BRPI0609949A2 - flavivìrus recombinante, seu uso na preparação de vacina, composição farmacêutica compreendendo o mesmo, molécula de ácido nucléico e método para atenuar candidato a vacina de flavivìrus - Google Patents

Abstract

FLAVIVìRUS RECOMBINANTE, SEU USO NA PREPARAçãO DE VACINA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMPREENDENDO O MESMO, MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO E MéTODO PARA ATENUAR CANDIDATO A VACINA DE FLAVIVìRUS. A presente invenção refere-se a vacinas de fíavivírus recombinantes que podem ser usadas na prevenção e tratamento da infecção por flavivírus. As vacinas da invenção contém flavivírus recombinantes que incluem mutações atenuantes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINAS DE FLAVIVÍRUS RECOMBINANTES".

Antecedentes da Invenção

A presente invenção refere-se a vacinas que incluem flavivírusrecombinantes.

Flavivírus são vírus de RNA de filamento positivo, pequenos,envelopados que são geralmente transmitidos por mosquitos e carrapatosinfectados. Vários flavivírus, tais como os da febre amarela, dengue, encefa-lite japonesa, encefalite transmitida pelo carrapato e vírus do Nilo Ocidental,representam ameaças reais ou potenciais à saúde pública global. O vírus dafebre amarela, por exemplo, tem sido a causa de epidemias em certas loca-lizações de selva da África sub-Saariana, assim como em algumas partes daAmérica do Sul. Apesar de muitas infecções pelo vírus da febre amarela se-rem leves, a doença também pode causar enfermidade severa, que ameaçaa vida. A fase inicial ou aguda do estado de doença é normalmente caracte-rizada por febre alta, calafrios, dor de cabeça, dor nas costas, dor muscular,perda do apetite, náusea e vômito. Após três a quatro dias esses sintomasdesaparecem. Em alguns pacientes, os sintomas então reaparecem, e a do-ença entra na assim chamada fase tóxica. Durante essa fase, febre alta rea-parece e pode,levar ao choque, sangramento (por exemplo, sangramento daboca, nariz, olhos e/ou estômago), insuficiência renal e insuficiência hepáti-ca. De fato, a insuficiência hepática causa a icterícia, que é o amarelamentoda pele e do branco dos olhos e assim dá à "febre amarela" o seu nome.Cerca da metade dos pacientes que entram na fase tóxica morrem dentro de10 a 14 dias. Entretanto, pessoas que se recuperam da febre amarela temimunidade por toda vida contra a reinfecção. O número de pessoas infecta-das com o vírus da febre amarela durante as duas últimas décadas vemaumentando, com cerca de 200.000 casos de febre amarela atualmente, ecerca de 30.000 mortes associadas, a cada ano. O ressurgimento do vírusda febre amarela então representa uma séria preocupação de saúde pública.

O vírus do Nilo Ocidental (WN) tem ampla distribuição na África,subcontinente indiano, Europa, Ucrânia, Rússia, Ásia Central e OrienteMédio (Monath & Heinz, em Virology 3â Ed., Fields et al., Eds., Lippincott-Raven, pp. 961-1034, 1995). Em 1999, uma epidemia sem precedentes deencefalite em humanos e cavalos causada pelo vírus WN ocorreu nos Esta-dos Unidos (Enserik, Science 286:1450-1451, 1999). Desde então o vírus setornou permanentemente estabelecido nas Américas, afetando aproximada-mente todo o território dos U.S. Até aqui, o ano recorde em termos de mor-bidade/mortalidade nos U.S. foi 2003, com 9862 casos relatados, dos quaisaproximadamente um terço foram acompanhados por sintomas neurológi-cos, e 264 mortes. A doença humana varia de uma doença leve semelhantea dengue até a meningo-encefalite fatal, com a enfermidade mais severaocorrendo nos mais idosos. Até agora, não há tratamento medicamentosoeficaz contra o vírus do Nilo Ocidental e métodos de vigilância e prevençãonão estão causando impacto significativo no número de casos de infecçãohumana. Os riscos do vírus migrar para a América do Sul, assim como epi-demias em países subdesenvolvidos, são extremamente altos. O desenvol-vimento de uma vacina segura e eficaz contribuirá para o controle de epide-mias futuras.

Os flavivírus, incluindo o vírus da febre amarela e o vírus do NiloOcidental, tem duas propriedades biológicas principais responsáveis por suaindução de estados de doença em humanos e animais. A primeira dessasduas propriedades é o neurotropismo, que é a tendência do vírus invadir einfectar o tecido nervoso do hospedeiro. A infecção neurotrópica do flavivíruspode resultar em inflamação e lesão do cérebro e medula espinhal (isto é,encefalite), consciência prejudicada, paralisia e convulsões. A segunda des-sas propriedades biológicas de flavivírus é o viscerotropismo, que é a ten-dência do vírus invadir e infectar órgãos viscerais vitais, incluindo o fígado,rim e coração. A infecção viscerotrópica do flavivírus pode resultar em infla-mação e lesão do fígado (hepatite), rim (nefrite) e músculo cardíaco (miocar-dite), levando a falência ou disfunção desses órgãos.

O neurotropismo e o viscerotropismo parecem ser propriedadesdistintas e separadas dos flavivírus. Alguns flavivírus são primariamente neu-rotrópicos (tal como, o vírus do Nilo Ocidental), outros são primariamenteviscerotrópicos (por exemplo, vírus da febre amarela e vírus da dengue) eoutros ainda exibem ambas as propriedades (tal como, o vírus da doença daFloresta de Kyasanur). Entretanto, tanto o neurotropismo como o viscerotro-pismo estão presentes em algum grau em todos os flavivírus. Dentro dohospedeiro, uma interação entre viscerotropismo e neurotropismo é possívelocorrer, por que a infecção de vísceras ocorre antes da invasão do sistemanervoso central. Assim, o neurotropismo depende da habilidade do vírus dese replicar em órgãos extraneurais (vísceras). Essa replicação extraneuralproduz viremia, que por sua vez é responsável pela invasão do cérebro e damedula espinhal.

Os vírions maduros de flavivírus, completamente processados,contem três proteínas estruturais, capsídeo (C), membrana (M) e envelope(E). Sete proteínas não estruturais (NSI, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, eNS5) são produzidas em células infectadas. Ambos os domínios virais deligação ao receptor e de fusão se encontram dentro da proteína E. Além dis-so, a proteína E também é um componente desejável de vacinas de flaviví-rus, já que anticorpos contra essa proteína podem neutralizar a infecciosida-de do vírus e conferir proteção ao hospedeiro contra a doença. Flavivírionsimaturos encontrados em células infectadas contem proteína pré-membrana(prM) que é uma precursora da proteína M. As proteínas de flavivírus sãoproduzidas por tradução de-um único molde aberto de leitura, longa, para ge-rar uma poliproteína, seguida por uma série complexa de clivagens proteolíti-cas pós-traducionais da poliproteína, para gerar as proteínas virais maduras(Amberg et al., J. Virol. 73:8063-8094, 1999; Rice, "Flaviviridade", em Virology,Fields et al., Ed., Raven-Lippincott, Nova Iorque, Volume I, p. 937, 1995). Asproteínas estruturais do vírus estão arranjadas na região N-terminal da poli-proteína na ordem C-prM-E, enquanto que as proteínas não estruturais estãolocalizadas na região C-terminal, na ordem observada acima.

Vacinas vivas conferem as respostas imunes protetoras maispotentes e duráveis contra a doença causada por infecções virais. No casode flavivírus, o desenvolvimento de uma vacina bem-sucedida requer que aspropriedades de virulência sejam modificadas, para que o vírus da vacinatenha neurotropismo e viscerotropismo reduzido para humanos ou animais.Várias abordagens diferentes têm sido usadas no desenvolvimento de vaci-nas contra flavivírus. No caso do vírus da febre amarela, duas vacinas (febreamarela 17D e vacina neurotrópica francesa) foram desenvolvidas por pas-sagens seriadas (Monath, "Yellow Fever", em Plotkin & Orenstein, Vaccines,3- Ed. Sunders, Filadélfia, pp. 815-879, 1999). A vacina 17D da febre amare-la foi desenvolvida por passagem seriada em tecido de embrião de galinha eresultou em um vírus com neurotropismo e viscerotropismo significativamen-te reduzidos. A vacina neurotrópica francesa foi desenvolvida por passagensseriadas do vírus em tecido cerebral de camundongo, e resultou em perdado viscerotropismo, mas manteve o neurotropismo. De fato, uma alta inci-dência de acidentes neurológicos (encefalite pós-vacinal) foi associada como uso da vacina francesa.

Outra abordagem para atenuação envolve a construção de flavi-vírus quiméricos, que incluem componentes de dois (ou mais) flavivírus dife-rentes. Flavivírus quiméricos tem sido feitos incluindo proteínas estruturais enão estruturais de flavivírus diferentes. Por exemplo, a assim chamada tec-nologia ChimeriVax® emprega as proteínas do capsídeo e não estruturais dovírus 17D da febre amarela para liberar as proteínas do envelope (prM e E)de outros flavivírus (veja, por exemplo, Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999). De fato, essa tecnologia tem sido usada para desenvolver vaci-nas candidatas contra o vírus da dengue, o vírus da encefalite japonesa, ovírus do Nilo Ocidental e o vírus da encefalite de St. Louis (SLE) (veja, porexemplo, Pugachev et al., em New Generation Vaccines, 3à ed., Levine etal., eds., Mareei Dekker, Nova Iorque, Basel, pp. 559-571, 2004; Chamberset al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999; Guirakhoo et al., Virology 257:363-372,1999; Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999; Guirakhoo et al., J. Virol.74:5477-5485, 2000; Arroyo et al., Trends Mol. Med. 7:350-354, 2001; Gui-rakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004; Guirakhoo et al., J. Virol.78:9998- 10008, 2004; Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003;Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004; e Pugachev et al., Am. J. Trop.Med. Hyg. 71 :639- 645, 2004). Essas são vacinas virais vivas que, da mes-ma forma que a vacina YF17D, fazem surgir respostas imunes humorais ecelulares acentuadas direcionadas contra um vírus heterólogo desejado.Com base na extensa caracterização de ChimeriVax®-JE e vacinas de den-gue, as principais características das vacinas ChimerVax® que tem sido ob-servadas incluem a habilidade de se replicar em títulos elevados em célulasde substrato (7logi0 pfu/ml ou superior), baixa neuro-virulência em camun-dongos desmamados e jovens (significativamente menor em comparaçãocom YF17D), alta atenuação em testes formais com macacos para neuro-virulência e viscerotropismo, alta estabilidade genética e fenotípica in vitro ein vivo, replicação ineficiente em mosquitos, o que é importante para preve-nir a disseminação sem controle na natureza, e a indução de imunidade pro-tetora robusta em camundongos, macacos e humanos acompanhando aadministração de uma única dose, sem efeitos colaterais sérios pós-imunização.

Em outras abordagens para atenuação, a mutagênese de flaviví-rus, incluindo flavivírus quiméricos, tem sido experimentada. Várias aborda-gens experimentais de atenuação de patógenos de flavivírus selvagens têmsido descritas (veja, por exemplo, revisado por Pugachev et al., Int. J. Para-sito!. 33:567-582, 2003). Por exemplo, foi descoberto que mutações em cer-tos aminoácidõs das proteínas do envelope de flavivírus quiméricos incluindoas proteínas do capsídeo e não estruturais de vírus da febre amarela e pro-teínas de membrana e do envelope do vírus da encefalite japonesa, do vírusda dengue ou vírus do Nilo Ocidental diminuem o viscerotropismo (veja, porexemplo, WO 03/103571 e WO 2004/045529). Outra abordagem, original-mente aplicada ao vírus da dengue-4 selvagem, envolve grandes deleçõesde 30 nucleotídeos ou mais na região 3' não traduzida (3'UTR; Men et al., J.Virol. 70:3930-3937, 1996; Patente U.S. N9 6.184.024 B1). Uma dessas de-leções, denominada deleção delta 30 ou A30, foi estudada ainda no contextodos vírus da dengue-4 e dengue-1 selvagens e um vírus quimérico da den-gue-4/WN (Durbin et al., AJTMH 65:405-413, 2001; Whitehead et al., J. Virol.77:1653-1657, 2003; Pletnev et al., Virology 314:190-195, 2003; WO03/059384; WO 03/092592; WO 02/095075). Adicionalmente, algumas dasgrandes deleções em 3'UTR (417-616 nucleotídeos de extensão) introduzi-das nos vírus selvagens da encefalite provocada por carrapato (TBE) e Lan-gat foram descobertas serem altamente atenuantes em um modelo de ca-mundongo (Mandl et al., J. Virol., 72:2132-2140, 1998; Pletnev, Virology282:288-300, 2001). Uma quantidade limitada de dados in vitro foi publicadapara o vírus da vacina YF17D. Especificamente, Bredenbeek e co-autoresdemonstraram que uma grande deleção de todos os três elementos de se-qüência de repetição (RS) da 3'UTR (188 aminoácidos de extensão; a locali-zação dos elementos RS está ilustrada na Figura 1A) ou uma deleção de 25nucleotídeos do elemento de seqüência conservada 2 (CS2) não impediu areplicação de vírus em células BHK, enquanto que outras três deleções (25- 68 nucleotídeos de extensão) que afetaram CS1 ou haste-e-alça 3' extre-ma foram letais (Bredenbeeek et al., J. Gen. Virol. 84:1261-1268, 2003). Ou-tros mostraram que mutações introduzidas na grande estrutura 3' terminalhaste-alça da 3'UTR de flavivírus (dengue) resultaram em atenuação, en-quanto manteve a habilidade do vírus de imunizar o hospedeiro (Markoff etal., J. Virol. 76:3318-3328, 2002).

Uma segunda abordagem que foi descrita para atenuação de umvírus TBE selvagem altamente patogênico utilizou deleções relativamentegrandes na proteína C do capsídeo, como descrito por Kofler e colaborado-res, que introduziram uma série de deleções na proteína C do vírus TBE erecuperaram vários mutantes viáveis (Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543,2002). Especificamente, uma deleção de 16 aminoácidos no domínio hidro-fóbico central da proteína (Hélice I prevista; veja na Figura 2A) reduziu dras-ticamente a replicação do vírus em células BHK e diminui significativamentea invasão neural em camundongos. A imunização com esse mutante de TBEprotegeu os camundongos do estímulo com a cepa Hypr de TBE ( LD50>100) altamente patogênica (Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002).

As vacinas aprovadas não estão disponíveis atualmente paravários flavivírus clinicamente importantes que tem propriedades viscerotrópi-cas, tais como os vírus do Nilo Ocidental, dengue e da febre hemorrágica deOmsk, entre outros.Sumário da Invenção

A invenção fornece flavivírus recombinantes (por exemplo, vírusda febre amarela ou flavivírus quiméricos) que incluem uma ou mais muta-ções que fornecem uma pequena diminuição no viscerotropismo para umflavivírus já atenuado, como descrito aqui. Um exemplo de um flavivírusquimérico incluído na invenção é um que inclui proteínas do capsídeo e nãoestruturais de um primeiro flavivírus (por exemplo, um vírus da febre amare-la, tal como a cepa 17D do vírus da febre amarela) e as proteínas da mem-brana e do envelope de um segundo flavivírus (por exemplo, um vírus sele-cionado a partir do grupo que consiste em vírus da encefalite japonesa, den-gue-1, dengue-2, dengue-3, dengue-4, encefalite de Murray Valley, encefali-te de St. Louis, Nilo Ociental, Kunjin, encefalite de Rocio, Ilhéus, encefaliteda Europa Central, encefalite siberiana, encefalite Russa da primavera-verão, Doença da Floresta de Kyasanur, Alkhurma, Febre Hemorrágica deOmsk, mal de Louping, vírus Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova,Apoi e Hypr). No caso de um flavivírus quimérico que inclui proteínas damembrana e do envelope o vírus do Nilo Ocidental, a proteína do envelopepode, opcionalmente, incluir substituições nos aminoácidos 107, 316 e 440do envelope. As mutações dos flavivírus recombinantes da invenção podemser, por exemplo, uma ou mais deleções ou substituições.

