CZ306499A3 - Chimerický, živý, infekční, oslabený virus, jeho použití a molekula nukleové kyseliny pro léčbu flavivirových infekcí - Google Patents
Chimerický, živý, infekční, oslabený virus, jeho použití a molekula nukleové kyseliny pro léčbu flavivirových infekcí Download PDFInfo
- Publication number
- CZ306499A3 CZ306499A3 CZ19993064A CZ306499A CZ306499A3 CZ 306499 A3 CZ306499 A3 CZ 306499A3 CZ 19993064 A CZ19993064 A CZ 19993064A CZ 306499 A CZ306499 A CZ 306499A CZ 306499 A3 CZ306499 A3 CZ 306499A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- virus
- prm
- protein
- flavivirus
- chimeric
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 96
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 24
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims abstract description 75
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 51
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 51
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 claims abstract description 25
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 122
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 13
- 241000710888 St. Louis encephalitis virus Species 0.000 claims description 13
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 claims description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 13
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 8
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 7
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims description 6
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 6
- 208000037404 Central European encephalitis Diseases 0.000 claims description 5
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 claims description 5
- 241000710912 Kunjin virus Species 0.000 claims description 5
- 241001466978 Kyasanur forest disease virus Species 0.000 claims description 5
- 241000725177 Omsk hemorrhagic fever virus Species 0.000 claims description 5
- 241000710884 Powassan virus Species 0.000 claims description 5
- 241000907329 Russian Spring-Summer encephalitis virus Species 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 206010057199 Flaviviral infections Diseases 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 13
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 12
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 9
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 8
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 8
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 241001147422 tick-borne encephalitis virus group Species 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 229940124928 YF-Vax Drugs 0.000 description 5
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 3
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000710908 Murray Valley encephalitis virus Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 229960001515 yellow fever vaccine Drugs 0.000 description 3
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000710829 Dengue virus group Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 108700008783 Hepatitis C virus E1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- -1 NS2B Proteins 0.000 description 1
- 101100293593 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nar-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710152005 Non-structural polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 101710114167 Polyprotein P1234 Proteins 0.000 description 1
- 101710124590 Polyprotein nsP1234 Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004234 Yellow 2G Substances 0.000 description 1
- 241000710764 Yellow fever virus 17D Species 0.000 description 1
- 229940124926 Yellow fever virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 210000003956 transport vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000010463 virion release Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
Předkládaný vynález se vztahuje k infekčním, oslabeným virům, které jsou použitečné jako vakcíny proti onemocněním způsobovaným flaviviry.
DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Několik členů patřících do čeledě flavivirů v současnosti jsou hrozbou nebo potenciálně mohou být ohrožením globálního obecného zdraví. Například Japonská encefalitida je závažným obecným zdravotním problémem, který představuje nebezpečí pro miliony jednotlivců na Dalekém Východě. Virus horečky Dengue, který je každoročně celosvětově odhadován jako příčina 100 milionů případů primární horečky Dengue a více než 450 000 případů hemoragické horečky Dengue, byl vyhodnocen jako jedna z nejvýznamnějších arthropodpřenosných lidských chorob. Další flaviviry pokračují ve způsobování endemických chorob u různých živočichů a mají potenciál vniknout i do nových oblastí, jakými jsou příčiny změn klimatu, vektor populací a výsledky narušení životního prostředí způsobované lidskou činností. Tyto flaviviry zahrnují například St. Louis encefalitický virus, který způsobuje sporadickou, ale vážnou akutní chorobu na středozápadě, jihovýchodě a západě Spojených států amerických; Západonilský virus, který způsobuje horečnatá onemocnění, příležitostně komplikovaná akutní encefalitidou a je významně rozšířen v Africe, na Středním Východě, v dřívějším Sovětském svazu a některých částech Evropy; Murray Valley encefalitický virus, který způsobuje endemické onemocnění nervového systému v Austrálii a Klíšťový encefalitický virus, který je rozšířen v bývalém Sovětském svazu a východní Evropě, kde jeho klíšťový nosič je běžný a je odpovědný za vážnou formu encefalitidy v těchto regionech.
Virus hepatitidy C (HCV) je dalším členem čeledě flavivirů, jehož organizace genomu a replikační strategie jsou podobné, ale nikoliv identické těm virům, které jsou zmíněny výše. HCV virus, který je přenášen hlavně mimostřevní expozicí, je spojen s chronickou hepatitidou, která se může vyvinout do cirhóze jater a hepatocelulárního karcinomu a je vedoucí příčinou jaterních onemocnění, která vyžadují orthotopickou transplantaci ve Spojených státech amerických.
Čeleď Flaviviridae je odlišná od alfavirů (např.: WEE, VEE, EEE, SFV atd.) a v současnosti zahrnuje tři rody: flaviviry, pestiviry a viry hepatitidy C. Zcela zralé viriony flavivirů obsahují tři
·· 00 • 0 0
0 0
000 000 0 0
0 0 0 strukturní proteiny, obálky (E), kapsidy (C) a membrány (M) a sedm nestrukturních proteinů (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B a NS5). Nezralé viriony nalézají v buněčném obsahu infikovaných buněk pre-membránový (prM) protein, který je prekurzorem membránového proteinu M.
Po navázání virionů na receptory hostitelské buňky, E protein prochází nevratnou konformační změnou pod vlivem kyselého pH endozomů, což způsobuje fůzi mezi dvojvrstevnou obálkou virionů a endocytickými váčky, a tudíž dochází k vypuštění virálního genomu do cytosolu hostitelské buňky. Viry klíšťové encefalitidy (TBE), které obsahují prM protein, jsou neschopné fůze, což znamená, že proteolytická úprava prM proteinu je nezbytná pro vytvoření virionů, které jsou schopné fůze a jsou to zcela infekční viriony (Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72 (Pt. 2):333-338, 1991). Pozdějším použitím chloridu amonného ve virovém replikačním cyklu byly produkovány Murray Valley encefalitické viry (MVE), které obsahovaly prM protein, a které byly neschopné fůze. Za použití peptidů specifické sekvence a monoklonálních protilátek bylo demonstrováno, že prM protein interaguje s aminokyselinami 200 až 327 E proteinu. Tato interakce je nezbytná proto, aby ochránila E protein před nevratnými konformačními změnami způsobovanými maturací virionů v kyselých měchýřcích exocytické cesty (Guirakhoo et al., Virology 191:921-931, 1992).
Štěpení prM proteinu na M protein se objevuje krátce před vypuštěním virionů, provádí ho celulární proteáza podobná furinu (Stadler et al., J. Virol. 71:8475-8481, 1997) a je nezbytné pro aktivaci hemoaglutinační aktivity, ťúsogení aktivity a infekčnosti virionů. M protein je vyštěpen ze svého prekurzoru v souhlasné sekvenci R-X-R/K-R (X je variabilní) a je začleněn do virové lipidové obálky společně s E proteinem.
Štěpící sekvence byly konzervativní ne pouze u flavivirů, ale také u proteinů ostatních nepříbuzných virů takový, jako jsou PE2 myších koronavirů, PE2 alfavirů, HA chřipkových virů a pl60 retro virů. Štěpení prekurzového proteinu je hlavní pro virovou infektivitu, ale ne pro vytvoření virové částice. Bylo prokázáno, že v případě TBE-dengue 4 chiméry, změna v štěpícím místě prM proteinu vede ke snížení neurovirulence této chiméry (Pletnev et al., J. Virol. 67:4956-4963, 1993), což je v souladu s předchozím pozorováním, že dostatečná úprava prM proteinu je nezbytná pro plnou infekčnost (Guirakhoo et al., 1991, výše, 1992, výše; Heinz et al., Virology 198:109-117, 1994). Protilátky proti prM proteinu mohou zprostředkovat ochranou imunitu, zjevně z důvodu neutralizace vypuštěných virionů, které obsahují nějaký nenaštěpený prM protein. Proteolytické štěpící místo vPE2 u VEE (4 aminokyseliny) bylo deletováno cílenou mutagenezí infekčního klonu (Smith et al., ASTMH meeting, December 7-11, 1997). Deleční mutánty se replikovaly s velkou účinností a PE2 proteiny byly začleňovány • · do částic. Tento mutant byl odzkoušen na nehumánních primátech a vykazoval 100% serokonzervaci a ochraňoval všechny imunizované opice před smrtelnými změnami.
PODSTATA VYNÁLEZU
Předkládaný vynález charakterizuje chimérické, živé, infekční, oslabené viry, které jsou každý tvořen takto:
a) první virus žluté horečky (např.: kmen 17D), který představuje živou, oslabenou virovou vakcínu, v které je nukleotidová sekvence pro prM-E protein buď déletována, oklestěna nebo zmutována tak, že funkční prM-E protein prvního flaviviru není exprimován, a
b) nukleotidová sekvence kódující virální obálku (prM-E proteinů) druhého, odlišného flaviviru, je integrována do genomu prvního flaviviru, takže prM-E protein druhého flaviviru je exprimován z pozměněného genomu prvního flaviviru.
Chimérický virus je tudíž tvořen geny a genovými produkty odpovědnými za intracelulární replikaci patřící prvnímu flaviviru a geny a genovými produkty obálky druhého flaviviru. Protože virální obálka obsahuje všechny antigenní determinanty odpovědné za indukci neutralizujících protilátek, výsledkem infekce chimérickým virem je, že tyto protilátky jsou produkovány pouze proti druhému flaviviru.
Upřednostňovaným živým virem pro použití jako první flavivirus v chimérických virech podle předkládaného vynálezu je virus žluté horečky. Nejméně jedna vakcína již použila tento živý, oslabený virus; tato vakcína je známa jako YF17D a byla použita pro imunizaci lidí před více než 50 lety. Vakcína YF17D je popsána v řadě publikací, včetně publikací Smithburna et al. („Yellow Fever Vaccination“, World Health Org., p. 238, 1956) a Freestona (in Plotkin et al., (Eds.), Vaccines, 2nd edition, W.B. Saunders, Philadelphia, 1995). Kromě toho byl virus žluté horečky studován na genetické úrovni (Rice et al., Science 229:726-733, 1985) a informace vztahující se ke genotypu a fenotypu byly získány (Marchevsky et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:75-80, 1995).
Upřednostňované viry pro použití jako druhý flavivirus v chimérických virech podle předkládaného vynálezu a tudíž zdroje imunizačního antigenu zahrnují virus japonské encefalitidy (JE), virus horečky Dengue (DEN, např.: jakýkoliv zDengue typů 1 až 4), Murray Valley encefalitický virus (MVE), St. Louis encefalitický virus (SLE), Západonilský virus (WN), virus klíšťové encefalitidy (TBE) a viry hepatitidy C (HCV). Další flaviviry použitelné jako druhý flavivirus zahrnují Kunjin virus, středoevropský encefalitický virus, ruský jaro-letní encefalitický virus, Powassan virus, Kyasanur Forest Disease virus a virus omské hemoragické • · · horečky. V upřednostňovaném chimérickém viru podle předkládaného vynálezu je sekvence kódující prM-E protein druhého flaviviru zaměněna za sekvenci kódující prM-E protein živého viru žluté horečky. V upřednostňovaném chimérickém viru je sekvence kódující prM-E protein odvozena od oslabeného virového kmene takového, jako je vakcínový kmen. Také jak je popsáno dále níže, prM část proteinu může obsahovat mutaci, která zabraňuje štěpení, které umožňuje vytvoření zralého membránového proteinu.
