DD297997A5 - Proteine, vakzine und nukleinsaeuren - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung offenbart die Nucleotidsequenz sowie die Aminosaeuresequenz des NS1-Proteins von der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus. Die Sequenz wurde von den cDNA-Klonen abgeleitet. Das NS1-Protein kann als Komponente der Zeckenenzephalitisvakzine, als Diagnostikum oder fuer andere Zwecke eingesetzt werden. Die Nucleinsaeurekodierung fuer das NS1-Protein laeszt sich fuer die Erzeugung von Expressionssystemen oder fuer die Herstellung einer Lebendvakzine einsetzen.{Nucleotidsequenz; Aminosaeuresequenz; NS1-Protein; Zeckenenzephaltitisvirus; Vakzine; Diagnostikum; Nucleinsaeurecodierung; Expressionssystem; Lebendvakzine}
Description
Hierzu 25 Seiten Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Vakzine und Diagnostika für die westliche Unterart des Zeckenenzephalitisvirus sowie auf Nucleinsäuren und Proteine, die für solche Vakzine und Diagnostika geeignet sind.
Die westliche Unterart des Zeckenenzephalitisvirus gehört zur Familie der Flaviviren, der sphärischen lipidumhüllten RNA-Viren (Westaway et al., Intervlrology 24,183-192,1985). Bei dem Protovirus handelt es sich um das Gelbfiebervirus. Der Definition nach sind alle Flaviviren serologisch miteinander verbunden, wie aus Versuchen zur Hemmung der Hämagglutination hervorgeht. Durch Kreuzneutralisation läßt sich die Familie jedoch in verschiedene Serokomplexe untergliedern {DeMadrid und Porterfield, J. Gen. Virol. 23,91-96,1974), die im Gegensatz zu serologisch verschiedenartigeren Viren unterschiedlicher Serokomplexe oder zu nicht klassifizierten Flaviviren aus sich stärker ähnelnden Flaviviren bestehen. Das Zeckenenzephalitisvirus gehört dem durch Zecken übertragenen Serokomplex an, der ferner Viren für Krankheiten wie l.ouping ill, Langat, Omsk, epidemisches hämorrhagisches Fieber. Kyasanur-Waldkrankheit und Negishi umfaßt. Die Stämme des Zeckenenzephalitisvirus können des weiteren einer westlichen (europäischen), in erster L! ie durch Ixodes rlsclnus übertragenen Unterart sowie einer fernöstlichen, durch Ixodes persulcates als Hauptvektor übertragenen Unterart zugeordnet werden (Clarke, 1964; Bull. WHO 31,45-56).
Diese Differenzierung der Unterarten wurde mittels kompetitivem radioimmunologischem Versuch sowie Peptidkartierung bei begrenzter Proteolyse der entsprechenden Glycostrukturproteine (Heinz und Kunz, 1981; J. Gen. Virol. 57, 263-274) sowie mittels Antigenanalyse bei Einsatz monoklonaler Antikörper (Heinz et al., Virology 126,525-537,1983) bestätigt.
Reife Viruspartikel verfügen nur über drei, als E, C bzw. M bezeichnete Strukturproteine, deren relative Molekülmassen 50 bis 60000,15000 bzw. 7000 betragen.
Das Genom der Flaviviren setzt sich aus einer einzelsträngigen RNA mit etwa 11000 Basen und mRNA-Polarität zusammen und verfügt über eine relative Molekülmasse von 4 x 106 Dalion. Diese RNA bildet zusammen mit dem C-Protein ein sphärisches Nucleokapsid, das von einer Lipidhülle umgeben ist, die sowohl mit dem E- als auch mit dem M-Protein assoziiert wird. Versuche mit reindargestellten Präparaten des Ε-Proteins, das durch Solubilisation des Virus mittels Detergenzien entstand, haben aufgezeigt, daß E Virushämagglutinine repräsentiert, d.h., es versucht unter entsprechenden Bedingungen Agglutination gewisser Erythrozyten. Dadurch kommt es nach Immunisierung zu Hämagglutinationshemmung, Neutralisierung und zur Bildung schützender Antikörper sowie zu Immunität gegenüber dem virulenten Lebendvirus (Heinz et al., Infect. Immun. 33 250-257,1981).
Ferner wurde festgestellt, daß neben diesen Strukturproteinen auch verschiedene nichtstrukturelle virusspezifische Proteine in Zellen, die mit Flaviviren infiziert sind, existieren.
Die Genomorganisation der Flaviviren wurde vor kurzem mittels cDNA-Klonierung und -Sequenzierung des Gelbfieber-, West-Nile- und Murray-Valley-Enzephalitis-Virus nachgewiesen (Rice et al., Sclonce 229,726-733,1985; Dalgarno et al., J. Mol. BIoI. 187,309-323,1986; Castle et al., Virology 147,227-236,1985; Castle et al., Vlroloßy 49,10-26,1986; Wengler et al., Virology 147, 264-274,1985). Diesen Analysen zufolge enthält die Genom-RNA von Flaviviren ein einzelnes, langes offenes Leserastor aus etwa 11000 Nucleotiden, das alle Struktur- und nichtstrukturellen Proteine kodiert.
Die für das Gelbfiebervirus ermittelte und für weitere Flaviviren bestätigte Genfolge lautet: 5; C-prM(M)-E-NS 1 -NS 2 A-NS 2 B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 3.C, prM(M). Dabei repräsentiert E Strukturprotoine, die in unreinen (C, prM, E) und reifen (C, M, E) Viruspartikeln nachgewiesen wurden. Der restliche Teil des Genomkodes steht dagegen für nichtstrukturelle Proteine. Die Struktur- und die nichtstrukturellen Proteine sind mittels Sequenzanalyse der Aminoendgruppen nachgewiesen worden und wurden so mit den entsprechenden Genomsegmenten ir. Wechselbeziehung gesetzt.
Es wird angenommen, daß die Translation der Virusproteine an der Seite 5' der RNA und dort am ersten AUG beginnt und sich bis zu einem Stoppcodon am 3'-Ende der RNA fortsetzt. Die Bildung der einzelnen Proteine soll über eine Reihe spezieller proteolytischer Spaltungsreaktionen erfolgen, woran zell- sowie virusspezifische Proteasen beteiligt sind. Bis jetzt sind etwa 60 verschiedene Flaviviren nachgewiesen worden, ungefähr zwei Drittel davon werden durch den Biß infizierter Gliederfüßer übertragen, d.h., es handelt sich um Arboviren. Einige Flavoviren sind bekannte humane Pathogene. Dazu zählen das Gelbfiebervirus, das Denguefiebervirus, das Japan-Enzephalitis-Virus oder das Zeckenenzephalitisvirus JShope, in: „TheTogaviruses", S.47-82, Academic Press, New York, 1980).
Das Zecitenenzephalitisvirus ist in vielen europäischen Ländern, in Rußland und China heimisch. Die Krankheit ist in einigen mitteleuropäischen Ländern, wie zum Beispiel Österreich, Tschechoslowakei und Ungarn, gut dokumentiert. Einige Hundert Hospitalisierungen sind in jedem Jahr zu verzeichnen. Die Krankheit stellt für die Volksgesundheit ein großes Problem dar. Die wirksame Verhütung der Krankheit ist über das Impfen hochreiner, formaldehydinaktivierter Ganzvirusvakzine möglich (Kunz et al., J. Med. Vlrol. 6,103-109,1980), wodurch eine Immunreaktion gegenüber den Strukturproteinen des Virus induziert wird. Der größte Nachteil dieser Vakzine besteht darin, daß bei der Herstellung große Mengen an infektiöser und potentiell gefährlicher Virussuspension verarbeitet werden müssen. Aus diesem Grunde sind kostspielige und umfangreiche Sicherheitsvorkehrungen zu treffen.
Deshalb wurde nach einer Möglichkeit zur Herstellung einer Vakzine gesucht, mit der die oben aufgeführten Nachteile überwunden werden können. In der Europäischen Patentschrift Nr.EP-A-0284791 wurde das Problem behandelt, indem ein DNA-Molekül geschaffen wurde, das eine von der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus abgeleitete DNA enthielt, und indem zumindest ein Teil mindestens eines Strukturproteins kodiert wurde, d.h., die Auswahl wurde unter einer Gruppe von Proteinen, bestehend aus C, prM, M oder E der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus getroffen. Ein solches DNA-Molekül entspricht der einzelsträngigen RNA der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus. Es erwies sich für die Bereitstellung genetischer Informationen zur Expression eines Polypeptids geeignet, das das gesamte C-, prM-, M- oder Ε-Protein des Zeckenenzephalitisvirus (westliche Unterart) - wie oben beschrieben - oder Teil eines der oben aufgeführten Proteine sein kann. Ein solches Polypep. .. !aßt sich diagnostisch oder therapeutisch beispielsweise bei der Vakzineherstellung einsetzen. Mit Hilfe der Sequenzanalyse wurde auch die Differenzierung zur fernöstlichen Unterart deutlich, indem Aminosäuresequenzunterschiede um bis zu 14 Prozent (abhängig vom Protein) im Vergleich zur fernöstlichen Unterart (Yamschikow und Pletnow, Nucleic Acid Res. 16 7750 (1988) nachgewiesen wurden.