As mutações da invenção podem estar localizadas em regiõesdos flavivírus recombinantes incluindo, por exemplo, a região 3' não traduzi-da dos flavivírus recombinantes e geralmente incluem menos do que 30 nu-cleotídeos. Como um exemplo desse tipo de mutação, a mutação pode seruma que desestabiliza uma estrutura de haste na região 3' não traduzida dovírus (por exemplo, uma estrutura haste em uma região não conservada daregião 3' não traduzida do vírus) ou possíveis elementos alternativos de es-trutura secundária prevista ou de estrutura geral. Como exemplos específi-cos, a mutação pode ser qualquer uma ou mais de d7, dA, dB, dC e dD, co-mo descritas aqui. Em outros exemplos, a mutação pode incluir um ou maisnucleotídeos da seqüência conservada 2 (C S2) e assim pode ser, por e-xemplo, CS2 d5 ou CS2 d16. Em outros exemplos, o flavivírus mutante estáadaptado a um substrato de cultura celular, resultando em modificação es-pontânea de uma mutação que ele inclui (por exemplo, uma deleção, tal co-mo, por exemplo, uma modificação que aumenta a deleção de 5 nucleotí-deos original no mutante dC para 24 nucleotídeos; figura 1E) ou em umamutação de segundo sítio, que não afeta a atenuação in vivo.

As mutações da invenção também podem ser introduzidas emseqüências do capsídeo. Tais mutações podem incluir, por exemplo, umadeleção de 1-3 aminoácidos da proteína do capsídeo. Como um exemploespecífico de tais mutações, a mutação pode ser uma ou mais deleções naHélice I da proteína do capsídeo (por exemplo, mutação C2, como aqui descrita).

Em outros exemplos, as mutações da invenção podem incluiruma ou mais substituições dos aminoácidos do envelope. Em um exemplo,tais mutações no envelope são substituições em um ou mais dos aminoáci-dos do envelope 138, 176, 177, 244, 264 e 280 ou combinações desses.Exemplos específicos de tais combinações incluem o seguinte: 176, 177 e280; 176, 177, 244, 264 e 280; e 138, 176, 177 e 280.

Os flavivírus recombinantes da invenção podem incluir mutaçõesem apenas uma das regiões destacadas acima, ou em duas ou em todas astrês dessas regiões. Além disso, os flavivírus recombinantes podem incluiruma ou mais mutações na região de dobradiça da proteína do envelope doflavivírus e/ou uma mutação na proteína de membrana do flavivírus. Comoexemplos específicos de flavivírus recombinantes da invenção, é feita men-ção a flavivírus que incluem a mutação C2 em combinação com as mutaçõesd7, dB, dD, e/ou E#5 (isto é, E176, E177 e E180) (figura 1A), opcionalmenteno contexto de ChimeriVax™-WN02 (figura 5). Exemplos adicionais de flavi-vírus recombinantes que incluem mutações múltiplas são fornecidos aqui emoutro lugar.

A invenção também fornece métodos para prevenir ou tratar in-fecções por flavivírus em indivíduos (por exemplo, indivíduos humanos ouveterinários), que envolvem administrar ao indivíduo uma vacina que incluium ou mais dos flavivírus recombinantes aqui descritos, assim como compo-sições farmacêuticas que incluem tais flavivírus recombinantes. Adicional-mente, a invenção inclui moléculas de ácido nucléico (por exemplo, molécu-las de RNA ou DNA) que compreendem os genomas (ou complementosdesses) de tais flavivírus recombinantes. Além disso, a invenção inclui o usodos flavivírus recombinantes aqui descritos na preparação de vacinas inati-vadas. Também são incluídos na invenção métodos de atenuação de candi-datos de vacina de flavivírus, que envolvem a introdução de uma ou maismutações nos candidatos de vacina de flavivírus que reduzem o viscerotro-pismo dos candidatas de vacina de flavivírus, como aqui descrito.

A invenção fornece várias vantagens. Os vírus submetidos asmutações da invenção são flavivírus vivos, atenuados que mantém a habili-dade de infectar células de mamíferos. Como os vírus são infectantes, é im-portante assegurar que eles estão suficientemente atenuados, de maneira anão levar à doença em indivíduos vacinados. A presente invenção forneceabordagens de ajuste delicado da atenuação de candidatas de vacinas deflavivírus, assim possibilitando a produção de vacinas seguras. Os flavivírusrecombinantes da invenção também são vantajosos, por que eles são relati-vamente seguros quando comparados às cepas parental e selvagem. Essacaracterística é vantajosa em seu uso e administração como vacinas vivas,atenuadas, aásim como com relação a sua preparação e uso como vacinasinativadas.

Outras características e vantagens da invenção ficarão aparen-tes a partir da descrição detalhada, das figuras e reivindicações seguintes.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1A é uma representação esquemática da região 3' nãotraduzida de vírus da febre amarela, que mostra domínios dentro dessa regi-ão (seqüências de repetição (RS), CS2, CS1 e a estrutura haste-alça 3'-extrema), assim como exemplos de mutações da invenção (por exemplo, dA,dB, dC, dD, d7, d14, CS2 d5 e CS2 d16).

Figura 1B é uma representação esquemática da seqüência eestrutura secundária da região 3' não traduzida de vírus da febre amarela apartir do meio do 3e elemento RS e até o final da UTR (Proutski et al., J.Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999).

Figura 1C é uma representação esquemática da predição daestrutura secundária ótima de 3'UTR de YF 17D produzida usando o algo-ritmo de dobramento de RNA de Zuker.

Figura 1D é uma representação esquemática dos efeitos dasdeleções de 3'UTR (mostradas para a deleção dC; método de Zuker) sobrea estrutura ótima de YF 17D ( comparar com a Figura 1C).

Figura 1E é uma representação esquemática do efeito do au-mento espontâneo do tamanho da deleção em vírus dC de 5 nucleotídeos(em nível P2) para 24 nucleotídeos (em nível P5) sobre a estrutura secundá-ria prevista (comparar com a Figura 1D e Figura 1C). O tamanho aumentadoda deleção resultou em uma estrutura que se parece com a estrutura de YF17D original, ótima.

Figura 2A é uma representação esquemática da seqüência daproteína do capsídeo do vírus da encefalite causada por carrapato, assimcomo as deleções nessa proteína relatadas por Kofler et al., J. Virol.76:3534-3543, 2002.

Figura 2B é uma representação esquemática da seqüência daproteína do capsídeo de YF17D. As regiões previstas pela análise por com-putador de ter uma estrutura secundária a helicoidal (a-hélices l-IV), assimcomo as regiões hidrofóbicas, estão indicadas.

Figura 3 é uma representação esquemática de um modelo dehomologia do homodímero da proteína E de YF, mostrando a localizaçãodos resíduos que diferem entre YF selvagem (Asibi) e a cepa de vacinaYF17D.

Figura 4 é uma representação esquemática das proteínas damembrana (M) e do envelope (E) do vírus do Nilo Ocidental, mostrando dife-rentes combinações de mutações introduzidas nessas regiões usando a a-bordagem com dois plasmídeos.

Figura 5 é um gráfico que mostra a cinética de crescimento devariantes ChimeriVax™-WN04 selecionadas e controles de placa grande(vacina sub-atenuada) e de placa pequena de WN02.Descrição Detalhada

A presente invenção fornece flavivírus recombinantes que po-dem ser usados em métodos terapêuticos, tais como métodos de vacinação.Importante para os flavivírus da invenção é a presença de mutações atenu-antes nos genomas dos vírus. Essas mutações podem atenuar os vírus, porexemplo, pela diminuição do viscerotropismo e/ou neurotropismo dos vírus.As mutações podem estar presentes nas regiões do genoma do flavivírusincluindo a região 3' não traduzida (3'UTR), seqüências do capsídeo e/ouseqüências do envelope. Como é discutido mais abaixo, as mutações dainvenção podem ser usadas para o ajuste fino da atenuação de cepas devacina que já incluem uma ou mais outras mutações atenuantes. Assim, porexemplo, as mutações da invenção podem ser identificadas por resultaremem diminuição do tamanho da placa em ensaios de placa e/ou em viremiareduzida em modelos animais (figura 5). As mutações da invenção fornecemportanto um nível de segurança adicional com relação a atenuação de taisvírus. Detalhes dos vírus e métodos da invenção são fornecidos abaixo.

Um exemplo de um flavivírus que pode ser submetido às muta-ções da invenção é o vírus da febre amarela, por exemplo, a cepa de vacinaYF17D (Smithburn et al., "Yellow Fever Vaccination," World Health Org., p.238, 1956; F)eestone, em Plotkin et al. (eds.), Vaccines, 2- edição, W. B.Saunders, Filadélfia, 1995). Outras cepas de vírus da febre amarela, por e-xemplo, YFI 7DD (No. de Acesso no GenBank U 17066) e YF17D-213 (No.de Acesso no GenBank U17067) (dos Santos et al., Virus Res. 35:35- 41,1995), YF17D-204 France (X15067, X15062), YF17D-204, 234 US (Rice etal., Science 229:726-733, 1985; Rice et al., New Biologist 1:285-296, 1989;C 03700, K 02749), e as cepas de vírus da febre amarela descritas por Gal-ler et al., Vaccine 16 (9/10):1024-1028, 1998, também podem ser usadas nainvenção.

Flavivírus adicionais que podem ser submetidos às mutações dainvenção incluem outros flavivírus veiculados por mosquito, tais como osvírus da encefalite japonesa (por exemplo, SA14-14-2), dengue (sorotipos1-4), encefalite de Murray Valley, encefalite de St. Louis, Nilo Ociental, Kun-jin, encefalite de Rocio e Ilhéus; flavivírus veiculados por carrapato tais comoos vírus da encefalite da Europa Central, encefalite siberiana, encefaliteRussa da primavera-verão, Doença da floresta de Kyasanur, Alkhurma, Fe-bre Hemorrágica de Omsk, mal de Louping, vírus Powassan, Negishi, Abset-tarov, Hansalova, Apoi e Hypr; assim como vírus do gênero Hepacivírus (porexemplo, vírus da Hepatite C). Todos esses vírus têm alguma propensão eminfectar órgãos viscerais. O viscerotropismo desses vírus pode não necessa-riamente causar disfunção de órgãos viscerais vitais, mas a replicação dovírus nesses órgãos pode causar viremia e assim contribuir para a invasãodo sistema nervoso central. Assim, além de diminuir o risco de dano a ór-gãos viscerais, a diminuição do viscerotropismo desses vírus por mutagêne-se pode reduzir suas habilidades de invadir o cérebro e causar encefalite.

Além dos vírus listados acima, assim como outros flavivírus, fla-vivírus quiméricos que incluem um ou mais dos tipos de mutação apontadosacima também estão incluídos na invenção. Essas quimeras consistem emum flavivírus, (isto é, um esqueleto de flavivírus) no qual uma proteína estru-tural (ou proteínas) foi substituída por uma proteína estrutural corresponden-te (ou proteínas) de um segundo vírus (isto é, um vírus de teste ou prede-terminado, tal como um flavivírus; veja, por exemplo, Patente U.S. Ne6.696.281; Patente U.S. Ne 6.184.024; Patente U.S. No 6.676.936; e PatenteU.S. Ne 6.497.884). Por exemplo, as quimeras podem consistir de um esque-leto de flavivírus (por exemplo, um vírus da febre amarela) no qual as proteí-nas de membrana e do envelope foram substituídas pela membrana e o en-velope de um segundo vírus de teste (por exemplo, vírus do Nilo Ocidental,um vírus da dengue (sorotipo 1, 2, 3 ou 4), vírus da encefalite japonesa ououtros vírus, tal como qualquer um daqueles aqui mencionados). Os vírusquiméricos podem ser feitos a partir de quaisquer combinações de vírus,mas tipicamente o vírus contra o qual a imunidade é procurada é a fonteda(s) proteína(s) estrutural(is) inserida(s).

Um exemplo específico de um tipo de vírus quimérico que podeser submetido às mutações da presente invenção é a cepa de vacina da fe-bre amarela humana, YF17D, na qual a proteína de membrana e a proteínado envelope foram substituídas pela proteína da membrana e proteína doenvelope de outro flavivírus, tais como vírus do Nilo Ocidental, vírus da den-gue (tipo 1, 2, 3 ou 4), vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite de St.Louis, vírus da encefalite de Murray Valley ou qualquer outro flavivírus, taiscomo um daqueles listados acima. Flavivírus quiméricos feitos usando essaabordagem foram designados como os assim chamados vírus "ChimeriVax".Os seguintes flavivírus quiméricos, que foram feitos usando a tecnologiaChimeriVax® e depositados na American Type Culture Collection (ATCC) emManassas, Virgínia, U.S.A. sob os termos do Tratado de Budapeste e con-cedidos uma data de depósito de 6 de janeiro de 1998, podem ser usadospara fazer os vírus da invenção: Vírus Quimérico da Febre Amarela17D/Dengue Tipo 2 (YF/DEN-2; N- de acesso ATCC VR-2593) e Vírus Qui-mérico da Febre Amarela 17D/Encefalite Japonesa SA14-14-2 (YF/JE A1.3;Ns de Acesso ATCC VR-2594). Detalhes da produção de vírus quiméricosque podem ser usados na invenção são fornecidos, por exemplo, nas se-guintes publicações: WO 98/37911; WO 01/39802; Chambers et al., J. Virol.73:3095-3101, 1999; WO 03/103571; WO 2004/045529; Patente U.S. N96.696.281; Patente U.S. Ne 6.184.024; Patente U.S. Ne 6.676.936; e. PatenteU.S N2 6.497.884.

Como é observado acima, as novas mutações da invenção es-tão presentes, nas seqüências 3'UTR, do capsídeo e/ou envelope de flaviví-rus, incluindo flavivírus quiméricos. Cada um desses tipos de mutação, quepodem ser combinados uma com a outra e/ou com outras mutações atenu-antes, são descritos a seguir.

Mutações na Região 3' Não Traduzida

A organização da 3' UTR de uma cepa de vacina do vírus dafebre amarela, YF17D, que é compartilhada por todos os vírus ChimeriVax®,é mostrada na Figura 1A. Ela inclui em ordem a partir da extremidade 3' (i)uma estrutura haste-e-alça 3' extrema que funcionaria hipoteticamente comoum promotor para a síntese de RNA de filamento negativo e que é conser-vada para todos os flavivírus, (ii) dois elementos de seqüência conservados,CS1 e CS2, que compartilham um alto grau de homologia de seqüência denucleotídeos com todos os flavivírus veiculados por mosquito, e (iii) únicopara as cepas de vírus da febre amarela da África Ocidental, incluindo o ví-rus da vacina YF17D, três cópias de um elemento de seqüência de reepeti-ção (RS) localizado na porção à montante de 3'UTR (Chambers et al., Annu.Rev. Microbiol. 44:649-688, 1990). A 3' UTR também inclui várias estruturashaste-alça previstas, tais como aquelas na região não conservada a jusantedos elementos RS, como descrito na Figura 1B.