V předkládaném vynálezu jsou také zahrnuty metody zabraňující nebo léčící flavivirovou infekci u savců takových, jako je člověk, podáváním chimérického flaviviru infekce savcům; použití chimérických flavivirů podle předkládaného vynálezu při přípravě medikamentů pro zabraňování nebo léčbu flavivirové infekce; a způsoby přípravy chimérických flavivirů podle předkládaného vynálezu.
Předkládaný vynález zajišťuje několik výhod. Například, protože jsou chimérické viry živé a replikují se, mohou být chimérické viry podle předkládaného vynálezu použity k vytvoření dlouhotrvající ochranné imunity. Protože mají tyto viry replikační geny oslabeného viru (např.: virus žluté horečky 17D), je výsledný virus oslabený na takový stupeň, že skýtá bezpečí pro použití u lidí.
Další vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou jasné z následného detailního popisu, obrázků a nároků.
Předkládaný vynález zajišťuje chimérické flaviviry, které mohou být použity při vakcinačních metodách proti flavivirové infekci. Zkonstruování a analýza chimérických flavivirů podle předkládaného vynálezu takových, jako jsou chiméry viru žluté horečky a viru japonské encefalitidy (JE), viru horečky Dengue (DEN 1 až 4), Murray Valley encefalitického viru (MVE), St. Louis encefalitického viru (SLE), Západonilského viru (WN), viru klíšťové encefalitidy (TBE) a virů hepatitidy C (HCV), jsou popsány v následující textu.
Proteiny flavivirů jsou vytvářeny translací z jednoho, dlouhého otevřeného čtecího rámce (kódovány jsou strukturní proteiny, kapsida (C), pre-membránový (prM) protein a obálka (E), zrovna tak, jako nestrukturní proteiny) a komplexem několika posttranslačních proteolytických štěpení. Chimérické flaviviry podle předkládaného vynálezu, jak již bylo diskutováno výše, zahrnují ty, u kterých byly pr-M a E proteiny jednoho flaviviru zaměněny za pr-M a E proteiny jiného flaviviru. Tudíž takto vytvořené chimérické flaviviry zahrnují generaci nových spojení mezi kapsidou a pre-membránovými proteiny; a obálkovým proteinem a nestrukturní oblastí (NS1) dvou odlišných flavivirů. Štěpení mezi každou z těchto sad proteinů (C a pr-M; a E a NS1) se vyskytuje během přirozené proteolytické úpravy flavivirových proteinů a vyžaduje přítomnost signální sekvence, která vytváří boční sekvence spojení štěpících míst.
• · • · · · ···· • · · · · · ···· ···· · · · ···· • · ···· · · · · » ··· ··· 5 · · · · · · · · ·· · · · · ·· · · · ·
V chimérických flavivirech podle předkládaného vynálezu je upřednostňováno, aby signální sekvence virů tvořících chiméry byly skutečně udržovány, takže vlastní štěpení mezi C a pr-M proteiny a E a NS1 proteiny by mohlo účinně proběhnout. Tyto signální sekvence byly udržovány v chimérách, které jsou popsány níže. Alternativně jakákoliv z řady známých signálních sekvencí může být zařazena, aby se připojila k C a pre-M proteinům nebo E a NS1 proteinům chimér (např.: von Heijne, Eur. J. Biochem. 133:17-21, 1983; von Heijne, J. Mol.
Biol. 184:99-105, 1985) nebo například použitím známých vedoucích sekvencí může ten, kdo je znalý stavu techniky, vytvořit doplňkové signální sekvence, které mohou být použity v chimérách podle předkládaného vynálezu. Obvykle například bude signální sekvence obsahovat jako svůj poslední aminokyselinový zbytek aminokyselinu s malým, nenabitým postraním řetězcem, takovou, jako je alanin, glycin, serin, cystein, threonin nebo glutamin. Další požadavky kladené na signální sekvence jsou známé těm, kdo znají stav techniky (např.: von Heijne, 1983, výše; von Heijne, 1985, výše). Také signální sekvence dalších virů, které tvoří chiméry, mohou být udržovány nebo skutečně udržovány, takže vlastní štěpení probíhá.
Konstrukce cDNA templátů pro vytvoření YE/JE chimérických virů - odvození celodélkových cDNA templátů pro chiméry podle předkládaného vynálezu popsané níže zahrnuje strategii podobnou té, kterou dřívější pracovníci použili k vytvoření YF17D z cDNA pro molekulárněgenetické analýzy replikace YF. Strategie je popsána např.: vNestorowicz et al. (Virology 199:114-123, 1994).
V krátkosti, odvození YF/JE chiméry podle předkládaného vynálezu zahrnuje následující. Genomové sekvence YF jsou rozšířeny do dvou plasmidů (YF5'3'IV a YFM5.2), které kódují YF sekvence od nukleotidu 1 až do 2 276 a od 8 279 do 10 861 (YF5'3'IV) a od 1 373 do 8 704 (YFM5.2) (Rice et al., The New Biologist 1:285-296, 1989). Celodélkové cDNA templáty jsou vytvářeny ligací vhodných restrikční ch fragmentů odvozených od těchto plasmidů. Tato metoda byla nejspolehlivější pro zajištění stabilní exprese YF sekvencí a vytvoření RNA transkriptů, které mají vysoce specifickou infekticivitu.
Naše strategie pro konstrukci chimér zahrnuje náhradu YF sekvencí mezi YF5'3'IV a YFM5.2 plasmidy odpovídajícími JE sekvencemi z oblasti startu prM proteinu (nukleotid 478, aminokyselina 128) přes E/NS1 štěpící místo (nukleotid 2 452, aminokyselina 817). Kromě toho, aby mohla být klonována cDNA JE, bylo nezbytné provést několik kroků pro zavedení nebo eliminování restrikčních míst v obou YF a JE sekvencích, aby bylo umožněna in vitro ligace. Struktura templátů pro regenerování chimérických YF (C)/JE (prM-Ε) virů je ukázána na obrázku 4. Druhá chiméra kódující celou JE strukturní oblast (C-prM-E) byl vytvořen za použití podobné strategie.
• ·
Molekulární klonování JE virové strukturní oblasti - klony genů skutečného JE strukturního proteinu byly vytvořeny z JE SAm-14-2 kmene (JE živý, oslabený vakcinační kmen), protože biologické vlastnosti a molekulární charakterizace tohoto kmene jsou dobře zdokumentovány (Eckels et al., Vaccine 6:513-518, 1988; JE SAh-14-2 virus je dostupný v Centers for Disease Control, Fort Collins, Colorado a v Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut, které jsou Světovou zdravotnickou organizací označeny za referenční centra pro arboviry ve Spojených státech amerických). JE SAi4-14-2 virus v transportní formě PDK-5 byl získán a transportován v LLC-MK2 buňkách, aby bylo získáno dostatečné množství pro klonování cDNA. Strategie, která byla použita, zahrnovala klonování strukturní oblasti ve dvou částech, které se překrývají v Nhe I restrikčním místě (JE nukleotid 1 125), a které mohou být pak použity pro in vitro ligaci.
RNA byl extrahována z jednovrstevných infikovaných LLC-MK2 buněk a syntéza prvního řetězce z negativního vlákna cDNA byla provedena za použití reverzní transkriptázy s primerem pro negativní vlákno (JE nukleotidová sekvence 2 456 až 71), které obsahovalo naskládaná Xba I a Nar 1 restrikční místa pro klonování zpočátku do pBluescript II KS(+) a následně do YFM5.2 (Nar I), respektive. Syntéza prvního řetězce cDNA byla následována PCR amplifikací JE sekvence od nukleotidů 1 108 do 2 471 za použití stejného primeru pro negativní vlákno a primeru pro pozitivní vlákno (JE nukleotidová sekvence 1 108 až 1 130), který obsahoval naskládaná Xba I a Nsi I restrikční místa pro klonování do pBluescriptu a do YFM5.2 (Nar I), respektive. JE sekvence byly určeny restrikčním štěpením za pomoci restrikčního enzymu a nukleotidovým sekvenováním. JE nukleotidová sekvence od nukleotidu 1 do nukleotidu 1 130 byla odvozena pomocí PCR amplifikacee negativního vlákna JE cDNA za použití primeru pro negativní vlákno, který odpovídal JE nukleotidům 1 116 až 1130 a primeru pro pozitivní vlákno, který odpovídal JE nukleotidům 1 až 18, oba primery obsahují EcoR I restrikční místo. PCR fragmenty byly klonovány do pBluescriptu a JE sekvence byly určeny nukleotidovým sekvenováním. Toto dohromady představuje klonování JE sekvence od nukleotidu 1 do nukleotidu 2 471 (aminokyseliny 1 až 792).
Konstrukce derivátů YF5'3'IV/JE a YFM5.2/JE - aby byl vložen C konec JE obálkového proteinu do YF E/NS1 štěpícího místa, bylo zavedeno unikátní restrikční místo Nar I do YFM5.2 plasmidu řízenou oligonukleotidovou mutagenezí signální sekvence vE/NSl štěpícího místa (YF nukleotidy 2 447 až 2 452, aminokyseliny 816 až 817), aby se vytvořil YFM5.2 (Nar I). U transkriptů odvozených od templátů začleněných touto změnou byla kontrolována infiticivita a výsledná specifická infekticivita zda je podobná parentálním templátům (přibližně 100 plaky tvořících jednotek/250 nanogramů transkriptů). JE sekvence z nukleotidů 1 108 až 2 471 byla • · · · • · · · • · · · subklonována z několika nezávislých pBluescript/JE klonů, které byly vytvořeny PCR, do YFM5.2 (Nar I) za použití unikátních Nsi I a Nar I restrikčních míst. YF5'3'IV/JE klony obsahující YF5' netraslatovatelnou oblast (nukleotidy 1 až 118) sousedící sJE prM-E oblastí byly připraveny PCR amplifikací.
Aby byly odvozeny sekvence obsahující spojení YF kapsidu a JE prM, byl použit chimérický primer negativního vlákna zabírající tuto oblast spolu s primerem pozitivního vlákna, který odpovídá YF5'3'IV nukleotidům 6 625 až 6 639, aby vznikly PCR fragmenty, které byly pak použity jako PCR příměry negativního vlákna v konjugaci s primerem pozitivního vlákna doplňujícím v pBluescriptu vektoru upstream sekvenci EcoR I restrikčního místa, aby se pak amplifikovala JE sekvence (kódovaná v opačné orientaci v pBluescript vektoru) od nukleotidu 477 (N konec prM proteinu) přes Nhe I restrikční místo do nukleotidu 1 125. Výsledné PCR fragmenty byly vneseny do YF5'3TV plasmidu za použití Not I a EcoR I restrikčních míst. Tento konstrukt obsahuje SP6 promotor, který předchází YF5' netranslatovatelné oblasti, a je následován sekvencí: YF (C) JE (prM-Ε) a obsahuje Nhe I restrikční místo (JE nukleotid 1 125), které je nezbytné pro in vitro ligaci.
