CN104812407A - 疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于保护人类受试者免于登革热病的方法中的疫苗组合物。

Description

疫苗组合物
发明领域
本发明涉及疫苗组合物和所述组合物在保护人类受试者免于登革热病的方法中的用途。
发明背景
登革热是继疟疾之后的第二最重要的感染性热带病，世界人口中大约有一半生活在有流行病传播风险的地区。估计每年有5千万-1亿例登革热病，导致500,000名患者因登革出血热(DHF)住院，并导致约25,000例死亡。
登革热病感染流行于100多个热带国家，这些国家中有60个已证实有登革出血热(DHF) (Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology, 10: 100-103)。
登革热病是由黄病毒属的4种在抗原上截然不同但密切相关的登革热病毒血清型引起的(Gubler等, 1988, 载于: Epidemiology of arthropod-borne viral disease. Monath TPM编辑, Boca Raton (FL): CRC Press: 223-60；Kautner等, 1997, J. of Pediatrics, 131: 516-524；Rigau-Perez等, 1998, Lancet, 352: 971-977；Vaughn等, 1997, J. Infect. Dis., 176: 322-30)。
登革热病通常通过被登革热病毒感染的埃及伊蚊(Aedes aegypti)吸血时注入该病毒而传播。在4-10天的潜伏期后，疾病突然开始，并接着以下3个阶段：发热(2-7天)、危急(24-48小时—期间可能出现严重的并发症)和恢复(48-72小时)。在危急期，可能出现危及生命的并发症，例如出血、休克和急性器官损害。适当管理这些不可预测的结局可降低病死率。在7-10天之后完成登革热的医治，但是长期虚弱是正常的。通常观察到白细胞和血小板数减少。
登革出血热(DHF)是登革热病毒感染的潜在致死并发症。除有极度嗜睡和困倦以外，DHF的特征还在于高烧和登革热病的症状。血管通透性增加和稳态异常可导致血容量降低、低血压，以及在严重情况下低血容量性休克和内出血。两个因素在DHF的发生中似乎起主要作用—快速病毒复制伴高水平的病毒血症(该病的严重程度与病毒血症水平有关；Vaughn等, 2000, J. Inf. Dis., 181: 2-9)和主要炎性反应伴高水平炎性介质释放(Rothman和Ennis, 1999, Virology, 257: 1-6；Alan L. Rothman. 2011, Nature Reviews Immunology, 11: 532-543)。在无治疗的情况下，DHF的死亡率可达10%，但在可获得治疗的大多数中心区，死亡率< 1%。
登革热休克综合征(DSS)是DHF的常见进展，并且常常是致死的。DSS产生于导致血浆渗漏进入血管外腔隙的泛发性血管炎。DSS的特征是脉量快且差、低血压、四肢发冷和烦燥。
在亚洲，主要在儿童中观察到DHF和DSS，患有DHF儿童中约90%小于15岁(Malavige等, 2004, Postgrad Med. J., 80: 588-601；Meulen等, 2000, Trop. Med. Int. Health, 5:325-9)。相比之下，在加勒比海和中美洲的爆发主要累及成人(Malavige等, 2004, Postgrad Med. J., 80: 588-601)。
登革热病毒的4种血清型具有约60-80%序列同源性。被一种登革热血清型感染提供持久的同源免疫但有限的异源免疫(Sabin, 1952, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1: 30-50)。因此，被一种登革热血清型感染的个体之后可能被不同的血清型感染。在过去，曾认为产生于不同登革热病毒血清型的第二次感染在理论上是发生DHF的风险因素，因为显示DHF的大部分患者之前曾暴露于其它4种登革热病毒血清型的至少一种。
至今，没有针对登革热病的特效治疗。对登革热病的治疗是针对症状的，卧床休息，通过退热药和镇痛药控制发烧和疼痛及大量饮水。DHF的治疗需要平衡液体丢失、置换凝血因子和输注肝素。
由于登革热预防措施(例如蚊虫控制和个人防护免叮咬)的功效有限，难于实施而且昂贵，因此安全和有效的登革热疫苗可能是最佳的预防方式。然而，没有目前可获得的经许可的该类型的疫苗。
因此需要开发当用于保护人类受试者免于登革热病的方法时证实是有功效的疫苗组合物。
发明概述
本发明涉及用于保护人类受试者免于登革热病的方法的疫苗组合物，其中所述组合物包含：
(i) 选自以下的登革热抗原：
(a) 活的减毒登革热病毒；
(b) 灭活的登革热病毒；
(c) 活的减毒或灭活的嵌合登革热病毒；
(d) 登革热病毒样颗粒(VLP)；和
(e) (a)-(d)的两种或更多种的组合；
或
(ii) 能够在人细胞中表达登革热抗原的核酸构建体或病毒载体，所述登革热抗原是登革热VLP。
本发明还涉及本发明的疫苗组合物在用于制备保护人类受试者免于登革热病的药物中的用途。
本发明还涉及保护人类受试者免于登革热病的方法，其中所述方法包括给予所述人类受试者有效量的本发明的组合物。
另外，本发明涉及包括本发明的组合物和在保护人类受试者免于登革热病的方法中使用所述组合物的使用说明书的药盒。
附图描述
图1说明YF-VAX cDNA通过RT-PCR构建和克隆。
定义
本文所用术语“登革热病”是指在被4种登革热病毒血清型的任何一种感染之后个体出现的临床症状。自1970以来，按照世界卫生组织准则，临床登革热被归类为：(i)登革热(dengue fever)，或(ii)登革出血热(World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 第2版. Geneva: WHO, 1997；ISBN 92 4 154500 3)。2009年，WHO颁布了新的准则，将临床登革热归类为：(i)发出警告标志或无警告标志的登革热，或(ii)严重登革热。两种分类见Srikiatkachorn等, Clin. Infect. Dis. (2011) 53(6): 563的图1和2。按照较早的分类，登革热的特征为选自以下的至少两种症状：头痛、关节痛、眶后痛、皮疹、肌痛、出血现象和白细胞减少以及支持性血清学或在与其它已证实的登革热病情的相同地点和时间出现过。当发热、出血现象、血小板减少和血浆渗漏的证据所有这些全被观察到时，证实已发展成为登革出血热。按照较新的分类，登革热的诊断要求存在发热和选自恶心、呕吐、皮疹、疼痛的至少两种临床症状、阳性止血带试验或选自以下的任何警告标志：腹部疼痛和触痛、持续呕吐、临床流体蓄积、粘膜出血、嗜眠或烦燥、肝增大超过2 cm或血细胞比容增加同时伴血小板计数快速降低。当观察到以下任何事件时，诊断为重度登革热：导致休克或呼吸窘迫的严重血浆渗漏、由临床医生评价为严重出血或严重器官受累。
本文所用术语“登革出血热或DHF”是指病毒学上已证实的登革热病，其中发热、出血现象、血小板减少和血浆渗漏的证据全都被观察到。还根据其严重程度可进一步定义本文所用的DHF。例如，DHF可定义为I级、II级、III级或IV级(World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 第2版. Geneva: WHO, 1997；ISBN 92 4 154500 3)。I级定义为发热伴发非特异性全身症状；唯一的出血现象是阳性止血带试验和/或易瘀伤。II级定义为除I级患者的表现以外的自发性出血，通常呈皮肤或其它出血形式。III级定义为表现为脉搏急速微弱和脉压缩小或低血压的循环衰竭，伴以存在皮肤湿冷和烦燥。IV级定义为无可检测血压或脉搏的深度休克。本领域技术人员应了解，在本发明的实践中，例如防止DHF的方法，所述DHF不必是病毒学上已证实的。
本文所用术语“病毒学上已证实的登革热”是指由通过例如反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或登革热非结构1 (NS1)蛋白酶联免疫吸附测定法(ELISA)证实的登革热病毒诱导的急性发热发作。在RT-PCR方法中，血清样品通过Callahan等人的方法测试(J. Clin. Microbiol. (2001) 39: 4119)。简单地说，使用商用试剂盒，从血清中提取RNA以弃去潜在的Taq聚合酶抑制剂或干扰因子。然后用来自登革热NS5基因序列的血清型特异性引物进行RT-PCR反应。结果表示为与含有已知浓度的整合至质粒的病毒基因组血清型特异性核酸序列的标准品比较的log10GEQ (基因组当量)/mL的浓度。在ELISA方法中，将50 μL的患者血清、阳性对照、阴性对照或截止值对照(cut-off control) 1:2稀释于样品稀释剂中，并与100 μL稀的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗NS1单克隆Ab (MAb)混合。加入稀的血清和缀合物以俘获抗NS1 MAb包被的微孔，将板在37℃下孵育90分钟。当NS1存在于血清中时，形成俘获MAb/NS1/HRP标记的MAb复合物。通过阳性孔中的比色反应检测复合物，所述比色反应通过加入160 μL 3,3’,5,5’四甲基联苯胺(TMB)底物并在室温下避光孵育30分钟来诱导。加入100 μL终止溶液(1N H2SO4)终止反应，并读板。通过试验样品的平均光密度(OD)除以截止值对照的平均OD (一式四份测试)，求出各样品的样品比率。样品比率<0.5、0.5-<1.0和≥1分别表示阴性、不明确和阳性结果。
本文所用术语“病毒学上已证实的重度登革热”是指如1997 WHO分类定义的登革出血热(DHF)，且其进一步的特征为下列另外列举的症状：需要输血的出血、毛细血管通透性的客观证据、循环衰竭的征兆或脏象。
本文所用术语“登革热休克综合征”是指上文定义的最严重的DHF并发症。按照1997 WHO分类，DSS相当于III级和IV级的DHF。
术语“登革热病毒”、“登革热病毒”和“DEN”可互换使用。它们是指属于黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属的正单链RNA病毒。有4种不同血清型的登革热病毒(血清型1、2、3和4)，它们具有约60-80%序列同源性。基因组的组构包含下列元件：5'非编码区(NCR)、编码结构蛋白(衣壳(C)、前膜(prM)和包膜(E))的区域和编码非结构蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)的区域和3' NCR。登革热病毒基因组编码不间断编码区，其翻译为进行翻译后加工的单一多蛋白。
在本发明的情况下，“疫苗登革热病毒”是指通过将疫苗登革热病毒给予免疫活性受试者能够诱导针对所述疫苗登革热病毒来自于其中的登革热病毒血清型的中和抗体的病毒。可用于本发明方法的疫苗登革热病毒的实例包括灭活登革热病毒、活的减毒登革热病毒和活的减毒或灭活嵌合登革热病毒。用于本发明的疫苗登革热病毒的血清型包括血清型1、2、3和4。优选用于本发明的疫苗登革热病毒是活的减毒嵌合登革热病毒。
本文所用表述“灭活病毒”是指在允许复制相应的野生型病毒的细胞中不能复制到任何有效程度的病毒。病毒可通过本领域技术人员熟知的多种方法灭活。用于灭活病毒的方法的实例包括化学处理或照射处理(包括热或通常呈X射线或紫外辐射形式的电磁辐射)。
本文所用的术语“灭活登革热病毒”是指含有全部登革热结构蛋白(env、前膜/膜蛋白和衣壳蛋白)和灭活病毒RNA的灭活野生型病毒。灭活的登革热病毒也可指灭活的嵌合登革热病毒。灭活登革热病毒描述于例如美国专利号6,254,873。
本文所用术语“活的减毒病毒或LAV”是指不能诱导特征在于与相应的野生型病毒相关的相同组症状的疾病状态的病毒。活的减毒病毒的实例是本领域众所周知的。可通过例如重组DNA技术、位点定向诱变、遗传操作、复制型细胞的系列传代、化学诱变处理或电磁辐射，自野生型病毒制备活的减毒病毒。
本文所用术语“活的减毒登革热病毒”是指通过导致毒力减弱和无法诱导特征在于与相应的野生型登革热病毒有关的相同组症状的疾病状态的遗传修饰，来源于有毒的野生型登革热病毒的活的登革热病毒。可用于本发明实践中的活的减毒登革热病毒的实例包括VDV-1、VDV-2和描述于例如以下申请的毒株：WO 02/66621、WO 00/57904、WO 00/57908、WO 00/57909、WO 00/57910、WO 02/0950075和WO 02/102828。可用于本发明方法的血清型1的活的减毒登革热病毒包括VDV-1。可用于本发明方法的血清型2的活的减毒登革热病毒包括VDV-2和LAV-2。
“VDV”和“Vero登革热疫苗”在本文中可互换使用，并命名为能够在Vero细胞中复制并能够在人中诱导特异性体液反应(包括诱导中和抗体)的活的减毒登革热病毒。
DEN-1 16007/PDK13毒株，亦称“LAV1”，来源于通过原代狗肾(PDK)细胞进行11次传代的野生型DEN-1 (登革热病毒血清型1) 16007毒株(DEN-1 16007/PDK11)。LAV1描述于Mahidol University名下的专利申请EP1 159968，并提交给国家微生物培养物保藏中心(National Microorganisms Cultures Collection，CNCM)，编号为I-2480。“VDV-1”是通过对Vero细胞的后续适应而来源于LAV1的病毒；在这一方面，从LAV1提取RNA并纯化后，转染至Vero细胞。随后通过板纯化，在Vero细胞中扩增，获得VDV-1毒株。与DEN-1 16007/PDK13毒株(通过PDK细胞13次传代)相比，VDV-1毒株具有14个另外的突变。用于制备和表征VDV-1毒株的方法描述于Sanofi-Pasteur和疾病控制与预防中心(Center for Disease Control and Prevention)名下的以编号WO06/134433提交的国际专利申请。
DEN-2 16681/PDK53毒株，亦称为“LAV2”，获自野生型毒株DEN-2 (登革热病毒血清型2) 16681，其通过PDK细胞进行50次传代(DEN-2 16681/PDK50)。LAV2描述于Mahidol University名下的专利申请EP1159968，并提交给国家微生物培养物保藏中心(CNCM)，编号为1-2481。“VDV-2”是通过对Vero细胞的后续适应而来源于LAV2的毒株；在这一方面，自LAV2提取RNA并纯化后，转染至Vero细胞。随后通过板纯化和在Vero细胞中扩增来获得VDV-2毒株。与DEN-2 16681/PDK53毒株(通过PDK细胞53次传代)相比，VDV-2毒株具有10个另外的突变，包括4个沉默突变。用于制备和表征VDV-2毒株的方法描述于以Sanofi-Pasteur和疾病控制与预防中心(Center for Disease Control and Prevention)的名义以编号WO06/134443提交的国际专利申请。VDV-2毒株的完整核酸序列如SEQ ID NO: 24所示。VDV-2毒株M蛋白的序列如SEQ ID NO: 27所示，VDV-2毒株E蛋白的序列如SEQ ID NO: 26所示。
通过在Vero细胞中扩增制备VDV 1和2毒株。收获所产生的病毒，并通过过滤从细胞碎片中澄清。通过用酶处理消化DNA。通过超滤清除杂质。可通过浓缩方法提高感染滴度。在加入稳定剂后，毒株在用前以冻干或冷冻形式保存，然后在需要时重构。
在本发明的情况下，“登革热嵌合体或嵌合登革热病毒”意指这样的受体黄病毒，其中遗传骨架通过编码受体黄病毒的prM和E蛋白的序列用登革热病毒的相应序列交换而被修饰。受体黄病毒通常可被减毒。受体黄病毒可以是黄热病(YF)病毒，例如减毒的YF 17D、YF 17DD和YF 17D204 (YF-VAX?)病毒；如果这样的话，所述嵌合体被称为YF/登革热嵌合体。受体黄病毒还可以是登革热病毒，如果这样的话，它被称为登革热/登革热嵌合体，特征为prM和E蛋白的登革热病毒血清型与特征为遗传骨架的受体登革热病毒血清型相同或不同。当血清型是相同的时，受体登革热病毒和prM和E蛋白编码序列来源于其中的登革热病毒是相同血清型的两种不同的病毒毒株。为了用于本发明，嵌合登革热病毒通常是YF/登革热嵌合体。嵌合登革热病毒优选是灭活或活的减毒嵌合登革热病毒。有利的是，本发明的活的减毒嵌合登革热病毒的受体黄病毒是YF 17D或YF 17D204。按照一个实施方案，登革热嵌合体是灭活病毒。按照备选的实施方案，登革热嵌合体是活的减毒病毒。可用于本发明的保护方法的登革热嵌合体包括Chimerivax?登革热血清型1 (亦称为CYD-1)、Chimerivax?登革热血清型2 (亦称为CYD-2)、Chimerivax?登革热血清型3 (亦称为CYD-3)和Chimerivax?登革热血清型4 (亦称为CYD-4)。
可用于本发明的实践中的嵌合登革热病毒的实例包括描述于专利申请WO 98/37911的登革热/YF嵌合病毒和登革热/登革热嵌合体，例如描述于专利申请WO 96/40933和WO 01/60847的那些。
在一个实施方案中，嵌合YF/登革热病毒包含减毒黄热病病毒毒株YF17D的基因组骨架(Theiler M.和Smith H.H., 1937, J.Exp.Med., 65. 767-786)，例如病毒YF17D/DEN-1、YF17D/DEN-2、YF17D/DEN-3和YF17D/DEN-4。可以使用的YF17D毒株的实例包括YF17D204 (YF-VAX(R), Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA；Stamaril(R), Sanofi-Pasteur, Marcy I'Etoile, France；ARILVAX(TM), Chiron, Speke, Liverpool, UK；FLAVIMUN(R), Berna Biotech, Bern, Switzerland；YF17D-204 France (X15067, X15062)；YF17D-204,234 US (Rice等, 1985, Science, 229：726-733)或相关毒株YF17DD (Genbank登录号U17066)、YF17D-213 (Genbank登录号U17067)和Galler等人描述的毒株YF17DD (1998, Vaccines, 16(9/10): 1024-1028)。