Obwohl eine Vakzine auf der Grundlage eines oder mehrerer rekombinanter Strukturproteine wie in der Europäischen Patentschrift fVr. EP-A-0284791 unter dem Aspekt der Herstellung gegenüber einer inaktivierten Ganzvirusvakzine eine Verbesserung darstellen kann, so besitzt sie doch den Nachteil der inaktivierten Ganzvirusvakzine und verfügt über keine nichtstrukturellen Proteine, die zu einer Immunschutzreaktion beitragen können.
Die nichtstrukturellen Proteine üben einen großen Einfluß auf den Lebenszyklus der Flaviviren aus. Sie sind bei der Virusreifung, bei den proteolytischen Vergangen und der RNA-Replikation beteiligt. Obwohl nachgewiesen wurde, daß ein nichiMrukturelles Protein (NS 1) bei einigen F'aviviren - neben dem Zeckenenzephalitisvirus- in Versuchstieren eine Immunschutzreaktion induzieren kann (Schlessinger et al., J. Ger. Virol. 68 853-857 (1987] Zhang et al., J. Vlrol. 62 3027-3031 (1988)), liegt eine derartige Offenbarung für nichtstruktureile Proteine des Zeckenenzephalitisvirus nicht vor.
Es ist bekannt, daß Subneutralisierungskonzentrationen der Neutralisierungsantikörper oder anderer Antikörper für die Epitopen im Ε-Protein des Flavivirus eine antikörperunabhängige Verbesssrung der Infektiosität in Fc-rezeptorhaltigen Zellen hervorrufen können (Porterfield, Cardosa; „Concepts in Viral Pathogenesis I", Chapter 17 p. 117), was sich auf die Pathogenese des Denguefiebers und des Dengue-Schocksyndroms auswirkt (Halstead, Science 239,476-481 (1988]). In einigen Fällen kann es sich deshalb als vorteilhaft erweisen, den Gebrauch des Ε-Proteins von Flaviviren in Vakzinen zu umgehen oder sogar NS1 als alleinige Vakzinkomponente zu verwenden und ksine Virusstrukturproteine einzubauen.
Jetzt ist ein NS 1-Protein des Zeckenenzephalitisvirus (westliche Unterart) anhand seiner Sequenz nachgewiesen worden. Bei diesem Protein handelt es sich um eine geeignete Vakzinkomponente, und es läßt sich auf einfache Weise mit Hilfe der DNA-Rekombinationstechnik erzeugen.
Entsprechend ainem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Peptid oder Polypeptid geschaffen, das zumindest einen Teil der Aminosäurefrequenz des NS1-Proteins vom Zeckenenzephalitisvirus der westlichen Unterart besitzt.
Enthält das Peptid oder Polypeptid nur einen Toil der Aminosäuresequenz vom Gesamt; rotein, so umlaßt es vorzugsweise einen immunogenen Teil. Vorzugsweise verfügt das Peptid oder Polypeptid jedoch über die in Figur 4 dargestellte Aminosäuresequenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft eindeutig alle Aminosäuresequenzen, die von der Aminosäuresequenz eines natürlichen NS1 entweder durch Mutationen und/oder Transpositionen abweichen, die sich im normalen Nahmen einer natürlich variierenden westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus bewegen. Diese Sequenzen weisen dushalb noch immer die grundlegenden Eigenschaften (insbesondere die wichtigen Antigenmerkmale) des nichtstrukturellen NS1 -Proteins der westlichen Unterart vom Zeckenenzephalitisvirus auf.
Obwohl die erfindungsgemäßen Peptide oder Polypeptide vorzugsweise durch Expression der entsprechenden Nucleptidsequenzen dieser Erfindung hergestellt werden, ist es ferner möglich, die erfindungsgemäßen Peptide oder Polypeptide zu isolieren oder vorzugsweise chemisch zu synthetisieren. Auf diese Weise lassen sich die Peptide oder Polypeptide in nahezu reiner Form und/oder im wesentlichen frei von anderen, mit ihnen auf natürliche Weise assoziierten Substanzen darstellen.
Die Peptide oder Polypeptide nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung sind allein oder in Verbindung mit einem oder mehreren Bindemitteln als Diagnostika und als Ingredienzien bei der Vakzinherstellung geeignet. Vorzugsweise sind die Peptide oder Polypeptide in einer Mischung enthalten, die auf dem Gebiet der Medizin eingesetzt werden kann. Entsprechend einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vakzinmischung geschaffen, die sich aus einem Peptid oder Polypeptid nach dem ersten Aspekt der Erfindung und aus einem oder mehreren zusätzlichen, aus pharmazeutischer Sicht zulässigen Bestandteilen zusammensetzt. Zu solchen Bestand:eilen zählen ein pharmazeutisch annehmbarer Träger oder ein Adjuvans für das Peptid oder Polypeptid. Weiterhin ist als Bestandteil eine Pufferlösung geeignet. Der Vakzinträger kann jeder geeignete Träger sein. Falls notwendig, kann er ein oder mehrere Adjuvanzien umfassen. Üblicherweise sind alle Vakzinmischungen gemäß dieser Erfindung steril.
Ein weiterer, bevorzugter Einsatzbereich für vgkzinhaltige Antigenpeptide oder -polypeptide liegt in der Herstellung spezieller Immunoglobuline, wie zum Beispiel monoklonal oder polyklonak) Antikörper, die sich mit Hilfe von unter Fachleuten bekannten Verfahren herstellen lassen. Als Grundlage der Erfindung können ferner die Antikörper für die Peptide oder Polypeptide angesehen werden.
Wie bereits erwähnt, läßt sich eine Mischung mit einem oder rnohnvron Peptiden oder Polypeptiden gemäß dieser Erfindung auch als Diagnostikum einsetzen.
Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf eine Nucleinsäure für die Kodierung der Peptide oder Polypeptide nach dem ersten Aspekt der Erfindung.
Entsprechend einem dritten Aspekt der Erfindung wird eine Neucleinsäurekodierung für zumindost einen Teil des NS 1-Proteins der westlichen Unterart vom Zeckenenzephalitisvirus geschaffen. Die Nucleinsäure-oftmalsrekombinante N jcleinsäure- kann das gesamte oder im wesentlichen das gesamte NS1 -Protein oder - falls zutreffend - Teile dejsolben kodieren. Diese DNA- und RNA-Moleküle eignen sich nicht nur für die Schaffung der Peptide oder Polypeptide gemäß dem ersten Aspekt, sondern sie können auch für die Erzeugung einer Lebendvakzine eingesetzt werden. Die DNA-Sequenzen werden vorzugsweise mit der DNA des Vakzina-Virus, einer bekannten Lebendvakzine, kombiniert.
Neben ihrem Einsatz als Lebendvakzine sind die erfindungsgemäßen DNA- oder RNA-Sequenzen des weiteren als Proben für Untersuchungszwecke geeignet.
Gegenwärtig stehen für die Spezialbehandlung von Patienten, die an Zeckenenzephalitis erkrankt sind, keine antiviralen Mittel zur Verfügung. Es bestehen jedoch verschiedene Möglichkeiten, um speziell in den viralen Lebenszyklus einzugreiten, einschließlich Prozesse unter Beteiligung nichtstruktureiler Proteine, wie zum Beispiel RNA-Replikation, posttranslationale Proteolyse und Virusaufbau. Die Nucleir_. irekodierung für das Protein NS1 oder einen Teil desselben wäre für diesen Zweck ebenfalls geeignet. Nsben der Beeinflussung der funktioneilen Aktivitäten der Virusproteine ist es des weiteren möglich, den Virusreplikationsprozeß mittels Antikodierungs-RNAzu blockieren.
Es gibt zahlreiche Möglichkeiten zur Herstellung von DNA-Molekülen, ohne vom Schutzumfang dieser Erfindung abzuweichen. Ein Weg zur Erzeugung eines DNA-Moleküls besteht erstens in der Extraktion der viralen RNA von der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus sowie in der Reindarstellung des RNA-Moleküls, gefolgt von der Transkription dieser RNA-Matrize in ein DNA-Molekül mittels Umkahrtranskriptase. Eine weitere Möglichkeit besteht in der chemischen Synthese der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle nach der Untersuchung der DNA-Sequenz.
Als eine bevorzugte Anwendungsform betrifft diese Erfindung DNA-Moleküle, die zu DNA-Molekulen nach dem ersten Aspekt hybridisieren, und insbesondere eine DNA-Sequenz wie in Figur 3 und/oder eine DNA-Sequenzkodierung für eine Proteinsequenz wie in Figur 4 unter bestimmten Badingungen, d. h,, es wird eine Nucleotidsequenzhomologie von mindestens 90% gewählt. Die DNA-Moleküle dieser bevorzugten Anwendungsform können noch immer Antikörperreaktionen hervorrufende Peptide kodieren, und darüber hinaus sind diese DNA-Moleküle als DNA-Proben geeignet. Durch eine Anwendungsform dieser Erfindung werden eine Nucleinsäure mit der vollständigen Sequen; vom westlichen Wildtyp des Zeckenenzephalitisvirusgenoms, das das nichtstrukturelle Protein NS1 kodiert, sowie von der genorr.ischen, der zumindest einen Teil des Proteins kodierenden RNA abgeleitete L >JA-Moleküle geschaffen. Die DNA-Moleküle innerhalb des Schutzumfangs entsprechen oder ergänzen die einzelsträngige RNA der westlichen Untergrt des Zeckenenzephalitisvirus und sind für die Bereitstellung genetischer Informationen für die Expression des gesamten NS 1-Pro'eins oder eines oder mehrerer Teile desselben, das als Vakzinkomponente oder für Diagnose- und Therapiezwacke verwendet werden kann, geeignet. Die vorliegende Erfindung betrifft explizit alle DNA-Sequenzen, die sich von den DNA-Molekülen, die einer natürlichen NS1 -RNA-Sequenz entsprechen oder diese ergänzen, entweder durch Degeneration des genetischen Kodes und/oder Mutationen und/ oder Transpositionen im normalen Rahmen einer natürlich variierenden westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus unterscheiden. Diese Sequenzen kodieren deshalb noch immer Proteine mit den grundlegenden Eigenschaften (insbesondere die wichtigen Antigenmerkmale) des nichtstrukturellen NS 1-Proteins der westlichen Unterart vom Zeckenenzephalitisvirus. In einer bevorzugten Anwendungsform dieser Erfindung lassen sich die beanspruchten DNA-Moleküle mit weiteren DNA-Sequenzen kombinieren.
