JP2008538698A

JP2008538698A - 組換えフラビウイルスワクチン

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Publication number: JP2008538698A
Application number: JP2008507956A
Authority: JP
Inventors: コンスタンティンブイ．プガチェフ; ファーシャドギラクホー; トーマスピー．モナート
Original assignee: アカンビスインコーポレーティッド
Priority date: 2005-04-24
Filing date: 2006-04-24
Publication date: 2008-11-06
Anticipated expiration: 2026-04-24
Also published as: CN103031279A; AU2006239954A1; EP1874346A4; BRPI0609949A2; US20120288520A1; RU2007143529A; RU2465326C2; EP1874346A1; ES2478303T3; JP5469336B2; CN103031279B; EP1874346B1; CA2605924A1; US8124398B2; US8871222B2; WO2006116182A1; US20080175862A1

Abstract

本発明は、フラビウイルス感染の予防および処置に用いられうる組換えフラビウイルスワクチンを提供する。本発明のワクチンは弱毒変異を含む組換えフラビウイルスを含む。

Description

本発明は、組換えフラビウイルスを含むワクチンに関する。

フラビウイルスは一般に、感染したカおよびダニによって伝染する、小さな、エンベロープを有したプラス鎖RNAウイルスである。黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、およびウエストナイルウイルスのようないくつかのフラビウイルスは、世界的な公衆衛生に現在的または将来的な脅威を与える。例えば、黄熱病ウイルスは、サハラ以南のアフリカの特定のジャングルの場所、および南アフリカの一部の地域において流行病の原因になっている。多くの黄熱病ウイルス感染は軽症であるが、その疾患はまた重篤な生命にかかわる疾患を引き起こしうる。その疾患状態の初期または急性期は、普通には、高熱、悪寒、頭痛、背中の痛み、筋肉痛、食欲減退、吐き気、および嘔吐により特徴付けられる。3〜4日後、これらの症状は消える。いくらかの患者において、症状はその後、疾患がそのいわゆる毒性期に入った場合、再発する。この期の間、高熱が再発し、ショック、出血(例えば、口、鼻、目、および/または胃からの出血)、腎不全、および肝不全へ導きうる。実際、肝不全は、皮膚および目の白目の黄変である黄疸を引き起こし、それゆえに、その名前に「黄熱」を与えている。毒性期に入った患者の約半分は、10〜14日以内に死ぬ。しかしながら、黄熱病から回復した人は、再感染に対する一生続く免疫を有する。過去20年間に渡って黄熱病ウイルスに感染した人々の数は増加し続けており、今、約200,000例の黄熱病症例があり、毎年、約30,000例の関連死亡例がある。黄熱病の再興は、このように、深刻な公衆衛生上の懸念を示している。

ウエストナイル(WN)ウイルスは、アフリカ、インド亜大陸、ヨーロッパ、ウクライナ、ロシア、中央アジア、および中東において広く分布している(Monath and Heinz, Virology 3^rd ed., Fields et al., eds., Lippincott-Raven, pp. 961-1034, 1995)。1999年に、WNウイルスによって引き起こされたヒトおよびウマにおける脳炎のかつてない流行が米国で起きた(Enserik, Science 286:1450-1451, 1999)。それ以来、ウイルスは南北アメリカにおいて永久的に定着し、米国のほとんど全領土に影響を及ぼしている。これまで、米国における罹患率/死亡率に関して記録的な年は2003年であり、約3分の1が神経学的症状を伴っている9862例の報告された症例、および264例の死亡例があった。ヒト疾患は軽症のデング熱様疾患から致命的な髄膜脳炎まで様々であり、高齢者において最も重度の疾患が起きる。今まで、ウエストナイルウイルスに対する効果的な薬剤処置および監視の方法がなく、予防は、ヒト感染の症例の数に有意には影響を及ぼしていない。南アフリカへ移動するウイルスのリスク、および発展途上国における流行は極めて高い。安全かつ効果的なワクチンの開発は将来的な流行の管理へ貢献すると考えられる。

黄熱病ウイルスおよびウエストナイルウイルスを含むフラビウイルスは、ヒトおよび動物においてそれらの疾患状態の誘発に関与する2つの主要な生物学的性質を有する。これらの2つの性質の第一は、向神経性であり、それは宿主の神経組織に侵襲し、感染するウイルスの性向である。向神経性フラビウイルス感染は、結果として、脳および脊髄の炎症ならびに傷害(すなわち、脳炎)、意識障害、麻痺、ならびに痙攣を生じうる。フラビウイルスのこれらの生物学的性質の第二は、内臓向性であり、それは、肝臓、腎臓、および心臓を含む生命維持に必要な内臓器官に侵襲し、感染するウイルスの性向である。内臓向性フラビウイルス感染は、結果として、肝臓(肝炎)、腎臓(腎炎)、および心筋(心筋炎)の炎症ならびに傷害を生じ、これらの器官の不全または機能障害へと導きうる。

向神経性および内臓向性は、フラビウイルスの異なった別々の性質であるように考えられる。あるフラビウイルスは主として向神経性であり(ウエストナイルウイルスのような)、別のものは主として内臓向性であり(例えば、黄熱病ウイルスおよびデング熱ウイルス)、さらに別のものは両方の性質を示す(キャヌサール森林病ウイルスのような)。しかしながら、向神経性および内臓向性の両方は、すべてのフラビウイルスにおいてある程度は存在している。宿主内において、内臓の感染が中枢神経系の侵襲の前に起こるため、内臓向性と向神経性の間の相互作用が起こる可能性が高い。従って、向神経性は、神経外器官(内臓)において複製するウイルスの能力に依存する。この神経外複製は、ウイルス血症を生じ、それが次に、脳および脊髄の侵襲の原因となる。

フラビウイルスの完全にプロセシングされた成熟ビリオンは、3つの構造タンパク質、キャプシド(C)、膜(M)、およびエンベロープ(E)を含む。7つの非構造タンパク質(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5)は感染細胞において産生される。ウイルス受容体結合および融合ドメインの両方はEタンパク質内に存在する。さらに、Eタンパク質はまた、このタンパク質に対する抗体がウイルス感染力を中和し、疾患に対して宿主に保護を与えることができるため、フラビウイルスワクチンの望ましい成分である。感染細胞に見出される未成熟フラビビリオンは、Mタンパク質の前駆体であるプレ膜(prM)タンパク質を含む。フラビウイルスタンパク質は単一の長いオープンリーディングフレームの翻訳により産生されて、ポリタンパク質を生成し、続いて、ポリタンパク質の複雑な一連の翻訳後タンパク分解性切断により、成熟ウイルスタンパク質を生成する(Amberg et al., J. Virol. 73:8083:8094, 1999; Rice, "Flaviviridae," Virology, Fields et al., ed., Raven-Lippincott, New York, Volume I, P. 937, 1995)。ウイルス構造タンパク質は、C-prM-Eの順にポリタンパク質のN末端領域に配置されており、一方、非構造タンパク質は、上で述べられた順にC末端領域に位置している。

生ワクチンは、ウイルス感染により引き起こされる疾患に対する最も強力かつ耐久性のある防御免疫応答を与える。フラビウイルスの場合、成功したワクチンの開発は、ワクチンウイルスがヒトまたは動物についての向神経性および内臓向性を低下させているように毒性性質は改変されていることを必要とする。いくつかの異なるアプローチがフラビウイルスに対するワクチンの開発に用いられている。黄熱病ウイルスの場合、2つのワクチン(黄熱病17Dおよびフランス向神経性ワクチン)が連続継代により開発されている(Monath, "Yellow Fever," Plotkin and Orenstein, Vaccines, 3^rd ed., Saunders, Philadelphia, pp. 815-879, 1999)。黄熱病17Dワクチンは、ニワトリ胚組織における連続継代により開発され、結果として、有意に低下した向神経性および内臓向性を有するウイルスを生じた。フランス向神経性ワクチンは、マウス脳組織におけるウイルスの連続継代により開発され、結果として内臓向性の喪失を生じたが、向神経性を保持した。実際、神経学的偶発症候(種痘後脳炎)の高発生率は、フランスワクチンの使用と関連していた。

弱毒化へのもう一つのアプローチは、2つ(またはそれ以上)の異なるフラビウイルスの成分を含むキメラフラビウイルスの構築を含む。異なるフラビウイルス由来の構造および非構造タンパク質を含むキメラフラビウイルスが作製されている。例えば、いわゆるChimeriVax(商標)テクノロジーは、黄熱病17Dウイルスキャプシドおよび非構造タンパク質を用いて他のフラビウイルスのエンベロープタンパク質(prMおよびE)を送達する(例えば、Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999参照)。実際、このテクノロジーは、デング熱ウイルス、日本脳炎(JE)ウイルス、ウエストナイルウイルス、およびセントルイス脳炎(SLE)ウイルスに対するワクチン候補を開発するために用いられている(例えば、Pugachev et al., New Generation Vaccines, 3rd ed., Levine et al., eds., Marcel Dekker, New York, Basel, pp. 559-571, 2004; Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999; Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999; Guirakhoo et al., J. Virol. 74:5477-5485, 2000; Arroyo et al., Trends Mol. Med. 7:350-354, 2001; Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004; Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004; Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003; Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004;およびPugachev et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 71:639-645, 2004参照)。これらは、YF17Dワクチンと同様に、所望の異種性ウイルスに対して向けられる強い体液性および細胞性免疫応答を誘発する生ウイルスワクチンである。ChimeriVax(商標)-JEおよびデング熱ワクチンの広範囲に渡る特徴付けに基づいて、ChimeriVax(商標)の主な特徴は、基質細胞において高力価まで複製する能力(7 log₁₀ pfu/mlまたはそれ以上)、離乳児および乳児マウスにおける低神経毒性(YF17Dと比較して有意に低い)、神経毒性および内臓向性についての公式サル試験における高い弱毒化、インビトロおよびインビボでの高い遺伝的ならびに表現型安定性、天然における非制御的伝播を防ぐために重要であるカにおける非効率的な複製、ならびに重篤な免疫化後副作用なしに単一用量の投与後のマウス、サル、およびヒトにおける頑強な防御免疫の誘導を含むことが観察されている。

弱毒化への他のアプローチにおいて、キメラフラビウイルスを含むフラビウイルスの変異誘発が計画されている。野生型フラビウイルス病原体の弱毒化へのいくつかの実験的アプローチが記載されている(例えば、Pugachev et al., Int. J. Parasitol. 33:567-582, 2003による概説を参照)。例えば、黄熱病ウイルスのキャプシドタンパク質および非構造タンパク質、ならびに日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、またはウエストナイルウイルスの膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質の特定のアミノ酸における変異が内臓向性を減少させることが見出されている(例えば、WO 03/103571およびWO 2004/045529参照)。もう一つのアプローチは、もともと野生型4型デング熱ウイルスに適用されたのだが、3'非翻訳領域(3'UTR)に30ヌクレオチドまたはそれ以上の大きな欠失を含む(Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996; 米国特許第6,184,024 B1号)。欠失デルタ30またはΔ30と名付けられたこれらの欠失の1つは、野生型4型デング熱ウイルスおよび1型デング熱ウイルス、ならびに4型デング熱/WNキメラウイルスとの関連においてさらに研究された(Durbin et al., AJTMH 65:405-413, 2001; Whitehead et al., J. Virol. 77:1653-1657, 2003; Pletnev et al., Virology 314:190-195, 2003; WO 03/059384; WO 03/092592; WO 02/095075)。追加として、野生型ダニ媒介性脳炎(TBE)およびランガト(Langat)ウイルスへ導入された大きな3'UTR欠失(417〜616ヌクレオチド長)のいくつかは、マウスモデルにおいて高度に弱毒化していることが見出された(Mandl et al., J. Virol. 72:2132-2140, 1998; Pletnev, Virology 282:288-300, 2001)。限られた量のインビトロデータがYF17Dワクチンウイルスについて発表された。具体的には、Bredenbeekおよび共著者らは、3'UTRのすべての3つの反復配列(RS)エレメントの大きな欠失(188ヌクレオチド長；RSエレメントの位置は図1Aに示されている)または保存配列エレメント2(CS2)の25ヌクレオチド欠失はBHK細胞においてウイルス複製を妨げなかったが、CS1または3'極端ステムループに影響を及ぼす3つの他の欠失は致死的であることを実証した(Bredenbeek et al., J. Gen. Virol. 84:1261-1268, 2003)。フラビウイルス(デング熱)3'UTRの大きな3'末端ステムループ構造へ導入された変異は結果として、宿主を免疫するウイルスの能力を保持しながら、弱毒化を生じたことを他の者が示している(Markoff et al., J. Virol. 76:3318-3328, 2002)。

TBEのCタンパク質へ一連の欠失を導入し、いくつかの生存可能な変異体を回収したKoflerおよび共同研究者らにより記載されているように、高病原性野生型TBEウイルスの弱毒化について記載された第二のアプローチは、キャプシドタンパク質Cにおける比較的大きな欠失を利用した(Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002)。具体的には、タンパク質(推定のヘリックス(Helix)I；図2A参照)の中央の疎水性ドメインにおける16アミノ酸欠失が、BHK細胞においてウイルス複製を劇的に低下させ、マウスにおいて神経侵襲性を有意に減少させた。このTBE変異体での免疫化は、高病原性TBE株Hypr(>100 LD₅₀)での曝露からマウスを保護した(Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002)。

認可されたワクチンは、とりわけ、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、およびオムスク出血熱ウイルスのような内臓向性性質を有する多くの医学的に重要なフラビウイルスについて現在、利用できない。

