DE3752389T2

DE3752389T2 - Attenuierte Herpesviren, Herpesviren die eine Aminosäuresequenz kodierende fremde DNA enthalten, und diese enthaltende Impfstoffe

Info

Publication number: DE3752389T2
Application number: DE3752389T
Authority: DE
Inventors: Mark D. Carlsbad Cochran; Meng-Fu San Diego Shih; William P. Cardiff MacConnel; Richard D. Encinitas Macdonald
Original assignee: Schering Plough Ltd
Current assignee: MSD International Holdings GmbH
Priority date: 1986-01-27
Filing date: 1987-01-23
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2007-01-24
Also published as: ATE164885T1; ATE342996T1; CA1339468C; DE122007000004I1; LU91303I2; EP0794257B1; DE3752389D1; EP0794257A1; DE3752182T2; DE3752182D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Anmeldung wird durch in Klammern gesetzte arabische Ziffern auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Die vollständigen Literaturzitate finden sich am Ende der Beschreibung direkt vor den Ansprüchen. Der Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichungen wird vollständig in die vorliegende Anmeldung aufgenommen, um den diese Anmeldung betreffenden Stand der Technik umfassender zu beschreiben.
Die Einführung der rekombinante-DNA-Techniken hat es möglich gemacht, die natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen in einem Organismus (das Genom) zu manipulieren, um auf irgendeiner Weise die Funktionen des Organismus durch Gentechnik zu verändern. Die vorliegende Erfindung betrifft Organismen definiert als Viren, die Tiere infizieren und DNA als ihr Erbmaterial enthalten; insbesondere Viren aus der Herpesvirus-Gruppe (Herpesviren) (23). Diese Gruppe von Viren umfaßt eine Reihe von. pathogenen Agentien, die eine Reihe von Zielarten infizieren und eine Krankheit hervorrufen: Schweine, Rinder, Hühner, Pferde, Hunde, Katzen, usw. Jedes Herpesvirus ist spezifisch für seine Wirtsspezies, aber sie sind alle verwandt in bezug auf die Struktur ihrer Genome, in bezug auf ihre Art der Replikation und in gewisser Weise auch in bezug auf die Pathologie, die sie im Wirtstier verursachen und den Mechanismus der Immunantwort des Wirts auf die Virus-Infektion.
Die Arten von gentechnischer Manipulation, die bei diesen Herpesviren vorgenommen wurden, bestehen aus der Klonierung von Teilen der Virus-DNA in Plasmide in Bakterien, aus der Rekonstruktion der Virus-DNA im klonierten Zustand, so daß die DNA Deletionen bestimmter Sequenzen aufweist und weiter dem Hinzufügen von Fremd-DNA-Sequenzen entweder anstelle der Deletionen oder an Stellen, die räumlich von den Deletionen entfernt sind. Die übliche Methode ist, Insertionen der Fremd-DNA in die Virussequenzen vorzunehmen, obwohl die Fremd-DNA auch am Ende der DNA des Virus angehängt werden könnte. Ein Nutzen der Insertion der Fremdsequenzen wird dann erreicht, wenn die Fremdsequenz ein Fremdprotein kodiert, das während der Infektion mit dem Virus im Tier exprimiert wird. Ein Virus mit diesen Merkmalen wird als ein Vektor bezeichnet, weil es ein lebender Vektor wird, welcher das Fremdprotein in das Tier einbringen und dort exprimieren wird. Im Grunde wird es ein ausgeklügeltes Verabreichungssystem für das Fremdprotein.
Der Stand der Technik für diese Erfindung beruht zunächst auf der Möglichkeit, die DNA in den bakteriellen Plasmiden zu klonieren und zu analysieren. Die für den größten Teil zur Verfügung stehenden Techniken werden in Maniatis et al. (1) im Detail dargestellt. Diese Veröffentlichung stellt die aktuellen allgemeinen Techniken der rekombinanten DNA dar.
Die Anwendung der Gentechnik auf Tier-Viren hat eine relativ kurze Historie seit etwa 1980. Die ersten manipulierten Viren sind die kleinsten gewesen – die Papovaviren. Diese Viren enthalten 3.000–4.000 Basenpaare (base pairs, bp) DNA in ihrem Genom. Ihre geringe Größe macht die Analyse ihrer Genome relativ einfach und tatsächlich sind die meisten, die studiert wurden (SV40, Polyoma, Rinderpapilloma) vollständig sequenziert worden. Weil diese Viruspartikeln klein sind und nicht viel extra DNA verstauen können, und weil ihre DNA dicht mit essentiellen Sequenzen (d.h. mit solchen, die für die Replikation erforderlich sind) bestückt ist, ist es nicht möglich gewesen, diese Viren als lebende Vektoren für Fremdgen-Expression genetisch zu manipulieren. Sie sind in der Gentechnik bislang nur als defekte Replikons für die Expression von Fremdgenen in Tierzellen in Kultur (in etwa analog zu Plasmiden in bakteriellen Systemen) benutzt worden, oder in gemischten Populationen von Virionen, wobei Wildtyp-Virus als Helfer für das Virus, in dem ein essentieller Teil seiner DNA mit einem Fremdgen ersetzt wurde, wirkt. Die Studien in Papovaviren haben das Konzept der lebenden Virusvektoren als Verabreichungssysteme für Wirtstiere nicht nahegelegt oder gelehrt.
Die nächstgrößten DNA-Tierviren sind die Adenoviren. In diesen Viren gibt es eine geringe Menge nicht-essentieller DNA, die durch Fremdsequenzen ersetzt werden kann. Anscheinend sind die einzigen Fremdgene, die in Adenoviren exprimiert wurden, die T-Antigen-Gene der Papovaviren (2, 3, 4, 5) und das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen (28). Es ist in Anbetracht dieses anfänglichen Erfolges möglich, sich die Insertion anderer kleiner Fremdgene in Adenoviren vorzustellen. Die Techniken, die bei Adenoviren benutzt wurden, lehren jedoch nicht, wie die gleichen Ergebnisse mit Herpesviren erzielt werden können. Insbesondere identifizieren diese Ergebnisse nicht die nicht-essentiellen Bereiche in Herpesviren, die für die Insertion von Fremd-DNA geeignet sind, und sie lehren auch nicht, wie die Expression der Fremdgene in Herpesviren zustandegebracht werden kann, z.B. welche Promotorsignale und Terminationssignale benutzt werden müssen.
Eine weitere Gruppe von Tierviren, die genetisch manipuliert wurde, ist die Gruppe der Pockenviren. Ein Mitglied dieser Gruppe, Vaccinia, ist Gegenstand von vielen Untersuchungen zur Fremdgen-Expression gewesen. Pockenviren sind große, DNA enthaltende Viren, die sich im Zytoplasma der infizierten Zellen teilen. Sie weisen eine Struktur auf, die einzigartig unter den Viren ist – sie enthalten kein Capsid, das auf eikosaedrischer oder helicaler Symmetrie basiert.
Bei den theoretischen Überlegungen zu dem Ursprung der Viren sind die Pockenviren die wahrscheinlichsten Kandidaten dafür, von Bakterien-ähnlichen Mikroorganismen durch Funktionsverlust und Degeneration abzustammen. Teilweise bedingt durch diese Einzigartigkeit können die Fortschritte, die bei der genetischen Manipulation der Pockenviren erzielt werden, nicht unmittelbar auf andere Virus-Systeme, einschließlich der Herpesviren, übertragen werden. Rekombinante Konstrukte des Vaccinia-Virus sind in einer Reihe von Laboratorien hergestellt worden, mit Expression folgender insertierter Fremdgene: Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen (6, 7), Hepatitis B-Oberflächenantigen (8, 9, 29), Herpes simplex-Virus-Glykoprotein D-Gen (8, 29), Influenza Haemagglutinin-Gen (10, 11), Malaria-Antigen Gen (12) und Vesikuläre Stomatitis Glykoprotein G-Gen (13). Die allgemeinen Gesamtmerkmale der Arbeiten mit rekombinanter Vaccinia-DNA sind ähnlich zu den Techniken, die bei allen Viren angewandt werden, insbesondere im Hinblick auf die in bezug genommenen Techniken (1). In Einzelheiten jedoch stellen die Vaccinia-Techniken keine Lehre dar, wie Herpesviren genetisch manipuliert werden können. Vaccinia-DNA ist nicht infektiös, daher muß der Einbau der fremden DNA einen Infektions-/Transfektionsschritt umfassen, der für andere Viren nicht geeignet ist, und Vaccinia besitzt einzigartige Stabilitätscharakteristiken, die das Screening einfacher machen. Desweiteren sind die von Promotoren in Vaccinia benutzten Signalsequenzen einzigartig und werden in anderen Viren nicht funktionieren. Die Nützlichkeit von Vaccinia als ein Impfstoff-Vektor ist fraglich, bedingt durch seine nahe Verwandtschaft zu humanen Pocken und seine bekannte Eigenschaft, bei Menschen Krankheit zu erregen. Die Anwendung wirtsspezifischer Herpesviren verspricht eine bessere Lösung für die Vakzinierung von Tieren zu sein.
Herpesviren enthalten 100.000 bis 150.000 Basenpaaren an DNA als ihr genetisches Material und es sind verschiedene Bereiche ihres Genoms identifiziert worden, auf die für die Replikation des Virus in vitro in Zellkulturen verzichtet werden kann. Änderungen in diesen Bereichen der DNA vermindern bekanntlich die Pathogenität des Virus für eine Tierspezies, d.h. attenuieren das Virus für diese Spezies. So macht zum Beispiel die Inaktivierung des Thymidinkinase-Gens das humane Herpes simplex-Virus nicht-pathogen (45) und Schweine-Pseudorabies-Virus nicht-pathogen (46 und 47).
Entfernung eines Teiles des Wiederholungsbereiches (repeat region) nimmt humanem Herpes simplex-Virus seinen krankheitserregenden Charakter (48 und 49). Ein Wiederholungsbereich ist im Marek Krankheits-Virus identifiziert worden, das mit von Viren ausgelöstem Krebs in Verbindung gebracht wird (50). Ein Bereich in Herpesvirus saimiri ist ebenfalls mit Krebsauslösung in Zusammenhang gebracht worden (51). Änderungen in diesen Wiederholungsbereichen lehren jedoch nicht die Konstruktion von attenuierten Pseudorabiesviren mit Deletionen in Wiederholungsbereichen.
Das Ausmaß der Attenuierung eines Virus ist von Bedeutung für die Nützlichkeit des Virus als Vakzine. Deletionen, die eine zu starke Attenuierung des Virus bewirken, werden zu einer Vakzine führen, die nicht in der Lage ist, eine ausreichende Immunantwort hervorzurufen.
Die Herpesviren sind dafür bekannt, eine Vielzahl von latenten und wiederkehrenden Infektionen beim Menschen und bei weiteren Wirbeltieren zu verursachen, und man weiß, daß sie sogar einen Fungus und eine Auster infizieren. Unter den mit Herpesvirus-Infektionen in Verbindung gebrachten Leiden sind Fieberbläschen, verursacht durch Herpes simplex-Typ I, Herpes im Genitalbereich, verursacht durch Herpes simplex-Typ 2, und Windpocken bei Kindern und Gürtelrose bei Erwachsenen, verursacht durch eine Infektion mit Herpes zoster. Pseudorabiesvirus (PRV), ein Klasse D-Herpesvirus, ist Verursacher der Aujesky'schen Krankheit, einer akuten und oftmals fatalen Nervenerkrankung bei Haustieren und wilden Tieren.
Bei den Herpesviren wurden vor dieser Offenbarung lediglich humanes Herpes simplex und in beschränktem Umfang Herpes saimiri aus Affen genetisch manipuliert, um fremde DNA-Sequenzen aufzunehmen. Die früheste Arbeit zur genetischen Manipulation von Herpes simplex-Virus umfaßte das Isolieren von temperatur-sensitiven Mutanten des Virus unter Verwendung gereinigter DNA-Restriktionsfragmente (14). Diese Arbeit umfaßte nicht das Klonieren der DNA-Fragmente in das Virusgenom. Die erste Verwendung rekombinanter DNA zur Manipulation von Herpes simplex-Virus umfaßte das Klonieren eines DNA-Stückes aus dem L-S-Verbindungsabschnitt in den Unique-Long-Bereich (unique long region), insbesondere in das Thymidinkinase-Gen (15). Bei diesem Insert handelte es sich nicht um ein Stück Fremd-DNA, sondern es handelte sich um ein natürlich vorkommendes Herpesvirus-DNA-Stück, das an einer anderen Stelle im Genom dupliziert war. Dieses DNA-Stück wurde nicht genetisch manipuliert um irgendein Protein spezifisch zu exprimieren, und damit lehrte dieses Dokument nicht, wie Protein in Herpesviren exprimiert wird. Die Manipulation von Herpes simplex umfaßte anschließend die Bildung von Deletionen im Virusgenom durch eine Kombination von rekombinanter DNA und Thymidinkinase-Selektion. Der erste Schritt lag in der Herstellung einer spezifischen Deletion des Thymidinkinase-Gens (16). Der nächste Schritt umfaßte die Insertion des Thymidinkinase-Gens in das Genom an einer bestimmten Stelle und dann wurden das Thymidinkinase-Gen und die flankierende DNA an der neuen Stelle durch eine negative Selektion auf Thymidinkinase deletiert (17). Auf dieser Weise ist das Herpes simplex-alpha-22-Gen deletiert worden (17). In der neuesten Verfeinerung dieser Technik wurde eine 15.000 bp DNA-Sequenz aus dem internen Wiederholungsbereich von Herpes simplex-Virus deletiert (18).
Die Insertion von für ein Protein kodierenden Genen in Primaten-Herpesviren hat sieben Fälle umfaßt: die Insertion von Herpes simplex-Glykoprotein C zurück in eine in der Natur vorkommende Deletionsmutante dieses Gens in Herpes simplex-Virus (19); die Insertion von Glykoprotein D von Herpes simplex-Typ-2 in Herpes simplex-Typ 1 (20), wiederum ohne Manipulation von Promotoren, da das Gen nicht wirklich "fremd" ist; die Insertion von Hepatitis B-Oberflächenantigen in Herpes simplex-Virus unter Kontrolle des ICP4-Herpes simplex-Promotors (21) und die Insertion von Rinderwachstumshormon in Herpes saimiri-Virus mit einem SV40-Promotor, der in jenem System tatsächlich nicht wirksam war (ein stromaufwärts gelegener endogener Promotor diente zur Transkription des Gens) (22). In zwei weiteren Fällen wurden Fremdgene (Hühner-Ovalbumingen und das Kern-Antigen von Epstein-Barr-Virus) in Herpes simplex-Virus insertiert (30), und das Glykoprotein X des Pseudorabies-Virus wurde in Herpes simplex-Virus insertiert (31).
Diese wenigen Fälle von Deletion und Insertion von Genen in Herpesviren belegen, daß es möglich ist, Herpesvirus-Genome durch rekombinante DNA-Techniken genetisch zu manipulieren. Die Verfahren, die verwendet wurden, um Gene zu insertieren, umfassen homologe Rekombination zwischen auf Plasmide klonierter Virus-DNA und gereinigter, in die gleiche Tier-Zelle transfizierter Virus-DNA. Dies wird insgesamt als die homologe Rekombinationstechnik bezeichnet. Diese Technik ist mit geringen Modifikationen bei anderen Herpesviren, die wir genetisch manipuliert haben, anpaßbar. Es ist aus diesen früheren Studien jedoch nicht offensichtlich, inwieweit die Position der Deletion und der Stellen für die Insertion der Fremdgene verallgemeinert werden kann. Des weiteren ist es auch nicht offensichtlich, daß nicht-Primaten-Herpesviren mit den gleichen Techniken behandelt werden können wie die Primaten-Herpesviren und daß man eine gezielte Methode für die Deletion, Insertion und Expression von Fremdgenen etablieren könnte.
Infektiöses bovines Rhinotracheitis-(IBR) Virus (infectious bovine rhinotracheitis virus), ein alpha-Herpesvirus mit einem Klasse D-Genom ist ein bedeutender Krankheitserreger bei Rindern. Es wurde mit Erkrankungen der Atemwege, der Augen, der Fortpflanzungsorgane, des Zentralen Nervensystems, des Gedärms, der Neugeborenen und der Haut in Verbindung gebracht (37). Rinder sind der normale Wirt des IBR-Virus, aber es infiziert ebenfalls Ziegen, Schweine, Wasserbüffel, Wildebeest, Nerz und Frettchen. Experimentelle Infektionen wurden bei Mauleseln, Ziegen, Schweinen, Frettchen und Kaninchen hervorgerufen (38).
Herkömmliche Vakzine mit modifiziertem lebenden Virus sind im breiten Rahmen verwendet, um durch IBR hervorgerufene Krankheiten zu beherrschen. Diese Vakzine-Viren können jedoch zur Virulenz zurückkehren. In letzter Zeit sind IBR-Vakzine mit getöteten Viren verwendet worden, aber ihre Wirksamkeit scheint unwesentlich zu sein.
IBR ist auf der molekularen Ebene untersucht worden, wie in einem Reviewartikel (39) beschrieben wurde. Eine Restriktionskarte des Genoms ist in dieser Referenz vorhanden, die bei der genetischen Manipulation des IBR nach den durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Methoden behilflich sein wird. Kein Beweis wurde bislang vorgelegt, daß IBR durch genetische Manipulation eine Deletion oder Insertion einer Fremd-DNA erhielt.
Das Marek-Krankheits-Virus (Marek's disease virus, MDV) verursacht Geflügellähmung, eine häufig vorkommende lymphoproliferative Erkrankung bei Hühnern. Die Krankheit tritt meistens bei jungen Hühnern im Alter zwischen 2 und 5 Monaten auf. Die auffälligen klinischen Anzeichen sind progressive Lähmung einer oder mehrerer Extremitäten, Koordinationsmängel bedingt durch Lähmung der Beine, Herabhängen des Gliedes wegen Befall des Flügels und eine Senkung der Position des Kopfes durch Befall der Nackenmuskulatur. In akuten Fällen kann ernste Depression auftreten. Bei stark krebsauslösenden Stämmen tritt eine charakteristische Atrophie von Bursa und Thymus auf. Zusätzlich treten Tumoren der Lymphdrüsen auf, welche die Gonaden, Lungen, Leber, Milz, Niere und Thymus betreffen können (37).
Sämtliche Hühner werden gegen MDV vakziniert, wenn sie ein Tag alt sind, um dem Huhn einen lebenslänglichen Schutz gegen MDV zu verschaffen. Bei einer Vakzinierungsmethode für MDV spielt die Verwendung von Truthahnherpesvirus (HVT) eine Rolle. Es würde von Vorteil sein, andere Antigene bei dieser Vakzinierung am ersten Lebenstag mit einzubeziehen, aber Anstrengungen, Vakzine zu kombinieren, waren bislang bedingt durch Kompetition und Immunsuppression zwischen den Pathogenen nicht befriedigend. Die multivalenten Vakzine durch genetische Manipulation nach der vorliegenden Erfindung sind ein neuartiger Weg, um gleichzeitig gegen verschiedene unterschiedliche Krankheitserreger zu vakzinieren.
Eine Restriktionskarte ist sowohl von MDV (43) als auch von HVT (34) in der Literatur verfügbar. Es gibt keinen Beweis dafür, daß jemand vor dieser Offenbarung mit Erfolg eine Deletion oder Insertion von Fremd-DNA in MDV oder HVT durchgeführt hat.
Andere Herpesviren die als zugänglich für diese Verfahren in Betracht gezogen werden, sind Katzen-Herpesvirus (feline herpesvirus, FHV), Pferde-Herpesvirus (equine herpesvirus, EHV) und Hunde-Herpesvirus (canine herpesvirus, CHV). Diese Krankheitserreger verursachen Krankheit in jedem ihrer jeweiligen Wirte. Katzen-Herpesvirus verursacht Katzenrhinotracheitis, eine akute Infektion der oberen Luftwege, charakterisiert durch Fieber, ausgeprägtes Niesen, Ausscheidungen aus Nase und Augen und Depression. Das Virus kann Geschwüre der Hornhaut und Fehlgeburten verursachen. Nasengänge und Nasenmuschel zeigen nekrotische Foci und die Tonsillen sind vergrößert und blutig. Pferde-Herpesvirus verursacht Rhinopneumonitis, Fehlgeburten, Exantheme der Genitalien und gelegentlich neurologische Erkrankung. Die akute Krankheit wird durch Fieber, Anorexie und übermäßige, ernsthafte Ausscheidung aus der Nase charakterisiert. Die neurologischen Symptome, wenn vorhanden, bestehen aus Ataxie, Körperschwäche und Lähmung. Hunde-Herpesvirus verursacht ernsthafte Krankheit bei Jungtieren, wobei die Todesrate 80% betragen kann. Die Krankheit wird durch Viraemie, Anorexie, Krankheit der Atemwege, Bauchschmerzen, Erbrechen und dauerhaftes Jaulen charakterisiert. Im allgemeinen liegt kein Fieber vor. Die Hauptläsionen sind vereinzelte Nekrosen und Blutungen in Nieren, Leber und Lungen.
Die Molekularbiologie der Katzen-, Pferde- und Hunde-Herpesviren steckt noch in der Anfangsphase. Partielle Restriktionskarten sind für Pferde-Herpesvirus verfügbar und für Katzen-Herpesvirus in mindestens einem Laboratorium in Bearbeitung. Über diese Art von Genomanalyse hinaus ist ein Beweis für die Deletion oder Insertion von Fremdgenen in diese Viren nicht verfügbar.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung von genetisch manipuliertem Herpesvirus, um Tiere gegen Krankheit zu schützen. Es ist nicht naheliegend, welche Deletionen in Herpesviren eine Attenuierung des Virus in geeignetem Ausmaß hervorrufen würden. Sogar die Überprüfung der in Betracht kommenden Vakzine in Tiermodellen, z.B. bei Mäusen, funktioniert nicht als zuverlässiges Modell, um die Sicherheit und Wirksamkeit der Vakzine in der anvisierten Tierspezies, wie z.B. dem Schwein, vorauszusagen.
Auch hierin offenbart ist eine Vakzine für Pseudorabies-Virus (Herpesvirus suis, Suid Herpesvirus 1 oder Aujesky'scher Krankheits-Virus)-Krankheit bei Schweinen. Schweine sind der natürliche Wirt von Pseudorabies-Virus, wobei sich die Infektion bei älteren Tieren gewöhnlich nicht zeigt, insbesondere bei jüngeren Tieren jedoch durch Fieber, Konvulsionen und Mortalität charakterisiert wird. Pseudorabies infiziert auch Rinder, Schafe, Hunde, Katzen, Frettchen, Füchse und Ratten (37) wobei die Infektion meistens tödlich endet. Dem Tod geht meistens massiver Pruritus, Manie, Encephalitis, Lähmung und Koma voraus. Herkömmliche lebende Vakzine sind zur Anwendung in Schweinen verfügbar, aber diese sind tödlich für die anderen Tiere. Eine verbesserte Vakzine für Pseudorabies würde eine zuverlässigere Immunantwort in Schweinen hervorrufen, würde spezifisch attenuiert sein, damit ein Rückverwandeln zur Virulenz nicht mehr möglich ist, und würde bei anderen Wirten keine Krankheit hervorrufen.
Pseudorabies-Virus, ein Schweine-alpha-Herpesvirus, besitzt ein Genom der Klasse D (23); das heißt es enthält zwei Kopien eines einzelnen Wiederholungsbereichs, eine gelegen zwischen dem Unique-Long- und dem Unique-Short-DNA-Bereich und eine bei dem Terminus des Unique-Short-Bereichs (siehe 1). Herpes simplex-Virus ist ein alpha-Herpesvirus mit einem Klasse E-Genom (23); d.h. es enthält zwei Kopien von jedem der zwei Wiederholungsbereiche. Herpes saimiri ist ein gamma-Herpes-Virus mit einem Klasse B-Genom; d.h. es enthält zahlreiche Wiederholungen der gleichen Sequenz bei beiden Termini (23). Da die Genomstruktur sich signifikant zwischen diesen unterschiedlichen Klassen von Herpesviren unterscheidet, und da die unterschiedlichen Viren unterschiedliche Zellen in ihren Wirten angreifen und unterschiedliche Krankheitszustände hervorrufen, ist es in jedem Fall erforderlich festzustellen, welche spezifische Bereiche entfernt werden können, um zu attenuieren und welche Bereiche geändert werden können, um Fremdgene zu exprimieren.
Unter Anwendung der Hilfsmittel der molekularen Biologie einschließlich der Benutzung der rekombinante-DNA-Techniken hat man das Pseudorabies-Virus studiert. BamHI-, KpnI- und BgIII-Restriktionskarten des Virusgenoms sind veröffentlicht worden (24, 27). DNA-Transfektions-Prozeduren wurden angewandt, um Temperatur-empfindliche und Deletions-Mutanten des Virus mittels der homologen Rekombinations-Verfahren zu isolieren (24). Es gibt zwei Beispiele von Deletionen, die im Pseudorabies-Virus-Genom vorgenommen wurden – eine ist eine Thymidinkinase-Gen-Deletion (25), auch im Patent No. 4,514,497 mit der Bezeichnung "Modified Live Pseudorabies Viruses" offenbart. Dieses Patent lehrt lediglich Thymidinkinase-Deletionen und legt weder weitere attenuierende Deletionen nahe, noch schlägt es Insertion von Fremd-DNA-Sequenzen vor. Die andere Referenz betrifft die Deletion einer kleinen DNA-Sequenz um eine HindIII-Restriktionsstelle in dem Wiederholungsbereich (26) worauf die Europäische Patentschrift No. 0 141 458 basiert, veröffentlicht am 15. Mai 1985, entsprechend der Europäischen Patentanmeldung No. 84201474.8, angemeldet am 12. Oktober 1984. Diese Patentanmeldung lehrt weder attenuierende Deletionen oder schlägt diese vor noch lehrt sie die Insertion von DNA-Sequenzen in Pseudorabiesvirus oder schlägt diese vor.
Auch hierin offenbart sind Deletionen, die im Pseudorabiesvirus-Genom an bislang nicht offenbarten Stellen vorgenommen wurden, Fremd-DNA-Sequenzen, die auch in das attenuierte Pseudorabiesvirus-Genom eingeführt und als Proteine exprimiert wurden, und eine Vakzine, die dazu beiträgt, Pseudorabies und andere Krankheiten des Schweins mit einem einzelnen Inokulum vorzubeugen.
Weitere in dieser Beschreibung offenbarte relevante Pseudorabies-Literatur betrifft die Anwesenheit von in der Natur vorkommenden Deletionen im Genom von zwei Impfstämmen der Pseudorabies-Viren (27). Diese Deletionen sind zumindestens zum Teil verantwortlich für den attenuierten Charakter dieser Vakzine, aber sie treten nicht in eher wiederholten Sequenz auf und legen nicht nahe, das Pseudorabies-Virus durch eine Deletion eines Teils einer Wiederholungssequenz zu attenuieren. Solche in der Natur vorkommenden Deletionen stellen keine Offenbarung von Methoden dar, um ausgehend von Wildtyp-Pseudorabies-Virus-DNA diese Deletionen vorzunehmen und legen auch keine weitere Stellen nahe, wo solche attenuierende Deletionen vorzunehmen sind. Es liegen keine Beispiele von in der Natur vorkommenden Insertionen von Fremd-DNA in Herpesviren vor.
Der natürliche Wirt des Pseudorabies-Virus ist das Schwein, bei dem die Infektion im allgemeinen nicht zu Tage tritt, aber durch Fieber, Konvulsionen und Lähmung gekennzeichnet sein kann. Pseudorabies-Virus infiziert ebenfalls Rinder, Schafe, Hunde, Katzen, Füchse und Nerze, wo die Infektion normalerweise zu dem Tod des Wirtes fuhrt. Das überwiegende sichtbare Merkmal der Pseudorabies-Virus-Infektion ist der massive Pruritus, was im allgemeinen beim Wirt zu einer Verstümmelung des betroffenen Gebiets führt. Heftige Erregung, Anfalle und Lähmung, insgesamt Symptome einer Encephalomyelitis, gehen dem Tod voraus, wobei dieser meistens wenige Tage nach Beginn der klinischen Symptome eintritt.
Pseudorabies-Virus-Krankheit in Schweinen stellt weltweit ein ernsthaftes Problem für Regierungsorgane dar. In den Vereinigten Staaten dürfen Schweine aus infizierten Herden nur an Schlachthäuser verkauft werden. Mehrere Einzelstaaten haben getrennt durchgeführte Ausrottungsmaßnahmen gegen Pseudorabies erlassen. Zur Zeit wird jedes Tier, das gegen Pseudorabies-Virus-Krankheit geimpft wird, behandelt, als sei es mit Pseudorabies-Virus infiziert und es wird den gleichen regulatorischen Beschränkungen unterworfen. Dies liegt im wesentlichen an dem Fehlen eines diagnostischen Testverfahrens, um geimpfte von infizierten Tieren zu unterscheiden.
Der Trend in der Forschung und Entwicklung bei den traditionellen Vakzine-Herstellern hat im allgemeinen Forschung betont, die zu Vakzinen führt, welche auf Virus-Untereinheiten im statt auf lebenden Viren basiert. Dieser Abkehr von lebenden Virus-Vakzinen liegt teilweise an dem Aspekt der anerkannten Sicherheit der Untereinheits-Vakzine und der Unwahrscheinlichkeit, daß diese infektiöse lebende Viren enthält. Ein weiterer Grund, eine Untereinheits-Vakzine zu entwickeln, war die Möglichkeit, einen Diagnosetest zu entwickeln, der die Vakzine begleiten und vakzinierte von infizierten Tieren unterscheiden würde, was einen Ausweg aus der nach Anwendung anderer Vakzine auferlegten regulatorischen Belastung darstellen würde.
Vakzine gegen Untereinheiten haben auch Grenzen. Sie enthalten im Vergleich mit Vakzinen, die mit lebenden Viren hergestellt wurden, eine begrenzte Zahl von Virus-Antigenen. Diese geringe Zahl der Antigene bewirkt im geimpften Tier eine schwache Immunantwort von kurzer Dauer zu wesentlich höheren Kosten als bei einer Vakzinierung mit lebenden Viren. Das beschränkte Spektrum der Antigene in der Untereinheits-Vakzine es jedoch möglich, vakzinierte Schweine von mit dem Wildtyp-Virus infizierten Schweinen zu unterscheiden. Die Möglichkeit, vakzinierte von infizierten Schweinen zu unterscheiden, stellt eine entscheidende Eigenschaft einer Pseudorabiesvakzine dar, da keiner der bekannten Impfstoffe die infizierten Tiere davor schützt, mit Wildtyp-Virus superinfiziert zu werden. Obwohl die infizierten Tiere nach Superinfektion nicht krank werden, liegen starke Anhaltspunkte vor, daß sie Träger des Wildtyp-Virus werden und dieses Wildtyp-Virus auf andere Schweine übertragen können.
In jedem Ausrottungsprogramm mit dem Ziel, das Pseudorabies-Virus auszurotten, wäre eine Vakzine mit Merkmalen, die es ermöglichen würden, vakzinierte Tiere von mit Wildtyp-Virus infizierten Tieren zu unterscheiden, von Vorteil. Die Untereinheits-Vakzine sind teuer und zeigen eine geringe Wirksamkeit, aber ein mit diesem Vakzinetyp vakziniertes Tier wird lediglich Antikörper gegen das beschränkte Spektrum der in der Vakzine vorhandenen Antigene produzieren. Es ist durch Serumabnahme bei dem Schwein möglich, zu zeigen, daß das geimpfte Tier lediglich Antikörper gegen die in der Vakzine enthaltenen Antigene besitzt, während ein mit dem Wildtyp-Virus infiziertes Tier Antikörper gegen einen weit größeres Spektrum von Antigenen haben würde. Eine Untereinheits-Vakzine, die auf diese Art benutzt wurde, um geimpfte von mit Pseudorabies infizierten Tieren zu unterscheiden, ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 8540074.4, am 4. September 1985 eingereicht, am 27. November 1985 als Europäische Offenlegungsschrift Nr. 0 162 738 mit der Bezeichnung "Production of Pseudorabies Virus Subunit Vakzines" offengelegt, offenbart. Diese offengelegte Patentanmeldung stellt keine Lehre dar, um einen vergleichbaren diagnostischen Test in Verbindung mit einer Vakzine mit lebendem Virus zu konstruieren oder anzuwenden und legt dies auch nicht nahe. Eine Impfung von einem Tier mit einem lebenden Virus, die zu einer von der Wildtyp-Infektion unterscheidbaren Immunantwort führen würde, hätte als weitere Vorteile die geringen Kosten und die hohe Wirksamkeit, die Lebendvirus-Vakzine kennzeichnen.
Deletionen in Genen, die für die Virusantigene kodieren, wurden bereits früher beschrieben. Bekannt sind eine spontane Deletion in dem Glykoprotein C-Gen des Herpes simplex-Virus (52), eine spontane Deletion in dem Glykoprotein A-Gen des Marekschen Krankheits-Virus (53), eine spontane Deletion in dem Glykoprotein A-Gen (auch Glykoprotein gI genannt) bei PRV (27, 55) und die Abwesenheit oder stark verminderte Menge des Glykoproteins gIII in einigen PRV-Mutanten (54). All diese Deletionen entstanden jedoch spontan in einem unkontrollierten Prozeß. Es ist deswegen nicht möglich gewesen, Deletionen auf Teile in der DANN, die für bestimmte Antigene kodieren, zu richten, um den Deletionsprozeß zu lenken und die Deletionen auf solche Antigene zu richten, die als diagnostische Marker besonders geeignet sind.
Die Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Antigene in irgendeiner infektiöser Krankheit kann als diagnostischer Test für den Auslöser der infektiösen Krankheit benutzt werden. Diese Anwesenheit oder Abwesenheit bildet die Grundlage für sämtliche immunologischen diagnostischen Teste, die sich lediglich in bezug auf die Details ihres spezifischen immunologischen Ansatzes unterscheiden. Veröffentlichungen, die einschlägig sind für die vorliegende Erfindung, umfassen Wathan und Wathan (54), die berichtet haben, daß entweder das gI-Gen oder das gIII-Gen in PRV deletiert werden konnte und den Vorschlag gemacht haben, das enthaltene Virus könne benutzt werden, um geimpfte von infizierten Schweinen zu unterscheiden. Sie beschrieben jedoch nicht die Methodologie die für die Erzeugung der Vakzine erforderlich ist, sie demonstrierten nicht die Nützlichkeit solcher Vakzine in serologischen Tests und sie bewiesen auch in keinster Weise die Machbarkeit einer solchen Vakzine.
Van Oirschot et al. (56) haben ein bestimmtes immunologisches Meßsystem auf monoklonaler Grundlage für PRV-gI verwendet, und sie haben gezeigt, daß es möglich ist, Schweine, die mit in der Natur vorkommenden Vakzine-Stämmen inokuliert sind, bei denen wenigstens ein Teil des gI-Gens fehlt, von Schweinen zu unterscheiden, die mit Wildtyp-PRV infiziert sind. Dieser diagnostische Test kann jedoch für jede der verschiedenen Vakzine gegen PRV verwendet werden, die in sowohl Europa als den Vereinigten Staaten benutzt werden, ohne zu differenzieren, welche Vakzine benutzt wurde. Dies schränkt die Nützlichkeit dieses Diagnostikums ein, da die detektierbaren Vakzine unterschiedliche Eigenschaften in bezug auf Biologie und Virulenz besitzen.
Der Ansatz, zum Attenuieren eines Virus ein Gen zu deletieren, in Verbindung mit einem Diagnostikum für dieses Gen, stellt eine Vakzine zur Verfügung, die von jeder der zur Zeit gebrauchten Vakzinen und von Wildtyp-PRV unterschieden werden kann. Es ist von Bedeutung, in der Lage zu sein, eine neue, sicherere Vakzine von den zur Zeit gebrauchten zu unterscheiden, weil Schweine, welche die heutigen Vakzine erhalten, im Rahmen von Ausrottungsprogrammen den gleichen Regelungen unterliegen wie Schweine, die mit Wildtyp-PRV infiziert sind.
Antigene der Wahl als diagnostischer Marker sollten die folgenden Merkmale aufweisen: 1) die Antigene und ihre Gene sollten für die Produktion des infektiösen Virus in Gewebekultur nicht essentiell sein; und 2) das Antigen sollte eine größere serologische Antwort im Tier hervorrufen, aber bevorzugt kein wichtiges neutralisierendes Antigen darstellen.
Auch hierin offenbart ist somit die Fähigkeit, Schweine-Pseudorabies-Virus zu attenuieren, um ein lebendes Virusvakzin zu erzeugen, und die Fähigkeit zu unterscheiden, ob ein Tier dieses Vakzin erhalten hat oder mit Wildtyp-Pseudorabies-Virus infiziert worden ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein hybrides nicht-Primaten Herpesvirus, welches DNA umfasst, einschließlich einer für die virale Replikation des hybriden nicht-Primaten Herpesvirus essentiellen Sequenz, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die für die Replikation eines in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus essentiell ist, und mindestens einer fremden DNA-Sequenz.
Sie bezieht sich auch auf ein attenuiertes nicht-Primaten Herpesvirus, welches DNA umfasst, einschließlich einer für die virale Replikation des attenuierten nicht-Primaten Herpesvirus essentiellen Sequenz, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die für die Replikation eines in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus essentiell ist, von der mindestens ein Teil einer Wiederholungssequenz deletiert wurde.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein attenuiertes hybrides nicht-Primaten Herpesvirus. Das Virus umfaßt DNA, einschließlich einer für die virale Replikation des attenuierten, hybriden nicht-Primaten Herpesvirus essentiellen Sequenz, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die für die Replikation eines in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus essentiell ist, und mindestens einer fremden DNA-Sequenz.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein rekombinantes Truthahn Herpesvirus zur Verfügung, welches eine fremde DNA eingefügt in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms des Truthahn Herpesvirus umfaßt, die in der Lage ist, in einer mit dem Truthahn Herpesvirus infizierten Zelle exprimiert zu werden.
Bevorzugt ist die fremde DNA in die BamHI 16 Region des viralen Genoms des Truthahn Herpesvirus eingefügt.
Bevorzugt ist die fremde DNA in die XhoI Schnittstelle der BamHI 16 Region des viralen Genoms des Truthahn Herpesvirus eingefügt.
Die fremde DNA kann für ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann antigen sein. Das Polypeptid kann E. coli beta-Galaktosidase sein.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Vakzin bereit, das eine effektive immunisierende Menge eines rekombinanten Truthahn Herpesvirus aus dem ersten Aspekt und einen geeigneten Träger umfasst.
Auch offenbart sind attenuierte Pseudorabiesviren, die DNA umfassen, einschließlich einer für die Replikation des attenuierten Virus essentiellen Sequenz, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die für die Replikation eines in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus essentiell ist, und mindestens einer für die Expression in einem Wirt angepaßten fremden DNA-Sequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die in dem Wirt antigen wirkt.
Vakzine, die eine effektive immunisierende Menge eines hierin offenbarten Virus und einen geeigneten Träger umfassen, sind nützlich zur Immunisierung von Tieren gegen Pseudorabiesvirus-Erkrankung. Multivalente Vakzine, die auch eine immunisierende Menge eines hierin offenbarten Virus und einen geeigneten Träger umfassen, sind nützlich zur Immunisierung von Tieren gegen Pseudorabiesvirus-Erkrankung und mindestens ein weiteres Pathogen.
Hierin auch offenbart sind Verfahren zur Herstellung attenuierter Pseudorabiesviren, die mindestens eine fremde DNA-Sequenz einschließen, und Verfahren zur Immunisierung von Tieren mit diese Viren umfassenden Vakzinen.
Hierin auch offenbart ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für Schweine Rotavirus-Glykoprotein kodiert und ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für Schweine Parvovirus B Capsid-Protein kodiert.
Auch offenbart sind attenuierte Pseudorabiesviren, die DNA umfassen, die eine für die Replikation des attenuierten Pseudorabiesvirus essentielle Sequenz einschließt, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die für die Replikation eines in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus essentiell ist. Diese DNA kodiert in einem mit dem attenuierten Pseudorabiesvirus infizieren Tier für mRNAs, die in antigene Pseudorabiesvirus-Genprodukte translatiert werden, welche in dem infizieren Tier eine Immunantwort hervorrufen, die unterscheidbar von der Immunantwort ist, die in einem von einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus infizierten Tier hervorgerufen wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 Details des Wildtvp Iowa S-62 A Stammes