Vytvoření YFM5.2 a YF5 3TV plasmidů, které obsahují restrikční místa pro in vitro ligaci - aby mohlo být použito Nhe I restrikční místo uvnitř sekvence JE obálky jako 5' koncové in vitro ligační místo, bylo nadbytečné Nhe I restrikční místo vYFM5.2 plasmidu (nukleotid 5 459) eliminováno. Toto bylo provedeno tichou mutací YF sekvence v nukleotidu 5 461 (T—»C; alanin, aminokyselina 1820). Toto místo bylo začleněno do YFM5.2 ligaci vhodných restrikčních fragmentů a zavedeno do YFM5.2(Afor I)/JE výměnou za Nsi UNar I fragment kódující chimérickou YF/JE sekvenci.
Aby se vytvořilo unikátní 3' koncové restrikční místo pro in vitro ligaci, bylo vytvořeno BspE I restrikční místo downstream od Aat II restrikčního místa, které je normálně používané pro vytvářené celodélkových templátů z YF5'3'IV a YFM5.2. (četná Aat II restrikční místa jsou přítomna v JE strukturní sekvenci, což zabraňuje použití tohoto místa pro in vitro ligaci). BspE I restrikční místo bylo vytvořeno tichou mutací YF nukleotidu 8 581 (A—>C, serin, aminokyselina 2 860) a bylo zavedeno do YFM5.2 výměnou vhodné restrikční fragmenty. Unikátní místo bylo začleněno do YFM5.2/JE výměnou zaXba USph I fragment a do YF5'3TV/JE(prM-E) plasmidů tříčásťovou ligaci vhodných restrikčních fragmentů z těchto parentálních plasmidů a z derivátu YFM5.2 (BspE I) delecí YF sekvence mezi EcoR I restrikčními místy nukleotidů 1 a 6 912. Výměna JE Nakayma cDNA s YF/JE chimérickými plasmidy - z důvodu nejistoty ohledně kapacity JE SAm-14-2 strukturní oblasti, která byla vytvořena PCR amplifikací, aby fungovala správně v kontextu chimérického viru, byla použita cDNA z klonu JE Nakayama kmene, který
00
0 0
0 0
000 000
0
0 00 • 0 • 0 · 0 · · • · · 0 0*
0 0 · ··
0 0000 0 0 0 • 0 0 0 0 ·
0 · · · · · byl široce charakterizován během expresních experimentů a pro jeho kapacitu navodit ochrannou imunitu (Mclda et al., Virology 158:348-360, 1987; JE Nakayama kmen je dostupný vCenters for Disease Control, Fort Collins, Colorado a v Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut). Nakayama cDNA byla vnesena do YF/JE chimérických plasmidů za použití vhodných restrikčních míst {Hind III až Pvu Π a Bpm I až Mun I), aby byla zaměněna celá prM-E oblast v dvou plasmidových systémech kromě jedné aminokyseliny, šeřinu, v pozici 49, která byla ponechána intaktní, aby mohla být použita pro Nhe I restrikční místo k in vitro ligaci. Celá JE oblast v Nakayama klonu byla sekvenována, aby bylo ověřeno, že záměna cDNA opravdu proběhla (tabulka 2).
Vytvoření celodélkových cDNA templátů, RNA transfekce a vytvoření infekčního viru postupy pro vytvoření celodélkových cDNA templátů jsou hlavně popsány vRice et al. (The New Biologist 1:285-296, 1989) (obrázek 1). V případě chimérických templátů jsou plasmidy YF5'3'IV/JE(prM-E) a YFM5.2/JE štěpeny restrikčními endonukleázami Nhe UBsp I a in vitro ligace byla provedena za použití 50 nanogramů puntíkovaných fragmentů a za přítomnosti T4 DNA ligázy. Produkty ligace byly linearizovány enzymem Xho I, aby byla umožněna ubíhající transkripce. SP6 transkripty byly synthetizovány za použití 50 nanogramů purifikovaného templátů, kvantifikován začleněním 3H-UTP a celistvost RNA byla určena nedenaturující elektroforézou v agarózovém gelu. Výtěžky byly v rozmezí od 5 do 10 mikrogramů RNA na reakci při použití této procedury, jichž většina byla představována celodélkovými transkripty. Transfekce RNA transkripty v přítomnosti kationtových liposomů bylo prováděno tak, jak je popsáno vRice et al. (výše) pro YF17D. V počátečních experimentech byly pro transfekci a kvantifikaci viru použity LLC-MK2 buňky, protože u nich byla určena tolerantnost pro replikaci a vytváření plaků parentálních kmenů YF a JE. Tabulka 1 ilustruje obvyklé výsledky transfekčních experimentů za použití Lipofectinu (GIBCO/BRL) jako transfekčního nosiče. Věro buněčné linie byly také běžně použity pro přípravu infekčních virových zásobních roztoků, charakterizaci značených proteinů a neutralizační testy.
Nukleotidové sekvenování chimérických cDNA templátů - plasmidy obsahující chimérickou YF/JE cDNA byly podrobeny sekvenční analýze části JE klonů, aby byla identifikována správné sekvence SAh-14-2 a Nakayama obálkového proteinu. Odlišnosti nukleotidových sekvencí mezi těmito konstrukty v porovnání s publikovanými sekvencemi (McAda et al., výše) jsou ukázány v tabulce 2.
Strukturní a biologická charakterizace chimérických YF/JE virů - genomová struktura chimérických YF/JE virů získaných z transfekčních experimentů byla ověřena analýzou založenou na RT/PCR virální RNA izolované z monovrstevných infikovaných buněk. Tyto • · · • · · • · · * • · · · · · • · • · • · · experimenty byly provedeny tak, aby byla eliminována možnost, že virové zásobní roztoky budou kontaminovány během transfekčních procedur. Při těchto experimentech byl použit prvoprůchozí virus, který zahájil infekční cyklus, aby byla eliminována tvorba jakýchkoliv artefaktů přítomností reziduální transfektovanou virální RNA. Celkové RNA extrakty z buněk infikovaných buď YF/JE (prM-E)-SAH-14-2 nebo YF/JE (prM-E)-Nakayama chimérami byly podrobeny RT/PCR za použití YF a JE-specifických primerů, které umožnily vytvoření celé strukturní oblasti, jako dva PCR produkty o přibližné velikosti 1 kilobáze. Tyto produkty byly poté analyzovány štěpením restrikčními enzymy za použití předpověděných restrikčních míst uvnitř sekvencí JE SAm-14-2 a Nakayama, které umožňují diferenciaci těchto virů. Použitím tohoto přístupu byla virální RNA určena, že je chimérickou a u vytvořených virů byla ověřena přítomnost vhodných restrikčních míst. Aktuální vazba C-prM byla pak ověřena, že je intaktní na úrovni sekvence cyklickou sekvenční analýzou před chimérické spojení YF/JE C-prM.
Přítomnost JE obálkového proteinu ve dvou chimérách byla ověřena imunoprecipitací obou za použití JE-specifického antiséra a plakovým redukčním neutralizačním testem za použití YF a JE-specifického antiséra. Imunoprecipitace extraktů z infikovaných LLC-MK2 buněk, které byly označeny S, s chimérami za použití monoklonální protilátky k JE E proteinu ukázala, že JE obálkový protein by mohl být vytvořen 55 kD proteinem, kde stejné antisérum selhává při imunoprecipitací proteinu z YF-infikovaných buněk. Obě JE a YF hyperimunní séra vykázala křížovou reaktivitu ke dvěma obálkovým proteinům, ale rozdílnost ve velikosti mezi proteiny (YF = 53 kD, neglykosylovaný; JE = 55 kD, glykosylovaný) mohla být reprodukovatelně pozorována. Použití YF monoklonálních protilátek nebylo za uspokojivých imunoprecipitačních podmínek, tudíž specifita této analýzy byla závislá na JE monoklonálních protilátkách. Plakový redukční neutralizační test (PRNT) byl proveden na chimérických virech a na YF a JE SAi4-14-2 virech za použití YF a JE-specifických hyperimunních ascitických kapalin (ATCC) a YFspecifických purifikovaných IgG (monoklonální protilátka 2E10). Významné odlišnosti v 50% plakovém redukčním titru těchto antisér byly pozorovány pro chiméry, když byly porovnány s kontrolními viry použitými v těchto experimentech (tabulka 3). Tedy epitopy nezbytné pro neutralizaci jsou exprimovány v infekčních chimérických YF/JE virech.
Růstové vlastnosti v buněčné kultuře - růstová kapacita chimér byla zkoušena kvantitativně v buněčných liniích, obě v liniích původem pocházejících od primátů a komárů. Obrázek 2 ilustruje kumulativní růstové křivky chimér v LLC-MK2 buňkách po nízké mnohonásobné infekci (0,5 plak tvořících jednotek/buňku). V tomto experimentu byly použity viry YF5.2iv (klonovaný derivát) a JE SAm-14-2 (neklonovaný) pro srovnání. Oba chimérické viry dosáhly maximálního virového výtěžku přibližně o řád vyššího než parentální virus. V případě YF/JE • · φ * ·· φφφφ φφφ · · φ φ φφφφ • ΦΦΦ φφφ φφφφ φ φφφφφ φ φφφφ φφφ φφφ φφφ φφφ φφ • · φ φφφφφ φ · φφ
SAh-14-2 chiméry se pík virové produkce objevil o 12 hodin později než v případě YF/JE Nakayama chiméry (50 hodin proti 38 hodinám). YF/JE Nakayama chiméra vykázala významně vyšší cytopatické vlivy než YF/JE SAh-14-2 chiméra na této buněčné linii. Podobný experiment byl proveden v C6/36 buňkách po nízké mnohonásobné infekci (0,5 plak tvořících jednotek/buňku). Obrázek 2 také ilustruje růstovou kinetiku virů v této intervertebrální buněčné linii. Podobné virové výtěžky byly získány ve všech bodech použitých pro izolování viru v tomto experimentu, dále prokazující představu, že chimérických virů není poškozena replikační účinnost.
Porovnání růstové kinetiky RMS (YF/JE SAh-14-2) s YF 17D vakcinou vMRC-5 buňkách experiment byl proveden, aby byla určena schopnost vakcinového kandidáta rozmnožit se v buněčné linii akceptovatelně pro lidskou vakcínu. Komerční vakcína žluté horečky 17D (YFVax®) byla získána z Connaught Laboratories, Swiftwater, PA. MRC-5 (diploidní lidské embryonální plicní buňky) byly zakoupeny od ATCC (171-CCL, vsádka#: F-14308, pasáž 18) a rostly vEMEM, 2 mM L-Gln, Earle's BSS, které bylo upraveno tak, aby obsahovalo 1,5 g/1 uhličitanu sodného, 0,1 mM neesenciálních aminokyselin a 10% FBS.
