CN106999564A - 针对登革热病毒疾病的疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在保护人类受试者抵抗登革热疾病的方法中有用的疫苗组合物。

Description

针对登革热病毒疾病的疫苗组合物

发明领域

本发明涉及疫苗组合物和这些组合物在保护人类受试者抵抗登革热疾病的方法中的用途。

背景

登革热是在疟疾之后第二重要的传染性热带疾病，世界人口约一半生活在有流行传播风险的地区。据估计，每年有3.9亿例登革热病例，并且约有9600万人处于临床期。每年估计有50万人(包括儿童)患有重型登革热需要住院，这在疫情爆发期间对卫生保健系统造成巨大压力，世界卫生组织(WHO)-2012-2020年登革热预防控制的全球战略(Globalstrategy for dengue prevention control:2012-2020)；可获自：http:// reliefweb.int/sites/reliefweb.int/files/resources/9789241504034_eng.pdf。受重型登革热影响的那些中的大约2.5％将死亡(泛美卫生组织(Pan American HealthOrganisation)2014年5月-http://www.paho.org/hq/index.php？option＝com_content&view＝article&id＝9657&Itemid＝1926。

登革热疾病是由黄病毒属的四种抗原性不同但密切相关的登革热病毒血清型引起的(居布莱(Gubler)等人，1988，于：节肢动物传播的病毒性疾病的流行病学(Epidemiology of arthropod-borne viral disease)。莫纳思(Monath TPM)，编辑，佛罗里达州布卡拉顿市CRC出版社(Boca Raton(FL):CRC Press)：223-60；考特纳(Kautner)等人，1997，儿科学杂志(J.of Pediatrics)131：516-524；Rigau-Perez等人，1998，柳叶刀(Lancet)，352：971-977；沃恩(Vaughn)等人，1997，传染病杂志(J.Infect.Dis.)176：322-30。登革热病毒是正义的单链RNA病毒。

登革热疾病通常是通过在被病毒感染的埃及伊蚊(Aedes aegypti)的血液餐期间注射登革热病毒而传播。在4-10天的孵育期之后，疾病突然开始，接着是三个阶段：发热期(2至7天)、关键期(24-48小时-其间可能发生严重的并发症)和恢复期(48-72小时)。在关键期期间，可能发生危及生命的并发症，如出血、休克和急性器官损害。适当管理这些不可预测的结果可以减少病例死亡率。7至10天后登革热发热的医治完成，但旷日持久的衰弱是常见的。经常观察到减少的白细胞和血小板数目。

包括登革热出血热(DHF)的重型登革热疾病是登革热病毒感染的潜在致死并发症。DHF的特征在于高热和登革热疾病的症状，但具有极度嗜睡和困倦。增加的血管通透性和异常稳态可导致血容量减少、低血压，并且在严重的情况下，可导致低血容量性休克和内出血。两个因素似乎在DHF的发生中起主要作用-具有高水平的病毒血症的快速病毒复制(疾病的严重性与病毒血症水平相关；沃恩(Vaughn)等人，2000，传染病杂志(J.Inf.Dis.)，181：2-9)和具有高水平的炎症介质释放的主要炎症反应(罗思曼(Rothman)和恩尼斯(Ennis)，1999，病毒学(Virology)，257：1-6；艾伦·L.罗斯曼(Alan L.Rothman)，2011，自然评论免疫学(Nature Reviews Immunology)，11：532-543)。DHF的死亡率在没有治疗的情况下可以达到10％，但在大多数可以治疗的中心中为<1％。登革热疾病感染在100多个热带国家中流行，并且其中60个国家已经记录了DHF(居布莱(Gubler)，2002，微生物学趋势(TRENDS in Microbiology)，10：100-103)。

登革热休克综合征(DSS)是DHF的常见进展，并且通常是致命的。DSS由导致血浆渗入到血管外空间的全身性血管炎引起。DSS的特征在于快速和差的容积脉搏、低血压、肢冷和不安定。

在亚洲，DHF和DSS主要在儿童中观察到，患有DHF的那些中的约90％小于15岁(Malavige等人，2004，医学研究生杂志(Postgrad Med.J.)，80：588-601；Meulen等人，2000，热带医学与国际卫生(Trop.Med.Int.Health)，5：325-9)。相比之下，在加勒比和中美洲的暴发主要影响成年人(Malavige等人，2004，医学研究生杂志(Postgrad Med.J.)，80：588-601)。在登革热流行的许多国家，登革热疾病的发病率在老年群体中增加(Sabchareon等人，2012，柳叶刀(Lancet)，380，1559-1567；墨西拿(Messina)等人，2014，微生物学趋势(Trends Microbiol.)，22，138-146)。

登革热病毒的四种血清型具有约60％-80％的序列同源性。感染一种登革热血清型提供持久的同源免疫但有限的异源免疫(萨宾(Sabin)，1952，美国热带医学和卫生杂志(Am.J.Trop.Med.Hyg.)，1：30-50)。因此，已经被一种登革热血清型感染的个体可能随后被不同的血清型感染。认为由不同登革热病毒血清型产生的二次感染理论上是DHF发展的风险因素，因为展现DHF的大多数患者先前已暴露于登革热病毒的其他四种血清型的至少一种中。

迄今为止，没有针对登革热疾病的特异性治疗。对登革热疾病的治疗是针对症状的、卧床休息、通过退热剂和镇痛药控制发烧和疼痛、以及充分饮水。DHF的治疗需要平衡体液损失、替换凝血因子和输注肝素。

由于登革热预防措施(例如蚊虫控制和个人防止叮咬)的效能有限，难以强制并且昂贵，因此安全和有效的登革热疫苗将是最好的预防方式。然而，目前尚无这种类型的许可疫苗。因此，期望开发一种疫苗组合物，其可用于保护人类受试者抵抗登革热病毒的四种血清型的每一种的方法中。

发明概述

本发明涉及用于在保护人类受试者抵抗由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病的方法中使用的疫苗组合物，其中所述组合物包括：

(i)血清1至4型中每一种的登革热抗原，其中所述血清1至4型登革热抗原各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：

(a)减毒活登革热病毒；和

(b)嵌合的减毒活登革热病毒；

或者

(ii)能够在所述人类受试者中表达血清1至4型中每一种的登革热抗原的一个或多个核酸构建体，其中所述登革热抗原是登革热VLP。

本发明进一步涉及如在此所定义的疫苗组合物在制备用于保护人类受试者抵抗由登革热病毒血清2型引起的登革热疾病的药物中的用途。优选地，所述保护还在由登革热病毒血清1型、登革热病毒血清3型和登革热病毒血清4型引起的登革热疾病方面得以证明。

本发明进一步涉及保护人类受试者抵抗由登革热病毒血清2型引起的登革热疾病的方法，其中所述方法包括向所述人类受试者给予有效量的如在此所定义的疫苗组合物。优选地，所述方法还提供保护以抵抗由登革热病毒血清1型、登革热病毒血清3型和登革热病毒血清4型引起的登革热疾病。

另外，本发明涉及包含在此所定义的疫苗组合物的试剂盒，以及将所述组合物在用于保护人类受试者抵抗由登革热病毒血清2型引起的登革热疾病的方法中使用的说明书。优选地，所述方法还抵抗由登革热病毒血清1型、登革热病毒血清3型和登革热病毒血清4型引起的登革热疾病。

附图说明

图1是在意向治疗(ITT)群体中从第0天开始，在试验期间的任何时间(实例1中描述的)发生的由任何血清型引起的症状性病毒学确认的登革热(VCD)的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线。两条线中的上一条代表疫苗组，并且两条线中的下一条代表对照组。

图2显示了在第3次给药后在12个月时期内的总体疫苗效能(所有血清型)(实线)。

定义

如在此使用的，术语“登革热疾病”是指登革热病毒感染后由个体表现的所有严重级别的临床症状。如在此使用的，术语登革热疾病涵盖登革热疾病的较温和的表现，例如登革热发热，以及登革热发热较严重的表现，例如在此定义的重症登革热或如在此定义的登革热出血热(DHF)。自1975年以来，根据世界卫生组织指南(1997年更新)将临床登革热分类为：(i)登革热发热或(ii)登革热出血热(世界卫生组织，登革热出血热：诊断、治疗、预防和控制，第2版，日内瓦(Geneva)：WHO，1997；ISBN 92 4 154500 3)。2009年，WHO发布了新的指南，将临床登革热分类为(i)有或没有预警指征的登革热或(ii)重症登革热。两种分类均显示于Srikiatkachorn等人，临床传染性疾病(Clin.Infect.Dis.)(2011)53(6)：563的图1和2中。根据更早的1997年WHO分类，登革热发热通过以下来诊断：(i)存在发热，具有选自头痛、关节痛、眼窝痛、皮疹、肌痛、出血性表现和白细胞减少中的至少两种症状；以及(ii)支持性血清学或在与其他确认的登革热疾病病例相同的位置和时间的发生。当发热、出血性表现、血小板减少症和血浆渗漏的证据均被观察到时，确认进展为登革热出血热。根据2009年WHO分类，登革热的诊断需要存在：(i)发烧和选自以下项的至少两种临床症状：恶心，呕吐，皮疹，疼痛(ache)和痛苦(pain)，阳性血压带试验，或选自以下项的任何预警指征：腹痛和压痛、持续性呕吐、临床积液、粘膜出血、嗜睡或不安定、肝肿大>2cm或血细胞比容增加，同时血小板计数快速减少；以及(ii)支持性血清学或在与其他确认的登革热病例相同的位置和时间的发生。根据2009年WHO分类，重症登革热被定义为登革热的诊断观察到下列任何附加事件：(i)导致休克或呼吸窘迫的严重血浆渗漏(积液)；(ii)临床医生评估的严重出血；或(iii)严重器官受累(即肝脏：AST、ALT≥1000；CNS：意识障碍或心脏或其他器官损伤)。

如在此使用的，术语“登革热出血热”或“DHF”与1997年WHO定义一致，并且是指以下症状-1)临床表现：(a)发热：急性发作，高热(≥38℃)并且连续持续2至7天；(b)任何以下出血表现：阳性血压带试验、瘀点、紫癜、瘀斑、鼻出血、牙龈出血和呕血和/或黑粪症；2)实验室检查结果：(a)血小板减少(血小板计数≤100×10⁹/L)；(b)如血液浓缩(血细胞比容增加20％或更多)或胸腔积液(胸部X射线所见)和/或腹水和/或低白蛋白血症所示的血浆渗漏。前两个临床标准(即发热和出血表现)，加上血小板减少和血浆渗漏的体征足以建立DHF的临床诊断。胸腔积液(胸部X射线所见)和/或低白蛋白血症提供血浆渗漏的支持性证据。如在此使用的，DHF可以基于其严重性进一步定义。因此，DHF可以定义为I级、II级、III级或IV级(世界卫生组织(World Health Organization)，登革出血热：诊断、治疗、预防与控制(Denguehemorrhagic fever：Diagnosis，treatment，prevention and control)，第2版，日内瓦：WHO，1997；ISBN 92 4 154500 3)。I级定义为伴有非特异性组成症状的发热；唯一的出血表现是阳性血压带试验。II级定义为除了I级患者的表现之外的自发性出血，通常为皮肤或其他出血的形式。III级定义为由快速、弱脉搏和脉压收缩(20mmHg或更小)或低血压所表现的循环衰竭，存在皮肤湿冷和不安定。IV级定义为具有不可检测的血压和脉搏的深度休克。如本领域技术人员将理解的，在本发明的实践中，例如抵抗DHF的方法中，所述DHF不需要病毒学上确认。

如在此使用的，术语“病毒学确认的登革热”是指通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和/或通过登革热非结构1(NS1)蛋白酶联免疫吸附测定(ELISA)确认的由登革热病毒诱发的急性发热发作(即至少连续两天体温≥38℃)。在RT-PCR方法中，使用商业试剂盒从血清中提取RNA以丢弃潜在的Taq聚合酶抑制剂或干扰因子。然后用来自在登革热病毒之间保守的基因序列的引物来进行登革热筛选RT-PCR反应。通过与含有已知浓度的病毒基因组核酸序列的标准品进行比较，将结果表达为log₁₀噬斑形成单位(PFU)/mL的浓度。用Simplexa^TM登革热RT-PCR测定(美国加利福尼亚州焦点诊断公司(Focus Diagnostics,Inc.CA,USA))通过测试血清样品来确定感染后登革热病毒血症的血清型鉴定。简言之，使用商业试剂盒从血清中提取RNA以丢弃潜在的聚合酶抑制剂或干扰因子。然后进行Simplexa^TM测定，该测定合并来自登革热序列的血清型特异性引物。对结果进行定性表达，并且针对检测到的或未检测到的每种登革热血清型进行报告。将Simplexa^TM测定用于所有登革热筛选RT-PCR阳性的样品或登革热NS1 Ag ELISA阳性的样品的血清型鉴定。使用可商购的试剂盒(Platelia^TM登革热NS1Ag，伯乐公司(Bio-Rad)，马尔纳拉科屈埃特(Marnes-la-Coquette)，法国)进行NS1 ELISA。遵循制造商的说明。登革热NS1Ag测试是能够检测血清中的NS1 Ag的基于一个步骤的夹心ELISA的测定。该测试使用鼠单克隆Ab(MAb)进行捕获和揭示。在覆盖有MAb的微板孔内，将样品和对照与轭合物直接并同时孵育。如果样品中存在NS1Ag，那么将形成免疫复合物MAb-NS1-MAb/过氧化物酶。免疫复合物的存在通过添加引发显色反应的显色溶液来证明。在室温下孵育30分钟后，通过添加酸溶液停止酶促反应。用设定在450/620nm的分光光度计获得的光密度(OD)读数与样品中存在的NS1 Ag的量成比例。通过将样品的OD读数与截留对照血清的OD进行比较来确定个体样品中NS1 Ag的存在。样品比<0.5、≥0.5至<1.0和≥1分别表示阴性、可疑和阳性结果。

如在此使用的，术语“重症登革热”或“重症登革热疾病”是指由为监督在此报道的III期临床试验而建立的独立数据监测委员会(IDMC，Independent Data MonitoringCommittee)定义的重症登革热。根据IDMC的定义，在登革热发热的情况下，以下标准中的任一项的出现导致重症登革热的诊断：(i)休克(儿童或青少年中脉压≤20mmHg，或伴有心动过速的低血压[≤90mmHg]，弱脉搏和灌注不良)；(ii)需要输血的出血；(iii)脑病，即意识不清或差的意识状态或不归因于单纯性热惊厥或局灶性神经学体征的抽搐。差的意识状态或意识不清必须由格拉斯哥昏迷量表(GCS)得分支持；(iv)肝脏损伤(AST>1000U/L或凝血酶原时间[PT]国际标准化比率[INR]>1.5)；(v)肾脏功能损伤(血清肌酐≥1.5mg/dL)或(vi)由可用的胸部X射线(CXR)、超声心动图、心电图(ECG)或心脏酶支持的心肌炎、心包炎或心力衰竭(临床心力衰竭)。如本领域技术人员将理解的，在本发明的实践中，例如抵抗重症登革热的方法中，所述重症登革热不需要经病毒学确认并且可以简单地发生在与其他病毒学确认的登革热疾病病例相同的地点。

术语“登革热发热病毒(dengue fever virus)”、“登革热病毒(dengue virus)”和“DEN”可互换地使用。它们是指属于黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)的阳性单链RNA病毒。有四种不同的登革热病毒血清型(血清1、2、3和4型)，它们具有大约60％-80％的序列同源性。基因组的结构包括以下元件：5'非编码区(NCR)、编码结构蛋白(衣壳(C)、前膜(prM)和包膜(E))的区域和编码非结构蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)的区域和3'NCR。登革热病毒基因组编码不间断的编码区域，其被翻译成经历翻译后加工的单一多蛋白。

如在此使用的，术语“减毒活登革热病毒”是指通过遗传修饰从强毒性野生型登革热病毒起源的活的登革热病毒，导致毒力减弱并且不能诱导以与相应的野生型登革热病毒相关的相同症状为特征的疾病状态。减毒活登革热病毒可以从野生型病毒制备，例如通过重组核酸技术、定点诱变、在复制感受态细胞上的连续传代、化学诱变、电磁辐射或遗传操作例如小部分病毒核酸的缺失。可用于本发明的实践中的减毒活登革热病毒的实例包括VDV1(WO 2006/134433)、VDV2(WO 2006/134443)、以及描述于例如申请WO 02/066621、WO00/57904、WO 00/57908、WO 00/57909、WO 00/57910、WO 02/0950075和WO 02/102828中的病毒株。在本发明的方法中可用作登革热抗原血清1型的减毒活登革热病毒血清1型包括LAV1和VDV1。在本发明的方法中可用作登革热抗原血清2型的减毒活登革热病毒血清2型包括LAV2和VDV2。术语“VDV”表示能够在Vero细胞中复制并能够在人类中诱导特异性体液应答(包括中和抗体的诱导)的减毒活登革热病毒。