発明の概要
本発明は、本明細書に記載されているように、すでに弱毒化されたフラビウイルスへ内臓向性における小さな減少を与える1つまたは複数の変異を含む組換えフラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルスまたはキメラフラビウイルス)を提供する。本発明に含まれるキメラフラビウイルスの例は、第一のフラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルス株17Dのような黄熱病ウイルス)のキャプシドタンパク質および非構造タンパク質ならびに第二のフラビウイルス(例えば、日本脳炎ウイルス、1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、3型デング熱ウイルス、4型デング熱ウイルス、マーレーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、クンジンウイルス、ロシオ脳炎ウイルス、イレウスウイルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、シベリア脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、アルフルマ(Alkhurma)ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、ネギシウイルス、アブセッタロブ(Absettarov)ウイルス、ハンサロバ(Hansalova)ウイルス、アポイウイルス、およびHyprウイルスからなる群より選択されるウイルス)の膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含むものである。ウエストナイルウイルス膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルスの場合、エンベロープタンパク質は、任意で、エンベロープアミノ酸107位、316位、および440位における置換を含むことができる。本発明の組換えフラビウイルスの変異は、例えば、1つもしくは複数の欠失または置換でありうる。

本発明の変異は、例えば、組換えフラビウイルスの3'非翻訳領域を含む組換えフラビウイルスの領域に位置することができ、一般的に、30ヌクレオチド未満を含む。この型の変異の例として、変異は、ウイルスの3'非翻訳領域におけるステム構造(例えば、ウイルスの3'非翻訳領域の非保存領域におけるステム構造)、または推定二次構造もしくは全体構造の可能な代替的要素を不安定にするものでありうる。具体例として、変異は、本明細書に記載されているように、d7、dA、dB、dC、およびdDの任意の1つまたは複数でありうる。他の例において、変異は、保存配列2(CS2)の1つまたは複数のヌクレオチドを含むことができ、従って、例えば、CS2 d5またはCS2 d16でありうる。他の例において、変異体フラビウイルスは、細胞培養基質に適応し、結果として、それが含む変異の自発性改変(例えば、dC変異体における最初の5ヌクレオチド欠失を24ヌクレオチドへ増加させる改変のような欠失；下記参照)、またはインビボで弱毒化に影響を及ぼさない第二の部位変異を生じる。

本発明の変異はまた、キャプシド配列へ導入されうる。そのような変異は、例えば、キャプシドタンパク質の1〜3アミノ酸の欠失を含みうる。そのような変異の具体例として、変異は、キャプシドタンパク質のヘリックスIにおける1つまたは複数の欠失でありうる(例えば、本明細書に記載されているように、変異C2)。

他の例において、本発明の変異は、エンベロープアミノ酸の1つまたは複数の置換を含みうる。一つの例において、そのようなエンベロープ変異は、エンベロープアミノ酸138位、176位、177位、244位、264位、および280位の1つもしくは複数、またはそれらの組み合わせにおける置換である。そのような組み合わせの具体例は以下を含む：176位、177位、および280位；176位、177位、244位、264位、および280位；ならびに138位、176位、177位、および280位。

本発明の組換えフラビウイルスは、上記の領域の1つのみにおける、またはこれらの領域の2つもしくはすべての3つにおける変異を含みうる。加えて、組換えフラビウイルスは、フラビウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域における1つもしくは複数の変異、および/またはフラビウイルスの膜タンパク質における変異を含みうる。本発明の組換えフラビウイルスの具体例として、d7、dB、dD、および/またはE#5(すなわち、E176、E177、およびE180)変異(下記参照)と組み合わせてのC2変異を、任意でChimeriVax(商標)-WN02(同じく下記参照)との関連において、含むフラビウイルスは注目される。複数の変異を含む組換えフラビウイルスの追加の例は、本明細書の他の所で提供されている。

本発明はまた、本明細書に記載された組換えフラビウイルスの1つまたは複数を含むワクチンを被験体に投与する段階を含む、被験体においてフラビウイルス感染を予防または処置する方法、およびそのような組換えフラビウイルスを含む薬学的組成物を提供する。さらに、本発明は、そのような組換えフラビウイルスのゲノム(またはその相補体)を含む核酸分子(例えば、RNAまたはDNA分子)を含む。加えて、本発明は、不活性化ワクチンの調製における本明細書に記載された組換えフラビウイルスの使用を含む。本明細書に記載されているように、フラビウイルスワクチン候補の内臓向性を低下させる1つまたは複数の変異をフラビウイルスワクチン候補へ導入する段階を含む、フラビウイルスワクチン候補を弱毒化する方法もまた本発明に含まれる。

本発明はいくつかの利点を提供する。本発明の変異を受けるウイルスは、哺乳動物細胞に感染する能力を維持する、生きている弱毒フラビウイルスである。ウイルスは感染性であるため、それらが、ワクチン接種される被験体において疾患へ導くことのないように十分に弱毒化されていることを保証することが重要である。本発明は、候補フラビウイルスワクチンの弱毒化を微調整するためのアプローチを提供し、それに従って、安全なワクチンの作製を可能にする。本発明の組換えフラビウイルスはまた、それらが親株および野生型株と比較して相対的に安全であるため、有利である。この特徴は、生きている弱毒ワクチンとしてのそれらの使用および投与において、加えて不活性化ワクチンとしてのそれらの調製および使用に関して、有利である。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および添付の特許請求の範囲から明らかであると考えられる。

詳細な説明
本発明は、ワクチン接種方法のような治療方法に用いられうる組換えフラビウイルスを提供する。本発明のフラビウイルスの中心となるのは、ウイルスのゲノムにおける弱毒変異の存在である。これらの変異は、例えば、ウイルスの内臓向性および/または向神経性を減少させることによりウイルスを弱毒化することができる。変異は、3'非翻訳領域(3'UTR)、キャプシド配列、および/またはエンベロープ配列を含むフラビウイルスゲノムの領域に存在しうる。さらに下で考察されているように、本発明の変異は、1つまたは複数の他の弱毒変異をすでに含むワクチン株の弱毒化を微調整するために用いられうる。従って、例えば、本発明の変異は、プラークアッセイにおいてプラークサイズにおける減少および/または動物モデルにおけるウイルス血症の低下を結果として生じることにより同定されうる(下記参照)。本発明の変異は、それゆえに、そのようなウイルスの弱毒化に関して安全性のレベルの追加を提供する。本発明のウイルスおよび方法の詳細は下に提供されている。

本発明の変異を受けうるフラビウイルスの一つの例は、黄熱病ウイルス、例えば、YF17Dワクチン株である(Smithburn et al., "Yellow Fever Vaccination," World Health Org., p. 238, 1956; Freestone, Plotkin et al. (eds.), Vaccines, 2^nd edition, W.B. Saunders, Philadelphia, 1995)。他の黄熱病ウイルス株、例えば、YF17DD(GenBankアクセッション番号U17066)およびYF17D-213(GenBankアクセッション番号U17067)(dos Santos et al., Virus Res. 35:35-41, 1995)、YF17D-204 France(X15067, X15062)、YF17D-204、234 US(Rice et al., Science 229:726-733, 1985; Rice et al., New Biologist 1:285-296, 1989; C 03700, K02749)、およびGaller et al., Vaccine 16(9/10):1024-1028, 1998により記載された黄熱病ウイルス株もまた、本発明に用いられうる。

本発明の変異を受けうる追加のフラビウイルスは、日本脳炎ウイルス(例えば、SA14-14-2)、デング熱ウイルス(血清型1〜4)、マーレーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、クンジンウイルス、ロシオ脳炎ウイルス、およびイレウスウイルスのような他のカ媒介性フラビウイルス；中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、シベリア脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、アルフルマウイルス、オムスク出血熱ウイルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、ネギシウイルス、アブセッタロブウイルス、ハンサロバウイルス、アポイウイルス、およびHyprウイルスのようなダニ媒介性フラビウイルス；加えて、ヘパシウイルス属(例えば、C型肝炎ウイルス)由来のウイルスを含む。これらのウイルスの全部は、内臓器官に感染するいくらかの性向を有する。これらのウイルスの内臓向性は、必ずしも生命維持に必要な内臓器官の機能障害を引き起こすとは限らないが、これらの器官におけるウイルスの複製が、ウイルス血症を引き起こし、それに従って、中枢神経系の侵襲に寄与しうる。従って、内臓器官への損傷のリスクを減少させることに加えて、変異誘発によりこれらのウイルスの内臓向性を減少させることは、脳に侵襲し、脳炎を引き起こすそれらの能力を低下させることができる。

上で列挙されたウイルスおよび他のフラビウイルスに加えて、上で述べられた変異の型の1つまたは複数を含むキメラフラビウイルスもまた本発明に含まれる。これらのキメラは、構造タンパク質が第二のウイルス(すなわち、フラビウイルス；例えば、米国特許第6,696,281号；米国特許第6,184,024号；米国特許第6,676,936号；および米国特許第6,497,884号参照、のような試験ウイルスまたはあらかじめ決められたウイルス)の対応する構造タンパク質と置換されているフラビウイルス(すなわち、バックボーンフラビウイルス)からなりうる。例えば、キメラは、フラビウイルスの膜タンパク質およびエンベロープタンパク質が第二の試験ウイルス(例えば、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス(血清型1、2、3、または4)、日本脳炎ウイルス、または本明細書で述べられたもののいずれかのような別のウイルス)の膜およびエンベロープと置換されているバックボーンフラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルス)からなりうる。キメラウイルスは、ウイルスの任意の組み合わせから作製されることができるが、典型的には、それに対する免疫が求められるウイルスが挿入される構造タンパク質の源である。

本発明の変異を受けることができるキメラウイルスの型の具体例は、黄熱病ヒトワクチン株、YF17Dであり、それにおいて、膜タンパク質およびエンベロープタンパク質が、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス(血清型1、2、3、または4)、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マーレーバレー脳炎ウイルス、または上で列挙されたものの1つのような任意の他のフラビウイルスのようなもう一つのフラビウイルスの膜タンパク質およびエンベロープタンパク質と置換されている。このアプローチを用いて作製されたキメラフラビウイルスは、いわゆる「ChimeriVax」と名付けられている。ChimeriVax(商標)テクロノジーを用いて作製され、ブダペスト条約の条項によりManassas, Virginia, U.S.A.におけるAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、1998年1月6日の寄託日を付与された以下のキメラフラビウイルスは、本発明のウイルスを作製するために用いられうる：キメラ黄熱病17D/デング熱2型ウイルス(YF/DEN-2；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2593)およびキメラ黄熱病17D/日本脳炎SA14-14-2ウイルス(YF/JE A1.3；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2594)。本発明に用いられうるキメラウイルスを作製する詳細は、例えば、以下の刊行物に提供されている：WO 98/37911; WO 01/39802; Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999; WO 03/103571; WO 2004/045529;米国特許第6,696,281号;米国特許第6,184,024号;米国特許第6,676,936号;および米国特許第6,497,884号。

上で述べられているように、本発明の新しい変異は、キメラフラビウイルスを含むフラビウイルスの3'UTR、キャプシド、および/またはエンベロープ配列に存在する。変異のこれらの型のそれぞれは、お互いと、および/または他の弱毒変異と組み合わせられうるが、以下のとおり記載される。

3'非翻訳領域変異
すべてのChimeriVax(商標)ウイルスに共通している、黄熱病ウイルスワクチン株、YF17Dの3'UTRの構成は図1Aに示されている。それは、3'末端から順番に、(i)マイナス鎖RNA合成のためのプロモーターとして機能すると仮定されており、すべてのフラビウイルスについて保存されている3'極端ステムループ構造、(ii)すべてのカ媒介性フラビウイルスに対して高いヌクレオチド配列相同性を有する2つの保存配列エレメント、CS1およびCS2、ならびに(iii)YF17Dワクチンウイルスを含む西アフリカ黄熱病ウイルス株に固有の、3'UTRの上流部分に位置する反復配列エレメント(RS)の3つのコピーを含む(Chambers et al., Annu. Rev. Microbiol. 44:649-688, 1990)。3'UTRはまた、図1Bに描かれているように、RSエレメントから下流の非保存領域におけるもののような多数の推定ステムループ構造を含む。

本発明の3'UTR変異は、一般的に、短い、例えば30ヌクレオチド未満(例えば、1、2、3などで、29まで(例えば、2〜25、3〜20、4〜15、5〜10、または6〜8ヌクレオチド長))の弱毒化欠失である。ワクチン候補へ個々に、または他の弱毒変異と組み合わせて導入される場合、本発明の新しい変異は、結果として、弱毒化のレベルの追加を生じ、それに従って、ワクチン候補の弱毒化のレベルを微調整するためのアプローチを提供する。いくつかの例において、本発明の短い3'UTR欠失は、3'UTRにおける推定ステム構造の1つもしくは複数および/または3'UTRの全体構造の二次構造を不安定にするように設計される。欠失に加えて、そのような構造における変異はまた、同様に結果としてステム構造の不安定化を生じる置換を含みうる。特定の例において、本発明の変異を受けるステムループ構造は、3'UTRの非保存領域に、またはそのような変異に耐えることができる保存領域に(例えば、CS2に)存在する。例えば、黄熱病ウイルス(例えば、YF17D)3'UTRの場合、無傷の黄熱病ウイルスの関連であろうが黄熱病ウイルスに基づいたキメラの関連であろうが、ステム不安定化変異は、図1Bに示されたステム構造の任意の1つまたは複数に存在することができ、図1Bは、下でさらに記載されているが、そのような欠失の4つの例(dA、dB、dC、およびdD)を示している。従って、これらの具体例に加えて、黄熱病ウイルスにおける3'UTR変異の他の例は、5'から3'へ読まれる場合、図1Bに示されている、例えば、以下のステム配列の1〜2、3〜8、4〜7、または5〜6ヌクレオチドを含む変異を含む：

