이션하였다. 유사하게, 각각의 샘플에 있어서, 10개의 발육란(6일령 내지 7일령)에 각각 계란 당 0.5 ㎖(TDV-2 1가 BVS) 또는 계란 당 0.25 ㎖(TDV-1, TDV-3 및 TDV-4 BVS)을 난황낭 내로의 주사에 의해 접종하고, 9일 동안 35℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 10개 계란으로부터의 난황낭을 수확하고 풀링하고, 10% 현탁액을 10개의 신선 발육란(6일령 내지 7일령; 0.5 ㎖/계란)의 난황낭 내로 계대배양하고, 추가 9일 동안 35℃에서 인큐베이션하였다. 양수 내로 접종된 계란(최초 및 계대 접종 모두)을 3일 인큐베이션 후 생활성에 대해 관찰하였다. 2개 풀의 양수를 모두 4℃ 및 25℃에서 닭, 기니아픽 및 인간 O형 적혈구를 이용하여 혈구응집 활성에 대해 평가하였다. 난황낭 내로 접종된 계란(최초 및 계대 접종 모두)을 9일 인큐베이션 후 생활성에 대해 관찰하였다.
바이러스 플라크 검정 및 면역초점 검정
바이러스 역가를 Vero 세포를 이용하여 플라크 검정 또는 면역초점 검정에 의해 측정하였다. 플라크 검정을 전술된 바와 같이 융합성 Vero 세포의 6-웰 플레이트에서 이중 아가로스 오버레이에서 수행하였고, 이들을 또한 이용하여 TDV 씨드의 플라크 표현형을 평가하였다. 정확한 비교를 위해, 동일한 실험에서 모든 바이러스의 플라크 크기를 측정하고 비교하였다. 9일 pi에 뉴트럴 레드로의 가시화 후, 각각의 바이러스에 대해 최대 10개의 잘 단리된 플라크를 평균 플라크 크기 계산을 위해 측정하였다. wt DENV-1, -3, 및 -4에 있어서 더 적은 플라크가 측정되었고, 더 큰 플라크 크기는 종종 10개의 잘-분리된 플라크 측정을 허용하지 않았다.
4가 TDV는 모든 4개 DENV 혈청형을 함유하므로, DENV 혈청형-특이적 면역초점 검정을 개발하여 4가 제형물에서 각각의 TDV 성분을 정량하였다. 각각의 개별 TDV MVS의 면역초점 검정을 플라크 검정과 비교하여 바이러스 적정 결과가 두 검정 간에 필적함을 확인하였다. 면역초점 검정을 연속 희석된 바이러스로 감염된 융합성 Vero 세포의 6-웰 플레이트에서 수행하였다. 세포에 0.7% 고점도 카복시메틸 셀룰로스(Sigma)를 함유하는 균형잡힌 염 배지(BSS/YE-LAH 배지)를 오버레이하고, 5% CO2로 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 오버레이의 제거 후, 세포 시트를 PBS로 3회 세척하고, -20℃에서 30분 동안 저온 80% 아세톤으로 고정하고, PBS로 1회 세척하고, 30분 동안 37℃에서 PBS 중 2.5%(w/v) 무지방 건조유, 0.5% Triton X-100, 0.05% Tween-20을 함유하는 차단 완충액으로 차단하였다. 차단된 세포를 1시간 동안 37℃에서 또는 하룻밤 동안 4℃에서 차단 완충액 중 희석된 DENV 혈청형-특이적 MAb, 1F1(DENV-1), 3H5(DENV-2), 8A-1(DENV-3), 또는 1H10(DENV-4)과 인큐베이션하고, 세척 완충액(PBS 중 0.05% Tween-20)으로 3회 세척하고, 45분 내지 60분 동안 37℃에서 알칼린 포스파타제- 또는 홀스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 친화도-순수 염소 항-마우스 IgG(Jackson Immuno Research Laboratories)와 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척한 후, 적절한 기질, 알칼린 포스파타제에 대해 1-단계 NBT/BCIP 플러스 억제인자(Pierce) 또는 HRP에 대해 벡터-VIP 키트(Vector Labs)를 발색을 위해 첨가하였다. 초점이 완전 발색되면, 물로 헹궈서 발색을 중단시켰다. 염색된 면역초점을 직접 가시화하고 라이트 박스 상에서 계수하였다.
유전자 서열
MVS 및 WVS의 전장 게놈을 서열분석하였다(하기 참고). 간략하게, 바이러스 RNA를 QIAamp 바이러스 RNA 키트(Qiagen)를 이용하여 TDV 씨드로부터 추출하고, 전체 게놈을 커버하는 중복 cDNA 단편을 Titan One Tube RT-PCR 키트(Roche Applied Science, Inc.)를 이용해서 증폭하였다. 증폭된 cDNA 단편을 겔 정제한 후 BigDye Terminator v3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 전방 및 후방 프라이머 둘 다로 서열분석하였다. 서열 반응을 BigDye XTerminator 정제 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 세정하고, DVBD/CDC에서 3130xl 유전자 분석기(Applied Biosystems) 상에 걸었다. Lasergene SeqMan 소프트웨어(DNAStar, Inc)를 게놈 분석 및 비교를 위해 이용하였다.
Taqman-기반 미스매치 증폭 돌연변이 검정(TaqMAMA)
TaqMAMA는 5'NC-57 약독화 유전자위에서의 복귀 수준의 더 미세한 평가를 허용하도록 개발된 민감한, 정량적 단일 뉴클레오타이드 다형성 검정이며, 본 연구를 위해 추가로 최적화되었다. MVS 및 WVS로부터 추출된 바이러스 RNA를 wt 또는 백신 5'NC-57 영역에 특이적인 2개 세트의 프라이머/Taqman 탐침으로 TaqMAMA에 의해 분석하였다. DENV-2 wt 및 백신 서열을 검출하기 위해 이용된 전방 프라이머는 각각 D2-41-GC 및 D2-40-TT였다. 각각의 전방 프라이머의 3'-말단 뉴클레오타이드는 각각의 바이러스에 대해 특이적인 5'NCR-57 뉴클레오타이드와 매칭된 반면, 각각의 프라이머에서 3'-말단 뉴클레오타이드에 인접한 뉴클레오타이드는 미스매치 효과를 증강시키기 위해 DENV-2 바이러스 게놈 서열과 상이하였다. wt 및 백신 세트 둘 다에 대한 후방 프라이머, CD-207, 및 Taqman 탐침, CD-169F는 동일하였다. 프라이머 및 탐침의 서열뿐만 아니라 사이클링 조건이 전술되었다. 5 ㎕의 바이러스 RNA 주형, 0.4 μM의 각각의 프라이머, 및 0.2 μM의 탐침을 함유하는 25 ㎕ 반응에서, BioRad iScript RT-PCR(탐침용) 키트를 이용하여, iQ5 또는 CFX-95 시스템(BioRad)으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 각각의 wt- 및 백신-특이적 검정에 있어서 각각의 샘플에 대해 3개 반응을 수행하였다. 게놈 카피수를 각각의 바이러스 유전형에 대해 제조된 표준 곡선에 대비하여 결정하였고, 여기서 RNA 표준은 각각의 유전형-특이적 cDNA의 nt 1 내지 2670을 함유하는 플라스미드로부터 유래된 전사체였다. 또한, 매 실험에서 최소 교차-반응성을 보장하기 위해, 이종성 유전형 프라이머/탐침 세트로 각각의 RNA 표준을 평가하여 검정의 특이성을 확인하였다. 결과를 복귀를 나타내는 바이러스 게놈의 백분율로서 보고하였다. 이전에, 상기 검정에 대한 입력 RNA 수준을 제한한 더 높은 교차-반응성 배경으로 인해, 원래의 검출 민감도는 약 0.1% 복귀였다(구별력). 이후, 검정을 개선된 실시간 PCR 설비 및 반응 키트를 이용하여 추가로 최적화하였고, 교차-반응성 배경은 훨씬 높은 수준(7 내지 8 log10 카피)의 RNA 주형 입력에서 상당히 감소되었다. 상기 최적화는 0.01% 내지 0.07% 복귀까지 낮게, 검출 민감도의 유의미한 개선을 일으켰다.
모기 C6/36 세포에서의 바이러스 복제 및 포유류 Vero 세포에서의 온도 민감도
4개의 TDV MVS 스톡 및 wt DENV-1, -2, -3, 및 -4 바이러스의 복제 표현형을 C6/36 모기 세포(애데스 알보픽투스(Aedes albopictus))에서 평가하였다. 6-웰 플레이트에서 성장시킨 C6/36 세포를 0.001의 MOI로 각각의 바이러스로 2개씩 감염시키고, 28℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 2% FBS를 함유하는 4 ㎖/웰의 DMEM 배지와 인큐베이션하였다. 배양 상청액의 소량 분취물을 6일 pi에 각각의 바이러스에 대해 수집하고, 40% FBS를 함유하는 동일 부피의 배지와 혼합하고, 바이러스 플라크 적정을 위해 준비될 때까지 -80℃에서 보관하였다.
6-웰 플레이트에서 Vero 세포의 5일 pi에 39℃에서의 바이러스 성장 대 37℃에서의 성장을 비교하여 온도 민감도를 수행하였다. 세포를 37℃에서 0.001의 MOI로 각각의 바이러스로 4개씩 감염시켰다. 바이러스의 흡착 후, 감염된 배양을 한 세트(2개씩의 플레이트)는 37℃에서 및 다른 세트는 39℃에서로 2개의 별도 5% CO2 인큐베이터에서 2% FBS를 함유하는 4 ㎖/웰의 DMEM 배지와 인큐베이션하였다. 배양 상청액의 분취물(50 ㎕)을 5일 pi에 수집하고, 40%의 FBS를 함유하는 동일 부피의 DMEM과 혼합하고, 바이러스 플라크 적정이 준비될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 인큐베이터 온도를 NIST-추적 가능한 공장-교정 온도계(-1℃ 내지 51℃; ERTCO)로 교정하였다.
모기 감염, 전염, 및 전파
연구를 위해 이용된 애데스 애집티(Aedes aegypti) 모기는 태국 Mae Sot 근처 빌리지(16' N, 33' E)에서 2002년에 확립된 콜로니에서 유래되었다. 유충에서 출현 후, 성체 모기를 자유롭게 제공되는 10% 수크로스 용액과 함께 16:8(명:암) 광주기로 28℃에서 유지하였다. 5일령 내지 7일령 암컷 모기를 감염성 혈액 식사 섭취 또는 흉곽내(IT) 접종을 위해 이용하였다. 신선 배양된 TDV 및 wt DENV의 분취물을 수확 즉시(임의의 냉동-해동 사이클 없이) 이용하여 경구 감염을 위해 아래에 나타낸 바와 같이 바이러스 혈액 식사를 제조하였다. 잔여 바이러스 상청액에 FBS를 최종 농도 20%까지 보충하고, 분취물을 향후 바이러스 플라크 적정 및 IT 접종 실험을 위해 -80℃에서 보관하였다. 이러한 실험을 위해 신선 제조된 TDV 씨드를 Vero 세포에서 프리-마스터 씨드로부터 증폭하고, TDV MVS 등가물로서 간주하였다.
신선 바이러스를 경구 감염일에 피브린 제거된 닭 혈액(Colorado Serum Company)과 1:1로 비로 혼합하여 감염성 혈액 식사를 제조하였다. 모기를 하룻밤 동안 당-금식시킨 후, Hemotek 멤브레인 섭식 시스템(Discovery Workshops)을 이용하여 1시간 동안 바이러스:혈액 혼합물을 제공하였다. 혈액 식사의 50 ㎕ 분취물을 바이러스 용량의 역-적정을 위해 -80℃에서 보유하였다. 완전-충혈된 암컷을 저온 마취 하에 정렬하고, 자유롭게 제공되는 10% 수크로스 용액을 포함하는 상자 내에 배치하였다. 상자를 16:8 h(명:암)의 광주기로 28℃에 배치하였다. 14일 후, 각각의 바이러스 그룹으로부터의 25마리 내지 30마리의 모기를 트리에틸아민(Flynap®, Carolina Biological Supply Company)으로의 노출을 통해 마취하고, 1개의 뒷다리를 제거하고, 10% FBS 및 5% 페니실린/스트렙토마이신(각각 100 U/㎖ 및 100 ㎍/㎖)을 포함하는 0.5 ㎖의 DMEM에 배치하였다. 마취된 모기의 주둥이를 2.5% FBS 및 25% 수크로스 용액을 함유하는 모세관 내로 삽입하여 침을 수집하였다. 모기가 적어도 15분 동안 침을 분비하게 둔 후, 모세관 및 신체를 DMEM을 함유하는 별도의 튜브 내에 배치하였다. 모기 신체, 다리 및 침을 분쇄하고 감염성 바이러스에 대해 검정하기 전까지 이를 -80℃에서 보관하였다. IT 접종을 위해, 모기를 저온-마취하고, 0.34 ㎕의 접종물에서 대략 50 pfu의 바이러스로 접종하였다. 접종된 모기를 전술된 바와 같이 동일한 조건에서 7일 동안 유지하였다. 이어서 모기를 마취하고, 이의 침 및 신체를 전술된 바와 같이 수집하였다. 샘플을 추가 가공 전까지 -80℃에서 보관하였다.