通过原始狗肾脏(PDK)细胞将野生型病毒株传代13次，称为16007/PDK13，也称为“LAV1”的减毒活登革热病毒血清1型源自野生型DEN-1(登革热病毒血清1型)16007病毒株。LAV1已经在EP 1159968中描述并且已经以编号I-2480提交给国家微生物培养物保藏中心(CNCM，巴斯德研究所(Institut Pasteur)，巴黎，法国)。“VDV1”是通过随后适应Vero细胞而源自LAV1的病毒；在这方面，在转染到Vero细胞之前，已经提取和纯化来自LAV1的RNA。随后通过在Vero细胞中的板纯化和扩增获得VDV1病毒株。与DEN-1 16007/PDK13病毒株相比，VDV1病毒株具有3个另外的突变。VDV1病毒株的完整核苷酸序列以及制备和表征VDV1病毒株的方法已描述于国际专利公开WO 2006/134433中。VDV1病毒株的完整核酸序列在SEQ ID NO：6中给出。

通过PDK细胞将野生型病毒传代53次，称为16681/PDK53，也称为“LAV2”的减毒活登革热病毒血清2型已经从野生型DEN-2(登革热病毒血清2型)16681病毒株获得。LAV2已经在EP 1159968中描述并且已经以编号1-2481提交给国家微生物培养物保藏中心(CNCM，巴斯德研究所(Institut Pasteur)，巴黎，法国)。“VDV2”是通过随后适应Vero细胞而源自LAV2的病毒株；在这方面，在转染到Vero细胞之前，已经提取和纯化来自LAV2的RNA。随后通过在Vero细胞中的板纯化和扩增获得VDV2病毒株。与16681/PDK53病毒株相比，VDV2病毒株具有10个另外的突变，包括在非编码区中的3个沉默突变和1个突变。VDV2病毒株的完整核苷酸序列以及制备和表征VDV2病毒株的方法已描述于国际专利公开WO 2006/134443中。VDV2病毒株的完整核酸序列在SEQ ID NO：7中给出。

在本发明的上下文中，“登革热嵌合体”或“嵌合登革热病毒”意指已经通过将受体黄病毒的至少E蛋白的序列与登革热病毒的相应序列交换来修饰遗传主链的受体黄病毒。可替代地，并且更优选地，受体黄病毒的遗传主链是通过将编码受体黄病毒的prM和E蛋白两者的核酸序列与登革热病毒的相应序列交换来修饰。典型地，受体黄病毒可以是减毒的。受体黄病毒可以是黄热(YF)病毒，在这种情况下，嵌合体在此被称为“嵌合的YF/登革热病 毒”。优选地，根据本发明的嵌合的YF/登革热病毒的YF骨架来自减毒的YF病毒。受体黄病毒也可以是登革热病毒，并且在这种情况下，嵌合的登革热病毒在此被称为“嵌合的登革热/ 登革热病毒”，以E或prM和E蛋白为特征的登革热病毒血清型与以遗传主链为特征的受体登革热病毒血清型是相同或不同的。当受体黄病毒是登革热病毒时，所述登革热病毒优选是减毒的。当受体和供体登革热病毒的血清型相同时，prM和E蛋白编码序列起源的受体登革热病毒和供体登革热病毒是相同血清型的两种不同的病毒株。为了在本发明中使用，嵌合的登革热病毒通常是嵌合的YF/登革热病毒。

在一个实施例中，嵌合的YF/登革热病毒包含减毒的黄热病病毒株YF17D的基因组主链(泰勒(Theiler M.)和史密斯(Smith H.H.)，1937，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，65，767-786)。可以使用的其他减毒YF病毒株的实例包括YF17D204(YF-VAX(R)，赛诺菲公司(Sanofi-Pasteur)，美国宾夕法尼亚州斯威夫特沃特(Swiftwater，PA，USA)；Stamaril(R)，赛诺菲公司(Sanofi-Pasteur)，Marcy I'Etoile，法国；ARILVAX(TM)，喀戎公司(Chiron)，斯皮克(Speke)，利物浦(Liverpool)，英国；FLAVIMUN(R)，贝赫那生物技术公司(BernaBiotech)，伯尔尼(Bern)，瑞士(Switzerland)；法国YF17D-204(X15067，X15062)；美国YF17D-204,234(赖斯(Rice)等人，1985，科学(Science)，229：726-733)，或相关病毒株YF17DD(基因库访问号U17066)，YF17D-213(基因库访问号U17067)和由伽列(Galler)等人描述的病毒株YF17DD(1998，疫苗(Vaccines)，16(9/10)：1024-1028)。有利地，本发明的嵌合的减毒活YF/登革热病毒的受体黄病毒是YF 17D或YF 17D204。

可用于本发明实践的嵌合登革热病毒的实例包括在专利申请WO 98/37911中描述的嵌合YF/登革热病毒和嵌合登革热/登革热病毒，例如在专利申请WO 96/40933和WO 01/60847中描述的那些。

特别适合用于本发明实践的嵌合YF/登革热病毒的一个实例是YF/登革热病毒，其在此也称为“CYD”病毒。如在此使用的，YF/登革热(或CYD)病毒是嵌合的减毒活YF/登革热病毒，其包含合适的减毒YF病毒(例如YF17D或YF17D204)的基因组主链，其中编码前膜(prM)和包膜(E)蛋白的核酸序列已被编码登革热病毒的相应结构蛋白的核酸序列替代。这类病毒的构建可以根据或基本上根据钱伯斯(Chambers)等人(1999，病毒学杂志(J.Virology)73(4)：3095-3101)的传授来实现。通过使用来自病毒株DEN 1 PUO 359(TVP1140)、DEN2 PUO 218、DEN3 PaH881/88和DEN 4 1228(TVP 980)的prM和E序列，已经产生实例中描述的特定的(CYD)病毒。为了方便起见，实例中描述的特定的(CYD)病毒在此称为“CYD1”、“CYD2”、“CYD3”和“CYD4”。这些特定病毒株的制备已详细描述于国际专利申请WO98/37911、WO 03/101397、WO 07/021672、WO 08/007021、WO 08/047023和WO 08/065315中，针对其可以参考这些病毒株的制备方法的准确描述。对应于CYD1、CYD2、CYD3和CYD4的prM-E区域的核苷酸序列的SEQ ID NO在表16中给出。可替代地，其他登革热发热病毒株可用作核酸来源，以促进用于本发明实践的嵌合病毒的构建，如本文别处所述，例如用于构建其他YF/登革热病毒。可用于本发明保护方法的嵌合登革热病毒的可替代的实施例是受体黄病毒，其中已经通过将(i)编码受体黄病毒的E蛋白的序列与登革热病毒的相应序列交换和(ii)编码受体黄病毒的prM蛋白的序列与非登革热黄病毒例如JEV病毒的相应序列交换来修饰遗传主链。此类嵌合登革热病毒的实例描述于WO 2011/138586中。

如在此使用的，术语“登革热病毒样颗粒”或“登革热VLP”是指不含有复制遗传物质但在其表面存在于与天然病毒粒子结构相似的重复有序阵列中的登革热E蛋白的病毒颗粒。典型地，登革热VLP还含有登革热prM和/或M蛋白。可以在体外产生VLP(张(Zhang)等人，病毒学杂志(J.Virol.)(2011)30(8)：333)。也可以在体内产生VLP。为此，经由本领域已知的方法，例如经由至少一种病毒载体的使用，可以将编码prM/M和E登革热蛋白的一个或多个核酸构建体(例如DNA或RNA)引入受试者(例如人类受试者)的细胞中。然后在体内形成VLP颗粒。可用于本发明方法中的病毒载体的非限制性实例包括痘病毒(例如减毒安卡拉痘病毒)和麻疹病毒。为了在本发明中使用，在体内表达VLP的特定类别的病毒载体包括复制缺陷型假感染(PIV)病毒，例如，根据Replivax^TM技术。(鲁缅采夫(Rumyantsev AA)等人，疫苗(Vaccine)，2011年7月18日；29(32)：5184-94)。

本发明的疫苗组合物在受试者中引发免疫反应(即诱导中和抗体的产生)的能力可以例如通过测量针对在组合物内包含的一种或多种登革热病毒血清型产生的中和抗体滴度来评估。中和抗体滴度可以通过斑块减少中和测试(PRNT₅₀)试验测量(Timiryasova，TM等人，美国热带医学和卫生杂志(Am.J.Trop.Med.Hyg.)(2013)，第88(5)卷，962-970)。简言之，在从待测试的受试者收集的血清中测量其登革热中和抗体的水平的中和抗体滴度。如果受试者是接种疫苗的受试者，那么在给予本发明的疫苗组合物之后至少28天从所述受试者收集样品。将系列的两倍稀释的血清(先前热灭活的)与血清1、2、3或4型的每种登革热病毒的恒定攻击剂量(酌情)(表示为PFU/mL)混合。CYD登革热疫苗构建体的亲本登革热病毒株用作攻击株。然后将混合物接种到具有融合的Vero细胞单层的微板的孔中。吸附后，将细胞单层培养几天。登革热病毒感染细胞的存在通过感染的病灶(即斑块)的形成来指示，并且因此可以检测由于血清样品中存在中和抗体而导致的病毒感染性的降低(即，斑块数量的减少)。报告值(终点中和滴定度)表示当与阴性对照孔中的平均病毒斑块计数(其代表100％病毒载荷)比较时≥50％的登革热攻击病毒(以斑块计数)被中和的血清最高稀释度。终点中和滴度表示为连续值。该测定的定量下限(LLOQ)为10(1/dil)。通常认为当滴度高于或等于10(1/dil)时发生血清转化。由于PRNT测试可能因实验室而略有不同，LLOQ也可能略有不同。因此，以一般方式，认为当滴度高于或等于测试的LLOQ时发生血清转换。在下列参考文献中考虑中和抗体滴度，但作者没有建立保护的相关性(Guirakhoo等人，病毒学杂志(J.Virol.)(2004)78(9)：4761；Libraty等人，PLoS医学(2009)6(10)；巩特尔(Gunther)等人，疫苗(Vaccine)(2011)29：3895)以及恩迪(Endy)等人，传染病杂志(J.Infect.Dis.)(2004)，189(6)：990-1000)。

术语“CCID₅₀ ”是指感染50％细胞培养物的病毒(例如疫苗病毒)的量。CCID₅₀测定是具有统计滴度计算的极限稀释测定(莫里森(Morrison D)等人，传染病杂志(J InfectDis.)2010；201(3)：370-7)。

如在此使用的，“无登革热(dengue )”受试者是指未被登革热病毒感染并且之前也未用登革热疫苗免疫的受试者，即，取自所述受试者的血清样品将在登革热ELISA或PRNT50测定中产生阴性结果。

如在此使用的，“登革热免疫”受试者是指在给予本发明的疫苗组合物之前已经被登革热病毒感染或被登革热疫苗免疫的受试者，即，从所述受试者获取的血清样品将在登革热ELISA或PRNT50测定中产生阳性结果。

根据本发明，如在此使用的“保护方法”导致在暴露于登革热病毒的人类受试者中发生登革热疾病的严重性或登革热疾病的可能性降低。有利地，所述降低是统计学显著的。根据本发明的保护方法可以导致以下项中的任何一种或多种：

(i)由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病的发生率或可能性的统计学上显著的降低(例如预防上述登革热疾病)；

(ii)由血清1型登革热病毒引起的登革热疾病、由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病、由血清3型登革热病毒引起的登革热疾病和由血清4型登革热病毒引起的登革热疾病的发生率或可能性的统计学上显著的降低(例如预防上述登革热疾病)；

(iii)不论严重程度如何，由血清1、2、3和4型引起的登革热疾病的预防；

(iv)由血清2型登革热病毒引起的重症登革热疾病的发生率或可能性的统计学上显著的降低(例如预防上述重症登革热疾病)；

(v)由血清1型登革热病毒引起的重症登革热疾病、由血清2型登革热病毒引起的重症登革热疾病、由血清3型登革热病毒引起的重症登革热疾病和由血清4型登革热病毒引起的重症登革热疾病的发生率或可能性的统计学上显著的降低(例如预防上述重症登革热疾病)；

(vi)由血清2型登革热病毒引起的DHF的发生率或可能性的降低(例如预防上述DHF)；优选地，所述降低是统计学显著的；

(vii)由血清1型登革热病毒引起的DHF、由血清2型登革热病毒引起的DHF、由血清3型登革热病毒引起的DHF和由血清4型登革热病毒引起的DHF的发生率或可能性的降低(例如预防上述DHF)；优选地，所述降低是统计学显著的；

(viii)由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病所导致的住院的发生率或可能性的统计学上显著的降低(例如预防上述住院)；

(ix)由血清1型登革热病毒引起的登革热疾病、由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病、由血清3型登革热病毒引起的登革热疾病和由血清4型登革热病毒引起的登革热疾病所导致的住院的发生率或可能性的统计学上显著的降低(例如预防上述住院)；

(x)归因于由任何血清型引起的重复症状性病毒学确认的登革热病例的发生率或可能性的统计学上显著的降低，例如对被定义为归因于不同血清型的、发生在相距超过14天的≥2次登革热发作的重复症状性病毒学确认的登革热病例进行预防。

(xi)在年龄为至少5岁的人类受试者中(i)至(x)中的任一项；

(xii)在年龄为至少7岁的人类受试者中(i)至(x)中的任一项；

(xiii)在年龄为至少9岁的人类受试者中(i)至(x)中的任一项；

(xiv)在年龄为至少12岁的人类受试者中(i)至(x)中的任一项；

(xv)在年龄为9岁至16岁之间的人类受试者中(i)至(x)中的任一项；

(xvi)在年龄为12岁至16岁之间的人类受试者中(i)至(x)中的任一项；

(xvii)在生活在流行地区的年龄为9岁直至60岁的个体中预防由血清1、2、3和4型登革热病毒引起的登革热疾病；

(xviii)在生活在流行地区的年龄为12岁直至60岁的个体中预防由血清1、2、3和4型登革热病毒引起的登革热疾病；

(xix)(i)至(xviii)中任一项，其中所述血清2型登革热病毒具有美洲、亚洲/美洲或世界性的基因型。

发明综述

本发明涉及用于在保护人类受试者抵抗由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病的方法中使用的疫苗组合物，其中所述组合物包括：

(i)血清1至4型中每一种的登革热抗原，其中所述血清1至4型登革热抗原各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：

(a)减毒活登革热病毒；和

(b)嵌合的减毒活登革热病毒；

或者

(ii)能够在所述人类受试者中表达血清1至4型中每一种的登革热抗原的一个或多个核酸构建体，其中所述登革热抗原是登革热VLP。

优选地，所述由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病是重症登革热疾病。优选地，所述方法导致由于血清2型登革热病毒引起的登革热疾病住院的发生率或可能性降低。优选地，所述由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病是DHF。

优选地，所述方法还保护所述人类受试者抵抗由血清1型登革热病毒引起的登革热疾病，由血清3型登革热病毒引起的登革热疾病和由血清4型登革热病毒引起的登革热疾病。优选地，所述方法导致由于血清1型登革热病毒引起的登革热疾病、由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病、由血清3型登革热病毒引起的登革热疾病和由血清4型登革热病毒引起的登革热疾病导致的住院的发生率或可能性降低。优选地，当本发明的疫苗组合物用于如在此所述的方法中时，所述方法导致保护所述人类受试者抵抗由血清1型登革热病毒引起的登革热发热、由血清2型登革热病毒引起的登革热发热、由血清3型登革热病毒引起的登革热发热和由血清4型登革热病毒引起的登革热发热。优选地，当本发明的疫苗组合物用于如在此所述的方法中时，所述方法导致保护所述人类受试者抵抗由血清1型登革热病毒引起的重症登革热疾病，由血清2型登革热病毒引起的重症登革热疾病，由血清3型登革热病毒引起的重症登革热疾病和由血清4型登革热病毒引起的重症登革热疾病。优选地，当本发明的疫苗组合物用于如在此所述的方法中时，所述方法导致保护所述人类受试者抵抗由血清1型登革热病毒引起的DHF、由血清2型登革热病毒引起的DHF、由血清3型登革热病毒引起的DHF和由血清4型登革热病毒引起的DHF。

优选地，向登革热免疫的人类受试者给予本发明的疫苗组合物。优选地，向至少2岁的人类受试者给予本发明的疫苗组合物。优选地，所述人类受试者是至少5岁。优选地，所述人类受试者是至少7岁。优选地，所述人类受试者是至少9岁。优选地，所述人类受试者是至少12岁。优选地，所述人类受试者的年龄在2岁至60岁之间。优选地，所述人类受试者的年龄在6岁至60岁之间。优选地，所述人类受试者的年龄在7岁至60岁之间。优选地，所述人类受试者的年龄在9岁至60岁之间。优选地，所述人类受试者的年龄在12岁至60岁之间。优选地，所述人类受试者的年龄在2岁至16岁之间。优选地，所述人类受试者的年龄在5岁至16岁之间。优选地，所述人类受试者的年龄在9岁至16岁之间。

根据本发明的人类受试者优选不是怀孕，哺乳或可能分娩的，没有自我报告的或疑似先天性或获得性免疫缺陷，在接种疫苗6个月内没有接受免疫抑制治疗或在接种疫苗前3个月内没有超过2周的全身性皮质类固醇治疗，不是HIV血清反应阳性的，并且对在此所定义的任何疫苗组分没有全身性超敏反应。

