DE69233004T2

DE69233004T2 - Rekombinanter Virus der Marek-Krankheit, Verfahren zur Herstellung dieses Viruses und diesen enthaltender Impfstoff

Info

Publication number: DE69233004T2
Application number: DE69233004T
Authority: DE
Inventors: Masashi Kikuchi-gun Sakaguchi; Michitaka Kikuchi-gun Yamamoto
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1991-07-09
Filing date: 1992-07-08
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2012-07-09
Also published as: DE69233004D1; CA2073493C; EP0522535A1; CA2073493A1; EP0522535B1; ES2195994T3; US5558867A; AU1947892A; ATE237629T1; AU657144B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen Virusvektor, der ein exogenes Genprodukt in einer Hühnerzelle oder im Körper eines Huhnes exprimieren kann und ein Verfahren zur Herstellung desselben. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Konstruktion eines rekombinanten Virus der Marek-Krankheit zur Verabreichung einer physiologisch aktiven Substanz (z. B. ein Hormon, etc.) in einem lebenden Körper und einen dasselbe enthaltenden multivalenten Lebendimpfstoff für Hühner, die durch Verwendung des Vektors hergestellt werden, wie vorstehend dargelegt.
Auf dem Gebiet der modernen Geflügelhaltung ist die Vermeidung von Krankheiten durch Impfung ein wesentliches Mittel zur Gesunderhaltung ungeachtet der Art des Huhnes, d. h. ein für die Zucht eingesetztes Huhn, ein Huhn zum Eierlegen oder ein Huhn für die Fleischgewinnung. Die Impfung muss jedoch sehr häufig erfolgen, so dass die Personalausgaben immer mehr steigen, so dass ein wirtschaftlicher Nachteil für den Geflügelzüchter verursacht wird. Um diesen Nachteil zu vermeiden, kann man in Erwägung ziehen, einfach mehrere bekannte Impfstoffe zu mischen. Jedoch gibt es das Problem, dass sich die Viren im Falle eines Lebendimpfstoffgemisches gegenseitig stören, und es gibt auch eine Begrenzung bei der Mischungsmenge im Falle eines Gemisches inaktivierter Impfstoffe. Zusätzlich beobachtet man im Falle eines Gemisches eines Lebendimpfstoffes und eines inaktivierten Impfstoffes eine Titerabnahme aufgrund einer Adsorption eines Lebendimpfstoff-Antigens an ein Gel (Adjuvans).
Kürzlich wurde unter Einbeziehung der vorstehenden Gegebenheiten in einem alternativen Verfahren versucht, einen Virusvektor einzusetzen, d. h. multiple Gene von Impfstoffantigenen werden in ein einzelnes Virus eingebaut, um einen multivalenten Lebendimpfstoff her zustellen. Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung eines multivalenten Lebendimpfstoffes ohne die gegenseitige Störung der Viren oder der Erhöhung der Animpfmenge im Falle des Gemisches von inaktiviertem Impfstoffen zu induzieren, wie vorstehend erwähnt.
Bisher wurden bereits Forschungen über die Verwendung eines Virus als Vektor bei der Herstellung von Impfstoffen für verschiedene Viren wie das Vaccinavirus, Adenovirus, Herpes simplex-Virus, Retrovirus und dergleichen durchgeführt, und das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBs-Antigen) oder die Glycoproteine des Tollwutvirus oder Varicella zoster-Virus wurden erfolgreich in vitro exprimiert. Jedoch sind einige dieser Viren (die kein Vaccinavirus sind) onkogene Viren und somit ist die Verabreichung dieser Viren an den Menschen oder an Tiere begrenzt und unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit nicht praktikabel. Zusätzlich kann das Virus, auch wenn es selbst sicher ist, nicht wirksam als Virusvektor für Vögel, auf die die vorliegende Erfindung abzielt, genutzt werden, da die zu impfenden Vögel nicht der ursprüngliche Wirt des Virus sind.
Außerdem wurde die Verwendung des Vogelpockenvirus (z. B. Geflügelpockenvirus der Hühner) als Vektor vorgeschlagen, und das Virus wurde bereits für die Verwendung als Virusvektor untersucht. Es wird berichtet, dass ein exogenes Gen in die Virus-DNA eingebaut werden kann [Saeki et al., Abstract of the 35^th Meeting of Japan Virology Society, Seite 209 (1987)]. Auf dem Gebiet der modernen Geflügelhaltung hält jedoch die Immunität gegen Geflügelpocken nur einen kurzen Zeitraum an und somit sind gewöhnlich mehrere Impfungen eines Impfstoffvirus (abgeschwächtes Geflügelpockenvirus oder Taubenpockenvirus) während der Züchtung der Hühner erforderlich.
Folglich ist bei der Verwendung des Pockenvirus als Virusvektor noch eine häufige Impfung erforderlich, auch wenn ein Virusvektor, in den mehrere Antigene eingebaut werden, hergestellt wird und als Impfstoff verwendet wird. Außerdem ist im Falle eines Pockenvirusvektors bekannt, dass das Wachstum des Pockenvirus selbst stark durch einen mütterlichen Antikörper gegen den Pockenvirus gehemmt wird und somit keine ausreichende Immunantwort gegen die eingebauten Antigene erhalten werden kann.
Die Marek-Krankheit ist ein maligner Tumor, dessen Ausbruch nur durch Impfung verhindert werden kann. Als Verhinderungsmechanismus wird in Betracht gezogen, dass wenn die Wirtsvögel wie Hühner permanent mit dem Impfstoffvirus infiziert sind, die humoralen und zellvermittelten Immunitäten gegen die Marek-Krankheit induziert werden und während der Lebensdauer des Wirtes aufrechterhalten werden und dabei die Tumorgenese durch das viru lente Virus unterdrückt wird. Dieser Virusimpfstoff wird gewöhnlich in Form von lebenden, mit dem Virus infizierten Zellen verabreicht und dadurch charakterisiert, dass er einem neugeborenen Huhn verabreicht werden kann, da sich das Virus über Zell-zu-Zell-Infektion vermehrt und vom mütterlichen Antikörper kaum beeinflusst wird.
In Anbetracht der vorstehenden Merkmale des Virus der Marek-Krankheit wurde in den letzten Jahren ein multivalenter Impfstoff unter Verwendung des Virus der Marek-Krankheit als Vektor entwickelt. Um den multivalenten Lebendimpfstoff herzustellen, in dem der Virus der Marek-Krankheit als Vektor verwendet werden kann, wobei das Virus viel bessere Eigenschaften als andere Virusvektoren besitzt, ist es notwendig, die Stelle, die für den Einbau eines exogenen Gens geeignet ist, oder den entfernbaren Bereich auf der Virus-DNA der Marek-Krankheit herauszufinden.
Bisher wurden das Thymidinkinase (TK)-Gen und das gA-Gen auf der Virus-DNA der Marek-Krankheit als Stelle zum Einbau eines exogenen Gens untersucht. Es wurde jedoch berichtet, dass der Verlust der Thymindinkinaseaktivität aufgrund von Mutationen im TK-Gen ein virales Wachstum reduziert [P. Bandyopadyay et al. (1987), 12^th INTERNATIONAL HERPESVIRUS WORKSHOP], und es wurde über kein rekombinantes Virus berichtet, in das ein exogenes Gen in das TK-Gen eingebaut wird. Was das gA-Gen anbelangt, wurde berichtet, dass ein rekombinantes Virus, in das das LacZ-Gen in das gA-Gen eingebaut wird, nicht stabil ist und nicht gereinigt werden kann [Kato Atsushi et al. (1991), 111^th Meeting of the Japan Veterinary Society]. Deshalb sind sowohl die TK- als auch die gA-Gene nicht praktikabel.
gA sowie gB ist eines der vom Virus produzierten Hauptglycoproteine. Obwohl bekannt ist, dass die Impfung von gB die Produktion neutralisierender Antikörper im Tierkörper induziert, wurde das bisher noch nicht bei der Impfung von gA beobachtet, trotzdem erwartet man, dass gA eine zelluläre Immunisierung verursacht. Deshalb ist, wenn man wünscht, dass das Virus der Marek-Krankheit beide Funktionen als Vektor und als Impfstoff besitzt, der Einbau eines exogenen Gens in dieses gA-Gen unerwünscht, um das gA-Gen zu mutieren, da dieses die Funktion als Impfstoff verschlechtert.
Unter den Umständen hatten die anwesenden Erfinder intensiv weniger analysierte Gene erforscht, um ein wirksames rekombinantes Virus der Marek-Krankheit herzustellen und haben als Ergebnis bereits herausgefunden, dass das rekombinante Virus der Marek-Krankheit unter Verwendung eines BamHI-H-Fragments des Gens des Virus Typ-I der Marek-Krankheit (das B. Fragment von dem Größten, das durch Spaltung des Virusgens der Marek-Krankheit mit dem Restriktionsenzym BamHI hergestellt wurde) (EP 361182A) hergestellt werden konnte.