。

ステム不安定化変異に加えて、本発明の変異はまた、3'UTRにおいて他の短い欠失を含む。例えば、本発明は、上記のΔ30変異内にある特定の変異を含む。従って、例えば、本発明は、この領域内に1、2、3などで、29まで(例えば、1〜25、2〜20、3〜15、4〜14、5〜13、6〜12、7〜11、8〜10、または9)のヌクレオチド長である任意の生存可能な変異を含む。具体例として、本発明は、欠失d7を含み、ここでは、YF17Dにおけるこの領域から以下のヌクレオチドが欠失している：ヌクレオチド345位〜351位(AAGACGG；ウイルスORFのUGA終結コドン後の3'UTRの第1のヌクレオチドから番号を付ける；図1A)。この配列の3'末端または5'末端からの、例えば、1個、2個、3個、4個、または5個の追加のヌクレオチドの欠失を含む変異もまた本発明に含まれる。他の例において、保存配列CS1およびCS2における短い欠失が本発明に含まれる。これらの変異は、これらの配列の例えば、1〜29、2〜25、3〜20、4〜15、5〜10、または6〜8ヌクレオチドの欠失を含みうる。2つの具体例として、下でさらに記載されているが、ヌクレオチド360位〜364位(GGTTA；CS2d5；図1A)および/またはヌクレオチド360位〜375位(GGTTAGAGGAGACCCT；CS2d16；図1A)は、YF17D特異的3'UTRのCS2から欠失している。この配列の3'末端または5'末端からの、例えば、1個、2個、3個、4個、または5個の追加のヌクレオチドの欠失を含む変異もまた本発明に含まれる。他のフラビウイルス3'UTRについて、同様の変異が、3'UTRの二次構造に基づいて加えられうる。他のフラビウイルスの3'UTRの二次構造の予測は、例えば、デング熱、クンジン、およびTBE(例えば、Proutski et al., Virus Res. 64:107-123, 1999参照)、ならびにHCV(例えば、Kolykhalov et al., J. Virol. 70:3363-3371, 1996参照)について、発表されている。さらに、すべての4つの主要な血清型群を表すフラビウイルス(YF、JE、デング熱、およびTBE)の多くの株についての多数の3'UTRヌクレオチド配列は、GenBankから入手できる。追加の株の配列は、ウイルスシーケンシングにより決定されうる。これらの配列の二次構造は、標準ソフトウェア(例えば、mfoldまたはRNAfoldプログラム)を用いて容易に予測され、変異を受けることができる可能なステムループ構造を明らかにすることができる。

下でさらに考察されているように、本発明の3'UTR変異は、すでに弱毒化されたワクチン候補をさらに弱毒化するために用いられうる。従って、本明細書に記載された3'UTR変異(例えば、d7、dB、dC、および/またはdD)の1つまたは複数は、YF17D黄熱病ウイルスワクチン株へ更なるレベルの安全性を与えるために行われうる。任意で、3'UTR変異は、ウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域(例えば、エンベロープアミノ酸48位〜61位、127位〜131位、および196位〜283位、例えばアミノ酸279位、の任意の1つもしくは複数、またはデング熱1ウイルスのアミノ酸204位、252位、253位、257位、258位、および261位に対応する黄熱病ウイルスにおけるエンベロープアミノ酸の1つもしくは複数の置換(例えば、WO 03/103571参照)；フラビウイルスエンベロープタンパク質のヒンジ領域はドメインIとドメインIIの間にある；例えば、Rey et al., Nature 375:291-298, 1995参照)、黄熱病ウイルスの膜タンパク質におけるアミノ酸(例えば、膜タンパク質の膜ヘリックス部分、例えば、ウエストナイルウイルス膜タンパク質の66位に対応するアミノ酸)における弱毒変異、または本明細書に記載されたキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質変異のいずれか(例えば、ウエストナイルウイルスアミノ酸138位、176位、177位、244位、264位、280位、313位、316位、380位、および440位に対応する位置における、単独または組み合わせでのアミノ酸置換)のような1つまたは複数の追加の弱毒変異と共にこの株に含まれうる。

実際、3'UTRにおいて特定された変異または欠失を、フラビウイルスを弱毒化することが知られている部位でのキャプシド遺伝子における(下記のような)、prM遺伝子における(例えば、YF-日本脳炎キメラのM5もしくはM60、またはYF-WNキメラのM66、または周囲のアミノ酸における(PCT/US2005/037369および下記参照))、またはE遺伝子における1つもしくは複数の変異または欠失と組み合わせることは可能である。E遺伝子は、HurrelbrinkおよびMcMinnにより記載されているように(Adv. Virus Dis. 60:1-42, 2003)、機能性ドメイン内のアミノ酸変化が機能に影響を及ぼし、それにより毒性を低下させうる機能性ドメインを含む。本出願に記載された3'UTR欠失/変異と共に結果として適切に弱毒化されたワクチンを生じうる変異が挿入されうるEタンパク質の機能性領域は、以下を含む：a)ドメインIIIの外面上の推定上の受容体結合領域、b)エンドソームにおけるEタンパク質の酸依存性立体構造変化を決定し、ウイルス内部移行の効率を低下させる、ドメインIとドメインIIの間の分子ヒンジ領域；c)prM/MとEタンパク質の界面、エンドソームにおける低pHへの曝露後の二量体から三量体への再編成に従ってprM/Mと相互作用するEタンパク質の領域；d)内部移行事象中にエンドソームの膜との融合に関与する、ドメインIIの融合ドメインの先端；およびe)酸誘導融合事象中のEタンパク質の立体構造変化にも機能的に関与する、ステム-アンカー領域。

3'UTR変異はまた、キメラフラビウイルスワクチン候補に含まれうる。一つの例において、下でさらに記載されているが、本明細書に記載された3'UTR変異の1つまたは複数は、黄熱病ウイルス(YF17D)のキャプシドタンパク質および非構造タンパク質、ならびにウエストナイルウイルス(NY99)の膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含むワクチン候補(ChimeriVax(商標)-WN02と本明細書で呼ばれる)に含まれ、そのエンベロープタンパク質は弱毒変異(107位、316位、および440位における置換；WO 2004/045529；下記も参照)をすでに含む。従って、本発明は、例えば、d7、dB、dC、dD、または本明細書に記載された任意の他の3'UTR変異も含む(任意で、本明細書に記載されているような、1つもしくは複数のキャプシド変異または追加のエンベロープ変異と組み合わせて)ChimeriVax(商標)-WN-02を含む。他の例において、膜タンパク質およびエンベロープタンパク質は、日本脳炎ウイルス(例えば、SA14-14-2)、デング熱ウイルス(デング熱1、2、3、または4ウイルス)、または本明細書に記載された別のフラビウイルスのような別のフラビウイルス由来である。

上記の黄熱病ウイルスワクチンと同様に、3'UTR変異は、任意で、ウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域(例えば、黄熱病ウイルスアミノ酸48位〜61位、127位〜131位、および196位〜283位、例えばアミノ酸279位、に対応する任意の1つもしくは複数のアミノ酸、またはデング熱1ウイルスのアミノ酸204位、252位、253位、257位、258位、および261位に対応するエンベロープタンパク質におけるアミノ酸の1つもしくは複数の置換(例えば、WO 03/103571参照))、膜タンパク質におけるアミノ酸(例えば、膜タンパク質の膜ヘリックス部分、例えば、ウエストナイルウイルス膜タンパク質の66位に対応するアミノ酸)における弱毒変異、または本明細書に記載されたキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質変異のいずれか(例えば、ウエストナイルウイルスアミノ酸138位、176位、177位、244位、264位、および280位に対応する位置における、単独または組み合わせでのアミノ酸置換)のような1つまたは複数の追加の弱毒変異と共にキメラフラビウイルスに含まれうる。弱毒異なるタイプの変異の組み合わせを含む高度に弱毒化されたウイルスの具体例は、下に記載されている。これらは、キャプシドタンパク質におけるC2欠失が、3'UTRにおけるd7、dB、もしくはdD欠失と、またはエンベロープタンパク質におけるアミノ酸変化のE#5組み合わせ(E176、E177、およびE280アミノ酸変化)と共に組み合わされている、キメラ黄熱病-ウエストナイル変種を表す。

キャプシド変異
下でさらに考察されているように、本発明者らは、キャプシドタンパク質内の短い欠失変異がまた、すでに弱毒化されたワクチン候補をさらに弱毒化するために用いられうることを見出した。従って、本発明は、キャプシドタンパク質に短い欠失(例えば、1、2、3、または4アミノ酸の欠失)を含むフラビウイルス(他の弱毒変異をすでに含むワクチン候補のようなキメラフラビウイルスを含む)を含む。YF17Dウイルスキャプシドタンパク質に関して提供されるそのような変異の例は、タンパク質のヘリックスIに影響を及ぼす生存可能な欠失を含む(図2A参照)。そのような変異の具体例は、ヘッリクスIからのアミノ酸PSRの欠失を含む変異C2である(図2A)。この領域における他の短い変異は、生存力および弱毒化について試験されることができ、同様に本発明に含まれる。他のフラビウイルスのキャプシドタンパク質配列は、例えば、TBEウイルス、WNウイルス、クンジンウイルス、JEウイルス、およびデング熱ウイルスについて発表されている(例えば、Pletnev et al., Virology 174:250-263, 1990)。

上で考察された3'UTR変異と同様に、キャプシドタンパク質変異は、黄熱病ウイルスワクチン株(例えば、YF17D)へ、任意で以下の変異の任意の1つまたは複数と組み合わせて、導入されうる：本明細書に記載された3'UTR変異(例えば、d7、dB、dC、dD、またはそれらの変形)；ウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域(例えば、エンベロープアミノ酸48位〜61位、127位〜131位、および196位〜283位、例えばアミノ酸279位、の任意の1つもしくは複数、またはデング熱1ウイルスのアミノ酸204位、252位、253位、257位、258位、および261位に対応する黄熱病ウイルスにおけるアミノ酸の1つもしくは複数の置換(例えば、WO 03/103571参照))、黄熱病ウイルスの膜タンパク質におけるアミノ酸(例えば、膜タンパク質の膜ヘリックス部分、例えば、ウエストナイルウイルス膜タンパク質の66位に対応するアミノ酸)における弱毒変異、または本明細書に記載されたエンベロープタンパク質変異のいずれか(例えば、ウエストナイルウイルス138位、176位、177位、244位、264位、および280位に対応する位置における、単独または組み合わせでのアミノ酸置換)。

同様に、キャプシドタンパク質変異は、キメラフラビウイルスへ導入されうる。一つの例において、下でさらに記載されているが、本明細書に記載されたキャプシド変異の1つまたは複数は、黄熱病ウイルス(YF17D)のキャプシドタンパク質および非構造タンパク質、ならびにウエストナイルウイルス(NY99)の膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含むワクチン候補(ChimeriVax(商標)-WN02と本明細書で呼ばれる)に含まれ、そのエンベロープタンパク質は弱毒変異(107位、316位、および440位における置換；WO 2004/045529；下記も参照)をすでに含む。従って、本発明は、例えば、C2変異も含む(任意で、本明細書に記載されているような、1つもしくは複数の3'UTR変異および/または追加のエンベロープ変異と組み合わせて、例えば、3'UTRにおけるd7、dB、もしくはdD欠失との、またはエンベロープタンパク質におけるアミノ酸変化のE#5組み合わせとのC2欠失の構築されかつ特徴付けられた組み合わせ)ChimeriVax(商標)-WN-02を含む。他の例において、膜タンパク質およびエンベロープタンパク質は、日本脳炎ウイルス(例えば、SA14-14-2)、デング熱ウイルス(デング熱1、2、3、または4ウイルス)、または本明細書に記載された別のフラビウイルスのような別のフラビウイルス由来である。他の例において、そのような変異は、上で考察されているように、天然(非キメラ)のフラビウイルスへ導入される。

さらに、3'UTR変異は、任意で、ウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域(例えば、黄熱病ウイルスアミノ酸48位〜61位、127位〜131位、および196位〜283位、例えばアミノ酸279位、に対応する任意の1つもしくは複数のアミノ酸、またはデング熱1ウイルスのアミノ酸204位、252位、253位、257位、258位、および261位に対応するエンベロープタンパク質におけるアミノ酸の1つもしくは複数の置換(例えば、WO 03/103571参照))、膜タンパク質におけるアミノ酸(例えば、膜タンパク質の膜ヘリックス部分、例えば、ウエストナイルウイルス膜タンパク質の66位に対応するアミノ酸)における弱毒変異、または本明細書に記載されたエンベロープタンパク質変異のいずれか(例えば、ウエストナイルウイルスアミノ酸138位、176位、177位、244位、264位、280位、313位、316位、380位、および440位に対応する位置における、単独または組み合わせでのアミノ酸置換)のような1つまたは複数の追加の弱毒変異と共にキメラフラビウイルスに含まれうる。

エンベロープ変異
本明細書の他の所で考察されているように、特定のエンベロープ変異は、黄熱病ウイルス(例えば、YF17D)およびキメラフラビウイルスのようなフラビウイルスについて弱毒化していると記載されている。これらは、ヒンジ領域変異(例えば、黄熱病ウイルスのアミノ酸48位〜61位、127位〜131位、170位、173位、200位、299位、305位、380位、および196位〜283位に対応する位置における置換、ならびに黄熱病ウイルスの場合の残基52位および200位(図3)を含むドメインIIの疎水性ポケットを裏打ちしている残基(Hurrelbrink et al., Adv. Virus Res. 60:1-42, 2003; Modis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:6986-6991, 2003;図3参照)、日本脳炎ウイルスのアミノ酸279位(黄熱病に基づいたキメラの関連において)、およびデング熱1ウイルスのアミノ酸204位、252位、253位、257位、258位、および261位における置換(例えば、WO 03/103571参照))、加えてウエストナイルウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸107位、316位、および440位における置換(例えば、WO 2004/045529参照)を含む。