Diese zusätzlichen Sequenzen gestatten die Replikation und Expression des DNA-Moleküls in einer Zellkultur. Zu den für diesen Zweck wichtigsten DNA-Sequenzen zählen jene, die als Promotoren, Verstärker, Polyadenylierungssignale und Spleißsignale wirken. Diese weiteren DNA-Sequenzen können mit den DNA-Molekülen nach dem ersten Aspekt dieser Erfindung mit Hilfe von in der Fachwelt bekannten Standardverfahran kombiniert werden.
Die oben diskutierten Vorteile der DNA-Moleküle innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung treffen auch auf RNA-Moleküle zu. Die erfindungsgemäßen RNA-Moleküle können durch Isolation und Reindarstellung der RNA von der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus oder durch RNA/DNA-Rekombinationstechniken entstehen. Des weiteren bezieht sich diese Erfindung nicht allein auf RNA-Moleküle. die mittels Reindarstellung des Zeckenenzephalitisvirus von der westlichen Unterart erzeugt wurden, sondern auch auf RNA-Moleküle, die durch Transkription isolierter und reindargestellter Virus-RNA in DNA mittels Umkehrtranskriptase und anschließende erneute Transkription der so erhaltenen DNA in RNA oder durch RNA-abhängige RNA-Transkription entstanden.
Die vorliegende Erfindung sieht nicht nur die Schaffung der oben beschriebenen DNA- und RNA-Moleküle vor, sondern auch Vektoren, die als Insert ein DNA- oder RNA-Molekül entsprechend dem Schutzumfang der Erfindung umfassen. Entsprechend einem vierten Aspekt der Erfindung ist ein Vektor vorgesehen, ein Klonierungs- oder ein Expressionsvektor, der eine Nucleinsäuresequenz nach dem dritten Aspekt der Erfindung aufweist. Bei dem Vektor kann es sich beispielsweise um ein Plasmid, ein Virus (zum Beispiel ein tierisches (z. B. Vakzina) Virus oder ein Phage) oder ein Cosmid handeln. In der Fachwelt ist bekannt, daß solche Vektoren im allgemeinen Sequenzen enthi/'in, die die Replikation und Expression der inserierten RNA- oder DNA-Sequenzen kontrollieren. Solche Kontrollsequenzen können neben anderen Sequenzen einen Promotor und möglicherweise zusätzlich einen Verstärker aufweisen.
Entsprechend einem vierten Aspekt der Erfindung ist eine Wirtszelle mit einem Vektor vorgeseehen, wie oben beschrieben. Viele solcher Zellen können in einer Zellkultur enthalten sein.
Die Vektoren befinden sich vorzugsweise in Zellkulturen, in denen die Expression der durch die RNA- oder DNA-Sequenzen kodierten Polypeptide erfindungsgemäß abläuft, wobei die Zellkultur vorzugsweise eine Säugerzellkultur ist. Durch Einsatz einer Säugerzellkultur werden die für die Expression eines Polypeptide für den Einsatz in ei· or Vakzine zur Verhütung von Zeckenenzephalitisvirusinfektionen (wesentliche Unterart) bei Säugetieren günstigsten Bedingungen geschaffen.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und zur Erläuterung ihrer Umsetzung in die Praxis werden jetzt unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen die bevorzugten Anwendungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Darin zeigt
FIGUR 1 eine Fotografie der Agarosegelelektrophorese des nicht aufgeschlossenen Plasmids BS 17-6 (Streifen h), das die gesamte Kodierungssequenz für das NS1-Protein enthält. Streifen c zeigt einem BamHi-Aufschluß desselben Plasmids, und die beiden Streifen a enthalten Marker der Größen 0,6Kb, 2Kb und 10 Kb.
FIGUR 2 die vollständige Nucleotidsequenz des Inserts 17-6, die in Plasmid BS 17-6 enthalten ist.
FIGUR 3 dio RNA-Sequenz und die kodierte Aminosäuresequenz von Insert 17-6. Die Positionszahlen beziehen sich auf das Zeckenenzephalitisvirusgenom mit voller Länge.
FIGUR 4 die Aminosäuresequenz von Protein NS1, wie sie von der Sequenzinformation des Klons 17-6 abgeleitet wird. Die Positionszahlen beginnen an der ersten Aminosäure von Protein NS1.
FIGUR 5, auf die im nachfolgenden Beispiel 10 Bezug genommen wird, eine Möglichkeit zur Klonierung von NS1 in den prokaryotischen Expressionsvektor pUC 19S.
FIGUR 6A und FIGUR 6 B, auf die in Beispiel 10 ebenfalls Bezug genommen wird, die Nucleotidsequenzen von Klon pNS 1387 an den 5'- und 3'-Endstellen. Ein NS1 -Insert befindet sich mit Bakteriengen lacZ im Rahmen. Die Expression wird vom lacZ-Operator/Promotorsystem kontrolliert. In FIGUR 6A ist die allgemeine Organisation des Aufbaus zu erkennen. In FIGUR 6B sind die DNA- und Proteinsequenzen angegeben. Bei diesem Aufbau verfügt das NS1 über 40 zusätzliche Nucleotide, die 14 Aminosäuren von lacZ-Gen und dem pUC19S-Polylinker am 5'-Ende entsprechen. Es sind weitere 27 Nucleotide (nicht NS1) (entsprechend 9 Aminosäuren) am 3'-Ende vorhanden. Die Nucleotidstellen mit Bezug auf das Zeckenenzephalitisgenom (von FIGUR 3) werden anhand von Sternchen angegeben.
FIGUR 7 A, auf die in Beispiel 11 Bezug genommen wird, eine Möglichkeit zur Klonierung von NS1 mit seiner authentischen 5-Signalsequenz in den prokaryotischen Expressionsvektor pUC19S.
FIGUR 7 B, auf die in Beispiel 11 ebenfalls Bozug genommen wird, die Nucleotidsequenzen von Klon ptSNS 1791 an den 5'- und 3' Endstellen. Das NS1 -Insert befindet sich mit der lacZ-Bakteriengenexpression im Rahmen und wird vom lacZ-Promotorsystem kontrolliert. In Teil I ist die allgemeine Organisation des Aufbaus zu erkennen. In Teil Il werden die DNA- und Proteinsequenzen angegeben. Bei diesem Aufbau verfügt das NS1 über 39 zusätzliche Nucleotide, die 13 Aminosäuren von lacZ-Gen und dem pUC19S-Polylinker am 5'-Ende entsprechen. Die Nucleotidstellen mit Bezug auf das Zeckenenzephalitisgenom (von FIGUR 3) werden anhand von Sternchen angegeben.
FIGUR 8A, auf die in Beispiel 12 Bezug genommen wird, die Klonierung des NSI-Kodierungsbereichs in den Transfervektor pTKgptFI s zwecks Rekombination mit dem Vakzina-Virus.
FIGUR 8 B, auf die in Beispiel 12 ebenfalls Bezug genommen wird, die Nucleotidsequenzen des Klons pAPNS 1338 an den 5'- und 3'-Endstellen. Das NS1 verfügt in seinem erwarteten Translationsprodukt am 5'-Ende des Polylinkerbereichs über 19 zusätzliche Nucleotide, die 7 Aminosäuren entsprechen. Weitere 30 Nucleotide, die 10 Aminosäuren entsprechen, wurden am 3'-Ende festgestellt. Die Nucleotidstellen im Zeckenenzephalitisvirusgenom von FIGUR 3 werden anhand von Sternchen angegeben.
FIGUR 9 A und FIGUR 9B, auf die in Beispiel 13 Bezug genommen wird, die Klonierung von NS1 und seiner vermeintlichen Signalsequenz durch Polymerasekettenreaktion. FIGUR 8A zeigt eine allgemeine Form der Polymerasekettenreaktion. In FIGUR 8 B ist die Sequenz der als Primer für die DNA-Amplifikation verwendeten, chemisch synthetisierten Oligonucleotide zu erkennen. Die Nucleotidstellen im Virusgenom nach FIGUR 3 werdan ,inhand von S.ternchen angegeben.
FIGUR 10, auf die in Beispiel 13 ebenfalls Bezug genommen wird, ein Agarosegel, in dem das durch Polymerasekettenreaktion synthetisierte NS 1-Fragment sichtbar ist. Das Agarosegel ist mit Ethidiumbromid eingefärbt. Die DNA läßt sich unter UV-Licht nachweisen. Der Pfeil verweist auf das Fragment mit einer Länge von etwa 1130bp.