Unter solchen Umständen haben die anwesenden Erfinder weiter intensiv geforscht, um einen wirksameren Virusvektor herzustellen und haben als Ergebnis eine neue Stelle im Virusgenom der Marek-Krankheit gefunden, in der ein exogenes Gen ganz effizient eingebaut werden kann und fanden bestätigt, dass das so erhaltene rekombinante Virus der Marek-Krankheit eine ausgezeichnete Wachstumsstabilität in vivo sowie in vitro zeigte, ohne seine intrinsische Natur als das Virus der Marek-Krankheit zu verlieren.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein neuartiges rekombinantes Virus der Marek-Krankheit bereitzustellen, das nützlich für einen Impfstoff für Vögel ist.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Virus der Marek-Krankheit, das durch die Mutation eines Virus der Marek-Krankheit mit einem Plasmid erhalten wird, wobei das Plasmid umfasst

(1) ein Genfragment, das von der etwa 2,8 kbp großen Us-Region stammt, das durch das Behandeln eines HindIII-B-Fragments eines Gens des Virus Typ-I der Marek-Krankheit mit dem Restriktionsenzym EcoRI (ein A4-Fragment wie in 2 gezeigt) hergestellt wird, und
(2) eine exogene Genexpressionskassette, die in die Restriktionsschnittstelle BalI des Genfragments eingebaut ist, wobei die Kassette ein exogenes Gen umfasst, das stromabwärts eines Promotors gebunden ist, der in einer tierischen Zelle oder einem tierischen Virus wirksam sein kann.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Virus bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, einen multivalenten Lebendimpfstoff für Vögel bereitzustellen, der das rekombinante Virus der Marek-Krankheit umfasst.
Und noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, einen Vektor zur Verabreichung einer physiologischen Substanz wie ein Hormon in einen Hühnerkörper bereitzustellen.
Diese und die anderen Gegenstände und die Vorteile der Erfindung werden dem Fachmann anhand der folgenden Beschreibung klar.
1 ist eine Darstellung, die ein Muster der EcoRI-Spaltung von pKHB zeigt, das ein subcloniertes Plasmid der DNA des Virus Typ-I-Stammes der Marek-Krankheit ist: 61–554 Stamm.
2 zeigt die Position der A4-, A5- und A6-Fragmente des 61-554-Stammes auf dem Genom.
3 zeigt das Insertionsplasmid pKA4BL, das für die Herstellung eines rekombinanten Virus K-A4BL der Marek-Krankheit verwendet wird.
4 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse der Southern-Hybridisierung zeigt, die mit dem Spaltungsprodukt der DNAs, die aus mit K-A4BL infizierten CEF extrahiert wurden, mit dem Restriktionsenzym EcoRI unter Verwendung des LacZ-Gens (Spur 1) und dem KA4-Fragment (Spur 2) als Sonde durchgeführt wurde.
5 ist eine Graphik, die den Serumspiegel von anti-β-gal ELISA-Antikörpern in 7 Wochen alten Hühner zeigt, die mit K-A4BL (7000 PFU) am ersten Lebenstag geimpft wurden, wobei der weiße Kreis den Serumspiegel der 7 Wochen alten Hühner zeigt, die mit dem herkömmlichen divalenten Impfstoff des Virus der Marek-Krankheit geimpft wurden.
6 zeigt die Konstruktion des Insertionsvektors pKA4B der vorliegenden Erfindung.
7 zeigt die Konstruktion des Insertionsvektors pKA4BF der vorliegenden Erfindung.
8 zeigt die Konstruktion des Insertionsvektors pKA4BHN der vorliegenden Erfindung.
9 zeigt das Insertionsplasmid pKA3VL, das für die Herstellung eines anderen rekombinanten Virus K-A3VL der Marek-Krankheit verwendet wurde.
10 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse der Southern-Hybridisierung zeigt, die mit dem Spaltungsprodukt der DNAs, die aus mit K-A3VL infizierten CEF extrahiert wurden, mit dem Restriktionsenzym EcoRI unter Verwendung des LacZ-Gens (Spur 1) und dem KA3-Fragment (Spur 2) als Sonde durchgeführt wurde.
11a zeigt eine Position der Wiederholungssequenz im A5-Fragment des 61-554-Stammes.
11b zeigt eine Position der Wiederholungssequenz im A6-Fragment der Stämme 61-554 und BC-1.
12 zeigt eine Nucleotidsequenz des A6-Fragments des BC-1-Stammes (Seq. ID 1).
13 zeigt das Insertionsplasmid pKA5SL.
14 zeigt eine Nucleotidsequenz des ORF, der aus Us639 besteht, enthaltend die BalI-Schnittstelle und den benachbarten Bereich davon im A4-Fragment des 61-554-Stammes (Seq. ID 2).
Als Impfstoff gegen die Marek-Krankheit waren bisher diejenigen bekannt, die ein abgeschwächtes Virus Typ-I der Marek-Krankheit (MDV-I), das Truthahn-Herpesvirus (HVT:MDV-III) oder ein Gemisch des Virus Typ-II der Marek-Krankheit und dem Truthahn-Herpesvirus enthielten. Da man herausgefunden hat, dass die Marek-Krankheit selbst durch die Infektion des Typ-I-Virus induziert wird, ist es vorzuziehen, einen abgeschwächten Impfstoff des serologisch homologen Virus, d. h. das Virus Typ-I der Marek-Krankheit, zur Vermeidung des Krankheitsausbruchs zu verwenden. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird demnach das Virus Typ-I der Marek-Krankheit zur Herstellung des rekombinanten Virus Typ-I der Marek-Krankheit der vorliegenden Erfindung verwendet, das als multivalenter Impfstoff einschließlich des Impfstoffes für die Marek-Krankheit nützlich ist.
Die Erfinder haben zwei für den Einbau eines exogenen Gens geeignete Bereiche gefunden, die für die Herstellung eines rekombinanten Virus der Marek-Krankheit nützlich sind, d. h. den Us-Bereich und die umgekehrten Wiederholungssequenzen des Virusgenoms der Marek-Krankheit. Der Us-Bereich bezieht sich auf eine Gensequenz von etwa 12 kb, die sich am 3'-Ende der MDV-DNA befindet, die zwischen den umgekehrten Wiederholungssequenzen liegt. Durch den Einbau eines exogenen Gens in den Bereich wird es möglich, ein gewünschtes exogenes Gen stabil zu exprimieren und ein rekombinantes Virus der Marek-Krankheit herzustellen, ohne den Verlust oder der Verringerung der Merkmale des rekombinanten Virus der Marek-Krankheit, die für die Herstellung des Impfstoffes der Marek-Krankheit notwendig sind.
Ein Genfragment, das aus dem Us-Bereich des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Virus der Marek-Krankheit stammt, ist ein Genfragment aus dem Us-Bereich mit mindestens etwa 1 kb, das eine Insertionsstelle enthält, in die ein exogenes Gen eingebaut werden kann, beispielsweise eine geeignete Restriktionsenzymschnittstelle. Das aus dem Us-Bereich stammende Genfragment schließt ein Genfragment von etwa 2,8 kbp ein, das die BalI-Schnittstelle enthält, die durch Behandlung eines HindIII-Fragments des Virus Typ-I der Marek-Krankheit mit dem Restriktionsenzym EcoRI (A4-Fragment wie in 2 dargestellt) hergestellt wird. Die spontane Wiederholungssequenz in der umgekehrten Wiederholungssequenz der vorliegenden Erfindung kann ohne Beeinträchtigung des Viruswachstums entfernt werden, und somit ist diese Wiederholungssequenz auch für den Einbau eines exogenen Gens geeignet, ohne das Viruswachstum wie das vorstehende Fragment zu beeinträchtigen.
Es wurde bisher noch nicht berichtet, dass ein Antikörper gegen ein Produkt eines Gens, das in das Virusgenom eingebaut wurde, produziert wird und für einen langen Zeitraum in einem Huhn aufrechterhalten wurde, das mit dem rekombinanten Virus der Marek-Krankheit geimpft wurde. Zusätzlich wurde bisher noch kein ausgezeichnetes immunologisches Verfahren wie die vorliegende Erfindung entwickelt, d. h. das Verfahren, bei dem ein Antikörper geen ein Protein produziert wird, das in Zellen produziert wird wie β-Galaktosidase und für einen Zeitraum von mehr als 4 Monaten durch nur eine Impfung unmittelbar nach der Geburt aufrechterhalten wird. Deshalb erwartet man, dass eine viel stärkere Immunisierung induziert wird, indem unter Verwendung des immunologischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung im Körper des Huhnes ein Protein exprimiert wird, das auf der Oberfläche infizierter Zellen wie ein Membranprotein des Virus der Newcastle-Krankheit (nachstehend hier als „NDV" bezeichnet) oder dem infektiösen Bronchitis-Virus (nachstehend hier als „IBV") bezeichnet) exprimiert wird. Tatsächlich zeigte, wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, das rekombinante Virus der Marek-Krankheit, in das das NDV-Fusionsprotein (abgekürzt als NDV-F-Protein) codierende Gen eingebaut ist, die Wirkung, die Newcastle-Krankheit mehr als 4 Monate nach der Impfung ausreichend zu verhindern. Was ein Protein anbelangt, das nicht intrinsisch auf oder außerhalb der Zellmembran exprimiert wird, so kann ein Gen konstruiert werden, das ein derartiges Protein codiert, so dass das Protein aus den Zellen sezerniert wird, indem ein Signalpeptid am N-Terminus hinzugefügt wird [Nucleic Acids Research, 14, 4683-4690 (1986)] oder das Protein wird auf der Zellmembran exprimiert, indem ein Ankerbereich hinzugefügt wird, der reich an hydrophoben Aminosäuren am C-Terminus ist. Durch die Art dieser Expressionen kann eine viel stärkere Immunisierung gegen die Expressionsprodukte des eingebauten Gens induziert werden.
