KR20000075830A - 키메라 플라비바이러스 백신 - Google Patents

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Abstract

본원에는 prM-E 단백질의 뉴클레오티드 서열이 결실, 트룬케이션, 또는 돌연변이되어 기능적인 prM-E 단백질이 발현되지 않는 황열 바이러스를 포함하고, 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 상기 황열 바이러스의 게놈에 통합되어 있어 제 2의 플라비바이러스의 prM-E 단백질이 발현될 수 있는, 키메라, 살아있는 감염성 약독화 바이러스(chimeric, live, infectious, attenuated virus)가 개시되어 있다.

Description

키메라 플라비바이러스 백신{CHIMERIC FLAVIVIRUS VACCINES}
플라비바이러스과의 몇몇 멤버들은 전세계 사람들의 건강에 위협이 되거나 위협을 가할 가능성이 있다. 예를 들어, 일본 뇌염은 극동지역의 수백만의 사람들이 위험에 처해 있는 것을 포함하여 중대한 전세계적인 건강 문제이다. 연간 전세계에서 약 1억건이 발병되는 뎅그열(Dengue fever)과 45만건을 넘는 뎅그 출혈열(dengue hemorrhagic fever)로 인해, 뎅그 바이러스(Dengue virus)는 단일의 가장 중요한 절지동물 매개성 사람 질병으로 대두되었다. 다른 플라비바이러스들은 계속해서 여러 자연환경에서 풍토병을 유발하고 기후의 변화, 매개 동물 집단, 인간의 활동에 의한 환경 파괴로 인해 새로운 지역에 출현할 가능성이 있다. 예를 들어, 플라비바이러스는 미국의 중서부, 남동부, 및 서부지역에서 산발성이지만, 급성 질병을 유발하는, 성 루이스 뇌염 바이러스; 열병(febrile illness)을 유발하고, 때로 급성 뇌염에 의해 악화되며, 아프리카, 중동, 구소련연방, 및 유럽의 일주 지역에 광범위하게 분포되어 있는 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus); 오스트레일리아에서 풍토성 신경계 질환을 유발하는 머레이 밸리 뇌염 바이러스(Murray Valley encephalitis virus); 구소련연방, 동유럽에 광범위하게 분포하고, 참진드기 매개동물이 특히 우세하며 이들 지역에서 심각한 형태의 뇌염의 원인이 되는 진드기매개 뇌염 바이러스(Tick-borne)바이러스를 포함한다.
C형 간염 바이러스(HCV)는 플라비바이러스과에 속하는 다른 멤버로서, 상술한 플라비바이러스들과 유사하지만 완전히 동일하지는 않은 게놈 구조 및 복제 기작을 갖는다. HCV는 대개 비경구적 경로를 통해 전파되고 간경변 또는 간세포암으로 진행되기도 하는 만성 간염과 상관관계를 보이며, 미국에서 동소이식(orthotopic transplantation)을 필요로 하는 간질병의 주된 원인이 되고 있다.
플라비비리다에과는 알파바이러스(예컨대, WEE, VEE, EEE, SFV 등)와 상이하고 현재 플라비바이러스, 페스티바이러스 및 C형 간염 바이러스의 3개의 속을 포함한다. 플라비바이러스의 완전하게 처리된 성숙한 비리온들은 3종의 구조 단백질 엔벨로프(E), 캡시드(C) 및 막(M) 단백질과 7종의 비구조 단백질들(non-structural proteins)(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 및 NS5)을 포함한다. 감염된 세포에서 발견되는 미성숙된 플라비비리온들은 M 단백질의 전구체인 프리-멤브레인(prM) 단백질을 포함한다.
비리온들이 숙주 세포 수용체에 결합하고나서, E 단백질들은 산성 pH의 엔도솜에 노출시 비가역적인 구조 변화를 수행하여 비리온들의 엔벨로프 이중층과 세포내이입 소포(endocytic vesicles)들 사이의 융합을 유발함으로써 바이러스 게놈을 숙주의 세포질내로 방출시킨다. prM-포함 진드기매개 뇌염(TBE; tick-borne encephalitis) 바이러스들은 융합-불능인데, 이것은 prM의 단백질 분해성 처리(proteolytic processing)가 융합-가능한, 완전한 감염성 비리온의 생성에 필요하다는 것을 가리킨다(Guirakhoo et al., J. Gen, Virol. 72(Pt.2):333-338, 1991). 바이러스 복제환의 후기에 염화암모늄을 사용하여, prM-포함 머레이 밸리 뇌염(MVE) 바이러스를 만들어 융합 불능임을 확인하였다. 서열-특이성 펩타이드 및 단클론 항체의 이용에 의해, prM이 E 단백질의 아미노산 200-327과 상호작용한다는 것이 확인되었다. 이러한 상호작용은 세포외유출 경로(exocytic pathway)의 산성 소포(acidic vesicles)에서의 성숙에 의해 유발된 E 단백질의 비가역적인 구조 변화를 방해한다(Guirakhoo et al., Virology 191:921-931, 1992).
prM의 M 단백질로의 절단은 퓨린-유사 세포 프로테아제에 의한 비리온의 방출 조금 전에 일어나며(Stadler et al., J. Virol. 71:8475-8481, 1997), 이러한 과정은 비리온들의 혈구응집반응 활성, 융합형성 활성(fusogenic activity), 및 감염성을 활성화하는데 필요하다. M 단백질은 공통서열 R-X-R/K-R(X는 다양하다)의 다음에서 그의 전구 단백질(prM)로부터 절단되고 E 단백질과 함께 바이러스 지질 엔벨로프(virus lipid envelope))에 통합된다.
절단 서열(cleavage sequence)들은 플라비바이러스내에서는 물론 돼지 코로나바이러스의 PE2, 알파바이러스의 PE2, 인플루엔자 바이러스의 HA, 및 레트로바이러스의 p160과 같은 다른 관련되지 않은 바이러스들의 단백질들내에서도 보존되어 있다. 전구 단백질의 절단은 바이러스의 감염성에는 필수적이나 파티클 형성(particle formation)에는 그렇지 않다. TBE-뎅그 4 키메라에 있어서, prM 절단부위상의 변화는 이러한 키메라의 신경독성(neurovirulence)을 약화시키는 것으로 확인되었는데(Pletnev et al., J. Virol. 67:4956-4963, 1993), 이러한 사실은 prM의 효과적인 처리(processing)가 완전한 감염성에 필요하다는 종전의 연구내용과 일치한다(Guirakhoo등의 1991, 상술한 문헌, 1992, 상술한 문헌; Heinz등, Virology 198:109-117, 1994). prM 단백질에 대한 항체들은 외견상 일부의 절단되지 않은 prM을 포함하는, 방출된 비리온들의 중화에 의해 보호면역을 매개할 수 있다. 감염성 클론의 부위지정 돌연변이유발에 의해 VEE의 PE2의 단백질분해성 절단 부위(4 아미노산들)를 결실시켰다(Smith et al., ASTMH 회의, 1997년 12월 7-11일). 결실 돌연변이체들은 고효율로 복제하였고 PE2 단백질들은 파티클내에 통합되었다. 이러한 돌연변이체들을 사람 이외의 영장류에서 실험해 본 결과 100% 혈청변환(seroconversion)을 유발하였고 모든 면역화된 원숭이들을 치명적인 공격으로부터 보호하는 것으로 나타났다.
[발명의 요약]
본 발명은
(a) prM-E 단백질의 뉴클레오티드 서열이 결실, 트룬케이션, 또는 돌연변이되어 제 1 플라비바이러스의 prM-E 단백질이 발현되지 않는, 생존한, 약독화된 백신 바이러스인, 제 1 황열종 바이러스(예컨대, 균주 17D), 및
(b) 상기 제 1 플라비바이러스의 게놈내에 통합되어 있는, 제 2의 상이한 플라비바이러스의 바이러스 엔벨로프(prM-E 단백질들)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열로 구성되어, 제 1 플라비바이러스의 변화된 게놈으로부터 제 2의 플라비바이러스의 prM-E 단백질이 발현되는, 키메라인, 생존한, 감염성, 약독화 바이러스를 특징으로 한다.
따라서, 키메라 바이러스는 제 1 플라비바이러스의 세포내 복제를 담당하는 유전자 및 유전자 산물과 제 2 플라비바이러스의 엔벨로프 유전자 및 유전자 산물로 구성된다. 바이러스 엔벨로프는 중화(neutralizing) 항체를 유도하는 모든 항원결정기(antigenic determinants)를 포함하기 때문에, 상기 키메라 바이러스에 감염되면 그러한 항체들이 제 2의 플라비바이러스에 대항해서만 생성된다.
