JP3531934B2 - キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス - Google Patents

キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、組換え活性キメラフラビウイルスに関し、
さらに、デング熱ウイルスと、ダニ媒介脳炎ウイルス
（TBEV）を含むその他のフラビウイルスに対するワクチ
ンに関する。本発明は、さらに、組換え４型デング熱ウ
イルスの生成を導くようにRNA転写物をコードするcDNA
配列と、組換え突然変異４型デング熱ウイルスキメラデ
ング熱ウイルスと、組換えDNA断片を作製して突然変異
を組み込んだキメラデング熱ウイルスと、それらを用い
て形質転換した細胞に関する。
背景技術 フラビウイルス科（Flaviviridae）には、約60個の包
被正鎖RNAウイルスが含まれ、その大半は昆虫により媒
介される。この科に属する多数のウイルスは、世界各地
で重大な公衆衛生上の問題を起こしている（T.P.Monath
（1986）「トガウイルス科（Togaviridae）およびフラ
ビウイルス科」S.Schlesinger他編、375〜440頁、プレ
ナム・プレス社、ニューヨーク）。これまでに配列決定
されたすべてのフラビウイルスのゲノムは、同一の遺伝
子順序を有している。すなわち、5'−Ｃ−preM−Ｅ−NS
1−NS2A−NS2B−NS3−NS4A−NS4B−NS5−3'であり、最
初の３つの遺伝子は、構造タンパク質であるカプシド
（Ｃ）と、プレメンブレンタンパク質（preM）と、エン
ベロープタンパク質（Ｅ）をコードしている。
デング熱は、蚊媒介ウイルス性疾病であり、世界各地
の熱帯および亜熱帯地域で発生する。デング熱ウイルス
亜群［subgroup］は、フラビウイルス科の他のウイルス
のどれよりもヒト疾病を起こす。デング熱は、発熱、発
疹、激しい頭痛、関節痛を特徴としている。その死亡率
は低い。しかしながら、過去数十年間にわたり、出血お
よびショックを特徴とする、より重症のデング熱（デン
グ出血熱／デング熱ショック症候群;DHF/DSS）が、子供
および若者に増加している。DHF/DSSは、ある血清型［s
erotype］のデング熱ウイルスにすでに感染した者が別
のデング熱ウイルスに感染した際に、もっとも頻繁に発
生する。このことは、ウイルス複製の免疫強化が、より
重症の疾病の病因においてある役割を果たしていること
を示唆している（S.B.Halstead（1988）サイエンス第23
9巻476〜481頁）。
デング熱伝染は、媒介となる蚊種が豊富な熱帯および
亜熱帯の多くの地域において、大きな公衆衛生問題とな
っている。40年間もの熱心な研究にもかかわらず、デン
グ熱ウイルス疾病のための安全で有効なワクチンはでき
ていない。デング熱ウイルスは、WHOにより、研究促進
およびワクチン開発の高優先度目標として指定された。
デング熱ウイルスは、1944年における単離の後まもな
く、マウスの脳において繰り返し継代培養［passage］
され、その結果、マウス神経毒性［neurovirulent］突
然変異体が選抜された（A.B.Sabin（1952）Amer.J.Tro
p.Med.Hyg.第１巻30〜50頁）。興味深いことに、被験希
望者において実施された研究により、１型または２型デ
ング熱ウイルスの３つの株のマウス脳適合神経毒性突然
変異体は弱毒化されてはいるが、なお、ヒトについて免
疫原性をもつことが示された（A.B.Sabin（1952）Amer.
J.Trop.Med.Hyg.第１巻30〜50頁、A.B.Sabin（1955）Am
er.J.Trop.Med.Hyg.第４巻198〜207頁、A.B.Sabin（195
5）Amer.J.Trop.Med.Hyg.第４巻198〜207頁、R.W.Schle
singer他（1956）J.Immunol.第77巻352〜364頁、C.L.Wi
sseman他（1963）Amer.J.Trop.Med.第12巻620〜623
頁）。しかしながら、これらの突然変異体は、ワクチン
株候補としてはそれ以上開発されなかった。これは、ワ
クチン製剤中のマウス脳抗原に対する懸念の故である。
このとき以来、（ｉ）小型プラーク（溶菌斑）表現型を
示した、および／または（ii）温度感受性であった、お
よび／または（iii）人工的な宿主から由来する細胞培
養に適合した（すなわち宿主域突然変異）ウイルス突然
変異が、弱毒化生菌ウイルスワクチンに包含させるため
の候補として選抜され評価されてきた（V.R.Harrison他
（1977）Infec.Immun.第18巻151〜156頁;C.H.Hoke他（1
990）Am.J.Trop.Med.Hyg.第43巻219〜226頁;N.Bhamarap
ravati他（1987）Bull.WHO第65巻189〜195頁）。しかし
ながら、25年間のこのような努力にもかかわらず、安全
で効果的なデング熱ワクチンは、一般用としてはまだ得
られていない。不活化全デング熱ウイルスワクチンは、
免疫原性が不十分であることが証明されている。細胞培
養において連続継代培養により弱毒化された生菌ウイル
スワクチンは、弱毒化による遺伝子的不安定性や免疫原
性の欠乏という難点がある。本発明は、キメラデング熱
ウイルスおよびキメラフラビウイルスワクチンを提供す
ることにより、技術的発展をもたらすものである。
４つの血清型のデング熱ウイルス（１型〜４型）は、
血清型特異的モノクローナル抗体を用いたプラーク減縮
中和法により、および、ポリクローナル血清を用いたや
や特異性の低い試験により区別することができる（W.M.
Bankcroft他（1979）Pan Am.Hlth.Org.Sci.Publ.第375
巻175〜178頁;E.A.Henchal他（1982）Am.J.Trop.Med.Hy
g.第31巻548〜555頁）。血清型の存在は、ヒト被験希望
者における初期の研究において最初に発見され、１つの
血清型のデング熱に感染すると耐久性のある同型免疫が
誘導されるものの異型免疫は３〜５ケ月しか持続しない
ことが証明された（A.B.Sabin（1952）Amer.J.Trop.Me
d.Hyg.第１巻30〜50頁）。デング熱ウイルス一般に対し
て広範囲の免疫を誘導するために４つの血清型すべてを
含む効果的なデング熱ワクチンがあれば、DHF/DSSの発
生を妨害することができるだろう。
３型および４型デング熱ウイルスおよびマウス神経毒
性ニューギニアＣ型を含む２型ウイルスの数株について
は、完全なヌクレオチド配列が決定されている。しかし
ながら、１型ウイルスゲノムについては、5'部分だけが
配列決定されているにすぎない（E.Mackow他（1987）Vi
rology第159巻217〜228頁;B.Zhao他（1986）Virology第
155巻77〜88頁;K.OsatomiおよびH.Sumiyoshi（1990）Vi
rology第176巻643〜647頁;A.Irie他（1989）Gene第75巻
197〜211頁;P.W.Mason他（1987）Virology第161巻262〜
267頁;Y.S.Hahn他（1988）Virology第162巻167〜180
頁）。これらの研究の成果は、デング熱ウイルスの４つ
の血清型が共通のゲノム構成をもつことを示している。
４型デング熱のカリブ株814669のゲノムは10646個のヌ
クレオチドを含むことがわかっている（E.Mackow他（19
87）Virology第159巻217〜228頁;B.Zhao他（1986）Viro
logy第155巻77〜88頁）。5'末端における最初の101個の
ヌクレオチドおよび3'末端における最後の384個はコー
ドしていない。残りの配列は、3386個のアミノ酸ポリタ
ンパク質をコードしており、これには、３つの構造タン
パク質、すなわち、カプシド（Ｃ）、プレメンブレン
（pre−Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）がそのＮ末端に含ま
れ、７個の非構造タンパク質が上述した順序で続いてい
る。これは、これまでに識別されたすべてのフラビウイ
ルスゲノムに共通している。ポリタンパク質は、細胞信
号ペプチダーゼにより、および、ウイルスプロテアーゼ
により、11個以上のウイルスタンパク質を生じるように
プロセス（L.Markoff（1989）J.Virol.第63巻3345〜335
2頁;B.Falgout他（1989）J.Virol.第63巻1852〜1860頁;
B.Falgout他（1991）J.Virol.第65巻2467〜2476頁;H.Ho
riおよびC.J.Lai（1990）J.Virol.第64巻4573〜4577
頁）。
我々はすでに、感染性RNAの転写のための鋳型として
用いることのできる完全長デング熱ウイルスcDNAを構築
した。我々は、決定的にクローンされた完全長デング熱
ウイルスcDNAを得、DNA鋳型から派生した（インビト
ロ）試験管内RNA転写物が培養中の細胞に対して感染性
をもつことがわかった。しかしながら、この感染性構築
物と、そこから生成された感染性RNA転写物は病原性で
ある。さらに、これまでに生成された弱毒化デング熱ウ
イルスは遺伝学的に不安定で、時間がたつと病原性形態
に逆戻りする可能性を有している。それでも、弱毒化ウ
イルスは望ましい。その理由は、弱毒化ウイルスにより
長期間持続する免疫が得られることが一般に知られてい
るからである。したがって、この構築物またはキメラ構
築物を病原性の低いウイルスの産生を導くように改変す
れば、弱毒化フラビウイルスワクチン技術において相当
の進歩となるだろう。したがって、我々は、ここに開示
するとおり、cDNAの3'非コード領域において一連の欠失
を構築し、活性デング熱ウイルス突然変異体を回収して
増殖特性を分析した。
フラビウイルス科のその他のウイルスもやはり病原性
である。その例としては、ダニ媒介脳炎ウイルスおよび
日本脳炎ウイルスがあげられる。弱毒化デング熱ウイル
スワクチンのように、弱毒化ダニ媒介脳炎ウイルス（TB
EV）ウイルスは、遺伝学的に不安定で免疫性に乏しい傾
向があった。したがって、他の弱毒化フラビウイルスワ
クチンも、技術におけるかなりの前進となるであろう。
すなわち、本発明は、さらに、他のフラビウイルスに対
するワクチン製造のための遺伝子操作およびキメラウイ
ルス開発のフレームワークとして、デング熱ウイルスや
別のフラビウイルスの改変完全長組換えcDNA構築物を採
用する。
ダニ媒介脳炎ウイルス（TBEV）は、ダニによってのみ
媒介され、血清学的に区別できる２つのサブタイプに分
類される。ロシアのシベリア地方と極東地方に優勢な東
部サブタイプ（プロトタイプ株Sofjin）と、ヨーロッパ
東部および中央部に見られる西部サブタイプ（プロトタ
イプ株Neudorfl）である。TBEVは、死亡率が１〜30％の
重い脳炎を引き起こす。TBEVの詳細についてはCalisher
他（J.Gen.Virol.第70巻37〜43頁）を参照されたい。現
在、TBEVのホルマリン不活化により製造された試験的TB
Eワクチンが入手できるが、このワクチンはいくつかの
制約を有している。たとえば、このワクチンの免疫原性
は十分ではないため、防御免疫反応を生じさせるために
は繰返し接種が必要である。ワクチンに対する抗体反応
があった場合でも、このワクチンは、個体群の20％にお
いて、ウイルスに対する防御反応を提供することができ
ない。したがって、より改良されたTBEVワクチンが必要
とされている。
発明の概要 一態様において、本発明は、少なくとも２つのフラビ
ウイルスから由来した核酸を含む、組換えDNA構築物を
提供する。この構築物は、ダニ媒介脳炎ウイルス（TBE
V）からの２つ以下の構造タンパク質を作動可能（opera
bly）にコード化する核酸領域を含む。この領域は、TBE
V以外のフラビウイルスからの構造タンパク質を作動可
能にコード化する核酸領域に結合する。好ましくは、こ
の構築物は、ダニ媒介脳炎ウイルスからの２つ以下の構
造タンパク質を作動可能にコード化する核酸領域に結合
する、フラビウイルスカプシドタンパク質を作動可能に
コード化する核酸領域を含む。カプシドタンパク質およ
び非構造タンパク質をコード化する核酸領域は、好まし
くは、４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウイルス由
来のものである。好ましい形態において、この構築物
は、少なくとも２つのフラビウイルスに由来する核酸内
に、少なくとも１つの突然変異を含む。この好ましい形
態の一実施例において、突然変異は、NS1（１）タンパ
ク質グリコシル化を排除する。この形態の別の実施例に
おいて、突然変異は、成熟フラビウイルスメンブレンタ
ンパク質の産生を妨害する。突然変異がウイルス増殖速
度に影響することが好ましい。さらに、本発明は、これ
らの組換えDNA構築物に対応するRNA転写物を含む。
本発明の別の態様において、フラビウイルス由来のゲ
ノムを有するキメラウイルスが得られる。このキメラウ
イルスは、ダニ媒介脳炎ウイルスからの２つ以下の構造
タンパク質をコード化する核酸領域と、他のフラビウイ
ルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領域と
を含む。好ましくは、このウイルスは、フラビウイルス
ファミリーの他のメンバーからのカプシドタンパク質を
コード化する核酸領域を含む。ダニ媒介脳炎ウイルスか
らの核酸は、プレメンブレンおよび／またはエンベロー
プタンパク質など、多数のタンパク質のどれでもコード
化することができる。他のフラビウイルスからの非構造
タンパク質をコード化する核酸は、好ましくは、４型デ
ング熱ウイルスなどのデング熱ウイルスである。一実施
例において、本発明の本態様のキメラウイルスは、核酸
内に少なくとも１つの突然変異を含む。この突然変異
は、NS1（１）タンパク質グリコシル化を排除する突然
変異や、成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産
生を妨害する突然変異など、多数の形態のいずれをとっ
てもよい。突然変異がウイルス増殖速度に影響すること
が好ましい。
本発明の別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウイルスの
プレメンブレンおよびエンベロープタンパク質をコード
化する核酸領域と、別のフラビウイルスからのカプシド
タンパク質をコード化する核酸領域と、同じフラビウイ
ルスからの非構造タンパク質をコード化する核酸領域と
を含むキメラウイルスが得られる。フラビウイルスは、
たとえば、４型デング熱ウイルスなどのデング熱ウイル
スである。本発明の本態様において、好ましい形態のキ
メラウイルスは、ダニ媒介脳炎ウイルスのプレメンブレ
ンおよびエンベロープタンパク質をコード化する核酸領
域内に少なくとも１つの突然変異を含む。突然変異は、
成熟フラビウイルスメンブレンタンパク質の産生を妨害
するものを用いることができる。別の好ましい形態にお
いて、キメラウイルスは、他のフラビウイルスからの核
酸領域内に少なくとも１つの突然変異を含む。この突然
変異は、NS1（１）タンパク質グリコシル化を排除する
ものを用いることができる。
さらに別の態様において、本発明によれば、脊椎動物
において防御免疫反応を生起することのできる、本発明
のキメラウイルスからなるダニ媒介脳炎に対するヒト用
ワクチンが得られる。すなわち、本発明は、さらに、フ
ラビウイルスに対するヒト用ワクチンを製造する方法を
含み、フラビウイルスからのプレメンブレンおよびエン
ベロープタンパク質と、デング熱ウイルスからのカプシ
ドおよび非構造タンパク質とをコード化することのでき
るDNA構築物を作製し、上記DNA構築物から感染性RNA転
写物を生成し、上記RNA転写物を細胞に導入し、上記細
胞内でRNA転写物を発現させ、上記細胞からウイルスを
収穫し、上記ウイルスを脊椎動物において試験し、それ
により前記第１のフラビウイルスに対する前記ワクチン
を作製する。
本発明の好ましい態様によれば、日本脳炎ウイルスの
プレメンブレンおよびエンベロープタンパク質をコード
化する核酸領域と、別のフラビウイルスからのカプシド
タンパク質をコード化する核酸領域と、デング熱ウイル
スなどの、同じフラビウイルスからの非構造タンパク質
をコード化する核酸領域とを含むキメラウイルスが得ら
れる。
本発明の別の態様によれば、RNAゲノムを有するキメ
ラウイルスが得られる。このゲノムは、４型デング熱ウ
イルスの非構造タンパク質を作動可能（operatively）
にコード化する核酸領域と、１型デング熱ウイルス、２
型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウ
イルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ま
たは別のフラビウイルスの構造タンパク質を作動可能に
コード化する核酸領域とを含む。本発明の一実施例にお
いて、キメラウイルスのゲノムは、４型デング熱ウイル
ス構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸を実質
的にもっていない。このキメラウイルスの好ましい実施
例は、p2A（D1WP）またはp2A（D2NGC）RNAを含む。好ま
しくは、キメラウイルスは、１型デング熱ウイルス、２
型デング熱ウイルス、または３型デング熱ウイルスの非
構造タンパク質をコード化することのできる核酸領域
と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３
型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウ
イルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ま
たは別のフラビウイルスの構造タンパク質をコード化す
ることのできる核酸領域とを含む。非構造タンパク質を
作動可能にコード化することのできる核酸は、好ましく
は、非構造タンパク質を作動可能にコード化することの
できる核酸の領域とは異なるウイルス由来のものであ
る。
本発明の別の態様によれば、RNAゲノムを有するキメ
ラウイルスが得られる。このゲノムは、黄熱病ウイル
ス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、または
別のフラビウイルスの非構造タンパク質を作動可能にコ
ード化する核酸領域と、１型デング熱ウイルス、２型デ
ング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４型デング熱
ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒
介脳炎ウイルス、または別のフラビウイルスの構造タン
パク質を作動可能にコード化する核酸領域とを含む。構
造タンパク質を作動可能にコード化する核酸の領域は、
好ましくは、非構造タンパク質を作動可能にコード化す
る核酸の領域とは異なるウイルス由来のものである。
本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物において
ウイルスに対する防御免疫反応を生起することのできる
ワクチンが得られる。このワクチンは、安全でかつ免疫
学的に有効な量の本発明のウイルスのいずれかと、薬学
的および免疫学的に受容可能な担体とを含んでいる。
本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物において
ウイルスに対する防御免疫反応を生起することのできる
別のワクチンが得られる。本発明の本態様において、こ
のワクチンは、以下のウイルスの安全でかつ免疫学的に
有効な量を含む。
ａ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパク質をコード
化する核酸領域と、１型デング熱ウイルスの構造タンパ
ク質をコード化する核酸領域とを含むゲノムをもつキメ
ラウイルス、ｂ）４型デング熱ウイルスの非構造タンパ
ク質をコード化する核酸領域と、２型デング熱ウイルス
の構造タンパク質をコード化する核酸領域とを含むゲノ
ムをもつキメラウイルス、ｃ）４型デング熱ウイルスの
非構造タンパク質をコード化する核酸領域と、３型デン
グ熱ウイルスの構造タンパク質をコード化する核酸領域
とを含むゲノムをもつキメラウイルス、ｄ）弱毒化４型
デング熱ウイルス。
本発明のさらなる態様によれば、４型デング熱ウイル
スの非構造領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング
熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、
日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および別の
フラビウイルスのうちの１つからの構造領域とを含むDN
Aセグメントが得られる。本発明の好ましい実施例にお
いて、DNAセグメントは、構造および非構造領域に作動
可能に結合するプロモーターを含む。別の好ましい実施
例において、DNAセグメントは、プロモーターとしてSP6
またはT7プロモーターを含む。さらに別の実施例におい
て、DNAセグメントはp2A（D1WP）またはp2A（D2NGC）で
ある。
本発明の他のいくつかの態様によれば、他のキメラDN
Aセグメントが得られる。本発明のこれらの態様によるD
NAセグメントは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱
ウイルス、または３型デング熱ウイルスの非構造領域を
含んでいる。これらのDNAセグメントは、さらに、以下