Es ist bekannt, dass das Virus, von dem ein Teil der Gene durch den Einbau eines exogenen Gens inaktiviert wird, gewöhnlich ein reduziertes Wachstum oder Pathogenität als Wachstumsparameter in vivo zeigt, auch wenn das Virus ein ausgezeichnetes Wachstum in vitro zeigt [Bernard Meignier et al., The Herpes Viruses 4, 265 (1985)]. Um sicher zu stellen, dass das hergestellte rekombinante Virus oder der Impfstoff in vivo verwendet werden kön nen, ist es deshalb notwendig, zu bestätigen, ob das Virus tatsächlich wächst und Immunogenität zeigt, wenn ein Huhn mit dem erhaltenen Virus geimpft wird. Von diesem Gesichtspunkt ausgehend haben die anwesenden Erfinder ein Experiment zur Bestätigung der Wirkung des hergestellten rekombinanten Virus durchgeführt, wobei das Huhn mit dem Virus geimpft wird. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte rekombinante Virus der Marek-Krankheit im Körper des Huhns mehr als 16 Wochen weiter infizierte und somit seine Fähigkeit beibehielt, in vivo zu wachsen. Zusätzlich wurde diese ausgezeichnete Immunogenität durch die ständige Produktion eines Antikörpers gegen das Virus der Marek-Krankheit, durch die ständige Produktion eines Antikörpers gegen das Produkt des eingebauten Gens, d. h. β-Galaktosidase und die ausgezeichnete Wirkung bestätigt, die Marek-Krankheit und die Newcastle-Krankheit zu verhindern.
Wie vorstehend erwähnt, wächst das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte rekombinante Virus der Marek-Krankheit gut und infiziert kontinuierlich im Körper des Huhns und zeigt nicht nur die Wirkung, das virulente Virus der Marek-Krankheit zu verhindern, sondern kann auch einen Antikörper gegen ein Produkt des exogenen Gens produzieren. Das charakteristischste Merkmal der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren, das rekombinante Virus herzustellen, wobei es das vorstehend erwähnte ausgezeichnete Wachstum und Immunogenität in vivo besitzt, wodurch die in vivo-Anwendung möglich ist, d. h. der rekombinante multivalente Lebendimpfstoff kann tatsächlich hergestellt werden, was bisher niemals erreicht wurde.
Demnach wird, wenn ein exogenes Gen, das ein Impfstoff-Antigen für andere Krankheiten codiert, in das Virus der Marek-Krankheit eingebaut wird und Vögel mit dem rekombinanten Virus geimpft werden, das von dem exogenen Gen stammende Antigen kontinuierlich für einen langen Zeitraum oder das gesamte Leben der Wirtsvögel durch denselben Mechanismus wie der Virus der Marek-Krankheit exprimiert und dabei wird die humorale oder zellvermittelte Immunität gegen das Antigen kontinuierlich für einen langen Zeitraum oder das gesamte Leben des Wirts induziert. D. h. gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein multivalenter Lebendimpfstoff hergestellt werden, der eine Immunität gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern nur durch eine einzige Verabreichung an Vögel wie Hühner, wenn sie ausgebrütet werden, vermitteln kann.
Da das rekombinante Virus der Marek-Krankheit der vorliegenden Erfindung weiterhin β-Galaktosidase im Körper des Huhns für einen langen Zeitraum exprimieren kann, kann das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung zusätzlich nicht nur als System zur Verabreichung eines Antigens verwendet werden, sondern auch als Transportsystem für Medikamente zur Verabreichung einer physiologisch aktiven Substanz, wie ein Hormon, in den lebenden Körper.
Die Herstellung des rekombinanten Virus der Marek-Krankheit der vorliegenden Erfindung wird hier nachstehend detaillierter beschrieben.
Im allgemeinen erfolgt die Herstellung des rekombinanten Virus der Marek-Krankheit der vorliegenden Erfindung durch die folgenden Verfahren:

(i) Ein Teil der viralen DNA wird in einen Plasmidvektor cloniert
(ii) Ein Insertionsplasmid wird durch Einbau eines Genfragments, das eine Expression eines exogenen Gens ermöglicht, in ein Plasmid konstruiert, in das das Virus-DNA-Fragment cloniert wird.
(iii) Das Insertionsplasmid wird in virusinfizierten Zellen transduziert.
(iv) Ein rekombinantes, das exogene Gen enthaltende Virus wird durch ein geeignetes Verfahren ausgewählt.

Das Insertionsplasmid, das für den Einbau des exogenen Genes in das Virus verwendet wird, enthält grundsätzlich ein Gen, das den Us-Bereich oder die umgekehrte Wiederholungssequenz codiert, der/die vom Virus der Marek-Krankheit stammt, einen von einer tierischen Zelle oder einem tierischen Virus abstammenden Promotor, ein Strukturgen, das ein gewünschtes exogenes Protein codiert, das stromabwärts des Promotors gebunden ist, und fakultativ einen Transkriptionsterminator, der stromabwärts des Strukturgens gebunden ist. Das rekombinante Genfragment wird als „exogene Genexpressionscassette" bezeichnet, wobei der Promotor und das das exogene Protein codierende Strukturgen und fakultativ der Transkriptionsterminator so konstruiert werden, dass das Gen, das das exogene Protein codiert, transkribiert und translatiert werden kann. Deshalb kann das Insertionsplasmid der vorliegenden Erfindung auch als ein Plasmid bezeichnet werden, das den Us-Bereich oder die umgekehrte Wiederholungssequenz enthält, die vom Virus der Marek-Krankheit stammen, in den die exogene Genexpressionscassette eingebaut wird. Unter Verwendung dieses Insertionsplasmids wird das vom Virus abstammende Genfragment im Plasmid gegen die homologe Einheit im Virus-DNA-Genom ersetzt, und dabei wird das exogene Genfragment in das Virusgenom eingebaut. Der hier verwendete, von einer tierischen Zelle oder einem tierischen Virus abstammende Promotor schließt verschiedene bekannte Promotoren ein, die in einem Plasmid zur Expression in einer tierischen Zelle verwendet werden und ist nicht auf einen spezifischen Promotor begrenzt.
In dem vorstehenden Verfahren (i) wird die Virus-DNA zuerst mit einem Restriktionsenzym gespalten und dann werden die Spaltungsprodukte einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um Fragmente voneinander zu trennen und um jedes Fragment aus dem Gel zu sammeln. Jedes der erhaltenen Fragmente wird in ein Plasmid cloniert.
Im Verfahren (ii) wird jedes Virusfragment, das in das Plasmid im vorstehenden Verfahren (i) cloniert wird, mit einem geeigneten Restriktionsenzym an einer Stelle oder an zwei Stellen gespalten, um einen Teil des Virusfragments zu deletieren und dort werden in einen in einer tierischen Zelle wirksamen Promotor und ferner ein Strukturgen eingebaut, das ein gewünschtes exogenes Protein stromabwärts des Promotors codiert.
Das Verfahren (iii) wird zur homologen Rekombination eines Virus-DNA-Fragments einschließlich eines exogenen Gens in einer Virus-DNA durchgeführt und erfolgt gewöhnlich durch die gleichzeitige Transduktion der Zellen mit der infektiösen Virus-DNA und dem Insertionsplasmid. In der vorliegenden Erfindung wird es jedoch durchgeführt, indem zuerst die Kulturzellen mit dem Virus infiziert werden und dann das vorstehende Insertionsplasmid in die infizierten Zellen eingebaut wird. Demnach ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein ganz einfaches Verfahren zur Rekombination, um unter Verwendung eines Elektroporationsverfahren zur Transduktion ein rekombinantes Virus mit einem ziemlich hohen Effizienzniveau zu erhalten.
Das einzubauende exogene Gen schließt verschiedene Gene ein, die ein Protein codieren, das als Impfstoffantigen für eine Reihe von Hühnerkrankheiten wie eine Viruserkrankung, eine bakterielle Erkrankung, eine parasitäre Erkrankung etc. wirkt. Im Falle eines multivalenten Impfstoffes für Hühner schließt das einzubauende exogene Gen beispielsweise ein Gen ein, das ein Antigen des Virus der Newcastle-Krankheit (NDV) codiert, z. B. ein Gen, das das NDV-F-Protein oder Hämagglutinin-Neuramidase-Protein (abgekürzt als HN-Protein) codiert, ein Gen, das ein Glycoprotein des infektiösen Hühner-Laryngotracheitis-Virus (ILTV) codiert, ein Gen, das ein Virusstrukturprotein des Virus der infektiösen Bursa-Fabricii-Krankeit (IBDV) codiert, z. B. ein Gen, das VP2 codiert, ein Gen, das ein Spike-Protein des infektiösen Bronchitis-Virus (IBV) codiert und ein Gen, das das HA-Protein von Haemophilus paragallinarum codiert, das eine infektiöse Coryza verursacht, und dergleichen.
In einer Ausführungsform des rekombinanten Lebendimpfstoffes der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Virus der Marek-Krankheit zur Vermeidung der Newcastle-Krankheit und ein Verfahren zur Konstruktion davon sowie dessen Wirkungen beschrieben. Als Gen des Virus der Newcastle-Krankheit, das in das rekombinante Virus eingebaut werden soll, wird eine cDNA verwendet, die von einem sehr stark abgeschwächten Stamm D-26 stammt. Die Pathogenität des Virus der Newcastle-Krankheit wird dadurch bestimmt, ob das Fusionsprotein (abgekürzt als F-Protein) virulent ist oder nicht, oder ob das HN-Protein virulent ist oder nicht. Wenn das rekombinante Virus unter Verwendung des virulenten F-Gens oder HN-Gens hergestellt wird, gibt es die Möglichkeit, dass der Vektorvirus die Pathogenität aus dem virulenten Gen erhalten kann. Um diese gefährliche Möglichkeit zu vermeiden, wird das rekombinante Virus der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Genen hergestellt, die von dem sehr stark abgeschwächten Stamm D-26 stammen.