As mutações de 3'UTR da presente invenção geralmente sãodeleções curtas, atenuantes de, por exemplo, menos do que 30 nucleotídeos(por exemplo, 1, 2, 3, etc, até 29 (por exemplo, 2-25, 3-20, 4-15, 5-10 ou 6-8nucleotídeos de extensão)). Quando introduzidas individualmente em umcandidato de vacina ou combinadas com outras mutações atenuantes, asnovas mutações da invenção podem resultar em um nível adicional de ate-nuação, assim fornecendo uma abordagem para um ajuste delicado do nívelde atenuação de um candidato a vacina. Em alguns exemplos, as deleçõescurtas de 3'UTR da invenção são projetadas para desestabilizar a estruturasecundária de uma ou mais estruturas de haste previstas em 3'UTR e/ou detoda a estrutura de 3'UTR. Além das deleções, mutações em tais estruturastambém podem incluir substituições que resultam similarmente em desesta-bilização da estrutura de haste. Em certos exemplos, as estruturas haste-alça que são submetidas as mutações da invenção estão presentes em regi--ões não conservadas de 3'UTR ou em regiões conservadas que podem tole-rar tais mutações (por exemplo, em CS2). Por exemplo, no caso de 3'UTRdo vírus da febre amarela (por exemplo, YF17D), tanto no contexto de umvírus da febre amarela intacto quanto em uma quimera a base do vírus dafebre amarela, as mutações que desestabilizam a haste podem estar pre-sentes em qualquer uma ou mais das estruturas de haste mostradas na Fi-gura 1B, que mostra quatro exemplos de tais deleções (dA, dB, dC e dD),que são descritas mais abaixo. Assim, além desses exemplos específicos,outros exemplos de mutações de 3'UTR no vírus da febre amarela incluemmutações que compreendem, por exemplo, 1-2, 3-8, 4-7 ou 5-6 nucleotídeosdas seguintes seqüências de haste que são mostradas na Figura 1B comolidas a partir de 5' para 3': TGGAG, CTCCA, GACAG, TTGTC, AGTTT,GGCTG, CAGCC, AACCTGG, TTCTGGG, CTACCACC, GGTGGTAG,GGGGTCT, AGACCCT, AGTGG, e TTGACG.

Além das mutações que desestabilizam a haste, as mutações dainvenção também incluem outras deleções curtas na 3'UTR. Por exemplo, ainvenção inclui certas mutações que caem dentro da mutação A30, descritaacima. Assim, por exemplo, a invenção inclui quaisquer mutações viáveisque tem 1, 2, 3, etc. e até 29 (por exemplo, 1-25, 2-20, 3-15, 4-14, 5-13, 6-12, 7-11, 8-10 ou 9) nucleotídeos de extensão dentro dessa região. Comoum exemplo específico, a invenção inclui a deleção d7, na qual os seguintesnucleotídeos dessa região em YF17D são deletados: nucleotídeos de 345-351 (AAGACGG; numeração a partir do primeiro nucleotídeo da 3'UTR, apóso códon de terminação UGA da ORF viral; Figura 1A). Mutações que inclu-em, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos adicionais da extremidade 3'ou 5' dessa seqüência também estão incluídas na invenção. Em outros e-xemplos, deleções curtas nas seqüências conservadas CS1 e CS2 estãoincluídas na invenção. Essas mutações podem incluir a deleção de, por e-xemplo, 1-29, 2-25, 3-20, 4-15, 5-10 ou 6-8 nucleotídeos dessas seqüências.Como dois exemplos específicos, que estão descritos mais abaixo, os nu-cleotídeos 360-364 (GGTTA; CS2d5; Figura 1A) e/ou os nucleotídeos 360-375 (GGTTAGAGGAGACCCT; CS2d16; Figura 1A) são deletados de CS2da 3'UTR específica de YF17D. Mutações que incluem a deleção de, porexemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos adicionais da extremidade 3' ou 5' des-sa seqüência também estão incluídas na invenção. Para outras 3'UTRs deflavivírus, mutações similares podem ser feitas, com base nas estruturassecundárias das 3'UTRs. Previsões de estruturas secundárias de 3'UTR deoutros flavivírus foram publicadas, por exemplo, para dengue, Kunjin e TBE(veja, por exemplo, Proutski et al., Virus Res 64:107-123, 1999) e HCV (veja,por exemplo, Kolykhalov et al., J. Virol. 70:3363-3371, 1996). Além disso,várias seqüências de nucleotídeo de 3'UTR para várias cepas de flavivírusque representam os quatro maiores soro-complexos (YF, JE, dengue e TBE)estão disponíveis no GenBank. Seqüências de cepas adicionais podem serdeterminadas pelo seqüenciamento do vírus. As estruturas secundárias des-sas seqüências podem ser facilmente previstas usando um programa padro-nizado (por exemplo, programas mfold ou RNAfold) para revelar as potenci-ais estruturas haste-alça que podem ser submetidas a mutagênese.

Como discutido mais abaixo, mutações de 3'UTR da invençãopodem ser usadas para fornecer atenuação adicional para candidatos a va-cina já atenuadas. Assim, uma ou mais das mutações de 3'UTR aqui descri-tas (por exemplo, d7, dB, dC e/ou dD) podem ser feitas para fornecer umnível adicional de segurança para a cepa de vacina do vírus da febre amare-la YF17D. Opcionalmente, a(s) mutação(ões) de 3'UTR pode(m) ser incluí-da(s) nessa cepa com uma ou mais mutações atenuantes adicionais, taiscomo uma mutação atenuante na região de dobradiça da proteína do enve-lope do vírus (por exemplo, uma substituição de qualquer um ou mais ami-noácidos do envelope 48-61, 127-131 e 196-283, por exemplo, aminoácido279, ou um ou mais dos aminoácidos do envelope no vírus da febre amarelaque correspondem aos aminoácidos 204, 252, 253, 257, 258 e 261 do vírusda dengue 1 (veja, por exemplo, WO 03/103571); a região de dobradiça dasproteínas do envelope de flavivírus está entre os Domínios I e II; veja, porexemplo, Rey et al., Nature 375:291-298, 1995), um aminoácido na proteínade membrana de vírus da febre amarela (por exemplo, a porção da hélice demembrana da proteína de membrana, porexemplo, um aminoácido que cor-responde a posição 66 da proteína de membrana do vírus do Nilo Ocidental),ou qualquer uma das mutações de proteínas do capsídeo ou do envelopeaqui descritas (por exemplo, substituições de aminoácidos nas posições quecorrespondem aos aminoácidos 138, 176, 177, 244, 264, 280, 313, 316, 380e 440 do vírus do Nilo Ocidental isoladas ou em combinação).

De fato, é possível combinar mutações ou deleções especifica-das na 3'UTR com uma ou mais mutações ou deleções no gene do capsídeo(como descrito abaixo), no gene prM (por exemplo, em M5 ou M60 de qui-meras de YF-encefalite japonesa ou M66 de quimeras YF-WN ou aminoáci-dos circundantes (veja PCT/US2005/037369 e abaixo) ou no gene E em sí-tios conhecidos por atenuar flavivírus. O gene E contem domínios funcionaisdentro dos quais alterações de aminoácidos podem afetar a função e dessamaneira reduzir a virulência, como descrito por Hurrelbrink & McMinn (Adv.Virus Dis. 60:1-42, 2003). As regiões funcionais da proteína E nas quais mu-tações podem ser inseridas que, junto com deleções/mutações de 3'UTRdescritas no presente pedido, podem resultar em uma vacina apropriada-mente atenuada incluem: a)a suposta região de ligação do receptor sobre asuperfície externa do domínio III, b) a região de dobradiça molecular entre osdomínios I e II, que determina as alterações conformacionais ácido-dependentes da proteína E no endossomo e reduzem a eficiência de interna-lização do vírus; c) a interface de proteínas prM/M e E, uma região da prote-ína E que faz interface com prM/M acompanhando o rearranjo de dímeropara trímero após a exposição a pH baixo no endossomo; d) a ponta do do-mínio de fusão do domínio II, que está envolvida na fusão à membrana doendossomo durante eventos de internalização; e e) a região haste-ancora,que também está funcionalmente envolvida em alterações conformacionaisda proteína E durante eventos de fusão induzidos por ácido.

As mutações de 3'UTR também podem ser incluídas em candi-datos a vacina de flavivírus quimérico. Em um exemplo, que é descrito abai-xo mais tarde, uma ou mais mutações de 3'UTR aqui descritas é incluída emuma vacina candidata (referida aqui como ChimeriVax®-WN02) que incluiproteínas do capsídeo e não estruturais de vírus da febre amarela (YF17D) eproteínas de membrana e do envelope de vírus do Nilo Ocidental (NY99),cuja proteína do envelope já inclui mutações atenuantes (substituições nasposições 107, 316 e 440; WO 2004/45529; veja também abaixo). Dessa for-ma, a invenção inclui ChimeriVax®-WN-02 que também inclui, por exemplo,d7, dB, dC, dD ou qualquer outra mutação de 3'UTR aqui descrita (opcio-nalmente em combinação com uma ou mais mutações adicionais do capsí-deo ou envelope, como aqui descritas). Em outros exemplos, as proteínasda membrana e envelope são de outro flavivírus, tais como o vírus da ence-falite japonesa (por exemplo, SA14-14-2), um vírus da dengue (vírus dadengue 1, 2, 3 ou 4) ou outro flavivírus aqui descrito.

Como com a vacina de vírus da febre amarela, descrita acima,a(s) mutação(ões) de 3'UTR pode(m) opcionalmente ser incluída(s) em flavi-vírus quiméricos com uma ou mais mutações atenuantes, tais como umamutação atenuante na região de dobradiça da proteína do envelope do vírus(por exemplo, uma substituição de qualquer um ou mais aminoácidos quecorrespondem aos aminoácidos 48-61, 127-131 e 196-283 do vírus da febreamarela, por exemplo, aminoácido 279, ou um ou mais dos aminoácidos naproteína do envelope que correspondem aos aminoácidos 204, 252, 253,257, 258 e 261 do vírus da dengue 1 (veja, por exemplo, WO 03/103571)),um aminoácido na proteína da membrana (por exemplo, a porção da héliceda proteína de membrana, por exemplo, um aminoácido que corresponde aposição 66 da proteína da membrana do vírus do Nilo Ocidental), ou qual-quer uma das mutações da proteína do capsídeo ou envelope aqui descritas(por exemplo, substituições de aminoácidos nas posições que correspondemaos aminoácidos 138, 176, 177, 244, 264 e 280, sozinhas ou em combina-ção, do vírus do Nilo Ocidental). Exemplos específicos de vírus altamenteatenuados que contém combinações de diferentes tipos de mutações atenu-antes estão descritos abaixo. Esses representam variantes quiméricas dafebre amarela-Nilo Ocidental nas quais a deleção C2 na proteína do capsí-deo está combinada com as deleções d7, dB ou dD em 3'UTR ou com acombinação E#5 de alterações de aminoácidos na proteína do envelope (al-terações dos aminoácidos E176, E177 e E280).

Mutações no capsídeo

Como é discutido mais abaixo, foi descoberto que mutações dedeleções curtas dentro da proteína do capsídeo poderiam também ser usa-das para fornecer atenuação adicional para um candidato à vacina já atenu-ado. Assim, a invenção inclui flavivírus (que incluem flavivírus quiméricos,tais como candidatos à vacina já atenuados que incluem outras mutaçõesatenuantes) que incluem deleções curtas (por exemplo, deleções de 1, 2, 3ou 4 aminoácidos) na proteína do capsídeo. Exemplos de tais mutações,fornecidas com relação a proteína do capsídeo do vírus YF17D, incluem de-leções viáveis que afetam a Hélice I da proteína (veja Figura 2A). Um exem-plo específico de tal mutação é a mutação C2, que inclui uma deleção deaminoácidos PSR da Hélice I (Figura 2A). Outras mutações curtas nessaregião podem ser testadas quanto a viabilidade e atenuação, e também es-tão incluídas na invenção. Seqüências de proteína do capsídeo de outrosflavivírus foram publicadas, por exemplo, para vírus TBE, WN, Kunjin, JE edengue (por exemplo, Pletnev et al., Virology 174:250-263, 1990).

Como com as mutações de 3'UTR discutidas acima, as muta-ções da proteína do capsídeo podem ser introduzidas em uma cepa de vaci-na do vírus da febre amarela (por exemplo, YF17D), opcionalmente emcombinação com qualquer uma ou mais das seguintes mutações: mutaçõesde 3'UTR como descritas aqui (por exemplo, d7, dB, dC, dD ou uma variantedessas); mutações atenuantes na região de dobradiça da proteína do enve-lope do vírus (por exemplo, uma substituição de qualquer um ou mais dosaminoácidos do envelope 48-61, 127-131 e 196-283, por exemplo, aminoá-cido 279, ou um ou mais dos aminoácidos do vírus da febre amarela quecorrespondem aos aminoácidos 204, 252, 253, 257, 258, e 261 do vírus dadengue 1 (veja, por exemplo, WO 03/103571)), um aminoácido na proteínada membrana do vírus da febre amarela (por exemplo, a porção da hélice damembrana da proteína da membrana, por exemplo, um aminoácido que cor-responde a posição 66 da proteína da membrana do vírus do Nilo Ocidental)ou qualquer ãma das mutações da proteína do envelope descritas aqui (por.exemplo, substituições de aminoácidos nas posições que correspondem asposições 138, 176, 177, 244, 264 e 280 sozinhas ou em combinação, do ví-rus do Nilo Ocidental).

Similarmente, as mutações da proteína do capsídeo podem serintroduzidas em flavivírus quiméricos. Em um exemplo, que é descrito aindaabaixo, uma ou mais das mutações do capsídeo aqui descritas está incluídaem um candidato a vacina (referido aqui como ChimeriVax®-WN02) que in-clui proteínas do capsídeo e não estruturais de vírus da febre amarela(YF17D) e proteínas da membrana e do envelope do vírus do Nilo Ocidental(NY99), proteína do envelope do qual já inclui mutações atenuantes (substi-tuições nas posições 107, 316, e 440; WO 2004/045529; veja também abai-xo). Assim, a invenção inclui ChimeriVax®-WN-02 que também inclui, porexemplo, a mutação C2 (opcionalmente em combinação com uma ou maismutações adicionais de 3'UTR e/ou do envelope, como descritas aqui, porexemplo, as combinações construídas e caracterizadas da deleção C2 comas deleções d7, dB ou dD em 3'UTR ou com a combinação E#5 de altera-ções de aminoácidos na proteína do envelope). Em outros exemplos, as pro-teínas da membrana e do envelope são de outros flavivírus, tais como umvírus da encefalite japonesa (por exemplo, SA14-14-2), um vírus da dengue(vírus da dengue 1, 2, 3 ou 4) ou outro flavivírus descrito aqui. Em outrosexemplos, tais mutações são introduzidas em flavivírus naturais (não quime-ricos), como discutido acima.