特别适用于本发明实践中的嵌合登革热病毒的一个实例是“Chimerivax登革热病毒”。本文所用“Chimerivax登革热病毒”是活的减毒嵌合YF/登革热病毒，其包含YF17D或YF17D204 (YF-VAX?)病毒的基因组骨架，其中编码前膜(prM)和包膜(E)蛋白的核酸序列被编码登革热病毒的相应结构蛋白的核酸序列置换。用于本发明的优选的嵌合登革热病毒是活的减毒嵌合YF/登革热病毒，其包含YF17D病毒的基因组骨架，其中编码前膜(prM)和包膜(E)蛋白的核酸序列被编码登革热病毒的相应结构蛋白的核酸序列置换。用于本发明的优选的嵌合登革热病毒是活的减毒嵌合YF/登革热病毒，其包含YF17D204 (YF-VAX?)病毒的基因组骨架，其中编码前膜(prM)和包膜(E)蛋白的核酸序列被编码登革热病毒的相应结构蛋白的核酸序列置换。所述Chimerivax病毒的构建可按照或基本按照Chambers等(1999，J.Virology 73(4):3095-3101)的教导实现。通过使用来自毒株DEN 1 PU0359 (TYP1 140)、DEN2 PUO218、DEN3 PaH881/88和DEN 4 1228 (TVP 980)的prM和E序列和YF17D病毒的基因组骨架，产生描述于实施例中的具体Chimerivax (CYD)登革热病毒。所述特殊的Chimerivax毒株在本文(参见本发明实施例)分别称为“CYD-1”、“CYD-2”、“CYD-3”和“CYD-4”。这些特殊的CYD-1、CYD-2、CYD-3和CYD-4毒株的制备详细描述于国际专利申请WO 98/37911、WO 03/101397、WO 07/021672、WO 08/007021、WO 08/047023和WO 08/065315，可引用其制备方法的精确描述。或者，其它登革热病毒毒株可用作核酸来源以便于可用于本发明实践的嵌合病毒的构建，例如用于其它Chimerivax登革热血清型1 (CYD-1)、Chimerivax登革热血清型2 (CYD-2)、Chimerivax登革热血清型3 (CYD-3)和Chimerivax登革热血清型4 (CYD-4)毒株的构建中。有利的是，本发明的疫苗组合物，例如血清型2的嵌合登革热病毒可包含与来自实施例中描述的血清型2毒株LAV-2、BID-V585、PR/DB023或MD1280的prM-E序列有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的prM-E序列或可包含与SEQ ID NO: 2所示prM-E序列有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的prM-E序列。有利的是，疫苗组合物，例如用于本发明方法的血清型2的嵌合登革热病毒可包含来自血清型2毒株LAV-2、BID-V585、PR/DB023或MD1280的prM-E序列或来自实施例中描述的SEQ ID NO: 2的prM-E序列。当所述嵌合登革热病毒的受体基因组骨架来源于YF-VAX?时，所述毒株在本文被称为CYD-LAV、CYD-BID、CYD-PR和CYD-MD。在本发明的疫苗组合物中，包含使用血清型2毒株LAV-2 (SEQ ID NO: 8)、BID-V585 (SEQ ID NO: 9)、PR/DB023 (SEQ ID NO: 10)、MD1280 (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列产生的或使用与来自血清型2毒株LAV-2、BID-V585、PR/DB023、MD1280的prM-E序列或来自SEQ ID NO: 2的prM-E序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的prM-E序列产生的血清型2的嵌合登革热病毒的本发明的疫苗组合物可有利地与CYD-1、CYD-3和CYD-4联用。
可用于本发明的保护方法的嵌合登革热病毒的备选实施方案是这样的受体黄病毒，其中遗传骨架通过(i)编码受体黄病毒E蛋白的序列用登革热病毒的相应序列交换，和(ii)编码受体黄病毒prM蛋白的序列用非登革热黄病毒(例如JEV病毒)的相应序列交换而被修饰。通常，所述嵌合病毒可以是活的减毒病毒或灭活病毒。所述嵌合登革热病毒的实例描述于WO2011/138586。
用于本发明的疫苗组合物中的血清型1的疫苗登革热病毒可以是例如毒株VDV1、CYD-1或包含DEN-1 16007/PDK13毒株的prM和E氨基酸序列的YF17D/DEN-1嵌合病毒。用于本发明方法的血清型2的疫苗登革热病毒可以是例如毒株VDV2、CYD-2、包含DEN-2 16681/PDK53毒株的prM和E氨基酸序列的YF17D/DEN-2嵌合病毒、包含DEN-2毒株LAV-2、BID-V585、PR/DB023或MD1280的prM和E氨基酸序列的嵌合病毒或包含与来自血清型2毒株LAV-2、BID-V585、PR/DB023或MD1280的prM-E序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性或与SEQ ID NO: 2的prM-E序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的prM-E序列的嵌合病毒。用于本发明方法的血清型3的疫苗登革热病毒可以是例如CYD-3或备选的YF17D/DEN-3嵌合病毒。血清型4的疫苗登革热病毒的实例是CYD-4或备选的YF17D/DEN-4嵌合病毒。
本发明的组合物包含至少一种登革热抗原。本发明的组合物通常包含登革热抗原，例如血清型1、2、3和4每一种的疫苗登革热病毒。登革热抗原，例如每种血清型的本发明的疫苗登革热病毒可如本发明描述的一样。例如，本发明的组合物可有利地包含登革热抗原的下列组合的任一种：i)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-LAV的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E氨基酸序列的嵌合登革热病毒和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原；ii)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-BID的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原；(iii)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-PR的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原；(iv)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-MD的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原。例如，本发明的组合物还可有利地包含登革热抗原的下列组合的任一种：i) CYD-1、CYD-LAV、CYD-3和CYD-4；ii) CYD-1、CYD-BID、CYD-3和CYD-4；(iii) CYD-1、CYD-PR、CYD-3和CYD-4或(iv) CYD-1、CYD-MD、CYD-3和CYD-4。本发明的组合物还可有利地包含登革热抗原的下列组合：i)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、VDV2、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原。例如，本发明的组合物可有利地包含CYD-1、VDV-2、CYD-3和CYD-4。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含与CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列具有至少90%同一性的序列。例如，所述序列可与CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
本文所用术语“病毒样颗粒或VLP”是指不含复制性遗传物质但在其表面上以类似于病毒体结构的重复有序的阵列存在登革热E蛋白的病毒颗粒。通常，登革热VLP还含有登革热prM和/或M和E蛋白。VLP可体外产生(Zhang等, J. Virol. (2011) 30 (8):333)。VLP还可体内产生。为此目的，可通过本领域已知方法，例如通过使用病毒载体，将编码prM和E登革热蛋白质的核酸构建体(例如DNA或RNA构建体)导入受试者(例如人类受试者)的细胞中。可使用任何病毒载体，只要它能够含有和表达prM和E登革热病毒序列两者。可用于本发明方法的病毒载体的非限制性实例包括痘病毒(例如减毒pox Ankara病毒)和麻疹病毒。为了用于本发明，体内表达VLP的病毒载体的具体类别包括例如按照Replivax?技术的复制缺陷型假性感染性(PIV)病毒(Rumyantsev AA,等, Vaccine. 2011 Jul 18;29(32):5184-94)。
本文所用术语“复制缺陷型假性感染性病毒”是指由于在基因组中缺乏复制周期的必需序列，例如编码衣壳蛋白的序列，因此是体内复制缺陷型的病毒体颗粒。然而，病毒体颗粒可在提供反式必需序列的辅助细胞的培养物中繁殖。用于本发明的复制缺陷型假性感染性病毒包括能够表达任何血清型的登革热病毒的prM和E蛋白的上述定义的任何病毒。实例包括复制缺陷型黄病毒/登革热嵌合体，例如复制缺陷型西尼罗病毒/登革热、日本脑炎病毒/登革热和YF/登革热嵌合体。
可通过例如测量针对包含在组合物内的登革热病毒血清型引起的中和抗体滴度，来评价本发明的疫苗组合物在受试者中引起免疫应答(即诱导中和抗体产生)的能力。中和抗体滴度可通过蚀斑减少中和试验(plaque-reduction neutralization test，PRNT50)测量。简单地说，在给予本发明的疫苗组合物后至少28天，在从接种受试者中收集的血清中测量中和抗体滴度。适当时，将血清(之前已热灭活)的2倍系列稀释液与恒定攻击剂量的血清型1、2、3或4的各登革热病毒(表示为PFU/mL)混合。将混合物接种在具有汇合的Vero细胞单层的微量板的孔中。在吸附后，使细胞单层孵育几天。通过感染灶的形成表明登革热病毒感染的细胞的存在，因此可检测由于血清样品中中和抗体的存在所引起的病毒感染性的降低。所报告的值(终点中和滴度)表示当与阴性对照孔(其代表100%病毒载量)中的平均病毒灶计数相比时，登革热攻击病毒(在病毒灶计数中)≥ 50%被中和的血清的最高稀释度。终点中和滴度以连续值提供。该测定法的定量下限(LLOQ)为10 (1/dil)。一般认为，当滴度优于或等于10 (1/dil)时发生血清转化。由于PRNT试验可能在实验室间略有不同，因此LLOQ也可能略有不同。因此，通常认为，当滴度优于或等于试验的LLOQ时，发生血清转化。在下列参考文献中考虑了中和抗体滴度，但是作者没有建立保护的相关性(Guirakhoo等, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761；Libraty等, PLoS Medicine (2009) 6 (10)；Gunther等, Vaccine (2011) 29: 3895和Endy等, J. Infect. Dis. (2004), 189(6): 990-1000)。
术语“CCID 50 ”是指感染50%细胞培养物的病毒(例如疫苗病毒)的量。CCID50测定法是含统计滴度计算的有限稀释测定法(Morrison D等, J Infect Dis. 2010；201(3):370-7))。
术语“人类受试者”意指不同年龄的男性和女性。优选本发明的人类受试者小于18岁或小于12岁。例如，本发明的人类受试者可为0-17岁、0-11岁、4-17岁、4-11岁、4-6岁、6-8岁、8-10岁、2-8岁、2-11岁、2-14岁、9-16岁、12-17岁或18-45岁。更优选本发明的人类受试者为4-11岁、2-14岁或9-16岁。本发明的人类受试者可为至少9月龄或小于9月龄。例如本发明的人类受试者可为9个月-16岁、9个月-14岁、9个月-11岁或9个月-8岁。本发明的人类受试者可为至少9月龄，对本文定义的疫苗组合物的任何组分无严重变态反应史，无先天性或获得性免疫缺陷，无症状性HIV感染，且所述受试者应未怀孕或哺乳。
本文所用表述“黄病毒幼稚受试者”是指未曾被黄病毒感染、之前也未用黄病毒疫苗免疫的受试者，即取自所述受试者的血清样品将在黄病毒ELISA或PRNT测定法中产生阴性结果。
本文所用表述“登革热幼稚受试者”是指未曾被登革热病毒感染、之前也未用登革热疫苗免疫的受试者，即取自所述受试者的血清样品将在登革热ELISA或PRNT测定法中产生阴性结果。
本文所用表述“黄病毒免疫受试者”是指在给予本发明的疫苗组合物之前被黄病毒感染或经免疫的受试者，即取自所述受试者的血清样品将在黄病毒ELISA或PRNT测定法中产生阳性结果。
本文所用表述“登革热免疫受试者”是指在给予本发明的疫苗组合物之前被登革热病毒感染或经登革热疫苗免疫的受试者，即取自所述受试者的血清样品将在登革热ELISA或PRNT测定法中产生阳性结果。
按照本发明，本文所用的“保护方法”导致在暴露于登革热病毒的人类受试者中发生登革热病的严重程度或可能性降低。有利的是，所述降低有统计显著性。例如，本发明的保护方法可导致本文定义的登革热病的至少一种症状减轻或这些症状的任何两种或更多种的组合的减轻。保护可导致以下的任一种或多种：
(i) 由任何血清型的登革热病毒引起的有症状的病毒学上已证实的登革热病的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(ii) 由血清型1、3或4的任一种的登革热病毒引起的有症状的病毒学上已证实的登革热病的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(iii) 由任何血清型的登革热病毒引起的有症状的登革热病的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(iv) 由血清型1、3或4的任一种的登革热病毒引起的有症状的登革热病的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(v) 由任何血清型的登革热病毒引起的病毒学上已证实的重度登革热的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(vi) 由任何血清型的登革热病毒引起的重度登革热病的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(vii) 由任何血清型的登革热病毒引起的I-IV级登革出血热病例的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(viii) 由任何血清型的登革热病毒引起的I级DHF病例的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(ix) 由任何血清型的登革热病毒引起的II级DHF病例的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(x) 由任何血清型的登革热病毒引起的III级DHF病例的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(xi) 由任何血清型的登革热病毒引起的IV级DHF病例的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(xii) 发热的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防，或发热的平均持续时间缩短和/或强度减弱；
(xiii) 由血细胞比容的变化限定的血浆渗漏的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防，或由血细胞比容的变化限定的血浆渗漏的平均值降低；
(xiv) 血小板减少的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防，或血小板减少的平均值降低；
(xv) 包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)在内的肝酶水平升高的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其预防；
(xvi) 因由任何血清型的登革热病毒引起的病毒学上已证实的登革热病所致住院的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其防止；
(xvii) 因由任何血清型的登革热病毒引起的登革热病所致住院的发生率或可能性统计显著性地降低，例如其防止；
(xviii) 因病毒学上已证实的登革热病所致住院时间长度统计显著性地缩短；
(xix) 因登革热病所致株院时间长度统计显著性地缩短。
按照标准住院规程监测并记录发热的持续时间和强度。在人类受试者中，发热(即发热发作)定义为在至少4小时间隔期间两次测量的至少37.5℃的2次温度读数的观察。血细胞比容、血小板减少和肝酶水平的测量是例如药典中所描述的本领域技术人员众所周知的标准试验。
有关由具体的登革热病毒血清型引起的登革热病，可证实例如上述(i)-(xix)点定义的针对登革热病的保护。例如，有关由血清型1的登革热病毒、血清型2的登革热病毒、血清型3的登革热病毒或血清型4的登革热病毒引起的登革热病，可证实本文定义的针对登革热病的保护。有利的是，有关由例如血清型1或血清型3的登革热病毒、血清型1或血清型4的登革热病毒、血清型3或血清型4的登革热病毒、血清型1或血清型2的登革热病毒、血清型2或血清型3的登革热病毒、血清型2或血清型4的登革热病毒、血清型1、2或3的登革热病毒、血清型1、3或4的登革热病毒、血清型2、3或4的登革热病毒或血清型1、2、3或4的登革热病毒引起的登革热病，可证实本文定义的针对登革热病的保护。
可在人类受试者的特定亚群中有利地证实本文定义的针对登革热病的保护。例如，可在小于18岁或小于12岁的人类受试者中有利地证实针对登革热病的保护。例如，本发明的人类受试者可为0-17岁、0-11岁、4-17岁、4-11岁、4-6岁、6-8岁、8-10岁、2-8岁、2-11岁、2-14岁、9-16岁、12-17岁或18-45岁。更优选本发明的人类受试者为4-11岁、2-14岁或9-16岁。本发明的人类受试者可为至少9月龄或小于9月龄。例如本发明的人类受试者可为9个月-16岁、9个月-14岁、9个月-11岁或9个月-8岁。本发明的人类受试者可为至少9月龄，对本文定义的疫苗组合物的任何组分无严重变态反应史，无先天性或获得性免疫缺陷，无有症状的HIV感染，且所述受试者应未怀孕或哺乳。
可在世界的特定国家、区域或地区有利地证实本文定义的针对登革热病的保护。例如，可在登革热病区有利地证实针对登革热病的保护。例如，其中保护可被证实的本发明的登革热病区可包含列入热带或亚热带的那些美洲国家或其部分。其中按照本发明保护可被证实的登革热病区因此可包括以下的任一个或多个：巴西、委内瑞拉、哥伦比亚、厄瓜多尔、秘鲁、玻利维亚、巴拉圭、巴拿马、哥斯达黎加、尼加拉瓜、洪都拉斯、萨尔瓦多、危地马拉、伯利兹、墨西哥、美国和加勒比海岛屿。在一个具体的实施方案中，其中保护可被证实的本发明的登革热病区可包括：巴西、哥伦比亚、洪都拉斯、墨西哥和波多黎各。其中按照本发明保护可被证实的登革热病区还可包括在热带和亚热带内的南亚和大洋洲国家。其中保护可被证实的本发明的登革热病区因此可包括以下的任一个或多个：印度、缅甸(Myanmar/Burma)、泰国、老挝、越南、柬埔寨、印度尼西亚、马来西亚、新加坡、菲律宾、台湾、巴布亚新几内亚和澳大利亚。在其中按照本发明保护可被证实的登革热病区中，野生型登革热病毒的特定血清型、毒株或基因型可为主要的传播毒株。例如，血清型2的登革热病毒可称为具有亚洲I或亚洲/美洲基因型。亚洲/美洲基因型毒株的特征在于下列残基的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有6个：分别在prM-16、E-83、E-203、E-226、E-228和E-346位上的Arg、Asn、Asp、Thr、Gly和His (其中prM-16表示prM蛋白的第16位，E-83表示E蛋白的第83位等)。亚洲I基因型毒株的特征在于下列残基的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有6个：分别在prM-16、E-83、E-203、E-226、E-228和E-346位上的Ile、Lys、Asn、Arg、Glu和Tyr (参见Hang等，PLoS NTD，4(7)：e757的表1)。其中按照本发明保护可被证实的优选的登革热病区是其中具有亚洲/美洲基因型的登革热病毒是主要的传播毒株的登革热病区，即在所述登革热病区中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%登革热病病例由具有亚洲/美洲基因型的登革热病毒引起。其中按照本发明保护可被证实的优选的登革热病区是其中血清型1、3或4的任一种或多种的登革热病毒是主要传播血清型的登革热病区，即至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%的登革热病病例由血清型1、3或4的登革热病毒引起。
本文所用的指定DNA序列的术语“RNA等同物”是指其中脱氧胸苷被尿苷置换的序列。因为所述DNA序列构成登革热病毒的cDNA序列，因此等同的RNA序列构成这些登革热病毒的正链RNA。
