ES2345614T3 - Vacunas quimericas de flavivirus. - Google Patents
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Abstract
Composición de vacuna que comprende un virus quimérico vivo, infeccioso, atenuado, que comprende: un virus de la fiebre amarilla en el que la secuencia nucleótida que codifica una proteína prM-E es suprimida, truncada, o mutada de forma que la proteína prM-E funcional del virus de la fiebre amarilla no se expresa, y es integrada en el genoma de dicho virus de la fiebre amarilla, una secuencia nucleótida que codifica una proteína prM-E de un segundo flavivirus distinto, de forma que dicha proteína prM-E de dicho segundo flavivirus se expresa, en el que la secuencia señal en la unión C/prM de dicho virus de la fiebre amarilla, se conserva.
Description
Vacunas quiméricas de flavivirus.
La presente invención se refiere a composiciones
de vacuna que comprenden virus infecciosos, atenuados, como son
reivindicadas.
Varios miembros de la familia de los flavivirus
representan amenazas habituales o potenciales para la salud pública
global. Por ejemplo, la Encefalitis japonesa constituye un problema
significativo de salud pública que afecta a millones de individuos
que corren peligro en el Lejano Oriente. El virus del dengue, con
una incidencia anual estimada de 100 millones de casos de fiebre
primaria del dengue y más de 450.000 casos de fiebre hemorrágica
del dengue en todo el mundo, ha surgido como la enfermedad humana
más importante transmitida por artrópodos. Otros flavivirus
continúan causando enfermedades endémicas de naturaleza variable y
tienen el potencial de manifestarse en áreas nuevas como resultado
de cambios en el clima, poblaciones vectoras y alteraciones del
entorno provocadas por la actividad humana. Estos flavivirus
incluyen, por ejemplo, el virus de la Encefalitis de San Luis, que
causa una enfermedad esporádica pero aguda grave en el Medio Oeste,
el Sudeste y Oeste de Estados Unidos; el virus del Oeste del Nilo,
que causa una enfermedad febril, que se complica ocasionalmente por
Encefalitis aguda, y se distribuye ampliamente a través de África,
el Oriente Medio, la antigua Unión Soviética, y partes de Europa;
el virus de la Encefalitis Murray Valley que causa una enfermedad
endémica del sistema nervioso en Australia; y el virus de la
Encefalitis transmitida por las garrapatas, que se distribuye a
través de la antigua Unión Soviética y del Este de Europa, en la que
su vector garrapata es habitual y responsable de una forma grave de
Encefalitis en estas regiones.
El virus de la hepatitis C (HCV) es otro miembro
de la familia flavivirus, con una organización genómica y
estrategia de replicación que son similares, pero no idénticos, a
las de los flavivirus mencionados anteriormente. El HCV se
transmite principalmente mediante exposición parenteral, y se asocia
con la hepatitis crónica que puede progresar a cirrosis y carcinoma
hepatocelular, y es una causa principal de enfermedad hepática que
requiere trasplante ortotópico en los Estados Unidos.
La familia Flaviviridae es diferente de los
alfavirus (por ejemplo, WEE, VEE, EEE, SFV, etc.) y habitualmente
contiene 3 géneros, los flavivirus, los pestivirus y los virus de la
hepatitis C. Los viriones maduros completamente procesados de los
flavivirus contienen tres proteínas estructurales, cubierta (E),
cápside (C) y membrana (M), y siete proteínas no estructurales
(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5). Los flaviviriones
inmaduros que se encuentran en las células infectadas contienen la
preproteína de membrana (prM), que es la precursora de la proteína
M.
Después de la unión de los virus a los
receptores de la célula huésped, la proteína E experimenta un cambio
conformacional irreversible tras exponerse al pH ácido de los
endosomas, provocando la fusión entre las bicapas de la envuelta de
los viriones y las vesículas endocíticas, liberando de este modo el
genoma vírico en el citosol del huésped. Los virus de la
Encefalitis que se transmite por las garrapatas (TBE) que contienen
prM no son competentes para la fusión, indicando que el
procesamiento proteolítico de prM es necesario para generar
viriones competentes para la fusión y enteramente infecciosos
(Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72 (Pt.2):
333-338, 1991). Utilizando cloruro amónico al final
del ciclo de replicación del virus, se produjeron virus de la
Encefalitis (MVE) de Murray Valley que contenían prM, mostrándose
ser incompetentes para la fusión. Utilizando péptidos
secuencia-específicos y anticuerpos monoclonales, se
demostró que prM interacciona con los aminoácidos
200-327 de la proteína E. Esta interacción es
necesaria para proteger la proteína E de los cambios
conformacionales irreversibles causados por la maduración en las
vesículas ácidas de la vía exocítica (Guirakhoo et al.,
Virology 191:921-931, 1992).
La división de prM a la proteína M tiene lugar
poco antes de la liberación de los viriones mediante una proteasa
celular del tipo furina (Stadler et al., J. Virol.
71:8475-8481, 1997), que es necesaria para activar
la actividad hemaglutinante, la fusogénica y la infectividad de los
viriones. La proteína M se divide a partir de su proteína
precursora (prM) después de la secuencia de consenso
R-X-R/K-R (X es
variable), y se incorpora en la envuelta lipídica del virus, junto
con la proteína E.
Las secuencias de división se han conservado no
sólo en los flavivirus, sino también en las proteínas de otros
virus no relacionados, tal como PE2 de los coronavirus murinos, PE2
de los alfavirus, HA de los virus de la influenza, y p160 de los
retrovirus. La división de la proteína precursora es esencial para
la infectividad del virus, pero no para la formación de las
partículas. Se mostró que, en el caso de una quimera del dengue
4-TBE, un cambio en el sitio de división de prM dio
lugar a una disminución en la neurovirulencia de esta quimera
(Pletnev et al., J. Virol. 67:4956-4963,
1993), que está de acuerdo con la observación previa de que el
procesamiento eficiente de prM es necesario para la infectividad
total (Guirakhoo et al., 1991, supra, 1992,
supra; Heinz et al., Virology
198:109-117, 1994). Los anticuerpos para la proteína
prM pueden mediar inmunidad protectora, debido aparentemente a la
neutralización de viriones liberados que contienen algunas prM no
divididas. El sitio de división proteolítica de la PE2 de VEE (4
aminoácidos) se suprimió mediante mutagénesis dirigida del clon
infeccioso (Smith et al., ASTMH meeting, 7 al 11 de
diciembre, 1997). Los mutantes de deleción replicaron con una gran
eficiencia y las proteínas PE2 se incorporaron a las partículas.
Este mutante se evaluó en primates no humanos y se mostró que
provocó una seroconversión del 100% y que protegió a todos los
monos inmunizados de una estimulación letal.
En el documento WO 93/06214 se han descrito los
flavivirus de crecimiento restringido y/o quiméricos para su
utilización en una preparación de vacuna.
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La invención se refiere a composiciones de
vacuna que comprenden virus quiméricos, vivos, infecciosos y
atenuados, estando compuesto cada uno de ellos por:
- (a)
- un primer virus de la fiebre amarilla (por ejemplo, la cepa 17D), que representa un virus vacunal vivo, atenuado, en el que la secuencia nucleótida para una proteína prM-E es suprimido, truncado o mutado, de forma que la proteína funcional prM-E del primer flavivirus no se expresa, y
- (b)
- una secuencia nucleótida integrada en el genoma del primer flavivirus, que codifica la envoltura vírica (proteínas prM-E) de un segundo y distinto flavivirus, de forma que la proteína prM-E del segundo flavivirus se expresa a partir del genoma alterado del primer flavivirus, en el que la secuencia señal en la unión C/prM del virus de la fiebre amarilla se mantiene.