Além disso, a(s) mutação(ões) de 3'UTR pode(m) opcionalmenteser incluída(s) em flavivírus quimericos com uma ou mais mutações atenu-antes adicionais, tais como uma mutação atenuante na região de dobradiçada proteína do envelope do vírus (por exemplo, uma substituição de qual-quer um ou mais aminoácidos que correspondem aos aminoácidos do enve-lope do vírus da febre amarela 48-61, 127-131 e 196-283, por exemplo, ami-noácido 279, ou um ou mais dos aminoácidos na proteína do envelope quecorrespondem aos aminoácidos 204, 252, 253, 257, 258, e 261 do vírus dadengue 1 (veja, por exemplo, WO 03/103571)), um aminoácido na proteínada membrana (por exemplo, a porção da hélice da membrana da proteína demembrana, por exemplo, um aminoácido que corresponde a posição 66 daproteína de membrana do vírus do Nilo Ocidental) ou qualquer uma das mu-tações da proteína do envelope descritas aqui (por exemplo, substituiçõesde aminoácidos nas posições que correspondem aos aminoácidos 138, 176,177, 244, 264, 280, 313, 316, 380 e 440 sozinhos ou em combinação, dovírus do Nilo Ocidental).

Mutações no envelope

Como discutido aqui em outro lugar, certas mutações no envelo-pe tem sido descritas como sendo atenuantes para flavivírus, tais como ovírus da febre amarela (por exemplo, YF17D) e flavivírus quimericos. Essasincluem mutações na região de dobradiça (por exemplo, substituições nasposições que correspondem aos aminoácidos 48-61, 127-131, 170, 173,200, 299, 305, 380, e 196-283 de vírus da febre amarela e substituições emresíduos ao longo do bolso hidrofóbico do domínio II (Hurrelbrink et alM Adv.Vírus Res. 60:1-42, 2003; Modis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.100:6986-6991, 2003; veja Figura 3) incluindo os resíduos 52 e 200 no casodo vírus da febre amarela (Figura 3), aminoácido 279 do vírus da encefalitejaponesa (no contexto de uma quimera a base de febre amarela), e aminoá-cidos 204, 252, 253, 257, 258, e 261 de vírus da dengue 1 (veja, por exem-plo, WO 03/103571)), assim como substituições nos aminoácidos 107, 316,e 440 da proteína do envelope do vírus do Nilo Ocidental (veja, por exemplo,WO 2004/045529).

Como discutido mais abaixo, nos exemplos, foi descoberto queaquelas mutações (por exemplo, substituições) em seqüências de envelopede flavivírus também podem fornecer meios para ajustar a atenuação de umflavivírus já atenuado. Assim, a invenção inclui flavivírus (por exemplo, vírusda febre amarela ou um flavivírus quimérico, como descritos aqui) que inclu-em uma ou mais mutações da proteína do envelope que podem ser usadaspara ajustar a atenuação da candidata a vacina. Exemplos de tais mutaçõesincluem substituições em posições que correspondem aos aminoácidos 138,176, 177, 244, 264, 280 do vírus do Nilo Ocidental e combinações dessasmutações (por exemplo, 176, 177 e 280 ; 176, 177, 244, 264, e 280; e 138,176, 177, e 280). Mutações no envelope tais como essas, que fornecem umapequena diminuição na atenuação de um candidato a vacina já atenuado,podem ser incluídas em posições equivalentes em uma vacina de vírus dafebre amarela (por exemplo, uma vacina baseada em YF17D) ou um flaviví-rus quimérico, como aqui descrito. Opcionalmente, essas mutações podemser incluídas com uma ou mais das outras mutações de envelope, capsídeo,membrana e/ou 3'UTR aqui descritas.

Todas as mutações descritas para genes do capsídeo e 3'UTRpodem ser combinadas com essas mutações do envelope (com um resíduodo envelope ou múltiplos resíduos que como mostrado afetam a atenuação)para produzir um vírus com um fenótipo atenuado que é menos viscerotrópi-co (isto é, induz uma viremia menor no hospedeiro) do que cada um dos ví-rus parentais não combinados. Por exemplo, o mutante C2 (Tabela 2) podeser combinado com E#7 (Tabela 4) ou dC, dD, etc. Deleções de 3'UTR (Ta-bela 1) podem ser combinadas com vírus C2 ou E#7.

Mutações que podem ser incluídas com mutações de 3'UTR, proteína docapsídeo. e proteína do envelope da invenção

Além de uma ou mais das mutações atenuantes citadas acima,os flavivírus da invenção podem incluir outras mutações atenuantes. Emboramencionadas acima com relação a combinações com cada um dos três tiposde mutações incluídas na invenção, essa seção fornece uma descrição maisdetalhada dessas mutações.

Exemplos de mutações que podem ser incluídas nos flavivírus(incluindo flavivírus quiméricos) que incluem as mutações da invenção, in-cluem mutações na região de dobradiça da proteína do envelope ou certasmutações da proteína da membrana. Em particular, foi descoberto que cer-tas mutações da região de dobradiça da proteína do envelope reduzem oviscerotropismo. A cadeia de polipeptídeos da proteína do envelope se do-bra em três domínios distintos: um domínio central (domínio I), um domíniode dimerização (domínio II) e um domínio de módulo semelhante a imuno-globulina (domínio III). A região de dobradiça está presente entre os domí-nios I e II e, mediante exposição a pH ácido, sofre uma alteração conforma-cional (daí a designação "dobradiça") que resulta na formação de trímerosda proteína do envelope que estão envolvidos na fusão das membranas virale do endossomo, após a absorção do vírus pela endocitose mediada porreceptor. Antes da mudança conformacional, as proteínas estão presentesna forma de dímeros.

Vários aminoácidos do envelope estão presentes na região dedobradiça incluindo, por exemplo, os aminoácidos 48-61, 127-131, e 196-283 de vírus da febre amarela (Hurrelbrink et al., Adv. Virus Res. 60:1-42,2003; Rey et al., Nature 375:291-298, 1995). Mutações atenuantes em qual-quer um desses aminoácidos, ou aminoácidos intimamente circundantes (eaminoácidos correspondentes em outras proteínas do envelope de flaviví-rus), podem estar presentes nos vírus da invenção. De interesse particularsão os aminoácidos dentro do bolso hidrofóbico da região de dobradiça (Mo-dis et al., Publicado online antes da impressão 20 de maio de 2003,10.1073/pnas.0832193100. PNAS /10 de junho de 2003/ vol. 100/ Ns 12/6986-6991). Como um exemplo específico, uma substituição do aminoácido204 da proteína do envelope (K para R no vírus da dengue 1), que está nobolso hidrofóbico da região de dobradiça, em um flavivírus quimérico queinclui seqüências de dengue 1 inseridas em um vetor de vírus de febre ama-rela resulta em atenuação. Essa substituição leva a uma alteração na estru-tura da proteína do envelope, tal como a ligação intermolecular de hidrogê-nio entre um monômero e outro do envelope na proteína selvagem é rompi-da e substituída por novas interações intramoleculares no interior dos mo-nômeros. Dessa forma, substituições adicionais podem ser usadas para au-mentar as interações intramoleculares no bolso hidrofóbico, levando a ate-nuação. Exemplos de tais mutações/substituições que podem ser feitas nobolso hidrofóbico, em combinação com as mutações da invenção, incluemsubstituições em E202K, E204K, E252V, E253L, E257E, E258G, e E261H.

Além das mutações em 3'UTR, capsídeo e/ou envelope citadasacima, os flavivírus da invenção também podem incluir uma ou mais muta-ções atenuantes na proteína da membrana, por exemplo, no aminoácido quecorresponde ao aminoácido 66 da proteína da membrana do vírus do Nilo-Ocidental e/ou em outros aminoácidos dentro da hélice prevista da membra-na (por exemplo, em qualquer um ou mais aminoácidos que correspondemaos aminoácidos 40-75 do vírus do Nilo Ocidental). Como um exemplo es-pecífico, no caso de uma proteína da membrana do vírus do Nilo Ocidental,o aminoácido 66 da proteína da membrana (leucina no vírus do Nilo Ociden-tal selvagem) pode ser substituído por outro aminoácido, tal como prolina.Além da prolina, outros aminoácidos hidrofóbicos tais como isoleucina, meti-onina ou valina ou aminoácidos pequenos, tais como alanina ou glicina, po-dem substituir o aminoácido selvagem na posição 66 da proteína da mem-brana. Como outros exemplos, aminoácidos nas posições 60, 61, 62, 63e/ou 64 de vírus do Nilo Ocidental (ou posições correspondentes em outrosflavivírus) podem ser substituídos, sozinhos ou em combinação um com ooutro, uma mutação na posição 66 e/ou outra(s) mutação(ões). Exemplos desubstituições nessas posições incluem: arginina para glicina na posição 60,valina para alanina na posição 61, valina para ácido glutâmico ou metioninana posição 62, fenilalanina para serina na posição 63, e valina para isoleuci-na na posição 64. Outro exemplo inclui uma mutação de arginina para ciste-rna na posição 60 da proteína de membrana JE-específica no vírus Chimeri-Vax®-JE, que foi descoberta aumentar a estabilidade genética da vacina du-rante a produção em grande escala. É também fornecido, pela primeira vez,evidência de que o ectodomínio da proteína M é de importante significânciafuncional, por que uma alteração de glutamina para prolina no resíduo M5 deChimeriVax®-JE aumentou o limiar de pH da infecção (veja pedidoPCT/US2005/037369).

Além de uma ou mais mutações de proteína de membrana cita-das acima, os vírus da invenção também podem incluir uma ou mais muta-ções adicionais. Por exemplo, no caso do vírus do Nilo Ocidental, tais muta-ções adicionais podem ser na região da posição 107 (por exemplo, L paraF), 316 (por exemplo, A para V), ou 440 (por exemplo, K para R) (ou umacombinação dessas) da proteína do envelope do vírus do Nilo Ocidental. Asmutações pode assim ser, por exemplo, em um ou mais aminoácidos 102-112, 138 (por exemplo, E para K), 176 (por exemplo, Y para V), 177 (porexemplo, T para A), 244 (por exemplo, E para G), 264 (por exemplo, Q paraH), 280 (por exemplo, K para M), 311-321, e/ou 435-445 da proteína do en-velope do vírus do Nilo Ocidental. Como um exemplo específico, usando aseqüência da cepa NY99-flamingo 382-99 (Número de Acesso no GenBankAF 196835) como uma referência, lisina na posição 107 pode ser substituídapor fenilalanina, alanina na posição 316 pode ser substituída por valina e/oulisina na posição 440 pode ser substituída por arginina. Mutações corres-pondentes podem ser feitas em outros flavivírus também.

Além disso, os vírus da invenção podem incluir quaisquer outrasmutações que podem ou não serem atenuantes, mas são benéficas de outramaneira para a vacina (por exemplo, para a produção da vacina), por exem-plo, alterações de nucleotídeos nas UTRs ou alterações de aminoácidos emproteínas estruturais e não estruturais que podem se acumular espontanea-mente durante a propagação do vírus e ser desejáveis. Por exemplo, foiobservado recentemente uma alteração de aminoácido de R para C no resí-duo 60 que se acumulou na vacina ChimeriVax®-JE durante a produção emgrande escala em condições livres de soro. Essa alteração não afetou a i-munogenicidade ou atenuação, mas estabilizou o vírus pelo aumento emsua taxa de crescimento e pelo impedimento de acúmulo de uma reversãoindesejável para um resíduo selvagem na proteína do envelope (E107).

Mutações podem ser feitas nos vírus da invenção usando méto-dos padronizados, tais como mutagênese direcionada ao sítio. As mutaçõesacima descritas são deleções e substituições, mas outros tipos de mutações,tais como inserções, também podem ser usadas na invenção. Além disso,como é observado acima, as mutações podem estar presentes isoladamenteou no contexto de uma ou mais mutações adicionais. Além dos aminoácidosespecíficos citados acima, as substituições podem ser feitas com outros a-minoácidos, tais como aminoácidos que poderiam resultar em uma alteraçãoconservativa a partir daqueles citados acima. Substituições conservativasincluem tipicamente substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, ala-nina, valina, isoleucina, e leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, aspara-gina, e glutamina; serina e treonina; lisina e arginina; e fenilalanina e tirosina.Adicionalmente, tanto alterações conservativas_ como não conservativas po-dem ser selecionadas pela análise de seu(s) efeito(s) atenuante(s) com basenas alterações previstas por computador (usando um programa de modela-gem de estrutura de proteína) que elas causam na estrutura de raios X daproteína E.

Os vírus (incluindo quimeras) da presente invenção podem serfeitos usando métodos padronizados na técnica. Por exemplo, uma moléculade RNA que corresponde ao genoma de um vírus pode ser introduzida emcélulas primárias, embriões de galinha ou linhagens de células diplóides, apartir das quais (ou do sobrenadante das quais) a progênie do vírus pode serentão purificada. Outro método que pode ser usado para produzir vírus em-prega células heteroplóides, tais como células Vero (Yasumura et al., NihonRinsho 21, 1201-1215, 1963). Nesse método, uma molécula de ácido nucléi-co (exemplo, uma molécula de RNA) que corresponde ao genoma de umvírus é introduzida nas células heteroplóides, o vírus é coletado a partir domeio no qual as células foram cultivadas, o vírus coletado é tratado com umanuclease (por exemplo, uma endonuclease que degrada tanto o DNA comoo RNA, tal como Benzonase®; Patente U.S. NQ 5.173.418), o vírus tratadocom nuclease é concentrado (por exemplo, pelo uso de ultrafiltração usandoum filtro que tem um ponto de corte de peso molecular de, por exemplo, 500kDa) e o vírus concentrado é formulado para os o propósitos de vacinação.

Detalhes desse método são fornecidos na WO 03/060088 A2, que está in-corporada aqui por referência.

Os vírus da invenção podem ser administrados como agentesprofiláticos primários naqueles em risco de infecção ou podem ser usadoscomo agentes secundários para tratar pacientes infectados. Como os vírussão atenuados, eles são particularmente bem adequados para administraçãoem "indivíduos em risco" tais como idosos, crianças ou pessoas infectadaspor HIV. As vacinas também podem ser usadas em contextos veterinários,por exemplo, na vacinação de cavalos contra a infecção do vírus do NiloOcidental ou na vacinação de pássaros (por exemplo, valiosos, em risco deextinção ou domésticos, tais como flamingos, águias carecas e gansos, res-pectivamente). Além disso,-as vacinas da invenção podem incluir um vírus,tal como um vírus quimérico, que inclui uma mutação particular, em umamistura com vírus desprovidos de tais mutações.

A formulação dos vírus da invenção pode ser realizada usandométodos que são padronizados na técnica. Várias soluções farmaceutica-mente aceitáveis para uso na preparação de vacina são bem conhecidas epodem ser rapidamente adaptadas para uso na presente invenção por aque-les peritos nessa técnica (veja, por exemplo, fíemington 's PharmaceuticalSciences (18ê edição), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton,PA). Em dois exemplos específicos, os vírus são formulados em Meio Míni-mo Essencial com Sal de Earle (MEME) contendo 7,5% de lactose e 2,5%de albumina sérica humana ou MEME contendo 10% de sorbitol. Entretanto,os vírus podem simplesmente ser diluídos em uma solução fisiologicamenteaceitável, tal como soluções salina estéril ou salina tamponada estéril. Emoutro exemplo, os vírus podem ser administrados e formulados, por exem-plo, da mesma maneira que a vacina 17D da febre amarela, por exemplo,como uma suspensão clarificada de tecido de embrião de galinha infectadoou um fluido coletado a partir de culturas de células infectadas com um vírus quimérico.