下の実施例においてさらに考察されているように、本発明者らは、フラビウイルスエンベロープ配列における変異もまた、すでに弱毒化されたフラビウイルスの弱毒化を微調整するための手段を提供できることを発見している。従って、本発明は、候補ワクチンの弱毒化を微調整するために用いられうる1つまたは複数のエンベロープタンパク質変異を含むフラビウイルス(例えば、本明細書に記載されているように、黄熱病ウイルスまたはキメラフラビウイルス)を含む。そのような変異の例は、ウエストナイルウイルスのアミノ酸138位、176位、177位、244位、264位、および280位に対応する位置における置換、ならびにこれらの変異の組み合わせ(例えば、176位、177位、および280位；176位、177位、244位、264位、および280位；ならびに138位、176位、177位、および280位)を含む。すでに弱毒化されたワクチン候補の弱毒化における小さな減少を与えるこれらのようなエンベロープ変異は、本明細書に記載されているような、黄熱病ウイルスワクチン(例えば、YF17Dに基づいたワクチン)またはキメラフラビウイルスにおける等価の位置に含まれうる。任意で、これらの変異は、本明細書に記載された、他のエンベロープ変異、キャプシド変異、膜変異、および/または3'UTR変異の1つまたは複数と共に含まれうる。

キャプシド遺伝子および3'UTRについて記載されたすべての変異は、組み合わせられていない親ウイルスのそれぞれより内臓向性が低い(すなわち、宿主においてウイルス血症を誘発することがより少ない)弱毒表現型を有するウイルスを作製するためにこれらのエンベロープ変異(弱毒化に影響を及ぼすことが示された1つのエンベロープ残基または複数の残基に関する)と組み合わせられうる。例えば、C2変異体(表2)は、E#7(表4)、またはdC、dDなどと組み合わせられうる。3'UTR欠失(表1)は、C2またはE#7ウイルスと組み合わせられうる。

本発明の3'UTR、キャプシドタンパク質、およびエンベロープタンパク質の変異と共に含まれうる変異
上記の弱毒変異の1つまたは複数に加えて、本発明のフラビウイルスは、他の弱毒変異を含みうる。本発明に含まれる変異の3つの型のそれぞれとの組み合わせに関して上で述べられているが、このセクションはこれらの変異のより詳細な説明を提供する。

本発明の変異を含むフラビウイルス(キメラフラビウイルスを含む)に含まれうる変異の例は、エンベロープタンパク質のヒンジ領域における変異または特定の膜タンパク質変異を含む。特に、特定のエンベロープタンパク質ヒンジ領域変異は内臓向性を低下させることが見出されている。エンベロープタンパク質のポリペプチド鎖は以下の3つの別個のドメインへ折り畳む：中央ドメイン(ドメインI)、二量体化ドメイン(ドメインII)、および免疫グロブリン様モジュールドメイン(ドメインIII)。ヒンジ領域は、ドメインIとドメインIIの間に存在し、酸性pHへの曝露により、受容体媒介性エンドサイトーシスによるウイルス取り込み後のウイルス膜およびエンドソーム膜の融合に関与するエンベロープタンパク質三量体の形成を生じる立体構造変化を起こす(このゆえに、名称「ヒンジ」)。立体構造変化の前に、そのタンパク質は二量体の形で存在する。

例えば、黄熱病ウイルスのアミノ酸48位〜61位、127位〜131位、および196位〜283位を含む多数のエンベロープアミノ酸がヒンジ領域に存在する(Hurrelbrink et al., Adv. Virus Res. 60:1-42, 2003; Rey et al., Nature 375:291-298, 1995)。これらのアミノ酸、または近接の周囲アミノ酸(および他のフラビウイルスエンベロープタンパク質における対応するアミノ酸)のいずれかにおける弱毒変異は、本発明のウイルスに存在しうる。特に興味深いのは、ヒンジ領域の疎水性ポケット内のアミノ酸である(Modis et al., 印刷物の前にオンラインで発表された、2003年5月20日、10.1073/pnas.0832193100. PNAS│June 10, 2003│vol. 100│no. 12│6986-6991)。具体例として、黄熱病ウイルスベクターへ挿入されたデング熱1配列を含むキメラフラビウイルスにおける、ヒンジ領域の疎水性ポケットにあるエンベロープアミノ酸204位の置換(デング熱1ウイルスにおいてKからRへ)は、結果として弱毒を生じる。この置換は、野生型タンパク質における1つのエンベロープ単量体と別の単量体との間の分子間水素結合が乱され、単量体内の新しい分子内相互作用へと置換されるように、エンベロープタンパク質の構造における変化につながる。従って、追加の置換は、疎水性ポケットにおける分子内相互作用を増加させて、弱毒化へ導くために用いられうる。本発明の変異と組み合わせて、疎水性ポケットに対して行われうるそのような変異/置換の例は、E202K、E204K、E252V、E253L、E257E、E258G、およびE261Hにおける置換を含む。

上記の3'UTR、キャプシド、および/またはエンベロープ変異に加えて、本発明のフラビウイルスはまた、膜タンパク質において、例えば、ウエストナイルウイルスの膜タンパク質のアミノ酸66位に対応するアミノ酸において、および/または推定の膜ヘリックス内の他のアミノ酸において(例えば、ウエストナイルウイルスのアミノ酸40位〜75位に対応する任意の1つまたは複数のアミノ酸において)、1つまたは複数の弱毒変異を含みうる。ウエストナイルウイルス膜タンパク質の場合における具体例として、膜タンパク質アミノ酸66位(野生型ウエストナイルウイルスにおけるロイシン)は、プロリンのようなもう一つのアミノ酸に置換されうる。プロリンに加えて、イソロイシン、メチオニン、もしくはバリンのような他の疎水性アミノ酸、またはアラニンもしくはグリシンのような小さなアミノ酸は、膜タンパク質の66位において野生型アミノ酸を置換できる。他の例として、ウエストナイルウイルスの60位、61位、62位、63位、および/または64位(または他のフラビウイルスにおける対応する位置)におけるアミノ酸は、単独で、またはお互いに、66位における変異と、および/もしくは別の変異と組み合わせて、置換されうる。これらの位置における置換の例は以下を含む：60位においてアルギニンからグリシンへ、61位においてバリンからアラニンへ、62位においてバリンからグルタミン酸へ、63位においてフェニルアラニンからセリンへ、および64位においてバリンからイソロイシンへ。もう一つの例は、ChimeriVax(商標)-JEウイルスにおけるJE特異的膜タンパク質の60位におけるアルギニンからシステインへの変異を含み、ラージスケール製造中のワクチンの遺伝的安定性を増加させることが見出された。本発明者らはまた、初めて、ChimeriVax(商標)-JEのM5残基におけるグルタミンからプロリンへの変化が感染のpH閾値を増加させたため、Mタンパク質の外部ドメインが重要な機能的意義をもつという証拠を提供した(出願PCT/US2005/037369参照)。

上記の膜タンパク質変異の1つまたは複数に加えて、本発明のウイルスはまた、1つまたは複数の追加の変異を含みうる。例えば、例えば、ウエストナイルウイルスの場合、そのような追加の変異は、ウエストナイルウイルスエンベロープタンパク質の107位(例えば、LからFへ)、316位(例えば、AからVへ)、または440位(例えば、KからRへ)(またはそれらの組み合わせ)の領域にありうる。変異は、従って、例えば、ウエストナイルウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸102位〜112位、138位(例えば、EからKへ)、176位(例えば、YからVへ)、177位(例えば、TからAへ)、244位(例えば、EからGへ)、264位(例えば、QからHへ)、280位(例えば、KからMへ)、311〜321位、および/もしくは435〜445位の1つまたは複数にありうる。参照としてウエストナイルウイルス株NY99-フラミンゴ(flamingo)382-99(GenBankアクセッション番号AF196835)の配列を用いる具体例として、107位におけるリジンはフェニルアラニンと置換されることができる、316位におけるアラニンはバリンと置換されることができる、および/または440位におけるリジンはアルギニンと置換されることができる。対応する変異が、同様に他のフラビウイルスにおいて行われうる。

さらに、本発明のウイルスはまた、弱毒化していてもしていなくてもよいが、他の点ではワクチンとして有益である(例えば、ワクチン製造にとって)任意の他の変異、例えば、UTRにおけるヌクレオチド変化、またはウイルス伝播中に自発的に蓄積され、かつ望ましくありうる構造もしくは非構造タンパク質におけるアミノ酸変化、を含みうる。例えば、本発明者らは、最近、無血清条件におけるラージスケール製造中にChimeriVax(商標)-JEワクチンに蓄積した残基60位におけるRからCへのアミノ酸変化を観察した。この変化は、免疫原性または弱毒化に影響を及ぼさなかったが、それは、その増殖速度を増加させ、エンベロープタンパク質(E107)における望ましくない野生型残基への復帰変異の蓄積を防ぐことにより、ウイルスを安定化した。

変異は、部位特異的変異誘発のような標準方法を用いて本発明のウイルスにおいて行われうる。上記の変異は欠失および置換であるが、挿入のような変異の他の型も同様に本発明に用いられうる。加えて、上で述べられているように、変異は、単独で、または1つもしくは複数の追加の変異との関連において、存在しうる。さらに、上記の特定のアミノ酸に加えて、置換は、結果として上記のものからの保存的変化を生じるアミノ酸のような他のアミノ酸によって行われうる。保存的置換は、典型的には、以下の群内での置換を含む：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。さらに保存的および非保存的変化の両方は、それらがEタンパク質X線構造において引き起こすコンピューター予測された(タンパク質構造モデリングソフトウェアを用いて)変化に基づいてそれらの弱毒化効果の分析について選択されうる。

本発明のウイルス(キメラを含む)は、当技術分野における標準方法を用いて作製されうる。例えば、ウイルスのゲノムに対応するRNA分子が初代細胞、ニワトリ胚、または二倍体細胞系へ導入されることができ、それら(またはそれらの上清)から子孫ウイルスがその後、精製されうる。ウイルスを作製するために用いられうるもう一つの方法は、ベロ細胞のような異数体細胞を用いる(Yasumura et al., Nihon Rinsho 21, 1201-1215, 1963)。この方法において、ウイルスのゲノムに対応する核酸分子(例えば、RNA分子)が異数体細胞へ導入され、ウイルスは、細胞が培養されている培地から収集され、収集されたウイルスはヌクレアーゼ(例えば、Benzonase(商標)のようなDNAおよびRNAの両方を分解するエンドヌクレアーゼ；米国特許第5,173,418号)で処理され、ヌクレアーゼ処理されたウイルスは濃縮され(例えば、例として500kDaの分子量カットオフを有するフィルターを用いる限外濾過の使用により)、濃縮されたウイルスはワクチン接種を目的として製剤化される。この方法の詳細は、参照により本明細書に組み入れられているWO 03/060088 A2に提供されている。

本発明のウイルスは、感染のリスクのあるものにおいて一次予防薬として投与されうる、または感染した患者を処置するために二次薬として用いられうる。ウイルスは弱毒化されるため、それらは、高齢者、子ども、またはHIV感染患者のような「リスクのある個体」への投与に特に十分に適している。ワクチンはまた、獣医学関連において、例えば、ウエストナイルウイルス感染に対するウマのワクチン接種において、またはトリ(例えば、それぞれ、フラミンゴ、ハクトウワシ、およびガチョウのような貴重なトリ、絶滅の危機に瀕したトリ、または家畜化されたトリ)のワクチン接種において用いられうる。さらに、本発明のワクチンは、そのような変異を欠くウイルスとの混合物における特定の変異を含むキメラウイルスのようなウイルスを含みうる。

本発明のウイルスの製剤化は、当技術分野において標準である方法を用いて行われうる。ワクチン調製に用いる多数の薬学的に許容される溶液は周知であり、当業者により本発明に用いるために容易に適合されうる(例えば、Remington's Pharmaceutical Science (18^th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA)。2つの具体例において、ウイルスは、7.5%乳糖および2.5%ヒト血清アルブミンを含む最小必須培地アール塩(MEME)、または10%ソルビトールを含むMEMEに製剤化される。しかしながら、ウイルスは、単純に、滅菌食塩水または滅菌緩衝食塩水のような生理学的に許容される溶液に希釈されうる。もう一つの例において、ウイルスは、例えば、黄熱病17Dワクチンと同じ様式で、例えば、感染したニワトリ胚組織の透明化懸濁液、またはキメラウイルスに感染した細胞培養物から収集された液体として、投与および製剤化されうる。

本発明のワクチンは、当技術分野において周知である方法を用いて投与されることができ、投与されるべきワクチンの適切な量は、当業者により容易に決定されうる。投与するためのウイルスの適切な量であると決定されるものは、例えば、ウイルスが投与されることになっている被験体のサイズおよび全般的な健康のような因子の考慮により決定されうる。例えば、本発明のウイルスは、例えば、筋肉内、皮下、または皮内の経路により投与されうる0.1〜1.0mlの用量において10²と10⁸の間、例えば、10³〜10⁷感染単位(プラーク形成単位または組織培養感染用量)を含む滅菌水溶液として製剤化されうる。加えて、フラビウイルスは経口経路のような粘膜経路を介してヒト宿主に感染する能力がありうるため(Gresikova et al., "Tick-borne Encephalitis," The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, Volume IV, 177-203)、ウイルスは同様に粘膜経路により投与されることができる。さらに、本発明のワクチンは、単一用量で投与されることができ、または、任意で、投与は、初回抗原刺激用量、続いて、当業者により適切であると決定されるように、例えば、2〜6ヶ月後に投与される追加抗原用量の使用を含むことができる。