본 발명의 키메라 바이러스에서 제 1 플라비바이러스로 바람직한 생존한 바이러스는 황열종 바이러스(yellow fever virus)이다. 적어도 하나의 백신은 이미 이러한 생존한, 약독화 바이러스를 이용하고 있다; 이 백신은 YF17D로 알려져 있고 50년 넘게 사람 면역화에 이용되어 왔다. YF17D 백신은 스미스번 등의 논문("Yellow Fever Vaccination", World health Org., p.238, 1956) 및 프리스톤의 저서(Plokin et al., (Eds.), Vaccines, 2nd edition, W.B. Saunders, Philadelphia, 1995)를 포함하는 많은 문헌에 설명되어 있다. 또한, 황열종 바이러스들은 유전자 레벨에서 연구되어 왔고(Rice et al., Science 229:726-733, 1985), 유전자형 및 표현형과 관련된 정보들이 밝혀졌다(Marchevsky et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:75-80, 1995).
본 발명의 키메라 바이러스에서 제 2의 플라비바이러스로 이용되어, 면역화 항원(immunizing antigen)의 소스가 되기에 적합한 플라비바이러스들은 일본뇌염(JE), 뎅그(DEN, 예컨대, 뎅그 타입 1-4중 어느 하나), 머레이 밸리 뇌염(MVE), 성 루이스 뇌염(SLE), 웨스트 나일(WN), 진드기매개뇌염(TBE), 및 C형 간염(HCV) 바이러스를 포함한다. 제 2의 플라비바이러스로 사용할 수 있는 추가의 플라비바이러스들은 쿤진 바이러스(Kunjin virus), 중앙 유럽 뇌염 바이러스, 러시아 춘하 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스(Powassan virus), 캬사누 포레스트 디지즈 바이러스(Kyasanur Forest Disease virus), 및 옴스크 출혈열 바이러스를 포함한다. 본 발명의 바람직한 키메라 바이러스에 있어서, 제 2 플라비바이러스의 prM-E 단백질 코드화 서열은 살아있는 황열종 바이러스의 prM-E 단백질 코드화 서열을 대체한다. 바람직한 키메라 바이러스에서, prM-E 단백질 코드화 서열은 백신 균주와 같은, 약독화된 바이러스 균주로부터 유래된다. 또한, 후술하는 바와 같이, 단백질의 prM 부분은 성숙한 막 단백질을 생성하기 위한 절단을 방해하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명은 사람과 같은 포유동물에서 본 발명의 키메라 플라비바이러스를 포유동물에 투여함으로써 플라비바이러스의 감염을 치료하는 방법; 본 발명의 키메라 플라비바이러스를 플라비바이러스의 감염을 예방하는 약물의 제조에 이용하는 방법; 본 발명의 키메라 플라비바이러스를 코드화하는 핵산서열, 및 본 발명의 키메라 플라비바이러스의 제조방법도 포함한다.
본 발명은 몇 가지 이점들을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 바이러스들은 생존해서 복제하기 때문에, 장기간의 보호면역을 유발하는데 이용될 수 있다. 상기 바이러스들은 약독화된 바이러스(예컨대, 황열 17D)의 복제 유전자를 갖기 때문에, 그 결과로 수득되는 키메라 바이러스들은 사람에 이용할 수 있을 정도로 안전하게 약독화된다.
본 발명의 다른 특징 및 이점들은 이하의 상세한 설명, 도면, 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.
본 발명은 플라비바이러스에 의해 발병된 질병에 대한 백신으로 이용가능한 감염성인, 약독화된 바이러스(infectious, attenuated viruses)에 관계한다.
도 1은 본 발명의 황열/일본 뇌염(YF/JE) 바이러스의 제조를 위해 수행된 유전자 조작 단계들의 개략도이다.
도 2는 인체용 백신의 제조에 이용가능한 세포 컬처에서의 본 발명의 키메라 YF/JE 바이러스들의 한 벌의 성장곡선이다.
도 3은 MRC-5 세포들에서 RMS(Research Master Seed, YF/JE SA14-14-2)와 YF-Vax의 성장을 비교한 그래프도이다.
도 4는 본 발명의 키메라 YF/JE 바이러스를 가지고 수행한 마우스 신경독성 분석 결과를 도시한 그래프 및 표이다.
도 5는 키메라 YF/DEN-2 바이러스의 제조를 위한 두 가지 플라스미드 시스템의 개략도이다. 이러한 방법은 키메라 YF/JE 바이러스에 대해서 설명된 대로이다.
도 6은 NS1 단백질의 부분들이 결실되어 있고/있거나 내부 리보좀 진입 부위(IRES; internal ribosome entry site)의 조절하에 있는 외래 단백질들을 발현하도록 설계된 변형된 YF 클론들의 개략도이다. 도면은 바이러스 게놈의 E/NS1 영역만을 도시한 것이다. 해독 종결 코돈(translational stop codon)은 엔벨로프(E) 단백질의 카복시 말단에 도입된다. 하류쪽으로의 해독은 IRES 1에 의해 유전자간 개방 리딩 프레임(ORF)내에서 시작되어 외래 단백질(예컨대, HCV 단백질들 E1 및/또는 E2)을 발현시킨다. 제 2 IRES(IRES-2)는 그 안에 포함된 트룬케이션된 NS1 단백질들(예컨대, NS1del-1, NS1del-2, 또는 NS1del-3)이 발현되는 YF 비구조 영역의 해독 개시를 제어한다. NS1 결실의 크기는 IRES-1에 링크된 ORF의 크기에 반비례한다.
도 7은 YF/JE SA14-14-2 키메라 백신에 의해 면역화된 마우스의 중화 항체 반응를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 플라비바이러스 감염에 대한 예방접종에 이용될 수 있는 키메라 플라비바이러스를 제공한다. 황열 바이러스와 일본뇌염바이러스(JE), 뎅그 타입 1-4(DEN 1-4), 머레이 밸리 뇌염(MVE), 성 루이스 뇌염(SLE), 웨스트 나일(WN), 진드기매개뇌염(TBE), 및 C형 간염 바이러스(HCV)의 키메라와 같은 본 발명의 키메라 바이러스의 구성 및 분석에 대해서 설명한다.
플라비바이러스 단백질들은 하나의 긴 개방 리딩 프레임(즉, 구조단백질, 캡시드(C), 프리-멤브레인(pr-M) 및 엔벨로프(E) 및 비구조 단백질들을 코드화하는)의 해독과 해독후의 일련의 복잡한 단백질 분해성 절단(post-translational proteolytic cleavage)에 의해 제조된다. 후술하는 바와 같은, 본 발명의 키메라 플라비바이러스들은 하나의 플라비바이러스의 pr-M 및 E 단백질들이 다른 플라비바이러스의 pr-M 및 E 단백질들로 대체된 것들을 포함한다. 따라서, 이들 키메라 플라비바이러스들의 제조과정은 두 가지 상이한 플라비바이러스들의 캡시드 및 프리-멤브레인 단백질들과 엔벨로프 단백질 및 비구조 영역(NS1) 사이의 신규한 접합의 형성시키는 과정을 포함한다. 이러한 세트의 단백질들(C와 pr-M, 및 E와 NS1)의 각각의 절단은 플라비바이러스의 본래의 단백질분해성 프로세싱 중에 일어나고, 절단 부위의 접합부 옆에 인접하는 신호서열들(signal sequences)의 존재를 필요로 한다.
본 발명의 키메라 플라비바이러스에서, 키메라를 구성하는 신호서열들은 실질적으로 유지되어, C와 pr-M, 및 E와 NS1 단백질들 사이의 적당한 절단이 효과적으로 일어날 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 신호서열들은 후술하는 키메라들에서 그대로 유지된다. 그렇지 않으면, 공지의 무수한 신호서열들 가운데 임의의 것이 키메라의 C와 pr-M, 또는 E와 NS1 단백질들을 연결하도록 유전자조작되거나(예컨대, von Heijne, Eur. J. Biochem. 133:17-21, 1983, von Heijne, J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985 참조) 또는 예를 들어, 공지의 지도용 서열을 이용하여, 당업자들은 본 발명의 키메라 제조에 이용될 수 있는 추가의 신호서열들을 설계할 수 있을 것이다. 전형적으로, 예를 들어, 신호서열은 그의 마지막 잔기로 알라닌, 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 또는 글루타민과 같은, 작은 비하전 측쇄(uncharged side chain)를 갖는 아미노산을 포함할 것이다. 신호서열의 다른 요구조건은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다(von Heijne, 1983, 상술한 문헌; von Heijne. 1985, 상술한 문헌 참조). 또한, 키메라를 구성하는 두 바이러스들의 신호서열들은 그대로 유지되거나 거의 그대로 유지되어 적당한 절단을 유발할 수 있다.