As vacinas da invenção podem ser administradas usando méto-dos que são bem conhecidos na técnica e quantidades apropriadas das va-cinas a ser administradas podem rapidamente ser determinadas por aquelesperitos na técnica. O que é determinado ser uma quantidade apropriada devírus para administrar pode ser determinado pela consideração de fatorestais como, por exemplo, o tamanho e a saúde geral do indivíduo ao qual ovírus será administrado. Por exemplo, os vírus da invenção podem ser for-mulados como soluções aquosas estéreis que contem entre 102 e 108, porexemplo, 103 a 107, unidades infecciosas (por exemplo, unidades que for-mam placas ou doses de culturas de tecidos infecciosos) em um volume dedose de 0,1 a 1,0 ml, a serem administrados, por exemplo, por vias intra-muscular, subcutânea ou intradérmica. Além disso, como os flavivírus po-dem ser capazes de infectar o hospedeiro humano através de vias mucosas,tais como via oral (Gresikova et al., "Tick-borne Encephalitis," In The Arbovi-ruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton,Florida, 1988, Volume IV, 177-203), os vírus podem ser administrados tam-bém por vias mucosas. Além disso, as vacinas da invenção podem ser ad-ministradas em uma dose única ou, opcionalmente, a administração podeenvolver o uso de uma dose de ataque seguida por uma dose de reforço queé administrada, por exemplo, 2-6 meses mais tarde, como determinado serapropriado por aqueles peritos na técnica.

Opcionalmente, adjuvantes que são conhecidos por aqueles pe-ritos na técnica podem ser usados na administração dos vírus da invenção.Adjuvantes que podem ser usados para intensificar a imunogenicidade dosvírus incluem, por exemplo, formulações lipossomais, adjuvantes sintéticostais como (por exemplo, QS21), dipeptídeo de muramila, monofosforil lipídioA, polifosfazina, oligonucleotídeos CpG ou outras moléculas que parecemfuncionar pela ativação das moléculas do receptor Toll-like (TLR) sobre asuperfície de células ou sobre membranas nucleares dentro das células.Embora esses adjuvantes sejam tipicamente usados para intensificar as res-postas imunes para vacinas inativadas, eles também podem ser usados comvacinas vivas. Ambos os agonistas ou antagonistas de TLR podem ser úteisno caso de vacinas vivas. No caso de vírus liberados através de uma viamucosa, por exemplo, oralmente, adjuvantes de mucosa, tais como a toxinasensível ao calor de E. coli (LT) ou derivados mutantes de LT podem serusados como adjuvantes. Além disso, genes que codificam citocinas quetem atividades de adjuvantes podem ser inseridos nos vírus. Assim, genesque codificam citocinas, tais como GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 ou IL-5 podemser inseridos junto com genes de antígenos estranhos para produzir umavacina que resulta em respostas imunes intensificadas ou para modular aimunidade dirigida mais especificamente na direção de respostas celular,humoral ou de mucosa.

No caso de vírus da dengue e/ou flavivírus quiméricos que inclu-em proteínas de membrana e envelope de um vírus da dengue, contra osquais a vacinação ótima pode envolver a indução de imunidade contra todosos quatro sorotipos de dengue, os vírus da invenção podem ser usados naformulação de vacinas tetravalentes. Qualquer um ou todos os vírus usadosem tais formulações tetravalentes podem incluir uma ou mais mutações quediminuem o viscerotropismo, como aqui descrito. Os vírus podem ser mistu-rados para formar preparações tetravalentes em qualquer ponto durante aformulação ou podem ser administrados em série. No caso de uma vacinatetravalente, quantidades equivalentes de cada vírus podem ser usadas.Alternativamente, as quantidades de cada um dos diferentes vírus presentesnas vacinas administradas podem variar (WO 03/101397 A2).

Os flavivírus da invenção também podem ser usados para liberarprodutos de genes heterólogos, tais como antígenos de vacina ou outrosagentes terapêuticos (veja, por exemplo, WO 02/102828; Patente U.S. N96.589.531; e WO 02/072835).

A invenção é baseada, em parte, nos seguintes resultados expe-rimentais.

Resultados Experimentais e Exemplos

Antecedentes e Sumário

Em um exemplo da invenção, mutações, tais como aquelas des-critas acima foram feitas em um candidato a vacina de flavivírus quimérica,referida aqui como ChimeriVax®- WN02, que compreende as proteínas docapsídeo e as não estruturais de um vírus da febre amarela (YF17D) e asproteínas pré-membrana e do envelope de um vírus do Nilo Ocidental(NY99) como está descrito adicionalmente abaixo. Esse candidato a vacinafoi testado em estudos pré-clínicos e clínicos de Fase I. Embora ele tenhaparecido altamente atenuado e imunogênico em camundongos e macacosrhesus, ele induziu uma replicação mais ativa em macacos cinomolgos e emvários voluntários humanos em testes de Fase I (N = 45) em comparação auma vacina de febre amarela controle (YF) 17D como julgado por viremiapós-inoculação. Ainda que ela tenha sido bem tolerada no teste de fase I ealtamente imunogênica, com base nos níveis de viremia, foram conduzidosestudos para melhorar ainda mais o perfil de segurança de ChimeriVax®-WN02 por meio de mutagênese específica, com um objetivo de obter umaleve diminuição na viremia em animais pequenos (hamsters) em compara-ção com a variante ChimeriVax®-WN02. Três abordagens de mutagêneseforam empregadas, e são cada uma discutidas nos exemplos descritos abai-xo. Em uma primeira abordagem, pequenas deleções de nucleotídeos foramintroduzidas na região 3' não traduzida do vírus (a 3'UTR). Em uma segundaabordagem, deleções de aminoácidos foram introduzidas na proteína decapsídeo. Em uma terceira abordagem, substituições de aminoácidos atenu-antes específicas foram introduzidas dentro da proteína de envelope do ví-rus. Como discutido adicionalmente abaixo e em outros lugares aqui, essestipos de mutações podem ser combinadas umas com as outras (e outrasmutações atenuantes ou de outra forma benéficas) para fazer vírus da in-venção.ChimeriVax®-WN02

Uma quimera inicial YF17D/WN contendo a seqüência do geneprM-E selvagem da cepa NY99 do vírus WN, designada ChimeriVax®-WN01,foi construída usando um sistema de dois plasmídeos padrão (Arroyo et al.,J. Virol. 78:12497-12507, 2004). As seqüências do gene prM-E JE-específicas nos plasmídeos pYF5'3TV/SA14-14-2 (contém porções 5' e 3' decDNA para vírus de vacina ChimeriVax®-JE) e pYFM5.2/SA14-14-2 (contemuma grande porção intermediária de cDNA de ChimeriVax®-JE) foram subs-tituídas pelas seqüências de cDNA correspondentes do vírus NY99 WN deorigem. O vírus ChimeriVax®-WN01 foi obtido por ligação in vitro de frag-mentos dos plasmídeos pYWN5'3'N1A3 e pYWN5.2/5 resultantes para obtero molde de DNA de extensão completa, seguido por transcrição in vitro etransfecção de células Vero pelos transcritos de RNA resultantes. O novovírus quimérico mostrou ser significativamente atenuado para camundongose macacos rhesus quando comparado com WN NY99 e YFI 7D, embora elemantivesse um leve grau de neurovirulência e para camundongos adultos.Ele ainda foi atenuado pela introdução de três alterações de aminoácidosSA14-14-2 JE- vacina-específicas nos resíduos E107, E316, e E440 (veja aTabela 3 abaixo) da proteína do envelope (E). Os dois novos plasmídeoscontendo essas mutações foram designados pYWN5'3'NF3A2 e pYWN5.2316/440#2. Com base nos resultados do teste do triplo mutante, designadoChimeriVax®-WN02, em camundongos e macacos, foi concluído que ele erasuficientemente atenuado para ser testado adicionalmente em teste clínicosde Fase I. Os testes foram realizados em adultos saudáveis (N=30 para do-se de inoculação de 5 logio pfu e N=15 por dose de 3 log10 pfu). De formainesperada, vários voluntários inoculados em ambos os grupos de dosagemdesenvolveram viremia que foi estatística e significativamente maior (até 3,5vezes) em comparação ao controle de YF-Vax. Isso indicou que, embora avacina tenha sido bem tolerada e imunogênica, maior desenvolvimento po-deria ser feito para obter uma variante de vacina ChimeriVax®-WN mais ate-nuada. Altos níveis de viremia podem ser indicativos de replicação de vírusexcessiva em órgãos periféricos, e pode apresentar um risco de desenvolversintomas hemorrágicos em um subgrupo de vacinados, de forma similar afebre amarela clássica, ou encefalite devido ao cruzamento da barreira he-mato-encefálica, que pode ser facilitado por alta viremia com base no co-nhecimento de flavivírus encefalitogênicos.

Dessa forma, o único parâmetro subótimo da vacina ChimeriVax®-WN02 foi uma viremia levemente mais alta do que o esperado após a inocula-ção observada em uma proporção de voluntários humanos, que pode ser indi-cativa de uma replicação excessiva em órgãos periféricos (viscerotropismo).Como o vírus ChimeriVax®-WN02 inicial já é um candidato a vacina altamenteatenuado, ao invés de um isolado selvagem virulento, busca-se identificar no-va(s) mutação(ões) que não superatenuariam a vacina. Busca-se mutaçõesque impediram a ocorrência de alta viremia em modelo(s) animal(is) apropria-do^) (no experimento descrito abaixo são usados hamsters) e subseqüente-mente em humanos, mas sem reduzir a eficácia de forma significativa.

As etapas experimentais envolvidas na produção e caracteriza-ção de novos ChimeriVax®-WN04 candidatos incluíram:

Construção de DNAs de plasmídeos contendo as mutaçõesdesejadas. Especificamente, todas as mutações foram intro-duzidas nos plasmídeos ChimeriVax®-WN02 iniciais* pYWN5'3'NF3A2 e pYWN5.2 316/440#2 por mutagênese di-recionada por oligonucleotídeos padrão usando técnicas dePCR simples ou de overlap, seguido pela ligação dos produ-tos de PCR resultantes nesses plasmídeos e seleção deplasmídeos mutantes por clonagem em E. coli e seqüencia-mento de clones individuais.

Ligação in vitro de grandes fragmentos Eagl-BspEI de plas-mídeos apropriados das séries pYWN5'3' e pYWN5.2 paraobter os moldes de cDNA de extensão completa, seguidopor linearização de Xhol.

Transcrição in vitro de moldes de DNA de extensão comple-ta com RNA polimerase SP6 para produzir RNA sintético infeccioso.Produção de vírus ChimeriVax®-WN04 mutantes por trans-fecção de células Vero usando lipofectamina ou eletropora-ção e coleta de amostras de vírus de passagem 1 (P1), se-guida por uma passagem adicional em meio livre de soro pa-ra obter estoques de vírus de P2.

Confirmação da viabilidade de vírus mutantes por monitora-mento de efeito citopático (CPE), ensaio de placa de sobre-nadantes de células, e detecção de RNA viral por um RT-PCR sensível.

Confirmação da presença de mutações desejadas por se-qüenciamento consenso de RNA genômico viral em nível deP2 (e análise preliminar de estabilidade genética por se-qüenciamento de vírus passados para nível P5).

Análise de morfologia de placa e propriedades de cresci-mento por titulação padrão de vírus P2 em células Vero.Análise de viscerotropismo em hamsters Sírios inoculadoscom 5 logio pfu/dose de amostras de vírus P2 pela medidade viremia pós-inoculação nos dias 1-9; análise de imunoge-nicidade pela medida dos títulos de soro de anticorpos neu-tralizantes do vírus WN-específicos no dia 30 usando testede neutralização com redução de placa de 50% (PRNT50).Como descrito abaixo, foram introduzidas deleções na 3'UTR ouna proteína de capsídeo (C) de vírus ChimeriVax®-WN02, em um esforçopara alcançar um efeito levemente atenuante nesse candidato de vacinacomprovado, altamente atenuado. Isso foi alcançado por pequenas dele-ções, de 5-16 nucleotídeos de extensão na 3' UTR, ou deleções de 3 amino-ácidos na proteína C. Algumas das deleções na 3'UTR eram deleções curtas(5-6 nucleotídeos) que foram planejadas com base em uma estrutura secun-dária prevista da 3'UTR do vírus YF17D (Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999). Essas foram direcionadas para desestabilizar especifica-mente algumas das estruturas haste-alça específicas previstas por compu-tador no meio da 3'UTR localizada fora de quaisquer elementos de seqüên-cia conservados. Em uma terceira abordagem, foram introduzidos mutaçõesatenuantes SA14-14-2 adicionais na proteína E de ChimeriVax®-WN02, quefoi o mesmo método que nós usamos para desenvolver ChimeriVax®-WN02a partir de ChimeriVax®-WN01. Os efeitos dessas modificações foram moni-torados em um modelo de hamster. As variantes de ChimeriVax®-WN04 fo-ram identificadas que resultam em uma pequena redução desejada no visce-rotropismo em hamsters.

Construção de candidatos de ChimeriVax®-WNQ4-3'UTR pela introdução dedelecões específicas na 3'UTR.

Como discutido acima, a organização da 3'UTR YF17D-específica compartilhada por todos os vírus ChimeriVax® é mostrada na Fi-gura 1A. Ela contém em ordem a partir da extremidade 3' (i) uma estruturahaste-e-alça 3'-extrema conservada para todos os flavivírus, (ii) dois elemen-tos de seqüência conservados CS1 e CS2, e (iii) três cópias de um elementode seqüência de repetição (RS) localizado na porção a montante da 3'UTR(Chambers et al, Annu. Rev. Microbiol. 44:649-688, 1990). Uma característi-ca valiosa de deleções nessa região é sua estabilidade, já que reversão es-pontânea durante a replicação viral é virtualmente impossível. As 11 dele-ções que foram introduzidas dentro do vírus ChimeriVax®-WN02 (usando oplasmídeo pYWN5'3'NF3A2) para gerar novos candidatos ChimeriVax®-WN04-3'UTR são mostradas na Figura 1A e incluem:

uma deleção dRS que remove os três elementos RS (nucle-otídeos 18-164, AT A ACC GGG...-...TCCACAC, da 3' UTR deYF17D; a numeração é a partir do primeiro nucleotídeo da3'UTR após o códon de terminação TGA da ORF viral);quatro deleções pequenas, de 5-6 nucleotídeos: dA (nucleo-tídeos 229-234, GCAGTG), dB (nucleotídeos 256-260,CAGGT), dC (nucleotídeos 293-297, CCAGA), e dD (nucleo-tídeos 308-312, CGGAG) que ocorrem entre RSs e CS2,planejadas para desestabilizar estruturas haste-alça/pseudoknot individuais previstas por computador(Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999) mostra-das na Figura 2B;

uma deleção grande, de 105 nucleotídeos, d105 (nucleotí-deos 218-321, TAAGCT...- ...CCGCTA), que remove a maiorparte dos nucleotídeos entre RSs e CS2 (uma deleção simi-lar foi tolerada por DEN4 selvagem mas reduziu de formasignificativa a replicação in vitroe in vivo (Men et al., J. Virol.70:3930-3937, 1996) e portanto era esperada que ela pu-desse ser superatenuante para ChimeriVax®-WN02);uma deleção de 30 nucleotídeos, d30 (nucleotídeos 322-351, CCACCC -...GACGG), a montante de CS2, imitando amutação A30 originalmente descrita para atenuar o vírus sel-vagem DEN4 (Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996; Pa-tente U.S. Ne 6,184,024 B1);

duas deleções menores, d7 (nucleotídeos 345-351, AA-GACGG) e d14 (nucleotídeos 338-351, TGGTAGAAA-GACGG), na região de A30, que foram testadas porque nósesperávamos que a mutação d30 descrita acima pudessesuperatenuar ChimeriVax®-WN02 in vitro e/ou in vivo;duas deleções pequenas de 5 e 16 nucleotídeos na regiãoCS2 designada CS2d5 (nucleotídeos 360-364, GGTTA) eCS2dl6 (nucleotídeos 360-375, GGTTAGAGGAGACCCT).

