KR101501162B1

KR101501162B1 - 일본 뇌염 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스에 대한 백신

Info

Publication number: KR101501162B1
Application number: KR1020077011389A
Authority: KR
Inventors: 파쉐드 귀라쿠; 지안 리우; 존 에이. 카탈란; 토마스 피이. 모나쓰; 콘스탄틴 브이. 푸가체프
Original assignee: 사노피 파스테르 바이오로직스, 엘엘씨
Priority date: 2004-10-20
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2015-03-16
Also published as: KR20070072597A; IL182453A0; US8029802B2; US20070269458A1; NO20071924L; US8691550B2; NZ584079A; AU2005295438B2; JP2008520187A; WO2006044857A3; SG156666A1; EP1809325B1; WO2006044857A2; MY148075A; HK1106723A1; US20120201852A1; EA015907B1; CA2584228A1; AU2005295438A1; EP1809325A4

Abstract

본 발명은 일본 뇌염 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스에 대한 백신과 같은 약독화된 플라비바이러스 백신 뿐만 아니라 상기 백신의 제조 및 사용방법을 제공한다.

Description

일본 뇌염 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스에 대한 백신 {Vaccines against Japanese Encephalitis Virus and West Nile Virus}

본 발명은 일본 뇌염 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스에 대한 백신에 관한 것이다.

플라비비리대 (Flaviviridae) 과(科)의 플라비바이러스 (Flavivirus) 속(屬)은 대략 70가지 바이러스들을 포함하며, 대부분 황열병 바이러스 (YF), 뎅기 (DEN), 일본 뇌염 (JE), 및 진드기-매개 뇌염 (TBE) 바이러스와 같은 아르보바이러스 (arboviruses)로서, 대다수는 주요한 인간 병원체이다 (rev. in Burke and Monath, Fields Virology, 4^th Ed.: 1043-1126, 2001). 예를 들어, 일본 뇌염은 아시아에서 바이러스성 뇌염의 주요인으로, 매년 30,000 ~ 50,000건의 새로운 증례가 보고된다. 다른 예로써, 첫 번째 증례가 1999년 뉴욕 지역에서 발견되었던 웨스트 나일 바이러스는 전 북아메리카에 걸쳐 빠르게 확산되고 있었다. 남아메리카로 이동한 이러한 바이러스의 위험과 함께 미개발지역에서는 전염병이 극에 달했다. 가 장 비용 효과적인 수단인 예방접종으로, 이러한 바이러스들에 의한 감염을 예방하기 위한 효과적인 방법들이 필요하다.

플라비바이러스 입자는 바이러스 (viral) RNA 및 캡시드 단백질 C (capsid protein C)로 구성된 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid)를 포함한다. 뉴클레오캡시드는 엔벨로프 당단백질 E (envelope glycoprotein E)(50-60 kDa)와 소형 막단백질 M (7-8 kDa)을 포함하는 엔벨로프 (envelope)로 둘러싸여 있다. 게놈 RNA의 번역 (translation)은 세포내 프로테아제 및 바이러스 프로테아제에 의해 바이러스 단백질들로 절단되는 polyprotein 전구체를 초래하며, 순서대로 보면: C, prM/M, E, NS 1 , NS2 A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B, 및 NS5로 절단되며 여기서, C 내지 E는 비리온 (virion)의 구조적 구성요소이고 NS1 내지 NS5는 증식에 필요한 비구조적 단백질들이다 (Lindenbach and Rice, Fields Virology, 4^thEd.:991-1041, 2001). 상기 prM 단백질 (~ 25 kDa)은 M을 위한 세포내 전구체이다. prM을 포함하는 미성숙 비리온은 소포체 내강 (lumen of endoplasmic reticulum)에서 버딩 (budding)에 의해 생산되고 외포작용 경로 (exocytosis pathway)를 통해 세포표면으로 수송된다. prM의 절단은 후-골지체 소낭 (post-Golgi vesicles)에서 입자의 분비 직전에 일어난다. 성숙한 세포외 바이러스는 M 단백질을 지배적으로 포함하지만, 절단되지 않은 prM의 작은 단편 또한 존재한다.

E 단백질은 비리온의 주요 기능적 및 항원성 표면 구성요소이다. 중성 pH에서 성숙한 바이러스 입자의 표면에 동형다이머 (homodimer)를 형성하는 E의 엑토도 메인 (ectodomain) 분자구조는 동결전자현미경 (cryoelectron microscopy)으로 분석되었으며 (Rey et al., Nature 375:291-298, 1995) 바이러스 입자들의 전자밀도맵 (electron density map)에 일치시켰다 (Kuhn et al., Cell 108:717-725, 2002). 감염이 일어나는 동안, E 단백질은 class II 융합단백질 (fusion protein)로서 작용한다 (Modis et al., Nature 427:313-319, 2004). 바이러스가 세포의 수용체에 결합하고 내재화 (internalization)된 후에, 그 결과인 엔도좀 (endosome)에서 산성 pH는 다이머의 분리를 유발하여 사전에 숨겨진 각 모노머 (monomer)의 소수성 융합 루프가 외부로 노출된다. 이와 함께, 상기 루프는 세포 (엔도좀) 막에 삽입되고 모노머들은 연장된 트리머 (elongated trimers)로 재배열한다. 트리머들의 추가 리폴딩 (refolding)은 세포와 바이러스 막들을 아주 근접하게 가져와서 그들을 융합하게 하고 세포질 (cytoplasm)내로 바이러스 입자의 내용물 (contents)을 방출하게 한다. 이전의 연구들은 마우스 뇌 및 배양된 원숭이 신장세포와 모기세포에서 계대배양 (serial passages) 중에서 선택된 DEN과 JE의 E 단백질에서 일부 치환 (some substitutions)이 단백질의 3D 구조의 특정부위에 국한되어 있음을 보여주며, 바이러스들의 융합 기능 (fusion function)에서의 변화와 관련되어 있음을 보고하였다. 상기 연구들은 몇몇 약독화된 백신에 대한 융합 pH 역치 (fusion pH threshold)가 대응하는 모(母)바이러스 분리주 (parental virus isolate)와 비교하면 0.6 내지 1 pH unit만큼 감소하는 것을 보여주었다. DEN3 단백질 E의 6개 잔기 (residues 54, 191, 202, 266, 268 및 277)에서의 일부 변화들은 도메인 II의 부위로 매핑 (map)된다. 이 부위는 보존된 소수성의 cd 융합 루프의 표면 노출에 필요 한 low-pH 매개된 형태적 변형 (conformational change)에 대한 초점으로 제안된다 (Lee et al., Virology 232:281-290, 1997).

작은 (성숙한) M 단백질은, 그것의 세포내 전구체인 prM이 바이러스 입자의 형태 형성 (morphogenesis)과 수송을 위해 중요한 것으로 알려진 반면, 엔도좀으로부터 바이러스 내재화 (internalization)를 유발하는 기작 (events)에서 중요한 역할을 한다거나 또 다른 어떤 감지할 수 있을 만한 기능을 가진다는 아무런 증거가 없다. 또한 prM 단백질은 E의 적절한 폴딩을 용이하게 하고 (Lorenz et al., J. Virol. 76:5480-5491, 2002), 산성분비구획 (acidic secretory compartment)을 통해 세포표면을 향한 새로운 입자들이 통과 (passage)하는 동안 조숙한 형태적 재배열 (premature conformational rearrangement)로부터 E 단백질 다이머를 보호하는 기능을 한다 (Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991; Guirakhoo et al., Virology 191 :921-931, 1992).

ChimeriVax™ 기술은 의학적으로 중요한 플라비바이러스들에 대한 생(生) 약독화된 백신 후보물질들을 만드는데 사용되어 왔다. 상기 기술은 prM-E 유전자가 JE, 뎅기, 웨스트 나일 또는 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같이 이종 기원 (heterologous) 플라비바이러스의 prM-E 유전자로 대체된 벡터로써 YF 17D 백신 바이러스를 사용한다 (Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999; Monath et al., Curr. Drug Targets - Inf. Disorders 1 :37-50, 2001; Monath et al., Vaccine 20: 1004-1018, 2002; Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; Guirakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304, 2001; Guirakhoo et al., Virology 298:146-159, 2002; Pugachev et al., Int. J. Parasitol. 33:567-582, 2003; Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004). 이전에는, SA14-14-2 바이러스 (중국에서 사용된 살아있는 약독화된 JE 백신)의 prM-E 유전자를 포함하는 ChimeriVax™-JE 백신 바이러스를 우태혈청 (FBS)이 첨가된 배지에서 배양된 베로세포 (Vero cells)에 고역가 (high titers)로 증식시켰다. 상기 ChimeriVax™-JE 백신 바이러스는 전임상 및 Phase I와 U 임상 실험들에서 성공적으로 시험되었다 (Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002; Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003). 마찬가지로, 웨스트 나일 바이러스 (NY99 균주)의 prM-E 서열을 포함하는, 약독화를 증가시키기 위해 E 단백질에 통합된 (incorporated) 3개의 특이 아미노산 변화를 가진 ChimeriVax™-WN 백신 후보물질에 대하여 성공적인 Phase I 임상 실험이 실시되어 왔다 (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004).

본 발명은, 플라비바이러스를 약독화하거나 (예컨대, 플라비바이러스의 내장기관친화성/바이러스 혈증을 감소시킨 돌연변이)세포 배양 (예컨대, 무혈청 배양에서 제조하는 것)에서 증식하는 동안 플라비바이러스의 유전적 안정성을 증가시키거나, 및/또는 백신 바이러스 수율을 증가시키는 돌연변이와 같이, 하나 이상의 막 (M) 단백질 돌연변이 (예컨대, 치환, 삭제, 또는 삽입)를 포함하는, 재조합 플라비바이러스를 제공한다. 본 발명의 플라비바이러스는 제 1 플라비바이러스 (예컨대, YF 17D와 같은 황열병 바이러스)의 캡시드와 비-구조 단백질 및 제 2 플라비바이러스 (예컨대, 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스 (뎅기-1, 뎅기-2, 뎅기-3, 또는 뎅기-4 바이러스), 세인트루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 뿐만 아니라 YF, JE, DEN, 및 TBE 혈청복합체 (serocomplexes)로부터 유래한 인간/동물 병원체인 또 다른 어떤 플라비바이러스)의 막 또는 엔벨로프 단백질을 포함하는 플라비바이러스와 같은 키메라 플라비바이러스일 수 있다.

본 발명의 플라비바이러스에서, 돌연변이 (예컨대, 치환)는 막 단백질 M의 트랜스멤브레인 (transmembrane) 또는 엑토도메인 (ectodomain)에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 상기 돌연변이는 플라비바이러스 막 단백질 M의 예측되는 막 나선구조 (predicted membrane helix)의 아미노산 40-75 부위에서 일어날 수 있다. 예로써, 상기 돌연변이는 일본 뇌염 바이러스와 같은 플라비바이러스 막 단백질의 아미노산 60의 치환 (substitution)일 수 있으며 (예컨대, 일본 뇌염 바이러스 M 단백질에서 아르기닌 (arginine)이 시스테인 (cysteine)으로 치환), 또는 또 다른 플라비바이러스의 대응하는 아미노산에서 치환일 수 있다. 제시된 플라비바이러스에서 어떤 아미노산이 다른 플라비바이러스의 아미노산에 “대응하는”지의 결정은 표준 아미노산 서열 정렬 (standard amino acid sequence alignment)에 의해 수행될 수 있으며, 이러한 기술은 당업계에서 잘 알려져 있다. 또 다른 예로써, 상기 돌연변이는 웨스트 나일 바이러스 (예컨대, 웨스트 나일 바이러스의 M 단백질에서 루이신 (leucine)의 프롤린 (proline)으로의 치환)와 같은 플라비바이러스 막 단백질의 66 아미노산의 치환, 또는 다른 플라비바이러스의 대응하는 아미노산에서 치환일 수 있다. 또 다른 예에서는, 상기 돌연변이는 다른 막 고정 아미노산 (membrane anchor amino acid), 예컨대 일본 뇌염 바이러스 또는 웨스트 나일 바이러스 (또는 또 다른 플라비바이러스에서 대응하는 아미노산)의 60, 61, 62, 63, 64, 65, 및 66 위치 또는 트랜스멤브레인 도메인의 또 다른 아미노산 잔기를 포함하는 M66 잔기의 측면에 위치하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에 있다.

또한 본 발명은, M5 잔기에서 글루타민이 프롤린으로의 변화가 감염의 pH 역치 (threshold)를 증가시켰기 때문에, M 단백질의 엑토도메인이 중요한 기능적 의미를 가기키는 증거를 처음으로 제공한다. 따라서, 현재 플라비바이러스 약독화는 M 단백질의 C-말단 소수성 고정 (acchor) 아미노산에서가 아니라 M 단백질의 표면 부분 (surface part) 또는 아미노-말단 엑토도메인 (amino-terminal ectodomain)에서 아미노산 변화 또는 다양한 삭제 (deletions), 삽입 (insertions)의 유도를 통해서 얻을 수 있음을 예상할 수 있다. 따라서 또 다른 예에서는, 본 발명의 바이러스들은 상기 기술된 것과 같이 M 단백질 엑토도메인 (잔기 1-40)에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이러한 결과는 플라비바이러스들의 성숙한 M 단백질의 어떤 알려진 기능의 결핍으로 볼 때, 예상치 않은 것이다.

상기 기술된 막 단백질 돌연변이 이외에도, 웨스트 나일 바이러스의 막과 엔벨로프 단백질들을 포함하는 키메라 플라비바이러스의 경우에는, 본 발명의 바이러스들은 아미노산 107, 138, 176, 177, 224, 264, 280, 316, 및 440으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산들에서 하나 이상의 엔벨로프 단백질 돌연변이를 포함할 수 있다. 또 다른 플라비바이러스들에서는, 상기 돌연변이는 이러한 아미노산에 대응하는 아미노산에서 존재할 수 있다. 특정 예로써, 플라비바이러스는 웨스트 나일 M 단백질 아미노산 66에서의 돌연변이에 대응하는 돌연변이 및 웨스트 나일 바이러스 아미노산 107, 316, 및 440에 대응하는 아미노산에서의 E 단백질 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 기술된 돌연변이 이외에도, 본 발명의 플라비바이러스는 본 명세서의 다른 부분에 기술된 것과 같이 엔벨로프 단백질의 힌지 영역의 소수성 포켓 (hydrophobic pocket)에서 하나 이상의 돌연변이 역시 포함할 수 있다. 본 발명의 바이러스에 포함될 수 있는 추가 돌연변이들은 하기에 추가적으로 기술된 것과 같은 3'UTR, 캡시드 단백질 또는 또 다른 엔벨로프 단백질 영역에서의 돌연변이들이다.

본 발명은 또한 상기 기술되거나 본 명세서의 다른 부분에 기술된 플라비바이러스와 약제학적으로 수용 가능한 담체 (carriers) 또는 희석제 (diluents)를 포함하는 백신 조성물 뿐만 아니라 이와 같은 백신 조성물을 투여함으로써 환자에게 플라비바이러스에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 이와 같은 방법에 따라 처치되는 환자는 플라비바이러스에 감염된 환자 뿐만 아니라 플라비바이러스에 감염되지 않았으나 감염으로 발전될 위험에 있는 환자도 포함한다. 더욱이, 본 발명은 여기 기술된 예방 및 치료방법 뿐만 아니라 이러한 목적을 위한 약제의 제조에서 여기 기술된 플라비바이러스의 사용을 포함한다.

본 발명은 여기 기술된 것처럼 플라비바이러스를 포함하는 백신을 제조하는 방법을 더 제공한다. 이는 감소된 내장기관친화성/바이러스혈증 및/또는 증가된 유전적 안정성/수율을 가져오는 돌연변이를 플라비바이러스 막 단백질에 도입하는 것을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 여기 기술된 플라비바이러스의 게놈 (genome)에 대응하는 핵산 분자 (RNA 또는 DNA) (또는 그 상보체 (complements))들 및 본 발명의 바이러스들을 만들기 위한 이러한 핵산 분자를 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 플라비바이러스는 환자에 투여될 때 감소된 발병력 (virulence)(예컨대, 감소된 내장기관친화성/바이러스 혈증에 의해 나타남)을 가지며, 추가적인 안정성 수준을 제공하기 때문에 비-돌연변이 된 카운터파트 (counterparts)와 비교하여 유리하다. 추가적인 이점은 ChimeriVax™-JE에서 M-60 돌연변이와 같은 어떤 돌연변이가 백신 제조 시 안전성을 떨어뜨리는 원치 않은 돌연변이의 누적을 방지하거나 제조 수율을 증가시킬 수 있다는 것이다. 이러한 바이러스의 추가적인 이점들은 그들이 황열병 바이러스 균주 YF17D의 서열 (예컨대, 캡시드 및 비-구조 단백질을 코딩하는 서열들)을 포함할 수 있다는 사실에 의해 제공된다. 상기 황열병 바이러스 균주는 (i) 60년 이상 그 안전성이 입증되어 왔으며 이 기간에 3억 5천 이상 투여량(dose)이 인간에게 투여되어 왔으며, (ii) 단일 투여량 후 긴 면역 지속시간을 유도하고, (iii) 접종후 몇일내 빠르게 면역을 유도한다. 게다가, 본 발명의 백신 바이러스들은 상기 처치된 환자에서 활성적인 (active) 감염을 유도한다. 그래서, 면역화된 개인 (individuals)의 사이토카인 환경 (cytokine milieu)과 선천적 (innate) 면역반응이 자연적인 감염의 반응과 유사하기 때문에, 플라비바이러스의 성숙한 M 단백질의 어떤 알려진 기능의 결핍을 고려하면, 항원체 (antigenic mass)가 숙주에서 퍼져서 알맞게 폴딩된 형태적 에피토프 (conformational epitopes)가 능률적으로 처리되어 적응된 면역반응이 강력하게 일어나고 면역반응의 기억이 숙주에 확립된다.

백신 안전성 및 세포 배양에서 제조에 대한 M 단백질에서 돌연변이의 유익한 측면은 새롭고 예기치 않은 것이다.

본 발명의 또 다른 특징과 이점은 하기의 상세한 설명, 도면, 및 청구범위로부터 구체적으로 설명한다.

본 발명은 플라비바이러스 (예컨대, 일본 뇌염 (Japanese encephalitis, JE) 또는 웨스트 나일 (West Nile, WN) 바이러스) 감염을 예방하거나 처치하는 데 사용하기 위한 백신 및 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 살아있는 재료 (subjects), 즉 하나 이상의 구조 단백질 (예컨대, 막 단백질 및/또는 엔벨로프 단백질)이 제 2 플라비바이러스 (예컨대, 일본 뇌염 (JE) 및/또는 웨스트 나일 (WN) 바이러스; 이하 제시함)의 구조 단백질로 대체된 제 1 플라비바이러스 (예컨대, 황열병 바이러스)로 구성된 생약독화된 키메라 플라비바이러스로 백신접종하는 것을 포함한다. 본 발명의 키메라들의 막 단백질 (membrane proteins)은 이하 구체적으로 설명하는 것처럼 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 또한 이하 기술된 것과 같이, 또 다른 플라비바이러스의 막 단백질 및/또는 엔벨로프 단백질과 같은 구조 단백질은 본 발명의 키메라 바이러스들에서 일본 뇌염 바이러스 또는 웨스트 나일 바이러스의 구조 단백질 대신에 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 막 단백질 돌연변이는, 여기 기술된 것과 같이, 어떠한 구조 단백질의 대체 (replacements)도 포함하지 않고 선택적으로 하나 이상의 추가적 돌연변이를 갖는 온전한 (intact) 비-키메라 플라비바이러스 (예컨대, 여기 목록에 있는 어떤 비-키메라 플라비바이러스)에서도 사용될 수 있다.

본 발명의 백신에 포함될 수 있는 키메라 바이러스의 특정 예는 인간 황열병 백신 균주, YF 17D (예컨대, YF17D-204 (YF-VAX®, Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA; Stamaril®, Sanofi-Pasteur, Marcy-L'Etoile, France; ARILVAX™, Chiron, Speke, Liverpool, UK; FLAVIMUN®, Berna Biotech, Bern, Switzerland); YF17D-204 France (X15067, X15062); YF17D-204, 234 US (Rice et al., Science 229:726-733, 1985))이며, 이들은 막 단백질 및 엔벨로프 단백질이 일본 뇌염 바이러스의 막 단백질 및 엔벨로프 단백질 (여기에 기술된 M60에서의 치환과 같은 M 단백질 돌연변이를 포함하는)로 대체되어 있다. 다른 예에서는, YF 17D 막 단백질 및 엔벨로프 단백질은 웨스트 나일 바이러스의 막 단백질 및 엔벨로프 단백질 (여기에 기술된 M66에서의 치환과 같은 M 단백질 돌연변이를 포함하는)로 대체되어 있다.

또 다른 예에서, 뎅기 바이러스 (혈청형 1, 2, 3 또는 4), 세인트루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, YF 17D 균주들을 포함하는 황열병 바이러스와 같은 다른 플라비바이러스, 또는 또 다른 어떤 플라비바이러스와 같은 다른 플라비바이러스들은 이러한 키메라 바이러스에 막 및/또는 엔벨로프 단백질들을 제공할 수 있다. 온전한 비-키메라 바이러스 또는 키메라에서 막 단백질 및/또는 엔벨로프 단백질의 근원 (source)으로서 본 발명에 따라 약독화될 수 있는 추가적인 플라비바이러스들은 쿤진 (Kunjin), 로시오 뇌염 (Rocio encephalitis), 및 일헤우스 바이러스 (Ilheus viruses)와 같은 다른 모기-매개 플라비바이러스들 (mosquito-borne Flaviviruses); 중앙 유럽 뇌염 (Central European encephalitis), 시베리아 뇌염 (Siberian encephalitis), 러시아 봄-여름 뇌염 (Russian Spring-Summer encephalitis), 키아사누르 포레스트 질병 (Kyasanur Forest Disease), 옴스크 출혈열 (Omsk Hemorrhagic fever), 도약병 (Louping ill), 포와산 (Powassan), 네기쉬 (Negishi), 앱세타로프 (Absettarov), 한살로바 (Hansalova), 아포이 (Apoi), 및 하이프르 바이러스 (Hypr viruses)와 같은 진드기-매개 플라비바이러스들 (tick-borne Flaviviruses); 뿐만 아니라 헤파시바이러스 속(屬) (예컨대, C형 간염 바이러스) 유래 바이러스들을 포함한다. 또 다른 황열병 바이러스 균주들, 예컨대 YF17DD (GenBank Accession No. U 17066), YF17D-213 (GenBank Accession No. U17067; dos Santos et al., Virus Res. 35:35-41, 1995), 및 Galler et al., Vaccines 16(9/10): 1024-1028, 1998등에 의해 설명된 황열병 바이러스 17DD 균주들이, 본 발명에 따라 이종 (heterologous)의 구조 단백질이 삽입될 수 있는 백본 바이러스들 (backbone viruses)로서 사용될 수 있다.

상기에 각각 기재된 바이러스들은 어느 정도 내장기관을 감염시키는 성질을 갖는다. 이들 바이러스의 내장기관친화성 (viscerotropism)은 YF 백신-관련 부작용 (adverse disease events)에서 관찰되는 것 같은 중요한 내장 기관의 기능장애를 일으키지는 않으나 매우 드물게는 일으킨다. 이들 기관에서 바이러스의 증식 (replication)은 바이러스혈증 (viremia)을 일으킬 수도 있으며 이렇게 되면 중추신경계의 침입의 원인이 된다. 그러므로 본 발명에 따른 돌연변이 유발 (mutagenesis)에 의해 이들 바이러스의 내장기관친화성을 감소시키는 것은 내장기관친화적 부작용을 일으키거나 뇌를 칩입하여 뇌염을 일으키는 이들 바이러스의 능력을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 돌연변이는 바이러스에 유익한 효과를 초래하며, 이러한 효과는 예컨대, 증가된 약독화, 안정성, 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 막 단백질에 존재한다, 예컨대 막 단백질의 트랜스멤브레인 영역 (transmembrane region) 또는 엑토도메인 (ectodomain). 예를 들어, 상기 돌연변이는 막 단백질의 아미노산 60 또는 66, 및/또는 예상되는 트랜스멤브레인 도메인 내의 또 다른 아미노산 (예컨대, 아미노산 40-75의 하나 이상에서), 또는 M 단백질의 N-말단 엑토도메인 (예컨대, M-5)에 있을 수 있다. 특정 예로서, 막 단백질 아미노산 60 (야생형 일본 뇌염 바이러스에서 아르기닌 (arginine))은 시스테인 (cysteine)과 같은 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. ChimeriVax™-JE 바이러스에서 M-60 위치의 아르기닌에서 시스테인으로의 치환은 M-60 돌연변이가 있거나 있지 않은 백신의 변이체 (variants)로 시험된 임상 실험에서 인간에 대한 바이러스의 바이러스 혈증 (내장기관친화성)을 현저하게 감소시켰다 (표 1의 IA 및 IB). 시스테인 이외에도, 세린 (serine), 트레오닌 (threonine), 글리신 (glycine), 메티오닌 (methionine) 등과 같은 또 다른 아미노산들은 막 단백질의 60 위치에서 야생형 (wild type) 아미노산을 치환할 수 있다. 다른 예에서는, 막 단백질 아미노산 66 (야생형 웨스트 나일 바이러스에서 루이신 (Leucine))은 프롤린 (proline)과 같은 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 프롤린 이외에도, 이소루이신 (isoleucine), 메티오닌 또는 발린과 같은 또 다른 소수성 아미노산들, 또는 알라닌 (alanine) 또는 글리신과 같은 작은 아미노산들은 막 단백질의 66 위치에서 야생형 아미노산을 치환할 수 있다. 또한, 이 돌연변이들은 여기 기술된 것처럼, 또 다른 플라비바이러스의 대응하는 아미노산에 존재할 수도 있다.

막 단백질 서열에서 만들어질 수 있는 치환의 또 다른 예로써, 61, 62, 63, 및/또는 64 위치에서 아미노산들은 치환될 수 있으며, 60 위치 돌연변이, 66 위치 돌연변이, 및/또는 다른 돌연변이들이 단독 또는 서로 조합될 수 있다. 웨스트 나일 바이러스 막 단백질 서열에서 치환의 예들은 다음을 포함한다: 61 위치에서 발린이 알라닌으로, 62 위치에서 발린이 글루타민산 (glutamic acid) 또는 메티오닌으로, 63 위치에서 페닐알라닌 (phenylalanine)이 세린으로, 및 발린이 64위치에서 이소루이신으로 치환. 또한, 이 돌연변이들은 여기 기술된 것처럼, 또 다른 플라비바이러스의 대응하는 아미노산에 존재할 수도 있다.

JE 바이러스 막 단백질 서열에서 이들 또는 주변 위치들에서 치환의 예들은 백신을 제조하는 동안 세포배양에서 내장기관친화성 및/또는 백신 바이러스 증식/안정성에 대한 기대된 효과를 얻을 수 있을 것이라고 기대되는 남아있는 어떠한 20 아미노산들을 포함한다. 키메라 또는 비-키메라 플라비바이러스에서 또 다른 예들은, 상기 단백질의 1-~40 잔기로 조성된 M 단백질의 N-말단 엑토도메인에서 단독 또는 조합하여 어떤 아미노산의 치환 뿐만 아니라 M 단백질의 엑토도메인 및/또는 트랜스멤브레인 도메인에 도입된 다양한 크기 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 등, 아미노산 길이)의 삭제도 포함한다.

상기 언급된 하나 이상의 막 단백질 돌연변이 이외에도, 본 발명의 바이러스들은 하나 이상의 추가적인 돌연변이들도 포함할 수 있다. 예를 들어, 웨스트 나일 바이러스의 경우에는 추가적인 돌연변이가 웨스트 나일 바이러스 엔벨로프 단백질의 107 위치 (예컨대, L에서 F), 316 위치 (예컨대, A에서 V), 또는 440 위치 (예컨대, K에서 R) (또는 이들의 조합)의 영역에서 있을 수 있다. 요컨대 돌연변이는, 예를 들면, 웨스트 나일 엔벨로프 단백질의 하나 이상의 아미노산 102-112, 138 (예컨대, E에서 K), 176 (예컨태, T에서 V), 177 (예컨대, T에서 A), 244 (예컨대, E에서 G), 264 (예컨대, Q에서 H), 280 (예컨대, K에서 M), 311-321, 및/또는 435-445에서 있을 수 있다. 특정 예로써, 문헌에 따라 웨스트 나일 바이러스 균주 NY99-flamingo 382-99 (GenBank Accession Number AF196835)의 서열을 이용하여, 107 위치에서 라이신 (lysine)은 페닐알라닌으로 대체될 수 있고, 316 위치에서 알라닌은 발린으로 대체될 수 있으며, 및/또는 440 위치에서 라이신은 아르기닌으로 대체될 수 있다. 돌연변이가 일어날 수 있는 아미노산들의 추가적인 조합의 예는 다음을 포함한다: 176, 177, 및 280; 176, 177, 244, 264, 및 280; 138, 176, 177, 및 280. 게다가, 이러한 돌연변이들은 여기 기술된 것처럼, 또 다른 플라비바이러스의 대응하는 아미노산에 존재할 수도 있다.

ChimeriVax™-JE 백신은 SA14-14-2-특이 JE 엔벨로프를 포함하므로 상기-언급된 모든 SA14-14-2 특이적 돌연변이를 이미 포함한다. E 단백질에서 추가적인 아미노산 변화는 추가적인 약독화 (예컨대, 하기 기술된 것과 같은)를 위해 또한 선택될 수 있으며 E 단백질의 구조/기능에 대한 이해를 바탕으로 도입될 수 있다. 이 돌연변이들은 또한 여기 기술된 것처럼, 또 다른 플라비바이러스에 대응하는 아미노산에 존재할 수 있다. 상기 언급된 아미노산들 이외에도, 상기 치환은 상기 언급된 아미노산들로부터 보존성 변화 (conservative changes)를 일으킬 수 있는 아미노산과 같은 또 다른 아미노산에서 일어날 수 있다. 보존성 치환 (conservative substitutions)은 대개 다음의 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 이소루이신, 및 루이신; 아스파르트산 (aspartic acid), 아스파라긴 (asparagine), 및 글루타민 (glutamine); 세린 및 트레오신; 라이신 및 아르기닌; 페닐알라닌 및 티로신 (tyrosine).

본 발명의 바이러스들 (예컨대, 일본 뇌염 및 웨스트 나일 바이러스들, 그리고 이들 또는 또 다른 플라비바이러스 유래 막 단백질과 엔벨로프 단백질을 포함하는 키메라 플라비바이러스)은 상기 논의된 돌연변이 (예컨대, 막 단백질 돌연변이)를 포함할 수도 있고, 엔벨로프 단백질의 힌지 영역 또는 소수성 포켓에서 하나 이상의 돌연변이를 추가적으로 포함할 수도 있으며, 이러한 돌연변이들은 감소된 내장기관친화성을 일으키는 것으로 밝혀졌다 (Monath et al., J. Virol. 76:1932- 1943, 2002; WO 03/103571 A2; WO 05/082020; Guirakhoo et al., J. Virol. 78(18):9998-10008, 2004). 엔벨로프 단백질의 폴리펩타이드 사슬은 3개의 구별되는 도메인으로 폴딩된다: 중심 도메인 (central domain, 도메인 I), 다이머화 도메인 (dimerization domain, 도메인 II), 및 면역글로불린-유사 모듈 도메인 (immunoglobulin-like module domain, 도메인 III). 힌지 영역은 도메인 I과 II 사이에 존재하고, 산성 pH에 노출되면, 수용체-매개 내세포작용 (endocytosis)에 의한 바이러스 흡수 후, 바이러스와 엔도좀 막의 융합에 관련되는 엔벨로프 단백질 트리머 (trimers)의 형성을 초래하는 형태적 변형 (conformational change)(여기서“힌지”명명)를 수행한다. 형태적 변형에 앞서, 상기 단백질들은 다이머의 형태로 존재한다.

황열병 바이러스의 아미노산, 예를 들어 48-61, 127-131 및 196-283을 포함하는 힌지 영역에 다수의 엔벨로프 아미노산들이 존재한다 (Rey et al., Nature 375:291-298, 1995). 이들 아미노산 중 어떤 것, 또는 가깝게 인접하는 아미노산들 (그리고 또 다른 플라비바이러스 엔벨로프 단백질에서 대응하는 아미노산들)은, 본 발명에 따라 돌연변이 될 수 있으며, 약독화를 위해 시험될 수 있다. 특히 흥미로운 것은 힌지 영역의 소수성 포켓내에 있는 아미노산이다. 특정한 예로써, 황열병 바이러스 벡터에 삽입된 뎅기 1 엔벨로프 단백질 서열을 포함하는 키메라 플라비바이러스에서, 힌지 영역의 소수성 포켓에 있는 엔벨로프 단백질 아미노산 204를 치환 (K에서 R)하는 것이 약독화를 초래한다는 것은 밝혀져 있다 (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004). 이러한 치환은 야생형 단백질에서 하나의 엔벨로프 모노머와 다른 엔벨로프 모노머 사이의 분자간 수소결합 (intermolecular hydrogen bonding)이 끊어지고 모노머들내에서 새로운 분자간 상호작용으로 대체되는 것과 같은 엔벨로프 단백질의 구조에서 변화를 초래한다. 이러한 발견은 이러한 치환으로부터 일어나는 약독화가, 아마도 숙주세포와 바이러스 막의 융합에 필요한 pH 역치 (pH threshold)를 변화시킴으로써, 사전-융합 형태 (pre-fusion conformation)에서 단백질의 구조를 변화시키는 이러한 새로운 상호작용에 기인한다는 제안을 이끌었으며, 추가적인 치환이 소수성 포켓에서 분자 간 상호작용들을 증가하여 약독화를 초래하는데 사용되는 더욱 약독화된 돌연변이체의 디자인을 위한 근거를 제공한다. 소수성 포겟에서 일어날 수 있으며, 본 발명의 바이러스에 포함될 수 있는 이런 돌연변이/치환의 예들은 E202K, E204K, E252V, E253L, E257E, E258G, 및 E261H에서의 치환들 (그리고, 또 다른 플라비바이러스에 대응하는 치환들)을 포함한다. JE와 WN 바이러스의 E 단백질의 대응하는 영역에서 어떠한 아미노산 변화도 대응하는 단백질 구조 (homologous protein structure)의 이해에 근거하여 디자인되고 통합될 수 있다.