YF/JE 키메라 바이러스의 제조를 위한 cDNA 주형의 구성
본 발명의 YF/JE 키메라들을 위한 전체-길이 cDNA 주형들(full-length cDNA templates)은 앞선 연구자들이 YF 복제의 분자유전학적 분석을 위해 cDNA로부터 YF17D를 재생하는데 이용하였던 것과 유사한 방법을 이용하여 제조하였다. 이러한 방법은 예컨대, Nestorowicz 등(Virology 199:114-123, 1994)에 설명되어 있다.
간단하게 설명하면, 본 발명의 YF/JE 키메라들은 다음과 같은 방법에 의해 만들 수 있다. YF 게놈 서열들을 두 개의 플라스미드(YF5'3'IV 및 YFM5.2)내에서 증식시키는데, 이들은 뉴클레오티드 1-2,276 및 8,279-10,861(YF5'3'IV)로부터의 서열과 1,373-8,704(YFM5.2)로부터의 서열을 코드화한다.(Rice et al., The New Biologist 1:285-296, 1989). 전체 길이 cDNA 주형들은 이러한 플라스미드들로부터 유래된 적당한 제한 단편들을 리게이션함으로써 생성한다. 이러한 방법은 YF 서열의 안정한 발현 및 고도의 특이성 감염력을 갖는 RNA 전사체의 생성을 보장하는 가장 신뢰할만한 방법이다.
본 발명의 키메라 구성 전략은 YF5'3'IV 및 YFM5.2 플라스미드들내에서의 YF 서열들을 prM 단백질(뉴클레오티드 478, 아미노산 128)의 시작부분부터 E/NS1 절단 부위(뉴클레오티드 2,452, 아미노산 817)까지의 대응하는 JE 서열로 대체하는 과정을 포함한다. JE cDNA의 클로닝 이외에, 생체외 리게이션(in vitro ligation)이 가능하도록 YF 및 JE 서열들 양자에 제한부위들을 도입 또는 제거하기 위해 몇몇 단계를 더 거쳐야 한다. 키메라 YF(C)/JE(prM-E) 바이러스의 재생을 위한 주형의 구조를 도 4에 도시하였다. 전체 JE 구조 영역(C-prM-E)을 코드화하는 제 2의 키메라를 유사한 방법을 이용하여 유전자조작하였다.
JE 바이러스 구조 영역의 분자 클로닝
진정한 JE 구조 단백질 유전자들의 클론들을 JE SA14-14-2 균주(생존한 JE, 약독화된 백신 균주)로부터 생성하였는데, 이러한 균주들의 생물학적 특성 및 분자적 특성이 문헌상에 잘 설명되어 있기 때문에 이러한 균주를 이용하였다(예컨대, Eckels et al., Vaccine 6:513-518, 1988 참조; JE SA14-14-2 바이러스들은 콜로라도주의 포트 콜린스 소재의 질병 구제 센터 또는 미국내에서 아르보바이러스에 대해 세계 보건 기구가 지정한 참고기관인 코네티컷주, 뉴헤븐, 예일 대학, 예일 아브로바이러스 연구부로부터 수득할 수 있다). 계대 레벨 PDK-5인 JE SA14-14-2 바이러스를 수득하여 LLC-MK2세포에서 계대배양하여 충분한 양의 cDNA 클로닝을 위한 바이러스를 수득하였다. 우리가 사용한 이러한 방법은 NheI 부위(JE 뉴클레오티드 1,125)에서 중첩되는 두 개의 조각들에 있는 구조 영역을 클로닝하는 과정을 포함하는데, 이러한 구조 영역은 이어서 생체외 리게이션에 이용될 수 있다.
감염된 LLC-MK2세포 단층으로부터 RNA를 추출하고 각각 처음에 pBluescript Ⅱ KS(+)내로 클로닝되고나서 이어서 YFM5.2(NarⅠ)내로 클로닝되는데 필요한 XbaⅠ 및 NarⅠ 제한부위를 포함하는 네거티브 센스 프라이머(JE 뉴클레오티드 서열 2,456-71)를 가지고 역전사효소에 의해 네거티브 센스 cDNA의 제 1 가닥을 합성하였다. 제 1 가닥 cDNA 합성에 이어서 동일한 네거티브 센스 프라이머 및 각각 pBluescript 및 YFM5.2(NarⅠ)내로 클로닝되는데 필요한 XbaⅠ 및 NsiⅠ 제한부위를 포함하는 포지티브 센스 프라이머(JE 뉴클레오티드 서열 1,108-1,130)를 이용하여 JE 서열의 뉴클레오티드 1,108-2,471을 PCR 증폭시켰다. JE 서열들을 제한효소절단 및 뉴클레오티드 서열결정에 의해 확인하였다. 뉴클레오티드 1부터 1,130까지의 JE 뉴클레오티드 서열은 양자 모두 EcoRⅠ 제한부위를 포함하는, JE 뉴크레오티드 1,116 내지 1,130에 해당하는 네거티브 센스 프라이머 및 JE 뉴클레오티드 1부터 18까지에 해당하는 포지티브 센스 프라이머를 이용하여 네거티브 가닥 JE cDNA의 PCR 증폭에 의해 수득하였다. PCR 단편들을 pBluescript내에 클로닝하고 JE 서열들을 뉴클레오티드 서열결정에 의해 확인하였다. 이것은 뉴클레오티드 1-2,471(아미노산 1-792)의 JE 서열의 클로닝을 의미한다.
YF5'3'IV/JE 및 YFM5.2/JE 유도체들의 구성
JE 엔벨로프 단백질의 C 말단을 YF E/NS1 절단부위에 삽입하기 위해, E/NS1 절단부위(YF 뉴클레오티드 2,447-2,452, 아미노산 816-817)에 있는 시그널라제 서열(signalase seaquence)의 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발에 의해 유일한 NarⅠ제한부위를 YFM5.2 플라스미드내에 도입하여 YFM5.2(NarⅠ)를 만들었다. 이와 같이 변형된 주형으로부터 획득된 전사체들을 감염력에 대해 체크해 본 결과 모주형(parental template)과 유사한 특이적 감염력(약 100 플라크-형성 단위/250 나노그램의 전사체)을 제공하였다. 뉴클레오티드 서열 1,108 내지 2,471의 JE 서열을 유일한 NsiⅠ 및 NarⅠ 제한부위를 이용하여 몇몇의 개별적인 pBluescript/JE의 PCR-유래 클론들로부터 YFM5.2(NarⅠ)내로 2차클로닝하였다. JE prM-E 영역에 인접한 YF5' 비해독 영역(뉴클레오티드 1-118)을 포함하는 YF5'3'IV/JE 클론들을 PCR 증폭에 의해 수득하였다.
YF 캡시드와 JE prM의 접합부(junction)를 포함하는 서열을 구하기 위해, 이러한 영역에 걸쳐 있는 네거티브 센스 키메라 프로모터를 YF5'3'IV 뉴클레오티드 6,625-6,639에 해당하는 포지티브 센스 프라이머와 함께 이용하여 PCR 단편을 만들고, 이어서 이것을 EcoRⅠ 부위 상류의 pBluescript 벡터 서열과 상보적인 포지티브 센스 프라이머와 함께 네거티브 센스 PCR 프라이머로 이용하여, JE 서열(pBluescript 벡터내에서 역방향으로 코드화되어 있는)을 뉴클레오티드 477(prM 단백질의 N-말단)로부터 뉴클레오티드 1,125의 NheⅠ부위까지 증폭시켰다. 그 결과로 수득된 PCR 단편들을 NotⅠ 및 EccoRⅠ 제한부위를 이용하여 YF5'3'IV 플라스미드내에 삽입하였다. 이러한 구조체는 그 다음에 YF(C) JE(prM-E) 서열이 이어지는 YF 5'비해독 영역 보다 앞선 SP6 프로모터를 포함하고, 생체외 리게이션에 필요한 NheⅠ부위(JE 뉴클레오티드 1,125)를 포함한다.