A viabilidade de vírus mutantes foi monitorada por cuidadosaobservação microscópica de CPE durante as passagens P1 e P2, assimcomo passagens subseqüentes até P5 feitas para avaliar a estabilidade ge-nética de mutantes viáveis e para determinar se quaisquer mutações de se-gundo sítio restabeleceriam a viabilidade de mutantes aparentemente nãoviáveis. Essas observações foram confirmadas por RT-PCR e ensaio de pla-ca em células Vero. O ensaio de placa também produziu informações impor-tantes sobre os títulos de vírus mutantes indicativo de propriedades de cres-cimento em células Vero e sobre alterações na morfologia de placa produzi-das pelas deleções introduzidas. Porções relevantes dos genomas de vírusviáveis foram seqüenciadas nos níveis P2 e P5. Os resultados desses expe-rimentos estão resumidos na Tabela 1.

Com base nos dados na Tabela 1, pode-se concluir:

1) Apesar do grande tamanho da deleção de dRS, ela não con-feriu uma atenuação marcante in vitro, porque o vírus mutante produziu pla-cas grandes e claras, semelhantes àquelas do controle ChimeriVax®-WN02LP (controle de placas grandes; veja nota de rodapé 1 da Tabela 1), e cres-ceu para um título relativamente alto de 6x106 PFU/ml. Esse resultado foiesperado, porque uma deleção similar quase não teve efeito sobre a replica-ção do vírus YF17D in vitro (Bredenbeek et al., J. Gen. Virol. 84:1261-1268,2003), e uma grande deleção similar não reduziu a neurovirulência do vírusChimeriVax®-JE em camundongos lactentes.

2) As pequenas deleções, dA, dB, dC, e dD, causaram atenua-ção marcante in vitro a julgar pela morfologia das placas. Os tamanhos dasplacas de todos os quatro vírus mutantes estavam reduzidos; placas do vírusdD eram opacas (placas de ambos os controles de WN02 LP e SP são cla-ras). Os vírus cresceram para títulos relativamente altos durante a passagemP2 no excesso de 6 logio PFU/ml, que é uma característica desejável paraprodução (Tabela 1; exceto para o título do mutante dA, que não pôde serdeterminado por ele formou placas pequenas demais para serem contadasnesse experirtiento). Esses resultados indicaram que as estruturas haste-a\ça/pseudoknot previstas (Figura 1B) existem e são importantes para a re-plicação do flavivírus. Ao contrário do vírus DEN4 selvagem, que tolerougrandes deleções nessa região a montante de CS2 (Men et al., J. Virol.70:3930-3937, 1996), a grande deleção dl05, que abrange todos os elemen-tos estruturais atingidos por pequenas deleções, foi superatenuante (letal)para o vírus ChimeriVax®-WN02.

3) A deleção d30, que é análoga a mutação A30 (Men et al., J.Virol. 70:3930-3937, 1996; Patente U.S. N9 6.184.024 B1), assim como umadeleção menor d14, na região que precede imediatamente CS2, foram letais.A única mutação nessa região que foi tolerada por ChimeriVax®-WN02 foi apequena deleção d7. Ela foi atenuante já que ela reduziu a morfologia daplaca.4) As pequenas deleções CS2d5 e CS2d16 tiveram efeitos ate-nuantes moderados in vitro, já que os mutantes contendo a deleção formaramplacas de tamanho intermediário, opacas. Foi esperado que essas mutaçõesafetassem a estrutura de haste-alça prevista que inclui a seqüência do sítio derestrição de Xbal no nucleotídeo 10.708, como mostrado na Figura 1B.

Nesses experimentos, demonstramos pela primeira vez que pe-quenas deleções fora dos elementos conservados da 3'UTR podem fornecerum grau de atenuação. Além disso, demonstramos pela primeira vez que adesestabilização individual específica de estruturas haste-alça/pseudoknotprevistas resulta em atenuação. Além disso, há várias estruturas haste-alça/pseudoknot previstas na 3'UTR de flavivírus, incluindo o vírus YF17D,que fornece uma grande variedade de oportunidades para alcançar uma va-riação de efeitos atenuantes. Essas estruturas, ou áreas entre as estruturas,podem agora ser direcionadas por pequenas deleções que podem ser intro-duzidas por aqueles peritos na técnica. A mutagênese de qualquer uma des-sas estruturas pode ser agora esperada, com base na nossa descoberta,para fornecer um grau de atenuação. A escolha da variação de efeitos per-mite a seleção de um mutante com um grau desejado de atenuação.

Tabela 1. Características in vitro de mutantes de delecão ChimeriVax®-WN04-3,UTR

<table>table see original document page 37</column></row><table>1 Os vírus de controle LP e SP (usados para comparação de morfologia deplaca apenas no ensaio de placa) foram isolados previamente por purifica-ção de placa a partir de uma amostra de vírus de P5 de ChimeriVax®-WN02de produção que era uma população de placas grandes (LP) e placas pe-quenas (SP); a variante SP apareceu devido ao acúmulo de uma alteraçãode aminoácido M66 Leu para Pro.

2 N/D - não determinado porque as placas eram pequenas demais quandocoradas com vermelho neutro no dia 5 após a infecção para serem contadasde forma acurada.

Deve ser observado que as estruturas secundárias verdadeirasdas 3'UTRs de Flavivírus, incluindo vírus YF 17D, são desconhecidas, por-que não há métodos disponíveis para provar experimentalmente sua exis-tência no contexto de vírus inteiros, e portanto previsões publicadas, por e-xemplo aquela prevista para YF 17D por Proutski e colaboradores (Figura1B), pode ser incorreta. Várias estruturas alternativas podem ser previstaspara formar uma molécula de RNA relativamente longa (Zuker et al., N.A.R.19:2707-2714, 2001), e é possível que estruturas diferentes (DE filamentospositivos ou negativos) se formem e funcionem em etapas diferentes do ciclode vida viral. Estruturas reais podem ser influenciadas pela formação de vá-rios pseudokrfots (Olsthoorn et al., RNA 7:1370-1377, 2001) e interações de.RNA de grande variação (por exemplo, ciclização de RNA e outras intera-ções (Alvarez et al., J. Virol. 79:6631-6643, 2005)), assim como as intera-ções de RNA possíveis com proteínas do hospedeiro e virais. Para complicarainda mais a interpretação de resultados publicados de previsões de compu-tador teóricas, operações manuais são freqüentemente usadas, tais comodobramento inicial de seqüências parciais com subseqüente forçamento deestruturas inicialmente previstas em estruturas de seqüências de RNA maislongas, o uso artificial de N's durante as etapas de dobramento iniciais, e aseleção subjetiva de elementos de estrutura preferidos (por exemplo, Mutebiet al., J. Virol. 78:9652-9665, 2004). Para esse fim, é dobrada a seqüênciade RNA de 3'UTR de YF 17D usando o algoritmo de predição de Zuker co-mumente usado. A estrutura ótima prevista é mostrada na Figura 1C, quedifere da previsão de Proutsky mostrada na Figura 1B. É importante que aspequenas deleções dA, dB, dC, dD, d7, e dl4 nas Figuras 1A e 1B geralmen-te desestabilizaram as estruturas de YF 17D nativas previstas como ótimas(Figura 1C) e subótimas. Um exemplo de tal estrutura alterada (para o mu-tante dC) é mostrado na Figura 1D. Em contraste, as deleções CS2d5 eCS2dl6 (Figuras 1A e 1B) não alteraram de forma notável a estrutura nativaótima, indicando que essas deleções podem atenuar o vírus (a atenuação foidemonstrada no modelo de hamster para ChimedVax®- WN) em virtude dealteração da seqüência de CS2 por si própria ao invés da estrutura 3'UTRou, alternativamente, pela alteração de algumas estruturas subótimas. Des-sa forma, mesmo que algumas das deleções tenham sido projetadas combase na predição de estrutura de Proutski (Figura 1B), seu efeito real podeser devido a elementos de estrutura desestabilizantes diferentes das hastes-alças previstas na Figura 1B.

Após o mutante dC ter sido passado do nível de passagem P2 aP5 em células Vero livres de soro para analisar a estabilidade genética, e ovírus P5 ter sido seqüenciado, foi descoberto que a deleção de cinco nucleo-tídeos aumentou de tamanho espontaneamente para 24 nucleotídeos (nu-cleotídeos 277-300, TCTGGGACCTCCCACCCCA deletados). (Outras dele-ções (dRS, d7, CS2d5, CS2d16, dA, dB, e dD) eram estáveis durante asmesmas passagens de estabilidade genética.) O efeito do tamanho aumen-tado da deleção foi que a estrutura secundária prevista se tornou similar aestrutura de YF 17D original ótima (Figura 1E; compare com a Figura 1C).Essa mudança espontânea pareceu ser uma adaptação da cultura da célula.Tanto as variantes P2 como P5 eram altamente atenuadas e imunogênicasem hamsters (veja a nota de rodapé 4 para a Tabela 5). Dessa forma, a va-riante P5 do mutante dC pode ter o fenótipo de vacina desejado.

A construção de ChimeriVax®-WN04-C candidatos pela introdução de dele-ções específicas na proteína de capsídeo C específica de YF17D.

A análise computacional da estrutura da proteína C de YF17Dusando os métodos ProteinPredict e Protean previram que sua organizaçãogeral não difere substancialmente daquela de TBE (Figura 2B). Acredita-seque grandes deleções na proteína em ChimeriVax - WN02 seriam as maisprovavelmente superatenuantes. Portanto, foram introduzidas cinco peque-nas deleções de 3-4 aminoácidos como mostrado na Figura 2B (resíduosdeletados estão dentro de retângulos). As deleções foram projetadas noplasmídeo pYWN5'3'NF3A2 de ChimeriVax®-WN02, que abrange todo o ge-ne da proteína C. As três primeiras deleções (C1-3; cada uma com 3 amino-ácidos de extensão) estão na mesma área geral descrita para TBE em Kofleret al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002. Entretanto, foram posicionadas as muta-ções a fim de permitir o teste da importância de características estruturaisespecíficas: a deleção C1 está localizada a montante tanto do filamento hi-drofóbico central como da Hélice I prevista, C2 afeta apenas a Hélice I, e C3esperava-se que fosse interferir tanto com a Hélice I como com o filamentohidrofóbico central. Adicionalmente, a deleção C4 (4 aminoácidos de exten-são) foi planejada para atingir a Hélice III prevista na porção carbóxi-terminal, porção positivamente carregada da proteína, e a deleção C5 (3 a-minoácidos) está entre as Hélices III e IV (ela também elimina o sítio de cli-vagem de protease viral NS2b/NS3 na terminação C da forma intracelular daproteína; ela foi introduzida para determinar se quaisquer mutações de se-gundo sítio poderiam compensar pelo defeito esperado no processamentoda poliproteínà).

Os resultados da caracterização in vitro de mutantes WN04-Cestão resumidos na Tabela 2. Apenas os mutantes C1 e C2 eram viáveisenquanto que as deleções C3-C5 eram letais. Enquanto o forte efeito deleté-rio da mutação C5 não foi surpreendente, foi interessante que uma pequenadeleção na porção carbóxi-terminal, porção positivamente carregada da pro-teína (C4) foi letal, sugerindo que alterações de seqüência/estrutura nessaregião podem não ser toleradas pelo vírus. A observação mais surpreenden-te foi que a deleção C3 também foi letal, porque ela está na mesma áreageral que tolerou grandes deleções no contexto do vírus TBE. A presença dedeleções nas variantes C1 e C2 foi confirmada por seqüenciamento. Os re-sultados do seqüenciamento de toda a região estrutural da proteína nos ví-rus nos níveis P2 e P5 são mostrados na Tabela 2. Enquanto que a varianteC1 acumulou alterações nos resíduos M14 e E313, que apareceram comoheterogeneidades na passagem P5, mas não P2 (acredita-se que a altera-ção em E313 seja uma adaptação para condições de crescimento de víruslivres de soro vistas anteriormente acumulando em ChimeriVax®-WN02), avariante C2 pareceu ser geneticamente estável. O ultimo vírus continha umaheterogeneidade do resíduo M71 tanto em P2 como P5, mas a proporção demutante para não mutante (-80%) não se alterou durante a passagem. Ajulgar pela morfologia de placa, a variante C1 não estava atenuada em com-paração a ChimeriVax®-WN02, enquanto que a variante C2 pareceu atenua-da, porque ela formou pequenas placas, sugerindo a importância da Hélice I.Ambos os mutantes cresceram para altos títulos em células Vero (~ 7 log-i0PFU/ml). Não há dados anteriores publicados que indiquem que tais peque-nas deleções podem atenuar um flavivírus ou ter valor prático. A geraçãobem-sucedida de mutantes Cl e C2 viáveis no nosso estudo forneceu evi-dência de que o vírus YF17D ou vírus de vacina ChimeriVax® podem tolerarpequenas deleções a montante da região central hidrofóbica e no início daa-Hélice I.

Tabela 2. Características in vitrode mutantes ChimeriVax®-WN04 -C

Mutação <table>table see original document page 41</column></row><table>1 O vírus controle WN02 (usado para comparação de morfologia de placaapenas no ensaio de placa) foi uma amostra de P1 obtida por transfecção decélulas com transcritos de RNA ChimeriVax®- WN02 in vitro.

2 Toda a região estrutural da proteína (genes C-prM-E) foi seqüenciada pelométodo consenso para confirmar a deleção pretendida e para checar a pre-sença de quaisquer outras alterações/heterogeneidades de aminoácidos.Construção de candidatos de ChimeriVax®-WN04-E pela introdução de alte-rações SA14-14-2-específicas adicionadas na proteína de envelope (E)

Os resíduos da proteína E que diferem no vírus JE selvagem(Nakayama) e na cepa de vacina SA14-14-2, assim como resíduos nas posi-ções correspondentes em WN NY99, são mostrados na Tabela 3. Como dis-cutido acima, um grau desejado de atenuação da variante de vacina Chime-riVax®-WN02 foi inicialmente atingido pela introdução de três resíduos SA14-14-2 específicos, E107, E316, e E440, na quimera YF17D/WN originalmenteconstruída que continha os genes prM-E selvagens específicos da cepaNY99 (o vírus WN01). ChimeriVax®-WN02 (e WN01) também contém o resí-duo E227 Ser que coincide em ambos os vírus SA14-14-2 e NY99.

Tabela 3. Os resíduos de SA14-14-2 JE vacina-específicos na proteína deenvelope E a serem combinados em ChimeriVax®-WN04 para reduzir o vis-cerotropismo4de ChimeriVax®-WN02

<table>table see original document page 42</column></row><table>1 Resíduos específicos de SA-14-14-2 já presentes em ChimeriVax®-WN02estão em negrito; observe que o resíduo E227 é o mesmo (Ser) em SA14-14-

2 e WN NY99 e portanto não requer alteração por mutagênese específica.