A. Diagramm der DNA im PRV-Genom mit Darstellung des Unique-Long-Bereichs (UL), des Unique-Short-Bereichs (US), des internen Wiederholungsbereichs (IR) und des terminalen Wiederholungsbereichs (TR).
B. BamHI Restriktionsenzymkarte von PRV. Fragmente sind nach abnehmender Größe numeriert.

2 Details der S-PRV-004-Konstruktion und Daten der Karte

A. Detaillierte Karte von BamHI #8' und #8. Die Position des internen Wiederholungsbereichs (IR) ist gezeigt.
B. Detaillierte Karte des BamHI #8'-TK-8-Fragments, das zum Schluß im Rekombinantvirus vorhanden war.
C. Diagramm des S-PRV-004 DNA-Genoms mit Darstellung der Position des HSV-1-TK-Gens, eingefügt in den Verbindungsbereich zwischen den UL- und IR-Bereichen.

3 Details der S-PRV-005-Konstruktion und Daten der Karte.

A. Detaillierte Spaltungskarte von BamHI #5. Das HSV-1 TK-Gen fusioniert mit dem HSV-1 ICP4-Promotor ist auf einem PvuII-Fragment dargestellt.
B. Detaillierte Karte von BamHI #5 nach Insertion des TK-Gen-Konstrukts.
C. Diagramm des S-PRV-005-DNA-Genoms mit Darstellung der Position des TK-Gens, eingefügt in beiden Kopien von BamHI #5 im Wiederholungsbereich des Genoms und die Erzeugung neuer Deletionen.

4 Konstruktion des in S-PRV-010 verwendeten Fremd-DNA-Inserts.

A. Diagramm des relevanten Abschnitts von pJF751, enthaltend das lacZ (beta-Galactosidase)-Gen. Die Position des TAA-Terminierungscodons für das Polypeptid ist angegeben.
B. Diagramm der Promotor-Sequenz aus dem HSV-1-TK-Gen.
C. Diagramm des RsaI-Fragments des TK-Gens, jetzt mit BamHI-modifizierten Enden.
D. Diagramm des entstandenen Plasmids, enthaltend das lacZ-Gen fusioniert mit dem HSV-1 TK-Promotor.

5 Details der S-PRV-010-Konstruktion und Daten der Karte.

A. Detaillierte Karte von BamHI #5. Das lacZ-Gen (beta-Galactosidase) fusioniert mit dem HSV-1 TK-Promotor ist auf einem XbaI-Fragment dargestellt (siehe 4). Die Position der Deletion in S-PRV-002 ist dargestellt.
B. Detaillierte Karte von BamHI #5 nach der Insertion des lacZ-Genkonstrukts.
C. Diagramm der DNA des S-PRV-010-Genoms mit Darstellung der Position des lacZ-Gens in beiden Kopien von BamHI #5 in dem Wiederholungsbereich des Genoms.

6 Details der S-PRV-007 Konstruktion und Daten der Karte.

A. Detaillierte Karte von BamHI #5 aus S-PRV-005.
B. Detaillierte Karte von BamHI #5 nach der Substitution des TK-Gens gegen das Schweinerotavirus gp38-Gen.
C. Diagramm des S-PRV-007 DNA-Genoms mit Darstellung des gp38-Gens, eingefügt in beide Kopien von BamHI #5 in den Wiederholungs bereichen des Genoms.

7 Konstruktion des in S-PRV-007 verwendeten Fremd-DNA-Inserts
8 Details der S-PRV-012-Konstruktion und Daten der Karte.

A. Detaillierte Karte von PRV, sich erstreckend von BamHI #10 bis BamHI #7.
B. Detaillierte Karte von PRV, sich erstreckend von BamHI #10 bis BamHI #7 nach der Insertion des TK-Gens in das rekombinante Virus;
C. Diagramm des S-PRV-012-DNA-Genoms mit Darstellung der Position des TK-Gens, eingefügt in den gpX-Bereich und der Erzeugung einer Deletion, die den größten Teil des kodierenden Bereiches des gpX-Gens entfernt und das Virus unfähig macht, das gpX-Polypeptid zu synthetisieren.

9 Details der S-PRV-013-. S-PRV-014- und S-PRV-016-Konstruktion und Daten der Karte.

A. Detaillierte Karte von PRV, sich erstreckend von BamHI #10 bis BamHI #7.
B. Detaillierte Karte von PRV, sich erstreckend von BamHI #10 bis BamHI #7 nach der Insertion des lacZ-Gens in das rekombinante Virus.
C. Diagramm des S-PRV-013-DNA-Genoms mit Darstellung der Position des lacZ-Gens, eingefügt in den gpX-Bereich und der Erzeugung einer Deletion, die den größten Teil des kodierenden Bereichs des gpX-Gens entfernte und das Virus unfähig machte, das Polypeptid gpX zu synthetisieren. Weitere Deletionen im TK-Bereich und in den Wiederholungsbereichen sind mit (
) markiert.
D. Diagramm des S-PRV-014-DNA-Genoms mit Darstellung der Position des lac2-Gens, eingefügt in den gpX-Bereich und der Erzeugung einer Deletion, die den größten Teil des kodierenden Bereichs des gpX-Gens entfernte und das Virus unfähig machte, das Polypeptid gpX zu synthetisieren. Es gibt keine weitere Deletionen in diesem Virus.
E. Diagramm des S-PRV-016-DNA-Genoms mit Darstellung der Position des lacZ-Gens, eingefügt in den gpX-Bereich und der Erzeugung einer Deletion, die den größten Teil des kodierenden Bereichs des gpX-Gens entfernte und das Virus unfähig machte, das Polypeptid gpX zu synthetisieren. Weitere Deletionen im Wiederholungsbereich sind mit (
) markiert.

10A und 10B Schweinerotavirus-gp38 Gensequenz in pSY565.
11A und 11B Schweineparvovirus-B Gensequenz in pSY875
12 Schweineparvovirus-B Gen-Konstruktion mit Signalsequenz

A. pSY864, welches das B-Gen von AccI bei Nucleotid #391 bis zur RsaI-Stelle bei Nucleotid #2051 enthält, kloniert zwischen der BamHI-Stelle in BamHI #10 und der NdeI-Stelle in BamHI #7.
B. pSY957, welches das SalI-Fragment von pSY864 enthält, kloniert in einen Polylinker in pSP65, so daß die XbaI-Stellen den Insert flankieren.

13 Details der S-PRV-020-Konstruktion und Daten der Karte.

A. Detaillierte Karte von PRV, sich erstreckend von BamHI #10 bis BamHI #7 mit Darstellung des Parvovirus B-Gens, das das gpX-Gen ersetzen wird.
B. Detaillierte Spaltungskarte von PRV von BamHI #10 bis BamHI #7 nach der Insertion des Schweineparvovirus B-Gens anstelle des gpX-Gens.
C. Diagramm des S-PRV-020-Genoms mit Darstellung des Schweineparvovirus B-Gens, eingefügt in den gpX-Bereich von PRV.

14 Details der S-PRV-025-Konstruktion und Daten der Karte

A. Bereich des Ausgangsvirus S-PRV-002 mit Darstellung des BamHI #5 Fragments. Das Parvovirus B-Gen XbaI-Fragment aus pSY957 ist schematisch darunter angegeben mit Darstellung wie es durch direkte Ligierung in die XbaI-Stelle eingefügt werden wird.
B. Bereich von BamHI #5 nach Insertion des Parvovirus B-Gens.
C. Position des Parvovirus B-Gens, eingefügt in beide Kopien des Wiederholungsbereichs in S-PRV-025.

15 Details der S-PRV-029-Konstruktion und Daten der Karte

A. Detaillierte Karte von PRV, sich von BamHI #10 bis BamHI #7 erstreckend mit Darstellung des lacZ-Gens, das das gpX-Gen ersetzen wird.
B. Detaillierte Karte von PRV, sich erstreckend von BamHI #8' bis BamHI #8 bei der Verbindung des Unique-Long-Bereichs und des internen Wiederholungsbereichs (IR). Das lacZ-Gen wird als ein SalI-Fragment die DNA zwischen den die Verbindung umklammernden StuI-Stellen ersetzen.
C. Diagramm des S-PRV-029-Genoms mit Darstellung der Positionen der lacZ-Gene in dem gpX-Bereich und des Verbindungsbereichs.

16 Restriktionskarte von deletiertem S-IBR-002-EcoRI B-Fragment und EcoRI F-Fragment.
Eine 800 bp große, die EcoRV- und BgUI-Restriktionsstellen umfassende Deletion wurde in beiden Wiederholungsfragmenten kartiert.
17 Konstruktion des rekombinanten S-IBR-004-Virus.
S-IBR-004 ist ein rekombinantes IBR-Virus, das ein eingefügtes Fremdgen (NEO) unter der Kontrolle des PRV-gpX-Promotors trägt. Eine neue XbaI-Schnittstelle wurde bei dem Small-Unique-Bereich erzeugt und die ursprüngliche SacI-Stelle wurde deletiert.
18 Konstruktion des rekombinanten S-IBR-008-Virus.
S-IBR-008 ist ein rekombinantes IBR-Virus, bei dem ein Rinder-Rota-Glykoprotein-Gen und der Plasmidvektor in die XbaI-Stelle in dem Unique-Long-Bereich eingefügt ist. Eine ortsspezifische Deletion wurde durch den Verlust des NEO-Gens im Small-Unique-Bereich bei der [SacI]-Schnittstelle erzeugt.
19 Details der HVT-Konstruktion und Daten der Karte

A. BamHI Restriktionsfragmentkarte von HVT. Fragmente sind nach abnehmender Größe numeriert; Buchstaben bezeichnen kleine Fragmente, deren relative Größe nicht bestimmt worden ist.
B. BamHI #16-Fragment mit Darstellung der Position der beta-Galactosidase-Gen-Insertion in S-HVT-001.
C. BamHI #19-Fragment mit Darstellung der beta-Galactosidase-Gen-Insertion.