생체외 리게이션을 위한 제한부위를 포함하도록 하는 YFM5.2 및 YF5'3'IV/JE의 유전자조작
JE 엔벨로프 서열내의 NheⅠ 부위를 5' 생체외 리게이션 부위(in vitro ligation site)로 이용하기 위해서, YFM5.2 플라스미드내에 있는 많은 NheⅠ 부위(뉴클레오티드 5,459)를 제거하였다. 이러한 과정은 뉴클레오티드 5,461에서의 YF에서의 침묵 돌연변이(silent mutation)(T→C; 알라닌, 아미노산 1820)에 의해 행하였다. 이러한 부위를 적당한 제한단편들을 리게이션함으로써 YFM5.2내에 통합시켜 키메라 YF/JE 서열을 코드화하는 NsiⅠ/NarⅠ 단편의 교환에 의해 YFM5.2/JE(NarⅠ)내에 도입시켰다.
생체외 리게이션을 위한 유일한 3' 제한부위를 만들기 위해, BspEⅠ 부위를 보통 YF5'3'IV 및 YFM5.2로부터의 전체 길이 주형을 만드는데 이용되는 AatⅡ 부위의 하류에 유전자조작하였다. (JE 구조 서열들에는 많은 AatⅡ 부위들이 존재하므로, 생체외 리게이션을 위해 이러한 부위를 이용할 수 없다). BspEⅠ 부위를 YF 뉴클레오티드 8,581(A→C; 세린, 아미노산 2,860)의 침묵 돌연변이에 의해 만들어 적당한 제한단편의 교환에 의해 YFM5.2내에 도입하였다. 유일한 부위를 XbaⅠ/SphⅠ 단편의 교환에 의해 YFM5.2/JE내에 통합시키고, 모플라스미드(parental plasmid) 및 뉴클레오티드 1과 6,912의 EcoRⅠ 부위들 사이의 YF 서열이 결실된 YFM5.2(BspEⅠ)의 유도체로부터의 적당한 제한단편들의 3-피스 리게이션에 의해 YF5'3'IV/JE(prM-E) 플라스미드내에 도입하였다.
JE 나카야마 cDNA의 YF/JE 키메라 플라스미드로의 교환
PCR-유래 JE SA14-14-2 구조 영역이 키메라 바이러스에서도 적당하게 기능하는지 확실하지 않기 때문에, 우리들은 발현 실험에서 특성이 많이 규명되어 있고 보호면역을 유발하는 능력이 잘 확인된 JE 나카야마 균주의 클론으로부터의 cDNA를 이용하였다(예컨대, McIda et al., Virology 158:348-360, 1987 참조; JE 나카야마 균주는 콜로라도주의 포트 콜린스 소재의 질병 구제 센터 또는 코네티컷주, 뉴헤븐, 예일 대학, 예일 아브로바이러스 연구부로부터 수득할 수 있다). 생체외 리게이션을 위한 NheⅠ 부위를 이용하기 위해 그대로 남겨두는, 위치 49에 있는 하나의 아미노산, 세린을 제외하고 두 개의 플라스미드 시스템들내에 있는 전체 prM-E 영역을 대체하기 위해서, 이용가능한 제한부위들(HindⅢ 내지 PvuⅡ 및 BpmⅠ 내지 MunⅠ)을 이용하여 YF/JE 키메라 플라스미드들내에 나카야마 cDNA를 삽입하였다. 나카야마 클론내의 전체 JE 영역을 서열결정하여 대체된 cDNA가 진정한 것인지를 확인하였다(표 2).
전체 길이 cDMA 주형, RNA 트랜스펙션, 및 감염성 바이러스의 회수
전체 길이 cDNA 주형들의 제조방법은 기본적으로 라이스 등에 의해 설명된 방법대로 실시하였다(The New Biologist 1:285-96, 1989)(도 1 참조). 키메라 주형의 경우에, 플라스미드 YF5'3'IV/JE(prM-E)와 YFM5.2/JE를 NheⅠ/BspEⅠ으로 절단하고 T4 DNA 리가제의 존재하에서 50 나노그램의 정제된 단편들을 이용하여 생체외 리게이션을 행하였다. 리게이션된 생성물을 XhoⅠ으로 선형으로 만들어 런-오프 전사(run-off transcription)되도록 하였다. SP6 전사체들을 50 나노그램의 정제된 주형을 이용하여 합성하고3H-UTP의 혼입에 의해 정량하고, RNA가 완전한지 비변성 아가로스 겔 전기영동(non-denaturating agarose gel electrophoresis)에 의해 확인하였다. 수율 범위는 이러한 방법을 이용하는 반응당 5부터 10 마이크로그램 RNA의 범위이었고, 이들 대부분은 전체-길이 전사체로 존재하였다. 양이온성 리포좀들의 존재하에서의 RNA 전사체들의 트랜스펙션을 YF17D에 대해 라이스 등(상술한 문헌)에 의해 설명된 방법대로 행하였다. 최초 실험에서, LLC-MK2세포들을 트랜스펙션 및 바이러스의 정량을 위해 이용하였는데, 이는 우리가 YF 및 JF의 모균주의 복제 및 플라크 형성에 대한 허용가능성을 확인하였기 때문이다. 표 1에 리포펙틴(GIBCO/BRL)을 트랜스펙션 비히클로 이용한 트랜스펙션 실험의 전형적인 결과를 나타내었다. 베로 세포주(Vero cell lines)들도 감염성 바이러스 스톡의 제조, 표지된 단백질의 특성규명, 및 중화 시험에 이용되어 왔다.
키메라 cDNA 주형들의 뉴클레오티드 서열결정
키메라 YF/JE cDNA를 포함하는 플라스미드들을 클론들의 JE 부분의 서열분석을 행하여 SA14-14-2 및 나카야마 엔벨로프 단백질의 정확한 서열을 확인하였다. 이러한 구조체들 사이의 보고된 서열(McAda 등의 상순한 문헌)에 대한 뉴클레오티드 서열 차이를 표 2에 나타내었다.
키메라 YF/JE 바이러스들의 구조 및 생물학적 특성 규명
트랜스펙션 실험으로부터 회수된 키메라 YF/JE 바이러스들의 게놈 구조를 감염된 세포 단층으로부터 회수된 바이러스 RNA의 RT/PCR-기초 분석에 의해 확인하였다. 이러한 실험들은 바이러스 스톡들이 트랜스펙션 과정중에 오염될 가능성을 배제하기 위해 행하였다. 이러한 실험에서, 잔여 트랜스펙션된 바이러스 RNA의 존재에 의해 생성된 인공물을 제거하기 위해, 제 1 계대 바이러스를 이용하여 감염 사이클을 시작하였다. YF/JE(prM)-SA14-14-2 또는 YF/JE(prM-E)-나카야마 키메라에 의해 감염된 세포들의 전체 RNA 추출물을 약 1 킬로베이스 크기의 두 개의 PCR 생성물로서 전체 구조 영역의 회수를 가능하게 하는 YF 및 JE-특이성 프라이머들을 이용하여 RT/PCR하였다. 이어서 이러한 생성물들을 이들 바이러스들의 구별을 가능하게 하는 JE SA14-14-2 및 나카야마 서열내에 있는 추론 부위(predicted site)를 갖는 제한효소절단에 의해 분석하였다. 이러한 접근방법에 의해, 바이러스 RNA는 키메라임이 확인되었고 회수된 바이러스들은 적당한 제한부위들을 갖는 것으로 입증되었다. 실제 C-prM 경계는 키메라 YF/JE C-prM 접합부 전반에 대한 사이클 서열 분석(cycle sequence analysis)에 의해 서열 레벨에서 완전한 것으로 확인되었다.
상기 두 키메라내의 JE 엔벨로프 단백질의 존재는 JE-특이성 항혈청에 의한 면역침강 및 YF 및 JE-특이성 항혈청을 모두 이용한 플라크 감소 중화 시험에 의해 확인하였다. 키메라에 의해 감염된 LLC-MK2세포의35S-표지된 추출물의 JE E 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 면역침강분석 결과, JE 엔벨로프 단백질은 55kD 단백질로 회수될 수 있는 반면에, 동일한 항혈청은 YF-감염된 세포들의 단백질은 면역침강시키지 못하는 것으로 나타났다. JE 및 YF 고도면역 혈청은 두 엔벨로프 단백질에 대해 교차반응성을 나타냈지만, 단백질들 사이의 크기 차이(YF=53 kD, 비포도당화; JE=55kD, 포도당화)는 반복재현적으로 관찰될 수 있다. YF 단클론 항체의 이용은 면역침강 조건하에서는 바람직하지 않았기 때문에, 이러한 분석에서 특이성은 JE 단클론 항체에 의존하였다. 플라크 감소 중화 시험(PRNT; plaque reduction neutralization testing)을 YF 및 JE-특이성 고도면역 복수액(ATCC) 및 YF-특이성 정제된 IgG(단클론 항체 2E10)를 이용하여 키메라 바이러스 및 YF와 JE SA14-14-2 바이러스에 대해서 행하였다. 이들 실험에서 대조군 바이러스와 비교할 때, 키메라의 경우에는 이들 항혈청들의 50% 플라크 감소 역가상에 현저한 차이가 관찰되었다(표 3). 따라서, 중화에 필요한 에피톱들은 감염성 키메라 YF/JE 바이러스들에서 발현된다.