若干实施方案的综述
本发明人首次证实了一种疫苗组合物在保护人类受试者免于登革热病中的功效。
因此，本发明涉及用于保护人类受试者免于登革热病的方法的疫苗组合物，其中所述组合物包含：
(i) 选自以下的登革热抗原：
(a) 活的减毒登革热病毒；
(b) 灭活的登革热病毒；
(c) 活的减毒或灭活的嵌合登革热病毒；
(d) 登革热病毒样颗粒(VLP)；和
(e) (a)-(d)的两种或更多种的组合；
或
(ii)能够在人细胞中表达登革热抗原的核酸构建体或病毒载体，所述登革热抗原是登革热VLP。
优选本发明的登革热病是病毒学上已证实的登革热病。
优选本发明的人类受试者小于18岁或小于12岁。例如，本发明的人类受试者可为0-17岁、0-11岁、4-17岁、4-11岁、4-6岁、6-8岁、8-10岁、2-8岁、2-11岁、2-14岁、9-16岁、12-17岁或18-45岁。更优选本发明的人类受试者为4-11岁，2-14岁或9-16岁。本发明的人类受试者可为至少9月龄或小于9月龄。例如本发明的人类受试者可为9个月-16岁、9个月-14岁、9个月-11岁或9个月-8岁。本发明的人类受试者可为至少9月龄，对本文定义的疫苗组合物的任何组分无严重变态反应史，无先天性或获得性免疫缺陷，无有症状的HIV感染，且所述受试者应未怀孕或哺乳。
向其给予本发明的疫苗组合物的受试者优选为有感染风险的人，例如在存在登革热的区域(即登革热病区)旅行的人或所述区域的居民。本发明的登革热病区包括大多数热带和亚热带，例如由WHO确定为地方病国家的任何国家。例如，本发明的登革热病区可包含列入热带或亚热带的那些美洲国家或其部分。本发明的登革热病区因此可包括以下的任一个或多个：巴西、委内瑞拉、哥伦比亚、厄瓜多尔、秘鲁、玻利维亚、巴拉圭、巴拿马、哥斯达黎加、尼加拉瓜、洪都拉斯、萨尔瓦多、危地马拉、伯利兹、墨西哥、美国和加勒比海岛屿。在一个具体的实施方案中，本发明的登革热病区可包括：巴西、哥伦比亚、洪都拉斯、墨西哥和波多黎各。本发明的登革热病区还可包括在热带和亚热带内的南亚和大洋洲国家。本发明的登革热病区因此可包括以下的任一个或多个：印度、缅甸(Myanmar/Burma)、泰国、老挝、越南、柬埔寨、印度尼西亚、马来西亚、新加坡、菲律宾、台湾、巴布亚新几内亚和澳大利亚。在本发明的登革热病区，野生型登革热病毒的特定血清型、毒株或基因型可为主要的传播毒株。例如，血清型2的登革热病毒可表征为具有亚洲I或亚洲/美洲基因型。亚洲/美洲基因型毒株的特征在于下列残基的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有6个：分别在prM-16、E-83、E-203、E-226、E-228和E-346位上的Arg、Asn、Asp、Thr、Gly和His (其中prM-16表示prM蛋白的第16位，E-83表示E蛋白的第83位等)。亚洲I基因型毒株的特征在于下列残基的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有6个：分别在prM-16、E-83、E-203、E-226、E-228和E-346位上的Ile、Lys、Asn、Arg、Glu和Tyr (参见Hang等，PLoS NTD，4(7)：e757的表1)。本发明优选的登革热病区是其中具有亚洲/美洲基因型的登革热病毒是主要的传播毒株的登革热病区，即在所述登革热病区中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%登革热病病例由具有亚洲/美洲基因型的登革热病毒引起。本发明优选的登革热病区是其中血清型1、3或4的任一种或多种的登革热病毒是主要传播血清型的登革热病区，即至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%的登革热病病例由血清型1、3或4的登革热病毒引起。
可将本发明的疫苗组合物给予黄病毒免疫受试者，例如登革热免疫受试者，或可将本发明的疫苗组合物给予黄病毒幼稚受试者。有利的是，将本发明的疫苗组合物给予黄病毒免疫受试者，例如登革热免疫受试者。
优选本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低DHF的可能性或严重程度。可通过比较接受本发明的疫苗组合物的受试者组的DHF的病例数与未接受本发明疫苗组合物的受试者的对照组的DHF病例数来测量DHF可能性的降低(即感染DHF的概率的降低)。通过计算在接受本发明的疫苗组合物的受试者组中显示I、II、III或IV级各自的DHF的受试者数并比较这些数与来自未接受本发明疫苗组合物的受试者的对照组的等效数，可确定DHF严重程度的降低。例如，当与发生在未接受本发明疫苗组合物的受试者的对照组中的I级DHF、II级DHF、III级DHF和IV级DHF的等效病例数相比时，用于本发明方法的组合物优选减少接受疫苗的那些受试者中的I级DHF的病例数、II级DHF的病例数、III级DHF的病例数和/或IV级DHF的病例数。
优选本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低有症状的病毒学上已证实的登革热病的发生率或可能性。有利的是，本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低由血清型1、3或4的登革热病毒引起的有症状的病毒学上已证实的登革热病的发生率或可能性。优选本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低由病毒学上已证实的登革热病所致的住院率，即降低住院的病毒学上已证实的登革热病的发生率。例如本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低因由血清型1、3或4的登革热病毒引起的病毒学上已证实的登革热病所致的住院率，即降低由血清型1、3或4的登革热病毒引起的住院的病毒学上已证实的登革热病的发生率。
优选本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低登革热病的发生率或可能性。有利的是，本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低由血清型1、3或4的登革热病毒引起的登革热病的发生率或可能性。有利的是，本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低由血清型1、2、3或4的登革热病毒引起的登革热病的发生率或可能性。优选本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低因登革热病所致的住院率，即降低住院登革热病的发生率。例如本发明的组合物，例如用于本发明方法的组合物，降低因由血清型1、3或4的登革热病毒引起的登革热病所致的住院率，即降低由血清型1、3或4的登革热病毒引起的住院登革热病的发生率。
本发明的疫苗组合物可以多剂量给予。本发明的疫苗组合物的剂量可以初始接种方案给予，接着加强接种。例如，本发明的疫苗组合物可以1剂、2剂、3剂或3剂以上的剂量(例如4剂)给予。优选第1剂和第3剂相隔约12个月给予。例如，本发明的初始接种方案以3剂给予，其中所述接种方案的第1剂和第3剂相隔约12个月给予。有利的是，本发明的疫苗组合物以第1剂、第2剂和第3剂给予。在这类实施方案中，所述第1剂和所述第3剂可相隔约12个月给予。例如，本发明的疫苗组合物可以第1剂、第2剂和第3剂给予，其中所述第2剂在所述第1剂后约6个月给予，且其中所述第3剂在所述第1剂后约12个月给予。或者，3个剂量可在零月时、在约3-4个月时(例如在约3个半月时)和在约12个月时给予(即其中组合物的第2剂在第1剂后约3个半月时给予，且其中组合物的第3剂在第1剂后约12个月时给予的方案)。
本发明的疫苗组合物可以2剂给予。优选第1剂和第2剂在第1剂后约6-12个月给予。优选第2剂在第1剂后8个月给予。优选第2剂在第1剂后约8个半月至9个月时给予。
本发明的疫苗组合物可以单剂量给予。
本文定义的登革热病可能由登革热病毒的2种血清型的任一种引起。例如，登革热病优选由血清型1或血清型3的登革热病毒、血清型1或血清型4的登革热病毒、血清型3或血清型4的登革热病毒、血清型1或血清型2的登革热病毒、血清型2或血清型3的登革热病毒、血清型2或血清型4的登革热病毒引起。本文定义的登革热病，优选由登革热病毒的3种血清型的任一种引起。例如，登革热病优选由血清型1、2或3的登革热病毒、血清型1、3或4的登革热病毒、血清型1、2或4的登革热病毒、血清型2、3或4的登革热病毒引起。在另一个实施方案中，登革热病由血清型1的登革热病毒、血清型2的登革热病毒、血清型3的登革热病毒或血清型4的登革热病毒引起。
例如用于本发明方法的本发明的疫苗组合物优选包含血清型1的登革热抗原、血清型2的登革热抗原、血清型3的登革热抗原和血清型4的登革热抗原。所述组合物在本文可描述为四价组合物。例如本发明的组合物，例如用于本发明的保护方法的组合物，可有利地包含血清型1、2、3和4的登革热抗原的下列组合的任一种：i)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-LAV的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的嵌合登革热病毒和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原；ii)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-BID的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原；(iii)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-PR的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原；(iv)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-MD的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原。例如，本发明的组合物还可有利地包含登革热抗原的下列组合的任一种：i) CYD-1、CYD-LAV、CYD-3和CYD-4；ii) CYD-1、CYD-BID、CYD-3和CYD-4；(iii) CYD-1、CYD-PR、CYD-3和CYD-4或(iv) CYD-1、CYD-MD、CYD-3和CYD-4。本发明的组合物还可有利地包含登革热抗原的下列组合：i)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、VDV2、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原。例如，本发明的组合物可有利地包含CYD-1、VDV-2、CYD-3和CYD-4。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含与CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列具有至少90%同一性的序列。例如，所述序列可与CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
例如用于本发明方法的本发明的疫苗组合物优选包含血清型1的登革热抗原、血清型2的登革热抗原、血清型3的登革热抗原和血清型4的登革热抗原。所述组合物在本文可描述为四价组合物。例如本发明的组合物，例如用于本发明的保护方法的组合物，可有利地包含血清型1、2、3和4的登革热抗原的下列组合的任一种：i)包含CYD-1的M和E序列的登革热抗原、包含CYD-LAV的M和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的M和E序列的嵌合登革热病毒和包含CYD-4的M和E序列的登革热抗原；ii)包含CYD-1的M和E序列的登革热抗原、包含CYD-BID的M和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的M和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的M和E序列的登革热抗原；(iii)包含CYD-1的M和E序列的登革热抗原、包含CYD-PR的M和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的M和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的M和E序列的登革热抗原；(iv)包含CYD-1的M和E序列的登革热抗原、包含CYD-MD的M和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的M和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的M和E序列的登革热抗原。例如，本发明的组合物还可有利地包含登革热抗原的下列组合的任一种：i) CYD-1、CYD-LAV、CYD-3和CYD-4；ii) CYD-1、CYD-BID、CYD-3和CYD-4；(iii) CYD-1、CYD-PR、CYD-3和CYD-4或(iv) CYD-1、CYD-MD、CYD-3和CYD-4。本发明的组合物还可有利地包含登革热抗原的下列组合：i)包含CYD-1的M和E序列的登革热抗原、VDV2、包含CYD-3的M和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的M和E序列的登革热抗原。例如，本发明的组合物可有利地包含CYD-1、VDV-2、CYD-3和CYD-4。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含CYD-LAV (SEQ ID NO: 13)、CYD-BID (SEQ ID NO: 14)、CYD-PR (SEQ ID NO: 15)、CYD-MD (SEQ ID NO: 16)或SEQ ID NO: 18的E序列。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含与CYD-LAV (SEQ ID NO: 13)、CYD-BID (SEQ ID NO: 14)、CYD-PR (SEQ ID NO: 15)、CYD-MD (SEQ ID NO: 16)或SEQ ID NO: 18的E序列具有至少90%同一性的序列。例如，所述序列可与CYD-LAV (SEQ ID NO: 13)、CYD-BID (SEQ ID NO: 14)、CYD-PR (SEQ ID NO: 15)、CYD-MD (SEQ ID NO: 16)或SEQ ID NO: 18的E序列有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
如本文所述，本发明的组合物(例如用于本发明方法的四价制剂)，可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含选自SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 23的多肽。优选所述血清型2的登革热抗原还包含选自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18的多肽。例如，所述血清型2的登革热抗原优选包含：i) SEQ ID NO: 13的多肽和SEQ ID NO: 19的多肽；ii) SEQ ID NO: 14的多肽和SEQ ID NO: 20的多肽；iii) SEQ ID NO: 15的多肽和SEQ ID NO: 21的多肽；iv) SEQ ID NO: 16的多肽和SEQ ID NO: 22的多肽；或v) SEQ ID NO: 18的多肽和SEQ ID NO: 23的多肽。
本文所述的本发明的组合物(例如用于本发明方法的四价制剂)，可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含与SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 23具有至少90%同一性的多肽。优选所述血清型2的登革热抗原还包含与SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18具有至少90%同一性的多肽。例如，所述血清型2的登革热抗原优选包含：i)与SEQ ID NO: 13具有至少90%序列同一性的多肽和与SEQ ID NO: 19具有至少90%序列同一性的多肽；ii)与SEQ ID NO: 14具有至少90%序列同一性的多肽和与SEQ ID NO: 20具有至少90%序列同一性的多肽；iii)与SEQ ID NO: 15具有至少90%序列同一性的多肽和与SEQ ID NO: 21具有至少90%序列同一性的多肽；iv)与SEQ ID NO: 16具有至少90%序列同一性的多肽和与SEQ ID NO: 22具有至少90%序列同一性的多肽；或v)与SEQ ID NO: 18具有至少90%序列同一性的多肽和与SEQ ID NO: 23具有至少90%序列同一性的多肽。在优选的实施方案中，本文提及至少90%同一性时可解释为与指定序列有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
在前面段落描述的血清型2的登革热抗原可有利地与本文其它部分描述的血清型1、3和4的登革热抗原的任一种组合形成包含血清型1的登革热抗原、血清型2的登革热抗原、血清型3的登革热抗原和血清型4的登革热抗原的四价制剂。例如，所述血清型1、2、3和4的登革热抗原可各自独立选自活的减毒登革热病毒或活的减毒嵌合登革热病毒。有利的是，用于本发明方法的组合物包含血清型1、2、3和4各自的登革热抗原，其中所述血清型1、2、3和4的登革热抗原各自为活的减毒嵌合登革热病毒。有利的是，用于本发明方法的组合物包含血清型1、2、3和4各自的登革热抗原，其中所述血清型1、3和4的登革热抗原各自为活的减毒嵌合登革热病毒，且所述血清型2的登革热抗原选自活的减毒登革热病毒和活的减毒嵌合登革热病毒。
有利的是，用于本发明方法的组合物包含血清型1、2、3和4各自的登革热抗原，其中所述血清型1、3和4的登革热抗原各自为活的减毒嵌合登革热病毒，且所述血清型2的登革热抗原为活的减毒登革热病毒。例如，所述血清型1、3和4的活的减毒嵌合登革热病毒可为登革热/登革热嵌合体例如基于DEN-2 16681/PDK53毒株(亦称为LAV2)的登革热/登革热嵌合体。例如所述血清型1、3和4的登革热/登革热嵌合体可为这样的嵌合病毒，其中DEN-2 16681/PDK53毒株的基因组被修饰，使得DEN-2 16681/PDK53毒株的prM和E基因分别被血清型1毒株、血清型2毒株和血清型3毒株的prM和E基因置换。所述嵌合登革热/登革热病毒分别可称为DEN-2/1、DEN-2/3和DEN-2/4。在这种情况下，是活的减毒病毒的血清型2的登革热抗原可为DEN-2 16681/PDK53毒株(亦称为LAV2)。
本发明人的目的是提供用于本发明方法的优化的四价登革热疫苗组合物(即包含血清型1、2、3和4各自的登革热抗原的疫苗组合物)，当与由实施例1限定的CYD-1、CYD-2、CYD-3和CYD-4产生的中和抗体反应相比时，其提供针对血清型2的登革热病毒的改进的中和抗体反应。
因此，一方面，本发明有利地提供用于本发明方法的疫苗组合物，其中所述组合物包含血清型1、2、3和4各自的登革热抗原，其中所述血清型1、3和4的登革热抗原各自为活的减毒嵌合登革热病毒，且所述血清型2的登革热抗原为活的减毒登革热病毒，其包含与SEQ ID NO: 24所示序列具有至少90%序列同一性的核酸序列。