のウイルスのうちの１つからの構造領域を含んでいる。
１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デ
ング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイル
ス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、フラビ
ウイルス。ただし、構造領域と非構造領域は同一ウイル
ス由来ではないことを条件とする。
本発明のさらなる態様によれば、DNAセグメントは、
黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイ
ルス、および別のフラビウイルスのうちの１つからの非
構造領域と、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイ
ルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳
炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および別のフラビ
ウイルスのうちの１つからの構造領域とを含み、構造領
域は非構造領域とは異なるウイルス由来である。
本発明の別の態様によれば、フラビウイルスの非構造
領域またはその一部、および異なるフラビウイルスの構
造領域またはその一部からなるDNAセグメントが得られ
る。
本発明のさらに別の態様によれば、脊椎動物において
ウイルスに対する防御免疫反応を生起することのできる
ワクチンが得られる。このワクチンは、安全かつ免疫学
的に有効な量のキメラウイルスを含む。このウイルスの
ゲノムは、ダニ媒介脳炎ウイルスからの構造タンパク質
を作動可能にコード化する核酸と、デング熱ウイルスか
らの非構造タンパク質を作動可能にコード化する核酸と
を含む。
本発明のさらに別の態様によれば、別のキメラウイル
スが得られる。この態様において、キメラウイルスは、
ダニ媒介脳炎ウイルス構造タンパク質および４型デング
熱ウイルス非構造タンパク質とを作動可能にコード化す
るウイルスのゲノムをもつ。好ましい実施例において、
ウイルスの構造タンパク質はダニ媒介脳炎ウイルス由来
のものである。
本発明のさらに別の態様によれば、ダニ媒介脳炎ウイ
ルス構造タンパク質および４型デング熱ウイルス非構造
タンパク質を作動可能にコード化するDNAセグメントが
得られる。
本発明のさらなる態様によれば、感染性４型デング熱
ウイルスRNAをコード化する、分離されたDNA断片が得ら
れる。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のDNA
断片とベクターからなる組換えDNA構築物が得られる。
好ましい実施例において、ベクターはプラスミドであ
る。本発明のさらなる態様によれば、DNA断片の発現を
可能とするようにして本発明の組換えDNA構築物で安定
的に形質転換された宿主細胞が得られる。好ましい実施
例において、宿主細胞は原核細胞である。
本発明の別の態様によれば、４型デング熱ウイルスの
突然変異を作製する方法が得られる。この方法は、
（ｉ）部位特異的突然変異誘発により４型デング熱ウイ
ルスのゲノムに突然変異を導入し、（ii）突然変異を有
する感染性４型デング熱ウイルスを回収し、（iii）回
収したウイルスを評価するステップを含む。本方法の一
実施例において、回収されたウイルスは、弱毒化または
無毒性の表現型について評価される。
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイ
ルスに対するヒト用ワクチンが得られる。このワクチン
は、疾病に対して免疫を誘導するのに十分な量の無毒性
４型デング熱ウイルスと、薬学的に受容可能な担体とを
含む。好ましい実施例において、無毒性４型デング熱ウ
イルスは、ウイルスゲノム内の重要な領域において突然
変異を加工することにより得られる。
本発明のさらに別の態様によれば、キメラフラビウイ
ルスRNAをコード化するDNA断片が得られる。キメラRNA
は、たとえば、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウ
イルス、３型デング熱ウイルスからなる群から選択され
たウイルスを含んでいる。
本発明のさらに別の態様によれば、キメラデング熱ウ
イルスの構築のための方法が得られる。この方法は、本
発明の方法により得られた４型デング熱ウイルスDNAのD
NA断片を、異なるフラビウイルスからの、対応する遺伝
子全体またはその画分［fraction］で置換することを含
んでいる。好ましい実施例において、異なるフラビウイ
ルスは以下のウイルスの１つである。１型デング熱ウイ
ルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス。
別の好ましい実施例において、４型デング熱ウイルスは
少なくとも１つの突然変異を含む。
本発明は、デング熱ウイルスに対するヒト用ワクチン
を提供する別の態様を含む。本態様において、本発明
は、疾病に対して免疫を誘発するのに十分な量の感染性
キメラウイルスと、薬学的に受容可能な担体とを含む。
キメラウイルスは、たとえば、１型デング熱ウイルス、
２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、あるい
は４型デング熱ウイルスに由来する。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明のDNA断片
と、ベクターからなる組換えDNA構築物が得られる。１
つの好ましい実施例において、ベクターはプラスミドで
ある。本発明のさらに別の態様によれば、DNAの発現を
可能とするようにして、本発明の方法により得られた組
換えDNA構築物で安定的に形質転換された宿主細胞が得
られる。好ましい実施例において、宿主細胞は原核細胞
である。
本発明のさらに別の態様によれば、非構造タンパク質
NS1−NS2Aの開裂部位のNS1のＣ末端における８個のアミ
ノ酸のうちの１つ又はそれ以上をコード化する配列内に
置換突然変異を含む、４型デング熱ウイルスRNAをコー
ド化するDNA断片が得られる。
本発明のさらなる態様によれば、非構造タンパク質NS
1−NS2Aの開裂部位のつぎの＋１位置の部位である、グ
リシンをコード化する部位に置換を含む、４型デング熱
ウイルスRNAをコード化するDNA断片が得られる。
本発明のさらなる態様によれば、3'側非コード領域内
に欠失を含む、４型デング熱ウイルスRNAをコード化す
るDNA断片が得られる。好ましい実施例において、欠失
は、ヌクレオチド30〜202個分の長さをもつ。
本発明の別の態様によれば、本発明のDNA断片のいず
れかとベクターとを含む組換えDNA構築物が得られる。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明のDNA断片の
感染性RNA転写物が得られる。本発明のさらなる態様に
よれば、DNA断片の発現を可能とするようにして、本発
明のDNA構築物でトランスフェクションされた宿主細胞
が得られる。このような宿主細胞には哺乳類または昆虫
の細胞を用いることができる。
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイ
ルスに対するヒト用ワクチンが得られる。本発明の本態
様において、このワクチンは、疾病に対して免疫を誘発
するのに十分な量の、毒性低減化突然変異４型デング熱
ウイルスを含む。好ましい実施例において、突然変異４
型デング熱ウイルスは、ウイルスゲノムにおける3'側非
コード領域内に欠失突然変異を加工することにより得ら
れる。別の好ましい実施例において、突然変異４型デン
グ熱ウイルスは、非構造タンパク質NS1−NS2Aの開裂部
位のNS1のＣ末端における８個のアミノ酸のうちの１つ
又はそれ以上をコード化するウイルスDNA配列内に置換
突然変異を加工することにより得られる。さらに別の好
ましい実施例において、突然変異４型デング熱ウイルス
は、非構造タンパク質NS1−NS2Aの開裂部位のつぎの＋
１位置の部位である、グリシンをコード化するウイルス
DNA部位に置換を加工することにより得られる。
本発明のさらに別の態様によれば、４型デング熱ウイ
ルスDNAのDNA断片を、異なるフラビウイルスからの対応
する遺伝子全体またはその画分で置換することを含む、
キメラデング熱ウイルスの構築方法が得られる。好まし
い実施例において、異なるフラビウイルスは、１型デン
グ熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウ
イルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスの１
つである。別の好ましい実施例において、キメラデング
熱ウイルスの構築方法は、本発明による４型デング熱ウ
イルスDNAのDNA断片を、異なるフラビウイルスからの対
応する遺伝子全体またはその画分で置換することを含
む。好ましくは、フラビウイルスは、１型デング熱ウイ
ルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、
日本脳炎ウイルスからなる群から選択される。さらに好
ましくは、キメラデング熱ウイルスの構築方法は、本発
明による４型デング熱ウイルスDNAのDNA断片を、フラビ
ウイルスからの対応する遺伝子全体またはその画分で置
換することを含む。好ましい方法において、フラビウイ
ルスは、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイル
ス、３型デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒
介脳炎ウイルスからなる群から選択される。
本発明のさらに１つの態様によれば、疾病に対して免
疫を誘発するのに十分な量を投与される、デング熱ウイ
ルスに対するワクチンが得られる。このワクチンは、毒
性が低減したキメラウイルスを含み、上記キメラウイル
スは、3'側非コード領域に欠失を含む４型デング熱ウイ
ルスRNAをコード化するDNA断片を含む。好ましい実施例
において、キメラウイルスは２型デング熱ウイルス、３
型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルスからなる群
から選択される。
本発明のさらなる態様は、以下の発明の詳細な説明を
参照することにより、当業者にとって明らかになるであ
ろう。
図面の説明 図１は、キメラデング熱ウイルスの作製に用いられる
完全長デング熱ウイルスcDNAの構造を示す。
図２は、RNA転写物を用いたトランスフェクション後
の、ウイルス感染細胞のパーセンテージとウイルスの力
価［titer］を示す。
図３は、キメラデング熱ウイルスの血清型分析を示
す。
図４は、親またはキメラのデング熱ウイルスにより生
成された１型、２型、または４型ウイルスタンパク質の
ポリアクリルアミドゲル分析を示す。
図５は、LLC−MK2細胞上のウイルスプラークの形態観
察を示す。
図６は、親２型NGCまたは４型デング熱ウイルスまた
は２型/4型キメラウイルスのマウス神経毒性を示す。
図７は、感染性RNAの転写に用いられるクローン化さ
れた完全長デング熱ウイルスcDNAの末端配列を示す。
合計10646個のヌクレオチドの長さをもつ完全長デン
グ熱ウイルスcDNAは、図示のように、SP6ポリメラーゼ
のためのプロモーター配列および唯一のAsp718開裂部位
に隣接してクローン化される。ここで、10448および104
49の間の位置に付加Ｃ残基が、10470および10471の間に
付加Ｇ残基が存在する。これらはもとの４型デング熱ウ
イルス配列にはなかったものである。RNA転写物の予測
5'末端および3'末端の近くの配列も示されている。転写
開始のＧは、太字体で示される3'デング配列の前に配置
されていた。Asp718開裂配列GGTACCは、太字体で示され
る3'デング配列の直後に位置していた。
図８は、完全長デングcDNAクローンおよび制限エンド
ヌクレアーゼ消化パターンを示す。
図には、5'端にSP6プロモーター、3'端にAsp718開裂
部位を含む完全長デングcDNAクローンが示されている。
ヌクレオチド5069のBstB1開裂部位により、デングゲノ
ムは5'および3'断片に分離される。完全長クローン1Aの
断片を、対応する5'−２、3'−Ｂ、または3'−Ｃ断片で
置換することにより、図示されている他の完全長の組合
せが得られる。
図９は、Bgl II、Nsi I、およびAsp718で消化された
完全長デングcDNAクローンの制限エンドヌクレアーゼパ
ターンを示し、消化物はアガロースゲル上での分離によ
り分析された。Ｍは、キロ塩基対の分子サイズマーカー
としてのλHind III DNA断片を示す。
図10は、感染RNAから回収されたデング熱ウイルスが
鋳型DNAのゲノム配列を含むことの実例を示す。
子孫デング熱ウイルスは、クローン2ADNA（野生型対
照（コントロール））から、または、デング配列のヌク
レオチド3473のPst I部位を含むクローン2A（Ｐ）DNAか
ら転写されたRNAでトランスフェクションしたLLC−MK2
細胞から回収された。回収されたウイルスから抽出され
たゲノムRNAは、逆転写に用いられ、cDNA産物は、適当
なプライマーを用いたPCRにより1343bpのDNA断片（ヌク
レオチド3193〜4536）を製造するための鋳型として用い
られた。PCR産物のPst I消化が図示されている。レーン
Ｍは、サイズマーカーとしての123のDNAラダーを示す。
図11は、回収されたウイルスおよび親ウイルスに感染
した細胞からのデング熱ウイルスタンパク質の比較を示
す。
回収されたデング熱ウイルスまたは親野生型ウイルス
に感染したLLC−MK2細胞からの溶解物［ライゼート（ly
sates）］を35Sメチオニンで標識したものを用意し、デ
ング高度免疫マウス腹水を用いた免疫沈降を行なった。
沈殿物は、SDS−12％ポリアクリルアミドゲル上の電気
泳動により分離された。図示のゲルレーンは、下記のも
のに感染した細胞からの溶解物を含んでいる。（１）親
デング熱ウイルス、（２）クローン2ADNAから回収され
たデング熱ウイルス、（３）クローン2A（Ｐ）DNAから
回収されたデング熱ウイルス。レーン４はダミー［moc
k］感染細胞溶解物からのものである。レーンＭは、左
側に示したキロダルトンのタンパク質サイズマーカーを
含む。PreM、Ｅ、NS、NS3を含むデング熱ウイルスタン
パク質に対応する標識バンドが図示されている。その他
の標識バンドの特定はしなかった。
図12は、野生型４型デング熱ウイルスと、それに由来
するアミノ酸置換突然変異体D4（D1126−Ｅ）のプラー
ク形態観察を示す。
76cm2ビンに入れた集密な（コンフルエント（conflue
nt）な）蚊C6/36細胞をデング熱ウイルスに感染させ、
次に、アガロースのオーバーレイを加えた。感染の６日
後、ニュートラルレッドを用いて細胞を染色した。翌
日、プラークサイズを測定した。10個の別々のプラーク
から、野生型４型デング熱ウイルスおよび置換突然変異
体の平均プラークサイズを算出した。図示の突然変異ウ
イルスは、４型デングポリペプチド配列の1126位置に、
Gly（Ｇ）を置換したGlu（Ｅ）を含んでいた。この位置
は、NS1−NS2A開裂配列の＋１位置に対応する。
図13は、3'非コード配列中に欠失を含む４型デング熱
ウイルス突然変異のゲノム構造と特性を示す。
図示の線形マップは、４型デング熱ウイルスのヌクレ
オチド384個の3'非コード配列を示す。この領域には、
少なくとも３つの配列要素が示されている。塗り潰した
四角形で示したのは、nt234からnt211、および、nt143
からnt120の保存配列２（CS−２）である。白抜きの四
角形で示したのは、nt105からnt82の保存配列１（CS−
１）であり、最後の84個のヌクレオチド内にはステム・
アンド・ループ構造がある。各々特定の位置に長さ30〜
202個のヌクレオチドの欠失突然変異を含む、７個のcDN
Aクローンが構築され、これから誘導されたRNA転写物を
用いて、受容（permissive）LLC−MK2細胞のトランスフ
ェクションを行なった。CS−１配列を全く欠いた突然変
異D4（Δ3'、172〜83）cDNAは致死突然変異のようであ
る。というのは、活性ウイルスが試行を繰返しても検出
されなかったからである。活性欠失突然変異体は、残り
６個のRNA転写物から回収された。感染の６日後、野生
型ウイルスとこれから誘導された欠失突然変異体の増殖
特性を、染色したLLC−MK2細胞単層上のプラーク検定に
より比較した。同一条件のもとで、野生型ウイルスは約
0.3cmの大きさのプラークを示した。逆番号付与システ
ム（reverse numbering system）を用いて、４型デング
熱ウイルスのヌクレオチド位置を割り当てた。10646の
最後のヌクレオチドには、この番号付与システムを用い
てnt1が割り当てられた。
図14は、野生型デング熱ウイルス、および、これから
誘導された、3'非コード領域に欠失を含む突然変異体の
プラーク形態観察を示す。
プラーク検定は、蚊C6/36細胞に対して実施された。7
5cm2ビンに入れたコンフルエントな蚊C6/36細胞を、野
生型４型デング熱ウイルスまたは活性欠失突然変異体ウ
イルスに、適当な多重度で感染させた。実施例に述べる
ように、感染の６日後に、被感染細胞をニュートラルレ
ッドで染色した。翌日、プラークサイズを測定した。各
突然変異体について、10個の別々のプラークの平均プラ
ークサイズを算出した。パネルＡは、非感染細胞単層
（ダミー）、４型デング熱ウイルス欠失突然変異体（Δ
3'、172〜113）、（Δ3'、172〜143）、親・野生型ウイ
ルスを示す。
図15は、野生型ウイルスと、欠失突然変異体（Δ3'、
243〜183）、（Δ3'、303〜183）、（Δ3'、384〜183）
を示す。逆番号付与システムを用いて４型デング配列の
欠失位置を割り当てた。
図16は、NS1−NS2A接合部の表を示す。
図17は、キメラTBEV/DEN4構築物における遺伝子間接
合部を示す。制限酵素で開裂したTBEVcDNA断片を、下線
を付した配列により示される適当な部位において、DEN4
cDNAに挿入した。TBEVのアミノ酸およびコード化ヌク
レオチド配列は太字で示されている。ヌクレオチド番号
付与システムは、Plentnev他によりVirology第174巻250
〜263頁（1990）に開示されたものである。
図18は、親DEN4およびキメラTBE（ME）/DEN4ウイルス
により産生されたウイルスタンパク質のポリアクリルア
ミドゲル分離の写真である。vTBE（ME）/DEN4またはDEN
4ウイルスに感染したサル細胞、または、非感染のサル
細胞の溶解物を35Sメチオニンで標識し、TBEVのHMAF
（１）、またはDEN4のHMAF（２）、またはDEN4のNS3
（３）、NS5（４）、preM（５）、Ｅ（６）に特異的な
ウサギ血清を用いた免疫沈殿を行ない、SDS−12％ポリ
アクリルアミドゲル上で分析した。タンパク質マーカー
の分子量はキロダルトンで示す。DEN4タンパク質の位置
は右端に沿って示されている。
図19は、LLC−MK2およびC6/36細胞上のvTBE（ME）/DE
N4およびDEN4についての増殖曲線を示す。細胞は、細胞
当り0.01pfuのMOIで、図示の時点（感染後日数）におい
て細胞を収穫し、プラーク検定によりウイルス力価を判
定した。
図20は、被感染組織培養細胞から分離したRNAの試料
をブロットしたニトロセルロースフィルターの写真のコ
ピーである。フィルターは、32Pで標識したpTBE（ME）/
DEN4ニックトランスレーションDNAをプローブとして検
査された。
図21は、感染後のさまざまな時点における、vTBE（M
E）/DEN4およびDEN4に感染したLLC−MK2またはC6/36細
胞からの細胞溶解物タンパク質のポリアクリルアミドゲ
ル分離の写真である。
図22は、マウスにおけるvTBE（ME）/DEN4の防御効力
および神経毒性を判定するための研究の結果を示す。
図23は、神経毒性に対する突然変異の効果を評価する
ために、TBE（ME）/DEN4構築物に組み込んだいくつかの
突然変異例のリストである。
図24は、図23に示した突然変異を含む構築物から回収
したTBE（ME）/DEN4キメラを用いた神経毒性研究の結果
をまとめたものである。
発明の詳細な説明 キメラフラビウイルスの生成 デング熱ウイルスは、ほぼ11キロベースの正鎖RNAゲ
ノムを含み、このゲノムは、３つの構造タンパク質（カ
プシド（Ｃ）、プレメンブレン（preM）、エンベロープ
（Ｅ））を１つの読取りフレームでコードしており、７
個の非構造タンパク質（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、
NS4B、NS5）がそれに続いている。
本発明は、１つの「型（type）」のデング熱ウイルス
またはフラビウイルスからの非構造タンパク質と、異な
る「型」のデング熱ウイルスまたは別のフラビウイルス
からの構造タンパク質とをキメラデング熱ウイルスに関
する。
一実施例において、本発明は、 １）１型、２型、３型、４型デング熱ウイルス、黄熱病
ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、
またはフラビウイルスの非構造領域と、 ２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３
型デング熱ウイルス、４型デング熱ウイルス、黄熱病ウ
イルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ま