任意で、当業者に公知であるアジュバントは、本発明のウイルスの投与に用いられうる。ウイルスの免疫原性を増強するために用いられうるアジュバントは、例えば、リポソーム製剤、(例えば、QS21)のような合成アジュバント、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドA、ポリホスファジン、CpGオリゴヌクレオチド、または細胞の表面上もしくは細胞内の核膜上のToll様受容体(TLR)分子を活性化することにより働くように考えられる他の分子を含む。これらのアジュバントは典型的には、不活性化されたワクチンに対する免疫応答を増強するために用いられるが、それらはまた生ワクチンと共に用いられうる。TLRのアゴニストまたはアンタゴニストの両方は、生ワクチンの場合、有用でありうる。粘膜経路を介して、例えば経口で、送達されるウイルスの場合、大腸菌(E. coli)の易熱性毒素(LT)またはLTの変異誘導体のような粘膜アジュバントがアジュバントとして用いられうる。加えて、アジュバント活性を有するサイトカインをコードする遺伝子は、ウイルスへ挿入されうる。従って、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5のようなサイトカインをコードする遺伝子が、結果として免疫応答の増強を生じるワクチンを作製するために、または細胞性、体液性、もしくは粘膜性応答へより特異的に向けられる免疫を調節するために、外来抗原遺伝子と共に挿入されうる。

デング熱ウイルス、ならびに/またはデング熱ウイルスの膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルスの場合、それに対する最適なワクチン接種はデング熱血清型の4つすべてに対する免疫の誘導を含みうるが、本発明のウイルスは、四価のワクチンの製剤化に用いられうる。そのような四価の製剤化に用いられるウイルスのいずれかまたは全部は、本明細書に記載されているように、内臓向性を減少させる1つまたは複数の変異を含むことができる。ウイルスは、製剤化中の任意の時点で四価の調製物を形成するように混合されうる、または順番に投与されうる。四価ワクチンの場合、各ウイルスの等価量が用いられうる。または、投与されるワクチンに存在する異なるウイルスのそれぞれの量は異なりうる(WO 03/101397 A2)。

本発明のフラビウイルスはまた、ワクチン抗原または他の治療剤のような異種性遺伝子産物を送達するために用いられうる(例えば、WO 02/102828；米国特許第6,589,531号；およびWO 02/072835参照)。

本発明は、以下の実験結果に一部、基づいている。

実験結果および実施例
背景および概要
本発明の一つの実施例において、上記のもののような変異は、下でさらに記載されているように、黄熱病ウイルス(YF17D)のキャプシドタンパク質および非構造タンパク質ならびにウエストナイルウイルス(NY99)のプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含む、本明細書でChimeriVax(商標)-WN02と呼ばれているキメラフラビウイルスワクチン候補においてなされた。このワクチン候補は、前臨床試験および第一相臨床試験において試験されている。それはマウスおよびアカゲザルにおいて高度弱毒化および免疫原性であるように考えられたが、カニクイザルにおいて、および第一相試験(N=45)における数人のヒトボランティアにおいて、接種後ウイルス血症により判断されるように、対照黄熱病(YF)17Dワクチンと比較してより活性な複製を引き起こした。それは、ウイルス血症レベルに基づいて、第一相試験において耐容性がよく、かつ高度に免疫原性であったとしても、本発明者らは、ChimeriVax(商標)-WN02変種と比較して小動物(ハムスター)においてウイルス血症にわずかな減少を得ることを目的として、特異的変異誘発を用いてChimeriVax(商標)-WN02の安全性プロフィールをさらに向上させるための研究を企てた。3つの変異誘発アプローチが用いられ、下で示された実施例においてそれぞれ、考察された。第一のアプローチにおいて、小さなヌクレオチド欠失が、ウイルスの3'-非翻訳領域(3'UTR)へ導入された。第二のアプローチにおいて、アミノ酸欠失が、キャプシドタンパク質へ導入された。第三のアプローチにおいて、特定の弱毒化アミノ酸置換が、ウイルスのエンベロープタンパク質へ導入された。下および本明細書の他の所でさらに考察されているように、変異のこれらの型は、本発明のウイルスを作製するためにお互い(および他の弱毒化するまたは別なふうに有益な変異)に組み合わせられうる。

ChimeriVax(商標)-WN02
ChimeriVax(商標)-WN01と名付けられた、WNウイルスのNY99株由来の野生型prM-E遺伝子配列を含む最初のYF17D/WNキメラは、標準2プラスミド系を用いて構築された(Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004)。プラスミドpYF5'3'IV/SA14-14-2(ChimeriVax(商標)-JEワクチンウイルスについてcDNAの5'および3'部分を含む)およびpYFM5.2/SA14-14-2(ChimeriVax(商標)-JE cDNAの大きな中間体部分を含む)におけるJE特異的prM-E遺伝子配列が、NY99 WN親の対応するcDNA配列と置換された。ChimeriVax(商標)-WN01ウイルスは、完全長DNA鋳型を得るための結果として生じたpYWN5'3'N1Δ3プラスミドおよびpYWN5.2/5プラスミド由来の断片のインビトロライゲーション、続いて、インビトロ転写、および結果として生じたRNA転写産物によるベロ細胞のトランスフェクションにより得られた。新しいキメラウイルスは、WN NY99およびYF17Dと比較してマウスおよびアカゲザルについて有意に弱毒化されていることが示されたが、それは成体マウスについて軽度の神経毒性を保持した。それは、エンベロープ(E)タンパク質の残基E107、E316、およびE440における3つのSA14-14-2 JEワクチン特異的アミノ酸変化の導入によりさらに弱毒化された。これらの変異を含む2つの新しいプラスミドは、pYWN5'3'NF3Δ2およびpYWN5.2 316/440#2と名付けられた。ChimeriVax(商標)-WN02と名付けられた結果として生じた三重変異体をマウスおよびサルにおいて試験した結果に基づいて、それが第一相試験でさらに試験されるのに十分、弱毒化されたと結論づけられた。試験は、健康な成人において行われた(5 log₁₀ pfuの接種用量についてN=30、および3 log₁₀ pfu用量についてN=15)。予想外にも、両方の用量群における接種されたボランティアのうちの数人は、YF-Vax対照と比較して統計学的に有意により高い(3.5倍まで)ウイルス血症を発症した。これは、ワクチンが耐容性がよく、かつ免疫原性であったが、より弱毒化されたChimeriVax(商標)-WNワクチン変種を得るためにさらなる開発が行われうることを示した。高いウイルス血症レベルは、末梢器官における過剰なウイルス複製を示すことができ、脳炎フラビウイルスについての知識に基づいて高ウイルス血症により促進されうる、古典的な黄熱病または血液脳関門を渡ることによる脳炎と類似した、ワクチンの一部において出血症状を発生するリスクを示しうる。

従って、ChimeriVax(商標)-WN02ワクチンの唯一の次善のパラメーターは、ヒトボランティアのある割合において観察される予想の接種後ウイルス血症よりわずかに高く、末梢器官における過剰複製(内臓向性)を示している可能性がある。出発のChimeriVax(商標)-WN02ウイルスはすでに、毒性野生型単離物よりむしろ高度に弱毒化されたワクチン候補であるため、本発明者らは、ワクチンを過剰弱毒化しない新しい変異を同定しようと努力した。本発明者らは、適切な動物モデルにおいて(下記の実験において、本発明者らはハムスターを用いた)、およびその後ヒトにおいて、有意に効力を低下させることなく、高ウイルス血症の発生を防ぐ変異を探した。

新しいChimeriVax(商標)-WN04候補の作製および特徴付けに関与する実験段階は以下を含んだ：
− 所望の変異を含むプラスミドDNAの構築。具体的には、すべての変異を最初のChimeriVax(商標)-WN02プラスミドpYWN5'3'NF3Δ2およびpYWN5.2 316/440#2へ単純または重複PCR技術を用いる標準オリゴヌクレオチド定方向変異誘発により導入し、続いて結果として生じたPCR産物のこれらのプラスミドへのライゲーション、および大腸菌においてクローニングすることによる変異体プラスミドの選択、および個々のクローンのシーケンシングを行った。
− 完全長cDNA鋳型を得るためのpYWN5'3'およびpYWN5.2シリーズの適切なプラスミドの大きなEagI-BspEI断片のインビトロライゲーション、続いてXhoI線状化。
− 合成感染性RNAを産生するためのSP6 RNAポリメラーゼでの完全長DNA鋳型のインビトロ転写。
− リポフェクタミンまたはエレクトロポレーションを用いるベロ細胞のトランスフェクションおよび継代1(P1)ウイルス試料の収集、続いてP2ウイルスストックを得るための無血清培地における追加の継代による変異体ChimeriVax(商標)-WN04の作製。
− 細胞変性効果(CPE)をモニターすること、細胞上清のプラークアッセイ、および高感度RT-PCRによるウイルスRNAの検出による変異体ウイルス生存力の確認。
− P2レベルにおけるウイルスゲノムRNAのコンセンサスシーケンシングによる所望の変異の存在の確認(およびP5レベルへ継代されたウイルスをシーケンシングすることによる遺伝的安定性の予備分析)。
− ベロ細胞におけるP2ウイルスの標準的力価測定によるプラーク形態および増殖性質の分析。
− 1日〜9日目において接種後ウイルス血症を測定することによるP2ウイルス試料の5 log₁₀ pfu/用量を接種されたシリアンハムスターにおける内臓向性の分析；標準50%プラーク減少中和試験(PRNT₅₀)を用いて30日目にWNウイルス特異的中和抗体の血清力価を測定することによる免疫原性の分析。

下に記載されているように、本発明者らは、この証明済みの高度に弱毒化されたワクチン候補において非常にわずかな弱毒効果を達成することを目的として、ChimeriVax(商標)-WN02ウイルスの3'UTRまたはキャプシド(C)タンパク質へ欠失を導入した。これは、3'UTRにおける5〜16ヌクレオチド長の小さな欠失、、またはタンパク質Cにおける3アミノ酸欠失により達成された。3'UTRにおける欠失の一部は、YF17Dウイルスの3'UTRの推定二次構造に基づいて設計された短い(5〜6ヌクレオチド)欠失であった(Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999)。これらは、任意の保存配列エレメントの外側に位置する3'UTRの中央の特定のコンピューター推定ステムループ構造の一部を特異的に不安定にすることを目標とされた。第三のアプローチにおいて、本発明者らは、ChimeriVax(商標)-WN02のEタンパク質へ追加のSA14-14-2弱毒変異を導入したが、それはChimeriVax(商標)-WN01からChimeriVax(商標)-WN02を発生するために本発明者らが用いた同じ方法であった。これらの改変の効果は、ハムスターモデルにおいてモニターされた。ハムスターにおいて結果として内臓向性の所望の少しの低下を生じるChimeriVax(商標)-WN04変種が同定された。

3'UTRに特定の欠失を導入することによるChimeriVax(商標)-WN04-3'UTR候補の構築
上で考察されているように、すべてのChimeriVax(商標)ウイルスにより共有されるYF17D-特異的3'UTRの構成は図1Aに示されている。それは、3'末端から順番に、(i)すべてのフラビウイルスについて保存された3'極端のステムループ構造、(ii)2つの保存配列エレメント、CS1およびCS2、ならびに(iii)3'UTRの上流部分に位置した反復配列エレメント(RS)の3つのコピーを含む(Chambers et al., Annu. Rev. Microbiol. 44:649-688, 1990)。ウイルス複製中の自発的復帰変異は事実上不可能であるため、この領域における欠失の一つの価値のある特徴はそれらの安定性である。新しいChimeriVax(商標)-WN04-3'UTR候補を作製するために本発明者らがChimeriVax(商標)-WN02ウイルスへ(プラスミドpYWN5'3'NF3Δ2を用いて)導入した11個の欠失は図1Aに示されており、以下を含む：
− 3つのRSエレメントを除去するdRS欠失(YF17D3'UTRのヌクレオチド18位〜164位、ATAACCGGG...-...TCCACAC；番号付けはウイルスORFのTGA終結コドン後の最初の3'UTRヌクレオチドからである)；
− 図2Bに示された個々のコンピューター推定のステムループ/シュードノット(pseudoknot)構造(Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999)を不安定にするように設計されたRSとCS2の間に存在する4つの小さな5〜6ヌクレオチド欠失：dA(ヌクレオチド229位〜234位、GCAGTG)、dB(ヌクレオチド256位〜260位、CAGGT)、dC(ヌクレオチド293位〜297位、CCAGA)、およびdD(ヌクレオチド308位〜312位、CGGAG)；
− RSとCS2の間のヌクレオチドの大部分を除去する大きな105ヌクレオチド欠失、d105(ヌクレオチド218位〜321位、TAAGCT...-...CCGCTA)(類似した欠失は野生型DEN4により許容されたが、インビトロおよびインビボで複製を有意に低下させ(Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996)、それゆえに、本発明者らは、それはChimeriVax(商標)-WN02について過剰弱毒化していると予想した);
− 野生型DEN4ウイルスを弱毒化すると最初に記載されたΔ30変異(Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996;米国特許第6,184,024 B1号)を模倣する、CS2から上流での30ヌクレオチド欠失、d30(ヌクレオチド322位〜351位、CCACCC...-...GACGG)；
− 本発明者らは上記のd30変異がインビトロおよび/またはインビボでChimeriVax(商標)-WN02を過剰弱毒化しうると予想したために試験された、Δ30領域における2つのより小さな欠失、d7(ヌクレオチド345位〜351位、AAGACGG)およびd14(ヌクレオチド338位〜351位、TGGTAGAAAGACGG)；
− CS2d5(ヌクレオチド360位〜364位、GGTTA)およびCS2d16(ヌクレオチド360位〜375位、GGTTAGAGGAGACCCT)と名付けられたCS2領域における2つの小さな5ヌクレオチドおよび16ヌクレオチド欠失。