E 유전자는 Hurrelbrink와 McMinn (Adv. Virus Dis. 60:1-42, 2003)에 의해 기술된 바와 같이, 그 범위내의 아미노산 변화가 기능에 영향을 주고 그것에 의하여 발병력 (virulence)을 감소시키는 기능적 도메인들을 포함한다. 본 명세서에 기술된 막 삭제/돌연변이 (membrane deletions/mutations)와 함께 적당히 약독화된 백신을 초래할 수 있는 돌연변이가 삽입될 수 있는 E 단백질의 기능적 영역은 다음을 포함한다: a) 도메인 III의 외면상의 추정 수용체 결합 영역; b) 도메인 I와 II 사이의 힌지 분자 영역, 이는 엔도좀에서 E 단백질의 산성-의존적 형태적 변화를 결정하고, 바이러스 내재화의 효율성을 감소시킨다; c) prM과 E 단백질의 인터페이스 (interface), 즉 엔도좀에서 낮은 pH에 노출된 후 다이머에서 트리머로 재배열에 이어 prM과 상호작용하는 E 단백질의 영역; d) 도메인 II의 융합 도메인의 끝부분 (tip), 이는 내재화하는 동안 엔도좀의 막에 융합하는 것과 관련이 있다; 및 e) 줄기-고정 영역 (stem-anchor region), 이는 산성-유도 융합하는 동안 E 단백질의 형태적 변화와 기능적으로 관련되어 있다.

본 발명의 바이러스에서 하나 이상의 막 단백질 돌연변이와 함께 포함될 수 있는 추가적인 약독화 돌연변이는 황열병 바이러스 백본 (backbone)의 3'UTR (3'untranslated region)에서의 돌연변이를 포함한다. 모든 ChimeriVax™ 바이러스들에 사용되는 황열병 바이러스 백신 균주인 YF 17D의 3'UTR의 유기적 구조 (organization)는 도 1a에 보여진다. 유기적 구조는 3'말단으로부터 순서대로 다음을 포함한다: (i) 마이너스-가닥 RNA (minus-strand RNA) 합성에 대한 프로모터로서 기능에 대하여 가정되어 지고 모든 플라비바이러스에 대하여 보존된 3'-극단 stem-and-loop 구조, (ii) 모든 모기-매개 플라비바이러스와 높은 비율로 뉴클레오티드 서열 상동성을 공유하는 2개의 보존된 서열 요소들 CS1과 CS2, 및 (iii) YF17D 백신 바이러스를 포함하는 웨스트 아프리카 황열병 바이러스 균주에 대하여 유일한(unique) 3'UTR의 상부 (upstream) 일부분에 위치하는 반복서열요소 (repeat sequence element, RS)의 3 카피 (copy) (Chambers et al., Annu. Rev. Microbiol. 44:649-688, 1990). 도 1b에서 묘사된 3'UTR은 또한 상기 RS elements로부터 비-보존된 영역 하부 (downstream)에서의 stem-loop 구조들과 같은 다수의 stem-loop 구조들을 포함한다.

본 발명의 바이러스들에 포함될 수 있는 3'UTR 돌연변이는 일반적으로 짧은데, 예를 들어 30 뉴클레오티드 미만 (예컨대, 1, 2, 3.. 29까지 (예컨대, 2-25, 3-20, 4-15, 5-10, 또는 6-8 뉴클레오티드 길이); U.S. Patent Application Nos. 60/674,546 및 60/674,415))의 삭제 (deletions)로 약독화한다. 몇몇 예들에서, 3'UTR에서 짧은 3'UTR 삭제 (short deletions)는 하나 이상의 stem 구조들의 2차 구조를 불안정하게 하기 위해서 디자인된다. 삭제 이외에도, 이러한 구조에서 돌연변이는 유사하게 stem 구조 불안정을 초래하는 치환을 포함할 수도 있다. 어떤 예에서는, 돌연변이에 영향을 받기 쉬운 상기 stem-loop 구조가 3'UTR의 비-보존된 영역 또는 이러한 돌연변이를 견딜 수 있는 보존된 영역에 존재한다 (예컨대, CS2에서). 예를 들어, 줄기 (stem) 불안정화 돌연변이는 도 1b에 보여지는 임의의 하나 이상의 예상된 stem 구조에 존재할 수 있으며, 도 1b는 그러한 삭제의 4가지 예들을 보여준다 (dA,dB, dC, 및 dD). 이와 같이, 이들 특정 예들 이외에도, 황열병 바이러스에서 3'UTR 돌연변이의 또 다른 예들은 예컨대, 다음의 stem 서열의 1-2, 3-8, 4-7, 또는 5-6 뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이를 포함하며, 이는 도 1b에 나타내었고 5'에서 3'으로 읽는다: TGGAG, CTCCA, GACAG, TTGTC, AGTTT, GGCTG, CAGCC, AACCTGG, TTCTGGG, CTACCACC, GGTGGTAG, GGGGTCT, AGACCCT, AGTGG, 및 TTGACG. 이들 돌연변이는 여기 기술된 또 다른 플라비바이러스의 대응하는 아미노산에 존재할 수도 있다.

줄기 (stem) 불안정화 돌연변이 이외에도, 3'UTR에서 또 다른 삭제가 본 발명의 바이러스들에서 하나 이상의 막 (그리고 가능한 또 다른 것) 돌연변이와 함께 포함될 수도 있다. 예를 들어, 이전에 기술된 Δ30 돌연변이 (Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996; U.S. Patent No. 6,184,024 Bl) 또는 이 서열에 속해있는 돌연변이가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 이 영역내의 1, 2, 3.. 29까지 (예컨대, 1-25, 2-20, 3-15, 4-14, 5-13, 6-12, 7-11, 8-10, 또는 9) 뉴클레오티드 길이인 어떤 실행 가능한 삭제들 (viable deletions)을 포함한다. 특정 예로써, 본 발명의 바이러스들은 삭제 d7을 포함할 수 있으며, 이는 YF17D에서 이 영역으로부터 다음의 뉴클레오티드들이 삭제된다: 뉴클레오티드 345-351 (AAGACGG; 실행 가능한 ORF의 UGA 종결코돈 뒤, 3'UTR의 첫 번째 뉴클레오티드에서부터 번호 매김; 도 1a). 이 서열의 3' 또는 5'으로부터 추가적인 1, 2, 3, 4, 또는 5 뉴클레오티드의 삭제를 포함하는 돌연변이도 본 발명에 포함된다. 또 다른 예로써, 보존된 서열 CS1과 CS2에서 짧은 삭제들 (short deletions)은 본 발명에 포함된다. 이 돌연변이들은 예컨대, 이 서열의 1-29, 2-25, 3-20, 4-15, 5-10, 또는 6-8 뉴클레오티드의 삭제를 포함할 수 있다. 2가지 특정 예로써, 뉴클레오티드 360-364 (GGTTA; CS2d5; 도 1a) 또는 뉴클레오티드 360-375 (GGTTAGAGGAGACCCT; CS2dl6; 도 1a)는 YF17D-특이 3'UTR의 CS2로부터 삭제된다. 이 서열의 3' 또는 5'말단으로부터 추가적인 1, 2, 3, 4, 또는 5 뉴클레오티드들의 삭제를 포함하는 돌연변이들이 사용될 수도 있다. 또 다른 플라비바이러스 3'UTRs에 대해서는, 3'UTRs의 2차 구조들에 기초한 유사한 돌연변이가 일어날 수 있다. 또 다른 플라비바이러스의 3'UTR의 2차 구조들의 예상들 (predictions)은 공개되어져 있다 (예컨대 뎅기, 쿤진, TBE (Proutski et al., Virus Res. 64:107-123, 1999등 참조) 및 HCV (Kolykhalov et al., J. Virol. 70:3363-3371, 1996등 참조). 게다가, 모든 4가지 주요 혈청복합체들 (serocomplexs)(YF, JE, dengue, and TBE)을 나타내는 플라비바이러스의 많은 균주들에 대한 다수의 3'UTR 뉴클레오티드 서열들은 GenBank에서 입수가능하다. 추가적인 균주들의 서열은 바이러스 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다. 이 서열들의 2차 구조들은 가능한 stem-loop 구조들을 나타내기 위하여 표준 소프트웨어 (예컨대, mfold 또는 RNA fold 프로그램)를 사용하여 쉽게 예상될 수 있다.

전체 바이러스들의 군 (context)에서 3'UTRs의 2차 구조들의 존재를 실험적으로 증명하기 위한 사용가능한 방법들이 없기 때문에, YF 17D 바이러스를 포함하는 플라비바이러스들의 3'UTRs의 정확한 2차 구조들이 알려지지 않았고, 따라서 공개된 예상들, 예컨대, Proutski와 co-workers (도 1b)에 의해 YF 17D에 대하여 예상된 것도 부정확할 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 많은 선택적인 (alternative) 구조들은 상대적으로 긴 RNA 분자로부터 예상될 수 있어서 (Zuker et al., N.A.R. 19:2707-2714, 2001), 바이러스 생활사 (life cycle)의 서로 다른 단계에서 서로 다른 구조 (플러스 또는 마이너스 가닥 (strand)에서)가 형성되고 기능하는 것이 가능하다. 정확한 구조들은 다양한 pseudoknots (Olsthoorn et al., RNA 7:1370-1377, 2001)의 형성과 긴 범위 RNA 결합 (long range RNA interactions)(예컨대, RNA 고리화 (cyclization)과 또 다른 결합들 (Alvarez et al., J. Virol. 79:6631-6643, 2005)) 뿐만 아니라 숙주와 바이러스 단백질들과의 가능한 RNA 결합에 의해 영향을 받을 수 있다. 이론상 컴퓨터 예상들의 공개된 결과의 더욱 복잡한 해석을 위하여, 초기 예상된 구조를 더 긴 RNA 서열 구조로 후속적으로 유인할 부분 서열의 초기 폴딩 (initial folding), 초기 폴딩 단계 동안 N's의 인위적 사용, 및 우선 구조 요소들 (preferred structure elements)의 주관적 선택과 같은 수작업 (manual operations)이 종종 사용된다 (e.g., Mutebi et al., J. Virol. 78:9652-9665, 2004). 이를 위하여, 본 발명자들은 YF 17D의 3'UTR RNA 서열을 일반적으로 사용되는 Zuker's 예상 알고리즘을 이용하여 폴딩시켰다. 상기 예상된 최적의 구조는 도 1c에 나타나며, 도 1b에서 보여지는 Proutsky 예상과는 다르다. 도 1a와 도 1b에서의 작은 삭제들, 즉 dA, dB, dC, dD, d7, 및 dl4가 예상된 본래의 YF 17D 최적 (optimal) 구조 (도 1c)와 차선 (suboptimal) 구조를 일반적으로 불안정화 하였다는 것은 중요하다. 이러한 하나의 변경된 최적의 구조 (dC 돌연변이에 대한)의 예는 도 1d에 나타난다. 이와 대조적으로, CS2d5와 CS2dl6 삭제 (도 1a와 1b)는 본래의 최적 구조를 현저하게 변화시키지 않았으므로, 이 삭제들은 아마도 3'UTR 구조보다는 오히려 CS2 자체의 서열을 변경하거나 또는 어떤 차선 구조를 선택적으로 변경하는 것에 의해 바이러스 (약독화는 ChimeriVax™-WN의 대상으로 햄스터 모델에서 증명되었다)를 약독화한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 어떤 삭제들이 Proutski 구조 예상에 기초로 하여 디자인되었다 하더라도 (도 1b), 그들의 정확한 효과는 도 1b에서의 예상된 stem-loops보다는 서로 다른 구조 요소들을 불안정화 (destablizing)하기 때문일 것이다.

본 발명의 바이러스들에서 막 단백질 (및 가능한 또 다른 단백질) 돌연변이들과 함께 포함될 수 있는 추가적인 돌연변이들은 캡시드 단백질 내 짧은 삭제 (예컨대, 1, 2, 3, 또는 4 아미노산의 삭제) 돌연변이들이다. YF 17D 바이러스 캡시드 단백질과 관련하여 제공된 이러한 돌연변이들의 예는 단백질의 Helix I에 영향을 미치는 실행 가능한 삭제들을 포함한다 (도 2a 참조). 이러한 돌연변이의 특정 예는 돌연변이 C2이며, 이는 Helix I로부터 아미노산 PSR의 삭제를 포함한다 (도 2a). 이 영역 (또 다른 플라비바이러스 서열에서 대응하는 돌연변이 뿐만 아니라)에서의 또 다른 짧은 돌연변이들이 생존능력과 약독화에 대하여 시험될 수 있고, 또한 본 발명에서 사용될 수도 있다. 또 다른 플라비바이러스의 캡시드 단백질 서열들 공개되어 있다 (예컨대, TBE, WN, 쿤진, JE, 및 뎅기 바이러스들 (e.g., Pletnev et al., Virology 174:250-263, 1990)).

다음은 미국 버지니아주의 매나세스 (Manassas)에 소재하는 ATCC (American Type Culture Collection)에 부타페스트 조약에 따라 1998년 1월 6일자로 기탁된 키메라 플라비바이러스의 특정 예들이며, 본 발명의 바이러스를 제조하는데 사용될 수 있다: 키메라 황열병 17D/뎅기 타입 2 바이러스 (YF/DEN-2; ATCC 수탁번호 VR-2593) 및 키메라 황열병 17D/일본 뇌염 SA14-14-2 바이러스 (YF/JE Al.3; ATCC 수탁번호 VR-2594). 본 발명에서 사용될 수 있는 키메라 바이러스들을 제조에 대한 자세한 내용이, 예를 들면, U.S. Patent No. 6,696,281 Bl; 국제특허출원 PCT/US98/03894 (WO 98/37911)와 PCT/USOO/32821 (WO 01/39802); 및 Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999에서 제공되는데, 이들 또한 아래에서 제공된다. 여기 기술된 이 방법들은 삽입된 서열들 (예컨대, 일본 뇌염 바이러스 또는 웨스트 나일 바이러스의 막 단백질 또는 또 다른 서열들, 구체적으로 상기 U.S. Patent No. 6,696,281 Bl에 기재된 일본 뇌염 SA14-14-2 바이러스의 막 단백질- 서열번호 37의 아미노산 서열을 가짐)에 하나 이상의 돌연변이를 도입하는 어떤 단계를 포함함으로써, 본 발명에서 사용하기 위하여 변형될 수 있다. 본 발명에 바이러스들을 도입하기 위하여 사용될 수 있는 방법들은 PCT/US03/01319 (WO 03/060088 A2; 역시 아래를 참조)에 개시되어 있다.

돌연변이들은 부위-지정 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis)과 같은 표준 방법을 사용하여 본 발명의 바이러스들에서 일으킬 수 있다. 본 발명의 바이러스에 존재하는 돌연변이 타입의 일례는 치환이지만, 삭제와 삽입 같은 또 다른 타입의 돌연변이 역시 사용될 수 있다. 또한, 상기에 언급한 바와 같이, 돌연변이들은 막 단백질 자체에서 이든지 예컨대, 3'UTR, 캡시드, 또는 엔벨로프 서열들의 어떤 조합에서 이든지, 단독으로 존재하거나 하나 이상의 추가 돌연변이들의 군 (context)으로 존재할 수 있다. 본 발명의 바이러스들 (키메라들을 포함하는)은 당업계에서 표준방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이러스의 게놈 (genome)에 대응하는 RNA 분자는 일차배양세포 (primary cells), 계 배아 (chicken embryo), 또는 이배체 세포계 (diploid cell lines)에 도입될 수 있으며, 그 후 이들 (또는 이들의 상청액)로부터 자손 바이러스 (progeny viruses)가 정제될 수 있다. 바이러스들을 제조하기 위하여 사용될 수 있는 다른 방법은 베로세포 (Vero cells) (Yasumura et al., Nihon Rinsho 21 :1201-1215, 1963)와 같은 이수체 (異數體) 세포 (heteroploid cells)를 사용한다. 이 방법에서, 바이러스의 게놈에 대응하는 핵산 분자 (예컨대, RNA 분자)는 이수체 세포에 도입되고, 바이러스는 그 세포들이 배양된 배지로부터 회수되고, 회수된 바이러스는 핵산분해효소 (예컨대, Benzonase™; U.S. Patent No. 5,173,418과 같은 DNA와 RNA를 모두 분해시키는 엔도뉴클레아제)에 의해 처리된다. Benzonase™의 경우에는, 15 units/mL이 사용될 수 있으며, 조절된 배지 (conditioned medium)는 핵산의 소화 (digestion)를 고려하여 2-8 ℃에서 약 16시간 이상 냉장보관 하였다. 그리고 나서 뉴클레아제-처리된 바이러스를 농축한 뒤 (예컨대, 500 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 (예컨대, Pellicon-2 Mini 한외여과 카세트))를 이용한 한외여과 (ultrafiltration)를 사용하여), 페놀 레드 (phenol red) 또는 FBS 없는 MEME에서 투석 (diafilter)하고, 락토오스 (lactose)를 첨가하여 제형화하고, 멸균기에서 멸균한다. 이러한 방법의 자세한 내용은 WO 03/060088 A2에서 제공한다. 그리고, 본 발명의 바이러스의 증식을 위하여 사용된 세포들은 아래에 기술된 무혈청 배지에서 증식할 수 있다.

본 발명의 바이러스들은 감염될 염려가 있는 사람들에게 1차 예방약제 (primary prophylactic agents)로 투여될 수 있으며, 또한 감염된 환자들을 치료하기 위한 2차 약제로 사용될 수 있다. 상기 바이러스들은 약독화되어 있기 때문에, 노인, 어린이 또는 HIV 감염된 사람들과 같이 “위험에 노출된 사람들“에 투여하는 데에 특히 적합하다. 상기 백신들은 또한 수의학 분야 (contexts)에서 예컨대, 웨스트 나일 바이러스 감염에 대한 말 (horses)의 예방접종, 또는 애완동물 (예컨대, 고양이, 개, 및 새), 가축, 및 희귀새와 같은 귀중한 동물의 예방접종에 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 백신들은 돌연변이가 부족한 바이러스와 혼합되어, 키메라 바이러스와 같은 특수한 돌연변이 (예컨대, M5, M60, 및/또는 M66 돌연변이)를 포함하는 바이러스를 포함할 수 있다.

본 발명의 바이러스들의 제형화 (formulation)는 당업계에서 표준화된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 백신 제조에 사용되는 다수의 제약학상 허용가능한 용액들이 잘 알려져 있고 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에 의해 본 발명에 사용하기 위하여 쉽게 적용될 수 있다 (see, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 참조). 두 가지 특정 예에서는, 바이러스들은 7.5% 락토오스와 2.5% 인간 혈청 알부민 (human serum albumin)을 함유하는 MEME (Minimum Essential Medium Earle's Salt) 또는 10% 소르비톨 (sorbitol)을 함유하는 MEME에서 제형화된다. 그러나, 바이러스들은 단지 멸균 식염수 또는 멸균 완충액 (sterile buffered saline)과 같은 생리학적으로 허용가능한 용액으로 희석되기만 할 수도 있다. 다른 예에서는, 바이러스들은 예를 들어, 황열병 17D 백신처럼 동일한 방법에서 제형화되고 투여될 수 있는데 예컨대, 감염된 계 배아 조직 (chicken embryo tissue)의 정제된 현탁액 또는 키메라 황열병 바이러스로 감염된 세포 배양물로부터 수득된 유체 (fluid)로서 제형화되고 투여될 수 있다. 본 발명의 백신들은 당업계에서 잘 알려진 방법을 이용하여 투여될 수 있으며, 투여되는 백신의 적당한 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 투여자에게 바이러스의 적당한 양이 되도록 결정하는 것은 예컨대, 바이러스가 투여되는 환자의 치수 및 건강상태와 같은 요소들을 고려함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바이러스들은 예컨대, 근육내, 피하, 또는 피부내 경로를 통해 투여되기 위하여 0.1 내지 1.0 ml의 도스 용적 (dose volume)에서 10² 및 10⁸ 사이, 예컨대 10³ 내지 10⁷ 또는 10⁴ 내지 10⁶ 감염단위 (예컨대, 플라크-형성 단위 또는 조직 배양 감염 도스)를 포함하는 멸균 수용액으로 제형화될 수 있다. 또한, 플라비바이러스들은 구강 경로와 같은 점막 경로를 통해 인간 숙주에 감염될 수 있기 때문에 (Gresikova et al., "Tick-borne Encephalitis," In The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, Volume IV, 177- 203), 바이러스들은 마찬가지로 점막 (예, 구강) 경로를 통해 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 백신들은 단일 도스 (single dose)로 투여되거나, 선택적으로 투여는 1차 처치 도스 (priming dose)의 사용에 이어 예컨대, 당업자에 의해 적당하다고 결정된 2-6 개월 후 투여되는 하나 이상의 2차 처치 도스 (booster doses)를 포함할 수 있다.

선택적으로, 당업자에게 잘 알려진 보조제 (adjuvants)들은 본 발명의 바이러스들의 투여 시에 사용될 수 있다. 바이러스들의 면역원성 (immunogenicity)를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 보조제는 예컨대, 리포좀 제제 (liposomal formulations), 합성 보조제 (예, QS21), 무라밀 디펩티드 (muramyl dipeptide), 모노포스포릴리피드 A (monophosphoryl lipid A), 또는 폴리포스파진 (polyphosphazine)을 포함한다. 비록 이러한 보조제들은 전형적으로 불활성화된 백신에 대한 면역반응을 증가시키기 위해 사용되지만, 이들은 또한 생백신 (live vaccines)과 함께 사용될 수 있다. 점막 경로, 예를 들어 경구를 통해 전달된 바이러스의 경우에는, 열에 불안정한 독소인 E. coli (LT) 또는 LT의 돌연변이 유도체 (mutant derivations)와 같은 점막 보조제들이 보조제로 사용될 수 있다. 또한, 보조제 활성을 가지는 사이토카인 (cytokines)을 코딩하는 유전자들이 상기 바이러스에 삽입될 수 있다. 요컨대, GM-CSF, EL-2, IL-12, IL-13, 또는 IL-5와 같은 사이토카인들을 코딩하는 유전자는 증가된 면역반응을 유도하는 백신을 생산하거나 세포, 체액, 또는 점막 반응에 대하여 보다 특수하게 유도된 면역을 조절하기 위해 외래 항원 유전자들과 함께 삽입될 수 있다. 본 발명에서 선택적으로 사용될 수 있는 추가적인 보조제들은 TLR (toll-like receptor) 조절자 (modulators)를 포함한다.

뎅기 바이러스 및/또는 뎅기 바이러스의 막 단백질과 엔벨로프 단백질을 포함하는 키메라 플라비바이러스의 경우, 이는 최적의 예방접종이 모든 4가지 뎅기 혈청형 (serotype)에 대한 면역의 유도를 포함할 수 있으며, 본 발명의 바이러스들은 4가 백신 (tetravalent vaccines)의 제형화에 사용될 수 있다. 이러한 4가 백신 제형화에 사용되는 임의의 또는 모든 바이러스들은 내장기관친화성을 감소시킨 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있으며, 이는 여기에 기술한다. 바이러스들은 4가 백신 조제 (preparations)를 위해 제형화시 어떤 시점에서 혼합될 수 있고, 또는 연속하여 (in series) 투여될 수 있다. 4가 백신의 경우에는, 동등한 양의 각각의 바이러스가 사용될 수 있다. 선택적으로, 투여된 백신에 존재하는 서로 다른 바이러스의 각각의 양은 다양할 수 있다 (WO 03/101397 A2).

본 발명은 또한 여기 기술된 본 발명의 바이러스 게놈에 대응하는 핵산 분자들 (예컨대, RNA 또는 DNA (예컨대, cDNA) 분자들), 또는 그들의 상보체 (complements)를 포함한다. 이 핵산 분자들은 예를 들어, 본 발명의 바이러스를 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 어떤 바이러스의 게놈에 대응하는 핵산 분자는 바이러스가 생산되고 증식하는 세포 (예컨대 일차배양세포, 계배아, 이배체 세포계, 또는 이수체 세포계 (예, Vero cells))에 도입되고 난 후 이로부터 자손 바이러스를 정제할 수 있다. 이 방법들은 당업계에 알져진 바이러스 정제 단계를 더 포함할 수 있다.

상기에 언급되어 있듯이, 본 발명에 사용될 수 있는 키메라 바이러스들을 제조하는 것의 세부적인 내용은 예를 들어, U.S. Patent No. 6,696,281 Bl; 국제특허출원 PCT/US98/03894 (WO 98/37911)와 PCT/USOO/32821 (WO 01/39802); 및 Chambers et al, J. Virol. 73:3095-3101, 1999에서 제공된다. 일본-뇌염 바이러스 (또는 웨스트 나일 바이러스)의 프리-막 (pre-membrane) 단백질과 엔벨로프 단백질, 및 황열병 바이러스의 캡시드 단백질과 비-구조 단백질을 포함하는 키메라 플라비바이러스의 구조 (construction)의 세부적인 내용은 다음에서 제공된다. 이 방법들은 여기 기술된 돌연변이를 포함하는 키메라들 뿐만 아니라 또 다른 프리-막 서열과 엔벨로프 서열을 포함하는 키메라들을 구성하는데 사용하기 위하여 당업자에 의해 쉽게 적용될 수 있다.

간단히 말해서, YF/JE 키메라의 유도 (derivation)는 다음을 포함할 수 있다. YF 게놈 서열은 2가지 플라스미드 (YF5'3IV와 YFM5.2)에서 증식되는데, 이는 뉴클레오티드 1-2,276 및 8,279-10,861 (YF5'3'IV)와 1,373-8,704 (YFM5.2) (Rice et al., The New Biologist 1:285-296, 1989)로부터 YF 서열을 코딩한다. 전체-길이 cDNA 주형 (full-length cDNA templates)은 이 플라스미드들에서 유래된 적절한 단편들 (restriction fragments)의 연결 (ligation)에 의해 생성된다. 그 때, YF5'3'IV와 YFM5.2 플라스미드내 YF 서열들은 prM 단백질 (뉴클레오티드 478, 아미노산 128)의 개시 (start)에서부터 E/NS1 절단부위 (cleavage site)(뉴클레오티드 2,452, 아미노산 817)까지 대응하는 JE 서열들에 의해 재위치된다.

진정한 JE 구조 단백질 유전자들의 클론은 JE SA14-14-2 균주 (JE live, 약독화된 백신 균주; JE SA14-14-2 바이러스는 콜로라도의 포트 콜린스 소재 질병관리센터 및 커네티컷의 뉴 헤븐 소재 예일 대학교의 예일 아르보바이러스 연구 유닛으로부터 입수가능하다. 이들은 미국에 있는 아르보바이러스 (Arboviruses)에 대한 세계보건기구(WHO)-지정 추천 센터이다)로부터 생산되었다. SA14-14-2 바이러스는 계대접종 (passage) 레벨 PDK-5에서 얻었으며, cDNA 클로닝에 대한 충분한 양의 바이러스를 얻기 위하여 LLC-MK₂ 세포에서 계대접종 되었다. 사용된 전략 (strategy)은 NheI 부위 (JE 뉴클레오티드 1,125)에서 서로 겹쳐지는 두 부분 (two pieces)에서 구조 영역을 클로닝하는 것을 포함하였고, 그 다음 시험관내 연결 (in vitro ligation)에 사용될 수 있다.

RNA는 감염된 LLC-MK₂ 세포들의 단일층 (monolayers)으로부터 추출되었으며, 네거티브 센스 (negative sense) cDNA의 첫 번째 가닥 합성은 처음에는 pBluescript II KS(+)에, 다음으로 YFM5.2(NarI)에 각각 클로닝 하기 위해 삽입된 (nested) XbaI과 NarI 제한효소 부위를 포함하는 네거티브 센스 프라이머 (JE 뉴클레오티드 서열 2,456-71)로 역전사효소를 사용하여 수행되었다. 첫 번째 가닥 cDNA 합성은 pBluescript 및 YFM5.2 (NarI)에 각각 클로닝 하기 위해 삽입된 XbaI과 NsiI 제한효소 부위를 포함하는 동일한 네거티브 센스 프라이머 및 포지티브 센스 (positive sense) 프라이머 (JE 뉴클레오티드 서열 1,108-1,130)를 사용하여 뉴클레오티드 1,108-2,471로부터 JE 서열의 PCR 증폭에 의해 수행되었다. JE 서열들은 제한효소 소화 (digestion) 및 뉴클레오티드 시퀀싱 (sequencing)에 의해 확인되었다. 뉴클레오티드 1에서 1,130까지의 JE 뉴클레오티드 서열은 JE 뉴클레오티드 1,116에서 1,130에 대응하는 네거티브 센스 프라이머와 JE 뉴클레오티드 1에서 18에 대응하는 포지티브 센스 프라이머를 사용하여 네거티브 가닥 JE cDNA의 PCR 증폭에 의해 생성되었으며, 둘 다 EcoRI 제한효소 부위를 포함하였다. PCR 단편들은 pBluescript에 클로닝되었고 JE 서열들은 뉴클레오티드 시퀀싱에 의해 확인되었다. 종합하면, 이것은 뉴클레오티드 1-2,471 (아미노산 1-792)로부터 JE 서열의 클로닝을 나타낸다.

YF E/NS1 절단부위에 JE 엔벨로프 단백질의 C 말단을 삽입하기 위하여, YFM5.2(NarI)를 만들기 위한 E/NS1 절단부위 (YF 뉴클레오티드 2,447-2,452, 아미노산 816-817)에서 단백분해효소 (signalase) 서열의 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 유발 (oligonucleotide-directed mutagenesis)에 의해 YFM5.2 플라스미드에 유일한 NarI 제한효소 부위를 도입하였다. 이러한 변형을 도입한 주형 (templates)으로부터 생성된 전사체 (transcripts)를 감염성 (infectivity)에 대하여 조사하였고 모(母) 주형 (전사의 대략 100 플라크-형성 단위/250 나노그램)과 유사한 특이적 감염성을 획득하였다. 뉴클레오티드 1,108에서 2,471까지의 JE 서열은 유일한 NsiI와 NarI 제한효소 부위를 사용하여 YFM5.2(NarI)에 몇몇 독립적인 pBluescript/JE의 PCR-유래 클론들로부터 서브클로닝 (subclone)되었다. JE prM-E 영역에 인접한 YF 5'UTR (뉴클레오티드 1-118)을 포함하는 YF5'3'IV/JE 클론들은 PCR 증폭으로 생성되었다.

YF 캡시드와 JE prM의 접합 (junction)을 포함하는 서열을 얻기 위하여, 이 영역을 연결 (spanning)하는 네거티브 센스 키메라 프라이머는 EcoRI 부위의 pBluescript 벡터 서열 upstream에 상보적인 포지티브 센스 프라이머와 함께 네거티브 센스 PCR 프라이머로써 사용되었던 PCR 단편들을 만들기 위해 YF5'3'IV 뉴클레오티드 6,625-6,639에 대응하는 포지티브 센스 프라이머와 함께 사용되었으며, 이 것은 뉴클레오티드 1,125에서 NheI 부위를 통해 뉴클레오티드 477 (prM 단백질의 N-말단)로부터 JE 서열 (pBluescript 벡터에 반대배향 (reverse orientation)으로 코딩된)을 증폭하기 위한 것이다. 상기 결과인 PCR 단편들은 NotI과 EcoRI 제한효소 부위를 사용하여 YF5'3'IV 플라스미드에 삽입되었다. 이 구성물은 YF 5'-UTR 앞에 SP6 프로모터를, 이어 다음 서열들: YF (C) JE (prM-E)을 포함하고, 또한 시험관내 연결에 필요한 NheI 부위 (JE 뉴클레오티드 1,125)를 포함한다.

시험관내 5' 연결 부위로써 JE 엔벨로프 서열 내 NheI 부위를 사용하기 위하여, YFM5.2 플라스미드 (뉴클레오티드 5,459)에서 여분의 NheI 부위는 제거하였다. 이는 뉴클레오티드 5,461 (T C; 알라닌, 아미노산 1820)에서 YF 서열의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)에 의해 완성된다. 이 부위는 적절한 제한 단편 (appropriate restriction fragments)의 연결에 의해 YFM5.2에 도입(incorporated)되고 키메라 YF/JE 서열을 코딩하는 NsiI/NarI 단편의 교환에 의해 도입(introduced)된다.

시험관내 연결을 위한 유일한 3'제한효소 부위를 만들기 위해, BspEI 부위는 YF5'3'IV와 YFM5.2로부터 전체-길이의 주형을 만드는 데 일반적으로 사용된 AatII 부위의 downstream에 설계되었다 (다중 AatII 부위는 JE 구조 서열에 존재하고 시험관내 연결을 위한 이 부위의 사용을 포함한다). BspEI 부위는 YF 뉴클레오티드 8,581 (A C; 세린, 아미노산 2,860)의 잠재적 돌연변이에 의해 생성되고, 적절한 제한 단편의 교환에 의해 YFM5.2에 도입된다. 상기 유일한 부위는 XbaI/SphI 단편의 교환에 의해 YFM5.2/JE에 도입되고, 이러한 모(母) 플라스미드 및 뉴클레오티드 1과 6,912에서 EcoRI 부위들 사이 YF 서열을 제거하는 YFM5.2 (BspEI)의 유도체로부터 적절한 제한 단편의 세 개의 단편 연결 (three-piece ligation)에 의해 YF5'3'IV/JE(prM-E) 플라스미드에 도입된다.