たはフラビウイルスから選択された構造領域とを含み、
上記構造領域は上記非構造領域とは異なる「型」のデン
グ熱ウイルスまたはフラビウイルス由来のものであるこ
とを特徴とするキメラウイルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 １）４型デング熱ウイルス（DEN4）の非構造領域と、 ２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
１つの好ましい実施例において、このウイルスは、４型
デング熱ウイルス構造領域を実質的にもっていない。好
ましい実施例において、このウイルスはp2A（D1WP）ま
たはp2A（D2NGC）RNAからなる。
さらなる実施例において、本発明は、 １）１型デング熱ウイルスの非構造領域と、 ２）２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
さらなる実施例において、本発明は、 １）２型デング熱ウイルスの非構造領域と、 ２）１型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルス、４
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 １）３型デング熱ウイルスの非構造領域と、 ２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、４
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含むキメラウイルスに関する。
別の実施例において、本発明は、 １）黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介ウイ
ルス、およびフラビウイルスから選択された非構造領域
と、 ２）１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、４
型デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイル
ス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびフラビウイルスから
選択された構造領域とを含み、上記構造領域は上記非構
造領域とは異なるウイルス由来のものであることを特徴
とする、キメラウイルスに関する。
さらなる実施例において、本発明は、上記キメラウイ
ルスの少なくとも１つと、薬学的ならびに免疫学的に受
容可能な担体からなるワクチンに関する。
ワクチンに含まれるウイルスの量は、投与の経路に応
じて選択される。皮下経路が好ましいが、上述のワクチ
ンは、皮内経路によっても投与できる。当業者であれ
ば、いかなる治療法についても、投与すべき量を容易に
決定できることが理解されよう。
さらに別の実施例において、本発明は、 １）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、１型デング
熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、 ２）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、２型デング
熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、 ３）４型デング熱ウイルスの非構造領域と、３型デング
熱ウイルスの構造領域からなるキメラウイルスと、 ４）弱毒型４型デング熱ウイルスからなるワクチンに関
する。
１つの好ましい実施例において、弱毒化ウイルスは、
非構造タンパク質領域（たとえば、改変されたNS1−NS2
開裂部位配列）内に、突然変異（点突然変異、欠失、挿
入、これらの組合せ）を含む。別の好ましい実施例にお
いて、弱毒化ウイルスは、3'非コード領域内に、突然変
異（点突然変異、欠失、挿入、これらの組合せ）を含
む。さらに好ましい実施例において、弱毒化ウイルス
は、5'非コード領域に、突然変異（点突然変異、欠失、
挿入、これらの組合せ）を含む。別の好ましい実施例に
おいて、弱毒化ウイルスは、天然由来のものまたは研究
室で加工したものである。
別の実施例において、本発明は、上述のウイルスの少
なくとも１つをコード化するDNAセグメントに関する。
１つの好ましい実施例において、DNAセグメントは、構
造および非構造領域に作動可能に連結するプロモーター
（好ましくは、真核、原核、ウイルス性プロモーター、
より好ましくはSP6またはT7プロモーター）を含む。別
の好ましい実施例において、DNAセグメントはp2A（D1W
P）またはp2A（D2NGC）を含む。
すなわち、当業者であれば、後述の実施例において提
供される方法を用いて、フラビウイルス科の１つのウイ
ルスの構造領域を、フラビウイルス科の別のウイルスか
らの非構造領域に組合せて得られる型間組換え体を含む
キメラデング熱ウイルスワクチンを生成できることはい
うまでもない。好ましい実施例において、４型デング熱
ウイルス（DEN4）の非構造タンパク質を１型デング熱ウ
イルスの構造タンパク質に組み込んだキメラデング熱ウ
イルスが作製される。これらの方法の詳細は、Bray他
（Proc.Natl.Acad.Sci.第88巻1042〜1046頁、1991年）
を参照されたい。
後述の実施例17は、実施例１に説明するキメラデング
熱ウイルス製造のための方法につづいて４型デング熱ウ
イルスの非構造領域をダニ媒介脳炎ウイルスの構造領域
に組み合わせたキメラウイルス（TBEV（CME）/DEN4）の
作製を開示している。これらの方法により作製されたウ
イルスは培養中で複製され、組織培養細胞または実験動
物の感染に用いられた。
神経毒性に影響するデングゲノムにおける突然変異 我々は、細胞培養における増殖特性およびプラーク形
態の変化を示す、3'非コード領域における欠失を含む一
連の活性デング熱ウイルス突然変異体を加工した。同様
に、我々は、ウイルスポリタンパク質の非構造タンパク
質領域の新規な開裂部位配列内に核酸酸置換を含む、別
の一連の、増殖制限されたデング熱ウイルス突然変異体
を加工した。複製能力が低下したデング熱ウイルス突然
変異体は、生菌ウイルスワクチンに用いるための適格性
を判定するために、実験動物における毒性の低下につい
て評価を受ける。
本発明において、3'非コード領域内に欠失を含む増殖
制限された４型デング熱ウイルス突然変異体の構築は、
完全長４型デング熱ウイルスcDNAクローンを用いて重要
な領域内に欠失を加工することにより実行される。欠失
突然変異は、アミノ酸置換突然変異に比べて、表現型の
逆転が少ないという利点をもっている。
他の蚊媒介フラビウイルスと同様に、４型デング熱ウ
イルスは、指定された保存配列１（CS−１）および保存
配列２（CS−２）の保存領域と、潜在的末端ステム・ア
ンド・ループ構造とを含む3'非コード配列を有してい
る。ヌクレオチド３〜202個の範囲の欠失は、４型デン
グcDNAのヌクレオチド384個の3'非コード配列内のさま
ざまな位置に導入することができる。CS−１領域のcDNA
クローン欠損配列から作製され、しかしステム・アンド
・ループ構造をとどめているRNA転写物は、子孫ウイル
スを生じることがなく、欠失が致死的であることを示し
ている。一方、たいていの他の3'非コード領域欠失構築
物からは、感染性ウイルスを回収することができる。
これらの突然変異体および野生型ウイルスのプラーク
検定は、蚊細胞（C6/36）に対して実施することができ
る。分析の結果、ほとんどの欠失突然変異体が、欠失の
位置と程度に応じて、1.0から0.3cmにわたる、縮減サイ
ズのプラークを形成することが示されている。プラーク
形態のこのような変化は、これらの欠失突然変異体が増
殖制限表現型をあらわすことを示すものである。3'非コ
ード領域内に欠失を含むデング熱ウイルス突然変異体の
このパネルは、実験動物においてそれらの感染性および
免疫原性について評価することができる。実験霊長類に
対して低下した毒性を示す突然変異体は、ワクチンウイ
ルス候補として選択され、ヒトにおける評価を受ける。
さらに、本発明は、3'非コード領域に欠失を含むDNA
断片およびベクターを含む組換えDNA構築物に関する。
さらに、本発明は、DNA構築物を用いてトランスフェク
ションした宿主細胞に関する。さらに、本発明は、ウイ
ルスゲノムの3'非コード領域に欠失突然変異を導入し、
欠失突然変異を宿す感染ウイルスを回収する工程を含
む、４型デング熱ウイルスの突然変異を生成する方法に
関する。
別の実施例において、本発明は、非構造タンパク質NS
1−NS2Aの開裂部位のNS1のＣ末端における８個のアミノ
酸のうちの１つ又はそれ以上をコード化する配列内に置
換を含む、４型デング熱ウイルスRNAをコード化するDNA
断片に関する。置換の概略は図16に示されている。さら
に、本発明は、非構造タンパク質NS1−NS2Aの開裂部位
のつぎの＋１位置の部位である、グリシンをコード化す
る位置に置換を含む、４型デング熱ウイルスRNAをコー
ド化するDNA断片に関する。本発明は、さらに、ここに
述べたDNA断片の感染性RNA転写物に関する。
非構造タンパク質内に突然変異を含む増殖制限された
４型デング熱ウイルス突然変異の構築は、完全長４型デ
ング熱ウイルスcDNAクローンを用いてこのような戦略的
突然変異を加工することにより実行できる。デング熱ウ
イルス非構造タンパク質の機能的活性に影響する突然変
異により、増殖制限を誘起することができる。たとえ
ば、開裂配列またはウイルスプロテアーゼ部分を改変す
ることにより、ウイルスポリタンパク質の開裂を最適以
下に抑え、ウイルス増殖を制限する。
我々は、非効率的な開裂により増殖制限されるデング
熱ウイルス突然変異を構築するためのターゲットとし
て、ポリタンパク質NS1−NS2A開裂部位を選択した。我
々は、４型デング熱ウイルスNS1−NS2A開裂には、NS1の
Ｃ末端における８個のアミノ酸ドメインが必要であるこ
とを証明した。我々は、さらに、これらの位置の各々に
おける置換および開裂部位のつぎの＋１位置のGlyの置
換の効果を証明した。
このドメインにおけるアミノ酸置換の突然変異のパネ
ルは、開裂に対する効果について評価された（図16参
照）。開裂に対して広範囲の効果を生じた突然変異を識
別し、多数のこのような突然変異を選抜して、完全長４
型デング熱ウイルスcDNAクローンに組み込んだ。突然変
異体cDNA由来のRNA転写物を用いて細胞のトランスフェ
クションを行ない、これにより、NS1−NS2A開裂領域内
に指定された突然変異をもつ活性デング熱ウイルス突然
変異体が生成された。これらの突然変異体は、まず、蚊
C6/36細胞でのプラーク検定により特徴づけられた。突
然変異体のいくつかは、サイズの縮小したプラークを生
じ、これらの突然変異体ウイルスが細胞培養において増
殖制限を呈したことを示す。
さらに、本発明は、非構造タンパク質NS1−NS2Aの開
裂部位のNS1のＣ末端における８個のアミノ酸の１つ又
はそれ以上をコード化する配列内に置換突然変異を含む
DNA断片と、ベクターを含む組換えDNA構築物に関する。
本発明は、さらに、DNA構築物でトランスフェクション
した宿主細胞に関する。
さらに、本発明は、非構造タンパク質NS1−NS2Aの開
裂部位のつぎの＋１位置である、グリシンをコード化す
る位置に置換を含むDNA断片と、ベクターを含む組換えD
NA構築物に関する。本発明は、さらに、DNA構築物でト
ランスフェクションした宿主細胞に関する。
別の実施例において、本発明は、上述したように、毒
性の低下した突然変異体４型デング熱ウイルスを、疾病
に対して免疫を誘発するのに十分な量含んでなる４型デ
ング熱ウイルスに対するヒト用ワクチンに関する。
本発明の突然変異体は、（１）ウイルス血症の期間と
して測定される毒性と、（２）ウイルス感染後の抗体反
応の種類と規模により示される免疫原性について、霊長
類において評価される。サルにおいて毒性が低下しなお
十分な免疫原性を維持するデング熱ウイルス突然変異体
は、ヒトに対する臨床試験において評価される。
さらなる実施例において、本発明は、４型デング3'非
コード領域および／または非構造タンパク質遺伝子内
に、十分な弱毒化をもたらす突然変異を含む４型デング
熱ウイルスを構築すること、ならびに、４型デング熱ウ
イルス突然変異体の各々を用いて他のデング熱ウイルス
血清型の抗原特異性をもつ型間キメラウイルスを構築し
これにより１型、２型、または３型デング熱ウイルスに
より発生する疾病の防御のために用いることのできる弱
毒化ウイルスを創作することに関する。さらに、キメラ
ウイルスは、日本脳炎ウイルスおよびダニ媒介脳炎ウイ
ルスなどのその他のフラビウイルスに対する抗原特異性
をもつものとしても構築することができる。
デング熱に対する免疫のための現在の戦略としては、
４つのデング熱血清型すべてを含むワクチン製剤の使用
が好ましい。このことは、異なるデング熱血清型に連続
して感染することから生じる重いデング出血性ショック
症候群の危険から、風土病地域の人々を守ることになろ
う。現在、弱毒化デング熱ワクチン候補は、人工的な宿
主の細胞内の連続継代培養を含む標準的技術により作製
されている。これらの宿主域突然変異体を用いて達成さ
れた成功は、ごく限られたものに過ぎない。たとえば、
２型デング熱ワクチンは満足できる程度に弱毒化された
けれども、この方法により作製された３型デング熱ワク
チンはヒト被験希望者にデング熱を引き起こした。
本発明は、活性キメラデング熱ウイルスを構築する方
法を提供する。本発明は、さらに、４型ウイルス5'およ
び3'非コード配列と、その７個の非構造タンパク質のす
べてをコードする配列とを含む、共通の４型デング熱ウ
イルス遺伝子的背景を共有するキメラウイルスを用い
て、４つのデング熱血清型すべてに対して有効なワクチ
ンを製造する方法を提供する。
この目的のため、我々は、3'非コード系に、あるい
は、非構造タンパク質遺伝子の１つに欠失を含む４型デ
ング熱ウイルスを構築し、これらのデング熱ウイルス突
然変異体が複製能力の大幅な抑制を示すことを証明し
た。したがって、満足できる程度の弱毒化をもたらす突
然変異をこれらの共通領域内において加工することがで
き、その結果、４つのデング熱血清型特異性を別々に発
現することになる４個のクローン化された弱毒化デング
熱ウイルスのひと組が得られる。これらのウイルスに
は、親４型ウイルス、１型（構造タンパク質遺伝子領
域）−４型キメラ、同様な２型−４型キメラ、および同
様な３型−４型キメラ、ならびに、日本脳炎およびダニ
媒介脳炎のキメラが含まれる。
不活化全デング熱ウイルスワクチンは、十分な免疫原
性を欠くことが示されていた。細胞培養における連続継
代培養により弱毒化された生菌ウイルスワクチンは、不
十分な弱毒化、遺伝学的不安定性、過度の弱毒化などの
欠点をもっていた。２型デング熱ワクチンは、まだ、開
発の初期段階にある。残りの３つの血清型の生菌ワクチ
ンは得られていない。本発明は、ウイルスゲノム内に指
定された突然変異をもつデング熱ウイルスを構築する能
力における技術的進歩を提供する。
キメラダニ媒介脳炎ウイルスワクチン カプシド、メンブレン、エンベロープの３つの構造タ
ンパク質配列を、デング熱ウイルス非構造タンパク質を
コード化する配列を含むデング熱ウイルス構築物に組み
込むことにより、ダニ媒介脳炎キメラウイルスが作製さ
れた。
デング熱／ダニ媒介脳炎ウイルス（TBEV）の組合せ
は、デング熱ウイルスとTBEVウイルスタンパク質および
核酸配列の協力を必要とするようである。構築物のウイ
ルスは、それぞれ対応する天然のウイルスより感染性が
低かった。DEN4およびTBEVは、同じゲノム構成をもち、
遺伝子発現の同じ戦略を共有する。しかし、２つのウイ
ルス間の配列を比較すると、配列相同性が比較的低いこ
とが示される（Pletnev他、Virology第174巻250〜263頁
（1990）をここに参考として取り入れる）。たとえば、
２つのウイルスの間のアミノ酸同一性は、カプシドタン
パク質（Ｃ）については15.4％、メンブレンタンパク質
（Ｍ）については15.9％、エンベロープグリコタンパク
質（Ｅ）については36.5％、非構造タンパク質（NS1）
については39.1％である。以下の実施例に、改良された
キメラTBEVワクチンを開示する。
我々は、すでに、感染性RNAのインビトロ転写のため
の鋳型として用いることのできるクローン化された完全
長デング熱ウイルスcDNAについて説明した。これは、pB
R322ベクターを用いて大腸菌株内に安定な完全長デング
熱cDNAコピーをクローン化することにより達成された。
デング熱ウイルスは、cDNAのインビトロRNA転写物を用
いてトランスフェクションした受容細胞から回収され
た。デング熱cDNAの感染性RNA転写物を用いてトランス
フェクションした細胞により生成されたウイルスの特性
は、cDNAクローンが由来したもとのウイルスの特性と同
一であった。
さらに、我々は、本発明において、１つの血清型のデ
ング熱ウイルスの非構造タンパク質遺伝子と、別の血清
型のデング熱ウイルスからの構造タンパク質遺伝子とを
含むゲノムを有するキメラデング熱ウイルスの作製を開
示した。キメラデング熱ウイルスの１例として、１つの
デング熱ウイルスからのカプシド、preM（メンブレ
ン）、エンベロープ遺伝子配列を用いて、組換えcDNA構
築物における４型デング熱ウイルスの対応する遺伝子を
置換した。この構築物でトランスフェクションした細胞
内で生成されたウイルスは、同型デング熱ウイルスに対
するワクチンの作製において有用である。上述したよう
に、本出願は、さらに、デング熱ウイルスの非構造領域
と別のフラビウイルスの構造領域に対応する遺伝子配列
を含むキメラウイルスの構築を開示している。特に、キ
メラダニ媒介脳炎ウイルスが開示されている。「キメラ
フラビウイルスの生成」と題した項において概説した本
発明の方法は、TBEVからの３つの構造タンパク質を組み
込んだ組換えデング熱ウイルス構築物の製造を開示して
いる。この構築物でトランスフェクションした細胞から
生成されるウイルスは、生菌ウイルスワクチンのための
ウイルス候補である。
本出願に係る発明は、キメラフラビウイルス作製の技
術に対する重要かつ予想外の改良と、この新規なワクチ
ン戦略の有用性についてのあらがえない証拠を提供す
る。当業者であれば、１つのウイルスの構造タンパク質
のすべてを第２のウイルスの非構造要素に組み込んだキ
メラフラビウイルス組合せが容易に回収可能であり、培
養細胞において効率的に複製することを期待できる。こ
れは、関連性の離れたフラビウイルス由来の構造タンパ
ク質の機能的協力という要件の可能性があるためであ
る。しかしながら、予期せぬことに、本発明は、TBEVゲ
ノムからの２つの構造タンパク質（すなわちＭおよび
Ｅ）を、デング熱ウイルスからの第３の構造タンパク質
（すなわちＣ）と組み合わせたキメラTBEVウイルス（TB
EV/DEN4）を識別する。
キメラTBEV/DEN4構築物の作製 DEN4とTBEVとの間のアミノ酸配列相同性は低いため、
TBEV配列を用いて対応するDEN4配列を置換することによ
り、多様なTBEVおよびDEN4キメラcDNA構築物が作られ
た。これらの構築物は、分子生物学分野において公知の
技術を用いて作製された。cDNA構築物のインビトロ転写
およびRNA産物の受容細胞内へのトランスフェクション
の後、さまざまな遺伝子組合せのいずれかにより活性キ
メラウイルスが産生されるかどうかを決定するために、
構築物を試験した。すでに、TBEV（Sofjin株）のサブゲ
ノムcDNA断片がクローンされ、公知の技術を用いてヌク
レオチド配列が決定された（前出のPletnev他、Virolog
y、および、Pletnev他、FEBS Lett.第200巻317〜321頁
1986を参照）。これらのプラスミドは、全TBEVゲノム配
列を一緒に含む重複遺伝子配列を提供する。プラスミド
pGEM2−CMEまたはpGEM2−ENS1を鋳型として用い、適当
なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて（例17参
照）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により一連のTBEV
cDNA断片を作製し、各断片は、制限酵素開裂部位が脇に
ある１つ又はそれ以上の特異遺伝子を定めている。断片
は図17に示されており、右端のヌクレオチド位置により
示される断片の配列は、Pletnev他による刊行物（Virol
ogy第174巻250〜263頁、1990）において提供されてい
る。図17に、７個のこのようなTBEV cDNA断片と、部位
特異的突然変異誘発により完全長DEN4 cDNAのRNA転写物
内に同様に導入された適当な部位に連結するのに適した
修飾末端を示す。TBEV配列の、ヌクレオチド（nt）76〜
1977を含むプラスミドpGEM2−CMEおよびヌクレオチド96
6〜3672を含むpGEM2−ENS1は、共有された制限酵素部位
におけるTBEV断片のライゲーション（連結）により、プ
ラスミドp10、p4、p18、p2、p11から構築された（前出
のPletnev他、Virology、1990参照）。プラスミドDEN4p
5'−２およびp5'−２（ΔPst I、Xho I）（前出のBray
他、Proc.Natl.Acad.Sci.1991）、および誘導体p5'−２
（ΔPst I、Xho I、ΔHind III）が、対応するDEN4遺伝
子のかわりに１つ又はそれ以上のTBEV遺伝子を置換する
ために用いられた。分子生物学の当業者であれば、実施
例17に示したプライマー配列すなわち配列番号21〜31を
用いてキメラTBEV構築物を生成することができる。キメ
ラ構築物の接合部における配列は、核酸配列決定により