FIGUR 11, auf die in Beispiel 13 ebenfalls Bezug genommen wird, die Klonierung des NS1-Kodierungsbereichs mit seiner vermeintlichen Signalsequenz nach Synthese durch Polymerasekettenroaktion in den Transfervektor pSC 11-OrthDELTAO zwecks Rekombination mit dem Vakzina-Virus.
FIGUR 12, auf die in Beispiel 13 ebenfalls Bezug genommen wird, die Sequenzen von Klon pSCtSNS 1444 an den 3'- und 5'-Endstellen. Der authentische NS1 -Kodierungsbereich, einschließlich seiner Signalsequenz, orhält vom Polylinkerbsreich am S'-Ende in seinem erwarteten Translationsprodukt 12 zusätzliche Nucleotide, die vier Aminosäuren entsprechen. Weitere 47 Nucleotide (d. h. 16 Aminosäuren) wurden am 3'-Ende festgestellt. Die Nucleotidstellen im Zeckenenzephalitisvirusgenom nach FIGUR 3 werden anhand von Sternchen angegeben.
FIGUR 13, auf die in Beispiel 13 ebenfalls Bezug genommen wird, eine Analyse des Plasmids pSCtSNS 1444 durch Aufschluß mit entsprechenden Restriktionsendonucleasen. Das DNA-Muster verweist auf die korrekte Orientierung der in den pSC 11-Orth-Vektor eingeführten NS1 -Sequenz und bestätigt die Fragmentgröße, wie sie anhand der Nucleotidsequenz von Klon 17-6 abgeleitet wurde.
FIGUR 14, auf die in Beispiel 14 Bezug genommen wird, die Klonierung von NS1 mit seiner vermeintlichen Signalsequenz in den Transvektor pTKgptF3a zwecks Rekombination mit dem Vakzina-Virus.
FIGUR 15, auf die in Beispiel 14 ebenfalls Bezug genommen wird, die Nucleotidsequenz des Plasmids pTKtSNS1556 an den 5'- und 3'-2nuäic!!"i. Bei diesem Aufbau verfügt das NS1 über 24 zusätzliche Nucleotide, die in seinem erwarteten Tranolationsprodula am 5'-Ende vom Polylinkerbereich 8 Aminsäuren entsprechen. Es sind weitere 26 Nucleotide (d. h. 9 Aminosäuren) am 3'-Ende festgestellt worden. Die Nucleotidstellen im Zeckenenzephalitisvirusgenom nach FIGUR 3 werden anhand von Sternchen angegeben.
HIGUR 16, auf die in Beispiel 15 Bezug genommen wird, eine Southern-Blot-An alyse der NS 1-Vakzina-Rekombinanten varec NS1444 und varec NS1556 mit rekombinanten Vakzina-Viren boi einer Multiplizität von 5 pfu/Zelle infizierten Zellen. Zwei Tage nach der Infektion wurde die gesamte Zeil-DNA reindargestellt, mit der Restriktionsendonuclease Hind III aufgeschlossen und auf 1 % Agarosegel getrennt. Die DNA wurde auf ein Cellulosenitratfilter übertragen und mit dem radioaktiv markierten Plasmid pSCtSNS 1444 als Probe zum Nachweis des eingefügten NS1 -Fragments und der benachbarten tk-Virussequenz hybridisiert. Bei einem Vergleich der Rekombinanten varecNS 1556, -124, -122 und varecNS 1444-121 mit dem Wildtyp der Vakzina-DNA (Schlitz 4) wird die erwartete Erhöhung der relativen Molekülmasse vom Hindlll-Fragment deutlich. Allein varecNS 1556-222 zeigt gegenüber dem Wildtyp-Fragment eine geringere Bande. Daraus ist zu schließen, daß die Plaque-Isolation nicht homugen ist. 1556-122 usw. sind verschiedene Plaque-Isolationen desselben Rekombinationsversuchs nach drei Plaque-Reindarstellungen. Unterschiedliche Aufschlüsse des Plasmids pSCtSNS 1444 wurden als Kontrollen und Größen-Marker eingesetzt (Schlitze 6 und 7).
FIGUR 17, auf die in Beispiel 16 Bezug genommen wird, ein Autoradiogramm eines denaturierenden SDS-GeIs mit den rekombinanten Viren varecNS 1444 und varecNS 1556 für die Expression des NS1 -Proteins. Es läßt sich ein Protein mit einer erwarteten relativen Molekülmasse von etwa 48 kD nachweisen, das in Zellen, die mit dem Wildtyp oder varec 1342 (Expression eines anderen Proteins) infiziert waren, nicht vorkam. Die sehr starke, über die 97AD-Marker-Bande migrierende Protein-Bande steht für ß-Galactosidase (116kD), deren Expression unter Kontrolle des P11-Promotors in den pSC 11-Orth-abgeleitoten Rekombinanten varecNS 1444 und varec 1342 erfolgt.
Mit Hilfe der nachfolgenden allgemeinen Verfahren läßt sich die erfindungsgemäße Nucleinsäure herstellen und die Sequenz bestimmen:
Zuerst läßt sich Virus-RNA von der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus oder von Zellen, die mit der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus infiziert sind, extrahieren. Eine doppelsträngige cDNA kann bei Einsatz dieser RNA als Matrize beispielsweise durch Umkehrtranskriptase synthetisiert werden. Mit Hilfe der DNA-Rekombinationstechniken läßt sich diese cDNA in eine Vektor-DNA, wie zum Beispiel Escherichla coli-Plasmid-DNA, unter Bildung eines rekombinanten Plasmids einfügen. Die rekombinanten Plasmide können für die Umwandlung entsprechender Wirtszellen, wie zum Beispiel E. colI-Stsmm HB101, zur Amplifikation der Plasmide oder zur Expression der entsprechenden Proteine verwendet werden. Einzelne Kolonien mit inserthaltigen Plasmiden lassen sich durch das Mini-Plasmidpräparationsverfahren nach Birnboim und DoIy (Nucleic Acids Research, 7,1195-1204,1979) nachweisen. Die Basensequenz der für das Virus (westliche Unterart) spezifischen DNA kann durch schnelle DNA-Sequenzierungsverfahren wie Didesoxy-Kettenabbruchverfahren bestimmt werden. Es folgt eine detailliertere Beschreibung eines besonderen Verfahrens zur Erzeugung von cDNA, rekombinanten Plasmiden, mit diesen Plasmiden umgewandelten Zellen und zur Bestimmung der Nucleotidsequenz: Zuerst kann die Zeckenenzephalitisvirus-RNA der westlichen Unterart aus dem reindargestellten Virus entstehen. Zu diesem Zwecke wird die westliche Unterart des Zeckenenzephalitisvirus in primären Hühnerembryozellen gezüchtet, durch Ultrazentrifugation konzentriert und durch zweimalige Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation reindargestellt. Nach Solubilisierung der Proteine mit Natriumdodecylsulfat, wie zum Beispiel durch einstündige Inkubation bei 37°C, bei Vorhandensein von Proteinase K und Ribonuclease-Inhibitor wird die RNA beispielsweise mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Bei Einsatz dieser RNA als Matrize wird im Anschluß eine zur Virus-RNA komplementäre DNA in vitro mittels Umkehrtranskriptase beispielsweise vom Myeloblastose-Geflügelvirus nach dem Verfahren von Gubler und Hofmann (Gene 25,263-269,1983) synthetisiert. Unter Zuhilfenahme von Primern, wie zum Beispiel Hexanucleotidprimer der Kälberthymus-DNA, wird die Virus-RNA unter entsprechenden Bedingungen, wie zum Beispiel im Handbuch „cDNA synthesis system" von Amersham, England, beschrieben, mit Umkehrtranskriptase inkubiert, wobei Desoxyadenosintriphosphat (dATP), Desoxythymidintriphosphat (dTTP), Desoxyguanosintriphosphat (dGTP) und Desoxycytidintriphosphat (dCTP) als Substrate dienen. Die so entstandene cDNA.RNA-Hybride wird unter bestimmten Bedingungen mit Ribonuclease H behandelt, wodurch in der RNA des Hybridmoleküls Schnitte erzeugt werden. Der RNA-Strang kann dann gegen E.coli-DNA-Polymerase I ausgetauscht werden, die geschnittene RNA dient dabei als Primer. Die auf diese Weise erzeugte doppelsträngige RNA wird anschließend durch Phenol-Chloroform-Extraktion entproteinisiert, mit Ethanol ausgefällt, und die zurückbleibenden RNA-Fragmente werden durch Ribonucleasebehandlung entfernt (zum Beispiel in TE-Pufferlösung, 37°C, 30 Minuten).