세포 컬처에서의 성장 특성
키메라들의 성장능력을 영장류 및 모기 기원의 세포주에서 정량적으로 조사하였다. 도 2는 낮은 감염중복도(0.5 플라크-형성 단위/세포)로 감염시킨 후의 LLC-MK2세포들상에서의 키메라들의 누적 성장 곡선을 도시한 것이다. 이 실험에서, YF5.2IV(클로닝된 유도체)와 JE SA14-14-2(클로닝되지 않은) 바이러스들을 비교를 위해 사용하였다. 양자의 키메라 바이러스들은 양자의 모 바이러스에 비해 대략 1 로그 만큼 높은 최대 바이러스 수율을 달성하였다. YF/JE SA14-14-2 키메라의 경우에, 최대 바이러스 생산은 YF/JE 나카야마 키메라 보다 12시간 뒤에 일어났다(50시간 대 38시간). YF/JE 나카야마 키메라는 이러한 세포주들에 대해 YF/JE SA14-14-2 키메라 보다 훨씬 강한 세포변성 효과(cytopathic effect)를 시현하였다. 유사한 실험을 낮은 감염중복도로(0.5 플라크-형성 단위/세포) 감염시킨 이후에 C6/36 세포들에 대하여 행하였다. 도 2는 이러한 무척추 세포주에서 바이러스들의 성장 카이네틱(growth kinetics)을 설명한 것이다. 이러한 실험에서 회수된 바이러스들에 대한 모든 점에서 유사한 바이러스 수율이 얻어졌는데, 이러한 사실은 바이러스들이 복제 효율(replication efficiency)면에서 손상을 받지 않는다는 생각을 입증해 준다.
MRC-5 세포에서 RMS(YF/JE SA14-14-2)와 YF17D 백신의 성장 카이네틱의 비교
사람 백신으로 허용가능한 세포주내에서 백신 후보들의 증식능력을 평가하기 위한 실험을 행하였다. 시판되는 황열 17D 백신(YF-Vax)을 펜실베니아 스위프워터, 코노트 레보라토리스로부터 수득하였다. MRC-5(2배체 사람 태아 폐세포)를 ATCC(171-CCL. Batch#:F-14308, 계대 18)로부터 구매하여 1.5g/L 중탄산나트륨, 0.1mM 비필수 아미노산들, 및 10% FBS를 포함하도록 조정된 EMEM, 2 mM L-Gln, Earle's BBS내에서 생장시켰다.
RMS(Research Master Seed, YF/JE SA14-14-2)와 YF-Vax의 성장 카이네틱을 비교하기 위해, 세포들을 90% 컨플루언시로 배양하여 RMS 및 YF-Vax로 0.1 pfu의 MOI로 감염시켰다. MRC-5 세포들은 일반적으로 천천히 성장하기 때문에, 이들 세포들을 접종후 10일간 유지하였다. 샘플들을 7-10일 동안 매일 냉동시켜 감염력을 Vero 세포에서의 플라크 분석에 의해 측정하였다.
YF-Vax와 YF/JE 키메라는 MRC-5 세포에서 적당한 역가로 성장하였다(도 3). 최대 역가는 YF-Vax의 경우는 제 2일에 도달한 ∼4.7log10pfu이었고, RMS의 경우는 6일후 약간 낮은, 4.5log10pfu이었다.
정상인 성체 마우스에서의 신경독성 시험
YF/JE SA14-14-2 키메라의 발병력(virulence)을 대뇌내 접종에 의해 젊은 성체 마우스에서 분석하였다. 10 마우스들의 그룹(4주령의 수컷 및 암컷 ICR 마우스, 각 그룹당 5마리씩)에 10,000 플라크-형성 단위의 YF/JE SA14-14-2 키메라, YF5.2iv 또는 JE SA14-14-2를 접종하고 매일 3주 동안 관찰하였다. 이들 실험의 결과를 도 4에 나타내었다. YF5.2iv 모균주를 접종받은 마우스들은 접종후 약 1주일에 사멸하였다. JE SA14-14-2 모균주 또는 키메라를 접종받은 마우스들 사이에서는 치사 또는 발병이 관찰되지 않았다. 실험에 이용된 접종물은 주사시에 정량하였고 생존한 마우스들의 서브그룹에 대해 중화 항체(neutralizing antibodies)들이 존재하는지 시험하여 감염이 되었는지 여부를 확인하였다. 시험된 것들중에서, JE SA14-14-2 바이러스에 대한 역가들은 이러한 균주 또는 키메라 균주를 접종받은 동물들 사이에서 유사하였다.
마우스에서의 YF/JE SA14-14-2 키메라의 신경독성을 조사하는 추가 실험 결과를 표 4에 나타내었다. 이 실험에서, YF5.2iv를 접종받은 모든 마우스들을 7-8일 이내에 모두 사망하였다. 이와 대조적으로, YF/JE SA14-14-2를 접종받은 마우스들은 어떤 것도 감염후 2주간의 관찰기간 동안 죽지 않았다.
YF/JE 키메라들의 신경침입성 및 병원성을 조사하기 위한 실험 결과를 표 5에 나타내었다. 이 실험에서는, 키메라 바이러스들을 3주령의 마우스들에게 10,000과 백만 pfu 사이의 다양한 도스로 복강내 경로를 통해서 접종하였다. YF/JE 나카야마 또는 YF/JE SA14-14-2에 의해 접종된 어떠한 마우스들도 3주간의 감염후 관찰기간내에 죽지 않았는데, 이러한 사실은 바이러스들이 말초 접종후 병을 일으킬 수 없었다는 것을 가리킨다. YF/JE SA14-14-2에 의해 접종된 마우스들은 JE 바이러스에 대해서 중화 항체를 형성하였다(도 7).
황열/뎅그(YF/DEN) 키메라 바이러스의 생성을 위한 cDNA 주형의 구성
황열/뎅그(YF/DEN) 키메라 바이러스들은 다음과 같이 제작하였는데,원칙적으로 상술한 YF/JE 키메라의 제조시와 동일한 방법에 따라 제작하였다. 다른 플라비바이러스 키메라들은 천연 또는 유전자조작된 부위를 이용하고 예컨대, 표 6에 기재된 것과 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 이용하여 유사한 방법으로 유전자조작될 수 있다.
YF/DEN 키메라 바이러스의 구성
뎅그 바이러스들에 대한 몇몇 분자 클론들이 개발되어 왔지만, 일반적으로 플라스미드 시스템내에서의 바이러스 cDNA의 안정성 및 회수된 바이러스들의 복제 효율이 문제가 되어 왔다. 본 발명자들은 오스트레일리아의 클레이톤 소재의 모나쉬 대학의 분자생물학과 피터 라이트 교수에 의해 개발된 DEN-2 클론을 선택하여 사용하였다. 이러한 시스템은 바이러스의 재생에 비교적 효율적이고 우리가 사용하는 방법과 유사하게 2-플라스미드 시스템을 이용하기 때문에 상기 시스템을 사용하였다. 이러한 DEN-2 클론의 완전한 서열을 입수할 수 있고 YF 클론들을 약간만 변형하면 되기 때문에, 키메라 YF/DEN 주형들의 구성도 용이해진다. 이하에서 관련 단계들을 설명한다.