証明された。得られたキメラプラスミドのすべては、DE
N4の第１のヌクレオチドをあらわすＡ残基が後に続く転
写開始のＧの上流に位置するSP6プロモーターを含んで
いた。プラスミドは、インビトロ転写物の前に、DEN4配
列の3'末端の直後の唯一のAsp718開裂部位で線状化され
た。この構築物は、Lai他（Proc.Natl.Acad.Sci.第88巻
5139〜5143頁、1991）により開示された技術を用いて、
インビトロ転写により転写された。図17のキメラ構築物
からの転写物は、サルLLC−MK2細胞にRNAをトランスフ
ェクションすることにより、感染性について試験され
た。
トランスフェクション処理には、LipofectinTM（Beth
esda Research Laboratories,Inc.、メリーランド州G
aithersberg）またはDOTAP（Ｎ−［１−（2,3−ジオレ
オイロキシ）プロピル−N,N,N−トリメチルアンモニウ
ム硫酸ジメチル、Boehringer Mannheim、インディアナ
州インディアナポリス）のいずれかを用い、キメラRNA
転写物を受容細胞に導入した。サルLLC−MK2細胞の培養
をこれらの処理に用いたが、TBEV複製のための受容細胞
型のどれでもかわりに用いることができることは言うま
でもない。トランスフェクションされた培養は、TBEV特
異的ウサギ血清または高度免疫マウス腹水を用いた免疫
蛍光検査により、時間に対するウイルスの存在につい
て、評価された。pTBE（ME）/DEN4（TBEVのプレメンブ
レンおよびエンベロープタンパク質からの配列をDEN4の
カプシドタンパク質および非構造配列に連結したものを
含む）のRNA転写物を用いてトランスフェクションされ
た細胞は、TBEV特異的ウサギ血清、TBEV特異的高度免疫
マウス腹水（HMAF）、およびDEN4特異的HMAFで、陽性に
染まった。DEN4のみに感染した対照培養は、免疫蛍光標
識されたTBEV特異的血清に対しては、陰性であった。こ
のことは、キメラvTBE（ME）/DEN4がTBEVおよびDEN4双
方の特異抗原を発現したことを示す。
キメラウイルスをトランスフェクションvTBEVから分
離し、TBE（CME）/DEN4（TBEVのカプシド、メンブレ
ン、エンベロープ遺伝子と、DEN4の非構造配列とを含む
ゲノム構築物）と、vTBE（ME）/DEN4と呼ぶ。実施例17
に開示したように、TBE（CME）/DEN4のRNAによるトラン
スフェクションの16日後、約１％の細胞が、TBEVおよび
DEN4特異抗原に対して陽性に染まった。陽性細胞の割合
は時間とともに増加し、トランスフェクション後26日目
に６×105pfu/mLのピーク力価を示し、80％の細胞がト
ランスフェクションされた。一方、TBE（ME）/DEN4のRN
Aを用いてトランスフェクションした細胞はより迅速に
ウイルスを生成し16日目に培養の100％が感染した。ト
ランスフェクション細胞内に存在するTBE（ME）/DEN4ウ
イルス（v TBE（ME）／（DEN4）で示す）の力価は、感
染後26日目に４×106pfu/mLであった。さらに、キメラ
構築物に感染させた細胞から生成された子孫ウイルスの
配列決定により、図17に示すように、キメラビリオン
（ウイルス粒子）からのゲノム断片のDEN4およびTBEV接
合部が、キメラ構築物の接合部に符合することが確認さ
れた。
TBEV/DEN4ウイルスの性質 実施例17において提供された方法を用いて、キメラウ
イルスの性質を調べた。キメラTBEV/DEN4ウイルスを用
いたすべての作業は、BL−３封じ込め設備において実施
された。
キメラウイルスから製造されたタンパク質を、４型デ
ング熱ウイルスから作製されたタンパク質と比較した。
完全長DEN4cDNAクローンから回収した４型デング熱ウイ
ルスのタンパク質は、「キメラフラビウイルス」と題す
る項において同定され、図４に示され、Bray他（前出の
Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1991））に開示されている。
デング熱ウイルスタンパク質のタンパク質分離のパター
ンを、vTBE（ME）DEN4感染細胞から生成されたキメラウ
イルスタンパク質と比較した。この検定（図18および実
施例18参照）において、融合性LLC−MK2細胞を、感染多
重度（MOI）0.01で感染させた。前出のLai他、（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA（1991）により開示された技術を用い
て、被感染培養を35Sメチオニンとともにインキュベー
トした。以下のレーンを用いて感染細胞溶解物の免疫沈
降検査を実施した。１）TBEV特異的HMAF、２）DEN4特異
的HMAF、３）DEN4NS3に対して作製されたウサギ抗血
清、４）DEN4NS5に特異なウサギ抗血清、５）DEN4のpre
Mに特異なウサギ抗血清、６）DEN4のＥタンパク質に特
異なウサギ抗血清。免疫沈降物は、Laemmli（Nature第2
27巻680〜685頁、1970）により開示された技術を用い、
図18に示すように、変性条件のもとで、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析された。キメラおよび親DE
N4ウイルスのいずれも、DEN4 NS3およびNS5として識別
されたタンパク質バンドを生じた（レーン３および
４）。DEN4のpreMまたはＥタンパク質は、キメラウイル
スに感染した細胞においては識別されなかったが、DEN4
感染細胞においては識別された（レーン５および６参
照）。DEN4特異的HMAFは、vTBE（ME）/DEN4感染細胞溶
解物からのタンパク質バンドのみを沈降させ、これはDE
N4 NS1およびNS3非構造タンパク質と共に泳動した（レ
ーン２）。TBEVのHMAFは、キメラvTBE（ME）/DEN4に感
染した細胞の溶解物からのTBEVのＥタンパク質（55kD
a）について正確なサイズを有するタンパク質を免疫沈
降した。キメラウイルス感染細胞タンパク質は、DEN4の
Ｅよりも迅速に泳動した（レーン１および６）。以前の
実験において、TBEVのHMAFは、TBEV感染細胞からの天然
TBEV preMおよびＣタンパク質を沈降しなかった。した
がって、TBEVのpreMおよびＣタンパク質の同定は期待さ
れなかった。LLC−MK2細胞においてvTBE（CME）/DEN4に
より生成されたタンパク質バンドのプロフィールは、vT
BE（ME）/DEN4により生成されたものと同一であった。
このように、キメラウイルスはLLC−MK2細胞において期
待されたタンパク質を生成した。
DEN4により生じたウイルスプラークをキメラ構築物か
ら生じたプラークと比較することにより、ウイルスのプ
ラーク形態観察を評価した。蚊C6/36細胞上で、DEN4ウ
イルスプラークの平均サイズは12.1mmであった。一方、
vTBE（ME）/DEN4は平均6.5mmのプラークを生じた。vTBE
（ME）/DEN4は、サルLLC−MK2細胞上にDEN4により生じ
るものと比べて５倍大きいプラークを生じた。このこと
は、キメラウイルスが、LLC−MK2細胞において、DEN4よ
りも効果的に複製したことを示唆する。これらの思わぬ
結果は、被感染LLC−MK2細胞におけるvTBE（ME）/DEN4
の増殖速度およびウイルス収量の分析により確認された
（図19参照）。
キメラウイルスの力価は108pfu/mLに達し、これは、
同一条件下で親DEN4により達成されるものにくらべて、
ほぼ1000倍高い。キメラvTBE（ME）/DEN4ウイルスは、
蚊C6/36細胞上でゆっくりと増殖し、親DEN4により生成
されるよりも100倍低い力価に達した。キメラvTBE（CM
E）/DEN4のプラークサイズは、LLC−MK2細胞上のDEN4の
ものと比べて、検知できるほどには異なっていなかっ
た。これらの研究において、ウイルスは、Bancroft他
（Pan Am.Health Organ.Sci.Publ.第375巻175〜178
頁、1979）に開示された技術を用いたプラーク検定によ
り、測定された。プラークサイズの相違は、TBEVのＣタ
ンパク質とDEN4ウイルスRNAとの非互換性を反映するも
のであり、これは、ウイルスRNAパッケージングおよび
ウイルス成熟の際のタンパク質の効率的な相互作用を妨
げる。また、プラークサイズの相違は、DEN4の5'非コー
ド領域におけるAUGコドンの上流の６個のヌクレオチド
の置換の結果である可能性もある。この配列変更は、ウ
イルスタンパク質翻訳の効率に影響し得る。
キメラ構築物からのウイルスRNA生成の分析（図20）
は、図21のタンパク質データとあわせて、被感染C6/36
細胞におけるvTBE（ME）/DEN4の小型プラーク表現型と
増殖速度低下の説明を与える。LLC−MK2またはC6/36細
胞の培養（約106個の細胞）は、ウイルス吸着の後のさ
まざまな時間に収集され、ドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）を含む緩衝液中に溶解された。Maniatis他（Molecul
ar Cloning,A Laboratory Manual,1982 Cold Spri
ng Harbor Laboratory,ニューヨーク）により提供さ
れた技術を用いて、フェノール抽出により、全RNAが細
胞溶解物と培地から分離された。RNA試料をホルムアル
デヒド中で変性し、ニトロセルロースフィルター（BA8
5,SchleicherおよびSchuell）に塗布した。フィルター
は、ニックトランスレーションされた32P標識pTBE（M
E）/DEN4のDNAプローブを用いて、ハイブリダイズされ
た。pTBE（ME）/DEN4からインビトロで作製されたRNA転
写物を陽性対照（コントロール）として用いた。
DEN4に感染したLLC−MK2またはC6/36細胞からのウイ
ルスタンパク質は、vTBE（ME）/DEN4に感染したLLC−MK
2またはC6/36細胞からのウイルスタンパク質と比較され
た。DEN4に感染したLLC−MK2またはC6/36細胞におい
て、Ｅ、NS1、NS3を含むDEN4ウイルスタンパク質は感染
後48時間で高レベルに蓄積した（図21）。しかしなが
ら、ウイルスタンパク質合成の動態は、vTBE（ME）/DEN
4感染LLC−MK2とC6/36細胞では異なっていた。ウイルス
タンパク質は、LLC−MK2細胞においては感染後８時間と
早く検出された。一方、C6/36細胞においては感染後48
時間まではウイルスタンパク質は検出されなかった。C6
/36細胞への接種の後、vTBE（ME）/DEN4ビリオンの約70
％が培地中に残っていた。一方、LLC−MK2細胞培養の培
地においては接種されたウイルスの小さなフラクション
のみが見られた。この発見は、キメラvTBE（ME）/DEN4
のLLC−MK2細胞への導入は、C6/36細胞への導入より
も、効率的であることを示唆している。そしてその結果
としてあり得ることは、このウイルスがDEN4ウイルスと
比較してこれらの細胞においてよりゆっくりと、かつ、
より低い力価に増殖するということである。LLC−MK2細
胞への導入の後、キメラウイルスRNAの複製は、DEN4ウ
イルスRNAのそれとくらべて迅速であった。一方、キメ
ラウイルスのRNA合成は、被感染C6/36細胞におけるDEN4
のそれよりもゆっくりであった。このように、vTBE（M
E）/DEN4は、蚊細胞内への導入の効率が低く、これは、
ウイルスRNAおよびタンパク質の生成低減に関連してい
た。これらの観察結果は、TBEVウイルスRNAのC6/36細胞
内へのトランスフェクションの効率が低いことと符合し
ている（Mandl他、J.Virol.第65巻、4070〜4077頁、199
1年）。
当業者には、１つのウイルスからの核酸配列を別のウ
イルスの核酸配列に組合せるために用いることのできる
さまざまな方法があることが理解されよう。このような
ライゲーション技法とクローニング戦略は公知である。
したがって、他の技術を用い得ること、および、これら
の技術の採用はクレームされた発明から逸脱しないこと
は言うまでもない。
キメラワクチンの効力と神経毒性の判定 vTBE（ME）/DEN4は、さまざまな投与経路を介して試
験動物にウイルス試料を導入することにより、ワクチン
としての防御効力について評価された。親デング熱ウイ
ルスと比較したvTBE（ME）/DEN4の神経毒性は、マウス
への脳内接種（IC）により分析された。他の投与経路と
しては、皮内（ID）または腹腔内（IP）注射が含まれ
る。１つの実験において、生後３日のBALB/cマウス乳児
に、ウイルス102pfuをMEM0.02mL/0.25％ヒト血清アルブ
ミンに加えた服用量を、IC注射した。別の組の実験にお
いて、生後６週のBALB/c雌マウスにIC、ID、IP接種を行
なった。21日間にわたり、脳炎の症候や死亡について、
マウスを観察した。生存した成体マウスは感染後20日後
に採血し、TBEVに対する抗体反応を評価した。ワクチン
の防御効力を判定するため、感染後21日目に、BL−４封
じ込め設備において、生存したマウスに、103LD50TBEV
（Sofjin株）をIP投与した。
vTBE（ME）DEN4は、乳児または成体マウスの脳（IC）
内に直接接種した場合、親TBEVの神経毒性を維持してい
た（図22および実施例21）。陽性対照として、TBEVの典
型的な株（Sofjin株）との比較を行なった。TBEVは神経
毒性が高く、0.1pfuで、IC接種した乳児マウスの50％に
新生児脳炎を起こした。同様に、TBEVは、IP接種した成
体マウスに対しても神経毒性が高かった。この場合に
は、ID50は14.2pfuであった。一方、vTBE（ME）DEN4
は、IDまたはIPのいずれかの周辺（末梢）経路により接
種した場合には脳炎を起こさず（図22参照）、これらが
潜在的に安全なワクチン接種経路であることが示され
た。
vTBE（ME）/DEN4の免疫原性は、生存したマウスの血
清抗体を用いた35S標識抗原を使用して、ウイルスに対
する抗体の免疫沈降検査を行うことにより分析された。
免疫沈殿物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
析したところ、DEN4 NS1（キメラウイルスによりコード
化されるタンパク質）に特異な抗体は容易に検出される
こと、しかし、TBEV Eに対する抗体は力価が低いか、検
出不可能であることが明らかになった。マウスはTBEVに
対する天然の宿主ではないため、マウスの周辺接種で
は、低レベルのウイルス複製しか行なわれないというこ
とが推定される。
vTBE（ME）/DEN4のIPまたはID接種を生き延びたマウ
スは、つぎに、致死量の投与に対する抵抗の徴候につい
て研究された。vTBE（ME）/DEN4またはDEN4ウイルス接
種の21日後、神経毒性の高いTBEVのSofjin株103LD50を
投与した。キメラvTBE（ME）/DEN4のIPまたはID接種で
生き延びたマウスは、この投与に対して防御ができてき
た。一方、先にDEN4で免疫化されたマウスの３つのグル
ープのすべては、11日〜20日の間に死亡した（図22参
照）。これらの結果は、ワクチンとしてのこのウイルス
は、TBEV感染に対して防御的であり特異的であることを
示した。非免疫化対照マウスは、TBEV感染の後、10日〜
16日の間に脳炎で死亡した。TBE（ME）/DEN4ウイルス
は、脳内接種の後、乳児および成体マウスの両方に、均
等に脳炎を起こした。一方、DEN4を接種したマウスで
は、デング熱ウイルス関連の疾病の発生頻度は低かっ
た。このように、キメラウイルスは、preMおよびＥ遺伝
子が由来した、もとのTBEVのマウス神経毒性を維持して
いる。このことは、すべてでないとしても、TBEVマウス
神経毒性マップの遺伝的決定基のほとんどが、これら２
つの構造タンパク質遺伝子内にあることを示している。
しかしながら、親TBEVとは異なり、cTBE（ME）DEN4は、
成体マウスに周辺接種した場合には病原性ではなく、周
辺接種により神経侵入性の損失が起きたことが示され
る。これらの発見は、TBEVがCNSに侵入し脳炎を生じる
ためには、preMおよびＥ遺伝子以外のTBEVゲノムの領域
が必要であることを示唆するものである。vTBE（ME）/D
EN4で周辺接種したマウスは、次回の致死量TBEVの腹腔
内投与に対して防御された。一方、DEN4で同様に接種し
たマウスではそうではなかった。これらの発見は、vTBE
（ME）DEN4のpreM（Ｍの前駆体）、Ｍ、および／または
Ｅタンパク質が、マウスにおけるTBEV脳炎に対する防御
免疫の主要な抗原決定基を含んでいることを示すもので
ある。
キメラvTBE（ME）/DEN4の神経毒性の改変 上記の「神経毒性に影響するデングゲノムにおける突
然変異」と題する項において説明したように、組換えデ
ング熱ウイルス構築物を、部位特異的突然変異誘発また
はPCRなどによる突然変異誘発により改変し、神経毒性
特性が低減したことによりワクチン接種に適した改変ウ
イルスを生成する。ここに開示するように、同様な技術
を用いて、vTBEV/DEN4ゲノムを改変して神経毒性を低減
させることができ、これにより、TBEVに対する弱毒化ウ
イルスワクチンの安全性が改善される。
TBEVの防御抗原を維持し、かつ、TBEVの周辺侵入性を
欠く、活性TBEV/DEN4キメラを構築することができれ
ば、この重要な病原体の免疫予防のための新規な戦略、
すなわち、弱毒化TBEVワクチンの開発の基盤が得られ
る。しかしながら、このゴールに到達するには、まず、
キメラのさらなる改変を達成しなければならない。すな
わち、ウイルスの脳内への直接接種により測定される、
CNSに対する神経毒性の除去である。TBEV/DEN4キメラ
は、親TBEVの神経毒性を維持しているため、キメラゲノ
ムのDEN4またはTBEV部分において戦略的突然変異を加工
し、マウス神経毒性に対するそれらの効果を評価するこ
とにより、この特性を無効にする必要があった。これら
の突然変異体は、ウイルスゲノム内の位置のいくつにで
も導入される突然変異を潜在的に含んでいる。初期の研
究は、以下の突然変異をもつキメラウイルスを評価し
た。すなわち、（１）5'非コード領域における欠失、
（２）preM−Ｍ開裂部位またはpreMあるいはＥあるいは
NS1タンパク質のグリコシル化部位を除去する突然変
異、（３）Ｅ遺伝子における点突然変異である。これま
でに試験された突然変異は図24に含まれている。
TBE（ME）DEN4構築物を系統的に改変し、神経毒性に
対する遺伝子的変更の効果について試験を行なうという
研究の一部として、タンパク質配列に１つ又はそれ以上
の変化を含む、６個の異なる構築物を作製した。実施例
22参照。当業者であれば、本発明において提供される技
術を用いて、TBE（ME）/DEN4構築物に対して任意の数の
置換、挿入、欠失を作製し、神経毒性における変化を試
験することができる。同様に、当業者であれば、遺伝子
組成における好ましくは少なくとも１つの変更を有する
キメラ構築物を、天然の配列を組合せたキメラ構築物と
比べて試験するために、図23に示す突然変異をこれらの
またはその他の突然変異と組合せることが容易に行なえ
る。
突然変異体キメラウイルスの作製を導く突然変異構築
物の能力を評価する研究において、トランスフェクショ
ンされたLLC−MK2細胞から６個の突然変異体キメラを回
収し、プラーク形態観察における変化についてウイルス
を分析した。突然変異体TBE（ME）/DEN4ウイルスの子孫
をLLC−MK2細胞内の継代培養により増幅し、LLC−MK2細
胞上または蚊C6/36細胞上でのプラーク検定により分析
した。キメラウイルスTBE（CME）/DEN4は、TBEVの３つ
の構造タンパク質遺伝子すべてを含んでいたが、同様に
分析された。また、野生型DEN4も、対照として用いられ
た。図24に示すように、各細胞株上のたいていの突然変
異体のプラークサイズは、親TBE（ME）/DEN4のウイルス
プラークに比して縮減しており、これらの突然変異体は
ウイルス複製について制限されていることが示唆され
る。ＥまたはNS1に欠陥グルコシル化部位を含んでいた
突然変異体は、試験された数組の突然変異体の中で最小
サイズのプラークを生じた。
突然変異体キメラ構築物は、マウスにおける神経毒性
についてさらに試験された。実施例21に記載されるよう
に、および、実施例23に記載されるように、マウスにウ
イルスを接種した。脳炎の徴候および死亡について、被
感染マウスを31日間観察した。＊NS1（１）−Glc-およ
び＊PreM/M-突然変異を含む構築物のLD50は、100pfuよ
り大きく、これらの突然変異体がマウス神経毒性におい
て100倍以上減少したことが示された。この発見は、NS1
（１）−Glc-、PreM/M-、あるいは両方の突然変異を、
マウス神経毒性の弱毒化を提供するために用いることが
できることを示す。この発見は、同様の突然変異を、日
本脳炎ウイルスを含む他の脳炎フラビウイルスの弱毒化
を提供するためにも採用できることを示唆するものであ
る。
さらに、LD50の値の増加により証明されるとおりマウ
スにおける神経毒性低下を示すこれらのキメラ構築物
は、つぎに、霊長類において試験されることはいうまで
もない。実施例24は、霊長類におけるワクチン効力に対
する試験法を提供する。霊長類研究における成功に続
き、本発明のワクチンは、ヒトに対する臨床試験におい
て試験される。当業者であれば、霊長類での研究をヒト
における研究に適したものに改変することができる。
したがって、本出願の発明は、多数のワクチンを提供
するとともに、デング熱ウイルスやその他のフラビウイ
ルスの血清型に対する防御免疫反応を発生させるために
キメラデング熱ウイルスワクチンを作製することを当業