Die Klonierung der dsDNA erfolgt beispielsweise mit Hilfe von synthetischen Linkern. Zu diesem Zwecke wird die dsDNA mit dem Klenow-Fragment von E.coli-DNA-Polymerase I unter entsprechenden Bedingungen (Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH 1982) behandelt, um ein Maximum an klonierbaren stumpfen Enden zu erreichen. Es folgt die Phenolextraktion zwecks Entproteinisierung. Die dsDNA wird unter entsprechenden Bedingungen mit BamHI-Linkern bei Vorhandensein von DNA-Ligase inkubiert. Die Reaktionsmischung wird eingetragen und auf einen 1 % Agarosegel geführt, und unterschiedliche Korngrößenklassen werden aus dem Gel geschnitten und beispielsweise durch Elektroelution reindargestellt. Andererseits wird
eine als Vektor-DNA einzusetzende Plasmid-DNA wie E, coli-Plasmid-BLUESCRIPT-SK- mit der Restriktionsendonuctease BamH! geschnitten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Nach dem Aufschluß der cDNA mit BamHI wird sie mit der BamHI-geschnittenen Vektor-DNA gemischt und unter entsprechenden Bedingungen zwecks Hybridisierung der komplementären überhängenden Sequenzen an den Enden beider DNA-Moleküle inkubiert sowie mittels T4-DNA-Ligase ligiert. Das DNA-Rekombinationsmolekül wird für die Umwandlung eines kompetenten E. coli-Stammes (zum Beispiel E. coil XL 1-blau) verwendet. Rekombinantenhaltige virusspezifische Inserts werden durch Farbselektion nachgewiesen. Plasmide werden nach dem Mini-Plasmidpräparationsverfahren (Birnboim und DoIy, Nucleic Acids Research 7,1195-1204,1979) isoliert, und die Insertgrößen werden durch Restriktaseanalysen mit BamHI und Trennung der entstandenen Fragmente auf 1 % Agarosegel analysiert.
Die Basensequenz dieser Inserte wird mittels Didesoxy-Kettenabbruchverfahren nach Sanger etal. (Pnas USA, 74,5463-5467, 1977) bestimmt. Die entstandene Sequenz wird mit bereits bekannten Sequenzen anderer Flaviviren (Rice et al., Science 229, 726-733,1985; Dalgarno et al., J. Mol. BIoI., 187,309-323,1986; Castle et al., Virology 147,227-236,1985; Castle et al., Virology 149,10-26,1986; Wengler et al., Virology 147,264-274,1985; Yamshchikov und Pletnev, Nudele Acid Res. 16,7750,1988) auf Homologien geprüft, wobei für die Bestimmung der Position der zu untersuchenden Sequenz innerhalb der Gesamtsequenz der Genom-RNA Computerprogramme verwendet werden. Figur 2 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz, und in Figur 3 ist die entsprechende Aminosäuresequenz des NS1-Bereichs von der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirusgenoms zu erkennen.
Die vorliegende Erfindung sieht so zum ersten Male die Nucleotidsequenz der Genkodierung für das NS 1-Protein der westlichen Unterart vom Zeckenenzephalitisvirus vor und schafft folglich die Aminosäuresequenz dieses Proteins. Die Basensequenz in Figur 2 stellt ein bevorzugter Beispiel für eine DNA dar, die Polypeptide mit den charakteristischen Eigenschaften des NS 1-Proteins von der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus kodiert. Aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes kann dieselbe Aminosäuresequenz auch durch andere Basentripletts als die in der Figur gezeigten kodiert werden.
In den Schutzumfang fallen auch Sequenzen, die durch Mutation, Transposition und Degradation geändert werden, jedoch trotzdem eine Aminosäuresequenz mit den grundlegenden antigenen Merkmalen des NS 1-Proteins kodieren. Ferner betrifft die Erfindung nicht nur genau dieselbe Aminosäuresequenz wie in Figur 3, die nur ein Beispiel für die NS1-Sequenz einer natürlichen Isolation der westlichen Unterart vom Zeckenenzephalitisvirus ist. Es ist bekannt, daß die Genome der RNA-Viren höheren Mutationsfrequenzen als der DNA-Viren oder Zellgene ausgesetzt sind, was auf die höhere Fehlerhäufigkeit von RNA-Polymerasen und auf das Fehlen von Korrekturmechanismen zurückzuführen ist (Holland et al., Science 215,1577-1585,1982; Reanney, Ann. Rev. Mlcrobiol. 36,47-73,1982). In Abhängigkeit von den Viruseigenschaften können diese Mutationen eine schnelle Entwicklung neuer Virusarten bewirken. Dies ist auf die Antigendrift zurückzuführen, wie es beim Influenzavirus der Fall ist (Both et al. in: „The Origin of Pandemic Influenza Viruses", W.G. Laver (ed.), Elsevier, 1983). Andererseits können RNA-Viren aus antigener Sicht unter natürlichen ökologischen Bedingungen stabiler sein, was seine Ursache wahrscheinlich in den funktioneilen Beschränkungen hat, die umfangreiche Strukturänderungen in antigen aktiven Proteinen nicht zuläßt. Trotzdem ist ein gewisses Maß an Veränderungen zur erwägen, was sich auch anhand eines Sequenzvergleichs verschiedener natürlicher Isolationen nachweisen läßt.
Möglich ist dies beispielsweise mit Hilfe der RNA-Sequenzierung verschiedener Isolctionen nach dem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren mit synthetischen Oligonucleotiden als Primer, die entsprechend der Sequenz von der Prototypisolation in Figur 2 hergestellt worden sind.
Alle Sequenzen, die im Vergleich zu den Prototypsequenzen leichte Änderungen aufweisen, wie bei anderen natürlichen Isolationen der westlichen Unterart vom Zeckenenzephalitisvirus festgestellt wurde, sind in die Erfindung einbezogen, zu solchen Veränderungen kann es auch durch In-Vltro-Modifikation der Nucleinsäure kommen. Die Erfindung betrifft deshalb alle Sequenzen, die unter streng kontrollierten Bedingungen hybridisieren, zum Beispiel durch Auswahl einer Nucleotidsequenz, die zu mindestens 90% zu den offenbarten Sequenzen oder Teilen der Sequenzen homolog ist und die vorzugsweise Proteine oder Peptide mit den wesentlichen antigenen, bestimmenden Eigenschaften der Strukturproteine von der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus kodiert.
Die Insertion der Nucleotidsequenzkodierung für ein Protein wie NS1 in geeignete Vektoren und Wirtszellen zwecks hochgradiger Expression ist eine leistungsfähige Technikfür die Untersuchung der Struktur sowie der biologischen Funktion(en) des Proteins. Das einzusetzende Expressionssystem ist stets von verschiedenen Moleküleigenschaften abhängig, wie posttranslationale Modifikation des betreffenden Proteinmoleküls.
Die Expression kann in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellsystemen durchgeführt werden. Bei Glycoproteinen wie NS1 sollte sie besser in einer eukaryotischen, zur korrekten Glycolisierung fähigen Wirtszelle stattfinden.
Ein bevorzugtes Expressionssystem besteht aus einem Vakzina-Virus und einer Primatzelle, die in einer Kultur kontinuierlich wächst. Auf diesem Wege sind posttranslationale Modifikationen sowie eine hochgradige Synthese möglich. Ferner gibt es zahlreiche Hinweise dafür, daß die Regulatorsequenzen des Vakzina-Virus die Synthese nahezu jedes Fremdproteins entweder mittels „Endphasen"-Promotor oder konstitutiven, während der Anfangs- und Endphase der Virusreplikation aktiven Promotor steuern (Moss und Flexner, Ann. Rev. Immunol. 4,305-324 [1987]). Die Stabilität der in Zellen ausgedrückten Fremdproteine, die mit dem Vakzina-Virus infiziert sind, soll jedoci ι durch den die Expression des Gens regulierenden Promotor stark beeinflußt werden (Coupar et al., Eur. J. Immunol. 16,1479 [1986]; Townsendet al., J. Exp. Med. 168,1211-1224(1988]).
Der Aufbau der entcprechenden Expressionsplasmide mit NS !-spezifischen Inserts erfordert eine umfangreiche DNA-Manipulation. Es istzu berücksichtigen, daß NS1 Toil eines Polyproteins ist, das posttranslational mittels Zeil- und Virusprotease in einzelne Proteine umgewandelt wird (Mandl et al., Virology 173,291-301 [1989)). Im Laufe der natürlichen Virusinfektion ist bei der NS 1-Synthese eine innere Signalsequenz an der NHrEndstelle beteiligt. Das Signal leitet die entstehende Polypeptidkette in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, was für korrekte posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung erforderlich ist. Für ein ordnungsgemäß verarbeitetes Expressionsprodukt ist dies oder eine heterologe Signalsequenz in das rekombinante Molekül einzubeziehen.
Da NS1 Teil eines Polyproteins ist, besitzt es ferner keine Start- und Stoppcodone für die Translation. Diese sind durch spezielle DNA-Rekombinationsmanipulation zu liefern.
In der Sequenz von Klon 17-6 (Figur 3) sind hydrophobe (5') Signal- und Ankersequenzen (3') enthalten. Das Fehlen entsprechender Endonucleaserestriktionsstellen macht eine direkte Klonierung von NS1 mit seiner „natürlichen" Signalsequenz in die Insertionsvektoren nicht möglich. Aus diesem Grunde kann ein Abschnitt von 1200bp, bestehend aus der NS1-Signalsoquenz und der Sequenz des reifen NS1, beispielsweise durch eine Polymerasekettenreaktion synthetisiert werden. Mit Hilfe dieser Technik können wahlweise an beiden Seiten der verstärkten DNA Restriktionsstellen sowio Start- und Signalsequenzen eingeführt werden.