20 Western-Blot der in das Medium der mit PRV infizierten Zellen abgegebenen Proteine, mit Darstellung der Abwesenheit von gpX in S-PRV-012 und S-PRV-013, demgegenüber der Anwesenheit im Wildtyp PRV-000. Spuren: (A) Molekulargewichtsmarker, (B) nicht infizierte Vero-Zellen, (C) Wildtyp-PRV, (D) S-PRV-012, (E) S-PRV-013.
21 Diagnostischer Test auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen gpX im Serum eines an Tag 0 mit S-PRV-013 geimpften Schweines, bei dem an Tag 28 mit Wildtyp-Pseudorabies-Virus eine Kontrollinfektion gesetzt wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein hybrides nicht-Primaten Herpesvirus, welches DNA umfaßt, einschließend eine für die virale Replikation des hybriden nicht-Primaten Herpesvirus essentielle Sequenz, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die essentiell für die Replikation eines in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus ist und mindestens eine fremde DNA-Sequenz. Die für die virale Replikation des hybriden nicht-Primaten Herpesvirus essentielle Sequenz kann synthetisch sein oder von einem in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus stammen.
Die Fremd-DNA-Sequenz kann für die Expression in einem Wirt angepaßt werden und für eine Aminosäuresequenz kodieren. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Fremd-DNA-Sequenz zur Expression mittels eines Herpesvirus-Promotors angepaßt. Der Herpesvirus-Promotor kann ein stromaufwärts gelegener endogener Herpesvirus-Promotor oder ein stromaufwärts gelegener eingefügter Herpesvirus-Promotor sein. Beispiele solcher Herpesvirus-Promotoren umfassen, ohne sich darauf zu beschränken, den Herpes simplex-Typ ICP4 Protein-Promotor, den Herpes simplex-Typ 1 Thymidinkinase-Promotor, den Pseudorabies-Thymidinkinase-Promotor, den Pseudorabies-Immediate Early Gen-Promotor, den Pseudorabies-Glykoprotein X-Promotor oder den Pseudorabies-Glykoprotein 92-Promotor.
Die durch die Fremd-DNA-Sequenz kodierte Aminosäuresequenz kann ein Polypeptid sein. Des weiteren kann das Polypeptid ein Protein sein. In einer Ausführungsform der Erfindung weist das Protein, wenn es im Wirt exprimiert wird, antigene Eigenschaften auf. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Protein Schweinerotavirus-Glykoprotein 38. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Protein Rinderrotavirus-Glykoprotein 38. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Protein Schweineparvovirus B-Capsidprotein.
Auch hierin offenbart ist ein hybrides nicht-Primaten Herpesvirus, welches DNA umfasst, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die essentiell für die Replikation eines in der Natur vorkommenden alpha-Herpesvirus ist. Das alpha-Herpesvirus kann ein Pseudorabiesvirus, infektiöses Rinderrhinotracheitisvirus, Pferdeherpesvirus I, Katzenherpesvirus I oder Hundeherpesvirus I sein. Zusätzlich kann das alpha-Herpesvirus ein Klasse D-Herpesvirus sein. Das Klasse D-Herpesvirus kann Pseudorabiesvirus, infektiöses Rinderrhinotracheitisvirus, Pferdeherpesvirus I, Katzenherpesvirus I oder Hundeherpesvirus I sein. Ein hierin offenbartes alpha-Herpesvirus ist ein infektiöses Rinderrhinotracheitis-Virus, und die fremde DNA kodiert für das Escherichia coli-Neomycinresistenz-Gen. Diese Fremd-DNA-Sequenz kann auch unter der Kontrolle eines eingefügten Pseudorabiesvirus-Glykoprotein X-Promotors stehen. Ein solches Virus ist konstruiert worden, es wurde mit S-IBR-004 bezeichnet und bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland unter der Hinterlegungsnummer VR 2134 hinterlegt.
Ein weiteres hierin offenbartes alpha-Herpesvirus ist ein infektiöses Rinderrhinotracheitis-Virus mit einer Deletion in der Unique-Short-Sequenz. Des weiteren kann die Fremd-DNA-Sequenz für das Rinderrotavirus-Glykoprotein 38-Gen kodieren. Dieses Virus, mit S-IBR-008 bezeichnet, ist konstruiert worden, und es wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer VR 2141 hinterlegt.
Das erfindungsgemäße rekombinante Herpesvirus wird DNA umfassen, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die für die Replikation einer in der Natur vorkommenden gamma-Herpesvirus, Truthahn-Herpesvirus, essentiell ist. Damit ist der das gamma-Herpesvirus ein Klasse E-Herpesvirus, Truthahn-Herpesvirus.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein attenuiertes nicht-Primaten Herpesvirus, welches DNA umfaßt, einschließend eine Sequenz, die für die virale Replikation des attenuierten nicht-Primaten Herpesvirus essentiell ist, vor der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die essentiell für die Replikation eines in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus ist, aus der mindestens ein Teil einer Wiederholungssequenz deletiert wurde. Die für die virale Replikation des attenuierten nicht-Primaten Herpesvirus essentielle Sequenz kann von einem in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus abgeleitet sein.
Der deletierte Teil der Wiederholungssequenz kann einen anderen Teil einer Wiederholungssequenz als einen Verbindungsbereich (junction region) umfassen oder kann einen Verbindungsbereich umfassen. Zusätzlich kann der deletierte Teil der Wiederholungssequenz eine nicht-essentielle Sequenz von einer oder beiden Wiederholungssequenzen umfassen. Des Weiteren kann mindestens ein Teil der essentiellen Sequenz eines Wiederholungsbereichs deletiert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung kann ein gesamter Wiederholungsbereich deletiert werden. Außerdem kann eine nicht in einem Wiederholungsbereich gelegene Sequenz zusätzlich deletiert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die nicht in einem Wiederholungsbereich gelegene deletierte Sequenz mindestens ein Teil eines Gens.
Auch hierin offenbart ist ein attenuiertes nicht-Primaten Herpesvirus, welches DNA umfasst, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die essentiell für die Replikation eines in der Natur vorkommenden alpha-Herpesvirus ist. Das alpha-Herpesvirus kann ein Pseudorabies-Virus, infektiöses Bovines Rhinotracheitis-Virus, Pferde-Herpesvirus I, Katzen-Herpesvirus I oder Hunde-Herpesvirus I sein. Zusätzlich kann das alpha-Herpesvirus ein Klasse D-Herpesvirus sein. Das Klasse D-Herpesvirus kann ein Pseudorabies-Virus, infektiöses Bovines Rhinotracheitis-Virus, Pferde-Herpesvirus I, Katzen-Herpesvirus I oder Hunde-Herpesvirus I sein. Ein alpha-Herpesvirus ist ein infektiöses Bovines Rhinotracheitis-Virus. Ein weiteres hierin offenbartes attenuiertes nicht-Primaten Herpesvirus umfasst ein infektiöses Bovines Rhinotracheitis-Virus, bei dem mindestens ein Teil beider Wiederholungssequenzen deletiert wurde. Dieses Virus wurde hergestellt, als S-IBR-002 bezeichnet und bei der ATCC unter Zugangsnummer VR 2140 hinterlegt.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein attenuiertes hybrides nicht-Primaten Herpesvirus, DNA umfassend, die eine Sequenz einschließt, die essentiell für die virale Replikation des attenuierten, hybriden nicht-Primaten Herpesvirus ist, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die essentiell für die Replikation eines in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus ist, und mindestens eine fremde DNA-Sequenz. Die für die virale Replikation des attenuierten hybriden nicht-Primaten Virus essentielle Sequenz kann von einem in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Virus abgeleitet sein. Weiterhin kann mindestens ein Teil einer Wiederholungssequenz des attenuierten hybriden nicht-Primaten Herpesvirus deletiert sein.
Die Fremd-DNA-Sequenz kann zur Expression in einem Wirt angepaßt sein und für eine Aminosäuresequenz kodieren. Zusätzlich kann die Fremd-DNA-Sequenz zur Expression durch einen Herpesvirus-Promotor angepaßt sein. Der Herpesvirus-Promotor kann ein stromaufwärts gelegener endogener Promotor oder ein stromaufwärts gelegener eingefügter Herpesvirus-Promotor sein.
Der Herpesvirus-Promotor kann der Herpes simpIex-Typ ICP4 Protein-Promotor, der Herpes simplex Typ I-Thymidinkinase-Promotor, der Pseudorabies Immediate early-Gen-Promotor, der Pseudorabies Glykoprotein X-Promotor oder der Pseudorabies Glykoprotein 92-Promotor sein.
Die von der Fremd-DNA-Sequenz kodierte Aminosäuresequenz kann ein Polypeptid sein. Des weiteren kann das Polypeptid ein Protein sein. Weiter kann das Protein, wenn es in einem Wirt exprimiert wird, antigen sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Protein Schweine-Rotavirus Glykoprotein 38. In einer weiteren Ausführungsform ist das Protein Rinder-Rotavirus Glykoprotein 38. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Protein Schweine-Parvovirus B-Capsidprotein.
Das hierin offenbarte attenuierte hybride nicht-Primaten Herpesvirus kann DNA umfassen, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die essentiell für die Replikation eines in der Natur vorkommenden alpha-Herpesvirus ist. Das alpha-Herpesvirus kann ein Pseudorabies-Virus, infektiöses Bovines Rhinotracheitis-Virus, Pferde-Herpesvirus I, Katzen-Herpesvirus I oder Hunde-Herpesvirus I sein. Zusätzlich kann das alpha-Herpesvirus ein Klasse D-Herpesvirus sein. Das Klasse D-Herpesvirus kann ein Pseudorabies-Virus, infektiöses Bovines Rhinotracheitis-Virus, Pferde-Herpesvirus I, Katzen-Herpesvirus I oder Hunde-Herpesvirus I sein.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein attenuiertes hybrides nicht-Primaten Herpesvirus, DNA umfassend, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die essentiell für die Replikation eines in der Natur vorkommenden gamma-Herpesvirus, Truthahn-Herpesvirus, ist. Hierin auch offenbart ist das gamma-Herpesvirus Marek Krankheits-Virus. Hierin auch offenbart ist, dass das gamma-Herpesvirus ein Klasse E-Herpesvirus ist, z.B. ein Marek Krankheits-Virus oder Truthahn-Herpesvirus.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Vakzine bereit, die eine wirksame, immunisierende Menge eines rekombinanten Truthahn-Herpesvirus der vorliegenden Erfindung und einen geeigneten Träger, d.h. ein physiologisch ausbalanciertes Kulturmedium, das stabilisierende Mittel enthält, umfaßt.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine multivalente Vakzine, die nützlich ist, um ein Tier gegen mindestens einen Krankheitserreger zu immunisieren. Diese Vakzine umfaßt eine wirksame immunisierende Menge eines hybriden nicht-Primaten Herpesvirus der vorliegenden Erfindung und einen geeigneten Träger, wobei das Virus eine Fremd-DNA-Sequenz enthält, die für ein Protein kodiert, das, wenn es im Wirt exprimiert wird, antigen ist.
Weiter bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Vakzine, die nützlich ist, um ein Tier gegen eine Herpesvirus-Erkrankung zu immunisieren, und die eine wirksame immunisierende Menge eines durch die Erfindung bereitgestellten attenuierten nicht-Primaten Herpesvirus und einen geeigneten Träger umfaßt. Die Erfindung bezieht sich auf eine weitere Vakzine, um ein Tier gegen eine Herpesvirus-Erkrankung zu immunisieren. Diese Vakzine umfaßt eine wirksame immunisierende Menge eines erfindungsgemäßen attenuieren hybriden nicht-Primaten Herpesvirus und einen geeigneten Träger.
Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf eine multivalente Vakzine, die nützlich für die Immunisierung eines Tieres gegen wenigstens einen Krankheitserreger ist. Diese Vakzine umfaßt eine wirksame immunisierende Menge eines attenuierten hybriden nicht-Primaten Herpesvirus und einen geeigneten Träger, wobei das Virus für wenigstens eine Fremd-DNA-Sequenz enthält, die für ein Protein kodiert, welches, wenn es im Wirt exprimiert wird, antigen ist.
Des erfindungsgemäße rekombinante Herpesvirus kann in Verfahren verwendet werden, Tiere gegen Herpesvirus-Krankheiten zu immunisieren, und in Verfahren, ein Tier gegen wenigstens einen Krankheitserreger zu immunisieren. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer geeigneten Dosis einer erfindungsgemäßen Vakzine an das Tier. Die Tiere, die immunisiert werden können, schließen Schweine, Rinder, Schafe, Ziegen, Hunde und Katzen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die Vakzine kann intramuskulär, subcutan, intraperitoneal oder intravenös injiziert werden. Die Vakzine kann ebenfalls intranasal oder oral verabreicht werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren, um die hybriden, nicht-Primat-Herpesviren zu identifizieren, bei denen die Fremd-DNA-Sequenz im Virus nachgewiesen wird, die Anwesenheit des exprimierten Polypeptids im Wirtstier oder in der Wirtszelle nachgewiesen wird und/oder die Anwesenheit des exprimierten Proteins im Wirtstier oder in der Wirtszelle nachgewiesen wird.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren, um das erfindungsgemäße attenuierte hybride nicht-Primaten Herpesvirus zu identifizieren, durch welche die Fremd-DNA-Sequenz nachgewiesen wird, die Anwesenheit des exprimierten Polypeptids im Wirtstier oder in der Wirtszelle nachgewiesen wird, und/oder die Anwesenheit des exprimierten Proteins im Wirtstier oder in der Wirtszelle nachgewiesen wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren, um in einem Tier ein Genprodukt für andere Zwecke als eine Immunisierung herzustellen. Dieses Verfahren umfaßt die Verabreichung an das Tier von einer geeigneten Menge eines erfindungsgemäßen hybriden nicht-Primaten Herpesvirus, das eine für eine Expression in einem Wirt angepaßte Fremd-DNA-Sequenz enthält, wobei die Fremd-DNA-Sequenz das Genprodukt exprimiert. Zusätzlich kann ein Genprodukt in einem Tier für andere Zwecke als Immunisierung produziert werden, wenn an das Tier eine geeignete Menge eines attenuierten hybriden nicht-Primaten Herpesvirus verabreicht wird, welches eine Fremd-DNA-Sequenz angepaßt zur Expression in einem Wirt enthält, wobei diese Fremd-DNA-Sequenz das Genprodukt exprimiert.
Das erfindungsgemäßes Virus kann unter Verwendung der folgenden Verfahren zur Herstellung eines attenuierten hybriden nicht-Primaten Herpesvirus hergestellt werden. Ein Verfahren umfaßt die Isolierung viraler DNA eines in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus und die Anwendung von Verdauung mit Restriktionsenzymen, um DNA-Restriktionsfragmente herzustellen. Diese Restriktionsfragmente werden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt, um spezifische DNA-Fragmente zu erhalten, die dann mit geeigneten Enzymen behandelt werden, die dem Fachmann bekannt sind, um modifizierte Virus-DNA-Fragmente zu produzieren. Diese modifizierte DNA-Fragmente sind fähig, an bakterielle Plasmid-DNA-Sequenzen zu binden. Geeignete bakterielle Plasmide werden getrennt mit geeigneten Restriktionsenzymen behandelt, die dem Fachmann bekannt sind, um bakterielle Plasmid-DNA-Sequenzen zu produzieren, die in der Lage sind, an modifizierte Virus-DNA-Fragmente zu binden. Diese bakteriellen Plasmid-Sequenzen werden daraufhin unter geeigneten Bedingungen mit den modifizierten Virus-DNA-Fragmenten kombiniert, um es der Virus-DNA zu ermöglichen, die bakterielle DNA zu binden und ein virales-bakterielles Plasmid zu bilden.
Das viral-bakterielle DNA-Plasmid wird dann mit Restriktionsenzymen kartiert, um eine Restriktionskarte des viralen DNA-Inserts zu erzeugen. Das viral-bakterielle DNA-Plasmid wird dann mit einem Restriktionsenzym behandelt, von dem im Stand der Technik bekannt ist, daß es wenigstens eine Deletion in der viralen DNA-Sequenz des viral-bakteriellen DNA-Plasmids verursacht. Dieses Plasmid, das wenigstens eine Deletion in der viralen DNA-Sequenz enthält, wird mit in der Natur vorkommender viraler nicht-Primaten Herpesvirus-DNA in Tierzellen transfiziert. Die Tierzellen werden unter geeigneten Bedingungen gehalten, um es der in der Natur vorkommenden nicht-Primaten Herpesvirus DNA zu ermöglichen, zu Herpesviren und zu einem geringen Prozentsatz zu Viren zu regenerieren, die mit der viralen/Fremd DNA-Sequenz des viral-bakteriellen-Fremd-DNA-Plasmids rekombiniert sind. Einige dieser rekombinierten Viren weisen bedingt durch die Deletionen in dem viralen DNA-Insert des Plasmids Deletionen in ihrem Genom auf. Die Viren werden identifiziert und danach aus Plaques von den unerwünschten Viren gereinigt.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Viren wird natürlich vorkommende virale nicht-Primaten Herpesvirus-DNA isoliert und mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um Virus-Restriktionsfragmente herzustellen. Getrennt wird Fremd-DNA mit geeigneten Enzymen verdaut, um Fremd-DNA-Restriktionsfragmente zu erzeugen. Die Fremd-DNA-Restriktionsfragmente werden mit den Virus-DNA-Restriktionsfragmenten unter geeigneten Bedingungen gemischt, wodurch es den Fragmenten möglich wird, sich zusammenzufügen und Virus-Fremd-DNA-Fragmente zu bilden. Tierzellen werden mit den Virus-Fremd-DNA-Fragmenten transfiziert und unter geeigneten Bedingungen gehalten, so daß es den Fremd-DNA-Fragmente möglich ist, zu Herpesviren und zu einem geringen Prozentsatz zu Viren zu regenerieren, die Fremd-DNA-Fragmente in ihr Genom aufgenommen haben. Herpesviren, die erwünschte Fremd-DNA-Fragmente in ihr Genom aufgenommen haben, werden identifiziert und aus Plaques von den unerwünschten Herpesviren gereinigt.
Auch hierin offenbart ist ein attenuiertes Pseudorabiesvirus, DNA umfassend, welche eine Sequenz einschließt, die essentiell für die Replikation des attenuierten Virus ist, von der mindestens ein Teil essentiell für die Replikation eines in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus ist, und mindestens eine Fremd-DNA-Sequenz, angepasst zur Expression in einem Wirt und kodierend für eine Aminosäuresequenz, welche in dem Wirt antigen wirkt. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die von der Fremd-DNA-Sequenz kodierte Aminosäuresequenz in dem Wirt exprimiert, wobei eine solche Expression zur Produktion von Antikörpern führt, die gegen die Aminosäuresequenz gerichtet sind, und solche Antikörper dem Wirt Schutz gegen folgende Infektionen mit einem anderen Krankheitserreger als Pseudorabiesvirus vermitteln.
Die für die Replikation des attenuierten Virus essentielle DNA-Sequenz kann synthetisch sein oder kann von einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus abgeleitet sein. Die von der Fremd-DNA-Sequenz kodierte Aminosäuresequenz kann ein Polypeptid sein. Das Polypeptid kann ein Protein sein. Weiterhin kann die Fremd-DNA-Sequenz zur Expression von einem stromaufwärts gelegenen endogenen Pseudorabiesviruspromoter oder von einem eingefügten stromaufwärts gelegenen Herpesviruspromoter angepasst sein. Der Herpesviruspromoter kann ein Pseudorabiespromoter sein.
Auch hierin offenbart ist ein attenuiertes Pseudorabiesvirus, umfassend ein Pseudorabiesvirus, aus dem eine nicht-essentielle Sequenz deletiert wurde. Die deletierte, nicht-essentielle Sequenz kann mindestens ein Teil eines Gens sein. Die deletierte, nicht-essentielle Sequenz kann mindestens einen Teil des Pseudorabies Glykoprotein X Gens umfassen. Wie auch hierin offenbart, kann die Fremd-DNA-Sequenz dort in die DNA eingefügt sein, wo die Deletion in dem Glykoprotein X Gen stattfand. Insbesondere ist die Fremd-DNA-Sequenz zur Expression von dem Pseudorabies Glykoprotein X Gen-Promoter und mit Pseudorabies Glykoprotein X Polyadenylierungssignalsequenzen angepasst und kodiert für E. coli Beta-Galaktosidase. Dieses Virus wurde als S-PRV-014 bezeichnet und ist bei der ATCC unter Zugangsnummer VR 2135 hinterlegt.
Auch hierin offenbart ist ein attenuiertes Pseudorabiesvirus, welches ein Pseudorabiesvirus umfasst, aus dem mindestens ein Teil des Glykoprotein X Gens und mindestens ein Teil einer Wiederholungssequenz deletiert wurde, und in das dort, wo die Deletion in dem Glykoprotein X Gen stattfand, eine Fremd-DNA-Sequenz eingefügt wurde, welche für E. coli Beta-Galaktosidase, angepasst zur Expression von dem Glykoprotein X Gen-Promoter und -Polyadenylierungssignalsequenzen, kodiert, zum Beispiel ist ein Teil beider Wiederholungssequenzen deletiert. Dieses Virus wird als S-PRV-016 bezeichnet und wurde bei der ATCC unter Zugangsnummer VR 2136 hinterlegt.
Auch hierin offenbart ist ein attenuiertes Pseudorabiesvirus, welches ein Pseudorabiesvirus umfasst, aus dem mindestens ein Teil eines Gens und aus dem mindestens ein Teil einer Wiederholungssequenz deletiert wurde. Zum Beispiel kodiert das Gen für Pseudorabies Thymidinkinase. Weiterhin kann die deletierte Sequenz, welche mindestens einen Teil einer Wiederholungssequenz umfasst, einen Teil einer einzigartigen Sequenz einschließen. In einer weiteren Version schliesst die deletierte Sequenz, welche mindestens einen Teil einer Wiederholungssequenz umfasst, einen Teil der Verbindungsregion der internen Wiederholung und die einzigartige lange Sequenz ein.
Weiterhin kann die Fremd-DNA-Sequenz dort in die DNA eingefügt sein, wo die Deletion in der Wiederholungssequenz stattfand, zum Beispiel weist das Virus eine Deletion in dem Pseudorabies Thymidinkinase-Gen, eine Deletion von mindestens einem Teil einer Wiederholungssequenz, welche einen Teil der Verbindungsregion der internen Wiederholung und einen Teil der einzigartigen langen Sequenz umfasst, auf, und eine Fremd-DNA-Sequenz ist eingefügt, wo die Deletion in der Verbindungsregion stattfand. In einer spezifischen Version ist die Fremd-DNA-Sequenz zur Expression von dem Herpessimplex Typ 1 ICP4 Genpromoter angepasst und kodiert für Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase. Dieses Virus wird als S-PRV-004 bezeichnet.
Auch hierin offenbart sind attenuierte Pseudorabiesviren, aus denen mindestens ein Teil des Thymidinkinasegens und mindestens ein Teil beider Wiederholungssequenzen deletiert wurden. Zum Beispiel ist eine Fremd-DNA-Sequenz dort in das Virus eingefügt, wo die Deletionen in beiden Wiederholungssequenzen stattfanden. Zum Beispiel weist das Virus eine Deletion in dem Pseudorabies Thymidinkinasegen, eine Deletion in beiden Wiederholungssequenzen, und eine Insertion einer Fremd-DNA-Sequenz in beide Wiederholungen auf. Zum Beispiel ist die Fremd-DNA-Sequenz zur Expression von dem Herpes simplex Typ 1 ICP4 Genpromoter angepasst und kodiert für Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase. Dieses Virus wird als S-PRV-005 bezeichnet und wurde bei der ATCC unter Zugangsnummer VR 2109 hinterlegt. Zum Beispiel ist die Fremd-DNA-Sequenz zur Expression von dem Herpes simplex Typ I ICP4 Genpromoter angepasst und kodiert für Schweine Rotavirus Glykoprotein 38. Dieses Virus wird als S-PRV-007 bezeichnet und ist unter ATCC Zugangsnummer VR 2118 hinterlegt. Zum Beispiel ist die Fremd-DNA zur Expression mit dem Herpes simplex Typ 1 Thymidinkinase-Genpromoter angepasst und kodiert für E. coli Beta-Galaktosidase (das lacZ Gen). Dieses Virus wird als S-PRV-010 bezeichnet und wurde unter ATCC Zugangsnummer VR 2110 hinterlegt.
In anderen Offenbarungen hierin wurde mindestens ein Teil jeder Wiederholungssequenz, das für Pseudorabies Thymidinkinase kodierende Gen und das für Pseudorabies Glykoprotein X kodierende Gen deletiert. Weiterhin kann die Fremd-DNA-Sequenz dort in die DNA-Sequenz eingefügt sein, wo die Deletion in dem Pseudorabies Glykoprotein X Gen stattfand. Zum Beispiel kodiert die Fremd-DNA-Sequenz für einen antigenen Teil des Schweineparvovirus B Kapsid-Proteins und ist zur Expression mit dem Pseudorabies Glykoprotein X Genpromoter und den Pseudorabies Glykoprotein X Polyadenylierungssignalsequenzen angepasst. Dieses Virus, als S-PRV-020 bezeichnet, wurde unter ATCC Zugangsnummer VR 2137 hinterlegt.
In einer weiteren Offenbarung hierin weist das Virus eine Deletion in dem Pseudorabies Thymidinkinasegen, eine Deletion in beiden Wiederholungssequenzen und Einfügungen von Fremd-DNA-Sequenzen in beide Wiederholungssequenzen auf, welche für einen antigenen Teil des Schweineparvovirus B Kapsid-Proteins kodieren. Die Fremd-DNA-Sequenzen sind zur Expression mit dem Pseudorabies Glykoprotein X Genpromoter und den Pseudorabies Glykoprotein X Polyadenylierungssignalsequenzen angepasst. Dieses Virus, als S-PRV-025 bezeichnet, wurde unter ATCC Zugangsnummer VR 2138 hinterlegt.
In einer anderen Offenbarung hierin wurde mindestens ein Teil einer Wiederholungssequenz aus einem Pseudorabiesvirus deletiert, und mindestens ein Teil des Pseudorabies Glykoprotein X Gens wurde deletiert. Die deletierte Sequenz, welche mindestens einen Teil einer Wiederholungssequenz umfasst, kann einen Teil einer einzigartigen Sequenz einschließen. Zum Beispiel umfasst die deletierte Sequenz, welche mindestens einen Teil einer Wiederholungssequenz und einen Teil einer einzigartigen Sequenz umfasst, einen Teil der Verbindungsregion der internen Wiederholung und die einzigartige lange Sequenz. Weiterhin kann die Fremd-DNA-Sequenz dort in die DNA-Sequenz eingefügt sein, wo die Deletion in dem Glykoprotein X Gen auftrat. In einer spezifischeren Offenbarung ist die Fremd-DNA-Sequenz zur Expression von dem Pseudorabies Glykoprotein X Promoter und den Pseudorabies Glykoprotein X Polyadenylierungssignalsequenzen angepasst und kodiert für E. coli Beta-Galaktosidase. Dieses Virus, als S-PRV-029 bezeichnet, wurde unter ATCC Zugangsnummer VR 2139 hinterlegt.
Zur Immunisierung eines Tieres gegen Pseudorabiesvirus-Krankheit nützliche Vakzine werden auch offenbart. Diese Vakzine umfassen eine effektive immunisierende Menge eines erfindungsgemäßen attenuierten Pseudorabiesvirus und einen geeigneten Träger, zum Beispiel ein physiologisch ausgewogenes Kulturmedium, welches stabilisierende Mittel enthält.
Auch offenbart werden multivalente Vakzine, die nützlich zur Immunisierung eines Tieres gegen Pseudorabiesvirus-Erkrankung und mindestens ein anderes Pathogen sind. Das Wirtstier wird gegen andere Pathogene durch die Produktion von fremden Antigenen durch das Tier, die von der Fremd-DNA-Sequenz des attenuierten Pseudorabiesvirus produziert werden, immunisiert. Tiere können gegen Pseudorabiesvirus und andere Pathogene immunisiert werden, indem man ihnen eine geeignete Dosis einer Vakzine der vorliegenden Erfindung verabreicht. Solche Tiere schließen Schweine, Hunde, Katzen, Schafe oder Rinder ein. Die Vakzine kann intramuskulär, subkutan, intraperitoneal oder intravenös injiziert werden. Die Vakzine können auch intranasal oder oral verabreicht werden.
Auch offenbart sind Verfahren zur Herstellung attenuierter Pseudorabiesviren, welche eine Fremd-DNA-Sequenz enthalten. Ein Verfahren beinhaltet die Isolierung von in der Natur vorkommender Pseudorabiesvirus DNA und die Verwendung eines Verdaus mit Restriktionsenzymen, um DNA Restriktionsfragmente herzustellen. Diese Restriktionsfragmente werden durch Agarosegelelektrophorese aufgereinigt, um spezifische DNA Fragmente zu erhalten, die mit geeigneten, Fachleuten bekannten Enzymen behandelt werden, um modifizierte virale DNA Fragmente herzustellen. Diese modifizierten viralen DNA Fragmente sind in der Lage, an bakterielle Plasmid-DNA-Sequenzen zu binden. Geeignete bakterielle Plasmide werden getrennt mit geeigneten, Fachleuten bekannten, Restriktionsenzymen behandelt, um bakterielle Plasmid-DNA-Sequenzen herzustellen, die in der Lage sind, an modifizierte virale DNA Fragmente zu binden. Diese bakteriellen Plasmid-DNA-Sequenzen werden dann mit den modifizierten viralen DNA Fragmenten unter geeigneten Bedingungen kombiniert, die der viralen DNA erlauben, an die bakterielle DNA zu binden und ein viral-bakterielles Plasmid zu bilden.
Das viral-bakterielle DNA Plasmid wird dann mit Restriktionsenzymen kartiert, um eine Restrikitionskarte des viralen DNA-Inserts herzustellen. Das viral-bakterielle DNA Plasmid wird dann mit den im Stand der Technik bekannten Restriktionsenzymen behandelt, um die virale DNA-Sequenz des viral-bakteriellen DNA Plasmids zu schneiden. Fremde DNA wird getrennt mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um Fremd-DNA-Restriktionsfragmente herzustellen. Fragmente, die gewünschte Gene enthalten, werden unter geeigneten Bedingungen mit den viral-bakteriellen DNA Plasmidsequenzen gemischt, um die Bildung eines viral-bakteriellen-Fremd-DNA-Plasmids zu erlauben. Dieses Plasmid, das die Fremd-DNA-Sequenz enthält, wird mit in der Natur vorkommenden intakten Pseudorabiesviren in Tierzellen transfiziert. Die Tierzellen werden unter geeigneten Bedingungen gehalten, um der in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus DNA zu erlauben, sich zu in der Natur vorkommenden Virus und zu einem geringen Prozentsatz von Viren, die einer Rekombination mit der Fremd-DNA-Sequenz des Plasmids unterlagen, zu regenerieren. Einige dieser rekombinierten Viren weisen als Folge der Deletionen in dem viralen DNA-Insert des Plasmids Deletionen in ihrem Genom auf. Die Fremd-DNA-Sequenz enthaltende Viren werden identifiziert und in der Folge aus Plaques von dem Wildtypvirus gereinigt.
Die in das Pseudorabies-Virusgenom eingebaute Fremd-DNA-Sequenz kann für Herpessimplex Typ 1 Thymidinkinase, E. coli Beta-Galaktosidase, Schweinerotavirus Glykoprotein 38 oder Schweineparvovirus B Kapsid-Protein kodieren.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von attenuierten Pseudorabiesviren, welche eine Fremd-DNA-Sequenz enthalten, wird offenbart. Bei diesem direkten Ligationsverfahren spielt eine Isolierung und ein Verdau von Pseudorabiesvirus DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen zur Herstellung viraler DNA Restriktionsfragmente eine Rolle. Fremd-DNA wird getrennt mit Restriktionsenzymen verdaut, um Fremd-DNA Restriktionsfragmente herzustellen. Die viralen DNA Restriktionsfragmente werden unter geeigneten Bedingungen zur Reaktion gebracht, um die Bildung von Virus-Fremd-DNA-Fragmenten zu erlauben.
Tierzellen werden dann mit den Virus-Fremd-DNA-Fragmenten transfiziert und unter geeigneten Bedingungen gehalten, um den Virus-Fremd-DNA-Fragmenten zu erlauben, zu Pseudorabiesviren zu regenerieren. Viren, die erwünschte Fremd-DNA-Sequenzen enthalten, werden identifiziert und von den anderen Viren durch Plaque-Aufreinigung gereinigt.
Bei dem direkten Ligationsverfahren spielt der Einbau einer Fremd-DNA-Sequenz, die für E. coli Beta-Galaktosidase kodiert, in das Pseudorabiesvirusgenom eine Rolle.
Auch Verfahren zur Herstellung von Vakzinen, die Pseudorabiesviren umfassen, welche eine Fremd-DNA-Sequenz enthalten, sind offenbart. Diese Verfahren schließen die Kultur des Virus in Rollflaschen oder in einer Suspension von Mikroträger-Kügelchen ein. Die Vakzine können auch durch Kultur des Virus durch Fermentation in Chargen hergestellt werden.