者に教示する。このようなワクチン試料は、好ましく
は、キメラウイルスの集団を含み、各ウイルスは少なく
とも１つのデング熱ウイルスに対して構造タンパク質を
発現する。ウイルス学および分子生物学の当業者であれ
ば、ここに開示された技術を用いて、１つのフラビウイ
ルスの構造領域と第２のウイルスの非構造領域とを組合
せたキメラウイルスを作製することができる。好ましく
は、この第２のウイルスはデング熱ウイルスである、さ
らに好ましくは、この第２のウイルスは４型デング熱ウ
イルスである。さらに、本発明は、部位特異的突然変異
誘発などを用いてデング熱ウイルス構築物を改変するこ
とにより改良されたデング熱ウイルスワクチンを作製す
ることを当業者に教示する。
これらの改変は、キメラウイルス構築物に同様に組み
込まれることは言うまでもない。本発明は、さらに、デ
ング熱ウイルスの非構造領域および少なくとも１つの構
造領域を、別のフラビウイルスからの構造遺伝子領域と
組合せて含むキメラウイルスの作製ならびに試験を教示
する。特に、４型デング熱ウイルスからの１つの構造領
域ならびに非構造領域と、TBEVからの２つの構造タンパ
ク質をコードする配列とを含むキメラウイルスを含む、
TBEVのためのワクチンが開示されている。
TBEV（ME）/DEN4についてこれまでに観察された、励
みになる成果は、これらの技術が、TBEVよりもデング熱
ウイルスにより密接に関連したウイルスに対するワクチ
ンを作製する際にも有用であることを示唆している。こ
のような例の１つは、極東において依然として大きな公
衆衛生問題である日本脳炎ウイルスである。すなわち、
さらなる実施例において、本発明の技術は、DEN4cDNA非
構造領域を、日本脳炎ウイルスからの少なくとも１つの
構造遺伝子とDEN4の残りの構造遺伝子領域に組合せるた
めに用いられる。
さらに、本発明の技術を用いて、異なるフラビウイル
ス間の非構造領域および構造領域の他の組合せを同様に
して作製し試験することができることは言うまでもな
い。たとえば、日本脳炎ウイルスの組換え構築物を、ウ
イルス非構造領域はそのままにして、１つ又はそれ以上
の構造領域をダニ媒介脳炎ウイルスからの対応する遺伝
子配列で置換するように改変することができる。同様
に、ダニ媒介脳炎ウイルスをコード化する組換えcDNAを
生成し、構造領域を、デング熱ウイルス構造タンパク質
をコード化する少なくとも１つの遺伝子で置換すること
ができる。
ここにおよび下記の実施例において引用されるすべて
の刊行物は参照として取り入れられる。以下、本発明の
特別な実施例を詳細に検討し、本発明の範囲内での可能
な変型について言及する。本発明を成功裡に実施するこ
とのできる、さまざまな代替技術や手順が当業者には知
られている。
実施例およびそれに関連する一般情報 ウイルス:4型デング熱ウイルス株814669を用いて、完
全長感染性RNA転写物の転写源として用いられる完全長c
DNAを構築した（E.Mackow他（1987）Virology第159巻21
7〜228頁、B.Zhao他（1986）Virology第155巻77〜88
頁）。アカゲザル胎児肺細胞継代培養レベル９の１型デ
ング熱ウイルス西太平洋株（D1WP）の標本は、K.Eckels
博士の好意により提供された（WRAIR、ワシントンDC）
（K.T.McKee他（1987）Am.J.Trop.Med.Hyg.第36巻435〜
442頁）。マウス脳継代培養レベル38の、マウス神経毒
性２型デング熱ウイルスニューギニアＣ株（D2NGC）の
マウス脳標本は、D.Dubois博士の好意により提供された
（WRAIR、ワシントンDC）（A.B.Sabin（1952）Amer.J.T
rop.Med.Hyg.第１巻30〜50頁）。１型および２型デング
熱ウイルスは、C6/36蚊細胞内で１回、継代培養するこ
とにより増幅された。つぎに、これらの３つのウイルス
は、LLC−MK2サル腎臓細胞内で１回、継代培養された。
得られたウイルス懸濁液はプラーク形態観察およびマウ
ス神経毒性の研究に用いられた。
クローニングベクター:4型デングゲノムの5'側半分を
含むプラスミドp5'−２を３つの構造タンパク質遺伝子
の置換を容易にするために改変した（C.j.Lai他（199
1）Proc.Natl.Acad.Sci.USA第88巻5139〜5143頁）。ま
ず、唯一のXho I部位が、部位特異的突然変異誘発によ
り、Ｅの3'末端の近くの、４型デング配列のヌクレオチ
ド2342（Ａ−Ｇ）に導入され、p5'−２（Xho I）を作製
した。このヌクレオチド変更はアミノ酸配列を変更する
ものではなかった。このベクターはつぎに、デング配列
内の唯一のBstB I部位において、および、p5'−２内の
デング配列の直後の唯一のAsp718部位において、消化さ
れた。断片はデング４ゲノムの3'側半分に連結され、完
全長p2A（Xho I）を作製した。第２に、フラビウイルス
に保存されている、ヌクレオチド88のBgl II部位は、p
5'−２内の他の３つのBgl II部位を除くことにより、唯
一の部位とされた。pBR322およびSP6プロモーター間の
接合部におけるBal II部位は、Not Iリンカーを挿入す
ることにより除去された。4128および4277の他の２つの
部位は、最近導入された3473のPst I部位までベクター
を短くすることにより、除去された（K.T.McKee他（198
7）Am.J.Trop.Med.Hyg.第36巻435〜442頁）。つぎに、
プラスミドp5'−２（Xho I,Pst I）をフラグメント交換
に用い、キメラcDNAを作製した。
図１は、構築された完全長デングcDNAを含む、以下の
プラスミドを示す。p2A（Xho I）は、４型デングゲノム
の完全なcDNAコピーであり、唯一のXho I部位がＥ遺伝
子の3'末端の近くに創製された。p2A（D1WP）は、p2A
（Xho I）から、5'非コード領域内のBgl II部位と唯一
のXho I部位との間の配列を、１型デング西太平洋株の
対応するcDNAで置換することにより、得られた。p2A（D
2NGC）は、同様にして、Bgl II−Xho I断片を、２型デ
ングニューギニアＣ株からの対応するcDNAで置換するこ
とにより、作製された。B:Bgl II、X:Xho I、A:Asp718
制限酵素部位。
キメラcDNA:C6/36蚊細胞内で増殖した１型または２型
デング熱ウイルスを精製し、B.Zhao他（1986）（Virolo
gy第155巻77〜88頁）により説明された手順にしたがっ
てビリオンRNAを抽出した。１型デング配列のヌクレオ
チド2306〜2338にハイブリダイズするネガティブセンス
オリゴヌクレオチドを用いて、逆転写により、１型デン
グ第１鎖cDNAを合成した。このプライマー配列は、上記
のp5'−２（Xho I,Pst I）内の４型デングＥ遺伝子内の
部位に対応する位置にXho I部位を創製するために、ヌ
クレオチド2316におけるサイレントな第３塩基変更（Ａ
−Ｇ）を含んでいた。つぎに、１型デングcDNAを鋳型と
して、ネガティブセンスオリゴヌクレオチドおよび１型
デングヌクレオチド51〜70にハイブリダイズする保存さ
れたBgl II部位を含むポジティブセンスプライマーを用
いて、PCRにより２本鎖DNAを合成した。PCR産物をBgl I
IおよびXho Iで消化し、つぎに、p5'−２（Xho I,Pst
I）にクローン化し、対応する４型デング配列を置換し
た。つぎに、１型デング配列を含むCla I−Xho I断片を
p2A（Xho I）からの残りの４型デングcDNAに連結し、完
全長キメラp2A（D1WP）を創製した。同様に、２型デン
グヌクレオチド2310〜2364にハイブリダイズするネガテ
ィブセンスプライマーを用いて、２型デング第１鎖cDNA
を合成した。このプライマーは、2333におけるＴ−Ｃ、
2336におけるＡ−Ｇ、2337におけるＣ−Ａの、３つの塩
基変更を含む。これらの変更は、上述した４型デング遺
伝子におけるXho I部位に対応する位置にXho I部位を創
製する。これらの変更はアミノ酸配列を変えるものでは
なかった。PCRによる２本鎖DNA合成のために、ネガティ
ブセンスプライマーが用いられ、１型デングに対しては
ポジティブセンスプライマーが同じく用いられた。PCR
産物をBgl IIおよびXho Iで消化し、p5'−２（Xho I）
にクローン化し、Cla I−Xho I断片を用いてp2A（Xho
I）の対応する断片を置換してp2A（D2NGC）を作製し
た。
RNA転写、トランスフェクション、およびウイルスの
回収：完全長RNA転写物を用いた細胞のトランスフェク
ションは、C.J.Lai他（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA
第88巻5139〜5143頁に記載されているようにして実施さ
れた。トランスフェクションの10日後、細胞はトリプシ
ン処理され、６穴プレートおよびチェンバースライドに
移された。２日後、免疫蛍光検査（IFA）により、デン
グ熱ウイルス抗原の存在について、スライド上の細胞を
試験した。ほとんどの細胞が感染したことがIFAにより
示された場合には、６穴プレート内の細胞をトリプシン
処理し、６倍量の非感染細胞と混合し、通常６〜７日後
に細胞病理効果（培地内の多数の死亡細胞の出現）があ
らわれるまで、インキュベートした。つぎに、培地を取
り出し、細胞をかきとり、標準容積の50％Eagle最小必
須培地/50％血清に再懸濁し、凍結することにより、感
染細胞を収穫した。他方、陽性細胞の割合が小さい場合
には、細胞をトリプシン処理し、新鮮培地に1:3で希釈
し、非感染細胞を添加せずに増殖させる。感染細胞の割
合を週ベースで評価し、間隔をおいて細胞溶解物を収穫
しウイルスの力価を測定した。
デング熱ウイルス抗原の検出：感染細胞は、血清型特
異的モノクローナル抗体（mab）1F1（１型デング）、3M
5（２型デング）、5D4（３型デング）、1H10（４型デン
グ）およびNS1特異的mab1G6（４型デング）を用いて、I
FAにより分析された。これらは、もともとM.K.Gentry博
士およびE.Henchal博士により作製されたものである（W
RAIR、ワシントンDC）（E.A.Henchal他（1982）Am.J.Tr
op.Med.Hyg.第31巻548〜555頁）。モノクローナル抗体
は、1:50〜1:300の希釈で用いた。一方、フルオレセイ
ン接合抗マウス抗血清（Kierkegaard−Perry Laborato
ries、メリーランド州Gaithersburg）は1:100で用い
た。結果は写真で記録した。各mabについて、陰性結果
を生じた感染細胞を、陽性細胞と同じ露光時間で写真撮
影した。親（野生型）デング熱ウイルスと子孫ウイルス
v2A（Xho I）のタンパク質を分析するため、６穴プレー
ト内のコンフルエントLLC−MK2細胞をMOI0.2でウイルス
に感染させた。感染の６日後、６時間にわたり50μCi/
ウェルのＳ−メチオニンを含まない培地で細胞を標識し
た。つぎに、RIPA緩衝液に細胞を溶解した。キメラウイ
ルスv2A（D1WP）については、細胞のほぼ100％が感染し
たときに、標識化を実施した。一方、v2A（D2NGC）につ
いては、約30％が感染したときに標識化を実施した。適
当な同型または異型高度免疫マウス腹水（HMAF）を用い
て溶解物を沈殿させ、SDS−12％ポリアクリルアミドゲ
ル上の電気泳動により分析した。
プラーク形態：ウイルスは、LLC−MK2細胞上でのプラ
ーク形態について調べられた（W.H.Bancroft他（1979）
Pan.Am.Hlth.Org.Sci.Publ.第375巻175〜178頁）。プラ
ーク形態の分析の前に、各親ウイルスをLLC−MK2細胞内
で１回、継代培養した。インキュベーションの６〜９日
後に、ニュートラルレッドを培養物に重層した。
乳児マウスにおけるキメラウイルスの評価：生後３日
のスイスマウスに、2000pfuの親またはキメラデング熱
ウイルスを、ウイルスに感染したLLC−MK2細胞を希釈し
た溶解物の形で、脳内接種した。陰性対照マウスには非
感染細胞の溶解物を注射した。親４型デング熱ウイルス
（814669）、１型デング熱ウイルスWP、または２型デン
グ熱ウイルスNGCについて、１リットルが接種された。v
2A（Xho I）、v2A（D1WP）、またはv2A（D2NGC）につい
て、２リットルが接種された。21日間にわたり、脳炎の
徴候および死亡について接種されたマウスを監視した。
実施例１ キメラcDNAおよびウイルス 完全長４型デング熱ウイルスcDNA（p2A）を用い、構
造遺伝子配列を１型または２型デング熱ウイルスの対応
する配列により置換したキメラウイルスを構築した。こ
の目的のために選択された１型ウイルス（WP）は、マウ
スの脳内での増殖に適さなかった低レベルの継代組織培
養株であった。２型株（NGC）は、マウスにおける脳内
連続継代培養の間に選抜された神経毒性の高い突然変異
体であった。２型突然変異体がこの研究のために選択さ
れたのは、マウス神経毒性の遺伝的決定基のマッピング
の可能性を提供するからである。
プラスミド構築体p2A（Xho I）、p2A（D1WP）、また
はp2A（D2NGC）を用いた大腸菌HD1528株の形質転換によ
り、安定なプラスミド集団が創製された。これらのプラ
スミドの推定された構造は図１に示されている。これら
の構造は制限酵素マッピングにより証明された。
第12日目のデング熱ウイルス抗原に対する免疫蛍光染
色により、p2A（Xho I）からのRNA転写物でトランスフ
ェクションされたLLC−MK2細胞のほぼ半数が陽性であっ
た（図2A）。
図２は、（Ａ）p2A（Xho I）、p2A（D1W）、またはp2
A（D2NGC）からのRNA転写物を同一濃度で用いてトラン
スフェクションしたLLC−MK2細胞を示す。トランスフェ
クション後のウイルス感染細胞のパーセンテージは、新
鮮培地中に移した後でIFAにより測定された。（Ｂ）細
胞の大多数がIFAで陽性となったときに感染細胞を収穫
した。ウイルスの力価測定はプラーク検定により実施さ
れた（W.H.Bancroft他（1979）Pan Am.Hlth.Org.Sci.P
ubl.第375巻175〜178頁）。
以前の研究において、p2Aおよびp2A（Pst I）からの
転写物を用いたトランスフェクションの12日後に、20〜
50％の範囲の同様な割合の抗原陽性細胞が観察された。
いずれの場合にも野生型表現型をもつウイルスが産生さ
れた（C.J.Lai他（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA第88
巻5139〜5143頁）。一方、p2A（D1WP）またはp2A（D2NG
C）からの転写物を用いてトランスフェクションされた
細胞は、12日目に、その１％未満が陽性であった。v2A
（D1WP）に感染した細胞の割合は、19日目にほぼ５％、
26日目に30％、33日目に80％に増加した。このとき、ト
ランスフェクションされた細胞内に存在するウイルスの
力価は５×106pfu/mLであった（図2Aおよび2B）。ま
た、v2A（D2NGC）はよりゆっくりと増殖した。我々は、
19日目に細胞の１％が陽性であると算定したが、54日目
までに感染したのは細胞の３分の１に満たなかった。ウ
イルス力価は30日目には1.5×102pfu/mL、44日目には2.
5×102に過ぎなかった。104pfu/mLに到達したのは58日
目であった。トランスフェクションの72日後に、細胞の
大多数が感染し、細胞懸濁液の力価が102pfu/mLである
ことが認められた。
p2A（Xho I）RNA転写物（106pfu/mL）でトランスフェ
クションした細胞により生成されるウイルスの力価は、
細胞培養に４型ウイルスをMOI0.1で感染させたときに観
察されたものと同じであった。さらに、１型/4型キメラ
（５×106pfu/mL）でトランスフェクションされた培養
により生成されるウイルスの最高力価は、１型ウイルス
（1.5×107pfu/mL）をMOI0.1で用いて細胞培養を感染さ
せた後に観察されたものと同じであった。トランスフェ
クション（102pfu/mL）の後に生成される２型/4型キメ
ラの最高力価は、MOI0.5で親２型ウイルスに感染させた
細胞培養により生成されたものと同じであった。
実施例２ キメラ構造タンパク質の性質 図３に示すように、子孫ウイルスを調べるために、間
接的免疫蛍光検査を実施した。
図３は、v2A（Xho I）、v2A（D1WP）、または、v2A
（D2NGC）に感染させたLLC−MK2細胞、もしくは非感染
細胞上で実施された免疫蛍光検定を示す。モノクローナ
ル抗体は、1:50〜1:300の希釈で用いた。一方、フルオ
レセイン接合抗マウス抗体は1:100で用いた。モノクロ
ーナル抗体の血清型特異性は左側に示されている。
v2A（Xho I）に感染させた細胞は、IFAにより、４型
デング特異的mabIH10で染まったが、１型デング特異的m
ab 1F1または２型デング特異的mab 3M5には結合しなか
った。予測されたように、v2A（D1WP）に感染した細胞
は1F1とのみ反応した。v2A（D2NGC）に感染したもの
は、3H5のみに染まった。３型デングに特異的なmab 5D4
は、どの感染細胞とも反応しなかった。これらの結果
は、キメラウイルスの両方とも、その構造タンパク質遺
伝子により特定される免疫原性をあらわすことを示し
た。期待されるように、４型デング非構造タンパク質NS
1に特異的なmab 1G5は、４型デングcDNAすなわち2A（Xh
o I）の子孫に感染した細胞を染めた。なお、４型ウイ
ルスに由来するキメラウイルス2A（D1WP）または2A（D2
NGC）の各々についても同様であった。
親４型デング熱ウイルスの、および、そのcDNA由来の
子孫v2A（Xho I）のタンパク質は、同型HMAFを用いた免
疫沈殿検査とその後のポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析すると、同一のようであった（図４）。図４
は、ウイルス感染LLC−MK2細胞または非感染対照細胞の
35S−メチオニン標識された溶解物を示し、１型、２
型、４型デングに対して作製された高度免疫マウス腹水
（HMAF）で免疫沈降され、SDS−12％ポリアクリルアミ
ドゲル（アクリルアミド：ビス＝60:1.6）上の電気泳動
により分析された。各レーンの先頭に、ウイルスが縦に
示され、溶解物を免疫沈降させたHMAFが横に示されてい
る。マーカー：タンパク質分子サイズマーカーはキロダ
ルトンである。１型、２型、４型デングのＥおよびpre
−Ｍグリコタンパク質の位置が示されている（図４）。
さらに、親１型デング熱ウイルス（WP）および２型デ
ング熱ウイルス（NGC）のタンパク質を分析した。１型
デングおよび２型デングのＥグリコタンパク質は共に移
動したが、それらは４型デングよりもゆっくりと移動し
た。同様に、１型および２型デングのpre−Ｍグリコタ
ンパク質は共に移動したが、やはり４型デングのpre−
Ｍよりもゆっくりと移動した。Ｅタンパク質の相対的な
分子サイズの相違はほぼ4kdであった。一方、pre−Ｍタ
ンパク質については約1kdであった。これらＥおよびpre
−Ｍの分子サイズの相違は、おそらく、グリコシル化の
程度における変化または配座的相違によるものであろ
う。v2A（D1WP）およびv2A（D2NGC）ウイルスの免疫沈
降されたタンパク質はハイブリッドパターンを示した。
１型デングHMAFを用いて免疫沈降したv2A（D1WP）のpre
−ＭおよびＥは、親１型デングのpre−ＭおよびＥと共
に移動した。しかし４型デングHMAFは、４型デング非構
造タンパク質と共に移動したバンドだけを沈降した。親
２型デングのpre−ＭおよびＥも同様であったが、４型
デングHMAFは４型ウイルスのものに似ている非構造タン
パク質を沈降させた。
親４型デング熱ウイルスおよびそのcDNA由来の子孫v2
A（Xho I）は、LLC−MK2細胞（図示せず）上に同様のプ
ラークを生成した。親ウイルスのプラークは、感染の６
日後にニュートラルレッドで染色すると明確に目視でき
た。しかし、キメラv2A（D2NGC）は、その時点では、検
出可能なプラークを生成しなかった。しかしながら、染
色を第９日まで遅らせると、非常に小さいv2A（D2NGC）
プラークが検出され、これはv2A（Xho I）または野生型
２型デングNGCのものよりも非常に小さかった（図
５）。４型デング814669のプラークは、子孫ウイルスv2
A（Xho I）のそれとは異ならなかった。v2A（D1WP）の
プラークは基本的にv2A（Xho I）のものと同様であっ
た。
図５は、被感染LLC−MK2細胞の単層を示し、子孫ウイ
ルスv2A（Xho I）のものとは異なっている。v2A（D1W
P）のプラークは基本的にはv2A（Xho I）のものと同様
であった。
図５は、デングウイルスに感染し、ついでアガロース
オーバーレイが加えられたLLC−MK2の単層（モノレイヤ
ー）を示す（W.H.Bancroft他（1979）Pan Am.Hlth.Or
g.Sci.Publ.第375巻175〜178頁）。細胞単層の感染の９
日後、ニュートラルレッドを重層し、翌日プラークの写
真を撮影した。A:2A（Xho I）、B:2A（D1NGC）、C:野生
型NGC3型デング。
実施例３ 乳児マウスに対するウイルスの神経毒性 キメラv2A（D2NGC）を、その親ウイルスであるマウス
脳適合２型デングNGCおよびv2A（Xho I）と、マウス神
経毒性について比較した。２型デングNGCはもっとも迅
速な致死性をもつことが証明された。接種後第５日また
は第６日に10匹のマウスの各々が脳炎で死亡し、平均生
存時間は5.1日であった。一方、キメラv2A（D2NGC）を
接種した15匹のマウスの各々は死亡するまで８〜11日間