Ein speziell für die Amplification aufgebautes Primer-Paar führt zu einem NS1-Sequenzprodukt mit benachbarten Erkennungsstellen für die Restriktionsendonuclease EcoRI. Diese Verfahrensweise ermöglicht ev, die authentische NS1-Signalsequenz gegen jede natürlich vorkommende Signalsequenz oder gegen eine synthetische Consensus-Signalsequenz nach den Vorschlägen von v.Heinje (NAR 14 4683-4690 (1986)) auszutauschen.
Alle speziell für die Expression von NS1-Molekülen entwickelten Plasmide lassen sich durch homologe Rekombination in einer entsprechenden Wirtszelle, v/o .'Uir 3c ispielCV-1-Primatzellen, in ein Vazina-Elternvirus (Stamm-WR oder abgeschwächte Derivate) transponieren. Die Versuchsdurchführung ist in der Fachwelt bekannt und muß an dieser Stelle nicht eingehender beschrieben werden (Mackett et al., JRl. Press; „DNA cloning II" Ed. DM Glover 191-211,1985).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich des weiteren auf die Synthese von NS1 -Molekülen in einem Bakterienwirt. In Bakterienzellen ausgedrückte Glycoproteine werden gewöhnlich nicht auf dieselbe Weise glycolisiert wie in eukaryotischen Zellen. Trotzdem ist die NL> 1-Synthese, selbst in nichtglycolisierter Form, für unterschiedliche Zwecke nützlich. Beispiels»>'9ise habe die in Bakterienzellen ausgedrückten Derivate des Hüllgycoproteins 160 von HIV-1 wesentlich zur HIV-Diagnosu scvvie zur experimentellen Vakzination beigetragen.
Analog zum Aufbau von Insertionsplasmiden für die Rekombination mit einem Vakzina-Virus wird eine NS 1-Sequenz, einschließlich der authentischen Signalsequenz, mit PCR synthetisiert und zum Beisiel in pUC-19 Moniert. Die Substitution der Zeckenenzephalitissignalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz zwecks wirksamer Sekretion der NS1 -Moleküle von den Bakterienzellen ist möglich. Durch letztgenanntes können die NS1 -Anhäufung sowie die Bildung von Einschlußkörpern, die mit Detergenzien oder anderen Lösungsmitteln zu lösen sind, umgangen werden.
Dieses Versuchsprotokoll kann nicht nur für die Synthese des vollständigen und reifen NS1, sondern auch für abgestumpfte Formen des NS1-Moleküls verwendet werden. Abgestumpfte Moleküle können zur Induktion einer Immunantwort zum Einsatz gelangen, die direkt zu speziellen Stellen des Proteins geleitet wird. Solche Formen können sich auch bei der auf bestimmte Stellen gerichteten Serologie als wertvoll erweisen. Immunologisch relevante Epitope innerhalb des NS1 können als Adjuvanzien in Transportmoleküle (z. B. HB-Karnpartikel) oder in einen immunstimulierenden Komplex (ISCOM) (Morein et al.
Immunology Today 8 [11 ] 333-338 [1978]) eingebaut werden. Alle NS 1-Moleki"ie, die wie in dieser Anmeldung beschrieben in prokaryotischen und eukaryotischen Expressionssystemen synthetisiert wuroen, stehen für Moleküle, die allein oder vielleicht in Kombination mit dem rekombinanten Glycoprotein-E des Zeckenenzephalitisvirus (EP-A-028791) oder der bereits vorhandene Vakzine, bestehend aus dem inaktivierten Zeckenenzephalitisvirus, als Kandidaten-NS-1 -Vakzine geeignet sind.
Des weiteren kann die Analyse der Immunantwort gegenüber diesem nichtstrukturellen Protein oder Teilen desselben für das Verständnis des Zeckenenzephalitisvirus und weiterer Mitglieder der Familie der Flaviviren entscheidend sein.
Fremd-DNA- oder -RNA-Sequenzen lassen sich ebenfalls in die Genome von Lebendviren einbauen, wodurch es zur Schaffung rekombinanter Viren kommt, die als Lebendvakzine eingesetzt werden können (zwecks Prüfung, siehe Mackett und Smith, J.
Gen. Vlrol. 67, 2067-2082,1986).
Auch Kombinationen verschiedener Gene, die beispielsweise von verschiedenen Viren abgeleitet werden, lassen sich mittels DNA-Rekombinationstechniken simultan ausdrücken und für die Vakzination einsetzen (Perkus et al., Science, 229,981-984, 1985). Die Erfindung betrifft deshalb alle Sequenzkombinationen aus den offenbarten Sequenzen und anderen Sequenzen, wie zum Beispiel die Genkodierung für andere Proteine oder Sequenzen, die zur Expression der Proteine beitragen wie Prcmotor, Verstärker, Polyadenylierungs- oder Spleißsignale.
Den Fachleuten ist gut bekannt, daß für die Immunisierung oder Diagnose nicht unbedingt ganze, natürlich vorkommende Proteine verwendet werden müssen (Lerner, Nature 299,492-596,1982; Arnon, TIBS 11,521-524,1986).
Die als Vakzine oder Diagnostika einzusetzenden Proteine oder Teile von Proteinen können nicht nur durch die oben beschriebenen DNA-Rekombinationstechniken entstehen, sondern die in der vorliegenden Erfindung offenbarte Sequenzinformation kann auch für die chemische Synthese der Oligopeptide genutzt werden. Zu diesem Thema steht umfangreiche Literatur zur Verfügung: Peptide, die entsprechend der DNA-Sequenzkodierung für viele unterschiedliche Proteine synthetisiert wurden, sind erzeugt und für vielerlei Zwecke, wie zum Beispiel Molekularbiologie- und Immununtersuchungen (Lerner, et öl.. Cell, 23,309-310,1981; Lerner, Nature, 299,592-596,1982) oder Vakzination (Shinnick et al., Ann. Rev. Microblol.
37,425-446,1S83; Dimarchi et al., Science, 232,639-641,1986) eingesetzt worden. Herstellung und Verwendung der Peptide oder Poptidkombinationen gemäß den in der vorliegenden Erfindung offenbarten Sequenzen spiegeln deshalb den bisherigen Stand der Technik wider.
Den Fachleuten ist auch bekannt, daß die durch diese Erfindung offenbarten Nucleinsäuren und -Sequenzen für die Herstellung der Hybridisierungsproben verwendet werden können wie für die Bestimmung der Virus-RNA in Zecken oder Blutflüssigkeit (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem. 138,267-284,1984; Kulski und Norval, Arch. Virol. 83,3-15,1985). Sie lassen sich entweder durch DNA-Rekombinationstechniken oder durch chemische Synthese der Oligonucleotide nach der offenbarten Sequenz herzustellen.
Die Erfindung wird jetzt anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Wo nicht ausdrücklich erwähnt, entsprechen die angewandten Verfahren den herkömmlichen Verfahren nach dem Stand der Technik. Solche Verfahren sind in einer Reihe von Standardwerken, einschließlich Sambrook, Fritsch und Maniatis „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (zweite Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, enthalten.
Vormehrung und Reindarstellung des Zeckenenzephalltisvirus
Eine 10%ige Suspension des mit Zeckenenzephalitisvirus infizierten Gehirns (Mäusejunge) wurde für die Infektion von Hühnerembryoprimärzellmonolayern verwendet, die in einem Minimalmedium gehalten und mit 15mMol HEPES und 15mMol MEPPS bei einem pH-Wert von 7,6gepuffert wurden. Na.:h40siündigur Inkubation bei 370C wurde der Überstand 30 Minuten bei 4°C auf 10000g geklärt, und das Virus wurde mittels Ultrazentrifugalion 3 Stunden lang bei 4°C auf 50000g pelletiert. Das Virus wurde dann in einer entsprechenden Menge TAN-Pufferlösung (0,05 M Triethanolamin, 0,1 M NaCI, pH-Wert 8,0) erneut suspendiert und 110 Minuten bei 40C der Geschwindigkeitszonalzentrifugation in einem Saccharose-Dichtegradienten von 5 bis 20Ma.-% bei 170000g ausgesetzt. Der Viruspeak wurde durch Abtasten des Gradienten bei 254nm lokalisiert. In einem Saccharose-Gradienten von 20 bis 50Ma.-% durchlief er 18 Stunden bei 40C und 150000p eine Gleichgewichtsdichtegradientenzentrifugation. Zwecks Beseitigung der Überschußsacchirose wurde der Viruspeak gegen TAN (pH-Wert 8,0) dialysiert.
Herstellung der Vlrus-RNA
100μg reindargestellter Virus wurden in 400plProteinase-K-Reaktionspufferlösung (1OmMoI TrisPuffer, pH-Wert 7,8,5mMol EDTA, 0,5Vol.-% Natriumdodecylsulfat) verdünnt. Zu sine Endkonzentration von 200μg/ml wurde Proteinase-K hinzugegeben, und die Mischung wurde 1 Stunde bei 370C inkubiert. Anschließend wurde die Lösung durch zweimalige Extraktion mit jeweils gleicher Phenolmenge (ΛΟΟμΙ) und einmalige Extraktion mit Chloroform (Isoamylalkohol [24:1 ]) entproteinisiert. Danach wurden 26μΙ einer 3 M Natriumacetatlösung hinzugesetzt, und die RNA wurde mit 2,5 Volumen Ethanol ausgefällt. Vor ihrer weiteren Verwendung wurde eine Teilmenge RNA mit Glyoxal denaturiert und zur Überprüfung der Ausbeute und der Qualität des Präparatsauf ein 1-%-Agarosegel gegeben.