変異体の生存力は、P1およびP2継代、加えて生存可能な変異体の遺伝的安定性を評価するために、および任意の第二の部位変異が見かけ上生存不可能な変異体の生存力を回復させるかどうかを決定するために行われるP5までのその後の継代中において、CPEの注意深い顕微鏡観察によりモニターされた。これらの観察は、RT-PCRおよびベロ細胞におけるプラークアッセイにより確認された。プラークアッセイはまた、ベロ細胞における増殖性質を示す変異体ウイルス力価に関する、および導入された欠失により与えられたプラーク形態における変化に関する重要な情報をもたらした。生存可能なウイルスのゲノムの関連性のある部分は、P2およびP5レベルにおいてシーケンシングされた。これらの実験の結果は表1に要約されている。

表1におけるデータに基づいて、本発明者らは以下と結論づけた：
1)dRS欠失の大きなサイズにも関わらず、それは、変異体ウイルスがChimeriVax(商標)-WN02 LP対照(大きなプラーク対照；表1の脚注1を参照)のと類似した大きくかつ透明なプラークを生じたため、インビトロで著しい弱毒化を与えず、6x10⁶ PFU/mlの比較的高い力価まで増殖させた。類似した欠失がインビトロでYF17Dウイルス複製にほとんど効果を生じず(Bredenbeek et al., J. Gen. Virol. 84:1261-1268, 2003)、類似した大きな欠失が乳のみマウスにおいてChimeriVax(商標)-JEウイルスの神経毒性を低下させなかったため、この結果は予想された。
2)小さな欠失、dA、dB、dC、およびdDは、プラーク形態により判断されたインビトロでの著しい弱毒化を引き起こした。すべての4つの変異体ウイルスのプラークサイズは減少した；dDウイルスのプラークは不透明であった(LPおよびSP WN02対照の両方のプラークは透明である)。ウイルスは、6 log₁₀ PFU/mlの過剰においてP2継代中に比較的高い力価まで増殖したが、それは、製造にとって望ましい特徴である(表1；dA変異体力価を除いて、それがこの実験においてカウントするにはあまりにも小さすぎるプラークを形成したため、測定されることができなかった)。これらの結果は、推定のステムループ/シュードノット構造(図1B)が存在し、フラビウイルス複製にとって重要であることを示した。CS2から上流のこの領域における大きな欠失を許容した野生型DEN4ウイルスと対照的に(Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996)、小さな欠失により標的とされたすべての構造要素を含む大きなd105欠失は、ChimeriVax(商標)-WN02ウイルスについて過剰弱毒化(致死性)していた。
3)CS2直前の領域における、Δ30変異(Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996;米国特許第6,184,024 B1号)に類似しているd30欠失、およびより短い欠失d14は致死性であった。ChimeriVax(商標)-WN02により許容されたこの領域における唯一の変異は、小さなd7欠失であった。それがプラーク形態を減少させたため、それは弱毒化していた。
4)小さなCS2d5およびCS2d16欠失は、その欠失を含む変異体が中間サイズの不透明なプラークを形成したため、インビトロで中程度の弱毒化効果を生じた。これらの変異は、図1Bに示されているように、ヌクレオチド10位、708位にXbaI制限部位の配列を含む推定のステムループ構造に影響を及ぼすことが予想された。

これらの実験において、本発明者らは、3'UTRの保存エレメントの外側の小さな欠失がある程度の弱毒化を与えうることを初めて実証した。加えて、本発明者らは、個々の推定のステムループ/シュードノット構造の特異的な不安定化が結果として弱毒化を生じることを初めて実証した。加えて、YF17Dを含むフラビウイルスの3'UTRにおいて多数の推定ステムループ/シュードノット構造があり、一連の弱毒化効果を達成しうる様々な種類の機会を提供する。これらの構造または構造間の領域は、今、当業者により導入されうる小さな欠失によって標的とされうる。これらの構造のいずれかの変異誘発は、今、本発明者らの発見に基づいて、ある程度の弱毒化をもたらすことが予想されうる。効果の範囲からの選択が、弱毒化の所望の程度をもつ変異体の選択を可能にする。

(表1)：ChimeriVax(商標)-WN04-3'UTR欠失変異体のインビトロ特徴

¹LPおよびSP対照ウイルス(プラークアッセイにおいてのみプラーク形態の比較のために用いられる)は、大きなプラーク(LP)および小さなプラーク(SP)の集団であった製造したChimeriVax(商標)-WN02 P5ウイルス試料からのプラーク精製により以前に単離された；SP変種はM66 LeuからProへのアミノ酸変化の蓄積のせいで現れた。
²N/D−感染から5日後にニュートラルレッドで染色された時、プラークが正確にカウントするには小さすぎたため、測定されなかった。

YF17Dウイルスを含むフラビウイルスの3'UTRの真の二次構造は、ウイルス全体との関連においてそれらの存在を実験的に証明する有効な方法がないため、知られておらず、それゆえに、発表された予測、例えば、Proutskiおよび共同研究者によりYF17Dについて予測されたもの(図1B)は正しくない可能性があることは留意されるべきである。多くの代替的構造は、比較的長いRNA分子において形成すると予測されることができ(Zuker et al., N.A.R. 19:2707-2714, 2001)、異なる構造(プラス鎖またはマイナス鎖における)がウイルスの生活環の異なる段階において形成かつ機能することは可能である。真の構造は、様々なシュードノットの形成(Olsthoorn et al., RNA 7:1370-1377, 2001)および長距離RNA相互作用(例えば、RNA環化および他の相互作用(Alvarez et al., J. Virol. 79:6631-6643, 2005))、加えて宿主タンパク質およびウイルスタンパク質との可能なRNA相互作用により影響を及ぼされうる。理論的コンピューター予測の発表された結果の解釈をさらに複雑にするために、最初に予測された構造のより長いRNA配列の構造への引き続きの強制を含む部分的配列の最初の折り畳み、最初の折り畳み段階中のNの人工的使用、および好ましい構造要素の主観的選択のような手作業操作がしばしば、用いられる(例えば、Mutebi et al., J. Virol. 78:9652-9665, 2004)。この目的を達成するために、本発明者らは、一般的に用いられるZukerの予測アルゴリズムを用いてYF17Dの3'UTR RNA配列を折り畳んだ。予測された最適な構造は図1Cに示されているが、図1Bに示されたProutsky予測と異なる。図1Aおよび1Bにおける小さな欠失dA、dB、dC、dD、d7、およびd14は一般的に、推定の天然YF17Dの最適な構造(図1C)および次善最適な構造を不安定にしたことは重要である。一つのそのような変化した最適構造の例(dC変異体について)は、図1Dに示されている。対照的に、CS2d5およびCS2d16欠失(図1Aおよび1B)は最適な天然の構造を顕著には変化させず、これらの欠失は、3'UTR構造よりむしろCS2自体の配列を変化させるおかげで、または代替として、いくつかの次善最適な構造を変化させることにより、ウイルスを弱毒化しうること(弱毒化はChimeriVax(商標)-WNについてハムスターモデルにおいて実証された)を示した。従って、欠失の一部がProutski構造予測(図1B)に基づいて設計されたとしても、それらの真の効果は、図1Bにおける予測されたステムループより異なる構造要素を不安定にしたせいである可能性がある。

dC変異体は、遺伝的安定性を分析するために無血清ベロ細胞においてP2からP5継代レベルへ継代され、P5ウイルスがシーケンシングされた後、5ヌクレオチド欠失が、自発的に長さが24ヌクレオチド(ヌクレオチド277位〜300位、TCTGGGACCTCCCACCCCAが欠失した)まで増加したことが見出された。(他の欠失(dRS、d7、CS2d5、CS2d16、dA、dB、およびdD)は同じ遺伝的安定性継代中、安定していた。)増加した欠失サイズの効果は、推定二次構造が最初の最適なYF17D構造に類似するようになったことであった(図1E；図1Cと比較)。この自発的変化は、細胞培養順応であると考えられた。P2およびP5変種の両方は、ハムスターにおいて、高度に弱毒化され、かつ免疫原性であった(表5の脚注4参照)。従って、dC変異体のP5変種は所望のワクチン表現型を有する可能性がある。

YF17D特異的キャプシドタンパク質Cに特定の欠失を導入することによるChimeriVax(商標)-WN04-C候補の構築
ProteinPredictおよびProtean方法を用いるYF17D Cタンパク質の本発明者らのコンピューター分析は、その全般的構成がTBEのそれと実質的には異ならないことを予測した(図2B)。本発明者らは、ChimeriVax(商標)-WN02のタンパク質における大きな欠失は過剰弱毒化している可能性が最も高いと推論した。それゆえに、本発明者らは、図2Bに示されているように(欠失した残基は囲まれている)、3〜4アミノ酸の5つの小さな欠失を導入した。欠失は、Cタンパク質遺伝子全体を含むChimeriVax(商標)-WN02プラスミドpYWN5'3'NF3Δ2へ操作された。最初の3つの欠失(C1〜C3；それぞれ3アミノ酸長)は、Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002によりTBEについて記載された同じ通常領域にある。しかしながら、本発明者らは、特異的な構造特徴の重要性の試験を可能にするように変異を位置づけた：C1欠失は中央の疎水性のひと続きおよび推定のヘリックスIの両方から上流に位置している、C2はヘリックスIのみに影響を及ぼす、ならびにC3はヘリックスIおよび中央の疎水性のひと続きの両方に干渉することが予想された。追加として、C4欠失(4アミノ酸長)は、タンパク質のカルボキシ末端の正荷電部分における推定ヘリックスIIIを標的とするように設計され、C5欠失(3アミノ酸)は、ヘリックスIIIとヘリックスIVの間にある(それはまた、タンパク質の細胞内型のC末端におけるNS2b/NS3-ウイルスプロテアーゼ切断部位を除去する；それは、任意の第二の部位変異がポリタンパク質のプロセシングにおいて予想される欠損を代償することができるかどうかを決定するために導入された)。

WN04-C変異体のインビトロ特徴付けの結果は表2に要約されている。C1変異体およびC2変異体のみが生存可能であり、一方、C3〜C5欠失は致死性であった。C5変異の強い有害な効果は驚くべきことではなかったが、タンパク質のカルボキシ末端の正荷電部分における小さな欠失(C4)が致死性であったことは興味深く、この領域における配列/構造変化がウイルスにより許容されることができないことを示唆した。最も驚くべき観察は、C3欠失もまた致死性であったことであり、それがTBEウイルスとの関連において大きな欠失を許容した同じ通常領域にあるからである。C1変種およびC2変種における欠失の存在は、シーケンシングにより確認された。P2およびP5レベルでのウイルスにおける構造タンパク質領域全体をシーケンシングした結果は、表2に示されている。C1変種は、P2では現れなかったが(E313における変化は、ChimeriVax(商標)-WN02に以前に蓄積することが見られた無血清ウイルス増殖条件に対する順応であると考えられる)、P5継代において不均一性として現れた残基M14およびE313における変化を蓄積したが、C2変種は遺伝学的に安定であるように考えられた。後者のウイルスはP2およびP5の両方で残基M71において不均一性を含んだが、非変異体に対する変異体の比率(〜80%)は、継代中変化しなかった。プラーク形態により判断すると、C1変種はChimeriVax(商標)-WN02と比較して弱毒化されなかったが、C2変種は、それが小さなプラークを形成したことから、弱毒化されているように考えられ、ヘリックスIの重要性を示唆した。両方の変異体は、ベロ細胞において高力価まで増殖した(〜7 log₁₀ PFU/ml)。そのような小さな欠失がフラビウイルスを弱毒化することができる、または実践的価値を有することができることを示す、前の発表されたデータはない。本発明者らの研究における生存可能なC1およびC2変異体の作製の成功は、YF17DウイルスまたはChimeriVax(商標)ワクチンウイルスが、中央の疎水性領域から上流における、およびα-ヘリックスIの始めにおける小さな欠失を許容できるという証拠を提供した。

(表2)：ChimeriVax(商標)-WN04-C変異体のインビトロ特徴付け

¹WN02対照ウイルス(プラークアッセイにおいてのみプラーク形態の比較のために用いられる)は、ChimeriVax(商標)-WN02インビトロRNA転写産物での細胞のトランスフェクションにより得られたP1試料であった。
²構造タンパク質領域全体(C-prM-E遺伝子)は、意図された欠失を確認するために、および任意の他のアミノ酸変化/不均一性の存在についてチェックするためにコンセンサス方法によりシーケンシングされた。

エンベロープ(E)タンパク質に追加のSA14-14-2特異的変化を導入することによるChimeriVax(商標)-WN04-E候補の構築
野生型JEウイルス(Nakayama)およびSA14-14-2ワクチン株において異なるEタンパク質残基、加えてWN NY99における対応する位置での残基は表3に示されている。上で考察されているように、ChimeriVax(商標)-WN02ワクチン変種の弱毒化の所望の程度は、最初、野生型NY99株特異的prM-E遺伝子を含む最初に構築されたYF17D/WNキメラ(WN01ウイルス)への3つのSA14-14-2特異的残基、E107、E316、およびE440の導入により達成された。ChimeriVax(商標)-WN02(およびWN01)はまた、SA14-14-2ウイルスおよびNY99ウイルスの両方において一致するE227 Ser残基を含む。

(表3)：ChimeriVax(商標)-WN02¹の内臓向性を低下させるためにChimeriVax(商標)-WN04において組み合わせられうるエンベロープタンパク質EにおけるSA14-14-2 JEワクチン特異的残基