\vskip1.000000\baselineskip
El virus quimérico está pues compuesto por los
genes y los productos génicos responsables de la replicación
intracelular que pertenecen al primer flavivirus, y los genes y
productos génicos de la envuelta del segundo flavivirus. Ya que la
envuelta vírica contiene todos los determinantes antigénicos
responsables de la inducción de anticuerpos neutralizantes, el
resultado de la infección con el virus quimérico es que dichos
anticuerpos se generan sólo contra el segundo flavivirus.
El virus para utilizar como primer flavivirus en
los virus quiméricos utilizados en la composición de vacuna de la
invención, es el virus de la fiebre amarilla. Por lo menos, una
vacuna ya ha empleado este virus vivo y atenuado; la vacuna se
conoce como YF17D y se ha utilizado para inmunización humana durante
50 años. La vacuna YF17D se describe en varias publicaciones,
incluyendo las publicaciones de Smithburn et al., (Yellow
Fever Vaccination'', World Health Org., p.238, 1956) y Freestone (en
Plotkin et al., (Eds), Vaccines, 2ª edición, W.B. Saunders,
Philadelphia, 1995). Además, el virus de la fiebre amarilla se ha
estudiado a nivel genético (Rice et al., Science
229:726-733, 1985), y se ha establecido información
que correlaciona el genotipo y el fenotipo (Marchevsky et
al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:75-80, 1995).
Los flavivirus preferidos para utilizar como
segundo flavivirus en los virus quiméricos utilizados en la
composición de vacuna de la invención, y por esto, fuente de
antígenos inmunizantes, incluyen los virus de la Encefalitis
japonesa (JE), del Dengue (DEN, por ejemplo, cualquiera de
los tipos 1 a 4 del dengue), del de la Encefalitis Murray Valley
(MVE), del de la Encefalitis de San Luis (SLE), del Oeste del Nilo
(WN), virus de la Encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), y
los virus de la hepatitis C (HCV). Otros flavivirus para utilizar
como el segundo flavivirus incluyen el virus de Kunjin, y los virus
de la Encefalitis europea central, virus de la Encefalitis rusa de
primavera-verano, virus de Powassan, virus de la
Enfermedad de Kyasanur Forest, y virus de la Fiebre hemorrágica de
Omsk. En un virus quimérico preferido utilizado en la composición de
vacuna de la invención, la secuencia del segundo flavivirus que
codifica la proteína prM-E se sustituye en la
secuencia del virus de la fiebre amarilla que codifica la proteína
prM-E. En un virus quimérico preferido, la secuencia
que codifica la proteína prM-E deriva de una cepa
vírica atenuada, tal como una cepa vacunal. Asimismo, tal como se
da a conocer además a continuación, la parte prM de la proteína
puede contener una mutación que evite la división para generar la
proteína madura de la membrana.
La invención proporciona varias ventajas. Por
ejemplo, a causa de que están vivos y llevan a cabo la replicación,
los virus quiméricos utilizados en la composición de vacuna de la
invención pueden utilizarse para producir una inmunidad protectora
a largo plazo. Debido a que los virus poseen los genes de
replicación de un virus atenuado (por ejemplo, el 17D de la fiebre
amarilla), el virus quimérico resultante está atenuado hasta un
grado que hace que su utilización sea segura en el hombre.
Otras características y ventajas se pondrán de
manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada, de los
dibujos y de las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 es una representación esquemática de
las etapas de la manipulación genética que se llevaron a cabo para
construir un virus quimérico Fiebre
amarilla-Encefalitis japonesa (YF/JE) utilizado en
la composición de vacuna de la invención.
La figura 2 es un conjunto de curvas de
crecimiento para virus quiméricos YF/JE utilizados en la composición
de vacuna de la invención, en cultivos celulares aceptables para
preparar una vacuna humana.
La figura 3 es un gráfico que muestra la
comparación del crecimiento entre RMS (Sembrado principal de
investigación, YF/JE
SA_{14}-14-2) y
YF-Vax en células MRC-5.
La figura 4 es una gráfica y tabla que muestra
los resultados de un análisis de la neurovirulencia del ratón
llevado a cabo con un virus quimérico YF/JE utilizado en la
composición de vacuna de la invención.
La figura 5 es una representación esquemática de
un sistema de dos plásmidos para generar el virus quimérico
YF/DEN-2. La estrategia es esencialmente tal como la
que se describe para el virus quimérico YF/JE.
La figura 6 es una representación esquemática de
la estructura de clones YF modificados diseñados para eliminar
partes de la proteína NS1 y/o expresar proteínas extrañas bajo el
control de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). La
figura muestra sólo la región E/NS1 del genoma vírico. Un codón de
detención traduccional se introduce en el extremo carboxilo de la
proteína de la envuelta (E). La traducción corriente abajo se inicia
en el interior de un marco de lectura abierto (ORF) intergénico
mediante IRES-1, que gobierna la expresión de
proteínas extrañas (por ejemplo, proteínas E1 y/o E2 de HCV). El
segundo IRES (IRES-2) controla el inicio de la
traducción de la región no estructural de YF, en la que se expresan
proteínas NS1 truncadas anidadas (por ejemplo,
NS1del-1, NS1del-2, o
NS1del-3). El tamaño de la deleción de NS1 es
inversamente proporcional al del ORF unido a
IRES-1.
La figura 7 es un gráfico que muestra la
respuesta neutralizante de los anticuerpos de ratones inmunizados
con una vacuna quimérica YF/JE
SA_{14}-14-2.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona una composición de
vacuna que comprende un flavivirus quimérico que puede utilizarse
en procedimientos de vacunación contra las infecciones por
flavivirus. La construcción y análisis de los flavivirus quiméricos
de la invención, tales como quimeras del virus de la fiebre amarilla
y del de la Encefalitis japonesa (JE), de cualquiera de los tipos 1
a 4 del Dengue (DEN 1-4), del de la Encefalitis
Murray Valley (MVE), del de la Encefalitis de San Luis (SLE), del
Oeste del Nilo (WN), del virus de la Encefalitis que se transmite
por las garrapatas (TBE), y de los virus de la hepatitis C (HCV), se
describen a continuación.
Las proteínas de los flavivirus se producen por
la traducción de un único y largo marco abierto de lectura (que
codifica, por ejemplo, las proteínas estructurales, la cápside (C),
la premembrana (pr-M) y la envuelta (E), así como
las proteínas no estructurales y una serie compleja de divisiones
proteolíticas postraduccionales. Los flavivirus quiméricos
utilizados en la composición de vacuna de la invención, tal como se
ha considerado anteriormente, incluyen aquéllos en los que las
proteínas pr-M y E de un flavivirus se han
reemplazado por las proteínas pr-M y E de otro
flavivirus. Así, la creación de estos flavivirus quiméricos implica
la generación de nuevas uniones entre la cápside y las proteínas
premembrana, y las proteínas de la envuelta y la región no
estructural (NS1) de los distintos flavivirus. La división entre
cada uno de estos conjuntos de proteínas (C y pr-M,
y E y NS1), tiene lugar durante el procesamiento proteolítico
natural de las proteínas del flavivirus, y necesita la presencia de
secuencias señal que franqueen las uniones de los sitios de
división.