Auch offenbart ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit der in 10 dargestellten Nukleinsäuresequenz, kodierend für Schweinerotavirus Glykoprotein 38. Dieses Nukleinsäuremolekül kann ein cDNA Molekül sein. Die Offenbarung betrifft weiter ein mRNA Molekül, welches komplementär zu dem in 10 dargestellten Nukleinsäuremolekül ist.
Es wird ebenfalls ein bakterielles rekombinantes Klonierungsvehikel offenbart, welches Plasmid DNA und die erfindungsgemäße cDNA umfasst. Zum Beispiel umfasst die Plasmid DNA pBR322 DNA. Dieses Klonierungsvehikel wird als pSY565 bezeichnet. Eine bakterielle Wirtszelle, welche dieses Klonierungsvehikel umfasst, wird zusätzlich offenbart. Zum Beispiel ist die Wirtszelle eine E. coli Zelle, die als DE-1/pSY565 bezeichnet wird und unter ATCC Zugangsnummer 53,340 hinterlegt ist.
Weiter ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül offenbart, welches die in 11 dargestellte Nukleinsäuresequenz aufweist und für Schweineparvovirus B Kapsid-Protein kodiert. Dieses Nukleinsäuremolekül kann ein cDNA Molekül sein. Die Offenbarung stellt auch ein mRNA Molekül bereit, welches komplementär zu dem in 11 dargestellten Nukleinsäuremolekül ist.
Darüber hinaus wird auch ein bakterielles rekombinantes Klonierungsvehikel offenbart, welches Plasmid DNA und die DNA von 11 umfasst. Zum Beispiel umfasst die Plasmid DNA pSP64 DNA. Dieses Klonierungsvehikel wird als pSY875 bezeichnet. Eine bakterielle Wirtszelle, welche dieses Klonierungsvehikel umfasst, wird zusätzlich offenbart. Zum Beispiel ist die Wirtszelle eine E. coli Zelle, die als HB101/pSY875 bezeichnet und unter ATCC Zugangsnummer 67146 hinterlegt ist.
Auch offenbart ist ein attenuiertes Pseudorabiesvirus, welches DNA umfasst, die eine für die Replikation des attenuierten Pseudorabiesvirus essentielle Sequenz enthält, von der mindestens ein Teil in einer Sequenz vorliegt, die essentiell für die Replikation eines in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus ist. Diese DNA kodiert für mRNAs, die in einem mit dem attenuierten Pseudorabiesvirus infizierten Tier in antigene Pseudorabiesvirus-Genprodukte translatiert werden, welche in dem infizierten Tier eine Immunantwort hervorrufen, die von einer Immunantwort unterscheidbar ist, die in einem mit einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus infizierten Tier hervorgerufen wird. Bei dieser Anwendung bedeutet ein in der Natur vorkommendes Pseudorabiesvirus ein Pseudorabiesvirus, welches nicht genetisch verändert wurde, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Wildtyp Pseudorabiesviren und Pseudorabiesviren, ausgewählt aus Pseudorabiesviren, die in der Natur vorkommen und spontane Deletionen aufweisen.
Die für die Replikation des attenuierten Pseudorabiesvirus essentielle Sequenz kann aus einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus stammen. Zusätzlich kann die DNA Wildtyp Pseudorabiesvirus DNA umfassen, aus der mindestens ein Teil eines nicht-essentiellen Gens deletiert wurde. Im Rahmen dieser Anwendung bedeutet nicht-essentielles Gen ein Gen, das für die virale Replikation nicht essentiell ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das nicht-essentielle Gen, von dem mindestens ein Teil deletiert wurde, das gpX Gen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde im Wesentlichen die ganze kodierende Region des gpX Gens, ein Teil einer Wiederholungssequenz und das Thymidinkinasegen deletiert. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde im Wesentlichen die ganze kodierende Region des gpX Gens, ein Teil einer Wiederholungssequenz und das Thymidinkinasegen deletiert, und das Herpes simplex Virus-1 (HSV-1) Thymidinkinasegen unter der Kontrolle des ICP4 Promoters ist anstelle der deletierten kodierenden Region des gpX Gens eingefügt. Das Virus, als S-PRV-012 bezeichnet, wurde bei der ATCC unter Zugangsnummer VR 2119 hinterlegt.
Es ist hierin auch offenbart, dass die kodierende Region des gpX Gens, ein Teil einer Wiederholungssequenz und das Thymidinkinasegen deletiert sind und das E. coli Beta-Galaktosidasegen anstelle der deletierten kodierenden Region des gpX Gens eingefügt ist. Das eingefügte Beta-Galaktosidasegen befindet sich unter der Kontrolle des endogenen gpX Promoters. Dieses Virus, bezeichnet als S-PRV-013, wurde bei der ATCC unter Zugangsnummer VR 2120 hinterlegt.
Auch hierin offenbart ist eine Vakzine für Pseudorabiesvirus-Erkrankung, welche eine effektive immunisierende Menge eines erfindungsgemäßen attenuierten Pseudorabiesvirus und einen geeigneten Träger umfasst. Der geeignete Träger kann ein physiologisch ausgewogenes Kulturmedium mit stabilisierenden Mitteln sein. Zusätzlich kann die effektive immunisierende Menge, d.h. eine Menge, die notwendig ist, um die Produktion von Antikörpern durch das Tier hervorzurufen, welche dem Tier Schutz gegen folgende Infektionen durch Wildtyp Pseudorabiesvirus verleihen, etwa 10³ bis etwa 10⁶ Plaque bildenden Einheiten (Plaque Forming Units, PFU)/Dosis sein. Darüber hinaus kann die effektive immunisierende Menge etwa 10⁴ bis etwa 10⁵ PFU/Dosis sein.
Es wird auch offenbart, dass die Vakzine eine effektive immunisierende Menge des als S-PRV-012 bezeichneten attenuierten Pseudorabiesvirus und einen geeigneten Träger umfasst. Es ist auch offenbart, dass die Vakzine eine effektive immunisierende Menge des als S-PRV-013 bezeichneten attenuierten Pseudorabiesvirus und einen geeigneten Träger umfasst.
Auch offenbart ist ein Verfahren zur Immunisierung eines Tieres gegen Pseudorabiesvirus-Erkrankung. Dieses Verfahren umfasst die Verabreichung einer geeigneten Dosis einer erfindungsgemäßen Vakzine an das Tier. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die effektive immunisierende Menge des attenuierten Pseudorabiesvirus der Vakzine etwa 10³ bis etwa 10⁶ PFU/Dosis. Darüber hinaus kann das Tier ein Schwein sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die effektive immunisierende Menge des attenuierten Pseudorabiesvirus der Vakzine etwa 10⁴ bis etwa 10⁵ PFU/Dosis. Das mit diesem Verfahren immunisierte Tier kann ein Schwein, Hund, Katze, Schaf oder Rind sein. Ein Tier kann durch Verabreichung einer geeigneten Dosis einer hierin offenbarten Vakzine, welche das attenuierte Pseudorabiesvirus S-PRV-012 umfasst, gegen Pseudorabiesvirus-Erkrankung immunisiert werden. Das immunisierte Tier kann ein Schwein sein. Eine noch andere Methode zur Immunisierung eines Tieres gegen Pseudorabiesvirus-Erkrankung umfasst die Verabreichung einer geeigneten Dosis der Vakzine, welche das attenuierte Pseudorabiesvirus S-PRV-013 umfasst, an das Tier. Darüber hinaus kann das immunisierte Tier ein Schwein sein.
Auch offenbart wird ein Verfahren zur Unterscheidung eines mit einer erfindungsgemäßen Vakzine geimpften Tiers von einem mit einem natürlich vorkommenden Pseudorabiesvirus infizierten Tier. Dieses Verfahren umfasst die Analyse einer Körperflüssigkeit des Tieres auf die Anwesenheit von Antigenen, die normalerweise in einem Tier exprimiert werden, das mit einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus infiziert ist, die Identifizierung von Antigenen, die in der Körperflüssigkeit vorliegen und von Antigenen, die nicht in der Körperflüssigkeit vorliegen, und die Korrelation der Antigene, die nicht in der Körperflüssigkeit vorliegen, mit Antigenen, die nicht in einem Tier exprimiert werden, das mit dem attenuierten Pseudorabiesvirus der Vakzine infiziert ist. Die Anwesenheit in der Körperflüssigkeit von Antigenen, welche normalerweise durch ein natürlich vorkommendes Pseudorabiesvirus in dem Tier exprimiert werden, außer jenen Antigenen, die nicht durch das attenuierte Pseudorabiesvirus der Vakzine in dem Tier exprimiert werden, wäre ein Hinweis auf ein Tier, das mit der Vakzine geimpft und nicht einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus infiziert ist.
In Bezug auf die Erfindung wird die Anwesenheit von Antigenen in der Körperflüssigkeit durch die Detektion von für die Antigene spezifischen Antikörpern in der Körperflüssigkeit bestimmt.
Auch offenbart wird ein Verfahren zur Unterscheidung eines mit einer das attenuierte Pseudorabiesvirus S-PRV-012 umfassenden Vakzine geimpften Tieres von einem mit einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus infizierten Tier offenbart. Nach diesem Verfahren wird eine Körperflüssigkeit des Tieres auf die Anwesenheit von Glykoprotein X und von mindestens einem anderen Antigen analysiert, welches normalerweise in dem Tier durch einen in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus exprimiert wird. Antigene, die in der Körperflüssigkeit vorliegen, werden identifiziert und die Anwesenheit oder Abwesenheit von Glykoprotein X in der Körperflüssigkeit wird bestimmt. Die Anwesenheit von Antigenen, die normalerweise durch ein in der Natur vorkommendes Pseudorabiesvirus in dem Tier exprimiert werden und die Abwesenheit von Glykoprotein X in der Körperflüssigkeit wäre ein Hinweis auf ein mit der Vakzine geimpftes und nicht mit einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus infiziertes Tier. Die Anwesenheit von Antigenen und Glykoprotein X in der Körperflüssigkeit kann bestimmt werden, indem man in der Körperflüssigkeit für die Antigene und Glykoprotein X spezifische Antikörper detektiert.
Auch ist ein Verfahren zur Unterscheidung eines mit einer Vakzine geimpften Tieres, welche das attenuierte Pseudorabiesvirus S-PRV-013 umfasst, von einem Tier, welches mit einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus infiziert ist, offenbart. Dieses Verfahren umfasst die Analyse einer Körperflüssigkeit des Tiers auf die Anwesenheit von Glykoprotein X und mindestens ein weiteres Antigen, das normalerweise in dem Tier durch ein in der Natur vorkommendes Pseudorabiesvirus exprimiert wird. Antigene, die in der Körperflüssigkeit vorliegen, werden identifiziert und die Anwesenheit oder Abwesenheit von Glykoprotein X in der Körperflüssigkeit wird bestimmt. Die Anwesenheit von Antigenen, die normalerweise in einem Tier durch ein in der Natur vorkommendes Pseudorabiesvirus exprimiert werden und die Abwesenheit von Glykoprotein X in der Körperflüssigkeit wären ein Hinweis auf ein mit der Vakzine geimpftes und nicht mit einem in der Natur vorkommenden Pseudorabiesvirus infiziertes Tier. Die Anwesenheit der Antigene und von Glykoprotein X kann bestimmt werden, indem man in der Körperflüssigkeit Antikörper bestimmt, die spezifisch für die Antigene und Glykoprotein X sind.
Auch hierin offenbart ist ein Verfahren zur Herstellung einer PseudorabiesvirusVakzine der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel wird ein attenuiertes Pseudorabiesvirus in Rollflaschen kultiviert, oder das attenuierte Pseudorabiesvirus wird in einer Suspension von Mikroträger-Kügelchen kultiviert oder attenuierte Pseudorabiesvirus wird durch Fermentation in Chargen kultiviert.
Verfahren zur Konstruktion, Auswahl und Aufreinigung erfindungsgemäßer Herpesviren, genau wie Testtechniken zur Bestimmung des Immunstatus von Schweinen nach der Impfung und der sekundären Reaktion nach Kontakt mit Wildtypviren sind im Detail in den nachfolgenden Kapiteln "Material und Methoden" und "Beispiele" beschrieben, die den Umfang der vorliegenden Erfindung, die durch die Ansprüche definiert wird, veranschaulichen, ohne ihn dabei in irgendeiner Form zu beschränken.
MATERIAL UND METHODEN
WACHSTUM DES HERPESVIRUS IN GEWEBEKULTUR. Sämtliche diskutierten Herpesviren wurden in Gewebekultur-Zellen kultiviert. Wenn nicht anders angegeben, wurden folgende Zellen genutzt: Vero-Zellen für PRV; MDBK-Zellen für IBR; CEF-Zellen für HVT; Crandall feline Nieren-Zellen für FHV. Vero-Zellen sind für EHV geeignet und MDCK-Zellen sind für CHV geeignet.
ZUBEREITUNG VON PROBEN EINER HERPESVIRUS-STAMMLÖSUNG. Proben einer Herpesvirus-Stammlösung wurden durch Infektion von Gewebekulturzellen mit einer Infektionsmultiplizität (multiplicity of infection) von 0,01 PFU/Zelle in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hergestellt, das 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 Einheiten/ml Streptomycin (diese Bestandteile wurden von Irvine Scientific oder einem vergleichbaren Lieferanten bezogen und werden hiernach als komplettes DME Medium bezeichnet) sowie 1% fötales Rinderserum enthielt. Nachdem die zytopathische Wirkung vollständig war, wurden Medium und Zellen geerntet und die Zellen wurden bei 3000 Upm während 5 Minuten in einer klinischen Zentrifuge pelletiert. Bei sämtlichen Herpesviren außer HVT wurden die Zellen in 1/10 des ursprünglichen Medienvolumens resuspendiert und ein gleiches Volumen zweimal sterilisierter Magermilch (9% w/v Magermilchpulver in H₂O) wurde zugegeben. Die Virusprobe wurde zweimal eingefroren und aufgetaut, aliquotiert und eingefroren bei –70°C gelagert. Üblicherweise betrug der Titer in etwa 10⁸ Plaque bildende Einheiten (plaque forming units)/ml. Bei HVT wurden die infizierten Zellen in komplettem, 20% fötales Rinderserum und 10% DMSO enthaltenden Medium resuspendiert und eingefroren bei –70°C gelagert.
ZUBEREITUNG VON HERPESVIRUS-DNA. Für die Zubereitung von Herpesvirus-DNA wurde ein konfluenter Monolayer von Gewebekulturzellen in einer 25 cm² Flasche oder einer 60 mm Petrischale mit 100 Mikrolitern der Virusprobe in 1 ml Medium infiziert. Die Adsorption lief während 1–2 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ in Luft ab. Nach der Adsorption wurden 4 ml komplettes DME Medium sowie 1% fötales Rinderserum zugegeben. Nach Inkubation über Nacht, oder nach dem Zeitpunkt, in dem die Zellen 100% zytopathische Wirkung zeigten, wurden die Zellen mit einem Zellschaber (Marke Costar) in das Medium geschabt. Die Zellen und das Medium wurden 5 Minuten bei 3000 UPM in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert. Das Medium wurde dekantiert und der Zellpellet wurde vorsichtig in 0,5 ml einer Lösung resuspendiert, welche 0,01 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA und 0,5% Nonidet P-40 (NP40, ein ionisches Detergens umfassend ein Octylphenolethylenoxidkondensat mit im Schnitt 9 mol Ethylenoxid per Molekül, bezogen von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt. Die Probe wurde bei Raumtemperatur während 10 Minuten inkubiert. Zehn Mikroliter einer Stammlösung von RNase A (Sigma) wurden zugesetzt (die Stammlösung enthielt 10 mg/ml und war 10 Minuten gekocht, um DNase zu inaktivieren). Die Probe wurde 5 Minuten bei 3000 Upm in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert, um die Kerne zu pelletieren. Das DNA-Pellet wurde mit einer Pasteur Pipette oder einem Holzstäbchen entfernt und weggeworfen. Die überstehende Flüssigkeit wurde in ein 1,5 ml Eppendorf Röhrchen mit 25 Mikrolitern 20%-igem Natriumdodecylsulfat (Sigma) und 25 Mikrolitern Proteinase K (10 mg/ml; Lieferant Boehringer Mannheim) dekantiert. Die Probe wurde gemischt und 30–60 Minuten bei 37°C inkubiert. Ein gleiches Volumen von mit Wasser gesättigtem Phenol wurde zugesetzt und die Probe wurde 1 Minute in einem Vortexmischer gemischt. Die Probe wurde während 5 Minuten in einer Eppendorf Minifuge bei höchster Geschwindigkeit zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde in ein frisches Eppendorf Röhrchen gebracht und das zweifache Volumen an absolutem Ethanol von –20°C wurde zugegeben und das Röhrchen 30 Minuten bei –20°C aufbewahrt, um Nukleinsäüre auszufällen. Die Probe wurde 5 Minuten in einer Eppendorf Zentrifuge bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und der Pellet wurde einmal mit kaltem 80%-igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde durch Lyophilisierung getrocknet und in 17 Mikrolitern H₂O rehydriert. Zur Herstellung von größeren Mengen DNA wurde der Maßstab des Verfahrens vergrößert und wurde mit einer 850 cm² Rollflasche Verozellen begonnen. Die DNA wurde in H₂O oder in 0,01 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA bei –20°C oder bei +4°C gelagert.
PHENOLEXTRAKTION. Phenolextraktion wurde an jedem beliebigen Volumen einer DNA-Probe durchgeführt, üblicherweise zwischen 100 Mikrolitern und 1 ml. Die DNA-Probe wurde in 0,01 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA verdünnt und ein gleiches Volumen von mit Wasser gesättigtem Phenol wurde zugesetzt. Die Probe wurde kurz mit einem Vortexmischer gemischt und 3 Minuten in Eis gestellt. Nachdem 3 Minuten in einer Mikrofuge zentrifugiert wurde, wurde die wäßrige Schicht in ein frisches Röhrchen überfuhrt und mit Ethanol gefällt.
ETHANOLFÄLLUNG. Die DNA in einer Probe wurde durch Ethanolfällung konzentriert. Es wurden der DNA-Probe 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 7,5 und das dreifache Volumen kaltes Ethanol zugesetzt. Die DNA wurde 30 Minuten bei –70°C oder über Nacht bei –20°C gefällt und dann durch Zentrifugieren während 15 Minuten bei 4°C in der Mikrofuge pelletiert. Der Pellet wurde einmal mit 200 Mikroliter kaltem 80%-igem Ethanol gewaschen und wieder 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Nachdem an der Luft getrocknet oder gefriertrocknet war, wurden die Pellets wieder in dem geeigneten Puffer oder in H₂O suspendiert.
VERDAU MIT RESTRIKTIONSENZYM. DNA wurde mit Restriktionsenzymen geschnitten, wobei der von dem Hersteller (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT. (IBI), Bethesda Research Laboratones, Bethesda, MD. (BRL) und New England Biolabs, Beverly, MA) empfohlene Puffer verwendet wurde. Wenn möglich, wurde die DNA-Konzentration unter 1 Mikrogram/50 Mikroliter gehalten. Inkubiert wurde 1–4 Stunden bei 37°C.
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE DER DNA. Um das Restriktionsmuster der DNA zu sehen, wurden 5 Mikroliter eines Aufbringpuffers (5× Elektrophoresepuffer, 0,01% Bromphenolblaufarbstoff, 50 mM EDTA und 50% Glycerin) zugesetzt. Die Probe wurde in einer Spur in einer horizontalen Unterwasser-Elektrophorese-Einheit, die ein 0,6%-iges Agarosegel enthielt, aufgebracht. Der Elektrophoresepuffer enthielt 40 mM Tris, 10 mM EDTA, mit Essigsaure auf pH 7,8 eingestellt, mit oder ohne 0,5 Mikrogram/ml Ethidiumbromid. Die Elektrophorese wurde 18 Stunden bei 40–50 V durchgeführt, und das Gel wurde entfernt und 30 Minuten mit 0,5 Mikrogram/ml Ethidiumbromid gefärbt. Die DNA-Banden wurden mit einem UV Transilluminator mit langen Wellenlängen sichtbar gemacht.
PHOSPHATASE-BEHANDLUNG DER DNA. Die Behandlung von DNA mit Phosphatase wurde durch unmittelbare Zugabe von 1 Mikroliter (25 Einheiten) Kälberdarmphosphatase (Boehringer Mannheim) zu den Restriktionsenzymverdau-Reaktionen durchgeführt und die Inkubation 30 Minuten lang bei 37°C fortgesetzt. Die Phosphatase wurde vor der Phenolextraktion 60 Minuten lang bei 65°C inaktiviert.
POLYMERASE AUFFÜLL-REAKTION. DNA wurde in einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris pH 7,4, 50 mM KCI, 5 mM MgCl₂ und 400 Mikromolar jedes der vier Desoxynukleotide enthielt. Zehn Einheiten Klenow DNA-Polymerase (BRL) wurden zugesetzt und die Reaktion durfte 15 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Die DNA wurde anschließend wie oben beschrieben mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
EXONUKLEASE RESEKTIONS-REAKTION. DNA wurde in 100 Mikrolitern 60 mM Tris pH 8,0, 0,66 mM MgCl₂, 1 mM beta-Mercaptoethanol resuspendiert. Die Probe wurde 5 Minuten auf 30°C erwärmt, und 10 Einheiten Lambda Exonuclease III (BRL) wurden zugegeben. In regelmäßigen Zeitabständen (z.B. alle 2,5 Minuten) wurden 10 Mikroliter Aliquots in 100 Mikroliter 30 mM Natriumacetat pH 4,5, 250 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 4 Mikrogram/100 Mikroliter Hefe-tRNA, 30 Einheiten/100 Mikroliter S1-Nuclease verdünnt. Nach 45 Minuten bei 30°C wurden 15 Mikroliter eines Stop-Puffers, bestehend aus 625 mM Tris pH 9,0, 150 mM EDTA, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) zugegeben. Die Proben wurden daraufhin wie oben beschrieben mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA-Verdauungsprodukte wurden anschließend analysiert und mittels Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt.
DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSE MIT PHENOL. Aus bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarose-Gelen ausgeschnittene DNA Banden wurden auf weniger als 0,5% Agarose bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat verdünnt. Die Proben wurden auf 65°C erhitzt, um die Agarose zu schmelzen und anschließend während 5 Minuten auf 37°C gekühlt. Ein gleiches Volumen Phenol wurde zugegeben und die Probe wurde dreimal mit Phenol extrahiert (siehe Abschnitt PHENOLEXTRAKTION). Die DNA wurde anschließend mit Ethanol gefällt und der Pellet wurde bei einer Konzentration von 3–6 fmol DNA/Mikroliter resuspendiert.
LIGATION. DNA wurde durch Einwirkung des Enzyms T4 DNA-Ligase (BRL) kovalent verknüpft. Die Ligationsreaktionen enthielten 10 fmol DNA, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 200 mikromolar ATP und 20 Einheiten T4 DNA Ligase in 10 Mikrolitern Endreaktionsvolumen. Die Ligation durfte 3–16 Stunden lang bei 15°C ablaufen. Üblicherweise wurden DNA-Fragmente, die miteinander gekoppelt werden sollten, in einem gleichen molaren Verhältnis zugegeben. Üblicherweise wurden während der Ligation zwei unterschiedliche DNA Fragmente verknüpft, aber die Verbindung von drei oder vier unterschiedlichen DNAs gleichzeitig war ebenfalls möglich.
ERSTELLUNG EINER DNA-RESTRIKTIONSKARTE. Die Erstellung einer DNA- Restriktionskarte wurde gemäß der genauen Beschreibung von Maniatis et al. (1) durchgeführt. Sobald sie kloniert war, wurde die DNA mit einer Reihe unterschiedlicher Restriktionsenzyme verdaut und die DNAs wurden auf Agarose-Gelen analysiert und die Größe der erhaltenen Fragmente wurde gemessen. Ein Doppelverdau mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen wurde mit der gleichen DNA-Probe durchgeführt, um bei der Interpretation der Spaltungskarten zu helfen. Nach einem anderen angewendeten Verfahren wurde die DNA mit einem Restriktionsenzym geschnitten, das die DNA an einer nur einmal vorkommenden Schnittstelle schneidet, das Ende der DNA mit Hilfe von T4 DNA Kinase oder Klenow DNA Polymerase (siehe Abschnitt POLYMERASE AUFFÜLL-REAKTION) mit ³²P markiert und die DNA anschließend mit weiteren Restriktionsenzymen bei niedriger Temperatur oder für kurze Zeit geschnitten, so daß lediglich ein auftrat. Die anschließende Analyse der Fragmente des partiellen Verdaus auf Agarose-Gelen führte zu einer Einordnung der Restriktionsstellen auf der Karte. All diese Verfahren zur Kartierung werden von Fachleuten gut verstanden und sind von Maniatis et al. (1) genau beschrieben. Die vollständigsten Restriktionskarten können erst dann zusammengestellt werden, wenn die DNA sequenziert worden ist, und die Sequenz wird dann von einem Computer analysiert, wobei dieser nach allen bekannten Restriktionsenzym-Stellen sucht. Einige unserer Restriktionskarten sind anhand von Sequenzinformation hergestellt worden.
SOUTHERN BLOTTING DER DNA. Das allgemeine Verfahren des Southern Blotting wurde Maniatis et al. (1) entnommen. DNA wurde auf Nitrocellulose-Filter (S&S BA85) in 20 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) übertragen (geblottet) und in Hybridisierungslösung, bestehend aus 30%-igem Formamid, 1 × Denhardtscher Lösung (0,02% Polyvinylpyrrolidon (PVP), 0,02% Rinderserumalbumin (BSA), 0,02% Ficoll), 6 × SSC, 50 mM NaH₂PO₄, pH 6,8, 200 Mikrogramm/ml Lachssperma DNA 4–24 Stunden bei 55°C vorhybridisiert. Markierte Sonden-DNA wurde zugesetzt, die durch Nick-Translation mit einem Kit von Bethesda Research Laboratories (BRL) und einem mit ³²P markierten Nukleotid markiert war. Die Sonden-DNA wurde von den nicht eingebauten Nukleotiden mittels einer NACS Säule (BRL) oder einer Sephadex G50 Säule (Pharmacia) getrennt. Nach Hybridisierung über Nacht bei 55°C wurde der Filter einmal bei Raumtemperatur mit 2 × SSC gewaschen, gefolgt von zwei Waschvorgängen bei 55°C mit 0,1 × SSC, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) während 30 Minuten. Das Filter wurde getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen.
DNA TRANSFEKTION, UM REKOMBINANTES VIRUS ZU ERZEUGEN. Das Verfahren basiert auf dem Calciumphosphat-DNA-Ausfällungsverfahren von Graham und Van der Eb (32) mit den folgenden Änderungen. Für die Transfektion in Tierzellen wurden 0,1–0,2 Mikrogramm Plasmid-DNA, die die Fremd-DNA flankiert von geeigneten klonierten Herpesvirus-Sequenzen enthält (der Homovektor), mit 0,3 Mikrogramm intakter DNA gemischt. Beide DNAs wurden in H₂O oder 0,01 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA aufbewahrt und das Endvolumen sollte weniger als 0,25 ml sein. Dieser Mischung wurde ein gleiches Volumen 2× mit HEPES gepufferter Salzlösung zugesetzt (10 g N-2-Hydroxyethyl-piperazinol-N'-ethansulfonsäure (HEPES), 16 g NaCl, 0,74 g KCl, 0,25 g Na₂HPO₄·2H₂O, 2 g Dextrose per Liter H₂O, und mit NaOH auf pH 7,4 gepuffert). Die Mischung wurde daraufhin durch Zugabe von dem geeigneten Volumen 1× mit HEPES gepufferter Salzlösung (hergestellt durch 1:1 Verdünnung der obigen Lösung mit H₂O) auf 0,5 ml verdünnt. Nach Vermischen wurden der DNA-Mischung 35 Mikroliter 2,2 M CaCl₂ zugesetzt und gemischt.
Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Medium wurde von einem 80% konfluenten Monolayer von in einer 25 cm² Flasche wachsenden Kaninchenhautzellen, Verozellen oder CEF Zellen entfernt, und die DNA Mischung wurde der Flasche zugegeben und über die Zellen verteilt. Nach Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden 5 ml komplettes DME Medium mit 10% fötalem Rinderserum zugegeben. Die Zellen wurden 5 Stunden lang bei 37°C in einem befeuchteten, 5% CO₂ in Luft enthaltenden Inkubator inkubiert. Das Medium wurde nach 5 Stunden mit oder ohne Glycerin-Shock ausgetauscht. Wenn genutzt, bestand der Glycerin-Shock aus der Entfernung des Mediums und der Zugabe von DME mit 20% Glycerin während 3 Minuten bei Raumtemperatur, einem anschließenden Waschvorgang mit 10% Glycerin in DME und einem Waschvorgang mit 5% Glycerin in DME, gefolgt von der Zugabe von frischem komplettem DME Medium mit 10% fötalem Rinderserum. Die Zellen wurden 3–4 Tage bei 37°C wie oben inkubiert, bis ein zytopathischer Effekt des Virus von 50–100% vorlag. Virus wurde, wie vorstehend für die Zubereitung der Virusstammlösung beschrieben, geerntet. Diese Stammlösung wurde als Transfektionsstammlösung bezeichnet und wurde anschließend auf rekombinantes Virus untersucht, wobei entwedeer ein hiernach beschriebenes Selektionsverfahren zur Anreicherung der rekombinanten Kolonien angewandt wurde oder nicht.
DIREKTES LIGATIONSVERFAHREN ZUR ERZEUGUNG VON REKOMBINANTEN HERPESVIREN. Anstatt Homovektoren zu benutzen und sich bei der Erzeugung von rekombinantem Virus auf die homologe Rekombination zu verlassen, wurde für die Insertion von fremden Genen in Herpesviren die Technik der direkten Ligation entwickelt. Bei dieser Alternative benötigte das klonierte fremde Gen keine flankierenden Herpesvirus-DNA-Sequenzen, sondern war es lediglich erforderlich, daß Restriktionsstellen verfügbar sind, um das fremde Gen-Fragment aus dem Plasmid-Vektor zu schneiden. Ein kompatibles Restriktionsenzym wurde benutzt, um die Herpesvirus-DNA zu schneiden. Es war ein Erfordernis dieser Technik, daß das Restriktionsenzym, das verwendet wird, um die Herpesvirus-DNA zu schneiden, bei einer beschränkten Zahl von Stellen schneiden muß, bevorzugt bei weniger als 3 Stellen. Für PRV-DNA haben wir xbaI benutzt, das PRV-DNA an zwei Stellen schneidet, und überlegen die Benutzung von HindIII (2 Schnittstellen), EcoRV (2 oder 3 Schnittstellen) oder NdeI (3–5 Schnittstellen). Die Herpesvirus-DNA wurde mit einem 30-fachen molaren Überschuss von Plasmid-DNA vermischt und die Mischung wurde mit dem geeigneten Restriktionsenzym aufgeschlossen. Die DNA-Mischung wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, um die Restriktionsenzyme zu entfernen, und gemäß dem vorstehend genau beschriebenen Ligationsverfahren gekoppelt. Die ligierte DNA-Mischung wurde dann mit Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 298 Mikroliter 0,01 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA resuspendiert. Es wurden 42 Mikroliter 2 M CaCl₂ zugegeben, danach ein gleiches Volumen 1× HEPES gepufferter Salzlösung (siehe oben), und die Probe wurde benutzt, um Tierzellen wie vorstehend beschrieben zu transfizieren.
Das Virus in der Transfektionsstammlösung wurde dann auf die Anwesenheit von Fremd-DNA Insertionen untersucht, wie hiernach beschrieben wird. Der Vorteil der direkten Ligationstechnik bestand darin, daß weniger Subklone in Plasmiden konstruiert werden mußten, und daß das rekombinante Virus in der Transfektionsstammlösung mit einer viel höheren Häufigkeit als bei der homologen Rekombination vorlag.
HAT-SELEKTION VON THYMIDINKINASE EXPRIMIERENDEM REKOMBINANTEN HERPESVIRUS. Deletionsmutanten von Herpesviren mit Deletionen in dem Thymidinkinase (TK)-Gen wurden konstruiert. Diese PRV-Stämme sind mit S-PRV-002 und S-PRV-003 bezeichnet und bei der ATCC unter den jeweiligen Zugangsnummern VR 2107 bzw. VR 2108 hinterlegt worden. Diese TK Minus (TK-)Viren sind als Empfänger für die Insertion des fremden Herpes simplex Typ 1 (HSV-1) TK-Gens benutzt worden. Ein von uns genutztes HSV-1 TK-Gen enthält den HSV-1 ICP4-Promotor und stammte von B. Roizman (16). Es wurde durch Subklonierung zwischen zwei flankierenden Bereichen in der PRV-DNA positioniert, z.B. durch Insertion des TK-Gens in das PRV BamHI #5-Fragment zwischen der XbaI- und der HpaI- Schnittstelle. Das Plasmid-Konstrukt wurde dann mit PRV-TK-DNA transfiziert, um so rekombinantes Virus zu erzeugen. Die Transfektionsstammlösung wurde in bezug auf TK-enthaltendes Virus mittels des in (35) beschriebenen HAT-Selektionsverfahrens angereichert. Die Transfektionsstammlösung wurde genutzt, um Monolayer von 143 TK-Zellen in 60 mm Kulturschalen zu infizieren, welche vorher 16 Stunden bei 37°C in HAT Medium inkubiert wurden (HAT Medium: Medium 199 enthaltend 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 Einheiten/ml Streptomycin, 10% fötales Rinderserum, 5 × 10^–5 M Hypoxanthin, 10^–5 M Thymidin, 5 × 10^–6 M Aminopterin). Die 143 TK-Zellen wurden mit Proben des Transfektionsstammlösungs-Virus in Virus-Verdünnungen von 10^–3 bis 10^–7 infiziert. Nach 1 oder 2 Tagen bei 37°C wurden die Schalen, die mit der höchsten Virusverdünnung inokuliert waren und noch immer Virus-Kolonien zeigten, geerntet und die Selektion wurde ein zweites Mal wiederholt. Die nach der zweiten HAT Selektion geerntete Virusstammlösung wurde in einem Plaque-Test benutzt, und individuelle Kolonien wurden gemäß einem unten beschriebenen Verfahren aufgenommen und auf Fremd-DNA-Inserts getestet.