D. h. die vorliegende Erfindung kann einen ganz ausgezeichneten Lebendimpfstoff bereitstellen, der solch eine langanhaltende Wirkung besitzt, die der herkömmliche Impfstoff für die Newcastle-Krankheit nicht zeigen kann, und der ferner eine hohe Sicherheit besitzt.
Der rekombinante Virusvektor der Marek-Krankheit der vorliegenden Erfindung ist auch nützlich als Vektor für die Verabreichung eines Hühner-Wachstumshormons oder eines Immunisators sowie als Antigen zur Infektionsvermeidung. Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann auch zur Verabreichung eines Antigens zur Immunisierung eines Zuchthuhns verwendet werden, um dem Ovum die Fähigkeit zu verleihen, eine Reihe nützlicher Antikörper herzustellen. D. h. das rekombinante Virus der Marek-Krankheit der vorliegenden Erfindung kann für den Einbau dieser Gene in einen Vektor verwendet werden, der nützlich in einem Transportsystem für Medikamente (hier nachtstehend als „DDS" bezeichnet) ist.
Die Auswahl des rekombinanten Virus, das das gewünschte exogene Gen in dem Verfahren (iv) enthält, kann durch die geeignetsten Mittel durchgeführt werden, abhängig von der Art des exogenen Gens, das in die Virus-DNA eingebaut werden soll. Beispielsweise kann bei der Herstellung des rekombinanten Virus der Marek-Krankheit, das das Virus-F-Antigen der Newcastle-Krankheit exprimieren kann, um einen multivalenten Impfstoff zu erhalten, der sowohl für die Newcastle-Krankheit als auch für die Marek-Krankheit nützlich ist, das gewünschte rekombinante Virus der Marek-Krankheit, das auch als Impfstoff für die der Newcastle-Krankheit verwendet werden kann, durch Nachweis des NDV-F-Antigens ausgewählt werden. Andererseits kann, wenn ein Gen, das ein Enzym codiert, in das rekombinante Virus der Marek-Krankheit eingebaut wird, das gewünschte Virus basierend auf der Aktivität des Enzyms durchmustert werden. Beispielsweise wird im Falle der Auswahl eines rekombinanten Virus, wobei ein Gen, das die β-Galaktosidase (β-gal) codiert (das hier nachstehend als „LacZ-Gen" bezeichnet wird), in das Virus der Marek-Krankheit zur Expression von β-Galaktosidase eingebaut wird, ein Substrat der β-Galaktosidase [z. B. X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid)] einer mit Agar überschichteten Zellschicht zugegeben, auf der ein Virusplaque, der eine β-Galaktosidase-Aktivität zeigt, durch die Farbe unterschieden werden kann [S. CHAKRABBARTI et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3403 (1985); Saeki et al., Abstract of the 35^th Meeeting of Japan Virology Society (1987)].
Zudem wird ein rekombinantes MDV, in das das betreffende Fremdgen eingebaut wird, leicht hergestellt, indem das zellfreie Virus vom Typ LacZ(+) (β-gal(-)-Virus) verwendet wird, das vorstehend als Elternzelle beschrieben wird, und ein LacZ(-)-Virus aus dem Überstand der rekombinanten Plaques cloniert wird, in denen das LacZ-Gen mit dem betreffenden Fremdgen ersetzt wird (hier nachstehend als „reverses Verfahren" bezeichnet). Dieses reverse Verfahren ist ein sehr praktisches Verfahren zur Konstruktion eines rekombinanten Virus, in das das betreffende Fremdgen eingebaut wurde. Da das herkömmliche MDV 1 sehr wenig zellfreies Virus ergab, war es unmöglich, das reverse Verfahren bei herkömmlichen MDV 1 oder dem zellassoziierten Virus zu übernehmen. Im Falle des zellassoziierten Virus ist es nämlich notwenig, die verschiedenen rekombinanten Plaques zu durchmustern, die das geeignete rekombinierte LacZ(-)-Virus und das nicht geeignete nicht rekombinierte LacZ(+)-Virus einschließen. Jedoch ist es schwierig, das geeignete rekombinierte LacZ(-)-Virus zu durchmustern. Andererseits ist das betreffende rekombinierte Zielvirus (revertierter Virus) leicht herzustellen, indem das zellfreie Virus vom Typ MDV der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele spezifischer veranschaulicht, sollte aber nicht so ausgelegt werden, darauf begrenzt zu sein.
Virusstamm
Es wurde der aus der freien Wildbahn isolierte Stamm 61–554 des Virus Typ-I der Marek-Krankheit verwendet. Dieser Stamm wurde von einem 50 Tage alten Huhn isoliert, das 1986 nicht mit dem Impfstoff der Marek-Krankheit geimpft wurde. Als dieser Stamm durch Impfung von 2 × 10³ PFU des Stammes in das Peritoneum eines ein Tage alten SPF (spezifizierten pathogenfreien)-Huhns getestet wurde, wurde kein Ausbruch der Krankheit oder der Tod des Tieres während der 10-wöchigen Testperiode beobachtet und auch die Autopsie konnte keine Erkrankung wie einen Tumor offenbaren.
Reinigung der Virus-DNA
Nach dem Impfen der Hühnerembryofibroblasten (hier nachstehend als „CEF" bezeichnet) mit dem Virus, wurden die virusinfizierten Zellen zu der Zeit geerntet, als sich der cytopathische Effekt (CPE) sehr stark zeigte, und die Virus-DNA wurde nach dem Verfahren von Hirai et al., [J. Gen. Virol., 45, 119 (1979)] gereinigt.
D. h. die virusinfizierten Zellen, die einen sehr starken CPE zeigten, wurden durch Zentrifugation gesammelt und dazu wurde eine doppelte Menge einer 1%-igen NP40-Lösung (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,01 M NaCl, 0,0015 M MgCl₂) zugegeben und das Gemisch wurde 30 Minuten auf Eis gekühlt und dann pipettiert. Nachdem die Lösung 10 Minuten bei 2500 UpM zentrifugiert wurde, wurde der Überstand auf einer 40%–60%-igen (Gew.-%) Saccharoselösung (0,02 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl) überschichtet. Nach der 2-stündigen Zentrifugation bei 175 KG wurde eine Schicht, die ein Capsid enthielt, das vom Virus der Marek-Krankheit stammte, die Schicht, die sich zwischen der 40%-igen Saccharoselösung und der 60%-igen Saccharoselösung bildete, getrennt. Diese Zwischenschicht wurde in einer Lösung resuspendiert, die 0,02 M Tris-HCl, pH 7,4 und 0,15 M NaCl enthielt, und die Suspension wurde 1 Stunde bei 160 KG zentrifugiert und ein Pellet erzeugt. Das erhaltene Pellet wurde in einer 1%-igen SDS-Lösung (0,1% Tris-HCl, pH 7,4, 0,01 M EDTA, 1% Sarcosinat; hergestellt von Nakarai Kagaku Co. Ltd.), ergänzt mit 0,1% Proteinase K (hergestellt von Boehringer Mannheim yamanouchi), suspendiert, und man ließ die Suspension bei 37°C über Nacht stehen. Dann wurde die DNA durch eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung gesammelt. Die erhaltene DNA wurde in einem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst, und die Lösung wurde mit einer 10%–30%-igen Glyceringradientenlösung überschichtet, gefolgt von einer 4-stündigen Zentrifugation bei 175 KG. Dann wurde die Lösung vom Boden des Zentrifugenröhrchens ab fraktioniert und eine die Virus-DNA enthaltende Fraktion wurde getrennt. Eine gleiche Menge 10%-iger Trichloressigsäure wurde der Virus-DNA enthaltenden Fraktion hinzugefügt, um die DNA zu fällen, und die gefällte DNA wurde gesammelt.
Clonieren der Virus-DNA
Dann wurde die vorstehend gereinigte Virus-DNA der Marek-Krankheit (1 μg) mit einem Restriktionsenzym gespalten und die erhaltenen Fragmente wurden einer 0,7%-igen Agarosegelelektrophorese unterzogen, um sie voneinander zu trennen, und die getrennten Fragmente wurden aus dem Gel durch ein Elektroelutionsverfahren eluiert, gefolgt von einem Sammelvorgang durch eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung. Das so erhaltene Fragment wurde mit dem pUC- oder PBR-Plasmid mit T4-DNA-Ligase ligiert. Geeignete kompetente Zellen (z. B. JM109) wurden mit dem Ligat transduziert, so dass sich transformierte E. coli-Zellen ergeben. Die transduzierten Zellen wurden dann auf einem mit Ampicillin (100 μg/ml) ergänzten LB-Medium gezüchtet. Die Plasmide in den Zellen wurden durch ein herkömmliches Alkaliverfahren gesammelt.