Aby mohla být porovnána růstová kinetika RMS (Research Master Seed, YF/JE SAh-14-2) s YF-Vax®), rostly buňky do 90% splývání a infikovány byly s RMS nebo YF-Vax® při MOI okolo 0,1 pfu. Protože MRC-5 buňky obvykle rostou pomalu, byly tyto buňky inkubovány po dobu 10 dnů po inokulaci. Vzorky byly zmrazovány každodenně po dobu 7 až 10 dnů a infektivita byla určena testem plaků ve Věro buňkách.
YF-Vax® a YF/JE chiméry rostly do slušných titrů v MRC-5 buňkách (obrázek 3). Pík titru byl ~4,7 logio pfu pro YF-Vax® dosažený druhý den a byl nepatrně nižší než 4,5 logio pfu pro RMS po 6 dnech.
Testování neurovirulence v normálních dospělých myších - virulenční vlastnosti YF/JE SAh14-2 chiméra byly analyzovány v mladých dospělých myších intracelebrální inokulaci. Skupiny po 10 myších (4 týdny staří samci a samice ICR myší, každých 5 na jednu skupinu) byly inokulovány 10 000 plak tvořícími jednotkami YF/JE SAh-14-2 chiméry, YF5.2iv nebo JE SAh-14-2 a pozorovány každý den po dobu 3 týdnů. Výsledky těchto experimentů jsou zobrazeny na obrázku 4. Myši přijímaly parentální YF5.2iv odevzdaně přibližně jeden týden po inokulaci. Žádná mortalita nebo onemocnění nebyly pozorovány mezi myšmi přijímajícími buď JE SAm-14-2 parentální virus nebo chiméru. Inokula, která byla použita pro experimenty, byla titrována v době injikace a podskupina myší, které přežily, byla testována na přítomnost neutralizačních protilátek, aby se potvrdilo, že došlo k infekci. Mezi těmito testovanými myšmi ·* ·» • ♦ 9 9 9
9 9 9 9
99 999
9 9 9 • * · · · · byly titry proti viru JE SAh-14-2 podobné pro zvířata, která přijala bud’ tento kmen nebo chiméru.
Výsledky dalších experimentů zjišťujících neurovirulenci YF/JE SAm-14-2 chiméry v myších jsou zobrazeny v tabulce 4. V těchto experimentech všechny myši inokulované YF5.2iv zemřely v rozmezí 7 až 8 dnů. Naopak žádná myš inokulovaná YF/JE SAm-14-2 nezemřela během dvou týdnů postinokulačního pozorování.
Výsledky experimentů, které určovaly neuroinvazivitu a patogenezi YF/JE chimér jsou zobrazeny v tabulce 5. V těchto experimentech byly chimérické viry inokulovány do 3 týdny starých myší v dávkách pohybujících se v rozmezí mezi 10 000 a 1 milionem plak tvořících jednotek přes intraperitoneální cestu. Žádná z myší inokulovaných buď YF/JE Nakayama nebo YF/JE SAi4-14-2 nezemřela během tří týdnů postinokulačního pozorování, což naznačuje, že virus byl neschopný způsobit onemocnění po periferní inokulaci. Myši inokulované YF/JE SAh14-2 virem vyvinuly neutralizující protilátky proti JE viru (obrázek 7).
Konstrukce cDNA templátů pro vytvoření žlutá horečka/dengue (YF/DEN) chimérických virů odvození chimérických žlutá horečka/dengue (YF/DEN) virů je popsáno v následujícím textu, a které je v principu prováděno stejně, jako konstrukce YF/JE chiméry, jak je popsáno výše. Další flavivirové chiméry mohou být vytvořeny podobnou strategií za použití přirozených nebo vytvořených restrikčních míst a například oligonukleotidových primerů, jak je ukázáno v tabulce 6.
Konstrukce YF/DEN chimérického viru - ačkoliv bylo vyvinuto několik molekulárních klonů dengue virů, byly zjištěny problémy se stabilitou virálních cDNA plasmidových systémů a s účinností replikace vytvořených virů. Pro použití byl vybrán klon DEN-2 vyvinutý Dr. Peterem Wrightem, Dept. of Microbiology, Monash University, Clayton, Austrálie, protože tento systém je relativně účinný pro regeneraci viru a tvoří dvou-plasmidový systém, který je podobný naší vlastní methodologii. Kompletní sekvence tohoto DEN-2 klonu je přístupná a usnadňuje konstrukci chimérických YF/DEN templátů, protože pouze několik modifikací YF klonu bylo nezbytných. Významné kroky jsou naznačeny v následujícím textu.
Podobně jako dvou-plasmidový systém pro YF5.2iv a YF/JE viry používá YF/DEN systém unikátní restrikční místo uvnitř DEN-2 obálkového proteinu (E), jako zlomové místo pro rozšíření strukturní oblasti (prM-E) uvnitř dvou plasmidů, tímto způsobem odvolávající se jako YF5'3'IV/DEN (prM-E') a YFM5.2/DEN (E'-E) (obrázek 5). Dvě restrikční místa pro in vitro ligaci chimérického templátů jsou Aat II a Sph I. Recipientní plasmid pro 3' koncovou část DEN E proteinové sekvence je YFM5.2(/Vďr I[+]5/?/? I[-]). Tento plasmid obsahuje Nar I restrikční místo v E/NSI spojení, které bylo použito pro začlenění karboxylového konce JE E t * ♦ * »99 9 1 • ♦ 9 9 ·
9 9999 9 · «99 9 »· 9 99
99 99
9 «99«
9 9 9 9 9
9 * 999 999 · 9 9 «· 9« proteinu. Dále bylo modifikováno eliminací Sph I restrikčního místa, které bylo navíc, v oblasti NS5 proteinu tichou v tomto místě řízenou mutagenezí. To dovolilo začlenění DEN-2 sekvence z unikátní Sph I místa do Nar I místa jednoduchým přímým klonováním. Vhodný fragment DEN-2 cDNA byl získán pomocí PCR z DEN-2 klonu MON310, který byl poskytnut Dr. Wrightem. PCR primery zahrnovaly 5' koncový primer ohraničující Sph I restrikční místo a 3' koncový primer homologní k DEN-2 nukleotidům okamžitě upstream od signalázového místa v E/NSI spojení a nahrazující signalázové místo substitucí, takže vytváří nové místo, ale zároveň zavádí Nar I restrikční místo. Výsledný 1 170 párů bází dlouhý PCR fragment byl poté zaveden do YFM5.2(Aar l[+]Sph I[-]).
5' koncová část DEN-2 klonu zahrnující prM a aminokoncová část E proteinu byla vytvořena a zavedena do YF5'3'IV plasmidů za použití chimérického PCR primeru. Chimérický primer zahrnující 3' konec negativního vlákna YF C proteinu a 5' konec DEN-2 prM proteinu byl použit s primerem pozitivního vlákna, který ohraničuje SP6 promotor YF5'3'IV plasmidů, tak, aby došlo k vytvoření 771 párů bází velký PCR produkt s 20 bázovým prodloužením představujícím DEN-2 prM sekvenci. Tento PCR produkt byl pak použit pro přípravu DEN-2 plasmidů pro konjugaci s 3' koncovým primerem, který představuje DEN-2 sekvenci 1 501 až 1 522 a ohraničuje Sph I, aby došlo k vytvoření 1 800 párů bází velkého konečného PCR produktu, který zahrnuje YF sekvenci od Not I restrikčního místa přes SP6 promotor, YF5' netranslatovatelnou oblast a YF C protein sousedící s DEN-2 prM-E1522 sekvencí. PCR produkt byl ligován do YF5'3'IV za použití Not I a Sph I restrikčních míst, aby výsledkem ligace byl YF5 '3 TV/DEN(prM-E) plasmid.
Konstrukce chimérických templátů dalších flavivirů - procedury pro vytváření celodélkových cDNA templátů kódujících chimérické YF/MVE, YF/SLE, YF/WN, YF/TBE viry jsou podobné těm, které byly popsané výše pro YF/DEN-2 systém. Tabulka 6 zobrazuje rysy strategie pro vytváření chimérických virů na základě YF17D. Unikátní restrikční místa použitá pro in vitro ligaci a chimérické primery pro vytváření C/prM a E/NSI spojení jsou také dobře známy. Zdroje cDNA pro tyto hetelognní flaviviry jsou lehce přístupné (MVE: Dalgarno et al., J. Mol. Biol. 187:309-323, 1986; SLE: Trente/íz/., Virology 156:293-304, 1987; TBE: Mandl etal., Virology 166:197-205, 1988; Dengue 1: Mason et al., Virology 161:262-267, 1987; Dengue 2: Deubel et al., Virology 155:365-377, 1986; Dengue3: Hahn et al., Virology 162:167-180, 1988; Dengue 4: Zhao etal, Virology 155:77-88, 1986).
Alternativní přístup k vytváření dalších chimérických virů je vytvořit C/prM spojení ligaci tupých konců restrikčních fragmentů, které bylo připraveny PCR, a které mají konce, které se setkávají v tomto spojení a 5' a 3' konce, které ohraničují vhodná restrikční místa pro zavedení •99 9 99 99 99
999 9999 9999
9999 999 9999 · 9999 9 9999 999 999
999 999 9 9
9 999 99 99 99 do YF5'3'IV nebo do intermediátového plasmidů takového, jako je pBS-KS(+). Volba použít chimérické oligonukleotidy nebo ligaci tupých konců může být různá, závisí na vhodnosti unikátních restrikčních míst uvnitř obálkového proteinu kódujícího oblast uvažovaného viru. Konstrukce virů kódujících HCV antigeny - protože strukturní proteiny El a E2 HCV nejsou homolognní k strukturním proteinům flavivirů, které byly popsány výše, strategie pro expresi těchto proteinů obsahuje inzerci uvnitř vedlejší oblasti genomu, takže všechny tyto proteiny jsou pak spoluexprimovány s proteiny žluté horečky během replikaci viru v infikovaných buňkách. Oblast vybraná pro inzerci proteinů je N koncové části NS1 proteinu, protože celý NS1 protein není nezbytný pro virální replikaci. Z důvodu potenciálních problémů se stabilitou YF genomu v přítomnosti heterologní sekvence převyšující normální velikost genomu (přibližně 10 000 nukleotidů), může být použita detekční strategie popsaná níže. Kromě toho delece vNSl může být výhodná v chimérickém YF/flavivirus systému popsaném výše, protože částečná delece tohoto proteinu může odstranit imunitu kYF asociovanému s protilátkami proti NS1 a tedy vyhnout se problémům s vektorovou imunitou, jestliže více než jedna chimérická vakcína byla nezbytně podána recipientovi nebo jestliže YF vakcína byla dříve podána nebo by byla potřeba v budoucnosti.
