DE19627193B4

DE19627193B4 - Rekombinantes myxomatisches Virus

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Publication number: DE19627193B4
Application number: DE19627193A
Authority: DE
Inventors: Stéphane BERTAGNOLI; Jacqueline Gelfi; Corine Boucraut-Baralon; Frédérique Petit; Alain Milon
Original assignee: Ecole Nationale Veterinaire De Toulouse; ENVT TOULOUSE; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Ecole Nationale Veterinaire De Toulouse; ENVT TOULOUSE; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2016-07-06
Also published as: ITTO960578A0; FR11C0050I1; ITTO960578A1; ES2113322A1; DE19627193A1; IT1286307B1; FR2736358A1; FR11C0050I2; FR2736358B1; ES2113322B1

Abstract

Abgeschwächtes, lebendes, rekombinantes, myxomatisches Virus, enthaltend wenigstens eine Fremd-Nukleotidsequenz, die für ein Immunogen eines pathogenen Erregers von Hasenartigen codiert, wobei die Nukleotidsequenz in Abhängigkeit eines Promotors, der in eines für die Replikation des besagten Virus nicht wesentlichen Gene eingefügt wurde, exprimiert wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein abgeschwächtes, lebendes, rekombinantes, myxomatisches Virus, seine Verwendung zur Herstellung eines Impfstoffes sowie einen derartigen Impfstoff.
Die vorliegende Erfindung betrifft im besonderen einen rekombinanten Myxomatose/virale hämorrhagische Kaninchenkrankheit-Impfstoff, welcher zum gleichzeitigen Impfen von Hasenartigen gegen diese zwei Krankheiten verwendet werden kann.

Das myxomatische Virus, bei dem es sich um ein Kaninchen-Pockenvirus handelt, weist die Eigenschaften auf, die allen Pockenviren gemeinsam sind. Die Pockenviren gehören zu einer DNA-Doppelstrang-Virusfamilie, die sich im Zytoplasma der eukaryotischen Wirtzellen replizieren. Der zentrale Teil des myxomatischen Virusgenoms enthält die erforderlichen Gene für die Transkription, Replikation und Virusreifung.

An den äußersten Enden dieses Genoms liegen die Gene, die für den viralen Zyklus nicht wesentlich sind und für Proteine kodieren, die insbesondere die Virulenz des Virus bestimmen.

Bekanntermaßen stellt die Myxomatose heutzutage eine der viralen Haupterkrankungen von Hasenartigen dar, insbesondere von Wild- und Hauskaninchen. Der Hase ist seinerseits für das Virus empfänglich, jedoch wenig empfindlich.

Nach Infektion und 3 – 5tägiger Inkubation der Krankheit beobachtet man insbesondere das Auftreten von pseudotumoralen Hautschädigungen (die Myxome), eine schmerzhafte Entzündung der Augenlider oder Lidränder und einen eitrigen Ausfluss (Bindehautentzündung und NAsenschleimhautentzündung), was in einigen Tagen zum Tod des Tieres führt.

Opgenorth et al. (Journal of Virology, Aug. 1992, S. 4720-4731) führten Deletionsanalysen zweier Virulenzgene des Myxomavirus, nämlich M11L und MGF, durch, um deren Rollen bei der Ausprägung der Myxomatose zu untersuchen. In den Studien wurden verschiedene mutante Formen des Myxoma-Virus erzeugt, die, eingeführt in Kaninchen, zu verschieden schweren Ausprägungen der Krankheit führten. Aus diesen Ergebnissen wurde auf die wichtige Funktion der Virulenzfaktoren MGF und M11L bei der Entwicklung der Myxomatose geschlossen.

Die sanitäre Prophylaxe vor der Myxomatose ist auf Grund ihrer Seucheneigenschaften (Übertragung im Wesentlichen über Arthropodenträger, hauptsächlich Flöhe und Stechmücken) sehr schwierig durchzuführen. Allein eine allgemeine medizinische Prophylaxe kann ihre Ausbreitung und die Sterblichkeit der Kaninchen begrenzen.

Allerdings ist diese genauso kompliziert durchzuführen, da die derzeitigen Züchtungspraktiken (Produktion in Hallen...) diese gesundheitliche Prophylaxe nicht begünstigt.

Die zahlreichen auf diesem Gebiet seit Jahren durchgeführten Forschungen führten zur Entwicklung von Impfverfahren, die mehr oder weniger wirksam gegen diese Krankheit sind.

In Frankreich wurde ein Impfverfahren entwickelt, das auf der Verwendung eines dem myxomatischen Virus verwandten Kaninchen-Pockenvirus, dem Shope-Fibrom-Virus, bei der Erstimpfung und eines myxomatischen Virusstammes, der durch aufeinander folgende Passagen in zellulärer Kultur abgeschwächt wurde, insbesondere der Stamm SG33, für die Nachimpfungen beruht.

Obwohl sich das Virus SG33 als ein sehr stabiles Virus erwies, stellte man fest, dass es für die jungen Tiere wenig brauchbar war und in den Züchtungen auf Grund einer immunodepressiven Restfähigkeit ein hohes Risiko barg.

Jedoch ist die Myxomatose nicht die einzige Krankheit, die Hasenartige betrifft. Sie sind außerdem besonders empfindlich gegenüber 9 anderen pathogenen Erregern, nicht nur viralen, sondern auch bakteriellen oder parasitären Ursprungs.

Es handelt sich dabei beispielsweise um die virale hämorrhagische Kaninchen-Krankheit oder RVHD (für Rabbit Viral Haemorrhagic Disease), das EBHS (für European Brown Hare Syndrome), die von Rotaviren verursachten Krankheiten, die von Francisella tularensis verursachte Tularämie, die Kokzidose, die Darmentzündungen, insbesondere verursacht von E. coli oder Clostridien, die vom "Bacillus piliformis" verursachte Tyzzer-Krankheit, die Enzephalitozoonose, die Pasteurellose und die Staphylokokkeninfektion.

Um gegen diese verschiedenen, für diese Erkrankungen verantwortlichen Erreger anzukämpfen, wurden verschiedene Forschungen durchgeführt, die jedoch nur zu sehr mittelmäßigen Ergebnissen führten oder aus einem industriellen Gesichtspunkt schwer durchzuführen waren.

Beispielsweise wurden derartige Forschungen über die virale hämorrhagische Kaninchenkrankheit (RVHD) durchgeführt, die ebenso eine der viralen Haupterkrankungen von Hasenartigen ist.

So beschreiben Laurent et al. (Journal of Virology, Okt. 1994, S. 6794-6798) die Expression des rekombinanten Kapsid-Proteins VP60 des Virus der hämorrhagischen Kaninchenkrankheit in einem Baculovirus-Vektor in Sf9-Insektenzellen. Das von den infizierten Zellen in das Medium sekretierte, rekombinante VP60 multimerisierte zu virusähnlichen Partikeln (VLP's), die anschließend aus dem Überstand der infizierten Insektenzellen isoliert und in gereinigter Form dazu verwendet wurden, Kaninchen zu immunisieren.