En los flavivirus quiméricos utilizados en la
composición de vacuna de la invención, es preferible que las
secuencias señal de los virus de la fiebre amarilla que dan lugar a
las quimeras se conserven, de manera que la división apropiada
entre las proteínas C y pr-M y E y NS1 pueda
llevarse acabo eficientemente.
Una secuencia señal puede incluir como su último
residuo un aminoácido con una cadena lateral pequeña no cargada,
tal como la alanina, la glicina, la serina, la cisteína, la treonina
o la glutamina.
La derivación de matrices enteras de ADNc para
quimeras YF/JE utilizadas en la composición de vacuna y que se
describen a continuación utilizó una estrategia similar a la que
investigadores anteriores utilizaron para regenerar YF17D a partir
de ADNc para el análisis genético molecular de la replicación de YF.
La estrategia se describe, por ejemplo, por Nestorowicz et
al., (Virology 199:114-123, 1994).
Brevemente, la derivación de una quimera YF/JE
utilizada en la composición de vacuna, implica lo siguiente:
secuencias genómicas de YF se propagan en dos plásmidos (YF5'3'IV y
YFM5.2) que codifican las secuencias YF de los nucleótidos 1 a
2.276 y 8.279 a 10.861 (YF5'3'IV) y de 1.373 a 8.704 (YFM5.2) (Rice
et al., The New Biologist 1:285-296, 1989).
Las matrices completas de ADNc se generaron por la unión de
fragmentos apropiados de restricción derivados de estos plásmidos.
Este procedimiento ha sido el más .fiable para asegurar la expresión
estable de las secuencias YF y de la generación de transcritos de
ARN de infectividad altamente específica.
La estrategia de los inventores para la
construcción de quimeras implica reemplazar las secuencias YF en el
interior de los plásmidos YF5'3'TV e YFM5.2 por las secuencias
correspondientes de JE, a partir del inicio de la proteínas prM
(nucleótido 478, aminoácido 128) a través del sitio de división
E/NS1 (nucleótido 2.452, aminoácido 817). Además de la clonación de
JE ADNc, se necesitaron varias etapas para introducir o eliminar
los sitios de restricción en las dos secuencias YF y JE, para dejar
que la unión in vitro se llevara a cabo. La estructura de la
matriz para la regeneración del virus quimérico YF (C)/JE
(prM-E) se muestra en la Figura 1. Una segunda
quimera, que codifica la región estructural completa JE
(C-prM-E), se obtuvo empleando una
estrategia similar.
A partir de la cepa JE
SA_{14}-14-2 (cepa vacunal
atenuada y viva de JE), se generaron clones de genes de proteínas
estructurales JE auténticas, porque las propiedades biológicas y la
caracterización molecular de esta capa están bien documentadas
(véase, por ejemplo., Eckels et al., Vaccine
6:513-518, 1988; el virus JE
SA_{14}-14-2 está disponible en
los Centers for Disease Control, Fort Collins, Colorado y en la Yale
Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut,
que constituyen Centros de Referencia para los Arbovirus en los
Estados Unidos, designados por la Organización Mundial de la Salud).
En el nivel de paso PDK-5 se obtuvo el virus JE
SA_{14}-14-2, que se hizo pasar
por las células LLC-MK_{2} para obtener cantidades
suficientes de virus para la clonación del ADNc. La estrategia que
se ha utilizado implicó la clonación de la región estructural en
dos fragmentos que se solaparon en un sitio NheI (nucleótido
1.125 de JE), que puede entonces utilizarse para la unión in
vitro.
El ARN se extrajo de las monocapas de las
células LLC-MK_{2} infectadas y la síntesis de la
primera cadena de ADNc con sentido negativo se llevó a cabo
utilizando la transcriptasa inversa con un iniciador de sentido
negativo (secuencia nucleótida 2.456 a 2471 de JE) que contenía los
sitios de restricción anidadas XbaI y NarI para
realizar inicialmente la clonación en pBluescript II KS (+), y a
continuación en YFM5.2 (NarI), respectivamente. La síntesis
de la primera cadena de ADNc fue seguida por la amplificación PCR de
la secuencia JE entre los nucleótidos 1.108 a 2.471, utilizando el
mismo iniciador con sentido negativo y un iniciador con sentido
positivo (secuencia nucleótida de JE entre 11.108 y 1.130) que
contenía los sitios de restricción anidadas XbaI y
NsiI para llevar a cabo la clonación en pBluescript e YFM5.2
(NarI), respectivamente. Las secuencias de JE se comprobaron
mediante digestión enzimática de restricción y secuenciación
nucleótida. La secuencia nucleótida de JE entre los nucleótidos 1 y
1130 se derivó mediante amplificación PCR de la cadena JE ADNc
negativa, utilizando un iniciador de sentido negativo que
corresponde a los nucleótidos JE 1.116 a 1.130, y un iniciador de
sentido positivo que corresponde a los nucleótidos 1 a 18 de JE,
conteniendo ambos un sitio de restricción EcoRI. Los
fragmentos PCR se clonaron en pBluescript, y las secuencias de JE se
comprobaron mediante secuenciación nucleótida. Conjuntamente, esto
representa la clonación de la secuencia JE entre los nucleótidos 1
y 2.471 (aminoácidos 1-792).
Para insertar el extremo C de la proteína JE de
la envuelta en el sitio de división YF E/NS1, se introdujo un único
sitio de restricción NarI en el plásmido YFM5.2 mediante
mutagénesis oligonucleótido-dirigida de la
secuencia señalasa en el sitio E/NS1 de división (nucleótidos 2.447
a 2.452 de YF, aminoácidos 816-817) para crear
YFM5.2 (NarI). Los transcritos derivados de las matrices que
incorporan este cambio se chequearon respecto a la infectividad y
dieron lugar a una infectividad específica similar a las matrices
parentales (100 unidades formadoras de calvas/250 nanogramos de
transcritos, aproximadamente). La secuencia de JE entre los
nucleótidos 1.108 y 2.471 se subclonó a partir de varios clones
independientes derivados mediante PCR de pBluescript/JE en YFM5.2
(NarI), utilizando los únicos sitios de restricción
NsiI y NarI. Los clones YF5'3'IV/JE que contienen la
región no traducida YF5'(nucleótidos 1 a 118) adyacente a la región
JE prM-E, se derivaron mediante amplificación
PCR.
Para derivar secuencias que contuvieran la unión
de la cápside YF y JE prM, se utilizó un iniciador quimérico de
sentido negativo que abarcaba esta región, con un iniciador de
sentido positivo que correspondía a los nucleótidos 6.625 a 6.639
de YF5'3'IV, para generar fragmentos PCR que se utilizaron entonces
como iniciadores PCR de sentido negativo en conjunción con un
iniciador de sentido positivo complementario a la secuencia del
vector pBluescript corriente arriba del sitio EcoRI, para
amplificar la secuencia JE (codificada en orientación inversa en el
vector pBluescript) desde el nucleótido 477 (extremo N de la
proteína prM), a través del sitio NheI en el nucleótido
1.125. Los fragmentos PCR resultantes se insertaron en el plásmido
YF5'3'IV utilizando los sitios de restricción NotI y
EcoRI. Este constructo contiene el promotor SP6 que precede a
la región no traducida YF-5', seguido por la
secuencia: YF(C)JE (prM-E). y contiene
el sitio NheI (nucleótido 1.125 de JE) necesario para la
unión in vitro.