因此，另一方面，本发明有利地提供用于本发明方法的疫苗组合物，其包含血清型1的登革热抗原、血清型2的登革热抗原、血清型3的登革热抗原和血清型4的登革热抗原，其中：
i) 所述血清型1的登革热抗原是YF/登革热嵌合登革热病毒(即其中YF病毒的遗传骨架通过编码YF病毒的prM和E蛋白的序列用登革热血清型1病毒的相应序列交换而被修饰的受体黄热病病毒)；
ii) 所述血清型2的登革热抗原是活的减毒血清型2的登革热病毒，其包含与SEQ ID NO: 24所示序列具有至少90%序列同一性的核酸序列；
iii) 所述血清型3的登革热抗原是YF/登革热嵌合登革热病毒(即其中YF病毒的遗传骨架通过编码YF病毒的prM和E蛋白的序列用登革热血清型3病毒的相应序列交换而被修饰的受体黄热病病毒)和
iv) 所述血清型4的登革热抗原是YF/登革热嵌合登革热病毒(即其中YF病毒的遗传骨架通过编码YF病毒的prM和E蛋白的序列用登革热血清型4病毒的相应序列交换而被修饰的受体黄热病病毒)。
优选所述受体YF病毒(其形成血清型1、3和4的YF/登革热嵌合病毒的遗传骨架)是减毒YF病毒。例如，所述受体YF病毒可以是选自YF 17D、YF 17DD和YF 17D204的减毒YF病毒。优选血清型1、3和4的YF/登革热嵌合病毒分别为Chimerivax登革热血清型1 (即CYD-1)、Chimerivax登革热血清型3 (即CYD-3)和Chimerivax登革热血清型4 (即CYD-4)。
本文提及与SEQ ID NO: 24所示序列具有至少90%序列同一性的核酸序列可优选解读为与SEQ ID NO: 24所示序列具有至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的核酸序列。优选相当于SEQ ID NO: 24的736、1619、4723、5062、9191、10063、10507、57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571位的所述核酸序列(与SEQ ID NO: 24所示序列具有至少90%序列同一性)内的位置上的核苷酸不突变。有利的是，是用于本发明的组合物中的活的减毒登革热病毒的血清型2的登革热抗原(例如与上文和本文其它部分描述的血清型1、3和4的登革热抗原(例如是活的减毒嵌合登革热病毒的血清型1、3和4的登革热抗原，例如YF/登革热嵌合登革热病毒)联用)是包含与SEQ ID NO: 24所示序列具有100%序列同一性的核酸序列的活的减毒登革热病毒或当与SEQ ID NO: 24所示序列比较时包含至少1个且不多于20个核苷酸取代的活的减毒登革热病毒。优选当与SEQ ID NO: 24所示序列比较时，所述活的减毒登革热病毒包含至少一个且不多于15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个核苷酸取代。优选在相当于SEQ ID NO: 24的736、1619、4723、5062、9191、10063、10507、57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571位的所述核酸序列内的位置上的核苷酸不突变。有利的是，当与SEQ ID NO: 24所示序列比较时，是用于本发明的组合物中的活的减毒登革热病毒的血清型2的登革热抗原包含不多于20个碱基突变、缺失或插入的核酸序列。在某些情况下，当与SEQ ID NO: 24所示序列比较时，所述血清型2的活的减毒登革热病毒包含不多于15个或甚至不多于12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个碱基突变、缺失或插入的核酸序列。优选在相当于SEQ ID NO: 24的736、1619、4723、5062、9191、10063、10507、57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571位上的所述核酸序列内的位置上的核苷酸不突变。
另外优选的是，用于本发明的疫苗组合物中的血清型2的登革热抗原(例如是血清型2的活的减毒登革热病毒或活的减毒嵌合登革热病毒的登革热抗原)当在四价登革热疫苗组合物的情况下使用时，能够诱导人的中和抗体并且能够诱导平衡的免疫应答。另外优选的是，用于本发明的疫苗组合物中的血清型2的登革热抗原(例如是血清型2的活的减毒登革热病毒或活的减毒嵌合登革热病毒的登革热抗原)在人中产生低病毒血症或无病毒血症。另外优选的是，当与由实施例1限定的CYD-1、CYD-2、CYD-3和CYD-4产生的中和抗体反应相比时，用于本发明的四价疫苗组合物的血清型2的登革热抗原(例如是血清型2的活的减毒登革热病毒或活的减毒嵌合登革热病毒的登革热抗原)提供针对血清型2的登革热病毒的改进的中和抗体反应。
有利的是，用于本发明方法的疫苗组合物包含血清型1、2、3和4各自的登革热抗原，其中所述血清型1、3和4的登革热抗原各自为活的减毒嵌合登革热病毒，且所述血清型2的登革热抗原为活的减毒登革热病毒，其包含与SEQ ID NO: 24所示序列具有至少90%序列同一性的核酸序列，且其中所述血清型1、2、3和4的登革热抗原分别不是CYD-1、VDV-2、CYD-3和CYD-4或分别不是包含CYD1的M和E序列的登革热抗原、VDV2、包含CYD3的M和E序列的登革热抗原和包含CYD4的M和E序列的登革热抗原。
有利的是，用于本发明方法的疫苗组合物包含血清型1、2、3和4各自的登革热抗原，其中：(i)所述血清型1的登革热抗原是CYD-1以外的活的减毒嵌合登革热病毒或所述血清型1的登革热抗原是CYD-1；(ii)所述血清型2的登革热抗原是VDV-2以外的活的减毒登革热病毒或所述血清型2的登革热抗原是VDV-2；(iii)所述血清型3的登革热抗原是CYD-3以外的活的减毒嵌合登革热病毒或所述血清型3的登革热抗原是CYD-3和(iv)所述血清型4的登革热抗原是CYD-4以外的活的减毒嵌合登革热病毒或所述血清型4的登革热抗原是CYD-4。在这种情况下，VDV-2毒株是通过对Vero细胞的后续适应而来源于DEN-2 16681/PDK53毒株(LAV2)的毒株，其中与包括4个沉默突变的DEN-2 16681/PDK53毒株相比，所述VDV-2毒株具有10个另外的突变。
有利的是，用于本发明方法的组合物包含血清型1、2、3和4各自的登革热抗原，其中：(i)所述血清型1的登革热抗原是CYD-1以外的活的减毒嵌合登革热病毒或所述血清型1的登革热抗原是CYD-1；(ii)所述血清型2的登革热抗原是VDV-2以外的活的减毒登革热病毒或所述血清型2的登革热抗原是VDV-2；(iii)所述血清型3的登革热抗原是CYD-3以外的活的减毒嵌合登革热病毒或所述血清型3的登革热抗原是CYD-3和(iv)所述血清型4的登革热抗原是CYD-4以外的活的减毒嵌合登革热病毒或所述血清型4的登革热抗原是CYD-4。在这种情况下，VDV-2毒株是包含SEQ ID NO: 24所示核酸序列的毒株。
用于本发明方法的优选的疫苗组合物包含血清型1的登革热抗原、血清型2的登革热抗原、血清型3的登革热抗原和血清型4的登革热抗原，其中：
i) 所述血清型1的登革热抗原是CYD-1以外的YF/登革热嵌合登革热病毒或所述血清型1的登革热抗原是CYD-1；
ii) 所述血清型2的登革热抗原是包含与SEQ ID NO: 24所示序列具有至少90%序列同一性的核酸序列的活的减毒血清型2的登革热病毒，其中所述血清型2的登革热抗原不是包含与SEQ ID NO: 24所示序列具有100%序列同一性的核酸序列的活的减毒血清型2的登革热病毒或所述血清型2的登革热抗原是包含与SEQ ID NO: 24所示序列具有100%序列同一性的核酸序列的活的减毒血清型2的登革热病毒；
iii) 所述血清型3的登革热抗原是CYD-3以外的YF/登革热嵌合登革热病毒或所述血清型3的登革热抗原是CYD-3；和
iv) 所述血清型4的登革热抗原是CYD-4以外的YF/登革热嵌合登革热病毒或所述血清型4的登革热抗原是CYD-4。
有利的是，是用于本发明的疫苗组合物中的活减毒嵌合登革热病毒的血清型2的登革热抗原(例如与上文和本文其它部分描述的血清型1、3和4的登革热抗原(例如是YF/登革热嵌合登革热病毒的血清型1、3和4的登革热抗原)联用)包含与SEQ ID NO: 25所示序列具有至少90%同一性的核酸序列。优选所述核酸序列与SEQ ID NO: 25所示序列具有至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%序列同一性。优选在相当于SEQ ID NO: 24的524、736、1619和2055位的所述核酸序列内的位置上的核苷酸不突变(即保留出现在这些位置上的SEQ ID NO: 24中的核苷酸)。
如本文所述，本发明的组合物可有利地包含选自以下的登革热抗原：(a)活的减毒登革热病毒；(b)灭活的登革热病毒；(c)活的减毒或灭活的嵌合登革热病毒和(d) (a)-(c)的两种或更多种的组合，其中所述登革热抗原包含选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
如本文所述，本发明的组合物可有利地包含选自以下的登革热抗原：(a)活的减毒登革热病毒；(b)灭活的登革热病毒；(c)活的减毒或灭活的嵌合登革热病毒和(d) (a)-(c)的两种或更多种的组合，其中所述登革热抗原包含选自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7的核苷酸序列。
如本文所述，本发明的组合物可有利地包含选自以下的登革热抗原：(a)活的减毒登革热病毒；(b)灭活的登革热病毒；(c)活的减毒或灭活的嵌合登革热病毒和(d) (a)-(c)的两种或更多种的组合，其中所述登革热抗原包含编码本文所述的M和E序列的核苷酸序列。
例如本发明的组合物，例如用于本发明的保护方法的组合物，可有利地包含血清型1、2、3和4的登革热抗原的下列组合的任一种：i) CYD-1、CYD-LAV、CYD-3和CYD-4；ii) CYD-1、CYD-BID、CYD-3和CYD-4；(iii) CYD-1、CYD-PR、CYD-3和CYD-4或(iv) CYD-1、CYD-MD、CYD-3和CYD-4。本发明的组合物还可有利地包含登革热抗原的下列组合：i)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、VDV2、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原。例如，本发明的组合物可有利地包含CYD-1、VDV-2、CYD-3和CYD-4。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含与CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列具有至少90%同一性的序列。例如，所述序列可与CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
用于本发明的疫苗组合物，例如用于本发明方法的疫苗组合物优选包含是疫苗登革热病毒的登革热抗原。所述疫苗登革热病毒包括例如灭活病毒、活的减毒病毒和活的减毒嵌合登革热病毒。优选疫苗登革热病毒是活的减毒嵌合登革热病毒。优选本发明的活的减毒嵌合登革热病毒包含来自登革热病毒的一种或多种蛋白和来自不同黄病毒的一种或多种蛋白。有利的是，所述不同的黄病毒是黄热病病毒，例如毒株YF 17D的黄热病病毒。优选本发明的嵌合登革热病毒包含登革热病毒的prM-E氨基酸序列，例如本发明的嵌合登革热病毒包含其prM-E序列被登革热病毒的prM-E序列置换的黄热病病毒基因组。有利的是，本发明的疫苗组合物，例如用于本发明方法的疫苗组合物包含CYD-1、CYD-2、CYD-3和CYD-4。本发明的组合物可有利地包含登革热抗原的下列组合的任一种：i)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-LAV的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的嵌合登革热病毒和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原；ii)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-BID的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原；(iii)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-PR的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原；(iv)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-MD的prM和E序列的登革热抗原、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原。例如，本发明的组合物还可有利地包含登革热抗原的下列组合的任一种：i) CYD-1、CYD-LAV、CYD-3和CYD-4；ii) CYD-1、CYD-BID、CYD-3和CYD-4；(iii) CYD-1、CYD-PR、CYD-3和CYD-4或(iv) CYD-1、CYD-MD、CYD-3和CYD-4。本发明的组合物还可有利地包含登革热抗原的下列组合：i)包含CYD-1的prM和E序列的登革热抗原、VDV2、包含CYD-3的prM和E序列的登革热抗原和包含CYD-4的prM和E序列的登革热抗原。例如，本发明的组合物可有利地包含CYD-1、VDV-2、CYD-3和CYD-4。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列。如本文所述，本发明的组合物可有利地包含血清型2的登革热抗原，其包含与CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列具有至少90%同一性的序列。例如，所述序列可与CYD-LAV (SEQ ID NO: 8)、CYD-BID (SEQ ID NO: 9)、CYD-PR (SEQ ID NO: 10)、CYD-MD (SEQ ID NO: 11)或SEQ ID NO: 2的prM-E序列有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
待给予的本发明的疫苗登革热病毒的确切量可随待接种的患者的年龄和体重、给药频率以及组合物中的其它成分(例如佐剂)而变化。本发明的疫苗组合物中所包含的活的减毒登革热病毒的量的范围为约103-约107 CCID50。一般而言，本发明的疫苗组合物中所包含的血清型1-4各自的活的减毒登革热病毒的量的范围为约103-约106 CCID50或约103-约107 CCID50，例如范围为约5 x 103-约5 x 105 CCID50、例如范围为约1 x 104-约1 x 105 CCID50、例如约105 CCID50。本发明的疫苗组合物中所包含的血清型1-4各自的活的减毒登革热病毒的量的范围还可为约104-约107 CCID50，例如约106 CCID50。本发明的四价组合物中所包含的血清型1-4各自的活的减毒登革热病毒的量可相等。例如本发明的四价组合物可包含约105 CCID50的血清型1-4各自的活的减毒登革热病毒。或者，本发明的四价组合物可包含约106 CCID50的血清型1-4各自的活的减毒登革热病毒。本发明的疫苗组合物中所包含的嵌合登革热病毒(例如本文所述的YF/登革热嵌合体或Chimerivax (CYD)疫苗病毒)的量为约105 CCID50或约106 CCID50。本发明的疫苗组合物中所包含的活的减毒病毒例如VDV-2的量为约104 CCID50。一般而言，本发明的组合物中所包含的血清型1-4各自的灭活的登革热病毒的量的范围为约104-约108 CCID50当量，优选范围为约5 x 104-约5 x 107 CCID50当量，优选范围为约1 x 104-约1 x 106 CCID50当量，优选约105 CCID50当量。一般而言，组合物中所包含的血清型1-4各自的VLP的量的范围为约100ng-约100μg VLP，优选范围为约100ng-约50μg、优选范围为约100ng-约20μg、优选约1μg-10μg。VLP的量可通过ELISA测量。有利的是，本发明的疫苗组合物包含有效量的本文定义的登革热抗原。
本发明的疫苗组合物还可包含药学上可接受的载体或赋形剂。本发明的药学上可接受的载体或赋形剂意指任何溶剂或分散介质等，常用于药物和疫苗的制备中以提高活性剂的稳定性、无菌度和递送能力，且在人中不产生任何副反应，例如变态反应。根据所选的药物形式、给药方法和途径选择赋形剂。合适的赋形剂和有关药物制剂的要求描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences” (第19版，A.R. Gennaro编辑, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995))。药学上可接受的赋形剂的具体实例包括水、磷酸缓冲盐水(PBS)溶液和0.3%甘氨酸溶液。本发明的疫苗组合物可有利地包含0.4%盐水和2.5%人血清白蛋白(HSA)。
需要时，用于本发明方法的疫苗组合物可任选含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂山梨坦、油酸三乙醇胺、人血清白蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸、L-精氨酸盐酸盐、蔗糖、无水D-海藻糖(D-trehalose dehydrate)、山梨糖醇、三(羟甲基)氨基甲烷和/或脲。另外，疫苗组合物可任选包含药学上可接受的添加剂，包括例如稀释剂、粘合剂、稳定剂和防腐剂。优选的稳定剂描述于WO 2010/003670。
本发明的疫苗组合物可包含是登革热免疫蛋白质的登革热抗原。本文所用登革热免疫蛋白质是登革热包膜(E)蛋白或其衍生物或片段，当给予免疫活性受试者时诱导针对血清型1、2、3或4的登革热病毒的中和抗体。登革热免疫蛋白质包括登革热E蛋白的天然和衍生化形式，包括其化学缀合物、免疫片段和融合蛋白。
登革热免疫蛋白质或其衍生物或片段可与载体分子缀合。所述缀合可通过化学缀合技术或通过包含登革热免疫蛋白质或其衍生物或片段和载体分子的融合蛋白的重组表达来实现。可用于制备缀合物的载体分子的实例包括白喉类毒素、破伤风类毒素、破伤风毒素的片段C、包括CRM 197、CRM 176、CRM228、CRM 45、CRM 9、CRM 45、CRM 102、CRM 103和CRM 107在内的白喉毒素的突变体、肺炎球菌溶血素、OMPC、热休克蛋白、百日咳蛋白、肺炎球菌表面蛋白PspA或艰难梭菌(Clostridium difficile)的毒素A或B。
本发明的疫苗组合物可包含一种或多种佐剂以提高登革热抗原的免疫原性。本领域技术人员应能够选择在本发明的情况下是合适的佐剂。佐剂优选用于包含灭活病毒或VLP或登革热结构蛋白的本发明的疫苗组合物。佐剂可用于包含活的减毒病毒的本发明的疫苗组合物，只要所述佐剂不影响复制。
合适的佐剂包括铝盐例如氢氧化铝凝胶、磷酸铝或明矾，但还可以是钙、镁、铁或锌的盐。其它合适的佐剂包括酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混悬液。或者，佐剂可以是水包油乳液佐剂(EP 0 399 843B)，以及水包油乳剂和其它活性剂的组合(WO 95/17210、WO 98/56414、WO 99/12565和WO 99/11241)。描述了其它油乳液佐剂，例如油包水乳剂(美国专利号5,422,109、EP 0 480 982 B2)和水包油包水乳剂(美国专利号5,424,067、EP 0 480 981 B)。所述佐剂的实例包括MF59、AF03 (WO 2007/006939)、AF04 (WO 2007/080308)、AF05、AF06及其衍生物。佐剂还可以是皂甙、脂质A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基磷酸葡糖酰胺(alkyl glucosamide phosphate)、水包油乳液或其组合。皂甙的实例包括Quil A和其纯化的片段，例如QS7和QS21。