Synthese der doppelstränglgen cDNA
5μg in Ethanol ausgefällter RNA wurden erneut in 40μΙ einsträngiger Synthesepufferlösung (Amersham, Großbritannien) suspendiert, die 5μς statistische Oligonucleotidprimer enthielt, eine Minute lang auf 70°C erwärmt wurde und anschließend langsam auf Raumtemperatur abkühlen konnte. Alle vier Desoxynucleotidtriphosphate wurden zu den Endkonzentrationen von
1 mMol hinzugegeben. Des weiteren wurden der Mischung 5 Einheiten humaner Plazentaribonucleaseinhibitor und 10μ0ί α-32ρ dCTP zugeführt. Die Synthese des ersten Strangs begann durch Zugabe von 100 Einheiten Umkehrtranskriptase (Amersham), und sie konnte zwei Stunden lang bei 420C stattfinden. Im Anschluß wurde die Reaktionsmischung auf Eis gegeben, und die Reagenzien für die Synthese des zweiten Strangs wurden in folgender Reihenfolge zugesetz: 93,5 μΙ der Pufferlösung für die Synthese des zweiten Strangs (Amersham, Großbritannien), 4 Einheiten Ribonuclease H, 23 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase und Wasser, so daß ein Endvolumen von 250μΙ erreicht wurde. Die Synthese des zweiten Strangs erfolgte durch anschließende Inkubationen bei 120C und 220C (jeweils zwei Stunden), und sie wurde durch 20minütige Erwärmung der Lösung auf 7O0C gestoppt. Die doppelsträngige cDNA wurde mit 10 Einheiten T4-DNA-Polymerase 30 Minuten bei 37°C aufgeschlossen, um stumpfe Enden zu schaffen. Schließlich wurde die cDNA durch Phenol- und Chloroformextraktionen reindargestellt und mit
2 Volumen Ethanol ausgefällt.
Linkerligation
Synthetische 5'-phosphorylierte BamHI-Linker (New England Biolabs) wurden auf die cDNA gegeben, und die Reaktion fand über Nacht bei 120C statt. Die in einer Ligationspufferlösung (50mMol Tris, pH-Wert 7,5, 5mMol MgCI2,5 mMol Dithiothreitol, 1 mMol ATP) mit einem Endvolumen von 20μΙ enthaltene Reaktionsmischung umfaßte ungefähr 1 μ9 cDNA, 1 yg Linke -DNA und 1 μΙ T4-DNA-Ligase (New England Biolabs).
Beisplel5
Größenfraktionlerung von cDNA
Die cDNA wurde auf einem 1-%-Agarosegel fraktioniert. Unterschiedliche Größenfraktionen wurden aus dem Gel geschnitten, und die DNA wurde in einem analytischen Elektroeluierungsmittel (IBI) nach den Vorschriften des Herstellers aus der Agarose extrahiert. Trotz der geringen DNA-Menge, die sich durch Einfärben mit Ethidiumbromid kaum nachweisen ließ, konnte der Extraktionsprozeß aufgrund dor radioaktiven Markierung der cDNA einfach überwacht werden. Aufgrund der Größenfraktionierung konnten großa cDNA-Fragmente selektiv kloniert und die cDNA von den nichtlegierten Linkermolekülen vollständig getrennt werden.
Klonierung In einen Bakteriophagen
Die cDNA wurde mit 10 Einheiten BamHI-Restriktionsendonuclease eine Stunde lang bei 370C aufgeschlossen. Nach Phenol- und Chloroformextraktionen wurde die DNA mit 2 Volumenanteilen Ethanol ausgefällt und erneut in einer kleinen Menge Wasser suspendiert. 20 bis 30ng der cDNA wurden mit 50ng des Phagen BLUESCRIPT SK- (Stratagene) gemischt, der durch BamHI-Aufschluß linearisiert worden war. (Das Wort BLUESCRIPT ist ein Warenzeichen.) Diese beiden Komponenten wurden mittels T4-DNA-Ligase in 10μΙ Ligationspufferlösung (siehe oben) in einer Reaktion über Nacht bei 16°C ligiert. Am nächsten Morgen wurde die Ligationsmischung 5 Minuten lang auf 650C erwärmt, lOOfach mit Wasser verdünnt und für die Umwandlung von E.coli-XLI-Blue-Zellon verwendet. Kompetente Bakterien wurden von Stratagane bezogen und mit 3μΙ der verdünnten Ligationsmischung genau nach dem vom Hersteller mitgelieferten Protokoll umg&wandelt. Die Bakterien wurden auf LB-Agarplatten plattiert, die Ampicillin, Tetracyclin, Isopropylthiogalactosid und 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galacto-pyranosid enthielten.
Nachweis der Inserthaltlgen Phagen
Im BLUESCRIPT-Vektorsystem erzeugen inserthaltige Phagen weiße Bakterienkolonien, während selbstligierte Phagen eine blaue Farbreaktion bewirken. So wurden die weißen Kolonien ausgewählt und für die Beimpfung von 2ml LB-Medium, das Ampicillin enthielt, verwendet und über Nacht bei 37°C in einer Schüttelmaschine mit 220 Umdrehungen je Minute gezüchtet.
Am darauffolgenden Tag erfolgte mit Hilfe eines herkömmlichen Siedeverfahrens (Birnboim und DoIy, Nucleic Acids Research 7, 1195-1204,1979) eine Schnellplasmiderzeugung. Die Plasmide wurden mit dem Restriktionsenzym BamHI aufgeschlossen und auf 1 -%-Agarosegel analysiert. Bei einem auf diese Weise nachgewiesenen Klon handelte es sich um den Phagen BS 17-6, der ein etwa 2000bp langes virusspezifisches Insert aufweist. Figur 1 zeigt ein 1-%-Agarosegel eine Schnellplasmidpräparats von BS 17-6 sowohl in der supergeknäulten ringförmigen als auch in der durch BAMHI aufgeschlossenen Form.
SequenzBnalyse des Inserts von Klon 17-6
Einzelsträngige DNA des Klons BS 17-6 entstand durch Zugabe des VCS-Helferphagen (Stratagene) mit einer Infektionsmultiplizitätvon 20:1 zu exponentiell wachsenden BS 17-6-KulturenmitE.coll-XLI-Blue-Bakterien. Nach16stündigem kräftigen Schütteln der Kultur bei 370C wurde ssDNA aus dem Überstand nach den herkömmlichen Protokollen reindargestellt.
Die einzelsträngige DNA wurde im gesamten Insertbereich mit Hilfe der Didesoxy-DNA-Sequenzierungsmethode nach Sangeret al. (PNAS USA 74,5463-5467; 1977) unter Einsatz des SEQUENASE-Enzyms (United States Biochemicals) und der vom Enzymhersteller gelieferten Reagenzien sequenziert. (Das Wort SEQUENASE ist ein Warenzeichen.) Ein vektorspezifisches sowie ein Satz virussoquenzspezifische Oligonucleotide wurden als Primer für die Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die vollständige Sequenz des Inserts 17-6 ist in Figur 2 zu erkennen.
Derivatisierung der Aminosäuresequenz von Protein NS1
Bei der Translation der Nucleotidsequenz von 17-6 in alle möglichen Leseraster wurde nur ein langes offenes Leseraster deutlich. Die in diesem Raster abgeleitete Aminosäuresequenz war mit maximaler Übereinstimmung zu den Sequenzen anderer Flaviviren angeordnet (Rice et al., Science 299; 726-733 [1985]; Coia et al., J. gen. Virol. 69,1-21 [1988]; Chambers et al., Virology 169,100-109 [1989]). Für diese Analysen wurde die Beckman MICROGENIE Software (Version 4.0) auf einem IBM-Personalcomputer genutzt. Das Wort MICROGENIE ist ein Warenzeichen. Die Analysen machten deutlich, daß Klon 17-6 die gesamte Kodierungssequenz für Protein NS1 und Teile der Kodierungssequenzen der Proteine E und NS 2 A enthielt, die das NS1-Gen im Flavirusgenom flankieren.
Figur 3 zeigt die RNA-Sequenz sowie die von Klon 17-6 abgeleitete und kodierte Aminosäuresequenz. Die Aminoendgruppe von NS1 soll durch Zellsignalase freigesetzt werden, die Carboxyendgruppe durch ein signalaseähnliches Enzym. Eine größere Form des NS1-Proteins, das auch auch die Aminoendgruppe von Protein NS 2A enthält, wurde von Mason et al. (Virology 158,361-372 [1987]) beobachtet. Die Carboxyendgruppe dieser Form des NS1 -Proteins läßt sich durch eine virusspezifische Protease oder Zellsignalase freisetzen (Rice et al., Science 229,726-733 [1985]). Die Aminoendgruppe und drei mögliche Carboxyendgruppen sind in Figur 3 zu erkennen. Die durch ein signalaseartiges Enzym freigesetzte Carboxyendgruppe (Chambers et al., Virology 169 100-109 [1988]) wird als „COOH-Endgruppe 1" beschrieben. Die womöglich durch eine virusspezifische Protease gebildete Carboxyendgruppe wird als „COOH-Endgruppe 2" angegeben, und die potentielle, durch die Zellsignalase freigesetzte Carboxyendgruppe wird als „COOH-Endgruppe 3" gezeigt. Die in Figur 3 verwendeten Positionszahlen beziehen sich auf die volle Länge des Zeckenenzephalitisvirusgenoms.