2 Números de aminoácidos estão de acordo com a numeração na proteína Edo vírus WN.

Todos os plasmídeos construídos anteriormente no processo deseleção do candidato de vacina WN02 (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004) e aqueles construídos mais recentemente (os dois pYWN5'3' epYWN5.2 de construção inferior) estão representados na Figura 4. Gruposdesejados de mutações SA14-14-2 na proteína E de vírus quimérico foramobtidos por ligação in vitro de pares específicos de fragmentos de DNA a partirde plasmídeos pYWN5'3' e pYWN5.2 apropriados através do sítio de restriçãode Eagl no gene E, por exemplo, ChimeriVax®-WN02 foi gerado por ligaçãode pYWN5'3'NF3A2 e pYWN5.2 316/440#2. Algumas das combinações foramtestadas anteriormente em camundongos e macacos, levando a seleção docandidato WN02 para testes adicionais em humanos (Arroyo et al., J. Virol.78:12497-12507, 2004). A mutação M66 (alteração de Leu para Pro no resí-duo 66 da proteína M) que incorpora-se dentro dos dois novos plasmídeospYWN5'3' era uma adaptação de cultura da célula que se acumulou na vacinaChimeriVax®-WN02 durante produção em larga escala. Isso reduziu o tama-nho da placa do vírus, mas não teve efeito sobre a neurovirulência em ca-mundongo (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004). De acordo comnossos resultados recentes a partir de testes Fase I em humanos, e experi-mentos adicionais em macacos, ela diminuiu o viscerotropismo do vírus paraprimatas e assim parece ser uma mutação benéfica para o desempenho davacina, aumentando a segurança. Por causa da vacina ChimeriVax®-WN02atual ser uma mistura de placas grandes e pequenas, induzindo viremia leve-mente maior do que a esperada em alguns humanos, trabalho adicional foirealizado para diminuir o viscerotropismo. Por exemplo, a variante de placapequena foi recentemente purificada em placa e está sendo atualmente testa-da em macacos. Variantes recentemente construídas com combinações demutações não testadas previamente estão descritas abaixo.Tabela 4. Novas variantes de ChimeriVax®-WN04-E: mutações introduzidas e caracterização in vitro de vírus

<table>table see original document page 44</column></row><table>1 Todos os vírus foram obtidos por transfecção de células Vero; em designa-ções de vírus "A" denota uma variação na preparação de molde de DNA deextensão completa (ligação de 3 fragmentos) e "R" denota um vírus obtido apartir de uma transfecção repetida; os vírus que estão sombreados foramselecionados para testes adicionais em hamsters.

2 Resíduos WN02 SA14-14-2-específicos: E107, 227, 316, e 440; alteraçãoM66 é uma adaptação de cultura de célula conhecida por reduzir o tamanhoda placa do vírus WN02.

3 L+S, uma mistura aparente de placas pequenas e grandes (em vírus 1R);S, placas pequenas; <L+S, as placas pareceram ser uma mistura de placaspequenas e grandes, mas o tamanho geral foi algo menor do que para o ví-rus 1R (L+S).

4 Toda a região estrutural da. proteína (genes C-prM-E) foi seqüenciada pormétodo consenso para confirmar as mutações pretendidas (cada uma con-firmada a menos que indicado ao contrário); outras altera-ções/heterogeneidades de aminoácidos detectadas estão listadas.

Os dados sobre a viabilidade e caracterização in vitro de novasconstruções de ChimeriVax®-WN04-E estão resumidas na Tabela 4. O vírus11, no qual tenta-se combinar todos os dez resíduos SA14-14-2-específicos,pareceu ser não viável porque ele não induziu CPE após a transfecção, du-rante passagens subseqüentes não formou placas no ensaio de placa, e seuRNA genômico não pôde ser detectado nos sobrenadantes das células poruma reação de RT-PCR sensível. Outros novos vírus contendo 5 a 9 altera-ções de SA14-14-2 listados na Tabela 4 eram viáveis (todas as amostras 3,4, 5, 6, e 7). A maioria delas pareceu estar levemente atenuada porque suasplacas eram um pouco menores do que as placas do controle de WN02 (ví-rus 1R), enquanto eles cresceram para títulos relativamente altos no exces-so de 6-7 logio pfu/ml; a única exceção foi o vírus 4, que pareceu estar supe-ratenuado (placas muito pequenas e título muito baixo) devido a adição si-multânea das mutações E138 e M66.

As alterações de SA14-14-2 pretendidas foram confirmadas porseqüenciamento consenso nos vírus 3, 5, e 7. O vírus 6 era singular porquesua amostra 6R não tinha uma das mutações pretendidas quando seqüenci-ado em P2: ele tinha uma Glu selvagem no resíduo E244 ao invés de GLy(ele também não tinha duas alterações de nucleotídeo silenciosas intencio-nalmente introduzidas a jusante da tripla E244 para criar um sítio de restri-ção de Sphl). Outra amostra, 6A, tinha uma Vai no resíduo E244 que diferetanto da seqüência WN selvagem como da SA14-14-2 (ele tinha o sitio Sphlpretendido). Essas alterações nas seqüências virais foram inesperadas, por-que toda a região vírus-específica na preparação de plasmídeopYWN5.2/8mut usada para gerar os transcritos de RNA de 6R, 6 A, e 11 invitro foi confirmada por seqüenciamento. É possível que a alteração E244SA14-14-2-específica seja letal para ChimeriVax®-WN, sozinha ou em com-binação com algumas outras mudanças, tais como E264, o que poderia ex-plicar porque o vírus 11 não pôde ser recuperado. As modificações detecta-das desse resíduo nas amostras 6R e 6A que restabeleceram a viabilidadepodem ser devidas a um erro pela polimerase viral durante a replicação dovírus (mais provavelmente o caso do vírus 6A), a instabilidade do plasmídeopYWN5.2/8mut em bactérias, ou pequenas contaminações por outro clonebacteriano não foram revelados por seqüenciamento do plasmídeo. Os vírusde P2 seqüenciados eram relativamente homogêneos, exceto que algunsvírus começaram a mostrar acúmulo de algumas mutações adicionais, al-gumas das quais podiam ser esperadas (por exemplo, a alteração E313 deG para R, que é uma uma adaptação de cultura de célula livre de soro co-nhecida de ChimeriVax®-WN que não afeta o fenótipo biológico). Mais diver-sas mutações se acumularam durante a propagação para o nível P5. Combase nessas observações, os vírus 3, 5, 6 A, e 7 no nível P2 (sombreadosna Tabela 4) foram selecionados para testes adicionais para viscerotropis-mo/imunogenicidade em hamsters.

Análise de viscerotropismo e imunoaenicidade de variantes ChimeriVax®-WN04 em hamsters

Os camundongos são usados como um modelo de animal pe-queno sensível para demonstrar neurovirulência reduzida, que é um indica-dor importante de atenuação, e alta imunogenicidade de candidatos de vaci-na ChimeriVax®-WN (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004). Entre-tanto, esse modelo não pode ser usado para predizer o nível de viscerotro-pismo em macacos e humanos, que é outro atributo importante de atenua-ção, porque as quimeras não induzem viremia detectável em camundongos.Alguns flavivírus induzem altos níveis de viremia em hamsters, como mos-trado recentemente para o vírus WN selvagem (Tesh et al., Emerg. Inf. Dis.8:1392- 1397, 2002). Estudos recentes usando a vacina ChimeriVax®-WN02(uma mistura de vírus de placas grandes e pequenas) e variantes LP e SPpurificadas de placa demonstraram uma boa correlação entre a viremia cau-sada por esses vírus em hamsters sírios fêmeas observada em voluntárioshumanos e macacos cinomolgos. Especificamente, a variante LP, que é me-nos atenuada para humanos, induziu uma viremia facilmente detectável emhamsters, enquanto que o vírus SP mais atenuado induziu uma viremia mui-to baixa ou indetectável. É usado esse novo modelo de animal pequeno parainvestigar se as mutações WN04 descritas acima reduzem o viscerotropis-mo, sem impedir o desenvolvimento de resposta imune anti- WN eficaz.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os re-quisitos do NIH para tratamento humano de animais de laboratório sob umprotocolo aprovado por Acambis IACUC. Hamsters sírios fêmeas de quatrosemanas de idade foram inoculados subcutaneamente (SC) com 5 logio pfude candidatos de vacina ChimeriVax®-WN04 selecionados, assim como ví-rus de controle LP e SP de WN02 ou ~4 log10 pfu de YF17D, seguido pormedidas de viremia nos dias 1, 3, 5, 7, e 9 (os animais tiveram sangue reti-rado sob anestesia e os títulos dos vírus nos soros colhidos foram determi-nados por ensaio de placa) e as respostas de anticorpo no dia 30 medidapor teste de 50% de neutralização de placa padrão (PRNT50), em animaisindividuais. Os resultados estão mostrados na Tabela 5.Tabela 5. Viremia e respostas de anticorpo a variantes de ChimeriVax -WN04 após a inoculação SC de hamsters sírios fêmeas.

<table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>

1 Volumes de inoculação: 100 ul; doses de inoculação: 5 logio pfu para vírusChimeriVax®- WN04 e controles LP e SP de WN02, e -4 logio pfu paraYF17D (YF- VAX); animais falsamente inoculados (mock) receberam 100 ulde meio de diluição (MEM, 50% FBS).

2 Nível de detecção: 25 PFU/ml.

3 Títulos de anticorpos neutralizantes determinados por PRNT50 no dia 30contra: ChimeriVax®-WN02 para todos os grupos inoculados com variantesde ChimeriVax®-WN, ou YF17D para o grupo de YF-VAX, ou ambos para ogrupo falsamente inoculado (mock).

4 Em um experimento separado em hamster, a amostra de Passagem 5 (P5)do mutante dC, no qual a deleção aumentou espontaneamente para 24 nu-cleotídeos (veja texto acima), foi testada. O vírus permaneceu altamente a-tenuado (pico de viremia médio de 25 pfu/ml, duração média de 3,5 dias) eimunogênico (PRNT5o GMT de 452 no dia 33). Os vírus de P2 CS2d5 eCS2dl6 também foram testados e se encontraram similarmente altamenteatenuados e imunogênicos (pico de viremia médio (pfu/ml)/ duração médiada viremia (dias)/PRNT50 GMT no dia 33 de 137/2,75/127 e 343/2,25/905,respectivamente). Todos os animais imunizados com essas variantes deWN04 incluindo dC P5 eram solidamente protegidos, ao contrário do contra-le de Placa Pequena WN02, quando estimulados ~ 10 meses após a imuni-zação com WN selvagem.

O controle de ChimeriVax®-WN02 LP (variante de vacina suba-tenuada) induziu alto pico de viremia em 5 hamsters inoculados variando de1.650 a 2.925 PFU/ml (média de 2.285 PFU/ml). Esses animais tinham ostítulos de anticorpos neutralizantes WN mais elevados no dia 30 na faixa de5.120 - 10.240 (GMT 6.760). O controle de WN02 SP não induziu viremiadetectável em 4 de 5 animais; uma viremia de baixo nível detectada em umhamster no dia 3 foi o limite de detecção do ensaio de 25 PFU/ml. A respos-ta de anticorpo WN-específica foi muito baixa nesses animais. Ela não foidetectável em dois hamsters (título <10); ou outros três tinham títulos baixosde anticorpo de 40-320. De forma interessante, a inoculação com YF-VAXnão resultou em viremia detectável mas uma alta resposta de anticorpo neu-tralizante YF-específica (títulos de PRNT50 de 320 - 10.240; GMT 2,150).

Como esperado, os animais falsamente inoculados (mock) não tinham anti-corpos neutralizantes WN- ou YF- específicos no dia 30.

Para alcançar uma redução pequena no viscerotropismo paraprimatas, foi idealmente identificada no modelo de hamster um grupo de va-riantes de ChimeriVax®-WN04 que causam uma variedade de viremias quepodiam ser rrfenores do que aquelas do vírus LP, mas ao mesmo tempo queinduzem uma resposta imune maior do que aquela do vírus SP. Dos 11 vírus"ChimeriVax(TM)-WN04 testados, a maioria pareceu estar pelo menos umpouco atenuado in vivo em comparação com o vírus LP (Tabela 5) comojulgado pelos níveis de viremia pós inoculação (o pico médio de viremia vari-ou de <25 a 1.460 pfu/ml). Dentre as variantes menos atenuadas estavam omutante de deieção da proteína-C C1; o mutante de deleção de 3'UTR dRS;e as variantes de WN04-E, #3 e #5. Esses vírus induziram altas respostasde anticorpos neutralizantes (GMT 1.110 - 2.560). Um vírus, a variante deWN04-E #6A, estava claramente superatenuada como evidenciado tantopela resposta de viremia muito baixa como pela fraca resposta de anticorpo.Sem dúvida, a última variante pode ser excluída de testes adicionais em ma-cacos/humanos. Os candidatos ChimeriVax(TM)-WN04 que tem característi-cas particularmente favoráveis são o mutante de deleção de proteína docapsídeo, C2; os mutantes de pequena deleção de 3'UTR, d7, dB, dC, e dD,e a variante E#7. Esses vírus causaram viremia moderadamente a fortemen-te reduzida em hamsters (títulos de viremia médios na faixa de <25 - 680PFU/ml), o que apesar disso não impediu uma forte resposta imune (GMT deanticorpo neutralizante 370 - 2.940).

Para demonstrar eficácia protetora, todos os animais foram es-timulados intraperitonealmente no dia 62 após a imunização com 4 x 105PFU de vírus WN selvagem virulento (cepa NY382/99). Todos os animaistinham altos títulos de anticorpos neutralizantes de WN (no dia 30), especifi-camente nos grupos WN04-C1, C2, dRS, d7, dB, dC, dD, E#3, E#5, E#7, econtrole WN02 LP (veja na Tabela 5), estavam completamente protegidos ajulgar pela ausência de viremia pós-estímulo (medida nos soros colhidos nosdias 1, 3, 5, 7, e 9), perda de peso, sintomas ou morte. Pelo menos algunsdos animais nos outros grupos, especificamente E#6A, controle WN02 SP,YF-VAX, e Mock, que não tinham altos títulos de anticorpos neutralizantesde WN, não estavam protegidos a julgar por pelo menos um dos parâmetrosobservados acima. Houve uma alta viremia nos dias 1 - 5 (pico de título deviremia de até 9,75 x 105 pfu/ml) em todos os animais YF-VAX e falsamenteimunizados. A maioria desses animais ficou doente, perdeu peso e 2 animaisno grupo YF-VAX morreram. Dois animais no grupo E#6 e -1 animal no grupoWN02 SP mostraram um baixo nível de viremia nos dias 1-2.

Efeitos de mutações em variantes de ChimeriVax®-WN04 sobre o cresci-mento do vírus em células hepáticas

Para obter evidência adicional do viscerotropismo reduzido queresulta das mutações WN04, foi analisada a cinética de crescimento de al-gumas das variantes de ChimeriVax®-WN04 mais promissoras (seleciona-das com base nos dados apresentados acima, por exemplo baixa viremia ealta imunogenicidade em hamsters; veja na Tabela 5) na linhagem celular dehepatoma humano HepG2. Já que o vírus YF é um vírus hepatotrópico, es-perava-se ver uma redução na replicação de variantes WN04 em compara-ção com o vírus ChimeriVax®-WN02 LP (vacina subatenuada). Monocama-das de células HepG2 foram infectadas em uma MOI de 0,005 PFU/ml, alí-quotas de sobrenadantes contendo o vírus foram colhidas diariamente (até odia 10), e os títulos dos vírus foram então determinados por ensaio de placaem células Vero. As variantes de WN04 atenuadas incluídas nesse experi-mento eram os mutantes de deleção de 3'UTR d7, dB, dC, e dD, o mutantede deleção de proteína do capsídeo C2 (assim como o mutante menos ate-nuado C1 como um controle adicional), e o mutante de proteína do envelopeE#7. Exceto para o mutante C1, todos os outros vírus WN04 replicaram me-nos eficientemente em comparação ao vírus WN02 LP (Figura 5), mas amaioria deles (com a exceção de dD) cresceram melhor do que a varianteWN02 SP, que é presumido ser uma variante de vacina superatenuada parahumanos. Isso indicou que algumas mutações WN04 podem reduzir o hepa-totropismo da vacina em humanos, o que é uma característica altamentedesejável. Esse experimento ainda mostra os benefícios de candidatos aE#7, d7, dC, e dD que exibem a redução mais clara na replicação em com-paração a WN02 LP, com o mutante dD talvez sendo o menos hepatotrópi-co.