BROMDESOXYURIDIN SELEKTION VON REKOMBINANTEM HERPESVIRUS. Um ein Fremdgen anstelle eines bereits im Herpesvirusgenom vorhandenen TK-Gens einzufügen, wurde das Fremdgen in Plasmide kloniert, so daß es die gleichen flankierenden Homologiebereiche wie die TK-Gene enthielt. Diese flankierenden Bereiche konnten Bestandteil des TK-Gens selber sein, oder Teile des Herpesvirus, die das TK-Gen flankieren. In jedem Fall wurde die das Fremdgen enthaltende Plasmid-DNA zusammen mit intakter, das HSV-1 TK-Gen enthaltender genomischer Herpesvirus-DNA transfiziert. Die Transfektionsstammlösung des rekombinanten Virus wurde für zwei Selektionen in 143 TK-Zellen in Anwesenheit von 40 Mikrogramm/ml Bromdesoxyuridin (BUDR, Sigma) in komplettem DME Medium mit 10% fötalem Rinderserum kultiviert. Der Wirkstoff BUDR ist ein Thymidin-Analogon, das von dem Virusenzym Thymidinkinase (TK) erkannt und letztendlich in die DNA eingebaut wird. Wenn es in der DNA eingebaut ist, wirkt BUDR mutagen und lethal und die Substanz macht es auf dieser Weise möglich, Viren mit einem aktiven TK-Gen auszuselektieren. Durch dieses Selektionsverfahren wurden solche Viren in der Population angereichert, die durch homologe Rekombination ihr TK-Gen gegen ein Fremdgen ausgetauscht hatten. Ein Screening auf rekombinante Viren wurde nach einem der hiernach beschriebenen Verfahren durchgeführt.
SCREENING AUF REKOMBINANTES HERPESVIRUS MITTELS HYBRIDISIERUNG. Eines der benutzten Verfahren ist in (36) beschrieben. Die Technik umfaßte die Durchführung eines Plaque-Tests auf PRV unter Agarose, die Entfernung der Agarose, sobald sich Kolonien gebildet hatten, und die Anhebung der Zell-Monolayer von der Schale auf ein Nitrocellulose Membranfilter. Der Filter unterlag dann dem vorher detailliert beschriebenen Southern Verfahrens zur DNA-Hybridisierung. Die bei dem Verfahren verwendete DNA-Sonde wurde aus dem in das Virus eingefügten Fremdgen hergestellt. So wurden Kolonien, die das Fremdgen enthielten, identifiziert, und diese wurden von der abdeckenden Agaroseschicht, die aufbewahrt worden war, ausgewählt.
SCREENING AUF REKOMBINANTES HERPESVIRUS MIT BLUOGAL. Wenn das Fremdgen das Enzym beta-Galactosidase kodierte, wurden die Kolonien, die das Gen enthielten, leichter visualisiert. Die Chemikalie Bluogal^TM (BRL) wurde während des Plaque-Tests in der Größenordnung von 200–300 Mikrogramm/ml in die abdeckende Agaroseschicht aufgenommen und die Kolonien, die aktive beta-Galactosidase exprimierten, nahmen eine blaue Farbe an. Die blauen Kolonien wurden dann ausgewählt und mit weiteren Isolierungsschritten blauer Kolonien gereinigt. Andere Fremdgene wurden durch homologe Rekombination so eingefügt, daß sie das beta-Galactosidase-Gen ersetzten; in diesem Fall wurden die nicht-blauen Kolonien für die Reinigung des rekombinanten Virus ausgewählt.
SCREENING AUF REKOMBINANTES HERPESVIRUS MIT ANTIKÖRPERN. Es war eine dritte Methode, um die Stammlösung des rekombinanten Virus zu untersuchen, auf direkte Weise mit Antikörpern nach der Expression des Fremdgens zu suchen. Herpesvirus-Kolonien wurden identifiziert und durch Einstecken eines Zahnstochers durch die Agarose über der Kolonie und durch Schaben der Koloniefläche auf die Platte aufgenommen. Die Viren wurden dann durch Einstecken des Zahnstochers in ein Loch einer 96-Loch-Mikrotiterplatte (Falcon Plastics) von dem Zahnstocher gespült, wobei das Loch einen konfluenten Monolayer von Gewebekulturzellen enthielt, die dreimal mit DME-Medium ohne Serum gewaschen wurden. Es war wichtig, daß das Virus in dieser Phase ohne Serum wuchs, damit der Ablauf der immunologischen Prozesse ermöglicht wird. Nachdem die zytopathische Wirkung vollständig war, wurden die Platten bei –70°C gelagert, um die Zellen einzufrieren und zu lysieren. Das Medium wurde aufgetaut und das Einfrier/Auftau-Verfahren wurde ein zweites Mal wiederholt. Dann wurden 50–100 Mikroliter des Mediums aus jedem Loch genommen und unter Vakuum durch eine Nitrocellulosemembran (S&S BA85) unter Anwendung eines DotBlot^TM Gerätes (BRL) filtriert. Die Filterblots wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einer blockierenden Lösung von 0,01 M Tris pH 7,5, 0,1 M NaCl, 3% Rinderserumalbumin unter Schütteln eingeweicht. Der Filter wurde anschließend in eine versiegelbaren Tasche (Sears Seal-A-Meal oder ein Äquivalent) gebracht und 10 ml der blockierenden Lösung, die 10 Mikroliter eines für das Fremdprotein spezifischen Antikörpers enthielten, wurden hinzugefügt. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln wurde der Filter dreimal mit 100 ml 0,01 M Tris, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween 20-Detergens (Sigma) gewaschen. Das Filter wurde in eine weitere versiegelbare Tasche gebracht und 10 ml blockierende Lösung, enthaltend 10⁶ Zählungen (counts) pro minute ¹²⁵I-Protein A (New England Nuclear), wurden zugefügt. Nachdem dem Protein A 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Schütteln an den Antikörper binden konnte, wurde der Filter wie vorher gewaschen, getrocknet und mit einem Röntgenfilm und einem verstärkenden Schirm (intensifying screen, Dupont) abgedeckt und I–3 Tagen bei –70°C autoradiographiert. Der Film wurde nach Standardverfahren entwickelt. Virus aus den positiven Löchern, welche das rekombinante Virus enthielten, wurden weiter gereinigt.
WESTERN BLOTTING VERFAHREN. Proben der Zellysate, positive Kontrollen und Proteinstandards wurden auf einem Polyacrylamidgel nach dem Verfahren von Laemmli (42) laufen gelassen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in einem Transferpuffer (0,025 M Trisbase, 0,192 M Glycin, 20% Methanol) mit 0,1% SDS 20 Minuten lang eingeweicht. Das Sammelgel wurde entfernt und das Trenngel wurde auf Whatman 3 mm Papier gebracht. Ein Stück Nitrocellulosefilter von der gleichen Größe wurde mit dem Transferpuffer vorbenetzt und auf das Polyacrylamidgel gebracht, so daß das Gel vollständig abgedeckt wurde und ein enger Kontakt zustande kam. Ein vorbenetztes Stück Whatman 3 mm Papier wurde oben auf den Nitrocellulosefilter gebracht, um einen "Sandwich" zu erzeugen, und das Sandwich wurde in eine Elektrophorese-Transfer-Vorrichtung (Biorad) gebracht. Das Sandwich wurde vollständig in Transferpuffer eingetaucht. Der elektrophoretische Transfer wurde 3 Stunden bei 250 mA durchgeführt. Nach dem Transfer wurde das Nitrocellulosefilter aus der Anordnung genommen und in eine Schale mit 50 ml blockierendem Puffer gebracht (50 mg/ml Rinderserumalbumin, 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Kaliumchlorid, 1 mM Calciumchlorid, 10 mM Imidazol pH 7,0, 0,3% Tween-20, 0,02% Natriumazid). Der Nitrocellulosefilter wurde 1–2 Stunden lang in dem blockierenden Puffer bei Raumtemperatur auf einem Schüttelgerät inkubiert. Der Filter wurde dann in eine versiegelbare, 15 ml blockierenden Puffer mit dem spezifischen Antiserum als Sonde enthaltende Tasche gebracht und über Nacht bei 37°C auf einem Schüttelgerät inkubiert. Der Filter wurde dann aus der Lösung mit der Sonde entfernt und mit 5- bis 6-maligem Wechseln der mit Phosphat gepufferten Salzlösung über einem Zeitraum von 1 Stunde gespült. Die mit Phosphat gepufferte Salzlösung wurde entfernt und 50 ml blockierender Puffer, enthaltend 5 × 105 cpm ¹²⁵I markiertes Protein A (Amersham) wurde zugefügt. Der Filter wurde 1 Stunde mit der Lösung mit markiertem Protein A inkubiert, die markierte Protein A-Lösung wurde entfernt und der Filter wurde mit 5–6-maligem Wechseln der 0,3% Tween-20 enthaltenden, mit Phosphat gepufferten Salzlösung gespült Der Filter wurde an der Luft getrocknet und über Nacht mit einem verstärkenden Schirm autoradiographiert.
VERFAHREN ZUR cDNA-KLONIERUNG VON SCHWEINEROTAVIRUS-gp38-GEN. Virus Wachstum. Der OSU-Stamm von Schweinerotavirus (ATCC VR-892) wurde in MA-104-Zellen (Rhesusaffen-Nierenzellen von MA Bioproducts) kultiviert. Konfluente Monolayer wurden bei einer Infektionsmultiplizität von mehr als 10 in 5 Mikrogramm/ml Trypsin enthaltendem DMEM infiziert. Zellen wurden 48 Stunden lang, oder bis eine zytopathische Wirkung eintrat, mit dem Virus inkubiert. Medien und Zellreste wurden gesammelt und 20 Minuten lang bei 4°C und 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand mit dem Rotavirus wurde anschließend bei 10.000 g in einem präparativen Beckman Ti45 Rotor bei 4°C zentrifugiert. Virus-Pellets wurden in SM Medium (50 mM Tris-HCI pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂) resuspendiert und in einem Homogenisator vom Typ Dounce leicht homogenisiert. Das resuspendierte Virus wurde 10 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert und dann auf einen 25–50% CsCl Gradienten in SM-Puffer aufgetragen. Die Gradienten wurden 4 Stunden lang bei 20°C und 100.000 g zentrifugiert. Die zwei blau-weiße Banden, welche die intakten Virionen und Kerne des Rotavirus darstellen, wurden gesammelt, verdünnt und das CsCl-Gradienten-Verfahren wurde ein zweites Mal wiederholt. Von dem zweiten Gradienten erhaltenes Virus wurde über Nacht bei 4°C gegen SM-Puffer dialysiert.
Isolierung von Virus-RNA. Dialysiertes Schweinerotavirus wurde zweimal mit einem gleichen Volumen SDS/Phenol extrahiert, danach zwei weitere Male mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1). Die doppelsträngige RNA wurde mit Ethanol in Anwesenheit von 0,2 M Natriumacetat ausgefällt, zentrifugiert und in Wasser resuspendiert. Die Ausbeute war typischerweise 100 Mikrogramm aus 1.000 cm² infizierter Zellen.
Synthese und Klonierung von gp38 cDNA. 160 Mikrogramm der nach der oben beschriebenen Arbeitsweise erhaltenen Doppelstrang-Schweinerotavirus-RNA wurden mit jeweils einem Mikrogramm der zwei synthetischen Oligonukleotidprimer in einem Volumen von 160 Mikrolitern gemischt (die Sequenzen der Primer waren: 5'-GGGAATTCTGCAGGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3' und 5'-GGGAATTCTGCAGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTTTGGCTA-3'), hergeleitet aus der veröffentlichten Sequenz des Rinderrotavirus (24). Die RNA-Primer-Mischung wurde 3 Minuten lang in einem Wasserbad gekocht und danach auf Eis gekühlt. Nacheinander wurden 25 Mikroliter 1 M Tris-HCl pH 8,3, 35 Mikroliter 1 M KCl, 10 Mikroliter 0,25 M MgCl₂, 7 Mikroliter 0,7 M 2-Mercaptoethanol, 7 Mikroliter 20 mM dNTP's und 6 Mikroliter Reverse Transkriptase (100 Einheiten) zugegeben. Die Reaktion wurde 1,5 Stunde bei 42°C inkubiert, danach wurden 10 Mikroliter 0,5 M EDTA pH 8,0 zugesetzt und die Lösung wurde einmal mit Chloroform: Phenol (1:1) extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde entfernt und es wurden dazu 250 Mikroliter 4 M Ammoniumacetat und 1.0 ml 95%-iger Ethanol gegeben, die Mischung wurde in Trockeneis eingefroren und in der Kälte zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 100 Mikrolitern 10 mM Tris-HCl pH 7,5 resuspendiert, und das Ammoniumacetat-Ausfällungsverfahren wurde wiederholt. Das Pellet wurde in 100 Mikrolitern 0,3 M KOH resuspendiert und zunächst über Nacht bei Raumtemperatur und anschließend 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde durch Zugabe von 10 Mikrolitern 3,0 M HCl und 25 Mikrolitern 1,0 M Tris-HCl pH 7,5 auf einen neutralen pH-Wert gebracht. Die erhaltene Einzelstrang-cDNA wurde daraufhin zwei Mal mittels dem vorher beschriebenen Ammoniumacetat-Ethanol-Verfahren ausgefällt. Das erhaltene Pellet wurde in 50 Mikroliter 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA resuspendiert, 2 Minuten in einem Wasserbad gekocht und anschließend 16 Stunden bei 59°C inkubiert. Die Lösung wurde bis zu einem Volumen von 15 Mikrolitern lyophilisiert und die erhaltene doppelsträngige cDNA auf einem 1,0%-igem Agarose-Gel (Sigma Agarose Typ II) laufen gelassen. Die mit Ethidiumbromid gefärbte, bei einer Länge von 1.000–1.100 bp wandernde DNA wurde aus dem Gel ausgeschnitten und in einer CBS Elektroelutionsanlage elektroeluiert. Die Lösung wurde lyophilisiert und die cDNA wurde in 25 Mikroliter Wasser resuspendiert. Dieser Lösung wurden 2 Mikroliter 1,0 M Tris-HCl pH 7,5, 2 Mikroliter 1 M KCl, 1 Mikroliter 0,25 M MgCl₂, 1 Mikroliter 20 mM dNTP's und 5 Einheiten E. coli DNA Polymerase I zugegeben. Die Reaktion wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann wie vorstehend beschrieben mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Ammoniumacetat-Ethanol ausgefällt. Das Ende der erhaltenen cDNA wurde unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidtransferase (Puffer und Enzym von BRL) mit einer dCTP-Gruppe verlängert. Die Reaktion wurde mit 2 Mikroliter 0,5 M EDTA beendet, mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Natriumacetat in Anwesenheit von 10 Mikrogramm Träger-tRNA ausgefällt. Die resuspendierte cDNA wurde mit 200 ng mit PstI geschnittenem, mit dGMP verlängertem pBR322 (BRL Katalog #5355SA) in 200 Mikroliter 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA gemischt und zunächst 5 Minuten bei 65°C, danach 2 Stunden bei 57°C erwärmt. Der angelagerte cDNA-Vektor pBR322 wurde auf E. coli DH-1-Zellen, die für hocheffiziente Transformation vorbereitet waren, transformiert. Kolonien, die Ampicillin-Empfindlichkeit und Tetracyclin-Resistenz zeigten, wurden kultiviert, und DNA wurde isoliert und mit PstI geschnitten, um die Größe des cDNA-Inserts zu bestimmen. Verschiedene Klone mit PstI-Inserts von 1.050–1.100 Basenpaaren wurden analysiert, wobei ein identisches Restriktionsmuster festgestellt wurde. Der größte Klon wurde als pSY565 bezeichnet und ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer 53,340 hinterlegt worden. Für einen dieser Klone wurde das 1.100 Basenpaare große PstI-Insert in einem M13 Phagen Sequenzierungsvektor subkloniert. Die gesamte DNA-Sequenz dieses Klons wurde bestimmt und ist in 10A und 10B dargestellt. Die Position des offenen Leserasters für gp38 wurde aus der Homologie der Aminosäuren mit bereits veröffentlichten Menschen- und Rindersequenzen (44) bestimmt.
VERFAHREN ZUR cDNA-KLONIERUNG VON RINDERROTAVIRUS-gp38-GEN. Virus Wachstum. Der Calf Nebraska-Stamm von Rinderrotavirus (USDA) wurde in MA-104-Zellen (Rhesusaffen-Nierenzellen von MA Bioproducts) kultiviert. Konfluente Monolayer wurden bei einer Infektionsmultiplizität von mehr als 10 in 5 Mikrogram/ml Trypsin enthaltendem DMEM infiziert. Zellen wurden 48 Stunden lang oder bis eine zytopathische Wirkung eintrat mit dem Virus inkubiert. Medien und Zellreste wurden gesammelt und 20 Minuten lang bei 4°C und 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand mit dem Rotavirus wurde anschließend bei 10.000 g in einem präparativen Beckman Ti45 Rotor bei 4°C zentrifugiert. Virus Pellets wurden in SM Medium (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂) resuspendiert und in einem Homogenisator vom Dounce-Typ leicht homogenisiert. Das resuspendierte Virus wurde 10 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert und dann auf 25–50% CsCl Gradienten in SM-Puffer aufgetragen. Die Gradienten wurden 4 Stunden lang bei 20°C und 100.000 g zentrifugiert. Die zwei blau-weiße Banden, welche die intakten Virionen und Kerne des Rotavirus darstellten, wurden gesammelt, verdünnt und das CsCl-Gradienten-Verfahren wurde ein zweites Mal wiederholt. Von dem zweiten Gradienten erhaltenes Virus wurde über Nacht bei 4°C gegen SM-Puffer dialysiert.
Isolierung von Virus-RNA. Dialysiertes Rinderrotavirus wurde zweimal mit einem gleichen Volumen SDS/Phenol extrahiert, danach zwei weitere Male mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1). Die doppelsträngige RNA wurde mit Ethanol in Anwesenheit von 0,2 M Natriumacetat ausgefällt, zentrifugiert und in Wasser resuspendiert. Die Ausbeute war typischerweise 100 Mikrogramm aus 1.000 cm² infizierten Zellen.
Synthese und Klonierung von gp38 cDNA. 160 Mikrogramm der nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Doppelstrang-Rinderrotavirus-RNA wurden mit jeweils einem Mikrogramm von zwei synthetischen Oligonukleotidprimern in einem Volumen von 160 Mikroliter gemischt (die Sequenzen der Primer waren: 5'-GGGAATTCTGCAGGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3' und 5'-GGGAATTCTGCAGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTTTGGCTA-3') hergeleitet aus der veröffentlichten Sequenz des Rinderrotavirus (24). Die RNA-Primer-Mischung wurde 3 Minuten lang in einem Wasserbad gekocht und danach auf Eis gekühlt. Nacheinander wurden 25 Mikroliter 1 M Tris-HCI pH 8,3, 35 Mikroliter 1 M KCl, 10 Mikroliter 0,25 M MgCl₂, 7 Mikroliter 0,7 M 2-Mercaptoethanol, 7 Mikroliter 20 mM dNTP's und 6 Mikroliter Reverse Transkriptase (100 Einheiten) zugegeben. Die Reaktion wurde 1,5 Stunde bei 42°C inkubiert, danach wurden 10 Mikroliter 0,5 M EDTA pH 8,0 zugesetzt und die Lösung wurde einmal mit Chloroform:Phenol (1:1) extrahiert. Der wäßrige Schicht wurde entfernt und es wurden dazu 250 Mikroliter 4 M Ammoniumacetat und 1.0 ml 95%-iger Ethanol gegeben, die Mischung wurde in Trockeneis eingefroren und in der Kälte zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 100 Mikrolitern 10 mM Tris-HCl pH 7,5 resuspendiert und die Ammoniumacetat-Ausfällungsprozedur wurde wiederholt. Das Pellet wurde in 100 Mikrolitern 0,3 M KOH resuspendiert und zunächst über Nacht bei Raumtemperatur und anschließend 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde durch Zugabe von 10 Mikrolitern 3,0 M HCl und 25 Mikrolitern 1,0 M Tris-HCl pH 7,5 auf einen neutralen pH-Wert gebracht. Die erhaltene Einzelstrang-cDNA wurde daraufhin zweimal mit dem vorher beschriebenen Ammoniumacetat-Ethanol-Verfahren ausgefällt. Das erhaltene Pellet wurde in 50 Mikrolitern 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA resuspendiert, 2 Minuten in einem Wasserbad gekocht und anschließend 16 Stunden bei 59°C inkubiert. Die Lösung wurde bis zu einem Volumen von 15 Mikrolitern lyophilisiert und die erhaltene doppelsträngige cDNA auf einem 1,0%-igen Agarose-Gel (Sigma Agarose Typ III) laufen gelassen. Die mit Ethidiumbromid gefärbte, bei einer Länge von 1.000–1.100 bp wandernde DNA wurde aus dem Gel ausgeschnitten und in einer CBS Elektroelutionsanlage elektroeluiert. Die Lösung wurde lyophilisiert und die cDNA wurde in 25 Mikroliter Wasser resuspendiert. Dieser Lösung wurden 2 Mikroliter 1,0 M Tris-HCl pH 7,5, 2 Mikroliter 1 M KCl, 1 Mikroliter 0,25 M MgCl₂, 1 Mikroliter 20 mM dNTP's und 5 Einheiten E. coli DNA Polymerase I zugegeben. Die Reaktion wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann wie vorstehend beschrieben mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Ammoniumacetat-Ethanol ausgefällt. Das Ende der erhaltenen cDNA wurde unter Verwendung von Terminaler Desoxynukleotidtransferase (verwendete Puffer und Enzym von BRL) mit einer dCTP-Gruppe verlängert. Die Reaktion wurde mit 2 Mikrolitera 0,5 M EDTA beendet, mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Natriumacetat in Anwesenheit von 10 Mikrogramm Träger-tRNA ausgefällt. Die resuspendierte cDNA wurde mit 200 ng mit PstI geschnittenem, mit dGMP verlängertem pBR322 (BRL Katalog #5355SA) in 200 Mikrolitern 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA gemischt und zunächst 5 Minuten bei 65°C, danach 2 Stunden bei 57°C erwärmt. Für hocheffiziente Transformation vorbereitete E. coli DH-1-Zellen wurden mit dem angelagerten cDNA-Vektor pBR322 transformiert. Kolonien, die Ampicillin-Empfindlichkeit und Tetracyclin-Resistenz zeigten, wurden kultiviert, und DNA wurde isoliert und mit PstI geschnitten, um die Größe des cDNA-Inserts zu bestimmen. Verschiedene Klone mit PstI-Inserts von 1.050–1.100 Basenpaaren Länge wurden analysiert, wobei ein identisches Restriktionsmuster festgestellt wurde. Für einen dieser Klone wurde das 1.100 Basenpaare große PstI-Insert in einem M13 Phagen Sequenzierungsvektor subkloniert. Ein Teil der DNA-Sequenz dieses Klons wurde bestimmt und es wurde festgestellt, daß sie mit der veröffentlichten Sequenz (24) übereinstimmt.
SELEKTION VON HERPESVIRUS MIT RESISTENZ GEGEN G418. Das Antibiotikum G418 (GIBCO) weist in einem breiten Bereich eine die Proteinsynthese hemmende Aktivität auf. Das rekombinante Virus exprimierte jedoch, nach Aufnahme dieses Fremdgens, die durch das NEO-Gen kodierte Aminoglykosid 3'-Phosphotransferase und wurde gegen G418 resistent. Die Transfektionsstammlösung der rekombinanten Viren wurden auf MDBK-(für IBR-Virus), Vero-(für PRV) oder QT35-(für HVT)Zellen in Anwesenheit von 500 Mikrogramm/ml G418 in komplettem DME Medium plus 1% fötalem Rinderserum kultiviert. Nach einem oder zwei Tagen bei 37°C wurden Kolonien von den Platten, die mit der höchsten Virusverdünnung inokuliert worden waren, ausgewählt, um Virusstammlösungen zu erhalten. Die Selektion wurde ein zweites oder drittes Mal wiederholt. Die aus der G418-Selektion erzeugten Virusstammlösungen wurden mittels der vorher im Abschnitt SOUTHERN BLOTTING DER DNA beschriebenen Hybridisierungsmethode auf NEO-Gen-Insertion untersucht.
REINIGUNG VON gpX. gpX wurde aus dem Gewebekulturmedium von in komplettem DME plus 1% fötalem Rinderserum kultivierten, infizierten Vero-Zellen gereinigt. Konfluente Vero-Zellen wurden bei einer Infektionsmultiplizität von 5 mit dem Wildtyp Iowa S-62 Pseudorabies-Virus-Stamm infiziert. Die Virus-Proteine wurden 8 Stunden nach der Infektion mit ¹⁴C-Glucosamin und/oder ³⁵S-Methionin durch Zugabe der geeigneten Markierung in die Flasche radioaktiv markiert. Die Zellen und die Medien wurden 20 Stunden nach der Infektion geerntet, als die Zellen einen erheblichen zytopathischen Effekt zeigten, und die Flüssigkeiten wurden zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde 10× konzentriert und gegen 0,02 M Natriumsulfat/0,01 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2 (16 Stunden, 0°C), und anschließend gegen zweimal ausgetauschten 0,01 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2 (24 Stunden, 0°C) dialysiert Das Dialysat wurde 30 Minuten lang bei 0°C mit 70%-iger Perchlorsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,2 M Perchlorsäure behandelt, danach 25 Minuten lang bei 10.000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde danach gegen 0,02 M Tris, pH 8,5 dialysiert.
Die Reinigung wurde durch High Performance Liquid Chromatography mit einem Beckman-Gerät Modell 334 HPLC durchgeführt.
Die säurelöslichen Proteine wurden auf einer Biogel TSK DEAE 5-PW Säule (75 × 75 mm) mit einem linearen Gradienten 60 Minuten bei einer Flußrate von 0,8 ml/Min getrennt. Der Startpuffer war 0,02 M Tris, pH 8,5, Endpuffer war 0,02 M Tris, pH 7,0, das 0,75 M NaCl enthielt.
Das gpX eluierte als Haupt-radioaktiver Peak bei 64% des Endpuffers. Das gewonnene Material stellte 25% der aufgebrachten Radioaktivität dar.
ELISA BESTIMMUNG. Ein Standard "enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)"-Protokoll wurde verwendet, um den Immunstatus von Schweinen nach Impfung und Kontrollinfektion zu bestimmen.
Eine gereinigte gpX Antigen-Lösung (40 Mikroliter) durfte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur an die Vertiefungen (wells) von Polycarbonat-Mikrotiter-Platten adsorbieren. Das Antigen wurde in einem (0,015 M) Carbonat–(0,04 M) Bicarbonat-Puffer, pH 9,6 aufgebracht. Die beschichteten Vertiefungen wurden dreimal mit ELISA-Waschlösung (0,05% Tween 20, nicht-ionisches Detergens, enthaltende Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,5) gewaschen.
Vierzig Mikroliter gpX-Antikörper enthaltendes Serum (1 zu 10 verdünnt in Tris-Puffer, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,05% Tween 20) wurden in die Vertiefungen gegeben und 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Das Antiserum wurde entfernt und die Vertiefungen wurden dreimal mit ELISA-Waschlösung gewaschen. Eine Lösung, die Staphylokokken Protein A gekoppelt an Meerrettich-Peroxidase (Bio-Rad) (1:10.000 in dem vorher beschriebenen Tris/BSA/Tween-Puffer verdünnt) enthielt, wurde zugesetzt (50 Mikroliter), um die Vertiefungen, die Antikörper gegen das spezifische Antigen enthielten, zu visualisieren. Die Lösung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert, danach entfernt und die Vertiefungen wurden dreimal mit ELISA-Waschlösung gewaschen. 100 Mikroliter der Substratlösung (gleiche Volumina Wasserstoffperoxyd und ATBS-Pufifer (Bio-Rad)) wurden jeder Vertiefung zugesetzt und die Farbe durfte sich 20 Minuten lang entwickeln.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 Mikroliter 0,01 M Oxalsäure beendet. Die Farbe wurde bei einer Absorption (A) von 410 nm auf einem automatischen Plattenleser gemessen.
VAKZINATIONSSTUDIEN IN SCHWEINEN. Abgestillte Schweine (4–6 Wochen alt) und schwangere Säue wurden aus Schweineherden bezogen, von denen man wußte, daß sie frei von der Pseudorabies Krankheit waren. Die Empfindlichkeit der Versuchstiere in bezug auf Pseudorabies wurde weiter anhand einer Überprüfung des Schweineserums auf Abwesenheit von neutralisierenden Antikörpern gegen Pseudorabiesvirus (PRV) verifiziert. Die abgestillten Schweine und 3–4 Tage alte Ferkel wurden intramuskulär mit 1 ml von etwa 10⁴ bis 10⁶ infektiöse Einheiten (TCID₅₀) enthaltender Virusflüssigkeit inokuliert. Die Tiere wurden nach der Impfung täglich in bezug auf Gegenreaktionen (klinische Zeichen der PRV Krankheit) beobachtet, und die Körpertemperaturen wurden gemessen. Tonsillenabstriche wurden vorgenommen und kultiviert, um zu bestimmen, ob das Virus in der Vakzine ausgeschieden und auf andere Tiere übertragen werden konnte. Die Immunität wurde durch wöchentliche Messung der Menge an Antikörper gegen PRV im Serum bestimmt und in einigen Fällen durch Kontrollinfektion der geimpften Tiere mit virulentem Virus. Im letzteren Fall wurden die geimpften Tiere und eine Gruppe nicht-geimpfter Schweine mit virulentem PRV vom Iowa S-62-Stamm inokuliert, wobei eine solche Virusmenge verwendet wurde, die die PRV-Krankheit bei wenigstens 80% der Schweine in der nicht geimpften Gruppe verursachte. Dies wurde etwa 28 Tage nach der Impfung durchgeführt. Die zur Kontrolle infizierten Tiere wurden täglich in bezug auf Anzeichen der Krankheit und auf erhöhte Körpertemperaturen beobachtet. Es wurde bei gestorbenen Tieren eine Sektion durchgeführt und ausgewählte Gewebe wurden untersucht und auf das Vorhandensein von PRV kultiviert.
Bei den folgenden Beispielen sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die mit (*) markierten Beispiele außerhalb des Rahmens der Ansprüche liegen und aus Gründen der Anschaulichkeit in Bezug auf die von den Ansprüchen definierte Erfindung enthalten sind.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 (*)
S-PRV-004
Wir haben ein Virus erzeugt, das eine Deletion in dem Verbindungsbereich zwischen der Einzigartigen langen (Unique long)-DNA und dem internen Wiederholungsbereich von PRV und eine Deletion im endogenen PRV-Thymidinkinase-Gen in dem Einzigartigen langen Bereich aufweist. In die Verbindungsdeletion haben wir das Herpes simplex Typ 1 (HSV-1) Thymidinkinase (TK)-Gen unter der Kontrolle des ICP4-Promotors kloniert. Dieses Virus wird als S-PRV-004 bezeichnet.
Um dieses Virus zu erzeugen, haben wir zuerst das SalI #1-Fragment von PRV kloniert. PRV-DNA wurde zubereitet und dann mit dem SalI Restriktionsenzym geschnitten. Die geschnittene DNA wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen und der größte SalI Bande (15 kb) wurde aus dem Gel aufgereinigt (siehe Abschnitt DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSE MIT PHENOL). Die gereinigte DNA wurde in das Plasmid pSP64 ligiert (siehe Abschnitt LIGATION) und die DNA-Mischung wurde benutzt, um E. coli HB101 nach Maniatis et al. (1) zu transformieren. Es wurde beim SalI #1 Klon Kartierung der Restriktionsstellen vorgenommen.
Zur Erzeugung von S-PRV-004 wurde das Verfahren der homologen Rekombination angewandt (siehe 2). Die genaue Position des Verbindungsbereichs wurde durch Sequenzierung der DNA aus dem SalI #1-Fragment bestimmt. Es wurde gefunden, daß der Verbindungsbereich zwischen zwei StuI-Schnittstellen gelegen war (2A). Es wurden zwei Fragmente der DNA des SalI Klons genutzt, um den Homologievektor für die Rekombination zu erzeugen. Eines war ein Fragment aus BamHI #8' von StuI bis BamHI und das andere war aus BamHI #8 von BamHI bis StuI (siehe 1B und 2A). Diese Fragmente wurden in die BamHI Stelle von pSP64 kloniert. Dieses Plasmid wurde mit StuI geschnitten und ein 3,8 kb großes PvuII-Fragment, erhalten von B. Roizman (16), Universität von Chicago, das den ICP4-Promotor auf dem BamHI-N Fragment und das HSV-1 TK-Gen auf dem BamHI-Q-Fragment trug, fusioniert an den BamHI/BglII Stellen, wurde in die StuI-Schnittstelle ligiert. Das Endergebnis dieser Reihe von Klonierungen war ein Plasmid, in welchem 3 kb zwischen den StuI Stellen deletiert waren und in welches 3,8 kb des fremden TK-Gens eingebaut worden war (siehe 2B). Das TK-Gen war also von PRV-DNA-Sequenzen flankiert, um die Insertion des Fremdgens in das PRV-Genom mitteis homologer Rekombination zu ermöglichen. Die Plasmid-DNA wurde zusammen mit der intakten PRV-DNA von S-PRV-003, was ein Pseudorabies-Virus mit einer Deletion in dem endogenen TK-Gen ist, in Kaninchenhautzellen transfiziert Die transfizierte Virusstammlösung wurde in HAT-Medium selektiert und das Virus wurde identifiziert und durch Analyse des Restriktionsmusters der aus den infizierten Zellen isolierten DNA selektiert.
S-PRV-004 enthielt das HSV-1 TK-Gen und exprimierte dieses Gen, wie durch den Einbau von 14C-Thymidin in einem bei Tenser et al. (40) beschriebenen Plaque-Test und durch direkte Analyse der TK-Aktivität in infizierten Zell-Extrakten gemäß dem Verfahren von Cheng et al. (41) gezeigt wurde. Die Position dieses Gens im PRV-Genom wird in 2C dargestellt.
Sechs Schweine im Alter des Abstillens wurden mit 10^5.0 infektiösen Einheiten S-PRV-004 geimpft und 28 Tage später mit virulentem PRV zur Kontrolle infiziert, gemäß dem im Abschnitt VAKZINATIONSSTUDIEN IN SCHWEINEN beschriebenen Verfahren. Die geimpften Schweine blieben nach der Impfung gesund und entwickelten neutralisierende Serum-Antikörper gegen PRV (siehe Tabelle I unten). Virus aus der Vakzine wurde in Sekret aus Nase oder von den Tonsillen nicht festgestellt. Nach Konrollinfektion mit virulentem PRV, waren 83% der geimpften Schweine gegen PRV-Krankheit geschützt. Tabelle I Reaktionen von mit S-PRV-004 geimpften und mit virulentem PRV zur Kontrolle infizierten abgestillten Schweinen (zweiter Kontakt)