Strategie zahrnuje vytvoření série delecí v rámci uvnitř NS1 kódující oblasti YFM5.2 plasmidů v konjugaci s vytvořením translačního terminačního kodonu na konci E a sérii dvou IRES (vnitřní ribozomální vstupní místo). Jedno IRES je ihned downstream od terminačního kodonu a dovoluje expresi z otevřeného čtecího rámce uvnitř oblasti mezi E a NS1. Druhé IRES iniciuje translaci z okleštěných NS1 proteinů, zajišťující expresi zbytku YF nestrukturních polyproteinů. Tyto deriváty byly testována na schopnost vytvořit infekční virus a konstrukt s největší delecí byl použit pro inzerci cizorodých sekvencí (např.: HCV proteiny) v oblasti prvního IRES. Tento jednotlivý konstrukt může také sloužit jako základ pro určování zda bude delece v NS1 působit vektorovou specifickou imunitu v kontextu YF/Flavivirus chimérických virů exprimujících prM-E, jak bylo popsána výše.
Inzerce nukleotidů kódujících El, E2 a/nebo El plus E2 HCV proteiny je limitována velikostí tolerované delece vNSl proteinu. Z toho důvodu okleštěné HCV proteiny mohou být použity k zesílení stability uvnitř modifikovaného YF klonu. HCV proteiny jsou vytvářeny s N-koncovou signální sekvencí ihned následovanou IRES a s terminačním kodonem na C konci. Tato konstrukce bude řídit HCV proteiny směrem do endoplasmatického retikula z důvodu sekrece ven z buněk. Strategie této konstrukce je schématicky ukázána na obrázku 6. Plasmid kódující HCV proteiny genotypu I může být použit pro tyto konstrukce, například HCV plasmidy získané od Dr. Charlese Riceho z Washington University (Grakoui et al., J. Virology • ·
67:1385-1395, 1993), který exprimoval tuto virovou oblast v upravených systémech a uvnitř replikačně-komplementárních celodélkových HCV klonů.
PrM štěpené deleční mutanty jako kandidáti oslabené vakcíny pro flaviviry - další chimérické viry zahrnuté v předkládaném vynálezu obsahují mutace, které zabraňují štěpení prM takové, jako mutace v prM štěpícím místě. Například prM štěpící místa ve flavivirových infekčních klonech, které jsou předmětem zájmu takové, jako jsou dengue, TBE, SLE a další mohou být mutována místní přímou mutagenezí. Jakákoliv nebo všechny aminokyseliny v štěpícím místě, tak jako výše popsané, mohou být deletovány nebo substituovány. Fragment nukleové kyseliny obsahující mutované prM-Ε geny může být pak vnesen do vektoru viru žluté horečky metodami, které byly popsány výše. PrM delece může být použita s nebo bez ostatních zeslabujících mutací, například mutací v E proteinu, aby byla pak vnesena do viru žluté horečky. Tyto mutanty mají výhody oproti jednou substituovaným mutantům coby kandidátům na vakcínu, protože je téměř nemožné vrátit zpět deletovanou sekvenci a obnovit tak virulenci.
Následující chimérické flaviviry podle předkládaného vynálezu byly umístěny do American Type Culture Collection (ATCC) vRockville, Maryland, U.S.A v souladu s Budapešťskou smlouvou a bylo jim uděleno datum umístění 6. ledna 1998: chimérický žlutá horečka 17D/dengue typ 2 virus (YF/DEN-2; ATCC přístupové číslo ATCC VR-2593) a chimérický žlutá horečka 17D/japonská encefalitida SAu-14-2 virus (YF/JE A1.3; ATCC přístupové číslo ATCC VR-2594).
Tabulka 1 - charakterizace YF/JE chimér
| klon | výtěžek (gg) | infekticivita plaky/100 ng llc-mk2 | PBS log titr VĚRO | RNAsa log titr VĚRO | DNAsa log titr VĚRO |
| YF5.21 v | 5,5 | 15 | 7,2 | 0 | 7 |
| YF/JE-S | 7,6 | 50 | 6,2 | 0 | 6,2 |
| YF/JE-A | 7 | 60 | 5 | 0 | 5,4 |
• 99
9 ·
| Tabulka 2 - porovnání sekvencí JE kmenů a YF/JE chimér | ||||||||
| virus | E | E | E | E | E | E | E | E |
| 107 | 138 | 176 | 177 | 227 | 243 | 244 | 279 | |
| JE SA14- 14-2 | F | K | V | T | S | K | G | M |
| YF/JE SAu-14-2 | F | K | V | A | S | E | G | M |
| YF/JE NAK | L | E | I | T | P | E | E | K |
| JENAK | L | E | I | T | P | E | E | K |
| JE SAh | L | E | I | T | s | E | G | K |
| Tabulka 3 - plakové redukční neutralizační titry na YF/JE chimérách | |||||
| virus | neimunní ascitická kapalina | YF ascitická kapalina | JE ascitická kapalina | neimunní IgG | YFIgG |
| YF5.2iv | <1,3 | 3,7 | <1,3 | <2,2 | >4,3 |
| JE SA14- 14-2 | <1,3 | <1,3 | 3,4 | <2,2 | <2,2 |
| YF/JE SA,4- 14-2 | - <1,3 | <1,3 | 3,1 | <2,2 | <1,9 |
| YF/JE Nakayama | <1,3 | <1,3 | 3,4 | <2,2 | <2,2 |
• ·
Tabulka 4 - neurovirulence YF/JE SAi4-14-2 chiméry, 3 týdny staré samčí ICR myši
YF5.2ÍV
YF/JE SA14-14-2 YF/JE SA,4-14-2 YF/JE SA,4-14-2 log dávky I.C. 4 % úmrtnosti 100 (7/7) (0/7) (0/7) (0/8)
Tabulka 5 - neuroivazivnost YF/JE chimér, 3 týdny staré samčí ICR myši log dávky (intraperitoneální) % úmrtnosti
| YF/JE Nakayama | 4 | 0 | (0/5) |
| YF/JE Nakayama | 5 | 0 | (0/4) |
| YF/JE Nakayama | 6 | 0 | (0/4) |
| YF/JE SA,4-14-2 | 4 | 0 | (0/5) |
| YF/JE SAi4-14-2 | 5 | 0 | (0/4) |
| YF/JE SA,4-14-2 | 6 | 0 | (0/4) |
| Tabulka 6 - vytvoření Y/Flavivirus chimér |
| virus | chimérické C/prM | chimérické E/NS1 | 5' 3' místa5 |
| spojení1 | spojení2 | ligace ligace elimino- | |
| váno nebo | |||
| (změněno) | |||
| YF/WN | X-cactgggagagcttgaaggtc | aaagccagttgcagccEcggtttaa | Aat II Nsi I |
| (SEQ ID NO: 1) | (SEQ ID NO: 2) | ||
| YF/DEN-1 | X-aaggtagactggtgggctccc | gatcctcagtaccaaccgcggtttaa | Aat JI Sphl SphlvOEN |
| (SEQ ID NO: 3) | (SEQ ID NO: 4) | ||
| YF/DEN-2 | X-aaggtagattggtgtgcattg | aaccctcagtaccacccgcggtttaa | Aat li Sphl |
| (SEQ ID NO: 5) | (SEQ ID NO: 6) |
• · · · 0 0 0 · · · · • * 0000 0 0 0 00 000 «00 • 00 000 0 0
| YF/DEN-3 | X-aaggtgaattgaagtgctcta (SEQ ID NO: 7) | accccca gcaccacccgcggtttaa (SEQ ID NO: 8) | Aat II | Sphl | Xho I v DEN (Sph I v DEN) |
| YF/DEN-4 | X-aaaaggaacagttgttctcta (SEQ ID NO: 9) | acccgaa gtgtcaaccgcggtttaa (SEQ ID NO: 10) | Aat II | Nsi I | |
| YF/SLE | X-aacgtgaatagttggatagtc (SEQ ID NO: 11) | accgttggtcgcacccgcggtttaa (SEQ ID NO: 12) | Aat I | Sph I | Aat I v SLE |
| YF/MVE | X-aatttcgaaaggtggaaggtc (SEQ ID NO: 13) | gaccggtgtttacagccgcggtttaa (SEQ ID NO: 14) | Aat II | Agel | (Age I v YF) |
| YF/TBE | X-tactgcgaacgacgttgccac (SEQ ID NO: 15) | actgggaacctcacccgcggtttaa (SEQ ID NO: 16) | Aat Π | Agel | (Age I v YF) |
2 ’ : sloupec znázorňuje oligonukleotidy použité pro vyrvoření chimérických YF/flavivirus primerů, které odpovídají C/prM nebo E/NS1 spojení, (v textu). X = karboxylový konec kódující sekvence YF kapsidy. Podtrhnutá oblast odpovídá cílené heterologní sekvenci ihned upstream od Nar I restrikčního místa (opačná sekvence - ccgcgg). Toto místo dovoluje začlenění PCR produktů do YFM5.2 (Nar I) plasmidu, který je nezbytný pro vytvoření celodélkových cDNA templátů. Další nukleotidy jsou specifické pro heterologní virus. Oligonukleotidové primery jsou zapsány v orientaci od 5' konce k 3' konci.
3,4 : Unikátní restrikční místa použitá pro vytvoření restrikčních fragmentů, které mohou být izolovány a ligovány in vitro, aby mohlo dojít k produkci celodélkových chimérických cDNA templátů jsou zde zapsána. Protože některé sekvence neobsahují vhodná místa, je v některých případech nezbytné vhodná místa vytvořit (poznámka 5).
5 : V závorkách jsou místa pro restrikční enzymy, která musí být vytvořena buď v YF páteři nebo v heterologním virus, aby umožnila účinnou in vitro ligaci. Restrikční místa, která nejsou v závorkách musí být eliminována. Všechny tyto modifikace jsou prováděny tichou mutagenezí cDNA pro určitý klon. Prázdná místa označují, že nebyly potřeba žádné modifikace.
Ostatní části jdou uvedeny v následujících patentových nárocích. Například geny prM-E proteinu dalších flavivirů, které jsou důležité z medicínského hlediska, mohou být vneseny do vakcíny s páteří viru žluté horečky, aby mohlo dojít k produkci vakcín proti dalším medicínsky • · · · · · ·· • · · · · · · ftftft • ftft* ··· · · · v ······ · · · · ··· ftftft ftftft · · • ft · ····· ♦· ftft zajímavým flavivirům (Monath eí al., „Flaviviruses“, ve Virology, Fields (ed.), RavenLippincott, New York, 1995, Volume I, 961-1034).
PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH
Obrázek 1 je schématickým představením kroků genetické manipulace, které byly provedeny, aby byl zkonstruován chimérický virus podle předkládaného vynálezu virus žluté horečky/virus japonské encefalitidy (YF/JE).
Obrázek 2 zobrazuje sadu růstových křivek pro chimérické viry YF/JE podle předkládaného vynálezu v buněčné kultuře akceptovatelné pro přípravu lidské vakcíny.
Na obrázku 3 je graf ukazující porovnání růstu mezi RMS (Research Master Seed, YF/JE SAi414-2) a YF-Vax v MRC-5 buňkách.