Bestimmung der Nucleotidsequenz
Das erhaltene Genfragment wurde in den Polylinker von pUC119 eingebaut und in kompetente Zellen wie JM109 transduziert. Die erhaltenen Transformanten wurden auf einem LB-Medium über Nacht gezüchtet und dann wurden 30 μl der Kultur mit dem M13-Phagen (mehr als 10⁹/ml; 60 μl) infiziert, und die Kultur wurde über Nacht weiter gezüchtet. Die Zellen wurden durch eine Zentrifugation entfernt und der Phage wurde aus dem Überstand gesammelt. Dann wurde eine einzelsträngige DNA (hier nachfolgend als „ss DNA" bezeichnet), die eine Nucleotidsequenz eines gewünschten Genfragments enthielt durch das herkömmliche Verfahren hergestellt.
Unter Verwendung von SEQUENASE V2.0 (hergestellt von TOYOBO) wurde die Nucleotidsequenz der erhaltenen ss DNA gemäß der Vorschrift bestimmt.
Das Genfragment auf dem Plasmid wurde gegebenenfalls schrittweise unter Verwendung des Deletions-Kits für Kilo-Sequenzen (hergestellt von Takara; Kat. Nr. 6030) verkürzt, die Plasmide wurden unter Verwendung des erhaltenen verkürzten Genfragments rekonstruiert und die ss DNAs wurden auf dieselbe Weise hergestellt.
Herstellung des rekombinanten Virus
Es wurden primäre CEF, die bei 37°C über Nacht mit einer EDTA-Trypsin-Lösung gezüchtet wurden, geerntet und dann in einem Eagle-MEM (E-MEM; hergestellt von Nissui Co. Ltd.)-Medium, das mit einem 5%-igen Rinderserum (hier nachstehend als „BS" bezeichnet) ergänzt wurde, bei einer Zellkonzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert. 40 ml der Suspension wurden in einen von Falcon (Nr. 3028) hergestellten Gewebekulturkolben gegeben.
Mit dem Virus der Marek-Krankheit infizierte CEF wurden bei etwa 8 × 10⁵ Zellen angeimpft, und die Zellen wurden 4 Stunden bei 37°C gezüchtet. Danach wurden die Zellen erneut mit der EDTA-Trypsin-Lösung geerntet und zweimal mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (abgekürzt als PBS(-)) gewaschen. Die Zellen (5 × 10⁵ Zellen) wurden in die Küvette des Gene Pulser (hergestellt von Bio-Rad; Kat. Nr. 165–2075) überführt. Das Insertionsplasmid wurde in die Küvette gegeben und der Puls nach der Vorschrift abgegeben, um das Insertionsplasmid in die virusinfizierten Zellen einzuschleusen. Die Zellen wurden dann in mit 5% BS ergänztem E-MEM (hergestellt von Nissui Co. Ltd.; 15 ml) suspendiert, auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm (hergestellt von Falcon, Kat. Nr. 3003) übertragen und bei 37°C gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die toten Zellen, die nicht an der Schale hafteten, zusammen mit dem Kulturmedium entfernt und der Schale wurde mit 5% BS ergänztes E-MEM (15 ml) zugegeben, in das primäre CEF, die am Tag zuvor gezüchtet wurden (sekundäre CEF), zusätzlich bei 5 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert wurden. Nach 4- oder 7-tägiger Züchtung der Zellen bei 37°C wurden die gezüchteten Zellen mit 1%-iger Agarose/E-MEM-Lösung (die kein Phenolrot enthielt), die mit Chlorphenolrot β-D-Galaktopyranosid (hergestellt von Seikagaku Kogyo; 100 μg/ml) ergänzt wurde, überschichtet.
Die roten Plaques, die die β-gal-Aktivität zeigten, erschienen innerhalb von 5 bis 60 Minuten und wurden durch eine Plaqueclonierung subkultiviert. Dieses Verfahren wurde mehrere Male wiederholt und dann wurden die virusinfizierten Zellen sanft mit einem Ultraschalldesintegrator aufgelöst, so dass sich zellfreie Viren ergeben. CEF, die 4 Stunden gezüchtet wurden, wurden mit den erhaltenen zellfreien Viren angeimpft und mehrere Tage gezüchtet. Die Plaqueclonierung wurde ferner zweimal oder dreimal durchgeführt, um das rekombinante Virus zu reinigen
Southern-Hybridisierung
Die Sonden wurden unter Verwendung des DIG-DNA-Markierungs-Kits (hergestellt von Boehringer Mannheim yamanouchi; Kat. Nr. 150350) und Southern-light (hergestellt von TROPIX; Kat. Nr. SL100) hergestellt, und die Hybridisierung wurde nach den Vorschriften durchgeführt. Kurz gesagt, wurde die DNA linearisiert und durch Hitze denaturiert, und die Sonden-DNA wurde unter Verwendung eines Zufallsprimers, Klenow-Fragments und dNTPs, einschließlich Digoxigenin-markiertem dUTP als Substrat, synthetisiert.
Die erhaltene Sonde wurde mit der gewünschten DNA hybridisiert, auf Hybond N+ (hergestellt von Amersham Japan; Kat. Nr. RPN.303B) nach Vorschrift übertragen und mit einem Alkaliphosphatase-markiertem anti-Digoxigenin-Schaf-IgG nachgewiesen. 3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)-phenyl-l,3-dioxotano (AMPPD) wurde als Substrat des Enzyms Alkaliphosphatase verwendet, und die erhaltene spezifische Lumineszenz wurde mit einem Röntgenfilm (hergestellt von FUJIXEROX; X-OMAT) nachgewiesen.
Sammeln der rekombinanten Virus-DNA
Der Überstand wurde durch Saugen entfernt, wenn die auf einer Petrischale (hergestellt von Falcon; Kat. Nr. 150350) angeimpften Viren einen CPE auf der gesamten Schale zeigten. Eine Proteinase-K-Lösung (2 ml) (Proteinase K lmg/ml, 0,1 M Tris-HCl, pH 9,0, 0,1 M NaCl, 0,001 M EDTA, 1% SDS) wurde auf die Schale gegossen und die Zellen wurden 1 Stunde bei 37°C behandelt. Die Zellen wurden dann in konische Röhrchen (hergestellt von Falcon; Kat. Nr. 2099) überführt und bei 37°C über Nacht behandelt. Dann wurden die Zellen mit Phenol behandelt und der Überstand wurde einer Ethanolfällung unterzogen. Nach dem Trocknen wurde das Präzipitat in 100 μl TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst. Für die Southern-Hybridisierung wurden 2 μl dieser Lösung nach der Spaltung mit einem Restriktionsenzym verwendet.
Sammeln der Viren aus dem Hühnerkörper
Mit einer Heparin enthaltenden Spritze wurde Blut (1 ml) abgenommen. Diesem Blut wurde PBS(-) zugegeben, so dass das Gesamtvolumen 4 ml ergibt, und das Gemisch wurde sanft auf Ficoll-Pque (hergestellt von Falmacia; 3 ml) überschichtet, das in dem konischen Röhrchen (hergestellt von Falcon; Kat. Nr. 2099) enthalten war, das einer 30-minütigen Zentrifugation bei 1500 UpM unterzogen wurde (KN-30F, hergestellt von KUBOTA).
Die Lymphocyten und Monocyten (Leukocytenmanschette) enthaltende Zwischenschicht wurde getrennt und wiederum in 0,01% EDTA enthaltender PBS(-) suspendiert. Die Suspension wurde einer 5-minütigen Zentrifugation bei 1000 UpM unterzogen, um die Lymphocyten und Monocyten zu gewinnen, mit denen die sekundären, 4 Stunden gezüchteten CEF geimpft wurden. Die CEF wurden 4 bis 7 Tage beobachtet. CEF, die keinen CPE durch das MDV zeigten, wurden bis zur 3. Generation subkultiviert und dann wurde das Vorhandensein des CPE bestimmt.
Fluoreszenz-Antikörper (FA)-Verfahren
Der 61–554 Stamm (10⁴ PFU) wurde auf der Petrischale (Durchmesser: 5 cm), die drei Deckgläser (hergestellt von MATUNAMI, Nr. 1, 18 × 18 mm) enthielt, zusammen mit CEF (10⁷ Zellen) angeimpft und 2 Tage gezüchtet. Die Deckgläser wurden herausgenommen, bei Raumtemperatur 20 Minuten mit Aceton fixiert und bei –80°C aufbewahrt. Zum Nachweis eines anti-β-gal-Antikörpers wurden BMT-10-Zellen mit dem Plasmid pASLacZ eingebaut, wobei das LacZ-Gen stromabwärts des β-Actin-Promotors [Japanische Patentanmeldung Nr. 226960/1989 (Japanisches Patent Erstveröffentlichung Nr. 76578/1990)] durch Elektroporation gebunden wird und dann 2 Tage gezüchtet wird. Die Zellen wurden auf dieselbe Weise acetonfixiert, wie vorstehend erwähnt, und bei –80°C aufbewahrt.
Das Hühnerserum wurde (x10) mit PBS(-)verdünnt, und man ließ es bei 4°C über Nacht stehen. Dazu wurde ein 20-fach mit PBS(-) verdünnter, FITC-markierter anti-Huhn-IgG-Ziegenantikörper (hergestellt von KIRKEKAARD & PERRY Lab., Kat. Nr. 031506) zugegeben. Nach der 1-stündigen Reaktion bei 37°C und dem Waschen, erfolgte die Beobachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop.