바이러스 적정을 위한 샘플을 가공하기 위해, 신체 및 다리 샘플을 믹서 밀을 이용해서 4분 동안 24사이클/초로 구리 코팅된 BB(Crossman Corporation, NY)로 균질화한 후, 3분 동안 3,000 × g에서 원심분리에 의해 청정화하였다. 침 샘플을 3분 동안 3,000 × g에서 원심분리하여 모세관으로부터 유체를 축출하였다. 신체 및 다리 균질화물 및 침 샘플의 10배 희석액을 플라크 검정에 의해 감염성 바이러스의 존재에 대해 평가하였다. 신체, 다리, 및 침으로부터의 결과를 각각 감염율, 전염율, 및 전파율의 결정을 위해 이용하였다.
마우스 신경독력
임신 시기의 암컷 ICR 마우스를 Taconic Labs에서 입수하였고, 한배 새끼의 근사 출산 시간을 결정하기 위해 매일 여러 번 모니터링하였다. 주어진 실험에서, 출생 후 대략 12시간 내지 24시간에, 바이러스 당 8마리의 2배 새끼(n=16)를 30-게이지 바늘을 이용하여 두개내(ic) 접종에 의해 20 ㎕의 희석액에서 103 내지 104 pfu의 바이러스로 유발접종하였다. 동물을 유발접종 후 적어도 32일 동안 매일 적어도 3회 모니터링하였다. 질병의 최초 징후(거친 털, 구부린 등, 체중 감소, 비정상적인 운동, 마비, 또는 무기력) 시, 동물을 이소플루란 가스로의 치사 마취에 이어 경추 탈골에 의해 안락사시켰다. 안락사의 감염-후 날짜가 동물에 있어서 "질병/유병률까지의 시간" 또는 "생존 시간"을 나타내었다. 동물 실험을 DVBD/CDC IACUC-승인된 동물 프로토콜에 따라 수행하였다.
마스터 씨드 바이러스의 유도
TDV-1 마스터 바이러스 씨드(MVS)
키메라성 바이러스 게놈의 뉴클레오타이드 서열 및 번역된 단백질의 추정되는 아미노산 서열이 본원에서 제공된다. 예를 들어, TDV-1 폴리뉴클레오타이드 서열에는 서열번호 1, 3, 5 및 7로 나타내는 것들이 포함되며, TDV-1 폴리펩타이드 서열에는 서열번호 2, 4, 6 및 8로 나타내는 것들이 포함된다. 대부분의 prM-E 유전자(nt 457 내지 -2379, 밑줄침)는 야생형(wt) DEN-1 16007 바이러스 특이적이다; 나머지 게놈은 DEN-2 PDK-53 바이러스 특이적이다. wt 바이러스(D1 16007 또는 D2 16681)와 상이한 모든 조작된 치환뿐만 아니라, MVS에서 검출된 추가적인 돌연변이(조작된 cDNA 클론으로부터의 변화)를 표시한다.
게놈 및 단백질에 포함되는 치환 :
D1(prM-E) 및 D2 골격 간의 접합 부위:
a. MluI(nt 451 내지 456): 조작된 침묵화 돌연변이, nt-453 A-에서-G로
b. NgoMIV(nt 2380 내지 2385): 조작된 돌연변이, nt-2381/2382 TG-에서-CC로(E-482 Val-에서-Ala로의 변화를 생성함)
D2 PDK-53 바이러스 골격(wt D2 16681로부터의 변화): 모두 진한 글씨체
a. 5'-비코딩 영역(NCR)-57(nt-57 C-에서-T로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
b. NS1-53 Gly-에서-Asp로(nt-2579 G-에서-A로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
c. NS2A-181 Leu-에서-Phe로(nt-4018 C-에서-T로)
d. NS3-250 Glu-에서-Val으로(nt-5270 A-에서-T로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
e. nt-5547(NS3 유전자) T-에서-C로의 침묵화 돌연변이
f. NS4A-75 Gly-에서-Ala으로(nt-6599 G-에서-C로)
* PDK-53의 nt-8571 C-에서-T로의 침묵화 돌연변이는 백신 바이러스에서 조작되지 않음.
DEN-1 prM-E(wt D1 16007로부터의 변화)
a. 원상태 XbaI 부위를 제어하기 위해 조작된 nt-1575 T-에서-C로의 침묵화 돌연변이
백신 씨드에서 확인된 추가적인 치환(원래 클론과 0.03% nt 상이함)
TDV-2 마스터 바이러스 씨드(MVS)
a. NS2A-116 Ile-에서-Leu으로(nt-3823 A-에서-C로, 진한 글씨체)
b. NS2B-92 Glu-에서-Asp로(nt-4407 A-에서-T로, 진한 글씨체)
c. nt-7311 A-에서-G로의 침묵화 돌연변이(진한 글씨체)
키메라성 바이러스 게놈의 뉴클레오타이드 서열 및 번역된 단백질의 추정되는 아미노산 서열이 본원에서 제공된다. 예를 들어, TDV-2 폴리뉴클레오타이드 서열에는 서열번호 9, 11, 13 및 15로 나타내는 것들이 포함되며, TDV-2 폴리펩타이드 서열에는 서열번호 10, 12, 14 및 16으로 나타내는 것들이 포함된다. 조작된 바이러스는 D2 PDK-53 바이러스에 기반한다. 야생형 DEN-2 16681 바이러스(또한 PDK-53에 대한 모체 바이러스)와 상이한 모든 조작된 치환뿐만 아니라, MVS에서 검출된 추가적인 돌연변이(조작된 cDNA 클론으로부터의 변화)를 표시한다.
게놈 및 단백질에 포함된 치환 :
D2 PDK-53 바이러스 골격(wt D2 16681로부터의 변화): 모두 진한 글씨체
a. 5'-비코딩 영역 (NCR)-57(nt-57 C-에서-T로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
b. prM-29 Asp-에서-Val으로(nt-524 A-에서-T로)
c. nt-2055 C-에서-T로의(E 유전자) 침묵화 돌연변이
d. NS1-53 Gly-에서-Asp로(nt-2579 G-에서-A로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
e. NS2A-181 Leu-에서-Phe로(nt-4018 C-에서-T로)
f. NS3-250 Glu-에서-Val으로(nt-5270 A-에서-T로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
g. nt-5547(NS3 유전자) T-에서-C로의 침묵화 돌연변이
h. NS4A-75 Gly-에서-Ala으로(nt-6599 G-에서-C로)
* PDK-53의 nt-8571 C-에서-T로의 침묵화 돌연변이는 백신 바이러스에서 조작되지 않음.
조작된 클론 마커(침묵화 돌연변이):
a. nt-900 T-에서-C로의 침묵화 돌연변이: 감염성 클론 마커
백신 씨드에서 확인된 추가적인 치환(원래 클론과 0.02% nt 상이함
a. prM-52 Lys-에서-Glu로(nt-592 A-에서-G로), 진한 글씨체
b. NS5-412 Ile-에서-Val으로(nt-8803 A-에서-G로), 진한 글씨체
TDV-3 마스터 바이러스 씨드(MVS)
키메라성 바이러스 게놈의 뉴클레오타이드 서열 및 번역된 단백질의 추정되는 아미노산 서열이 본원에서 제공된다. 예를 들어, TDV-3 폴리뉴클레오타이드 서열에는 서열번호 17, 19, 21 및 23으로 나타내는 것들이 포함되며, TDV-3 폴리펩타이드 서열에는 서열번호 18, 20, 22 및 24로 나타내는 것들이 포함된다. 대부분의 prM-E 유전자(nt-457에서 nt-2373으로, 밑줄침)는 야생형(wt) DEN-3 16562 바이러스-특이적이며; 잔여 뉴클레오타이드 서열은 DEN-2 PDK-53 바이러스-특이적이다. DEN-3 바이러스의 E 단백질은 DEN-2의 E 단백질보다 2개 더 적은 아미노산을 갖는다. 따라서, NgoMIV로부터 시작되는 nt 위치는 원래의 DEN-2 PDK-53 nt 위치보다 6 nt가 더 적다. wt 바이러스(DEN-3 16562 또는 DEN-2 16681)와 상이한 모든 조작된 치환뿐만 아니라, 추가적인 돌연변이(조작된 cDNA 클론으로부터의 변화)를 표시한다.
게놈 및 단백질에 포함된 치환 :
접합 부위:
a. MluI(nt 451 내지 456): 조작된 침묵화 돌연변이, nt-453 A-에서-G로
b. NgoMIV(nt 2374 내지 2379): 조작된 돌연변이, nt-2375/2376 TG-에서-CC로(E-480 Val-에서-Ala으로의 변화를 생성함)
D2 PDK-53 바이러스 골격(wt D2 16681로부터의 변화): 진한 글씨체
a. 5'-비코딩 영역(NCR)-57(nt-57 C-에서-T로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
b. NS1-53 Gly-에서-Asp로(nt-2573 G-에서-A로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
c. NS2A-181 Leu-에서-Phe으로(nt-4012 C-에서-T로)
d. NS3-250 Glu-에서-Val으로(nt-5264 A-에서-T로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
e. nt-5541(NS3 유전자) T-에서-C로의 침묵화 돌연변이
f. NS4A-75 Gly-에서-Ala으로(nt-6593 G-에서-C로)
* PDK-53의 nt-8565 C-에서-T로의 침묵화 돌연변이는 백신 바이러스에서 조작되지 않음.
DEN-3 prM-E에서 조작된 돌연변이(wt D3 16562로부터의 변화)
a. 조작된 nt-552 C-에서-T로의 침묵화 돌연변이: 클론 마커
b. 배양에서 효율적인 복제를 위해 조작된 E-345 His-에서-Leu으로(nt-1970 A-에서-T로)
백신 씨드에서 확인된 추가적인 치환(원래 클론과 0.02% nt 상이함)
a. E-223 Thr-에서-Ser으로의 돌연변이(nt-1603 A-에서-T로, 진한 글씨체)
b. nt-7620 A-에서-G로의 침묵화 돌연변이(진한 글씨체)
TDV-4 마스터 바이러스 씨드(MVS)
키메라성 바이러스 게놈의 뉴클레오타이드 서열 및 번역된 단백질의 추정되는 아미노산 서열이 본원에서 제공된다. 예를 들어, TDV-4 폴리뉴클레오타이드 서열에는 서열번호 25, 27, 29 및 31로 나타내는 것들이 포함되며, TDV-4 폴리펩타이드 서열에는 서열번호 26, 28, 30 및 32로 나타내는 것들이 포함된다. 대부분의 prM-E 유전자(nt-457에서 nt-2373으로, 밑줄침)는 야생형(wt) DEN-4 1036 바이러스-특이적이며; 잔여 뉴클레오타이드 서열은 DEN-2 PDK-53 바이러스-특이적이다. wt 바이러스(DEN-3 16562 또는 DEN-2 16681)와 상이한 모든 조작된 치환뿐만 아니라, 추가적인 돌연변이(조작된 cDNA 클론으로부터의 변화)를 표시한다.
게놈 및 단백질에 포함된 치환 :
접합 부위:
a. MluI(nt 451 내지 456): 조작된 침묵화 돌연변이, nt-453 A-에서-G로
b. NgoMIV(nt 2380 내지 2385): 조작된 돌연변이, nt-2381/2382 TG-에서-CC로(E-482 Val-에서-Ala으로의 변화를 생성함)
D2 PDK-53 바이러스 골격(wt D2 16681로부터의 변화)
a. 5'-비코딩 영역(NCR)-57(nt-57 C-에서-T로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
b. NS1-53 Gly-에서-Asp로(nt-2579 G-에서-A로): 주요 약독화 유전자위(빨간색)
c. NS2A-181 Leu-에서-Phe으로(nt-4018 C-에서-T로, 진한 글씨체)
d. NS3-250 Glu-에서-Val으로(nt-5270 A-에서-T로: 주요 약독화 유전자위(빨간색)
e. nt-5547(NS3 유전자) T-에서-C로의 침묵화 돌연변이(진한 글씨체)
f. NS4A-75 Gly-에서-Ala으로(nt-6599 G-에서-C로, 진한 글씨체)
* PDK-53의 nt-8571 C-에서-T로의 침묵화 돌연변이는 백신 바이러스에서 조작되지 않음.
cDNA 클론에서 조작된 치환
a. 조작된 C-100 Arg-에서-Ser으로(nt-396 A-에서-C로): 배양에서 바이러스 복제를 개선할 수 있음
b. 조작된 nt-1401 A-에서-G로의 침묵화 돌연변이
c. 조작된 E-364 Ala-에서-Val으로(nt-2027 C-에서-T로): 배양에서 바이러스 복제를 개선할 수 있음
d. 조작된 E-447 Met-에서-Leu으로(nt-2275 A-에서-C로): 배양에서 바이러스 복제를 개선할 수 있음
백신 씨드에서 확인된 추가적인 치환(원래 클론과 0.06% nt 상이함)
a. nt-225(C 유전자) A-에서-T로의 침묵화 돌연변이(진한 글씨체)
b. NS2A-66 Asp-에서-Gly으로의(nt-3674 A-에서-G로의) 돌연변이(진한 글씨체)
c. NS2A-99 Lys-에서-Lys/Arg 혼합으로(nt-3773 A-에서-A/G 혼합으로, 진한 글씨체)
d. nt-5391 C-에서-T로의(NS3 유전자) 침묵화 돌연변이(진한 글씨체)
e. NS4A-21 Ala-에서-Val으로(nt-6437 C-에서-T로, 진한 글씨체)
f. nt-7026 T-에서-C/T 혼합으로의 침묵화 돌연변이(진한 글씨체)
g. nt-9750 A-에서-C로의 침묵화 돌연변이(진한 글씨체)
*******************
본원에서 개시되고 청구되는 모든 조성물 및 방법은 본 개시의 견지에서 과도한 실험없이 제조되고 실행될 수 있다. 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 관점으로 기재되었으나, 당업자에게는 본 발명의 개념, 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 본원에서 기재되는 조성물 및 방법 및 방법의 단계 또는 단계 순서에 변화가 적용될 수 있음이 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 그리고 생리적으로 모두 관련된 소정 제제가 동일하거나 유사한 결과가 달성되면서 본원에서 기재되는 제제에 대해 치환될 수 있음이 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환 및 개질은 첨부되는 청구범위에서 정의되는 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내인 것으로 간주된다.