Das RVHD-Virus wird im Allgemeinen über den Weg der Nahrung und/oder Getränke übertragen.

In der akuten Form tritt der Tod des Kaninchens 48 bis 72 Stunden nach der Infektion ein.

Nach der Autopsie stellt man eine Anzahl innerer Blutungen fest, sowie schwere Schädigungen der Leber, der Luftröhre und der Lungen des Tieres.

Derzeitig basiert die medizinische Prophylaxe gegen RVHD auf der Verwendung eines Impfstoffes aus inaktivierten Viren, extrahiert aus vorrangig den Lebern geimpfter Tiere.

Es stellte sich schnell heraus, daß diese Technik einen beträchtlichen Nachteil darstellt. In der Tat ist dieses Verfahren, das auf einer Extraktion der Viren aus den Lebern geimpfter Tiere beruht, schwierig. Jedoch ist es bis heute eines der wenigen bekannten Verfahren, da das RHDV (Rabbit Haemorrhagic Disease Virus) in zellulären Systemen unmöglich zu kultivieren ist.

Zusammengefaßt treten bei den derzeitigen Prophylaxen gegen die Myxomatose und die anderen Krankheiten Hasenartiger folgende Probleme und Nachteile auf:

– sie sind manchmal schwierig durchzuführen, da sie auf "schweren" Techniken beruhen;
– sie sind nicht immer wirksam und zeigen manchmal unerwünschte Nebenwirkungen;,
– sie erlauben nicht die gleichzeitige Bekämpfung mehrerer Krankheiten;
– sie sind nur sehr schwierig im industriellen Maßstab anwendbar.

Die erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, einen Impfstoff zum Impfen Hasenartiger gegen die Myxomatose und die virale hämorrhagische Kaninchenkrankheit zur Verfügung zu stellen, welcher die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile nicht aufweist.

Um die technischen Probleme zu lösen und die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden, wurden die Forschungen, die zu der vorliegenden Erfindung führten, auf ein rekombinantes, myxomatisches Virus und einen Impfstoff auf Basis eines derartigen rekombinanten Virus gerichtet, der ein wirksames und gleichzeitiges Impfen von Hasenartigen gegen die Myxomatose und eine andere Krankheit erlaubt, das, obgleich sehr spezifisch, leicht durchzuführen ist.

Zu diesem Zweck wurden die nicht wesentlichen Gene im Genom des myxomatischen Virus, insbesondere das TK-Gen, wel ches für die Thymidinkinase codiert, und die Gene M11L und MGF, die in die pathogene Fähigkeit verwickelt sind, geändert, um neue, rekombinante, deletierte und abgeschwächte Viren zu erhalten, die zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Myxomatose verwendet werden können und ebenfalls die fremden Antigene exprimieren.

Derartige Rekombinationen zwischen dem Genom eines myxomatischen Virus und einem oder mehreren Genen, die für Antigene codieren, die auf verschiedenen pathogenen Erregern vorliegen, erlauben eine Impfung von Hasenartigen nicht nur gegen die Myxomatose, sondern auch gegen eine weitere infektiöse Krankheit bzw. Krankheiten.

Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung ein abgeschwächtes, lebendes, rekombinantes myxomatisches Virus gemäß Ansprüchen 1 bis 13 zur Verfügung, enthaltend wenigstens eine Fremd-Nukleotidsequenz, die für ein Immunogen eines pathogenen Erregers von Hasenartigen codiert, wobei die Nukleotidsequenz in Abhängigkeit eines Promotors, der in eines der für die Replikation des besagten Virus nicht notwendigen Gene eingeführt wurde, exprimiert wird.

Vorteilhafterweise codiert die Nukleotidsequenz für ein Capsid-, Membran- oder Hüllprotein eines viralen, bakteriellen oder parasitären Erregers von Hasenartigen.

Vorzugsweise ist der pathogene Erreger ausgewählt aus dem RVHD-Virus, dem EBHS-Virus, den Rotaviren, den für die Enzephalitozoonose verantwortlichen Protozoen, den Enterobakterien, insbesondere E. Coli und den Clostridien, "Bacillus piliformis", den Kokzidien, den Pasteurella, Francisella tularensis und den Staphylokokken.

Vorteilhafterweise stammt das myxomatische Virus von einem Kaninchenpocken-Virusstamm, wie beispielsweise SG 33, LEON 162, HONGROIS, FINISTERE, R 801, TOULOUSE 1 oder LAUSANNE, ab.

Diese verschiedenen Stämme werden in einem Depot bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.) unter folgenden Bezeichnungen aufbewahrt:

Bei dem Stamm 801 handelt es sich um einen Stamm des respiratorischen Typs, d. h., er induziert eine respiratorische Erkrankung bei den Kaninchen, jedoch ohne Myxome; die Stämme TOULOUSE 1 und LAUSANNE sind klassische virulente Stämme, die jedoch durch Deletion abgeschwächt werden können.

Diese verschiedenen Stämme weisen bezüglich ihrer Kultur die üblichen Eigenschaften und Charakteristika auf. Vorzugsweise sind die besagte Nukleotidsequenz und der Promotor in die Gene M11L-MGF oder TK des myxomatischen Virus inseriert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines abgeschwächten, lebenden, rekombinanten Virus, wie vorangehend beschrieben, zur Herstellung eines Impfstoffes zum wirkungsvollen und gleichzeitigen Impfen der Hasenartigen gegen die Myxomatose und eine andere infektiöse Krankheit gemäß Ansprüchen 14 bis 20.

Vorteilhafterweise enthält der erfindungsgemäße Impfstoff als Vektor das abgeschwächte, lebende, rekombinante, myxomatische Virus, wie vorangehend beschrieben.

Vorteilhafterweise enthält der Impfstoff eine wirksame Impfdosis des rekombinanten, myxomatischen Virus.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen rekombinanten Impfstoff zum gleichzeitigen Impfen Hasenartiger gegen die Myxomatose und die vira le hämorrhagische Kaninchenkrankheit (RVHD), dadurch gekennzeichnet, daß er als Vektor das abgeschwächte, lebende, myxomatische Virus, enthaltend eine Nukleotidsequenz, die für ein antigenes Polypeptid des Virus der hämorrhagischen viralen Kaninchenkrankheit codiert, die in Abhängigkeit eines Promotors exprimiert wird enthält.

Vorzugsweise codiert die besagte Nukleotidsequenz das Capsidprotein VP60 oder VP60+VP12 des Virus der viralen hämorrhagischen Kaninchenkrankheit.

Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Promotor der Nukleotidsequenz um den frühen/späten Vaccinapromotor P7,5.

Vorteilhafterweise enthält die wirksame Menge an rekombinantem Virus pro Impfdosis zwischen 10² und 10⁹ Äquivalente pfu (plaquebildende Einheiten oder "plaque forming units") und für den intradermalen Weg vorzugsweise zwischen 10³ und 10⁶ Äquivalente pfu.