EILSA
100 μl β-Gal (hergestellt von TOYOBO, Code Nr. GAH-201; 20 ml) wurden pro Vertiefung in eine Schale mit flachem Boden mit 96 Vertiefungen gegossen (hergestellt von Nunc, Kat. Nr. 473768), und man ließ es bei 4°C über Nacht reagieren. Nach Waschen mit 0,15 M PBS(-) (pH 7,3) wurde die Schale 2 Stunden bei 37°C mit 1% BSA/0,15 M PBS(-) blockiert.
Nach der 800-fachen Verdünnung der Testseren mit PBS(-) wurden 100 μl der verdünnten Testseren der Platte zugegeben und man ließ es 1 Stunde bei 37°C reagieren. Danach ließ man nach einem bekannten Verfahren einen anti-Huhn-IgG POD-markierten Kaninchenantikörper (Nordick) und TMBZ (hergestellt von Dojin Kagaku; Kat. Nr. 346-04031) mit der Platte reagieren. Nachdem die Reaktion mit 1 N H₂SO₄ gequencht wurde, wurde die Absorption bei OD 450 nm/630 nm gemessen und der Wert, der durch die Subtraktion der Absorption bei 630 nm von der Absorption bei 450 nm erhalten wurde, wurde als ELISA-Wert betrachtet.
Beispiel 1 (Clonieren der DNA des Virus Typ-I-61-554 Stammes der Marek-Krankheit)
DNA (1 μg) des 61-554-Stammes wurde mit HindIII gespalten und die erhaltenen Fragmente wurden einer 0,7%-igen Agarosegelelektrophorese unterzogen. Das 1,7 kb-Fragment (hier nachstehend als „HindIII-B-Fragment" bezeichnet) wurde aus dem Gel herausgenommen und in pBR322 cloniert. Dieses HindIII-B-Fragment wurde mit EcoRI gespalten und in ein pUC119-Plasmid subcloniert, wobei der Bereich von der BamHI-Schnittstelle bis zur HindIII-Schnittstelle in der Multiclonierungsschnittstelle (MCS) entfernt wurde (hier nachstehend als „Δpuc119" bezeichnet), wobei das subclonierte Plasmid als „pKHB" bezeichnet wird. 1 zeigt ein Muster der EcoRI-Spaltung von pKHB.
Die Position des EcoRI-Subfragmnets, A3 (5,2 kb), A4 (2,8 kb), A5 (2,1 kb) and A6 (2,4 kb), ist in 2. dargestellt. Plasmide, die jedes dieser Fragmente enthalten, wurden als pKA3, pKA4, pKA5 bzw. pKA6 bezeichnet. Es wurde gezeigt, dass unter diesen Fragmenten die A5- und A6- Fragmente eine unterschiedliche Größe besitzen, abhängig von der Art der Virusstämme (vgl. Tabelle 1).
Tabelle 1
Beispiel 2 (Herstellung eines rekombinanten Virus der Marek-Krankheit, in das ein SV40-LacZ-Gen; K-A4BL eingebaut wird)
pCH110 (hergestellt von Pharamacia, Kat. Nr. 27-4508-01) wurde mit BamHI and TthIII I gespalten, und das erhaltene 4,2 kb-Fragment (SV40-LacZ), das in die BalI-Schnittstelle von pKA4 (Insertionsplasmid pKA4BL) (vgl. 3) eingebaut wurde, hatte glatte Enden.
Nachdem pKA4BL durch Spaltung mit KpnI linearisiert wurde, wurde das rekombinante Virus K-A4BL durch das in der Herstellung des rekombinanten Virus beschriebenen Verfahren hergestellt. Dieses rekombinante Virus zeigte ein ausgezeichnetes Wachstum in vitro, das dem des Elternstammes 61–554 entsprach.
Um die Position zu bestätigen, in der das LacZ-Gen in K-A4BL eingebaut ist, wurden DNAs, die aus mit K-A4BL infizierten CEF extrahiert wurden, mit EcoRI gespalten, und die erhaltenen Fragmente wurden einer Southern-Hybridisierung unterzogen. 4 zeigt die Ergebnisse der Southern-Hybridisierung, bei der das KA4-Fragment und das LacZ-Gen (3,7 kb), das aus pCH110 durch Spaltung mit HindIII und BamHI herausgenommen wurde, als Sonden verwendet wurden. In beiden Fällen wurden unter Verwendung des KA4-Fragments (Spur 2) und des LacZ-Gens (Spur 1) als Sonden, nur Banden mit der erwarteten Größe nachgewiesen und dabei wurde bestätigt, dass der Einbau des LacZ-Gens durch die homologe Rekombination erfolgte und das rekombinante Virus gereinigt wurde.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse des Viruswiedergewinnungstests und des anti-MDV-Fluoreszenz-Antikörper (nachstehend bezeichnet als „FA")-Tests in 1 Tag alten SPF-Hühnern, die mit K-A4BL (7000 PFU) geimpft wurden. Die Viruswiedergewinnung nach 1 Woche und 6 Wochen nach der Impfung betrug 4/5 bzw. 5/5(+) und der anti-MDV-FA 6 Wochen nach der Impfung betrug 7/7(+). Andererseits wurde der anti-β-gal-Antikörpertiter mittels ELISA für Seren 7 Wochen nach der Impfung gemessen. Wie in 5 dargestellt, zeigten alle 7 Fälle höhere Werte als diejenigen der Kontrollen (geimpft mit HVT + SB – 1) und waren sogar in FA gegen das Antigen β-gal positiv, dessen Nachweis weniger sensitiv war, und dabei wurde die Produktion des anti-β-gal-Antikörpers in dem mit K-A4BL geimpften Huhn bestätigt. Zusätzlich waren alle Fälle für den anti-β-gal-Antikörper sogar 16 Wochen nach der Impfung positiv, und die Viruswiedergewinnung 16 Wochen nach der Impfung zeigte ebenfalls gute Ergebnisse wie 2/7(+). In diesem Stadium betrug die Viruswiedergewinnung aus Hühnern, die mit 20.000 PFU HVT oder dem CVI988-Clon C geimpft wurden, 2/12(+) [Witter et al., Avian Diseases 31, 829–840 (1987)].
D. h. nach den Ergebnissen der Tests in diesem Beispiel wurde bestätigt, dass A4BL eine anhaltende Infektiosität besaß, die dem Elternstamm des Impfstoffs aus dem Virus der Marek-Krankheit entsprach oder überlegen war und somit für die Verwendung als Vektor ganz geeignet war.
Überraschenderweise wurde der anti-β-gal-Antikörper in allen Hühnern vier Wochen nach der Impfung nachgewiesen und der FA-Wert von 160 oder mehr hielt mehr als vier Monate an. Diese Ergebnisse zeigen, dass dieses System eine äußerst exzellente Art und Weise darstellt, Hühnern einen Impfstoff zu verabreichen.
Zusätzlich zeigten alle Plaques des rekombinanten Virus, die aus dem peripheren Blut 6 Wochen nach der Impfung gewonnen wurden, β-Galaktosidase-Aktivität und somit wurde bestätigt, dass der Vektor der vorliegenden Erfindung nicht nur als System zur vorübergehenden Verabreichung eines Antigens nützlich ist, sondern auch als DDS zur kontinuierlichen Herstellung einer physiologisch aktiven Substanz wie ein Enzym oder eines Hormons in einem lebenden Körper.
Tabelle 2
Andererseits war im Falle der Hühner, die nicht mit den Viren geimpft wurden, sondern in demselben Isolator gezüchtet wurden wie die Hühner, die mit dem rekombinanten Virus geimpft wurden, sowohl die Viruswiedergewinnung als auch der Antikörpertiter negativ, was zeigte, dass das rekombinante Virus der vorliegenden Erfindung am selben Ort lebende Individuen nicht infiziert. D. h., dass das rekombinante Virus der vorliegenden Erfindung recht praktisch von dem Gesichtspunkt aus ist, dass es in den damit geimpften Individuen verbleibt.
Um diese Wirkung von K-A4BL als Impfstoff für die Marek-Krankheit zu bestätigen, wurden 1 Tag alte Hühner peritoneal mit 2000 PFU oder 6000 PFU K-A4BL geimpft und eine Woche später peritoneal mit 5000 PFU des Alabama-Stammes des virulenten Virus der Marek-Krankheit geimpft. Die Hühner wurden gezüchtet und 10 Wochen beobachtet, ob der Tod oder der Ausbruch der Beinlähmung aufgrund der Marek-Krankheit eintrat, und die Wirkung von K-A4BL wurde, basierend auf der Abwesenheit des Tumors, nach 10 Wochen durch Autopsie bestimmt. Als Ergebnis wurde, wie in Tabelle 3 gezeigt, der Tod oder der Ausbruch der Krankheit in allen getesteten Hühnern der nicht immunisierten Kontrollgruppe beobachtet, aber im Falle der mit K-A4BL geimpften Gruppe wurde der Ausbruch der Krankheit nur in einem Huhn beobachtet, das mit 2000 PFU geimpft wurde. Deshalb besitzt das rekombinante Virus der vorliegenden Erfindung genügend Immunogenität als Impfstoff für die Marek-Krankheit.
Tabelle 3
Beispiel 3 (Konstruktion des Insertionsvektors pKA4B zur Herstellung des rekombinanten Virus)
pUC119 wurde mit MflI gespalten und die erhaltenen Fragmente wurden einer 1%-igen Agarosegelelektrophorese unterzogen.