<110> Takeda Vaccines, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DENGUE VIRUS CHIMERIC CONSTRUCTS IN VACCINES <130> 2018-FPA-8969 <150> US 62/322,167 <151> 2016-04-13 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus serotype 1, Pre-Master <400> 1 agttgttagt ctacgtggac cgacaaagac agattctttg agggagctaa gctcaatgta 60 gttctaacag ttttttaatt agagagcaga tctctgatga ataaccaacg gaaaaaggcg 120 aaaaacacgc ctttcaatat gctgaaacgc gagagaaacc gcgtgtcgac tgtgcaacag 180 ctgacaaaga gattctcact tggaatgctg cagggacgag gaccattaaa actgttcatg 240 gccctggtgg cgttccttcg tttcctaaca atcccaccaa cagcagggat attgaagaga 300 tggggaacaa ttaaaaaatc aaaagctatt aatgttttga gagggttcag gaaagagatt 360 ggaaggatgc tgaacatctt gaataggaga cgcagatctg caggcatgat cattatgctg 420 attccaacag tgatggcgtt ccatttaacc acgcgtgggg gagagccgca tatgatagtt 480 agcaagcagg aaagaggaaa gtcacttttg ttcaagacct ctgcaggtgt caacatgtgc 540 accctcattg cgatggattt gggagagttg tgtgaggaca cgatgaccta 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1440 cctacgtcgg aaatacagct gaccgactac ggaaccctta cattagattg ttcacctagg 1500 acagggctag attttaacga gatggtgttg ctgacaatga aagaaagatc atggcttgtc 1560 cacaaacaat ggttcctaga cttaccactg ccttggacct ctggggcttc aacatcccaa 1620 gagacttgga acagacaaga tttactggtc acatttaaga cagctcatgc aaagaagcag 1680 gaagtagtcg tactaggatc acaagaagga gcaatgcaca ctgcgctgac tggagcgaca 1740 gaaatccaaa cgtcaggaac gacaacaatt ttcgcaggac acctaaaatg cagactaaaa 1800 atggacaaac taactttaaa agggatgtca tatgtgatgt gcacaggctc attcaagtta 1860 gagaaagaag tggctgagac ccagcatgga actgttctgg tgcaggttaa atatgaagga 1920 acagacgcac catgcaagat tcccttttcg acccaagatg agaaaggagc aacccagaat 1980 gggagattaa taacagccaa ccccatagtc actgacaaag aaaaaccagt caatattgag 2040 gcagaaccac cctttggtga gagctacatc gtggtaggag caggtgaaaa agctttgaaa 2100 ctaagctggt tcaagaaagg aagcagcata gggaaaatgt ttgaagcaac tgcccgagga 2160 gcacgaagga tggccattct gggagacacc gcatgggact tcggttctat aggaggagtg 2220 ttcacgtcta tgggaaaact ggtacaccag gtttttggaa ctgcatatgg agttttgttt 2280 agcggagttt cttggaccat gaaaatagga atagggattc tgctgacatg gctaggatta 2340 aattcaagga acacgtccct ttcgatgatg tgcatcgcag ccggcattgt gacactgtat 2400 ttgggagtca tggtgcaggc cgatagtggt tgcgttgtga gctggaaaaa caaagaactg 2460 aaatgtggca gtgggatttt catcacagac aacgtgcaca catggacaga acaatacaag 2520 ttccaaccag aatccccttc aaaactagct tcagctatcc agaaagccca tgaagaggac 2580 atttgtggaa tccgctcagt aacaagactg gagaatctga tgtggaaaca aataacacca 2640 gaattgaatc acattctatc agaaaatgag gtgaagttaa ctattatgac aggagacatc 2700 aaaggaatca tgcaggcagg aaaacgatct ctgcggcctc agcccactga gctgaagtat 2760 tcatggaaaa catggggcaa agcaaaaatg ctctctacag agtctcataa ccagaccttt 2820 ctcattgatg gccccgaaac agcagaatgc cccaacacaa atagagcttg gaattcgttg 2880 gaagttgaag actatggctt tggagtattc accaccaata tatggctaaa attgaaagaa 2940 aaacaggatg tattctgcga ctcaaaactc atgtcagcgg ccataaaaga caacagagcc 3000 gtccatgccg atatgggtta ttggatagaa agtgcactca atgacacatg gaagatagag 3060 aaagcctctt tcattgaagt taaaaactgc cactggccaa aatcacacac cctctggagc 3120 aatggagtgc tagaaagtga gatgataatt ccaaagaatc tcgctggacc agtgtctcaa 3180 cacaactata gaccaggcta ccatacacaa ataacaggac catggcatct aggtaagctt 3240 gagatggact ttgatttctg tgatggaaca acagtggtag tgactgagga ctgcggaaat 3300 agaggaccct ctttgagaac aaccactgcc tctggaaaac tcataacaga atggtgctgc 3360 cgatcttgca cattaccacc gctaagatac agaggtgagg atgggtgctg gtacgggatg 3420 gaaatcagac cattgaagga gaaagaagag aatttggtca actccttggt cacagctgga 3480 catgggcagg tcgacaactt ttcactagga gtcttgggaa tggcattgtt cctggaggaa 3540 atgcttagga cccgagtagg aacgaaacat gcaatactac tagttgcagt ttcttttgtg 3600 acattgatca cagggaacat gtcctttaga gacctgggaa gagtgatggt tatggtaggc 3660 gccactatga cggatgacat aggtatgggc gtgacttatc ttgccctact agcagccttc 3720 aaagtcagac caacttttgc agctggacta ctcttgagaa agctgacctc caaggaattg 3780 atgatgacta ctataggaat tgtactcctc tcccagagca ccctaccaga gaccattctt 3840 gagttgactg atgcgttagc cttaggcatg atggtcctca aaatggtgag aaatatggaa 3900 aagtatcaat tggcagtgac tatcatggct atcttgtgcg tcccaaacgc agtgatatta 3960 caaaacgcat ggaaagtgag ttgcacaata ttggcagtgg tgtccgtttc cccactgttc 4020 ttaacatcct cacagcaaaa aacagattgg ataccattag cattgacgat caaaggtctc 4080 aatccaacag ctatttttct aacaaccctc tcaagaacca gcaagaaaag gagctggcca 4140 ttaaatgagg ctatcatggc agtcgggatg gtgagcattt tagccagttc tctcctaaaa 4200 aatgatattc ccatgacagg accattagtg gctggagggc tcctcactgt gtgctacgtg 4260 ctcactggac gatcggccga tttggaactg gagagagcag ccgatgtcaa atgggaagac 4320 caggcagaga tatcaggaag cagtccaatc ctgtcaataa caatatcaga agatggtagc 4380 atgtcgataa aaaatgaaga ggaagatcaa acactgacca tactcattag aacaggattg 4440 ctggtgatct caggactttt tcctgtatca ataccaatca cggcagcagc atggtacctg 4500 tgggaagtga agaaacaacg ggccggagta ttgtgggatg ttccttcacc cccacccatg 4560 ggaaaggctg aactggaaga tggagcctat agaattaagc aaaaagggat tcttggatat 4620 tcccagatcg gagccggagt ttacaaagaa ggaacattcc atacaatgtg gcatgtcaca 4680 cgtggcgctg ttctaatgca taaaggaaag aggattgaac catcatgggc ggacgtcaag 4740 aaagacctaa tatcatatgg aggaggctgg aagttagaag gagaatggaa ggaaggagaa 4800 gaagtccagg tattggcact ggagcctgga aaaaatccaa gagccgtcca aacgaaacct 4860 ggtcttttca aaaccaacgc cggaacaata ggtgctgtat ctctggactt ttctcctgga 4920 acgtcaggat ctccaattat cgacaaaaaa ggaaaagttg tgggtcttta tggtaatggt 4980 gttgttacaa ggagtggagc atatgtgagt gctatagccc agactgaaaa aagcattgaa 5040 gacaacccag agatcgaaga tgacattttc cgaaagagaa gactgaccat catggacctc 5100 cacccaggag cgggaaagac gaagagatac cttccggcca tagtcagaga agctataaaa 5160 cggggtttga gaacattaat cttggccccc actagagttg tggcagctga aatggaggaa 5220 gcccttagag gacttccaat aagataccag accccagcca tcagagctgt gcacaccggg 5280 cgggagattg tggacctaat gtgtcatgcc acatttacca tgaggctgct atcaccagtt 5340 agagtgccaa actacaacct gattatcatg gacgaagccc atttcacaga cccagcaagt 5400 atagcagcta gaggatacat ctcaactcga gtggagatgg gtgaggcagc tgggattttt 5460 atgacagcca ctcccccggg aagcagagac ccatttcctc agagcaatgc accaatcata 5520 gatgaagaaa gagaaatccc tgaacgctcg tggaattccg gacatgaatg ggtcacggat 5580 tttaaaggga agactgtttg gttcgttcca agtataaaag caggaaatga tatagcagct 5640 tgcctgagga aaaatggaaa gaaagtgata caactcagta ggaagacctt tgattctgag 5700 tatgtcaaga ctagaaccaa tgattgggac ttcgtggtta caactgacat ttcagaaatg 5760 ggtgccaatt tcaaggctga gagggttata gaccccagac gctgcatgaa accagtcata 5820 ctaacagatg gtgaagagcg ggtgattctg gcaggaccta tgccagtgac ccactctagt 5880 gcagcacaaa gaagagggag aataggaaga aatccaaaaa atgagaatga ccagtacata 5940 tacatggggg aacctctgga aaatgatgaa gactgtgcac actggaaaga agctaaaatg 6000 ctcctagata acatcaacac gccagaagga atcattccta gcatgttcga accagagcgt 6060 gaaaaggtgg atgccattga tggcgaatac cgcttgagag gagaagcaag gaaaaccttt 6120 gtagacttaa tgagaagagg agacctacca gtctggttgg cctacagagt ggcagctgaa 6180 ggcatcaact acgcagacag aaggtggtgt tttgatggag tcaagaacaa ccaaatccta 6240 gaagaaaacg tggaagttga aatctggaca aaagaagggg aaaggaagaa attgaaaccc 6300 agatggttgg atgctaggat ctattctgac ccactggcgc taaaagaatt taaggaattt 6360 gcagccggaa gaaagtctct gaccctgaac ctaatcacag aaatgggtag gctcccaacc 6420 ttcatgactc agaaggcaag agacgcactg gacaacttag cagtgctgca cacggctgag 6480 gcaggtggaa gggcgtacaa ccatgctctc agtgaactgc cggagaccct ggagacattg 6540 cttttactga cacttctggc tacagtcacg ggagggatct ttttattctt gatgagcgca 6600 aggggcatag ggaagatgac cctgggaatg tgctgcataa tcacggctag catcctccta 6660 tggtacgcac aaatacagcc acactggata gcagcttcaa taatactgga gttttttctc 6720 atagttttgc ttattccaga acctgaaaaa cagagaacac cccaagacaa ccaactgacc 6780 tacgttgtca tagccatcct cacagtggtg gccgcaacca tggcaaacga gatgggtttc 6840 ctagaaaaaa cgaagaaaga tctcggattg ggaagcattg caacccagca acccgagagc 6900 aacatcctgg acatagatct acgtcctgca tcagcatgga cgctgtatgc cgtggccaca 6960 acatttgtta caccaatgtt gagacatagc attgaaaatt cctcagtgaa tgtgtcccta 7020 acagctatag ccaaccaagc cacagtgtta atgggtctcg ggaaaggatg gccattgtca 7080 aagatggaca tcggagttcc ccttctcgcc attggatgct actcacaagt caaccccata 7140 actctcacag cagctctttt cttattggta gcacattatg ccatcatagg gccaggactc 7200 caagcaaaag caaccagaga agctcagaaa agagcagcgg cgggcatcat gaaaaaccca 7260 actgtcgatg gaataacagt gattgaccta gatccaatac cttatgatcc gaagtttgaa 7320 aagcagttgg gacaagtaat gctcctagtc ctctgcgtga ctcaagtatt gatgatgagg 7380 actacatggg ctctgtgtga ggctttaacc ttagctaccg ggcccatctc cacattgtgg 7440 gaaggaaatc cagggaggtt ttggaacact accattgcgg tgtcaatggc taacattttt 7500 agagggagtt acttggccgg agctggactt ctcttttcta ttatgaagaa cacaaccaac 7560 acaagaaggg gaactggcaa cataggagag acgcttggag agaaatggaa aagccgattg 7620 aacgcattgg gaaaaagtga attccagatc tacaagaaaa gtggaatcca ggaagtggat 7680 agaaccttag caaaagaagg cattaaaaga ggagaaacgg accatcacgc tgtgtcgcga 7740 ggctcagcaa aactgagatg gttcgttgag agaaacatgg tcacaccaga agggaaagta 7800 gtggacctcg gttgtggcag aggaggctgg tcatactatt gtggaggact aaagaatgta 7860 agagaagtca aaggcctaac aaaaggagga ccaggacacg aagaacccat ccccatgtca 7920 acatatgggt ggaatctagt gcgtcttcaa agtggagttg acgttttctt catcccgcca 7980 gaaaagtgtg acacattatt gtgtgacata ggggagtcat caccaaatcc cacagtggaa 8040 gcaggacgaa cactcagagt ccttaactta gtagaaaatt ggttgaacaa caacactcaa 8100 ttttgcataa aggttctcaa cccatatatg ccctcagtca tagaaaaaat ggaagcacta 8160 caaaggaaat atggaggagc cttagtgagg aatccactct cacgaaactc cacacatgag 8220 atgtactggg tatccaatgc ttccgggaac atagtgtcat cagtgaacat gatttcaagg 