Vorteilhafterweise ist der Impfstoff in Hinblick auf eine parenterale, vorzugsweise intradermale, oder orale Verabreichung formuliert.

Im Fall der viralen hämorrhagischen Kaninchenkrankheit (RVHD) wurde ein rekombinantes Myxomatose-RHDV-Virus, ausgehend von einem einzigen und gleichen abgeschwächten, lebenden Virus, der vom Stamm SG33 abstammt und in den ein für das Protein VP60 codierendes Capsidgen des RHDV kloniert worden ist, hergestellt.

Gleichermaßen wurde ein anderes rekombinantes Virus mit Totaldeletion der Sequenzen M11-L und MGF, Eliminierung des Reportergens LacZ und Einführung eines Polystops stromabwärts der Sequenz VP60 hergstellt.

Derartige Myxomatose-RHDV-Rekombinanten erlauben eine anti-Myxomatose- und anti-RVHD (Rabbit Viral Haemorrhagic Disease)-Doppelimpfung und lösen damit das Problem bzw. die Probleme bezüglich dieser beiden pathogenen Erreger in der Kaninchenzüchtung.

Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung des experimentellen Protokolls ersichtlich, welches, in Bezug auf die Figuren, nicht limitativ eine Ausführungsform der Erfindung darstellt, nämlich die Herstellung eines rekombinanten Myxomatose-RHDV-Virus, wobei:

1 ein Schema zeigt, welches die Konstruktion der Plasmide pSM1 und pSM2, ausgehend vom Plasmid pSC11-(VP60 + VP12) und den Genen M11L-MGF und TK des Virusstammes SG33, darstellt;

2A einen Southern Blot nach Lauf einer PFGE und Hybridisierung mit einer SG33-Gesamtsonde zeigt;

2B einen Southern Blot nach Lauf einer PFGE und Hybridisierung mit einer VP60-Sonde zeigt;

die 3A und 3B die Elektrophoresegele, erhalten nach Immunopräzipitation des Virus SG33, RecIA122 und RecB2111, darstellen;

4 die Titrationskurven von anti-VP60-Antikörpern (d. h. anti-RVHD), erhalten durch einen ELISA-Test, nach Impfung der Kaninchen mit den Viren Rec A und Rec B, zeigt;

5 die Titrationskurven von anti-Myxomatose-Antikörpern, erhalten durch einen ELISA-Test, nach Impfung der Kaninchen mit den Viren SG33, Rec A und Rec B, zeigt;

6 die Titrationskurven von anti-Myxomatose-Antikörpern, erhalten durch Seroneutralisation, nach Impfung der Kaninchen mit den Viren SG33, Rec A und Rec B, zeigt;

7 eine Graphik ist, die die Kinetik der anti-Myxomatosevirus- und Anti-RHDV-Antikörper und die Antwort auf einen Virulenztest durch den Stamm T1 des Myxomatosevirus nach Impfung der Kaninchen auf oralem Weg mit der Rekombinanten Rec B, zeigt;

die 8a und 8b Graphiken sind, die die Kinetik der anti-Myxomatosevirus- und anti-RHDV-Antikörper und die Antwort auf einen Virulenztest durch das RHDV nach Impfung der Kaninchen auf oralem Weg mit den Rekombinanten Rec A und Rec B und dem Stamm SG33, zeigt;

9 schematisch die Konstruktion des zur Herstellung der Rekombinanten "26b" verwendeten Plasmids und die offenen Leseraster des Bereichs von UTPase/VP60/M9-L in den 6 möglichen Rahmen zeigt;

9a die physikalische und genetische Karte der Region M11-L/MGF von SG33 zeigt;

9b die physikalische und genetische Karte des Fragments XhoI-NotI von pAT VP60 zeigt;

9c die Kartographie der Codons AUG (_|) und der Stopcodons ( | / |) zeigt und

10 schematisch die Rekombinationsereignisse in der Konstruktion der Myxomatose/VP60-Rekombinanten "26b" zeigt.

Zu allererst wird das myxomatische Virus SG33 (Vaccinastamm) auf RK13-Zellen bei 37°C in Anwesenheit des Mediums OptiMEM mit 2 % FCS (fötales Kälberserum) kultiviert.
Das virale Genom enthält die Gene M11L und MGF, die an seinem linken äußersten Ende liegen. Diese beiden Gene sind im Tandem plaziert, wobei der 3'-Bereich von M11L mit dem 5'-Bereich von MGF überlappt (2 Leseraster).
Eine 1.063 bp-Sequenz, enthaltend die zwei Leseraster und die Promotorbereiche, wurde durch die PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifiziert.
Die verwendeten Startermoleküle waren folgende:

–GTAGGATCCGTAACAAGTGTAAATATA (SEQ ID 1)
–CCCGGGATGTTTTCGCGATGTGA (SEQ ID 2)

Die Amplifikation wurde in Anwesenheit einer Unit Taq-Polymerase in einem Perkin-Elmer-Apparat unter Verwendung des folgenden Programms über 30 Zyklen durchgeführt: eine Minute 50°C, eine Minute 72°C und eine Minute 95°C.
Das erhaltene Produkt wurde danach durch ein 0,7 %iges Agarosegel und nachfolgender Anfärbung in ETB visualisiert. Gleichermaßen wurde eine Amplifikation des TK-Gens des Virus SG33 unter den gleichen Bedingungen und mit Hilfe der folgenden Startermoleküle durchgeführt (Sequenz des Stammes LAUSANNE):

–GGTGTTGGATAAGGAAGTTACG (SEQ ID 3)
–GAGGTCGCTGTCGGAGACG (SEQ ID 4)