Na obrázku 5 jsou schématicky uvedeny dva plasmidové systémy, které jsou nutné pro vytvoření chimérického YF/DEN-2 viru. Strategie je hlavně popsána pro YF/JE chimérický virus.
Na obrázku 6 je schématicky zobrazena struktura modifikovaných YF klonů vytvořených, aby byly deletovány částí NS1 proteinu a/nebo exprimovány cizí proteiny pod kontrolou vnitřního ribozomálního vstupního místa (IRES). Obrázek ukazuje pouze E/NS1 oblast virálního genomu. Translační stop kodon je zaveden na karboxylový konec obálkového (E) proteinu. Downstream translace je zahajována uvnitř intergenového otevřeného čtecího rámce (ORF) pomocí IRES-1, což je cizí protein, který řídí expresi (např.: HCV proteiny El a/nebo E2). Druhý protein IRES (IRES-2) kontroluje iniciaci translace YF nestrukturní oblasti, v které jsou nahromaděné a ohraničené NS1 proteiny (např.: NSldel-1, Nsdel-2 nebo NSldel-3) exprimovány. Rozměr NS1 delece je inverzně úměrný tomu, jak se IRES-1 připojuje na ORF.
Na obrázku 7 je graf, který ukazuje neutralizační odpověď protilátky u myší, které byly imunizovány YF/JE SAí4-14-2 chimérickou vakcínou.
PŘÍKLAD PROVEDENÍ VYNÁLEZU
Příklady dalších flavivirů, z jejichž vynášených genů mohou být získány chimérické vektory podle předkládaného vynálezu, zahrnují např.: Kunjin virus, středoevropský encefalitický virus, ruský jaro-letní encefalitický virus, Powassan virus, Kyasanur Forest Disease virus a virus omské hemoragické horečky. Kromě toho mohou být vnášeny do vakcíny viru žluté horečky dokonce geny z mnohem vzdáleněji příbuzných virů za účelem vytvoření nových vakcín.
• · ··· · · · · ·»·· ···· · · · ···· • ·····« · · · · tlt · · · ··· · · · · ·
Výroba vakciny a její použití - vakciny podle předkládaného vynálezu jsou podávány v množstvích a za použití způsobů, které mohou být ihned určeny osobou, která má zkušenosti se stavem techniky. Vakciny mohou být podávány vytvářeny například'stejným způsobem, jako vakcina žluté horečky 17D např.: jako vyčištěná suspenze tkáně infikovaného kuřecího embrya nebo kapalina získaná z buněčných kultur infikovaných chimérickým virem žluté horečky. Tudíž živý, oslabený chimérický virus je vytvořen jako sterilní vodný roztok, který obsahuje mezi 100 a 1 000 000 infekčních jednotek (např.: plak tvořících jednotek nebo infekčních dávek tkáňové kultury) v dávce o objemu od 0,1 do 1,0 ml, aby byl podáván například intramuskulární, podkožní nebo intradermální cestou. Navíc, protože flaviviry mohou být schopné infikovat lidského hostitele přes sliznice taková, jako je orální cesta (Gresikova et al., „Tick-borne Encephalitis“, v The Arboviruses, Ecology and Epidemilogy, Monath (ed.), CRC Press, Boča Raton, Florida, 1988, Volume IV, 177-203), může být virová vakcina podávána přes sliznice, aby bylo dosaženo ochranné imunitní odpovědi. Vakcina může být podávána jako primární profylaktické činidlo dospělým nebo dětem v případě nebezpeční flavivirové infekce. Vakciny mohou také být použity jako sekundární činidla pro léčbu pacientů, kteří byly infikováni flaviviry, aby stimulovaly imunitní odpověď proti flavivirům.
Může být žádoucí použít vakciny vektorového systému žluté horečky pro imunizaci hostitele proti jednomu viru (například proti viru japonské encefalitidy) a později přeočkovat stejného jedince proti druhému nebo třetímu viru za použití odlišného chimérického konstruktu. Hlavní výhodou chimérického systému žluté horečky je, že vektor nebude sám vyvolávat silnou imunitní odpověď. Ani nebude dřívější imunita proti viru žluté horečky znemožňovat použití chimérické vakciny, jako vektoru pro heterologní genovou expresi. Tyto výhody jsou z důvodu odstranění části E genu vakciny žluté horečky, která kóduje neutralizující (ochranné) antigeny žluté horečky, a zaměnění za jiné heterologní geny, které neumožňují křížové ochranu proti žluté horečce. Ačkoliv nestrukturní proteiny viru YF17D mohou hrát roly v ochraně například vyvoláváním tvorby protilátek proti NS1, které jsou obsaženy v komplementárně-dependentní protilátce zprostředkovávající lyži infikovaných buněk (Schlesinger et al., J. Immunology 135:2805-2809), nebo zahrnutím cytotické odpovědi T buněk na NS3 nebo jiné virální proteiny, je nepravděpodobné, že tyto odpovědi budou rušit schopnost živé virové vakciny stimulovat neutralizační protilátky. Toto je podpořeno fakty, že (1) jedinci, kteří byly dříve infikováni JE virem, odpovídali na vakcinaci YF17D podobně, jako osoby, které nebyly dříve JE virem infikováni, a (2) jedinci, kteří dříve obdržely YF17D vakcínu odpovídali na přeočkování vzrůstajícími titry neutralizačních protilátek (Sweet et al., AM. J. Trop. Med. Hyg. 11:562-569, 1962). Tudíž chimérický vektor může být použit v populacích, které jsou imunní vůči žluté • · · • 9 9 • 9 9 9
9 9999 • · · ·· ·· • · 9
9 9
999 999 • 9
9 9 9 horečce bez ohledu na předchozí přirozenou infekci nebo vakcinaci, a může být použit opakovaně nebo pro simultánní imunizaci nebo následnou imunizaci řadou odlišných konstruktů, které zahrnují chiméry žluté horečky s inzerty z například japonské encefalitidy, St. Louis encefalitického viru nebo Západonilského viru.
Pro vakcinační aplikace mohou být použity pomocné látky, které jsou známé těm, kteří se zajímají o stav techniky. Pomocné látky, které mohou být použity, aby zesílily imunogenicitu chimérických vakcin, zahrnují například lipozomální formulace, synthetické pomocné látky takové, jako jsou saponiny (např.: QS21), muramyl dipeptid, monofosforyl lipid A nebo polyfosfazin. Ačkoliv tyto pomocné látky jsou obvykle používány pro zesílení imunitních odpovědí u inaktivovaných vakcin, mohou být také použity v případě živých vakcin. V případě chimérické vakcíny dopravované přes sliznice, například orálně, jsou použitelné pomocné látky takové, jako je tepelně-labilní toxin zE. coli (LT) nebo mutantní deriváty LT. Kromě toho geny kódující cytokiny, které mají aktivitu pomocných látek, mohou být vneseny do vektorů žluté horečky. Tudíž geny kódující cytokiny takové, jako jsou GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 nebo IL-5, mohou být vneseny společně s heterologními flavivirovými geny, aby docházelo k produkci vakcíny, která ve výsledku zesiluje imunitní odpovědi nebo zmírňuje imunitu zaměřenou více specificky směrem k buněčným, humorálním nebo sliznicovým odpovědím. Kromě toho jako aplikace vakcíny tak, jak jim bude ten, kdo zná stav techniky ihned rozumět, mohou být vektory podle předkládaného vynálezu použity v metodách genové terapie, aby byly zavedeny do buněk pacienta produkty terapeutických genů. V těchto metodách jsou geny kódující terapeutické genové produkty zavedeny do vektorů, například v místě genu kódujícího prM-E protein.
Další výhodou vektorového systému žluté horečky je, že se flaviviry replikují v cytoplasmě buněk, takže virová replikační strategie nezahrnuje integraci virového genomu do genomu hostitelských buněk (Chambers et al. (1990) „Flavivirus Genome Organization, Expression, and Replication“, v Annual Review of Microbiology 44:649-688), což zajišťuje důležitou míru bezpečnosti.
Všechny odkazy zde citované jsou začleněny jako reference v jejich úplnosti.
Seznam sekvencí (1) obecné informace (i) přihlašovatel: OraVax, lne., et al.
(ii) název vynálezu: CHIMERIC FLAVIVIRUS VACCINES • toto • · · • to to · • ·toto·· · • · · ·· toto • > > · · to tototo· • · ··· ··· • ·· *· ·· (iii) počet sekvencí: 16 (iv) korespondenční adresa:
(a) adresa: Clark & Elbing LLP (b) ulice: 176 Federal Street (c) město: Boston (d) stát: MA (e) země: USA (f) směrovací číslo: 02110 (v) forma čitelná počítačem:
(a) typ média: disketa (b) počítač: kompatibilní s IBM (c) operační systém: DOS (d) software: FastSEQ pro Windows verze 2.0 (vi) v současnosti přihlašovaná data:
(a) aplikační číslo:
(b) datum vyplnění: 2. březen 1998 (c) klasifikace:
(vii) dříve přihlášená data:
(a) aplikační číslo: 08/807,445 (b) datum vyplnění: 28. únor 1997 (viii) dříve přihlášená data:
(a) aplikační číslo: neznámé (b) datum vyplnění: 15. leden 1998 (ix) právní zástupce/agent informace:
(a) jméno: Clark, Paul T (b) registrační číslo: 30, 162 (c) odkaz/soudní číslo: 06132/033W02
φφ φφ • φ φ • φ φ φφ · •
φφφ φ
φφ (χ) telekomunikační informace:
(a) telefon: 617-428-0200 (b) telefax: 617-428-7045 (c) telex:
(2) informace o SEQ ID NO: 1:
(i) ' charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
CA.CTGGGAGA GCTTGAAGGT C (2) informace o SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
AAAGCCAGTT GCAGCCGCGG TTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 3 :
4
• 4
4444 •4 44 49
4 4 9 4 4
9 4 4 4 9
94 444 444
9 4 9
44 49 (i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
AAGGTAGACT GGTGGGCTCC C (2) informace o SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 26 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
GATCCTCAGT ACCAACCGCG GTTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární
00 • » · 0
0 0 0
000 000
0
00 (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
AAGGTAGATT GGTGTGCATT G (2) informace o SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 26 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
AACCCTCAGT ACCACCCGCG GTTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 7:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
AAGGTGAATT GAAGTGCTCT A ·· 9 • · · • · · · • · · 9 · ·
9 9
9
99 99
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
99 999 999
9 9 9
99 99 99 (2) informace o SEQ ID NO: 8:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
ACCCCCAGCA CCACCCGCGG TTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 9:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
AAAAGGAACA GTTGTTCTCT A (2) informace o SEQ ID NO: 10:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý ** · • « * • · · » • *·.··· ·
99 99
9 9 9 9 ·
9 9 9 9 9
99 999 999
9 9 9
99 99 (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
ACCCGAAGTG TCAACCGCGG TTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 11:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie; lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
AA.CGTGAATA GTTGGATAGT C (2) informace o SEQ ID NO: 12:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
**» · * · · • ♦ · · • · »11» t • 9 ·
9« « • 9 • · *9 • 9 99 • 9 9 9
9 9 9
999 999
9 «9 99
ACCGTTGGTC GCACCCGCGG TTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 13 :
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
AATTTCGAAA GGTGGAAGGT C (2) informace o SEQ ID NO: 14:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 26 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
GACCGGTGTT TACAGCCGCG GTTTAA (2) informace o SEQ ID NO: 15:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 21 párů bází
I 49 · · * • · · · • 9 ···· ·
9 9
9 fc ·· 99 99
9 9 · 9 « 9
9 9 · 9 · ·
99 999 999 • 9 9 9 9
Ul 99 99 «9 (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
TACTGCGAAC GACGTTGCCA C (2) informace o SEQ ID NO: 16:
(i) charakteristika sekvence:
(a) délka: 25 párů bází (b) typ: nukleová kyselina (c) řetězec: jednoduchý (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
ACTGGGAACC TCACCCGCGG TTTAA • · · • · · · · · ··· · · · · ··
Claims (21)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Chimérický, živý, infekční, oslabený virus, který zahrnuje virus žluté horečky, v kterém je nukleotidová sekvence kódující prM-E protein buď deletována, okleštěná nebo zmutována, takže není exprimován funkční prM-E protein viru žluté horečky, a do genomu tohoto viru žluté horečky je integrována nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flaviviru, takže prM-E protein tohoto druhého flaviviru exprimován je.