발현 실험 (expression experiments)에서와 보호성 면역 (protective immunity)을 유도하는 능력에 대하여 널리 특성화되어 있는 JE Nakayama 균주 (예컨대, Mclda et al., Virology 158:348-360, 1987 참조; JE Nakayama 균주는 콜로라도의 포트 콜린스 소재 질병관리센터 및 커네티컷의 뉴 헤븐 소재 예일 대학교의 예일 아르보바이러스 연구 유닛으로부터 입수가능하다)의 클론 유래 cDNA는 키메라 플라비바이러스의 구성에 역시 사용된다. 상기 Nakayama cDNA는 시험관내 연결을 위한 NheI 부위를 사용하기 위하여 온전히 남겨진 위치 49에서 단일 아미노산 (세린)을 제외하고, 두 개의 플라스미드 시스템에서 전체 prM-E 영역을 대체하기 위하여 이용 가능한 제한효소 부위 (HindIII에서 PvuIII와 BpmI에서 MunI)를 사용하여 YF/JE 키메라 플라스미드에 삽입되었다.

전체-길이 cDNA 주형들을 만들기 위한 절차 (Procedures)는 Rice 등 (The New Biologist 1 :285-96, 1989)에서 기술된 것과 본질적으로 같다. 키메라 주형 (chimeric templates)의 경우에는, 플라스미드들 YF5'3'IV/JE (prM-E)와 YFM5.2/JE는 NheI/BspEI로 소화 (digested)되고, 시험관내 연결은 T4 DNA 리가아제 (ligase) 존재 하에 300 나노그램의 정제된 단편을 사용하여 수행된다. 연결 산물 (ligation products)은 런-오프 전사 (run-off franscription)를 수행하도록 XhoI로 선형으로 만들었다. SP6 전사체들은 50 나노그램의 정제된 주형을 사용하여 합성되고 ³H-UTP의 도입으로 정량되며, RNA의 완전한 상태 (integrity)는 비-변성 아가로즈 겔 전기영동에 의해 확인된다. 이 과정을 이용하여 매 반응 시 수율은 RNA 5 내지 10 마이크로그램 범위에 있으며, 이들 대부분은 전체-길이 전사체로 존재한다. 양이온성 리포좀 (cationic liposomes) 존재 하에서 RNA 전사체들의 트랜스펙션 (transfection)은 YF 17D에 대한 Rice et al. (supra)에 의해 기술된 것과 같이 수행되어 키메라 바이러스들을 생산한다.

웨스트 나일 바이러스와 황열병 바이러스 서열들을 포함하는 키메라 플라비바이러스의 경우에는, 상기 기술된 두 개의 플라스미드 시스템이 역시 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 사용된 웨스트 나일 (WN) 바이러스 prM과 E 유전자는 GenBank acession No. AF196835 서열인 WNV flamingo isolate 383-99로부터 클로닝되었다. 바이러스 prME cDNA는 RT-PCR (XL-PCR kit, Perkin Elmer)에 의해 얻었다. WN prM 유전자의 5'말단은 Pwo 폴리머라제 (Roche)를 사용하여 오버랩-신장 (overlap-extension) PCR에 의해 YF 17D 캡시드 유전자의 3' 말단에서 정확하게 클로닝 되었다. E 유전자의 3' 말단은 오버랩-신장 PCR에 의해 YF NS1 코딩 서열의 5' 말단에서 역시 정확하게 클로닝 되었다. 잠재성 돌연변이 (silent mutations)는 제한효소 부위 Bsp EI와 Eag I를 만들기 위하여 prM의 서열에 도입되었다. 이러한 효소들을 가진 두 플라스미드의 소화 (digestion)는 겔 정제된 DNA 단편들을 생성하였고 전체-길이 키메라 cDNA를 생산하기 위하여 시험관내에서 연결되었다. 상기 cDNA는 SP6 폴리머라제 (Epicentre)에 의한 시험관내 전사를 용이하게 하기 위하여 XhoI으로 선형으로 만들어졌다. RNA 산물은 바이러스 RNA 번역 (translation)과 증폭을 위한 복제 가능한 진핵세포군 (eukaryotic cell lines)에 도입되었다. 상기 기술된 YF/JE 키메라로써 본 발명의 돌연변이들은 표준 방법을 사용하여 여기 기술된 YF/WN 키메라에 도입될 수 있다.

또 다른 플라비바이러스 키메라들은 자연적 또는 설계된 제한효소 부위, 및 예컨대 표 14에 나타난 바와 같이 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 사용하여 유사한 방법으로 처리될 수 있으며,

본 발명은 부분적으로 하기 실시예들에 기술된 실험 결과에 기초하고 있다.

도 1a는 황열병 바이러스의 3'UTR의 도식적인 설명이며, 이는 이 영역 (반복서열 (repeat sequences, RS), 보존된 서열 CS2, CS1, 및 3'-극단 stem-and-loop 구조)내 도메인 뿐만 아니라 본 발명의 바이러스에서 포함될 수 있는 돌연변이의 예들 (예컨대, 삭제들 dA, dB, dC, dD, d7, dl4, CS2 d5, 및 CS2 dl6)을 나타낸다.

도 1b는 황열병 바이러스의 3^rd RS element의 중간에서 UTR의 끝부분까지의 서열 및 발표된 3'UTR의 2차 구조 예상의 도식적인 설명이다 (Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999).

도 1c는 Zuker RNA 폴딩 알고리즘을 이용하여 제작된 최적 YF 17D 3'UTR 2차 구조 예상 도면이다.

도 1d는 최적 YF 17D 구조에서 3'UTR 삭제들 (dC 삭제를 도시; Zuker method)의 효과에 대한 도면이다 (도 1c와 비교하여).

도 2a는 진드기-매개 뇌염 바이러스의 캡시드 단백질의 서열 뿐만 아니라 Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543에 의해 보고된 이 단백질에서 삭제들의 도식적인 설명이다.

도 2b는 YF 17D 바이러스의 캡시드 단백질 서열의 도식적인 설명이다. α-helical 2차 구조 (α-helices I-IV)를 가지기 위하여 컴퓨터 분석에 의해 예상된 영역 뿐만 아니라 특정 ChimeriVax™-WN 바이러스에서 이 단백질에 도입된 소수성 영역 (solid bars) 및 삭제들을 나타낸다 (예컨대, C1과 C2 삭제들; boxed).

도 3은 HepG2세포에서 지시된 바이러스 (WN01, WN02, P5, 큰 플라크, 작은 플라크, 및 YF/17D)의 성장을 보여주는 그래프이다.

도 4는 THLE-3 세포에서 지시된 바이러스 (WN01, WN02, P5, 큰 플라크, 작은 플라크, 및 YF/17D)의 성장을 보여주는 그래프이다.

도 5는 햄스터에서 지시된 바이러스 (WN02 P5; 혼합된 플라크, 작은 플라크 (PMS, P10), 및 큰 플라크 (PMS, P10))에 의해 유도된 바이러스혈증을 보여주는 그래프이다.

도 6은 SF ChimeriVax™-JE 바이러스 샘플들의 계대접종 (예컨대, 유전적 안정성을 연구하기 위한 실험 계대접종)의 도식적인 설명이다.

도 7은 감염 후 지시된 시간에서 본 발명의 SF ChimeriVax™-JE 바이러스 (클로닝 되지 않은 P2, P3 MS (E-107), P4 PS (E-107), P5 g.s. (M-60), 및 P5 VB (E-107))의 성장곡선을 보여주는 그래프이며, 이는 비돌연변이 바이러스 (P2)와 비교하여 M-60 [아르기닌(R)→시스테인(C) 및 E 107 페닐알라닌(F)→루이신(L)] 돌연변이체를 포함하는 바이러스 샘플의 SF 배양에서 더 높은 성장률을 보여준다.

도 8a는 산성 pH의 범위로 처리한 후 P5 클로닝 되지 않은 백신 벌크와 클론 I (E-107 돌연변이체), 비-돌연변이체 (클론 A), 및 M-60 돌연변이체 (클론 C)와 비교하여 M-5 ChimeriVax™-JE 돌연변이체 (클론 E)의 감염성을 보여주는 그래프이다. 중요한 것은 기울기 형태이며, 희석된 샘플에서의 초기 역가 (initial titers) (예컨대, pH 6.8에서)가 아니라 여기의 pH에서 바이러스는 감염성을 잃는다.

도 8b는 뇌내 경로로 접종된 생후 3-4일된 젖먹이 마우스에서 ChimeriVax™JE M5 돌연변이체 (1.4 log₁₀ PFU/dose, 접종에 대한 역적정에 의해 측정됨)와 비교한 ChimeriVax™-JE 백신 (1.9 log₁₀ PFU/dose, 접종에 대한 역적정에 의해 측정됨)의 Survival Plot이다.

도 8c는 뇌내 경로로 접종된 생후 3-4일된 젖먹이 마우스에서 YF-VAX® (0,9 log₁₀ PFU/dose, 접종에 대한 역적정에 의해 측정됨)와 비교한 ChimeriVax™-JE M5 돌연변이 바이러스 (1.4 log₁₀ PFU/dose, 접종에 대한 역적정에 의해 측정됨)의 Survival Plot이다.

도 8d는 간접 융합 분석의 결과를 보여주는데, 이 분석은 ChimeriVax™- DEN1-4 바이러스의 P7과 P10의 비교를 제공한다. 각 실험을 위해 생산된 바이러스는 표준 플라크 분석에 의해 측정하였다. A, ChimeriVax™-DEN1 PMS P7 (삼각형)과 P10 (다이아몬드형) B, ChimeriVax™-DEN2 PMS P7 (삼각형)과 P10 (다이아몬드형); C, ChimeriVax™-DEN3 PMS P7 (삼각형)과 P10 (다이아몬드형); D, ChimeriVax™-DEN44 PMS P7 (삼각형)과 P10 (다이아몬드형).

도 8E는 ChimeriVax™-DEN3으로 수행한 간접 융합 분석의 결과를 보여주는데, Vaccine lot (P10)과 P15 바이러스를 가진 PMS (P7) 백신를 비교하였다. 각 실험을 위해 생산된 바이러스는 표준 플라크 분석에 의해 측정되었다. ChimeriVax™-DEN3 PMS P7 (삼각형), PlO (다이아몬드형), 및 Pl5 (정사각형).

도 8F는 ChimeriVax™-DEN1 바이러스의 E-단백질 다이머의 구조 (아미노산 1에서 394)를 보여준다 (Guirakhoo etal., J. Virol. 78:9998-10008, 2004). (A) P7 (PMS, 204K) 바이러스의 204 잔기에서 양성으로 전하된 라이신 (K)의 위치는 CPK (반데르발스 반지름 크기의 구형들을 나타냄) 설명에 의해 나타난다. 3개의 구조 도메인은 검정색 (도메인 I), 밝은 회색 (도메인 II), 및 어두운 회색 (도메인 III)으로 나타난다. (B) 패널 A에서 표시된 영역의 확대. (C) 돌연변이체 DEN1 바이러스의 E 단백질 모델로부터의 패널 B에서와 같은 동일한 영역 (P10, 204R는 검정색으로 나타남). 패널 B와 C에서 선택된 아미노산을 막대 표시 (stick representation)로 보여준다. 중간 회색, 탄소; 어두운 회색, 질소; 검정, 산소; 밝은 회색, 황.

도 9a는 지시된 시간에서 ChimeriVax™-JE 바이러스 M60 돌연변이체 (클론 C), E 107 돌연변이체 (클론 I), 및 비-돌연변이체 (클론 A)의 침투 능력을 보여주는 그래프이다. 이러한 결과는 M60 돌연변이가 분명히 5분과 10분 시점에서 SF 베로세포에서 침투가 용이하다는 것을 나타낸다. SF 베로세포를 적절히 희석된 바이러스 (무혈청 배지에서 클론 A, C, 및 I)로 5, 10, 20, 또는 60분간 감염시킨 다음, 세포외 바이러스를 불활성화 시키기 위해 0,1 M 글리신, 0,1 M NaCl, pH 3,0의 용액으로 3분간 처리하였다. 웰들을 PBS로 두 번 세척하고 나서 단일층을 메틸-셀룰로오스로 중층한 다음 크리스탈 바이올렛으로 5일째에 플라크를 염색하였다. 침투 능력은 글리신 대신 PBS로 처리한 감염된 대조군 웰과 비교하여, 글리신 처리 후 관찰된 플라크 수의 퍼센트로 나타난다.

도 9b는 엔벨로프 단백질 E와 M에서 E-107, M-5, 및 M-60 아미노산 잔기들의 위치의 도식적인 설명이며, 융합에서의 M-5 잔기의 가정에 근거한 효과를 설명한다. E-107 잔기를 포함하는 E 단백질의 도메인 II의 끝에서 직선표시 범위 (dashed stretch)는 융합 펩타이드 (c-d 루프)를 나타내며, 이는 세포막에 삽입된다 (Rey et al., Nature 375:291-298, 1995). M-5 잔기는 M 단백질 엑토도메인의 N 말단 부분에 있다. E 단백질 모노머들은 트리머 복합체로 재배열되어, 세포막과 바이러스 막이 융합하도록 접힌다 (Modis et al., Nature 427(6972) :313-319, 2004). M 단백질은 아마도 복합체의 기능적 구성 요소, 예컨대 E 단백질과의 결합을 통해 바이러스 막과 세포막의 융합을 용이하게 하는 것일 것이다. M-60 잔기는 M의 2개의 C-말단 트랜스멤브레인 뻗침 (streches) 사이에 있으며, 융합하는 동안 세포막과 바이러스 막의 결합에 관여하는 것 같다.

실험 1: ChimeriVax™-WN

실험결과

배경기술 및 요약

키메라 황열병-웨스트 나일 (YF-WN) 바이러스인 ChimeriVax™-WN는 YF17D 백본에 WN 바이러스 (NY99)의 프리-막 (prM)과 엔벨로프 (E) 유전자의 삽입에 의해 생산되었다. 상기 바이러스는 무혈청 조건 (5계대에서, P5)하에서 베로세포 (Vero cells)에서 제작되었으며 전임상 모델에서 안전성, 면역원성 (immunogenicity), 및 효능에 대하여 평가되었고, 인간에서는 I기 (phase I)에서 시험되어 왔다. 상기 바이러스 백신 (P5)의 추가적인 약독화는 E 단백질 (107, 316, 및 440 잔기)에서 세 가지 SA14-14-2-특이 돌연변이에 의해 결정된다. 백신 바이러스는 IC 경로로 접종된 마우스와 원숭이에서 시험될 때 YF-VAX® 보다 신경발병력 (neurovirulent)이 적었으며, 단일 접종 (single inoculation)에 대하여 마우스, 햄스터, 및 원숭이를 보호하였다 (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004; Tesh et al., Emer. Infect. Dis. 8:1392- 1397, 2002). 백신 바이러스는 혼합된 바이러스의 개체군 (작은 플라크는 S, 큰 플라크는 L인 플라크 표현형을 표시하는)을 포함하며, 이는 M 단백질 66 위치 (M66)에서 단일 아미노산 잔기에 의해 구분되었다. 이 돌연변이는 생후 8일된 젖먹이 마우스에 대하여 바이러스의 신경발병력에 영향을 주지 않는다 (Arroyo et al., J. Virol. 78: 12497-12507, 2004). 본 발명에서, 본 발명자들 은 M66 돌연변이가 숙주에서 바이러스혈증을 감소시키고, 따라서 현재의 백신 (ChimeriVax™-WN02, P5, 모(母) 바이러스와 돌연변이 바이러스의 혼합된 개체군) 또는 큰 플라크 변이체 (비 돌연변이체) 바이러스의 안전성을 개선하는데 사용될 수 있다는 사실을 설명한다.

T와 C (CTA/CCA)의 뉴클레오티드 이질성 (heterogeneity)(~50%)은 무혈청 조건하에서 베로세포에서 제작된 P5에서의 ChimeriVax™-웨스트 나일 바이러스의 공통 서열 (consensus sequence)에서 관찰되었다. 이 돌연변이는 막 (M) 단백질 66 잔기에서 아미노산 프롤린 (돌연변이체) 뿐만 아니라 루이신 (母야생형)을 포함하는 바이러스 (여기서 M66 돌연변이로 명명됨)를 만들어 낼 것이다. ChimeriVax™WN02와 ChimeriVax™WN02 M66 변이체의 서열들은 첨부된 서열목록에서 제공되며, 서열목록은 또한 이 단백질들의 아미노산 서열을 포함한다.

웨스트 나일 바이러스의 M 단백질은 75개 아미노산들을 포함한다. 단백질의 구조를 예상하고 웹사이트 http://www.predictprotein.org에 단백질 서열을 입력하여 JE SA14 (AAA67174), 쿤진 (AAP78942), MVE (CAA27184), SLE MSI (AAP44973, 및 SLE CORAN (AAP44972)의 M 단백질의 구조와 비교하였다. 모든 예상된 구조에서, M 단백질의 처음 40개 아미노산 (SLTVQTHGESTLANKKGAWMDSTKATRYLVKTESWILRN)은 비-막 영역이라고 예상되는 반면, 남은 35개 아미노산 (40-75) (PGYALVAAVIGWMLGSNTMQRVVFVVLLLLVAPAYS)은 바이러스 막 영역 내에 있다고 예상된다. 또한, 처음 40개 아미노산 잔기들내에는 9-10 전하된(charged) 아미노산 (3-4개 산성의, E 또는 D)과 6개 염기성 (R 또는 K)이 있는 반면, 여기 기술된 모든 5 가지 플라비바이러스 (WNV, SLE, MVE, JE, 및 쿤진)의 60 잔기에서는 단지 하나의 전하된 아미노산 (염기성의)이 있다. 이와 같이, M60 잔기가 그것의 인접한 아미노산들내 상호작용에 의해 바이러스 생물학에 중요한 역할을 할지도 모른다. P5에서 백신 바이러스의 플라크 형태학은 L과 S 플라크 크기 표현형의 혼합된 개체군을 나타낸다. P2, P3, P4 및 P5 바이러스의 시퀀싱은 돌연변이가 P4 (전체 개체군의 10%)에서 처음으로 나타났고 P5에서 ~50%에 달한다는 것을 나타냈다. 백신 바이러스의 S와 L 플라크 분리주 (plaque isolates)의 시퀀싱은 상기 돌연변이가 L에서 S까지 플라크 크기의 변화를 유발하고 있음을 보여주었다. S와 L 바이러스 변이체 (연구 바이러스로서 준비된) 모두는 생후 8일된 젖먹이 마우스에 대한 신경발병력에서 뚜렷한 차이가 없었다 (p=<0.0001).

L과 S 바이러스의 프리-마스터 시드 (Pre-Master Seed, PMS, P10) 균주 (stocks)는“청정 실험실 조건”하에서 ChimeriVax™-WN02 (p5)로부터 베로세포에서 3회의 플라크-플라크 직접 정제 (direct plaque to plaque purifications)와 2회의 바이러스 증폭에 의해 제조되었다. P10 S와 L 바이러스의 시퀀싱은 M66 잔기에서 단일 아미노산 차이를 나타냈다 (S 바이러스는 M66에서 프롤린을 포함하는 반면, L 바이러스는 이 부위에서 루이신을 포함하였다). M66 돌연변이는 대규모의 생산 환경에서 안정한 것으로 보였다. S 플라크 바이러스 (p10, PMS)는 피하 접종으로 햄스터에 접종되면, 백신 바이러스 (P5) 또는 L 플라크 바이러스 변이체 (P10, PMS)와 비교하여 매우 낮은 농도 (level)를 생산했다. ChimeriVax™-WN P5 바이러스 (S와 L 플라크 변이체 ~50:50이 포함된)로 접종된 원숭이와 인간의 혈청에서는, 바이러스의 대다수는 L 플라크 크기의 표현형을 가졌다. 또한, S 플라크는 인간 간암 세포계 (hepatoma cell line)에서 L 플라크보다 더 낮은 역가 (titer)로 성장하는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 S 플라크 바이러스 (M66 돌연변이를 가진 ChimeriVax™-WN02)가 ChimeriVax™-WN02 (M66 돌연변이 없는) 보다 인간에서 낮은 수준의 바이러스혈증을 유발할 수 있으며, 따라서 노인, 어린이, 또는 HIV 감염된 사람들과 같은 “위험에 노출된 사람들”을 위한 알맞은 (안전한) WN 백신 후보를 구성할 수 있음을 나타냈다. M 영역에서 추가적인 돌연변이는 P10에서 P12까지 PMS S 플라크의 대규모 제조의 계대접종 (예컨대, M62, M63, 및 M64) 또는 ChimeriVax™-WN02 백신 (예컨대, M60, M61, 및 M63)으로 접종된 원숭이로부터 분리된 개개의 플라크들을 시퀀싱함으로써 찾아냈다. 이러한 돌연변이들은 본 발명의 바이러스의 구성에 사용될 수도 있다.

베로세포에서 S와 L 플라크 바이러스의 PMS 생산

ChimeriVax™-WN02 백신 물질 (P5)은 무혈청 베로세포 (Serum Free Vero cells)에서 키웠으며; “작은 크기”(S)로 확인된 10개 플라크와 “큰 크기”(L)로 확인된 10개 플라크를 채집하였다. 그 다음 각각의 분리주 (isolate)는 무혈청 베로세포에 계대접종하였고, 각각의 분리주로부터 하나의 플라크를 채집하였다. 상기 과정은 총 3회의 플라크 정제 (plaque purification)를 위해 최종 한번 반복되었다. 분리주들을 정제한 플라크 (P8)를 무혈청 베로세포 (무혈청 배지에서 자란)를 포함하는 T25 cm² 플라스크에서 증폭한 다음 채취하고 -80℃에서 저장하였다. 분리주를 허위 돌연변이 (spurious mutation)가 없는 PMS 후보를 찾기 위해 시퀀싱하였다. 두 분리주를 발현된 (비-잠재성:non-silent) 돌연변이가 없도록 동정하였다: 한 분리주는 작은 플라크임을 확인하였고 (M66 프롤린)(표 1), 다른 하나는 wt 서열을 포함하였다 (M66 루이신)(표 2). 이 두 분리주를 큰 플라스크에서 키웠으며, 부분표본 (aliquoted)을 LP와 SP PMS (P10) 바이러스처럼 QC 목록 (QC inventory)에 제출하였다.

대규모에서 생산된 SP 바이러스의 유전적 안정성

대규모 제조과정 시 S 플라크 표현형이 안정한 지를 확인할 목적으로, 베로세포를 감염시키는 것과 무혈청 조건하에서 성장시키는 것에 의한 생물반응장치 (bioreactor)에서 작은 플라크 PMS 바이러스를 P12 바이러스를 생산하기 위하여 두 번 계대접종 하였다. 상기 P12 바이러스를 채취하여 6-웰 플레이트에서 플라크를 형성시켰다. 상기 플라크의 대부분은 작은 크기를 가졌다. 이용할 만한 가장 큰 플라크 20개를 채취하여, O-Vero (1회 계대접종)에 증폭시켰으며, prME 영역을 Titan One-Tube RT-PCR kit (Roche)를 통해서 전사/증폭시켰다. M 영역을 포함하는 cDNA 단편들을 시퀀싱하였고, 분리주의 형태학 (morphology)을 WN 특이적 단클론 항체를 사용하는 면역-염색을 통해서 확인하였다. 20개 플라크 중 13개는 M66 (SP 형태학을 초래하는 유전자 마커)만을 포함하였고, 5개 분리주는 M66 이외에 또 다른 돌연 변이를 포함하였다. 분리주 #4는 M63 (LP 표현형)을 포함하였고, 분리주 #16은 wt와 M66의 혼합된 개체군을 포함하였다. 몇몇 플라크가 큰 크기로 나타나는 사실에도 불구하고, 이러한 데이터는 그들이 M66 돌연변이를 포함하고 증폭으로 S 크기가 된다는 것을 설명한다. 20개 중 단지 하나의 플라크 (#4)만이 L 크기가 되는 것으로 나타나, 분명히 M63에서 L에서 P로의 돌연변이 때문임을 나타낸다. 플라크 #16은 M66 위치에서 돌연변이체 P 아미노산과 wt L 모두를 포함하는 큰 및 작은 플라크 크기 바이러스의 혼합된 개체군을 생산하는 것으로 나타났다 (표 3).

간세포에서 ChimeriVax™-WN 바이러스 변이체의 성장

인간 간암 세포계 HepG2와 THLE-3 세포를 0,005 MOI에서 ChimeriVax™-WN01 (야생형 prME), ChimeriVax™-WN02 P5 (El07, E313, E316, E440, L/P 아미노산이 혼합된 M66, S와 L 혼합된 플라크에서 돌연변이를 포함하는), ChimeriVax™-WN LP (E107, E313, E316, 및 E440, WNL), 및 ChimeriVax™-WN SP (E 107, E313, E316, E440, 및 M66P, WNS)로 감염시켰다. 매일 상청액 (supernatants)을 수집하여 표준 중성 레드 더블 아가로즈 중층 방법 (neutral red double agarose overlay procedure)을 사용하여 O-Vero 세포에 적정 (titrate)하였다.

HepG2 세포에서(도 3), WN01 (야생형 prME)에 대한 가장 높은 바이러스 성장 (7× 10⁶ PFU/ml)이 5일째에 관찰되었으며, 이어 5일째에 LP의 성장 (2.7× 10⁶ PFU/ml) 이었다. YF-VAX®에 대한 바이러스 피크는 3일째에 도달 (1.17× lO⁶ PFU/ml)하였으며, 그 다음은 4일째에 백신 바이러스가 혼합된 WN02 (6.4× 10⁵ PFU/ml)이었다. 가장 낮은 성장은 SP 바이러스로 나타났고 (4일째에 피크 역가 1× 10⁵ PFU/ml), 이는 M66에서 단일 아미노산 치환 (L에서 P)을 포함한다. THLE-3 세포에서 (도 4), LP 바이러스의 역가보다 YF-VAX® 의 역가가 약간 더 높은 것을 제외하고 HepG2 세포에서와 같은 패턴이 관찰되었다. 다시, WN01이 가장 높은 역가 (1.3× lO⁵ PFU/ml, 4일째)을 보였으며, 이어 LP의 역가 (5.7× lO⁴ PFU/ml, 7일째), YF-VAX® (8.8× lO⁴ PFU/ml, 4일째), 및 혼합된 P5 바이러스 (1.8× 10⁴ PFU/ml, 4일째)의 성장이었다. 다시, SP 바이러스에 대한 가장 낮은 역가가 관찰되었다 (9.2× 10³ PFU/ml, 4일째).

각 바이러스에 대한 세포변성효과 (cytopathic effects, CPE)의 유도를 매일 기록하였다 (표 4). WN01과 LP 바이러스에 대한 CPE를 5일째에 처음 관찰되었고 2일후 완료 (100%)된 반면, SP 또는 혼합된 플라크 개체군은 CPE를 더 이른 시점 (3일째)에 유도하였고 WN01 또는 LP보다 1일 더 빠르게 (6일째) 세포 단일층을 완전히 파괴하였다. YF-VAX® 에 대한 CDP의 유도는 3일째 처음 관찰되었고 상기 단일층은 접종 6일후 전부 파괴되었다. 야생형 뎅기 바이러스에서 찾아볼 수 있듯이 (Catteau et al., J. Gen. Virol. 84:2781-2793, 2003), HepG2 세포에서 CPE의 유도는 아마 M 단백질의 세포사멸활성 (apoptotic activity) 때문일 것이다. 이러한 데이터는 SP 바이러스 변이체가 혼합된 또는 LP 바이러스보다 더 낮은 역가로 자랐 음을 보여주며, 상기 M66 돌연변이는 아마도 바이러스가 인간에 대하여 더 적은 간친화성 (hepatotropic)이 되었다는 것을 보여주었다.

혼합된 (SP와 LP 바이러스) P5 백신 바이러스로 원숭이 접종 후 ChimeriVax™-WN, SP 바이러스의 검출의 결여

WN, JE, 및 YF 바이러스 (플라크 감소 중화 실험 (plaque reduction neutralization test, PRNT)에 의해 측정된 것처럼)와 같은 플라비바이러스를 검출할 수 있는 항체가 결여된 총 8마리의 접종한 적이 없는 사이노몰거스 (cynomolgus) 원숭이는 ChimeriVax™-WN02 (P5) (n=4) 이거나 YF-VAX® (n=4) 중의 하나를 피하경로로 접종되었다. 이 실험의 목적은 3일의 관찰기간 동안 바이러스혈증, 생물학적 분포 (biodistribution), 및 ChimeriVax™-WN02 백신의 일어날 만한 독성을 평가하기 위한 것이다. ChimeriVax™-WN02와 YF-VAX® 에 대한 접종된 양 (dose)은 각각 ~1.25× lO⁵ PFU/0.5 ml과 5.5× lO⁴ PFU/mL이다. 매일 동물들을 채혈하고 접종 후 4일째에 희생 (sacrifice)시켰다. 혈액은 베로 세포에서 표준 플라크 분석 (standard plaque assay)을 사용하여 바이러스혈증 수준 (level)을 확인하기 위해 사용하였으나, 수집된 조직들은 바이러스 분석을 위해 급속냉동하거나 조직병리학적 (histopathological) 평가를 위해 보존하였다.

1일째 (접종 전)에서 4일째 (안락사 전)까지 수집된 원숭이 혈청에 대해 바이러스혈증을 평가하였다. 상기 분석은 Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742- 1751, 2000에 기술된 것처럼 아가로즈 더블 중층/중성 레드 염색 (agarose double overlay and neutral red staining)(개개의 플라크들을 분리하고 시퀀싱하기 위해)을 사용하거나 메틸 셀룰로오스 중층/크리스탈 바이올렛 염색 (methyl cellulose overlay and crystal violet staining)(바이러스혈증을 측정하기 위해)에 의해 수행되었다. ChimeriVax™-WM02가 접종된 원숭이에서 바이러스혈증의 심한 정도 (magnitude)와 지속기간 (duration)은 YF-VAX® 가 접종된 원숭이에서보다 더 높았다 (표 5). YF-VAX® 에 대한 바이러스혈증의 가장 높은 역가는 200 PFu/ml (동물 MF21157, 4일째)였다. ChimeriVax™-WN P5 바이러스에 대한 바이러스혈증의 가장 높은 역가는 1000 PFU/ml (동물 MF21191F, 4일째)였다. ChimeriVax™-WN02 바이러스로 접종된 모든 동물 (4/4)은 접종 후 3일 동안 바이러스혈증을 나타났으나, YF-VAX® 로 접종된 동물은 단지 2/4만이 바이러스혈증 (2일 동안만)을 나타냈다 (표 5).

ChimeriVax™-WN02 바이러스로 접종된 동물들은 SP와 LP 바이러스의 혼합물이 투여되었기 때문에, 높은 수준의 바이러스혈증의 원인이 되는 바이러스 변이체 (S 또는 L)를 동정하기 위하여 혈청으로부터 SP와 LP 바이러스를 분리할 필요가 있었다. 접종 후 2 ~ 4일째에서 얻은 4마리 원숭이 모두의 혈청을 1:2 및 1:10으로 희석하여 베로세포가 부착 (seed)되어 있는 6-웰 플레이트의 쌍을 이룬 웰 (duplicate wells)에 접종하기 위해 사용하였다. 두 번째 아가로즈 중층/중성 레드의 추가 후에, 개개의 플라크 (4개의 S와 3개의 L 플라크들)을 채취하여 M66 돌연변이 바이러스의 존재를 확인하기 위하여 직접 시퀀싱하였다 (표 6). 어떠한 분리 된 플라크들도 M66 돌연변이 (L에서 P로 치환)를 포함하지 않았으므로, M66 돌연변이 바이러스가 이 동물들에서 검출되는 높은 수준의 바이러스혈증의 원인이 아니라는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, M 영역 (M60m M61, 및 M63)에서 3개의 또 다른 돌연변이들이 관찰되었다. 이 바이러스 변이체가 ChimeriVax™-WN02 백신 바이러스에서 낮은 양 (quantity)으로 존재했었거나 (이 경우 공통 서열 시퀀싱에 의해 검출될 수 없다), 또는 그들이 LP 바이러스 변이체의 게놈 (genome)에서 돌연변이에 의해 생체 (원숭이)내에서 생성되었다는 것 중의 하나일 가능성이 있다.

ChimeriVax™-WN SP (PMS, PlO), LP (PMS, PlO), 또는 혼합된 (P 5, SP, 및 LP) 바이러스로 접종된 햄스터에서의 바이러스혈증과 중화 항체 반응 (neutralizing antibody responses)

본 발명에 사용된 동물들은 BL2하에서 마이크로분리기 (microseparators)에서 보호되었고 본 발명의 실험동안 IACUC에 의해 입증된 동물 프로토콜에 따라 다뤄졌다. 3가지 ChimeriVax™-WN02 바이러스 (SP, PMS, P10; LP, PMS, P10, 및 SP와 LP 혼합 백신 바이러스, P5)를 생후 7주된 암컷 골든 시리안 햄스터 (Golden Syrian hamsters)를 감염시키는 데 사용하였다. 각 바이러스들을 서혜부(鼠蹊部)의 피하경로로 1그룹이 15마리인 햄스터들에 접종하였다. 감염 도스 (dose)는 10⁵ pfu였으며, 접종양 (inoculum volume)은 100 ㎕였다. 5마리의 추가 그룹을 모의대조군 (sham control)으로써 바이러스 희석액 100 ㎕로 유사하게 주사하였다. 바이러스 감염일 (0 일)과 접종 후 5일까지 매일, 혈액 샘플을 안와 뒤쪽 혈액채취법 (retro orbital bleeding)에 의해 모의대조군을 제외한 모든 동물로부터 수집하였다. 혈액채취 및 접종에 전에 가스마취 (isofluorane) 흡입에 의해 동물들을 마취시켰다. 12-웰 플레이트에서 배양된 베로세포의 쌍을 이룬 웰 (duplicate wells)에 1:10 희석된 혈청 샘플 0.1 ml을 직접 플라크법 (direct plaquing)하여 실험 샘플에서의 바이러스 농도를 결정하였다 (도 5).