Das erhaltene 700 bp-Produkt enthält das offene Leseraster und die regulatorischen Sequenzen.
Die erhaltenen Amplikons wurden in das Plasmid PGEMT (Promega) kloniert. Die Sequenz M11L-MGF wurde anschließend in pSK+(Stratagene) in die Stellen ApaI und SpeI subkloniert.
Außerdem wurde das Gen VP60 mit seinen Promotorsequenzen, gefolgt von der Sequenz VP12 am 3'-Ende, in Form von cDNA in pSK+ kloniert. Das VP60-Protein ist das einzige Capsidprotein von RHDV.
Nach Verdau mit SacI und SmaI und anschließender Behandlung mit dem Klenowfragment der DNA-Polymerase I, wurde ein 2,2 kb-Fragment, enthaltend den ORF von VP60 und VP12, in die SmaI-Stelle des Plasmids PSC11 kloniert, was das Plasmid pSC11-VP60+VP12 ergab.
Das Plasmid pSC11-VP60+VP12 wurde am 3'-Ende mit NotI und am 5'-Ende partiell mit PstI verdaut, was ein 5,6 kb-Fragment (Fragment A), enthaltend das Gen der βgal unter Kontrolle des späten Vaccinapromotors P11K und die Gene VP60+VP12 stromabwärts des frühen/späten Vaccinapromotors P7,5, ergab.
Das Ganze wurde in pSK+ in die NotI- und PstI-Stellen subkloniert (pSK+-A).
Nach Amplifikation der Gene TK und M11L-MGF des Stammes SG33 durch PCR wurden die erhaltenen Amplikons in pGEMT kloniert und anschließend in das Plasmid pSK+ als M11L-MGF subkloniert.
Das Plasmid pGEMT-TK wurde mit EcoRV verdaut und, nach Verdau mit NotI und KpnI, das Fragment A in pGEMT-TK an der EcoRV-Stelle integriert, was das Plasmid pSM2 ergab, dessen richtige Orientierung (das VP60-Gen gegen das äußerste 3'-Ende des TK-Gens) durch PCR und Restriktionsprofil verifiziert wurde.
Hinsichtlich pSK+ (M11L-MGF) ermöglichten die Verdaue mit HincII und BsaBI eine Deletion der ORFs der Gene M11L und MGF von 356 bp und die Insertion eines kleineren Fragmentes von 5,3 kb (Fragment B), welches aus dem HindIII-Verdau von pSK+(A) hervorgegangen war, und nicht die Sequenz VP12 enthält, in die besagten HincII- und BsaBI-Stellen, was pFM1 ergab.
Die richtige Orientierung (VP60 gegen das äußerste 3'-Ende von MGF) wurde durch PCR und Restriktionsprofil verifiziert.
Für jedes Plasmid ist die korrekte Orientierung diejenige, bei der der Transkriptionssinn des VP60-Gens dem des TK-Gens oder der M11L-MGF-Gene entspricht. Dieses wird durch ein Restriktionsprofil und PCR-Amplifikation unter Verwendung eines externen Startermoleküls, entsprechend den Sequenzen TK oder M11L-MGF, und eines internen Startermoleküls, entsprechend der Sequenz βgal oder VP60, verifiziert.
Die rekombinanten Viren wurden gemäß eines modifizierten Verfahrens der Standardmethode zum Erhalt von mutanten Pockenviren konstruiert.
Die 24 Stunden alten RK13-Zellen mit 90%iger Konfluenz wurden mit 0,03-0,04 pfu/Zelle des Virus SG33 infiziert.
Nach 2 Stunden bei 37°C wurde das virale Inokulum entfernt und die Zellen zweimal mit OptiMEMSS (ohne Serum) gewaschen. Die Transfektionsmischung wurde zu 3 ml OptiMEMSS gegeben und danach den Zellen zugefügt. Diese Transfektionsmischung enthält 10 μg pSM1 oder pSM2, welches zuvor über einem Zeitraum von 20 Minuten mit 40 μg Lipofektamin gemischt worden war.
Das Ganze wurde bei 37°C 5 1/2 Stunden stehengelassen, dann mit 3 ml OptiMEM mit 4 % fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt und in den Inkubator zurückgestellt (37°C). Nach 48 Stunden wurden die Rekombinationsprodukte drei Einfrier-Auftau-Zyklen und einer 20sekündigen Beschallung (maximale Stärke, Schallgerät B15 Branson) unterzogen und danach auf 24 Stunden alten RK13-Zellen in OptiMEM mit 2 % FCS ausgebreitet.
48 Stunden später wurde das Flüssigmedium durch ein Festmedium (2× M.E.M.E, 1 % LM-Agarose (Low Melting) und 2,5 FCS) ersetzt, welches nach 48 Stunden mit einer Lage Agarose bedeckt wurde, die die Detektion der rekombinanten Viren ermöglicht (2× M.E.M.E., 1 % LM, 1 % RN (Neutralrot) und 330 μg/ml Xgal). Jeder blaue Plaque, der die Anwesenheit des rekombinanten Virus signalisiert, wurde entnommen und in DMEM mit 2,5 % FCS verdünnt, um, nach Einfrieren-Auftauen und Beschallung, auf RK13-Zellen wieder ausgebreitet zu werden. Nach 5 Reinigungszyklen unter 1 %iger LM-Agarose wurden die rekombinanten Viren auf RK13-Zellen vermehrt.
Die genomische Struktur der rekombinanten Viren wurde durch PCR und anschließende Southern-Blot-Analyse bestätigt. Das rekombinante Virus Myx.(ΔM11L-MGF)(VP60) wird als RecB2111 (Rec B) und das rekombinante Virus Myx.[TK-(VP60+VP12)] als RecIA122 (Rec A) bezeichnet.
Wie zuvor beschrieben, wurden die rekombinanten Viren RecIA122 und RecB2111 durch ein klassisches Verfahren erhalten, in dem die Selektion der Virusmutanten mit Hilfe einer Blaufärbung, entstanden durch den Abbau von Xgal durch die β-Galaktosidase, erreicht wird.
Die "Lysehöfe", die von RecIA122 (RecA) und dem Virus SG33 produziert werden, sind hinsichtlich Größe und Erscheinung äquivalent. Bei RecB2111 (Rec B) sind die Höfe kleiner, ohne daß sich das nachteilich auf die virale Produktion auswirkt.
Nach der Verifizierung durch PCR werden die Viruskandidaten durch Southern-Blot nach einem Lauf zur Auftrennung mittels der Elektrophoresetechnik im pulsierten Feld (PFGE) analysiert.
Auf diese Weise kann man einen Restriktionspolymorphismus zwischen den rekombinanten Viren und dem SG33 beobachten.
Die Stufen der elektrophoretischen Analyse sind im folgenden erklärt.
Die Inserts aus der von 0,75 %igen Agarose, enthaltend den zytoplasmatischen Extrakt des Äquivalenten von 10⁶ RK13-Zellen, die mit einem rekombinanten Virus oder dem SG33-Virus infiziert worden waren, werden in einem 1× Verdaupuffer 15 Minuten bei 4°C präinkubiert. Anschließend werden 80 U Restriktionsenzym (HindIII oder PstI) zugegeben und das ganze 12 Std. bei 37°C inkubiert.
Die so behandelten Insertionen werden auf ein 1%iges Agarosegel getragen, wo sie einer elektrophoretischen Wanderung im elektrischen Feld (Alternanz 1,5 s) in einem 0,5× TBE-Puffer bei 275 Volt über 7 Stunden unterzogen werden. Die erhaltenen Profile werden nach Anfärbung in ETB visualisiert.
Im Hinblick auf die Vervollständigung der Analyse der genomischen Struktur verwendet man die Technik des Southern-Blot. Die Elektrophoresegele werden zuvor auf Nylonmembran transferiert. Ein DNA-Fragment von 830 bp, welches den internen ClaI-ClaI-Stellen des VP60-Gens und der gesamten DNA des SG33-Virus entspricht, wird mit Digoxigenin durch "Random-Priming" markiert. Nach Hybridisierung über Nacht mit einer der beiden Sonden wird die Detektion durch eine chemiluminiszente Reaktion, die auf den Abbau eines Substrats durch die Alkalische Phosphatase, welche an einen anti-Digoxigenin-Antikörper gekoppelt ist, folgt, durchgeführt. Nach Anfärbung in ETB und Hybridisierung mit einer SG33-Gesamtsonde erscheinen deutliche Unterschiede zwischen den Verdauprofilen der Virusrekombinanten und des Virus SG33. Diese Restriktionsprofile sind in 2 dargestellt.
Ausgehend von den Restriktionsprofilen mit HindIII und PstI des myxomatischen Virus des Stammes LAUSANNE werden die DNA-Fragmente, enthaltend die Gene TK und M11L-MGF, identifiziert.
Es wird darauf hingewiesen, daß das 5,6 kb-Fragment (Fragment A) eine HindIII- und eine PstI-Stelle zu denen, die bereits auf dem Genom von SG33 existieren, hinzufügt.
Das ist ebenfalls in 2 dargestellt, wo:

Spur 1: DNA des Virus SG33, verdaut mit PstI,
Spur 2: DNA des Virus RecIA122, verdaut mit PstI,
Spur 3: DNA des Virus RecB2111, verdaut mit PstI,
Spur 4: DNA des Virus RecB2111, verdaut mit HindIII,
Spur 5: DNA des Virus RecIA122, verdaut mit HindIII,
Spur 6: DNA des Virus SG33, verdaut mit HindIII,

In der Tat beobachtet man in 2 in den Profilen das Verschwinden einer Bande von etwa 32 kb des Virus RecIA122 zugunsten zweier Banden von ungefähr 25 kb und 7 kb (2A, Spur 5 und 6) und eine Bande von 60 kb zugunsten einer von etwa 30 kb (Spur 1 und 2).
Gleichermaßen fügt das 5,3 kb-Fragment zwei PstI- und eine HindIII-Stelle hinzu, was einerseits das Verschwinden einer Bande von 23 kb (2A, Spur 3) und andererseits das Erscheinen von zwei Banden von 13 kb und 8 kb (2A, Spur 4), in den Profilen, die mit dem Virus RecB2111 erhalten werden, bewirkt.
Auf der anderen Seite bestätigt die Hybridisierung mit einer internen (ClaI-ClaI)-VP60-Sonde von 830 bp die Anwesenheit eines einzigen Inserts in dem myxomatischen Genom bei jedem rekombinanten Virus, wie man in 2B feststellen kann, wo:

Spur 1: DNA des Virus RecIA122, verdaut mit PstI,
Spur 2: DNA des Virus RecB2111, verdaut mit PstI,
Spur 3: DNA des Virus RecB2111, verdaut mit HindIII,
Spur 4: DNA des Virus RecIA122, verdaut mit HindIII,

Die Expression von VP60 in der zellulären Kultur wurde durch Immunopräzipitation und Immunofluoreszenz verifiziert. Die konfluenten, 24 Stunden alten RK13-Zellen, infiziert mit 30 pfu/Zelle der rekombinanten Viren RecB2111 oder RecIA122, werden mit ³⁵S-Methionin (100 μci/ml) über 5 1/2 Stunden markiert.
Am Ende dieser Markierung werden die Zellen geerntet, lysiert und die Cytosole in Anwesenheit von Protein A-Sepharose entweder mit einem anti-Myxomatose- und RVHD-Immunoserum oder mit einem polyklonalen anti-RVHD-Antikörper oder mit 2 monoklonalen anti-VP60-, 61A47- und 4E3-Antikörpern ausgefällt.
Die so markierten und ausgefällten Proteine werden einer SDS-Gelelektrophorese (PAGE) mit 10 % unterzogen (3A und 3B).
Das VP60-Protein wird auf den infizierten RK13-Zellen durch indirekte Immunofluoreszenz visualisiert. Dafür werden die mit dem einen oder anderen rekombinanten Virus infizierten Zellen 20 Stunden nach der Infektion mit einer Lösung aus 50 % Ethanol/50 % Aceton fixiert, bevor sie mit dem polyklonalen oder monoklonalen anti-VP60-Antikörper versetzt werden. Die Detektion wird durch einen anti-Kaninchen- oder anti-Maus-FITC-Antikörper realisiert.
Nach Immunopräzipitation erscheint für die beiden Viren in der SDS-PAGE eine klare Proteinbande von etwa 60 kDa, welche die Anwesenheit des Proteins VP60 signalisiert.
Die nach Immunopräzipitation auf RK13-Zellen und Elektrophorese erhaltenen Gele sind in den 3A und 3B dargestellt.
Das in 3A gezeigte Elektrophoresegel wurde nach folgendem Protokoll ausgeführt:

Spur 1: Proteine der RK13-Zellen, infiziert mit dem Virus SG33,
Spur 2: Proteine der RK13-Zellen, infiziert mit dem Virus RecIA122,
Spur 3: Proteine nichtinfizierter Zellen,
PM: Molekularer Gewichtsmarker
Serie a: Ausfällung duch ein anti-Myxomatose- und anti-RVHD-Immunoserum,
Serie b: Ausfällung durch ein anti-RVHD-Immunoserum
Serie c: Ausfällung durch einen monoklonalen anti-VP60-Antikörper (61A47)
Serie d: Ausfällung durch einen monoklonalen anti-VP60-Antikörper (4E3).

Gleichermaßen wurde das in 3b gezeigte Elektrophoresegel nach folgendem Protokoll ausgeführt:

Spur 1: Proteine der RK13-Zellen, infiziert mit SG33.
Spur 2: Proteine der RK13-Zellen, infiziert mit RecB 2111,
Spur 3: Proteine der nichtinfizierten RK13-Zellen, PM: Molekularer Gewichtsmarker.
Serie a: Ausfällung mit einem anti-Myxomatose-Immunoserum,
Serie b: Ausfällung mit einem anti-RVHD-Immunoserum,
Serie c: Ausfällung mit einem anti-VP60 monoklonalen Antikörper (61A47).