- 2. Chimérický virus podle nároku 1 vyznačující se tím, že druhým flavivirem je virus japonské encefalitidy (JE).
- 3. Chimérický virus podle nároku 1 vyznačující se tím, že druhým flavivirem je virus dengue vybraný ze skupiny zahrnující typy virů dengue 1 až 4.
- 4. Chimérický virus podle nároku 1 vyznačující se tím, že druhý virus je vybrán ze skupiny zahrnující Murray Valley encefalitický virus, St. Louis encefalitický virus, Západonilský virus, virus klíšťové encefalitidy, viry hepatitidy C, Kunjin virus, středoevropský encefalitický virus, ruský jaro-letní encefalitický virus, Powassan virus, Kyasanur Forest Disease virus a virus omské hemoragické horečky.
- 5. Chimérický virus podle nároku 1 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flaviviru, nahrazuje nukleotidovou sekvenci kódující prM-E protein virus žluté horečky.
- 6. Chimérický virus podle nároku 1 vyznačující se tím, že tato nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flaviviru, obsahuje mutaci, která zabraňuje štěpení prM, aby mohlo dojít k produkci M proteinu.
- 7. Chimérický virus podle nároku 1 vyznačující se tím, že signální sekvence v C/prM a E/NS1 spojeních jsou udržovány v konstrukci zmíněného chimérickém flaviviru.
- 8. Použití chimérického živého, infekčního oslabeného viru pro přípravu léčiv pro prevenci nebo léčbu flavivirových infekcí u pacientů; chimérický, živý, infekční oslabený virus zahrnuje virus žluté horečky, v kterém je nukleotidová sekvence kódující prM-Ε protein buď deletována, • · • · · · • toto to okleštěná nebo zmutována, takže není exprimován funkční prM-E protein viru žluté horečky, a do genomu tohoto viru žluté horečky je integrována nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flaviviru, takže prM-Ε protein tohoto druhého flaviviru exprimován je.
- 9. Použití podle nároku 8 v němž druhým flavivirem je virus japonské encefalitidy (JE).
- 10. Použití podle nároku 8 v němž druhým flavivirem je virus dengue vybraný ze skupiny zahrnující typy virů dengue'1 až 4.
- 11. Použití podle nároku 8 v němž druhý flavivirus je vybrán ze skupiny zahrnující Murray Valley encefalitický virus, St. Louis encefalitický virus, Západonilský virus, virus klíšťové encefalitidy, viry hepatitidy C, Kunjin virus, středoevropský encefalitický virus, ruský jaro-letní encefalitický virus, Powassan virus, Kyasanur Forest Disease virus a virus omské hemoragické horečky.
- 12. Použití podle nároku 8 v němž nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flaviviru, nahrazuje nukleotidovou sekvenci kódující prM-E protein virus žluté horečky.
- 13. · Použití podle nároku 8 v němž tato nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flaviviru, obsahuje mutaci, která zabraňuje štěpení prM, aby mohlo dojít k produkci M proteinu.
- 14. Použití podle nároku 8 v němž signální sekvence vC/prM a E/NS1 spojeních jsou udržovány v konstrukci zmíněného chimérickém flaviviru.
- 15. Molekula nukleové kyseliny kódující chimérický živý, infekční oslabený virus, který zahrnuje virus žluté horečky, v kterém je nukleotidová sekvence kódující prM-Ε protein buď deletována, okleštěná nebo zmutována, takže není exprimován funkční prM-Ε protein viru žluté horečky, a do genomu tohoto viru žluté horečky je integrována nukleotidová sekvence kódující prM-Ε protein druhého, odlišného flaviviru, takže prM-Ε protein tohoto druhého flaviviru exprimován je.• · • ·
- 16.. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 15 u níž druhým flavivirem je virus japonské encefalitidy (JE).
- 17. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 15 u níž druhým flavivirem je virus dengue vybraný ze skupiny zahrnující typy virů dengue 1 až 4.
- 18. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 15 u níž druhý flavivirus je vybrán ze skupiny zahrnující Murray Valley encefalitický virus, St. Louis encefalitický virus, Západonilský virus, virus klíšťové encefalitidy, viry hepatitidy C, Kunjin virus, středoevropský encefalitický virus, ruský jaro-letní encefalitický virus, Powassan virus, Kyasanur Forest Disease virus a virus omské hemoragické horečky.
- 19. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 15 u níž nukleotidová sekvence kódující prME protein druhého, odlišného flaviviru, nahrazuje nukleotidovou sekvenci kódující prM-E protein virus žluté horečky.
- 20. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 15 u níž tato nukleotidová sekvence kódující prM-E protein druhého, odlišného flaviviru, obsahuje mutaci, která zabraňuje štěpení prM, aby mohlo dojít k produkci M proteinu.
- 21. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 15 u níž signální sekvence v C/prM a E/NS1 spojeních jsou udržovány v konstrukci zmíněného chimérickém flaviviru.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80744597A | 1997-02-28 | 1997-02-28 | |
| US766498A | 1998-01-15 | 1998-01-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ306499A3 true CZ306499A3 (cs) | 2000-01-12 |
| CZ300172B6 CZ300172B6 (cs) | 2009-03-04 |
Family
ID=26677253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0306499A CZ300172B6 (cs) | 1997-02-28 | 1998-03-02 | Chimerický živý, infekcní, oslabený virus, lécivopro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP2251036A1 (cs) |
| JP (2) | JP4504464B2 (cs) |
| KR (1) | KR100517323B1 (cs) |
| CN (1) | CN1187088C (cs) |
| AT (2) | ATE468858T1 (cs) |
| AU (1) | AU740961B2 (cs) |
| BR (1) | BR9807873A (cs) |
| CA (1) | CA2282790C (cs) |
| CZ (1) | CZ300172B6 (cs) |
| DE (2) | DE69841690D1 (cs) |
| DK (2) | DK0977587T3 (cs) |
| ES (2) | ES2345614T3 (cs) |
| HK (1) | HK1025743A1 (cs) |
| HU (1) | HU228705B1 (cs) |
| IL (4) | IL131600A0 (cs) |
| NO (1) | NO329693B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ337522A (cs) |
| PL (1) | PL192957B1 (cs) |
| PT (2) | PT1625852E (cs) |
| RU (1) | RU2209082C2 (cs) |
| WO (1) | WO1998037911A1 (cs) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962708B1 (en) | 1997-02-28 | 2005-11-08 | Acambis, Inc. | Chimeric flavivirus vaccines |
| AU778988B2 (en) | 1998-06-04 | 2004-12-23 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| US7227011B2 (en) * | 1998-06-04 | 2007-06-05 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| US7009044B1 (en) * | 1999-06-04 | 2006-03-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | HCV/BVDV chimeric genomes and uses thereof |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| WO2001039802A1 (en) * | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Oravax, Inc. | Chimeric flavivirus vaccines |
| US6589531B1 (en) * | 2000-01-21 | 2003-07-08 | The Regents Of The University Of California | Recombinant yellow fever virus and method of use thereof |
| DE60137491D1 (de) * | 2000-02-10 | 2009-03-12 | Us Gov Nat Inst Health | Vollständiger, infektiöser cdna klon des tick borne flavivirus |
| AU3844101A (en) | 2000-02-16 | 2001-08-27 | Us Health | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| AU2007202304B2 (en) * | 2001-04-04 | 2010-03-18 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| FR2823222B1 (fr) * | 2001-04-06 | 2004-02-06 | Merial Sas | Vaccin contre le virus de la fievre du nil |
| US7740863B2 (en) | 2001-04-06 | 2010-06-22 | Merial | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
| EP2305299B1 (en) | 2001-05-31 | 2017-03-01 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Chimeric alphavirus replicon particles |
| US20030232324A1 (en) | 2001-05-31 | 2003-12-18 | Chiron Corporation | Chimeric alphavirus replicon particles |
| CN1551782A (zh) | 2001-06-01 | 2004-12-01 | ��������ķ������ | 嵌合黄病毒载体 |
| US6682883B1 (en) * | 2001-07-19 | 2004-01-27 | Acambis, Inc. | Diagnosis of flavivirus infection |
| RU2313367C2 (ru) * | 2001-10-19 | 2007-12-27 | Экэмбис, Инк. | Способы профилактики и лечения инфекции, вызываемой флавивирусами у животных |
| EP1461441A4 (en) * | 2001-11-26 | 2006-02-22 | Univ Queensland | FEEDING SYSTEM FOR FLAVIVIRUS VACCINES |
| EP1471873A4 (en) | 2002-01-15 | 2005-03-16 | Acambis Inc | VACCINES AGAINST FLAVIVIRUS |
| DE60233038D1 (de) | 2002-06-20 | 2009-09-03 | Pasteur Institut | Infektiöse cDNA eines zugelassenen Impfstammes des Masern Virus. Verwendung in immunogenen Zusammensetzungen |
| ES2427139T3 (es) | 2002-06-20 | 2013-10-29 | Institut Pasteur | Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna |
| WO2004009764A2 (en) * | 2002-07-19 | 2004-01-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions concerning altered yellow fever virus strains |
| DE60330708D1 (de) | 2002-11-15 | 2010-02-04 | Sanofi Pasteur Biologics Co | Impfstoff gegen das west-nile-virus |
| CA2432738A1 (en) | 2003-02-26 | 2004-08-26 | Philippe Despres | New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications |
| WO2005040390A1 (fr) * | 2003-07-21 | 2005-05-06 | Shanghai Tengen Biomedical Co., Ltd. | Vaccin recombine utilisant le virus de la fievre jaune comme vecteur |
| CN1304579C (zh) * | 2003-07-21 | 2007-03-14 | 上海天甲生物医药有限公司 | 重组的以黄热病病毒为载体的疫苗 |
| CN103088038B (zh) * | 2004-07-12 | 2015-06-24 | 美国天甲生物医药有限公司 | 黄病毒疫苗 |
| EA015907B1 (ru) * | 2004-10-20 | 2011-12-30 | Санофи Пастер Байолоджикс Ко. | Рекомбинантный флавивирус и его применение |
| CA2591665C (en) | 2004-12-20 | 2015-05-05 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof |
| AU2005320001B2 (en) | 2004-12-24 | 2011-05-19 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated Japanese encephalitis virus gene as backbone |
| BRPI0609949A2 (pt) | 2005-04-24 | 2010-05-11 | Acambis Inc | flavivìrus recombinante, seu uso na preparação de vacina, composição farmacêutica compreendendo o mesmo, molécula de ácido nucléico e método para atenuar candidato a vacina de flavivìrus |