¹ChimeriVax(商標)-WN02にすでに存在するSA-14-14-2特異的残基は太字である；残基E227はSA14-14-2およびWN NY99において同じ(Ser)であり、それゆえに、特異的変異誘発により変化させる必要がなかった。
²アミノ酸番号はWNウイルスEタンパク質における番号付けによる。

WN02ワクチン候補の選択の過程において以前に構築されたすべてのプラスミド(Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004)および最近になって本発明者らが構築したもの（2つの底部のpYWN5'3'およびpYWN5.2構築物）は、図4に描かれている。キメラウイルスのEタンパク質におけるSA14-14-2変異の所望のセットは、E遺伝子においてEagI制限部位を介しての適切なpYWN5'3'およびpYWN5.2プラスミド由来のDNA断片の特定のペアのインビトロライゲーションにより得られた、例えば、ChimeriVax(商標)-WN02は、pYWN5'3'NF3Δ2およびpYWN5.2 316/440#2のライゲーションにより作製された。組み合わせの一部は、以前にマウスおよびサルにおいて試験されており、ヒトにおけるさらなる試験のためのWN02候補の選択へ導いた(Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004)。本発明者らが2つの新しいpYWN5'3'プラスミドへ組み込んだM66変異(Mタンパク質の残基66位におけるLeuからProへの変化)は、ラージスケール製造中にChimeriVax(商標)-WN02ワクチンに蓄積した細胞培養順応であった。それはウイルスのプラークサイズを減少させたが、マウス神経毒性へ効果を生じなかった(Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004)。第一相ヒト試験および追加のサル実験からの本発明者らの最近の結果により、それは、霊長類についてウイルスの内臓向性を減少させ、従って、安全性を増加させ、ワクチン性能にとって有益な変異であるように考えられる。現行のChimeriVax(商標)-WN02ワクチンは大きなプラークおよび小さなプラークの混合物であり、いくらかのヒトにおいて予想されたウイルス血症よりわずかに高く引き起こすため、内臓向性を減少させるためにさらなる研究がなされた。例えば、小さなプラーク変種が、最近、プラーク精製され、現在、サルにおいて試験中である。変異の以前に試験されていない組み合わせを有する新しく構築された変種は下に記載されている。

(表4)：新しいChimeriVax(商標)-WN04-E変種：導入された変異およびウイルスのインビトロ特徴付け

¹すべてのウイルスはベロ細胞のトランスフェクションによって得られた；ウイルス命名において、「A」は完全長DNA鋳型の調製(3-断片ライゲーション)におけるバリエーションを意味し、「R」は繰り返されたトランスフェクションから得られたウイルスを意味する；網掛けされているウイルスはハムスターにおけるさらなる試験のために選択された。
²WN02 SA14-14-2特異的残基：E107、227、316、および440；M66変化はWN02ウイルスのプラークサイズを減少させることが知られた細胞培養順応である。
³L＋S、大きなプラークおよび小さなプラークの見かけ上の混合物(1Rウイルスにおいて)；S、小さなプラーク；<L＋S、プラークは大きなプラークおよび小さなプラークの混合物であるように見えたが、全体のサイズは1Rウイルス(L＋S)についてよりいくらか小さかった。
⁴構造タンパク質領域全体(C-prM-E遺伝子)は、意図された変異を確認するためにコンセンサス方法によりシーケンシングされた(他に指示がない限り、それぞれが確認された)；他の検出されたアミノ酸変化/不均一性が列挙されている。

新しいChimeriVax(商標)-WN04-E構築物の生存力およびインビトロ特徴付けについてのデータは表4に要約されている。本発明者らがすべての10個のSA14-14-2特異的残基を組み合わせようと試みたウイルス11は、それがトランスフェクション後CPEを誘導しなかった、引き続く継代中にプラークアッセイにおいてプラークを形成しなかった、およびそのゲノムRNAは高感度のRT-PCR反応により細胞上清において検出されることができなかったことから、生存不可能であると考えられた。表4に列挙された5〜9個のSA14-14-2変化を含む他の新しいウイルスは生存可能であった(すべての3、4、5、6、および7試料)。これらの大部分は、それらのプラークがWN02対照(ウイルス1R)のプラークよりいくらか小さかったため、わずかに弱毒化されているように考えられたが、6〜7 log₁₀ pfu/mlの過剰において比較的高い力価まで増殖した；唯一の例外はウイルス4であり、E138およびM66変異の同時的追加のせいで過剰弱毒化されている(とても小さいプラークおよびとても低い力価)ように考えられた。

意図されたSA-14-14-2変化は、ウイルス3、5、および7においてコンセンサスシーケンシングにより確認された。ウイルス6は、その6R試料がP2においてシーケンシングされた時、意図された変異の1つを欠いたため、好奇心をそそった；それは、残基E244においてGlyの代わりに野生型Gluを有した(それはまた、SphI制限部位を生じるためにE244トリプレットから下流に意図的に導入された2つのサイレントヌクレオチド変化を欠いた)。もう一つの試料、6Aは、野生型WNおよびSA14-14-2配列の両方と異なる、残基E244においてValを有した(それは意図されたSphI部位を有した)。ウイルス配列におけるこれらの変化は予想外であり、なぜなら、6R、6A、および11のインビトロRNA転写産物を作製するために用いられるpYW5.2/8mutプラスミド調製におけるウイルス特異的領域は、シーケンシングにより確認されているからである。E244 SA14-14-2特異的変化は、単独で、またはE264のようないくつかの他の変化と組み合わせて、ChimeriVax(商標)-WNに対して致死的であり、それは、なぜウイルス11が回復できなかったかを説明するものと考えられる。生存力を回復させた6Rおよび6A試料におけるこの残基の検出された改変は、ウイルス複製中のウイルスポリメラーゼによる誤り(ウイルス6Aについての場合、最も可能性が高い)、細菌におけるpYWN5.2/8mutプラスミド不安定性、またはプラスミドシーケンシングにより明らかにされなかった別の細菌クローンによる微量混入のせいでありうる。シーケンシングされたP2ウイルスは、一部は予想されることができたことだが(例えば、生物学的表現型に影響を及ぼさないChimeriVax(商標)-WNの公知の無血清細胞培養順応である、E313 GからRへの変化)、いくらかのウイルスが少しの追加の変異の蓄積を示し始めたことを除いて、比較的均一であった。より多様な変異が、P5レベルまでの増殖中に蓄積された。これらの観察に基づいて、P2レベルにおけるウイルス3、5、6A、および7(表4における網掛け)は、ハムスターにおける内臓向性/免疫原性についてのさらなる試験のために選択された。

ハムスターにおけるChimeriVax(商標)-WN04変種の内臓向性および免疫原性の分析
マウスは、ChimeriVax(商標)-WNワクチン候補の、弱毒化の重要な指標である神経毒性の低下、および高免疫原性を実証するための感受性の高い小動物モデルとして用いられる(Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004)。しかしながら、このモデルは、キメラがマウスにおいて検出可能なウイルス血症を引き起こさないため、弱毒化のもう一つの重要な属性であるサルおよびヒトにおける内臓向性のレベルを予測するために用いられることができない。野生型WNウイルスについて最近、示されたように、いくつかのフラビウイルスは、ハムスターにおいて高レベルのウイルス血症を引き起こす(Tesh et al., Emerg. Inf. Dis. 8:1392-1397, 2002)。ChimeriVax(商標)-WN02ワクチン(大きなプラークおよび小さなプラークのウイルスの混合物)ならびにプラーク精製されたLPおよびSP変種を用いる本発明者らの研究は、雌シリアンハムスターにおいてこれらのウイルスにより引き起こされたウイルス血症とヒトボランティアおよびカニクイザルにおいて観察されたウイルス血症の間に良い相関を実証した。具体的には、ヒトに対してあまり弱毒化されていないLP変種は、ハムスターにおいて容易に検出可能なウイルス血症を引き起こしたが、より高度に弱毒化されたSPウイルスは、非常に低い、または検出不可能なウイルス血症を引き起こした。本発明者らは、上記のWN04変異が、効率的な抗WN免疫応答の発生を妨げることなく、内臓向性を低下させるかどうかを調べるためにこの新しい小動物モデルを用いた。

すべての手順は、Acambis IACUCにより認可されたプロトコール下で、人間味のある実験動物の扱いについてのNIH要件に従って行われた。4週齢の雌シリアンハムスターに、選択されたChimeriVax(商標)-WN04候補、加えてWN02 LPおよびSP対照ウイルスの5 log₁₀ pfu、またはYF17Dの〜4 log₁₀ pfuを皮下に(SC)接種し、続いて、個々の動物において、1日目、3日目、5日目、7日目、および9日目におけるウイルス血症の測定(動物は麻酔下で採血され、収集された血清におけるウイルス力価はプラークアッセイにより測定された)および標準50%プラーク減少中和試験(PRNT₅₀)により測定される30日目における抗体応答の測定を行った。結果は表5に示されている。

(表5)：雌シリアンハムスターのSC接種後のウイルス血症およびChimeriVax(商標)-WN04変種に対する抗体応答

¹接種容量：100μl；接種用量：ChimeriVax(商標)-WN04ウイルスならびにWN02 LPおよびSP対照について5 log₁₀ pfu、YF17D(YF-VAX)について〜4 log₁₀ pfu；偽接種された動物は100μlの希釈培地(MEM、50%FBS)を受けた。
²検出のレベル：25 PFU/ml。
³以下に対して30日目にPRNT₅₀により測定された中和抗体力価：ChimeriVax(商標)-WN変種を接種されたすべての群についてのChimeriVax(商標)-WN02、またはYF-VAX群についてのYF17Dを接種された、または偽接種された群についての両方。
⁴別々のハムスター実験において、欠失が自発的に24ヌクレオチドまで増加したdC変異体の継代5(P5)試料(上の本文参照)が試験された。ウイルスは高度に弱毒化され(平均ピークウイルス血症25 pfu/ml、平均期間3.5日間)、かつ免疫原性(33日目において452のPRNT₅₀ GMT)のままであった。CS2d5およびCS2d16 P2ウイルスもまた試験され、同様に高度に弱毒化され、かつ免疫原性であることが見出された(それぞれ、137/2.75/127および343/2.25/905の33日目における平均ピークウイルス血症(pfu/ml)/平均ウイルス血症期間(日)/PRNT₅₀ GMT)。dC P5を含むこれらのWN04変種で免疫されたすべての動物は、免疫化から〜10ヶ月後に野生型WNに曝露された時、WN02小さなプラーク対照と対照的にしっかりと保護された。

ChimeriVax(商標)-WN02 LP対照(弱毒化不足のワクチン変種)は、1,650 PFU/mlから2,925 PFU/mlまでの範囲(平均2,285 PFU/ml)で5匹の接種されたハムスターにおいて高いピークのウイルス血症を引き起こした。これらの動物は、5,120〜10,240(GMT6,760)の範囲で30日目において最高のWN中和抗体力価を有した。WN02 SP対照は5匹の動物のうち4匹において検出可能なウイルス血症を引き起こさなかった；3日目に1匹のハムスターにおいて検出された低レベルのウイルス血症は、25 PFU/mlのアッセイ検出限界であった。WN特異的抗体応答はこれらの動物において非常に低かった。それは、2匹のハムスターにおいて検出不可能であった(力価<10)；残りの3匹は40〜320の低い抗体力価を有した。興味深いことに、YF-VAXの接種は、結果として、検出可能なウイルス血症を生じなかったが、高いYF特異的中和抗体応答を生じた(320〜10,240 PRNT50力価；GMT2,150)。予想どおり、偽接種された動物は、30日目においてWN特異的またはYF特異的中和抗体を有しなかった。

霊長類について内臓向性における微量の低下を達成するために、本発明者らは、LPウイルスのより低いであろうウイルス血症の範囲を引き起こすが、同時にSPウイルスより高い免疫応答を誘導するChimeriVax(商標)-WN04変種のセットをハムスターモデルにおいて同定することを理想的には望んだ。11個の試験されたChimeriVax(商標)-WN04ウイルスのうち、たいていは、接種後ウイルス血症レベルにより判断されるように(<25 pfu/mlから1,460 pfu/mlまでの範囲の平均ピークウイルス血症力価)、LPウイルスと比較してインビボで少なくともいくらかは弱毒化されているように考えられた(表5)。あまり弱毒化されていない変種の中には、Cタンパク質欠失変異体C1、3'UTR欠失変異体dRS、ならびにWN04-E変種#3および#5があった。これらのウイルスは、高い中和抗体応答を誘導した(GMT 1,110〜2,560)。一つのウイルス、WN04-E変種#6Aは、非常に低いウイルス血症および弱い抗体応答の両方により証明されているように、明らかに過剰弱毒化されていた。疑う余地なく、後者のウイルスは、サル/ヒトにおけるさらなる試験から排除されうる。特に好ましい特徴を有するChimeriVax(商標)-WN04候補は、キャプシドタンパク質欠失変異体C2、3'UTR少量欠失変異体d7、dB、dC、およびdD、ならびにE#7変種である。これらのウイルスは、ハムスターにおいて中程度から強度に低下したウイルス血症を引き起こしたが（<25〜680PFU/mlの範囲内の平均ピークウイルス血症力価）、それにもかかわらず、強い免疫応答を妨げなかった(中和抗体GMT 370〜2,940)。