生存し、平均生存期間9.1日であった（図６）。
図６は、親またはキメラデングウイルス2000pfuを、
被感染LLC−MK2細胞を希釈した溶解物の形で脳内接種し
た生後３日のスイスマウスについて示す。注射されたマ
ウスの数は:2型デング（NGC）10匹、v2A（D2NGC）15
匹、４型デング814669 12匹、v2A（Xho I）18匹。陰性
対照（マウス11匹）には非感染細胞の希釈溶解物を注射
した。マウスは、脳炎の徴候および死亡について毎日観
察された。
生存分布における差異は大きい（ｐ＝00001、スミル
ノフ２点統計）。さらに、親ウイルス４型デング814669
は、その子孫v2A（Xho I）と比較された。親ウイルスを
接種した12匹のマウスのうち５匹が脳炎で死亡し、最初
の死亡は第11日に起きた。一方、v2A（Xho I）を接種し
た18匹のマウスのうちただ１匹だけが接種の16日後に死
亡し残りは健康を保った。生存分布は、スミルノフ統計
によれば大きく異なってはいない（ｐ＞.14）が、２つ
のグループの生存率はフィッシャー精密試験では異なっ
ている（ｐ＝.0256）。このことは、４型デング81466
9、または、ウイルス調製におけるビリオンのサブセッ
トが、ある程度の神経毒性を所有していること、およ
び、子孫ウイルスv2A（Xho I）が非神経毒性の下位集団
［sub−population］をつくるかクローニングまたはウ
イルス繁殖の際に生じるヌクレオチド変化を含むことを
示唆している。親１型デング熱ウイルス（WP）を接種し
たマウスと、またはそのキメラ子孫v2A（D1WP）を注射
した12匹のマウスと、非感染細胞の溶解物を受け入れた
11匹のいずれも、脳炎を起こさなかったし死亡しなかっ
た。
突然変異分析 我々は、４型デング熱ウイルスゲノムの完全長にわた
る一連のデングcDNAインサートをクローン化した。これ
らは、実施例４にあるように、完全長デングDNAをクロ
ーン化するという最初の試行において用いられた。
実施例４ SP6プロモーターを含むプラスミドpBR322における完全
長デングDNAをクローン化する最初の試行 さまざまな４型デングcDNAインサートを、共有された
制限酵素部位において連結し、pBR322の同じPst Iクロ
ーニング部位を用いて、完全長デングDNAコピーを形成
した。インビトロ転写のために、SP6ポリメラーゼプロ
モーター配列を、デング配列の前の5'末端に配置した。
RNA転写物の予測された5'配列は図７に示されている。
第１のデングヌクレオチドのＡ残基は、Ｇで始まる正常
SP6ポリメラーゼ転写物の直後に位置している。ゲノムR
NAの5'末端に存在するm7Gキャップ構造は、転写反応にm
7GpppG類似物を添加することにより得られる。このよう
なDNA構造は、5'末端に付加ヌクレオチドを含むデングR
NAを生成することになるだろう。ランオフ［run−off］
転写物を作製するために、唯一のAsp718開裂配列が、デ
ング配列の3'末端に導入された。図７に示すように、鋳
型鎖中には、Asp718開裂部位の前に５個の付加ヌクレオ
チドが存在する。転写が最後のヌクレオチドに進むと、
RNA転写物には、3'末端におけるこれらの５個の付加残
基が含まれることになる。
形質転換のための宿主として大腸菌株HB101を用いた
この研究中に気づいたことは、完全長デングDNAを含む
プラスミドは、再配列を経た多くの形質転換体における
プラスミドとしてしばしば不安定であり、予測された制
限酵素パターンをもつクローンDNAを単離するためには
多数のコロニーをスクリーニングしなければならないと
いうことである。我々は、異なる大腸菌株により作製さ
れるプラスミドの安定性を調べた。研究室ですでに用い
られていた、形質転換に高度に適した市販の大腸菌株DH
5αおよび大腸菌株DB1528を、大腸菌株HB101と比較し
た。DB1528株は、HB101よりもコロニーサイズが３〜４
倍大きい形質転換体を産生した。特に、DB1528の形質転
換体は、一般に、予測された制限酵素パターンをもつプ
ラスミドを産生し、このことは、大腸菌株DB1528が、安
定的にクローン化されたデング完全長DNAを生成するた
めの優秀な株であることを示唆している。しかしなが
ら、トランスフェクション細胞上で試験した場合、この
第１の完全長デングDNAクローンから作製されたインビ
トロRNA転写物は、デング熱ウイルスを産生しなかっ
た。ここで、免疫蛍光検定により検出されるように、10
0倍低い濃度の、陽性対照としてのビリオンRNAはデング
熱ウイルスを産生した。
実施例５ 独立に由来するDNAクローンを用いた、完全長構築物に
おけるデングDNAセグメントの置換 感染性RNA転写物を産生できないのは、完全長クロー
ンにおける欠陥突然変異の存在によるものであると説明
された。このような突然変異は、ウイルス株における欠
陥集団のクローニングまたはプラスミドのクローニング
または繁殖の際の結合エラーから生じると推定される。
我々は、１つ又はそれ以上の欠陥突然変異を含むデング
DNAセグメントを、独立にクローン化したデングDNA構築
物からの対応するセグメントで置換することに決定し
た。系統的な置換実験のためのフレームワークとして、
デング配列の5'および3'断片を別々にクローン化した。
ヌクレオチド5069における唯一のBstB1部位を用いて、
完全長デング配列を、各々ゲノムの約50％を示す２つの
断片に分離した。SP6プロモーターを含む第１の完全長
クローンの5'断片は、5'−１と呼ばれ、BstB1とAsp718
の間の残りの3'配列は3'−Ａと呼ばれた。第２の5'断片
5'−２を含むプラスミドは、独立に由来するひと組のデ
ングcDNAインサートから構築された。唯一のAsp718部位
は、デング配列のBstB1部位の下流のpBR322のPst I部位
に導入された。このように、このプラスミドは、完全長
DNA構築物に3'断片を挿入するためのクローニングベク
ターとしても適している。２つの付加3'断片3'−Ｂおよ
び3'−Ｃも、デングcDNAインサートの独立したひと組か
ら構築された（図８）。第１の完全長クローン1A内の3'
断片を3'−Ｂおよび3'−Ｃ断片で置換すると、２つの別
の完全長クローン1Bおよび1Cが作製された。同様に、３
つの完全長DNA構築物すべてにおいて5'断片を5'−２断
片で置換すると、３つの別の完全長クローン、すなわ
ち、2A、2B、2Cが生成された。これらのプラスミドをBg
l II、Nsi I、Asp718で消化すると、図９に示されるよ
うに、６個の完全長クローンすべてについて区別不可能
な、予測されたDNA断片のパターンを示した。このよう
に、大腸菌株DB1528中の完全長デングDNA配列を明らか
に含むプラスミドの増殖に成功することによって、培養
細胞における感染性の評価のためのインビトロRNA転写
物の生成が可能となった。
実施例６ インビトロで作製されたRNA転写物の感染性についての
最初の証拠 構築された完全長デングDNA鋳型から生成されたRNA転
写物は、LLC−MK2のトランスフェクションにより、感染
性についてそれぞれ試験された。デング感染細胞は、間
接的免疫蛍光検定により検出されるとおり、2A RNAでの
トランスフェクションの10日後に容易に観察された。他
の４つの完全長DNAクローンからのRNA転写物は、この検
定では陰性であり、これらのDNAクローンは、クローン1
Aのように、制限酵素分析では検出できない致死突然変
異を含んでいることが示された。
上述したデング熱ウイルス感染細胞の陽性判定に加え
て、感染性デング熱ウイルスを、培地または2A RNAトラ
ンスフェクション細胞の細胞溶解物から回収した。トラ
ンスフェクション細胞溶解物中に存在するデング熱ウイ
ルスの力価は105pfu/mLであった。2A RNA転写物をDNase
Iを用いて処理した場合、その感染性には影響がなかっ
たが、RNase処理ではその感染性は完全に損なわれた。R
NAを用いた細胞モノレイヤーのトランスフェクションの
後、デング熱ウイルスのプラーク形成は行なわれなかっ
たため、ウイルスの生成は、ウイルス増幅のための延長
されたインキュベーションの後で判定された。この間接
的免疫蛍光検定手順を用いて、感染性は、ゲノムRNA1ng
または2A RNA転写物10ngの最小濃度において検出され
た。この試験のこれらの結果は、クローン2Aから作製さ
れたRNA転写物が、受容培養細胞のトランスフェクショ
ンの後で、感染性を持つことを示している。
実施例７ RNA転写物の感染性についてのその他の証拠 クローン2A RNA転写物でトランスフェクションした細
胞により、感染性デング熱ウイルスが生成されたことを
正式に証明するため、デングゲノムのヌクレオチド3473
に新たなPst I部位を創製するがアミノ酸配列には影響
しない２つの突然変異（G3473−→ＴおよびC3476−→
Ｔ）を、完全長デングクローン2A DNAに導入した。この
突然変異DNAから作製されたRNA転写物を、DNase Iを用
いた消耗性消化によりDNA鋳型を完全に除去したのち、
細胞のトランスフェクションに用いた。トランスフェク
ションされた細胞は感染性デング熱ウイルスを生成し
た。子孫ウイルスから抽出されたゲノムRNAを逆転写
し、cDNA産物をPCRのための鋳型として用いて、ヌクレ
オチド3193〜4536の間にDNA断片を生成した。図10に示
すように、PCR DNA産物のPst I消化は、Pst I開裂配列
の存在により予測されるように、それぞれ280個および1
063個の塩基対の長さの２つの断片を産生した。2A RNA
由来のウイルスの対照PCR DNA産物は、Pst I消化に対し
ては非感受性であった。この観察は、突然変異体2A DNA
のRNA転写物に由来する子孫ウイルスがPst I部位を含む
ことの証拠を提供した。
実施例８ インビトロで転写された感染性RNAから回収されたデン
グ熱ウイルス クローン2Aまたはクローン2A（Pst）鋳型から作製さ
れたRNA転写物を用いてトランスフェクションした細胞
の溶解物から子孫デング熱ウイルスを分離し、LLC−MK2
細胞単層上でのプラーク形成能力について、親・野生型
ウイルスと比較した。感染の６日後、子孫ウイルスおよ
び親ウイルスは、ともに、さまざまな大きさの特徴的な
デングプラークを生成した。蚊細胞内の継代培養により
増殖した親ウイルスでは圧倒的に小型プラークがみられ
たが、子孫ウイルスでは混合的でありしかし主に大きい
プラークが生成され、回収されたウイルスがクローン化
集団を提供することを示唆している。子孫ウイルス感染
細胞および親ウイルス感染細胞において生成されたデン
グ特異タンパク質についても比較を行なった。図11に示
すように、デング高度免疫腹水により沈殿させたPreM、
Ｅ、NS1、NS2、およびその他未決定のデングタンパク質
バンドのプロフィールは、子孫ウイルスおよび親ウイル
ス双方について識別不可能であるように見えた。この結
果は、回収されたデング熱ウイルスが、cDNAクローンが
由来するもとのウイルスと同じ遺伝子型および表現型を
呈することを示すものである。
NS1−NS2A開裂接合部におけるアミノ酸置換による活性
デング熱ウイルスの加工 実施例９ 開裂部位配列におけるアミノ酸置換を特定するNS1−NS2
A DNAの構築 真正［authentic］NS1の発現のために構築された中間
組換えpSC−11−NS1−NS2A DNAをこの研究に用いた。デ
ング熱ウイルスDNAは、24アミノ酸Ｎ末端信号のための
コード配列と、NS1およびNs2Aの完全ポリペプチド配列
を含んでいた。まず、このプラスミドDNAを、突然変異
を含むDNAセグメントの置換を容易にするために改変し
た。２つのサイレントな突然変異が、オリゴヌクレオチ
ド特異的突然変異誘発により、NS1−NS2A DNA（G3473→
ＴおよびC3476→Ａ）に導入された。これらの変更は、
ヌクレオチド（nt）3476に新たなPst I部位を作製し
た。組換えプラスミドは、デングNS1コード配列中のnt3
320に唯一のNco I部位を含んでいた。NS1−NS2A開裂接
合部はnt3477に位置している。開裂部位配列にアミノ酸
置換を導入するために、オリゴヌクレオチド誘発突然変
異により、ヌクレオチド変更を行った。一連のオリゴヌ
クレオチドを合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に
おける負鎖プライマーとして用いた。正鎖プライマー
は、5'AAGGCTATGCCACGCAAA3'（配列番号１）であり、Nc
o I部位の上流に位置していた。たとえば、開裂位置−
２（Thr1124）において、オリゴGCC CTG GCC GGC C
TT CAC CTG TGA TTT GAC CAT（配列番号２）が、
ThrをLysで置換するために用いられた。同様にして、オ
リゴGCC CTG GCC GGC CTG CAC CTG TGA TTT G
AC CAT（配列番号３）が、ThrをGlnで置換するために
用いられ、オリゴGCC CTG GCC GGC CAG CAC CTG
TGA TTT GAC CAT（配列番号４）が、ThrをLeuで置
換するために用いられた。同様に、オリゴTTC TGA TG
T GCC CTG TTC GGC CGT CAC CTG TGA（配列番
号５）が、開裂位置＋１においてGly1120をGluで置換す
るために用いられ、あるいは、オリゴTTC TGA TGT G
CC CTG CCA GGC CGT CAC CTG TGA（配列番号
６）が、開裂位置＋１において同じGlyをTrpで置換する
ために用いられた。
特定された突然変異を含む中間組換えDNAの構築のた
め、あらたに作製されたPst I部位と唯一のNco I部位の
間のDNA断片を、Nco IおよびPst Iで開裂されたPCR DNA
産物のシリーズで置換した。これらの突然変異体NS1−N
S2A配列を発現する組換えワクシニアウイルスは、すで
に説明された手順（B.Zhao、G.Prince、R.Horswood、K.
Eckels、P.Summers、R.Chanock、およびC.J.Lai（198
7）、組換え体ワクシニアウイルスによるデング熱ウイ
ルス構造タンパク質および非構造タンパク質NS1の発
現、J.Virol.第61巻4109〜4022頁）にしたがって作製さ
れた。
実施例10 NS1−NS2A接合部における開裂の分析 ６穴プレート内のコンフルエントCV−１細胞を、細胞
あたり5pfuの組換えワクシニアウイルスに感染させ、最
小必須培地に２％ウシ胎児血清（MEM2）を加えた中に保
持した。感染の16〜20時間後、培地を取り出してメチオ
ニン非含有MEM2とともに置いた。１時間のインキュベー
ションの後、この培地は、ふたたび、100μの35Sメチオ
ニン（比放射能＞800μm/mol）を含む0.7mLのメチオニ
ン遊離MEM2とともに置かれた。２時間の標識期間の後、
RIPA緩衝液（デオキシコール酸ナトリウム１％、Nonido
tP−40を１％、硫酸ドデシルナトリウム［SDS］0.1％、
0.1Mトリス塩酸、pH7.5、0.15M NaCl）に細胞を溶解
し、溶解物を遠心分離して細胞砕片を除く。溶解物の澄
んだ上澄み液に対して、デング高度免疫マウス腹水（HM
AF）を用いた免疫沈降検査を行ない、デング熱ウイルス
を分析した。免疫沈殿物は、SDS−12％ポリアクリルア
ミドゲル（アクリルアミド／ビス比60:1.6）上の電気泳
動分離により分析された。標識されたタンパク質バンド
は、蛍光撮影により視覚化された。非開裂NS1−NS2A前
駆体および開裂NS1産物に対応するゲルバンドが切り出
され、液体シンチレーションカウンターで放射能が計測
された。
NS1−NS2A接合部における開裂の程度を判定するため
に、発現したNS1−NS2Aの総標識は、同じpfu使用で各突
然変異体に感染した細胞において同じであるという仮定
にもとづいて、NS1−NS2AおよびNS1の間の免疫沈降能力
差を補正した。野生型NS1−NS2Aは、開裂されたNS1を優
勢的に発現し、NS1−NS2A前駆体は検出されなかった。
野生型ウイルスについての開裂度を100％と定めた。
実施例11 NS1−NS2A開裂配列におけるアミノ酸置換を特定する完
全長４型デングcDNAの構築 前項において構築され分析された、NS1−NS2A接合部
における開裂度が低下したNS1−NS2A DNAの突然変異体
は、このようなアミノ酸置換を含むデング熱ウイルス突
然変異体の構築のために選抜された。すでに構築された
以下の４つの突然変異が採用された。（１）開裂位置＋
１におけるGlyをGluに置換、（２）−２位置のThrをLys
に置換、（３）−２位置のThrをGlnに置換、（４）−２
位置のThrをLeuに置換。突然変異体psc11−NS1−NS2A D
NAを、nt3338のSpe Iおよびnt3616のStu Iで消化し、27
8個の断片として分離した。突然変異を含むこのDNA断片
は、デングcDNA配列の5'側半分を含むプラスミドp5'−
２内の対応する野生型DNA断片の置換に用いられた。Bst
E1（nt5069）と3'末端のAsp718の間の残りの3'デングcD
NA断片は、共有制限酵素開裂部位においてp5'−2DNAに
連結された。このようにして、完全長cDNAが作製され、
pBR322ベクターを用いてクローン化された。このシリー
ズのcDNAは、NS1−NS2A開裂接合部にアミノ酸置換をコ
ード化する突然変異された配列を含んでいた。
実施例12 NS1−NS2A接合部における最適でない開裂を呈する４型
デング熱ウイルス突然変異体 ここで重要なことは、デング熱疾病に対する安全で効
果的な弱毒化生菌ウイルスワクチンの開発に、デング熱
ウイルスの分子理解を応用することである。デング熱ウ
イルス複製の制限は弱毒化を誘起するであろう。開裂配
列またはウイルスプロテアーゼ構成要素の改変の結果、
ウイルスポリタンパク質の開裂は最適以下となり、ウイ
ルス増殖が制限される。
ポリタンパク質NS1−NS2A開裂部位は、その非効率的
開裂の故に、増殖制限されたデング熱ウイルス突然変異
体を構築するための第１のターゲットとして選択され
た。我々は、４型デング熱ウイルスのNS1−NS2A開裂に
は、開裂接合部の前のNS1のＣ末端に８アミノ酸配列が
必要であることを証明した（H.HoriおよびC.J.Lai（199
0）。デング熱ウイルスNS1−NS2Aの開裂には、NS1のＣ
末端にオクタペプチド配列が必要である。J.Virol.第64
巻4573〜4577頁）。
フラビウイルス間で８アミノ酸配列を比較すると、Al
a（−１）、Val（−３）、Ser（−５）、Val（−７）、
Met/Leu−８）は正確に保存されるのに対し、Thr（−
２）、Gln（−４）、Lys（−６）は変化するという興味
深い特色が明らかになった。位置−１のAla、位置−２
のThr、位置−３のVal、位置＋１のGlyのアミノ酸置換
の効果を分析した。この分析の結果は図16に示されてい
る。保存された位置−１または−３におけるアミノ酸置
換は、低レベルの開裂を生じた。非保存位置−２または
＋１におけるアミノ酸置換は、効果がないかもしくはご
くおだやかな開裂低減を呈した。
ある範囲の開裂効率を生じたアミノ酸置換のパネル
を、完全長cDNAへの組み込みのために選抜し、インビト
ロ由来RNA転写物をデング熱ウイルス突然変異体の構築
のために用いた。１つのデング熱ウイルス突然変異体
は、Gly（＋１）のかわりにGluを含むDEN4（Gly1120→G
lu）であり、他の３つの突然変異体は、DEN4（Thr1124
→Lys）、DEN4（Thr1124→Gln）、DEN4（Thr1124→Le
u）であり、Thr（２）の置換を含んでいる。これらはト
ランスフェクションしたLLC−MK2細胞から回収された。
以下に述べるように、これらの突然変異体の増殖特性
は、蚊C6/36細胞上のプラーク検定により調べられた。
図12はDEN4（Gly1124→Glu）および対照親ウイルスに対
するこの検定の結果を示す。突然変異体ウイルスのプラ
ークサイズは直径約0.1cmが計測され、親ウイルスの1.1
cmのプラークサイズと比較して大きく縮減していた。そ
の他のデング熱ウイルス突然変異体もプラークサイズの
縮減を示し、これらのウイルスが培養細胞において増殖
制限を示すことを示唆している。最適以下の開裂に起因
する増殖制限は、感染宿主におけるウイルス毒性に対し
て、大きな効果をもつようである。
活性デング熱ウイルス3'非コード領域欠失突然変異体の
加工 実施例13 3'非コード領域に欠失を含むデングcDNAの構築 ヌクレオチド384個の3'非コード領域への欠失突然変
異の導入を容易にするために、まず、nt10104の唯一のB
amH I部位と3'末端のAsp718部位の間の４型デングcDNA
の540ntのサブフラグメントを、pGEM3クローニングベク
ターに挿入した。この組換えプラスミドにおいて、４型
デング配列のnt10470の唯一のApa I部位は、3'非コード
配列のほぼ中心点に位置している。この便利な位置にあ
るApa I部位を用いて、２つの欠失突然変異配列を構築
した。すなわち、構築物の１つの配列は、Apa I部位の
下流に欠失を含んでいた。他の配列の欠失はApa I部位
の上流に位置していた。ヌクレオチド30〜90個の長さを
もつ欠失突然変異の第１の配列を加工するために、オリ
ゴヌクレオチド特異的突然変異誘発が実施された。
Apa I開裂部位に指定された適当な欠失を含み、下流
配列が続く以下のオリゴヌクレオチドを、PCRにおける
正鎖プライマーとして用いた。
オリゴCAA AAG GGG GCC CAA GAC TAG AGG TT
A CAG GAG ACC−（Δ3'172−143）（配列番号７） オリゴCAA AAG GGG GCC CAA CAA AAA CAG CA
T ATT GAC GCT GGG−（Δ3'172−113）（配列番号