도 5에 보이는 것처럼, LP 바이러스 감염된 햄스터로부터 수집된 혈청 샘플에서는 피크의 바이러스혈증의 더 높은 수준 (평균하여 pfu의 3 logs)이 관찰되었는데, SP 바이러스 접종된 햄스터의 혈액 샘플에서는 바이러스혈증의 매우 낮은 수준 (<10 pfu)이 나타났다. 접종원 (inoculum)에서 SP 바이러스의 비율 (proportion)이 증가되면 (혼합된 플라크 바이러스에 대하여 50%로), 피크의 바이러스혈증 역가는 바이러스혈증 수준이 유도된 LP 바이러스의 대략 절반으로 낮아졌다. 추가적으로, 바이러스혈증 피크 시간 (viremia peak time)은 감염 후 적어도 1일 내지 4일간은 연기되었다. 이러한 데이터는 동일한 모(母) 바이러스로부터 분리된 LP와 SP 변이체, 즉 ChimeriVax™-WN02가 서로 다른 생물학적 특성을 가진다는 것을 설명하였다. 햄스터에서 SP 바이러스와 비교해 볼 때 LP 바이러스는 더 빠른 비율에서 더 높은 수준으로 증식하였다. 또한, LP와 혼합한 SP 바이러스 (P5 바이러스)는 LP 바이러스의 몇몇 특성을 분명히 방해 (counteract)한다. 이는 햄스터 감염 실험들에서 나타나는데, 여기에서 혈액 중에 바이러스의 존재는 낮은 수준으로 감소하고, 바이러스 증식 동역학 (virus replication kinetics)은 혼합된 바이 러스가 감염된 햄스터에서 느리게 나타났다. 요컨대, SP 변이체 바이러스에 존재하는 M66 (L에서 P)에서의 돌연변이는 햄스터에서 SP 변이체 바이러스의 바이러스혈증을 감소시켰다.

실험 2: ChimeriVax™-JE와 ChimeriVax™-DENl-4

배경기술 및 요약

이하 기술된 본 발명에서 본 발명자는 전염성 소 뇌질환 (bovine transmissible encephalopathy)의 프리온 오염원 (prion agent)으로 백신이 오염될 가능성에 대한 어떠한 우려를 제거하기 위하여 무혈청 (serum-fee, SF) 배지에서 배양된 베로세포를 사용하여 새로운 ChimeviVax™-JE 시드 바이러스 (seed virus)를 조제하고 특성화하였다.

SF 배양에서 증식하는 동안, 클로닝되지 않은 바이러스는 앞서 혈청-포함 배양에 나타나지 않았던 돌연변이를 축적하였는데, 이는 바이러스 증식의 비율을 증가시키는 SF 성장조건에 적응시키기 위함인 것으로 보인다. 이 돌연변이들은 E 또는 M 단백질 (E-107 F에서 L 또는 M-60 R 에서 C 돌연변이)에 나타났으며 바이러스 증식의 과정에서 M 단백질의 기능적 중요성을 암시하였는데, 이는 SF 조건에서 바이러스가 성장하는 동안 현저해졌다 (실시예 1 (ChimeriVax™-WN)에서 보여준 M-단백질의 60 위치에서 아미노산 R 참조). 상기 백신의 생물학적 특성에 관한 M (M60, M5 in ChimeriVax™-JE) 또는 E (ChimeriVax™-JE에서 E-107, ChimeriVax™-DENl과 -DEN3에서 E202/204, 및 ChimeriVax™-DEN2에서 E251) 단백질내 돌연변이의 효과를 밝혔다. 이 키메라 바이러스들 모두는 임상실험에서 이미 시험되어 있다.

재료 및 방법

세포 및 배지

베로세포는 ATCC (ATCC; Manassas, VA; CCL 81; 아프리카 녹색 원숭이 신장세포)로부터 얻었다. 이 세포들은 SF 배지에서 성장하도록 적응시켰고 백스터 (Baxter, Orth, Austria)로부터 133 계대접종 (passage 133)에서 얻었으며 그 후 플라스크에 심기 (seeding) 또는 136 계대접종에서 세포은행으로부터 심어진 개시 (seeded starting)에 의해 직접 사용되었다. 모든 실험에서, 베로세포의 계대접종 수준은 149 계대접종을 넘지 않았다. 세포와 바이러스를 16℃에서 7.5% CO₂ 하에 키웠다. 세포는 SF 조건하에 증식하였다.

ChimeriVax™-JE 변이체

바이러스 (passage Pl)는 전임상 또는 임상시험에서 시험된 non-SF ChimeriVax™-JE 백신 후보의 생산을 위해 이전에 사용된 동일한 시험관내 RNA 전사체 (-80℃에 저장된)와 함께 SF 베로세포의 전기천공법 (electroporation)에 의해 시작되었으며 (Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002) 이전에 기술된 것처럼 제조하였다 (Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999). 일반적으로 증폭 계대접종 (amplification passages)은 0.001 pfu/cell의 MOI에서 수행되었고 바이러스 수확물은 감염 후 3-4일째에 수집되었으며 (CPE가 ~10%일 때), 저속 원심분리에 의해 맑게 되면 10% 소르비톨 (sorbitol)을 첨가하여 -80℃에 저장하였다. 감마-방사선 조사된 FBS (HyClone; SF 배지로 조제된 아가 (agar)에서는 세포들이 플라크를 형성하지 못하기 때문에 FBS를 사용하였다)가 존재하는 표준 아가-중성 레드 중층 방법 (standard agar-neutral red overlay method)을 사용하여 연속된 3번의 플라크 정제에 의해 백스터사의 베로세포에서 클로닝된 변이체를 생산한 다음 SF 조건에서 증폭하였다. 제시된 샘플들에서 바이러스 역가를 측정하기 위한 플라크 분석은 감염-후 5일째에 크리스탈 바이올렛에 의해 플라크들을 시각화 (visualization)한 단일 메틸 셀룰로오스 중층 방법 (single methyl cellulose overlay method)을 사용하여 수행되었다.

ChimeriVax™-DEN 바이러스

ChimeriVax™_DEN1-4 백신 바이러스를 바이러스 cDNA로부터 만들어진 RNA 전사체를 가지는 베로세포의 전기천공에 의해 조제하였다. 계대접종 7 (P7)에서 프리-마스터 시드 (PMS)를 생산하기 위하여 자손 바이러스 (progeny viruses)들을 3회의 플라크 정제에 제시하였다. 백신 제품 (Vaccine lot) (P10 바이러스들)을 생산하기 위하여 미국 생산기준인 U.S. cGMP (U.S. current Good Manufacturing Practices)를 사용하여 3번의 추가 계대접종을 수행하였다. 몇몇 돌연변이들은 베로세포에서의 다수의 계대접종 후 키메라의 E 유전자에서 나타났다 (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004). 이 돌연변이들의 하나 (ChimeriVax™-DEN1에 서 E 204)는 실험용 영장류 (non-human primates)에서 바이러스의 내장기관친화성이 현저하게 감소하였다 (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004).

공통서열 시퀀싱

제시된 바이러스 샘플의 공통서열 시퀀싱을 이전 (Pugachev et al., Vaccine 20:996-999, 2003)에 기술된 것과 같이 수행하였다. 간단히 말해서, TRIZOL LS reagent (Life Technologies-Gibco BRL)로 추출된 비리온 RNA (virion RNA)는 길이 ~2-3 kb의 5번 중첩 cDNA 증폭산물 (five overlapping cDNA amplicons)에서 Titan One-Tube RT-PCR 키트 (Roche)로 증폭시켰다. 포지티브와 네거티브 위치 (orientation) 둘 다의 JE- 및 YF-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 수집과 CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing 키트 (Beckman)를 사용하여 증폭산물들을 시퀀싱하였다. 시퀀싱 반응 결과물을 CEQ2000XL 자동서열분석기 (automated sequencer, Beckman Coulter)로 분석하였다. 상기 데이터를 정렬하여 Sequencher 4.1.4 (GeneCodes) 소프트웨어로 분석하였다.

플러스- 및 마이너스-가닥 둘 다의 시퀀싱 반응을 나타내는 모든 크로마토그램 (chromatograms)에서 이질성 신호가 관찰되면 뉴클레오티드 이질성 (heterogeneities)을 기록 (register)하였다. 몇몇 바이러스에 대해서는, 구조 유전자들을 포함하는 5번 cDNA 증폭산물의 첫 번째 (Fragment I)만을 시퀀싱하였다.

젖먹이 마우스에서의 신경발병력

마우스의 유지와 관리는 실험동물의 인도적 사용에 대한 미국 국립보건원 관리지침 (National Institutes of Health guidelines)에 따라 수행하였다. 임신한 비근교계 (outbred) ICR 암컷 마우스를 Taconic Farms (Germantown, NY)로부터 구입하였다. 새로 태어난 마우스를 양육하여 접종 6일전에 새 그룹에 포함시켰다. 생후 8일된 젖먹이 마우스의 그룹을 제시된 바이러스 샘플 0.02 ml로 뇌내 경로 (IC route)를 통해 접종하였다. 접종에 사용된 바이러스의 일련의 1:10 희석은 MEM-10 10% FBS에서 하였다. 희석되지 않은 접종원 (inocula)을 역-적정 (back-titrate)하고 각 희석액의 정확한 도스 (doses)를 계산하였다. 사망률은 21일 경과 후 기록하였다. YF 17D 대조군 바이러스는 상업적 백신 바이알로부터 재구성된 YF-VAX® (Aventis Pasteur, Swiftwater, PA)로 하였다.

원숭이 안전성 및 효능 시험

실험 1. 새로운 클론 C (M-60) ChimeriVax™-JE 백신 Master Viral Bank (MVB; P11)와 Production Viral Bank (PVB; P12) 균주 (stocks)의 신경발병력/독성 분석표 (profile)는 YF-VAX® 대조군 (YF 17D 백신 바이러스)과 비교해서 시노몰거스 원숭이에서 GLP 표준에 따라 시험하였다. 33마리의 실험적으로-접종한 적이 없는, 플라비바이러스-혈청음성 시노몰거스 원숭이 (HAI 테스트에 의해 결정된)는 표 9에 나타난 처치 그룹으로 지정하였다. 모든 원숭이는 1일째에 단일 IC 주사를 통해 투여하여 30일간 관찰한 다음 안락사시키고 부검하였다. 상기 원숭이들을 임상징후 (clinical signs)(매일 두번), 음식물 섭취 (매일)에서의 변화, 체중 (매주), 및 임상 병리학 지수 (clinical pathology indices)에 대하여 평가하였다. 세계보건기구 (WHO)의 황열병 백신에 대한 요건에 기초하여 임상 스코어링 시스템에 따라 임상 스코어 (clinical score)를 정하였다 (WHO, Technical Report Series, No. 872, 1998). 임상 병리학 분석 (혈청화학 및 혈액학 파라미터들)을 위해 1일째 및 3, 5, 7, 15, 및 31일째에 접종-전 혈액 샘플을 수집하였다. 양적인 바이러스혈증 결정 (quantitative viremia determinations)을 위해 1일째 (투여-전) 및 2-11일째에, 중화 항체 역가 분석 (neutralizing antibody titer analyses)을 위해 1일째 (투여-전)와 31일째에 추가적인 혈액 샘플을 수집하였다. 31일째에 총체적인 부검 (complete necropsy)을 수행하고 조직들을 보존을 위해 수집하였다. 조직은 간, 비장, 심장, 신장, 및 부신의 조직병리학을 위해 준비하였다. 뇌와 척수의 조직병리학은 Levenbook et al. (J. Biol. Stand. 15:305, 1987)에 기술된 방법에 따라 수행하였으며 황열병 백신 (WHO, 1988)에 대한 WHO 요건에 맞추었다.

실험 2. 이 실험은 ChimeriVax™-JE 백신 [E 단백질의 소수성 말단에서의 E491 L에서 F로 변화를 제외한 어떠한 돌연변이도 포함하지 않는, FBS 존재하에 LS5 베로세포 (BB-IND #9167, Serial #000)에서 이전에 생산된 최초의 클로닝 되지 않은 백신 P5]과 새로운 클론 C (M-60 돌연변이체)인 ChimeriVax™-JE 백신이 정제된 벌크 조제물 (P13)의 바이러스혈증, 면역반응 및 안전성을 비교하기 위하여, GLP 표준에 따라 시노몰거스 원숭이에 하기의 단일 피하 (SC) 투여 30일간 수행하였다. 18마리의 실험적으로-접종한 적이 없는, 플라비바이러스-혈청음성 (HAI 테스트에 의해) 시노몰거스 원숭이를 표 10에 나타난 처치 그룹으로 지정하였다. 모든 원숭이를 1일째에 한 원숭이 당 단일 부위에 SC 주사를 통해 한번 투여하였다. 상기 원숭이들을 독성의 임상징후 (매일 2회), 체중에서의 변화 (매주), 그리고 혈청화학, 혈액학 및 응고작용 파라미터들에 대하여 평가하였다. 혈청화학, 혈약학, 및 응고작용 파라미터들 분석을 위해 1일째 (접종-전)와 4, 7, 15, 및 31일째에 혈액 샘플을 수집하였다. 양적인 바이러스혈증 분석을 위해 1일째 (접종-전) 및 2-11일째에, 일본 뇌염 바이러스-특이적 중화 항체 역가 분석을 위해 1일째 (접종-전)와 31일째에 추가적인 혈액 샘플을 수집하였다.

바이러스 불활성화의 pH 역치 (threshold) (간접 융합 분석)

낮은 pH (세포막이 없는 상태에서)에 플라비바이러스의 노출의 한 결과는 E 단백질에서의 형태적 변형과 바이러스 불활성화 (효력의 상실)의 유도이다. 세포막이 있는 상태에서는, 이러한 형태적 변형 (conformational changes)은 세포막과 바이러스 막의 융합에 필요하며, 숙주세포내 바이러스 게놈의 방출을 가져온다. WN, DEN, YF, 및 JE와 같은 모기-매개 바이러스의 융합에 대한 pH 역치 (threshold)는 모기 세포계 C6/36 (Guirakhoo et al, Virology 169(l):90-99, 1989)을 이용하여 (FFWI)내로부터의 융합에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 본 발명자는 본 발명의 모든 ChimeriVax™ 바이러스들로는 어떠한 FFWI도 설명할 수 없었는데, 아마도 모기와 모기 세포계에서 이 바이러스들이 충분히 성장하지 못하였기 때문인 것 같다 (Johnson et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 70(l):89-97, 2004). 따라서 본 발명자는 여기서 “간접 융합 분석 (Indirect Fusion Assay)”으로 명명된 분석법에서 서 로 다른 pH 수준에 노출한 후 바이러스 효력의 상실 (loss of virus potency)을 측정하려고 하였다. 이 분석은 바이러스 막과 세포막의 융합이 일어나는 곳에서의 pH 역치를 간접적으로 측정한다. 2 mM L-글루타민 (L-Glutamine), 2.7% 탄산수소나트륨 (sodium bicarbonate), 10% HI FBS, 및 MES (Sigma)로 적절한 pH 조정된 1% 항생물질/항균 용액 [페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 0.1 mg/ml, 암포테리신 0.25 μg/ml (Sigma)]이 첨가된 1× MEM을 사용하여 융합을 pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2, 6.0, 5.8, 5.6, 5.4, 및 5.0에서 수행하였다. 각 바이러스의 부분 표본 (aliquot)을 1× 10⁴ 플라크-형성 단위 (PFU)/ml로 각 pH 배지에 희석하였다 (10^-1 희석). 각 pH 값에 노출 10분 후, 50% 열-불활성화된 (HI) FBS를 각 바이알 (vial)에 첨가하고 각 용액의 pH를 탄산수소나트륨으로 중화하였다. 각 바이러스 역가 (titer)를 측정하기 위한 베로-세포 단일층 (monolayer, 6-well 플레이트에 9× 10⁵ 세포/well의 농도로 심어진)을 감염시키는데 각각의 pH 값에서 각 바이러스의 100 ㎕ 용량을 사용하였다. 감염은 쌍을 이뤄 (in duplicate) 수행하였고, 50 PFU/well이 되도록 하였다; 2개의 비-감염된 세포의 웰 (well)을 각 플레이트마다 유지하였으며 음성대조군 (negative controls)으로 사용하였다. pH 7.0과 pH 6.8 샘플들은 인용문헌 (references)을 참조하였다. 역가 (titers)는 표준 플라크 분석을 사용하여 분석하였다. 이 분석에서, 베로세포를 바이러스의 일련의 희석 (10^-1 내지 10^-6)으로 쌍을 이룬 웰 (duplicate wells)에서 감염시켰다. 감염 후, 베로 단일층은 2 mM L-글루타민, 2.7% 탄산수소나트륨, 5% HI FBS, 1% 항생물질/항균 용액 [페니실 린 100 U/ml, 스트렙토마이신 0.1 mg/ml, 암포테리신 0.25 μg/ml (Sigma)], 및 0.6% 아가로즈 44% (Sigma)가 첨가된 1× MEM (Sigma)로 중층하였다 (overlay). 세포들은 37℃, 5% CO₂에서 4일간 배양한 후, 2 mM L-글루타민, 2.6% 탄산수나트륨, 2% HI FBS, 1% 항생물질/항균 용액, 0.6% 아가로즈 44%, 및 3% 중성 레드 용액 (Sigma)이 첨가된 1× MEM을 포함하는 2차 중층배지로 덮었다. 밀리리터 당 플라크-형성 단위 (PFU)에서 한정되는 바이러스의 역가를 측정하기 위하여 2차 중층의 추가 24시간 후 상기 플라크들을 세었다.

Vlaycheva et al. (J. Virol. 76:6172-6184, 2002)에 따른 바이러스 침투력 분석

M-60 돌연변이 (및 E-107 돌연변이)가 SF 베로세포에서의 침투 (penetration)를 용이하게 하는 것을 설명하기 위하여, SF 베로세포를 클론 A, C, 및 I 바이러스로 감염시키고 5, 10, 20, 또는 60분 동안 SF 배지에 적절하게 희석하였으며, 그 후 세포 밖의 바이러스를 불활성화 (inactivate)시키기 위하여 0.1 M 글리신 (glycine), 0.1 M NaCl, pH 3.0으로 3분간 처리하였다. 웰들을 PBS로 두 번 세척한 뒤, 단일층을 메틸-셀룰로오스 (methyl-cellulose)로 중층하고, 이어 5일째에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 침투 효율은 글리신 처리 후 글리신 대신 PBS로 처리된 대조군의 감염된 웰 (control infected wells)과 비교하여 관찰된 플라크 수의 퍼센트로 계산되었다.

ChimeriVax™-JE의 임상실험

임상 연구 (프로토콜 H-040-003)를 수행하였다. 건강한 성인 남성과 여성 피실험자 (subjects)에게 투여된 백신은 M-60 (아르기닌)에서 정상서열 (native sequence)을 가졌다. 건강한 성인 피실험자/군은 ChimeriVax™-JE 백신의 등급이 매겨진 도스 (doses)로 피하주사 투여하였고, 여러 대조군 그룹이 포함되었다. 도스 그룹 당 11 내지 33 피실험자들이 시험되었다. 베로세포 단일층에서의 플라크 분석에 의해 바이러스혈증을 매일 측정하였다. 동일한 분석과 실험실은 두 시험 모두에서 바이러스혈증 수준을 결정하였다. 안전성 평가는 유해사례 (adverse events), 체온, 신체검사, 및 실험실 테스트 (바이러스혈증 수준의 측정을 포함하는)의 기록을 포함하였다. ChimeriVax™-JE를 투여 받은 대부분의 피실험자에서 바이러스혈증을 보였다. 2차 연구 (프로토콜 H-040-007)는 그룹 당 31 또는 32명의 피실험자가 M60 시스테인 돌연변이를 포함하는 ChimeriVax™-JE의 등급이 매겨진 피하주사 도스 (3, 4, 또는 5 log¹⁰ PFU)를 투여 받은 건강한 성인 남성과 여성 피실험자들에서 수행되었다. 도스 범위 (dose range)는 이전 연구에서의 도스 범위인 2.8, 3.8, 및 4.8 log¹⁰ PFU를 투여 받았던 피실험자들에서와 유사하였다.

결과

클로닝 되지 않은 SF ChimeriVax™-JE 바이러스에서 적응 돌연변이, 및 클로닝된 변이체의 조제

본 발명에서 생산된 바이러스 샘플들의 개략도 (diagram)는 도 6에서 나타난다. 초기의 클로닝 되지 않은 계대접종 2 (P2) 샘플 (프리-마스터 시드 후보; Pre-Master Seed candidate, PMS)은 이전 연구 (Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002)에서 FBS-포함한 배지에서 백신을 제조하는 데에 사용되었던 RNA 전사체를 시험관내에서 세포에 트랜스펙션하여 SF 배양에서 얻었고, 이어 추가적인 증폭 계대접종 (amplification passage)을 하였다. 이 바이러스의 전체 게놈은 시퀀싱되어 어떠한 검출 가능한 돌연변이도 포함하지 않는 것으로 나타났다 (표 7)(공통서열 시퀀싱 접근법 (consensus sequencing approach)은 소수 생물형군 (minor subpopulations)을 검출하지 못함을 나타냄; 돌연변이의 검출 한계는 ~10%이다). 이 P2 바이러스에서 P10 수준까지 시작하는 소규모 계대접종은 SF 배양 (도 6; g.s. 계대접종)에서 연장된 증식기간동안 바이러스의 유전적 안정성 (genetic stability, g.s.)을 위해 T25 플라스크에서 수행되었다. g.s. P5와 g.s. P10 계대접종의 전체 게놈 서열은 뉴클레오티드 935에서 C에서 T로 하나의 뉴클레오티드 변화가 있으며 그 결과 M-60 잔기에서 R에서 C로 아미노산 치환을 초래하였다 (표 7). 이 돌연변이는 g.s. P3가 아닌, g.s. P4에서 이질성 (heterogenecity)으로써 처음 검출되었다.

소규모 유전적 안정성 분석의 결과에도 불구하고, 클로닝 되지 않은 마스터 시드 (P3)와 생산 시드 (P4)를 생산하기 위한 롤러-병 (roller bottles) 및 그 후 백신 벌크 (P5)를 생산하기 위한 100 L 생물반응장기 (bioreactors)에서 클로닝 되지 않은 P2 PMS로부터 3번의 대규모 제조 SF 계대접종이 수행될 때, 서로 다른 돌 연변이, 즉 50:50% 이질성으로써 관찰된 뉴클레오티드 1301에서 T에서 C로 변화에 기인한 E-107 잔기에서 F에서 L로 아미노산 변화가 축적되었다 (표 7). 중대한 약독화 잔기 (critical attenuation residue)에서 SA14-14-2 서열로부터 야생형 JE 서열로의 복귀 (reversion) 때문에 (Arroyo et al., J. Virol. 75:934-942, 2001), 이는 수용 불가한 돌연변이이며 따라서 잠재적으로 백신의 안전성을 장담할 수 없다.

하기 언급되는 고려사항에 기초하여, 플라크 정제 (plaque purification)에 의해 클로닝된 PMS 후보를 생성함으로써, SF 백신을 안정화하고 E-107과 같은 원치 않은 돌연변이의 축적을 방지하였다. 플라크 정제는 YF 17D-특이 RNA 중합효소에 의한 바이러스 RNA 합성 (Pugachev et al., J. Virol. 78:1032-1038, 2004)과 비교하여 RNA 합성의 낮은 충실도 (fidelity)가 특징되는 시험관내 전사에 의해 도입된 클로닝 되지 않은 바이러스에서 랜덤 돌연변이를 제거한다. 클로닝 되지 않은 P2 PMS 바이러스로부터 시작하여, 어떠한 아미노산 치환도 가지지 않는, P7에서 생물학적 클론인, 클론 A 바이러스는 3번의 서열 플라크 정제에 의해 얻었으며 이어 SF 배지에서 2번의 증폭 계대접종을 하였다. 그리고 비-돌연변이체 P7 클론 A PMS라고 명명하였다. 그것의 게놈은 뉴클레오티드 6952와 7142에서 2개의 잠재성 뉴클레오티드 변화 (silent nucleotide change)를 포함하였다 (표 7). 잠재성 뉴클레오티드 변화는 바이러스 단백질들의 아미노산 서열을 변화하지 않고 능률적인 바이러스 증식에 필요한 cis-acting RNA elements를 외부에 위치시켰기 때문에 이러한 변화들은 수용 가능하였다. M-60 돌연변이 (M-60 P10 클론 C PMS 변이체라고 명시된)를 포함하는 A 클론 C P10 바이러스는 P5 g.s. 바이러스로부터 시작하여 유사하게 생산되었다 (도 6). 또한 원하는 M-60 돌연변이를 위해, 뉴클레오티드 3616에서 잠재성 뉴클레오티드 변화만을 포함하였다 (표 7). 추가적으로, 조사-등급 (research-grade) 클론 I 및 클론 E 바이러스 역시 클로닝 되지 않은 P5 백신 벌크 바이러스로부터 단일 플라크 정제 (큰 플라크 선별하는 것) 및 베로세포에서 1번의 증폭 계대접종에 의해 나중에 분리되었다. 클론 I는 E-107 잔기에서 단일 아미노산 변화를 포함하였기 때문에, 아미노산 F에서 아미노산 L로 야생형으로 복귀 (reversion)하였다. 이와 같이, 클론 I는 E-107 복귀변이체 (revertant)의 순수 개체군을 나타낸다. 클론 E는 M 단백질의 N-말단에서 단일 아미노산 돌연변이, 즉 M-5 잔기에서 Q에서 P로 아미노산 변화를 포함하였다.

클로닝된 PMS 변이체의 유전적 안정성을 규명하기 위하여, 제조 공정 (manufacturing events)을 모방한 상대적으로 대규모의 g.s. 계대접종을 SF 배지에서 수행하였다 (도 6)(S로 명시된 순차적 계대접종을 T-225 플라스크에서 수행하였고, F라고 명시된 계대접종을 베로세포가 사이토덱스 I 미립담체 비드 (Cytodex I microcarrier beads)에 성장되어 있는 5 또는 15 L 생물반응장치에서 수행하였다). 두 후보 SSS와 SSF 샘플 (3번의 고정 계대접종 (Static passages), 또는 2번의 고정 계대접종에 더한 1번의 발효조 계대접종 (Fermenter passages)에 의해 각각 얻어진), 및 M-60 변이체인 FFF 샘플들의 prM-E 영역만 (cDNA 단편 I)의 시퀀싱을 수행하였다. 이러한 g.s. 샘플들은 클론 C에서 M-60 돌연변이 이외에는 바이러스의 prM 또는 E 단백질에서 다른 어떠한 검출 가능한 돌연변이도 없었다. E-107 돌연변 이의 흔적은 없었다 (표 7). 이는 플라크-정제로 인하여 유전적 안정성의 수용 가능한 수준을 획득하였음을 나타내었다. 이어서, 세포공장 (cell factories)에서 생산된 새로운 마스터 (P11) 및 생산 바이러스 (P12) 시드, 그리고 50 L 생물반응장치에서 생산된 최종 백신 벌크 (P13)의 제조 시 M-60 변이체의 높은 유전적 안정성을 확인하였고, 이들 모두는 M-60 돌연변이를 보유하고 있었지만, 공통서열 시퀀싱 (consensus sequencing)에 의하여 그들의 전체 게놈에서 어떠한 검출 가능한 변화도 가지지 않았다.

SF 베로세포에서 바이러스 성장에 대한 M-60 및 E-107 돌연변이의 효과

SF-배양에서 비-돌연변이체, M-60 돌연변이, 및 E-107 돌연변이체 바이러스의 성장 동역학 (growth kinetics)을 비교하기 위하여, E-107 돌연변이의 일정 비율 역시 포함하는 클로닝 되지 않은 P3 마스터 시드와 P4 생산 시드 바이러스 뿐만 아니라, 클로닝 되지 않은 P2 PMS, 클로닝 되지 않은 P5 g.s. 샘플 (M-60 돌연변이체), 또는 클로닝 되지 않은 P5 백신 벌크 변이체 (E-107 돌연변이를 포함하는)로 0.001 pfu/ml MOI (역-적정에 의해 확인된)에서 세포를 감염시켰다. 매일 바이러스-포함하는 배지의 부분 표본 (aliquots)을 채취하고 플라크 분석에 의해 적정하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, M-60 바이러스는 비-돌연변이체 P2 바이러스보다 빠르게 자랐으며, 감염-후 3일째와 4일째에 현저히 (10회 이상) 더 높은 역가 로 생산하였다. 또한 E-107 돌연변이는 M-60 돌연변이와 유사하게 바이러스 증식을 증가시켰다. 따라서 M-60과 E-107 돌연변이 둘 다 SF 배양에서 성장 이점 (growth advantage)을 명백하게 제공하였다. 이러한 결론을 뒷받침하여, M-60 돌연변이체가 더 높은 피크 역가 (8 log₁₀ pfu/ml 가까이)로 10회까지 변함없이 생산하였다는 결과로 성장 동력학을 분석하기 위하여 매일 비-돌연변이체 클론 A와 M-60 돌연변이체 클론 C 바이러스 둘 다의 S, SSS, 및 SSF g.s. 계대접종으로부터 얻은 샘플들을 수집하고 적정하였다. 추가적으로, 클론 C (M-60)와 I (E-107)가 클론 A (비-돌연변이체) 보다 더 높은 역가로 변함없이 성장하였기 때문에, 이러한 결론을 소규모 SF 배양에서 클론 A, C 및 I 바이러스들의 성장곡선 (growth curves)과 비교함으로써 확인하였다.

젖먹이 마우스에서 ChimiriVax™-JE의 신경발병력에 대한 M-60과 E-107 돌연변이의 효과

마우스 신경발병력 시험은 ChimeriVax™ 백신 후보가 YF 17D 벡터의 신경발병력을 초과하지 않는다는 것을 보증하기 사용되어 왔다. YF 17D 백신은 IC 접종 후 모든 연령의 마우스에 대해서 치명적이다. 반면, ChimeriVax™ 백신들은 현저하게 더욱 약독화 되어있다. 일반적으로 성체 마우스 (adult mice)는 신경발병력, 예컨대 단일 아미노산 변화에 기인한 것에서 미묘한 차이를 검출하는 데에 민감하지 않기 때문에, 생존분석 (survival analysis)에 사용되는 더 민감성의 젖먹이 마우스 모델이 본 발명의 목적에 사용될 수 있다 (Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; Guirakhoo et al., Virology 298:146-159, 2002; Monath et al., J. Virol. 76:1932-1943, 2002).

클론 A P7 바이러스, 클론 C P10 바이러스 (M-60 돌연변이), 클로닝 되지 않은 P5 백신 벌크 (E-107 돌연변이), 뿐만 아니라 이전에 생산된 FBS-포함하는 대조군 ChimeriVax™-JE 바이러스 (P5 품질관리 참조 표준 바이러스; 돌연변이 없음), YF 17D 양성대조군 (YF-VAX®), 또는 희석액으로 접종된 모의군 (mock)의 일련의 희석 (serial dilutions)으로 생후 8일된 젖먹이 마우스를 IC 접종하였다. 21일 경과 후 사망률 (mortalities), IC 50% 반수(半數) 치사량 (median IC 50% lethal dose, LD₅₀) 값, 및 죽은 마우스들의 평균 생존 시간 (average survival times, AST)을 표 8에 나타내었다. 예상대로, YF-VAX®은 신경발병력이 높게 나타났다. 이 바이러스 2.4 log₁₀ PFU의 접종은 8.8일의 짧은 AST로 100% 사망률을 가져왔다. P7 비-돌연변이체와 P10 M-60 돌연변이체 클론 둘 다는 LD₅₀ 값 > 5 log₁₀ PFU와 더 긴 AST를 가지는 본래의 FBS-포함하는 키메라의 버전 (version) 만큼 고도로 약독화되었다. 따라서 M-60 돌연변이는 이러한 동물 모델에서 백신의 고도로 약독화된 표현형을 변화하지는 않았다. 클로닝 되지 않은 P5 백신 벌크 바이러스는 3.1 log₁₀ PFU의 IC LD₅₀을 가지는 상기 클론들과 비교하여 현저하게 더 높은 발병력을 가졌으나, YF-VAX® 와 비교하면 낮은 발병력을 가졌다. 이어서, 클로닝된 M-60 백신의 제조 계대접종 (마스터 시드, 생산 시드, 및 백신 벌크)은 이러한 시험에서 GLP 조건하에서 유사한 결과로 조사되었다. 이는 플라크 정제와 M-60 돌연변이의 사용에 의해 얻어진 높은 유전적/표현형 안정성을 확인하였다.