Para utilizar el sitio NheI dentro de la
secuencia JE de la envuelta como un sitio 5' de unión in
vitro, se eliminó un sitio NheI superfluo en el plásmido
YFM5.2 (nucleótido 5.459). Esto se llevó a cabo mediante una
mutación silenciosa de la secuencia YF en el nucleótido 5.461
(T\rightarrowC; alanina, aminoácido 1820). Este sitio se
incorporó a YFM5.2 mediante la unión de fragmentos de restricción
apropiados y la introducción en YFM5.2 (NarI)/JE
intercambiando un fragmento NsiI/NarI que codifica la
secuencia quimérica YF/JE.
Para crear un único sitio de restricción 3' para
la unión in vitro, se construyó un sitio BspEl
corriente abajo del sitio AatII utilizado normalmente para
generar matrices completas a partir de YF5'3'IV e YFM5.2 (Múltiples
sitios AatII se encuentran en la secuencia estructural JE,
excluyendo la utilización de este sitio para la unión in
vitro). El sitio BspEl se creó mediante la mutación
silenciosa del nucleótido 8.581 de YF (A\rightarrowC; serina,
aminoácido 2.860) y se introdujo en YFM5.2 mediante intercambio de
fragmentos apropiados de restricción. El único sitio se incorporó
en YFM5.2/JE mediante intercambio del fragmento
XbaI/SphI y en los plásmidos YF5'3'IV/JE
(prM-E) mediante la unión de 3 segmentos de
fragmentos apropiados de restricción de estos plásmidos parentales
y a partir de un derivado de YFM5.2 (BspEI), suprimiendo la
secuencia de YF entre los sitios EcoRI, en los nucleótidos 1
y 6.912.
A causa de la incertidumbre respecto a la
capacidad de la región estructural de JE
SA_{14}-14-2 derivada de PCR para
funcionar apropiadamente en el contexto del virus quimérico, se
utilizan ADNc procedentes de un clon de la cepa JE Nakayama que se
ha caracterizado ampliamente en experimentos de expresión y por su
capacidad inducir inmunidad protectora (véase, por ejemplo, Mclda
et al., Virology 158:348-360, 1987; la cepa
JE Nakayama está disponible en los Centers for Disease Control,
Fort Collins, Colorado y en la Yale Arbovirus Research Unit, Yale
University, New Haven, Connecticut). El ADNc Nakayama se insertó en
los plásmidos quiméricos YF/JE utilizando sitios de restricción
disponibles (HindIII a PvuII y BpmI a
MunI), para reemplazar la región prM-E
completa en el sistema de dos plásmidos excepto para un único
aminoácido, serina, en posición 49, que se dejó intacto con objeto
de utilizar el sitio NheI para la unión in vitro. La
región JE completa en el clon Nakayama se secuenció para comprobar
que el ADNc que se había reemplazado era auténtico (Tabla 2).
Los procedimientos para generar matrices
completas de ADNc, son esencialmente tal como se han descrito en
Rice
et al., (The New Biologist, 1:285-96, (1989) (véase la figura 1). En el caso de matrices quiméricas, los plásmidos YF5'
3'IV/JE (prM-E) e YFM5.2/JE se digirieron con NheI/BspEI, llevándose a cabo la unión in vitro utilizando 50 nanogramos de fragmentos purificados en presencia de la T4ADN ligasa. Los productos de la unión se linearizan con XhoI para permitir el procesamiento de la transcripción. Los transcritos SP6 se sintetizan utilizando 50 nanogramos de la matriz purificada, y se cuantifican por la incorporación de ^{3}H-UTP, comprobándose la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa no desnaturalizante. Los rendimientos, utilizando este procedimiento, oscilan entre 5 y 10 microgramos de ARN por reacción, la mayoría de los cuales se encuentra como transcritos completos. La transfección de los transcritos de ARN en presencia de liposomas catiónicos se lleva a cabo tal como se describe por Rice et al., (supra), para YF17D. En los experimentos iniciales, se utilizaron las células LLC-MK_{2} para la transfección y cuantificación del virus, ya que se determinó la permisividad para la replicación y la formación de las calvas de las cepas parentales de YF y JE. La tabla 1 muestra resultados típicos de los experimentos de transfección, empleando Lipofectina (GIBCO/BRL) como vehículo de transfección. Asimismo, se han utilizado rutinariamente progenies celulares Vero, para
la preparación de reservas de virus infecciosos, la caracterización de proteínas marcadas y ensayos de neutralización.
et al., (The New Biologist, 1:285-96, (1989) (véase la figura 1). En el caso de matrices quiméricas, los plásmidos YF5'
3'IV/JE (prM-E) e YFM5.2/JE se digirieron con NheI/BspEI, llevándose a cabo la unión in vitro utilizando 50 nanogramos de fragmentos purificados en presencia de la T4ADN ligasa. Los productos de la unión se linearizan con XhoI para permitir el procesamiento de la transcripción. Los transcritos SP6 se sintetizan utilizando 50 nanogramos de la matriz purificada, y se cuantifican por la incorporación de ^{3}H-UTP, comprobándose la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa no desnaturalizante. Los rendimientos, utilizando este procedimiento, oscilan entre 5 y 10 microgramos de ARN por reacción, la mayoría de los cuales se encuentra como transcritos completos. La transfección de los transcritos de ARN en presencia de liposomas catiónicos se lleva a cabo tal como se describe por Rice et al., (supra), para YF17D. En los experimentos iniciales, se utilizaron las células LLC-MK_{2} para la transfección y cuantificación del virus, ya que se determinó la permisividad para la replicación y la formación de las calvas de las cepas parentales de YF y JE. La tabla 1 muestra resultados típicos de los experimentos de transfección, empleando Lipofectina (GIBCO/BRL) como vehículo de transfección. Asimismo, se han utilizado rutinariamente progenies celulares Vero, para
la preparación de reservas de virus infecciosos, la caracterización de proteínas marcadas y ensayos de neutralización.
Los plásmidos que contenían el ADNc quimérico
YF/JE se sometieron a análisis secuencial de la parte JE de los
clones, para identificar las secuencias correctas de la
SA_{14}-14-2 y de la proteína
Nakagama de la envuelta. Las diferencias en la secuencia nucleótida
entre estos constructos en comparación con las secuencias de las
que se ha informado (McAda et al, supra), se muestran
en la tabla 2.
La estructura genómica de los virus quiméricos
YF/JE recuperados a partir de los experimentos de transfección, se
comprobó mediante análisis basado en RT/PCR del ARN vírico recogido
de las monocapas celulares infectadas. Esto experimentos se
llevaron a cabo para eliminar la posibilidad de que las reservas
víricas se contaminaran durante los procedimientos de transfección.