8280 atgttgatca acagatttac aatgagatac aagaaagcca cttacgagcc ggatgttgac 8340 ctcggaagcg gaacccgtaa catcgggatt gaaagtgaga taccaaacct agatataatt 8400 gggaaaagaa tagaaaaaat aaagcaagag catgaaacat catggcacta tgaccaagac 8460 cacccataca aaacgtgggc ataccatggt agctatgaaa caaaacagac tggatcagca 8520 tcatccatgg tcaacggagt ggtcaggctg ctgacaaaac cttgggacgt cgtccccatg 8580 gtgacacaga tggcaatgac agacacgact ccatttggac aacagcgcgt ttttaaagag 8640 aaagtggaca cgagaaccca agaaccgaaa gaaggcacga agaaactaat gaaaataaca 8700 gcagagtggc tttggaaaga attagggaag aaaaagacac ccaggatgtg caccagagaa 8760 gaattcacaa gaaaggtgag aagcaatgca gccttggggg ccatattcac tgatgagaac 8820 aagtggaagt cggcacgtga ggctgttgaa gatagtaggt tttgggagct ggttgacaag 8880 gaaaggaatc tccatcttga aggaaagtgt gaaacatgtg tgtacaacat gatgggaaaa 8940 agagagaaga agctagggga attcggcaag gcaaaaggca gcagagccat atggtacatg 9000 tggcttggag cacgcttctt agagtttgaa gccctaggat tcttaaatga agatcactgg 9060 ttctccagag agaactccct gagtggagtg gaaggagaag ggctgcacaa gctaggttac 9120 attctaagag acgtgagcaa gaaagaggga ggagcaatgt atgccgatga caccgcagga 9180 tgggatacaa gaatcacact agaagaccta aaaaatgaag aaatggtaac aaaccacatg 9240 gaaggagaac acaagaaact agccgaggcc attttcaaac taacgtacca aaacaaggtg 9300 gtgcgtgtgc aaagaccaac accaagaggc acagtaatgg acatcatatc gagaagagac 9360 caaagaggta gtggacaagt tggcacctat ggactcaata ctttcaccaa tatggaagcc 9420 caactaatca gacagatgga gggagaagga gtctttaaaa gcattcagca cctaacaatc 9480 acagaagaaa tcgctgtgca aaactggtta gcaagagtgg ggcgcgaaag gttatcaaga 9540 atggccatca gtggagatga ttgtgttgtg aaacctttag atgacaggtt cgcaagcgct 9600 ttaacagctc taaatgacat gggaaagatt aggaaagaca tacaacaatg ggaaccttca 9660 agaggatgga atgattggac acaagtgccc ttctgttcac accatttcca tgagttaatc 9720 atgaaagacg gtcgcgtact cgttgttcca tgtagaaacc aagatgaact gattggcaga 9780 gcccgaatct cccaaggagc agggtggtct ttgcgggaga cggcctgttt ggggaagtct 9840 tacgcccaaa tgtggagctt gatgtacttc cacagacgcg acctcaggct ggcggcaaat 9900 gctatttgct cggcagtacc atcacattgg gttccaacaa gtcgaacaac ctggtccata 9960 catgctaaac atgaatggat gacaacggaa gacatgctga cagtctggaa cagggtgtgg 10020 attcaagaaa acccatggat ggaagacaaa actccagtgg aatcatggga ggaaatccca 10080 tacttgggga aaagagaaga ccaatggtgc ggctcattga ttgggttaac aagcagggcc 10140 acctgggcaa agaacatcca agcagcaata aatcaagtta gatcccttat aggcaatgaa 10200 gaatacacag attacatgcc atccatgaaa agattcagaa gagaagagga agaagcagga 10260 gttctgtggt agaaagcaaa actaacatga aacaaggcta gaagtcaggt cggattaagc 10320 catagtacgg aaaaaactat gctacctgtg agccccgtcc aaggacgtta aaagaagtca 10380 ggccatcata aatgccatag cttgagtaaa ctatgcagcc tgtagctcca cctgagaagg 10440 tgtaaaaaat ccgggaggcc acaaaccatg gaagctgtac gcatggcgta gtggactagc 10500 ggttagagga gacccctccc ttacaaatcg cagcaacaat gggggcccaa ggcgagatga 10560 agctgtagtc tcgctggaag gactagaggt tagaggagac ccccccgaaa caaaaaacag 10620 catattgacg ctgggaaaga ccagagatcc tgctgtctcc tcagcatcat tccaggcaca 10680 gaacgccaga aaatggaatg gtgctgttga atcaacaggt tct 10723 <210> 2 <211> 3391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus serotype 1, Pre-Master <400> 2 Met Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Phe Asn Met Leu 1 5 10 15 Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg 20 25 30 Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met 35 40 45 Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly 50 55 60 Ile Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val 65 70 75 80 Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn 85 90 95 Arg Arg Arg Arg Ser Ala Gly Met Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Val 100 105 110 Met Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Gly Gly Glu Pro His Met Ile Val 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ser Ala Gly 130 135 140 Val Asn Met Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu 145 150 155 160 Asp Thr Met Thr Tyr Lys Cys Pro Arg Ile Thr Glu Ala Glu Pro Asp 165 170 175 Asp 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1, MVS <400> 3 agttgttagt ctacgtggac cgacaaagac agattctttg agggagctaa gctcaatgta 60 gttctaacag ttttttaatt agagagcaga tctctgatga ataaccaacg gaaaaaggcg 120 aaaaacacgc ctttcaatat gctgaaacgc gagagaaacc gcgtgtcgac tgtgcaacag 180 ctgacaaaga gattctcact tggaatgctg cagggacgag gaccattaaa actgttcatg 240 gccctggtgg cgttccttcg tttcctaaca atcccaccaa cagcagggat attgaagaga 300 tggggaacaa ttaaaaaatc aaaagctatt aatgttttga gagggttcag gaaagagatt 360 ggaaggatgc tgaacatctt gaataggaga cgcagatctg caggcatgat cattatgctg 420 attccaacag tgatggcgtt ccatttaacc acgcgtgggg gagagccgca tatgatagtt 480 agcaagcagg aaagaggaaa gtcacttttg ttcaagacct ctgcaggtgt caacatgtgc 540 accctcattg cgatggattt gggagagttg tgtgaggaca cgatgaccta caaatgcccc 600 cggatcactg aggcggaacc agatgacgtt gactgttggt gcaatgccac ggacacatgg 660 gtgacctatg gaacgtgctc tcaaactggc gaacaccgac gagacaaacg ttccgtcgca 720 ttggccccac acgtggggct tggcctagaa acaagagccg aaacgtggat gtcctctgaa 780 ggtgcttgga aacagataca aaaagtagag acttgggctc tgagacatcc aggattcacg 840 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cctttggtga gagctacatc gtggtaggag caggtgaaaa agctttgaaa 2100 ctaagctggt tcaagaaagg aagcagcata gggaaaatgt ttgaagcaac tgcccgagga 2160 gcacgaagga tggccattct gggagacacc gcatgggact tcggttctat aggaggagtg 2220 ttcacgtcta tgggaaaact ggtacaccag gtttttggaa ctgcatatgg agttttgttt 2280 agcggagttt cttggaccat gaaaatagga atagggattc tgctgacatg gctaggatta 2340 aattcaagga acacgtccct ttcgatgatg tgcatcgcag ccgccattgt gacactgtat 2400 ttgggagtca tggtgcaggc cgatagtggt tgcgttgtga gctggaaaaa caaagaactg 2460 aaatgtggca gtgggatttt catcacagac aacgtgcaca catggacaga acaatacaag 2520 ttccaaccag aatccccttc aaaactagct tcagctatcc agaaagccca tgaagaggac 2580 atttgtggaa tccgctcagt aacaagactg gagaatctga tgtggaaaca aataacacca 2640 gaattgaatc acattctatc agaaaatgag gtgaagttaa ctattatgac aggagacatc 2700 aaaggaatca tgcaggcagg aaaacgatct ctgcggcctc agcccactga gctgaagtat 2760 tcatggaaaa catggggcaa agcaaaaatg ctctctacag agtctcataa ccagaccttt 2820 ctcattgatg gccccgaaac agcagaatgc cccaacacaa atagagcttg gaattcgttg 2880 gaagttgaag actatggctt tggagtattc accaccaata tatggctaaa attgaaagaa 2940 aaacaggatg tattctgcga ctcaaaactc atgtcagcgg ccataaaaga caacagagcc 3000 gtccatgccg atatgggtta ttggatagaa agtgcactca atgacacatg gaagatagag 3060 aaagcctctt tcattgaagt taaaaactgc cactggccaa aatcacacac cctctggagc 3120 aatggagtgc tagaaagtga gatgataatt ccaaagaatc tcgctggacc agtgtctcaa 3180 cacaactata gaccaggcta ccatacacaa ataacaggac catggcatct aggtaagctt 3240 gagatggact ttgatttctg tgatggaaca acagtggtag tgactgagga ctgcggaaat 3300 agaggaccct ctttgagaac aaccactgcc tctggaaaac tcataacaga atggtgctgc 3360 cgatcttgca cattaccacc gctaagatac agaggtgagg atgggtgctg gtacgggatg 3420 gaaatcagac cattgaagga gaaagaagag aatttggtca actccttggt cacagctgga 3480 catgggcagg tcgacaactt ttcactagga gtcttgggaa tggcattgtt cctggaggaa 3540 atgcttagga cccgagtagg aacgaaacat gcaatactac tagttgcagt ttcttttgtg 3600 acattgatca cagggaacat gtcctttaga gacctgggaa gagtgatggt tatggtaggc 3660 gccactatga cggatgacat aggtatgggc gtgacttatc ttgccctact agcagccttc 3720 aaagtcagac caacttttgc agctggacta ctcttgagaa agctgacctc caaggaattg 3780 atgatgacta ctataggaat tgtactcctc tcccagagca ccctaccaga gaccattctt 3840 gagttgactg atgcgttagc cttaggcatg atggtcctca aaatggtgag aaatatggaa 3900 aagtatcaat tggcagtgac tatcatggct atcttgtgcg tcccaaacgc agtgatatta 3960 caaaacgcat ggaaagtgag ttgcacaata ttggcagtgg tgtccgtttc cccactgttc 4020 ttaacatcct cacagcaaaa aacagattgg ataccattag cattgacgat caaaggtctc 4080 aatccaacag ctatttttct aacaaccctc tcaagaacca gcaagaaaag gagctggcca 4140 ttaaatgagg ctatcatggc agtcgggatg gtgagcattt tagccagttc tctcctaaaa 4200 aatgatattc ccatgacagg accattagtg gctggagggc tcctcactgt gtgctacgtg 4260 ctcactggac gatcggccga tttggaactg gagagagcag ccgatgtcaa atgggaagac 4320 caggcagaga tatcaggaag cagtccaatc ctgtcaataa caatatcaga agatggtagc 4380 atgtcgataa aaaatgaaga ggaagatcaa acactgacca tactcattag aacaggattg 4440 ctggtgatct caggactttt tcctgtatca ataccaatca cggcagcagc atggtacctg 4500 tgggaagtga agaaacaacg ggccggagta ttgtgggatg ttccttcacc cccacccatg 4560 ggaaaggctg aactggaaga tggagcctat agaattaagc aaaaagggat tcttggatat 4620 tcccagatcg gagccggagt ttacaaagaa ggaacattcc atacaatgtg gcatgtcaca 4680 cgtggcgctg ttctaatgca taaaggaaag aggattgaac catcatgggc ggacgtcaag 4740 aaagacctaa tatcatatgg aggaggctgg aagttagaag gagaatggaa ggaaggagaa 4800 gaagtccagg tattggcact ggagcctgga aaaaatccaa gagccgtcca aacgaaacct 4860 ggtcttttca aaaccaacgc cggaacaata ggtgctgtat ctctggactt ttctcctgga 4920 acgtcaggat ctccaattat cgacaaaaaa ggaaaagttg tgggtcttta tggtaatggt 4980 gttgttacaa ggagtggagc atatgtgagt gctatagccc agactgaaaa aagcattgaa 5040 gacaacccag agatcgaaga tgacattttc cgaaagagaa gactgaccat catggacctc 5100 cacccaggag cgggaaagac gaagagatac cttccggcca tagtcagaga agctataaaa 5160 cggggtttga gaacattaat cttggccccc actagagttg tggcagctga aatggaggaa 5220 gcccttagag gacttccaat aagataccag accccagcca tcagagctgt gcacaccggg 5280 cgggagattg tggacctaat gtgtcatgcc acatttacca tgaggctgct atcaccagtt 5340 agagtgccaa actacaacct gattatcatg gacgaagccc atttcacaga cccagcaagt 5400 atagcagcta 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tggaagttga aatctggaca aaagaagggg aaaggaagaa attgaaaccc 6300 agatggttgg atgctaggat ctattctgac ccactggcgc