本领域技术人员认识到，适宜配制与预定给药途径相容的本发明的疫苗组合物。合适的给药途径的实例包括例如肌内、经皮、皮下、鼻内、口服或皮内。有利的是，给药途径为皮下。
可使用常规皮下注射器或安全注射器例如市购可获自Becton Dickinson Corporation (Franklin Lakes, NJ, USA)的注射器或射流注射器给予本发明的疫苗组合物。对于皮内给药，可使用利用Mantoux技术的常规皮下注射器或可使用专业的皮内递送装置例如BD Soluvia(TM)显微注射系统(Becton Dickinson Corporation, Franklin Lakes, NJ, USA)。
所给予的本发明的疫苗组合物的体积将取决于给药方法。在皮下注射的情况下，体积一般介于0.1和1.0 ml之间，优选约0.5 ml。
任选可在初次免疫后(即在给予初始免疫方案排定的最后剂量的给药之后)例如介于6个月和10年之间，例如6个月、1年、3年、5年或10年，使用本发明的疫苗组合物的加强给药。
按照一个实施方案，本发明还提供包含本发明的疫苗组合物和所述疫苗组合物在保护人类受试者免于登革热病的方法中的用法说明的药盒。药盒可包含本文考虑的任何疫苗组合物的至少1剂(通常在注射器中)。按照一个实施方案，药盒可包含本文所述任何疫苗组合物的多剂量制剂(通常在小瓶中)。药盒还包含提及所述疫苗组合物用于预防登革热病的用途或所述疫苗用于预防登革热病的用途的活页。活页还可提及接种方案和待接种的受试者人群。
可以多种方法测量本发明的疫苗组合物在降低登革热病的可能性或严重程度方面的功效。例如通过在给予至少1剂所述疫苗组合物后(例如在给予1、2或3剂所述疫苗组合物后)，测量接受所述疫苗组合物的受试者组中的以下方面，来计算本发明的疫苗组合物在降低有症状的病毒学上已证实的登革热病的可能性或严重程度上的功效：
(i) 由任何血清型的登革热病毒引起的有症状的病毒学上已证实的登革热病例的百分比；
(ii) 由任何血清型的登革热病毒引起的病毒学上已证实的重度登革热病例的百分比；
(iii) 由任何血清型的登革热病毒引起的I-IV级登革出血热病例的百分比；
(iv) 由任何血清型的登革热病毒引起的I级DHF病例的百分比；
(v) 由任何血清型的登革热病毒引起的II级DHF病例的百分比；
(vi) 由任何血清型的登革热病毒引起的III级DHF病例的百分比；
(vii) 由任何血清型的登革热病毒引起的IV级DHF病例的百分比；
(viii) 由任何血清型的登革热病毒引起的住院的病毒学上已证实的登革热的年发生率；和/或
(ix) 由任何血清型的登革热病毒引起的有症状的病毒学上已证实的登革热病例的住院时间长度；
并对所述测量与未接受所述疫苗组合物的受试者的对照组的等同测量进行比较，其中在所述两组中的受试者居住在登革热地方病区。当与未接种受试者的对照组比较时，接种受试者组中(i)-(ix)任一个或多个的统计显著性降低表明本发明的疫苗组合物的功效。在一个优选的实施方案中，通过上述测量的一个或多个的统计显著性降低，来证实本发明的疫苗组合物的功效，其中DHF病例或登革热病例由血清型1、3或4的登革热病毒引起。
还可通过在给予至少1剂所述疫苗组合物后(例如在给予1、2或3剂所述疫苗组合物后)，测量接受所述疫苗组合物且已发生病毒学上已证实的登革热病的受试者组的以下方面，来计算本发明的疫苗组合物在降低登革热病的严重程度或可能性中的功效：
(i) 发热的平均持续时间和/或强度；
(ii) 由血细胞比容的变化限定的血浆渗漏的平均值；
(iii) 血小板减少(血小板计数)的平均值；和/或
(iv) 包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)在内的肝酶水平的平均值；
并对所述测量与未接受所述疫苗组合物且已发生病毒学上已证实的登革热病的受试者的对照组的等同测量进行比较。当与已发生病毒学上已证实的登革热病的受试者的对照组比较时，已发生病毒学上已证实的登革热病的接种受试者组中(i)-(v)任一个或多个的统计显著性降低表明本发明的疫苗组合物在降低登革热病的严重程度或可能性中的功效。
通常，例如通过实施例1所述方法(VE=100*(1-IDCYD/ID对照)，其中ID为各组中的发病密度(即患有病毒学上已证实的登革热的人类受试者的数目除以有风险的人-年的数目(number of person-years at risk)))测量的，本发明针对登革热病的保护方法的功效为至少50%、优选至少60%，其中所述登革热病由血清型1、3或4引起。针对血清型3或4引起的登革热病的保护方法的功效有利地为至少70%、优选80%。针对由血清型4引起的登革热病的保护方法的功效有利地为至少90%。
2个氨基酸序列或2个核苷酸序列的百分比同一性通过标准比对算法确定，例如描述于Altschul等(1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410的基础局部比对工具(Basic Local Alignment Tool，BLAST)；Needleman等(1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453的算法；Meyers等(1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17或Tatusova等(1999) FEMS Microbiol. Lett., 174: 247-250等的算法。将所述算法整合到BLASTN、BLASTP和“BLAST 2 Sequences”程序中(参见www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST)。当应用所述程序时，可使用默认参数。例如，对于核苷酸序列，可使用“BLAST 2 Sequences”的下列设置：程序BLASTN，匹配奖励2，错配罚分-2，开放空位(open gap)和延长空位罚分分别为5和2，空位x~衰减50，预期10，字长11，筛选(filter) ON。对于氨基酸序列，可使用的下列设置“BLAST 2 Sequences”：程序BLASTP，矩阵BLOSUM62，开放空位(open gap)和延长空位罚分分别为11和1，空位x~衰减50，预期10，字长3，筛选(filter) ON。
要了解，本文公开的本发明的各种特征和优选的实施方案可以组合在一起。
在本申请中，引用了各种参考资料。这些参考资料的公开内容在此通过引用结合到本公开内容中。
将通过下列实施例对本发明作进一步说明。然而应了解，本发明由权利要求书限定，且这些实施例仅作为本发明的说明给出，并不以任何方式构成对其的限制。
实施例
实施例1：在泰国对接种包含Chimerivax? DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的四价登革热疫苗(TDV)组合物的患者的1年随访
方法
研究设计和参与者
针对病毒学上已证实的登革热病，对四价Chimerivax?疫苗(即包含由DEN1 PU0359 (TYP 1 140)的prM和E序列产生的特定CYD-1毒株、由DEN2 PUO218的prM和E序列产生的特定CYD-2毒株、由DEN3 PaH881/88的prM和E序列产生的特定CYD-3毒株和由DEN4 1228 (TVP 980)的prM和E序列产生的特定CYD-4毒株的四价疫苗，参见WO 03/101397和Guy等, Vaccine (2011), 29(42): 7229-41)的功效进行了观察者不知情的随机对照单中心IIb期试验。招募4002名根据病史和身体检查健康状态良好的年龄为4-11岁的学童进入试验。研究在Ratchaburi Regional Hospital (RRH), Ratchaburi province, Muang district, Thailand进行。不包括招募时有急性发热疾病的儿童、有先天性或获得性免疫缺陷的儿童和接受免疫抑制疗法或其它抑制性治疗(prohibited treatment)或疫苗的儿童。参与者以2:1随机分配，在第0、6和12个月时接受3剂登革热疫苗或对照制品。
制品
按以下文献所述，产生每种嵌合病毒并在Vero细胞上培养：WO 03/101397；Guy等, Hum. Vaccines (2010) 6 (9): 696；Guy等, Vaccine (2010) 28: 632；Guirakhoo等, J. Virol. (2000) 74: 5477；Guirakhoo等, J. Virol. (2001) 75 (16): 7290；Guirakhoo等, Virol. (June 20, 2002) 298: 146；以及Guirakhoo等, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761。
疫苗以冻干粉提供(之前保存在2℃和8℃之间的温度下)，用0.5 mL注射用溶剂(含有2.5%人血清白蛋白的0.4% NaCl)复溶。复溶时，各0.5 mL剂量的疫苗含有5 ± 1 log10 CCID50的各嵌合登革热血清型(1、2、3和4)和赋形剂(必需氨基酸、非必需氨基酸、L-精氨酸盐酸盐、蔗糖、无水D-海藻糖、山梨糖醇、三(羟甲基)氨基乙烷和脲)。对照制品是灭活的狂犬病疫苗(Verorab?，Sanofi Pasteur，Lyon France)，用于随机分配到对照组的前50名儿童的第1次注射，0·9% NaCl盐水安慰剂用于所有其它注射。所有制品皮下注射到上臂三角肌区。
评价
根据学期期间学校登记对旷课的每日监督(接着给旷课者打电话和家访)，且整个假期每周两次家访、打电话或移动电话短信，主动监视所有儿童以检测急性发热疾病。在发热疾病(定义为相隔至少4小时两次温度读数≥37.5℃的疾病)的任何情况下，要求父母带他们的孩子到RRH诊断和治疗。监视系统也捕捉在RRH的自发会诊(spontaneous consultation)。被≥14天的无症状时间间隔分隔开的连续发热发作被视为单独发作。在发生时(即在发热开始后不多于7天收集的急性期样品)和7-14天后(恢复期样品)收集配对血清样品，并送往Sanofi Pasteur’s Global Clinical Immunology (GCI)实验室(Swiftwater, PA, USA)和送往疫苗开发中心(Centre for Vaccine Development) (CVD, Mahidol University, Thailand)。采用初始RT-PCR测定法，针对黄病毒的存在筛选急性期样品，该测定法检测任何黄病毒的存在(使用包含高度保守的黄病毒序列的引物)。如本文所述，用血清型特异性定量RT-PCR针对野生型登革热病毒测试阳性样品。平行地，使用商品化ELIS药盒(Platelia?，Bio-Rad Laboratories，Marnes-La-Coquette，France)，针对登革热NS1抗原的存在测试所有急性期样品。登革热病的病毒学上已证实的发作定义为在血清型特异性RT-PCR或NS1抗原ELISA中为阳性结果。
保持主动监视直到在第3次接种后跟踪各参与者至少13个月且直到独立数据监测委员会(Independent Data Monitoring Committee，IDMC)证实在符合方案(per-protocol, PP)人群中已发生≥27例病例。
在最后一次接种后，记录所有严重的不良事件(SAE)直到第6个月，再之后记录任何致死SAE或疫苗相关SAE。
在RRH，在前300名入选儿童中，评价了在招募时和在每次注射后的28天收集的血清中的登革热免疫应答。在第3次注射后第28天，还前瞻性地收集了所有参与者的血清以评价从该时间点起发生的病毒学上已证实的登革热的儿童的免疫应答。血清被送往GCI以采用本文所述蚀斑减少中和试验(PRNT50)测量针对CYD亲代登革热病毒的血清型特异性中和抗体滴度。测定的定量限为10 (1/dil)。低于该值的样品被指定为滴度5，并被视为血清反应阴性。
统计分析
主要目的是按照以下等式，在按计划招募和接种的儿童中，确定针对在第3次接种后超过28天发生的有症状的病毒学上已证实的登革热病例的疫苗功效(VE)：VE =100*(1-IDCYD/ID对照)，其中ID为各组中的发病密度(即患有病毒学上已证实的登革热的儿童数除以有风险的人-年的数目)。其假定发病率为1.3%，真实VE为70%，在第3次接种后最少跟踪时间为1年，且符合方案(PP)受试者退出率(attrition rate)为7.5%/年，需要以2:1比率分配到登革热疫苗或对照的4002名受试者以超过82%效能和95%置信度来证实VE非零。分析基于应用以下精确方法(Exact method)计算的VE的双侧95%置信区间(CI)：(Breslow NE, Day NE. Statistical Methods in Cancer Research, 第II卷 - The Design and Analysis of Cohort Studies. International Agency for Research on Cancer (IARC科技出版号82), Lyon, France)。对PP人群进行了主要分析，所述PP人群即满足招募标准的人，其正确地在第0、6 (±15天)和12 (±30天)天接受了所有3剂指定疫苗，且对其组分配不是公开的。在接受3次注射的人中，对功效的全分析集重复了该分析。作为第二目的，在完成3剂接种方案前，测定针对登革热的VE。在揭盲后限定的分析中，分别对针对各血清型的VE进行了研究。使用95%CI，对安全性和免疫原性终点的研究是描述性的。
结果
4002名招募的儿童中，95.9%完成接种，91.8%包括在功效的符合方案(PP)分析集中。疫苗和对照组的年龄和性别相当。对于针对登革热或JEV的抗体，在基线采样的超过90%的样品为阳性。
功效
在研究期间，131例登革热病例(131名儿童有136次发作)是病毒学上已证实的。当此当中，在PP人群中，77例发生在第3次注射后超过28天，并包括在主要分析中：45例发生在疫苗组中的有风险的2522人-年期间，而32例发生在对照组中的有风险的1251人-年期间。相应的疫苗功效为30·2% (95%CI：?13·4-56·6)。该发现在全分析集中被证实(参见下表1)。至少1次注射后的功效为33·4% (95%CI：4·1-53·5)，在至少2次注射后为35·3% (95%CI：3·3-56·5)。
表1：血清型特异性和CYD四价登革热疫苗针对病毒学上已证实的登革热病的总体功效
事后分析显示血清型的不同功效(参见表1)。与针对DENV2的1.7%相比，在至少1次注射后针对DENV1、DENV3和DENV4的功效的范围为61·2%-90·0%。与针对DENV2的15.6%相比，在3次注射后针对DENV1、DENV3和DENV4的功效的范围为55.3%-100%。
在获得病毒学上已证实的登革热的那些受试者中，当与对照组相比时，在接种疫苗组中观察到年住院发生率统计显著性降低。3剂后的相对风险(RR)为0.523 (参见表2)。
表2：试验期间住院的病毒学上已证实的登革热的发生率
表3：按血清型区分的住院率
免疫原性
在符合方案分析集中，在疫苗组中，在第3次注射后第28天针对登革热血清型1-4的中和抗体的几何平均滴度(GMT)分别为146 (95%CI：98·5-217)、310 (224-431)、405 (307-534)和155 (123-196)。在对照组中，这些值为23·9 (14·0-40·9)、52·2 (26·8-102)、48·9 (25·5-93·9)和19·4 (11·6-32·2)。1年后，血清型1、2、3和4的GMT分别为76.5、122、94和153。
安全性
在该期研究期间有584例SAE：在疫苗组中报告了366例，占参与者的11.8% (315/2666)，在对照组中报告了218例，占参与者的13.2% (176/1331)。在登革热组中无疫苗相关SAE，在对照组中有1例。所观察到的SAE是与年龄组一致的医学病况，并显示在接种期后7和28天内无聚类(clustering)。
在接受疫苗者中作为突破发生的病毒学上已证实的登革热病例不比在对照组中发生的那些病例严重。
试验中传播性野生型血清型2毒株的prM-E区域的序列
测定了在试验中引起DEN-2病例的野生型血清型2毒株的prM-E区域的核苷酸和氨基酸序列。这些分别由以下SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。试验中引起DEN-2病例的血清型2毒株的E和M氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO: 18和23。
>核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)
ttccatctaaccacacgcaacggagaaccacacatgatcgtcggtatacaggagaaagggaaaagtcttctgttcaaaacagaggatggtgtgaacatgtgcaccctcatggctatggaccttggtgaattgtgtgaagacacaatcacgtacaagtgtcctcttctcaggcagaatgagccagaagacatagactgttggtgcaactccacgtccacgtgggtaacctatgggacctgtaccactacgggagaacataggagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggaatgggactggagacgcgaaccgaaacatggatgtcatcagaaggggcttggaaacatgcccagagaattgaaacttggatcctgagacatccaggcttcaccataatggcagcaatcctggcatacaccataggaacgacacatttccagagagtcctgattttcatcctactgacagctgtcgctccttcaatgacaatgcgttgcataggaatatcaaatagagactttgtagaaggggtttcaggaggaagttgggttgacatagtcttagaacatggaagctgtgtgacgacgatggcaaaaaacaaaccaacattggatttcgaactgataaaaacggaagccaaacagcctgccaccctaaggaagtactgcatagaagcaaaactaaccaacacaacaacagaatcccgttgcccaacacaaggggaacccagcctaaaagaagagcaggacaagaggttcgtctgcaaacactccatggtagacagaggatggggaaatggatgtggattatttggaaagggaggcattgtgacctgtgctatgttcacatgcaaaaagaacatggaagggaaaatcgtgcaaccagaaaacttggaatacaccattgtggtaacacctcactcaggggaagagcatgcggtcggaaatgacacaggaaaacacggcaaggaaatcaaagtaacaccacagagttccatcacagaagcagaactgacaggttatggcaccgtcacgatggagtgctccccgagaacaggcctcgacttcaatgagatggtgttgctgcagatggaaaataaagcttggctggtgcataggcaatggtttctagacctgccattaccatggctgcccggagcggataaacaagaatcaaattggatacagaaagaaacattggtcactttcaaaaatccccatgcgaagaaacaggatgttgttgttttaggatcccaagaaggggccatgcatacagcactcacaggagccacagaaatccaaatgtcgtcaggaaacttgctcttcactggacatctcaagtgcaggctgagaatggacaagctacagcttaaaggaatgtcatactctatgtgcacaggaaagtttaaagttgtgaaggaaatagcagaaacacaacatggaacgatagttatcagagtgcaatatgaaggggacggctctccatgtaaaattccttttgagataatggatttggaaaaaagatatgtcttaggccgcctgatcacagtcaacccaattgtaacagaaaaagacagcccagtcaacatagaagcagaacctccattcggagacagttacatcatcataggagtagagccgggacaactgaagctcaactggttcaagaaaggaagttctatcggccaaatgtttgagacaacgatgagaggggcgaagagaatggccattttgggtgacacagcctgggacttcggatccctgggaggagtgtttacatctataggaaaagctctccaccaagtctttggagcgatctatggggctgccttcagtggggtttcatggaccatgaaaatcctcataggagtcattatcacatggataggaatgaactcacgcagcacctcactgtctgtgtcactggtactggtgggaattgtgacactgtatttaggagtcatggtgcaggcc
>氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)
FHLTTRNGEPHMIVGIQEKGKSLLFKTEDGVNMCTLMAMDLGELCEDTITYKCPLLRQNEPEDIDCWCNSTSTWVTYGTCTTTGEHRREKRSVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRHPGFTIMAAILAYTIGTTHFQRVLIFILLTAVAPSMTMRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLKEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVVTPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKVTPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADKQESNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRYVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIVTLYLGVMVQA
>氨基酸序列(SEQ ID NO: 18)
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLKEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVVTPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKVTPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADKQESNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRYVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIVTLYLGVMVQA
>氨基酸序列(SEQ ID NO: 23)
SVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRHPGFTIMAAILAYTIGTTHFQRVLIFILLTAVAPSMT
讨论
该研究的主要结果是基于嵌合CYD病毒的针对登革热的安全有效的疫苗是可能的。针对DENV1、3和4的估计功效在与70%假设一致的范围内，并且在至少1次接种后是统计显著性的。未观察到在针对DENV2的与70%假设一致的范围内的功效。因为DENV2在该研究中是流行血清型(prevalent serotype)，在这种情况下，总体疫苗功效减弱。
疫苗的安全性和反应原性特征(reactogenicity profile)良好，无疫苗相关SAE，并且在评审中在主动跟踪超过2600名疫苗接种者两年间所收集的AE和SAE期间，未鉴定到安全信号。因针对4种登革热血清型的不完全免疫应答所致与登革热病的发生率或严重程度潜在提高有关的理论安全顾虑之前妨碍了疫苗开发。在该试验中，在针对传播性DENV2病毒的不完全免疫应答存在下没有疾病增强是重要的和令人安慰的结果。例如，就例如发热持续时间等因素而言或就例如出血、血浆渗漏或血小板减少等登革热的经典临床征象而言，接受疫苗者中的病例与对照中的病例没有不同。此外，与试验期间任何点上的对照相比，接受疫苗者中的重度登革热不更常见。
还证实了当与对照组相比时，在获得病毒学上已证实的登革热的那些受试者中，在接种疫苗组中观察到年住院发生率统计显著性降低。在获得血清型2的病毒学上已证实的登革热的那些受试者中观察到这种降低(参见表3)。
有关DENV2所观察到的结果可通过多个起作用的因素来解释。例如，在试验中引起疾病的CYD2疫苗病毒和DENV2病毒之间存在可能的抗原错配。在1990年代，出现在东南亚的DENV2的亚洲1基因型，替代了之前占优势的亚洲/美洲病毒谱系。在E蛋白的结构域2中鉴定出的几个突变(E83，特别是E226和E228)暗示变化中的病毒适合度和抗原性。CYD2疫苗的供体野生型病毒(和用于PRNT50的攻击毒株)是1980年得自曼谷的临床分离株(Guirakhoo F等, J Virol 2000, 74: 5477-85)。虽然该病毒也归类为属于亚洲I基因型，但在该病毒(因此在CYD2)中的上述关键氨基酸残基对应于亚洲/美洲基因型的哪些(Hang等, PLoS Negl Trop Dis. 2010年7月20日; 4(7): e757)。
另外，在CYD2疫苗的prM-E序列中有2个极端罕见的突变，其也可归因于错配的免疫应答。这些突变位于prM24和E251位处(Guirakhoo等, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761)。
针对DENV2所观察到结果与在PRNT50测定法中不存在免疫原性没有关联。在接种后针对DENV2的中和抗体反应高于针对DENV1和DENV3的中和抗体反应。
综上所述，本研究构成首次曾经证明，安全和有效的登革热疫苗是可能的，并代表了登革热疫苗开发中的重要里程碑。
实施例2：血清型2的优化登革热疫苗毒株的鉴定
本实施例的目的是鉴定血清型2的登革热病毒毒株，其为产生针对血清型2的登革热病毒的优化登革热疫苗组合物提供基础，其中当用于本发明的方法时，与Chimerivax? CYD-2相比，所述优化的登革热疫苗组合物提供改进的功效。
用于确定世界性登革热2抗原的优化毒株选择的标准包括：(i)最近传播的毒株；(ii)亚洲和美洲毒株之间的平衡选择；(iii)优化毒株应具有这样的prM-E序列，其尽可能地类似于计算出的总共有序列(global consensus sequence)，所述共有序列通过比对可获得的血清型2的登革热病毒的prM-E序列产生；(iv)应避免预测影响抗体识别的氨基酸变异；(v)应避免prM和E序列中特定位置上的稀有氨基酸，尤其是在E蛋白胞外域中(在特定位置上的稀有氨基酸定义为在小于15%的比对序列中的该位置上出现的氨基酸)；(vi)优选一些之前实验室经验存在的优化毒株，和(vii)在四价组合物中导致平衡的免疫应答的登革热抗原。确定地方性登革热2抗原的优化毒株选择的标准(即针对特定地区传播的野生型登革热病毒特别有效)为标准(i)和(vii)。
方法
数据库
序列从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)登革热病毒变异数据库检索(www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/VirusVariation/Database/nph-select.cgi?tax_id=12637)。
序列分析
序列比对应用MUSCLE算法进行( Edgar, R. C. (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput (MUSCLE：具有高精确度和高通量的多序列比对). Nucleic Acids Res, 32(5):1792-1797)。
序列比对输出在Vector NTi第9版，模块AlignX (Invitrogen)中产生。序列相似性检索应用BLAST算法进行(Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W.和Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool (基础局部比对搜索工具). J Mol Biol, 215(3):403-410)。
prM-E序列的序列编号
PrM-E序列中所包括的亚序列可以不同方式编号：(i)总的prM-E蛋白序列从1位到661位编号，其preM蛋白质序列指定为1位到90/91位，M蛋白序列指定为91/92位-166位，E蛋白序列指定为167位-661位；(ii) prM和M蛋白序列在一起编号，即从总序列的1位-166位，E单独从1位-495位编号；(iii) prM、M和E序列分别编号，即prM从1位-90/91位编号，M从1位到75/76位编号，E从1位到495位编号。
结果
公共序列检索
所有可获得的登革热病毒血清型2全长prM和E蛋白序列自NCBI登革热数据库下载。序列下载发生在两个单独的时间 - 2010年10月4日和2011年。在第一时间下载了669个序列，在第二时间下载了约3200个序列。
总共有序列产生
在各个时间，对全部所检索的蛋白质序列进行比对以产生血清型2登革热病毒的prM和E蛋白的总共有序列。根据定义，总共有序列是在各个位置上含有最频繁遇到的氨基酸的人工序列。2010比对和2011比对的总共有序列只有2个氨基酸之差。在2010比对中，E蛋白的总共有序列分别在129和308位含有异亮氨酸和缬氨酸(参照1-495 E序列编号)，相比之下，在2011比对中，E蛋白的总共有序列分别在129和308位上含有缬氨酸和异亮氨酸(参照1-495 E序列编号)。2010和2011总共有序列中的差异通过如下事实解释：在所述位置上含有缬氨酸或异亮氨酸的毒株各自的百分比接近50%。因此如下表示prM-E序列的总共有序列：
fhlttrngephmivgrqekgksllfktedgvnmctlmaidlgelcedtitykcpllrqnepedidcwcnststwvtygtctttgehrrekrsvalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftimaailaytigtthfqralifilltavapsmtMRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKXVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKZVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQA (SEQ ID NO: 3)
如下表示E序列的总共有序列：
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKXVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKZVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQA (SEQ ID NO: 12)
在上述序列中，总共有prM序列以小写字母表示，E序列以大写字母表示。注明为X (E序列的129位)和Z (E序列的308位)的氨基酸位置各自独立地为Val或Ile，即在这些位置上比对的氨基酸序列(包括Val或Ile)的比例接近50%。
Chimerivax? CYD2序列的少量氨基酸残基的确定和分析
由含有以至少5%比对序列变化的所有氨基酸位置的总比对，建立可变氨基酸位置列表。另外，还鉴定了不匹配总共有序列的Chimerivax? CYD2的prM和E蛋白序列的任何氨基酸。结果见表4 (N.B.，在该表中，prM和M蛋白序列共同编号，即从总序列的1位-166位编号，E单独从1位-495位编号)。
表4：登革热病毒血清型2可变残基和CYD2比较
在prM和E序列中鉴定出总共41个氨基酸位置，其以至少5%的比对序列而不同于总共有序列和/或不同于CYD2中的prM和E蛋白的序列。CYD2中prM和E蛋白序列的10个氨基酸位置不同于总共有序列(E中5个位置，M中2个位置，其前体部分中3个，参见表4)。10个不同残基中有5个呈现接近50:50的变动分布(variation distribution)，表明了天然可变的位置。CYD2 prM-E序列中仅3个位置以非常少的改变出现(pr-24 Val、M-125 Ile和E-251 Phe)。
E和M蛋白中改变的影响分析
为了进一步得到可变位置，还进一步分析了E蛋白胞外域(氨基酸1-395) (通过免疫系统进行血清中和的最重要的结构域)的变化。
利用可获自血清型2的登革热病毒E蛋白的可溶性胞外域已公布的3D结构的信息(Modis，Y.等(2003) Proc Natl Acad Sci U S A，100(12)：6986-6991)，重构了登革热病毒颗粒表面的3D模型。这允许微调来自E胞外域的各个氨基酸的可及性的评价，这进而与氨基酸变化的变动性水平和性质联用以评价CYD2变异对抗体识别的潜在影响。
分析证实来自总共有序列的Chimerivax? CYD2序列中的2个改变(E蛋白的Val 141和Val 164)完全埋在3D结构中，因此不能在病毒粒子表面与抗体直接相互作用。E蛋白的129位是介于Val (Chimerivax? CYD2)和Ile (总共有序列)之间的50:50可变氨基酸位置，且取代也是完全保守的变化。因此这些变动的潜在影响被视为非常有限。
E蛋白中203位的变动(Chimerivax? CYD2中的Asn和总共有序列中的Asp)可能具有影响(完全暴露的残基，电荷的变化)，但毒株间变动的分布接近50:50，表明了天然可变的位置。
Chimerivax? CYD2的E蛋白的251位的变动(Chimerivax? CYD2中的Phe和总共有序列中的Val)在检索的毒株中极罕见。所述变动对被抗体识别可能有一些影响，因为它罕见，极充分地暴露在病毒体的表面(29%)，且相当于非保守氨基酸变化。
上述建模分析在E蛋白中鉴定出可能对抗体识别具有潜在影响的其它2个位置变动(226和228位)，虽然Chimerivax? CYD2在这些位置上没有不同于总共有序列。因此在鉴定优化血清型2毒株方面，对于世界性登革热2疫苗，优选避免在所述位置上与总共有序列的变动(即226位的Thr和228位的甘氨酸)。
虽不受理论束缚，但本发明人认为还可采用评分方法，评价氨基酸变动的影响，该方法考虑多个相关因素。特别是该方法考虑了基因组位置的变动(G)、氨基酸性质的变化(B)、3D作图(M)和在所述位置上的已知变体(DB)，其中按G x B x M x DB计算评分。0分可归类为无预期影响，>0-10的评分可归类为低预期影响，>10-25的评分可归类为中等预期影响，>25的评分可归类为高预期影响。
如果氨基酸位于prM/M蛋白的M部分(即prM/M序列的92-166位)中或E蛋白的396-495位中，则基因组位置(G)评分为0。如果氨基酸位于prM/M蛋白的prM部分(即prM/M序列的1-91位)中或E蛋白的1-395位中，则基因组位置评分为1。
按B = 100 - [(Blosum95评分+ 6) x 10]计算与氨基酸性质的变化(B)有关的评分，其中不同氨基酸取代的Blosum95评分如下表5所示。
表5
M值取决于氨基酸是否位于prM/E界面。例如，对于如实施例1中使用的CYD2，位于该界面的氨基酸为prM残基6、7、39、40、46-54、56、59-65、67、74和77和E残基64-72、82-84、101-104、106-108和244-247。当氨基酸位于该界面时，M等于1。如果氨基酸不位于该界面，则M = Y x SAS%。如果氨基酸位于“上”位(即指向外部环境)，则Y为1；如果氨基酸位于分子“侧” (即氨基酸既不指向外部环境也不指向衣壳)，则Y为0.5，如果氨基酸位于“下”位(即指向衣壳)，则Y为0。应用Discovery Studio 3D建模软件(Accelrys, Inc., CA, USA)产生溶剂可及性表面% (SAS%)值。
当氨基酸取代导致在该取代位置上的氨基酸是存在于GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的登革热序列中该位置的最常见氨基酸时，DB值为0。当氨基酸取代导致在该取代位置的氨基酸以超过5%的存在于数据库中的登革热序列(但不是该位置上的最常见氨基酸)存在时，则DB值为0.25。当氨基酸取代导致在该取代位置的氨基酸以小于5%的存在于数据库中的登革热序列(唯一取代除外)存在时，则DB值为0.50。当取代氨基酸是唯一的，则DB值为1。
复制期间，病毒可获得导致氨基酸取代的突变。上述方法提供确定所述突变对突变病毒子代的作用的手段。
优选的序列(即被视为令人满意地接近已鉴定的共有序列的序列)可具有：(i)至多两个、优选一个或无高影响氨基酸取代；(ii)至多3个、优选两个或一个或无中等影响氨基酸取代；和/或(iii)至多5、4、3、2或1个低影响氨基酸取代。
优化的血清型2毒株的鉴定
根据上述选择标准鉴定优化的血清型2毒株。
进行了BLAST搜索以鉴定在所有可获得的序列中与prM-E总共有序列具有最接近的序列的毒株。未发现与prM-E总共有序列有100%同一性的序列，但最佳命中是得自毒株BID-V585 (NCBI蛋白质编号ACA58343；基因组编号EU529706；2006年自波多黎各分离)的序列，该序列只显示与总共有序列在91位处的一个变动(总共有序列中的Val和BID-V585中的Ile)。BID-V585 prM-E序列与Chimerivax? CYD-2 prM-E序列相比含有13个变动。
进行了进一步的毒株选择以提供毒株起源的地理平衡。因此选择在BLAST分析中显示良好评分的最近分离的亚洲毒株(毒株MD-1280；NCBI蛋白质编号CAR65175；基因组编号FM21043；2004年自越南分离)。尽管显示在prM-E中具有总共有序列的6个变动，但6个变动中的3个被鉴定为在超过30%的毒株中天然变化的多变位置。MD-1280 prM-E序列含有与Chimerivax? CYD-2 prM-E序列区分的15个变动。
根据大量之前积累的有关毒株的经验进行进一步的毒株选择。它是PDK53-16681毒株，亦称为LAV-2毒株，一种来源于来自Mahidol University的登革热血清型2 16681毒株的活的减毒病毒(NCBI蛋白质编号AAA73186；基因组编号M84728；1964年自泰国分离；Blok, J.等(1992)；Virology 187 (2)，573-590)。LAV-2 prM-E序列含有与总共有序列区分的10个变动，与Chimerivax? CYD-2 prM-E序列区分的13个变动。
基于上述标准选择的另一个毒株是毒株PR/DB023 (NCBI蛋白质编号AEN71248；基因组编号JF804036；2007年自波多黎各分离)。PR/DB023 prM-E序列含有与总共有序列区分的3个变动，与Chimerivax? CYD-2 prM-E序列区分的13个变动。
所选择的毒株无一含有存在于Chimerivax? CYD-2 prM-E序列的稀有氨基酸，即在prM-24处的Val、M-125处的Ile和E-251处的Phe。
四个所选毒株的PrM-E核苷酸序列