Para estos experimentos, se utilizó un primer paso del virus para
iniciar un ciclo de infección, para eliminar cualesquiera posibles
artefactos generados por la presencia del ARN vírico residual
transfectado. Los extractos del ARN total de las células infectadas
con las quimeras YF/JE
(prM-E)-SA_{14}-14-2,
o YF/JE (prM-E)-Nakayama, se
sometieron a RT/PCR empleando iniciadores específicos para YF y JE
que permitieron la recuperación de la región estructural completa
como productos de PCR de 1 kilobase aproximadamente de tamaño.
Estos productos se analizaron entonces mediante digestión enzimática
de restricción, utilizando los sitios predichos en el interior de
las secuencias JE SA_{14}-14-2 y
Nakayama que permiten la diferenciación de estos virus. Utilizando
este enfoque, se demostró que el ARN vírico era quimérico y se
comprobó que los virus recuperados presentaban los sitios de
restricción apropiados. El límite actual de C-prM
se comprobó entonces que estaba intacto a nivel secuencial, mediante
el análisis de la secuencia del ciclo a través de la unión
quimérica YF/JE C-prM.
La presencia de la proteína JE de la envuelta en
las dos quimeras se comprobó, tanto mediante inmunoprecipitación
con antisuero JE específico, como mediante el ensayo de
neutralización de reducción de la calva, utilizando antisueros YF y
JE específicos. La inmunoprecipitación de extractos marcados con
^{35}S de células LLC-MK_{2} que se habían
infectado con las quimeras, utilizando un anticuerpo monoclonal para
la proteína E JE, mostró que la proteína JE de la envuelta podía
recuperarse como una proteína de 55 kD, mientras que el mismo
antisuero no fue capaz de llevar a cabo una inmunoprecipitación de
una proteína de las células infectadas con YF. Tanto los sueros
hiperinmunes JE como YF demostraron reactividad cruzada para las dos
proteínas de la envuelta, pero la diferencia de tamaño entre las
proteínas (YF=53 kD, no glicosilada; JE=55 kD, glicosilada) pudo
observarse de forma reproducible. La utilización de anticuerpos
monoclonales YF no fue satisfactoria bajo las condiciones de
inmunoprecipitación, por lo que, la especificidad dependió de los
anticuerpos monoclonales para JE en este análisis. El ensayo de
neutralización de la reducción de las calvas (PRNT) se llevó a cabo
sobre los virus quiméricos y los virus YF y JE
SA_{14}-14-2 utilizando líquido
ascítico hiperinmune específico para JE e YF (ATCC) e IgG
purificada específica para YF (anticuerpo monoclonal 2E10). Se
observaron diferencias significativas para las quimeras en el
título de reducción del 50% de las calvas de estos antisueros,
cuando se compararon con los virus de control en estos experimentos
(Tabla 3). De este modo, los epítopos necesarios para la
neutralización se expresan en los virus quiméricos YF/JE
infecciosos.
La capacidad de crecimiento de las quimeras se
ha examinado cuantitativamente en progenies celulares con origen
tanto en primates como en mosquitos. La figura 2 muestra las curvas
de crecimiento acumulativo de las quimeras en las células
LLC-MK_{2} después de una infección de baja
multiplicidad (0,5 unidades formadoras de calvas/célula). En este
experimento, los virus YF5.2iv (derivado clonado) y JE
SA_{14}-14-2 (no clonado) se
utilizaron para comparar. Ambos virus quiméricos alcanzaron un
rendimiento vírico máximo de aproximadamente 1 log más alto que el
virus parental. En el caso de las quimeras YF/JE
SA_{14}-14-2, el pico de
producción vírica tuvo lugar 12 horas después que la quimera YF/JE
Nakayama (50 horas respecto a 38 horas). Las quimeras YF/JE Nakayama
mostraron considerablemente más efectos citopáticos que las
quimeras YF/JE SA_{14}-14-2 sobre
esta progenie celular. Un experimento similar se llevó a cabo en
las células C6/36 después de una infección de baja multiplicidad
(0,5 unidades formadoras de calvas/célula). La figura 2 muestra
asimismo la cinética del crecimiento de los virus en esta progenie
celular invertebrada. Se obtuvieron rendimientos víricos similares
en todos los puntos utilizados para la recuperación de los virus en
este experimento, confirmando además la idea el hecho de que los
virus quiméricos no se ven afectados en la eficiencia de la
replicación.
Se llevó a cabo un experimento para evaluar la
capacidad del candidato vacunal para multiplicarse en una progenie
celular aceptable para las vacunas humanas. La vacuna comercial 17D
de la fiebre amarilla (YF-Vax®) se obtuvo de
Connaught Laboratories, Swiftwater, PA. Las MRC-5
(células embrionarias humanas diploides) se obtuvieron de la ATCC
(171-CCL, Lote nº F-14308, pase 18)
y se hicieron crecer en EMEM, 2 mM L-Gln, BSS
(medio) de Earle ajustado para contener 1,5 g/l de bicarbonato
sódico, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y FBS al 10%.
Para comparar la cinética de crecimiento de los
RMS (Sembrado Principal de Investigación, YF/JE
SA_{14}-14-2 con
(YF-Vax®), se hicieron crecer las células hasta el
90% de confluencia y se infectaron con RMS o
(YF-Vax®) con una MOI de 0,1 unidades formadoras de
placa. Ya que las células MRC-5 crecen generalmente
lentamente, estas células se conservaron durante 10 días después de
la inoculación. Las muestras se congelaron diariamente entre 7 y 10
días y la infectividad se determinó mediante el ensayo en placa en
las células Vero.
YF-Vax® y las quimeras YF/JE
crecieron hasta títulos modestos en las células
MRC-5 (figura 3). El título máximo fue de
aproximadamente 4,7 log_{10} unidades formadoras de calvas para
YF-Vax® que se alcanzaron en el segundo día y fue
ligeramente inferior, de 4,5 log_{10} unidades formadoras de
calvas, para los RMS después de 6 días.
Las propiedades de virulencia de las quimeras
YF/JE SA_{14}-14-2 se analizaron
en ratones adultos jóvenes mediante inoculación intracerebral. A
grupos de 10 ratones (machos de 4 semanas de edad y ratones ICR
hembras, 5 por grupo) se les inoculó con 10.000 unidades formadoras
de calvas de las quimeras YF/JE
SA_{14}-14-2, YF5.2iv, o JE
SA_{14}-14-2, observándose
diariamente durante tres semanas. Los resultados de estos
experimentos se muestran en la figura 4. Los ratones que recibieron
la cepa YF5.2iv parental sucumbieron a la semana aproximadamente
después de la inoculación. Entre los ratones que recibieron la cepa
JE SA_{14}-14-2 parental o la
quimera, no se observó mortalidad o enfermedad. Los inóculos que se
utilizaron para los experimentos se titularon en el momento de la
inyección y un subgrupo de los ratones supervivientes se ensayaron
respecto a la presencia de anticuerpos neutralizantes para
confirmar que la infección había tenido lugar. Entre los ensayados,
los títulos contra los virus JE
SA_{14}-14-2, fueron similares
para los animales que recibieron esta cepa o la quimera.
Los resultados de otros experimentos que
investigaban la neurovirulencia de las quimeras YF/JE
SA_{14}-14-2 se muestran en la
Tabla 4. En estos experimentos, todos los ratones a los que se había
inoculado con YF5.2iv murieron entre los 7 y los 8 días. Al
contrario, ninguno de los ratones a los que se inoculó con YF/JE
SA_{14}-14-2 murió durante dos
semanas después de observar la post-inoculación.