실험용 영장류에서의 안전성과 효능의 분석

실험 1

이 실험에서는, 대조군으로써 YF-VAX® 바이러스를 사용하여 시노몰거스 원숭이에 IC 투여 후, 클론 C (M-60 돌연변이체), ChimeriVax™-JE 백신 마스터 시드 바이알 뱅크 (MVB)와 생산 바이알 뱅크 (PVB)를 비교하였다 (표 9).

음식물 섭취, 체중 또는 혈청 화학, 및 혈액학 파라미터들에서 어떠한 백신-관련 임상 징후 또는 변화도 관찰되지 않았다. 그룹 1-3으로부터 각각 11마리 중 9마리, 11마리 중 4마리, 및 11마리 중 8마리 원숭이에 대하여 비장에서 림프소절 (lymphoid nodules)의 증가된 크기 및 수로 이루어지는 림프양 증식증 (Lymphoid hyperplasia)이 기록되었다. 비록 이러한 결과는 시노몰거스 원숭이에서 보통의 백그라운드 결과이지만, 그룹 빈도 (incidences)는 이러한 원숭이들에서 정상 (normal)보다 더 높았으며, 백신에 의해 유도되는 예상된 면역반응에 비하면 2차적인 것으로 판단되었다. ChimeriVax™-JE 처치군과 YF-VAX® 비교대조군 둘 다에서 유사한 변화가 일어났다는 것은 주목할 만한 것이다. [모든 세 그룹에서 원숭이들의 일부는 짧은 시간에 낮은 수준의 접종 후 바이러스혈증을 나타내었으나, 이는 수용 가능한 한계 내에 있고, 모든 동물이 접종에 사용된 바이러스로 혈청변환 (seroconvert)되었다. 31일째에, YF-VAX® -처치된 원숭이에 대한 황열병 바이러스-특이적 중화 항체 역가 (neutralizing antibody titers)는 LNI 분석에서 2.07에서 >6.13까지의 범위에 있었으며, 어떠한 YF-VAX® -처치된 원숭이도 PRNT50 분석에서 JE 바이러스에 대한 교차-반응성 항체 (cross-reactive antibodies)를 가지지 않았다. 모든 ChimiriVax™-JE MVB 백신-처치된 원숭이들은 >320 (320에서 >20480 범위)의 JE 중화 항체 역가를 가졌으며, LNI 분석에서 YF 바이러스에 대한 교차-반응하는 항체를 가지지 않았다. 모든 ChimeriVax™-JE PVB 백신-처치된 원숭이들은 >160 (160에서 20480 범위)의 JE 중화 항체 역가를 가졌으며, YF 바이러스에 대한 교차-반응하는 항체를 가지지 않았다. 검출 가능한 바이러스혈증의 심한 정도 (magnitude) 또는 기간과 JE-중화 항체 역가 유도의 정도 (magnitude) 사이에 어떠한 인식할 수 있는 관련성도 없었다.

이 실험에서 ChimeriVax™-JE MVB와 PVB 조제물은 최소한의 신경발병력 (minimal neurovirulence)을 나타내었다. 플라비바이러스 백신에 대한 원숭이 신경발병력에서 신경발병력의 가장 포괄적인 측정 (comprehensive measure)은 결합된 그룹 평균 장애 점수 (mean lesion score)이며, 이는 평균 표적 범위 (mean target area)와 평균 식별자 범위 (mean discriminator area) 점수들의 평균 (average)을 나타낸다. 시노몰거스 원숭이에서 표적 범위는 모든 플라비바이러스에 의해 손상된 흑색질 (substantia nigra)과 척수 (spinal cord)의 경수 및 요수팽대 (cervical and lumbar enlargements) 그리고 중추신경계 (central nervous system, CNS)의 표시한 영역이다. 표시자 범위는 서로 다른 발병력 특성을 가지는 YF 17D (그리고 아마 또 다른 플라비바이러스)의 균주에 의해 선택적으로 손상된 담창구 (globus pallidus), 피각 (putamen), 전방 및 내측 시상 핵 (anterior/medial thalamic nucleus), 측면 시상 핵 (lateral thalamic nucleus), 및 CNS의 표시한 영역이며, 이는 비교 균주 (reference strain)와 증가된 신경발병력을 가지는 균주 사이를 식별한다. ChimeriVax™-JE MVB와 PVB 조제물로 처치된 원숭이들에 대한 결합된 평균 장애 점수는 YF-VAX® 비교대조군 그룹 (p<0.05)에 대한 것보다 현저하게 더 낮았다. ChimeriVax™-JE MVB와 PVB로 처치된 원숭이들의 두 그룹에 대한 평균 식별자 중앙 점수 (center scores)는 YF-VAX® 비교대조군 그룹 (p<0.05)에 대한 것보다 역시 현저하게 더 낮았다 (표 9). ChimeriVax™-JE 백신 조제물이 투여된 원숭이들의 2 그룹에 대한 평균 점수 사이에 통계적으로 현저한 차이는 없었으며, 두 조제물 모두는 원숭이 신경발병력 시험에서 유사하게 낮은 신경발병력의 증거가 되었다.

따라서, 상기 원숭이 신경발병력 시험의 결과는 새로운 (M60, 클론 C) 플라크-정제된 MVB와 PVB가 만족스러운 안전성 분석표 (safety profile)를 가진다는 것을 보여준다. 시험서 (test articles)는 어떠한 임상 독성 (clinical toxicity)도 나타내지 않았으며, 비교대조군 (YF-VAX®) 보다 신경병리학적인 검사에서 현저하게 낮은 표시자 및 결합된 장애 점수를 가졌다. 시험서는 양적으로 바이러스혈증에 의해 측정된 것과 같이 비교대조군 (YF-VAX®)과 내장기관친화성에서 다르지 않았다.

실험 2

이 실험은 본래의 클로닝 되지 않은 P5 ChimeriVax™-JE 백신 [FBS 존재하의 베로세로에서 이전에 생산되었으며, E 단백질의 소수성 말단에 위치한 E491 L에서 F로 변화를 제외하고 어떠한 돌연변이도 가지지 않았고, 즉 생물학적 표현형의 기간 (terms)에서 양성의 돌연변이 (benign mutation)인 것으로 여겨지며, 또한 이미 임상시험에서 시험되었던 (Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003; Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002)]과 새로운 클론 C (M-60 돌연변이체)인 ChimeriVax™-JE가 정제된 백신 벌크 (P13)의 바이러스혈증, 면역반응, 및 안전성을 비교하기 위하여, 시노몰거스 원숭이에 단일 피하 (SC) 투여 후 수행하였다. ChimeriVax™-JE 바이러스는 본래의 클로닝 되지 않은 P5 ChimeriVax™-JE 백신으로 접종된 5마리 혈청음성 (seronegative) 원숭이 중 5마리 (100%)의 혈청에서 검출되었다. 바이러스혈증의 지속기간은 20 ~ 790 PFU/ml 범위에 있는 역가로 2-5일이었다. 평균 피크 바이러스혈증 (± SD)는 244 (± 310) PFU/ml이며, 바이러스혈증의 평균 일수는 3.4 (± 1.34)였다 (표 10).

ChimeriVax™-JE 바이러스는 새로운 P13 JE 백신이 정제된 벌크로 접종된 4마리의 혈청음성 원숭이 중 4마리 (100%)의 혈청에서 검출되었다. 바이러스혈증 지속기간은 50 ~ 290 PFU/ml 범위에 있는 역가로 2-5일이었다. 평균 피크 바이러스혈증 (± SD)은 160 (± 123) PFU/ml이며, 바이러스혈증의 평균 일수는 3.75 (± 1.26)이었다 (표 10). 두 처치군 사이에서 평균 바이러스 혈증도 바이러스혈증의 평균 일수도 크게 다르지 않았다 (각각 p-values는 0.6290과 0.7016; ANOVA).

모든 혈청음성의 원숭이들은 본래의 클로닝 되지 않은 P5 ChimiriVax™-JE 백신 또는 P13 JE 백신 정제된 벌크를 가지고 하기의 처리로 혈청변환 (seroconvert) 되었다. 31일째에, 클로닝 되지 않은 P5 백신으로 접종된 5마리 원숭이 중 5마리 (100%)로부터 얻은 혈청은 640 ~ 5120 범위에 있는 JE 바이러스 중화 항체 역가를 가졌다 (기하학적 평균 역가 = 1689). P13 ChimeriVax™-JE 백신 정제된 벌크로 접종된 4마리 원숭이 중 4마리 (100%)로부터 얻은 혈청은 320 ~ 2560 범위에 있는 JE 바이러스 중화 항체 역가를 가졌다 (기하학적 평균 역가 = 761). 항체 역가는 처치군들 사이에서 크게 다르지 않았다 (p = 0.2986, ANOVA).

요컨대, 새로운 M-60 백신은 본래의 클로닝 되지 않은 ChimeriVax™-JE 백신 (E491을 제외하고 돌연변이 아님)과 안전성 (바이러스혈증) 및 면역원성 (immunogenicity)의 관계에 대하여 비교하였다. 새로운 백신은 약간 더 적은 내장기관친화성 (바람직한 특징)이었으나 여전히 높은 면역원성이었다. 바이러스혈증과 면역원성의 정도 (magnitude)에서 차이점은 통계학적으로 크지 않았다.

바이러스 감염성 (infectivity)의 pH 역치 (threshold)에 대한 M-5, M-60, 및 E-107의 효과

ChimeriVax™-JE 백신은 JE 바이러스의 SA14-14-2 유래 prM과 E 유전자를 YF 17D 바이러스의 백본 (backbone)에 삽입하여 생산하였다. SA14-14-2 바이러스의 엔벨로프 (ChimeriVax™-JE에 존재하는)는 그 모(母) SA14 바이러스와 10개의 아미노산이 달랐다: E107 L이 F로, E138 E가 K로, E176 I가 V로, E177 T가 A로, E227 P가 S로, E244 E가 G로, E264 Q가 H로, E279 K가 M로, E315 A가 V로, 및 E439 K가 R로 (Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999). 부위-지정 돌연변이유발 (site-directed mutagenesis)에 의하면, 이러한 잔기들의 일부는 ChimeriVax™-JE 바이러스의 약독화와 관련이 있음을 보여준다. 돌연변이가 이 바이러스들의 pH 역치를 변경하였는지를 확인하기 위하여 ChimeriVax™-JE의 돌연변이체 (mutants) 또는 복귀변이체 (revertants)를 선택하였다. M-60, E-107, 또는 M-5 돌연변이가 pH-의존적 방식에서 바이러스 감염성에 영향을 미치는 지를 결정하기 위하여, 감염성의 pH 역치에 대한 표준분석을 실험방법 및 재료 (Materials and Methods)에 기술된 것처럼 수행하였다. 다음의 바이러스들을 시험하였다: (1) ChimeriVax™-JE 비-돌연변이체 (클론 A, E 단백질에서 모든 10개의 SA14-14-2 돌연변이를 포함하는 P7); (2) ChimeriVax™-JE E 107 F에서 L로 복귀변이체 (클론 I, 9개 E 단백질 돌연변이를 포함하는 P6); (3) ChimeriVax™-JE M60 R에서 C로 돌연변이 (클론 C, 모든 10개의 E 단백질 돌연변이를 포함하는 P10), 및 (4) M-5 Q에서 P로 돌연변이체 (클론 E, 모든 E 단백질 돌연변이를 포함하는 P6) (표 12).

비-돌연변이체 클론 A P7 바이러스, M-60 돌연변이체 클론 C P10 바이러스, M-5 돌연변이체 클론 E, 및 E-107 돌연변이를 포함하는 클로닝 되지 않은 P5 바이러스는 점감적인 pH 범위 (range of decreasing pHs)로 처리하고 이어 잔여 바이러스 감염성의 적정 (titration)을 수행하였다. 3가지 바이러스들 (클론 A 대조군 바이러스, 클론 C M60 돌연변이체, 및 클론 I E-107 돌연변이체)의 감염성은 M5 돌연변이체 클론 E 바이러스를 제외하고 pH 6.0 이후 균일하게 떨어지기 시작하여 pH 5.8 (pH 역치 5.9)에서 소실되었다. M-5 돌연변이체는 다른 모든 바이러스들 (pH 5.9)와 비교하여 현저히 더 높은 pH 역치 (pH 6.3)을 가졌다 (도 8a). 이는 M 단백질의 엑토도메인 (ectodomain)이 플라비바이러스에 의한 세포 감염의 과정에서 가장 중요한 역할을 한다는 첫 번째의 직접적인 증거이다. 따라서, M 단백질의 N-말단은 아마도 엔도좀에서 낮은 pH에 의해 유발되는 융합 과정에 작용할 것이며, 이는 이전에 단독으로 엔벨로프 E 단백질에 기인한 기능이다.

ChimeriVax™-JE 바이러스의 융합에 대한 pH 역치 5.9는 다른 야생형 (wt) 플라비바이러스에 대하여 기술된 것보다 더 낮고 (Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991) 아마도 바이러스의 약독화에 관련되어 있을 것이다.

이러한 데이터는 ChimeriVax™-JE의 E 영역에서 E-107 돌연변이가 융합에 대한 pH 역치를 변화시키지 않았다는 것을 설명한다. 일반적으로, 낮은 pH 역치는 다이머 (dimer)에서 트리머 (trimer)로의 변환 (transition)에 필요한 것이 일어나도록 E-단백질에서 형태적 변형을 위해 특이 아미노산의 더 큰 양성자화(protonization)가 필요하다는 것을 의미한다. 하나 이상의 SA14-14-2 특이 돌연변이 (E 107 돌연변이가 아닌 것, 이는 보존된 융합 펩타이드내에 존재한다)는 융합에 대한 낮은 pH 역치 (pH 5.9)를 유지하는 원인이 되고, 그 결과 숙주에 대한 바이러스의 표현형을 약독화한 것 같다. 보기에는, 상기 M-5 돌연변이는 이러한 역가를 5.9에서 6.3까지 증가시키는 것이 가능한데, 이는 야생형 (wt)에 가깝다 (Guirakhoo et al., Virology: 169(l):90-99, 1989; Guirakhoo et al, J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991). 바이러스들은 융합 활성 상태로 변환하는 데 필요한 더 작은 양성자화를 갖는 높은 pHs에서 융합할 수 있기 때문에, 융합에 대한 pH 역 치를 증가시키는 것은 이론상으로 바이러스의 약독화된 표현형을 감소시킬 것이다. 뇌내 경로 (intracerebral route)를 통해 생후 3-4일된 젖먹이 마우스에 1.4 log₁₀ PFU에서 접종된 M5 바이러스는 1.7 log₁₀ PFU에서 접종된 대조군 바이러스 (M5 돌연변이 없는 ChimeriVax™-JE 백신 바이러스) 보다 발병력이 현저하였기 때문에 (p=0.056)(도 8b), 이는 사실인 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, M5 돌연변이체 바이러스 (1.4 log₁₀ PFU의 도스양에서)는 생후 3-4일된 젖먹이 마우스에서 YF-VAX® (0.9 log₁₀ PFU의 도스양에서) 보다 현저히 적은 신경발병력이 남아 있었으며, 백신 바이러스의 엔벨로프 단백질 내 SA14-14-2 돌연변이가 여전히 이 바이러스에 대한 충분한 수준의 약독화를 제공하고 있음을 나타낸다.

융합에 대한 pH 역치에 영향을 미치는 다른 키메라에서의 돌연변이

간접 융합 분석 (Indirect Fusion Assay)은 ChimeriVax™-DEN 백신 바이러스들 각각의 2 그룹을 이용하여 수행하였다: ChimeriVax™-DEN4 P10을 제외하고, E 단백질 돌연변이를 포함하지 않는 ChimeriVax™-DEN1-4 P7 및 E 단백질에서 단일 돌연변이가 포함된 ChimeriVax™-DEN1 P10. 바이러스들을 실온에서 10분간 서로 다른 pH의 배지에서 배양하였다. pH를 중성 pH로 되돌린 후 표준 플라크 분석을 사용하여 역가 (titer)를 측정하였다. 표 13에서 나타나듯이, 바이러스 불활성화 (융합)에 대한 역치 (threshold)는 ChimeriVax™-DEN2와 DEN4 바이러스의 P7과 P10 사이에서 유사하였다 (pH 6.4). 대조적으로, ChimeriVax™-DEN1 P10에 대한 pH 역치 는 ChimeriVax™-DEN1 P7 바이러스의 역치보다 0.4 units 더 낮았다 (pH 6.0 vs pH 6.4). ChimeriVax™-DEN3 P10 바이러스에 대한 pH 역치에서 차이는 유의성이 적었다 (pH 6.4 vs pH 6.2).

최대 바이러스 불활성화 (inactivation)는 ChimeriVax™-DEN4를 제외하고 ChimeriVax™-DEN 바이러스들의 모든 P7에 대하여 pH 6.2에서 일어났으며, ChimeriVax™-DEN4는 조금 더 낮았다 (pH 6.0). ChimeriVax™-DEN1 P10은 완전한 불활성화에 대하여 현저히 더 낮은 pH를 필요로 하는 것으로 보였다. ChimeriVax™-DEN1 및 -DEN3 바이러스 모두는 E-204에서 K에서 R로 (DEN3의 E-단백질은 다른 3가지 혈청형보다 2개 아미노산 더 짧으며, 따라서 이 바이러스에서 E-202 잔기는 DEN1에서 E-204에 상동성이다 (homologous))의 아미노산 치환을 포함한다. DEN3 키메라에 대한 융합 역치에서 유의성이 적은 차이는 WT (K)와 공통서열 시퀀싱에 의해 밝혀진 것 (K:R=50:50) (Pugachev et al., J. Virol. 78:1032-1038, 2004)처럼 P10 바이러스 균주 (stock)에서 돌연변이체 R 아미노산 (E204K/R)의 존재 때문일 것이다. E251 돌연변이에도 불구하고, DEN2 P10 키메라로 바이러스 불활성화에 대한 역치에서 변화가 없는 것이 관찰되었으므로 이 잔기에서 돌연변이는 바이러스 융합 과정에 관련이 없다고 결론내릴 수 있다 (도 8d).

ChimeriVax™-DEN3의 P10에서 K/R 이질성 (heterogeneity)이 융합에 대한 pH 역치에서 그것의 유의하지 않은 변화 (non-dramatic change)에 기인한 것인지를 확인하기 위하여, 간접 융합 분석을 P7 (돌연변이 없음, E202K), P10 (50% 돌연변이, E202K/R), 및 P15 (완전한 돌연변이, E202R) 바이러스를 사용하여 수행하였다. 도 8e에 나타나 바와 같이, ChimeriVax™-DEN3의 불활성화 (융합)에 대한 pH 역치는 pH 6.2였으며, 이는 ChimeriVax™-DEN3 P7 (pH 6.4)와 ChimeriVax™-DEN3 Pl5 (pH 6.0)에 대한 pH 역치 사이에 있었다. E202 K에서 R로 돌연변이는 단지 이 키메라들의 E-단백질에서 검출된 아미노산 치환이었으므로, 이 돌연변이는 아마도 P15 바이러스의 융합에 대한 pH 역치에서 0.4 pH 이동 (shift)에 원인이 있는 것 같다.

상기에 언급된 것처럼, 백신의 세포 배양 제조 시 E204 K에서 R로 돌연변이는 pH의 0.4 units 만큼 융합에 대한 pH 역치를 낮추었다. E204 K에서 R로 돌연변이는 새로운 분자간 H 결합 (intramolecular H bonds)과 새로운 염다리 (salt bridge)를 생성하는 것으로 보이며, 이는 E 다이머의 분리에 현저히 강한 영향을 주었을지 모른다. ChimeriVax™-DEN1 (PMS, P7) E 단백질의 구조는 세정제 n-octyl-β-D-glucoside의 존재 하에 결정된 DEN2 E-단백질 엑토도메인 (S1 균주)의 394 잔기의 원자 자리 (atomic coordinates)에 기초하여 설계 (model)되었다 (Modis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:6986-6991, 2003). 204 위치에서 K 잔기는 돌연변이체 바이러스를 모방 (mimic)하기 위하여 R로 변화시켰고, ChimeriVax™-DEN1 (VL, P10) 바이러스의 E-단백질 구조를 묘사하기 위하여 설계 (modeling)를 반복하였다 (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004). 204 위치에서의 K 잔기 (204K)는 잔기들에 의해 소수성 포켓에서 줄지어진 (lined) 짧은 루프 내에 위치하고 있고, 이는 신경발병력 또는 융합에 대한 pH 역치에 영향을 끼치는 것을 보여주고 있다 (Lee et al., Virology 232:281-290, 1997; Lindenbach et al., 2001 Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields Virology, eds. Knipe D.M., and Howley P.M. [Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia], 1, 991-1004; Monath et al., J. Virol. 76:1932-1943, 2002). 도 8f에서, 백신바이러스 (204R)의 E-동형 다이머 구조의 상동 모델 (homology model)은 PMS (204K) 바이러스의 그것과 비교된다. E 모노머 중 하나의 204K와 261H의 곁사슬 (side chains)은 반대쪽 모노머에서 252V와 253L 잔기의 백본 원자 (backbone atoms)와 각각 H 결합을 만드는 것으로 보인다. 204 위치에서, 백신 바이러스 (VL P10)의 E 단백질에서 R이 그 자신을 새로운 환경에 적응시키기 위한 것으로 예상되고, 그래서 이러한 수소 (H) 결합을 잃어버린다. 그 대신에 돌연변이체 R의 곁사슬은 261H와 257E와 아주 근접해 있어서, 204R과 261H 사이에 새로운 분자간 H 결합과 204R과 257E 사이에 아마도 새로운 염다리의 생성을 초래한다. 히스티딘 (Histidine)의 pk는 약간 더 낮은 융합 역치 (pH ~6.4)인 대략 6.0이었으므로, Guirakhoo 등 (J. Virol. 78:9998-10008, 2004)에 의한 초기 가설 (initial hypothesis)은 204R과 261H 사이에서 예상된 새로운 H 결합과 204R과 257E 사이에서 염다리가 아마도 융합의 pH 역치에 영향을 미친다는 것이다. 이러한 가설이 사실로 판명났고, 따라서 여기 묘사된 실험은 ChimeriVax™-DEN1의 융합에 대한 역치가 약 6.0이라는 것을 나타냈으며, 이는 ChimeriVax™-DEN1의 P7 바이러스 (pH 6.4)보다 0.4 pH units 더 낮은 것이다. 보기에는, 204 잔기에서 R에 의해 도입된 새로운 분자간 결합 (bonds)은 E-다이머의 결합 (association)을 강하게 하므로 낮은 pH로 전환은 적절한 잔기들 (예컨대, H261)의 더 큰 양성자화를 필요로 한다. 융합에 대한 더 낮은 역치는 원숭이에서 바이러스의 내장기관친화성에 영향 을 미치며 뇌내 경로로 접종된 젖먹이 마우스에 대한 신경발병력을 감소시킨다 (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004).

ChimeriVax™-DEN3 P10 백신의 E-단백질에서 E202 K에서 R로 치환은 ChimeriVax™-DEN1 P10 백신에서 E204 돌연변이와 상동 (homologous)이다. ChimeriVax™-DENl PlO에서와 같이, ChimeriVax™-DEN3 PlO (K와 R 잔기 둘 다를 포함하는 202 잔기에서 이질적인)은 P7과 비교할 때 융합에 대한 더 낮은 pH 역치 (-0.2 pH unit)를 나타냈다. 융합에 대한 pH 역치는 상기 돌연변이를 ChimeriVax™-DEN3의 P15에 고정시켰을 때 더욱 낮았다 (0.4 ph unit, ChimeriVax™-DEN1 P10과 유사한). 이러한 데이터는 202/204 잔기가 모든 뎅기 바이러스에서 약독화의 보편적인 결정기 (universal determinant)임을 나타낸다. 일반적으로, ChimeriVax™-DEN3와 -DEN4 PlO 백신 바이러스는 이 돌연변이를 포함하지 않으며 두 바이러스 모두 4가 백신 제형 (vaccine formulation)으로 접종된 원숭이에서 더 높은 바이러스혈증 수준을 유도한다 (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004). ChimeriVax™-DEN3 또는 ChimeriVax™-DEN4에서 K에서 R로의 돌연변이가 숙주에서 내장기관친화성을 더 낮추는지 지켜보는 것만 남았다. WT-JE가 6.4의 융합에 대한 pH 역치를 가진다고 이전에 보고되었다 (Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991). 본 발명에서는, ChimeriVax™-JE의 모든 변이체들은 5.9의 pH 역치를 가졌다. 본 실험에서 관찰된 낮은 pH 역치는 ChimeriVax™-JE의 엔벨로프 단백질에서 10개의 약독화하는 돌연변이 중 하나이상이 존재하기 때문인 것 같다. 이 돌연변이는 E-단백질 다이머의 결합을 강하게 하므로 더 낮은 pH가 트리머 구조로의 결합과 전환 및 이어 일어나는 융합에 필요할지 모른다. 데이터는 여기서 E107 F에서 L로 돌연변이 (E-단백질의 도메인 II의 cd-루프에 위치된)와 E279 M에서 K로 돌연변이 (도메인 II의 소수성 포켓내 위치된)가 둘 다 pH 역치를 낮추는 데 그 원인이 아님을 나타냈다. JE E 단백질에서 또 다른 돌연변이는 융합에 대한 pH 역치에 영향을 미치는 것이 가능하다. JE E 단백질을 꼭 닮은 TBE 바이러스 E 단백질의 크리스탈 구조의 분석은, 만약 변경되지 않는다면, 융합에 대한 pH 역치를 변경할 수 있는 잔기를 예상하는 것을 도울 수 있다. 이 모델에 기초하여, E244 G 및/또는 E264 H 잔기에서 돌연변이는 WT JE보다 ChimeriVax™-JE 바이러스의 융합에 대한 더 낮은 pH 역치의 원인이 될 것이다.

바이러스 침투의 능력에 대한 M-60과 E-107 돌연변이의 효과

Chambers (Vlaycheva et al., J. Virol. 76:6172-6184, 2002)의 방법을 이용하여 SF 베로세포에서 바이러스 침투에 대한 M-60 (클론 C 바이러스)과 E-107 (클론 I 바이러스) 돌연변이의 효과를 시험하였다. 이 실험에서, SF 베로세포는 5, 10, 20, 또는 60분간 적절히 희석된 바이러스 (각 시점에서 수율 ~50 플라크/웰로)로 접종하였다. 내재화 되지 않은 바이러스 (un-internalized virus)는 산성 글리신 용액 (acidic glycine solution)을 추가함으로써 불활성화시켰으며, 반면 같은 종류의 대조군 웰 (control parallel wells)은 PBS (중성 pH)로 처리하였다. 세포를 PBS로 세척하고 메틸-셀룰로오스 중첩 (methyl-cellulose overlay)으로 중층한 뒤, 5일째에 시각화하여 플라크들의 수를 세었다. 침투 능력은 PBS 처리된 웰, 즉 대조군에서 플라크 수에 대한 글리신-처리된 웰에서 평균 플라크 수의 비율을 퍼센트로 (percentages)써 나타낸다. 침투 예비시험 (preliminary penetration test) 결과는 도 9a에 나타난다. 침투된 클론 C와 클론 I 바이러스의 퍼센트는 비-돌연변이체 클론 A 바이러스보다 5분과 10분 시점에서 더 높았다는 것이 중요하며, 이 시점에서의 퍼센트에 대한 돌연변이의 효과는 검출될 가능성이 높다. 상기 결과는 표준 편차 막대 (standard deviation bars)에 의한 증거로서 통계학적으로는 현저하지 않으며, 추가적인 반복 실험에서 확증되는 것이 필요하다. 그럼에도 불구하고, 이 실험에 따르면 M-60과 E-107 돌연변이 둘 다는 SF 조건에서 성장된 세포에 대한 ChimeriVax™-JE 바이러스의 막 융합 능력을 증명할 수 있었다. 막 융합의 과정에 있어 M-60과 E-107 잔기의 효과에 대한 가능한 메커니즘은 도 9b에서 설명된다. M-60 잔기는 바이러스 막에 위치하고 있는 반면, E-107 잔기는 세포막에 삽입되어 있고, 2가지 막은 E 단백질의 낮은 pH-의존적 재배열을 따라 융합하게 된다 (이는 본 발명의 데이터가 M 단백질 엑토도메인에 의해 용이하게 될 수 있다는 것에 기초한다). 이러한 두 잔기 중 어느 하나에서 더욱 적절한 아미노산은 아마 막들의 융합을 용이하게 할 것이다. 본 발명의 데이터는 M 단백질의 엑토도메인과 그것의 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane domain) 모두가 기능적인 중요성이 있다는 것을 처음으로 확립하였으므로, 현재 전체 M 단백질은 새로운 생(生) 약독화된 백신을 개발하기 위하여 플라비바이러스를 약독화하기 위한 돌연변이유발 (mutagenesis)에 대한 매력적인 타겟으로 고려될 수 있다. 예를 들어, 랜덤 또는 특이적 (단백질 구조의 추가 분석에 따른) 아미노산 변화, 또는 증가하는 길이의 삭제들 (deletions), 예컨대 1, 2, 3, 4, 5.. 아미노산 등은 바이러스의 생물학적 표현형이 변경될 것이라고 예상되는 단백질을 통해 도입될 수 있으므로, 그 결과로 현저한 약독화를 만들 수 있다.

임상시험의 결과

상기에 언급된 임상시험으로 얻은 아르기닌 (arginine)과 시스테인 (cystein) M60 잔기들을 가진 ChimeriVax™-JE의 바이러스혈증 분석표는 표 11A와 11B에서 비교하였다. ChimeriVax™-JE M60 아르기닌을 투여 받은 피실험자에서, ChimeriVax™-JE M60 시스테인을 투여 받은 피실험자에 대한 29-50%와 비교할 때 피실험자의 67-100%는 1일 이상 바이러스혈증을 나타냈다. ChimeriVax™-JE M60 아르기닌을 투여 받은 피실험자에서 평균 최대 바이러스혈증 수준은 ChimeriVax™-JE M60 시스테인의 경우에서 평균 최대 바이러스혈증 수준 3.5 내지 6.3 PFU/ml과 비교할 때, 13 내지 40 PFU/ml 범위였다. 또한 바이러스혈증 지속기간은 ChimeriVax™-JE M60 아르기닌의 경우에서 현저히 더 길었다.

이러한 데이터는 바이러스혈증 수준이 M60 돌연변이를 포함하는 바이러스의 경우에서 현저히 더 낮다는 것을 설명하였다. 바이러스혈증은 백신 바이러스의 내장기관친화성 (발병력)의 척도이다. 바이러스가 혈액 뇌관문 (blood brain barrier)을 지나가서 중추신경계 (central nervous system)를 침입할 가능성이 있지만, 바이러스 증식을 유지하고 바이러스혈증을 일으키는 세포 손상 및 장기기관의 기능장애는 감소되기 때문에, 감소된 바이러스혈증을 가진 백신이 더 안전하다 고 여겨진다. 다른 실험에서는, M60 돌연변이체는 비-돌연변이체 만큼 인간에서 높은 면역원성이 있음을 나타냈다.

[표 1]. 작은 플라크 (P10 PMS)의 공통 서열 (P/N IT-Ol16; L/N I020504A)

(플라크는 p5 Run 1 Vaccine Lot로부터 정제하였다).

[표 2]. 큰 플라크 PMS (P10, PMS)의 공통 서열 (P/N IT-Ol17; L/N I030804A)(p5 Run 1 Vaccine Lot로부터 유래).

[표 3]. 무혈청 조건하 베로세포에서 S 플라크 PMS (p10)의 두 번 추가 계대접종한 후 분리돈 큰 플라크의 서열.

[표 4]. HepG2에 대한 관찰된 CPE.

[표 5]. ChimeriVax™-WN02 백신 또는 YF-VAX® 로 접종된 원숭이에서의 바이러스혈증.

*바이러스혈증은 pfu/ml로 표현하였다.

** Day 1: 연구 1일, 연구 1일째에 접종된 원숭이

Zero PFU/mL은 검출 한계 이하를 의미한다. 이론상 분석 컷오프 = 10 PFU/mL

[표 6]. WN02 백신 바이러스로 접종된 바이러스혈증의 원숭이에서 얻은 플라크 분리주로부터 직접 얻은 YF-WN 키메라의 M 영역의 서열.

[표 7]. 클로닝 되지 않거나 클로닝 된 SF ChimeriVax™-JE 샘플들 (도 6에 도시함)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열.

[표 8]. 생후 8일된 젖먹이 마우스에서 클론 A P7, 클론 C P10, 클로닝 되지 않은 P5, FBS-포함하는 표준, 및 YF-VAX® 바이러스의 신경발병력.

[표 9]. M-60 (클론 C) 마스터 및 생산 시드 vs YF-VAX® 대조군의 시노몰거스 원숭이에 대한 신경발병력

¹PFU = 플라크-형성 단위

²소급하는 PRNT50 테스트에서 1일째 (접종 전)에 JE-혈청양성이 됨을 확인하였기 때문에 각각 1, 2, 및 3 그룹에서 11마리 중 4마리, 11마리 중 2마리, 및 11마리 중 1마리 동물들을 점수 계산으로부터 제외시켰다. PRNT50 테스트는 사전 스크리닝에 사용된 HAI 테스트보다 더 민감하다.

[표 10]. FBS-포함하는 배지 (E491을 제외한 어떠한 돌연변이도 포함하지 않는)에서 생산된 본래의 클로닝 되지 않은 P5 ChimeriVax™-JE 백신과 새로운 클론 C P13 정제된 백신 벌크 (M-60 돌연변이체)로 SC 접종된 시노몰거스 원숭이에서 바이러스혈증과 면역원성의 비교.