taaaagaatt taaggaattt 6360 gcagccggaa gaaagtctct gaccctgaac ctaatcacag aaatgggtag gctcccaacc 6420 ttcatgactc agaaggcaag agacgcactg gacaacttag cagtgctgca cacggctgag 6480 gcaggtggaa gggcgtacaa ccatgctctc agtgaactgc cggagaccct ggagacattg 6540 cttttactga cacttctggc tacagtcacg ggagggatct ttttattctt gatgagcgca 6600 aggggcatag ggaagatgac cctgggaatg tgctgcataa tcacggctag catcctccta 6660 tggtacgcac aaatacagcc acactggata gcagcttcaa taatactgga gttttttctc 6720 atagttttgc ttattccaga acctgaaaaa cagagaacac cccaagacaa ccaactgacc 6780 tacgttgtca tagccatcct cacagtggtg gccgcaacca tggcaaacga gatgggtttc 6840 ctagaaaaaa cgaagaaaga tctcggattg ggaagcattg caacccagca acccgagagc 6900 aacatcctgg acatagatct acgtcctgca tcagcatgga cgctgtatgc cgtggccaca 6960 acatttgtta caccaatgtt gagacatagc attgaaaatt cctcagtgaa tgtgtcccta 7020 acagctatag ccaaccaagc cacagtgtta atgggtctcg ggaaaggatg gccattgtca 7080 aagatggaca tcggagttcc ccttctcgcc attggatgct actcacaagt caaccccata 7140 actctcatag cagctctttt cttattggta gcacattatg ccatcatagg gccaggactc 7200 caagcaaaag caaccagaga agctcagaaa agagcagcgg cgggcatcat gaaaaaccca 7260 actgtcgatg gaataacagt gattgaccta gatccaatac cttatgatcc gaagtttgaa 7320 aagcagttgg gacaagtaat gctcctagtc ctctgcgtga ctcaagtatt gatgatgagg 7380 actacatggg ctctgtgtga ggctttaacc ttagctaccg ggcccatctc cacattgtgg 7440 gaaggaaatc cagggaggtt ttggaacact accattgcgg tgtcaatggc taacattttt 7500 agagggagtt acttggccgg agctggactt ctcttttcta ttatgaagaa cacaaccaac 7560 acaagaaggg gaactggcaa cataggagag acgcttggag agaaatggaa aagccgattg 7620 aacgcattgg gaaaaagtga attccagatc tacaagaaaa gtggaatcca ggaagtggat 7680 agaaccttag caaaagaagg cattaaaaga ggagaaacgg accatcacgc tgtgtcgcga 7740 ggctcagcaa aactgagatg gttcgttgag agaaacatgg tcacaccaga agggaaagta 7800 gtggacctcg gttgtggcag aggaggctgg tcatactatt gtggaggact aaagaatgta 7860 agagaagtca aaggcctaac aaaaggagga ccaggacacg aagaacccat ccccatgtca 7920 acatatgggt 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tacgcccaaa tgtggagctt gatgtacttc cacagacgcg acctcaggct ggcggcaaat 9900 gctatttgct cggcagtacc atcacattgg gttccaacaa gtcgaacaac ctggtccata 9960 catgctaaac atgaatggat gacaacggaa gacatgctga cagtctggaa cagggtgtgg 10020 attcaagaaa acccatggat ggaagacaaa actccagtgg aatcatggga ggaaatccca 10080 tacttgggga aaagagaaga ccaatggtgc ggctcattga ttgggttaac aagcagggcc 10140 acctgggcaa agaacatcca agcagcaata aatcaagtta gatcccttat aggcaatgaa 10200 gaatacacag attacatgcc atccatgaaa agattcagaa gagaagagga agaagcagga 10260 gttctgtggt agaaagcaaa actaacatga aacaaggcta gaagtcaggt cggattaagc 10320 catagtacgg aaaaaactat gctacctgtg agccccgtcc aaggacgtta aaagaagtca 10380 ggccatcata aatgccatag cttgagtaaa ctatgcagcc tgtagctcca cctgagaagg 10440 tgtaaaaaat ccgggaggcc acaaaccatg gaagctgtac gcatggcgta gtggactagc 10500 ggttagagga gacccctccc ttacaaatcg cagcaacaat gggggcccaa ggcgagatga 10560 agctgtagtc tcgctggaag gactagaggt tagaggagac ccccccgaaa caaaaaacag 10620 catattgacg ctgggaaaga ccagagatcc tgctgtctcc tcagcatcat tccaggcaca 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serotype 2, MVS <400> 11 agttgttagt ctacgtggac cgacaaagac agattctttg agggagctaa gctcaatgta 60 gttctaacag ttttttaatt agagagcaga tctctgatga ataaccaacg gaaaaaggcg 120 aaaaacacgc ctttcaatat gctgaaacgc gagagaaacc gcgtgtcgac tgtgcaacag 180 ctgacaaaga gattctcact tggaatgctg cagggacgag gaccattaaa actgttcatg 240 gccctggtgg cgttccttcg tttcctaaca atcccaccaa cagcagggat attgaagaga 300 tggggaacaa ttaaaaaatc aaaagctatt aatgttttga gagggttcag gaaagagatt 360 ggaaggatgc tgaacatctt gaataggaga cgcagatctg caggcatgat cattatgctg 420 attccaacag tgatggcgtt ccatttaacc acacgtaacg gagaaccaca catgatcgtc 480 agcagacaag agaaagggaa aagtcttctg tttaaaacag aggttggcgt gaacatgtgt 540 accctcatgg ccatggacct tggtgaattg tgtgaagaca caatcacgta cgagtgtccc 600 cttctcaggc agaatgagcc agaagacata gactgttggt gcaactctac gtccacgtgg 660 gtaacttatg ggacgtgtac caccatggga gaacatagaa gagaaaaaag atcagtggca 720 ctcgttccac atgtgggaat gggactggag acacgaactg aaacatggat gtcatcagaa 780 ggggcctgga aacatgtcca gagaattgaa acttggatct tgagacatcc aggcttcacc 840 atgatggcag caatcctggc atacaccata ggaacgacac atttccaaag agccctgatc 900 ttcatcttac tgacagctgt cactccttca atgacaatgc gttgcatagg aatgtcaaat 960 agagactttg tggaaggggt ttcaggagga agctgggttg acatagtctt agaacatgga 1020 agctgtgtga cgacgatggc aaaaaacaaa ccaacattgg attttgaact gataaaaaca 1080 gaagccaaac agcctgccac cctaaggaag tactgtatag aggcaaagct aaccaacaca 1140 acaacagaat ctcgctgccc aacacaaggg gaacccagcc taaatgaaga gcaggacaaa 1200 aggttcgtct gcaaacactc catggtagac agaggatggg gaaatggatg tggactattt 1260 ggaaagggag gcattgtgac ctgtgctatg ttcagatgca aaaagaacat ggaaggaaaa 1320 gttgtgcaac cagaaaactt ggaatacacc attgtgataa cacctcactc aggggaagag 1380 catgcagtcg gaaatgacac aggaaaacat ggcaaggaaa tcaaaataac accacagagt 1440 tccatcacag aagcagaatt gacaggttat ggcactgtca caatggagtg ctctccaaga 1500 acgggcctcg acttcaatga gatggtgttg ctgcagatgg aaaataaagc ttggctggtg 1560 cacaggcaat ggttcctaga cctgccgtta ccatggttgc ccggagcgga cacacaaggg 1620 tcaaattgga tacagaaaga gacattggtc actttcaaaa atccccatgc gaagaaacag 1680 gatgttgttg ttttaggatc ccaagaaggg gccatgcaca cagcacttac aggggccaca 1740 gaaatccaaa tgtcatcagg aaacttactc ttcacaggac atctcaagtg caggctgaga 1800 atggacaagc tacagctcaa aggaatgtca tactctatgt gcacaggaaa gtttaaagtt 1860 gtgaaggaaa tagcagaaac acaacatgga acaatagtta tcagagtgca atatgaaggg 1920 gacggctctc catgcaagat cccttttgag ataatggatt tggaaaaaag acatgtctta 1980 ggtcgcctga ttacagtcaa cccaattgtg acagaaaaag atagcccagt caacatagaa 2040 gcagaacctc catttggaga cagctacatc atcataggag tagagccggg acaactgaag 2100 ctcaactggt ttaagaaagg aagttctatc ggccaaatgt ttgagacaac aatgaggggg 2160 gcgaagagaa tggccatttt aggtgacaca gcctgggatt ttggatcctt gggaggagtg 2220 tttacatcta taggaaaggc tctccaccaa gtctttggag caatctatgg agctgccttc 2280 agtggggttt catggactat gaaaatcctc ataggagtca ttatcacatg gataggaatg 2340 aattcacgca gcacctcact gtctgtgaca ctagtattgg tgggaattgt gacactgtat 2400 ttgggagtca tggtgcaggc cgatagtggt tgcgttgtga gctggaaaaa caaagaactg 2460 aaatgtggca gtgggatttt catcacagac aacgtgcaca catggacaga acaatacaag 2520 ttccaaccag aatccccttc aaaactagct tcagctatcc agaaagccca tgaagaggac 2580 atttgtggaa tccgctcagt aacaagactg gagaatctga tgtggaaaca aataacacca 2640 gaattgaatc acattctatc agaaaatgag gtgaagttaa ctattatgac aggagacatc 2700 aaaggaatca tgcaggcagg aaaacgatct ctgcggcctc agcccactga gctgaagtat 2760 tcatggaaaa catggggcaa agcaaaaatg ctctctacag agtctcataa ccagaccttt 2820 ctcattgatg gccccgaaac agcagaatgc cccaacacaa atagagcttg gaattcgttg 2880 gaagttgaag actatggctt tggagtattc accaccaata tatggctaaa attgaaagaa 2940 aaacaggatg tattctgcga ctcaaaactc atgtcagcgg ccataaaaga caacagagcc 3000 gtccatgccg atatgggtta ttggatagaa agtgcactca atgacacatg gaagatagag 3060 aaagcctctt tcattgaagt taaaaactgc cactggccaa aatcacacac cctctggagc 3120 aatggagtgc tagaaagtga gatgataatt ccaaagaatc tcgctggacc agtgtctcaa 3180 cacaactata gaccaggcta ccatacacaa ataacaggac catggcatct aggtaagctt 3240 gagatggact ttgatttctg tgatggaaca acagtggtag tgactgagga ctgcggaaat 3300 agaggaccct ctttgagaac aaccactgcc tctggaaaac tcataacaga atggtgctgc 3360 cgatcttgca cattaccacc gctaagatac agaggtgagg atgggtgctg gtacgggatg 3420 gaaatcagac cattgaagga gaaagaagag aatttggtca actccttggt cacagctgga 3480 catgggcagg tcgacaactt ttcactagga gtcttgggaa tggcattgtt cctggaggaa 3540 atgcttagga cccgagtagg aacgaaacat gcaatactac tagttgcagt ttcttttgtg 3600 acattgatca cagggaacat gtcctttaga gacctgggaa gagtgatggt tatggtaggc 3660 gccactatga cggatgacat aggtatgggc gtgacttatc ttgccctact agcagccttc 3720 aaagtcagac caacttttgc agctggacta ctcttgagaa agctgacctc caaggaattg 3780 atgatgacta ctataggaat tgtactcctc tcccagagca ccataccaga gaccattctt 3840 gagttgactg atgcgttagc cttaggcatg atggtcctca aaatggtgag aaatatggaa 3900 aagtatcaat tggcagtgac tatcatggct atcttgtgcg tcccaaacgc agtgatatta 3960 caaaacgcat ggaaagtgag ttgcacaata ttggcagtgg tgtccgtttc cccactgttc 4020 ttaacatcct cacagcaaaa aacagattgg ataccattag cattgacgat caaaggtctc 4080 aatccaacag ctatttttct aacaaccctc tcaagaacca gcaagaaaag gagctggcca 4140 ttaaatgagg ctatcatggc agtcgggatg gtgagcattt tagccagttc tctcctaaaa 4200 aatgatattc ccatgacagg accattagtg gctggagggc tcctcactgt gtgctacgtg 4260 ctcactggac gatcggccga tttggaactg gagagagcag ccgatgtcaa atgggaagac 4320 caggcagaga tatcaggaag cagtccaatc ctgtcaataa caatatcaga agatggtagc 4380 atgtcgataa aaaatgaaga ggaagaacaa acactgacca tactcattag aacaggattg 4440 ctggtgatct caggactttt tcctgtatca ataccaatca cggcagcagc atggtacctg 4500 tgggaagtga agaaacaacg ggccggagta ttgtgggatg ttccttcacc cccacccatg 4560 ggaaaggctg aactggaaga tggagcctat agaattaagc aaaaagggat tcttggatat 4620 tcccagatcg gagccggagt ttacaaagaa ggaacattcc atacaatgtg gcatgtcaca 4680 cgtggcgctg ttctaatgca taaaggaaag aggattgaac catcatgggc ggacgtcaag 4740 aaagacctaa tatcatatgg aggaggctgg aagttagaag gagaatggaa ggaaggagaa 4800 gaagtccagg tattggcact ggagcctgga aaaaatccaa gagccgtcca aacgaaacct 4860 ggtcttttca aaaccaacgc cggaacaata ggtgctgtat ctctggactt ttctcctgga 4920 acgtcaggat ctccaattat cgacaaaaaa ggaaaagttg tgggtcttta tggtaatggt 4980 gttgttacaa ggagtggagc atatgtgagt gctatagccc agactgaaaa aagcattgaa 5040 gacaacccag agatcgaaga tgacattttc cgaaagagaa gactgaccat catggacctc 5100 cacccaggag cgggaaagac gaagagatac cttccggcca tagtcagaga agctataaaa 