>LAV-2 prME核苷酸序列(SEQ ID NO: 4)
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大写字母：E编码序列；小写字母：prM编码序列
> BID/V585 - prME核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)
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>PR/DB023 prME核苷酸序列(SEQ ID NO: 6)
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>MD1280 prME核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)
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四个所选毒株相应的蛋白质prM-E序列
>LAV2 prME蛋白序列(SEQ ID NO: 8)
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>LAV2 E蛋白序列(SEQ ID NO: 13)
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>LAV2 M蛋白序列(SEQ ID NO: 19)
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>BID/V585 prME蛋白序列(SEQ ID NO: 9)
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>BID/V585 E蛋白序列(SEQ ID NO: 14)
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>BID/V585 M蛋白序列(SEQ ID NO: 20)
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>PR/DB023 prME蛋白序列(SEQ ID NO: 10)
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>PR/DB023 E蛋白序列(SEQ ID NO: 15)
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>PR/DB023 M蛋白序列(SEQ ID NO: 21)
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>MD1280 prME蛋白序列(SEQ ID NO: 11)
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>MD1280 E蛋白序列(SEQ ID NO: 16)
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>MD1280 M蛋白序列(SEQ ID NO: 22)
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>共有M序列(SEQ ID NO: 17)
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实施例3：相当于优化血清型2嵌合病毒的cDNA克隆的构建和编码病毒的产生
基本按照Chambers等人(1999，J. Virology 73(4): 3095-3101)的教导，采用Chimerivax?技术来实现相当于优化血清型2毒株的嵌合登革热病毒的构建。还可参照国际专利申请WO 98/37911、WO 03/101397、WO 07/021672、WO 08/007021、WO 08/047023和WO 08/065315，其详细描述了用于构建CYD-1、CYD2、CYD-3和CYD-4的类似方法。然而简单地说，如下构建相当于优化血清型2毒株的嵌合登革热病毒(注意：优化嵌合登革热病毒使用YF毒株YF17D204 (YF-VAX(R)，Sanofi-Pasteur，Swiftwater, PA, USA)的基因组骨架构建)。
质粒pSP1101的构建
YF-VAX cDNA克隆-pJSY2284.1 (pACYC YF-Vax 5-3)的构建
构建了YF-VAX的全长感染性cDNA克隆。全长感染性cDNA克隆以YF-VAX的序列为基础。低拷贝数质粒pACYC177 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA)用来装配全长cDNA克隆。
通过GeneArt?合成称为SP6 YF-Vax 5-3的DNA序列。以利于全长YF-Vax cDNA克隆的容易装配的方式设计SP6 YF-Vax 5-3的序列。序列长2897 bp，包含Xma I-SP6启动子；YF-Vax 5’UTR；衣壳；prM；M；E的部分，其延伸至Apa I位点接着用于装配的独特位点Mlu I-Sap I-Ngo MI-Aat II-Cla I；NS5的部分；并进一步延伸至3’ UTR接着Nru I位点，其用于脱去。这种合成的DNA序列的侧翼是EcoR V和Xho I位点。在用EcoR V/Xho I消化后，然后将该DNA片段克隆至低拷贝数质粒pACYC177的Aat II/Xho I位点以置换1615bp Aat II/Xho I片段。所得质粒pJSY2284.1 (pACYC YF-Vax 5-3)通过序列分析证实。
跨越位点Apa I、Mlu I、Sap I、Ngo MI、Aat II和Cla I的YF-Vax cDNA片段的RT-PCR和克隆和YF-vax的全长感染性cDNA克隆的装配(pJSY2374.5)
使黄热病疫苗YF-VAX在Vero细胞中生长，并浓缩病毒颗粒。从浓缩的病毒中提取YF-VAX的病毒RNA，并通过反转录酶产生cDNA拷贝。本文所示5个cDNA片段经PCR扩增、TOPO克隆、测序，并与YF-VAX 2003的序列比较。各片段中发现的PCR错误通过位点定向诱变或片段交换纠正。在TOPO克隆后有太多序列不同存在于Ngo MI-Aat II片段中，因此，该片段通过GeneArt?合成。在最终的序列证实后，分离5个DNA片段；Apa I-Mlu I、Mlu I-Sap I、Sap I-Ngo M1、Ngo MI-Aat II和Aat II-Cla I，并逐步克隆至质粒pJSY2284.1中的独特位点Apa I、Mlu I、Sap I、Ngo MI、Aat II和Cla I中以得到质粒pJSY2374.5，其被证实含有YF-VAX全长cDNA的正确序列。
用于来源于LAV2毒株的优化嵌合登革热病毒的cDNA的构建(pSP1101)
策略是采用Chimerivax?技术，在含有YF-VAX基因组的pJSY2374.5质粒中用LAV2毒株的prM和E基因置换YF-VAX?疫苗毒株的prM和E基因，如前进行以构建CYD-1、CYD-2、CYD-3和CYD-4登革热疫苗。所得质粒为pSP1101。
在pJSY2374中，用于克隆的限制位点为Xma I和Mlu I。这些位点位于3000 bp片段的上游和下游，所述片段含有：SP6启动子、YF17D 5’UTR、YF17D-衣壳、YF17D-prM、YF17D-E和YF17D-NS1的N末端。相当于该片段但取而代之含有侧翼是Xma I和Mlu I位点的LAV2的prM和E基因的序列通过GeneArt?合成，并克隆至质粒pMK-RQ (GeneArt?，Life Technologies Ltd，Paisley，U.K.)中以产生质粒pMK-RQ-Seq1。质粒pJSY2374.5和pMK-RQ-Seq1用Xma I和Mlu 1消化。然后将来自pMK-RQ-Seq1的Xma I-Mlu I片段插入质粒pJSY2374.5中以形成质粒pSP1101。XL-10 Gold Ultracompetent细菌(Agilent Technologies, CA, USA)用于转化，因为它们适于大的质粒。在第二步中，将阳性克隆转移至One Shot? TOP10大肠杆菌(E. coli) (Life Technologies Ltd，Paisley，U.K.)中，这允许大量扩增大尺寸质粒。
质粒pSP1101因此允许用YF-VAX复制引擎表达LAV2毒株prM和E蛋白。所得嵌合病毒命名为CYD-LAV。测序分析显示与原始序列相比无突变。
用于毒株BID-V585、PR/DB023和MD1280的相应质粒的构建
采用类似于上文所述的策略以构建对应于血清型2毒株BID-V585、PR/DB023和MD1280的质粒。这些质粒命名为pSP1102 (BID-V585)、pSP1103 (PR/DB023)和pSP1104 (MD1280)。从这些质粒产生的所得嵌合病毒命名为CYD-BID、CYD-PR和CYD-MD。所产生的质粒的序列分析显示与起始序列相比无突变。
自质粒pSP1101、pSP1102、pSP1103和pSP1104产生嵌合病毒
RNA的体外转录和病毒的产生按之前所描述的进行(Guirakhoo F等J. Virol. 2001；75:7290-304)。
实施例4. 在墨西哥的黄病毒-幼稚成人中评价四价登革热疫苗制剂
本研究的目的是对包含CYD-1 (即从DEN1 PU0359 (TYP 1 140)的prM和E序列产生的特殊的Chimerivax登革热血清型1 (CYD-1)毒株)、VDV2、CYD-3 (即从DEN3 PaH881/88的prM和E序列产生的特殊的Chimerivax登革热血清型3 (CYD-3)毒株)和CYD-4 (即从DEN4 1228 (TVP 980)的prM和E序列产生的特殊的Chimerivax登革热血清型4 (CYD-4)毒株)的混合四价登革热疫苗的免疫原性和病毒血症与包含CYD-1、CYD-2 (即自DEN2 PUO218的prM和E序列产生的特殊的Chimerivax登革热血清型2 (CYD-2)毒株)、CYD-3和CYD-4的四价登革热疫苗的免疫原性和病毒血症进行比较。有关用于本研究的特定CYD-1、CYD-2、CYD-3和CYD-4的更多详情参见实施例1。
VDV2毒株的相关核苷酸和蛋白质序列如下：
>VDV2核苷酸序列(SEQ ID NO: 24)
AGUUGUUAGUCUACGUGGACCGACAAAGACAGAUUCUUUGAGGGAGCUAAGCUCAAUGUAGUUCUAACAGUUUUUUAAUUAGAGAGCAGAUCUCUGAUGAAUAACCAACGGAAAAAGGCGAAAAACACGCCUUUCAAUAUGCUGAAACGCGAGAGAAACCGCGUGUCGACUGUGCAACAGCUGACAAAGAGAUUCUCACUUGGAAUGCUGCAGGGACGAGGACCAUUAAAACUGUUCAUGGCCCUGGUGGCGUUCCUUCGUUUCCUAACAAUCCCACCAACAGCAGGGAUAUUGAAGAGAUGGGGAACAAUUAAAAAAUCAAAAGCUAUUAAUGUUUUGAGAGGGUUCAGGAAAGAGAUUGGAAGGAUGCUGAACAUCUUGAAUAGGAGACGCAGAUCUGCAGGCAUGAUCAUUAUGCUGAUUCCAACAGUGAUGGCGUUCCAUUUAACCACACGUAACGGAGAACCACACAUGAUCGUCAGCAGACAAGAGAAAGGGAAAAGUCUUCUGUUUAAAACAGAGGUUGGCGUGAACAUGUGUACCCUCAUGGCCAUGGACCUUGGUGAAUUGUGUGAAGACACAAUCACGUACAAGUGUCCCCUUCUCAGGCAGAAUGAGCCAGAAGACAUAGACUGUUGGUGCAACUCUACGUCCACGUGGGUAACUUAUGGGACGUGUACCACCAUGGGAGAACAUAGAAGAGAAAAAAGAUCAGUGGCACUCGUUCCACAUGUGCGAAUGGGACUGGAGACACGAACUGAAACAUGGAUGUCAUCAGAAGGGGCCUGGAAACAUGUCCAGAGAAUUGAAACUUGGAUCUUGAGACAUCCAGGCUUCACCAUGAUGGCAGCAAUCCUGGCAUACACCAUAGGAACGACACAUUUCCAAAGAGCCCUGAUUUUCAUCUUACUGACAGCUGUCACUCCUUCAAUGACAAUGCGUUGCAUAGGAAUGUCAAAUAGAGACUUUGUGGAAGGGGUUUCAGGAGGAAGCUGGGUUGACAUAGUCUUAGAACAUGGAAGCUGUGUGACGACGAUGGCAAAAAACAAACCAACAUUGGAUUUUGAACUGAUAAAAACAGAAGCCAAACAGCCUGCCACCCUAAGGAAGUACUGUAUAGAGGCAAAGCUAACCAACACAACAACAGAAUCUCGCUGCCCAACACAAGGGGAACCCAGCCUAAAUGAAGAGCAGGACAAAAGGUUCGUCUGCAAACACUCCAUGGUAGACAGAGGAUGGGGAAAUGGAUGUGGACUAUUUGGAAAGGGAGGCAUUGUGACCUGUGCUAUGUUCAGAUGCAAAAAGAACAUGGAAGGAAAAGUUGUGCAACCAGAAAACUUGGAAUACACCAUUGUGAUAACACCUCACUCAGGGGAAGAGCAUGCAGUCGGAAAUGACACAGGAAAACAUGGCAAGGAAAUCAAAAUAACACCACAGAGUUCCAUCACAGAAGCAGAAUUGACAGGUUAUGGCACUGUCACAAUGGAGUGCUCUCCAAGAACGGGCCUCGACUUCAAUGAGAUGGUGUUGCUGCAGAUGGAAAAUAAAGCUUGGCUGGUGCACAGGCAAUGGUUCCUAGACCUGCCGUUACCAUGGUUGCCCGGAGCGGACACACAAGAGUCAAAUUGGAUACAGAAGGAGACAUUGGUCACUUUCAAAAAUCCCCAUGCGAAGAAACAGGAUGUUGUUGUUUUAGGAUCCCAAGAAGGGGCCAUGCACACAGCACUUACAGGGGCCACAGAAAUCCAAAUGUCAUCAGGAAACUUACUCUUCACAGGACAUCUCAAGUGCAGGCUGAGAAUGGACAAGCUACAGCUCAAAGGAAUGUCAUACUCUAUGUGCACAGGAAAGUUUAAAGUUGUGAAGGAAAUAGCAGAAACACAACAUGGAACAAUAGUUAUCAGAGUGCAAUAUGAAGGGGACGGCUCUCCAUGCAAGAUCCCUUUUGAGAUAAUGGAUUUGGAAAAAAGACAUGUCUUAGGUCGCCUGAUUACAGUCAACCCAAUUGUGACAGAAAAAGAUAGCCCAGUCAACAUAGAAGCAGAACCUCCAUUUGGAGACAGCUACAUCAUCAUAGGAGUAGAGCCGGGACAACUGAAGCUCAACUGGUUUAAGAAAGGAAGUUCUAUCGGCCAAAUGUUUGAGACAACAAUGAGGGGGGCGAAGAGAAUGGCCAUUUUAGGUGACACAGCCUGGGAUUUUGGAUCCUUGGGAGGAGUGUUUACAUCUAUAGGAAAGGCUCUCCACCAAGUCUUUGGAGCAAUCUAUGGAGCUGCCUUCAGUGGGGUUUCAUGGACUAUGAAAAUCCUCAUAGGAGUCAUUAUCACAUGGAUAGGAAUGAAUUCACGCAGCACCUCACUGUCUGUGACACUAGUAUUGGUGGGAAUUGUGACACUGUAUUUGGGAGUCAUGGUGCAGGCCGAUAGUGGUUGCGUUGUGAGCUGGAAAAACAAAGAACUGAAAUGUGGCAGUGGGAUUUUCAUCACAGACAACGUGCACACAUGGACAGAACAAUACAAAUUCCAACCAGAAUCCCCUUCAAAACUAGCUUCAGCUAUCCAGAAAGCCCAUGAAGAGGACAUUUGUGGAAUCCGCUCAGUAACAAGACUGGAGAAUCUGAUGUGGAAACAAAUAACACCAGAAUUGAAUCACAUUCUAUCAGAAAAUGAGGUGAAGUUAACUAUUAUGACAGGAGACAUCAAAGGAAUCAUGCAGGCAGGAAAACGAUCUCUGCGGCCUCAGCCCACUGAGCUGAAGUAUUCAUGGAAAACAUGGGGCAAAGCAAAAAUGCUCUCUACAGAGUCUCAUAACCAGACCUUUCUCAUUGAUGGCCCCGAAACAGCAGAAUGCCCCAACACAAAUAGAGCUUGGAAUUCGUUGGAAGUUGAAGACUAUGGCUUUGGAGUAUUCACCACCAAUAUAUGGCUAAAAUUGAAAGAAAAACAGGAUGUAUUCUGCGACUCAAAACUCAUGUCAGCGGCCAUAAAAGACAACAGAGCCGUCCAUGCCGAUAUGGGUUAUUGGAUAGAAAGUGCACUCAAUGACACAUGGAAGAUAGAGAAAGCCUCUUUCAUUGAAGUUAAAAACUGCCACUGGCCAAAAUCACACACCCUCUGGAGCAAUGGAGUGCUAGAAAGUGAGAUGAUAAUUCCAAAGAAUCUCGCUGGACCAGUGUCUCAACACAACUAUAGACCAGGCUACCAUACACAAAUAACAGGACCAUGGCAUCUAGGUAAGCUUGAGAUGGACUUUGAUUUCUGUGAUGGAACAACAGUGGUAGUGACUGAGGACUGCGGAAAUAGAGGACCCUCUUUGAGAACAACCACUGCCUCUGGAAAACUCAUAACAGAAUGGUGCUGCCGAUCUUGCACAUUACCACCGCUAAGAUACAGAGGUGAGGAUGGGUGCUGGUACGGGAUGGAAAUCAGACCAUUGAAGGAGAAAGAAGAGAAUUUGGUCAACUCCUUGGUCACAGCUGGACAUGGGCAGGUCGACAACUUUUCACUAGGAGUCUUGGGAAUGGCAUUGUUCCUGGAGGAAAUGCUUAGGACCCGAGUAGGAACGAAACAUGCAAUACUACUAGUUGCAGUUUCUUUUGUGACAUUGAUCACAGGGAACAUGUCCUUUAGAGACCUGGGAAGAGUGAUGGUUAUGGUAGGCGCCACUAUGACGGAUGACAUAGGUAUGGGCGUGACUUAUCUUGCCCUACUAGCAGCCUUCAAAGUCAGACCAACUUUUGCAGCUGGACUACUCUUGAGAAAGCUGACCUCCAAGGAAUUGAUGAUGACUACUAUAGGAAUUGUACUCCUCUCCCAGAGCACCAUACCAGAGACCAUUCUUGAGUUGACUGAUGCGUUAGCCUUAGGCAUGAUGGUCCUCAAAAUGGUGAGAAAUAUGGAAAAGUAUCAAUUGGCAGUGACUAUCAUGGCUAUCUUGUGCGUCCCAAACGCAGUGAUAUUACAAAACGCAUGGAAAGUGAGUUGCACAAUAUUGGCAGUGGUGUCCGUUUCCCCACUGUUCUUAACAUCCUCACAGCAAAAAACAGAUUGGAUACCAUUAGCAUUGACGAUCAAAGGUCUCAAUCCAACAGCUAUUUUUCUAACAACCCUCUCAAGAACCAGCAAGAAAAGGAGCUGGCCAUUAAAUGAGGCUAUCAUGGCAGUCGGGAUGGUGAGCAUUUUAGCCAGUUCUCUCCUAAAAAAUGAUAUUCCCAUGACAGGACCAUUAGUGGCUGGAGGGCUCCUCACUGUGUGCUACGUGCUCACUGGACGAUCGGCCGAUUUGGAACUGGAGAGAGCAGCCGAUGUCAAAUGGGAAGACCAGGCAGAGAUAUCAGGAAGCAGUCCAAUCCUGUCAAUAACAAUAUCAGAAGAUGGUAGCAUGUCGAUAAAAAAUGAAGAGGAAGAACAAACACUGACCAUACUCAUUAGAACAGGAUUGCUGGUGAUCUCAGGACUUUUUCCUGUAUCAAUACCAAUCACGGCAGCAGCAUGGUACCUGUGGGAAGUGAAGAAACAACGGGCCGGAGUAUUGUGGGAUGUUCCUUCACCCCCACCCAUGGGAAAGGCUGAACUGGAAGAUGGAGCCUAUAGAAUUAAGCAAAAAGGGAUUCUUGGAUAUUCCCAGAUCGGAGCCGGAGUUUACAAAGAAGGAACAUUCCAUACAAUGUGGCAUGUCACACGUGGCGCUGUUCUAAUGCAUAAAGGAAAGAGGAUUGAACCAACAUGGGCGGACGUCAAGAAAGACCUAAUAUCAUAUGGAGGAGGCUGGAAGUUAGAAGGAGAAUGGAAGGAAGGAGAAGAAGUCCAGGUAUUGGCACUGGAGCCUGGAAAAAAUCCAAGAGCCGUCCAAACGAAACCUGGUCUUUUCAAAACCAACGCCGGAACAAUAGGUGCUGUAUCUCUGGACUUUUCUCCUGGAACGUCAGGAUCUCCAAUUAUCGACAAAAAAGGAAAAGUUGUGGGUCUUUAUGGUAAUGGUGUUGUUACAAGGAGUGGAGC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>VDV2 prME核苷酸序列(SEQ ID NO: 25)