Bei der Immunofluoreszenz auf RK13-Zellen läßt die zytoplasmatische Fluoreszenz, die mit Hilfe des anti-VP60-Antikörpers erhalten wurde, keinen Zweifel an der Expression von VP60 durch die beiden rekombinanten Viren.
Nach Verifikation der richtigen Expression von VP60 in vitro wurden zwei 5 Wochen alte Kaninchen einer Einzelinjektion auf intradermalem Weg (ID) von 5 × 10³ pfu rekombinanten Viren unterzogen.
An dieser Stelle soll daran erinnert werden, daß im Fall von jungen, kaum abgesetzten Tieren die klassischen, von der Industrie empfohlenen Protokolle einerseits zu zwei aufeinanderfolgenden Injektionen von Impfstoffen mit inaktivierten Viren und andererseits zu einer Erstimpfung gegen Myxomatose mit dem Shope-Fibromvirus, gefolgt von einer Nachimpfung mit SG33, raten.
Zum Zweck der Verbesserung der existierenden Systeme durch Herstellung von rekombinanten Myxomatose-RHDV-Viren, welche das Protein VP60 exprimieren, wird dem im folgenden beschriebenen Protokoll gefolgt.
RVHD-Valenz:
Die Experimente zur Untersuchung der RVHD-Valenz wurden an 5 Wochen alten Kaninchen durchgeführt.
Nachdem jedem Tier Blut abgenommen wurde, wurden 54 Kaninchen geimpft, entweder mit einem kommerziellen Präparat ("Lapinject" von Sanofi) (18 Tiere) oder mit einem der beiden rekombinanten Viren (jeweils 18 Tiere).
Der Impfstoff "Lapinject" von Sanofi ist ein Präparat aus inaktiviertem RHDV-Virus. Die Hälfte jeder Gruppe und 5 Vergleichstiere wurden 5 Tage später (J5) einem Virulenztest unterzogen, während die andere Hälfte und 5 neue Vergleichstiere am Tag J15 durch 1.000 DL50 des RHDV-Virus getestet wurden.
Die nach 5 und 15 Tagen nach der Impfung durchgeführten Virulenztests zeigen deutlich den vollständigen Schutz der Kaninchen gegenüber einer intramuskulären Injektion von 1.000 DL50 des Wildtyp-RHDV-Virus. Im Gegensatz zu den Vergleichstiergruppen zeigte kein geimpftes Tier und keines, bei dem die Injektion durchgeführt wurde, die geringsten klinischen Symptome, und alle überlebten nach der Impfung an Tag J5 oder J15.
Die folgende Tabelle 1 gibt nicht nur einige Details des Impfprotokolls der verschiedenen Viren wieder, sondern auch die erhaltenen Ergebnisse nach den Virulenztests durch 1.000 DL50 des RHDV-Virus zur Zeit der Untersuchung der RVHD-Valenz. Tabelle 1
Myxomatose-Valenz:
Die Viren RecIA122 und RecB2111 wurden nach dem im folgenden beschriebenen Protokoll getestet; die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Zum Testen des Virus RecIA122 wurden 24 fünf Wochen alte, männliche Kaninchen einer Einzelimpfung auf dem ID-Weg über die Außenhaut des Ohres mit 5 × 10³ pfu des Virus an einem einzigen Injektionspunkt unterzogen (12 mit dem Virus SG33 und 12 mit RecIA122).
Zur gleichen Zeit wurden 6 Vergleichskaninchen des gleichen Alters, die nicht geimpft waren, unter den gleichen Bedingungen aufgezogen.
Jedem Kaninchen wurde an Tag J0, J10, J20, J30 und J44 eine kleine Menge Blut abgenommen, um die Serologien für die zwei Valenzen durchzuführen.
Von Tag J0 bis J15 wurde täglich eine sorgfältige klinische Untersuchung ausgeführt, um das Auftreten von lokalen oder allgemeinen Symptomen zu überprüfen.
Am Ende dieser Überwachung wurden die Kaninchen am Tag J44 durch eine ID-Injektion von 5 × 10³ pfu des myxomatischen Virus T1 (virulenter Stamm TOULOUSE 1) getestet und die klinischen Symptome bei jedem über einen Zeitraum von 10 Tagen beobachtet.
Das gleiche Protokoll wurde zu einem zweiten Zeitpunkt auf das Virus RecB2111 angewendet, dieses Mal mit 15 Kaninchen in jeder Gruppe.
Dieses Protokoll erlaubte die Bestätigung der totalen Unschädlichkeit dieser beiden Viren für die jungen Kaninchen. In der Tat wurde lediglich eine lokale Reaktion am Inokulationspunkt, entsprechend der mit dem Virus SG33 beobachteten Reaktion, beobachtet.
Eine Kinetik der anti-myxomatischen Antikörperproduktion wurde für die rekombinanten Viren und für SG33 täglich über 44 Tage durchgeführt. Die durch die ELISA-Methode erhaltenen Antworten sind in 5 dargestellt. Es zeigt sich, daß für die Viren SG33 und RecIA122 die Kinetiken vollständig vergleichbar sind, mit einem Titermaximum am Tag 30. Für das Virus RecB2111 erreichen die Antikörpertiter von Tag 21 an einen Höchstwert und liegen am Tag 30 und Tag 44 niedriger als die, die für die anderen beiden Viren erhalten werden. Die Testergebnisse der Seroneutralisation, die mit den drei Viren durchgeführt wurden, bestätigen diese Tendenz: Die seroneutralisierten Antikörpertiter sind von Tag J30 bis J44 stabil, bleiben aber wiederum schwächer für das Virus RecB2111, was in 6 dargestellt ist.
Die folgende Tabelle 2 gibt das Inokulationsprotokoll der verschiedenen Viren im Hinblick auf die Untersuchung der Myxomatose-Valenz wieder: Tabelle 2
Der am Tag J44 mit einem myxomatischen Virus des Stammes T1 (5 × 10³ pfu) durchgeführte Virulenztest bestätigt die Gleichwertigkeit der Schutzfähigkeit des Vaccina-Stammes SG33 und der rekombinanten Viren. Dieser Schutz, obgleich nur partiell, ist sehr befriedigend, da lediglich der Tod von 3 Kaninchen in der Gruppe SG33, eines Kaninchens in der Gruppe RecIA122 und dreier Kaninchen in der Gruppe RecB2111 festgestellt wurde, was in einer erheblich vereinfachten, klinischen Tabelle der Myxomatose dargestellt ist (Tabelle 3).
In Tabelle 3 sind die Ergebnisse wiedergegeben, die nach dem Virulenztest mit dem Stamm T1 bei einer Konzentration von 5 × 10³ pfu, injiziert auf intradermalem Weg, erhalten wurden. Tabelle 3
Außerdem wurden die anti-Myxomatose- und anti-RVHD-Antikörpertiter durch ELISA-Tests und Seroneutralisation bestimmt.
ELISA-TEST:
Für die Myxomatose-Valenz wurden 96-Loch-Platten (Typ Probind Falcon) über Nacht bei 37°C mit einer Suspension des myxomatischen Virus, welche auf einem Saccharosekissen in einem PBS-Puffer im Verhältnis von 800 ng zu 1 μg/Becher halb aufgereinigt worden war, bedeckt.
Für die RVHD-Valenz wurden die Löcher unter den gleichen Bedingungen, mit der gleichen Menge an rekombinantem, gereinigtem VP60-Protein, welches in einem Baculovirus-System in PIPES-Puffer bei einem pH von 6,5 hergestellt worden war, bedeckt.
Danach wurden die Löcher für 1 Stunde bei 37°C durch PBS mit 15 mg/ml gelöster Gelatine abgesättigt.
Nach dem Waschen wurden die zu testenden Serumproben 2:2 in PBS mit 0,1 % Tween 20 verdünnt; die Antigen-Antikörper Reaktion fand danach bei 37°C für 1 Stunde statt. Nach dem Waschen wurden die Löcher mit einem anti-Kaninchen-Alkalische Phosphatase-Konjugat bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Schließlich wurde nach dem Waschen das Substrat (PNPP in einem Diethanolamin-Puffer) bei Raumtemperatur zugefügt.