5160 cggggtttga gaacattaat cttggccccc actagagttg tggcagctga aatggaggaa 5220 gcccttagag gacttccaat aagataccag accccagcca tcagagctgt gcacaccggg 5280 cgggagattg tggacctaat gtgtcatgcc acatttacca tgaggctgct atcaccagtt 5340 agagtgccaa actacaacct gattatcatg gacgaagccc atttcacaga cccagcaagt 5400 atagcagcta gaggatacat ctcaactcga gtggagatgg gtgaggcagc tgggattttt 5460 atgacagcca ctcccccggg aagcagagac ccatttcctc agagcaatgc accaatcata 5520 gatgaagaaa gagaaatccc tgaacgctcg tggaattccg gacatgaatg ggtcacggat 5580 tttaaaggga agactgtttg gttcgttcca agtataaaag caggaaatga tatagcagct 5640 tgcctgagga aaaatggaaa gaaagtgata caactcagta ggaagacctt tgattctgag 5700 tatgtcaaga ctagaaccaa tgattgggac ttcgtggtta caactgacat ttcagaaatg 5760 ggtgccaatt tcaaggctga gagggttata gaccccagac gctgcatgaa accagtcata 5820 ctaacagatg gtgaagagcg ggtgattctg gcaggaccta tgccagtgac ccactctagt 5880 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atagttttgc ttattccaga acctgaaaaa cagagaacac cccaagacaa ccaactgacc 6780 tacgttgtca tagccatcct cacagtggtg gccgcaacca tggcaaacga gatgggtttc 6840 ctagaaaaaa cgaagaaaga tctcggattg ggaagcattg caacccagca acccgagagc 6900 aacatcctgg acatagatct acgtcctgca tcagcatgga cgctgtatgc cgtggccaca 6960 acatttgtta caccaatgtt gagacatagc attgaaaatt cctcagtgaa tgtgtcccta 7020 acagctatag ccaaccaagc cacagtgtta atgggtctcg ggaaaggatg gccattgtca 7080 aagatggaca tcggagttcc ccttctcgcc attggatgct actcacaagt caaccccata 7140 actctcacag cagctctttt cttattggta gcacattatg ccatcatagg gccaggactc 7200 caagcaaaag caaccagaga agctcagaaa agagcagcgg cgggcatcat gaaaaaccca 7260 actgtcgatg gaataacagt gattgaccta gatccaatac cttatgatcc aaagtttgaa 7320 aagcagttgg gacaagtaat gctcctagtc ctctgcgtga ctcaagtatt gatgatgagg 7380 actacatggg ctctgtgtga ggctttaacc ttagctaccg ggcccatctc cacattgtgg 7440 gaaggaaatc cagggaggtt ttggaacact accattgcgg tgtcaatggc taacattttt 7500 agagggagtt acttggccgg agctggactt ctcttttcta ttatgaagaa cacaaccaac 7560 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aacaggattg 4440 ctggtgatct caggactttt tcctgtatca ataccaatca cggcagcagc atggtacctg 4500 tgggaagtga agaaacaacg ggccggagta ttgtgggatg ttccttcacc cccacccatg 4560 ggaaaggctg aactggaaga tggagcctat agaattaagc aaaaagggat tcttggatat 4620 tcccagatcg gagccggagt ttacaaagaa ggaacattcc atacaatgtg gcatgtcaca 4680 cgtggcgctg ttctaatgca taaaggaaag aggattgaac catcatgggc ggacgtcaag 4740 aaagacctaa tatcatatgg aggaggctgg aagttagaag gagaatggaa ggaaggagaa 4800 gaagtccagg tattggcact ggagcctgga aaaaatccaa gagccgtcca aacgaaacct 4860 ggtcttttca aaaccaacgc cggaacaata ggtgctgtat ctctggactt ttctcctgga 4920 acgtcaggat ctccaattat cgacaaaaaa ggaaaagttg tgggtcttta tggtaatggt 4980 gttgttacaa ggagtggagc atatgtgagt gctatagccc agactgaaaa aagcattgaa 5040 gacaacccag agatcgaaga tgacattttc cgaaagagaa gactgaccat catggacctc 5100 cacccaggag cgggaaagac gaagagatac cttccggcca tagtcagaga agctataaaa 5160 cggggtttga gaacattaat cttggccccc actagagttg tggcagctga aatggaggaa 5220 gcccttagag gacttccaat aagataccag accccagcca tcagagctgt 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cgtggccaca 6960 acatttgtta caccaatgtt gagacatagc attgaaaatt cctcagtgaa tgtgtcccta 7020 acagctatag ccaaccaagc cacagtgtta atgggtctcg ggaaaggatg gccattgtca 7080 aagatggaca tcggagttcc ccttctcgcc attggatgct actcacaagt caaccccata 7140 actctcacag cagctttttt cttattggta gcacattatg ccatcatagg gccaggactc 7200 caagcaaaag caaccagaga agctcagaaa agagcagcgg cgggcatcat gaaaaaccca 7260 actgtcgatg gaataacagt gattgaccta gatccaatac cttatgatcc aaagtttgaa 7320 aagcagttgg gacaagtaat gctcctagtc ctctgcgtga ctcaagtatt gatgatgagg 7380 actacatggg ctctgtgtga ggctttaacc ttagctaccg ggcccatctc cacattgtgg 7440 gaaggaaatc cagggaggtt ttggaacact accattgcgg tgtcaatggc taacattttt 7500 agagggagtt acttggccgg agctggactt ctcttttcta ttatgaagaa cacaaccaac 7560 acaagaaggg gaactggcaa cataggagag acgcttggag agaaatggaa aagccgattg 7620 aacgcattgg gaaaaagtga attccagatc tacaagaaaa gtggaatcca ggaagtggat 7680 agaaccttag caaaagaagg cattaaaaga ggagaaacgg accatcacgc tgtgtcgcga 7740 ggctcagcaa aactgagatg gttcgttgag agaaacatgg tcacaccaga 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gtcatggtgc aggccgatag tggttgcgtt gtgagctgga aaaacaaaga actgaaatgt 2460 ggcagtggga ttttcatcac agacaacgtg cacacatgga cagaacaata caagttccaa 2520 ccagaatccc cttcaaaact agcttcagct atccagaaag cccatgaaga ggacatttgt 2580 ggaatccgct cagtaacaag actggagaat ctgatgtgga aacaaataac accagaattg 2640 aatcacattc tatcagaaaa tgaggtgaag ttaactatta tgacaggaga catcaaagga 2700 atcatgcagg caggaaaacg atctctgcgg cctcagccca ctgagctgaa gtattcatgg 2760 aaaacatggg gcaaagcaaa aatgctctct acagagtctc ataaccagac ctttctcatt 2820 gatggccccg aaacagcaga atgccccaac acaaatagag cttggaattc gttggaagtt 2880 gaagactatg gctttggagt attcaccacc aatatatggc taaaattgaa agaaaaacag 2940 gatgtattct gcgactcaaa actcatgtca gcggccataa aagacaacag agccgtccat 3000 gccgatatgg gttattggat agaaagtgca ctcaatgaca catggaagat agagaaagcc 3060 tctttcattg aagttaaaaa ctgccactgg ccaaaatcac acaccctctg gagcaatgga 3120 gtgctagaaa gtgagatgat aattccaaag aatctcgctg gaccagtgtc tcaacacaac 3180 tatagaccag gctaccatac acaaataaca ggaccatggc atctaggtaa gcttgagatg 3240 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taatcttggc ccccactaga gttgtggcag ctgaaatgga ggaagccctt 5220 agaggacttc caataagata ccagacccca gccatcagag ctgtgcacac cgggcgggag 5280 attgtggacc taatgtgtca tgccacattt accatgaggc tgctatcacc agttagagtg 5340 ccaaactaca acctgattat catggacgaa gcccatttca cagacccagc aagtatagca 5400 gctagaggat acatctcaac tcgagtggag atgggtgagg cagctgggat ttttatgaca 5460 gccactcccc cgggaagcag agacccattt cctcagagca atgcaccaat catagatgaa 5520 gaaagagaaa tccctgaacg ctcgtggaat tccggacatg aatgggtcac ggattttaaa 5580 gggaagactg tttggttcgt tccaagtata aaagcaggaa atgatatagc agcttgcctg 5640 aggaaaaatg gaaagaaagt gatacaactc agtaggaaga cctttgattc tgagtatgtc 5700 aagactagaa ccaatgattg ggacttcgtg gttacaactg acatttcaga aatgggtgcc 5760 aatttcaagg ctgagagggt tatagacccc agacgctgca tgaaaccagt catactaaca 5820 gatggtgaag agcgggtgat tctggcagga cctatgccag tgacccactc tagtgcagca 5880 caaagaagag ggagaatagg aagaaatcca aaaaatgaga atgaccagta catatacatg 5940 ggggaacctc tggaaaatga tgaagactgt gcacactgga aagaagctaa aatgctccta 6000 gataacatca 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aagatctcgg attgggaagc attgcaaccc agcaacccga gagcaacatc 6900 ctggacatag atctacgtcc tgcatcagca tggacgctgt atgccgtggc cacaacattt 6960 gttacaccaa tgttgagaca tagcattgaa aattcctcag tgaatgtgtc cctaacagct 7020 atagccaacc aagccacagt gttaatgggt ctcgggaaag gatggccatt gtcaaagatg 7080 gacatcggag ttccccttct cgccattgga tgctactcac aagtcaaccc cataactctc 7140 acagcagctc ttttcttatt ggtagcacat tatgccatca tagggccagg actccaagca 7200 aaagcaacca gagaagctca gaaaagagca gcggcgggca tcatgaaaaa cccaactgtc 7260 gatggaataa cagtgattga cctagatcca ataccttatg atccaaagtt tgaaaagcag 7320 ttgggacaag taatgctcct agtcctctgc gtgactcaag tattgatgat gaggactaca 7380 tgggctctgt gtgaggcttt aaccttagct accgggccca tctccacatt gtgggaagga 7440 aatccaggga ggttttggaa cactaccatt gcggtgtcaa tggctaacat ttttagaggg 7500 agttacttgg ccggagctgg acttctcttt tctattatga agaacacaac caacacaaga 7560 aggggaactg gcaacatagg agagacgctt ggagagaaat ggaaaagccg attgaacgcg 7620 ttgggaaaaa gtgaattcca gatctacaag aaaagtggaa tccaggaagt ggatagaacc 7680 ttagcaaaag 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aatggagtgc tagaaagtga gatgataatt ccaaagaatc tcgctggacc agtgtctcaa 3180 cacaactata gaccaggcta ccatacacaa ataacaggac catggcatct aggtaagctt 3240 gagatggact ttgatttctg tgatggaaca acagtggtag tgactgagga ctgcggaaat 3300 agaggaccct ctttgagaac aaccactgcc tctggaaaac tcataacaga atggtgctgc 3360 cgatcttgca cattaccacc gctaagatac agaggtgagg atgggtgctg gtacgggatg 3420 gaaatcagac cattgaagga gaaagaagag aatttggtca actccttggt cacagctgga 3480 catgggcagg tcgacaactt ttcactagga gtcttgggaa tggcattgtt cctggaggaa 3540 atgcttagga cccgagtagg aacgaaacat gcaatactac tagttgcagt ttcttttgtg 3600 acattgatca cagggaacat gtcctttaga gacctgggaa gagtgatggt tatggtaggc 3660 gccactatga cgggtgacat aggtatgggc gtgacttatc ttgccctact agcagccttc 3720 aaagtcagac caacttttgc agctggacta ctcttgagaa agctgacctc caaggaattg 3780 atgatgacta ctataggaat tgtactcctc tcccagagca ccataccaga gaccattctt 3840 gagttgactg atgcgttagc cttaggcatg atggtcctca aaatggtgag aaatatggaa 3900 aagtatcaat tggcagtgac tatcatggct atcttgtgcg tcccaaacgc agtgatatta 3960 caaaacgcat ggaaagtgag ttgcacaata ttggcagtgg tgtccgtttc cccactgttc 4020 ttaacatcct cacagcaaaa aacagattgg ataccattag cattgacgat caaaggtctc 4080 aatccaacag ctatttttct aacaaccctc tcaagaacca gcaagaaaag gagctggcca 4140 ttaaatgagg ctatcatggc agtcgggatg gtgagcattt tagccagttc tctcctaaaa 4200 aatgatattc ccatgacagg accattagtg gctggagggc tcctcactgt gtgctacgtg 4260 ctcactggac gatcggccga tttggaactg gagagagcag ccgatgtcaa atgggaagac 4320 caggcagaga tatcaggaag cagtccaatc ctgtcaataa caatatcaga agatggtagc 4380 atgtcgataa aaaatgaaga ggaagaacaa acactgacca tactcattag aacaggattg 4440 ctggtgatct caggactttt tcctgtatca ataccaatca cggcagcagc atggtacctg 4500 tgggaagtga agaaacaacg ggccggagta ttgtgggatg ttccttcacc cccacccatg 4560 ggaaaggctg aactggaaga tggagcctat agaattaagc aaaaagggat tcttggatat 4620 tcccagatcg gagccggagt ttacaaagaa ggaacattcc atacaatgtg gcatgtcaca 4680 cgtggcgctg ttctaatgca taaaggaaag aggattgaac catcatgggc