８） オリゴCAA AAG GGG GCC CAA CAG AGA TCC TG
C TGC TGT CTC TGC−−（Δ3'172−83）（配列番号
９） 負鎖プライマーは、オリゴGAG CTG GTA CCA GAA
CCT GTT GGA TCA Ａ（配列番号10）であり、これ
は、3'デング配列にAsp718開裂配列がつづいたものを含
んでいる。完全長４型デングcDNA（クローン2A）を鋳型
として用いた。これらの欠失突然変異を４型デング配列
に導入するために、pGEM3組換えプラスミド中のApa Iお
よびAsp718部位の間の野生型ウイルスDNA断片を、Apa I
およびAsp718で開裂したPCR DNA産物で置換した。
同様に、ヌクレオチド61〜202個の長さをもつ欠失突
然変異の第２の配列を加工しApa I部位の上流に配置す
るために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を施
した。下記のオリゴヌクレオチドが合成され、PCRにお
ける負鎖プライマーとして用いられた。
オリゴCCT GGC TTG GGC CCC CGC GTA CAG CT
T CCG TGG CGC−−（Δ3',243−183）（配列番号1
1） オリゴCCT GGC TTG GGC CCC GGA GCT ACA GG
C AGC ACG GTT−−（Δ3',303−183）（配列番号1
2） オリゴCCT GGC TTG GGC CCC CGT GGC ACA AG
T GGC CTG ACT−−（Δ3',333−183）（配列番号1
3） オリゴCCT GGC TTG GGC CCC TTA CAG AAC TC
C TTC ACT CTC TGA−−（Δ3',384−183）（配列番
号14） 正鎖プライマーはオリゴGCC TCC ATG GCC ATA T
GC TCA GC（配列番号15）であり、これは、BamH I部
位の上流のヌクレオチド9885〜9907の間に位置してい
る。完全長４型デングcDNAを鋳型として用いた。先に説
明したように、これらの欠失突然変異を４型デング配列
に導入するために、中間体pGEM3プラスミド中のBamH I
およびApa I部位の間の野生型ウイルスDNA断片を、BamH
IおよびApa Iで開裂したPCR DNA産物で置換した。cDNA
鋳型を加工する最終段階において、構築物の両方の配列
からのBamH I−Asp718断片が分離され、残りの４型デン
グ配列でクローン化された。
実施例14 RNA転写、トランスフェクションおよびウイルスの回収 デング熱ウイルスcDNAクローンは、3'末端におけるAs
p718での消化により線状化され、線状cDNAは、SP6ポリ
メラーゼによるインビトロ転写のための鋳型として用い
られた。RNA転写物による細胞のトランスフェクション
は、先に説明されているように実施された（Lai他、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA第88巻5139〜5143頁（1991））。
トランスフェクションの10日後、細胞をトリプシン処理
し、６穴プレートおよびチェンバースライドに移した。
２日後、免疫蛍光検査（IFA）により、デング熱ウイル
ス抗原の形跡について、スライド上の細胞を試験した。
IFAにより大半の細胞が感染したことが示された場合に
は、６穴プレート上の感染細胞は、培地を取り出し、細
胞を掻き取り、標準容積の50％イーグル最小必須培地/5
0％血清に再懸濁し、凍結させることにより、収穫され
た。一方、陽性の細胞の割合が小さい場合には、細胞を
トリプシン処理し、新鮮な媒地中に1:3で希釈し、増殖
させた。感染細胞の割合は週ベースで算定され、細胞溶
解物を収穫した。
実施例15 プラーク形態観察 ウイルスは、LLC−MK2細胞または蚊C6/36細胞上のプ
ラーク形態について調べられた（Bankcroft他、Pan A
m.Health Organ.Sci.Publ.第375巻175〜178頁（197
9）;Hoke他、Am.J.Trop.Med.Hyg.第43巻219〜226頁（19
90））。プラーク形態の分析の前に、親・野生型ウイル
スは、LLC−MK2細胞中で１回、継代培養された。すなわ
ち、２％ウシ胎児血清を含む培地199中に試験すべきデ
ング熱ウイルス0.2mLを連続10倍希釈し、これを25cm2ビ
ンに入れたLLC−MK2細胞に注入した。35℃で１時間の吸
着の後、各単層に、１×培地199、0.3％重炭酸ナトリウ
ム、1/2×イーグル基本培地ビタミン、1/2xイーグル基
本培地アミノ酸、10％ウシ胎児血清、0.5％アガロース
を含む7mLのアガロースを重層した。35℃で６日間のイ
ンキュベーションの後、このビンに、0.5％MEアガロー
スおよび1:7,500ニュートラルレッドを含む通常生理食
塩水4mLを２回目のオーバーレイとしてかけた。染色か
ら24時間以内にウイルスプラークがあらわれた。C6/36
細胞上のプラーク形態観察を行ない、分離されたすべて
のウイルス突然変異体が調べられた。この目的のため、
75cm2ビンに入れたのコンフルエントなC6/36細胞に、２
％ウシ胎児血清を加えたMEMに連続的に希釈された0.5mL
のウイルスを接種し、１〜２時間35℃で吸着させた。つ
ぎに被感染細胞に、20mL/フラスコのアガロース（１×
ハンク平衡食塩溶液、0.5％ラクトアルブミン加水分解
物、10％ウシ胎児血清、0.12％重炭酸ナトリウム、0.75
％SeakemTM GTGアガロース）を重層した。培養を35℃
で７日間、インキュベートした。つぎに、NaCl 8.0g/
L、KCl 0.4g/L、グルコース1.0g/L、Na2HCO222.5mg/L、
ニュートラルレッド3.3mg/Lからなるニュートラルレッ
ド染色液5mLを用いて培養物を染色した。35℃で３〜５
時間のインキュベーションののち、余分の染色液を取り
除き培養物はインキュベータに戻した。一般に、インキ
ュベータ内で24〜36時間経過した後プラークがあらわれ
た。
実施例16 3'非コード領域に欠失を含む４型デング熱ウイルス突然
変異体 ここで、デング組換えDNA系により、ウイルスDNAの5'
および3'非コード領域ならびにコード領域における欠失
を含むデングウイルス突然変異体を構築することも可能
となる。欠失突然変異体は、アミノ酸置換突然変異体よ
りも、表現型の復帰が起きることが少ないという利点を
提供する。４型デング熱ウイルスゲノムの3'非コード領
域における欠失突然変異の加工において進展がみられ
た。他の蚊媒介フラビウイルスと同様に、４型デング熱
ウイルスは、保存配列１（CS−１）および保存配列２
（CS−２）と呼ばれる伸張した保存配列と、3'非コード
領域内の末端ステムアンドループを取り得る構造を含
む。
ヌクレオチド30〜120個の範囲の欠失は、４型デング
熱ウイルスRNAのヌクレオチド385個の3'非コード配列の
さまざまな位置において作製された。CS−１領域に配列
を欠いていても、ステムアンドループ構造は維持してい
るcDNAクローンから転写された突然変異体RNAは、子孫
ウイルスを生成せず、これは、欠失ウイルスがほとんど
の他の欠失構築物から回収されたことを示唆している
（図13）。これらの突然変異体および野生型ウイルス対
照のプラーク検定はC6/36細胞上で実施された。
この分析の結果、これらの突然変異体のほとんどが、
欠失の位置と程度に応じて1.0〜0.3cmの範囲の縮減サイ
ズのプラークを形成したことが示された（図14および1
5）。プラーク形態の変化は、これらの欠失突然変異体
が増殖制限表現型をあらわしたことを示すものである。
この欠失突然変異体のパネルは、実験動物およびヒトに
対する毒性低減など、その他の興味深い潜在的に重要な
特性をみせる。
実施例17 完全長キメラTBEV/DEN4 cDNAおよびキメラウイルスの生
成 すでに、TBEV（Sofjin株）のサブゲノムcDNA断片がク
ローン化され、ヌクレオチド配列が決定された（前出の
Pletnev他、Virology（1990）参照）。TBEV配列のヌク
レオチド（nt）76〜1977を含むプラスミドpGEM2−CMEお
よびヌクレオチド966〜3672を含むpGEM2−ENS1は、E.Y
u.Dobricova博士（Novosibirsk Institute of Bioor
ganic Chemistry、ロシア）により、共有される制限酵
素部位においてTBEVセグメントを連結することにより、
プラスミドp10、p4、p18、p2、p11から（前出のPletnev
他）提供された。プラスミドDEN4 p5'−２およびp5'−
２（ΔPst I,Xho I）および誘導体p5'−２（ΔPst I,Xh
o I,ΔHind III）（前出のBray他、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA.（1991））が、対応するDEN4遺伝子に代えて１つ
又はそれ以上のTBEV遺伝子を置換するための組換えcDNA
構築物として、用いられた。合成オリゴヌクレオチド
（オリゴ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により２
本鎖DNAを生成するための負または正鎖プライマーとし
て用いられた。PCR特異的部位特異的突然変異誘発によ
り、制限酵素開裂配列を、TBEVおよびDEN4遺伝子間接合
部またはその近くに導入した（図17）。まず、示された
TBEV遺伝子を含む７個の中間キメラプラスミドが構築さ
れ、安定な完全長TBEV/DEN4 cDNAが、大腸菌株BD1528
（前出のLai他（1991）により説明されている）の形質
転換後に同定された。各プラスミド内のTBEVおよびDEN4
遺伝子の間の接合部を囲む配列は、分子生物学の分野で
公知の技術を用いた核酸配列決定により確認された。す
べてのキメラプラスミドは、第１のDEN4ヌクレオチドで
あるＡ残基が続く転写開始点Ｇの上流に位置するSP6プ
ロモーターを含んでいた。インビトロ転写の前に、DEN4
配列の3'末端の直後の唯一のAsp開裂部位において、プ
ラスミドを線状化した（前出のLai他、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA（1991）に説明された技術を用いて）。キメラ
ウイルスの回収とその特性の研究は、BL−３封じ込め設
備において実施された。転写反応は、実質的に、前出の
Lai他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1991）に記載されて
いるように実施された。トランスフェクションの前に、
37℃で15分間、40u/mLのDNase Iを用いて転写混合物を
処理した。つぎに、RNA転写物は、（ｉ）前出のLai他に
よりすでに述べられているLipofectinTM（Bethesda Re
search Laboratories,Inc.）、または（ii）Ｎ−［１
−（2,3−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N,N,N−ト
リメチルアンモニウムメチルサルフェート（DOTAP）（B
oehringer Manneheim）の存在のもとで、セミコンフル
エントなサルLLC−MK2細胞のトランスフェクションに用
いられた。DOTAPトランスフェクション条件のもとで、
トランスフェクション混合物は、0.02mMのHepes緩衝液4
0μＬ、pH7.05中にRNA転写物（２μｇ）、および、Hepe
s緩衝液30μＬ中にDOTAP 12μＬを含んでいた。室温に
おいて10分間のインキュベーションの後、10％のウシ胎
児血清（FBS）を含む2mLの培地199を添加した。混合物
0.5mLを、24穴プレートの４つのウェル中の半融合性細
胞に分注した。10日後、細胞をトリプシン処理し、６穴
プレートとチェンバースライドに移し、さらに２日間、
増殖培地においてインキュベーションした。スライド上
の細胞を免疫蛍光検定（IFA）により試験し、1:100希釈
のDEN4特異高度免疫マウス腹水（HMAF）、TBEF特異的HM
AF、またはTBEV特異的ウサギ血清（Institute of Pol
iomyelitis、ロシア、モスクワのA.S.Karavanov博士の
好意により提供された）を用いてDEN4またはTBEV抗原の
存在を検出した。フルオレセイン接合抗マウスまたは抗
ウサギ血清（Kirkegaard−Perry、メリーランド州Gaith
ersberg）を同一希釈で用いた。IFAにより50〜80％の細
胞が感染したことが示された場合には、６穴プレート内
の細胞をトリプシン処理し、２倍量の非感染細胞と混合
し、T75フラスコ中で６日間増殖させた。つぎに、被感
染細胞を培地とともに収穫し、同一容積のウシ胎児血清
と混合し、細胞懸濁液として凍結した。解凍された解剖
溶解物を、子孫キメラウイルスの源として用いた。Lipo
fectinTMまたはDOTAPを用いたトランスフェクション実
験により、TBE（ME）/DEN4およびTBE（CME）/DEN4のみ
が同定された。子孫ウイルスは免疫蛍光検定により同定
された。
vTBEV（ME）/DEN4と呼ばれる子孫キメラTBE（ME）/DE
N4ウイルスのゲノム構造を証明するために、Mackow他、
Virology第159巻217〜218頁（1987）に提供される技術
を用いたフェノール抽出により、総細胞RNAを感染LLC−
MK2細胞から分離した。DEN4配列のヌクレオチド（nt）
位置5090〜5110（Mackow他、Virology第159巻217〜228
頁1987参照）に対して相補的なオリゴ5'GCTCCGGGGTGTAA
GTCCATT3'（配列番号16）を、逆転写のためのプライマ
ーとして用いた。一本鎖cDNAを鋳型として用い、DEN4配
列のnt位置18〜44のオリゴ5'GACCGACAAGGACAGTTCCAAATC
GGA3'（配列番号17）をPCRの正鎖プライマーとして、TB
EV配列のnt位置2130〜2152のオリゴ5'CTTTTTGGAACCATTG
GTGACT3'（配列番号18）を負鎖プライマーとして用い
た。デング熱ウイルスに関連するヌクレオチド位置につ
いては、Zhao他、Virology第155巻77〜88頁1986参照。
ダニ媒介脳炎ウイルスに関連するヌクレオチド位置につ
いては、前出のPletnev他、Virology（1990）を参照。
制限酵素部位の存在を証明するため、2118塩基対（bp）
のPCR DNA産物は、Pst I、Bgl II、またはEcoR Iで消化
された。同様に、オリゴ5'GTCCGGCCGTCACCTGTGATT3'
（配列番号19）およびオリゴ5'TCACGGTGCACACATTTGGAAA
AC3'（配列番号20）（これらはそれぞれ、3459〜3480nt
のDEN4ゲノムに相補的、および、967〜985ntのTBEVゲノ
ムの負鎖に相補的である）を、PCRに用いた。DNA配列を
証明するため、PCR産物は、EcoR I、Pst I、BamH I、Xh
o I、またはSph Iで消化された。vTBE（ME）/DEN4ゲノ
ムからのPCR DNA産物（2118bp）は、Hind IIIおよびBam
H I制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いて消化された。H
ind III−BamH I−サブフラグメント（1922bp）をPAGE
により精製し、相補的な制限部位においてpGEM3ベクタ
ー内にクローン化した。DEN4（300〜398nt）のＣ遺伝子
とTBEV（418〜460nt）のpreM遺伝子の間の接合部の配列
は、核酸配列決定により確認された。TBE/DEN4キメラDN
Aの構築に用いられたオリゴヌクレオチドは以下のもの
を含む。
TBEV特異的オリゴ 5'CCGGTTTATAGATCTCGGTGCACACATTTGGAAAAC＋（配列番
号21） 5'CTCCATTGTCTGCATGCACCATTGAGCGGACAAGCCC−（配列
番号22） 5'CTTAGGAGAACGGATCCTGGGGATGGCCGGGAAGGCCATTCTG＋
（配列番号23） 5'GGCAAAAGAAGGTCTGCAGTAGACTGGACAGGTTGG＋（配列番
号24） 5'GAAGGAAGCTCATGGACATGGTCGGATTCCTCGAGTTCAGGCCCAA
CCAGGC−（配列番号25） 5'CCTGGCCTGGTTGGGCCGAACTCGAGGAATCCGACCATGTC＋
（配列番号26） 5'GTCCAGTCTACTGCAGACCTTCTTTTGCCACGTCTTTG−（配列
番号27） DEN4特異オリゴ 5'TACGCATCGGGATCCGTAGGATGGGGCGACCAGCAT−（配列番
号28） 5'TCACAGGTGCATGCCGGACAGGGCACATCAGAAACT＋（配列番
号29） 5'CAGCAATGTTACTGCAGACCTTTTTCTCCCGTTC−（配列番号
30） 5'GGGAGAAAAAGGTCTGCAGTAACATTGCTGTGCTTGATTCCC＋
（配列番号31） 配列番号23は、DEN4の5'非コード領域/TBEVカプシド
接合を作製するために用いられ、Bgl II/BamH I部位を
形成した。配列番号30および24は、DEN4 C/TBEV preM接
合を作製するために用いられ、Pst I/Pst I部位を形成
した。配列番号28および21は、DEN4 preM/TBEV E接合を
作製するために用いられ、BamH I/Bgl II部位を形成し
た。DEN4 NS1/TBEV NS1接合は、配列番号26を用いて作
製され、Xho I/Xho I部位を形成した。TBEV E/DEN4 NS1
接合は配列番号25を用いて作製され、Xho I/Xho I部位
を形成した。TBEV C/DEN4 preM接合は配列番号27および
31を用いて作製され、Pst I/Pst I部位を形成した。TBE
V NS1/DEN NS2A接合は配列番号22および29を用いて作製
され、Sph I/Sph I部位を生成した。配列に付した＋お
よび−の符号は、それぞれ上流および下流のプライマー
を示す。
実施例18 キメラビリオンのタンパク質分析 DEN4v 2A（Xho I）、完全長４型デング熱ウイルスcDN
A構築物、または、vTBE（ME）/DEN4により生成されるタ
ンパク質を分析するために、６穴プレート内のコンフル
エントなLLC−MK2細胞を、MOI 1.0で各ウイルスに感染
させた。感染の６日後、前出のLai他、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA（1991）に述べられているように、メチオニン
非含有MEM（イーグル最小必須培地）中の35Sメチオニン
（ウェルあたり60μCi、比放射能600Ci/mmole）で４時
間にわたり、細胞を標識した。１）TBEV特異的HMAF、
２）DEN4特異的HMAF、３）TBEV Eに対して作製されたウ
サギ血清、または、４）DEN4 preM、Ｅ、NS3、または、
NS5タンパク質に特異なウサギ抗血清を用いて、溶解物
を免疫降させた。前出のLaemmliにより説明される技術
を用いて、変性条件下でPAGEにより免疫沈降物を分析し
た。
時間に対するタンパク質合成の分析 T25フラスコに入れたLLC−MK2またはC6/36細胞単層
に、MOI 1で、vTBE（ME）/DEN4またはDEN4（v2A（Xho
I））を感染させた。37℃で１時間の吸着の後、ウイル
ス接種物を取り出し、新鮮培地を細胞に添加した。タン
パク質合成の分析のため、ウイルス吸着後さまざまな時
間（０、４、８、24、48時間）経過した被感染細胞を、
メチオニン非含有MEMとともに、20分間インキュベート
し、同じ培地中で２時間にわたり、35Sメチオニンで標
識した。標識された細胞の溶解物をDEN4特異的HMAFを用
いて沈降させ、PAGEおよびオートラジオグラフィにより
分析した。
実施例19 キメラ構築物の増殖分析 親DEN4およびそのキメラウイルスは、サルLLC−MK2お
よび蚊C6/36細胞上のプラーク検定により、調べられ
た。プラーク検定の技術は前出のBancroft他に説明され
ている。図19に示されている増殖分析は、感染後のさま
ざまな日付に、DEN4またはTBE（ME）/DEN4に感染したLL
C−MK2およびC6/36培養中に存在するウイルスの量を計
量することにより、実施された。感染およびウイルス吸
着の後、培養を収穫し、各培養をプラーク検定によりサ
ンプリングした。Log（pfu/mL）で表したウイルス力価
の変化は、時間に対する増殖曲線として与えられてい
る。
実施例20 ウイルスRNA合成の分析 ウイルスRNA合成の分析のために、被感染LLC−MK2ま
たはC6/36細胞（約106個の細胞）をウイルス吸着後のさ
まざまな時間（０、４、８、24、48時間）に収集し、0.
5mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.5で洗浄し、つ
いで、0.3M NaAc、pH5.2、5mM EDTA、１％SDSを含む緩
衝液中に溶解した。前出のManiatis他により提供される
技術を用いて、フェノール抽出により、総RNAを細胞溶
解物および培地から分離した。60℃で15分間、7.5％（w
t/vol）ホルムアルデヒドを含む６×SSC（１×SSCは、
0.15M NaClおよび0.015Mクエン酸ナトリウム）中でのイ
ンキュベーションにより、RNA試料は変性され、ニトロ
セルロースフィルターBA85（SchleicherおよびSchuel
l）に接合された。フィルターは80℃で１時間焼かれ、
６×SSC、３×Denhardt溶液、25mMのNa2HPO4（pH6.