Mutantes duplos ChimeriVax®-WN04; análise de viscerotropismo e imuno-qenicidade em hamsters.

Combinar diferentes efeitos de mutações atenuantes deve resul-tar em atenuação adicional e um fenótipo de vacina mais confiável, menosprovável de ser revertido para a patogenicidade. Para essa finalidade, quatromutantes duplos ChimeriVax®-WN04 foram produzidos nos quais a deleçãoC2 foi combinada com as deleções de 3'UTR d7, dB, ou dD ou a combina-ção E#5 de mutações nas proteínas do envelope (alterações adicionaisE176, 177, e 280 SA14-14-2-específicas). Os moldes de DNA para a trans-crição in vitro foram obtidos por ligação de dois ou três fragmentos padrãousando porções apropriadas de plasmídeos 5'3' e 5.2 construídos previa-mente para mutantes únicos WN04. Esses foram transcritos com RNA poli-merase SP6 e os vírus foram recuperados após eletroporação de célulasVero com transcritos de RNA. Os vírus P2 foram titulados em células Vero.Todos os quatro mutantes duplos pareceram fortemente atenuados em cul-tura de célula já que eles produziram placas muito pequenas, menores doque aquelas dos controles LP e SP de WN02. O mutante C2+E5 tinham umalto título de 1,3 x 107 pfu/ml, enquanto que os outros três vírus (C2+d7,C2+dB, e C2+dD) tinham títulos intermediários de 4,2 - 6,1 x 105 pfu/ml (Ta-bela 6).

Tabela 6. Características in vitro de mutantes duplos ChimeriVax®-WN04

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Para avaliar atenuação e imunogenicidade, hamsters sírios fê'meas de quatro semanas de idade foram inoculados subcutaneamente (SC)com 5 logio pfu dos mutantes duplos, assim como os vírus de controle LP eSP de WN02, ou diluente (simulação). A viremia foi medida nos dias 1 -10 eas respostas de anticorpo foram determinadas no dia 35 por PRNT50. Osresultados estão mostrados na Tabela 7. Os quatro mutantes duplos eramcompetentes para replicação, causando viremia de baixo nível detectavel namaioria dos animais, exceto para C2+d7 para o qual a viremia foi detectadaapenas em um animal. Esses vírus estavam significativamente mais atenua-dos em comparação ao vírus WN02 LP (pico de viremia médio - 7,000pfu/ml), e pareceram mais atenuados em comparação aos mutantes únicoscorrespondentes (por exemplo, compare os títulos do pico de viremia médioscom aqueles na Tabela 5). Embora a viremia não tenha sido detectada emcada animal, todos os hamsters desenvolveram alto nível de resposta deanticorpo neutralizante. Os valores de GMT de PRNT50 para C2+E5, C2+d7,C2+dB, e C2+dD foram 1:640, 1:840, 1:1,280, e 1:640, respectivamente.Tabela 7. Viremia e respostas de anticorpo a variantes duplos ChimeriVax^WN04 após a inoculacão SC de hamsters sírios fêmeas.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

1 Limite de detecção de viremia 50 pfu/ml; dias 8-10 também foram testa-dos, viremia não foi detectada.

2 Pelo fato da diluição de soro que produz 50% de neutralização não ter sidoalcançada para todos os animais, esse valor pode ser significativamentemaior do que o mostrado.

Para demonstrar proteção, os animais foram estimulados intra-perotonialmente no dia 36 com um vírus WN selvagem altamente letal, cepaNY385/99, que é mais patogênico do que NY382/99 usado nos experimen-tos acima, a 2 x 105 pfu/dose. Os animais imunizados com mutantes duplosWN04, assim como com controle WN02 LP, foram completamente protegi-dos, já que não houve viremia pós estímulo (medida nos dias 2, 4, e 6) enenhuma perda de peso que pudesse ser indicativa de doença. Ao contrário,os animais imunizados com WN02 SP e os controles de simulação de imuni-zação não foram protegidos. Eles desenvolveram viremia (títulos de pico de250-3.000 e >2,000 pfu/ml para WN02 SP e animais de simulação, respecti-vamente), mostraram sintomas de doença, e perderam peso. Um de 5 e 4 de5 animais nos grupos WN02 SP e de simulação, respectivamente, morreram.Dois animais que sobreviveram no grupo WN02 SP e 1 animal que sobrevi-veu no grupo de simulação estavam paralisados.

Dessa forma gera-se com sucesso múltiplos candidatos Chime-riVax®-WN04 que são mais atenuados em comparação a vacina Chimeri-Vax®-WN02 anterior, mas não superatenuados, pelo uso de modificaçõesúnicas dos três diferentes métodos para atenuação de flavivírus, e introdu-ção de diferentes tipos de mutações atenuantes unicamente ou em combi-nações.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Acambis Inc.

<12o> "FLAVIVÍRUS RECOMBINANTE, SEU USO NA PREPARAÇÃO DEVACINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OMESMO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO E MÉTODO PARAATENUAR CANDIDATO A VACINA DE FLAVIVÍRUS"

<130> 06132/101XX2

<140> PCT/ÜS2006/015241

<141> 24-04-2006

<150> 60/674,415

<151> 24-04-2005

<150> 60/674,546

<151> 25-04-2005

<160> 9

<170> Patentln versão 3.5

<210> 1

<211> 377

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Derivado do virus da febre amarela

<400> 1

taaaaactac ggatggagaa ccggactcca cacattgaga cagaagaagt tgtcagccca 60

gaaccccaca cgagttttgc oactgctaag ctgtgaggca gtgcaggctg ggacagccga 120

cctccaggtt gcgataaacc tggtttctgg gacctcccac cccagagtaa aaagaacgga 180

gcctccgcta ccaccttccc acgtggtggt agaaagacgg ggtctagagg ttagaggaga 240

ccctccaggg aacaaatagt gggaccatat tgacgccagg gaaagaccgg agtggttctc 300

tgcttttcct ccagaggtot gtgagcacag tttgctcaag aataagcaga cctttggatg 360

acaaacacaa aaccact 377

<210> 2

<211> 343

<212> RNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Derivado do vírus da febre amarela<400> 2

uugagacaga agaaguuguc agcccagaac cccacacgag uuuugccacu gcuaagcugu 60gaggcagugc aggcugggac agccgaccuc cagguugcga aaaaccuggu uucugggacc 120ucccacccca gaguaaaaag aacggagccu ccgcuaccac ccucccacgu ggugguagaa 180agacgggguc uagagguuag aggagacccu ccagggaaca aauaguggga ccauauugac 240gccagggaaa gaccggagug guucucugcu uuuccuccag aggucuguga gcacaguuug 300cucaagaaua agcagaccuu uggaugacaa acacaaaacc acu 343<210> 3<211> 338<212> RNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Derivado do vírus da febre amarela<400> 3

uugagacaga agaaguuguc agcccagaac cccacacgag uuuugccacu gcuaagcugu 60gaggcagugc aggcugggac agccgaccuc cagguugcga aaaaccuggu uucugggacc 120ucccaccgua aaaagaacgg agccuccgcu accacccucc cacguggugg uagaaagacg 180gggucuagag guuagaggag acccuccagg gaacaaauag ugggaccaua uugacgccag 240ggaaagaccg gagugguucu cugcuuuucc uccagagguc ugugagcaca guuugcucaa 300gaauaagcag accuuuggau gacaaacaca aaaccacu 338<210> 4

<211> 319<212> RNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Derivado do vírus da febre amarela<400> 4

uugagacaga agaaguuguc agcccagaac cccacacgag uuuugccacu gcuaagcugu 60gaggcagugc aggcugggac agccgaccuc cagguugcga aaaaccuggu uaaaagaacg 120319

gagccuccgc uaccacccuc ccacguggug guagaaagac ggggucuaga gguuagagga 180gacccuccag ggaacaaaua gugggaccau auugacgcca gggaaagacc ggagugguuc 240ucugcuuuuc cuccagaggu cugugagcac aguuugcuca agaauaagca gaccuuugga 300ugacaaacac aaaaccacu<210> 5

<211> 116<212> PRT

<213> Virus da encefalite da carraça<400> 5

Met Vai Lys Lys Ala lie Leu Lys Gly Lys Gly Gly Gly Pro Pro Arg15 10 15

Arg Vai Ser Lys Glu Thr Ala Thr Lys Thr Arg Gln Pro Arg Vai Gln

20 25 30

Met Pro Asn Gly Leu Vai Leu Met Arg Met Met Gly lie Leu Trp His35 40 45

Ala Vai Ala Gly Thr Ala Arg Asn Pro Vai Leu Lys Ala Phe Trp Asn

50 55 60

Ser Vai Pro Leu Lys Gln Ala Thr Ala Ala Leu Arg Lys lie Lys Arg65 70 75 80

Thr Vai Ser Ala Leu Met Vai Gly Leu Glu Lys Arg Gly Lys Arg Arg

85 90 95

Ser Ala Thr Asp Trp Met Ser Trp Leu Leu Vai lie Thr Leu Leu Gly

100 105 110

Met Thr Leu Ala115<210> 6<211> 121<212> PRT

<213> Virus da febre amarela <400> 6

Met Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Vai Asn Met Vai15 10 15Arg Arg Gly Vai Arg Ser Leu Ser Asn Lys lie Lys Gln Lys Thr Lys

20 25 30

Gln lie Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly Vai Gln Gly Phe lie35 40 45

Phe Phe Phe Leu Phe Asn lie Leu Thr Gly Lys Lys lie Thr Ala His50 55 60

Leu Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gln Gly Leu Ala Vai65 70 75 80

Leu Arg Lys Vai Lys Arg Vai Vai Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser85 90 95

Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Pro Vai Leu Thr Vai Gln Phe Leu lie

100 105 110

Leu Gly Met Leu Leu Met Thr Gly Gly115 120

<210> 7<211> 16<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Derivado do virus da febre amarela<400> 7

ggttagagga gaccct 16<210> 8<211> 14<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Derivado do virus da febre amarela<400> 8

tggtagaaag acgg 14<210> 9<211> 19<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Derivado do vírus da febre amarela

<400> 9

tctgggacct cccacccca

Claims (35)

1. Flavivírus recombinante que compreende uma mutação quefornece uma pequena diminuição no viscerotropismo a um flavivírus já ate-nuado.

2. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque o flavivírus é um vírus da febre amarela.

3. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque o flavivírus é um flavivírus quimérico.

4. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 3, emque o flavivírus quimérico compreende o capsídeo e proteínas não estrutu-rais de um primeiro flavivírus e as proteínas de membrana e do envelope deum segundo flavivírus.

5. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 4, emque o primeiro flavivírus é um vírus da febre amarela.

6. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 5, emque o vírus da febre amarela é YF17D.

7. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 4, emque o segundo flavivírus é selecionado a partir do grupo que consiste emvírus da encefalite japonesa, dengue- 1, dengue-2, dengue-3, dengue-4, en-cefalite de M jrray Valley, encefalite de St. Louis, Nilo Ocidental, Kunjin, en-cefalite de Rocio, Ilhéus, encefalite da Europa Central, encefalite da Sibéria,encefalite Russa da primavera-verão, Doença de Kyasanur Forest, Alkhur-ma, febre hemorrágica de Omsk, mal de Louping, Powassan, Negishi, Abset-tarov, Hansalova, Apoi, e Hypr.

8. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 7, emque o segundo flavivírus é um vírus do Nilo Ocidental.

9. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 8, emque o vírus do Nilo Ocidental compreende substituições nos aminoacidos doenvelope 107, 316, e 440.

10. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque a mutação compreende uma deleção.

11. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque a mutação compreende uma substituição.

12. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque a mutação é na região 3' não traduzida do flavivírus recombinante ecompreende menos do que 30 nucleotídeos.

13. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 12,em que a mutação desestabiliza a estrutura base na região 3' não traduzidado vírus, ou possíveis elementos alternativos de estrutura secundária ou es-trutura geral prevista.

14. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 13,em que a estrutura base está em uma região 3' não conservada da regiãonão traduzida do vírus.

15. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 14,em que a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste em d7, dA,dB, dC.edD.

16. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 12,em que a mutação compreende um ou mais nucleotídeos da seqüência con-servada 2 (CS2).

17. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 16,em que a mutação é CS2 d5 ou CS2 d16.

18. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque a mutação está na seqüência do capsídeo do flavivírus recombinante.

19. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 18,em que a mutação compreende uma deleção de 1-3 aminoácidos da proteí-na de capsídeo.

20. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 19,em que a mutação compreende uma deleção de aminoácidos na Hélice I daproteína do capsídeo.

21. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 20,em que a mutação é C2.

22. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque a mutação compreende uma substituição de um aminoácido do envelo-pe.

23. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 22,em que a mutação compreende uma substituição em um aminoácido sele-cionado a partir do grupo que consiste em aminoácidos do envelope 138, 176, 177, 244, 264, e 280, ou combinações desses.

24. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 23,em que a mutação compreende substituições em uma combinação de ami-noácidos do envelope selecionados a partir do grupo que consiste em 176, 177, e 280; 176, 177, 244, 264, e 280; e 138,176, 177, e 280.

25. Flavivírus recombinante na reivindicação 9, em que a muta-ção compreende uma substituição em um aminoácido selecionado a partirdo grupo que consiste em aminoácidos do envelope 138, 176,177, 244, 264,e 280, ou combinações desses.

26. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque o flavivírus compreende uma mutação em duas ou mais da região 3' nãotraduzida do vírus, da proteína do capsídeo, e da proteína do envelope.

27. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 26,em que as combinações de diferentes tipos e mutações são C2+d7, C2+dB,C2+dD, ou C2+E#5.

28. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque o flavivírus compreende ainda uma mutação na região de dobradiça daproteína do envelope do flavivírus.

29. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, emque o flavivírus ainda compreende uma mutação na proteína de membranado flavivírus.

30. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 13,em que o flavivírus mutante está adaptado a um substrato de cultura de cé-lula, resultando em modificação espontânea da mutação (por exemplo, dele-ção), ou em uma mutação de segundo sítio, que não afeta a atenuação invivo.

31. Flavivírus recombinante de acordo com a reivindicação 30,em que a modificação espontânea aumenta a deleção original de 5 nucleotí-deos no mutante dC para 24 nucleotídeos.

32. Método de prevenir ou tratar infecção por flavivírus em umindivíduo, o método compreende administrar ao indivíduo uma vacina quecompreende o flavivírus recombinante como definido na reivindicação 1.

33. Composição farmacêutica que compreende um flavivírus re-combinante como definido na reivindicação 1.

34. Molécula de ácido nucléico que compreende o genoma doflavivírus recombinante como definido na reivindicação 1.

35. Método de atenuar um candidato a vacina de flavivírus, ométodo compreendendo introduzir no candidato a vacina de flavivírus umamutação que reduz o viscerotropismo do flavivírus candidato.