UUCCAUUUAACCACACGUAACGGAGAACCACACAUGAUCGUCAGCAGACAAGAGAAAGGGAAAAGUCUUCUGUUUAAAACAGAGGUUGGCGUGAACAUGUGUACCCUCAUGGCCAUGGACCUUGGUGAAUUGUGUGAAGACACAAUCACGUACAAGUGUCCCCUUCUCAGGCAGAAUGAGCCAGAAGACAUAGACUGUUGGUGCAACUCUACGUCCACGUGGGUAACUUAUGGGACGUGUACCACCAUGGGAGAACAUAGAAGAGAAAAAAGAUCAGUGGCACUCGUUCCACAUGUGCGAAUGGGACUGGAGACACGAACUGAAACAUGGAUGUCAUCAGAAGGGGCCUGGAAACAUGUCCAGAGAAUUGAAACUUGGAUCUUGAGACAUCCAGGCUUCACCAUGAUGGCAGCAAUCCUGGCAUACACCAUAGGAACGACACAUUUCCAAAGAGCCCUGAUUUUCAUCUUACUGACAGCUGUCACUCCUUCAAUGACAAUGCGUUGCAUAGGAAUGUCAAAUAGAGACUUUGUGGAAGGGGUUUCAGGAGGAAGCUGGGUUGACAUAGUCUUAGAACAUGGAAGCUGUGUGACGACGAUGGCAAAAAACAAACCAACAUUGGAUUUUGAACUGAUAAAAACAGAAGCCAAACAGCCUGCCACCCUAAGGAAGUACUGUAUAGAGGCAAAGCUAACCAACACAACAACAGAAUCUCGCUGCCCAACACAAGGGGAACCCAGCCUAAAUGAAGAGCAGGACAAAAGGUUCGUCUGCAAACACUCCAUGGUAGACAGAGGAUGGGGAAAUGGAUGUGGACUAUUUGGAAAGGGAGGCAUUGUGACCUGUGCUAUGUUCAGAUGCAAAAAGAACAUGGAAGGAAAAGUUGUGCAACCAGAAAACUUGGAAUACACCAUUGUGAUAACACCUCACUCAGGGGAAGAGCAUGCAGUCGGAAAUGACACAGGAAAACAUGGCAAGGAAAUCAAAAUAACACCACAGAGUUCCAUCACAGAAGCAGAAUUGACAGGUUAUGGCACUGUCACAAUGGAGUGCUCUCCAAGAACGGGCCUCGACUUCAAUGAGAUGGUGUUGCUGCAGAUGGAAAAUAAAGCUUGGCUGGUGCACAGGCAAUGGUUCCUAGACCUGCCGUUACCAUGGUUGCCCGGAGCGGACACACAAGAGUCAAAUUGGAUACAGAAGGAGACAUUGGUCACUUUCAAAAAUCCCCAUGCGAAGAAACAGGAUGUUGUUGUUUUAGGAUCCCAAGAAGGGGCCAUGCACACAGCACUUACAGGGGCCACAGAAAUCCAAAUGUCAUCAGGAAACUUACUCUUCACAGGACAUCUCAAGUGCAGGCUGAGAAUGGACAAGCUACAGCUCAAAGGAAUGUCAUACUCUAUGUGCACAGGAAAGUUUAAAGUUGUGAAGGAAAUAGCAGAAACACAACAUGGAACAAUAGUUAUCAGAGUGCAAUAUGAAGGGGACGGCUCUCCAUGCAAGAUCCCUUUUGAGAUAAUGGAUUUGGAAAAAAGACAUGUCUUAGGUCGCCUGAUUACAGUCAACCCAAUUGUGACAGAAAAAGAUAGCCCAGUCAACAUAGAAGCAGAACCUCCAUUUGGAGACAGCUACAUCAUCAUAGGAGUAGAGCCGGGACAACUGAAGCUCAACUGGUUUAAGAAAGGAAGUUCUAUCGGCCAAAUGUUUGAGACAACAAUGAGGGGGGCGAAGAGAAUGGCCAUUUUAGGUGACACAGCCUGGGAUUUUGGAUCCUUGGGAGGAGUGUUUACAUCUAUAGGAAAGGCUCUCCACCAAGUCUUUGGAGCAAUCUAUGGAGCUGCCUUCAGUGGGGUUUCAUGGACUAUGAAAAUCCUCAUAGGAGUCAUUAUCACAUGGAUAGGAAUGAAUUCACGCAGCACCUCACUGUCUGUGACACUAGUAUUGGUGGGAAUUGUGACACUGUAUUUGGGAGUCAUGGUGCAGGCC 
>VDV2 E蛋白序列(SEQ ID NO: 26)
MRCIGMSNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFRCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQESNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVTLVLVGIVTLYLGVMVQA
>VDV2 M蛋白序列(SEQ ID NO: 27)
SVALVPHVRMGLETRTETWMSSEGAWKHVQRIETWILRHPGFTMMAAILAYTIGTTHFQRALIFILLTAVTPSMT
研究设计
在开放的随机对照IIa期试验中，在墨西哥城的两个中心招募150名年龄为18-45岁的健康成人，墨西哥城是登革热无病区。主要的排除标准为：妊娠或哺乳、人免疫缺陷病毒、乙型或丙型肝炎血清阳性、免疫缺陷或可能干扰结果的任何其它慢性病、之前在高登革热地方流行性的地区居住或旅行>2周、黄病毒感染史或针对黄病毒病的既往接种。要求能够受孕的女性使用有效的避孕方法或在第1次注射前至少4周节欲直到最后一次注射后至少4周。
参与者被随机分配到2组，在第0天和第105 (±15天)天进行接种。各组接受下列制剂：
第1组：混合CYD/VDV2四价制剂，即包含CYD-1、CYD-3、CYD4和VDV2的制剂。
第2组：对照四价制剂(CYD-TDV)，即CYD-1、CYD-2、CYD-3和CYD-4。
制剂含有105 CCID50的CYD病毒的各个血清型，并将含有104 CCID50的VDV-2病毒的制剂给予第1组。
病毒血症
为了评价疫苗的安全性，在每次注射后7、14和21天收集的血清中评价CYD-1-4或VDV-2的存在情况。通过Global Clinical Immunology实验室(Sanofi Pasteur，Swiftwater, PA, USA)进行分析。
如之前Poo等, Pediatr Infect Dis J (2011) 30: e9中的描述，分两步进行CYD-1-4病毒血症的分析。简单地说，第一，采用非血清型特异性的反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)以检测4种CYD病毒的任一种的存在。然后采用4个CYD血清型特异性定量RT-PCR对在该第一试验中呈阳性的样品进行分析。在非血清型特异性RT-PCR中，使用商用试剂盒，从血清中提取RNA，并用来自黄热病核心基因序列的引物进行RT-PCR。在血清型特异性RT-PCR中，再次使用商用试剂盒从血清中提取RNA，针对各个血清型，用来自包膜非结构蛋白1连接基因序列的血清型特异性引物进行RT-PCR。在第1组中针对血清型2进行登革热RT-PCR，因为给予该组的四价混合制剂含有VDV-2病毒。
免疫原性
通过对在每次注射后的28天以及在第1次注射后第365天收集的血清的50%蚀斑减少中和试验，测定4种登革热病毒血清型每一种的抗体水平。简单地说，将2倍系列稀释的热灭活的血清与恒定攻击剂量的各登革热血清型DEN-1、-2、-3或-4混合(表示为蚀斑形成单位[PFU]/mL)。将混合物接种在汇合的VERO细胞单层的24孔板的各孔中。在接种几天后，通过蚀斑的形成表明登革热病毒感染。以血清的最高倒数稀释度(1/dil)计算中和抗体滴度，在之下观察到病毒蚀斑计数≥50%减少(PRNT50)。登革热PRNT50的定量下限为10；滴度≥10的样品被视为血清阳性。
结果
在研究的第0天和第105天将制剂给予第1组和第2组的参与者。在第1次或第2次接种后就注射部位或全身反应原性而言，两组间没有显著差异。在每次注射后7、14和21天收集的血清中评价病毒血症(表6)。在每次注射后的28天和在第1次注射后第365天，测量中和抗体滴度(表7)。
表6. 在第1次和第2次注射后7、4或21天的疫苗病毒的病毒血症(患有可检测的和可定量的病毒血症的n (%))
在第1次注射之后，在两组参与者中以相似的比例观察到可检测的病毒血症，通过非血清型特异性RT-PCR试验测定(参见表6)。在大部分的病例中，病毒血症低于定量下限。用血清型特异性测定法的分析表明，CYD-4是最常检出的血清型，接着是CYD-3。在第1组中在第2次注射混合CYD/VDV疫苗后或在第2组中注射CYD-TDV疫苗后，通过非血清型特异性测定法，只在每组一个参与者中检出病毒血症。
因此，通过混合CYD/VDV和CYD-TDV诱导的病毒血症水平之间没有显著差异。
表7. 登革热抗体在第1次和第2次注射后28天和在第1次注射之后365天的几何平均滴度(95%置信区间)
从表7中可见，与CYD-TDV疫苗(第2组)相比，混合CYD/VDV疫苗(第1组)的第2次注射诱导针对登革热病毒的血清型2的更高的GMT。在第1剂后365天，在混合CYD/VDV组中还观察到对血清型2的反应改进。
此外，当与接受CYD-TDV疫苗的组(第2组)相比时，混合CYD/VDV疫苗(第1组)的第2次注射导致针对登革热病毒的所有血清型的中和抗体反应改进。重要的是，与在第1次注射后第365天的CYD-TDV组相比，混合CYD/VDV制剂组显示针对登革热病毒更持久的中和抗体反应。
因此实施例总体上表明，混合的CYD-1、3、4/VDV2疫苗制剂诱导针对登革热病毒血清型的免疫应答比CYD-TDV疫苗更强并更持久，同时显示类似的安全特征，如通过病毒血症水平所测定的。
序列表
SEQ ID NO. 序列
1 prM+E CYD23传播性毒株核苷酸序列
2 prM+E CYD23传播性毒株蛋白质序列
3 prM+E共有血清型2蛋白质序列
4 prM+E LAV2核苷酸序列
5 prM+E BID/V585核苷酸序列
6 prM+E PR/DB023核苷酸序列
7 prM+E MD1280核苷酸序列
8 prM+E LAV2蛋白质序列
9 prM+E BID/V585蛋白质序列
10 prM+E PR/DB023蛋白质序列
11 prM+E MD1280蛋白质序列
12 E共有血清型2蛋白质序列
13 E LAV2蛋白质序列
14 E BID/V585蛋白质序列
15 E PR/DB023蛋白质序列
16 E MD1280蛋白质序列
17 M共有血清型2蛋白质序列
18 E CYD23传播性毒株蛋白质序列
19 M LAV2蛋白质序列
20 M BID/V585蛋白质序列
21 M PR/DB023蛋白质序列
22 M MD1280蛋白质序列
23 M CYD23传播性毒株蛋白质序列
24 VDV2的完整核苷酸序列(RNA等同物)
25 prM+E VDV2核苷酸序列(RNA等同物)
26 E VDV2蛋白质序列
27 M VDV2蛋白质序列
在所列出的核苷酸序列中，当核苷酸序列为DNA时，核苷酸T可被核苷酸U置换以得到DNA序列的RNA等同物。同样，当核苷酸序列为RNA时，核苷酸U可被核苷酸T置换以得到等同的DNA序列。上列DNA序列构成所述登革热病毒的cDNA序列，因此等同的RNA序列构成这些登革热病毒的正链RNA。

Claims (41)

1.一种用于保护人类受试者免于登革热病的方法的疫苗组合物，其中所述组合物包含：
(i) 选自以下的登革热抗原：
(a) 活的减毒登革热病毒；
(b) 灭活的登革热病毒；
(c) 活的减毒或灭活的嵌合登革热病毒；
(d) 登革热病毒样颗粒(VLP)；和
(e) (a)-(d)的两种或更多种的组合；
或
(ii) 能够在人细胞中表达登革热抗原的核酸构建体或病毒载体，所述登革热抗原是登革热VLP。
2.权利要求1的组合物，其中所述人为4-11岁。
3.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述受试者居住在登革热病区。
4.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述受试者是黄病毒免疫的。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述受试者是首次接触黄病毒的。
6.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述方法降低登革热病的发生率或可能性。
7.前述权利要求中任一项的组合物，其中登革热病是病毒学上已证实的。
8.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述登革热病由血清型1、血清型3或血清型4的登革热病毒引起。
9.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述方法包括以多剂量给予所述组合物。
10.权利要求8的组合物，其中所述方法包括以3剂或更多剂给予所述组合物。
11.权利要求8或权利要求9的组合物，其中第1剂和第3剂相隔约12个月给予。
12.权利要求8-10中任一项的组合物，其中所述方法包括以第1剂、第2剂和第3剂给予所述组合物，且其中所述第2剂在所述第1剂后约6个月给予，且其中所述第3剂在所述第1剂后约12个月给予。
13.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包含血清型1的登革热抗原、血清型2的登革热抗原、血清型3的登革热抗原和血清型4的登革热抗原。
14.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包含活的减毒登革热病毒或活的减毒嵌合登革热病毒。
15.权利要求13的组合物，其中所述血清型1、2、3和4的登革热抗原各自独立选自活的减毒登革热病毒或活的减毒嵌合登革热病毒。
16.权利要求15的组合物，其中所述血清型1、3和4的登革热抗原各自为活的减毒嵌合登革热病毒，且所述血清型2的登革热抗原选自活的减毒登革热病毒和活的减毒嵌合登革热病毒，优选活的减毒登革热病毒。
17.权利要求16的组合物，其中所述血清型2的登革热抗原是活的减毒登革热病毒，其包含与SEQ ID NO: 24所示序列具有至少90%序列同一性的核酸序列。
18.权利要求15的组合物，其中所述血清型1、2、3和4的登革热抗原各自为活的减毒嵌合登革热病毒。
19.权利要求1-18中任一项的组合物，其中所述组合物包含活的减毒嵌合登革热病毒。
20.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述嵌合登革热病毒包含来自登革热病毒的一种或多种蛋白质和来自不同黄病毒的一种或多种蛋白质。
21.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述嵌合登革热病毒包含来自一种血清型的登革热病毒的一种或多种蛋白质和来自不同血清型的登革热病毒的一种或多种蛋白质。
22.权利要求19或20的组合物，其中所述不同的黄病毒是黄热病病毒。
23.权利要求21或22的组合物，其中所述黄热病病毒是毒株YF17D。
24.权利要求13-23中任一项的组合物，其中所述嵌合登革热病毒包含登革热病毒的prM-E序列。
25.权利要求13-20和22-24中任一项的组合物，其中所述嵌合登革热病毒包含其prM-E序列已被登革热病毒的prM-E序列置换的黄热病病毒基因组。
26.权利要求13-25中任一项的组合物，其中所述组合物包含CYD-1、CYD-2、CYD-3和CYD-4的prM-E序列。
27.按照权利要求13-20和22-26中任一项的组合物，其中所述组合物包含CYD-1、CYD-2、CYD-3和CYD-4。
28.权利要求13-17、19-20和22-25和21-25中任一项的组合物，其中所述组合物包含CYD-1、VDV-2、CYD-3和CYD-4。
29.权利要求13-28中任一项的组合物，其中所述登革热病毒的至少一种血清型以约103-约106 CCID50的量存在。
30.权利要求13-28中任一项的组合物，其中所述登革热病毒的至少一种血清型以约103-约107 CCID50的量存在。
31.权利要求27或权利要求29的组合物，其中所述组合物包含登革热病毒的所有4种血清型，且所述血清型的每一种以约103-约106 CCID50的量存在。
32.权利要求30的组合物，其中所述组合物包含登革热病毒的所有4种血清型，且所述血清型的每一种以约103-约107 CCID50的量存在。
33.权利要求13-32中任一项的组合物，其中所述登革热病毒的至少一种血清型以约105 CCID50的量存在。
34.权利要求13-32中任一项的组合物，其中所述登革热病毒的至少一种血清型以约106 CCID50的量存在。
35.权利要求31的组合物，其中所述组合物包含登革热病毒的所有4种血清型，且所述血清型的每一种以约105 CCID50的量存在。
36.权利要求32的组合物，其中所述组合物包含登革热病毒的所有4种血清型，且所述血清型的每一种以约106 CCID50的量存在。
37.前述权利要求中任一项的组合物，其中将所述组合物冻干。
38.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述方法包括通过皮下途径将所述组合物给予所述人类受试者。
39.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。
40.一种保护人类受试者免于登革热病的方法，其中所述方法包括给予所述人类受试者有效量的权利要求1-39中任一项的组合物。
41.一种药盒，所述药盒包含权利要求1-39中任一项的组合物和在保护人类受试者免于登革热病的方法中使用所述组合物的使用说明书。
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