Ein 1,0 kb-Fragment, das den Bereich der Mulitclonierungstelle von der HindIII-Schnittstelle bis zur XbaI-Schnittstelle (hier nachstehend als „Clonierungsstelle" bezeichnet) enthielt, wurde aus dem Gel herausgenommen und in die BglII-Schnittstelle von pSV2-dhfr (ATCC Nr. 371464) (pSV2-dln) eingebaut. Dieses Plasmid wurde mit HindIII und BamHI gespalten, und es wurde ein 1,0 kb-Fragment erhalten, das die Clonierungsstelle stromaufwärts des PolyA-Additionssignals enthielt, und stromabwärts der frühen Gene des SV40-Promotors von pCH110 eingebaut, indem es mit dem LacZ-Gen (pSVEA) ersetzt wurde. pSVEA wurde mit PvuII und BamHI gespalten. Ein 1,3 kb-Fragment, das die Clonierungsstelle mit dem SV40-Promotor der frühen Gene und das PolyA-Additionssignal enthält, wurde mit glatten Enden versehen und in die BalI-Schnittstelle von pKA4 eingebaut, um pKA4B zu konstruieren (6).
Das Virus der Marek-Krankheit, das ein zu exprimierendes Gen enthält, kann leicht hergestellt werden, indem das Gen in die Clonierungsstelle von pKA4B der vorliegenden Erfindung eingebaut wird, das rekombinante Virus hergestellt und die homologen Rekombination nach dem Verfahren von Beispiel 2 durchgeführt wird. Das Protein, das von diesem Gen codiert wird, kann effizient durch die frühen Gene des SV40-Promotors und das PolyA-Additionssignal exprimiert werden, indem das rekombinante Virus in Kulturzellen oder Hühner eingebracht wird.
Beispiel 4 (Herstellung eines rekombinanten Virus der Marek-Krankheit, in das ein Fusionsproteingen eingebaut wird, das vom Virus der Newcastle-Krankheit stammt; K-A4BF)
Ein Gen, das ein Fusionsprotein codiert (hier nachstehend als „F-Gen" bezeichnet; H.
Sato et al., Virus Research 7, 241–255 (1987)), das von dem stark abgeschwächten D-26-Vi russtamm der Newcastle-Krankheit stammt, wurde in die SmaI-Schnittstelle von pSVL (hergestellt von Pharmacia, Code Nr. 27-4509-01) (pSVLF; 7) eingebaut. Das erhaltene Plasmid wurde mit EcoRI und SalI gespalten und ein 4,3 kb-Fragment wurde durch das Elektroelutionsverfahren gesammelt. Das erhaltene Fragment besaß glatte Enden und wurde in die BalI-Schnittstelle von pKA4 eingebaut, um das Insertionsplasmid pKA4BF zu konstruieren (7).
Nach der Linearisierung des Plasmids mit PvuI erfolgte die Rekombination nach dem in der Herstellung des rekombinanten Virus beschriebenen Verfahren. Die Clonierung des rekombinanten Virus wurde durch Immunfärbung unter Verwendung der monoclonalen Antikörper #83 und #313 durchgeführt, die das F-Protein erkennen [Y. Umino et al., J. Gen Virol., 71, 1199 (1990)].
Die Clonierung des rekombinanten Virus durch Immunfärbung wird hier nachstehend beschrieben.
Mehrere Tage nach der Rekombination wurde die Petrischale mit den Plaques mit E-MEM gewaschen und dazu wurde eine isotonische Lösung zugegeben, die die monoclonalen Antikörper #83 und #313 enthielt, und man ließ das Gemisch 10 bis 60 Minuten reagieren. Nach dem Waschen wurde der Schale ein 100- bis 200-fach mit der isotonischen Lösung verdünnter, Peroxidase-markierter anti-Maus-Antikörper (hergestellt von Bio-Rad, Code Nr. 172-1011) zugegeben, und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur 10 bis 60 Minuten weiter reagieren. Nach dem Waschen wurden der Schale 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,5), der 5 mg 3,3-Diaminobenzidintetrachlorid (DAB; hergestellt von Wako Jun-yaku Kogyo, Code Nr. 343-00901) enthielt, und 1,6 μl Wasserstoffperoxid (hergestellt von Mitsubishi Gasu Kagaku, enthaltend 31% H₂O₂) pro 10 ml zugegeben, und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur 5 bis 60 Minuten weiter reagieren. Der Plaque des rekombinanten Virus änderte seine Farbe. Der sich braun färbende Plaque wurde von einem Ringmaterial umgeben.
Eine 0,1 % EDTA enthaltende Trypsinlösung wurde nur innerhalb des Rings zugegeben, um die Zellen zu gewinnen, die sich mit dem rekombinanten Virus infiziert hatten, das gleichzeitig mit zusätzlichen CEF gezüchtet wurde, um das rekombinante Virus zu reinigen. Das rekombinante Virus wurde weiter gereinigt, indem das vorstehende Verfahren und das Verfahren zur Herstellung des zellfreien Virus durch Ultraschall mehrere Male wiederholt wurde.
Das gereinigte rekombinante Virus zeigte ein ausgezeichnetes Wachstum in vitro, das dem des Elternstammes entsprach.
Um die präventiven Effekte gegen die Newcastle-Krankheit (ND) von K-A4BF zu bestätigen, wurde ein Immuntest durchgeführt.
Einen Tag alte Hühner wurden peritoneal mit K-A4BF (10³ PFU) geimpft und 3 Wochen, 9 Wochen und 16 Wochen nach der Impfung, intramuskulär am Schenkel mit dem virulenten NDV-Sato-Stamm 10⁴ MLD geimpft. Als Ergebnis wurde durch 2-wöchige Beobachtung der Tod oder der Ausbruch der Krankheit in allen getesteten Hühnern der nicht immunisierten Kontrollgruppe beobachtet, jedoch im Falle der Gruppe, die mit K-A4BF geimpft wurde, wurde weder der Tod noch der Ausbruch der Krankheit beobachtet. Deshalb wurde bestätigt, dass das rekombinante Virus der vorliegenden Erfindung eine ausreichende Wirkung als Impfstoff für die Newcastle-Krankheit besitzt (Tabelle 4).
Tabelle 4 (Tod oder Ausbruch der Krankheit)
Beispiel 5 (Herstellung eines rekombinanten Virus der Marek-Krankheit, in das ein HN-Proteingen eingebaut wird, das vom Virus der Newcastle-Krankheit stammt; K-A4BHN)
Ein Gen, das ein HN-Protein codiert, das von dem stark abgeschwächten Virus D-26-Stamm der Newcastle-Krankheit stammt (H. Sato et al., Virus Research 8, 217–232 (1987)), wurde in die SmaI-Schnittstelle von pSVL eingebaut. Das erhaltene Plasmid wurde mit EcoRI und SalI gespalten und ein 4,5 kb-Fragment wurde durch das Elektroelutionsverfahren gesammelt. Das erhaltene Fragment besaß glatte Enden und wurde in die BalI-Schnittstelle von pKA4 eingebaut, um das Insertionsplasmid pKA4BHN (8) zu konstruieren.
Nach der Linearisierung des Plasmids mit PvuI erfolgte die Rekombination nach dem Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Virus. Die Clonierung des rekombinanten Virus wurde durch Immunfärbung unter Verwendung der monoclonalen Antikörper #193, #142 und #246, die das HN-Protein erkennen [Y. Umino et al., J. Gen Virol., 71, 1189 (1990)], auf dieselbe Weise durchgeführt wie bei der Herstellung von K-A4BF.
Das gereinigte rekombinante Virus zeigte ein ausgezeichnetes Wachstum in vitro, das dem des Elternstammes entsprach.
Beispiel 6 (Herstellung eines rekombinanten Virus der Marek-Krankheit, in das ein SV40-LacZ-Gen eingebaut wird; K-A3VL)
SV40-LacZ wurde in die EcoRV-Schnittstelle von pKA3 eingebaut (9). Das erhaltene Plasmid wurde durch Spaltung linearisiert und dann wurde K-A3VL nach dem Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Virus hergestellt.
Um die Position des eingebauten LacZ-Gens zu bestätigen, wurde DNA, die aus mit K-A3VL infizierten CEF extrahiert wurde, mit EcoRI gespalten und die erhaltenen Fragmente wurden der Southern-Hybridisierung unterzogen (10). Unter Verwendung des KA3-Fragments und des LacZ-Gens als Sonde wurden nur Banden einer erwarteten Größe in beiden Sonden des KA3-Fragments (Spur 2) und des F-Gens (Spur 1) nachgewiesen, und dabei wurde bestätigt, dass der Einbau des LacZ-Gens durch homologe Rekombination erfolgt ist und das rekombinante Virus gereinigt wurde. Der Plaque von K-A3VL war kleiner als der des Elternstammes vor der Rekombination und das Wachstum des erhaltenen Virus war offensichtlich gehemmt.
Beispiel 7 (Bestimmung der Nucleotidsequenz der Wiederholungssequenz in IRs und TRs).
pKA5 wurde mit StuI gespalten und das erhaltene Fragment von etwa 220 kb wurde in die SmaI-Schnittstelle von pUC119 eingebaut und die Nucleotidsequenz wurde bestimmt. Die erhaltene Sequenz wurde mit der Nucleotidsequenz des GA-Stammes verglichen (GenBank Hinterlegungsnummer M80595, M. Sakaguchi). Als Ergebnis fand man heraus, dass der Bereich der Nucleotide von Position 614 bis 822 zweimal wiederholt wurde (11a). Andererseits war ein Ergebnis der Nucleotidsequenzbestimmung von pKA6, dass die Sequenz 5-mal wiederholt wurde (11b).