优选地，根据本发明的疫苗组合物包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，这些抗原各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：(a)减毒活登革热病毒和(b)嵌合的减毒活病毒。

优选地，根据本发明的疫苗组合物包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，其中所述血清1、3和4型登革热抗原各自是嵌合的减毒活登革热病毒，并且所述血清2型登革热抗原选自下组，该组由以下各项组成：减毒活登革热病毒和嵌合的减毒活登革热病毒。例如，本发明的疫苗组合物可以包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，其中所述血清1、3和4型登革热抗原各自是嵌合的减毒活登革热/登革热病毒，并且所述血清2型登革热抗原是减毒活登革热病毒。例如，根据本发明的疫苗组合物可以是血清1至4型中每一种的登革热抗原的四价混合物(称为DENVax)，其被披露于黄(Huang)等人，PLoS-被忽视的热带病(PLoSNegl Trop Dis)7(5)：e2243(2013)。可替代地，本发明的疫苗组合物可以包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，其中所述血清1、3和4型登革热抗原各自是嵌合的减毒活YF/登革热病毒，并且所述血清2型登革热抗原是减毒活登革热病毒。

优选地，根据本发明的疫苗组合物包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，其中所述血清1、3和4型登革热抗原各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：(a)减毒活登革热病毒和(b)嵌合的减毒活登革热病毒，并且所述血清2型登革热抗原是嵌合的减毒活登革热病毒。例如，本发明的疫苗组合物可以包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，其中所述血清1、3和4型登革热抗原各自是减毒活登革热病毒，并且所述血清2型登革热抗原是嵌合的减毒活登革热/登革热病毒。例如，根据本发明的疫苗组合物可以是血清1至4型中每一种的登革热抗原的四价混合物(称为TV001、TV002、TV003和TV004’)中的任何一种，其被披露于德宾(Durbin)等人，传染病杂志(Journal of Infectious Diseases)(2013)，207，957-965。优选地，根据本发明的这个实施例的疫苗组合物是TV003。

优选地，根据本发明的疫苗组合物包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，其中所述登革热抗原的每一种是嵌合的减毒活登革热病毒，优选嵌合YF/登革热病毒，更优选包含其prM-E序列已经被登革热病毒的prM-E序列取代的减毒YF基因组主链的嵌合YF/登革热病毒。

优选地，本发明的嵌合的减毒活登革热病毒包含来自登革热病毒的一种或多种蛋白质和来自不同黄病毒的一种或多种蛋白质。优选地，不同的黄病毒是黄热病病毒(即嵌合YF/登革热病毒)。优选地，根据本发明的嵌合的减毒活登革热病毒包含减毒的黄热病病毒基因组，该黄热病病毒基因组的prM-E序列已经被登革热病毒的prM-E序列取代。可替代地，本发明的嵌合的减毒活登革热病毒包含来自第一登革热病毒的一种或多种蛋白质和来自第二登革热病毒的一种或多种蛋白质(即嵌合登革热/登革热病毒)。优选地，所述第一登革热病毒和所述第二登革热病毒属于不同的血清型。当所述第一登革热病毒和所述第二登革热病毒属于相同的血清型时，所述第一和第二登革热病毒是不同的病毒株。

用于本发明的血清1型登革热抗原的优选实例是嵌合的减毒活YF/登革热病毒，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列一致性的核苷酸序列。用于本发明的血清1型登革热抗原的另一个优选实例是减毒活登革热病毒，其包含与SEQ ID NO：6具有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列一致性的核苷酸序列。优选地，与SEQ ID NO：6具有小于100％一致性的核苷酸序列不包含在所述核酸序列内的以下位置处的突变：对应于SEQ ID NO：6的位置1323、1541、1543、1545、1567、1608、2363、2695、2782、5063、5962、6048、6806、7330、7947和9445。

用于本发明的血清2型登革热抗原的优选实例是嵌合的减毒活YF/登革热病毒，其包含与SEQ ID NO：2具有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列一致性的核苷酸序列。用于本发明的血清2型登革热抗原的另一个优选实例是嵌合的减毒活YF/登革热病毒，其包含与SEQ ID NO：5具有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列一致性的核苷酸序列。用于本发明的血清2型登革热抗原的另一个优选实例是减毒活登革热病毒，其包含与SEQ ID NO：7具有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列一致性的核苷酸序列。优选地，与SEQ ID NO：7具有小于100％一致性的核苷酸序列不包含在所述核酸序列内的以下位置处的突变：对应于SEQ ID NO：7的位置736、1619、4723、5062、9191、10063、10507、57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571。

用于本发明的血清3型登革热抗原的优选实例是嵌合的减毒活YF/登革热病毒，其包含与SEQ ID NO：3具有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列一致性的核苷酸序列。

用于本发明的血清4型登革热抗原的优选实例是嵌合的减毒活YF/登革热病毒，其包含与SEQ ID NO：4具有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列一致性的核苷酸序列。

为了形成根据本发明的疫苗组合物(四价剂型)(即含有血清1至4型中每一种的登革热抗原的疫苗组合物)，在先前段落中披露的血清1、2、3和4型登革热抗原的优选实例能以任何可能组合来进行组合。可替代地，根据本发明的疫苗组合物可以作为两种二价剂型给予至受试者，其中在先前四个段落中披露的血清1、2、3和4型登革热抗原的优选实例能以任何可能的二价组合对来进行组合。因此，在血清1、2、3和4型登革热抗原的尤其优选的组合中，血清3和4型登革热抗原分别是包含与SEQ ID NO：3具有至少90％、至少95％、至少98％或100％序列一致性的核苷酸序列的嵌合的减毒活YF/登革热病毒，和包含与SEQ IDNO：4具有至少90％、至少95％、至少98％或100％序列一致性的核苷酸序列的嵌合的减毒活YF/登革热病毒。在这类尤其优选的组合中，血清1和2型登革热抗原可以分别是：

(i)包含与SEQ ID NO：1具有至少90％、至少95％、至少98％或100％序列一致性的核苷酸序列的嵌合的减毒活YF/登革热病毒，和包含与SEQ ID NO：2具有至少90％、至少95％、至少98％或100％序列一致性的核苷酸序列的嵌合的减毒活YF/登革热病毒；或者

(ii)包含与SEQ ID NO：1具有至少90％、至少95％、至少98％或100％序列一致性的核苷酸序列的嵌合的减毒活YF/登革热病毒，和包含与SEQ ID NO：5具有至少90％、至少95％、至少98％或100％序列一致性的核苷酸序列的嵌合的减毒活YF/登革热病毒；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：1具有至少90％、至少95％、至少98％或100％序列一致性的核苷酸序列的嵌合的减毒活YF/登革热病毒，和包含与SEQ ID NO：7具有至少90％、至少95％、至少98％或100％序列一致性的核苷酸序列的减毒活登革热病毒(优选地，与SEQ IDNO：7具有小于100％一致性的核苷酸序列不包含在所述核酸序列内的以下位置处的突变：对应于SEQ ID NO：7的位置736、1619、4723、5062、9191、10063、10507、57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571)；或者

(iv)包含与SEQ ID NO：6具有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列一致性的核苷酸序列的减毒活登革热病毒(优选地，与SEQ ID NO：6具有小于100％一致性的核苷酸序列不包含在所述核酸序列内的以下位置处的突变：对应于SEQ ID NO：6的位置1323、1541、1543、1545、1567、1608、2363、2695、2782、5063、5962、6048、6806、7330、7947和9445)和包含与SEQ ID NO：7具有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列一致性的核苷酸序列的减毒活登革热病毒(优选地，与SEQ ID NO：7具有小于100％一致性的核苷酸序列不包含在所述核酸序列内的以下位置处的突变：对应于SEQ ID NO：7的位置736、1619、4723、5062、9191、10063、10507、57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571)。

优选地，本发明的疫苗组合物引起一定水平的疫苗效能。例如，本发明的疫苗组合物对由血清2型引起的登革热疾病具有至少30％，更优选至少40％的疫苗效能。例如，本发明的疫苗组合物对于登革热疾病(由任何血清型引起)具有至少60％的总疫苗效能。例如，本发明的疫苗组合物针对由血清2型引起的登革热疾病具有至少30％、更优选至少40％的疫苗效能，以及对于登革热疾病(其由任何血清型引起)具有至少60％的总疫苗效能。

优选地，向黄热病免疫的人类受试者给予本发明的疫苗组合物。如在此使用的，黄热病免疫受试者是指在给予本发明的疫苗组合物之前已经被YF病毒感染或被YF疫苗免疫的受试者，即，从所述受试者获取的血清样品将在YF ELISA或YF PRNT50测定中产生阳性结果。简言之，YF PRNT50测定进行如下。将待测试的血清(预先热灭活的)的连续两倍稀释液与恒定浓度的YF疫苗病毒株17D(表示为PFU/mL)混合。将混合物一式两份接种到融合的Vero细胞的平板的孔中。吸附后，将细胞单层叠加并培养几天。报告值(终点中和滴度)表示当与阴性对照孔(其代表100％病毒载荷)比较时≥50％的YF攻击病毒(以斑块计数)被中和的血清最高稀释度。YF PRNT50测定的LLOQ为10(1/dil)。可替代地并且有利地，可以使用更严格的测定来定义黄热病免疫的人类受试者。例如，YF免疫受试者可以被定义为其血清样品在PRNT80或PRNT90测定中产生阳性结果的受试者。报告值(终点中和滴度)表示当与阴性对照孔比较时≥80％或≥90％的YF攻击病毒(以斑块计数)被中和的血清最高稀释度。优选地，向黄热病和登革热免疫的人类受试者给予本发明的疫苗组合物。优选地，向多类型登革热免疫的人类受试者给予本发明的疫苗组合物。如在此使用的，多类型登革热免疫受试者是指已经被多于一种登革热病毒血清型(通过自然感染或通过接种疫苗)感染的受试者。多类型登革热免疫受试者被定义为在登革热PRNT50测定中对至少两种血清型产生阳性结果(抗体滴度>10)和阳性血清型之间的差异小于6倍的受试者。单类型登革热免疫受试者被定义为在登革热PRNT50测定中仅对一种血清型产生阳性结果(抗体滴度>10)的受试者，或者与对剩余三种血清型的响应相比，在登革热PRNT50测定中对于单一血清型具有至少6倍更高的响应的受试者。优选地，向黄热病免疫和单类型登革热免疫的受试者给予本发明的疫苗组合物。优选地，向黄热病免疫和单类型登革热免疫的人类受试者给予本发明的疫苗组合物。

根据本发明的疫苗组合物能以多剂量给予。例如，根据本发明的疫苗组合物能以一次、两次或三次剂量给予。当根据本发明的疫苗组合物以三次剂量给予时，第一剂量和第三剂量优选地间隔约12个月给予。例如，本发明的疫苗组合物能以第一剂量、第二剂量和第三剂量给予，其中所述第二剂量将在所述第一剂量后约六个月给予，并且其中所述第三剂量将在所述第一剂量后约十二个月给予。可替代地，三次剂量可在零个月，约三至四个月(例如约三个半月)和约十二个月(即其中组合物的第二剂量在第一剂量后约三个半月给予，并且其中所述组合物的第三剂量在第一剂量后约十二个月给予的方案)。

根据本发明的疫苗组合物能以两次剂量给予。优选地，第一剂量和第二剂量间隔约三个月、六个月、八个月或九个月给予。优选地，第二剂量在第一剂量后约六个月给予。可替代地，可以向受试者同时或几乎同时给予两次剂量的根据本发明的疫苗组合物(例如在彼此的24小时内)。优选地，当根据本发明的疫苗组合物以两次剂量给予时，被给予疫苗组合物的人类受试者是登革热免疫的。如果由于先前的疫苗接种所述受试者是登革热免疫的，那么优选在两次剂量的根据本发明的疫苗组合物的第一次之前至少3个月，更优选至少6个月给予所述先前的接种。

根据本发明的疫苗组合物能以单一剂量给予。优选地，当根据本发明的疫苗组合物以单一剂量给予时，被给予疫苗组合物的人类受试者是登革热免疫的。如果由于先前的疫苗接种所述受试者是登革热免疫的，那么优选在根据本发明的疫苗组合物的单一剂量之前至少3个月，更优选至少6个月给予所述先前的接种。

任选地，可以使用根据本发明的疫苗组合物的加强给予，例如在初始免疫后(即在给予初始免疫方案中安排的最后剂量之后)六个月至十年，例如六个月、一年、三年、五年或十年。

根据本发明的人类受试者(向其给予本发明的疫苗组合物)优选居住在或正前往登革热流行地区。更优选地，所述人类受试者居住在登革热流行地区。根据本发明的人类受试者也可以居住在经历登革热流行的地区。术语居住在此给予其常规含义，并且是指通常居住在有关地区的人。登革热流行地区是本领域技术人员熟知的，并且根据本发明包括大多数热带和亚热带，例如由WHO鉴定为流行国家的任何国家。登革热流行地区在此可以被定义为其中群体具有至少50％登革热免疫或至少60％登革热免疫的地区。更优选地，登革热流行地区可以被定义为其中群体具有至少70％登革热免疫，至少80％登革热免疫或至少90％登革热免疫的地区。因此，根据本发明的人类受试者优选居住在登革热流行地区，其中所述地区的群体是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％登革热免疫。例如，根据本发明的登革热流行地区可以包括落入热带和亚热带内的那些美洲国家或其部分。因此，根据本发明的登革热流行地区可以包括以下国家中的任何一个或多个或其部分：巴西、委内瑞拉、哥伦比亚、厄瓜多尔、秘鲁、玻利维亚、巴拉圭、巴拿马、哥斯达黎加、尼加拉瓜、洪都拉斯、萨尔瓦多、危地马拉、伯利兹、墨西哥、美国和加勒比海岛屿。在一个具体实施例中，本发明的登革热流行地区可以由以下组成：巴西、哥伦比亚、洪都拉斯、墨西哥和波多黎各。在另一个具体实施例中，本发明的登革热流行地区可以由以下组成：巴西、哥伦比亚和洪都拉斯。根据本发明的登革热流行地区还可以包括热带和亚热带以内的南亚和大洋洲国家。因此，根据本发明的登革热流行地区可以包括以下各项中的任何一个或多个：印度、缅甸(Myanmar或Burma)、泰国、老挝、越南、柬埔寨、印度尼西亚、马来西亚、新加坡、菲律宾、台湾、巴布亚新几内亚和澳大利亚。

有利地，根据本发明的人类受试者(向其给予本发明的疫苗组合物)居住在登革热流行地区，其中登革热的显性循环株是血清1、3和4型。例如，所述登革热流行地区中登革热疾病的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％是由血清1、3或4型登革热病毒引起。有利地，根据本发明的人类受试者(向其给予本发明的疫苗组合物)居住在登革热流行地区，其中登革热的传播的主要病毒株是血清3和4型。例如，所述登革热流行地区中登革热疾病的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％是受血清3或4型登革热病毒感染。

有利地，根据本发明的人类受试者(向其给予本发明的疫苗组合物)居住在登革热流行地区，其中传播的血清2型登革热病毒株具有以在位置E-226和E-228处存在Thr和Gly为特征的基因型。有利地，传播的血清2型登革热病毒株具有以在位置prM-16、E-83、E-203、E-226、E-228和E-346处分别存在残基Arg、Asn、Asp、Thr、Gly和His中的至少五个或所有六个为特征的基因型，其中在位置E-226和E-228处的残基必须分别为Thr和Gly。在上下文中，prM-16表示prM蛋白的位置16，并且E-83表示E蛋白的位置83，等等。根据本发明的人类受试者(向其给予本发明的疫苗组合物)优选居住在登革热流行地区，其中传播的血清2型登革热病毒具有如本段中所定义的基因型，即在所述登革热流行地区至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的血清2型登革热疾病病例是由具有所述基因型的血清2型登革热病毒引起的。如在此所提及的，由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病优选是由具有如本段中所定义的基因型的血清2型登革热病毒引起的登革热疾病。