5）、0.1％SDS、25μg/mLのサケ精子DNAを含む溶液中に
おいて、65℃で１時間、プレハイブリダイゼーションさ
れた。ニックトランスレーションされた32P標識pTBE（M
E）/DEN4 DNAプローブ（50ng/mL、比放射能3.4×108cpm
/μｇ）を含む同じ溶液中で、65℃で一晩、ハイブリダ
イゼーションが続けられた。ハイブリダイゼーションの
後、65℃で、0.1％SDSを含む0.1×SSC中でフィルターを
５回洗浄し、乾燥し、70℃でＸ線フイルムに曝した。ま
た、RNAにハイブリダイズされた32P標識DNAの放射能
が、液体シンチレーションカウンターで計測された。pT
BE（ME）/DEN4からインビトロで作製されたRNA転写物
が、陽性対照として用いられた。
実施例21 ワクチン試料の防御効力とキメラウイルスの神経毒性の
試験 vTBE（ME）/DEN4および親デング熱ウイルスは、マウ
スに脳内（IC）、皮内（ID）、腹腔内（IP）経路により
接種することにより、神経毒性について分析された。生
後３日の乳児BALB/cマウスに、0.02mLMEM/0.25％ヒト血
清アルブミン中にウイルス102pfuを加えて、IC注射で投
与した。生後６週のBALB/c雌マウスに、（ｉ）103pfuの
ウイルスを上記のとおり希釈し、容積0.03mLにしてIC接
種により投与、または、（ii）0.10mLに希釈した103pfu
のウイルスをIDまたはIP接種した。マウスは、21日間、
脳炎の徴候や死亡について観察され、生き延びた成体マ
ウスは、感染の20日後に採血して接種されたウイルスに
対する抗体反応を評価した。生存マウスに対しては、第
21日に、BL−４封じ込め設備において、103LD50TBEV（S
ofjin株）をIP投与した。
実施例22 キメラウイルス突然変異体の構築および配列決定 分子生物学の当業者に公知の標準的オリゴPCR操作手
順にしたがい、部位特異的突然変異誘発を用いて、TBEV
（ME）/DEN4構築物に突然変異を導入した（下記のオリ
ゴ配列参照）。得られた構築物は、実施例17に開示され
た技術を用いて、LLC−MK2細胞内にトランスフェクショ
ンされた。突然変異誘発された構築物から回収した子孫
ウイルスは、実施例19において提供されている技術を用
いてプラーク形態の変化について評価された。キメラウ
イルスゲノムの予め定められた領域内に改変を系統的に
達成するために、完全長TBE（ME）/DEN4 DNA構築物に戦
略的突然変異を導入した。６個の突然変異キメラが、ト
ランスフェクションされたLLC−MK2細胞から回収され、
子孫ウイルスが、マウス神経毒性を誘導する能力につい
て分析された。さらに、他のウイルス増殖特性が、培養
細胞において評価された。図23に示すように、PreM、
Ｅ、または、NS1グリコタンパク質における切断された
グリコシル化部位を含む４つのウイルス突然変異が、示
された部位におけるグルコシル化欠損を示すものと予測
された。変異＊PreM/M-は、PreM/M遺伝子間接合部にお
いて欠陥開裂配列を含んでいた。変異＊Ｅは、２つのア
ミノ酸置換を含み、これらの置換が選択された理由は、
これらのアミノ酸が蚊媒介フラビウイルス内にのみ見ら
れるからである。
突然変異は、標準的オリゴPCR起動手順にしたがい、
部位特異的突然変異誘発により、TBE（ME）/DEN4構築物
に導入された。要するに、正鎖オリゴおよびその相補的
負鎖オリゴは、それぞれ突然変異配列と唯一の制限酵素
部位を含んでいるが、PCRにおいて、それぞれ下流また
は上流プライマー対のオリゴとともに用いられる。両方
のPCR産物は、共有される唯一の制限酵素部位において
連結された。このようにして、突然変異された配列を含
む、DNA断片産物が作製され、完全長TBE（ME）/DEN4 cD
NAにおける対応する野生型DNA断片を置換した。以下は
特異的突然変異体キメラDNAおよび構築に用いられたオ
リゴヌクレオチドのリストである。
（１）変異PreM/M−Glc: 5'GCGGCAACCCAGGTGCGTGTCGATCGTGGCACCTGTGTGATCCTGG
＋（配列番号32） 5'CCAGGATCACACAGGTGCCACGATCGACACGCACCTGGGTTGCCGC
−（配列番号33） （２）変異Ｅ−Glc: 5'GGGGGATTACGTCGCTGCTCTAGAGACTCACAGTGGAAGAAAA＋
（配列番号34） 5'TTTTCTTCCACTGTGAGTCTCTAGAGCAGCGACGTAATCCCCC−
（配列番号35） （３）変異NS1（１）−Glc: 5'TTCACCCCAGAAGCAAGGATCCGCACATTTTTAATAGACGGAC＋
（配列番号36） 5'GTCCGTCTATTAAAAATGTGCGGATCCTTGCTTCTGGGGTGAA−
（配列番号37） （４）変異NS1（２）−Glc: 5'TGGATAGAGAGCTCAAGGATCCAGACTTGGCAGATAGAGA＋（配
列番号38） 5'TCTCTATCTGCCAAGTCTGGATCCTTGAGCTCTCTATCCA−（配
列番号39） （５）変異PreM/M: 5'GGATCAAGAACAAGACGCGTAGTGCTGATCCCATCCCAC＋（配
列番号40） 5'GATGGGATCAGCACTACGCGTCTTGTTCTTGATCCTTCTTG（配
列番号41） （６）変異E: 5'AGAGACCAGAGCGATCGAGGCTGGGGCAACGGGTGTGGATTTTTTG
GAAAA＋（配列番号42） 5'GCCCCAGCCTCGATCGCTCTGGTCTCTCTTACACACTTACGACGC
−（配列番号43） さらに、上流プライマーは（配列番号44） 5'GACCGACAAGGACAGTTCCAAATCGGA＋ および下流プライマーは（配列番号45） 5'CTTGAACTGTGAAGCCCAGAAACAGAGTGATTCCTCCAACAGCTAT
GCA− 実施例23 マウスにおける神経毒性の分析 さらに、突然変異されたキメラウイルス調製物は、マ
ウスにIC接種され、実施例21に提供されている技術を用
いて、DEN4、TBE（ME）/DEN4およびTBE（CME）/DEN4と
比較された。試験動物の半数を死亡させるのに必要な致
死量が、突然変異キメラウイルスの各々について比較さ
れた。生後６週間のBALB/cマウスの８匹ずつのグループ
に、さまざまな変異キメラ、TBE（ME）/DEN4、TBE（CM
E）/DEN4、またはDEN4を、1000、100、10、１、0.1pfu
の投与量で、脳内接種した。被感染マウスは、31日間、
脳炎の徴候および死亡について観察された。50％致死量
（LD50）が各ウイルスについて算出され、その値がマウ
ス神経毒性の基盤として用いられた。図24に示すよう
に、親TBE（ME）/DEN4ウイルスのLD50は約10pfuであっ
た。このレベルのLD50は、いくつかの変異ウイルスにつ
いても観察された。少なくとも２つの突然変異体、すな
わち＊NS1（１）−Glc-および＊PreM/M-のLD50は、100p
fuよりも大きく、これらの突然変異体のマウス神経毒性
は100倍以上減少したことを示している。この発見は、
キメラウイルスゲノムにおけるNS1（１）−Glc-またはP
reM/M-突然変異は、それぞれ、マウス神経毒性の弱毒化
を提供することを示すものである。これらの突然変異ウ
イルスは、個別にまたは組合せて、ワクチン候補として
の有用性のさらなる評価に有益であろう。
実施例24 霊長類における最適化キメラ構築物の試験 その他の動物ではなく、ヒトよりも下位の霊長類は、
周辺経路により容易にデング熱ウイルスに感染すること
が証明されている（Simmons他、Philipp.J.Sci.第44巻
１〜247頁、1931およびRosen、Am.J.Trop.Med.Hyg.第７
巻:406〜410頁、1958）。サルの感染は、ヒトのデング
熱ウイルス感染に最も近い実験系である。デング感染に
対するアカゲザルの反応は、４〜６日のウイルス血症が
あるという点において、ヒトのそれと類似している。こ
れよりも低級な霊長類は臨床的デング徴候を起こさな
い。サルにおけるデングその他のフラビウイルス研究の
目的は、（１）さまざまなワクチン候補の免疫原性を評
価すること、（２）ウイルス血症の期間を日数で、ピー
クウイルス力価をpfu/mLで計測して、デングまたはキメ
ラデング熱生菌ウイルスワクチン候補の感染性および毒
性（弱毒化表現型）を評価すること、（３）同型デング
熱ウイルスまたは同一のキメラウイルス特異性をもつそ
の他のフラビウイルスによる投与に対する上記ワクチン
の防御効力を評価すること、である。
（１）接種：各アカゲザルに、イーグル最小必須培地/
0.25％ヒト血清アルブミンに希釈した合計３×106pfuの
ウイルスを接種する。通常、麻酔された動物に２回の皮
下投与を施す。
（２）血液採取：デング熱ウイルスまたはキメラデング
熱ウイルスの接種の後、3.0mLの血液試料を２週間のあ
いだ毎日と、３週目、４週目、６週目、８週目に採取す
る。
（３）デング熱ウイルスまたは他のフラビウイルスの投
与：ウイルス投与が、防御効力を評価するために適切で
あると考えられる場合、105pfu/1投与の非弱毒化ウイル
スを容積0.5mLにしてサルの上腕部に皮下接種する。
（４）研究室内検定：血清試料を用いて以下を決定し
た。（ａ）直接的ウイルスプラーク検定によるウイルス
血症期間、（ｂ）放射性免疫沈降およびELISAによるデ
ングまたは他のフラビウイルス特異抗体の力価、（ｃ）
プラーク縮減中和試験による中和抗体の力価。これらす
べての試験はワクチン開発技術の当業者には公知であ
る。
以上、本発明を特別の実施例について説明したが、当
業者であれば、これらの実施例は例示のためのものに過
ぎず本発明を限定するものではないことが理解されよ
う。本発明の真の範囲は下記の請求の範囲に鑑みて解釈
されるべきである。
配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： 厚生省長官により代表されるアメリカ合衆国 レイ，チン−ジュー（アメリカ合衆国のみ） ブレイ，マイケル（アメリカ合衆国のみ） メン，ルーエ（アメリカ合衆国のみ） ペテル，ミシェル（アメリカ合衆国のみ） （ii）発明の名称：キメラおよび／または増殖制限さ
れたフラビウイルス （iii）配列数:45 （iv）通信宛先： （Ａ）名宛人：クノービ，マーテンズ，オルソン
アンド ベアー （Ｂ）住 所：ニューポート センター ドライブ
620番地 16階 （Ｃ）都 市：ニュー ポート ビーチ （Ｄ）州 ：カリフォルニア （Ｅ）国 ：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:92660 （ｖ）コンピューター読取り形態： （Ａ）媒体種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換 （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:PatentInリリース＃1.0、バー
ジョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）弁理士／代理人情報： （Ａ）姓名：アルトマン，ダニエル イー （Ｂ）登録番号:34,115 （Ｃ）参照／書類番号:NIH024.024HPC （ix）通信情報： （Ａ）電話番号:714−760−0404 （Ｂ）ファクシミリ番号:714−760−9502 （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号1: （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号2: （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号3: （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号4: （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号5: （２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No 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（iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号34: （２）配列番号35についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:43塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号35: （２）配列番号36についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:43塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号36: （２）配列番号37についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:43塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号37: （２）配列番号38についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:40塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号38: （２）配列番号39についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:35塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号39: （２）配列番号40についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:39塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号40: （２）配列番号41についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号41: （２）配列番号42についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:51塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号42: （２）配列番号43についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号43: （２）配列番号44についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号44: （２）配列番号45についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:49塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列記述：配列番号45:
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:93） (72)発明者 プレトネフ，アリグザンダー ジー. アメリカ合衆国，20814，メリーランド, ベセスダ，モントローズ アベニュー, ＃102 10423番地 (72)発明者 メン．ルーエ アメリカ合衆国，20895，メリーランド, ケンジントン，コネチカット アベニュ ー，ノースウエスト 11344番地 (72)発明者 ロバート，チャノック アメリカ合衆国，20817，メリーランド, ベセスダ，ロングウッド 7001番地 (56)参考文献 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，1990年，Ｖｏｌ. 174，ｐ．250−263 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1991年11月，Ｖｏｌ．88, ｐ．10342−10346 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 7/04 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ)

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ダニ媒介脳炎ウイルス（TBEV）からのプレ
    メンブレンタンパク質およびエンベロープタンパク質を
    作動可能にコードする核酸領域を含み、前記核酸領域
    は、デング熱ウイルスからのカプシドタンパク質及び非
    構造タンパク質をコードする核酸領域に作動可能に連結
    していることを特徴とする組換えDNA構築物。
  2. 【請求項２】前記デング熱ウイルスは４型デング熱ウイ
    ルスであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の
    組換えDNA構築物。
  3. 【請求項３】前記構築物は、前記核酸内に、ウイルスの
    増殖を制限し、かつ、神経毒性を生じさせない１又は数
    個の突然変異を含むことを特徴とする請求の範囲第１項
    に記載の組換えDNA構築物。
  4. 【請求項４】前記突然変異は、プレメンブレンタンパク
    質、エンベロープタンパク質、またはNS1（１）タンパ
    ク質のグリコシル化を減少させる１又は数個の突然変
    異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質
    への開裂を減少させる１又は数個の突然変異、ポリタン
    パク質NS1−NS2A開裂部位のつぎの＋１位置の部位であ
    る、グリシンをコードする部位における１又は数個の置
    換、3'非コード末端の最も3'寄りのヌクレオチドを第１
    番としたとき、ヌクレオチド113番から384番までの間
    （113番および384番を含む）の少なくともヌクレオチド
    30個からなる１又は数箇所の欠失、NS1のＣ末端開裂部
    位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード
    する配列内の１又は数個の突然変異からなる群から選択
    されることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の組換
    えDNA構築物。
  5. 【請求項５】ゲノムを有するキメラウイルスにおいて、
    前記ゲノムは、ダニ媒介脳炎ウイルス（TBEV）からのプ
    レメンブレンタンパク質およびエンベロープタンパク質
    をコードする核酸領域と、デング熱ウイルスからのカプ
    シドタンパク質と非構造タンパク質をコードする核酸領
    域とを含むことを特徴とするキメラウイルス。
  6. 【請求項６】前記デング熱ウイルスは４型デング熱ウイ
    ルスであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の
    キメラウイルス。
  7. 【請求項７】前記ゲノムは、前記核酸において、ウイル
    スの増殖を制限し、かつ、神経毒性を生じさせない１又
    は数個の突然変異を含むことを特徴とする請求の範囲第
    ５項に記載のキメラウイルス。
  8. 【請求項８】前記突然変異は、プレメンブレンタンパク
    質、エンベロープタンパク質、またはNS1（１）タンパ
    ク質のグリコシル化を減少させる１又は数個の突然変
    異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質
    への開裂を減少させる１又は数個の突然変異、ポリタン
    パク質NS1−NS2A開裂部位のつぎの＋１位置の部位であ
    る、グリシンをコードする部位における１又は数個の置
    換、3'非コード末端の最も3'寄りのヌクレオチドを第１
    番としたとき、ヌクレオチド113番から384番までの間
    （113番および384番を含む）の少なくともヌクレオチド
    30個からなる１又は数箇所の欠失、NS1のＣ末端開裂部
    位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード
    する配列内の１又は数個の突然変異からなる群から選択
    されることを特徴とする請求の範囲第７項に記載のキメ
    ラウイルス。
  9. 【請求項９】脊椎動物において防御免疫反応を起こすこ
    とのできる、請求の範囲第５項のキメラウイルスを含
    む、ダニ媒介脳炎ウイルスに対するワクチン。
  10. 【請求項１０】第１のフラビウイルスに対するワクチン
    を作製する方法であって、前記第１のフラビウイルスか
    らのプレメンブレンタンパク質およびエンベロープタン
    パク質と、第２のウイルスからのカプシドタンパク質お
    よび非構造タンパク質を作動可能にコードするDNA構築
    物を調製し、前記DNA構築物から感染性RNA転写物を生成
    し、前記RNA転写物を細胞内に導入し、前記RNA転写物を
    前記細胞内で発現させてウイルスを生成し、前記細胞か
    ら前記ウイルスを収穫し、脊椎動物において前記ウイル
    スを試験し、それにより前記第１のフラビウイルスに対
    する前記ワクチンを作製する工程を含み、第２のウイル
    スはデング熱ウイルスであり、第１のウイルスは非デン
    グフラビウイルス又は第２のウイルスとサブタイプが異
    なるデング熱ウイルスであることを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】前記調製工程は、前記DNA構築物に、ウ
    イルスの増殖を制限し、かつ、神経毒性を生じさせない
    １又は数個の突然変異を導入する工程をさらに含むこと
    を特徴とする請求の範囲第10項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記突然変異は、プレメンブレンタンパ
    ク質、エンベロープタンパク質、またはNS1（１）タン
    パク質のグリコシル化を減少させる１又は数個の突然変
    異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質
    への開裂を減少させる１又は数個の突然変異、ポリタン
    パク質NS1−NS2A開裂部位のつぎの＋１位置の部位であ
    る、グリシンをコードする部位における１又は数個の置
    換、3'非コード末端の最も3'寄りのヌクレオチドを第１
    番としたとき、ヌクレオチド113番から384番までの間
    （113番および384番を含む）の少なくともヌクレオチド
    30個からなる１又は数箇所の欠失、NS1のＣ末端開裂部
    位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード
    する配列内の１又は数個の突然変異からなる群から選択
    されることを特徴とする請求の範囲第11項に記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】ダニ媒介脳炎ウイルス（TBEV）からのプ
    レメンブレンタンパク質およびエンベロープタンパク質
    を作動可能にコードする核酸領域を含み、前記核酸領域
    は、デング熱ウイルスからのカプシドタンパク質および
    非構造タンパク質をコードする核酸領域に連結されてい
    ることを特徴とするRNAセグメント。
  14. 【請求項１４】前記デング熱ウイルスは４型デング熱ウ
    イルスであることを特徴とする請求の範囲第13項に記載
    のRNAセグメント。
  15. 【請求項１５】前記RNAセグメントは前記核酸内に、ウ
    イルスの増殖を制限し、かつ、神経毒性を生じさせない
    １又は数個の突然変異を含むことを特徴とする請求の範
    囲第13項に記載のRNAセグメント。
  16. 【請求項１６】前記突然変異は、プレメンブレンタンパ
    ク質、エンベロープタンパク質、またはNS1（１）タン
    パク質のグリコシル化を減少させる１又は数個の突然変
    異、プレメンブレンタンパク質のメンブレンタンパク質
    への開裂を減少させる１又は数個の突然変異、ポリタン
    パク質NS1−NS2A開裂部位のつぎの＋１位置の部位であ
    る、グリシンをコードする部位における１又は数個の置
    換、3'非コード末端の最も3'寄りのヌクレオチドを第１
    番としたとき、ヌクレオチド113番から384番までの間
    （113番および384番を含む）の少なくともヌクレオチド
    30個からなる１又は数箇所の欠失、NS1のＣ末端開裂部
    位における８個のアミノ酸の１つ又はそれ以上をコード
    する配列内の１又は数個の突然変異からなる群から選択
    されることを特徴とする請求の範囲第15項に記載のRNA
    セグメント。
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Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6676936B1 (en) 1988-07-14 2004-01-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services. Chimeric and/or growth-restricted flaviviruses
DE19512142A1 (de) * 1995-03-31 1996-10-02 Immuno Ag Infektiöser cDNA-Klon des Tick-Borne Enzephalitis (TBE)-Virus, davon abgeleiteter rekombinanter Impfstoff und Herstellung desselben sowie ein pharmazeutisches Produkt, das eine replizierbare Nukleinsäure enthält
AU6093296A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Infectious dengue 2 virus pdk-53 as quadravalent vaccine
DE19521705C2 (de) 1995-06-14 1997-10-09 Immuno Ag Immunogenes Konstrukt, Verfahren zu dessen Herstellung und Verwendung als Vakzine
ES2345614T3 (es) * 1997-02-28 2010-09-28 Sanofi Pasteur Biologics Co. Vacunas quimericas de flavivirus.
US6962708B1 (en) 1997-02-28 2005-11-08 Acambis, Inc. Chimeric flavivirus vaccines
BRPI9701774B8 (pt) 1997-04-11 2015-09-29 Fundação Oswaldo Cruz Fiocruz cdna mutante e infeccioso do vírus da febre amarela, constructo de dna, vírus recombinante de febre amarela e vacina para humanos contra infecções de febre amarela.
RU2208635C2 (ru) * 1997-10-08 2003-07-20 ЗЕ ГАВЕРМЕНТ ОФ ЗЕ ЮНАЙТЕД СТАЙТС ОФ АМЕРИКА, репрезентед бай ЗЕ СЕКРЕТЕРИ, ДЕПАРТМЕНТ ОФ ХЕЛС ЭНД ХЬЮМЭН СЕРВАЙСЕЗ Днк-конструкт жизнеспособного химерного рекомбинантного флавивируса, вакцина против вируса клещевого энцефалита, способ предотвращения инфицирования млекопитающего вирусом клещевого энцефалита
US5968732A (en) * 1997-12-31 1999-10-19 Akzo Nobel, N.V. Isothermal transcription based assay for the detection and genotyping of dengue virus
US6541011B2 (en) 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
IL139844A0 (en) 1998-06-04 2002-02-10 Us Gov Health & Human Serv Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US7227011B2 (en) * 1998-06-04 2007-06-05 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US6685948B1 (en) * 1998-09-02 2004-02-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Replication-defective dengue viruses that are replication-defective in mosquitoes for use as vaccines
DE69942525D1 (de) * 1998-09-02 2010-08-05 Us Government Dengue viren, die in mosquitos nicht replizieren, zur verwendung als impfstoff
US7425437B2 (en) 1999-11-26 2008-09-16 Crucell Holland B.V. Vaccines against West Nile Virus
US6589531B1 (en) * 2000-01-21 2003-07-08 The Regents Of The University Of California Recombinant yellow fever virus and method of use thereof
EP3000477A1 (en) 2000-02-16 2016-03-30 The Government of The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras
AT410634B (de) 2001-02-21 2003-06-25 Franz X Dr Heinz Attenuierte lebendimpfstoffe
GB2372991B (en) * 2001-03-09 2004-11-17 Fiocruz Fundacao Oswaldo Cruz Flavivirus expression vector
WO2002074963A1 (en) * 2001-03-16 2002-09-26 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Healt Dengue viruses that are replication defective in mosquitos for use as vaccines
CA2448971C (en) 2001-06-01 2013-11-26 Acambis, Inc. Chimeric flavivirus vectors
CU23245A1 (es) 2001-07-16 2007-10-17 Inst De Medicina Tropical Pedr CADENAS QUIMéRICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS. PREPARADOS UTILIZANDO PROTEINAS QUIMéRICAS
US6682883B1 (en) 2001-07-19 2004-01-27 Acambis, Inc. Diagnosis of flavivirus infection
EP1441761B1 (en) 2001-10-19 2007-04-18 Acambis, Inc. Methods of preventing and treating flavivirus infection in animals
EP2339011B1 (en) * 2002-01-10 2015-04-15 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES West Nile virus and Dengue 4 virus chimeras for use in a live virus vaccine to prevent disease caused by west nile virus
US7459160B2 (en) 2002-01-15 2008-12-02 Acambis Inc. Chimeric flaviviruses
CA2481479C (en) 2002-02-26 2012-12-11 Maxygen, Inc. Novel flavivirus antigens
CA2505942C (en) 2002-11-15 2012-03-13 Acambis, Inc. West nile virus vaccine
KR100890885B1 (ko) * 2003-03-31 2009-03-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 일본 뇌염 바이러스 혈청군의 구성원을 포함하는, 특정플라비바이러스 검출용 조성물 및 방법
CN1299768C (zh) * 2004-08-13 2007-02-14 崔栋 人用二倍体细胞乙型脑炎纯化疫苗的制备方法
CA2591665C (en) 2004-12-20 2015-05-05 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof
US7749734B2 (en) 2004-12-24 2010-07-06 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated Japanese encephalitis virus gene as backbone
CN103031279B (zh) 2005-04-24 2015-11-18 赛诺菲巴斯德生物制药有限责任公司 重组黄病毒疫苗
CA2608058C (en) 2005-05-12 2013-09-10 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
CN101222936A (zh) * 2005-06-24 2008-07-16 英特威国际有限公司 灭活的嵌合疫苗和相关的使用方法
CU23578A1 (es) * 2005-09-16 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Proteína de la cápsida del virus dengue inductora de respuesta protectora y composición vacunal
US7455842B2 (en) * 2005-12-05 2008-11-25 University Of Kansas Chimeric West Nile viruses and uses thereof
US7968102B2 (en) * 2006-01-13 2011-06-28 Sanofi Pasteur S.A. Dengue chimeric viruses
EP3018142A1 (en) 2006-06-06 2016-05-11 Crucell Holland B.V. Human binding molecules having killing activity against staphylococci and uses thereof
CU23630A1 (es) 2006-10-30 2011-02-24 Ct Ingenieria Genetica Biotech Moléculas peptídicas quiméricas con propiedades antivirales contra los virus de la familia flaviviridae
JP5689687B2 (ja) 2008-03-05 2015-03-25 サノフィ・パスツールＳａｎｏｆｉｐａｓｔｅｕｒ アジュバント含有ワクチン組成物の安定化方法
EP2143440A1 (fr) 2008-07-09 2010-01-13 Sanofi Pasteur Agent stabilisant et composition vaccinale comprenant un ou plusieurs flavivirus vivants atténués
MY184428A (en) * 2009-06-01 2021-04-01 Inviragen Inc Compositions and methods for administration of vaccines against dengue virus
CA2770888C (en) 2009-08-31 2020-04-14 Gen-Probe Incorporated Dengue virus assay
PL3539565T3 (pl) 2013-03-15 2023-09-25 Takeda Vaccines, Inc. Kompozycje i sposoby dla konstruktów chimerycznych wirusa dengi w szczepionkach
CN111447947B (zh) 2017-12-07 2024-01-12 默沙东有限责任公司 登革病毒疫苗组合物的制剂
US11426461B2 (en) 2018-09-05 2022-08-30 Takeda Vaccines, Inc. Methods for preventing dengue and hepatitis A
US11464815B2 (en) 2018-09-05 2022-10-11 Takeda Vaccines, Inc. Dengue vaccine unit dose and administration thereof
MX2021002586A (es) 2018-09-05 2021-06-08 Takeda Vaccines Inc Dosis unitaria de vacuna contra el dengue y administracion de esta.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL91304A0 (en) * 1988-08-20 1990-03-19 Us Health Recombinant vaccinia virus for prevention of disease caused by flavivirus

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１年１１月，Ｖｏｌ．８８，ｐ．１０３４２−１０３４６
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０年，Ｖｏｌ．１７４，ｐ．２５０−２６３

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