Die Nucleotidsequenz eines Fragments des BC-1-Stammes des Virus Typ-I der Marek-Krankheit, der A6 entspricht, wurde ebenfalls bestimmt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass 278 Nucleotide mit 88% Homologie zur DNA des Vogel-Leukämievirus (ALV RAV2) in die umgekehrte Wiederholungssequenz TRs eingebaut waren und die Insertion 3,5-mal wiederholt wurde (11b ). 12 zeigt die Nucleotidsequenz des A6-Fragments des BC-1-Stammes.
Anhand der vorstehenden Ergebnisse fand man heraus, dass die umgekehrte Wiederholungssequenzen IRs und TRs neben dem Us-Bereich einen Bereich enthalten, in den ein Gen eingebaut werden kann, ohne das Wachstum des Virus zu beeinflussen.
Beispiel 8 (Herstellung eines rekombinanten Virus der Marek-Krankheit, in das ein SV40-LacZ-Gen eingebaut wird; K-A5SL)
Da der Bereich, in den ein exogenes Gen eingebaut werden kann, in den TRs und IRs neben dem Us-Bereich bestätigt wurde, wurde ein Insertionsplasmid unter Verwendung von pKA5 konstruiert. pKA5 wurde mit StuI gespalten, um die Wiederholungssequenzen von etwa 220 bp auszuschneiden und die erhaltenen Fragmente wurden einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Ein 5,1 kb-Fragment wurde aus dem Gel herausgenommen und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Dann wurde pCH110 (hergestellt von Pharmacia, Kat. Nr. 27-4508-01) mit BamHI und TthIII I gespalten, und es wurde ein 4,2 kb-Fragment (SV40-LacZ) erhalten und mit glatten Enden versehen. Dieses Fragment wurde in das vorstehende dephosphorylierte Fragment eingebaut, um ein Insertionsplasmid pKA5SL (13) zu konstruieren.
Das erhaltene Plasmid wurde durch Spaltung mit KpnI linearisiert und dann wurde die Rekombination nach dem Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Virus hergestellt. Das gereinigte rekombinante Virus zeigte ein ausgezeichnetes Wachstum in vitro, das dem des Elternstammes entsprach.
Beispiel 9 (Bestimmung der Nucleotidsequenz der Wiederholungssequenz von KA4).
pKA4 wurde mit BalI und SmaI gespalten, so dass sich zwei Fragmente von 1,1 kb und 4,9 kb ergaben, von denen jedes gesammelt wurde. Das 1,1 kb-Fragment wurde wiederum in die SmaI-Schnittstelle von ΔpUC119 eingebaut. Das 4,9 kb-Fragment wurde mit sich selbst ligiert und dann gemäß der Nucleotidsequenzbestimmung einzelsträngig gemacht, und die Nucleotidsequenz wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in 14 dargestellt. Es gab einen ORF von 639 Nucleotiden (Us639) in dieser Sequenz.
Beispiel 10 (Clonieren von K-A4BL, das zellfreie Viren ergibt)
Nach dem Ansetzen von mit K-A4BL (1 × 10⁵ PFU) infizierten CEF und primären CEF (3 × 10⁷) auf einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm wurde der Überstand vier Tage später geerntet, als der CPE stark ausgeprägt war. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 1500 UpM (KN-30F hergestellt von KUBOTA) wurde der pH-Wert des Überstandes mit 0,7% Natriumbicarbonatlösung auf etwa 7,4 eingestellt und primäre CEF (3 × 10⁷) und 5% BS zugegeben. Das Gemisch wurde in Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm gezüchtet. Wenn sich der CPE zeigte, wurde der Überstand wiederum geerntet und auf dieselbe Weise gezüchtet. Nach 5-maligem Wiederholen dieser Manipulation wurde der Überstand zehnfach mit 5% BS ergänztem E-MEM verdünnt und es wurden sekundäre CEF (5 × 10⁵) zugegeben. Dann wurde das Gemisch angesetzt, indem 100 μl in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben wurde, und gezüchtet. Die Zellen in den Vertiefungen, die einen einzelnen Plaque zeigten, wurden fünf Tage später geerntet und auf einer Petrischale mit einem Durchmesser von 5 cm mit primären CEF (1 × 10⁷) angesetzt. Der Überstand der Petrischale wurde verdünnt und dann auf Platten mit 96 Vertiefungen angesetzt, dann wurde der Überstand der Vertiefung, in dem sich ein einzelner Plaque zeigte, wiederum auf einer Platte mit 96 Vertiefungen angesetzt. Diese Manipulation wurde dreimal wiederholt, dann wurden die Zellen in den Vertiefungen, in denen sich ein einzelner Plaque zeigte, als Virusstammlösung geerntet, die zellfreie Viren in hohem Maße produzierten. Im CEF-Überstand, der fünf Tage nach dem Animpfen dieses Clons (5 × 10⁴ PFU) gezüchtet wurde, wurde zellfreies Virus von Typ LacZ(+) mit Spiegeln von 300–500 PFU/ml gewonnen. Andererseits wurde im CEF-Überstand, der mit einem Impfstoffvirus CVI988 infiziert wurde, der unter denselben Bedingungen gezüchtet wurde, zellfreies Virus vom Typ LacZ(+) mit Spiegeln von nur 2–10 PFU/ml produziert. Die Effizienz der homologen Rekombination liegt gewöhnlich bei etwa 0,1%. Deshalb wurde es zum ersten Mal möglich, ein rekombinantes Virus unter Verwendung von K-A4BL als Elternstamm herzustellen, der ein zellfreies Virus vom Typ LacZ(+) mit Spiegeln von 200–500 PFU/ml ergibt.
SEQUENZPROTOKOLL
1. SEQ ID Nr.: 1:

SEQUENZART: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 3001 bp STRANG: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear ORIGINALQUELLE ORGANISMUS: Virus-DNA

2. SEQ ID Nr.: 2:

SEQUENZART: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 900 bp STRANG: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear ORIGINALQUELLE ORGANISMUS: Virus-DNA MERKMALE: ORF von 117 bis 815

Claims

Rekombinantes Marek-Virus, erhältlich durch die Mutation eines Marek-Virus mit einem Plasmid, wobei das Plasmid umfasst (1) ein Genfragment, das von der etwa 2,8 kbp großen Us-Region stammt, das durch das Behandeln eines HindIII-B-Fragments eines Gens des Marek-Virus Typ 1 mit dem Restriktionsenzym EcoRI (ein A4-Fragment wie in 2 gezeigt) hergestellt wird, und (2) eine exogene Genexpressionskassette, die in die Restriktionsstelle BalI des Genfragments eingebaut ist, wobei die Kassette ein exogenes Gen umfasst, das stromabwärts eines Promotors gebunden ist, der in einer tierischen Zelle oder einem tierischen Virus wirksam sein kann.
Rekombinantes Marek-Virus nach Anspruch 1, wobei das Marek-Virus ein Marek-Virus des Typs I ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Marek-Virus, umfassend das Einbauen einer exogenen Genexpressionskassette in die Restriktionsstelle BalI eines Genfragments, das von der etwa 2,8 kbp großen Us-Region stammt, das durch das Behandeln eines HindIII-B-Fragments eines Gens des Marek-Virus Typ I mit dem Restriktionsenzym EcoRI (ein A4-Fragment wie in 2 gezeigt) hergestellt wird, wobei die Kassette ein exogenes Gen umfasst, das stromabwärts eines Promotors gebunden ist, der in einer tierischen Zelle oder einem tierischen Virus wirksam sein kann, und Einbauen des so erhaltenen rekombinanten Genfragments in das Marek-Virus-Genom, so dass das Einbauen des exogenen Gens in das Marek-Virus-Genom stattfindet.
Multivalenter Lebendimpfstoff für Vögel, umfassend ein rekombinantes Marek-Virus, erhältlich durch die Mutation eines Marek-Virus mit einem Plasmid, wobei das Plasmid umfasst (1) ein Genfragment, das von der etwa 2,8 kbp großen Us-Region stammt, das durch das Behandeln eines HindIII-B-Fragments eines Gens des Marek-Virus Typ I mit dem Restriktionsenzym EcoRI (ein A4-Fragment wie in 2 gezeigt) hergestellt wird, und (2) eine exogene Genexpressionskassette, die in die Restriktionsstelle BalI des Genfragments eingebaut ist, wobei die Kassette ein exogenes Gen umfasst, das stromabwärts eines Promotors gebunden ist, der in einer tierischen Zelle oder einem tierischen Virus wirksam sein kann.
Multivalenter Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, der ein Impfstoff für ein Huhn ist.
Multivalenter Lebendimpfstoff nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Marek-Virus ein Marek-Virus des Typs I ist.
Multivalenter Lebendimpfstoff nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das exogene Gen, das ein Antigen für einen Impfstoff codiert, ein Gen ist, das ein Antigen eines Newcastle-Disease-Virus codiert.
Multivalenter Lebendimpfstoff nach Anspruch 7, wobei das Gen, das ein Antigen des Newcastle-Disease-Virus codiert, ein Gen ist, das von einem attenuierten Newcastle-Disease-Virus stammt.
Vektor zur Verabreichung eines physiologisch aktiven Stoffs an Vögel, umfassend das rekombinante Marek-Virus nach Anspruch 1 oder 2, wobei das exogene Gen ein Gen ist, das einen physiologisch aktiven Stoff codiert.