有利地，根据本发明的人类受试者(向其给予本发明的疫苗组合物)居住在登革热流行地区，其中传播的血清2型登革热病毒株不具有亚洲-1基因型。血清2型登革热病毒可以细分为几种基因型，其称为：美洲、亚洲/美洲、亚洲-1、亚洲-2、世界性和森林性(TwiddySS等人(2002)登革热-2病毒基因型之间的系统发育关系和差异选择压力(Phylogeneticrelationships and differential selection pressure in genotypes of dengue-2virus)，病毒学(Virology)；298(1)：63-72)。因此，根据本发明的人类受试者(向其给予本发明的疫苗组合物)有利地居住在登革热流行地区，其中传播的血清2型登革热病毒株具有美洲、亚洲/美洲、亚洲-2、世界性或森林性基因型。更优选地，根据本发明的人类受试者(向其给予本发明的疫苗组合物)有利地居住在登革热流行地区，其中传播的血清2型登革热病毒株具有美洲、亚洲/美洲、或世界性基因型。根据本发明的人类受试者(向其给予本发明的疫苗组合物)优选居住在登革热流行地区，其中传播的血清2型登革热病毒具有如本段中所定义的基因型，即在所述登革热流行地区至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的血清2型登革热疾病病例是由具有美洲、亚洲/美洲、亚洲-2、世界性或森林性基因型基因型，优选美洲、亚洲/美洲或世界性基因型的血清2型登革热病毒引起的。如在此所提及的，由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病优选地是由具有美洲、亚洲/美洲、亚洲-2、世界性或森林性基因型的血清2型登革热病毒引起的登革热疾病。更优选地，如在此所提及的，由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病优选是由具有美洲、亚洲/美洲或世界性基因型的血清2型登革热病毒引起的登革热疾病。通过序列比对和系统发生树分析确定特定登革热-2病毒株的基因型。简言之，将参考序列(其是所选择的编码如Twiddy等人描述的每种基因型的代表性病毒株的E蛋白的核苷酸序列)与编码待基因分型的血清2型病毒株的E蛋白的核苷酸序列比对。然后计算系统发生树，并根据它们各自与参考基因型序列的聚类为每个未知血清2型病毒株分配基因型。根据最大似然方法使用FastTree 2软件(普赖斯(Price MN)等人，用于大调整的FastTree 2近似最大似然树(FastTree 2-approximate maximum-likelihood trees for large alignmentments)，公共科学图书馆杂志(PLoS One)，2010；5(3)：e9490)和氨基酸进化的惠兰和高曼模型(Whelan andGoldman model)(惠兰(Whelan S)，高曼(Goldman N)，使用最大似然方法从多个蛋白质家族衍生的蛋白质进化的一般经验模型(A general empirical model of proteinevolution derived from multiple protein families using a maximum-likelihoodapproach)，分子生物进化(Mol.Biol.Evol.)2001；18(5)：691-699)计算系统发生树。

根据本发明的登革热疾病可以是病毒学确认的登革热疾病。

优选地，根据本发明的组合物(即用于在根据本发明的方法中使用的组合物)降低登革热疾病的发生率或可能性。

优选地，根据本发明的组合物，即在根据本发明的方法中使用的组合物，导致在生活在流行地区的年龄为9岁直至60岁个体中预防(即用于预防)由登革热病毒血清1、2、3和4型引起的登革热疾病。在上下文中，个体理解为人类受试者。

优选地，根据本发明的组合物，即在根据本发明的方法中使用的组合物，导致在生活在流行地区的年龄为12岁直至60岁个体中预防(即用于预防)由登革热病毒血清1、2、3和4型引起的登革热疾病。在上下文中，个体理解为人类受试者。

待给予的本发明的减毒活登革热病毒或嵌合的减毒活登革热病毒的精确量可以根据所接种的受试者的年龄和体重，给药频率以及组合物中的其他成分而变化。通常，包含在本发明的疫苗组合物的剂量中的减毒活登革热病毒(例如VDV1或VDV2)的量在从约10³至约10⁶CCID₅₀的范围内，例如在约5x10³至约5x10⁵的范围内，例如约10⁴CCID₅₀。包含在本发明的疫苗组合物中的嵌合登革热病毒(例如嵌合YF/登革热病毒或(CYD)病毒)的量在约10⁵CCID₅₀至约10⁶CCID₅₀的范围内。包含在根据本发明的四价剂型或二价剂型中的血清1至4型中每一种的减毒活登革热病毒或嵌合的减毒活登革热病毒的量优选是相等的。有利地，根据本发明的疫苗组合物包含有效量的在此所定义的登革热抗原。

本发明的疫苗组合物可以作为单一的四价剂型(即包含在此所定义的登革热抗原的所有四种血清型的单一剂型)给予至人类受试者。可替代地，本发明的疫苗组合物可以作为两种二价剂型(即含有两种登革热抗原血清型的一种二价剂型和含有其余两种登革热抗原血清型的第二种二价剂型)给予至人类受试者。优选地，所述二价剂型在解剖学上分离的部位同时给予至所述人类受试者。如在此所定义的，术语“同时地”意指在24小时内，优选在3小时内，优选在10分钟内。如在此所定义的，术语“解剖学上分离的部位”意指身体上由不同淋巴结排出的部位，例如，每个臂的三角肌区域。优选地，根据本发明的疫苗组合物作为单一的四价剂型给予至受试者。

根据本发明的疫苗组合物可以进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。根据本发明的药学上可接受的载体或赋形剂意指通常用于药物和疫苗的配制品中以增强活性剂的稳定性、无菌性和递送性并且在人类中不产生任何次级反应(例如过敏反应)的任何溶剂或分散介质等。赋形剂基于所选的药物形式、给予的方法和途径来选择。在“雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”(第19版，热纳罗(A.R.Gennaro)，编辑，宾夕法尼亚州伊斯顿市马克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA)(1995))中描述了适当的赋形剂和与药物配制品相关的要求。药学上可接受的赋形剂的具体实例包括水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液和0.3％甘氨酸溶液。有利地，根据本发明的疫苗组合物可以包含0.4％盐水。

用于本发明方法的疫苗组合物可以任选地含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂及类似物，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇月桂酸酯、油酸三乙醇胺、人血清白蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸、L-精氨酸盐酸盐、蔗糖、D-海藻糖脱水物、山梨醇、三羟甲基甲胺和/或尿素。另外，疫苗组合物可以任选地包含药学上可接受的添加剂，包括例如，稀释剂、粘合剂、稳定剂、和防腐剂。优选的稳定剂描述于WO 2010/003670中。

如本领域技术人员所领会的，本发明的疫苗组合物被适当地配制成与预期的给予途径相兼容。合适的给予途径的实例包括例如肌内、经皮、皮下、鼻内、口服或皮内。有利地，给予途径是皮下。

本发明的疫苗组合物可以使用常规的皮下注射器或安全注射器(例如可从美国新泽西州富兰克林湖贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson Corporation(Franklin Lakes,NJ,USA))商购获得的那些)，或喷射注射器给予。对于皮内给予，可以使用Mantoux技术采用常规的皮下注射器，或者可以使用专业的皮内递送装置，例如BD Soluvia(TM)显微注射系统(美国新泽西州富兰克林湖贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson Corporation,Franklin Lakes,NJ,USA))。

给予的本发明的疫苗组合物的体积将取决于给予方法。在皮下注射的情况下，体积通常为0.1ml至1.0ml，优选约0.5ml。

根据一个实施例，本发明还提供了包含本发明的疫苗组合物以及所述疫苗组合物在用于保护人类受试者抵抗登革热疾病的方法中使用的说明书的试剂盒。该试剂盒可以包含处于单一四价剂型形式的所述疫苗组合物，或所述试剂盒可以包含处于两种二价剂型形式的所述疫苗组合物。该试剂盒可以包括在此考虑的任何疫苗组合物的至少一次剂量(典型地在注射器中)。根据一个实施例，该试剂盒可以包含如在此所述的任何疫苗组合物的多剂量配制品。该试剂盒进一步包括提及所述疫苗组合物用于预防登革热疾病的用途、或者所述疫苗用于防治登革热疾病的用途的传单。该传单可以进一步提及疫苗接种方案和待接种的人类受试者群体。

能以多种方式测量本发明的疫苗组合物在降低登革热疾病的可能性或严重性中的效能。例如，可以通过在给予至少一次剂量的所述疫苗组合物之后(例如在给予一次、两次或三次剂量的所述疫苗组合物之后)测量本发明的疫苗组合物在降低登革热疾病的可能性或严重性中的效能：

(i)由任何血清型的登革热病毒引起的登革热疾病病例的数目；

(ii)由任何血清型的登革热病毒引起的重症登革热病例的数目；

(iii)由任何血清型的登革热病毒引起的DHF病例的数目；和/或

(iv)由任何血清型的登革热病毒引起的登革热疾病的住院病例的数目；

在已经接受所述疫苗组合物的一组受试者中进行，并且将这些测量值与来自未接受所述疫苗组合物的受试者的对照组的等同测量值进行比较，其中两个所述组中的受试者都居住在登革热流行区域中。当与未接种的受试者的对照组相比时，在接种的受试者组中(i)至(iv)中任一项或多项的统计学上确定的减少表明根据本发明的疫苗组合物的效能。

也可以通过在给予至少一次剂量的所述疫苗组合物之后(例如在给予一次、两次或三次剂量的所述疫苗组合物之后)计算根据本发明的疫苗组合物在降低登革热疾病的严重性或可能性中的效能：

(i)发热的平均持续时间和/或强度；

(iii)由血细胞比容的变化定义的血浆渗漏的平均值；

(iii)血小板减少(血小板计数)的平均值；和/或

(iv)肝酶包括丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平的平均值；

在已经接受所述疫苗组合物并且已经发展病毒学确认的登革热疾病的受试者组中进行，并且将这些测量值与来自未接受所述疫苗组合物并且已经发展病毒学确认的登革热疾病的对照组的等同测量值进行比较。当与已经发展病毒学确认的登革热疾病的受试者的对照组相比时，在已经发展病毒学确认的登革热疾病的受试者的接种组中(i)至(iv)中任一项或多项的统计学显著的减少表明根据本发明的疫苗组合物在降低登革热疾病的严重性或可能性中的效能。

典型地，保护本发明抵抗登革热疾病的方法的效能为至少50％，优选至少60％，例如如通过实例1中所描述的方法测量的，(疫苗效能(VE)＝100*(1-ID_CYD/ID_对照)，其中ID是发病密度(即，患有病毒学确认的登革热的人类受试者的数量除以每组中处于风险中的人年数)。针对由血清3或4型引起的登革热疾病的保护方法的效能有利地为至少70％。

在此披露的核酸序列与其他核酸序列的比对可以通过本领域技术人员熟知的任何合适的序列比对方法来实现。例如，可以手动进行序列比对。更方便地，可以使用专业计算机程序来执行比对。例如，可以实现最佳序列比对，并且可以通过序列全局比对算法例如多序列比对(MSA)算法、Clustal W和ClustalΩ算法、或通过对数预测的多序列比较(MUSCLE)算法来确定百分比一致性(埃德加(Edgar RC)，核酸研究(Nucl.Acids Res.)(2004)，32(5)：1792)。这些算法可在欧洲生物信息学研究所(EBI，EuropeanBioinformatics Institute)网站http://www.ebi.ac.uk/services上获得。在这类算法具有用户定义的参数的情况下，应当使用默认参数。

应当理解的是，在此披露的本发明的各种特征和优选实施例可以组合在一起。

在这整个申请中，引用了各种参考文献。这些参考文献的披露内容通过引用并入本披露。

在以下实例中进一步举例说明本发明。然而，应当理解的是，本发明由权利要求书限定，并且这些实例仅通过说明本发明的方式给出，而不以任何方式构成其限制。

实例

实例1：

在拉丁美洲在9岁至16岁健康儿童和青少年中对四价CYD疫苗的研究

方法

研究设计和参与者

进行了四价CYD疫苗(包含病毒株CYD1、CYD2、CYD3和CYD4)对病毒学确认的登革热疾病的随机的、观察者盲的、安慰剂对照的、多中心III期效能试验。试验在以下登革热流行国家的地点进行：巴西、哥伦比亚、洪都拉斯、墨西哥和波多黎各。

该试验登记了20,875名基于病史和身体检查健康状况良好的9岁至16岁受试者。排除了具有可能干扰试验进行或完成，先天性或获得性免疫缺陷的慢性疾病的受试者，以及接受免疫抑制治疗或可能干扰试验进行或完成的其他禁止治疗或疫苗的受试者。

参与者以2:1随机分配以在第0、6和12个月接受三次剂量的CYD疫苗或对照产品。因此，13,917名受试者接受了CYD疫苗，并且6,958名受试者接受了NaCl安慰剂。还评估了来自每个国家的受试者的亚组的免疫原性，以使得能够产生关于免疫原性和基线登革热抗体水平的国家特异性数据。免疫原性亚组包括总共1944名受试者(在CYD疫苗组中为1,301名，并且在对照组中为643名)。

产物

如在WO 03/101397，盖伊(Guy)等人，人用疫苗(Hum.Vaccines)(2010)6(9)：696；盖伊(Guy)等人，疫苗(Vaccines)(2010)28：632；Guirakhoo等人，病毒学杂志(J.Virol.)(2000)74：5477；Guirakhoo等人，病毒学杂志(J.Virol.)(2001)75(16)：7290；Guirakhoo等人，病毒学杂志(J.Virol.)(2002年6月20日)298：146；以及Guirakhoo等人，病毒学杂志(J.Virol.)(2004)78(9)：4761中所描述的，在Vero细胞上制备并培养每种嵌合病毒。

疫苗作为冻干粉末(预先储存在2℃至8℃的温度下)存在，其用0.5mL的溶剂(0.4％NaCl)重构用于注射。重构后，每0.5mL剂量的疫苗包含5±1log₁₀CCID₅₀的活的、减毒的、嵌合的登革热血清1、2、3、4型病毒中的每一种和赋形剂(必需氨基酸、非必需氨基酸、L-精氨酸盐酸盐、蔗糖、D-海藻糖脱水物、山梨醇、三(羟甲基)甲胺和尿素)。对照产品为09％NaCl盐水安慰剂。所有产品皮下注射到上臂的三角肌区域。

评价

在研究的活跃期(在第3剂量之后D0至13个月，即25个月期间)的监测被设计为最大化对症状性、病毒学确认的登革热的检测，以便提供对CYD疫苗在预防症状性登革热(无论严重程度如何)中的效能的评价。预期第3剂量后12个月的监测导致足够数量的病毒学确认的登革热病例的检测，以允许效能的评价。在第3剂量后13个月的活跃期的延续基于在第3剂量后28天开始的这12个月的时期。在活跃期之后，该研究包括四年长期随访(LTFU)阶段，设计该阶段来了解登革热疫苗更长时期的安全性。

所有受试者参加至少5次定期访问。来自免疫原性亚组的受试者参加了另外7次访问。所有受试者以每周一次接触的初始最低频率定期接触(例如，电话、SMS、家访和基于学校的监测)。

在急性发热疾病的情况下(即，在至少连续2天体温≥38℃)，取两个血样以确认登革热病例。如果2次发作之间的间隔>14天，那么这两次连续发热发作被认为是单独的发作。一旦体温<38℃，就认为急性发热发作已结束。

在疾病的急性阶段尽快并且在发热发作的5天内采集第一血样。测试包括登革热IgM/IgG ELISA(来自美国加利福尼亚州的焦点诊断公司(Focus Diagnostics,California,US)的试剂盒“EL1500M”)、登革热NS1 ELISA Ag(试剂盒：来自法国马尔纳拉科屈埃特的伯乐公司(Bio-Rad,Marnes-la-Coquette,France)的“Platelia^TM登革热NS1Ag”)、登革热筛选(DS)RT-PCR、登革热血清型特异性RT-PCR(来自焦点诊断公司(FocusDiagnostics,California,US)的Simplexa^TM登革热RT-PCR)、血细胞比容、血小板计数、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)。登革热筛选(DS)RT-PCR是使用来自登革热病毒中保守的基因序列的引物进行的定量逆转录PCR。由于在每次运行中包括病毒标准品，结果可以表示为log¹⁰噬斑形成单位(PFU)/mL的浓度。登革热血清型特异性RT-PCR用于所有DS RT-PCR阳性或登革热NS1Ag ELISA阳性样品(用于血清型鉴定)。

在恢复期阶段(即，在急性样品后7天和14天之间)采集第二血样。测试包括登革热IgM/IgG ELISA，血细胞比容、血小板计数、AST和ALT。

如果样品对于DS RT-PCR是阳性的(即，≥定量下限[LLOQ])和/或NS1测定是阳性的和/或Simplexa登革热RT-PCR测定是阳性的，那么将其分类为病毒学确认的登革热感染。

在整个监测期间收集和评估所有严重不良事件(SAE)的信息。

使用CYD疫苗构建体的亲本登革热病毒株通过斑块减少中和测试(PRNT)来测量登革热中和抗体水平。该测定的定量限为10(1/dil)。PRNT测定数据用于免疫原性终点。

统计分析

主要目的是评估CYD登革热疫苗在0、6和12个月的3次接种之后在年龄为9岁至16岁的儿童和青少年中在包括的时间内预防由于四种血清型中任一种引起的症状性病毒学确认的登革热病例(不论严重性如何)的效能。符合方案(PP)群体包括根据方案接受3次剂量的所有参与者。在PP群体中确认的登革热病例是在第三次剂量后(即在第13个月)直到第25个月发生超过28天的病例。

效能分析包括在意向性治疗(ITT)群体中评价从D0至第25个月(即整个活跃期)的任何时间发生的针对病毒学确认的登革热的疫苗效能。ITT群体包括接受至少1次剂量的所有参与者。

统计方法是基于使用VE的双侧95％置信区间(CI)。使用由布雷斯洛(Breslow)和戴(Day)所描述的确切方法计算CI(布雷斯洛(Breslow NE)，戴(Day NE)，癌症研究中的统计方法。第II卷：群组研究的设计和分析(Statistical methods in cancerresearch.Volume II：The design and analysis of cohort studies)，牛津(英国)：牛津大学出版社(Oxford University Press)；1987)。如果95％CI的下限大于25％，那么认为CYD疫苗的效能是显著的。评估疫苗效能，考虑病例的数量(即具有一次或多次病毒学确认的登革热发作的参与者)和处于风险中的累积人时来计算每组中的发病密度(德兰(TranNH)、隆(Luong CQ)、乌(Vu TQH)等人，在健康的越南成年人和儿童中的重组的、减毒活四价登革热疫苗(CYD-TDV)的安全性和免疫原性(Safety and immunogenicity of recombinant，live attenuated tetravalent dengue vaccine(CYD-TDV)in healthy Vietnameseadults and children)，疫苗和疫苗接种杂志(J Vaccines Vaccin)2012；3：1-7)。