¹소급하는 PRNT50 테스트에서 1일째 (접종 전)에 JE-혈청양성이 됨을 확인하였기 때문에 각각 1, 2, 및 3 그룹에서 6마리 중 2마리, 6마리 중 1마리, 및 6마리 중 2마리 동물들을 점수 계산으로부터 제외시켰다. PRNT50 테스트는 사전 스크리닝에 사용된 HAI 테스트보다 더 민감하다.

[표 11a]. M60 아르기닌 아미노산을 가진 ChimeriVax™-JE가 투여되었던 연구 H-040-003에 등록된 피실험자에서 바이러스혈증 분석표. 볼드체로 된 도스 범위는 돌연변이체 M-60 시스테인 백신이 투여되었던 다른 연구 (H-040-007)에서 주어진 것과 유사하다.

[표 11b]. M60 시스테인 아미노산을 가진 ChimeriVax™-JE가 투여되었던 연구 H-040-007에 등록된 피실험자에서 바이러스혈증 분석표.

[표 12]. 각각의 ChimeriVax™-JE 백신에 대한 융합 분석으로 밝혀낸 융합에 대한 pH 역치의 값.

[표 13]. ChimeriVax™-DEN P7과 P10의 각 쌍에 대한 간접 융합 분석으로 밝혀낸 융합에 대한 pH 역치의 값.

[표 14].

1,2: 상기 칼럼 (column)은 C/prM 또는 E/NS1 접합 (junction)에 대응하는 키메라 YF/플라비바이러스 프라이머들을 만드는데 사용된 뉴클레오티드를 설명한다. (텍스트 참조). X = YF 캡시드의 서열을 코딩하는 카르복실 말단 (carboxyl terminal). 밑줄 친 영역은 NarI 부위 (안티센스 - ccgcgg)의 upsteam에 인접하여 표적으로 사용된 이질성 서열 (targeted heterologous sequence)에 대응한다. 이 부위는 전체-길이 cDNA 주형을 만드는 데 필요한 Yfm5.2 (NarI) 플라스미드에 PCR 산물을 삽입할 수 있게 한다. 또 다른 뉴클레오티드는 이질성 바이러스에 특이적이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 5'에서 3'으로 기재되어 있다.

3,4: 전체-길이 키메라 cDNA 주형들을 생산하기 위하여 시험관내에서 분리될 수 있거나 연결될 수 있는 절단 단편을 생성하는데 사용된 유일한 절단 부위 (restriction sites)들이 기재되어 있다. 왜냐하면 일부 서열들은 편리한 부위 (convenient sites)를 포함하지 않기 때문에, 적절한 부위의 가공이 몇몇 경우들에 필요하다 (각주 5).

5: 괄호는 효과적인 시험관내 연결을 위한 YF 백본 (backbone)과 이질성 바이러스 중 하나에서 생성되어야 하는 제한효소 부위이다. 괄호 안에 있지 않은 부위들은 제거되어야 한다. 이러한 모든 변경 (modifications)은 각각의 클론에 대한 cDNA의 잠재성 돌연변이유발 (silent mutagenesis)에 의해 수행된다. 비어있는 공간은 cDNA 클론의 변경이 필요치 않음을 나타낸다.

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### DNA Strider™ 1.317 ###

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### DNA Strider™ 1.317 ### Thursday, October 21, 2004 3:10:16 PM