予防効果を実証するために、すべての動物は、免疫化後62日目に、4x10⁵ PFUの毒性野生型WNウイルス(NY382/99株)に腹腔内で曝露された。WN中和抗体の高力価を有した(30日目において)すべての動物、具体的には群WN04-C1、C2、dRS、d7、dB、dC、dD、E#3、E#5、E#7、およびWN02 LP対照(表5参照)における動物は、曝露後ウイルス血症(1日目、3日目、5日目、7日目、および9日目に収集された血清において測定された)、体重減少、症状、または死の非存在により判断されるように、完全に保護された。高いWN中和抗体力価を有しなかった他の群、具体的にはE#6A、WN02 SP対照、YF-VAX、および偽接種群における動物の少なくとも一部は、上記のパラメーターの少なくとも1つにより判断されるように、保護されなかった。すべてのYF-VAXで免疫されたおよび偽免疫された動物において1日目〜5日目に高いウイルス血症があった(9.75x10⁵ pfu/mlのピークウイルス血症力価)。これらの動物の大多数は疾患なった、体重が減った、およびYF-VAX群における2匹の動物は死んだ。E#6における2匹の動物およびWN02 SP群における1匹の動物は1日目〜2日目において低レベルのウイルス血症を示した。

肝細胞におけるChimeriVax(商標)-WN04変種の変異のウイルス増殖への効果
WN04変異に起因する内臓向性の低下の追加の証拠を得るために、本発明者らは、ヒトヘパトーマ細胞系HepG2における最も有望なChimeriVax(商標)-WN04変種(上で示されたデータに基づいて選択された、例えば、ハムスターにおいて低ウイルス血症および高免疫原性；表5参照)の一部の増殖速度を分析した。YFウイルスは肝親和性ウイルスであるため、本発明者らは、ChimeriVax(商標)-WN02 LPウイルス(弱毒化不足ワクチン)と比較してWN04変種の複製の低下を見ることを期待した。HepG2細胞の単層を0.005 PFU/mlのMOIで感染させ、ウイルス含有上清のアリコートを毎日(10日目まで)収集し、その後、ウイルス力価をベロ細胞におけるプラークアッセイにより測定した。この実験に含まれた弱毒化WN04変種は、3'UTR欠失変異体d7、dB、dC、およびdD、キャプシドタンパク質欠失変異体C2(加えて、追加の対照として、あまり弱毒化されていない変異体C1)、ならびにエンベロープタンパク質変異体E#7であった。C1変異体を除いて、すべての他のWN04ウイルスはWN02 LPウイルスと比較してより低い効率で複製したが(図5)、それらの大部分(dDを除いて)は、ヒトに対して過剰弱毒化されたワクチン変種であると推定されるWN02 SP変種より良く増殖した。これは、いくつかのWN04変異がヒトにおいて、大いに望ましい特徴である、ワクチンの肝親和性を低下させうることを示した。この実験はさらに、WN02 LPと比較して複製において最も明らかな低下を示すE#7、d7、dC、およびdDに関する候補の利点を示し、dD変異体はおそらく肝親和性が最も低い。

ChimeriVax(商標)-WN04二重変異体；ハムスターにおける内臓向性および免疫原性の分析
弱毒変異の異なる型を組み合わせることは、結果として、追加の弱毒化およびより信頼性の高いワクチン表現型、病原性へ復帰することの可能性がより低いことを生じるはずである。この目的を達成するために、C2欠失がd7、dB、もしくはdD 3'UTR欠失、またはエンベロープタンパク質における変異のE#5組み合わせ(追加のE176、177、および280 SA14-14-2特異的変化)と組み合わせられた4つの二重変異体ChimeriVax(商標)-WN04変種を作製した。インビトロ転写のためのDNA鋳型は、WN04単一変異体について以前に構築された5'3'および5.2プラスミドの適切な部分を用いる標準2断片または3断片ライゲーションにより得られた。これらはSP6 RNAポリメラーゼで転写され、ウイルスは、RNA転写産物でのベロ細胞のエレクトロポレーション後、回収された。P2ウイルスはベロ細胞において力価測定された。すべての4つの二重変異体は、それらがWN02 LPおよびSP対照のよりも小さい、とても小さなプラークを生じたため、細胞培養において強く弱毒化されているように考えられた。C2＋E5変異体は、1.3x10⁷ pfu/mlの高力価を有したが、他の3つのウイルス(C2＋d7、C2＋dB、およびC2＋dD)は、4.2x10⁵〜6.1x10⁵ pfu/mlの中間の力価を有した(表6)。

(表6)：ChimeriVax(商標)-WN04二重変異体のインビトロ特徴付け

弱毒化および免疫原性を評価するために、4週齢の雌シリアンハムスターに、5 log₁₀ pfuの二重変異体、加えてWN02 LPおよびSP対照ウイルス、または希釈液(偽)を皮下に(SC)接種した。ウイルス血症は1日目〜10日目に測定され、抗体応答はPRNT₅₀により35日目に測定された。結果は表7に示されている。4つの二重変異体は、複製可能であり、ウイルス血症が1匹の動物においてのみ検出されたC2＋d7を除いて、ほとんどの動物において検出可能な低レベルのウイルス血症を引き起こした。これらのウイルスはWN02 LPウイルスと比較して有意により弱毒化されており(平均ピークウイルス血症〜7,000 pfu/ml)、対応する単一変異体と比較して(例えば、表5におけるものと平均ピークウイルス血症力価を比較する)より弱毒化されたように考えられた。ウイルス血症はあらゆる動物において検出されたというわけではなかったが、すべてのハムスターは、高レベルの中和抗体応答を発生した。C2＋E5、C2＋d7、C2＋dB、およびC2＋dDについてのPRNT₅₀ GMT値は、それぞれ、1:640、1:840、1:1,280、および1:640であった。

(表7)：雌シリアンハムスターのSC接種後のウイルス血症およびChimeriVax(商標)-WN04二重変異体変種に対する抗体応答

¹ウイルス血症検出限界50 pfu/ml；8日目〜10日目もまた試験され、ウイルス血症は検出されなかった。
²50%中和を生じる血清希釈がすべての動物について達成されなかったため、この値は示されたものより有意に高い可能性がある。

保護を実証するために、動物に、上の実験で用いられたNY382/99より病原性が高い高致死性野生型WNウイルス、NY385/99株を2x10⁵ pfu/用量で36日目に腹腔内へ曝露した。WN04二重変異体およびWN02 LP対照で免疫された動物は、曝露後ウイルス血症(2日目、4日目、および6日目に測定された)がなく、かつ疾患を示すと考えられる体重減少がなかったため、完全に保護された。対照的に、WN02 SPで免疫されたおよび偽免疫された対照動物は保護されなかった。それらはウイルス血症を発生し(WN02 SPおよび偽動物について、それぞれ、250〜3,000 pfu/mlおよび>2,000 pfu/mlのピーク力価)、疾患の症状を示し、体重が減少した。WN02 SP群および偽群、それぞれにおいて5匹のうちの1匹、および5匹のうちの4匹の動物が死んだ。WN02 SP群における2匹の生き残った動物および偽群における1匹の生き残った動物は麻痺した。

本発明者らは、このように、フラビウイルス弱毒化のための3つの異なる方法の独特な改変、および弱毒変異の異なる型の単独でまたは組み合わせての導入を用いることにより、前のChimeriVax(商標)-WN02ワクチンと比較してより弱毒化されているが、過剰弱毒化されていない複数のChimeriVax(商標)-WN04候補を作製するのに成功した。

図1Aは、黄熱病ウイルスの3'非翻訳領域の概略図であり、この領域内のドメイン(反復配列(RS)、CS2、CS1、および3'極端ステムループ構造)、加えて本発明の変異の例(例えば、dA、dB、dC、dD、d7、d14、CS2 d5、およびCS2 d16)を示す。図1Bは、黄熱病ウイルスの3'非翻訳領域の第三のRSエレメントの中央からUTRの末端までの配列および二次構造の概略図である(Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999)。図1Cは、Zuker RNA折り畳みアルゴリズムを用いて作成された最適なYF17D 3'UTR二次構造予測の概略図である。図1Dは、最適なYF17D構造への3'UTR欠失の効果の概略図(dC欠失について示された；Zuker方法)である(図1Cと比較する)。図1Eは、dCウイルスにおける欠失サイズの5ヌクレオチド(P2レベルにおける)から24ヌクレオチド(P5レベルにおける)までの自発的増加の推定二次構造への効果の概略図である(図1Dおよび図1Cと比較する)。欠失サイズの増加は、結果として、最初の最適なYF17D構造と似ている構造を生じた。図2Aは、ダニ媒介性脳炎ウイルスのキャプシドタンパク質の配列、およびKofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002により報告されたこのタンパク質における欠失の概略図である。図2Bは、YF17Dのキャプシドタンパク質の配列の概略図である。コンピューター分析によりα-ヘリックス状二次構造(α-ヘリックスI〜IV)および疎水性領域を有すると予測された領域が示されている。野生型YF(Asibi)とワクチンYF17D株の間で異なる残基の位置を示す、YF Eタンパク質ホモ二量体の相同性モデルの概略図である。ウエストナイルウイルスの膜(M)タンパク質およびエンベロープ(E)タンパク質の概略図であり、2プラスミドアプローチを用いてこれらの領域へ導入された変異の異なる組み合わせを示している。選択されたChimeriVax(商標)-WN04変種ならびにWN02大きなプラーク(弱毒化不足ワクチン)および小さなプラークの対照の増殖速度を示すグラフである。

Claims

すでに弱毒化されたフラビウイルスの内臓向性を僅かに減少させる変異を含む、組換えフラビウイルス。
黄熱病ウイルスである、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
キメラフラビウイルスである、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
キメラフラビウイルスが、第一のフラビウイルスのキャプシドタンパク質および非構造タンパク質ならびに第二のフラビウイルスの膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含む、請求項3記載の組換えフラビウイルス。
第一のフラビウイルスが黄熱病ウイルスである、請求項4記載の組換えフラビウイルス。
黄熱病ウイルスがYF17Dである、請求項5記載の組換えフラビウイルス。
第二のフラビウイルスが、日本脳炎ウイルス、1型デング熱ウイルス、2型デング熱ウイルス、3型デング熱ウイルス、4型デング熱ウイルス、マーレーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、クンジンウイルス、ロシオ脳炎ウイルス、イレウスウイルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、シベリア脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、アルフルマ(Alkhurma)ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、ネギシウイルス、アブセッタロブ(Absettarov)ウイルス、ハンサロバ(Hansalova)ウイルス、アポイウイルス、およびHyprウイルスからなる群より選択される、請求項4記載の組換えフラビウイルス。
第二のフラビウイルスがウエストナイルウイルスである、請求項7記載の組換えフラビウイルス。
ウエストナイルウイルスがエンベロープアミノ酸107位、316位、および440位における置換を含む、請求項8記載の組換えフラビウイルス。
変異が欠失を含む、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
変異が置換を含む、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
変異が、組換えフラビウイルスの3'非翻訳領域にあり、かつ30ヌクレオチド未満を含む、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
変異が、ウイルスの3'非翻訳領域におけるステム構造または、推定二次構造もしくは全体構造の可能な代替的要素を不安定にする、請求項12記載の組換えフラビウイルス。
ステム構造がウイルスの3'非翻訳領域の非保存領域にある、請求項13記載の組換えフラビウイルス。
変異が、d7、dA、dB、dC、およびdDからなる群より選択される、請求項14記載の組換えフラビウイルス。
変異が保存配列2(CS2)の1つまたは複数のヌクレオチドを含む、請求項12記載の組換えフラビウイルス。
変異がCS2 d5またはCS2 d16である、請求項16記載の組換えフラビウイルス。
変異が組換えフラビウイルスのキャプシド配列にある、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
変異がキャプシドタンパク質の1〜3アミノ酸の欠失を含む、請求項18記載の組換えフラビウイルス。
変異がキャプシドタンパク質のヘリックス(Helix)Iにおけるアミノ酸の欠失を含む、請求項19記載の組換えフラビウイルス。
変異がC2である、請求項20記載の組換えフラビウイルス。
変異がエンベロープアミノ酸の置換を含む、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
変異が、エンベロープアミノ酸138位、176位、177位、244位、264位、および280位からなる群より選択されるアミノ酸またはそれらの組み合わせにおける置換を含む、請求項22記載の組換えフラビウイルス。
変異が、176位、177位、および280位；176位、177位、244位、264位、および280位；ならびに138位、176位、177位、および280位からなる群より選択されるエンベロープアミノ酸の組み合わせにおける置換を含む、請求項23記載の組換えフラビウイルス。
変異が、エンベロープアミノ酸138位、176位、177位、244位、264位、および280位からなる群より選択されるアミノ酸またはそれらの組み合わせにおける置換を含む、請求項9記載の組換えフラビウイルス。
ウイルスの3'非翻訳領域、キャプシドタンパク質、およびエンベロープタンパク質のうちの2つまたはそれ以上における変異を含む、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
異なるタイプの変異の組み合わせが、C2＋d7、C2＋dB、C2＋dD、またはC2＋E#5である、請求項26記載の組換えフラビウイルス。
フラビウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域における変異をさらに含む、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
フラビウイルスの膜タンパク質における変異をさらに含む、請求項1記載の組換えフラビウイルス。
変異体フラビウイルスが、インビボで弱毒化に影響を及ぼさない、変異(例えば、欠失)の自然改変または第二の部位変異をもたらす細胞培養基質に適合化されている、請求項13記載の組換えフラビウイルス。
自然改変によってdC変異体における最初の5ヌクレオチドの欠失が24ヌクレオチドまで増大する、請求項30記載の組換えフラビウイルス。
請求項1記載の組換えフラビウイルスを含むワクチンを被験体に投与する段階を含む、被験体においてフラビウイルス感染を予防または処置する方法。
請求項1記載の組換えフラビウイルスを含む、薬学的組成物。
請求項1記載の組換えフラビウイルスのゲノムを含む核酸分子。
フラビウイルスワクチン候補へ該フラビウイルス候補の内臓向性を低下させる変異を導入する段階を含む、フラビウイルスワクチン候補を弱毒化する方法。