作为次要目的，根据每种登革热血清型，在病毒学确认的病例上评估VE。

根据病毒学确认的登革热病例的严重性(WHO标准和临床标准)执行类似的计算以评价VE估计。还研究了由于每种或任何血清型在活跃期期间发生的病毒学确认的住院的登革热病例。疑似登革热病例的血清学概况是基于IgG和IgM ELISA结果。

对于安全性和免疫原性终点的分析使用95％置信区间(CI)进行描述。使用在第一次注射之前、在第二次和第三次注射后的第28天以及第三次注射后1年对于每种血清型(亲本病毒株)的几何平均滴度(GMT)来评价免疫原性。

结果

在登记的20,875名受试者中，95.5％完成了完全免疫程序。在2年的活跃登革热监测期间有4.5％的退出率，从PP群体中排除了9.7％的受试者。疫苗组和对照组的年龄和性别相当，并且在基线处取样的几乎80％对于登革热的抗体是阳性的。

效能

在研究期间，在PP群体中鉴定了397例登革热病例(397次)的病毒学确认的登革热(完成了3次剂量)。所有这些发作在第三次剂量后超过28天并且在活跃期结束之前发生，并且包括在初步分析中。疫苗组中176例发生在处于风险中的11793人年数期间，然而对照组中221例发生在处于风险中的5809人年数期间。相应的疫苗效能为60.8％(95％CI：52.0-68.0)。

在活跃期期间在ITT组(接受至少1次剂量)中的总疫苗效能为64.7％(95％CI：58.7-69.8)。在ITT组中，疫苗组中277例发生在处于风险中的26883人年数期间，然而对照组中385例发生在处于风险中的13204人年数期间。因此，疫苗效能在ITT和PP群体中是一致的。

事后分析揭示了按血清型计的不同效能。在至少一次剂量(ITT群体)后针对四种血清型中每一种的效能在50.2％-80.9％的范围内。在三次剂量(PP群体)之后针对四种血清型中每一种的效能在42.3％-77.7％的范围内。因此，该试验已经证明对任何血清型具有统计学显著的效能(VE＝60.8％)以及对单独的每种血清型(包括血清2型)的确定效能。

关于PP和ITT组的这些发现在下表1和2中详细给出。

关于重症登革热的疫苗效能和在活跃期期间由登革热引起的住院的减少

在ITT群体中获得病毒学确认的登革热的那些受试者中，当与对照组相比时，在接种组中观察到针对由任何血清型引起的重症登革热病例的95.5％的疫苗效能。研究者考虑了关于所有病理学确认的登革热病例的严重性的以下潜在标准，以便确定病例是否考虑为严重：1)休克(在儿童或青少年中脉压≤20mmHg，或具有心动过速、脉搏微弱和灌注不良的低血压[≤90mmHg])；2)需要输血的出血；3)脑病，即意识不清或差的意识状态或不归因于单纯性热惊厥或局灶性神经学体征的抽搐。差的意识状态或意识不清必须由格拉斯哥昏迷量表(GCS)得分支持；4)肝脏损伤(AST>1000U/L或凝血酶原时间[PT]国际标准化比率[INR]>1.5)；5)肾脏功能损伤(血清肌酐≥1.5mg/dL)；6)由可用的胸部X射线(CXR)、超声心动图、心电图(ECG)或心脏酶支持的心肌炎、心包炎或临床心力衰竭。六个标准中的至少一个的出现足以导致重症登革热的诊断。此外，还尽力鉴定和记录任何现存的慢性并发症，例如不受控制的癫痫、慢性肝病、现有心脏病或急性并发症，例如急性肝炎。所有登革热病例都由独立数据监测委员会(IDMC，Independent Data Monitoring Committee)进行审查，以确保在登革热疾病背景下术语重的一致性应用。

关于由任何血清型和各个血清型各自引起的重症登革热(IDMC定义)(其显示特别是关于由血清2型引起的重症登革热的效能)的疫苗效能结果提供于下表3中：

表3：病毒学确认的重症登革热(活跃期，ITT群体)的疫苗效能

在获得病毒学确认的登革热的ITT群体中的那些受试者中，当与对照组相比时，在接种组中观察到归因于任何血清型的住院发生率的统计学显著的降低。对于每种单独的血清型，包括血清2型，也观察到这种确定的减少。至少一次剂量后关于所有登革热病例的相对风险(RR)为0.197(参见表4)。

表4：在活跃期(ITT)期间以血清型计的住院登革热病例

	疫苗组例数	对照组例数	相对风险(95％CI)
				血清1型	7	13	0.269(0.09；0.72)
血清2型	6	15	0.200(0.06；0.54)
				血清3型	3	9	0.166(0.03；0.67)
血清4型	1	6	0.083(0.00；0.69)
				所有登革热例数	17	43	0.197(0.11；0.35)

在活跃期期间按年龄组进行的效能估计

在活跃期期间ITT群体中9-11岁年龄组的疫苗效能为61.7％(95％CI：52.3-69.3)。疫苗组中在处于风险中的12172人年数期间发生150例和151次发作，然而对照组中在处于风险中的5967人年数期间发生192例和195次发作。

在活跃期期间ITT群体中12-16岁年龄组的疫苗效能为67.6％(95％CI：59.3-74.3)。疫苗组中在处于风险中的14711人年数期间发生127例和129次发作，然而对照组中在处于风险中的7237人年数期间发生193例和次发作。

每个国家的疫苗效力如下表所示。

表5：以国家计的疫苗效能(ITT群体，活跃期)

*在数字总计达不到100的情况下，这表明存在血清型未定的病例。

免疫原性

在疫苗组中，在第1剂量之前免疫原性亚组中针对登革血清型1-4的中和抗体的几何平均滴度(GMT)分别为128(95％CI：112–145)、138(123-156)、121(108-136)和43.6(39.6-48)。在对照组中，这些值分别为119(98.7-142)、115(97.2-136)、114(95.9-136)和39(33.9-44.7)。

在疫苗组中，在第三次注射后第28天免疫原性亚组中针对登革血清型1-4的中和抗体的几何平均滴度(GMT)分别为395(95％CI：353-441)、574(528-624)、508(465-555)和241(226-258)。在对照组中，这些值为121(101-145)、129(109；152)、124(105；147)和44.3(38.6；50.8)。

安全性

在活跃期的所有受试者(疫苗组中的13195和对照组中的6939)中，疫苗组中报告了4.1％(95％CI：3.7；4.4)严重不良事件(SAE)，并且对照组中报告了4.4％(4.0；4.9)SAE。没有疫苗相关的SAE或相关死亡并且没有重症登革热增加。来自活跃期的SAE评论没有安全问题。

讨论

这项研究的主要发现是，针对登革热病毒的所有四种血清型的安全、有效的疫苗是可能的。该研究显示在ITT和PP两个群体(活跃期)中针对任何血清型的具有统计学显著的疫苗效能，以及针对每种血清型的显示确定的效能。而且，疫苗效能在ITT和PP群体中是一致的。

这项研究因此第一次证明了针对血清2型，尤其是针对由血清2型特异性引起的重症登革热的确定的疫苗效能。这些结果必须根据先前的临床试验(其关于针对血清2型的CYD疫苗的效能是不确定的)来观察。

还证实，在获得病毒学确认的登革热的那些受试者中，当与对照组相比时，在接种组中观察到由于登革热引起的住院的统计学显著减少。关于任何血清型以及也关于每种单独的血清型(包括血清2型)看到这种减少(参见表4)。

该研究还显示，在基线处对至少一种血清型呈登革热血清阳性(即登革热免疫)的那些患者中观察到更高的疫苗效能的趋势(参见表6)，并且疫苗效能根据国家而不同(参见表5)。根据国家的变化可能特别是归因于每个国家中的群体的潜在登革热血清阳性状态和/或在每个国家中的传播的一个或多个病毒株的血清型。

从图2可以看出，在第3次剂量后12个月内没有观察到疫苗效能减弱的证据。将总体疫苗效能(针对任何血清型)显示为实线。

疫苗的安全性状况良好，在AE和SAE检查期间没有鉴定到疫苗相关的SAE和安全信号。在2年内没有观察到突破性感染的增强性疾病。

总之，本研究代表了登革热疫苗开发的一个重要里程碑。

实例2：

在亚洲在2岁至14岁年龄的健康儿童中对四价CYD疫苗的研究

方法

在亚太地区五个国家的10,275名2-14岁年龄的儿童中进行了多中心、随机、观察者掩蔽、安慰剂对照的III期试验。研究设计非常类似于实例1中描述的拉丁美洲试验，因为给予的疫苗(CYD1-4)、剂量和剂量方案以及效能和免疫原性分析都是相同的。试验的全部细节在Capeding等人(www.thelancet.com；发表在网站http://dx.doi.org/10.1016/ S0140-6736(14)61060-6上)中提供。

进一步分析了在基线处为登革热免疫的试验的免疫原性亚组中的受试者，以确定它们是单类型或多类型的登革热免疫(单类型的：Ab>＝10至1DENV或与其他3种相比具有至少6倍更高的反应的一种血清型；多类型的：至少2种血清型>＝10，并且在阳性血清型之间小于6倍的差异)。

结果

在探索性事后分析中，通过确定在每个亚组中病毒学确认的登革热的相对风险(RR)来研究登革热基线状态(无登革热、单类型登革热免疫或多类型登革热免疫)对疫苗效能(在免疫原性亚组中)的影响。结果在下表中表示。

表7：在亚组中登革热病例的基线状态的分布

	CYD	对照	RR**	95％CI
					无	23	18	0.646	(0.334，1.270)
单类型的	13	19	0.358	(0.162，0.764)
					多类型的	5	14	0.155	(0.044，0.456)

**相对风险

讨论

表7中的数据显示，与无登革热的受试者相比在单类型的登革热免疫的受试者中以及与单类型的登革热免疫相比在多类型登革热免疫的受试者中观察到更高的疫苗效能的趋势。

实例3：

实例1和2中报道的来自临床试验的数据的综合分析

在下面的实例中，已经合并来自在实例1和2中所述的拉丁美洲和亚洲III期临床试验的某些数据，以便增加分析的统计功效并且提供四价CYD疫苗的效能的更全面的图像。

关于任何血清型和关于每个试验的每种血清型，以及在两个试验中合并的每种血清型，针对病毒学确认的登革热(任何严重性的登革热)的第3剂量后疫苗效能(PP群体)在下表中示出：

表8：贯穿拉丁美洲和亚洲试验的疫苗效能的汇总数据(PP群体)

关于任何血清型和关于每个试验的每种血清型，以及在两个试验中合并的每种血清型，针对病毒学确认的登革热(任何严重性的登革热)的疫苗效能(ITT群体，活跃期)在下表中示出：

表9：贯穿拉丁美洲和亚洲试验的疫苗效能的汇总数据(ITT群体，活跃期)

在活跃期(任何血清型)期间针对重症登革热(IDMC定义)、DHF和导致住院的登革热病例的疫苗效能的类似的合并分析在下表中示出。显示了关于接受了至少一次剂量的群体(即ITT群体)的数据。关于PP群体的数据是一致的。

表10：针对重型登革热疾病的疫苗效能的贯穿拉丁美洲和亚洲试验的汇总数据(ITT群体，活跃期)

*＝将对于病毒学确认的登革热住院的相对风险(RR)计算为在疫苗组和对照组中每年的发病率之比，并且这里以疫苗效能(1-RR)提供。

基于来自两个临床试验的合并数据，通过将来自两个试验的病例数目加在一起并比较在疫苗组和对照组中的数目来估计针对每种血清型的重症登革热(IDMC定义)的疫苗效能(这种计算假定2比1的随机化和良好依从性试验方案)。数据在下表中示出。

表11：针对每种血清型的重症登革热疾病的疫苗效能的贯穿拉丁美洲和亚洲试验的汇总数据(ITT群体，活跃期)

	疫苗组例数	对照组例数	VE(95％CI)
				血清1型	6	12	75％(16.0；91.0)
血清2型	3	8	81.3％(21.9；96.8)
				血清3型	2	6	83％(24；98)
血清4型	2	6	83％(24；98)
				所有登革热例数	13	31	79.1％(60.0；89.0)

基于来自两个临床试验(活跃期，ITT分析)的合并数据的针对每种血清型的住院登革热的疫苗效能在下表中示出。

表12：针对每种血清型的住院的登革热疾病的疫苗效能的贯穿拉丁美洲和亚洲试验的汇总数据(ITT群体，活跃期)

	疫苗组例数	对照组例数	VE(95％CI)
				血清1型	22	39	72.1(82.9；83.4)
血清2型	20	29	65.7(39.3；80.6)
				血清3型	10	22	77.4(52.2；89.3)
血清4型	5	15	83.5(54.5；94.0)
				所有登革热例数	57	104	73.2(27.8；91.0)

对于在基线处的所有至少9岁年龄的试验受试者和对于相同年龄组(根据其基线登革热血清状态)，对于单独的和合并的试验数据集，针对由任何血清型引起的症状性病毒学确认的登革热的疫苗效能(活跃期，ITT分析)在下表中示出。

表13：在≥9岁年龄群体中以血清状态计的针对登革热疾病的疫苗效能的贯穿拉丁美洲和亚洲试验的汇总数据(ITT群体，活跃期)

*＝从免疫原性亚组中的患者产生的数据。

从表13可以看出，在综合分析中，在≥9岁年龄的血清阴性个体中95％置信区间的下限高于零。

对≥9岁年龄的个体(这个亚群中的所有患者)中的合并的疫苗效能数据的进一步分析证明了以下：针对血清1型的效能为58.4％(47.7；66.9)；针对血清2型的效能为47.1％(31.3；59.2)；针对血清3型的效能为73.6％(64.4；80.4)；针对血清4型的效能为83.2％(76.2；88.2)；针对住院的登革热的效能为80.8(70.1；87.7)；针对重(IDMC定义的)症登革热的效能为93.2(77.3；98.0)并且针对DHF的效能为92.9(96.1；97.9)。在每种情况下，括号中的数字代表95％置信区间，并且数据取自ITT群体。

在意向性治疗分析组(活跃期)中，对于单独的和合并的试验数据集，对于具有>1次由任何血清型引起的症状性病毒学确认的登革热发作的相对风险(RR)在下表中示出。

表14

表14中的数据显示，具有>1次由任何血清型引起的症状性病毒学确认的登革热发作的风险在疫苗组中更低，即在试验的活跃监测阶段期间的初始感染之后，与对照组相比在疫苗组中随后感染的风险降低。

实例4：

长期随访数据

在实例1和2中描述的试验具有四年的持续的长期随访(LTFU)阶段，以使用由任何血清型引起的任何严重性的VCD的住院发生率来进一步研究安全性。此外，涉及在实例1和2中描述的疫苗的进一步的试验中的参与者(涉及泰国的4,002名年龄在4-11岁的参与者的单中心IIb期试验，如Sabchareon等人，柳叶刀杂志(The Lancet)，第380卷：1559-1567(2012)，其具有与实例1和2中所述的试验的活跃期相似的设计)也具有四年LTFU期，以便进一步以与实例1和2中所述的试验相同的方式研究安全性。在每个试验中，LTFU期紧接着活跃期，即LTFU期的第1年在疫苗的第一次剂量后25个月开始。

在此提供的长期随访分析是基于在五个亚太国家(实例2)和五个拉丁美洲国家(实例1)进行的3期效能试验的4年LTFU期的第1年和在泰国的IIb期试验的4年LTFU期的前两年收集的数据。在LTFU期分析期间，试验的主办者对治疗分配是知情的。然而，所有参与者、他们的父母和现场工作人员保持不知情以便减少长期随访期间的任何偏见。

在LTFU期期间，所有参与者参加年度访问，在访问之间定期接触(每三个月≥1次接触，通过电话、SMS或家访)。在研究接触和访问期间，并且通过自我报告和鉴定的非研究医院的监测来记录急性发热的住院；取急性血样用于登革热感染的病毒学确认。年龄是指初始登记时的年龄。

目的是描述需要住院的由任何血清型引起的任何严重性的VCD的发生，以及在住院的那些患者中，活跃监测时期结束后四年内重症登革热(IDMC评估)和DHF(WHO 1997定义)的发生。

对于所有参与者和对于包括在内的年龄在<9岁和≥9岁的那些参与者，对于每个研究，计算在LTFU期期间每年发生的有任何血清型和每个血清型引起的住院的VCD病例(任何严重性，重症(IDMC)，DHF(WHO))的年发病率和95％CI。将RR计算为疫苗组和对照组中年发病率的比率。数据在下表中示出。