^a Erklärung der klinischen Symptome: Z = ZNS, F = Fieber

Beispiel 2 (*)
S-PRV-005
S-PRV-005 stellt ein Pseudorabiesvirus dar, das eine Deletion in dem Wiederholungsbereich und im endogenen PRV-TK-Gen in dem Einzigartigen langen Bereich, sowie eine Insertion des HSV-1 TK-Gens unter der Kontrolle des ICP4-Promotors, eingebaut in beide Kopien des Wiederholungsbereiches zwischen der XbaI-Schnittstelle und der HpaI-Schnittstelle im BamHI #5-Fragment (siehe 3) aufweist.
Um dieses Virus zu erzeugen, erhielten wir zunächst einen Klon des BamHI #5-Fragmentes aus PRV (1B). Das BamHI #5-Fragment wurde in das Plasmid pACYC184 bei der BamHI-Stelle kloniert (siehe vorher LIGATION). Eine Karte des BamHI #5-Fragmentes ist in 3A dargestellt.
Das das BamHI #5-Fragment enthaltende Plasmid wurde mit XbaI und HpaI geschnitten und das linearisierte Plasmid wurde gereinigt (siehe Abschnitt PHENOLEXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSE). Das in Beispiel 1 beschriebene 3,8 kb große PvuII-Fragment, welches das TK-Gen und den ICP4-Promotor aufweist, wurde ebenfalls gereinigt. Die XbaI-Schnittstelle wurde aufgefüllt (siehe Abschnitt POLYMERASE AUFFÜLL-REAKTION) und die zwei DNAs wurden gemischt und miteinander ligiert. Das hierdurch entstandene Plasmid, welches das TK-Gen, in der XbaI-HpaI-Deletion eingebaut, enthielt, wurde selektiert und durch Erstellung einer Restriktionskarte analysiert (3B).
Das das TK-Gen flankiert durch PRV-BamHI #5-Sequenzen enthaltende Plasmid wurde verwendet, um, zusammen mit gereinigter DNA aus S-PRV-003, einem Pseudorabiesvirus mit einer Deletion in dem endogenen TK-Gen, Kaninchenhautzellen zu transfizieren. Das hierdurch entstandene rekombinante PRV, das das HSV-1 TK-Gen in die Deletion in den Wiederholungsbereichen eingebaut enthielt, wurde gescreent und gemäß dem Verfahren beschrieben im Abschnitt SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MITTELS HYBRIDISIERUNG ohne jede vorherige Selektion aus der Transfektionsstammlösung gereinigt.
Es konnte durch den Einbau von ¹⁴C-Thymidin in einem Plaque-Test (40), durch Analyse der TK-Aktivität in infizierten Zelllysaten (41) und durch Immunodetektion des HSV-1 TK-Proteins gemäß dem vorstehend im Abschnitt SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT ANTIKÖRPERN beschriebenen Verfahren gezeigt werden, daß S-PRV-005 als rekombinantes PRV das HSV-1 TK-Gen exprimiert. Die Position dieses Gens in dem PRV-Genom wird in 3C dargestellt.
BEISPIEL 3 (*)
S-PRV-010
S-PRV-010 ist ein Pseudorabies-Virus mit einer Deletion im PRV-TK-Gen in dem einzigartigen langen Bereich, einer Deletion im Wiederholungsbereich und der Insertion des E. coli beta-Galactosidase-Gens (lacZ-Gen), eingebaut in beide Kopien der Wiederholungsbereiche bei der XbaI-Stelle im BamHI #5-Fragment (siehe 5A). Die Konstruktion des beta-Galactosidase-Gens wurde in einer solchen Weise durchgeführt, daß es unter Verwendung des HSV-1 TK-Gen-Promotors exprimiert wird, der, wie wir in diesem Konstrukt belegen konnten, in PRV aktiv ist.
Das Verfahren, das verwendet wurde, um das beta-Galactosidase-Gen in S-PRV-010 einzufügen, war eine direkte Ligation (siehe Abschnitt DIREKTES LIGATIONSVERFAHREN ZUR ERZEUGUNG VON REKOMBINANTEN HERPESVIREN). Das beta-Galactosidase-Gen befand sich auf Plasmid pJF751, das von Jim Hoch, Scripps Clinic and Research Foundation, erhalten wurde. Dieses Gen ist am 5'-Ende durch einer BamHI-Stelle trunkiert, die das AGT-Initiationscodon entfernt hat, und am anderen Ende wurde die AvaI-Stelle in pBR322 verwendet (siehe 4A). Der HSV-1 TK-Promotor (4B) wurde aus dem McKnight-TK-Gen als RsaI-Fragment entnommen, auf Gel gereinigt und mit einem synthetischen Stück DNA mit einer BamHI-Stelle innerhalb der Sequenz CGGATCCG ligiert (4C). Nach Verdauung mit BamHI wurde das Fragment in die BamHI-Stelle am Anfang des beta-Galactosidase-Gens kloniert (4D). Das Plasmid wurde mit den E. coli-Plasmiden pSP64 und pSP65 konstruiert, so daß die XbaI-Stellen aus den Polylinkern benutzt werden konnten, um das gesamte Konstrukt aus dem Plasmid auszuschneiden. Die Ligierungsmischung wurde verwendet, um E. coli HB101 gemäß veröffentlichten Verfahrensweisen (Maniatis et al. (1)) zu transfizieren. Dieses Konstrukt wurde so geplant, daß die ersten drei Aminosäuren des Proteins aus dem HSV-1-TK-Gen stammten, die nächsten drei aus dem synthetischen Linker und der Rest aus dem beta-Galactosidase-Gen. Das Gen enthielt bei der Verbindung zwischen TK und lacZ die nachfolgende Sequenz:
Ein Pseudorabiesvirus-Konstrukt bezeichnet mit S-PRV-002 mit einer Deletion im PRV-TK-Gen im einzigartigen langen Bereich sowie einer Deletion im Wiederholungsbereich wurde als Empfänger für das beta-Galactosidase-Gen verwendet. Intakte S-PRV-002-DNA wurde mit einem 30-fachen molaren Überschuß an Plasmid-DNA gemischt, die das beta-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle des HSV-1-TK-Promotor enthielt, und diese Mischung wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut. Die ligierte DNA wurde verwendet, um tierische Zellen zu transfizieren und die Transfektionsstammlösung wurde auf rekombinantes PRV analysiert. Zunächst wurde PRV-DNA aus mit dem Virus der Transfektionsstammlösung infizierten Zellen zubereitet und diese DNA wurde mit Restriktionsenzymen geschnitten und auf einem Agarose-Gel analysiert. Diese Analyse zeigte, daß das rekombinante Virus die wichtigste Sorte in der Transfektionsstammlösung darstellte, und es wurde anschließend durch den Plaque-Test verbunden mit dem im Abschnitt SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL beschriebenen Verfahren von anderen Virusarten gereinigt. Weil beta-Galactosidase mit dem Wirkstoff Bluogal^TM zu einem Produkt mit blauer Farbe reagierte, war es möglich, eine Reinigung der rekombinanten Kolonien durch die Auswahl der blauen Kolonien vorzunehmen.
Das Endergebnis der Reinigung war das rekombinante PRV mit der Bezeichnung S-PRV-010. Es konnte gezeigt werden, daß dieses das Enzym beta-Galactosidase exprimiert, und zwar anhand der vorstehend erwähnten Bildung von blauen Kolonien sowie anhand der Detektion des Enzyms in Extrakten infizierter Zellen unter Verwendung des Substrats O-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranosid (Sigma) nach der Arbeitsweise von Norton und Coffin (33). Die Position dieses Gens in dem PRV-Genom wird in 5C gezeigt.
Frühere Studien hatten belegt, daß mit S-PRV-002 geimpfte Schweine Antikörper gegen PRV bildeten und wenn sie virulentem PRV-Vkus ausgesetzt wurden, vollständig gegen klinische Erkrankung geschützt waren. Es wurden Tierversuche mit S-PRV-010 durchgeführt, um die Nützlichkeit des rekombinanten Pseudorabies-Virus als Vakzine gegen die Pseudorabieskrankheit zu bestimmen.
Eine Gruppe abgestillter Schweine und ein Wurf 4 Tage alte Ferkel wurden mit S-PRV-010 geimpft und drei bis vier Wochen später die Immunantwort getestet, wie im Abschnitt VAKZINATIONSSTUDIEN IN SCHWEINEN beschrieben.
Reaktionen von mit S-PRV-010 geimpften abgestillten Schweinen sind in Tabelle II dargestellt. Die Verabreichung dieses Virus löste keine unerwünschten Reaktionen in den Schweinen aus. Die geimpften Tiere entwickelten PRV-neutralisierende Antikörper. Zwei nicht-geimpfte Kontrolltiere (#75 und #91), mit den geimpften Tieren in Kontakt gebracht wurden, zeigten vor der Kontrollinfektion mit dem Erreger keinerlei Bildung von PRV-Antikörpern, was als Zeichen gilt, daß die geimpften Tiere das Virus der Vakzine nicht ausscheiden. Nach der Kontrollinfektion (challenge) blieben alle zehn geimpften Tiere klinisch normal und blieben frei von der PRV-Erkrankung. Im Gegensatz dazu entwickelten die zwei Kontrolltiere, die Kontakt mit den geimpften Tieren hatten, sowie drei der fünf nicht-geimpften Kontrolltiere PRV-Krankheit und eines der Schweine erlag dem PRV.
Um weiter die Nützlichkeit von S-PRV-010 als Vakzine zu testen, wurden 4 Tage alte Ferkel mit Virus inokuliert. Die in der Tabelle III dargestellten Ergebnisse belegten, daß das Virus eine Antikörperreaktion in den geimpften Ferkeln auslöste und keine unerwünschte Reaktionen hervorrief. Das Virus wurde offensichtlich von den geimpften Tieren ausgeschieden, da eines (#67) der zwei nicht-geimpften Kontrollferkel, die in Kontakt mit den geimpften Ferkeln standen, am Tag 24 Antikörper gegen PRV gebildet hatte. Nach der Kontrollinfektion blieben sämtliche geimpften Tiere sowie das sero-positive Kontrolltier, das vorher Kontakt zu den geimpften Tieren hatte, frei von PRV Krankheit. Im Vergleich entwickelten die drei nicht-geimpften Kontrollschweine und das zweite Kontrollschwein, das vorher Kontakt zu den geimpften Tieren gehabt hatte, klinische Symptome von PRV und verendeten.
Es ist die Schlußfolgerung aus dieser Studie, daß S-PRV-010 verabreicht in einer Dosierung von 10^4,0 oder 10^5,0 eine Schutzreaktion in geimpften Ferkeln oder abgestillten Schweinen hervorruft, die in der Lage ist, eine Infektion durch virulentes Virus zu verhindern. TABELLE II SEROLOGISCHE UND KLINISCHE REAKTIONEN IN ABGESTILLTEN SCHWEINEN NACH IMPFUNG MIT S-PRV-010 UND KONTROLLINFEKTION (2. KONTAKT) MIT WILDTYP-PRV

^a Bestimmung mittels RIDEA
^b Kontrollen mit Kontakt zu geimpften Tieren
^c ZNS-Symptome umfassen Ataxie, Mangel an Koordination, Drehbewegungen, Seitenlage
ng: nicht geprüft

^a Bestimmung mittels RIDEA
^b 8 Tage nach Impfung an gerissenem Magen eingegangen
^c am Tag 7 nach zweitem Kontakt oder davor eingegangen
^d ZNS-Symptome umfassen Ataxie, Mangel an Koordination, Drehbewegungen, Seitenlage
ng: nicht geprüft

BEISPIEL 4 (*)
S-PRV-007
S-PRV-007 stellt ein Pseudorabiesvirus dar, das eine Deletion im PRV-TK-Gen im einzigartigen langen Bereich, eine Deletion im Wiederholungsbereich und eine Insertion des Gens für Schweinerotavirus-Glykoprotein 38 unter der Kontrolle des HSV-1-ICP4-Promotors im Wiederholungsbereich insertiert aufweist.
Das vorher im Beispiel 2 beschriebene S-PRV-005-Virus wurde in nachfolgender Weise weiter gentechnologisch bearbeitet, so dass es das Rotavirus-Antigen (siehe 6) enthielt. Das Schweinerotavirus gp38-Gen wurde in Plasmid pBR322 an der PstI-Schnittstelle gemäß hier bereits vorher beschriebenen Arbeitsweisen kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde pSY565 genannt (siehe 7). Das 1090 bp große PstI-Fragment enthaltend das gp38-Gen wurde an der PstI-Schnittstelle in den Vektor pUC4K kloniert, so daß es in einem pSY762 genannten Plasmid von BamHI-Schnittstellen flankiert war.
Plasmid pSY590 hat einen komplexen Ursprung gehabt, wie es dem Flowchart zu entnehmen ist. Diese Klonierungen waren von routinemäßigem Charakter und sind von geschichtlichem Interesse, sind aber nicht unbedingt erforderlich, um die Erfindung auszuführen. Diese Geschichte ist kurz wie folgt:

(1) Das McKnight TK-Gen war das HSV-1 BamHI Q-Fragment von HaeIII bei –178 relativ zur CAP-Stelle bis zu BamHI bei +2700, welches zwischen HindIII und BamHI in pBR327 kloniert wurde.
(2) pSY491.. Der gesamte für TK kodierende Bereich von der BglII-Schnittstelle bei +55 (relativ zur CAP-Stelle) bis zur BamHI-Schnittstelle bei +2700 wurde in die BamHI-Schnittstelle in pSP65 kloniert und pSY491 genannt.
(3) pSY481.. Die polyA Signalsequenz (pA) auf einem 800 bp großen SmaI-Fragment von TK wurde in die SmaI-Schnittstelle in pSP65 kloniert und wurde pSY481 genannt.
(4) pSY583.. Die pA auf dem 800 bp großen SmaI-Fragment von pSY481 wurde in die HincII-Schnittstelle in pSP65 kloniert und PSY583 genannt.
(5) pSY429.. Das HSV-1 BamHI N-Fragment wurde von Dr. B. Roizman erhalten und in die BamHI-Schnittstelle von pBR322 kloniert und wurde pSY429 genannt.
(6) pSY584.. Das 2,2 kb große BamHI N-Fragment von PvuII bis BamHI (Ref. 16) in pSY420 wurde in pSP65 zwischen HincII und BamHI im Polylinker subkloniert und wurde pSY584 genannt.
(7) pSY479.. Ein eine fusionierte Polylinker-Sequenz enthaltendes Plasmid wurde aus pSP64 und pSP65 konstruiert. Beide Plasmide wurden mit PstI im Polylinker und PvuI im Plasmidkörper geschnitten. Das Gesamtergebnis bei diesem Konstrukt war die Erzeugung eines pSP66 genannten Fusionsplasmids mit einer symmetrischen Polylinker-Sequenz, zentriert in Bezug auf die PstI-Schnittstelle. Dieses Plasmid wird pSY479 genannt und enthält ebenfalls ein in die PstI-Schnittstelle kloniertes PstI-Fragment, das für die folgenden Manipulationen ohne Bedeutung ist.