ggacgtcaag 4740 aaagacctaa tatcatatgg aggaggctgg aagttagaag gagaatggaa ggaaggagaa 4800 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tacgcccaaa tgtggagctt gatgtacttc cacagacgcg acctcaggct ggcggcaaat 9900 gctatttgct cggcagtacc atcacattgg gttccaacaa gtcgaacaac ctggtccata 9960 catgctaaac atgaatggat gacaacggaa gacatgctga cagtctggaa cagggtgtgg 10020 attcaagaaa acccatggat ggaagacaaa actccagtgg aatcatggga ggaaatccca 10080 tacttgggga aaagagaaga ccaatggtgc ggctcattga ttgggttaac aagcagggcc 10140 acctgggcaa agaacatcca agcagcaata aatcaagtta gatcccttat aggcaatgaa 10200 gaatacacag attacatgcc atccatgaaa agattcagaa gagaagagga agaagcagga 10260 gttctgtggt agaaagcaaa actaacatga aacaaggcta gaagtcaggt cggattaagc 10320 catagtacgg aaaaaactat gctacctgtg agccccgtcc aaggacgtta aaagaagtca 10380 ggccatcata aatgccatag cttgagtaaa ctatgcagcc tgtagctcca cctgagaagg 10440 tgtaaaaaat ccgggaggcc acaaaccatg gaagctgtac gcatggcgta gtggactagc 10500 ggttagagga gacccctccc ttacaaatcg cagcaacaat gggggcccaa ggcgagatga 10560 agctgtagtc tcgctggaag gactagaggt tagaggagac ccccccgaaa caaaaaacag 10620 catattgacg ctgggaaaga ccagagatcc tgctgtctcc tcagcatcat tccaggcaca 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1620 gttcactgga attacaaaga gagaatggtg acatttaagg ttcctcatgc caagagacag 1680 gatgtgacag tgctgggatc tcaggaagga gccatgcatt ctgccctcgc tggagccaca 1740 gaagtggact ccggtgatgg aaatcacatg tttgcaggac atctcaagtg caaagtccgt 1800 atggagaaat tgagaatcaa gggaatgtca tacacgatgt gttcaggaaa gttctcaatt 1860 gacaaagaga tggcagaaac acagcatggg acaacagtgg tgaaagtcaa gtatgaaggt 1920 gctggagctc cgtgtaaagt ccccatagag ataagagatg tgaacaagga aaaagtggtt 1980 gggcgtatca tctcatccac ccctttggct gagaatacca acagtgtaac caacatagag 2040 ttagaacccc cctttgggga cagctacata gtgataggtg ttggaaacag tgcattaaca 2100 ctccattggt tcaggaaagg gagttccatt ggcaagatgt ttgagtccac atacagaggt 2160 gcaaaacgaa tggccattct aggtgaaaca gcttgggatt ttggttccgt tggtggactg 2220 ttcacatcat tgggaaaggc tgtgcaccag gtttttggaa gtgtgtatac aaccctgttt 2280 ggaggagtct catggatgat tagaatccta attgggttcc tagtgttgtg gattggcacg 2340 aactcaagga acacttcaat ggctatgacg tgcatagctg ccggcattgt gacactgtat 2400 ttgggagtca tggtgcaggc cgatagtggt tgcgttgtga gctggaaaaa caaagaactg 2460 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agaggaccct ctttgagaac aaccactgcc tctggaaaac tcataacaga atggtgctgc 3360 cgatcttgca cattaccacc gctaagatac agaggtgagg atgggtgctg gtacgggatg 3420 gaaatcagac cattgaagga gaaagaagag aatttggtca actccttggt cacagctgga 3480 catgggcagg tcgacaactt ttcactagga gtcttgggaa tggcattgtt cctggaggaa 3540 atgcttagga cccgagtagg aacgaaacat gcaatactac tagttgcagt ttcttttgtg 3600 acattgatca cagggaacat gtcctttaga gacctgggaa gagtgatggt tatggtaggc 3660 gccactatga cgggtgacat aggtatgggc gtgacttatc ttgccctact agcagccttc 3720 aaagtcagac caacttttgc agctggacta ctcttgagaa agctgacctc canggaattg 3780 atgatgacta ctataggaat tgtactcctc tcccagagca ccataccaga gaccattctt 3840 gagttgactg atgcgttagc cttaggcatg atggtcctca aaatggtgag aaatatggaa 3900 aagtatcaat tggcagtgac tatcatggct atcttgtgcg tcccaaacgc agtgatatta 3960 caaaacgcat ggaaagtgag ttgcacaata ttggcagtgg tgtccgtttc cccactgttc 4020 ttaacatcct cacagcaaaa aacagattgg ataccattag cattgacgat caaaggtctc 4080 aatccaacag ctatttttct aacaaccctc tcaagaacca gcaagaaaag gagctggcca 4140 ttaaatgagg ctatcatggc agtcgggatg gtgagcattt tagccagttc tctcctaaaa 4200 aatgatattc ccatgacagg accattagtg gctggagggc tcctcactgt gtgctacgtg 4260 ctcactggac gatcggccga tttggaactg gagagagcag ccgatgtcaa atgggaagac 4320 caggcagaga tatcaggaag cagtccaatc ctgtcaataa caatatcaga agatggtagc 4380 atgtcgataa aaaatgaaga ggaagaacaa acactgacca tactcattag aacaggattg 4440 ctggtgatct caggactttt tcctgtatca ataccaatca cggcagcagc atggtacctg 4500 tgggaagtga agaaacaacg ggccggagta ttgtgggatg ttccttcacc cccacccatg 4560 ggaaaggctg aactggaaga tggagcctat agaattaagc aaaaagggat tcttggatat 4620 tcccagatcg gagccggagt ttacaaagaa ggaacattcc atacaatgtg gcatgtcaca 4680 cgtggcgctg ttctaatgca taaaggaaag aggattgaac catcatgggc ggacgtcaag 4740 aaagacctaa tatcatatgg aggaggctgg aagttagaag gagaatggaa ggaaggagaa 4800 gaagtccagg tattggcact ggagcctgga aaaaatccaa gagccgtcca aacgaaacct 4860 ggtcttttca aaaccaacgc cggaacaata ggtgctgtat ctctggactt ttctcctgga 4920 acgtcaggat ctccaattat cgacaaaaaa ggaaaagttg tgggtcttta tggtaatggt 4980 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gttttttctc 6720 atagttttgc ttattccaga acctgaaaaa cagagaacac cccaagacaa ccaactgacc 6780 tacgttgtca tagccatcct cacagtggtg gccgcaacca tggcaaacga gatgggtttc 6840 ctagaaaaaa cgaagaaaga tctcggattg ggaagcattg caacccagca acccgagagc 6900 aacatcctgg acatagatct acgtcctgca tcagcatgga cgctgtatgc cgtggccaca 6960 acatttgtta caccaatgtt gagacatagc attgaaaatt cctcagtgaa tgtgtcccta 7020 acagccatag ccaaccaagc cacagtgtta atgggtctcg ggaaaggatg gccattgtca 7080 aagatggaca tcggagttcc ccttctcgcc attggatgct actcacaagt caaccccata 7140 actctcacag cagctctttt cttattggta gcacattatg ccatcatagg gccaggactc 7200 caagcaaaag caaccagaga agctcagaaa agagcagcgg cgggcatcat gaaaaaccca 7260 actgtcgatg gaataacagt gattgaccta gatccaatac cttatgatcc aaagtttgaa 7320 aagcagttgg gacaagtaat gctcctagtc ctctgcgtga ctcaagtatt gatgatgagg 7380 actacatggg ctctgtgtga ggctttaacc ttagctaccg ggcccatctc cacattgtgg 7440 gaaggaaatc cagggaggtt ttggaacact accattgcgg tgtcaatggc taacattttt 7500 agagggagtt acttggccgg agctggactt ctcttttnta ttatgaagaa cacaaccaac 7560 acaagaaggg gaactggcaa cataggagag acgcttggag agaaatggaa aagccgattg 7620 aacgcattgg gaaaaagtga attccagatc tacaagaaaa gtggaatcca ggaagtggat 7680 agaaccttag caaaagaagg cattaaaaga ggagaaacgg accatcacgc tgtgtcgcga 7740 ggctcagcaa aactgagatg gttcgttgag agaaacatgg tcacaccaga agggaaagta 7800 gtggacctcg gttgtggcag aggaggctgg tcatactatt gtggaggact aaagaatgta 7860 agagaagtca aaggcctaac aaaaggagga ccaggacacg aagaacccat ccccatgtca 7920 acatatgggt ggaatctagt gcgtcttcaa agtggagttg acgttttctt catcccgcca 7980 gaaaagtgtg acacattatt gtgtgacata ggggagtcat caccaaatcc cacagtggaa 8040 gcaggacgaa cactcagagt ccttaactta gtagaaaatt ggttgaacaa caacactcaa 8100 ttttgcataa aggttctcaa cccatatatg ccctcagtca tagaaaaaat ggaagcacta 8160 caaaggaaat atggaggagc cttagtgagg aatccactct cacgaaactc cacacatgag 8220 atgtactggg tatccaatgc ttccgggaac atagtgtcat cagtgaacat gatttcaagg 8280 atgttgatca acagatttac aatgagatac aagaaagcca cttacgagcc ggatgttgac 8340 ctcggaagcg gaacccgtaa catcgggatt gaaagtgaga taccaaacct agatataatt 8400 gggaaaagaa tagaaaaaat aaagcaagag catgaaacat catggcacta tgaccaagac 8460 cacccataca aaacgtgggc ataccatggt agctatgaaa caaaacagac tggatcagca 8520 tcatccatgg tcaacggagt ggtcaggctg ctgacaaaac cttgggacgt cgtccccatg 8580 gtgacacaga tggcaatgac agacacgact ccatttggac aacagcgcgt ttttaaagag 8640 aaagtggaca cgagaaccca agaaccgaaa gaaggcacga agaaactaat gaaaataaca 8700 gcagagtggc tttggaaaga attagggaag aaaaagacac ccaggatgtg caccagagaa 8760 gaattcacaa gaaaggtgag aagcaatgca gccttggggg ccatattcac tgatgagaac 8820 aagtggaagt cggcacgtga ggctgttgaa gatagtaggt tttgggagct ggttgacaag 8880 gaaaggaatc tccatcttga aggaaagtgt gaaacatgtg tgtacaacat gatgggaaaa 8940 agagagaaga agctagggga attcggcaag gcaaaaggca gcagagccat atggtacatg 9000 tggcttggag cacgcttctt agagtttgaa gccctaggat tcttaaatga agatcactgg 9060 ttctccagag agaactccct gagtggagtg gaaggagaag ggctgcacaa gctaggttac 9120 attctaagag acgtgagcaa gaaagaggga ggagcaatgt atgccgatga caccgcagga 9180 tgggatacaa gaatcacact agaagaccta aaaaatgaag aaatggtaac 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catcgggatt gaaagtgaga taccaaacct agatataatt 8400 gggaaaagaa tagaaaaaat aaagcaagag catgaaacat catggcacta tgaccaagac 8460 cacccataca aaacgtgggc ataccatggt agctatgaaa caaaacagac tggatcagca 8520 tcatccatgg tcaacggagt ggtcaggctg ctgacaaaac cttgggacgt cgtccccatg 8580 gtgacacaga tggcaatgac agacacgact ccatttggac aacagcgcgt ttttaaagag 8640 aaagtggaca cgagaaccca agaaccgaaa gaaggcacga agaaactaat gaaaataaca 8700 gcagagtggc tttggaaaga attagggaag aaaaagacac ccaggatgtg caccagagaa 8760 gaattcacaa gaaaggtgag aagcaatgca gccttggggg ccatattcac tgatgagaac 8820 aagtggaagt cggcacgtga ggctgttgaa gatagtaggt tttgggagct ggttgacaag 8880 gaaaggaatc tccatcttga aggaaagtgt gaaacatgtg tgtacaacat gatgggaaaa 8940 agagagaaga agctagggga attcggcaag gcaaaaggca gcagagccat atggtacatg 9000 tggcttggag cacgcttctt agagtttgaa gccctaggat tcttaaatga agatcactgg 9060 ttctccagag agaactccct gagtggagtg gaaggagaag ggctgcacaa gctaggttac 9120 attctaagag acgtgagcaa gaaagaggga ggagcaatgt atgccgatga caccgcagga 9180 tgggatacaa gaatcacact agaagaccta aaaaatgaag aaatggtaac aaaccacatg 9240 gaaggagaac acaagaaact agccgaggcc attttcaaac taacgtacca aaacaaggtg 9300 gtgcgtgtgc aaagaccaac accaagaggc acagtaatgg acatcatatc gagaagagac 9360 caaagaggta gtggacaagt tggcacctat ggactcaata ctttcaccaa tatggaagcc 9420 caactaatca gacagatgga gggagaagga gtctttaaaa gcattcagca cctaacaatc 9480 acagaagaaa tcgctgtgca aaactggtta gcaagagtgg ggcgcgaaag gttatcaaga 9540 atggccatca gtggagatga ttgtgttgtg aaacctttag atgacaggtt cgcaagcgct 9600 ttaacagctc taaatgacat gggaaagatt aggaaagaca tacaacaatg ggaaccttca 9660 agaggatgga atgattggac acaagtgccc ttctgttcac accatttcca tgagttaatc 9720 atgaaagacg gtcgcgtact cgttgttccc tgtagaaacc aagatgaact gattggcaga 9780 gcccgaatct cccaaggagc agggtggtct ttgcgggaga cggcctgttt ggggaagtct 9840 tacgcccaaa