表15：在亚洲的3期试验(实例2)、在拉丁美洲的3期试验(实例1)和在泰国的2b期试验(活跃期和LTFU期)的安全性分析集中由任何血清型引起的任何严重性的病毒学确认的登革热导致的住院年发生率(％)。

M：在每年年初出席的参与者的数量或在考虑期内包括的年份期间随访的参与者的数量的平均值。*一位参与者在第1年和第3年有两次发作。#在长期随访期的第一年中鉴定的每种血清型(ST)的总数(疫苗组比对照组-随机化2:1)：Ph.3-亚洲：ST1：11比1；ST2：3比0；ST3：13比7，ST4：0比5；Ph.3-拉丁美洲：ST1：5比5；ST2：8比11；St3：3比0，ST4：0比0；Ph.2b-第1年：ST1：5比5；ST2：17比4；St3：1比1，ST4：0比0；Ph.2b-第2年：ST1：4比3；ST2：4比6；ST3：6比3，ST4：2比4。

贯穿所有三个研究，LTFU的第一年的合并RR为0.84(95％CI：0.56；1.24)。大多数病例是血清1型或血清2型；血清4型是最不频繁的。在3期亚洲试验中，预定年龄组的分析显示在更年幼的儿童中这种结果的RR更高的明确趋势，尽管病例数量较少(2-5岁年龄的受试者：RR＝7.45，95％CI：1.15；313.80)。这个观察结果导致了2b期泰国试验的年龄特异性分析，该年龄特异性分析显示在随访的第一年，年龄在4-5岁的那些的RR为2.44(95％CI：0.27；115.34)。在2b期泰国试验中LTFU的第二年，对于年龄在4-5岁的那些，RR为0.81，但95％CI的上限保持>1(95％CI：0.16；5.24)。在3期拉丁美洲试验(登记了年龄在9-16岁的参与者)中的进一步分析显示在年龄为9-11岁和12-16岁的年龄组之间没有趋势。在所有三项研究中，在低龄组和在CYD15的观察结果导致对年龄为<9岁和≥9岁的两个亚组的特设分析(ad hoc analysis)。

在两个亚洲研究的LTFU的第一年，对于<9岁的参与者的RR与为1.58(95％CI：0.83；3.02)的合并估计的RR相似，表明疫苗组风险增加的总体趋势，尽管95％CI的下限为<1。在3期亚洲试验中，年龄为≥9岁的那些的RR为0.57(95％CI：0.18；1.86)，并且在2b期泰国试验中为0.31(95％Ci：0.05；1.58)，与3期拉丁美洲试验的类似，其中所有参与者年龄为≥9岁(RR＝0.53，95％CI：0.25；1.16)。对于3期亚洲试验，探索性分析显示，在年龄为9-11岁的那些中，RR为1.01(95％CI：0.22；6.23)，相比之下在年龄为12-24岁的那些中为0.25(95％CI：0.02；1.74)。在CYD15和CYD57中未观察到这种趋势。贯穿所有三项研究中年龄为≥9岁的参与者的合并RR为0.50(95％CI：0.29；0.86)。

在2b期泰国试验的LTFU的第二年，年龄为≥9岁的参与者的RR(0.31，95％CI：0.09；0.93)与第一年的RR(0.31，95％CI：0.05；1.58)相似，然而<9岁(LTFU的第二年)的参与者的RR已经下降(0.54，95％CI：0.23；1.29)。

在3期亚洲和拉丁美洲试验的LTFU第1年IDMC分别将12例和8例住院的VCD病例分类为重症(亚洲试验中疫苗组和对照组分别为11/27和1/13，并且拉丁美洲试验中疫苗组和对照组分别为3/16和5/15)。在亚洲试验中，在年龄为<9岁的参与者中，疫苗组和安慰剂组分别为8/19和0/6例，而在年龄为≥9岁的那些中，疫苗组和安慰剂组分别为3/8和1/7例，这些参与者被IDMC分类为重症。三个亚洲试验疫苗组病例发生在登记时年龄为9-11岁的参加者中。所有病例都分类为I/II级DHF。

IDMC将泰国2b期试验的LTFU的第1年的4/22例住院的VCD分类为重症，全部都在疫苗组中。在泰国2b期试验的LTFU的第2年中，他们在疫苗组和对照组中分别将1/16例和2/17例分类为重症。所有重症病例都发生在年龄为<9岁的参与者中。在第1年的疫苗组中的两个病例被分类为III级DHF，并且两个都具有临床休克，然而其他是I/II级。

在所有三个试验中，住院时间以及发热和临床症状的持续时间都与在活跃监测和LTFU期期间住院的那些相类似(数据未显示)。在任何研究中，在活跃监测期和LTFU期之间或在疫苗组和对照组之间没有观察到由住院参与者提供的各种体征和症状的频率的临床上重要的差异，表明在LTFU期间在住院病例的临床图像没有变化。

讨论

在3期亚洲试验的LTFU期的第一年期间，尽管观察到病例数较少，但是对于住院VCD，RR位移至1.0。进一步的分析表明，这种位移是由于在更年幼的儿童中更高的RR，特别是在年龄为≤5岁的那些儿童，与年龄为≥9岁的参与者的RR相比。与对照组中的那些相比，在三个试验中LTFU的第一年的组合分析显示，疫苗组中年龄为≥9岁的参与者中的住院VCD的风险更低。然而，在泰国2b期试验中，对于第1年(1.01，95％CI：0.47；2.30)和第2年(0.47，95％CI：0.22；1.00)的RR的变异性表明来自CYD14和CYD15中LTFU的第一年的结果应谨慎解释。

表16：序列表

上面所列出的核苷酸序列构成所列出的登革热病毒的正链RNA(即在相应的病毒颗粒中发现的核苷酸序列)。等同的DNA序列(其可以用于操纵和表达相应的病毒，并且也形成本申请披露内容的一部分)可以通过用核苷酸T替换核苷酸U来产生。这样的DNA序列构成相应登革热病毒的cDNA序列。

序列表

<110> 赛诺菲巴斯德有限公司（Sanofi Pasteur）

<120> 疫苗组合物

<130> PM1403 EP-EPA

<160> 7

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1983

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYD1 prME

<400> 1

uuucaucuga ccacacgagg gggagagccg cauaugauag uuaccaagca ggaaagagga 60

aagucacuuu uguuuaagac cucagcuggu gucaacaugu gcacccuuau ugcgauggau 120

uugggagagu uaugugagga uacaaugacu uacaaauguc cucgaaucac ugaggcggaa 180

ccagaugacg uugauuguug gugcaaugcc acagacacau gggugaccua uggaacgugu 240

ucccaaacug gcgagcaccg acgagacaaa cguuccgucg cacuggcccc acacguggga 300

cuuggucuag aaacaagaac cgaaacgugg auguccucug aaggcgcuug gaaacaaaua 360

caaagagugg agacuugggc ccugagacac ccaggauuca cagugauagc ccuuuuucua 420

gcacaugcca uaggaacauc caucacccag aaagggauua uuuucauuuu guugaugcug 480

guaacaccau ccauggccau gcgaugugug ggaauaggca acagggacuu cguggaagga 540

cugucaggag caacgugggu agauguggua cuggaacaug gaaguugcgu caccaccaug 600

gcaaaagaua aaccaacauu ggacauugaa cucuugaaga cggaagucac aaacccugcc 660

guccuucgaa aacugugcau cgaagcuaaa auaucaaaca ccaccaccga uucaagaugc 720

ccaacacaag gagaagccac acugguggaa gagcaagacg cgaauuuugu gugucgacga 780

acguuugugg acagaggcug gggcaauggc ugugggcucu ucggaaaagg uagccuaaua 840

acgugugcua aguucaagug ugugacaaaa cuggaaggaa agauaguuca auaugaaaac 900

uugaaauauu caguaauagu caccguccac acuggagacc agcaccaggu gggaaaugaa 960

agcacagaac augggacaac agcaacuaua acaccucaag cucccacguc ggaaauacag 1020

cugaccgacu acggagcucu aacauuggau ugcucaccua gaacaggacu agacuucaau 1080

gaaauggugu uguugacaau gaaagaaaga ucauggcuag uccacaaaca augguuucua 1140

gaccuaccac ugccuuggac cucgggagcu acaacgucac aagagacuug gaacagacaa 1200

gauuugcugg uaacauuuaa gacagcucau gcaaagaagc aggaaguagu cguacuagga 1260

ucacaagaag gagcaaugca cacugcguug accggagcga cagaaaucca aacgucugga 1320

acgacaacaa uuuuugcagg acacuugaaa uguagacuaa aaauggacaa acugacucua 1380

aaagggaugu cauaugugau gugcacaggc ucauucaagc uagagaaaga gguggcugag 1440

acccagcaug gaaccguucu agugcagguu aaauacgaag gaacagaugc accaugcaag 1500

aucccuuuuu cgacccaaga ugaaaaagga guaacccaga augggagagu gauaacagcc 1560

aacccuauag ucacugacaa ggaaaaacca gucaacauug aggcagaacc accuuuuggu 1620

gagaguuaca ucgugguagg agcaggugaa aaagcuuuga aacuaagcug guucaagaaa 1680

ggaagcacca uagggaaaau guuugaggca acugcccgag gagcacgaag gauggccaua 1740

cugggagaca ccgcauggga cuuugguucu auaggaggag uguucacauc uguuggaaaa 1800

cuaguacacc agauuuuugg aacugcauau ggaguuuugu ucagcggugu uuccuggacc 1860

augaaaauag gaauaggggu ucugcugaca uggcuaggau uaaacucaag gagcacgucc 1920

cuuucgauga cgugcauugc aguuggccug guaacacugu accuaggagu caugguuggc 1980

gcc 1983

<210> 2

<211> 1983

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYD2 prME

<400> 2

uuccaucuaa ccacacguaa cggagaacca cacaugaucg ucaguagaca agagaaaggg 60

aaaagucuug uguuuaaaac agaggauggc gugaacaugu gcacccucau ggccauggac 120

cuuggugaau ugugugaaga cacaaucacg uacaaguguc cccuucucag gcagaaugag 180

ccagaagaca uagacugcug gugcaacucc acguccacgu ggguaaccua ugggacuugu 240

accaccacgg gagaacauag aagagaaaaa agaucagugg cacucguucc acauguggga 300

augggacugg agacgcgaac ugaaacaugg augucaucag aaggggcuug gaaacaugcc 360

cagagaauug aaauuuggau ccugagacau ccaggcuuca ccauaauggc agcaauccug 420

gcauacacca uagggacgac acauuuccag agagcacuga uuuucaucuu acugacagcu 480

gucgcuccuu caaugacaau gcguugcaua ggaauaucaa auagagacuu uguagaaggg 540

guuucaggag gaagcugggu ugacauaguc uuagaacaug gaagcugugu gacgacgaug 600

gcaaaaaaca aaccaacauu ggauuuugaa cugauaaaaa cagaagccaa acagccugcc 660

acccuaagga aguacuguau agaggcaaag cuaaccaaca caacaacaga aucucguugc 720

ccaacacaag gggaacccag ccuaaaugaa gagcaggaua aaagguucgu cugcaaacac 780

uccaugguag acagaggaug gggaaaugga uguggauuau uuggaaaggg aggcauugug 840

accugugcua uguucacaug caaaaagaac auggagggaa aaguugugca gccagaaaac 900

uuggaauaca ccauuguggu aacaccccac ucaggggaag agcaugcggu cggaaaugac 960

acaggaaaac auggcaagga aaucaaagua acaccacaga guuccaucac agaagcagaa 1020

uugacagguu auggcacugu cacgauggag ugcucuccga gaacaggccu cgacuucaau 1080

gagauggugu ugcugcagau ggaaaauaaa gcuuggcugg ugcauaggca augguuccua 1140

gaccugccgu uaccauggcu gcccggagcg gacacacaag ggucaaauug gauacaaaaa 1200

gaaacauugg ucacuuucaa aaauccucau gcgaagaaac aggauguuuu uguuuuagga 1260

ucccaagaag gggccaugca cacagcacuc acaggggcca cagaaaucca aaugucauca 1320

ggaaacuuac ucuucacagg acaucucaag ugcaggcuga gaauggacaa gcuacagcuc 1380

aaaggaaugu cauacucuau gugcacagga aaguuuaaag uugugaagga aauagcagaa 1440

acacaacaug gaacaauagu uaucagggug caguaugaag gggacggcuc uccauguaaa 1500

aucccuuuug agauaaugga uuuggaaaaa agacaugucu uaggucgccu gaucacaguc 1560

aacccaauug ugacagaaaa agauagccca gucaacauag aagcagaacc uccauucgga 1620

gacagcuaca ucaucauagg aguagagccg ggacaacuga agcucaacug guuuaagaaa 1680

ggaaguucua ucggccaaau guuugagaca acaaugaggg gggcgaagag aauggccauu 1740

uugggugaca cagccuggga uuuuggaucc cugggaggag uguuuacauc uauaggaaaa 1800

gcccuccacc aagucuuugg agcaaucuau ggagcugccu ucaguggggu cucauggacu 1860

augaaaaucc ucauaggagu cauuaucaca uggauaggaa ugaauucacg cagcaccuca 1920

cugucugugu cacuaguauu ggugggaguc gugacgcugu auuugggagu uauggugggc 1980

gcc 1983

<210> 3

<211> 1977

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYD3 prME

<400> 3

uuccacuuaa cuucacgaga uggagagccg cgcaugauug uggggaagaa ugaaagaggg 60

aaaucccuac uuuuuaagac agcuucugga aucaacaugu gcacacucau agccauggac 120

uugggagaga ugugugauga cacggucacu uacaaaugcc cccucauugc cgaaguggaa 180

ccugaagaca uugacugcug gugcaaccuu acaucgacau gggugacuua uggaacgugc 240

aaucaagcug gggagcauag acgcgacaag agaucagugg cguuagcucc ccaugucggc 300

augggacugg acacacgcac ccaaaccugg augucggcug aaggagcuug gagacaaguc 360

gagaagguag agacaugggc ucuuaggcac ccaggguuca ccauacuagc ucuauuucuu 420

gcucauuaca uaggcacuuc ccugacccag aaagugguua uuuuuauacu acuaaugcug 480

gucacuccau ccauggcaau gagaugcgug ggaguaggaa acagagauuu uguggaaggu 540

cugucgggag cuacgugggu ugauguggug cuggagcacg gugggugugu gaccaccaug 600

gcuaagaaca agccuacgcu ggacauagag cuucagaaga ccgaggccac ccaacuggcg 660

acccuucgaa aguuaugcau ugagggaaaa auuaccaaca uaacaacuga cucaaggugu 720

ccuacccagg gggaagcgau uuuaccugag gagcaggacc agaacuacgu auguaagcac 780

acauaugugg auagaggcug gggaaacggu ugugguuugu uuggaaaagg aagcuuggug 840

acaugcgcga aauuucaaug ucuagaauca auagagggaa aaguggugca acaugagaac 900

cucaaauaca cugucaucau uacagugcac acaggaaacc aacaccaggu gggaaaugac 960

acgcagggag ucacggcuga gauaacaccc caggcaucaa ccguugaagc caucuugccu 1020

gaauauggaa cccuugggcu agaaugcuca ccacggacag guuuggauuu caaugaaaug 1080

auuuuauuga caaugaaaaa caaagcaugg augguacaua ggcaaugguu cuuugaccua 1140

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cuugugacau ucaaaaaugc acaugcaaaa aagcaagaag uaguuguccu uggaucgcaa 1260

gagggagcaa ugcacacagc gcugacagga gcuacagaga uccaaaacuc aggagguaca 1320

agcauuuuug cggggcacuu gaaauguaga cuuaagaugg acaaauugga acucaagggg 1380

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guggugacca agaaggagga gccugucaac auugaggcug aaccuccuuu uggggaaagu 1620

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uuuucaugcg uugcgauagg aauuaucaca cucuaucugg gagccguggu acaggcc 1977

<210> 4

<211> 1983

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYD4 prME

<400> 4

uuucaccugu caacaagaga cggcgaaccc cucaugauag uggcaaaaca cgaaaggggg 60

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acccagagcg gagaacggag acgagagaag cgcucaguag cuuuaacacc acauucagga 300

augggauugg aaacaagagc ugagacaugg augucaucgg aaggggcuug gaaacaugcu 360

caaagaguag aaagcuggau acucagaaac ccaggauucg cgcucuuggc aggauuuaug 420

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gucgccccau ccuacggaau gcgaugcgua ggaguaggga acagagacuu uguggaagga 540

gucucgggug gagcaugggu cgaccuggug cuggaacaug gaggaugcgu cacaaccaug 600

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cuacuucgaa ccuauugcau ugaagccucg auaucaaaca uaaccacggc aacaagaugu 720

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cuugaauaua cagugguugu gacaguccac aauggagaca cccaugcagu aggaaaugac 960

acaucuaauc auggagugac agccacgaua acucccaggu caccaucggu agaaguuaaa 1020

uugccggacu auggagaacu aacacucgau ugugaaccca gguccggaau ugauuucaau 1080

gagaugauuc ugaugaaaau gaaaaagaaa acguggcuug ugcauaagca augguuuuug 1140

gaccuaccuc uaccauggac agcaggagca gacacaucag aaguccauug gaauuacaaa 1200

gagagaaugg ugacauucaa gguuccucau gccaagagac aggaugugac agugcuagga 1260

ucucaggagg gagcuaugca uucugcccuc gccggagcca cagaagugga uuccggugau 1320

ggaaaucaca uguuugcagg acaucucaag ugcaaagucc guauggagaa auugagaauu 1380

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guccccauag agauaagaga ugugaacaag gaaaaagugg uugggcgcau caucucaucu 1560