Nach 12-15 Minuten wurde an einem Spektrometer bei einer OD von 405 nm abgelesen. Der Antikörpertiter ist gleich dem Umgekehrten der Verdünnung, deren OD höher oder gleich dem Dreifachen der OD des internen negativen Vergleichstieres ist.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in den 4 und 5 schematisch dargestellt.
Bei Betrachtung der Produktionskinetiken der anti-VP60-Antikörper durch ELISA-Test über 44 Tage nach Inokulation des rekombinanten Virus RecIA122 in 12 junge Kaninchen und des Virus RecB2111 in 15 Tiere unter identischen Bedingungen ist klar ersichtlich, daß die erhaltenen Anteile an anti-VP60-Antikörpern sehr viel höher nach Injektion des RecB2111-Virus sind, und zwar von Tag J21 an (4). Außerdem scheint es, daß am Tag J44 die Antikörpertiter bei ihrem Maximum sind.
Dennoch ist, von den zwei abgeschwächten, rekombinanten Viren ausgehend, die Produktion der anti-VP60-Antikörper früh, nimmt auf konstante Art zu und ermöglicht den totalen Schutz ab dem Tag J5 gegen ein virulentes RHDV-Virus.
Seroneutralisation:
Diese Technik ist nur auf die Myxomatose-Valenz anwendbar, da das RVHD-Virus nicht an die zelluläre Kultur angepaßt ist. Die zu testenden Seren werden in Serien mit OptiMEM auf 96-Loch-Platten in einem Volumen von 50 μl verdünnt. Danach fügt man 750 pfu der viralen Suspension pro Loch in 50 μl OptiMEM zu und inkubiert das Ganze 60 Minuten bei 37°C und anschließend weitere 60 Minuten bei 4°C. Die RK13-Zellen werden danach in einem Verhältnis von 1-2 × 10⁴/Loch in 50 μl OptiMEM bei einer FCS-Endkonzentration von 5 % verteilt. Nach 3-4 Tagen Inkubation bei 37°C wird ausgewertet, wenn die cytoplasmatische Wirkung in den Vergleichslöchern ohne Antikörper vollständig ist.
Der Neutralisationstiter wird durch die Umkehr der Serumendverdünnung, die fähig ist, 75 % des Zellrasens zu schützen, ausgedrückt (ein Positivserum als Referenz wird in jedem Experiment beigefügt).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
Unter Berücksichtigung aller vorangehenden Ergebnisse kann man folgern, daß der erfindungsgemäße Impfstoff eine Unschädlichkeit und bemerkenswerte Wirksamkeit aufweist:
Auf der einen Seite entwickelte keines der in dieser Studie verwendeten Viren eine Restpathogenität bei den jungen Kaninchen,
auf der anderen Seite wurde der totale und vollkommene Schutz gegen RVHD ab dem 5. Tag nach Impfung mit dem einen oder anderen rekombinanten Virus beobachtet, und dies trotz der geringen Anteile an zu diesem Zeitpunkt gemessenen Antikörpern.
Die Anwesenheit oder Abwesenheit von VP12 hat keinen Einfluß auf die Schutzfähigkeit von VP60, das durch den myxomatischen Vektor exprimiert wird. Diese Ergebnisse sind von besonderem Interesse, da sie nach Impfung mit lebenden Viren erhalten wurden, und ermutigen zur Verwendung der neuen Impfstoffe, wobei die Herstellungsverfahren der anti-RVHD-Impfstoffe signifikant erleichtert werden.
Außerdem kann unter den Züchtungsbedingungen, im Gegensatz zu den aktuellen Empfehlungen bezüglich des klassischen anti-RVHD-Impfstoffes, das gleiche Ergebnis mit einer einzigen Injektion in 1 bis 2 Monate alte Kaninchen erzielt werden, unabhängig von der An- oder Abwesenheit maternaler anti-RVHD-Restantikörper.
Der unvollkommene Schutz, der nach einem Test mit einem myxomatischen Virus des Typs T1 sowohl bei dem Virus SG33 (3 Tote unter 22) als auch bei den Viren RecIA122 (1 Toter unter 12) oder RecB2111 (3 Tote unter 15) beobachtet wurde, stimmt mit früheren Arbeiten überein. In der Tat ist unter den anderen jungen Tieren der durch eine einzige Injektion des Vaccina-Virus vom Typ SG33 verliehene Schutz sehr unterschiedlich und erklärt, warum von den Herstellern zwei Injektionen empfohlen werden. Jedoch haben alle die Kaninchen, die eine starke Serokonversion aufwiesen, den Virulenztest ohne Schädigungen überstanden. Dagegen gehörten diejenigen die starben zu einer Population mit einem geringeren Antikörperanteil (mit neutralisierten Antikörpern). Auf der anderen Seite haben die mit dem Virus RecB2111 geimpften Kaninchen trotz der weniger hohen Antikörpertiter insgesamt dem Test gut standgehalten.
Die Impfversuche der Kaninchen mit den Rekombinanten RecA und RecB auf oralem Weg wurden gleichermaßen durchgeführt.
Der orale Weg ist eine geeignete Art zur Verabreichung eines Impfstoffs und interessant zum Schutz von Wildkaninchen gegen die sie befallenden Krankheiten. Das ist im besonderen der Fall für die Myxomatose und die hämorrhagische virale Krankheit, Krankheiten, die die Populationen der Wildkaninchen, die außerdem als Virusreservoirs für die Zuchtkaninchen dienen, dezimieren.
Um die Möglichkeit der Impfung der Kaninchen auf oralem Weg mit den rekombinanten Myxomatose-VP60-Viren zu untersuchen, wurden die Viren RecA und RecB auf oralem Weg in zwei unabhängigen Experimenten mit einer Dosis von 5 × 10⁸ pfu kleinen Gruppen von Tieren verabreicht.
In beiden Fällen erwiesen sie sich als fähig, die Synthese von anti-Myxomatose-Virus- und anti-VP60-Antikörpern zu induzieren und die Tiere gegen die Virulenztests mit dem Stamm T1 des Myxomatosevirus und dem Virus der viralen hämorrhagischen Krankheit zu schützen, und zwar in Verhält nissen, die denen, die bei der Verabreichung auf intradermalem Wege erhalten worden waren, ähnlich sind.
Die Ergebnisse sind in den 7 und 8a-8b dargestellt.
Die in 7 dargestellten Ergebnisse wurden mit einer Gruppe auf oralem Weg mit 5 × 10⁸ pfu der Rekombinanten RecB geimpfter Kaninchen erhalten.
Die in den 8a und 8b dargestellten Ergebnisse wurden mit einer Gruppe auf oralem Weg mit 5 × 10⁸ pfu der Rekombinanten RecA und RecB und des Stammes SG33 geimpfter Kaninchen erhalten.
Die Konstruktion einer weiteren Rekombinanten SG33/VP60 wird im folgenden beschrieben.
Die Ziele der ausgewählten Rekombinationen waren die Sequenzen, die für die dUTPase und das offene Leseraster M9-L codieren und die ORFs M11-L und MGF einrahmen.
Es wurde ein Plasmid (pAT VP60) gemäß der 9a bis 9c konstruiert und zur Transfektion mit Coinfektion durch die Rekombinante RecB, wie im folgenden beschrieben, verwendet (ΔMGF::lacZ::vp60::ΔM11-L) (10).
Die Rekombinanten wurden anhand des weißen Phenotyps der Lyseplaques in Anwesenheit von X-Gal sortiert. Die Kandidaten wurden durch PCR an den Grenzen des Inserts verifiziert.
Ein viraler rekombinanter Klon, welcher den gewünschten Phenotyp darstellt, wurde auf gereinigt und seine dUTPase/VP60/M9-L-Region vollständig sequenziert,
um zu bestätigen, daß dieser Klon, genannt "26 b" folgende Eigenschaften aufweist:

– Vollständige Deletion der Sequenzen M11-L und MGF
– Eliminierung des Reportergens lacZ
– Einführung eines Polystops (Transkriptionsterminator

Die Rekombinante exprimiert korrekt VP60.
Dies ist das erste Mal, daß der Stamm SG33 einer Deletion oder einer Abschwächung durch Rekombination unterzogen wurde.
Eine weitere Originalität der Erfindung ist, daß der Virusvektor außerdem das Pathogen darstellt, gegen das eine Impfung erwünscht ist.
Ein nicht unbedeutender Vorteil der Verwendung eines Vektors wie des myxomatischen Virus ist, daß seine Spezifität so eingeschränkt ist, daß er ausschließlich für Hasenartige pathogen ist. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Abgeschwächtes, lebendes, rekombinantes, myxomatisches Virus, enthaltend wenigstens eine Fremd-Nukleotidsequenz, die für ein Immunogen eines pathogenen Erregers von Hasenartigen codiert, wobei die Nukleotidsequenz in Abhängigkeit eines Promotors, der in eines für die Replikation des besagten Virus nicht wesentlichen Gene eingefügt wurde, exprimiert wird.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz für ein Capsid-, Membran- oder Hüllprotein eines viralen, bakteriellen oder parasitären Erregers von Hasenartigen codiert.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der pathogene Erreger ausgewählt ist aus: dem RVHD-Virus, dem EBHS-Virus, den Rotaviren, den für die Enzephalitozoonose verantwortlichen Protozoen, den Enterobakterien, insbesondere E. Coli und den Clostridien, "Bacillus piliformis", den Kokzidien, den Pasteurella, Francisella tularensis und/oder den Staphylokokken.
Rekombinantes Virus gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das myxomatische Virus von einem der Stämme SG33, LEON 162, HONGROIS, FINISTERE, R801, TOULOUSE 1, LAUSANNE abstammt.
Rekombinantes Virus gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz und der Promotor in die Gene M11L-MGF oder TK des myxomatischen Virus eingefügt sind.
Rekombinantes Virus gemäß wenigstens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein antigenes Polypeptid des Virus der viralen hämorrhagischen Kaninchenkrankheit (RVHD) codiert, die in Abhängigkeit eines Promotors exprimiert wird.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz das Capsidprotein VP60 oder VP60+VP12 des Virus der viralen hämorrhagischen Kaninchenkrankheit codiert.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 6 und/oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor der Nukleotidsequenz der frühe/späte Vaccinapromotor P7,5 ist.
Rekombinantes Virus gemäß wenigstens einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es die Nukleotidsequenz, die für das Capsidprotein VP60+VP12 codiert, inseriert in das TK-Gen enthält, wobei die Nukleotidsequenz in Abhängigkeit des frühen/späten Vaccinapromotors P7,5 exprimiert wird.
Rekombinantes Virus gemäß wenigstens einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es die Nukleotidsequenz, die für das Capsidprotein VP60 codiert, inseriert in die Gene M11L-MGF enthält, wobei die Nukleotidsequenz in Abhängigkeit des frühen/späten Vaccinapromotors P7,5 exprimiert wird.
Rekombinantes Virus gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem die Nukleotidsequenz enthält, die für das Gen der β-Galaktosidase (β-Gal) codiert, wobei die Nukleotidsequenz in Abhängigkeit des späten Vaccinapromotors P11K exprimiert wird.
Rekombinantes Virus gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz und der Promotor in die Gene dUTPase und M9-L inseriert sind.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenzen, die die Gene M11-L und MGF codieren, vollständig deletiert sind, und dass es außerdem einen Polystop stromabwärts der Sequenz VP60 enthält.
Verwendung eines abgeschwächten, lebenden, rekombinanten Virus gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Impfstoffs zum wirksamen Impfen von Hasenartigen gleichzeitig gegen die Myxomatose und eine weitere infektiöse Krankheit.
Rekombinanter Impfstoff zum gleichzeitigen Impfen von Hasenartigen gegen die Myxomatose und eine weitere infektiöse Krankheit, hervorgerufen durch einen pathogenen Erreger gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass er als Vektor das abgeschwächte, lebende, rekombinante, myxomatische Virus gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 13 enthält.
Rekombinanter Impfstoff gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass er eine wirksame Impfdosis des rekombinanten, myxomatischen Virus enthält.
Rekombinanter Impfstoff zum gleichzeitigen Impfen von Hasenartigen gegen die Myxomatose und die virale hämorrhagische Kanin chenkrankheit (RVHD) gemäß Anspruch 15 und/oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass er als Vektor das abgeschwächte, lebende, myxomatische Virus, enthaltend eine Nukleotidsequenz, die für ein antigenes Polypeptid des Virus der viralen hämorrhagischen Kaninchenkrankheit (RHDV) codiert, die in Abhängigkeit eines Promotors exprimiert wird, enthält.
Rekombinanter Impfstoff gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass er als Vektor das myxomatische Virus gemäß mindestens einem der Ansprüche 7 bis 13 enthält.
Rekombinanter Impfstoff gemäß Anspruch 17 und/oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die wirksame Menge des rekombinanten Virus pro Impfdosis zwischen 10² und 10⁹ Äquivalente pfu und bei intradermaler Anwendung vorzugsweise zwischen 10³ und 10⁶ Äquivalente pfu beträgt.
Rekombinanter Impfstoff gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff im Hinblick auf eine parenterale, vorzugsweise intradermale, oder orale Verabreichung formuliert ist.