Los resultados de experimentos que investigaban
la neuroinvasividad y la patogénesis de las quimeras YF/JE se
muestran en la Tabla 5. En estos experimentos, los virus quiméricos
se inocularon en ratones de 3 semanas de edad a dosis que variaban
entre 10.000 y 1 millón de unidades formadoras de calvas a través de
la vía intraperitoneal. Ninguno de los ratones que había sido
inoculado con YF/JE Nakayama o YF/JE
SA_{14}-14-2, murió durante tres
semanas de observación de la post-inoculación,
indicando que los virus fueron incapaces de provocar enfermedad
después de la inoculación periférica. Los ratones a los que se
inoculó con YF/JE SA_{14}-14-2,
desarrollaron anticuerpos neutralizantes contra el virus JE (figura
7).
La derivación de los virus quiméricos de fiebre
amarilla/dengue (YF/DEN) se describe a continuación, la cual, en
principio, se lleva a cabo de la misma manera que la construcción de
las quimeras YF/JE descritas anteriormente. Otras quimeras de
flavivirus pueden obtenerse con una estrategia similar, utilizando
sitios de restricción naturales u obtenidos mediante ingeniería
genética y, por ejemplo, en la Tabla 6 se muestran iniciadores
oligonucleótidos.
Aunque se han desarrollado varios clones
moleculares para los virus del dengue, se han encontrado
habitualmente problemas relacionados con la estabilidad del ADNc
vírico en los sistemas plasmídicos, y con la eficiencia de la
replicación del virus recuperado. Se escogió utilizar un clon de
DEN-2 desarrollado por el Dr. Peter Wright, del
Departamento de Microbiología de la Universidad Monash, Clayton,
Australia, porque este sistema es relativamente eficiente para
regenerar los virus y utiliza un sistema biplasmídico similar a la
propia metodología de los inventores. La secuencia completa de este
clon DEN-2 está disponible y facilitó la
construcción de matrices quiméricas YF/DEN, porque sólo fueron
necesarias algunas modificaciones del clon YF. Las etapas
importantes se dan a conocer a continuación.
De forma similar al sistema biplasmídico para
los virus YF5.2iv e YF/JE, el sistema YF/DEN utiliza un único sitio
de restricción en el interior de la proteína (E) de la envuelta de
DEN-2 como un límite para la propagación de la
región estructural (prM-E) en el interior de los dos
plásmidos, a los que se hará alusión en lo sucesivo en la presente
memoria como YFS'3'IV/DEN (prM-E) e YFM5.2/DEN
(E'-E) (véase la figura 5). Los dos sitios de
restricción para la unión in vitro de la matriz quimérica son
AatII y SphI. El plásmido receptor para la parte del
extremo 3' de la secuencia de la proteína E de DEN es YFM5.2
(NarI[+]SphI[-]). Este plásmido contiene el sitio
NarI y la unión E/NSI, que se utilizó para la inserción del
extremo carboxilo de la proteína E de JE. Se modificó
posteriormente por eliminación de un sitio SphI extra en la
región NS5 de la proteína mediante mutagénesis silenciosa
sitio-dirigida. Esto permitió la inserción de la
secuencia de DEN-2 desde el único sitio SphI
al sitio NarI mediante clonación única direccional. El
fragmento apropiado de ADNc DEN-2 se derivó
mediante PCR a partir del clon MON310 de DEN-2
proporcionado por el Dr. Wright. Los iniciadores PCR incluyeron un
iniciador 5' que franqueaba el sitio SphI y un iniciador 3'
homólogo para los nucleótidos de DEN-2
inmediatamente corriente arriba del sitio señalasa en la unión
E/NSI, y reemplazando el sitio señalasa mediante sustituciones que
crean un nuevo sitio, pero que introducen asimismo un sitio
NarI. El fragmento PCR resultante de 1.170 pares de bases se
introdujo entonces en YFM5.2 (NarI[+]SphI[-]).
La parte 5' del clon DEN-2 que
incluye la prM y la parte terminal amino de la proteína E, se
construyó en el plásmido YF5'3'IV utilizando un iniciador PCR
quimérico. El iniciador quimérico, que incorpora el extremo 3' de
la proteína YF C de sentido negativo y el extremo 5' de la proteína
prM de DEN-2, se utilizó con un iniciador de
sentido positivo que franqueaba el promotor SP6 del plásmido
YF5'3'IV, para generar un producto PCR de 771 pares de bases con
una extensión de 20 bases que representaban la secuencia prM de
DEN-2. Este producto PCR se utilizó entonces para
cebar el plásmido DEN-2 conjuntamente con un
iniciador 3' que representa la secuencia DEN-2 de
1.501 a 1.522 y que franqueaba el SphI, para generar un
producto PCR final de 1.800 pares de bases que incluye la secuencia
YF desde el sitio NotI a través del promotor SP6, la región
no traducida YF 5', y la proteína C de YF, contigua a la secuencia
DEN-2 prM-E1522. El producto PCR se
unió a YF5'3'IV utilizando los sitios NotI y SphI
para dar lugar al plásmido
YF5'3'IV/DEN(prM-E).
Los procedimientos para generar matrices de ADNc
completo que codifiquen virus quiméricos YF/MVE, YF/SLE, YF/WN e
YF/TBE son similares a los descritos anteriormente para el sistema
YF/DEN-2. La Tabla 6 muestra las características de
la estrategia para generar virus quiméricos basados en YF17D. Los
únicos sitios de restricción utilizados para la unión in
vitro, y los iniciadores quiméricos para construir las uniones
C/prM y E/NSI son asimismo conocidos. Fuentes de ADNc para estos
flavivirus heterólogos están fácilmente disponibles (MVE: Dalgarno
et al., J. Mol. Biol. 187:309-323, 1986; SLE:
Trent et al., Virology 156:293-304, 1987;
TBE: Mandl et al., Virology 166:197-205,
1988; Dengue 1: Mason et al., Virology
161:262-267, 1987; Dengue 2: Deubel et al.,
Virology 155:365-377, 1986; Dengue 3: Hahn et
al., Virology 162:167-180, 1988; Dengue 4: Zhao
et al., Virology 155:77-88, 1986).
Un enfoque alternativo para construir otros
virus quiméricos es crear la unión C/prM uniendo el extremo romo de
fragmentos de restricción derivados de PCR que tienen extremos que
se encuentran en esta unión, y extremos 5' y 3' que franquean
sitios apropiados de restricción, para la introducción en YF5'3'IV o
en un plásmido intermediario tal como pBS-KS (+).
La opción de utilizar un oligonucleótido quimérico o una unión del
extremo romo variará, dependiendo de la disponibilidad de sitios
únicos de restricción en el interior de la región que codifica la
proteína de la envuelta del virus en cuestión.