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gcc 1983

<210> 5

<211> 1983

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYD2V prME

<400> 5

uuccauuuaa ccacacgaaa uggagaacca cacaugaucg uuggcagaca agagaaaggg 60

aaaagccuuc uguuuaaaac agaggauggu gugaacaugu guacccucau ggccauugau 120

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cagagaauug aaacuuggau cuugagacau ccaggcuuua ccauaauggc agcaauccug 420

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guuucaggag gaagcugggu ugacauaguc uuagaacaug gaaguugugu gacgacaaug 600

gcaaaaaaua aaccaacacu ggauuuugaa cugauaaaaa cagaagccaa acaaccugcc 660

acucuaagga aguacuguau agaggcaaag cugaccaaua caacaacaga aucucguugc 720

ccaacacaag gggaacccag ucuaaaugaa gagcaggaca aaagguucgu cugcaaacac 780

uccaugguag acagaggaug gggaaaugga uguggauuau uuggaaaggg aggcauugug 840

accugugcua uguucacaug caaaaagaac auggaaggaa aaaucgugca accagaaaau 900

uuggaauaca ccaucgugau aacaccucac ucaggagaag agcacgcugu agguaaugac 960

acaggaaaac augguaagga aauuaaaaua acaccacaga guuccaucac agaagcagaa 1020

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gcu 1983

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<212> RNA

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<220>

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uucuaacagu uuuuuauuag agagcagauc ucugaugauc aaccaacgaa aaaagacggg 120

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aaacaugcua aacauaauga acaggaggaa aagauccgug accaugcucc uuaugcugcu 420

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ugcuuggaaa cagauacaaa aaguagagac uugggcucug agacauccag gauucacggu 840

gauagcccuu uuucuagcac augccauagg aacauccauc acccagaaag ggaucauuuu 900

cauuuugcug augcugguaa caccaucuau ggccaugcga ugcgugggaa uaggcaacag 960

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ggucacaaac ccugcaguuc ugcguaaauu gugcauugaa gcuaaaauau caaacaccac 1140

caccgauucg agauguccaa cacaaggaga agccacacug guggaagaac aagacgcgaa 1200

cuuugugugc cgacgaacgu ucguggacag aggcuggggc aauggcugug ggcuauucgg 1260

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agcucaauau gaaaaccuaa aauauucagu gauagucacc guccacacug gagaucagca 1380

ccagguggga aaugagacua cagaacaugg aacaacugca accauaacac cucaagcucc 1440

uacgucggaa auacagcuga ccgacuacgg aacccuuaca uuagauuguu caccuaggac 1500

agggcuagau uuuaacgaga ugguguugcu gacaaugaaa aagaaaucau ggcuugucca 1560

caaacagugg uuucuagacu uaccacugcc uuggaccucu ggggcuuuaa caucccaaga 1620

gacuuggaac agacaagauu uacuggucac auuuaagaca gcucaugcaa agaagcagga 1680

aguagucgua cuaggaucac aagaaggagc aaugcacacu gcgcugacug gagcgacaga 1740

aauccaaacg ucaggaacga caacaauuuu cgcaggacac cuaaaaugca gacuaaaaau 1800

ggacaaacua acuuuaaaag ggaugucaua ugugaugugc acaggcucau ucaaguuaga 1860

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caucgacggc ccaaacaccc cagaaugccc ugacaaucaa agagcaugga auauuuggga 2880

aguagaggac uauggauuug ggauuuucac gacaaacaua ugguugaaau ugcgugacuc 2940

cuacacccaa guaugugacc accggcugau gucagcugcc auuaaggaca gcaaggcagu 3000

ccaugcugac augggguacu ggauagaaag ugaaaagaac gagacaugga aguuggcgag 3060

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caacuacaga ccaggauauu ucacacaaac agcagggccg uggcaccuag gcaaguugga 3240

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aggaccaucu cucagaacca caacagucac aggaaagaua auccaugaau ggugcugcag 3360

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acaccagcua ugggcuacuc ugcuauccuu gacauuuauu aaaacaacuu uuucauugca 3960

cuaugcaugg aagacaaugg cuaugguacu gucaauugua ucucucuucc cuuuaugccu 4020

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caaugaagga auuauggcug uuggaauagu uaguauucua cuaaguucac uuuuaaaaaa 4200

ugaugugccg cuagccggcc cauuaauagc uggaggcaug cuaauagcau guuaugucau 4260

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uaccuucaag accccugaag gcgaaguugg agccauagcc uuagacuuua aaccuggcac 4920

aucuggaucu cccaucguaa acagagaggg aaaaauagua ggucuuuaug gaaauggagu 4980

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gcggacuaca ugggccuugu gugaauccau cacauuggcu acuggaccuc ugaccacucu 7440

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uuucaggggg aguuaucuag caggagcagg ucuggccuuc ucauuaauga aaucucuagg 7560

aggagguagg agaggcacgg gagcccaagg ggaaacacug ggagaaaaau ggaaaagaca 7620

acuaaaccaa cugagcaagu cagaauucaa uacuuacaag aggaguggga uuauggaggu 7680

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accugagaaa ugugacaccc uuuuguguga uauuggugag uccucuccga acccaacuau 8040

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auuuugcaua aaaauucuaa aucccuauau gccgagcgug guagaaacuc uggaacaaau 8160

gcaaagaaaa cauggaggaa ugcuagugcg aaacccacuc ucaagaaauu ccacccauga 8220

aauguacugg guuucaugug gaacaggaaa cauuguguca gcaguaaaca ugacaucuag 8280

aauguugcua aaucgguuca caauggcuca caggaagcca acauaugaaa gagacgugga 8340

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agccaggugg uuaugggguu uccuuucuag aaacaaaaaa cccagaauuu gcacaagaga 8760