Das Plasmid pSY590 wurde aus pSY583, pSY584 und pSY479 in einer drei-Fragment-Ligation mit den folgenden Elementen erzeugt: die mit PstI ausgeschnittenen, 3 kb großen Plasmidsequenzen aus pSY479 (pSP66), das 800 bp große, mit PstI und BamHI aus dem Polylinker in pSY583 geschnittene SmaI pA-Fragment und das 2200 bp große mit PstI und BamHI aus pSY583 geschnittene BamHI N-Fragment. 7 zeigt die endgültige Konfiguration all dieser DNA-Fragmente in pSY590. Es liegt eine einzelne BamHI-Schnittstelle im Plasmid zwischen dem Promotor in BamHI N und dem TK-pA-Signal vor, welche für die Insertion des Kodierungsbereichs des gp38-Gens verwendet wurde.
Um den bei der Bildung von S-PRV-007 verwendeten Homologievektor zu erzeugen, wurde das Plasmid pSY590 mit BamHI geöffnet und das 1090 bp große gp38-Gen wurde durch Verdau mit BamHI aus pSY762 entfernt, und aus diesen zwei Fragmenten wurde durch Verknüpfung das pSY596 gebildet. Die richtige Orientierung des gp38-Gens wurde durch diagnostischen Restriktionsenzymverdau bestätigt, wobei die Schnittstellen in gp38 genutzt wurden (siehe 10A und 10B).
In dem vorher beschriebenen pSY596 befand sich das gp38-Gen zwischen zwei flankierenden HSV 1-DNA-Fragmenten. Diese zwei Bereiche waren somit homolog zu vergleichbaren Bereichen in dem HSV-1 TK-Gen in S-PRV-005, und diese Bereiche wurden für die homologe Rekombination zur Erzeugung von S-PRV-007 (6A) verwendet. DNA aus dem Plasmid und aus S-PRV-005 wurde gemischt und in dem im Abschnitt DNA TRANSFEKTION UM REKOMBINANTES VIRUS ZU ERZEUGEN beschriebenen Verfahren benutzt. Ein Virus mit dem Rotavirus-Antigen anstelle des TK-Gens wurde mit BUDR selektiert. Rekombinanten aus der selektierten Virusstammlösung mit inkorporierter Rotavirus-DNA wurden gemäß dem im Abschnitt SCREENING NACH REKOMBESfANTEM HERPESVIRUS MITTELS HYBRIDISIERUNG beschriebenen Verfahren und anhand einer Analyse der Verdauungsprodukte der DNA nach dem im Abschnitt SOUTHERN BLOTTING DER DNA beschriebenen Verfahren gescreent, wobei das klonierte Rotavirus gp38-Gen als Sonde diente.
Das Endergebnis bei diesem Screening war ein rekombinantes mit S-PRV-007 bezeichnetes PRV, bei welchem das Rotavirus-gp38-Gen in den Wiederholungsbereich zwischen den XbaI- und HpaI-Schnittstellen im PRV BamHI #5-Fragment eingebaut war, wie es in 6C dargestellt wird. Die Anwesenheit von von S-PRV-007 exprimiertem gp38 in einem Wirt, wurde bislang noch nicht nachgewiesen.
BEISPIEL 5 (*)
S-PRV-012
S-PRV-012 ist ein Pseudorabiesvirus mit einer Deletion in dem PRV TK-Bereich in dem einzigartigen langen Bereich, einer Deletion in dem Wiederholungsbereich und einer Deletion in dem einzigartigen kurzen Bereich, das für das PRV-Glykoprotein X kodiert, das gpX genannt wird und von Rea et al., (23) identifiziert und kartiert wurde. Das HSV-1 TK-Gen unter der Kontrolle des ICP4-Promotors wurde anstelle des gpX-Gens insertiert.
Das nachfolgende Verfahren wurde angewandt, um die Deletion von gpX und die gleichzeitige Insertion des HSV-1 TK-Gens vorzunehmen. Die flankierenden Bereiche für die Homologie mit PRV stammten aus klonierten Fragmenten des BamHI #10- und des BamHI #7-Fragmentes, die sich von NdeI bis BamHI erstrecken (8). Die BamHI- und NdeI-Schnittstellen wurden gemäß dem Verfahren beschrieben in Abschnitt POLYMERASE AUFFÜLLREAKTION aufgefüllt und das PvuII-Fragment der HSV-1-DNA wurde durch LIGATION eingefügt. Dieses Plasmid wurde mit intakter S-PRV-002-DNA gemäß dem Verfahren DNA TRANSFEKTION, UM REKOMBINANTES VIRUS ZU ERZEUGEN transfiziert. Das rekombinante Virus wurde gemäß dem Verfahren HAT SELEKTION VON THYMIDINE KINASE EXPRIMIERENDEM REKOMBINANTEN HERPESVIRUS selektiert und gemäß dem Verfahren SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT ANTIKÖRPERN unter Anwendung von für das HSV-1-Protein spezifischen Antikörpern gescreent.
Das mittels dieser Vorgehensweise selektierte rekombinante Virus wurde mit S-PRV-012 bezeichnet und ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer VR-2119 hinterlegt worden, und es wurde gemäß ERSTELLUNG EINER DNA-RESTRIKTIONSKARTE und SOUTHERN BLOTTING DER DNA gezeigt, daß es das insolierte HSV-1-TK-Gen anstelle des gpX-Gens enthält (8B). Das SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT ANTIKÖRPERN-Verfahren belegte, daß das Virus das insertierte HSV-1-TK-Gen exprimiert. Die Struktur dieses Virus ist in 8C gezeigt.
BEISPIEL 6 (*)
S-PRV-013
S-PRV-013 stellt ein Pseudorabies-Virus dar, das eine Deletion in dem TK-Gen im langen einzigartigen Bereich, eine Deletion im Wiederholungsbereich und eine Deletion in dem für gpX kodierenden Bereich aufweist. Das Gen für E. coli-beta-Galactosidase (lacZ-Gen) wurde anstelle des gpX-Gens eingefügt und steht unter Kontrolle des endogenen gpX-Gen-Promotors.
Die nachfolgende Vorgehensweise wurde angewandt, um S-PRV-013 durch homologe Rekombination zu konstruieren. Die flankierenden PRV-homologen Bereiche stammten aus dem klonierten BamHI #10-Fragment, welches den gpX-Promotor enthielt, und aus dem klonierten BamHI #7-Fragment zwischen der NdeI-Schnittstelle und der BamHI-Schnittstelle (9A). Die NdeI-Stelle wurde nach dem POLYMERASE AUFFÜLL-REAKTION Verfahren aufgefüllt und das beta-Galactosidase-Gen wurde zwischen dem BamHI #10- und dem BamHI #7-Fragment eingefügt. In diesem Konstrukt befand sich das beta-Galactosidase-Gen zwischen dem gpX-Promotor und den gpX-poly A-Signalsequenzen, wobei fast sämtliche für gpX kodierenden Bereiche deletiert waren. Die Plasmid-DNA und die DNA aus S-PRV-002, einem PRV-Stamm mit einer Deletion in beiden Wiederholungssequenzen und einer Deletion im Thymidinkinasegen, wurden gemischt und nach dem Verfahren DNA-TRANSFEKTION, UM REKOMBINANTES VIRUS ZU ERZEUGEN transfiziert. Das rekombinante Virus wurde aus der Transfektionsstammlösung gemäß dem Verfahren SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL gescreent und gereinigt.
Das erhaltene Virus aus dieser Untersuchung wurde mit S-PRV-013 bezeichnet und ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer VR 2120 hinterlegt worden. Es enthielt das beta-Galactosidase-Gen anstelle der für gpX kodierenden Bereiche (9B und 9C), wie anhand ZUBEREITUNG VON HERPESVIRUS-DNA, gefolgt von SOUTHERN BLOTTING DER DNA bestimmt wurde. Die Expression des beta-Galactosidase-Gens wurde durch den Test SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL und durch die o-Nitrophenylgalaktopyranosid Substratbestimmung (33) bestätigt.
Um zu bestätigen, daß der für gpX kodierende Bereich aus S-PRV-013 entfernt worden war, wurde aus einem gereinigten S-PRV-013-Stamm extrahierte DNA mit BamHI verdaut und die Fragmente wurden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt und durch das Verfahren aus Abschnitt SOUTHERN BLOTTING DER DNA analysiert. Die Hybridisierungssonde war das BamHI-NDE-Fragment des Pseudorabies-BamHI #7-Fragments aus dem einzigartigen kurzen Bereich. Diese Sonde umfaßte 90% der für gpX kodierenden Sequenzen. Bei dieser Analyse wurde gezeigt, daß der gpX-Bereich in S-PRV-013 fehlt.
Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden Zellen entweder mit Wildtyp-Pseudorabies, mit S-PRV-012 oder mit S-PRV-013 infiziert, und Proben der Medien von den infizierten Kulturen wurden SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen. Die Zelle wurde auf Filter übertragen und nach dem WESTERN BLOTTTNG VERFAHREN analysiert. Das benutzte Antiserum war ein hyper-immunes Kaninchenserum, das mit einem chemisch synthetisierten gpX-Peptid als Antigen, gekoppelt an Rinderserumalbumin hergestellt worden war. Wie in 4 dargestellt, liegt gpX in Medien von mit Wildtyp-Virus (PRV 000) infizierten Zellen deutlich vor, wird aber in Medien von mit S-PRV-012 oder S-PRV-013 infizierten Zellen nicht festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß das gpX-Gen bei sowohl S-PRV-012 als auch bei S-PRV-013 fehlt, und dass das Protein gpX nicht in entweder mit S-PRV-012 oder mit S-PRV-013 infizierten Zellen produziert wird.
Die nachfolgenden Experimente weisen darauf hin, daß S-PRV-013 als Vakzine benutzt werden kann, um Schweine gegen Pseudorabies-Krankheit zu schützen, und daß es eine Immunantwort hervorruft, die sich klar von der Wildtyp-Infektion unterscheiden läßt.
In der ersten Studie wurden empfindliche abgestillte Schweine und 4-Tage-alte Ferkel folgendermaßen intramuskulär mit S-PRV-13 geimpft: 4 aus jeder Gruppe wurden mit 10⁶ TCID₅₀ und 4 wurden mit 10⁴ TCID₅₀ Virus inokuliert. Die Tiere wurden beobachtet, dann wie in Abschnitt VAKZINATIONSSTUDIEN IN SCHWEINEN beschrieben zur Kontrolle infiziert (siehe Tabelle IV unten). TABELLE IV ANTWORTEN VON 4-TAGE-ALTEN FERKELN, GEIMPFT MIT S-PRV-013 UND ZUM ZWEITEN MAL MIT VIRULENTEM PRV KONTAKTIERT (KONTROLLINFEKTION)

^a kl. Zeich = klinischer Zeichen (Legende): Neg = negativ, Z = ZNS, T = Tod, F = Fieber, A = Atmung, D = Diarrhöe
^b nicht geprüft
^c am Tag 4 nach Impfung getötet
^d am Tag 7 nach Impfung getötet; ab Geburt schwaches Tier

Nach der Impfung waren sämtliche Tiere frei von unerwünschten Reaktionen und bis auf 2 (abgestillte Schweine) zeigten alle neutralisierende Serum-Antikörpertiter von 1:2 bis 1:64. Virus wurde nicht in Abstrichen der Tonsillen bei irgendeinem Schwein oder bei aus dem am Tag 4 getöteten Schweinchen (#11) entnommenen Geweben gefunden. Eines der 2 Kontaktkontrolltiere (#19) wurde nach 7 Tagen im Experiment getötet, weil es von Anfang an schwach war und sich schlecht entwickelte. Gewebsmaterial von diesem Ferkel war negativ in bezug auf kultivierten PRV. Das andere Kontaktkontrolltier blieb gesund und entwickelte vor der Kontrollinfektion mit dem Antigen keine Antikörper gegen PRV.
Nach der Kontrollinfektion blieben sämtliche geimpften Tiere klinisch normal und entwickelten sekundäre Antikörperantworten. Das Kontaktkontrollferkel und die drei Schweine zur Kontrolle der Kontrollinfektion entwickelten allesamt die typischen Zentralnervensystem-Symptome von PRV, und ein Kontrolltier starb nach der Infizierung.
In einer zweiten Studie mit S-PRV-013 unter Anwendung größerer Gruppen von Tieren wurden 2 Würfe von empfindlichen 3-Tage alte Ferkeln und eine Gruppe von 15 suszeptiblen abgestillten Schweinen mit 10⁴ TCID₅₀ Virus geimpft, dann wie in VAKZINATIONSSTUDIEN IN SCHWEINEN beschrieben eine Kontrollinfektion gesetzt (siehe Tabellen V und VI unten). TABELLE V REAKTIONEN VON MIT S-PRV-013 GEIMPFTEN UND MIT VIRULENTEM PRV ZUM ZWEITEN MAL KONTAKTIERTEN (KONTROLLINFEKTION) 3 TAGEN ALTEN FERKEL

^a kl. Zeich = klinische Zeichen: Neg = negativ, Z = ZNS, T = Tod, F = Fieber, A = Atmung
^b Temperaturerhöhung um 1°F wurde bei diesen geimpften Tieren am ersten Tag festgestellt
^c Abstr = Abstrich

^a kl. Zeich = klinische Zeichen: Neg = negativ, Z = ZNS, T = Tod, F = Fieber, A = Atmung,
^b ng = nicht geprüft