<110> SANOFI PASTEUR BIOLOGICS, LLC <120> Vaccines Against Japanese Encephalitis Virus and West Nile Virus <130> 06132/099KR3 <140> 10-2007-7011389 <141> 2007-03-30 <150> PCT/US05/37369 <151> 2005-10-19 <150> US 60/718,923 <151> 2005-09-19 <150> US 60/674,546 <151> 2005-04-25 <150> US 60/674,415 <151> 2005-04-24 <150> US 60/620,948 <151> 2004-10-21 <150> US 60/620,466 <151> 2004-10-20 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Yellow Fever virus and West Nile virus <400> 1 cactgggaga gcttgaaggt c 21 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Yellow Fever virus and West Nile virus <400> 2 aaagccagtt gcagccgcgg tttaa 25 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Yellow Fever virus and Dengue-1 virus <400> 3 aaggtagact ggtgggctcc c 21 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Yellow Fever virus and Dengue-1 virus 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Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr 340 345 350 gtc agc gat ctc tcc acc aaa gct gca tgc ccg acc atg gga gaa gct 1222 Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala 355 360 365 cac aat gac aaa cgt gct gac cca gct ttt gtg tgc aga caa gga gtg 1270 His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly Val 370 375 380 gtg gac agg ggc tgg ggc aac ggc tgc gga ttt ttt ggc aaa gga tcc 1318 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Phe Phe Gly Lys Gly Ser 385 390 395 400 att gac aca tgc gcc aaa ttt gcc tgc tct acc aag gca ata gga aga 1366 Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg 405 410 415 acc atc ttg aaa gag aat atc aag tac gaa gtg gcc att ttt gtc cat 1414 Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His 420 425 430 gga cca act act gtg gag tcg cac gga aat tac tcc aca cag gtt gga 1462 Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly 435 440 445 gcc act cag gcc ggc cga ttc agc atc act cct gct gcg 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Gly Thr Trp Met Ile His Thr Leu Glu Ala Leu 995 1000 1005 gat tac aag gag tgt gag tgg cca ctg aca cat acg att gga aca tca 3190 Asp Tyr Lys Glu Cys Glu Trp Pro Leu Thr His Thr Ile Gly Thr Ser 1010 1015 1020 gtt gaa gag agt gaa atg ttc atg ccg aga tca atc gga ggc cca gtt 3238 Val Glu Glu Ser Glu Met Phe Met Pro Arg Ser Ile Gly Gly Pro Val 1025 1030 1035 1040 agc tct cac aat cat atc cct gga tac aag gtt cag acg aac gga cct 3286 Ser Ser His Asn His Ile Pro Gly Tyr Lys Val Gln Thr Asn Gly Pro 1045 1050 1055 tgg atg cag gta cca cta gaa gtg aag aga gaa gct tgc cca ggg act 3334 Trp Met Gln Val Pro Leu Glu Val Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr 1060 1065 1070 agc gtg atc att gat ggc aac tgt gat gga cgg gga aaa tca acc aga 3382 Ser Val Ile Ile Asp Gly Asn Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr Arg 1075 1080 1085 tcc acc acg gat agc ggg aaa gtt att cct gaa tgg tgt tgc cgc tcc 3430 Ser Thr Thr Asp Ser Gly Lys Val Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ser 1090 1095 1100 tgc aca atg ccg cct gtg agc ttc cat ggt agt gat ggg tgt tgg tat 3478 Cys Thr Met Pro Pro Val Ser Phe His Gly Ser Asp Gly Cys Trp Tyr 1105 1110 1115 1120 ccc atg gaa att agg cca agg aaa acg cat gaa agc cat ctg gtg cgc 3526 Pro Met Glu Ile Arg Pro Arg Lys Thr His Glu Ser His Leu Val Arg 1125 1130 1135 tcc tgg gtt aca gct gga gaa ata cat gct gtc cct ttt ggt ttg gtg 3574 Ser Trp Val Thr Ala Gly Glu Ile His Ala Val Pro Phe Gly Leu Val 1140 1145 1150 agc atg atg ata gca atg gaa gtg gtc cta agg aaa aga cag gga cca 3622 Ser Met Met Ile Ala Met Glu Val Val Leu Arg Lys Arg Gln Gly Pro 1155 1160 1165 aag caa atg ttg gtt gga gga gta gtg ctc ttg gga gca atg ctg gtc 3670 Lys Gln Met Leu Val Gly Gly Val Val Leu Leu Gly Ala Met Leu Val 1170 1175 1180 ggg caa gta act ctc ctt gat ttg ctg aaa ctc aca gtg gct gtg gga 3718 Gly Gln Val Thr Leu Leu Asp Leu Leu Lys Leu Thr Val Ala Val Gly 1185 1190 1195 1200 ttg cat ttc cat gag atg aac aat gga gga gac gcc atg tat atg gcg 3766 Leu His Phe His Glu Met Asn Asn Gly Gly Asp Ala Met Tyr Met Ala 1205 1210 1215 ttg att gct gcc ttt tca atc aga cca ggg ctg ctc atc ggc ttt ggg 3814 Leu Ile Ala Ala Phe Ser Ile Arg Pro Gly Leu Leu Ile Gly Phe Gly 1220 1225 1230 ctc agg acc cta tgg agc cct cgg gaa cgc ctt gtg ctg acc cta gga 3862 Leu Arg Thr Leu Trp Ser Pro Arg Glu Arg Leu Val Leu Thr Leu Gly 1235 1240 1245 gca gcc atg gtg gag att gcc ttg ggt ggc gtg atg ggc ggc ctg tgg 3910 Ala Ala Met Val Glu Ile Ala Leu Gly Gly Val Met Gly Gly Leu Trp 1250 1255 1260 aag tat cta aat gca gtt tct ctc tgc atc ctg aca ata aat gct gtt 3958 Lys Tyr Leu Asn Ala Val Ser Leu Cys Ile Leu Thr Ile Asn Ala Val 1265 1270 1275 1280 gct tct agg aaa gca tca aat acc atc ttg ccc ctc atg gct ctg ttg 4006 Ala Ser Arg Lys Ala Ser Asn Thr Ile Leu Pro Leu Met Ala Leu Leu 1285 1290 1295 aca cct gtc act atg gct gag gtg aga ctt gcc gca atg ttc ttt tgt 4054 Thr Pro Val Thr Met Ala Glu Val Arg Leu Ala Ala Met Phe Phe Cys 1300 1305 1310 gcc atg gtt atc ata ggg gtc ctt cac cag aat ttc aag gac acc tcc 4102 Ala Met Val Ile Ile Gly Val Leu His Gln Asn Phe Lys Asp Thr Ser 1315 1320 1325 atg cag aag act ata cct ctg gtg gcc ctc aca ctc aca tct tac ctg 4150 Met Gln Lys Thr Ile Pro Leu Val Ala Leu Thr Leu Thr Ser Tyr Leu 1330 1335 1340 ggc ttg aca caa cct ttt ttg ggc ctg tgt gca ttt ctg gca acc cgc 4198 Gly Leu Thr Gln Pro Phe Leu Gly Leu Cys Ala Phe Leu Ala Thr Arg 1345 1350 1355 1360 ata ttt ggg cga agg agt atc cca gtg aat gag gca ctc gca gca gct 4246 Ile Phe Gly Arg Arg Ser Ile Pro Val Asn Glu Ala Leu Ala Ala Ala 1365 1370 1375 ggt cta gtg gga gtg ctg gca gga ctg gct ttt cag gag atg gag aac 4294 Gly Leu Val Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Phe Gln Glu Met Glu Asn 1380 1385 1390 ttc ctt ggt ccg att gca gtt gga gga ctc ctg atg atg ctg gtt agc 4342 Phe Leu Gly Pro Ile Ala Val Gly Gly Leu Leu Met Met Leu Val Ser 1395 1400 1405 gtg gct ggg agg gtg gat ggg cta gag ctc aag aag ctt ggt gaa gtt 4390 Val Ala Gly Arg Val Asp Gly Leu Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu Val 1410 1415 1420 tca tgg gaa gag gag gcg gag atc agc ggg agt tcc gcc cgc tat gat 4438 Ser Trp Glu Glu Glu Ala Glu Ile Ser Gly Ser Ser Ala Arg Tyr Asp 1425 1430 1435 1440 gtg gca ctc agt gaa caa ggg gag ttc aag ctg ctt tct gaa gag aaa 4486 Val Ala Leu Ser Glu Gln Gly Glu Phe Lys Leu Leu Ser Glu Glu Lys 1445 1450 1455 gtg cca tgg gac cag gtt gtg atg acc tcg ctg gcc ttg gtt ggg gct 4534 Val Pro Trp Asp Gln Val Val Met Thr Ser Leu Ala Leu Val Gly Ala 1460 1465 1470 gcc ctc cat cca ttt gct ctt ctg ctg gtc ctt gct ggg tgg ctg ttt 4582 Ala Leu His Pro Phe Ala Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Trp Leu Phe 1475 1480 1485 cat gtc agg gga gct agg aga agt ggg gat gtc ttg tgg gat att ccc 4630 His Val Arg Gly Ala Arg Arg Ser Gly Asp Val Leu Trp Asp Ile Pro 1490 1495 1500 act cct aag atc atc gag gaa tgt gaa cat ctg gag gat ggg att tat 4678 Thr Pro Lys Ile Ile Glu Glu Cys Glu His Leu Glu Asp Gly Ile Tyr 1505 1510 1515 1520 ggc ata ttc cag tca acc ttc ttg ggg gcc tcc cag cga gga gtg gga 4726 Gly Ile Phe Gln Ser Thr Phe Leu Gly Ala Ser Gln Arg Gly Val Gly 1525 1530 1535 gtg gca cag gga ggg gtg ttc cac aca atg tgg cat gtc aca aga gga 4774 Val Ala Gln Gly Gly Val Phe His Thr Met Trp His Val Thr Arg Gly 1540 1545 1550 gct ttc ctt gtc agg aat ggc aag aag ttg att cca tct tgg gct tca 4822 Ala Phe Leu Val Arg Asn Gly Lys Lys Leu Ile Pro Ser Trp Ala Ser 1555 1560 1565 gta aag gaa gac ctt gtc gcc tat ggt ggc tca tgg aag ttg gaa ggc 4870 Val Lys Glu Asp Leu Val Ala Tyr Gly Gly Ser Trp Lys Leu Glu Gly 1570 1575 1580 aga tgg gat gga gag gaa gag gtc cag ttg atc gcg gct gtt cca gga 4918 Arg Trp Asp Gly Glu Glu Glu Val Gln Leu Ile Ala Ala Val Pro Gly 1585 1590 1595 1600 aag aac gtg gtc aac gtc cag aca aaa ccg agc ttg ttc aaa gtg agg 4966 Lys Asn Val Val Asn Val Gln Thr Lys Pro Ser Leu Phe Lys Val Arg 1605 1610 1615 aat ggg gga gaa atc ggg gct gtc gct ctt gac tat ccg agt ggc act 5014 Asn Gly Gly Glu Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Thr 1620 1625 1630 tca gga tct cct att gtt aac agg aac gga gag gtg att ggg ctg tac 5062 Ser Gly Ser Pro Ile Val Asn Arg Asn Gly Glu Val Ile Gly Leu Tyr 1635 1640 1645 ggc aat ggc atc ctt gtc ggt gac aac tcc ttc gtg tcc gcc ata tcc 5110 Gly Asn Gly Ile Leu Val Gly Asp Asn Ser Phe Val Ser Ala Ile Ser 1650 1655 1660 cag act gag gtg aag gaa gaa gga aag gag gag ctc caa gag atc ccg 5158 Gln Thr Glu Val Lys Glu Glu Gly Lys Glu Glu Leu Gln Glu Ile Pro 1665 1670 1675 1680 aca atg cta aag aaa gga atg aca act gtc ctt gat ttt cat cct gga 5206 Thr Met Leu Lys Lys Gly Met Thr Thr Val Leu Asp Phe His Pro Gly 1685 1690 1695 gct ggg aag aca aga cgt ttc ctc cca cag atc ttg gcc gag tgc gca 5254 Ala Gly Lys Thr Arg Arg Phe Leu Pro Gln Ile Leu Ala Glu Cys Ala 1700 1705 1710 cgg aga cgc ttg cgc act ctt gtg ttg gcc ccc acc agg gtt gtt ctt 5302 Arg Arg Arg Leu Arg Thr Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Leu 1715 1720 1725 tct gaa atg aag gag gct ttt cac ggc ctg gac gtg aaa ttc cac aca 5350 Ser Glu Met Lys Glu Ala Phe His Gly Leu Asp Val Lys Phe His Thr 1730 1735 1740 cag gct ttt tcc gct cac ggc agc ggg aga gaa gtc att gat gcc atg 5398 Gln Ala Phe Ser Ala His Gly Ser Gly Arg Glu Val Ile Asp Ala Met 1745 1750 1755 1760 tgc cat gcc acc cta act tac agg atg ttg gaa cca act agg gtt gtt 5446 Cys His Ala Thr Leu Thr Tyr Arg Met Leu Glu Pro Thr Arg Val Val 1765 1770 1775 aac tgg gaa gtg atc att atg gat gaa gcc cat ttt ttg gat cca gcc 5494 Asn Trp Glu Val Ile Ile Met Asp Glu Ala His Phe Leu Asp Pro Ala 1780 1785 1790 agc ata gcc gct aga ggt tgg gca gcg cac aga gct agg gca aat gaa 5542 Ser Ile Ala Ala Arg Gly Trp Ala Ala His Arg Ala Arg Ala Asn Glu 1795 1800 1805 agt gca aca atc ttg atg aca gcc aca ccg cct ggg act agt gat gaa 5590 Ser Ala Thr Ile Leu Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Ser Asp Glu 1810 1815 1820 ttt cca cat tca aat ggt gaa ata gaa gat gtt caa acg gac ata ccc 5638 Phe Pro His Ser Asn Gly Glu Ile Glu Asp Val Gln Thr Asp Ile Pro 1825 1830 1835 1840 agt gag ccc tgg aac aca ggg cat gac tgg atc ctg gct gac aaa agg 5686 Ser Glu Pro Trp Asn Thr Gly His Asp Trp Ile Leu Ala Asp Lys Arg 1845 1850 1855 ccc acg gca tgg ttc ctt cca tcc atc aga gct gca aat gtc atg gct 5734 Pro Thr Ala Trp Phe Leu Pro Ser Ile Arg Ala Ala Asn Val Met Ala 1860 1865 1870 gcc tct ttg cgt aag gct gga aag agt gtg gtg gtc ctg aac agg aaa 5782 Ala Ser Leu Arg Lys Ala Gly Lys Ser Val Val Val Leu Asn Arg Lys 1875 1880 1885 acc ttt gag aga gaa tac ccc acg ata aag cag aag aaa cct gac ttt 5830 Thr Phe Glu Arg Glu Tyr Pro Thr Ile Lys Gln Lys Lys Pro Asp Phe 1890 1895 1900 ata ttg gcc act gac ata gct gaa atg gga gcc aac ctt tgc gtg gag 5878 Ile Leu Ala Thr Asp Ile Ala Glu Met Gly Ala Asn Leu Cys Val Glu 1905 1910 1915 1920 cga gtg ctg gat tgc agg acg gct ttt aag cct gtg ctt gtg gat gaa 5926 Arg Val Leu Asp Cys Arg Thr Ala Phe Lys Pro Val Leu Val Asp Glu 1925 1930 1935 ggg agg aag gtg gca ata aaa ggg cca ctt cgt atc tcc gca tcc tct 5974 Gly Arg Lys Val Ala Ile Lys Gly Pro Leu Arg Ile Ser Ala Ser Ser 1940 1945 1950 gct gct caa agg agg ggg cgc att ggg aga aat ccc aac aga gat gga 6022 Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Asn Arg Asp Gly 1955 1960 1965 gac tca tac tac tat tct gag cct aca agt gaa aat aat gcc cac cac 6070 Asp Ser Tyr Tyr Tyr Ser Glu Pro Thr Ser Glu Asn Asn Ala His His 1970 1975 1980 gtc tgc tgg ttg gag gcc tca atg ctc ttg gac aac atg gag gtg agg 6118 Val Cys Trp Leu Glu Ala Ser Met Leu Leu Asp Asn Met Glu Val Arg 1985 1990 1995 2000 ggt gga atg gtc gcc cca ctc tat ggc gtt gaa gga act aaa aca cca 6166 Gly Gly Met Val Ala Pro Leu Tyr Gly Val Glu Gly Thr Lys Thr Pro 2005 2010 2015 gtt tcc cct ggt gaa atg aga ctg agg gat gac cag agg aaa gtc ttc 6214 Val Ser Pro Gly Glu Met Arg Leu Arg Asp Asp Gln Arg Lys Val Phe 2020 2025 2030 aga gaa cta gtg agg aat tgt gac ctg ccc gtt tgg ctt tcg tgg caa 6262 Arg Glu Leu Val Arg Asn Cys Asp Leu Pro Val Trp Leu Ser Trp Gln 2035 2040 2045 gtg gcc aag gct ggt ttg aag acg aat gat cgt aag tgg tgt ttt gaa 6310 Val Ala Lys Ala Gly Leu Lys Thr Asn Asp Arg Lys Trp Cys Phe Glu 2050 2055 2060 ggc cct gag gaa cat gag atc ttg aat gac agc ggt gaa aca gtg aag 6358 Gly Pro Glu Glu His Glu Ile Leu Asn Asp Ser Gly Glu Thr Val Lys 2065 2070 2075 2080 tgc agg gct cct gga gga gca aag aag cct ctg cgc cca agg tgg tgt 6406 Cys Arg Ala Pro Gly Gly Ala Lys Lys Pro Leu Arg Pro Arg Trp Cys 2085 2090 2095 gat gaa agg gtg tca tct gac cag agt gcg ctg tct gaa ttt att aag 6454 Asp Glu Arg Val Ser Ser Asp Gln Ser Ala Leu Ser Glu Phe Ile Lys 2100 2105 2110 ttt gct gaa ggt agg agg gga gct gct gaa gtg cta gtt gtg ctg agt 6502 Phe Ala Glu Gly Arg Arg Gly Ala Ala Glu Val Leu Val Val Leu Ser 2115 2120 2125 gaa ctc cct gat ttc ctg gct aaa aaa ggt gga gag gca atg gat acc 6550 Glu Leu Pro Asp Phe Leu Ala Lys Lys Gly Gly Glu Ala Met Asp Thr 2130 2135 2140 atc agt gtg ttc ctc cac tct gag gaa ggc tct agg gct tac cgc aat 6598 Ile Ser Val Phe Leu His Ser Glu Glu Gly Ser Arg Ala Tyr Arg Asn 2145 2150 2155 2160 gca cta tca atg atg cct gag gca atg aca ata gtc atg ctg ttt ata 6646 Ala Leu Ser Met Met Pro Glu Ala Met Thr Ile Val Met Leu Phe Ile 2165 2170 2175 ctg gct gga cta ctg aca tcg gga atg gtc atc ttt ttc atg tct ccc 6694 Leu Ala Gly Leu Leu Thr Ser Gly Met Val Ile Phe Phe Met Ser Pro 2180 2185 2190 aaa ggc atc agt aga atg tct atg gcg atg ggc aca atg gcc ggc tgt 6742 Lys Gly Ile Ser Arg Met Ser Met Ala Met Gly Thr Met Ala Gly Cys 2195 2200 2205 gga tat ctc atg ttc ctt gga ggc gtc aaa ccc act cac atc tcc tat 6790 Gly Tyr Leu Met Phe Leu Gly Gly Val Lys Pro Thr His Ile Ser Tyr 2210 2215 2220 gtc atg ctc ata ttc ttt gtc ctg atg gtg gtt gtg atc ccc gag cca 6838 Val Met Leu Ile Phe Phe Val Leu Met Val Val Val Ile Pro Glu Pro 2225 2230 2235 2240 ggg caa caa agg tcc atc caa gac aac caa gtg gca tac ctc att att 6886 Gly Gln Gln Arg Ser Ile Gln Asp Asn Gln Val Ala Tyr Leu Ile Ile 2245 2250 2255 ggc atc ctg acg ctg gtt tca gcg gtg gca gcc aac gag cta ggc atg 6934 Gly Ile Leu Thr Leu Val Ser Ala Val Ala Ala Asn Glu Leu Gly Met 2260 2265 2270 ctg gag aaa acc aaa gag gac ctc ttt ggg aag aag aac tta att cca 6982 Leu Glu Lys Thr Lys Glu Asp Leu Phe Gly Lys Lys Asn Leu Ile Pro 2275 2280 2285 tct agt gct tca 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Asn His Tyr Ala Phe Val Gly Val Met Tyr Asn Leu Trp Lys Met 2500 2505 2510 aaa act gga cgc cgg ggg agc gcg aat gga aaa act ttg ggt gaa gtc 7702 Lys Thr Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asn Gly Lys Thr Leu Gly Glu Val 2515 2520 2525 tgg aag agg gaa ctg aat ctg ttg gac aag cga cag ttt gag ttg tat 7750 Trp Lys Arg Glu Leu Asn Leu Leu Asp Lys Arg Gln Phe Glu Leu Tyr 2530 2535 2540 aaa agg acc gac att gtg gag gtg gat cgt gat acg gca cgc agg cat 7798 Lys Arg Thr Asp Ile Val Glu Val Asp Arg Asp Thr Ala Arg Arg His 2545 2550 2555 2560 ttg gcc gaa ggg aag gtg gac acc ggg gtg gcg gtc tcc agg ggg acc 7846 Leu Ala Glu Gly Lys Val Asp Thr Gly Val Ala Val Ser Arg Gly Thr 2565 2570 2575 gca aag tta agg tgg ttc cat gag cgt ggc tat gtc aag ctg gaa ggt 7894 Ala Lys Leu Arg Trp Phe His Glu Arg Gly Tyr Val Lys Leu Glu Gly 2580 2585 2590 agg gtg att gac ctg ggg tgt ggc cgc gga ggc tgg tgt tac tac gct 7942 Arg Val Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Cys Tyr Tyr Ala 2595 2600 2605 gct gcg caa aag gaa gtg agt ggg gtc aaa gga ttt act ctt gga aga 7990 Ala Ala Gln Lys Glu Val Ser Gly Val Lys Gly Phe Thr Leu Gly Arg 2610 2615 2620 gac ggc cat gag aaa ccc atg aat gtg caa agt ctg gga tgg aac atc 8038 Asp Gly His Glu Lys Pro Met Asn Val Gln Ser Leu Gly Trp Asn Ile 2625 2630 2635 2640 atc acc ttc aag gac aaa act gat atc cac cgc cta gaa cca gtg aaa 8086 Ile Thr Phe Lys Asp Lys Thr Asp Ile His Arg Leu Glu Pro Val Lys 2645 2650 2655 tgt gac acc ctt ttg tgt gac att gga gag tca tca tcg tca tcg gtc 8134 Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Ser Ser Val 2660 2665 2670 aca gag ggg gaa agg acc gtg aga gtt ctt gat act gta gaa aaa tgg 8182 Thr Glu Gly Glu Arg Thr Val Arg Val Leu Asp Thr Val Glu Lys Trp 2675 2680 2685 ctg gct tgt ggg gtt gac aac ttc tgt gtg aag gtg tta gct cca tac 8230 Leu Ala Cys Gly Val Asp Asn Phe Cys Val Lys Val Leu Ala Pro Tyr 2690 2695 2700 atg cca gat gtt ctt gag aaa ctg gaa ttg ctc caa agg agg ttt ggc 8278 Met Pro Asp Val Leu Glu Lys Leu Glu Leu Leu Gln Arg Arg Phe Gly 2705 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Tyr Cys Gly Ser Tyr Val Thr Lys Thr Ser 2820 2825 2830 gga agt gcg gcg agc atg gta aat ggt gtt att aaa att ctg aca tat 8662 Gly Ser Ala Ala Ser Met Val Asn Gly Val Ile Lys Ile Leu Thr Tyr 2835 2840 2845 cca tgg gac agg ata gag gag gtc aca aga atg gca atg act gac aca 8710 Pro Trp Asp Arg Ile Glu Glu Val Thr Arg Met Ala Met Thr Asp Thr 2850 2855 2860 acc cct ttt gga cag caa aga gtg ttt aaa gaa aaa gtt gac acc aga 8758 Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg 2865 2870 2875 2880 gca aag gat cca cca gcg gga act agg aag atc atg aaa gtt gtc aac 8806 Ala Lys Asp Pro Pro Ala Gly Thr Arg Lys Ile Met Lys Val Val Asn 2885 2890 2895 agg tgg ctg ttc cgc cac ctg gcc aga gaa aag aac ccc aga ctg tgc 8854 Arg Trp Leu Phe Arg His Leu Ala Arg Glu Lys Asn Pro Arg Leu Cys 2900 2905 2910 aca aag gaa gaa ttt att gca aaa gtc cga agt cat gca gcc att gga 8902 Thr Lys Glu Glu Phe Ile Ala Lys Val Arg Ser His Ala Ala Ile Gly 2915 2920 2925 gct tac ctg gaa gaa caa gaa cag tgg aag act gcc aat 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gca atg gat ggt ggt gga ttc tac gcg gat gac acc gct gga tgg 9286 Ala Ala Met Asp Gly Gly Gly Phe Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp 3045 3050 3055 gac acg cgc atc aca gag gca gac ctt gat gat gaa cag gag atc ttg 9334 Asp Thr Arg Ile Thr Glu Ala Asp Leu Asp Asp Glu Gln Glu Ile Leu 3060 3065 3070 aac tac atg agc cca cat cac aaa aaa ctg gca caa gca gtg atg gaa 9382 Asn Tyr Met Ser Pro His His Lys Lys Leu Ala Gln Ala Val Met Glu 3075 3080 3085 atg aca tac aag aac aaa gtg gtg aaa gtg ttg aga cca gcc cca gga 9430 Met Thr Tyr Lys Asn Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Pro Gly 3090 3095 3100 ggg aaa gcc tac atg gat gtc ata agt cga cga gac cag aga gga tcc 9478 Gly Lys Ala Tyr Met Asp Val Ile Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly Ser 3105 3110 3115 3120 ggg cag gta gtg act tat gct ctg aac acc atc acc aac ttg aaa gtc 9526 Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Ile Thr Asn Leu Lys Val 3125 3130 3135 caa ttg atc aga atg gca gaa gca gag atg gtg ata cat cac caa cat 9574 Gln Leu Ile Arg Met Ala Glu Ala Glu Met Val Ile His His Gln His 3140 3145 3150 gtt caa gat tgt gat gaa tca gtt ctg acc agg ctg gag gca tgg ctc 9622 Val Gln Asp Cys Asp Glu Ser Val Leu Thr Arg Leu Glu Ala Trp Leu 3155 3160 3165 act gag cac gga tgt gac aga ctg aag agg atg gcg gtg agt gga gac 9670 Thr Glu His Gly Cys Asp Arg Leu Lys Arg Met Ala Val Ser Gly Asp 3170 3175 3180 gac tgt gtg gtc cgg ccc atc gat gac agg ttc ggc ctg gcc ctg tcc 9718 Asp Cys Val Val Arg Pro Ile Asp Asp Arg Phe Gly Leu Ala Leu Ser 3185 3190 3195 3200 cat ctc aac gcc atg tcc aag gtt aga aag gac ata tct gaa tgg cag 9766 His Leu Asn Ala Met Ser Lys Val Arg Lys Asp Ile Ser Glu Trp Gln 3205 3210 3215 cca tca aaa ggg tgg aat gat tgg gag aat gtg ccc ttc tgt tcc cac 9814 Pro Ser Lys Gly Trp Asn Asp Trp Glu Asn Val Pro Phe Cys Ser His 3220 3225 3230 cac ttc cat gaa cta cag ctg aag gat ggc agg agg att gtg gtg cct 9862 His Phe His Glu Leu Gln Leu Lys Asp Gly Arg Arg Ile Val Val Pro 3235 3240 3245 tgc cga gaa cag gac gag ctc att ggg aga gga agg gtg tct cca gga 9910 Cys Arg Glu Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg Gly Arg Val Ser Pro Gly 3250 3255 3260 aac ggc tgg atg atc aag gaa aca gct tgc ctc agc aaa gcc tat gcc 9958 Asn Gly Trp Met Ile Lys Glu Thr Ala Cys Leu Ser Lys Ala Tyr Ala 3265 3270 3275 3280 aac atg tgg tca ctg atg tat ttt cac aaa agg gac atg agg cta ctg 10006 Asn Met Trp Ser Leu Met Tyr Phe His Lys Arg Asp Met Arg Leu Leu 3285 3290 3295 tca ttg gct gtt tcc tca gct gtt ccc acc tca tgg gtt cca caa gga 10054 Ser Leu Ala Val Ser Ser Ala Val Pro Thr Ser Trp Val Pro Gln Gly 3300 3305 3310 cgc aca aca tgg tcg att cat ggg aaa ggg gag tgg atg acc acg gaa 10102 Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu 3315 3320 3325 gac atg ctt gag gtg tgg aac aga gta tgg ata acc aac aac cca cac 10150 Asp Met Leu Glu Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Thr Asn Asn Pro His 3330 3335 3340 atg cag gac aag aca atg gtg aaa aaa tgg aga gat gtc cct tat cta 10198 Met Gln Asp Lys Thr Met Val Lys Lys Trp Arg Asp Val Pro Tyr Leu 3345 3350 3355 3360 acc aag aga caa gac aag ctg tgc gga tca ctg att gga atg acc aat 10246 Thr Lys Arg Gln Asp Lys Leu Cys Gly Ser Leu Ile Gly Met Thr Asn 3365 3370 3375 agg gcc acc tgg gcc tcc cac atc cat tta gtc atc cat cgt atc cga 10294 Arg Ala Thr Trp Ala Ser His Ile His Leu Val Ile His Arg Ile Arg 3380 3385 3390 acg ctg att gga cag gag aaa tac act gac tac cta aca gtc atg gac 10342 Thr Leu Ile Gly Gln Glu Lys Tyr Thr Asp Tyr Leu Thr Val Met Asp 3395 3400 3405 agg tat tct gtg gat gct gac ctg caa ctg ggt gag ctt atc tgaaac 10390 Arg Tyr Ser Val Asp Ala Asp Leu Gln Leu Gly Glu Leu Ile 3410 3415 3420 accatctaac aggaataacc gggatacaaa ccacgggtgg agaaccggac tccccacaac 10450 ctgaaaccgg gatataaacc acggctggag aaccggactc cgcacttaaa atgaaacaga 10510 aaccgggata aaaactacgg atggagaacc ggactccaca cattgagaca gaagaagttg 10570 tcagcccaga accccacacg agttttgcca ctgctaagct gtgaggcagt gcaggctggg 10630 acagccgacc tccaggttgc gaaaaacctg gtttctggga cctcccaccc cagagtaaaa 10690 agaacggagc ctccgctacc accctcccac gtggtggtag aaagacgggg tctagaggtt 10750 agaggagacc ctccagggaa caaatagtgg gaccatattg acgccaggga aagaccggag 10810 tggttctctg cttttcctcc agaggtctgt gagcacagtt tgctcaagaa taagcagacc 10870 tttggatgac aaacacaaaa ccacaa 10896 <210> 21 <211> 3422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 21 Met Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val 1 5 10 15 Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ile Lys Gln Lys Thr Lys 20 25 30 Gln Ile Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly Val Gln Gly Phe Ile 35 40 45 Phe Phe Phe Leu Phe Asn Ile Leu Thr Gly Lys Lys Ile Thr Ala His 50 55 60 Leu Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gln Gly Leu Ala Val 65 70 75 80 Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser 85 90 95 Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile 100 105 110 Leu Gly Met Leu Leu Met Thr Gly Gly Val Thr Leu Ser Asn Phe Gln 115 120 125 Gly Lys Val Met Met Thr Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Asp Val Ile 130 135 140 Thr Ile Pro Thr Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg Ala Met 145 150 155 160 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3390 Thr Leu Ile Gly Gln Glu Lys Tyr Thr Asp Tyr Leu Thr Val Met Asp 3395 3400 3405 Arg Tyr Ser Val Asp Ala Asp Leu Gln Leu Gly Glu Leu Ile 3410 3415 3420 <210> 22 <211> 10896 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Yellow Fever Virus and West Nile virus <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> CDS <222> (119)..(10384) <400> 22 ngtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60 acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaac 118 atg tct ggt cgt aaa gct cag gga aaa acc ctg ggc gtc aat atg gta 166 Met Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val 1 5 10 15 cga cga gga gtt cgc tcc ttg tca aac aaa ata aaa caa aaa aca aaa 214 Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ile Lys Gln Lys Thr Lys 20 25 30 caa att gga aac aga cct gga cct tca aga ggt gtt caa gga ttt atc 262 Gln Ile Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly Val Gln Gly Phe Ile 35 40 45 ttt ttc ttt ttg ttc aac att ttg act gga aaa aag atc aca gcc cac 310 Phe Phe Phe Leu Phe Asn Ile Leu Thr Gly Lys Lys Ile Thr Ala His 50 55 60 cta aag agg ttg tgg aaa atg ctg gac cca aga caa ggc ttg gct gtt 358 Leu Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gln Gly Leu Ala Val 65 70 75 80 cta agg aaa gtc aag aga gtg gtg gcc agt ttg atg aga gga ttg tcc 406 Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser 85 90 95 tca agg aaa cgc cgt tcc cat gat gtt ctg act gtg caa ttc cta att 454 Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile 100 105 110 ttg gga atg ctg ttg atg acg ggt gga gtt acc ctc tct aac ttc caa 502 Leu Gly Met Leu Leu Met Thr Gly Gly Val Thr Leu Ser Asn Phe Gln 115 120 125 ggg aag gtg atg atg acg gta aat gct act gac gtc aca gat gtc atc 550 Gly Lys Val Met Met Thr Val Asn Ala Thr Asp Val Thr Asp Val Ile 130 135 140 acg att cca aca gct gct gga aag aac cta tgc att gtc aga gca atg 598 Thr Ile Pro Thr Ala Ala Gly Lys Asn Leu Cys Ile Val Arg Ala Met 145 150 155 160 gat gtg gga tac atg tgc gat gat act atc act tat gaa tgc cca gtg 646 Asp Val Gly Tyr Met Cys Asp Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Val 165 170 175 ctg tcg gct ggt aat gat cca gaa gac atc gac tgt tgg tgc aca aag 694 Leu Ser Ala Gly Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Thr Lys 180 185 190 tca gca gtc tac gtc agg tat gga aga tgc acc aag aca cgc cac tca 742 Ser Ala Val Tyr Val Arg Tyr Gly Arg Cys Thr Lys Thr Arg His Ser 195 200 205 aga cgc agt cgg agg tca ctg aca gtg cag aca cac gga gaa agc act 790 Arg Arg Ser Arg Arg Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr 210 215 220 cta gcg aac aag aag ggg gct tgg atg gac agc acc aag gcc aca agg 838 Leu Ala Asn Lys Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg 225 230 235 240 tat ttg gta aaa aca gaa tca tgg atc ttg agg aac cct gga tat gcc 886 Tyr Leu Val Lys Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala 245 250 255 ctg gtg gca gcc gtc att ggt tgg atg ctt ggg agc aac acc atg cag 934 Leu Val Ala Ala Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln 260 265 270 aga gtt gtg ttt gtc gtg cca ttg ctt ttg gtg gcc cca gct tac agc 982 Arg Val Val Phe Val Val Pro Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser 275 280 285 ttc aac tgc ctt gga atg agc aac aga gac ttc ttg gaa gga gtg tct 1030 Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val Ser 290 295 300 gga gca aca tgg gtg gat ttg gtt ctc gaa ggc gac agc tgc gtg act 1078 Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val Thr 305 310 315 320 atc atg tct aag gac aag cct acc atc gac gtc aag atg atg aat atg 1126 Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met 325 330 335 gag gcg gcc aac ctg gca gag gtc cgc agt tat tgc tat ttg gct acc 1174 Glu Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr 340 345 350 gtc agc gat ctc tcc acc aaa gct gca tgc ccg acc atg gga gaa gct 1222 Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala 355 360 365 cac aat gac aaa cgt gct gac cca gct ttt gtg tgc aga caa gga gtg 1270 His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly Val 370 375 380 gtg gac agg ggc tgg ggc aac ggc tgc gga ttt ttt ggc aaa gga tcc 1318 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Phe Phe Gly Lys Gly Ser 385 390 395 400 att gac aca tgc gcc aaa ttt gcc tgc tct acc aag gca ata gga aga 1366 Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg 405 410 415 acc atc ttg aaa gag aat atc aag tac gaa gtg gcc att ttt gtc cat 1414 Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His 420 425 430 gga cca act act gtg gag tcg cac gga aat tac tcc aca cag gtt gga 1462 Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly 435 440 445 gcc act cag gcc ggc cga ttc agc atc act cct gct gcg cct tca tac 1510 Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr 450 455 460 aca cta aag ctt gga gaa tat gga gag gtg aca gtg gac tgt gaa cca 1558 Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu Pro 465 470 475 480 cgg tca ggg att gac acc aat gca tac tac gtg atg act gtt gga aca 1606 Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly Thr 485 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Asp Thr Gly His 595 600 605 ggc act gtg gtg ttg gaa ttg cag tac act ggc acg gat gga cct tgc 1990 Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys 610 615 620 aaa gtt cct atc tcg tca gtg gct tca ttg aac gac cta acg cca gtg 2038 Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val 625 630 635 640 ggc aga ttg gtc act gtc aac cct ttt gtt tca gtg gcc acg gcc aac 2086 Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn 645 650 655 gct aag gtc ctg att gaa ttg gaa cca ccc ttt gga gac tca tac ata 2134 Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile 660 665 670 gtg gtg ggc aga gga gaa caa cag atc aat cac cat tgg cac aag tct 2182 Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser 675 680 685 gga agc agc att ggc aaa gcc ttt aca acc acc ctc aaa gga gcg cag 2230 Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln 690 695 700 aga cta gcc gct cta gga gac aca gct tgg gac ttt gga tca gtt gga 2278 Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp 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ttc cag ata 2950 Arg Lys Glu Cys Pro Phe Ser Asn Arg Val Trp Asn Ser Phe Gln Ile 930 935 940 gag gag ttt ggg acg gga gtg ttc acc aca cgc gtg tac atg gac gca 2998 Glu Glu Phe Gly Thr Gly Val Phe Thr Thr Arg Val Tyr Met Asp Ala 945 950 955 960 gtc ttt gaa tac acc ata gac tgc gat gga tct atc ttg ggt gca gcg 3046 Val Phe Glu Tyr Thr Ile Asp Cys Asp Gly Ser Ile Leu Gly Ala Ala 965 970 975 gtg aac gga aaa aag agt gcc cat ggc tct cca aca ttt tgg atg gga 3094 Val Asn Gly Lys Lys Ser Ala His Gly Ser Pro Thr Phe Trp Met Gly 980 985 990 agt cat gaa gta aat ggg aca tgg atg atc cac acc ttg gag gca tta 3142 Ser His Glu Val Asn Gly Thr Trp Met Ile His Thr Leu Glu Ala Leu 995 1000 1005 gat tac aag gag tgt gag tgg cca ctg aca cat acg att gga aca tca 3190 Asp Tyr Lys Glu Cys Glu Trp Pro Leu Thr His Thr Ile Gly Thr Ser 1010 1015 1020 gtt gaa gag agt gaa atg ttc atg ccg aga tca atc gga ggc cca gtt 3238 Val Glu Glu Ser Glu Met Phe Met Pro Arg Ser Ile Gly Gly Pro Val 1025 1030 1035 1040 agc tct cac aat cat atc cct gga tac aag gtt cag acg aac gga cct 3286 Ser Ser His Asn His Ile Pro Gly Tyr Lys Val Gln Thr Asn Gly Pro 1045 1050 1055 tgg atg cag gta cca cta gaa gtg aag aga gaa gct tgc cca ggg act 3334 Trp Met Gln Val Pro Leu Glu Val Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr 1060 1065 1070 agc gtg atc att gat ggc aac tgt gat gga cgg gga aaa tca acc aga 3382 Ser Val Ile Ile Asp Gly Asn Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr Arg 1075 1080 1085 tcc acc acg gat agc ggg aaa gtt att cct gaa tgg tgt tgc cgc tcc 3430 Ser Thr Thr Asp Ser Gly Lys Val Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ser 1090 1095 1100 tgc aca atg ccg cct gtg agc ttc cat ggt agt gat ggg tgt tgg tat 3478 Cys Thr Met Pro Pro Val Ser Phe His Gly Ser Asp Gly Cys Trp Tyr 1105 1110 1115 1120 ccc atg gaa att agg cca agg aaa acg cat gaa agc cat ctg gtg cgc 3526 Pro Met Glu Ile Arg Pro Arg Lys Thr His Glu Ser His Leu Val Arg 1125 1130 1135 tcc tgg gtt aca gct gga gaa ata cat gct gtc cct ttt ggt ttg gtg 3574 Ser Trp Val Thr Ala Gly Glu Ile His Ala Val Pro Phe Gly Leu Val 1140 1145 1150 agc atg atg ata gca atg gaa gtg gtc cta agg aaa aga cag gga cca 3622 Ser Met Met Ile Ala Met Glu Val Val Leu Arg Lys Arg Gln Gly Pro 1155 1160 1165 aag caa atg ttg gtt gga gga gta gtg ctc ttg gga gca atg ctg gtc 3670 Lys Gln Met Leu Val Gly Gly Val Val Leu Leu Gly Ala Met Leu Val 1170 1175 1180 ggg caa gta act ctc ctt gat ttg ctg aaa ctc aca gtg gct gtg gga 3718 Gly Gln Val Thr Leu Leu Asp Leu Leu Lys Leu Thr Val Ala Val Gly 1185 1190 1195 1200 ttg cat ttc cat gag atg aac aat gga gga gac gcc atg tat atg gcg 3766 Leu His Phe His Glu Met Asn Asn Gly Gly Asp Ala Met Tyr Met Ala 1205 1210 1215 ttg att gct gcc ttt tca atc aga cca ggg ctg ctc atc ggc ttt ggg 3814 Leu Ile Ala Ala Phe Ser Ile Arg Pro Gly Leu Leu Ile Gly Phe Gly 1220 1225 1230 ctc agg acc cta tgg agc cct cgg gaa cgc ctt gtg ctg acc cta gga 3862 Leu Arg Thr Leu Trp Ser Pro Arg Glu Arg Leu Val Leu Thr Leu Gly 1235 1240 1245 gca gcc atg gtg gag att gcc ttg ggt ggc gtg atg ggc ggc ctg tgg 3910 Ala Ala Met Val Glu Ile Ala Leu Gly Gly Val Met Gly Gly Leu Trp 1250 1255 1260 aag tat cta aat gca gtt tct ctc tgc atc ctg aca ata aat gct gtt 3958 Lys Tyr Leu Asn Ala Val Ser Leu Cys Ile Leu Thr Ile Asn Ala Val 1265 1270 1275 1280 gct tct agg aaa gca tca aat acc atc ttg ccc ctc atg gct ctg ttg 4006 Ala Ser Arg Lys Ala Ser Asn Thr Ile Leu Pro Leu Met Ala Leu Leu 1285 1290 1295 aca cct gtc act atg gct gag gtg aga ctt gcc gca atg ttc ttt tgt 4054 Thr Pro Val Thr Met Ala Glu Val Arg Leu Ala Ala Met Phe Phe Cys 1300 1305 1310 gcc atg gtt atc ata ggg gtc ctt cac cag aat ttc aag gac acc tcc 4102 Ala Met Val Ile Ile Gly Val Leu His Gln Asn Phe Lys Asp Thr Ser 1315 1320 1325 atg cag aag act ata cct ctg gtg gcc ctc aca ctc aca tct tac ctg 4150 Met Gln Lys Thr Ile Pro Leu Val Ala Leu Thr Leu Thr Ser Tyr Leu 1330 1335 1340 ggc ttg aca caa cct ttt ttg ggc ctg tgt gca ttt ctg gca acc cgc 4198 Gly Leu Thr Gln Pro Phe Leu Gly Leu Cys Ala Phe Leu Ala Thr Arg 1345 1350 1355 1360 ata ttt ggg cga agg agt atc cca gtg aat gag gca ctc gca gca gct 4246 Ile Phe Gly Arg Arg Ser Ile Pro Val Asn Glu Ala Leu Ala Ala Ala 1365 1370 1375 ggt cta gtg gga gtg ctg gca gga ctg gct ttt cag gag atg gag aac 4294 Gly Leu Val Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Phe Gln Glu Met Glu Asn 1380 1385 1390 ttc ctt ggt ccg att gca gtt gga gga ctc ctg atg atg ctg gtt agc 4342 Phe Leu Gly Pro Ile Ala Val Gly Gly Leu Leu Met Met Leu Val Ser 1395 1400 1405 gtg gct ggg agg gtg gat ggg cta gag ctc aag aag ctt ggt gaa gtt 4390 Val Ala Gly Arg Val Asp Gly Leu Glu Leu Lys Lys Leu Gly Glu Val 1410 1415 1420 tca tgg gaa gag gag gcg gag atc agc ggg agt tcc gcc cgc tat gat 4438 Ser Trp Glu Glu Glu Ala Glu Ile Ser Gly Ser Ser Ala Arg Tyr Asp 1425 1430 1435 1440 gtg gca ctc agt gaa caa ggg gag ttc aag ctg ctt tct gaa gag aaa 4486 Val Ala Leu Ser Glu Gln Gly Glu Phe Lys Leu Leu Ser Glu Glu Lys 1445 1450 1455 gtg cca tgg gac cag gtt gtg atg acc tcg ctg gcc ttg gtt ggg gct 4534 Val Pro Trp Asp Gln Val Val Met Thr Ser Leu Ala Leu Val Gly Ala 1460 1465 1470 gcc ctc cat cca ttt gct ctt ctg ctg gtc ctt gct ggg tgg ctg ttt 4582 Ala Leu His Pro Phe Ala Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Trp Leu Phe 1475 1480 1485 cat gtc agg gga gct agg aga agt ggg gat gtc ttg tgg gat att ccc 4630 His Val Arg Gly Ala Arg Arg Ser Gly Asp Val Leu Trp Asp Ile Pro 1490 1495 1500 act cct aag atc atc gag gaa tgt gaa cat ctg gag gat ggg att tat 4678 Thr Pro Lys Ile Ile Glu Glu Cys Glu His Leu Glu Asp Gly Ile Tyr 1505 1510 1515 1520 ggc ata ttc cag tca acc ttc ttg ggg gcc tcc cag cga gga gtg gga 4726 Gly Ile Phe Gln Ser Thr Phe Leu Gly Ala Ser Gln Arg Gly Val Gly 1525 1530 1535 gtg gca cag gga ggg gtg ttc cac aca atg tgg cat gtc aca aga gga 4774 Val Ala Gln Gly Gly Val Phe His Thr Met Trp His Val Thr Arg Gly 1540 1545 1550 gct ttc ctt gtc agg aat ggc aag aag ttg att cca tct tgg gct tca 4822 Ala Phe Leu Val Arg Asn Gly Lys Lys Leu Ile Pro Ser Trp Ala Ser 1555 1560 1565 gta aag gaa gac ctt gtc gcc tat ggt ggc tca tgg aag ttg gaa ggc 4870 Val Lys Glu Asp Leu Val Ala Tyr Gly Gly Ser Trp Lys Leu Glu Gly 1570 1575 1580 aga tgg gat gga gag gaa gag gtc cag ttg atc gcg gct gtt cca gga 4918 Arg Trp Asp Gly Glu Glu Glu Val Gln Leu Ile Ala Ala Val Pro Gly 1585 1590 1595 1600 aag aac gtg gtc aac gtc cag aca aaa ccg agc ttg ttc aaa gtg agg 4966 Lys Asn Val Val Asn Val Gln Thr Lys Pro Ser Leu Phe Lys Val Arg 1605 1610 1615 aat ggg gga gaa atc ggg gct gtc gct ctt gac tat ccg agt ggc act 5014 Asn Gly Gly Glu Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Thr 1620 1625 1630 tca gga tct cct att gtt aac agg aac gga gag gtg att ggg ctg tac 5062 Ser Gly Ser Pro Ile Val Asn Arg Asn Gly Glu Val Ile Gly Leu Tyr 1635 1640 1645 ggc aat ggc atc ctt gtc ggt gac aac tcc ttc gtg tcc gcc ata tcc 5110 Gly Asn Gly Ile Leu Val Gly Asp Asn Ser Phe Val Ser Ala Ile Ser 1650 1655 1660 cag act gag gtg aag gaa gaa gga aag gag gag ctc caa gag atc ccg 5158 Gln Thr Glu Val Lys Glu Glu Gly Lys Glu Glu Leu Gln Glu Ile Pro 1665 1670 1675 1680 aca atg cta aag aaa gga atg aca act gtc ctt gat ttt cat cct gga 5206 Thr Met Leu Lys Lys Gly Met Thr Thr Val Leu Asp Phe His Pro Gly 1685 1690 1695 gct ggg aag aca aga cgt ttc ctc cca cag atc ttg gcc gag tgc gca 5254 Ala Gly Lys Thr Arg Arg Phe Leu Pro Gln Ile Leu Ala Glu Cys Ala 1700 1705 1710 cgg aga cgc ttg cgc act ctt gtg ttg gcc ccc acc agg gtt gtt ctt 5302 Arg Arg Arg Leu Arg Thr Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Leu 1715 1720 1725 tct gaa atg aag gag gct ttt cac ggc ctg gac gtg aaa ttc cac aca 5350 Ser Glu Met Lys Glu Ala Phe His Gly Leu Asp Val Lys Phe His Thr 1730 1735 1740 cag gct ttt tcc gct cac ggc agc ggg aga gaa gtc att gat gcc atg 5398 Gln Ala Phe Ser Ala His Gly Ser Gly Arg Glu Val Ile Asp Ala Met 1745 1750 1755 1760 tgc cat gcc acc cta act tac agg atg ttg gaa cca act agg gtt gtt 5446 Cys His Ala Thr Leu Thr Tyr Arg Met Leu Glu Pro Thr Arg Val Val 1765 1770 1775 aac tgg gaa gtg atc att atg gat gaa gcc cat ttt ttg gat cca gcc 5494 Asn Trp Glu Val Ile Ile Met Asp Glu Ala His Phe Leu Asp Pro Ala 1780 1785 1790 agc ata gcc gct aga ggt tgg gca gcg cac aga gct agg gca aat gaa 5542 Ser Ile Ala Ala Arg Gly Trp Ala Ala His Arg Ala Arg Ala Asn Glu 1795 1800 1805 agt gca aca atc ttg atg aca gcc aca ccg cct ggg act agt gat gaa 5590 Ser Ala Thr Ile Leu Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Thr Ser Asp Glu 1810 1815 1820 ttt cca cat tca aat ggt gaa ata gaa gat gtt caa acg gac ata ccc 5638 Phe Pro His Ser Asn Gly Glu Ile Glu Asp Val Gln Thr Asp Ile Pro 1825 1830 1835 1840 agt gag ccc tgg aac aca ggg cat gac tgg atc ctg gct gac aaa agg 5686 Ser Glu Pro Trp Asn Thr Gly His Asp Trp Ile Leu Ala Asp Lys Arg 1845 1850 1855 ccc acg gca tgg ttc ctt cca tcc atc aga gct gca aat gtc atg gct 5734 Pro Thr Ala Trp Phe Leu Pro Ser Ile Arg Ala Ala Asn Val Met Ala 1860 1865 1870 gcc tct ttg cgt aag gct gga aag agt gtg gtg gtc ctg aac agg aaa 5782 Ala Ser Leu Arg Lys Ala Gly Lys Ser Val Val Val Leu Asn Arg Lys 1875 1880 1885 acc ttt gag aga gaa tac ccc acg ata aag cag aag aaa cct gac ttt 5830 Thr Phe Glu Arg Glu Tyr Pro Thr Ile Lys Gln Lys Lys Pro Asp Phe 1890 1895 1900 ata ttg gcc act gac ata gct gaa atg gga gcc aac ctt tgc gtg gag 5878 Ile Leu Ala Thr Asp Ile Ala Glu Met Gly Ala Asn Leu Cys Val Glu 1905 1910 1915 1920 cga gtg ctg gat tgc agg acg gct ttt aag cct gtg ctt gtg gat gaa 5926 Arg Val Leu Asp Cys Arg Thr Ala Phe Lys Pro Val Leu Val Asp Glu 1925 1930 1935 ggg agg aag gtg gca ata aaa ggg cca ctt cgt atc tcc gca tcc tct 5974 Gly Arg Lys Val Ala Ile Lys Gly Pro Leu Arg Ile Ser Ala Ser Ser 1940 1945 1950 gct gct caa agg agg ggg cgc att ggg aga aat ccc aac aga gat gga 6022 Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Asn Arg Asp Gly 1955 1960 1965 gac tca tac tac tat tct gag cct aca agt gaa aat aat gcc cac cac 6070 Asp Ser Tyr Tyr Tyr Ser Glu Pro Thr Ser Glu Asn Asn Ala His His 1970 1975 1980 gtc tgc tgg ttg gag gcc tca atg ctc ttg gac aac atg gag gtg agg 6118 Val Cys Trp Leu Glu Ala Ser Met Leu Leu Asp Asn Met Glu Val Arg 1985 1990 1995 2000 ggt gga atg gtc gcc cca ctc tat ggc gtt gaa gga act aaa aca cca 6166 Gly Gly Met Val Ala Pro Leu Tyr Gly Val Glu Gly Thr Lys Thr Pro 2005 2010 2015 gtt tcc cct ggt gaa atg aga ctg agg gat gac cag agg aaa gtc ttc 6214 Val Ser Pro Gly Glu Met Arg Leu Arg Asp Asp Gln Arg Lys Val Phe 2020 2025 2030 aga gaa cta gtg agg aat tgt gac ctg ccc gtt tgg ctt tcg tgg caa 6262 Arg Glu Leu Val Arg Asn Cys Asp Leu Pro Val Trp Leu Ser Trp Gln 2035 2040 2045 gtg gcc aag gct ggt ttg aag acg aat gat cgt aag tgg tgt ttt gaa 6310 Val Ala Lys Ala Gly Leu Lys Thr Asn Asp Arg Lys Trp Cys Phe Glu 2050 2055 2060 ggc cct gag gaa cat gag atc ttg aat gac agc ggt gaa aca gtg aag 6358 Gly Pro Glu Glu His Glu Ile Leu Asn Asp Ser Gly Glu Thr Val Lys 2065 2070 2075 2080 tgc agg gct cct gga gga gca aag aag cct ctg cgc cca agg tgg tgt 6406 Cys Arg Ala Pro Gly Gly Ala Lys Lys Pro Leu Arg Pro Arg Trp Cys 2085 2090 2095 gat gaa agg gtg tca tct gac cag agt gcg ctg tct gaa ttt att aag 6454 Asp Glu Arg Val Ser Ser Asp Gln Ser Ala Leu Ser Glu Phe Ile Lys 2100 2105 2110 ttt gct gaa ggt agg agg gga gct gct gaa gtg cta gtt gtg ctg agt 6502 Phe Ala Glu Gly Arg Arg Gly Ala Ala Glu Val Leu Val Val Leu Ser 2115 2120 2125 gaa ctc cct gat ttc ctg gct aaa aaa ggt gga gag gca atg gat acc 6550 Glu Leu Pro Asp Phe Leu Ala Lys Lys Gly Gly Glu Ala Met Asp Thr 2130 2135 2140 atc agt gtg ttc ctc cac tct gag gaa ggc tct agg gct tac cgc aat 6598 Ile Ser Val Phe Leu His Ser Glu Glu Gly Ser Arg Ala Tyr Arg Asn 2145 2150 2155 2160 gca cta tca atg atg cct gag gca atg aca ata gtc atg ctg ttt ata 6646 Ala Leu Ser Met Met Pro Glu Ala Met Thr Ile Val Met Leu Phe Ile 2165 2170 2175 ctg gct gga cta ctg aca tcg gga atg gtc atc ttt ttc atg tct ccc 6694 Leu Ala Gly Leu Leu Thr Ser Gly Met Val Ile Phe Phe Met Ser Pro 2180 2185 2190 aaa ggc atc agt aga atg tct atg gcg atg ggc aca atg gcc ggc tgt 6742 Lys Gly Ile Ser Arg Met Ser Met Ala Met Gly Thr Met Ala Gly Cys 2195 2200 2205 gga tat ctc atg ttc ctt gga ggc gtc aaa ccc act cac atc tcc tat 6790 Gly Tyr Leu Met Phe Leu Gly Gly Val Lys Pro Thr His Ile Ser Tyr 2210 2215 2220 gtc atg ctc ata ttc ttt gtc ctg atg gtg gtt gtg atc ccc gag cca 6838 Val Met Leu Ile Phe Phe Val Leu Met Val Val Val Ile Pro Glu Pro 2225 2230 2235 2240 ggg caa caa agg tcc atc caa gac aac caa gtg gca tac ctc att att 6886 Gly Gln Gln Arg Ser Ile Gln Asp Asn Gln Val Ala Tyr Leu Ile Ile 2245 2250 2255 ggc atc ctg acg ctg gtt tca gcg gtg gca gcc aac gag cta ggc atg 6934 Gly Ile Leu Thr Leu Val Ser Ala Val Ala Ala Asn Glu Leu Gly Met 2260 2265 2270 ctg gag aaa acc aaa gag gac ctc ttt ggg aag aag aac tta att cca 6982 Leu Glu Lys Thr Lys Glu Asp Leu Phe Gly Lys Lys Asn Leu Ile Pro 2275 2280 2285 tct agt gct tca ccc tgg agt tgg ccg gat ctt gac ctg aag cca gga 7030 Ser Ser Ala Ser Pro Trp Ser Trp Pro Asp Leu Asp Leu Lys Pro Gly 2290 2295 2300 gct gcc tgg aca gtg tac gtt ggc att gtt aca atg ctc tct cca atg 7078 Ala Ala Trp Thr Val Tyr Val Gly Ile Val Thr Met Leu Ser Pro Met 2305 2310 2315 2320 ttg cac cac tgg atc aaa gtc gaa tat ggc aac ctg tct ctg tct gga 7126 Leu His His Trp Ile Lys Val Glu Tyr Gly Asn Leu Ser Leu Ser Gly 2325 2330 2335 ata gcc cag tca gcc tca gtc ctt tct ttc atg gac aag ggg ata cca 7174 Ile Ala Gln Ser Ala Ser Val Leu Ser Phe Met Asp Lys Gly Ile Pro 2340 2345 2350 ttc atg aag atg aat atc tcg gtc ata atg ctg ctg gtc agt ggc tgg 7222 Phe Met Lys Met Asn Ile Ser Val Ile Met Leu Leu Val Ser Gly Trp 2355 2360 2365 aat tca ata aca gtg atg cct ctg ctc tgt ggc ata ggg tgc gcc atg 7270 Asn Ser Ile Thr Val Met Pro Leu Leu Cys Gly Ile Gly Cys Ala Met 2370 2375 2380 ctc cac tgg tct ctc att tta cct gga atc aaa gcg cag cag tca aag 7318 Leu His Trp Ser Leu Ile Leu Pro Gly Ile Lys Ala Gln Gln Ser Lys 2385 2390 2395 2400 ctt gca cag aga agg gtg ttc cat ggc gtt gcc aag aac cct gtg gtt 7366 Leu Ala Gln Arg Arg Val Phe His Gly Val Ala Lys Asn Pro Val Val 2405 2410 2415 gat ggg aat cca aca gtt gac att gag gaa gct cct gaa atg cct gcc 7414 Asp Gly Asn Pro Thr Val Asp Ile Glu Glu Ala Pro Glu Met Pro Ala 2420 2425 2430 ctt tat gag aag aaa ctg gct cta tat ctc ctt ctt gct ctc 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att gtg gag gtg gat cgt gat acg gca cgc agg cat 7798 Lys Arg Thr Asp Ile Val Glu Val Asp Arg Asp Thr Ala Arg Arg His 2545 2550 2555 2560 ttg gcc gaa ggg aag gtg gac acc ggg gtg gcg gtc tcc agg ggg acc 7846 Leu Ala Glu Gly Lys Val Asp Thr Gly Val Ala Val Ser Arg Gly Thr 2565 2570 2575 gca aag tta agg tgg ttc cat gag cgt ggc tat gtc aag ctg gaa ggt 7894 Ala Lys Leu Arg Trp Phe His Glu Arg Gly Tyr Val Lys Leu Glu Gly 2580 2585 2590 agg gtg att gac ctg ggg tgt ggc cgc gga ggc tgg tgt tac tac gct 7942 Arg Val Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Cys Tyr Tyr Ala 2595 2600 2605 gct gcg caa aag gaa gtg agt ggg gtc aaa gga ttt act ctt gga aga 7990 Ala Ala Gln Lys Glu Val Ser Gly Val Lys Gly Phe Thr Leu Gly Arg 2610 2615 2620 gac ggc cat gag aaa ccc atg aat gtg caa agt ctg gga tgg aac atc 8038 Asp Gly His Glu Lys Pro Met Asn Val Gln Ser Leu Gly Trp Asn Ile 2625 2630 2635 2640 atc acc ttc aag gac aaa act gat atc cac cgc cta gaa cca gtg aaa 8086 Ile Thr Phe Lys Asp Lys Thr Asp Ile His Arg Leu 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Arg Leu Leu Met Arg Arg Met Arg Arg Pro Thr Gly Lys Val 2755 2760 2765 acc ctg gag gct gac gtc atc ctc cca att ggg aca cgc agt gtt gag 8470 Thr Leu Glu Ala Asp Val Ile Leu Pro Ile Gly Thr Arg Ser Val Glu 2770 2775 2780 aca gac aag gga ccc ctg gac aaa gag gcc ata gaa gaa agg gtt gag 8518 Thr Asp Lys Gly Pro Leu Asp Lys Glu Ala Ile Glu Glu Arg Val Glu 2785 2790 2795 2800 agg ata aaa tct gag tac atg acc tct tgg ttt tat gac aat gac aac 8566 Arg Ile Lys Ser Glu Tyr Met Thr Ser Trp Phe Tyr Asp Asn Asp Asn 2805 2810 2815 ccc tac agg acc tgg cac tac tgt ggc tcc tat gtc aca aaa acc tcc 8614 Pro Tyr Arg Thr Trp His Tyr Cys Gly Ser Tyr Val Thr Lys Thr Ser 2820 2825 2830 gga agt gcg gcg agc atg gta aat ggt gtt att aaa att ctg aca tat 8662 Gly Ser Ala Ala Ser Met Val Asn Gly Val Ile Lys Ile Leu Thr Tyr 2835 2840 2845 cca tgg gac agg ata gag gag gtc aca aga atg gca atg act gac aca 8710 Pro Trp Asp Arg Ile Glu Glu Val Thr Arg Met Ala Met Thr Asp Thr 2850 2855 2860 acc cct ttt gga cag caa aga gtg ttt aaa gaa aaa gtt gac acc aga 8758 Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg 2865 2870 2875 2880 gca aag gat cca cca gcg gga act agg aag atc atg aaa gtt gtc aac 8806 Ala Lys Asp Pro Pro Ala Gly Thr Arg Lys Ile Met Lys Val Val Asn 2885 2890 2895 agg tgg ctg ttc cgc cac ctg gcc aga gaa aag aac ccc aga ctg tgc 8854 Arg Trp Leu Phe Arg His Leu Ala Arg Glu Lys Asn Pro Arg Leu Cys 2900 2905 2910 aca aag gaa gaa ttt att gca aaa gtc cga agt cat gca gcc att gga 8902 Thr Lys Glu Glu Phe Ile Ala Lys Val Arg Ser His Ala Ala Ile Gly 2915 2920 2925 gct tac ctg gaa gaa caa gaa cag tgg aag act gcc aat gag gct gtc 8950 Ala Tyr Leu Glu Glu Gln Glu Gln Trp Lys Thr Ala Asn Glu Ala Val 2930 2935 2940 caa gac cca aag ttc tgg gaa ctg gtg gat gaa gaa agg aag ctg cac 8998 Gln Asp Pro Lys Phe Trp Glu Leu Val Asp Glu Glu Arg Lys Leu His 2945 2950 2955 2960 caa caa ggc agg tgt cgg act tgt gtg tac aac atg atg ggg aaa aga 9046 Gln Gln Gly Arg Cys Arg Thr Cys Val Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg 2965 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Lys Lys Leu Ala Gln Ala Val Met Glu 3075 3080 3085 atg aca tac aag aac aaa gtg gtg aaa gtg ttg aga cca gcc cca gga 9430 Met Thr Tyr Lys Asn Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Pro Gly 3090 3095 3100 ggg aaa gcc tac atg gat gtc ata agt cga cga gac cag aga gga tcc 9478 Gly Lys Ala Tyr Met Asp Val Ile Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly Ser 3105 3110 3115 3120 ggg cag gta gtg act tat gct ctg aac acc atc acc aac ttg aaa gtc 9526 Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Ile Thr Asn Leu Lys Val 3125 3130 3135 caa ttg atc aga atg gca gaa gca gag atg gtg ata cat cac caa cat 9574 Gln Leu Ile Arg Met Ala Glu Ala Glu Met Val Ile His His Gln His 3140 3145 3150 gtt caa gat tgt gat gaa tca gtt ctg acc agg ctg gag gca tgg ctc 9622 Val Gln Asp Cys Asp Glu Ser Val Leu Thr Arg Leu Glu Ala Trp Leu 3155 3160 3165 act gag cac gga tgt gac aga ctg aag agg atg gcg gtg agt gga gac 9670 Thr Glu His Gly Cys Asp Arg Leu Lys Arg Met Ala Val Ser Gly Asp 3170 3175 3180 gac tgt gtg gtc cgg ccc atc gat gac agg ttc ggc ctg gcc ctg tcc 9718 Asp Cys Val Val Arg Pro Ile Asp Asp Arg Phe Gly Leu Ala Leu Ser 3185 3190 3195 3200 cat ctc aac gcc atg tcc aag gtt aga aag gac ata tct gaa tgg cag 9766 His Leu Asn Ala Met Ser Lys Val Arg Lys Asp Ile Ser Glu Trp Gln 3205 3210 3215 cca tca aaa ggg tgg aat gat tgg gag aat gtg ccc ttc tgt tcc cac 9814 Pro Ser Lys Gly Trp Asn Asp Trp Glu Asn Val Pro Phe Cys Ser His 3220 3225 3230 cac ttc cat gaa cta cag ctg aag gat ggc agg agg att gtg gtg cct 9862 His Phe His Glu Leu Gln Leu Lys Asp Gly Arg Arg Ile Val Val Pro 3235 3240 3245 tgc cga gaa cag gac gag ctc att ggg aga gga agg gtg tct cca gga 9910 Cys Arg Glu Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg Gly Arg Val Ser Pro Gly 3250 3255 3260 aac ggc tgg atg atc aag gaa aca gct tgc ctc agc aaa gcc tat gcc 9958 Asn Gly Trp Met Ile Lys Glu Thr Ala Cys Leu Ser Lys Ala Tyr Ala 3265 3270 3275 3280 aac atg tgg tca ctg atg tat ttt cac aaa agg gac atg agg cta ctg 10006 Asn Met Trp Ser Leu Met Tyr Phe His Lys Arg Asp Met Arg Leu Leu 3285 3290 3295 tca ttg gct gtt tcc tca gct gtt ccc acc tca tgg gtt cca caa gga 10054 Ser Leu Ala Val Ser Ser Ala Val Pro Thr Ser Trp Val Pro Gln Gly 3300 3305 3310 cgc aca aca tgg tcg att cat ggg aaa ggg gag tgg atg acc acg gaa 10102 Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu 3315 3320 3325 gac atg ctt gag gtg tgg aac aga gta tgg ata acc aac aac cca cac 10150 Asp Met Leu Glu Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Thr Asn Asn Pro His 3330 3335 3340 atg cag gac aag aca atg gtg aaa aaa tgg aga gat gtc cct tat cta 10198 Met Gln Asp Lys Thr Met Val Lys Lys Trp Arg Asp Val Pro Tyr Leu 3345 3350 3355 3360 acc aag aga caa gac aag ctg tgc gga tca ctg att gga atg acc aat 10246 Thr Lys Arg Gln Asp Lys Leu Cys Gly Ser Leu Ile Gly Met Thr Asn 3365 3370 3375 agg gcc acc tgg gcc tcc cac atc cat tta gtc atc cat cgt atc cga 10294 Arg Ala Thr Trp Ala Ser His Ile His Leu Val Ile His Arg Ile Arg 3380 3385 3390 acg ctg att gga cag gag aaa tac act gac tac cta aca gtc atg gac 10342 Thr Leu Ile Gly Gln Glu Lys Tyr Thr Asp Tyr Leu Thr Val Met Asp 3395 3400 3405 agg tat tct gtg gat gct gac ctg caa ctg ggt gag ctt atc tgaaac 10390 Arg Tyr Ser Val Asp Ala Asp Leu Gln Leu Gly Glu Leu Ile 3410 3415 3420 accatctaac aggaataacc gggatacaaa ccacgggtgg agaaccggac tccccacaac 10450 ctgaaaccgg gatataaacc acggctggag aaccggactc cgcacttaaa atgaaacaga 10510 aaccgggata aaaactacgg atggagaacc ggactccaca cattgagaca gaagaagttg 10570 tcagcccaga accccacacg agttttgcca ctgctaagct gtgaggcagt gcaggctggg 10630 acagccgacc tccaggttgc gaaaaacctg gtttctggga cctcccaccc cagagtaaaa 10690 agaacggagc ctccgctacc accctcccac gtggtggtag aaagacgggg tctagaggtt 10750 agaggagacc ctccagggaa caaatagtgg gaccatattg acgccaggga aagaccggag 10810 tggttctctg cttttcctcc agaggtctgt gagcacagtt tgctcaagaa taagcagacc 10870 tttggatgac aaacacaaaa ccacaa 10896 <210> 23 <211> 3422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 23 Met Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val 1 5 10 15 Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ile Lys Gln Lys Thr Lys 20 25 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agagaactga ccagaacatg 120 tctggtcgta aagctcaggg aaaaaccctg ggcgtcaata tggtacgacg aggagttcgc 180 tccttgtcaa acaaaataaa acaaaaaaca aaacaaattg gaaacagacc tggaccttca 240 agaggtgttc aaggatttat ctttttcttt ttgttcaaca ttttgactgg aaaaaagatc 300 acagcccacc taaagaggtt gtggaaaatg ctggacccaa gacaaggctt ggctgttcta 360 aggaaagtca agagagtggt ggccagtttg atgagaggat tgtcctcaag gaaacgccgt 420 tcccatgatg ttctgactgt gcaattccta attttgggaa tgctgttgat gacgggtgga 480 gttaccctct ctaacttcca agggaaggtg atgatgacgg taaatgctac tgacgtcaca 540 gatgtcatca cgattccaac agctgctgga aagaacctat gcattgtcag agcaatggat 600 gtgggataca tgtgcgatga tactatcact tatgaatgcc cagtgctgtc ggctggtaat 660 gatccagaag acatcgactg ttggtgcaca aagtcagcag tctacgtcag gtatggaaga 720 tgcaccaaga cacgccactc aagacgcagt cggaggtcac tgacagtgca gacacacgga 780 gaaagcactc tagcgaacaa gaagggggct tggatggaca gcaccaaggc cacaaggtat 840 ttggtaaaaa cagaatcatg gatcttgagg aaccctggat atgccctggt ggcagccgtc 900 attggttgga tgcttgggag caacaccatg cagagagttg tgtttgtcgt gctattgctt 960 ttggtggccc cagcttacag cttcaactgc cttggaatga gcaacagaga cttcttggaa 1020 ggagtgtctg gagcaacatg ggtggatttg gttctcgaag gcgacagctg cgtgactatc 1080 atgtctaagg acaagcctac catcgacgtc aagatgatga atatggaggc ggccaacctg 1140 gcagaggtcc gcagttattg ctatttggct accgtcagcg atctctccac caaagctgca 1200 tgcccgacca tgggagaagc tcacaatgac aaacgtgctg acccagcttt tgtgtgcaga 1260 caaggagtgg tggacagggg ctggggcaac ggctgcggat tttttggcaa aggatccatt 1320 gacacatgcg ccaaatttgc ctgctctacc aaggcaatag gaagaaccat cttgaaagag 1380 aatatcaagt acgaagtggc catttttgtc catggaccaa ctactgtgga gtcgcacgga 1440 aattactcca cacaggttgg agccactcag gccggccgat tcagcatcac tcctgctgcg 1500 ccttcataca cactaaagct tggagaatat ggagaggtga cagtggactg tgaaccacgg 1560 tcagggattg acaccaatgc atactacgtg atgactgttg gaacaaagac gttcttggtc 1620 catcgtgagt ggttcatgga cctcaacctc ccttggagca gtgctggaag tactgtgtgg 1680 aggaacagag agacgttaat ggagtttgag gaaccacacg ccacgaagca gtctgtgata 1740 gcattgggct cacaagaggg agctctgcat caagctttgg ctggagccat tcctgtggaa 1800 ttttcaagca acactgtcaa gttgacgtcg ggtcatttga agtgtagagt gaagatggaa 1860 aaattgcagt tgaagggaac aacctatggc gtctgttcaa aggctttcaa gtttcttagg 1920 actcccgtgg acaccggtca cggcactgtg gtgttggaat tgcagtacac tggcacggat 1980 ggaccttgca aagttcctat ctcgtcagtg gcttcattga acgacctaac gccagtgggc 2040 agattggtca ctgtcaaccc ttttgtttca gtggccacgg ccaacgctaa ggtcctgatt 2100 gaattggaac caccctttgg agactcatac atagtggtgg gcagaggaga acaacagatc 2160 aatcaccatt ggcacaagtc tggaagcagc attggcaaag cctttacaac caccctcaaa 2220 ggagcgcaga gactagccgc tctaggagac acagcttggg actttggatc agttggaggg 2280 gtgttcacta gtgttgggcg ggctgtccat caagtgttcg gaggagcatt ccgctcactg 2340 ttcggaggca tgtcctggat aacgcaagga ttgctggggg ctctcctgtt gtggatgggc 2400 atcaatgctc gtgataggtc catagctctc acgtttctcg cagttggagg agttctgctc 2460 ttcctctccg tgaacgtggg cgccgatcaa ggatgcgcca tcaactttgg caagagagag 2520 ctcaagtgcg gagatggtat cttcatattt agagactctg atgactggct gaacaagtac 2580 tcatactatc cagaagatcc tgtgaagctt gcatcaatag tgaaagcctc ttttgaagaa 2640 gggaagtgtg gcctaaattc agttgactcc cttgagcatg agatgtggag aagcagggca 2700 gatgagatca atgccatttt tgaggaaaac gaggtggaca tttctgttgt cgtgcaggat 2760 ccaaagaatg tttaccagag aggaactcat ccattttcca gaattcggga tggtctgcag 2820 tatggttgga agacttgggg taagaacctt gtgttctccc cagggaggaa gaatggaagc 2880 ttcatcatag atggaaagtc caggaaagaa tgcccgtttt caaaccgggt ctggaattct 2940 ttccagatag aggagtttgg gacgggagtg ttcaccacac gcgtgtacat ggacgcagtc 3000 tttgaataca ccatagactg cgatggatct atcttgggtg cagcggtgaa cggaaaaaag 3060 agtgcccatg gctctccaac attttggatg ggaagtcatg aagtaaatgg gacatggatg 3120 atccacacct tggaggcatt agattacaag gagtgtgagt ggccactgac acatacgatt 3180 ggaacatcag ttgaagagag tgaaatgttc atgccgagat caatcggagg cccagttagc 3240 tctcacaatc atatccctgg atacaaggtt cagacgaacg gaccttggat gcaggtacca 3300 ctagaagtga agagagaagc ttgcccaggg actagcgtga tcattgatgg caactgtgat 3360 ggacggggaa aatcaaccag atccaccacg gatagcggga aagttattcc tgaatggtgt 3420 tgccgctcct gcacaatgcc gcctgtgagc ttccatggta gtgatgggtg ttggtatccc 3480 atggaaatta ggccaaggaa aacgcatgaa agccatctgg tgcgctcctg ggttacagct 3540 ggagaaatac atgctgtccc ttttggtttg gtgagcatga tgatagcaat ggaagtggtc 3600 ctaaggaaaa gacagggacc aaagcaaatg ttggttggag gagtagtgct cttgggagca 3660 atgctggtcg ggcaagtaac tctccttgat ttgctgaaac tcacagtggc tgtgggattg 3720 catttccatg agatgaacaa tggaggagac gccatgtata tggcgttgat tgctgccttt 3780 tcaatcagac cagggctgct catcggcttt gggctcagga ccctatggag ccctcgggaa 3840 cgccttgtgc tgaccctagg agcagccatg gtggagattg ccttgggtgg cgtgatgggc 3900 ggcctgtgga agtatctaaa tgcagtttct ctctgcatcc tgacaataaa tgctgttgct 3960 tctaggaaag catcaaatac catcttgccc ctcatggctc tgttgacacc tgtcactatg 4020 gctgaggtga gacttgccgc aatgttcttt tgtgccatgg ttatcatagg ggtccttcac 4080 cagaatttca aggacacctc catgcagaag actatacctc tggtggccct cacactcaca 4140 tcttacctgg gcttgacaca accttttttg ggcctgtgtg catttctggc aacccgcata 4200 tttgggcgaa ggagtatccc agtgaatgag gcactcgcag cagctggtct agtgggagtg 4260 ctggcaggac tggcttttca ggagatggag aacttccttg gtccgattgc agttggagga 4320 ctcctgatga tgctggttag cgtggctggg agggtggatg ggctagagct caagaagctt 4380 ggtgaagttt catgggaaga ggaggcggag atcagcggga gttccgcccg ctatgatgtg 4440 gcactcagtg aacaagggga gttcaagctg ctttctgaag agaaagtgcc atgggaccag 4500 gttgtgatga cctcgctggc cttggttggg gctgccctcc atccatttgc tcttctgctg 4560 gtccttgctg ggtggctgtt tcatgtcagg ggagctagga gaagtgggga tgtcttgtgg 4620 gatattccca ctcctaagat catcgaggaa tgtgaacatc tggaggatgg gatttatggc 4680 atattccagt caaccttctt gggggcctcc cagcgaggag tgggagtggc acagggaggg 4740 gtgttccaca caatgtggca tgtcacaaga ggagctttcc ttgtcaggaa tggcaagaag 4800 ttgattccat cttgggcttc agtaaaggaa gaccttgtcg cctatggtgg ctcatggaag 4860 ttggaaggca gatgggatgg agaggaagag gtccagttga tcgcggctgt tccaggaaag 4920 aacgtggtca acgtccagac aaaaccgagc ttgttcaaag tgaggaatgg gggagaaatc 4980 ggggctgtcg ctcttgacta tccgagtggc acttcaggat ctcctattgt taacaggaac 5040 ggagaggtga ttgggctgta cggcaatggc atccttgtcg gtgacaactc cttcgtgtcc 5100 gccatatccc agactgaggt gaaggaagaa ggaaaggagg agctccaaga gatcccgaca 5160 atgctaaaga aaggaatgac aactgtcctt gattttcatc ctggagctgg gaagacaaga 5220 cgtttcctcc cacagatctt ggccgagtgc gcacggagac gcttgcgcac tcttgtgttg 5280 gcccccacca gggttgttct ttctgaaatg aaggaggctt ttcacggcct ggacgtgaaa 5340 ttccacacac aggctttttc cgctcacggc agcgggagag aagtcattga tgccatgtgc 5400 catgccaccc taacttacag gatgttggaa ccaactaggg ttgttaactg ggaagtgatc 5460 attatggatg aagcccattt tttggatcca gccagcatag ccgctagagg ttgggcagcg 5520 cacagagcta gggcaaatga aagtgcaaca atcttgatga cagccacacc gcctgggact 5580 agtgatgaat ttccacattc aaatggtgaa atagaagatg ttcaaacgga catacccagt 5640 gagccctgga acacagggca tgactggatc ctggctgaca aaaggcccac ggcatggttc 5700 cttccatcca tcagagctgc aaatgtcatg gctgcctctt tgcgtaaggc tggaaagagt 5760 gtggtggtcc tgaacaggaa aacctttgag agagaatacc ccacgataaa gcagaagaaa 5820 cctgacttta tattggccac tgacatagct gaaatgggag ccaacctttg cgtggagcga 5880 gtgctggatt gcaggacggc ttttaagcct gtgcttgtgg atgaagggag gaaggtggca 5940 ataaaagggc cacttcgtat ctccgcatcc tctgctgctc aaaggagggg gcgcattggg 6000 agaaatccca acagagatgg agactcatac tactattctg agcctacaag tgaaaataat 6060 gcccaccacg tctgctggtt ggaggcctca atgctcttgg acaacatgga ggtgaggggt 6120 ggaatggtcg ccccactcta tggcgttgaa ggaactaaaa caccagtttc ccctggtgaa 6180 atgagactga gggatgacca gaggaaagtc ttcagagaac tagtgaggaa ttgtgacctg 6240 cccgtttggc tttcgtggca agtggccaag gctggtttga agacgaatga tcgtaagtgg 6300 tgttttgaag gccctgagga acatgagatc ttgaatgaca gcggtgaaac agtgaagtgc 6360 agggctcctg gaggagcaaa gaagcctctg cgcccaaggt ggtgtgatga aagggtgtca 6420 tctgaccaga gtgcgctgtc tgaatttatt aagtttgctg aaggtaggag gggagctgct 6480 gaagtgctag ttgtgctgag tgaactccct gatttcctgg ctaaaaaagg tggagaggca 6540 atggatacca tcagtgtgtt cctccactct gaggaaggct ctagggctta ccgcaatgca 6600 ctatcaatga tgcctgaggc aatgacaata gtcatgctgt ttatactggc tggactactg 6660 acatcgggaa tggtcatctt tttcatgtct cccaaaggca tcagtagaat gtctatggcg 6720 atgggcacaa tggccggctg tggatatctc atgttccttg gaggcgtcaa acccactcac 6780 atctcctatg tcatgctcat attctttgtc ctgatggtgg ttgtgatccc cgagccaggg 6840 caacaaaggt ccatccaaga caaccaagtg gcatacctca ttattggcat cctgacgctg 6900 gtttcagcgg tggcagccaa cgagctaggc atgctggaga aaaccaaaga ggacctcttt 6960 gggaagaaga acttaattcc atctagtgct tcaccctgga gttggccgga tcttgacctg 7020 aagccaggag ctgcctggac agtgtacgtt ggcattgtta caatgctctc tccaatgttg 7080 caccactgga tcaaagtcga atatggcaac ctgtctctgt ctggaatagc ccagtcagcc 7140 tcagtccttt ctttcatgga caaggggata ccattcatga agatgaatat ctcggtcata 7200 atgctgctgg tcagtggctg gaattcaata acagtgatgc ctctgctctg tggcataggg 7260 tgcgccatgc tccactggtc tctcatttta cctggaatca aagcgcagca gtcaaagctt 7320 gcacagagaa gggtgttcca tggcgttgcc aagaaccctg tggttgatgg gaatccaaca 7380 gttgacattg aggaagctcc tgaaatgcct gccctttatg agaagaaact ggctctatat 7440 ctccttcttg ctctcagcct agcttctgtt gccatgtgca gaacgccctt ttcattggct 7500 gaaggcattg tcctagcatc agctgcctta gggccgctca tagagggaaa caccagcctt 7560 ctttggaatg gacccatggc tgtctccatg acaggagtca tgagggggaa tcactatgct 7620 tttgtgggag tcatgtacaa tctatggaag atgaaaactg gacgccgggg gagcgcgaat 7680 ggaaaaactt tgggtgaagt ctggaagagg gaactgaatc tgttggacaa gcgacagttt 7740 gagttgtata aaaggaccga cattgtggag gtggatcgtg atacggcacg caggcatttg 7800 gccgaaggga aggtggacac cggggtggcg gtctccaggg ggaccgcaaa gttaaggtgg 7860 ttccatgagc gtggctatgt caagctggaa ggtagggtga ttgacctggg gtgtggccgc 7920 ggaggctggt gttactacgc tgctgcgcaa aaggaagtga gtggggtcaa aggatttact 7980 cttggaagag acggccatga gaaacccatg aatgtgcaaa gtctgggatg gaacatcatc 8040 accttcaagg acaaaactga tatccaccgc ctagaaccag tgaaatgtga cacccttttg 8100 tgtgacattg gagagtcatc atcgtcatcg gtcacagagg gggaaaggac cgtgagagtt 8160 cttgatactg tagaaaaatg gctggcttgt ggggttgaca acttctgtgt gaaggtgtta 8220 gctccataca tgccagatgt tcttgagaaa ctggaattgc tccaaaggag gtttggcgga 8280 acagtgatca ggaaccctct ctccaggaat tccactcatg aaatgtacta cgtgtctgga 8340 gcccgcagca atgtcacatt tactgtgaac caaacatccc gcctcctgat gaggagaatg 8400 aggcgtccaa ctggaaaagt gaccctggag gctgacgtca tcctcccaat tgggacacgc 8460 agtgttgaga cagacaaggg acccctggac aaagaggcca tagaagaaag ggttgagagg 8520 ataaaatctg agtacatgac ctcttggttt tatgacaatg acaaccccta caggacctgg 8580 cactactgtg gctcctatgt cacaaaaacc tccggaagtg cggcgagcat ggtaaatggt 8640 gttattaaaa ttctgacata tccatgggac aggatagagg aggtcacaag aatggcaatg 8700 actgacacaa ccccttttgg acagcaaaga gtgtttaaag aaaaagttga caccagagca 8760 aaggatccac cagcgggaac taggaagatc atgaaagttg tcaacaggtg gctgttccgc 8820 cacctggcca gagaaaagaa ccccagactg tgcacaaagg aagaatttat tgcaaaagtc 8880 cgaagtcatg cagccattgg agcttacctg gaagaacaag aacagtggaa gactgccaat 8940 gaggctgtcc aagacccaaa gttctgggaa ctggtggatg aagaaaggaa gctgcaccaa 9000 caaggcaggt gtcggacttg tgtgtacaac atgatgggga aaagagagaa gaagctgtca 9060 gagtttggga aagcaaaggg aagccgtgcc atatggtata tgtggctggg agcgcggtat 9120 cttgagtttg aggccctggg attcctgaat gaggaccatt gggcttccag ggaaaactca 9180 ggaggaggag tggaaggcat tggcttacaa tacctaggat atgtgatcag agacctggct 9240 gcaatggatg gtggtggatt ctacgcggat gacaccgctg gatgggacac gcgcatcaca 9300 gaggcagacc ttgatgatga acaggagatc ttgaactaca tgagcccaca tcacaaaaaa 9360 ctggcacaag cagtgatgga aatgacatac aagaacaaag tggtgaaagt gttgagacca 9420 gccccaggag ggaaagccta catggatgtc ataagtcgac gagaccagag aggatccggg 9480 caggtagtga cttatgctct gaacaccatc accaacttga aagtccaatt gatcagaatg 9540 gcagaagcag agatggtgat acatcaccaa catgttcaag attgtgatga atcagttctg 9600 accaggctgg aggcatggct cactgagcac ggatgtgaca gactgaagag gatggcggtg 9660 agtggagacg actgtgtggt ccggcccatc gatgacaggt tcggcctggc cctgtcccat 9720 ctcaacgcca tgtccaaggt tagaaaggac atatctgaat ggcagccatc aaaagggtgg 9780 aatgattggg agaatgtgcc cttctgttcc caccacttcc atgaactaca gctgaaggat 9840 ggcaggagga ttgtggtgcc ttgccgagaa caggacgagc tcattgggag aggaagggtg 9900 tctccaggaa acggctggat gatcaaggaa acagcttgcc tcagcaaagc ctatgccaac 9960 atgtggtcac tgatgtattt tcacaaaagg gacatgaggc tactgtcatt ggctgtttcc 10020 tcagctgttc ccacctcatg ggttccacaa ggacgcacaa catggtcgat tcatgggaaa 10080 ggggagtgga tgaccacgga agacatgctt gaggtgtgga acagagtatg gataaccaac 10140 aacccacaca tgcaggacaa gacaatggtg aaaaaatgga gagatgtccc ttatctaacc 10200 aagagacaag acaagctgtg cggatcactg attggaatg 10239 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> West Nile virus <400> 25 Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> West Nile virus <400> 26 Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> West Nile virus <400> 27 Val Val Pro Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 75 <212> PRT <213> West Nile virus <400> 28 Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr Leu Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Val Lys Thr 20 25 30 Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Leu Val Ala Ala Val 35 40 45 Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln Arg Val Val Phe Val 50 55 60 Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser 65 70 75 <210> 29 <211> 74 <212> PRT <213> West Nile virus <400> 29 Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr Leu Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Val Lys Thr 20 25 30 Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Leu Val Ala Ala Val 35 40 45 Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln Arg Val Val Phe Val 50 55 60 Val Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser 65 70 <210> 30 <211> 75 <212> PRT <213> West Nile virus <400> 30 Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr Leu Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Val Lys Thr 20 25 30 Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Leu Val Ala Ala Val 35 40 45 Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln Arg Val Val Phe Val 50 55 60 Val Pro Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser 65 70 75 <210> 31 <211> 377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Yellow Fever virus <400> 31 taaaaactac ggatggagaa ccggactcca cacattgaga cagaagaagt tgtcagccca 60 gaaccccaca cgagttttgc cactgctaag ctgtgaggca gtgcaggctg ggacagccga 120 cctccaggtt gcgataaacc tggtttctgg gacctcccac cccagagtaa aaagaacgga 180 gcctccgcta ccaccttccc acgtggtggt agaaagacgg ggtctagagg ttagaggaga 240 ccctccaggg aacaaatagt gggaccatat tgacgccagg gaaagaccgg agtggttctc 300 tgcttttcct ccagaggtct gtgagcacag tttgctcaag aataagcaga cctttggatg 360 acaaacacaa aaccact 377 <210> 32 <211> 343 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Yellow Fever virus <400> 32 uugagacaga agaaguuguc agcccagaac cccacacgag uuuugccacu gcuaagcugu 60 gaggcagugc aggcugggac agccgaccuc cagguugcga aaaaccuggu uucugggacc 120 ucccacccca gaguaaaaag aacggagccu ccgcuaccac ccucccacgu ggugguagaa 180 agacgggguc uagagguuag aggagacccu ccagggaaca aauaguggga ccauauugac 240 gccagggaaa gaccggagug guucucugcu uuuccuccag aggucuguga gcacaguuug 300 cucaagaaua agcagaccuu uggaugacaa acacaaaacc acu 343 <210> 33 <211> 338 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Yellow Fever virus <400> 33 uugagacaga agaaguuguc agcccagaac cccacacgag uuuugccacu gcuaagcugu 60 gaggcagugc aggcugggac agccgaccuc cagguugcga aaaaccuggu uucugggacc 120 ucccaccgua aaaagaaggg agccucggcu accacccucc cacguggugg uagaaagacg 180 gggucuagag guuagaggag acccuccagg gaacaaauag ugggaccaua uugaggccag 240 ggaaagaccg gagugguucu cugcuuuucc uccagagguc ugugagcaca guuugcucaa 300 gaauaagcag accuuuggau gacaaacaga aaaccacu 338 <210> 34 <211> 116 <212> PRT <213> Tick-borne Encephalitis virus <400> 34 Met Val Lys Lys Ala Ile Leu Lys Gly Lys Gly Gly Gly Pro Pro Arg 1 5 10 15 Arg Val Ser Lys Glu Thr Ala Thr Lys Thr Arg Gln Pro Arg Val Gln 20 25 30 Met Pro Asn Gly Leu Val Leu Met Arg Met Met Gly Ile Leu Trp His 35 40 45 Ala Val Ala Gly Thr Ala Arg Asn Pro Val Leu Lys Ala Phe Trp Asn 50 55 60 Ser Val Pro Leu Lys Gln Ala Thr Ala Ala Leu Arg Lys Ile Lys Arg 65 70 75 80 Thr Val Ser Ala Leu Met Val Gly Leu Gln Lys Arg Gly Lys Arg Arg 85 90 95 Ser Ala Thr Asp Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Ile Thr Leu Leu Gly 100 105 110 Met Thr Leu Ala 115 <210> 35 <211> 121 <212> PRT <213> Yellow Fever virus <400> 35 Met Ser Gly Arg Lys Ala Gln Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Met Val 1 5 10 15 Arg Arg Gly Val Arg Ser Leu Ser Asn Lys Ile Lys Gln Lys Thr Lys 20 25 30 Gln Ile Gly Asn Arg Pro Gly Pro Ser Arg Gly Val Gln Gly Phe Ile 35 40 45 Phe Phe Phe Leu Phe Asn Ile Leu Thr Gly Lys Lys Ile Thr Ala His 50 55 60 Leu Lys Arg Leu Trp Lys Met Leu Asp Pro Arg Gln Gly Leu Ala Val 65 70 75 80 Leu Arg Lys Val Lys Arg Val Val Ala Ser Leu Met Arg Gly Leu Ser 85 90 95 Ser Arg Lys Arg Arg Ser His Asp Val Leu Thr Val Gln Phe Leu Ile 100 105 110 Leu Gly Met Leu Leu Met Thr Gly Gly 115 120 <210> 36 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from West Nile virus <400> 36 Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr Leu Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Val Lys Thr 20 25 30 Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Leu Val Ala Ala Val 35 40 45 Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln Arg Val Val Phe Val 50 55 60 Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser 65 70 75 <210> 37 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from Japanese encephalitis virus <400> 37 Ser Val Ser Val Gln Thr His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys 1 5 10 15 Glu Ala Trp Leu Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr 20 25 30 Glu Asn Trp Ile Ile Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Leu Ala Ala Val 35 40 45 Leu Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Asn Gly Gln Arg Val Val Phe Thr 50 55 60 Ile Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser 65 70 75