YF5.2iv 및 YF/JE 바이러스들에 대한 두 플라스미드 시스템과 마찬가지로, YF/DEN 시스템도 두 플라스미드(이하에서 YF5'3'IV/DEN(prM-E') 및 YFM5.2/DEN(E'-E)라 한다)내의 구조 영역(prM-E)을 증식시키기 위한 중지점으로 DEN-2 엔벨로프 단백질(E)내에 있는 유일한 제한부위를 이용한다(도 5 참조). 키메라 주형의 생체외 리게이션을 위한 두 개의 제한부위들은 AatⅡ와 SphⅠ이다. DEN E 단백질 서열의 3' 부분에 대한 수용 플라스미드는 YFM5.2(NarⅠ[+]SphⅠ[-])이다. 이러한 플라스미드는 E/NS1 접합부에 NarⅠ 부위를 포함하는데, 이것은 JE E 단백질의 카르복시 말단을 삽입하는데 이용된다. 그것은 침묵 부위-지정 돌연변이유발(silent site-directed mutagenesis)에 의해 NS1 단백질 영역에 있는 여분의 SphⅠ 부위를 제거함으로써 더 변형된다. 이것은 단순 방향 클로닝(simple directional cloning)에 의해 유일한 SphⅠ 부위부터 NarⅠ 부위까지의 DEN-2 서열의 삽입을 가능하게 한다. DEN-2 cDNA의 적당한 단편을 라이트 박사로부터 제공받은 DEN-2 클론 MON310으로부터 PCR에 의해 만들었다. PCR 프라이머들은 SphⅠ 부위에 플랭킹하는 5' 프라이머와 E/NS1 접합부에 있는 시그널라제 부위의 직상류에 있는 DEN-2 뉴클레오티드들과 상동이고 시그널라제 부위를 신규한 부위를 만드는 치환에 의해 대체하고 NarⅠ를 도입하는 3' 프라이머를 포함하였다. 이어서 이렇게 해서 수득된 1,170 염기쌍 PCR 단편을 YFM5.2(NarⅠ[+]SphⅠ[-])에 도입하였다.
E 단백질의 prM 및 아미노 말단 부분을 포함하는 DEN-2 클론의 5' 부분을 키메라 PCR 프라이머를 이용하여 YF5'3'IV 플라스미드내에 유전자조작하였다. 네거티브-센스 YF C 단백질의 3' 말단 및 DEN-2 prM 단백질의 5' 말단을 결합시킨 키메라 프라이머를 YF5'3'IV 플라스미드의 SP6 프로모터에 플랭킹하는 포지티브-센스 프라이머와 함께 이용하여 DEN-2 prM 서열인 20 염기 연장부를 갖는 771 염기쌍 PCR 생성물을 생성하였다. 이어서 이러한 PCR 생성물을 DEN-2 서열 1,501-1,522이고 SphⅠ에 플랭킹하는 3' 프라이머와 함께 이용하여 DEN-2 플라스미드를 프라이밍하여 DEN-2 prM-E1522 서열에 인접한 YF 서열의 NotⅠ 부위 내지 SP6 프로모터, YF5' 비해독 영역, 및 YF C 단백질을 포함하는 1,800 염기쌍 최종 PCR 생성물을 만들었다. 이러한 PCR 생성물을 NotⅠ 및 SphⅠ 부위를 이용하여 YF5'3'IV에 리게이션시킴으로써 YF5'3'IV/DEN(prM-E) 플라스미드를 만들었다.
다른 플라비바이러스에 대한 키메라 주형의 구성
키메라 YF/MVE, YF/SLE, YF/WN, YF/TBE 바이러스들을 코드화하는 전체-길이 cDNA 주형의 제작 방법은 YF/DEN-2 시스템과 관련하여 위에서 설명한 것과 유사하다. 표 6에 YF17D-기반 키메라 바이러스들의 제작방법의 특징을 나타내었다. 생체외 리게이션을 위해 사용되는 유일한 제한부위 및 C/prM 및 E/NS1 접합부의 유전자조작을 위한 키메라 프라이머들도 함께 나타내었다. 이러한 이종 플라비바이러스들의 cDNA들은 쉽게 구할 수 있다(MVE: Dalgarno et al., J.Mol.Biol. 187:309-323, 1986; SLE:Trent et al., Virology 156:293-304, 1987; TBE:Mandl et al., Virology 166:197-205, 1988; Dengue 1:Mason et al., Virology 161:262-267, 1987; Dengue 2:Deubel et al., Virology 155:365-377, 1986; Dengue 3: Hahn et al., Virology 162:167-180, 1988; Dengue 4: Zhao et al., Virology 155:77-88, 1986).
추가의 키메라 바이러스들의 유전자조작을 위한 다른 방법은 C/prM 접합부에서 만나는 말단부 및 YF5'3'IV 또는 pBS-KS(+)와 같은 중간 플라스미드내에 도입하기에 적합한 제한부위들에 플랭킹하는 5' 및 3' 말단을 갖는 PCR-유래 제한단편들의 평활말단 리게이션(blunt end ligation)에 의해 C/prM 접합부를 만드는 것이다. 문제의 바이러스의 엔벨로프 단백질 코드화 영역내에 있는 유일한 제한부위의 이용가능성에 따라, 키메라 올리고뉴클레오티드 또는 평활말단 리게이션을 선택적으로 이용할 수 있다.
HCV 항원들을 코드화하는 YF 바이러스들의 구성
HCV의 구조단백질 E1 및 E2는 상술한 플라비바이러스들의 구조단백질과 상동이 아니기 때문에, 이러한 단백질들을 발현시키는 방법은 게놈의 비필수 영역내에 삽입시켜 이들 단백질들 모두가 감염된 세포에서 바이러스 복제중에 황열 단백질들과 함께 발현되도록 하는 과정을 포함한다. 단백질의 삽입을 위한 표적이 되는 영역은 NS1 단백질의 N 말단 부분인데, 이것은 전체 NS1 단백질이 바이러스 복제에 요구되지 않기 때문이다. 게놈의 정상적인 크기(약 10,000 뉴클레오티드) 보다 큰 이종 서열의 존재하에서의 YF 게놈의 안정성이 문제될 가능성이 있기 때문에, 후술하는 검출 방법을 이용할 수 있다. 또한, NS1의 결실은 상술한 키메라 YF/플라비바이러스 시스템에 유리할 수 있는데, 이러한 단백질의 부분적인 결실이 NS1에 대한 항체와 관련된 YF에 대한 면역성을 제거하여, 주어진 수용주에서 하나 이상의 키메라 백신이 필요하거나 또는 YF 백신이 과거에 투여된 적이 있거나 장차 필요로 하게 될 경우 벡터 면역에 의한 문제를 피할 수 있기 때문이다.
본 방법은 YFM5.2 플라스미드의 NS1 코드화 영역내에 일련의 인-프레임 결실들(in-frame deletions)을 만드는 과정 및 E의 말단 및 일련의 두 개의 IRES(internal ribosome entry sites)에 해독 종결 서열을 유전자조작하는 과정을 포함한다. 하나의 IRES는 종결코돈의 직하류에 존재하여 E와 NS1 사이의 영역에서 하나의 리딩 프레임의 발현을 가능하게 한다. 제 2의 IRES는 트룬케이션된 NS1 단백질로부터 해독을 개시하여, YF 비구조 폴리프로테인의 나머지들의 발현을 제공한다. 이러한 유도체들을 감염성 바이러스의 회수에 대하여 시험하고 가장 많이 결실된 구조체를 제 1 IRES내에 외래 서열(예컨대, HCV 단백질)을 삽입하는데 이용하였다. 이러한 특수한 구조체는 NS1의 결실이 상술한 prM-E를 발현하는 YF/플라비바이러스 키메라 바이러스들의 경우에 있어서 벡터-특이성 면역에 영향을 미치는지를 조사하는데 기초로 이용될 수도 있다.
E1, E2 및/또는 E1 플러스 E2 HCV 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드의 삽입은 NS1 단백질에서 관용되는 결실의 크기에 의해 제한된다. 이 때문에, 트룬케이션된 HCV 단백질들이 변형된 YF 클론내에서의 안전성을 향상시키기 위해 이용될 수 있다. HCV 단백질들은 IRES 바로 다음에 있는 N-말단 신호서열을 갖고 C-말단에 종결코돈을 갖도록 유전자조작된다. 이러한 구조체는 HCV 단백질을 세포로부터의 분비를 위해 내형질세망으로 유도할 것이다. 이러한 구성 방법을 도 6에 개략적으로 나타내었다. 유전자형 Ⅰ의 HCV 단백질을 코드화하는 플라스미드들은 이러한 구성에 이용될 수 있는데, 예를 들어, 이러한 바이러스의 영역을 프로세스 시스템내 및 복제-컴플리턴트 전체-길이 HCV 클론에서 발현시킨 워싱턴 대학의 찰스 라이스 박사(Grakoui et al., J. Virology 67:1385-1395, 1993)로부터 수득한 HCV 바이러스가 이용될 수 있다.