Debido a que las proteínas estructurales E1 y E2
de HCV no son homólogas respecto a las proteínas estructurales de
los flavivirus descritos anteriormente, la estrategia para la
expresión de estas proteínas implica la inserción dentro de una
región no esencial del genoma, de forma que la totalidad de estas
proteínas se coexpresan entonces con proteínas (del virus de) la
fiebre amarilla durante la replicación vírica en las células
infectadas. La región diana para la inserción de las proteínas es
la parte terminal N de la proteína NS1, ya que la proteína NS1
entera no es necesaria para la replicación vírica. Debido a los
problemas potenciales relacionados con la estabilidad del genoma de
YF (que se producen) en presencia de secuencias heterólogas que
exceden al tamaño normal del genoma (10.000 nucleótidos
aproximadamente), puede utilizarse la estrategia de detección que se
describe a continuación. Además, la deleción de NS1 puede ser
ventajosa en los sistemas quiméricos YF/Flavivirus que se han
descrito anteriormente, porque la deleción parcial de esta proteína
puede abrogar la inmunidad para YF asociada con los anticuerpos
contra NS1, y evitar de este modo problemas con la inmunidad
vectorial si se requiriera en un receptor dado más de una vacuna
quimérica, o si una vacuna YF se hubiera administrado previamente o
se hubiera necesitado en un punto futuro.
La estrategia implica la creación de una serie
de deleciones en el interior del marco de lectura dentro de la
región codificante de NS1 del plásmido YFM5.2, en conjunción con la
construcción de un codón de finalización traduccional en el extremo
de E, y una serie de dos IRES (sitios internos de entrada
ribosómica). Un IRES se encuentra inmediatamente corriente abajo
del codón de finalización, y permite la expresión de un marco
abierto de lectura dentro de la región comprendida entre E y NS1. El
segundo IRES inicia la traducción a partir de las proteínas
truncadas NS1, proporcionando la expresión del resto de la
poliproteína YF no estructural. Estos derivados se ensayan respecto
a la recuperación de los virus infecciosos y el constructo con la
deleción más amplia se utiliza para insertar secuencias extrañas
(por ejemplo, proteínas HCV) en el primer IRES. Este constructo
particular puede asimismo servir como base para determinar si la
deleción de NS1 afectará a la inmunidad
vector-específica en el contexto de los virus
quiméricos YF/Flavivirus que expresan prM-E, tal
como se ha descrito anteriormente.
La inserción de nucleótidos que codifican las
proteínas E1, E2, y/o E1 más E2 HCV está limitada por el tamaño de
la deleción permitida en la proteína NS1. Debido a esto, las
proteínas HCV truncadas pueden utilizarse para potenciar la
estabilidad en el interior del clon YF modificado. Las proteínas HCV
se construyen con una secuencia señal N-terminal
que sigue inmediatamente al IRES y con un codón de finalización en
el extremo C. Esta construcción dirigirá a las proteínas HCV al
retículo endoplásmico para la secreción a partir de la célula. La
estrategia para esta construcción se muestra esquemáticamente en la
figura 6. Plásmidos que codifican proteínas HCV de genotipo l
pueden utilizarse para estas construcciones, por ejemplo. Los
plásmidos HCV obtenidos a partir del Dr. Charles Rice en la
Washington University (Grakoui et al., J. Virology 67:
1385-1395, 1993), que han expresado esta región del
virus en sistemas de procesamiento y en el interior de un clon HCV
completo de replicación-complemento.
Otros virus quiméricos adicionales de la
invención contienen mutaciones que evitan la división de prM, tales
como las mutaciones en el sitio de división de prM. Por ejemplo, el
sitio de división de prM en los clones infecciosos de flavivirus de
interés, tales como el dengue, TBE, SLE y otros, puede mutarse
mediante la mutagénesis sitio-dirigida. Cualquiera
o todos los aminoácidos en el sitio de división, como se ha expuesto
anteriormente, pueden suprimirse o sustituirse. Un fragmento de
ácido nucleico que contiene los genes mutados de
prM-E puede entonces insertarse en un vector del
virus de la fiebre amarilla utilizando los procedimientos que se han
descrito anteriormente. La deleción de prM puede utilizarse con o
sin otras mutaciones atenuantes, por ejemplo, mutaciones en la
proteína E, para ser insertadas en el virus de la fiebre amarilla.
Estos mutantes tienen ventajas respecto a los mutantes de
sustitución única como candidatos vacunales, porque es casi
imposible invertir la secuencia suprimida y restaurar la
virulencia.
Los siguientes flavivirus quiméricos utilizados
en la composición de vacuna fueron depositados en el American Type
Culture Collection (ATTC) en Rockville, Maryland, U.S.A, bajo los
términos del tratado de Budapest, garantizándose una fecha de
depósito del 6 de enero de 1998: Virus quimérico de la fiebre
amarilla 17D/tipo 2 del dengue (YF/DEN-2; número de
registro en ATCC VR-2593), y virus quimérico de la
fiebre amarilla 17D/Encefalitis japonesa SA_{14} 14- 2 (YF/JE
A1.3; número de registro ATCC Vr-2594).
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Otros ejemplos se encuentran en las
reivindicaciones siguientes. Por ejemplo, los genes de la proteína
prM-E de otros flavivirus de importancia médica
pueden insertarse en la estructura del virus de la vacuna de la
fiebre amarilla para producir vacunas contra otros flavivirus
médicamente importantes (véase, por ejemplo, Monath et al.,
"Flaviviruses", en Virology, Fields, editor,
Raven-Lippincott, New York, 1995, volumen 1,
961-1034).
Ejemplos de otros flavivirus, a partir de los
cuales pueden obtenerse genes para insertarse en los vectores
quiméricos, incluyen, por ejemplo, los virus de Kunjin, de la
Encefalitis europea central, de la Encefalitis rusa de
primavera-verano, de Powassan, de la Enfermedad de
Kyasanur Forest, y de la Fiebre hemorrágica de Omsk. Además, genes
de virus relacionados incluso de modo más distante, pueden
insertarse en el virus de la vacuna de la fiebre amarilla para
construir nuevas vacunas.
Las vacunas de la invención se administran en
cantidades y utilizando procedimientos, que pueden determinarse
fácilmente por los expertos en la materia. Las vacunas pueden
administrarse y formularse, por ejemplo, de la misma forma que la
vacuna 17D de la fiebre amarilla, por ejemplo, como una suspensión
transparente de tejido infectado de embrión de pollo, o como un
líquido recuperado a partir de cultivos celulares infectados con el
virus quimérico de la fiebre amarilla. De este modo, el virus
quimérico vivo y atenuado puede formularse como una solución acuosa
estéril que contiene entre 100 y 1.000.000 de unidades infecciosas
(por ejemplo, unidades formadoras de calvas o dosis infecciosas de
cultivo tisular) en un volumen de dosis de 0,1 a 1,0 ml, para ser
administradas, por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, o
intradérmica. Además, debido a que los flavivirus pueden infectar
al huésped humano a través de las vías mucosas, tales como la
vía oral (Gresikova et al., "Tick-borne
Encephalitis", o en The Arboviruses, Ecology and
Epidemiology, Monath (ed,) CRC Press, Boca Raton, Florida,
1988, Volumen IV, 177-203), el virus vacunal puede
administrarse por una vía mucosa para alcanzar una respuesta inmune
protectora. La vacuna puede administrarse como un agente
profiláctico primario en adultos o niños con riesgo de infección por
flavivirus. Las vacunas pueden también utilizarse como agentes
secundarios para tratar pacientes infectados con flavivirus,
estimulando una respuesta inmunitaria contra el flavivirus.