Claims

하나 이상의 구조 단백질이 제 2 플라비바이러스의 하나 이상의 구조 단백질로 대체된 제 1 플라비바이러스를 포함하고, 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane domain)이 돌연변이를 포함하는 키메라 플라비바이러스 (chimeric flavivirus)에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 일본 뇌염 SA14-14-2 바이러스 막 단백질의 아미노산 위치 60에서 아르기닌 (arginine)에서 시스테인 (cysteine)으로의 치환을 가져오는 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제 1항에 있어서, 상기 돌연변이는 플라비바이러스를 약독화하는 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제 2항에 있어서, 상기 돌연변이는 플라비바이러스의 내장기관친화성 또는 바이러스혈증을 감소시키는 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제 1항에 있어서, 상기 돌연변이는 돌연변이가 없는 대응하는 키메라 플라비바이러스와 비교하여, 키메라 플라비바이러스의 증가된 유전적 안정성을 가져오는 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제 1항에 있어서, 상기 돌연변이는 돌연변이가 없는 대응하는 키메라 플라비바이러스와 비교하여 세포에서 증가된 바이러스 증식을 가져오는 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
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제 1항에 있어서, 상기 제 1 플라비바이러스의 막 및 엔벨로프 단백질이 제 2 플라비바이러스의 막 및 엔벨로프 단백질로 대체된 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제 1항에 있어서, 상기 제 1 플라비바이러스는 황열병 바이러스 (yellow fever virus)인 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제 8항에 있어서, 상기 황열병 바이러스는 YF-17D인 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
제 1항에 있어서, 상기 제 2 플라비바이러스는 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus)인 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
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제 10항에 있어서, 상기 일본 뇌염 바이러스는 SA14-14-2 바이러스인 것을 특징으로 하는 키메라 플라비바이러스.
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제 1항 내지 제 5항, 제 7항 내지 제 10항, 및 제 14항중 어느 한 항의 키메라 플라비바이러스와 약제학적으로 수용가능한 담체 (carrier) 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물.
제 33항에 있어서, 환자에 투여시 환자에서 플라비바이러스에 대한 면역반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 34항에 있어서, 상기 환자는 플라비바이러스에 의해 감염되지는 않지만, 발전할 위험에 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 34항에 있어서, 상기 환자는 플라비바이러스에 의해 감염된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
키메라 플라비바이러스의 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인에 돌연변이를 도입하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 5항, 제 7항 내지 제 10항, 및 제 14항중 어느 한 항의 키메라 플라비바이러스를 포함하는 백신을 생산하는 방법.
제 37항에 있어서, 상기 돌연변이는 돌연변이가 없는 대응하는 키메라 플라비바이러스와 비교하여, 키메라 플라비바이러스를 약독화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, 상기 돌연변이는 돌연변이가 없는 대응하는 키메라 플라비바이러스와 비교하여, 키메라 플라비바이러스의 증가된 유전적 안정성을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, 상기 돌연변이는 돌연변이가 없는 대응하는 키메라 플라비바이러스와 비교하여, 키메라 플라비바이러스의 증가된 증식을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, 상기 제 1 플라비바이러스의 막 및 엔벨로프 단백질이 제 2 플라비바이러스의 막 및 엔벨로프 단백질로 대체된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항, 제 7항 내지 제 10항, 및 제 14항중 어느 한 항의 키메라 플라비바이러스 게놈 또는 그 상보체에 대응하는 핵산 분자.
키메라 플라비바이러스의 게놈에 대응하는 핵산 분자를 세포에 도입하는 단계 및 상기 세포에서 생산된 키메라 플라비바이러스를 상기 세포 또는 그것의 상청액으로부터 분리하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 5항, 제 7항 내지 제 10항, 및 제 14항중 어느 한 항의 키메라 플라비바이러스를 제조하는 방법.
제 43항에 있어서, 상기 세포는 베로세포 (Vero cells)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, 상기 세포는 무혈청 배지에서 배양된 것을 특징으로 하는 방법.