플라비바이러스에 대한 약독화 백신 후보로서의 prM 절단 결실 돌연변이체들
본 발명에 포함되는 추가의 키메라 바이러스들은 prM 절단부위내의 돌연변이와 같은 prM 절단을 방해하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, TBE, SLE 및 기타의 바이러스들과 같은 목적으로 하는 플라비바이러스 감염성 클론내의 prM 절단부위는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 돌연변이될 수 있다. 상술한 바와 같은, 절단부위내의 일부 또는 전체의 아미노산들이 결실되거나 치환될 수 있다. 이어서 돌연변이된 prM-E 유전자를 포함하는 핵산 단편은 상술한 방법을 이용하여 황열 바이러스 벡터내에 삽입될 수 있다. prM 결실은 예컨대, 황열 바이러스내에 삽입될 E 단백질내의 돌연변이와 같은 다른 약독화 돌연변이와 함께 또는 단독으로 이용될 수 있다. 이러한 돌연변이체들은 백신 후보로서 단일 치환 돌연변이체를 능가하는 이점을 갖는데, 왜냐하면 그것은 결실된 서열을 원상회복시키는 것 및 발병력을 회복하는 것은 불가능하기 때문이다.
본 발명의 후술하는 키메라 플라비바이러스들은 1998년 1월 6일에 부다페스트 조약의 규정에 따라 미국, 메릴랜드 록빌 소재의 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되었다: 키메라 황열 바이러스 17D/뎅그 타입 2 바이러스(YF/DEN-2; ATCC 수탁번호 ATCC VR-2593) 및 키메라 황열 바이러스 17D/일본뇌염 SA14-14-2 바이러스(YF/JE A1.3; ATCC 수탁번호 ATCC VR-2594).
YF/JE 키메라들의 특성규명
클론 수율(㎍) 감염력 플라크/100㎎ LLC-MK2 PBSlog 역가VERO RNAselog 역가VERO DNAselog 역가VERO
YF5.21v 5.5 15 7.2 0 7
YF/JE-S 7.6 50 6.2 0 6.2
YF/JE-N 7 60 5 0 5.4
JE 균주와 YF/JE 키메라들 사이의 서열 비교
바이러스 E E E E E E E E
107 138 176 177 227 243 244 279
JE SA 14 - 14-2 F K V T S K G M
YF/JESA14-14-2 F K V A S E G M
YF/JENAK L E I T P E E K
JE NAK L E I T P E E K
JE SA14 L E I T S E G K
YF/JE 키메라에서의 플라크 감소 중화 역가
바이러스 비면역 복수액 YF 복수액 JE 복수액 비-면역IgG YF IgG
YF5.2iv 〈1.3 3.7 〈1.3 〈2.2 〉4.3
JE SA 14-14-2 〈1.3 〈1.3 3.4 〈2.2 〈2.2
YF/JE SA 14 - 14-2 〈1.3 〈1.3 3.1 〈2.2 〈1.9
YF/JE나카야마 〈1.3 〈1.3 3.4 〈2.2 〈2.2
YF/JE SA14-14-2 키메라의 발병력(3주령 수컷 ICR 마우스)
log 도스 I.C. %사망률
YF5.2iv 4 100 (7/7)
YF/JE SA 14-14-2 4 0 (0/7)
YF/JE SA 14-14-2 5 0 (0/7)
YF/JE SA 14-14-2 6 0 (0/8)
YF/JE 키메라들의 발병력(3주령 수컷 ICR 마우스)
log 도스(복강내) %사망률
YF/JE 나카야마 4 0 (0/5)
YF/JE 나카야마 5 0 (0/4)
YF/JE 나카야마 6 0 (0/4)
YE/JE SA14-14-2 4 0 (0/5)
YF/JE SA14-14-2 5 0 (0/4)
YF/JE SA14-14-2 6 0 (0/4)
1,2: 컬럼은 C/pRM 또는 E/NS1 접합부에 상응하는 키메라 YF/플라비바이러스를 만드는데 이용되는 올리고뉴클레오티드를 나타낸 것이다(상세한 설명 참조). X=YF 캡시드의 카르복시 말단 코드화서열. 밑줄친 영역은 NarⅠ 부위의 직상류의 표적화된 이종 서열이다(안티센스-ccgcgg). 이 부위는 전체-길이 cDNA 주형의 제조에 필요한 YFM5.2(NarⅠ) 플라스미드내로 PCR 생성물을 삽입할 수 있게 한다. 다른 뉴클레오티드들은 이종 바이러스에 대해 특이적이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 열거하였다.
3,4: 전체-길이 키메라 cDNA 주형들의 생산을 위해 분리 및 생체외 리게이션될 수 있는 제한단편들의 생산에 이용되는 유일한 제한부위를 나타내었다. 일부 서열들은 편리한 부위를 포함하지 않기 때문에, 몇몇 경우에는 적당한 부위를 유전자조작에 의해 포함시켜야 한다(주석 5).
5: 괄호안에 기재한 것은 효과적인 생체외 리게이션을 위해 YF 골격 또는 이종 바이러스에서 만들어져야만 하는 제한효소부위를 나타낸다. 관호안에 있지 않은 부위들은 제거되어야만 한다. 이러한 모든 변형은 각각의 클론에 대한 cDNA의 침묵 돌연변이에 의해 이루어진다. 블랭크로 되어 있는 것은 cDNA 클론의 변형이 필요없는 것을 가리킨다.
기타의 구현예들
기타의 구현예들은 후술하는 청구범위에 속한다. 예를 들어, 의학적 중요성이 있는 다른 플라비바이러스의 prM-E 단백질 유전자들은 다른 의학적으로 중요한 플라비바이러스들에 대한 백신의 제조를 위해 황열 백신 바이러스 골격내에 삽입될 수 있다(예컨대, Monath et al., "Flaviviruses", In Virology, Fields(ed.), Raven-Lippincott, New York, 1995, Volume Ⅰ, 961-1034).
그로부터 본 발명의 키메라 벡터들내에 삽입될 수 있는 유전자들을 수득할 수 있는 추가의 플라비바이러스들의 예들은 쿤진, 중앙유럽 뇌염, 러시아 춘하 뇌염, 포와산 바이러스(Powassan virus), 캬사누 포레스트 디지즈 바이러스(Kyasanur Forest Disease virus), 및 옴스크 출혈열 바이러스를 포함한다. 또한, 더 관계가 먼 바이러스들로부터의 유전자들은 황열 백신 바이러스내에 삽입되어 신규한 백신을 제조할 수 있다.
백신의 제조 및 이용
본 발명의 백신들은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있는 양 및 이용방법으로 투여될 수 있다. 백신들은 예컨대, 황열 17D 백신과 유사한 방법으로 투여 및 제형화될 수 있는데, 예를 들어, 감염된 닭의 태아 조직의 정화된 현탁액으로 또는 키메라 황열 바이러스에 의해 감염된 세포 컬처로부터 회수된 유체로 투여 및 제형화될 수 있다. 따라서, 살아 있는, 약독화된 키메라 바이러스는 100과 1,000,000 감염성 단위(예컨대, 플라크-형성 단위 또는 조직 컬처 감염 도스)를 포함하는 멸균 수용액의 형태로 제형화될 수 있고, 예를 들어, 근육내, 피하, 또는 피부내부 경로로 투여될 0.1 내지 1.0ml 도스 용적으로 제형화될 수 있다. 또한, 플라비바이러스들은 구강 경로와 같이 점막 경로를 통해서 사람 숙주를 감염시킬 수 있기 때문에(Gresikova et al., "Tick-borne Encephalitis," In The Arboviruses, Ecology and Epidomiology, Monath(ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988,Volume Ⅳ, 177-203), 백신 바이러스는 보호면역반응을 일으키기 위해 점막 경로로 투여될 수 있다. 백신은 플라비바이러스에 감염될 우려가 있는 성인 또는 어린이에게 1차 예방약으로서 투여될 수 있다. 백신들은 플라비바이러스에 대한 면역반응을 자극함으로써 플라비바이러스에 감염된 환자의 치료용 2차 약으로서 이용될 수도 있다.