tgtggagctt gatgtacttc cacagacgcg acctcaggct ggcggcaaat 9900 gctatttgct cggcagtacc atcacattgg gttccaacaa gtcgaacaac ctggtccata 9960 catgctaaac atgaatggat gacaacggaa gacatgctga cagtctggaa cagggtgtgg 10020 attcaagaaa acccatggat ggaagacaaa actccagtgg aatcatggga ggaaatccca 10080 tacttgggga aaagagaaga ccaatggtgc ggctcattga ttgggttaac aagcagggcc 10140 acctgggcaa agaacatcca agcagcaata aatcaagtta gatcccttat aggcaatgaa 10200 gaatacacag attacatgcc atccatgaaa agattcagaa gagaagagga agaagcagga 10260 gttctgtggt agaaagcaaa actaacatga aacaaggcta gaagtcaggt cggattaagc 10320 catagtacgg aaaaaactat gctacctgtg agccccgtcc aaggacgtta aaagaagtca 10380 ggccatcata aatgccatag cttgagtaaa ctatgcagcc tgtagctcca cctgagaagg 10440 tgtaaaaaat ccgggaggcc acaaaccatg gaagctgtac gcatggcgta gtggactagc 10500 ggttagagga gacccctccc ttacaaatcg cagcaacaat gggggcccaa ggcgagatga 10560 agctgtagtc tcgctggaag gactagaggt tagaggagac ccccccgaaa caaaaaacag 10620 catattgacg ctgggaaaga ccagagatcc tgctgtctcc tcagcatcat tccaggcaca 10680 gaacgccaga aaatggaatg gtgctgttga atcaacaggt tct 10723 <210> 32 <211> 3391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus serotype 4, BVS <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1226) <223> Xaa is either lysine or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2481) <223> Xaa is either serine or phenylalanine <400> 32 Met Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Phe Asn Met Leu 1 5 10 15 Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg 20 25 30 Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met 35 40 45 Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly 50 55 60 Ile Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val 65 70 75 80 Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn 85 90 95 Arg Arg Arg Ser Ser Ala Gly Met Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Val 100 105 110 Met Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asp Gly Glu Pro Leu Met Ile Val 115 120 125 Ala Lys His Glu Arg Gly Arg Pro Leu Leu Phe Lys Thr Thr Glu Gly 130 135 140 Ile Asn Lys Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Met Cys Glu 145 150 155 160 Asp Thr Val Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu Val Asn Thr Glu Pro Glu 165 170 175 Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Leu Thr Ser Thr Trp Val Met Tyr Gly 180 185 190 Thr Cys 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<400> 33 Met Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Phe Asn Met Leu 1 5 10 15 Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg 20 25 30 Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met 35 40 45 Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly 50 55 60 Ile Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val 65 70 75 80 Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn 85 90 95 Arg Arg Arg Arg Ser Ala Gly Met Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Val 100 105 110 Met Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Gly Gly Glu Pro His Met Ile Val 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ser Ala Gly 130 135 140 Val Asn Met Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu 145 150 155 160 Asp Thr Met Thr Tyr Lys Cys Pro Arg Ile Thr Glu Ala Glu Pro Asp 165 170 175 Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn Ala Thr Asp Thr Trp Val Thr Tyr Gly 180 185 190 Thr Cys Ser Gln Thr Gly Glu His Arg Arg Asp Lys Arg Ser Val Ala 195 200 205 Leu Ala Pro 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Ser Ile Ile Leu Glu Phe Phe Leu 2195 2200 2205 Ile Val Leu Leu Ile Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Thr Pro Gln Asp 2210 2215 2220 Asn Gln Leu Thr Tyr Val Val Ile Ala Ile Leu Thr Val Val Ala Ala 2225 2230 2235 2240 Thr Met Ala Asn Glu Met Gly Phe Leu Glu Lys Thr Lys Lys Asp Leu 2245 2250 2255 Gly Leu Gly Ser Ile Ala Thr Gln Gln Pro Glu Ser Asn Ile Leu Asp 2260 2265 2270 Ile Asp Leu Arg Pro Ala Ser Ala Trp Thr Leu Tyr Ala Val Ala Thr 2275 2280 2285 Thr Phe Val Thr Pro Met Leu Arg His Ser Ile Glu Asn Ser Ser Val 2290 2295 2300 Asn Val Ser Leu Thr Ala Ile Ala Asn Gln Ala Thr Val Leu Met Gly 2305 2310 2315 2320 Leu Gly Lys Gly Trp Pro Leu Ser Lys Met Asp Ile Gly Val Pro Leu 2325 2330 2335 Leu Ala Ile Gly Cys Tyr Ser Gln Val Asn Pro Ile Thr Leu Ile Ala 2340 2345 2350 Ala Leu Phe Leu Leu Val Ala His Tyr Ala Ile Ile Gly Pro Gly Leu 2355 2360 2365 Gln Ala Lys Ala Thr Arg Glu Ala Gln Lys Arg Ala Ala Ala Gly Ile 2370 2375 2380 Met Lys Asn Pro Thr Val Asp Gly Ile Thr Val Ile Asp Leu Asp Pro 2385 2390 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Claims (49)

  1. 살아있는 약독화된 뎅기-2 바이러스 및 뎅기-2/1, 뎅기-2/3, 및 뎅기-2/4 키메라를 포함하는 모든 4개 뎅기 바이러스 혈청형을 포함하는 4가 백신 제형물을 포함하는 뎅기 바이러스 감염에 대한 2 내지 17세의 어린이 또는 젊은 성인 또는 1 내지 11세의 어린이의 치료 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물로서,
    상기 치료 방법은 상기 조성물을 2 내지 17세의 어린이 또는 젊은 성인 또는 1 내지 11세의 어린이에게 피하 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계는 0일에 제1 용량의 약학적 조성물을 투여하는 단계 및 상기 제1 투여 3개월 또는 90일 이내에 뎅기 바이러스에 대한 제2 용량의 동일한 약학적 조성물을 투여하는 단계로 이루어지며,
    상기 조성물은 2 내지 17세의 어린이 또는 젊은 성인 또는 1 내지 11세의 어린이에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하고, 및
    상기 조성물 내의 상기 살아있는 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형의 농도가 하나 이상의 다른 뎅기 바이러스 혈청형의 log 플라크 형성 단위(PFU)보다 적어도 1/2 log PFU 더 낮거나, 또는
    상기 뎅기-2/3 키메라의 농도가 상기 4가 백신 제형물 내의 상기 뎅기-2 바이러스 혈청형보다 PFU의 관점에서 적어도 1/2 log 더 크고,
    상기 뎅기-2 바이러스는 NS1-53, 5'NC-57 및 NS3-250에 삼중 돌연변이를 가져서 NS3 단백질의 아미노산 위치 250이 발린 잔기를 함유하는 DENV-2 16681 유래의 DEN-2 PDK-53 변이체의 형태이고, 및
    상기 키메라는 바이러스 골격으로서 상기 DEN-2 PDK-53 게놈, 및 DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4로부터의 하나 이상의 대응하는 구조 단백질 유전자로 대체된, 상기 DEN-2 PDK-53 게놈의 캡시드, 프리멤브레인/멤브레인 또는 외피 또는 이의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 구조 단백질 유전자를 갖고,
    상기 뎅기-2 바이러스는 뎅기-2 바이러스 MVS(마스터 바이러스 씨드)를 나타내는 서열번호 12로부터 증폭되는 뎅기-2 바이러스 WVS(워킹 바이러스 씨드)를 나타내는 서열번호 14로부터 증폭되는 뎅기-2 바이러스 BVS(벌크 바이러스 씨드)를 나타내는 서열번호 16에 의해 특정되고,
    뎅기-2/1 키메라는 뎅기-2-1 키메라 MVS를 나타내는 서열번호 4로부터 증폭되는 뎅기-2/1 키메라 WVS를 나타내는 서열번호 6으로부터 증폭되는 뎅기-2/1 키메라 BVS를 나타내는 서열번호 8에 의해 특정되고,
    뎅기-2/3 키메라는 뎅기-2/3 키메라 MVS를 나타내는 서열번호 20으로부터 증폭되는 뎅기-2/3 키메라 WVS를 나타내는 서열번호 22로부터 증폭되는 뎅기-/3 키메라 BVS를 나타내는 서열번호 24에 의해 특정되고, 및
    뎅기-2/4 키메라는 뎅기-2/4 키메라 MVS를 나타내는 서열번호 28로부터 증폭되는 뎅기-2/4 키메라 WVS를 나타내는 서열번호 30으로부터 증폭되는 뎅기-2/4 키메라 BVS를 나타내는 서열번호 32에 의해 특정되며,
    상기 약학적 조성물은 기준선-혈청음성 어린이에서 제1 용량 6개월 후에 적어도 80%의 4가 혈청양성도 비율을 제공하는 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 뎅기-2/1 키메라는 2개의 추가 돌연변이를 가져서, 상기 NS2A 단백질의 아미노산 위치 116이 루이신 잔기를 함유하고 상기 NS2B 단백질의 아미노산 위치 92가 아스파르트산 잔기를 함유하며,
    상기 뎅기-2 바이러스는 2개의 추가 돌연변이를 가져서, 상기 prM 단백질의 아미노산 위치 52가 글루탐산 잔기를 함유하고 상기 NS5 단백질의 아미노산 위치 412가 발린 잔기를 함유하며,
    상기 뎅기-2/3 키메라는 바이러스 골격으로서 상기 DEN-2 PDK-53 게놈을 갖고, 상기 DEN-2 PDK-53 게놈의 prM-E 유전자(nt-457 내지 -2373)가 야생형 DEN-3 16562로부터의 대응하는 prM-E 유전자로 대체되며, 상기 뎅기-2/3 키메라는 야생형 DEN-3 16562로부터의 상기 대응하는 prM-E 유전자에 1개의 추가 돌연변이를 가져서, 상기 E 단백질의 아미노산 위치 223이 세린 잔기를 함유하고, 및
    상기 뎅기-2/4 키메라는 2개의 추가 돌연변이를 가져서, 상기 NS2A 단백질의 아미노산 위치 66이 글리신 잔기를 함유하고 상기 NS4A 단백질의 아미노산 위치 21이 발린 잔기를 함유하며, 상기 뎅기-2/4 키메라는 상기 NS2A 단백질의 아미노산 위치 99에 관해 혼합 유전자형이고 아르기닌 또는 리신 잔기를 함유하는 약학적 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 뎅기-2/1 키메라는 바이러스 골격으로서 상기 DEN-2 PDK-53 게놈을 갖고, 상기 DEN-2 PDK-53 게놈의 prM-E 유전자(nt-457 내지 -2379)는 야생형 DEN-1 16007로부터의 대응하는 prM-E 유전자로 대체되며,
    상기 뎅기-2/3 키메라는 바이러스 골격으로서 상기 DEN-2 PDK-53 게놈을 갖고, 상기 DEN-2 PDK-53 게놈의 prM-E 유전자(nt-457 내지 -2373)는 야생형 DEN-3 16562로부터의 대응하는 prM-E 유전자로 대체되며, 및
    상기 뎅기-2/4 키메라는 바이러스 골격으로서 상기 DEN-2 PDK-53 게놈을 갖고, 상기 DEN-2 PDK-53 게놈의 prM-E 유전자(nt-457 내지 -2379)는 야생형 DEN-4 1036으로부터의 대응하는 prM-E 유전자로 대체되는 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 뎅기-2/1 키메라 대 상기 살아있는 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형 대 상기 뎅기-2/3 키메라 대 상기 뎅기-2/4 키메라의 비는 4:4:5:5 log 플라크 형성 단위(PFU)인 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 뎅기-2/1 키메라 대 상기 살아있는 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형 대 상기 뎅기-2/3 키메라 대 상기 뎅기-2/4 키메라의 비는 5:4:5:5 log PFU인 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    1.0×103 내지 5×105 PFU의 농도를 갖는 상기 뎅기-2/1 키메라;
    1.0×103 내지 5×105 PFU의 농도를 갖는 상기 살아있는 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형;
    5.0×103 내지 5×105 PFU의 농도를 갖는 상기 뎅기-2/3 키메라; 및
    1.0×104 내지 5×106 PFU의 농도를 갖는 상기 뎅기-2/4 키메라; 중 적어도 하나를 포함하는 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    2.5×104 PFU의 상기 뎅기-2/1 키메라,
    6.3×103 PFU의 상기 살아있는 약독화된 뎅기-2 바이러스 혈청형,
    3.2×104 PFU의 상기 뎅기-2/3 키메라, 및
    4.0×105 PFU의 상기 뎅기-2/4 키메라를 포함하는 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 상기 뎅기 바이러스의 분해를 감소시키기 위한 안정화 완충액을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 안정화 완충액은 트레할로스 및 알부민, 그리고 선택적으로 폴록사머 407을 포함하는 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    폴록사머 407은 0.1 내지 3.0%(w/v)의 농도를 갖고, 트레할로스는 5.0 내지 50%(w/v)의 농도를 가지며, 알부민은 0.01 내지 3.0%(w/v)의 농도를 갖는 약학적 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 어린이 또는 젊은 성인은 상기 약학적 조성물의 투여 전에 뎅기 바이러스에 대해 혈청음성이거나 나이브(naive)한 약학적 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 어린이 또는 젊은 성인은 상기 약학적 조성물의 투여 전에 뎅기 바이러스에 대해 혈청양성인 약학적 조성물.
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