In diesem Experiment blieben sämtliche geimpften Tiere nach der Impfung gesund, entwickelten neutralisierende Serumantikörper gegen PRV und zeigten keine Ausscheidung des Vakzine-Virus in den Sekreten der Tonsillen. Nach der Kontrollinfektion mit virulentem Virus blieben die vakzinierten Tiere beider Altersgruppen frei von der PRV-Krankheit, wohingegen die 3 nicht-geimpften Kontaktkontrollen und 10 von 11 der Kontrollen nach Kontrollinfektion eine schwere Pseudorabies-Krankheit entwickelten.
Die von den geimpften und kontrollinfizierten Schweinen entnommenen Serumproben wurden mittels ELISA-Bestimmung auf gpX untersucht. Weil das Gen für gpX in S-PRV-013 deletiert war, wurde erwartet, daß die mit S-PRV-013 geimpften Schweine bei dem ELISA-Test seronegativ in bezug auf dieses Antigen sein würden. Das Virus für die Kontrollinfektion trug das gpX-Gen. Die geimpften Tiere wurden durch die Impfung gegen Pseudorabies-Krankheit geschützt, wenn sie mit Wildtyp-Virus zur Kontrolle infiziert wurden. Die vakzinierten Tiere wurden jedoch ohne Auftreten von Symptomen durch den Infektionsstamm superinfiziert, und es wäre daher anzunehmen, daß sie Antikörper gegen gpX produzieren, wenn sie mit dem Wildtyp-Virus kontrollinfiziert werden.
Wie in 5 dargestellt, war das Serum eines mit S-PRV-013 geimpften Tieres gpX-negativ, bis mit dem Wildtyp-Virus infiziert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, daß S-PRV-013 ein wirksamer Impfstamm ist, welcher es erlaubt, geimpfte Tiere durch eine diagnostische Bestimmung einer Serumprobe von solchen, die mit Wildtypvirus infiziert sind, zu unterscheiden.
BEISPIEL 7 (*)
S-PRV-014
S-PRV-014 ist ein Pseudorabies-Virus, das in dem für gpX kodierenden Bereich eine Deletion aufweist. Das Gen für E. coli-beta-Galactosidase wurde anstelle des gpX-Gens eingefügt und ist unter der Kontrolle des endogenen gpX-Promotors.
Die nachfolgenden Arbeitsweisen wurden angewandt, um S-PRV-014 durch homologe Rekombination zu erzeugen. Die flankierenden PRV-homologen Bereiche stammten von dem klonierten BamHI #10 Fragment, das den gpX-Promotor enthält, und von dem klonierten BamHI #7-Fragment, das sich von der NdeI-Schnittstelle bis zur BamHI-Schnittstelle erstreckt (9). Die NdeI-Schnittstelle wurde gemäß dem Verfahren POLYMERASE AUFFÜLLREAKTION aufgefüllt und das beta-Galactosidase-Gen wurde zwischen den BamHI #10- und dem BamHI #7-Fragmenten eingefügt. Dieses Konstrukt positionierte das beta-Galactosidase-Gen zwischen dem gpX-Promotor und der gpX-poly A-Signalsequenz mit einer Deletion, die fast den gesamten kodierenden Bereich für gpX umfaßt. Die Plasmid-DNA und DNA von Wildtyp-PRV wurden gemischt und gemäß der Arbeitsweise DNA-TRANSFEKTION, UM REKOMBINANTES VIRUS ZU ERZEUGEN transfiziert. Das rekombinante Virus wurde durch die im Abschnitt SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL beschriebene Arbeitsweise gescreent und aus der Transfektionsstammlösung gereinigt.
Das erhaltene Virus aus diesem Screeningsverfahren wurde mit S-PRV-014 bezeichnet und ist unter der Zugangsnummer VR 2135 bei der ATCC hinterlegt worden. Es enthält das beta-Galactosidase-Gen anstelle des für gpX kodierenden Bereiches wie anhand der ZUBEREITUNG VON HERPESVIRUS-DNA und anschließend SOUTHERN BLOTTING DER DNA festgestellt wird. Die Expression des beta-Galactosidase-Gens wurde durch den Test SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL und durch die o-Nitrophenylgalaktopyranosidsubstrat-Bestimmung (33) bestätigt. Die Struktur dieses Virus wird in der 9D gezeigt.
BEISPIEL 8 (*)
S-PRV-016
S-PRV-016 ist ein Pseudorabies-Virus, das eine Deletion in beiden Wiederholungssequenzen sowie eine Deletion in dem für gpX kodierenden Bereich aufweist. Das Gen für E. coli-beta-Galactosidase wurde anstelle des gpX-Gens eingefügt und befindet sich unter der Kontrolle des endogenen gpX-Gen-Promotors.
Die nachfolgenden Arbeitsweisen wurden für die Konstruktion des S-PRV-016 mittels homologer Rekombination angewandt. Die flankierenden PRV-homologen Bereiche stammten von dem klonierten BamHI #10-Fragment, das den gpX-Promotor enthält, und von dem klonierten BamHI #7-Fragment zwischen der NdeI-Schnittstelle und der BamHI-Schnittstelle (9). Die NdeI-Schnittstelle wurde gemäß POLYMERASE AUFFÜLL-REAKTION aufgefüllt und das beta-Galactosidase-Gen wurde zwischen dem BamHI #10- und dem BamHI #7-Fragment insertiert. Dieses Konstrukt positionierte das beta-Galactosidase-Gen zwischen dem gpX-Promotor und der gpX-poly A-Signalsequenz, mit einer Deletion die fast den gesamten kodierenden Bereich für gpX umfaßt. Die Plasmid-DNA und DNA von S-PRV-001 wurden gemischt und gemäß der Arbeitsweise DNA TRANSFEKTION, UM REKOMBINANTES VIRUS ZU ERZEUGEN transfiziert. Das rekombinante Virus wurde durch das Verfahren SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL gescreent und aus der Transfektionsstammlösung gereinigt.
Das erhaltene Virus aus diesem Screeningsverfahren wurde mit S-PRV-016 bezeichnet und ist unter der Zugangsnummer VR 2136 bei der ATCC hinterlegt worden. Es enthalt das beta-Galactosidase-Gen anstelle des für gpX kodierenden Bereiches, wie anhand ZUBEREITUNG VON HERPESVIRUS-DNA und anschließend SOUTHERN BLOTTING DER DNA festgestellt wurde. Die Expression des beta-Galactosidase-Gens wurde durch den Test SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL und durch die o-Nitrophenylgalactopyranosidsubstrat-Bestimmung (33) bestätigt. Die Struktur dieses Virus wird in der 9E gezeigt.
BEISPIEL 9 (*)
S-PRV-020
S-PRV-020 ist ein Pseudorabies-Virus, das eine Deletion im TK-Gen, eine Deletion in den Wiederholungsbereichen und eine Deletion des gpX-Gens, mit einer Insertion des Schweineparvovirus B-Capsidprotein-Gens in den gpX-Bereich enthält.
Um das Schweineparvovirus B-Gen zu klonieren, wurde die DNA aus NADL-8-Stamm in doppelsträngiger replikativer Form aus mit Schweineparvovirus infizierten Zellen gereinigt und von Dr. T. Molitor, Universität Minnesota, zur Verfugung gestellt. Die Parvovirus NADL-8-DNA wurde mittels in (15) detailliert beschriebener Verfahren in das E. coli-Plasmid pSP64 kloniert. Die DNA wurde partiell sequenziert, um die Bestimmung von Anfang und Ende des größten Capsidproteingens, des B-Gens, zu ermöglichen. Die Identifizierung wurde durch Vergleich der verwandten Sequenzen im Ratten HI Parvoviruscapsidgen bestätigt (28,29). Die Sequenz des Schweineparvovirus B-Gens ist in den 11A und 11B dargestellt.
Der PRV-Glykoprotein X (gpX)-Gen-Promotor wurde benutzt, um das B-Gen zu exprimieren, und die gpX-poly A-Signalsequenz wurde benutzt, um die Transkription zu beenden. Das Parvovirus B-Gen von der AccI-Schnittstelle bei Nukleotid #391 bis zur RsaI-Schnittstelle bei Nukleotid #2051 wurde zwischen die BamHI- und der NdeI-Schnittstelle von gpX kloniert (siehe 7A und 7B). Plasmid pSY864 enthielt dieses Parvovirus B-Genfragment flankiert durch die gpX-Signalsequenz, wie in 13 veranschaulicht. Es wurde als die homologe DNA benutzt, um die homologe Rekombination zwischen S-PRV-013-DNA und der Plasmid-DNA zu fördern, um den Einbau des B-Gens in das PRV-Genom zu erleichtern. Die Plasmid-DNA und die S-PRV-013-DNA wurden gemischt und gemäß der Arbeitsweise DNA-TRANSFEKTION, UM REKOMBINANTES VIRUS ZU ERZEUGEN gemeinsam transfiziert. Das rekombinante Virus wurde gemäß dem Verfahren SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPES VIRUS MIT BLUOGAL gescreent und für eine nach dem transfizierte Stammlösung gereinigt, mit der nachfolgenden Modifikation. Weil das ursprüngliche S-PRV-013 das beta-Galactosidase-Gen enthielt, bildete es bei dem Screeningsverfahren blaue Kolonien. Da das Parvovirus-B-Gen das beta-Galactosidase-Gen im Virus ersetzen würde, würden Kolonien mit diesem Insert farblos sein. Deswegen wurden farblose Kolonien gepickt und während der Screeningsprozedur analysiert. Ein das B-Gen enthaltendes Virus wurde anhand des Screeningverfahrens isoliert und mit S-PRV-020 bezeichnet. S-PRV-020 ist bei der ATCC unterster Zugangsnummer VR 2137 hinterlegt worden.
Es wurde DNA aus S-PRV-020 nach dem Verfahren ZUBEREITUNG VON HERPES VIRUS-DNA isoliert und benutzt, um die Insertion des Parvovirus-B-Gens nach dem Verfahren SOUTHERN BLOTTING DER DNA zu bestätigen, wobei das B-Gen als Sonde diente. Die Prüfung zeigte, daß das Parvovirus-B-Gen wie erwartet in das PRV-Genom eingebaut worden ist. Die Struktur des S-PRV-020 ist in 13C gezeigt.
BEISPIEL 10 (*)
S-PRV-025
Das Klonieren des B-Gens und die Konstruktion dieser Signalsequenzen mit dem B-Gen werden in Beispiel 9 beschrieben und in 12 gezeigt.
Das DIREKTE LIGATIONSVERFAHREN ZUR ERZEUGUNG VON REKOMBINANTEN HERPESVIREN wurde für die Insertion des Parvovirus-B-Gens in PRV angewandt. Das das B-Gen enthaltende Plasmid pSY957 wurde mit S-PRV-002-DNA gemischt und sie wurden mit Restriktionsenzym XbaI geschnitten. Die DNA-Mischung wurde wie bei dem entsprechenden Verfahren beschrieben ligiert und die DNA wurde in Vero-Zellen transfiziert. Ein B-Gen enthaltendes Virus wurde aus der Transfektionsstammlösung isoliert und mit S-PRV-025 bezeichnet. S-PRV-025 ist unter der Zugangsnummer VR 2138 bei der ATCC hinterlegt worden.
DNA aus S-PRV-025 wurde nach dem Verfahren ZUBEREITUNG VON HERPES VIRUS-DNA isoliert und gemäß dem Verfahren SOUTHERN BLOTTING DER DNA unter Verwendung des B-Gens als Sonde benutzt, um die Insertion des Parvovirus-B-Gens zu bestätigen. Die Prüfung zeigte, daß das Parvovirus-B-Gen wie erwartet in das PRV-Genom eingebaut worden ist. Die Struktur des S-PRV-025 ist in 14 gezeigt.
BEISPIEL 11 (*)
S-PRV-029
S-PRV-029 ist ein Pseudorabies-Virus mit einer Deletion im Verbindungsbereich zwischen dem einzigartigen langen Bereich und dem internen Wiederholungsbereich von PRV, und mit einer Deletion im gpX-Gen im einzigartigen kurzen Bereich. Das E. coli-beta-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle des gpX-Promotors und der Polyadenylierungs-Signale ist bei S-PRV-029 in beide Deletionen insertiert worden.
Um dieses Virus zu konstruieren, wurde zunächst das SalI #1-Fragment von PRV kloniert. PRV-DNA wurde zubereitet und dann mit dem Restriktionsenzym SalI geschnitten. Die geschnittene DNA wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen und die größte SalI-Bande (15 kb) wurde aus dem Gel gereinigt (siehe PHENOLEXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSE). Die aufgereinigte DNA wurde in das Plasmid pSP64 ligiert (siehe LIGATION) und die DNA-Mischung wurde gemäß Maniatis et al. (1) zur Transformation von E. coli HB101 benutzt. Es wurde von dem SalI #1-Klon eine Restriktionskarte erstellt.
Zur Erzeugung des S-PRV-029 wurde das Verfahren der homologen Rekombination benutzt. Die genaue Position des Verbindungsbereichs wurde durch Sequenzierung der DNA aus dem SalI #1-Fragment bestimmt. Es wurde festgestellt, daß der Verbindungsbereich zwischen den zwei StuI-Stellen gelegen war (siehe 15B). Zwei DNA-Fragmente aus dem SalI-Klon wurden benutzt, um den Homologievektor für die Rekombination zu erzeugen. Das eine war ein Fragment aus BamHI #8' von StuI bis BamHI, und das andere war von BamHI bis StuI (15B).
Das E. coli-beta-Galactosidase-Gen wurde vorher genetisch manipuliert, damit es den gpX-Promotor und die Polyadenylierungssignale wie für S-PRV-013 beschrieben enthält. Um dieses B-Galactosidase-Gen in den Verbindungsbereichs-Klon einzufügen, wurde zunächst ein HindIII-Linker in die StuI-Schnittstelle zwischen BamHI #8 und BamHI #8' eingefügt, und in diese HindIII-Schnittstelle wurde ein HindIII-Fragment, das das beta-Galactosidase-Gen sowie die gpX-Signale enthielt, kloniert.
Das erhaltene Plasmid wurde mit Wildtyp-PRV-DNA nach der Arbeitsweise DNA-TRANSFEKTION, UM REKOMBINANTES VIRUS ZU ERZEUGEN, in Vero-Zellen transfiziert. Es wurde ein Virus aus der Transfektionsstammlösung isoliert, das das beta- Galactosidase-Gen als Insert sowohl in der Verbindungsdeletion (15B) als auch in der gpX-Deletion (15A) enthielt, bedingt durch die vorliegende Homologie mit diesen beiden Bereichen im Plasmid. Dieses Virus wurde mit dem Verfahren SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL gereinigt und wurde als S-PRV-029 bezeichnet. S-PRV-029 ist unter der Zugangsnummer VR 2139 bei der ATCC hinterlegt worden.
Es wurde anhand der Arbeitsweise SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL und der o-Nitrophenylgalactopyranosidbestimmung (33) gezeigt, daß S-PRV-029 beta-Galactosidase exprimiert. Die Struktur dieses Virus ist in 15C gezeigt.
BEISPIEL 12 (*)
S-IBR-002
S-IBR-002 ist ein IBR-Virus mit einer in etwa 800 bp großen Deletion im Wiederholungsbereich des Genoms. Diese Deletion entfernt die einzigen zwei EcoRV-Restriktionsstellen auf dem Virus-Genom und eine anliegende BglII-Schnittstelle (16).
Um dieses Virus zu konstruieren, wurde das DIREKTE LIGATIONS-VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG VON REKOMBINANTEN HERPESVIREN durchgeführt. Mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaute, gereinigte IBR-DNA (Stamm Cooper) wurde mit Plasmid-DNA, verdaut mit dem Restriktionsenzym DraI und das beta-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle des HSV-1-TK-Promotors enthaltend, gemischt. Nach Ligation wurde die Mischung benutzt, um Tierzellen zu transfizieren und die Transfektionsstammlösung wurde mittels des Verfahrens SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MITTELS HYBRIDISIERUNG auf rekombinantem IBR-Virus gescreent. Das Endergebnis der Reinigung war das mit S-IBR-002 bezeichnete rekombinante IBR. Es wurde durch Southern Hybridisierung gezeigt, daß dieses Virus keine Fremdgene trägt. Analyse mit Restriktionsenzym zeigte auch, daß die Insertionsstellen (EcoRV) bei beiden Wiederholungsbereichen deletiert waren. 15 zeigt die Restriktionskarte des EcoRI B-Fragmentes, das die EcoRV-Restriktionsstellen enthält und die Spaltungskarte von S-IBR-002 ohne die EcoRV-Stellen. S-IBR-002 ist bei der ATCC unter Zugangsnummer VR 2140 hinterlegt worden.
BEISPIEL 13 (*)
S-IBR-004
S-IBR-004 ist ein rekombinantes IBR-Virus mit einem eingefügten Fremdgen, Tn5 NEO (Aminogiykosid-3'-Phosphotransferase)-Gen unter der Kontrolle des Pseudorabies-Virus (PRV)-Glykoprotein X-Promotors.
Um dieses Virus zu konstruieren, wurde das HindIII-K-DNA-Fragment aus Wildtyp-IBR-Virus bei der HindIII-Schnittstelle in das Plasmid pSP64 kloniert. Dieses Plasmid wurde als pSY524 bezeichnet. Eine Restriktionskarte des HindIII-K-Fragments ist in der 17 gezeigt. Es wurde die pSY524-DNA von der XhoI-Schnittstelle bis zur HindIII-Schnittstelle, welche die NdeI-Schnittstelle enthielt, in das Plasmid pSP65 kloniert und pSY846 genannt. Aus pSY846 wurde durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen NdeI und EcoRI das NdeI bis EcoRI-Fragment enfernt, gefolgt von POLYMERASE AUFFÜLLREAKTION und LIGATION. Das erhaltene Plasmid wurde pSY862 genannt. Das Plasmid pNEO (P. L. Biochemicals, Inc.) enthält das Aminoglykosid-3'-phosphotransferase (NEO)-Gen und verschafft E. coli-Wirten Resistenz gegen Ampicillin und Neomycin. Der kodierende Bereich dieses Gens (BglII-BamHI-Fragment) wurde isoliert und zwischen den PRV-gpX-Promotor und die HSV-TK-poly A-Sequenz in ein Plasmid mit der Bezeichnung pSY845 kloniert.
Das NEO-Genkonstrukt in pSY845 wurde mit HindIII ausgeschnitten, seine Enden mit dem Verfahren POLYMERASE AUFFÜLL-REAKTION geglättet, und es wurde in die SacI-Schnittstelle des Plasmids pSY862 kloniert. Das Endprodukt wurde pSY868 genannt.
Wildtyp-IBR-DNA wurde mit pSY868-DNA gemischt und die Mischung wurde zur Erzeugung von rekombinantem IBR in Kaninchenhautzellen transfiziert. Das ein funktionelles NEO-Gen tragende rekombinante IBR-Virus wurde daraufhin isoliert und nach dem Verfahren SELEKTION VON HERPESVIRUS MIT RESISTENZ GEGEN G418 gereinigt.
Es wurde anhand der Tatsache, daß mit diesem Virus infizierte Zellen resistent gegen die toxische Wirkung von G418 waren, gezeigt, daß das rekombinante IBR S-IBR-004 das NEO-Gen exprimiert. Eine detaillierte Karte des Plasmidkonstruktes ist in der 17 dargestellt. Die Struktur des S-IBR-004 ist ebenfalls in 17 dargestellt S-IBR-004 ist unter der Zugangsnummer VR 2134 bei der ATCC hinterlegt.
BEISPIEL 14 (*)
S-IBR-008
S-IBR-008 ist ein IBR-Virus mit einer Deletion im einzigartigen kurzen Bereich und einer Insertion des Rinderrotavirus-Glykoproteins 38 (gp38)-Gens in die XbaI-Stelle im einzigartigen langen Bereich.
Zunächst wurde das Rinderrotavirus-gp38-Gen genetisch manipuliert, so daß es, wie in 18 dargestellt, Regulationssignale aus Herpesvirus enthielt. Dies wurde dadurch erreicht, daß das in pSY1053 vorhandene BamHI-Fragment im gp38-Gen zwischen die BamHI- und BglII-Schnittstellen in pSY1052 kloniert wurde. Das erhaltene Plasmid pSY1023 wies den PRV-gpX-Promotor vor dem gp38-Gen auf und das HSV-1-TK-Polyadenylierungssignal hinter dem gp38-Gen auf. Das gesamte Konstrukt wurde von XbaI-Schnittstellen flankiert, um die Insertion des XbaI-Fragments in IBR durch direkte Ligation zu ermöglichen.
S-IBR-004 war das Ausgangsvirus für die Erzeugung von S-IBR-008. S-IBR-004-DNA und pSY1023-DNA wurden zusammen vermischt, mit XbaI geschnitten und gemäß dem DIREKTEN LIGATIONSVERFAHREN ZUR ERZEUGUNG VON REKOMBINANTEN HERPESVIREN in Kanichenhautzellen transfiziert. Die Transfektionsstammlösung wurde mittels der Arbeitsweise SCREENTNG NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT ANTIKÖRPERN unter Anwendung von Antikörpern gegen Rotavirus-gp38-Protein auf rekombinantes Virus gescreent.
Eines der nach diesem Screeningsverfahren gereinigten Viren war S-IBR-008, welches die folgenden charakteristischen Eigenschaften aufweist. Es weist in der XbaI-Stelle in dem langen einzigartigen Bereich des Virusgenoms das insertierte Rotavirus-gp38-Gen sowie die Plasmid-DNA auf, weist aber nicht mehr das NEO-Gen des ursprünglichen S-IBR-004 im einzigartigen kurzen Bereich auf. Es wurde tatsächlich eine kleine Deletion im einzigartigen kurzen Bereich bei der Position des NEO-Gens erzeugt, wie anhand der Abwesenheit einer XbaI-Stelle an dieser Position im S-IBR-008 bewiesen wurde.
Es wurde anhand der Analyse der RNA-Transkription in infizierten Zellen und der Arbeitsweise SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT ANTIKÖRPERN unter Anwendung von spezifischen Antikörpern gegen das gp38-Protein gezeigt, daß S-IBR-008 das Rotavirus-gp38-Gen exprimiert. S-IBR-008 ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer VR 2141 hinterlegt und seine Struktur ist in 18 gezeigt.
BEISPIEL 15
Herpesvirus von Truthähnen
Herpesvirus von Truthähnen (Herpes virus of turkeys, HVT) ist ein weiteres Herpesvirus, das im Hinblick auf Organisation und Struktur den vorher beschriebenen Herpes virus-Beispielen ähnlich ist. Die Restriktionskarte von HVT ist veröffentlicht worden (34). Diese Information wurde als Ausgangspunkt benutzt, um die Insertion von Fremdgenen in HVT durch genetische Manipulation vorzunehmen. Die BamHI-Restriktionskarte von HVT ist in 19A dargestellt. Anhand dieser Daten wurden verschiedene unterschiedliche Bereiche in der HVT-DNA ausgewählt, die als Zielgebiet für die Insertion von Fremdgenen in Betracht kamen. Das für die Insertion gewählte Fremdgen war das E. coli-beta-Galactosidase-Gen (beta-Gal) das wir bei PRV benutzt haben. Der Promotor war der PRV-gpX-Promotor. Das beta-Gal-Gen wurde in den einzigartigen langen (unique long) Bereich von HVT eingefügt und zwar insbesondere in die XhoI-Stelle im BamHI #16 Fragment (3300 bp groß), und es wurde durch die Ausbildung von blauen Kolonien bei Anwendung des Substrates Bluogal gezeigt, daß das Gen in einem rekombinanten HVT exprimiert wird. In gleicher Weise ist das beta-Gal-Gen in die SalI-Schnittstelle im Wiederholungsbereich innerhalb des BamHI #19-Fragments (900 bp groß) eingefügt worden.
Diese Experimente zeigen, daß HVT für die im Rahmen dieser Anmeldung beschriebenen Arbeitsweisen für die Insertion und Expression von Fremdgenen in Herpesviren brauchbar ist. Insbesondere sind zwei Stellen für die Insertion von fremder DNA identifiziert worden (19B und 19C).
BEISPIEL 16
Verfahren zur Konstruktion eines attenuierten Herpesvirus mit einem Fremd-DNA-Insert
Die Anmelder erwarten, daß die hierin offenbarten Verfahren, die für die Attenuierung und Insertion von Fremd-DNA-Sequenzen in PRV, IBR und HVT benutzt sind, für die Konstruktion anderer Herpesviren brauchbar sind, welche attenuiert sind oder eingefügte Fremd-DNA-Sequenzen aufweisen, die in Aminosäuresequenzen in einem Wirt translatiert werden, oder beides. Es wird erwartet, daß Pferdeherpesvirus-1 (equine herpesvirus-1, EHV), Hundeherpesvirus-1 (canine herpesvirus-1, CHV), Katzenherpesvirus-1 (feline herpesvirus-1, FHV) oder irgendein Tier-Herpesvirus, dessen genomischen Struktur mit diesen Viren verwandt ist, für diese Verfahren zugänglich sind. Mehr insbesondere können die nachfolgenden Arbeitsweisen befolgt werden, um solche Viren zu konstruieren.
ZÜCHTUNG VON TIER HERPESVIREN IM ZELLKULTUR. Etablierte Zelllinien oder primäre Zellen können verwendet werden. Die Methodik für das Wachstum dieser Viren liegt in der Literatur vor und erfordert keine neuen Methoden. EHV wächst in Vero-Zellen, CHV wächst in Madin Darby Hundenierenzellen und FHV wächst in Crandell felinen Nierenzellen.
REINIGUNG VON HERPES VIRUS-DNA. Das hierin offenbarte Verfahren zur Reinigung von Herpesvirus-DNA war für alle untersuchten Herpesviren erfolgreich, einschließlich PRV, IBR, HVT und Cytomegalovirus, und stellt ein allgemeines Verfahren dar, das bei allen Herpesviren anwendbar ist.
KLONIERUNG VON RESTRIKTIONS-FRAGMENTEN. Das Klonieren von Restriktionsfragmenten aus Herpesviren ist ein bekanntes rekombinante-DNA-Verfahren und wird bei Maniatis et al. (1) beschrieben.
ZUORDNUNG VON RESTRIKTIONSFRAGMENTEN ZUM GENOM. Es ist von Nutzen, eine Restriktionskarte des Virusgenoms zu besitzen, um Bereiche für Deletion und Insertion zu identifizieren und auszuwählen. Solche Restriktionskarten sind für PRV und IBR verfügbar, und teilweise für HVT. Eine Restriktionskarte von EHV existiert, aber von CHV und FHV nicht. Die Erzeugung dieser Restriktionskarte erfordert keine neuartige Technologie und wird bei Maniatis et al. (1) in Detail beschrieben.
IDENTIFIZIERUNG VON RESTRIKTIONSFRAGMENTEN, DIE MIT DEM WIEDERHOLUNGSBEREICH ÜBEREINSTIMMEN. Die Identifizierung von Wiederholungsbereichen erfordert das Verfahren SOUTHERN BLOTTING DER DNA, das in Detail im Methodenteil beschrieben ist. Klone des Wiederholungsbereiches hybridisieren mit mehrfachen Banden in einem Restriktionsenzymverdau, bedingt durch die Tatsache, daß sie im Virusgenom wiederholt sind. Dieses Merkmal ist in Verbindung mit der Position der Klone im Genom ein Hinweis für das Vorliegen eines Wiederholungsbereichs.
ERSTELLUNG EINER DELETION IM KLON DES WIEDERHOLUNGSBEREICHS. Genetische Information im Wiederholungsbereich ist in der weiteren Kopie des Wiederholungsbereichs im Genom doppelt vorhanden. Aus diesem Grund ist eine Kopie des Wiederholungsbereichs für die Replikation des Virus nicht-essentiell. Deswegen ist der Wiederholungsbereich für Deletionen und Insertionen von Fremd-DNA geeignet. Nachdem der Wiederholungsbereich kloniert und mittels Restriktionsenzymen eine Restriktionskarte erstellt ist, können Enzyme gewählt werden, um den Wiederholungsbereich genetisch zu manipulieren und Fremd-DNA einzufügen. Es ist dem Fachmann klar, daß in einem bestimmten Stück DNA Schnittstellen für die Enzyme vorhanden sein werden, und daß sie durch Analyse gefunden werden können. Die Methodik umfaßt VERDAU MIT RESTRIKTIONSENZYM, AGAROSE-GELEKTROPHORESE DER DNA und LIGATION und die Klonierung in Bakterienzellen, wie bei Maniatis et al. (1) beschrieben.
DIE VORNAHME EINER INSERTION EINES MARKER-GENS IN DIE DELETION IN DEM KLON DES WIEDERHOLUNGSBEREICHS. Die Methodik dieser Insertion ist wie bei Maniatis et al. (1) für die Klonierung von Genen in Bakterien beschrieben. Was vor der vorliegenden Offenbarung nicht offensichtlich war, ist der Auswahl der zu benutzenden Markergene, die in einem Herpesvirus aktiv sein werden, oder auch der Auswahl der zu benutzenden Signalsequenzen für die Expression der Fremdgene in diesen Herpesviren. Das E. coli-beta-Galactosidase-Gen und das Neomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des HSV-1-ICP4-Promotors, des PRV-gpX-Promotors oder des HSV-1-ICP4-Promotors sind verwendet worden. Der gpX-Promotor funktioniert insbesondere bei PRV, IBR und HVT. Die weiteren Promotoren haben auch bei eingeschränkteren Untersuchungen funktioniert.
TRANSFEKTION MIT EINEM MARKERGENKLON UND HERPESVIRUS-DNA. Es ist bei diesem Verfahren die Absicht, die intakte Herpesvirus-DNA und den Klon der Wiederholungsregion, der das Markergen enthält, mit der Deletion in die gleiche Zelle zu bringen. Sobald diese beide DNAs in der gleichen Zelle vorliegen, gewährleisten normale Mechanismen der homologen Rekombination, daß eine Rekombination zwischen den homologen Bereichen in dem Klon und dem gleichen Bereich in der Herpesvirus-DNA eintreten wird, wobei das Markergen mit einer Häufigkeit von in etwa 1% für die deletierten Bereiche im Virus ausgetauscht wird. Die Technik betrifft die im Methodenteil detailliert beschriebene Arbeitsweise DNA-TRANSFEKTION, UM REKOMBINANTES VIRUS ZU ERZEUGEN.
REINIGUNG DER HERPESVIRUS-DNA. Herpesvirus-DNA kann gemäß den oben beschriebenen Verfahren gereinigt werden.
SELEKTION DER REKOMBINANTEN KOLONIE. Sämtliche Herpesviren die bei dieser Erfindung in Betracht gezogen werden, bilden Kolonien (Infektionsherde im Zellkultur), die ihre Reinigung ermöglichen. Eine Kolonie stammt von einer Infektion mit einem einzelnen Virusteilchen. Das bedeutet, daß das Auswählen einer einzelnen Kolonie die Selektion der Nachkommen eines einzelnen Rekombinationsvorgangs darstellt. Diese technische Leistung erfordert ein Verfahren zur Identifikation der auszuwählenden Kolonie. Die hierbei benutzten Verfahren umfassen SOUTHERN BLOTTING DER DNA, um die Kolonie im Hinblick auf die Anwesenheit des insertierten Gens auszuwählen, SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT ANTIKÖRPERN, um die Kolonie im Hinblick auf die Anwesenheit von durch das Gen hergestelltes Protein auszuwählen, SCREENING NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT BLUOGAL, um eine Kolonie im Hinblick auf die Expression des Markergens beta-Galactosidase auszuwählen oder SELEKTION VON HERPESVIRUS MIT RESISTENZ GEGEN G418, um die Kolonie im Hinblick auf ihre Fähigkeit, sich in Anwesenheit des Antibiotikums G-418 zu bilden, auszuwählen. Die ersten beiden Verfahren sind bei jedem Gen anwendbar; die letzten beide sind spezifisch für das beta-Galactosidase-Gen bzw. das Neomycinresistenzgen. Es liegt bei diesen Verfahren zur Screening und Selektion eine solche Biologie vor, daß sie bei allen Herpesviren anwendbar sind, einschließlich EHV, CHV, FHV und sämtlichen verwandten Tierherpesviren.
REINIGUNG DES REKOMBINANTEN VIRUS. Dieses Verfahren umfaßt mehrfaches, aufeinanderfolgendes Reinigen aus Plaques, um das rekombinante Virus komplett völlig frei vom ursprünglichen Virus zu reinigen. Das Screening wird bei jedem Schritt angewandt, um die Kolonie auszuwählen, mit welcher man weitermacht. Die Arbeitsweisen sind dem in der Virologie tätigen Fachmann bekannt.
Multivalente Vakzine für Tiere können durch die Einfügung eines fremden Antigengens in ein Herpesvirus konstruiert werden. Die Arbeitsweisen und Methodik sind mit denen, die bei der anfanglichen Insertion des Markergens in das Virus angewandt wurden, sehr analog und können wie folgt durchgeführt werden.
AUSTAUSCH EINES FREMDEN ANTIGENGEN GEGEN EIN MARKERGEN IM KLON DES WIEDERHOLUNGSBEREICHS. Dies stellt ein Klonierungsexperiment dar, bei dem das Antigengen stromabwärts des gleichen, für das Markergen genutzten Herpesviruspromotors gebracht wird und diese Konstruktion in die gleiche, identische Deletion in dem Klon des Wiederholungsbereichs eingefügt wird. Die Methoden für diese Klonierung sind bei Maniatis et al. (1) beschrieben.
TRANSFEKTION MIT ANTIGENKLON UND MIT DIESEN MARKER ENTHALTENDER REKOMBINANTER HERPES-DNA. Das Markergen, das bereits im Herpesvirusgenom vorhanden ist, kann als Hilfsmittel bei der Selektierung des neuen Rekombinanten verwendet werden. So hat es sich zum Beispiel als nützlich herausgestellt, weiße Kolonien anstelle von blauen als Test für die Abwesenheit der beta-Galactosidase bei diesem Schritt zu selektieren. Ein Grund für die Anwesenheit einer weißen Kolonie ist der Austausch der beta-Galactosidase-Gens durch das fremde Antigengen durch homologe Rekombination (das gewünschte Ergebnis). Fortgesetztes Screening auf diese neue Rekombinante mit dem Verfahren SOUTHERN BLOTTING DER DNA oder dem SCREENTNG NACH REKOMBINANTEM HERPESVIRUS MIT ANTIKÖRPERN wird gezielter, weniger zeitaufwendig und identifiziert in spezifischer Weise die interessierende Rekombinante.
ISOLIERUNG VON REKOMBINANTER HERPES-DNA. Die Transfektions-Prozedur erfordert intakte infektiöse Herpesvirus-DNA. Rekombinante Herpesviren, die ein insertiertes Markergen umfassen, können benutzt werden. Die Prozedur zur Isolierung von Herpesvirus-DNA ist auf diese rekombinanten Viren ebenfalls anwendbar.
SCREENING DER TRANSFEKTIONSSTAMMLÖSUNG AUF DIE INSERTION DES FREMDGENS. Screeningverfahren sind vorstehend beschrieben. Sie stellen eine Kombination von indirekten Methoden (Screening auf Abwesenheit des Markers) sowie direkten Methoden (SOUTHERN BLOT auf das Antigengen, und ANTIKÖRPER SCREENING auf das exprimierte Protein) dar. Die Methoden können nacheinander während der Reinigung des Virus angewandt werden.
REINIGUNG DER DAS FREMDE ANTIGENGEN ENTHALTENDEN REKOMBINANTEN VIREN. Das das fremde Antigengen enthaltende rekombinante Virus kann nach den vorstehend beschriebenen Arbeitsweisen gereinigt werden.
Diese Reihenfolge von Arbeitsschritten zusammen mit den hierin beschriebenen Verfahren und Beispielen erlaubt es jedem Fachmann, diese Erfindung mit jedem Tierherpesvirus erfolgreich umzusetzen.
BEISPIEL 17 (*)
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von genetisch manipulierten Herpesviren um Tiere gegen Krankheit zu schützen. Es war beim Anfang der Untersuchungen nicht klar, welche Deletionen in Herpesviren dienlich wären, um die Viren im gewollten Umfang zu attenuieren, damit sie als Vakzine nutzbar werden. Sogar die Untersuchung von in Betracht kommenden Vakzinen in Tiermodellen, z.B. in Mäusen, funktioniert nicht als valider Indikator für die Sicherheit und Wirksamkeit der Vakzine in der beabsichtigten Tierart, z.B. dem Schwein. Um diesen Punkt in aller Deutlichkeit darzustellen, zeigt Tabelle VII zusammenfassende Daten der Sicherheit und Wirksamkeit verschiedener Pseudorabiesviren, die konstruiert und bei Schweinen nach der Arbeitsweise VAKZINATIONSSTUDIEN IN SCHWEINEN untersucht wurden. TABELLE VII ZUSAMMENFASSUNG DER AM SCHWEIN DURCHGEFÜHRTEN STUDIEN MIT VERSCHIEDENEN PSEUDORABIESVIRUS-KONSTRUKTEN

¹ A = Wiederholungen; B = TK; C = Verbindungsbereich; D = gpX; E = beta-Galactosidase-Insert

Die acht untersuchten Konstrukte weisen die nachfolgenden Deletionen und Insertionen im Genom des virulenten PRV Shope-Stammes auf: S-PRV-001 weist eine Deletion in beiden Wiederholungsbereichen auf; S-PRV-002 weist eine Deletion in beiden Wiederholungsbereichen und in dem Thymidinkinasegen auf; S-PRV-003 weist eine Deletion im Thymidinkinasegen auf; S-PRV-004, S-PRV-010, S-PRV-013, S-PRV-014 und S-PRV-016 werden jeweils in den Beispielen 1, 3, 6, 7 bzw. 8 beschrieben.
Ein Vakzineprodukt mit überlegenen Eigenschaften darf keine klinische Zeichen in Ferkeln im Alter von 3–4 Tagen (im empfindlicheren Alter) hervorrufen und muß einen 100%-igen Schutz in Schweinen in jedem Alter verleihen. Aus Tabelle VII ist es offensichtlich, daß jeder Vakzine-Kandidat ein gewisses Maß an Attenuierung und Schutz in Schweinen verschaffte, aber jede Vakzine ergab eine einzigartige Antwort. Den bislang besten Vakzine-Kandidaten aus dieser Liste stellt S-PRV-013 dar, welches drei Deletionen aufweist; eine im Wiederholungsbereich, eine im TK-Gen und eine im gpX-Gen. Die Nützlichkeit dieser Kombination von Deletionen war unerwartet. Diese Ergebnisse sind neuartig, unvorhersehbar und nützlich bei der Auswahl eines Pseudorabies-Vakzineprodukts mit überlegenen Eigenschaften.
LITERATUR

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Claims

Rekombinantes Truthahn-Herpesvirus, umfassend eine Fremd-DNA, die in einen nicht-essentiellen Bereich des Truthahn-Herpesvirus Virusgenoms eingefügt wurden, die in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, die mit dem Truthahn-Herpesvirus infiziert ist.
Rekombinantes Truthahn-Herpesvirus gemäß Anspruch 1, wobei die Fremd-DNA in den BamHI 16 Bereich des Truthahn-Herpesvirus Virusgenoms eingefügt wurde.
Rekombinantes Truthahn-Herpesvirus gemäß Anspruch 2 wobei die Fremd-DNA in der XhoI Stelle der BamHI 16 Region des Truthahn-Herpesvirus Virusgenoms insertiert ist.
Rekombinantes Truthahn-Herpesvirus gemäß Anspruch 1, wobei die Fremd-DNA Sequenz ein Polypeptid kodiert.
Rekombinantes Truthahn-Herpesvirus gemäß Anspruch 4, wobei das Polypeptid antigen ist.
Rekombinantes Truthahn-Herpesvirus gemäß Anspruch 4, wobei das Polypeptid E. coli Beta-Galactosidase ist.
Impfstoff, welcher eine wirksame, immunisierende Menge des rekombinanten Truthahn-Herpesvirus gemäß Anspruch 1 sowie einen geeigneten Träger umfaßt.