| AU2006245734C1 (en) | 2005-05-12 | 2012-05-24 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| BRPI0504945B8 (pt) | 2005-10-31 | 2022-08-02 | Fundacao Oswaldo Cruz | Método para a produção de flavivirus recombinante contendo sequências de nucleotídeos codificantes de uma proteína heteróloga, constructo de dna, flavivirus, e, composição vacinal para imunizar contra flavivirus e/ou outros patógenos. |
| CU23586A1 (es) | 2005-11-22 | 2010-10-30 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Métodos y proteínas para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los cuatro serotipos del virus de dengue y otros flavivirus |
| CA2654712C (en) | 2006-06-06 | 2015-05-05 | Crucell Holland B.V. | Human binding molecules having killing activity against staphylococci and uses thereof |
| RU2009105099A (ru) | 2006-07-14 | 2010-08-27 | Санофи Пастер Байолоджикс Ко. (Us) | Конструирование рекомбинантных вирусных вакцин путем прямой транспозон-опосредованной инсерции чужеродных иммунологических детерминант в белки векторного вируса |
| FR2906724B1 (fr) | 2006-10-04 | 2009-03-20 | Sanofi Pasteur Sa | Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue. |
| RU2541784C2 (ru) | 2006-11-07 | 2015-02-20 | Санофи Пастер Байолоджикс Ко. | Лиофилизированная композиция для индукции иммунного ответа на флавивирус, композиция и способ для ее получения |
| CA2676689C (en) * | 2007-01-31 | 2014-12-16 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Recombinant bicistronic flavivirus vectors |
| US20110003884A1 (en) * | 2007-02-09 | 2011-01-06 | Pugachev Konstantin V | Viral Vectors and Methods of Use |
| EP2589392B1 (en) | 2008-03-05 | 2016-11-30 | Sanofi Pasteur | Process for stabilizing an adjuvant containing vaccine composition |
| BRPI0908936A2 (pt) * | 2008-03-14 | 2017-03-28 | Sanofi Pasteur Biologics Co | vacinas de flavivírus de replicação defeituosa e vetores de vacina |
| EP2143440A1 (fr) | 2008-07-09 | 2010-01-13 | Sanofi Pasteur | Agent stabilisant et composition vaccinale comprenant un ou plusieurs flavivirus vivants atténués |
| EP2353609A1 (en) | 2010-02-04 | 2011-08-10 | Sanofi Pasteur | Immunization compositions and methods |
| SG11201500412TA (en) | 2012-07-24 | 2015-02-27 | Sanofi Pasteur | Vaccine compositions |
| US20150265695A1 (en) | 2012-07-24 | 2015-09-24 | Sanofi Pasteur | Vaccine compositions for prevention against dengue virus infection |
| KR20150072411A (ko) | 2012-10-03 | 2015-06-29 | 사노피 파스퇴르 | 일본 뇌염, 홍역, 유행성 이하선염, 및 풍진에 대한 백신접종 |
| BR112015012515B1 (pt) | 2012-11-30 | 2023-04-11 | Sanofi Pasteur | Uso de antígenos, construções de ácido nucleico ou vetores virais capazes de expressar uma partícula do tipo vírus (vlp) da dengue e de uma vacina contra sarampo, uma vacina contra caxumba e uma vacina contra rubéola |
| PE20211814A1 (es) | 2013-03-15 | 2021-09-14 | Takeda Vaccines Inc | Composiciones y metodos de construcciones quimericas del virus del dengue en vacunas |
| BR112015031226A2 (pt) | 2013-06-21 | 2017-08-29 | Merck Sharp & Dohme | Composição de vacina, e, uso da composição de vacina |
| CN103352029A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-10-16 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用 |
| TW201620546A (zh) | 2014-09-02 | 2016-06-16 | 賽諾菲巴斯德公司 | 疫苗組合物 |
| EP3031923A1 (en) * | 2014-12-11 | 2016-06-15 | Institut Pasteur | Lentiviral vector-based japanese encephalitis immunogenic composition |
| US10449243B2 (en) | 2014-12-22 | 2019-10-22 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Dengue virus vaccine compositions and methods of use thereof |
| EP3316905A1 (en) | 2015-07-03 | 2018-05-09 | Sanofi Pasteur | Concomitant dengue and yellow fever vaccination |
| CN105400799B (zh) * | 2015-12-22 | 2018-12-28 | 成都生物制品研究所有限责任公司 | 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用 |
| WO2017109698A1 (en) | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic formulation |
| GB201716307D0 (en) * | 2017-10-05 | 2017-11-22 | Univ Leuven Kath | Chimeric yellow fever zika virus strain |
| WO2019069130A1 (en) | 2017-10-05 | 2019-04-11 | Sanofi Pasteur | COMPOSITIONS FOR RECALL VACCINATION AGAINST DENGUE |
| KR20190127605A (ko) * | 2018-05-04 | 2019-11-13 | 에스케이바이오사이언스(주) | 키메라 지카바이러스 백신 |
| WO2020051328A1 (en) | 2018-09-05 | 2020-03-12 | Takeda Vaccines, Inc. | Assay for determining antibody response to dengue virus |
| US11464815B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-10-11 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine unit dose and administration thereof |
| US11426461B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-08-30 | Takeda Vaccines, Inc. | Methods for preventing dengue and hepatitis A |
| MX2021002586A (es) | 2018-09-05 | 2021-06-08 | Takeda Vaccines Inc | Dosis unitaria de vacuna contra el dengue y administracion de esta. |
| GB201814563D0 (en) * | 2018-09-07 | 2018-10-24 | Univ Leuven Kath | Chimeric flavivirus lyssavirus vaccines |
| WO2021034349A1 (en) | 2019-08-16 | 2021-02-25 | Takeda Vaccines, Inc. | Methods for preventing dengue and hepatitis a |
| WO2021174059A1 (en) | 2020-02-27 | 2021-09-02 | Takeda Vaccines, Inc. | Method for removing host cell dna from virus preparation |
| CN113215116B (zh) * | 2021-05-11 | 2022-07-19 | 中国科学院动物研究所 | 基于朝阳病毒载体的嵌合病毒、疫苗及其应用 |
| JPWO2022249757A1 (cs) * | 2021-05-27 | 2022-12-01 | ||
| WO2023147342A2 (en) | 2022-01-25 | 2023-08-03 | Takeda Vaccines, Inc. | Large-scale flaviviral vaccine production and manufacture |
| WO2023158989A1 (en) | 2022-02-15 | 2023-08-24 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine batch mixing process |
| WO2023215383A1 (en) | 2022-05-04 | 2023-11-09 | Takeda Vaccines, Inc. | Computer-based determination of flavivirus infectivity |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL91304A0 (en) * | 1988-08-20 | 1990-03-19 | Us Health | Recombinant vaccinia virus for prevention of disease caused by flavivirus |
| ES2153223T3 (es) * | 1991-09-19 | 2001-02-16 | Us Health | Flavivirus quimericos y/o flavivirus de crecimiento restringido. |
-
1998
- 1998-03-02 DE DE69841690T patent/DE69841690D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 JP JP53790798A patent/JP4504464B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 DK DK98910103T patent/DK0977587T3/da active
- 1998-03-02 PT PT05012770T patent/PT1625852E/pt unknown
- 1998-03-02 AU AU64431/98A patent/AU740961B2/en not_active Expired
- 1998-03-02 BR BR9807873A patent/BR9807873A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-03-02 PL PL335481A patent/PL192957B1/pl unknown
- 1998-03-02 ES ES05012770T patent/ES2345614T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 EP EP10005372A patent/EP2251036A1/en not_active Withdrawn
- 1998-03-02 IL IL13160098A patent/IL131600A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 ES ES98910103T patent/ES2244050T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 KR KR10-1999-7007904A patent/KR100517323B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 AT AT05012770T patent/ATE468858T1/de active
- 1998-03-02 EP EP98910103A patent/EP0977587B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 HU HU0002139A patent/HU228705B1/hu unknown
- 1998-03-02 PT PT98910103T patent/PT977587E/pt unknown
- 1998-03-02 CN CNB988045567A patent/CN1187088C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 DK DK05012770.3T patent/DK1625852T3/da active
- 1998-03-02 CZ CZ0306499A patent/CZ300172B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 EP EP05012770A patent/EP1625852B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 RU RU99120696/14A patent/RU2209082C2/ru active
- 1998-03-02 DE DE69830579T patent/DE69830579T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 NZ NZ337522A patent/NZ337522A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 CA CA2282790A patent/CA2282790C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 AT AT98910103T patent/ATE297757T1/de active
- 1998-03-02 WO PCT/US1998/003894 patent/WO1998037911A1/en active Application Filing
-
1999
- 1999-08-27 NO NO19994185A patent/NO329693B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-08-09 HK HK00104982A patent/HK1025743A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-07-31 IL IL193170A patent/IL193170A/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-10-28 JP JP2009247641A patent/JP2010057496A/ja active Pending
-
2010
- 2010-08-10 IL IL207516A patent/IL207516A0/en unknown
- 2010-08-10 IL IL207517A patent/IL207517A0/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2282790C (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| US6962708B1 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| WO1998037911A9 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| JP5538729B2 (ja) | 偽感染性フラビウイルスおよびそれらの使用 | |
| JP5469336B2 (ja) | 組換えフラビウイルスワクチン | |
| Costa et al. | Protection against dengue type 2 virus induced in mice immunized with a DNA plasmid encoding the non-structural 1 (NS1) gene fused to the tissue plasminogen activator signal sequence | |
| US20060159704A1 (en) | Use of flavivirus for the expression of protein epitopes and development of new live attenuated vaccine virus to immunize against flavivirus and other infectious agents | |
| WO2001039802A9 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| US20070275015A9 (en) | West nile virus vaccine | |
| AU2002235678A1 (en) | Use of flavivirus for the expression of protein epitopes and development of new live attenuated vaccine virus to immune against flavivirus and other infectious agents | |
| MXPA99007949A (es) | Vacunas de flavivirus quimerico |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180302 |