ggaguuuaca agaaaaguua ggucaaacgc agcuauugga gcaguguucg uugaugaaaa 8820

ucaauggaac ucggcaaaag aagcagugga agacgaacgg uucugggaac uuguccacag 8880

agagagggag cuucauaaac aggggaaaug ugccacgugu gucuacaaua ugauggggaa 8940

gagagagaaa aaauuaggag aguucggaaa ggcaaaagga agucgugcaa uaugguacau 9000

gugguuggga gcacgcuucc uagaguuuga agcccuuggu uucaugaaug aagaucacug 9060

guucaguaga gagaauucac ucaguggagu ggaaggagaa ggacuccaca aacuuggaua 9120

cauacucaga gacauaucaa ggauuccagg ggggaacaug uaugcagaug acacagccgg 9180

augggacaca agaauaacag aggaugaucu ccagaaugag gcuaaaauca cugacaucau 9240

ggagcccgaa caugcccugc uggcuacguc aaucuuuaag cugaccuacc aaaauaaggu 9300

gguaagggug cagagaccag caaaaaaugg aaccgugaug gauguuauau ccagacguga 9360

ccagagaggc aguggacagg uuggaacuua uggcuuaaac acuuucacca acauggaggc 9420

ccaacugaua agacaaaugg agucugaggg aaucuuuuua cccagcgaau uggaaacccc 9480

aaaucuagcc ggaagaguuc ucgacugguu ggaaaaauau ggugucgaaa ggcugaaaag 9540

aauggcaauc agcggagaug acuguguggu gaaaccaauu gaugacaggu ucgcaacagc 9600

cuuaacagcu uugaaugaca ugggaaaagu aagaaaagac auaccacaau gggaaccuuc 9660

aaaaggaugg aaugauuggc aacaagugcc uuucuguuca caccacuucc accagcuaau 9720

uaugaaggau gggagggaga uaguggugcc augccgcaac caagaugaac uuguggggag 9780

ggccagagua ucacaaggcg ccggauggag ccugagagaa accgcaugcc uaggcaaguc 9840

auaugcacaa auguggcagc ugauguauuu ccacaggaga gaccugagac uggcggcuaa 9900

cgcuauuugu ucagccguuc caguugauug ggucccaacc agccgcacca ccuggucgau 9960

ccaugcccau caccaaugga ugacaacaga agacauguua ucaguaugga auagggucug 10020

gauagaggaa aacccaugga uggaggauaa gacucaugug uccaguuggg aagaaguucc 10080

auaccuagga aagagggaag aucaguggug uggaucccug auaggcuuaa cagcaagggc 10140

caccugggcc acuaauauac aaguggccau aaaccaagug agaaggcuca uugggaauga 10200

gaauuaucua gauuacauga caucaaugaa gagauucaag aaugagagug aucccgaagg 10260

ggcacucugg uaagucaaca cauucacaaa auaaaggaaa auaaaaaauc aaaugaggca 10320

agaagucagg ccagauuaag ccauaguacg guaagagcua ugcugccugu gagccccguc 10380

caaggacgua aaaugaaguc aggccgaaag ccacgguuug agcaagccgu gcugccugug 10440

gcuccaucgu ggggauguaa aaacccggga ggcugcaacc cauggaagcu guacgcaugg 10500

gguagcagac uagugguuag aggagacccc ucccaagaca caacgcagca gcggggccca 10560

acaccagggg aagcuguacc cuggugguaa ggacuagagg uuagaggaga ccccccgcgu 10620

aacaauaaac agcauauuga cgcugggaga gaccagagau ccugcugucu cuacagcauc 10680

auuccaggca cagaacgcca gaaaauggaa uggugcuguu gaaucaacag guucu 10735

<210> 7

<211> 10723

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VDV2

<400> 7

aguuguuagu cuacguggac cgacaaagac agauucuuug agggagcuaa gcucaaugua 60

guucuaacag uuuuuuaauu agagagcaga ucucugauga auaaccaacg gaaaaaggcg 120

aaaaacacgc cuuucaauau gcugaaacgc gagagaaacc gcgugucgac ugugcaacag 180

cugacaaaga gauucucacu uggaaugcug cagggacgag gaccauuaaa acuguucaug 240

gcccuggugg cguuccuucg uuuccuaaca aucccaccaa cagcagggau auugaagaga 300

uggggaacaa uuaaaaaauc aaaagcuauu aauguuuuga gaggguucag gaaagagauu 360

ggaaggaugc ugaacaucuu gaauaggaga cgcagaucug caggcaugau cauuaugcug 420

auuccaacag ugauggcguu ccauuuaacc acacguaacg gagaaccaca caugaucguc 480

agcagacaag agaaagggaa aagucuucug uuuaaaacag agguuggcgu gaacaugugu 540

acccucaugg ccauggaccu uggugaauug ugugaagaca caaucacgua caaguguccc 600

cuucucaggc agaaugagcc agaagacaua gacuguuggu gcaacucuac guccacgugg 660

guaacuuaug ggacguguac caccauggga gaacauagaa gagaaaaaag aucaguggca 720

cucguuccac augugcgaau gggacuggag acacgaacug aaacauggau gucaucagaa 780

ggggccugga aacaugucca gagaauugaa acuuggaucu ugagacaucc aggcuucacc 840

augauggcag caauccuggc auacaccaua ggaacgacac auuuccaaag agcccugauu 900

uucaucuuac ugacagcugu cacuccuuca augacaaugc guugcauagg aaugucaaau 960

agagacuuug uggaaggggu uucaggagga agcuggguug acauagucuu agaacaugga 1020

agcuguguga cgacgauggc aaaaaacaaa ccaacauugg auuuugaacu gauaaaaaca 1080

gaagccaaac agccugccac ccuaaggaag uacuguauag aggcaaagcu aaccaacaca 1140

acaacagaau cucgcugccc aacacaaggg gaacccagcc uaaaugaaga gcaggacaaa 1200

agguucgucu gcaaacacuc caugguagac agaggauggg gaaauggaug uggacuauuu 1260

ggaaagggag gcauugugac cugugcuaug uucagaugca aaaagaacau ggaaggaaaa 1320

guugugcaac cagaaaacuu ggaauacacc auugugauaa caccucacuc aggggaagag 1380

caugcagucg gaaaugacac aggaaaacau ggcaaggaaa ucaaaauaac accacagagu 1440

uccaucacag aagcagaauu gacagguuau ggcacuguca caauggagug cucuccaaga 1500

acgggccucg acuucaauga gaugguguug cugcagaugg aaaauaaagc uuggcuggug 1560

cacaggcaau gguuccuaga ccugccguua ccaugguugc ccggagcgga cacacaagag 1620

ucaaauugga uacagaagga gacauugguc acuuucaaaa auccccaugc gaagaaacag 1680

gauguuguug uuuuaggauc ccaagaaggg gccaugcaca cagcacuuac aggggccaca 1740

gaaauccaaa ugucaucagg aaacuuacuc uucacaggac aucucaagug caggcugaga 1800

auggacaagc uacagcucaa aggaauguca uacucuaugu gcacaggaaa guuuaaaguu 1860

gugaaggaaa uagcagaaac acaacaugga acaauaguua ucagagugca auaugaaggg 1920

gacggcucuc caugcaagau cccuuuugag auaauggauu uggaaaaaag acaugucuua 1980

ggucgccuga uuacagucaa cccaauugug acagaaaaag auagcccagu caacauagaa 2040

gcagaaccuc cauuuggaga cagcuacauc aucauaggag uagagccggg acaacugaag 2100

cucaacuggu uuaagaaagg aaguucuauc ggccaaaugu uugagacaac aaugaggggg 2160

gcgaagagaa uggccauuuu aggugacaca gccugggauu uuggauccuu gggaggagug 2220

uuuacaucua uaggaaaggc ucuccaccaa gucuuuggag caaucuaugg agcugccuuc 2280

agugggguuu cauggacuau gaaaauccuc auaggaguca uuaucacaug gauaggaaug 2340

aauucacgca gcaccucacu gucugugaca cuaguauugg ugggaauugu gacacuguau 2400

uugggaguca uggugcaggc cgauaguggu ugcguuguga gcuggaaaaa caaagaacug 2460

aaauguggca gugggauuuu caucacagac aacgugcaca cauggacaga acaauacaaa 2520

uuccaaccag aauccccuuc aaaacuagcu ucagcuaucc agaaagccca ugaagaggac 2580

auuuguggaa uccgcucagu aacaagacug gagaaucuga uguggaaaca aauaacacca 2640

gaauugaauc acauucuauc agaaaaugag gugaaguuaa cuauuaugac aggagacauc 2700

aaaggaauca ugcaggcagg aaaacgaucu cugcggccuc agcccacuga gcugaaguau 2760

ucauggaaaa cauggggcaa agcaaaaaug cucucuacag agucucauaa ccagaccuuu 2820

cucauugaug gccccgaaac agcagaaugc cccaacacaa auagagcuug gaauucguug 2880

gaaguugaag acuauggcuu uggaguauuc accaccaaua uauggcuaaa auugaaagaa 2940

aaacaggaug uauucugcga cucaaaacuc augucagcgg ccauaaaaga caacagagcc 3000

guccaugccg auauggguua uuggauagaa agugcacuca augacacaug gaagauagag 3060

aaagccucuu ucauugaagu uaaaaacugc cacuggccaa aaucacacac ccucuggagc 3120

aauggagugc uagaaaguga gaugauaauu ccaaagaauc ucgcuggacc agugucucaa 3180

cacaacuaua gaccaggcua ccauacacaa auaacaggac cauggcaucu agguaagcuu 3240

gagauggacu uugauuucug ugauggaaca acagugguag ugacugagga cugcggaaau 3300

agaggacccu cuuugagaac aaccacugcc ucuggaaaac ucauaacaga auggugcugc 3360

cgaucuugca cauuaccacc gcuaagauac agaggugagg augggugcug guacgggaug 3420

gaaaucagac cauugaagga gaaagaagag aauuugguca acuccuuggu cacagcugga 3480

caugggcagg ucgacaacuu uucacuagga gucuugggaa uggcauuguu ccuggaggaa 3540

augcuuagga cccgaguagg aacgaaacau gcaauacuac uaguugcagu uucuuuugug 3600

acauugauca cagggaacau guccuuuaga gaccugggaa gagugauggu uaugguaggc 3660

gccacuauga cggaugacau agguaugggc gugacuuauc uugcccuacu agcagccuuc 3720

aaagucagac caacuuuugc agcuggacua cucuugagaa agcugaccuc caaggaauug 3780

augaugacua cuauaggaau uguacuccuc ucccagagca ccauaccaga gaccauucuu 3840

gaguugacug augcguuagc cuuaggcaug augguccuca aaauggugag aaauauggaa 3900

aaguaucaau uggcagugac uaucauggcu aucuugugcg ucccaaacgc agugauauua 3960

caaaacgcau ggaaagugag uugcacaaua uuggcagugg uguccguuuc cccacuguuc 4020

uuaacauccu cacagcaaaa aacagauugg auaccauuag cauugacgau caaaggucuc 4080

aauccaacag cuauuuuucu aacaacccuc ucaagaacca gcaagaaaag gagcuggcca 4140

uuaaaugagg cuaucauggc agucgggaug gugagcauuu uagccaguuc ucuccuaaaa 4200

aaugauauuc ccaugacagg accauuagug gcuggagggc uccucacugu gugcuacgug 4260

cucacuggac gaucggccga uuuggaacug gagagagcag ccgaugucaa augggaagac 4320

caggcagaga uaucaggaag caguccaauc cugucaauaa caauaucaga agaugguagc 4380

augucgauaa aaaaugaaga ggaagaacaa acacugacca uacucauuag aacaggauug 4440

cuggugaucu caggacuuuu uccuguauca auaccaauca cggcagcagc augguaccug 4500

ugggaaguga agaaacaacg ggccggagua uugugggaug uuccuucacc cccacccaug 4560

ggaaaggcug aacuggaaga uggagccuau agaauuaagc aaaaagggau ucuuggauau 4620

ucccagaucg gagccggagu uuacaaagaa ggaacauucc auacaaugug gcaugucaca 4680

cguggcgcug uucuaaugca uaaaggaaag aggauugaac caacaugggc ggacgucaag 4740

aaagaccuaa uaucauaugg aggaggcugg aaguuagaag gagaauggaa ggaaggagaa 4800

gaaguccagg uauuggcacu ggagccugga aaaaauccaa gagccgucca aacgaaaccu 4860

ggucuuuuca aaaccaacgc cggaacaaua ggugcuguau cucuggacuu uucuccugga 4920

acgucaggau cuccaauuau cgacaaaaaa ggaaaaguug ugggucuuua ugguaauggu 4980

guuguuacaa ggaguggagc auaugugagu gcuauagccc agacugaaaa aagcauugaa 5040

gacaacccag agaucgaaga ucacauuuuc cgaaagagaa gacugaccau cauggaccuc 5100

cacccaggag cgggaaagac gaagagauac cuuccggcca uagucagaga agcuauaaaa 5160

cgggguuuga gaacauuaau cuuggccccc acuagaguug uggcagcuga aauggaggaa 5220

gcccuuagag gacuuccaau aagauaccag accccagcca ucagagcuga gcacaccggg 5280

cgggagauug uggaccuaau gugucaugcc acauuuacca ugaggcugcu aucaccaguu 5340

agagugccaa acuacaaccu gauuaucaug gacgaagccc auuucacaga cccagcaagu 5400

auagcagcua gaggauacau cucaacucga guggagaugg gugaggcagc ugggauuuuu 5460

augacagcca cucccccggg aagcagagac ccauuuccuc agagcaaugc accaaucaua 5520

gaugaagaaa gagaaauccc ugaacgcucg uggaauuccg gacaugaaug ggucacggau 5580

uuuaaaggga agacuguuug guucguucca aguauaaaag caggaaauga uauagcagcu 5640

ugccugagga aaaauggaaa gaaagugaua caacucagua ggaagaccuu ugauucugag 5700

uaugucaaga cuagaaccaa ugauugggac uucgugguua caacugacau uucagaaaug 5760

ggugccaauu ucaaggcuga gaggguuaua gaccccagac gcugcaugaa accagucaua 5820

cuaacagaug gugaagagcg ggugauucug gcaggaccua ugccagugac ccacucuagu 5880

gcagcacaaa gaagagggag aauaggaaga aauccaaaaa augagaauga ccaguacaua 5940

uacauggggg aaccucugga aaaugaugaa gacugugcac acuggaaaga agcuaaaaug 6000

cuccuagaua acaucaacac gccagaagga aucauuccua gcauguucga accagagcgu 6060

gaaaaggugg augccauuga uggcgaauac cgcuugagag gagaagcaag gaaaaccuuu 6120

guagacuuaa ugagaagagg agaccuacca gucugguugg ccuacagagu ggcagcugaa 6180

ggcaucaacu acgcagacag aagguggugu uuugauggag ucaagaacaa ccaaauccua 6240

gaagaaaacg uggaaguuga aaucuggaca aaagaagggg aaaggaagaa auugaaaccc 6300

agaugguugg augcuaggau cuauucugac ccacuggcgc uaaaagaauu uaaggaauuu 6360

gcagccggaa gaaagucucu gacccugaac cuaaucacag aaauggguag gcucccaacc 6420

uucaugacuc agaaggcaag agacgcacug gacaacuuag cagugcugca cacggcugag 6480

gcagguggaa gggcguacaa ccaugcucuc agugaacugc cggagacccu ggagacauug 6540

cuuuuacuga cacuucuggc uacagucacg ggagggaucu uuuuauucuu gaugagcgca 6600

aggggcauag ggaagaugac ccugggaaug ugcugcauaa ucacggcuag cauccuccua 6660

ugguacgcac aaauacagcc acacuggaua gcagcuucaa uaauacugga guuuuuucuc 6720

auaguuuugc uuauuccaga accugaaaaa cagagaacac cccaagacaa ccaacugacc 6780

uacguuguca uagccauccu cacaguggug gccgcaacca uggcaaacga gauggguuuc 6840

cuagaaaaaa cgaagaaaga ucucggauug ggaagcauug caacccagca acccgagagc 6900

aacauccugg acauagaucu acguccugca ucagcaugga cgcuguaugc cguggccaca 6960

acauuuguua caccaauguu gagacauagc auugaaaauu ccucagugaa ugugucccua 7020

acagcuauag ccaaccaagc cacaguguua augggucucg ggaaaggaug gccauuguca 7080

aagauggaca ucggaguucc ccuucucgcc auuggaugcu acucacaagu caaccccaua 7140

acucucacag cagcucuuuu cuuauuggua gcacauuaug ccaucauagg gccaggacuc 7200

caagcaaaag caaccagaga agcucagaaa agagcagcgg cgggcaucau gaaaaaccca 7260

acugucgaug gaauaacagu gauugaccua gauccaauac cuuaugaucc aaaguuugaa 7320

aagcaguugg gacaaguaau gcuccuaguc cucugcguga cucaaguauu gaugaugagg 7380

acuacauggg cucuguguga ggcuuuaacc uuagcuaccg ggcccaucuc cacauugugg 7440

gaaggaaauc cagggagguu uuggaacacu accauugcgg ugucaauggc uaacauuuuu 7500

agagggaguu acuuggccgg agcuggacuu cucuuuucua uuaugaagaa cacaaccaac 7560

acaagaaggg gaacuggcaa cauaggagag acgcuuggag agaaauggaa aagccgauug 7620

aacgcauugg gaaaaaguga auuccagauc uacaagaaaa guggaaucca ggaaguggau 7680

agaaccuuag caaaagaagg cauuaaaaga ggagaaacgg accaucacgc ugugucgcga 7740

ggcucagcaa aacugagaug guucguugag agaaacaugg ucacaccaga agggaaagua 7800

guggaccucg guuguggcag aggaggcugg ucauacuauu guggaggacu aaagaaugua 7860

agagaaguca aaggccuaac aaaaggagga ccaggacacg aagaacccau ccccauguca 7920

acauaugggu ggaaucuagu gcgucuucaa aguggaguug acguuuucuu caucccgcca 7980

gaaaagugug acacauuauu gugugacaua ggggagucau caccaaaucc cacaguggaa 8040

gcaggacgaa cacucagagu ccuuaacuua guagaaaauu gguugaacaa caacacucaa 8100

uuuugcauaa agguucucaa cccauauaug cccucaguca uagaaaaaau ggaagcacua 8160

caaaggaaau auggaggagc cuuagugagg aauccacucu cacgaaacuc cacacaugag 8220

auguacuggg uauccaaugc uuccgggaac auagugucau cagugaacau gauuucaagg 8280

auguugauca acagauuuac aaugagauac aagaaagcca cuuacgagcc ggauguugac 8340

cucggaagcg gaacccguaa caucgggauu gaaagugaga uaccaaaccu agauauaauu 8400

gggaaaagaa uagaaaaaau aaagcaagag caugaaacau cauggcacua ugaccaagac 8460

cacccauaca aaacgugggc auaccauggu agcuaugaaa caaaacagac uggaucagca 8520

ucauccaugg ucaacggagu ggucaggcug cugacaaaac cuugggacgu uguccccaug 8580

gugacacaga uggcaaugac agacacgacu ccauuuggac aacagcgcgu uuuuaaagag 8640

aaaguggaca cgagaaccca agaaccgaaa gaaggcacga agaaacuaau gaaaauaaca 8700

gcagaguggc uuuggaaaga auuagggaag aaaaagacac ccaggaugug caccagagaa 8760

gaauucacaa gaaaggugag aagcaaugca gccuuggggg ccauauucac ugaugagaac 8820

aaguggaagu cggcacguga ggcuguugaa gauaguaggu uuugggagcu gguugacaag 8880

gaaaggaauc uccaucuuga aggaaagugu gaaacaugug uguacaacau gaugggaaaa 8940

agagagaaga agcuagggga auucggcaag gcaaaaggca gcagagccau augguacaug 9000

uggcuuggag cacgcuucuu agaguuugaa gcccuaggau ucuuaaauga agaucacugg 9060

uucuccagag agaacucccu gaguggagug gaaggagaag ggcugcacaa gcuagguuac 9120

auucuaagag acgugagcaa gaaagaggga ggagcaaugu augccgauga caccgcagga 9180

ugggauacaa aaaucacacu agaagaccua aaaaaugaag agaugguaac aaaccacaug 9240

gaaggagaac acaagaaacu agccgaggcc auuuucaaac uaacguacca aaacaaggug 9300

gugcgugugc aaagaccaac accaagaggc acaguaaugg acaucauauc gagaagagac 9360

caaagaggua guggacaagu uggcaccuau ggacucaaua cuuucaccaa uauggaagcc 9420

caacuaauca gacagaugga gggagaagga gucuuuaaaa gcauucagca ccuaacaauc 9480

acagaagaaa ucgcugugca aaacugguua gcaagagugg ggcgcgaaag guuaucaaga 9540

auggccauca guggagauga uuguguugug aaaccuuuag augacagguu cgcaagcgcu 9600

uuaacagcuc uaaaugacau gggaaagauu aggaaagaca uacaacaaug ggaaccuuca 9660

agaggaugga augauuggac acaagugccc uucuguucac accauuucca ugaguuaauc 9720

augaaagacg gucgcguacu cguuguucca uguagaaacc aagaugaacu gauuggcaga 9780

gcccgaaucu cccaaggagc aggguggucu uugcgggaga cggccuguuu ggggaagucu 9840

uacgcccaaa uguggagcuu gauguacuuc cacagacgcg accucaggcu ggcggcaaau 9900

gcuauuugcu cggcaguacc aucacauugg guuccaacaa gucgaacaac cugguccaua 9960

caugcuaaac augaauggau gacaacggaa gacaugcuga cagucuggaa cagggugugg 10020

auucaagaaa acccauggau ggaagacaaa acuccagugg aaacauggga ggaaauccca 10080

uacuugggga aaagagaaga ccaauggugc ggcucauuga uuggguuaac aagcagggcc 10140

accugggcaa agaacaucca agcagcaaua aaucaaguua gaucccuuau aggcaaugaa 10200

gaauacacag auuacaugcc auccaugaaa agauucagaa gagaagagga agaagcagga 10260

guucuguggu agaaagcaaa acuaacauga aacaaggcua gaagucaggu cggauuaagc 10320

cauaguacgg aaaaaacuau gcuaccugug agccccgucc aaggacguua aaagaaguca 10380

ggccaucaua aaugccauag cuugaguaaa cuaugcagcc uguagcucca ccugagaagg 10440

uguaaaaaau ccgggaggcc acaaaccaug gaagcuguac gcauggcgua guggacuagc 10500

gguuagggga gaccccuccc uuacaaaucg cagcaacaau gggggcccaa ggcgagauga 10560

agcuguaguc ucgcuggaag gacuagaggu uagaggagac ccccccgaaa caaaaaacag 10620

cauauugacg cugggaaaga ccagagaucc ugcugucucc ucagcaucau uccaggcaca 10680

gaacgccaga aaauggaaug gugcuguuga aucaacaggu ucu 10723

Claims (32)

1.一种疫苗组合物，用于在保护人类受试者抵抗由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病的方法中使用，其中所述组合物包括：

(i)血清1至4型中每一种的登革热抗原，其中所述血清1至4型登革热抗原各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：

(a)减毒活登革热病毒；和

(b)嵌合的减毒活登革热病毒；

或者

(ii)能够在所述人类受试者中表达血清1至4型中每一种的登革热抗原的一个或多个核酸构建体，其中所述登革热抗原是登革热VLP。

2.一种组合物，用于根据权利要求1所述的而使用，其中所述登革热疾病是重症登革热疾病。

3.一种组合物，用于根据权利要求1或权利要求2所述的而使用，其中所述方法导致归因于所述登革热疾病的住院的发生率或可能性降低。

4.一种组合物，用于在如权利要求1所述的方法中使用，其中所述方法还保护所述人类受试者抵抗由血清1型登革热病毒引起的登革热疾病、由血清3型登革热病毒引起的登革热疾病和由血清4型登革热病毒引起的登革热疾病。

5.一种组合物，用于在如权利要求4所述的方法中使用，其中所述由血清1型登革热病毒引起的登革热疾病是重症登革热疾病，所述由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病是重症登革热疾病，所述由血清3型登革热病毒引起的登革热疾病是重症登革热疾病，并且所述由血清4型登革热病毒引起的登革热疾病是重症登革热疾病。

6.一种组合物，用于根据权利要求4所述的而使用，其中所述方法导致归因于由血清1型登革热病毒引起的登革热疾病、由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病、由血清3型登革热病毒引起的登革热疾病和由血清4型登革热病毒引起的登革热疾病而住院的发生率或可能性降低。

7.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述人类受试者是登革热免疫的。

8.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述受试者年龄在2岁至60岁之间。

9.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述受试者年龄在6岁至60岁之间。

10.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述受试者年龄为至少9岁。

11.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述受试者年龄为至少12岁。

12.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述受试者年龄在9岁至60岁之间。

13.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述受试者年龄在12岁至60岁之间。

14.一种组合物，用于根据权利要求1至8中任一项所述的而使用，其中所述受试者年龄在2岁至16岁之间。

15.一种组合物，用于根据权利要求1至9中任一项所述的而使用，其中所述受试者年龄在6岁至16岁之间。

16.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述受试者年龄在9岁至16岁之间。

17.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述组合物包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，这些抗原各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：(a)减毒活登革热病毒和(b)嵌合的减毒活登革热病毒。

18.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述组合物包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，并且其中所述血清1、3和4型登革热抗原各自是嵌合的减毒活登革热病毒，并且所述血清2型登革热抗原选自下组，该组由以下各项组成：减毒活登革热病毒和嵌合的减毒活登革热病毒。

19.一种组合物，用于根据权利要求1至17中任一项所述的而使用，其中所述组合物包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，并且其中所述血清1、3和4型登革热抗原各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：(a)减毒活登革热病毒和(b)嵌合的减毒活登革热病毒，并且所述血清2型登革热抗原是嵌合的减毒活登革热病毒。

20.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述组合物包含血清1至4型中每一种的登革热抗原，并且其中所述登革热抗原中的每一种是嵌合的减毒活登革热病毒。

21.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述嵌合的减毒活登革热病毒包含来自登革热病毒的一种或多种蛋白质和来自不同黄病毒的一种或多种蛋白质。

22.一种组合物，用于根据权利要求21所述的而使用，其中该不同的黄病毒是减毒的黄热病病毒。

23.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中该嵌合的减毒活登革热病毒包含黄热病病毒基因组，该黄热病病毒基因组的prM-E序列已经被登革热病毒的prM-E序列取代。

24.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述受试者是黄热病免疫的。

25.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述受试者居住在登革热流行地区。

26.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述方法包括以三次或更多次剂量给予所述组合物。

27.一种组合物，用于根据权利要求1所述的而使用，其中所述方法导致由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病的发生率或可能性降低。

28.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述由血清2型登革热病毒引起的登革热疾病是由具有美洲、亚洲/美洲、或世界性基因型的血清2型登革热病毒引起的登革热疾病。

29.一种组合物，用于根据任何前述权利要求所述的而使用，其中所述组合物进一步包括药学上可接受的载体或赋形剂。

30.一种组合物，用于在根据权利要求1至10和17至29中任一项所述的而进行保护的方法中使用，其中所述进行保护的方法被定义为在生活在流行地区的年龄为9岁直至60岁的个体中预防由登革热病毒血清1、2、3和4型引起的登革热疾病。

31.一种组合物，用于在根据权利要求1至10和17至29中任一项所述的而进行保护的方法中使用，其中所述进行保护的方法被定义为在生活在流行地区的年龄为12岁直至60岁的个体中预防由登革热病毒血清1、2、3和4型引起的登革热疾病。

32.一种组合物，用于在根据任何前述权利要求所述的而进行保护的方法中使用，其中所述进行保护的方法导致归因于由任何血清型引起的重复症状性病毒学确认的登革热病例的发生率或可能性的统计学上显著的降低，例如对被定义为归因于不同血清型的、发生在相距超过14天的≥2次登革热发作的重复症状性病毒学确认的登革热病例进行预防。