Figur 4 verdeutlicht die Aminosäuresequenz von Protein NS1, wie sie von der Sequenzinformation des Klons 17-6 abgeleitet wurde. Die möglichen COOH-Endgruppen sind Figur 3 zu entnehmen. Die Pos'tionszahlen beginnen an der ersten Aminosäure von Protein N^ 1. Figur 4 veranschaulicht ebenfalls die Stellungen der drei potentiellen N-Glycolisierungsorte im Zeckenenzephalitisprotein NS1.
Klonierung des NS1-Kodierungsberelchs In einen prokaryotlschen Expresslonsvoktor Die Nucleotidsequenzkodierung für NS1 wird von Klon 17-6 in pUC19Ssubkloniert. Der Vektor pUC19S ist ein Derivat von pUC 19 mit einem Stopplinker und in allen drei Leserastern mit einem Stoppcodon, das in die BAMHI-Stelle kloniert ist. Die NS1 -Sequenz, die an ihrem 3'-Ende einen geringen Teil NS 2 a besitzt, wird mit Restriktionsendonuclease Cfo I exzisiert, und stumpfe Enden werden mit S1 -Nuclease erzeugt. Der Klonierungsvektor pUC 19S wird mit Sa 11 in seinem Polylinker linearisiert, und Endstellen werden mit T4-DNA-Polymerase (Figur 5) eingeführt. Durch die Ligation von Vektor und Insert werden die Sa 11-Steller, regeneriert, und NS1 wird im Raster zum lacZ-Gen verschmolzen (Figuren 6a und 6b). An der 3'-Endstelle wird die NS1 -Nucleotidsequenz durch die prokaryotischen Transkriptions- und Translationsstoppsignale im Vektor flankiert. Das Plasmid wird als pNS1387 bezeichnet.
Klonierung des NS 1-Kodierungsbereichs, einschließlich der angenäherten hydrophoben 5'-Slgnalsequenz mittels Polymerasekattenreaktion
Für den Aufbau eines induzierbaren prokaryotischen Expressionsplosmids mit dem NS1-Kodierungsbereich, einschließlich der authentischen Signalsequenz, wird das Sa 11-Fragment von pSCtSNS 1444 (Beispiel 13) auf pUC 19S übertragen, was zu Klon ptSNS 1682 führt. Um das NS1 -Gen in dasselbe Leseraster wie lacZ zu bringen, wird Klon ptSNS 1682 mit Hind III aufgeschlossen, stumpfe Enden werden mit S1 -Nuclease gebildet, erneut verbunden, wodurch Klon ptSNS 1791 mit einer Deletion von 4 Nucleotiden erzeugt wird (Figuren 7a und 7 b).
Aubau eines Plasmids für die Rekombination des NS1 -Proteins in das Vakzlna-Virus unter Kontrolle des VV-p 11-(L)-Promotors Der NS1 -Kodierungsbereich (z. B. in Beispiel 10) wird in die Sa 1-Stelle von Plasmid pTKgptF 1 s subkloniert (Falkner, G. F., und B. Moss, J. Virol. 62,1849-1854 [1988)). Die NS 1-Sequenz wird mit dem ATG-Translationsstartcodon des Vektors in das Raster gebracht. Translationsstoppsignale werden ebenfalls vom Vektor geliefert. Der Polylinkerbereich liefert am 5'-Ende 7 zusätzliche Aminosäuren. In den Figuren 8A und 8B sind die Klonierungsslrategia sowie die Flankinrungssequenzen des Proteins abgebildet. Das Plasmid wird als pAPNS 1338 bezeichnet.
Aufbau eines Plasmids für die Rekombination des NS 1-Protolns mit seiner natürlichen Signalsequenz in das Vakzlna-Virus unter Kontrolle des VV-p7.5-(E/L)-Promotors
Eine Nuclootidsequenz, bestehend aus dem NSI-Kodierungsbereich und der Signalsequenz, wird durch eine Polymeräsekettenreaktion unter Einsatz von Klon 17-6 als Matrize synthetisiert. Zwei Oligonucleotide mit den Restriktionsendonucleasespaltstellen EcoRI und Sa 11 am 5'-Ende sowie Sa 11 und Hpal am 3'-Ende werden chemisch synthetisiert und in PCR als Primer verwendet (Figuren 9a und 9b). Das verstärkte NS 1-Fragment wird aus dem Agarosegel rein dargestellt (Figur 10), mit Sa 11 gespalten und nach geringfügigen Modifikationen in die Sa 11-Stelle von Vektor pSC 11-Orth klonicrt. Das Plasmid pSC 11-Orth wurde am 15. Januar 1990 als DSM 5734 im D. S. M. Braunschweig, Westdeutschland, hinterlegt. Die Figuren 11 und 12 zeigen die Klonierungsstrategie sowie die Sequenzen der 5'- und 3'-Endstellen des neuen Aufbaus. In Figur 13 ist ein Agarosegel eines Restriktionsaufschlusses vom Klon gebildet, wodurch die korrekte Orientierung des Inserts bestätigt wird. Das Plasmid wird als pSCtSNS 1444 bezeichnet.
unter Kontrolle des VV-p11-(L)-Promotors
pSC 11 -Orth-abgeleitete Rekombinante varecNS 1444 wird mit BuDR für 143tK-Zellan gewählt. Die pTKgptFs-abgeleitete
reindargestellt. Die korrekte Organisation der Rekombinanten wird mittels Southern-Blot-Analyse analysiert (Figur 16).
nachweiseen, die einer erwarteten relativen Molekülmasse von etwa 48kD entspricht. In Zellen mit dem Wildtyp des Virus odermit den Nicht-NS 1-Rekombinanten wie varec 1342 ist sie nicht vorhanden (Figur 17).
Figur 1
a = Größenmarker(\-DNA, Hlndlll-aufgeschlossen)
b = BS17-6 nicht aufgeschlossen
c = BS17-6, mit BamHI aufgeschlossen:
obere Bande: BS SK-
untere Bande: 17-6 Insert
Figurß
promoter polylinker Promotor-Poly linker
polylinker · Polylinker
Figur7bl)
promotor polylinker Promotor-Polylinker
signalsequence Signalsequenz
polylinker Polylinker
FiguriO
Hind III marker Hind Ill-Marker
base pairs Basenpaare
NSI fragment NS1-Fragment
Figur13
Hind III marker Hind Ill-Marker
Figur14
alkaline phosphatase alkalische Phosphatase
T4DNAIigase T4-DNA-Ligase
Claims (21)
1. Peptid oder Polypeptid, das zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz des NS 1-Proteins von der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus umfaßt.
2. Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von Figur 4 besitzt.
3. NS 1-Protein der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus.
4. Peptid oder Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die sich von der Aminosäuresequenz einer natürlichen NS 1-Sequenz entweder durch Mutationen und/oder Transpositionen unterscheidet, die sich im normalen Bereich der natürlichen Variationen der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus bewegen.
5. Peptid, Polypeptid oder Protein nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis4fürden Einsatz in der Medizin.
6. Vakzine-Mischung, bestehend aus einem Peptid, Polypeptid oder Protein nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 sowie einer oder mehreren zusätzlichen, aus pharmazeutischer Sicht annehmbaren Komponenten.
7. Diagnostikum, bestehend aus einem Peptid, Polypeptid oder Protein nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4.
8. Nucleinsäurekodierung für ein Peptid, Polypeptid oder Protein nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4.
9. Lebendvakzine mit einer Nucleinsäure nach Anspruch 8.
10. Probe mit Nucleinsäure nach Anspruch 8.
11. Nucleinsäure, die zu Nucleinsäure nach Anspruch 8 hybridisiert.
12. Nucleinsäure nach Anspruch 11, die zur DNA-Sequenz von Figur 3 hybridisiert.
13. Nucleinsäure, deren Sequenz sich von der eines DNA-Moleküls, das einer natürlichen NS1-RNA-Sequenz entspricht oder zu ihr komplementär ist, entweder durch Degeneration des genetischen Kodes und/oder Mutationen und/oder Transpositionen unterscheidet, die sich im normalen Bereich der natürlichen Variation der westlichen Unterart des Zeckenenzephalitisvirus bewegen.
14. Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 13 in Kombination mit zusätzlichen Nucleinsäuresequenzen.
15. Nucleinsäure nach Anspruch 14, die DNA ist und in der zusätzliche Sequenzen Replikation und Expression des DNA-Moleküls in einer Zellkultur gestatten, und die vorzugsweise Sequenzen umfaßt, die als Promotor, Verstärker, Polyadenylationssignal und/oder Spleißsignal wirken.
16. Vektor, wie zum Beispiel Plasmid, Virus oder Phage, einschließlich Nucleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 15.
17. Vektor nach Anspruch 16, der vom Vakzina-Virus abgeleitet wird.
18. Vektor nach Anspruch 16, der von einem Bakterienplasmid abgeleitet wird.
19. Wirtszelle mit einem Vektor nach Anspruch 16,17 oder 18.
20. Wirtszellkultur nach Anspruch 19.
21. Kultur nach Anspruch 20, die eine Säugerzellkultur ist.
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