황열 백신 벡터 시스템은 하나의 바이러스에 대해 숙주를 면역시키고 동일한 대상을 다른 키메라 구조체를 이용하여 제 2 또는 제 3의 바이러스에 대해 후에 다시 면역시키는데 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 황열 시스템의 중요한 이점은 벡터가 그 자체에 대한 강한 면역성을 시현하지 않는다는 것이다. 이전의 황열 바이러스에 대한 면역성은 키메라 백신을 이종 유전자 발현을 위한 벡터로 사용할 수 없게 만들 것이다. 이러한 이점들은 황열 백신 E 유전자중에서 황열에 대한 중화(보호) 항원을 코드화하는 부분을 제거하고 다른, 황열에 대해 교차-보호를 제공하지 않는 이종 유전자로 대체한데서 기인한다. YF17D 바이러스 비구조 단백질들이 예를 들어, 보체-의존 항체 매개 용해(complement-dependent antibody mediated lysis)에 관여하는 NS1에 대한 항체를 유발하거나(Schlesinger et al., J. Immunology 135:2805-2809, 1985) 바이러스의 NS3 또는 다른 단백질들에 대한 세포독성을 유발함으로써 보호를 담당할 수 있다고 해도, 이들 반응들은 살아 있는 바이러스 백신이 중화 항체들을 자극하는 능력을 제거하지는 않을 것이다. 이러한 생각은 (1) 이전에 JE 바이러스에 의해 감염되었던 환자가 이전에 JE에 감염된 적이 없는 사람과 유사하게 YF17D에 의한 예방접종에 반응한다는 사실, 및 (2) 이전에 YF17D 백신을 접종받았던 개체가 중화 항체 역가가 상승되도록 2차예방접종에 반응한다는 사실로부터 뒷받침된다(Sweet et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 11:562-569, 1962). 따라서, 키메라 벡터는 이전의 자연적인 감염 또는 예방접종에 의해 황열에 대해 면역된 집단에 이용될 수 있고, 반복적으로 또는 예컨대, 일본뇌염, 성 루이스 뇌염, 또는 웨스트 나일 바이러스들로부터의 삽입체를 갖는 황열 키메라들을 포함하는 몇가지 상이한 구조체로 동시에 또는 순차적으로 면역시키기 위해 이용될 수 있다.
예방접종에 이용하는 경우에, 당업자들에게 알려져 있는 임의의 아쥬반트가 이용될 수 있다. 키메라 백신의 면역원성을 향상시키기 위해 이용될 수 있는 아쥬반트들은 예를 들어, 리포좀 제형, 사포닌(예컨대, QS21)과 같은 합성 아쥬반트, 뮤라밀 디펩타이드, 모노포스포릴 리피드 A, 또는 폴리포스파진을 포함한다. 이러한 아쥬반트들이 전형적으로 불활성화된 백신에 대한 면역반응을 향상시키기 위해 이용된다고 해도, 이들은 살아 있는 백신과 함께 이용될 수도 있다. 예를 들어, 경구투여와 같이 점막 경로를 통해 백신이 투여되는 경우에, 이. 콜라이(LT) 또는 LT의 돌연변이 유도주의 열에 불안정한 독소와 같은 점막성 아쥬반트들이 유용한 아쥬반트이다. 또한, 아쥬반트 활성을 갖는 싸이토카인을 코드화하는 유전자들은 황열 벡터내에 삽입될 수 있다. 따라서, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13, 또는 IL-5와 같은 싸이토카인을 코드화하는 유전자들은 이종 플라비바이러스 유전자와 함께 삽입되어 면역반응이 향상되거나 세포, 체액, 또는 점막반응에 대해 특이적이 되도록 면역성을 조절하게 되는 백신을 생성할 수 있다. 백신으로의 이용 이외에, 당업자들은 본 발명의 벡터들이 치료 유전자 산물을 환자의 세포내에 도입하는 유전자요법에 이용될 수 있다는 사실을 쉽게 이해할 것이다. 이러한 방법에서, 치료 유전자 산물을 코드화하는 유전자들은 prM-E 단백질을 코드화하는 유전자 대신에 벡터내에 삽입될 수 있다.
황열 벡터 시스템의 다른 이점들은 플라비바이러스가 세포의 세포질내에서 복제하여, 바이러스 복제 전략이 바이러스 게놈이 숙주 세포내에 통합되는 과정을 포함하지 않는 다는 것인데(Chambers et al., (1990) "Flavivirus Genome Organization, Expression, and Replication," In Annual Review of Microbiology 44:649-699), 이것은 중요한 안전성 수단을 제공한다.
본원에서 언급된 모든 참고문헌들은 전문 그대로 본원에 첨부된다.
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Claims (21)

  1. 기능적인 황열 바이러스 prM-E 단백질이 발현되지 않도록 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 결실, 트룬케이션, 또는 돌연변이에 의해 결실된 황열 바이러스, 및
    상기 황열 바이러스의 게놈내에 통합되어 있는, 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 상기 제 2 플라비바이러스의 상기 prM-E 단백질이 발현되는 키메라, 살아 있는, 감염성, 약독화 바이러스(chimeric, live, infectious, attenuated virus).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스가 일본 뇌염(JE) 바이러스인 키메라 바이러스.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스가 뎅그 타입 1 내지 4로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뎅그 바이러스인 키메라 바이러스.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스가 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 성 루이스 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기매개뇌염 바이러스, 및 C형 간염 바이러스, 쿤진 바이러스(Kunjin virus), 중앙 유럽 뇌염 바이러스, 러시아 춘하 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스(Powassan virus), 캬사누 포레스트 디지즈 바이러스(Kyasanur Forest Disease virus), 및 옴스크 출혈열 바이러스(Omsk Hemorrhagic Fever virus)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것인 키메라 바이러스.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 상기 황열 바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 대체하는 키메라 바이러스.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 M 단백질을 만들기 위한 prM 절단을 방해하는 돌연변이를 포함하는 키메라 바이러스.
  7. 제 1항에 있어서, C/prM 및 E/NS1 접합부에 있는 신호서열이 상기 키메라 플라비바이러스의 구성시에 유지되는 키메라 바이러스.
  8. 키메라, 살아 있는, 감염성, 약독화 바이러스를 환자의 플라비바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 약물의 제조에 이용하는 용도로서, 상기 키메라, 살아 있는, 감염성, 약독화 바이러스가
    기능적인 황열 바이러스 prM-E 단백질이 발현되지 않도록 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 결실, 트룬케이션, 또는 돌연변이에 의해 결실된 황열 바이러스, 및
    상기 황열 바이러스의 게놈내에 통합되어 있는, 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 상기 제 2 플라비바이러스의 상기 prM-E 단백질이 발현되는 용도.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스가 일본 뇌염(JE) 바이러스인 용도.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스가 뎅그 타입 1 내지 4로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뎅그 바이러스인 용도.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스가 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 성 루이스 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기매개뇌염 바이러스, 및 C형 간염 바이러스, 쿤진 바이러스(Kunjin virus), 중앙 유럽 뇌염 바이러스, 러시아 춘하 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스(Powassan virus), 캬사누 포레스트 디지즈 바이러스(Kyasanur Forest Disease virus), 및 옴스크 출혈열 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 상기 황열 바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 대체하는 용도.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 M 단백질을 만들기 위한 prM 절단을 방해하는 돌연변이를 포함하는 용도.
  14. 제 8항에 있어서, C/prM 및 E/NS1 접합부에 있는 신호서열이 상기 키메라 플라비바이러스의 구성시에 유지되는 용도.
  15. 기능적인 황열 바이러스 prM-E 단백질이 발현되지 않도록 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 결실, 트룬케이션, 또는 돌연변이에 의해 결실된 황열 바이러스, 및
    상기 황열 바이러스의 게놈내에 통합되어 있는, 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 상기 제 2 플라비바이러스의 상기 prM-E 단백질이 발현되는 키메라, 살아 있는, 감염성, 약독화 바이러스를 코드화하는 핵산분자.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스가 일본 뇌염(JE) 바이러스인 핵산분자.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스가 뎅그 타입 1 내지 4로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뎅그 바이러스인 핵산분자.
  18. 제 15항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스가 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 성 루이스 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기매개뇌염 바이러스, 및 C형 간염 바이러스, 쿤진 바이러스(Kunjin virus), 중앙 유럽 뇌염 바이러스, 러시아 춘하 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스(Powassan virus), 캬사누 포레스트 디지즈 바이러스(Kyasanur Forest Disease virus), 및 옴스크 출혈열 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것인 핵산분자.
  19. 제 15항에 있어서, 상기 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 상기 황열 바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 대체하는 핵산분자.
  20. 제 15항에 있어서, 상기 제 2의 상이한 플라비바이러스의 prM-E 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 M 단백질을 만들기 위한 prM 절단을 방해하는 돌연변이를 포함하는 핵산분자.
  21. 제 15항에 있어서, C/prM 및 E/NS1 접합부에 있는 신호서열이 상기 키메라 플라비바이러스의 구성시에 유지되는 핵산분자.
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