Puede ser deseable utilizar el sistema vectorial
de la vacuna de la fiebre amarilla para inmunizar un huésped contra
un virus (por ejemplo, el virus de la Encefalitis japonesa) y volver
a inmunizar posteriormente al mismo individuo contra un segundo o
tercer virus, utilizando un constructo quimérico diferente. Una
ventaja significativa del sistema quimérico de la fiebre amarilla
es que el vector no provocará una inmunidad intensa para él mismo.
Ni una inmunidad previa al virus de la fiebre amarilla excluye la
utilización de la vacuna quimérica como un vector para la expresión
génica heteróloga. Estas ventajas se deben a la eliminación de la
parte del gen E de la vacuna de la fiebre amarilla que codifica
antígenos neutralizantes (protectores) para la fiebre amarilla, y
el reemplazo con otro gen heterólogo que no proporciona protección
cruzada contra la fiebre amarilla. Aunque las proteínas no
estructurales del virus YF17D pueden jugar un papel en la
protección, provocando, por ejemplo, anticuerpos contra NS1, que
está implicado en la lisis de las células infectadas mediada por el
anticuerpo dependiente del complemento (Schlesinger et al, J.
Immunology 135:2805-2809, 1985), o induciendo
respuestas citotóxicas de las células T para NS3 u otras proteínas
del virus, es improbable que estas respuestas abroguen la capacidad
de una vacuna de virus vivos para estimular a los anticuerpos
neutralizantes. Esto se apoya en el hecho de que (1) individuos que
se habían infectado previamente con el virus JE responden a la
vacunación con YF17D de modo similar a las personas sin previa
infección por JE, y (2) individuos que habían recibido previamente
la vacuna YF17D responden a la revacunación con un aumento en los
títulos de anticuerpos neutralizantes (Sweet et al., Am. J.
Trop. Med. Hyg. 11:562-569, 1962). Así, el vector
quimérico puede utilizarse en poblaciones que son inmunes a la
fiebre amarilla a causa de una infección natural previa o de una
vacunación, pudiéndose utilizar repetidamente, o para inmunizar
simultáneamente o secuencialmente con varios constructos distintos,
que incluyen quimeras de la fiebre amarilla con insertos de, por
ejemplo, la Encefalitis japonesa, la Encefalitis de San Luis o los
virus del Oeste del Nilo.
Para las aplicaciones de la vacuna, pueden
utilizarse los adyuvantes que son conocidos por lo expertos en la
materia. Los adyuvantes que pueden utilizarse para potenciar la
inmunogenicidad de las vacunas quiméricas incluyen, por ejemplo,
formulaciones liposómicas, adyuvantes sintéticos tales como
saponinas (por ejemplo QS21), el muramil dipéptido, el lípido A
monofosforilo, o la polifosfazina. Aunque estos adyuvantes se
utilizan típicamente para potenciar las respuestas inmunes a las
vacunas inactivadas, pueden sólo utilizarse con vacunas vivas. En
el caso de una vacuna quimérica suministrada a través de una vía
mucosa, por ejemplo, oralmente, los adyuvantes mucosos tales como
la toxina termolábil de E. coli (LT) o las derivaciones
mutantes de LT, constituyen adyuvantes útiles. Además, los genes
que codifican citoquinas que tienen actividades adyuvantes, pueden
insertarse en los vectores de la fiebre amarilla. De este modo, los
genes que codifican citoquinas, tales como GM-CSF,
IL-2, IL-12, IL-13 o
IL-5, pueden insertarse junto con genes heterólogos
de flavivirus para producir una vacuna que dé lugar a respuestas
inmunitarias potenciadas, o para modular la inmunidad dirigida más
específicamente hacia respuestas celulares, humorales o mucosas.
Otra ventaja del sistema vectorial de la fiebre
amarilla es que los flavivirus experimentan la replicación en el
citoplasma de las células, de forma que la estrategia de replicación
vírica no implica la integración del genoma vírico en la célula
huésped (Chambers et al, (1990) "Flavivirus Genome
Organization, Expression and replication", en Annual Review
of Microbiology 44: 649-688), proporcionando una
importante medida de seguridad.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Acambis, Inc. et al.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacunas quiméricas de flavivirus
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
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- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Dr. Volker Vossius
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: Geibelstrasse 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Munich
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Baviera
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 81679
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR PC: compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ para Windows Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- INFORMACIÓN DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 02 MARZO 98
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- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/807.445
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28 FEBRERO 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 09/007.664
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 ENERO 98
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DATOS DE LA SOLICITUD DE PATENTE DE LA MISMA FAMILIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 98 910 103.5
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 2 MARZO 98
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm7
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm9
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEC. ID nº
4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID.. nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº14:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm22
Claims (13)
1. Composición de vacuna que comprende un virus
quimérico vivo, infeccioso, atenuado, que comprende:
un virus de la fiebre amarilla en el que la
secuencia nucleótida que codifica una proteína prM-E
es suprimida, truncada, o mutada de forma que la proteína
prM-E funcional del virus de la fiebre amarilla no
se expresa, y es integrada en el genoma de dicho virus de la fiebre
amarilla, una secuencia nucleótida que codifica una proteína
prM-E de un segundo flavivirus distinto, de forma
que dicha proteína prM-E de dicho segundo flavivirus
se expresa, en el que la secuencia señal en la unión C/prM de dicho
virus de la fiebre amarilla, se conserva.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Composición de vacuna según la reivindicación
1, en la que la secuencia nucleótida que codifica la proteína
prM-E de dicho segundo y distinto flavivirus
sustituye la secuencia nucleótida que codifica la proteína
prM-E de dicho virus de la fiebre amarilla.
3. Composición de vacuna según la reivindicación
1 ó 2, en la que dicho virus de fiebre amarilla es la cepa YF
17D.
4. Composición de vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho segundo flavivirus es un
virus de la Encefalitis japonesa (JE).
5. Composición de vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho segundo flavivirus es un
virus Dengue.
6. Composición de vacuna según la reivindicación
5, en la que el virus Dengue se selecciona de entre el grupo
constituido por los tipos de Dengue 1 a 4.
7. Composición de vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho segundo flavivirus es
seleccionado de entre el grupo formado por un virus de la
Encefalitis Murray Valley, un virus de la Encefalitis de San Luis,
un virus del Oeste del Nilo, un virus de la Encefalitis transmitida
por garrapatas, un virus de la hepatitis C, un virus de Kunjin, un
virus de la Encefalitis europea central, un virus de la Encefalitis
rusa de primavera-verano, un virus de Powassan, un
virus de la Enfermedad de Kyasanur Forest, y un virus de la Fiebre
hemorrágica de Omsk.
8. Composición de vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha secuencia nucleótida que
codifica dicha proteína prM-E de dicho segundo y
distinto flavivirus, comprende una mutación que evita la división
de prM para producir la proteína M.
9. Composición de vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que las secuencias señal en las
uniones C/prM y E/NS 1 de dicho virus de la fiebre amarilla se
conservan en la construcción de dicho flavivirus quimérico.
10. Composición de vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, que está formulada como una solución
acuosa estéril que contiene entre 100 y 1.000.000 unidades
infecciosas del virus quimérico en un volumen de dosis de 0,1 a 1,0
ml.
11. Composición de vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10 que está formulada para la
administración por la ruta mucosal, intradérmica, subcutánea o
intramuscular.
12. Composición de vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11 que está formulada para la
administración oral.
13. Composición de vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12 que comprende además un adyuvante.
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